KR20230016152A - Sirp-alpha 변이체 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
신규한 SIRPα 변이체, 상기 SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질, 및 상기 변이체 및/또는 융합 단백질의 면역 증진 및/또는 항암 용도가 제공된다.
Description
신규한 SIRPα (Signal regulatory protein alpha) 변이체, 상기 SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질, 및 상기 변이체 및/또는 융합 단백질의 면역 증진 및/또는 항암 용도가 제공된다.
CD47은 각종 종양 세포에서 발현이 증가되어 있으며, macrophage에서 발현되는 SIRPα (Signal regulatory protein alpha)와의 결합을 통해 macrophage의 대식작용을 억제하는 innate immune checkpoint로 알려져 있다. 현재 CD47-SIRPα axis를 타겟으로 하는 다양한 약물 (CD47 타겟 항체, SIRPα-Fc 융합 단백질, SIRPα 타겟 항체 등)의 개발이 진행되고 있으며, 이 약물들은 CD47-SIRPα 간의 결합을 방해하여 macrophage의 대식작용을 활성화 하여 항암 효력을 나타낸다.
이에, CD47-SIRPα 간의 결합을 보다 효과적으로 억제하는 물질의 개발이 요구된다.
본 명세서는 야생형 SIRPα 대비 CD47 (예컨대, 인간 CD47)에 보다 높은 결합력을 가지는 SIRPα 변이체 및 이의 용도를 제공한다.
일 예는 신규한 SIRPα 변이체를 제공한다. 상기 SIRPα 변이체는 야생형 SIRPα의 단편; 야생형 SIRPα 또는 상기 야생형 SIRPα의 단편에 하나 이상의 아미노산 변이가 도입된 것; 또는 이의 조합일 수 있다. 일 구체예에서 상기 SIRPα 변이체는 서열번호 3 내지 10 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
다른 예는 상기 SIRPα 변이체 및 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 상기 면역글로불린의 Fc 영역은 면역글로불린의 CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 CH2 도메인 및 CH3 도메인 모두를 포함할 수 있고, 이에 더하여, N 말단에 면역글로불린의 힌지 영역을 포함하거나 포함하지 않는 것일 수 있다. 상기 융합 단백질은 SIRPα 변이체 및 면역글로불린의 Fc 영역을 순서에 상관없이 포함할 수 있다. 즉, 상기 융합 단백질은, N-말단에서 C-말단 방향으로, SIRPα 변이체 및 면역글로불린의 Fc 영역을 순서대로 포함하거나, 면역글로불린의 Fc 영역 및 SIRPα 변이체를 순서대로 포함할 수 있다. 일 예에서, 상기 융합 단백질은, N-말단에서 C-말단 방향으로, SIRPα 변이체 및 면역글로불린의 Fc 영역을 순서대로 포함할 수 있다.
다른 예는 상기 SIRPα 변이체 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 상기 폴리뉴클레오타이드를 세포에서 발현시키는 발현 벡터일 수 있다.
다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.
다른 예는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 CD47-SIRPα 간의 결합 억제 및/또는 면역 증진을 위한 약학적 조성물을 제공한다: (1) 상기 SIRPα 변이체, (2) 상기 융합 단백질, (3) 상기 SIRPα 변이체 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, (4) 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 (5) 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
다른 예는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 약학적 유효량을 CD47-SIRPα 간의 결합 억제 및/또는 면역 증진이 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, CD47-SIRPα 간의 결합 억제 및/또는 면역 증진 방법을 제공한다: (1) 상기 SIRPα 변이체, (2) 상기 융합 단백질, (3) 상기 SIRPα 변이체 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, (4) 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 (5) 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
다른 예는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 CD47-SIRPα 간의 결합 억제 및/또는 면역 증진을 위한 용도 또는 CD47-SIRPα 간의 결합 억제 및/또는 면역 증진을 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 용도를 제공한다: (1) 상기 SIRPα 변이체, (2) 상기 융합 단백질, (3) 상기 SIRPα 변이체 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, (4) 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 (5) 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
상기 면역 증진용 약학적 조성물의 면역 증진은 CD47-SIRPα 간의 결합 억제 및/또는 대식 세포의 대식 작용 활성화에 의한 것일 수 있다.
다른 예는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다: (1) 상기 SIRPα 변이체, (2) 상기 융합 단백질, (3) 상기 SIRPα 변이체 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, (4) 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 (5) 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
다른 예는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 약학적 유효량을 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료가 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다: (1) 상기 SIRPα 변이체, (2) 상기 융합 단백질, (3) 상기 SIRPα 변이체 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, (4) 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 (5) 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
다른 예는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 용도 또는 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 용도를 제공한다: (1) 상기 SIRPα 변이체, (2) 상기 융합 단백질, (3) 상기 SIRPα 변이체 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, (4) 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 (5) 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
상기 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료는 CD47-SIRPα 간의 결합 억제 및/또는 대식 세포의 대식 작용 활성화 및/또는 면역 반응 증진에 의한 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 면역 관련 질병은 암일 수 있다.
다른 예는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 암의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다: (1) 상기 SIRPα 변이체, (2) 상기 융합 단백질, (3) 상기 SIRPα 변이체 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, (4) 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 (5) 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
다른 예는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 약학적 유효량을 암의 예방 및/또는 치료가 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다: (1) 상기 SIRPα 변이체, (2) 상기 융합 단백질, (3) 상기 SIRPα 변이체 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, (4) 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 (5) 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
다른 예는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 암의 예방 및/또는 치료를 위한 용도 또는 암의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 용도를 제공한다: (1) 상기 SIRPα 변이체, (2) 상기 융합 단백질, (3) 상기 SIRPα 변이체 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, (4) 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 (5) 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
신규한 SIRPα 변이체, 상기 SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질, 및 상기 변이체 및/또는 융합 단백질의 면역 증진 및/또는 항암 용도가 제공된다. 상기 SIRPα 변이체 및/또는 융합 단백질은 CD47에 대한 결합력이 우수하여, SIRPα와 CD47 간의 결합을 억제, 대식 세포의 대식 작용 증진, 면역 반응 증진, 및/또는 항암 효과를 가질 수 있다.
용어의 정의
SIRPα (Signal regulatory protein alpha)는 골수세포, 줄기세포, 뉴런 등에서 주로 발현되는 SIRP 계열의 조절성막당단백질 (regulatory membrane glycoprotein)로서, 막통과단백질인 CD47과 상호작용하여 macrophage의 대식작용을 억제하는 innate immune checkpoint이다. 본 명세서에서, SIRPα는 인간 등의 포유류 유래의 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 SIRPα (예컨대, GenBank Accession No. AAH38510.1 (BC038510.2에 의하여 코딩됨), NP_001035111.1 (NM_001040022.1에 의하여 코딩됨), NP_001035112.1 (NM_001040023.2에 의하여 코딩됨), NP_001317657.1 (NM_001330728.1에 의하여 코딩됨), NP_542970.1 (NM_080792.3에 의하여 코딩됨) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 폴리뉴클레오타이드 ("유전자" 또는 "핵산 분자"와 혼용될 수 있음) 또는 폴리펩타이드 ("단백질"과 혼용될 수 있음)가 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다" 또는 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 이루어진다 또는 표현된다" 함은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 필수적으로 포함하는 것을 의미할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 범위에서 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 변이 (결실, 치환, 변형, 및/또는 부가)가 가해진 "실질적으로 동등한 서열"을 포함하는 것 (또는 상기 변이를 배제하지 않는 것)으로 해석될 수 있다.
일 예에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다" 또는 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 이루어진다 또는 표현된다" 함은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 (i) 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 (ii) 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성 (identity)을 갖는 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하고 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 것을 의미할 수 있다. 본 명세서에서, SIRPα 변이체에 있어서의 상기 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능은 CD47에 대한 우수한 결합력, SIRPα와 CD47 간의 결합 억제, 대식 세포의 대식 작용 증진, 및/또는 면역 반응 증진을 의미할 수 있다. 본 명세서에서, 용어 “SIRPα와 CD47 간의 결합 억제”는 상기 결합 억제에 따른 CD47-SIRPα axis 저해를 포함하는 의미일 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "상동성 (identity)"은 주어진 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율 (%)로 표시될 수 있다. 핵산 서열에 대한 상동성의 경우, 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST(참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993)나 Pearson에 의한 FASTA (참조: Methods Enzymol., 183, 63, 1990)를 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
본 명세서에서, 단백질 또는 폴리펩타이드가 "특정 아미노산 서열을 포함한다 또는 특정 아미노산 서열로 이루어진다 또는 표현된다" 함은 상기 아미노산 서열을 포함하는 경우, 및 상기 아미노산 서열에 본래의 활성 및/또는 목적하는 활성 (예컨대, CD47에 대한 우수한 결합력, SIRPα와 CD47 간의 결합 억제, 대식 세포의 대식 작용 증진, 및/또는 면역 반응 증진 등)에 영향이 없는 무의미한 변이(예컨대, 아미노산 잔기의 치환, 결실, 및/또는 추가)가 도입된 경우를 모두 의미하는 것일 수 있다.
본 명세서에 기재된 아미노산 위치는, 다르게 정의되지 않은 한, 기준이 되는 아미노산 서열의 N 말단부터 기산한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다:
SIRPα 변이체
본 출원의 일 예는 SIRPα (Signal regulatory protein alpha) 변이체를 제공한다. 상기 변이체는, 다음에 설명되는 변이를 포함하지 않는 SIRPα (예컨대, 야생형 SIRPα)와 비교하여, CD47에 대한 결합력이 우수한 것일 수 있고, SIRPα와 CD47 간의 결합 억제, 대식 세포의 대식 작용 증진 및/또는 면역 반응 증진 효과를 가질 수 있고, 우수한 항암 효과를 가질 수 있다.
보다 구체적으로, 본 출원에서 제공되는 SIRPα 변이체는 SIRPα (Signal regulatory protein alpha) 또는 이의 일부로서, 적어도 변형 SIRPα V2 도메인 또는 이의 단편을 필수적으로 포함하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 SIRPα는 서열번호 1, 상기 SIRPα V2 도메인은 서열번호 2로 표현되는 것일 수 있다. 상기 SIRPα V2 도메인의 단편은 SIRPα V2 도메인의 원래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 일부분을 의미하는 것으로, N 말단, C 말단, 또는 양 말단에서 1 내지 10개 (예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개)의 아미노산이 결실된 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 3으로 표현되는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 변형 SIRPα V2 도메인 또는 이의 단편은, 야생형 SIRPα V2 도메인 (예, 서열번호 2)을 기준으로 다음 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산이 원래 (야생형)와 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다:
31번째 위치 (서열번호 3을 기준으로 30번째 위치)에 해당하는 아미노산, 및
56번째 위치 (서열번호 3을 기준으로 55번째 위치에 해당하는 아미노산.
보다 구체적으로, 상기 SIRPα 변이체는,
SIRPα 중의 서열번호 2의 SIRPα V2 도메인을 포함하는 118개 이상의 연속하는 아미노산 또는 서열번호 3의 SIRPα V2 도메인 단편을 포함하는 115개 이상의 연속하는 아미노산을 포함하거나 상기 아미노산을 필수적으로 포함하여 이루어지고,
상기 SIRPα V2 도메인 또는 SIRPα V2 도메인 단편은, (1) 서열번호 2의 31번째 위치 또는 서열번호 3의 30번째 위치에 해당하는 아미노산, (2) 서열번호 2의 56번째 위치 또는 서열번호 3의 55번째 위치에 해당하는 아미노산, 또는 (3) (1) 및 (2) 모두가 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
상기 다른 아미노산은 알라닌(A, Ala), 아스파라진(N, Asn), 트레오닌(T, Thr), 글루탐산(E, Glu), 세린(S, Ser), 발린(V, Val), 이소류신(I, Ile), 류신(L, Leu), 아스파르트산(D, Asp), 시스테인(C, Cys), 글루타민(Q, Gln), 메티오닌(M, Met), 페닐알라닌(F, Phe), 프롤린(P, Pro), 트립토판(W, Trp), 타이로신(Y, Tyr), 아르기닌(R, Arg), 히스티딘(H, His), 라이신(K, Lys), 및 글라이신(G, Gly)로 이루어진 군에서 선택되고, 원래의 아미노산과 상이한 아미노산을 의미할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 변형 SIRPα V2 도메인 또는 이의 단편은,
(1) 서열번호 2 (야생형 SIRPα V2 도메인)의 31번째 위치 또는 서열번호 3 (야생형 SIRPα V2 도메인 단편)의 30번째 위치에 해당하는 아미노산이 타이로신 또는 라이신이거나,
(2) 서열번호 2의 56번째 위치 또는 서열번호 3의 55번째 위치에 해당하는 아미노산이 아르기닌 또는 라이신이거나, 또는
(3) (a) 서열번호 2의 31번째 위치 또는 서열번호 3의 30번째 위치에 해당하는 아미노산이 타이로신 또는 라이신이고, (b) 서열번호 2의 56번째 위치 또는 서열번호 3의 55번째 위치에 해당하는 아미노산이 아르기닌 또는 라이신인 것일 수 있다.
상기 변형 SIRPα V2 도메인 또는 이의 단편은, 앞서 설명한 서열번호 2를 기준으로 31번째 위치 및/또는 56번째 위치에 해당하는 아미노산에서의 치환에 더하여, 글리코실화 가능한 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환에 의한 탈글리코실화 변이를 더 포함하는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 탈글리코실화 변이는 서열번호 2를 기준으로 80번째 위치 (서열번호 3을 기준으로 79번째 위치)에 해당하는 아미노산이 원래 (야생형)와 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있고, 상기 다른 아미노산은 탈글리코실화를 가능하게 하는 모든 아미노산 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대, 아스파르트산일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 상기 SIRPα 변이체는,
SIRPα 중의 서열번호 2의 SIRPα V2 도메인을 포함하는 118개 이상의 연속하는 아미노산 또는 서열번호 3의 SIRPα V2 도메인 단편을 포함하는 115개 이상의 연속하는 아미노산으로 이루어지고,
상기 SIRPα V2 도메인 또는 SIRPα V2 도메인 단편은,
(1) 서열번호 2의 31번째 위치 또는 서열번호 3의 30번째 위치에 해당하는 아미노산,
(2) 서열번호 2의 56번째 위치 또는 서열번호 3의 55번째 위치에 해당하는 아미노산, 또는
(3) (1) 및 (2) 모두
가 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 SIRPα 변이체는,
SIRPα 중의 서열번호 2의 SIRPα V2 도메인을 포함하는 118개 이상의 연속하는 아미노산 또는 서열번호 3의 SIRPα V2 도메인 단편을 포함하는 115개 이상의 연속하는 아미노산으로 이루어지고,
상기 SIRPα V2 도메인 또는 SIRPα V2 도메인 단편은 다음
(1) 서열번호 2의 31번째 위치 또는 서열번호 3의 30번째 위치에 해당하는 아미노산이 타이로신 또는 라이신이거나 (또는 타이로신 또는 라이신으로 치환된 것),
(2) 서열번호 2의 56번째 위치 또는 서열번호 3의 55번째 위치에 해당하는 아미노산이 아르기닌 또는 라이신이거나 (또는 아르기닌 또는 라이신으로 치환된 것), 또는
(3) (1) 및 (2) 모두인 것일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 SIRPα 변이체는,
SIRPα 중의 서열번호 2의 SIRPα V2 도메인을 포함하는 118개 이상의 연속하는 아미노산 또는 서열번호 3의 SIRPα V2 도메인 단편을 포함하는 115개 이상의 연속하는 아미노산으로 이루어지고,
상기 SIRPα V2 도메인 또는 SIRPα V2 도메인 단편은,
(1) 서열번호 2의 31번째 위치 또는 서열번호 3의 30번째 위치에 해당하는 아미노산,
(2) 서열번호 2의 56번째 위치 또는 서열번호 3의 55번째 위치에 해당하는 아미노산, 또는
(3) (1) 및 (2) 모두
가 다른 아미노산으로 치환되고,
서열번호 2의 80번째 위치 또는 서열번호 3의 79번째 위치에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 SIRPα 변이체는,
SIRPα 중의 서열번호 2의 SIRPα V2 도메인을 포함하는 118개 이상의 연속하는 아미노산 또는 서열번호 3의 SIRPα V2 도메인 단편을 포함하는 115개 이상의 연속하는 아미노산으로 이루어지고,
상기 SIRPα V2 도메인 또는 SIRPα V2 도메인 단편은,
(1) 서열번호 2의 31번째 위치 또는 서열번호 3의 30번째 위치에 해당하는 아미노산,
(2) 서열번호 2의 56번째 위치 또는 서열번호 3의 55번째 위치에 해당하는 아미노산, 또는
(3) (1) 및 (2) 모두
가 다른 아미노산으로 치환된 것이고, 하기 변이를 더 포함하는 것일 수 있다:
서열번호 2의 80번째 위치 또는 서열번호 3의 79번째 위치에 해당하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환.
보다 구체적으로, 상기 SIRPα 변이체는,
SIRPα 중의 서열번호 2의 SIRPα V2 도메인을 포함하는 118개 이상의 연속하는 아미노산 또는 서열번호 3의 SIRPα V2 도메인 단편을 포함하는 115개 이상의 연속하는 아미노산으로 이루어지고,
상기 SIRPα V2 도메인 또는 SIRPα V2 도메인 단편은 다음
(1) 서열번호 2의 31번째 위치 또는 서열번호 3의 30번째 위치에 해당하는 아미노산이 타이로신 또는 라이신이거나 (또는 타이로신 또는 라이신으로 치환된 것),
(2) 서열번호 2의 56번째 위치 또는 서열번호 3의 55번째 위치에 해당하는 아미노산이 아르기닌 또는 라이신이거나 (또는 아르기닌 또는 라이신으로 치환된 것), 또는
(3) (1) 및 (2) 모두이고,
서열번호 2의 80번째 위치 또는 서열번호 3의 79번째 위치에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산 (예컨대, 아스파르트산)으로 치환된 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 SIRPα 변이체는,
SIRPα 중의 서열번호 2의 SIRPα V2 도메인을 포함하는 118개 이상의 연속하는 아미노산 또는 서열번호 3의 SIRPα V2 도메인 단편을 포함하는 115개 이상의 연속하는 아미노산으로 이루어지고,
상기 SIRPα V2 도메인 또는 SIRPα V2 도메인 단편은 다음
(1) 서열번호 2의 31번째 위치 또는 서열번호 3의 30번째 위치에 해당하는 아미노산이 타이로신 또는 라이신이거나 (또는 타이로신 또는 라이신으로 치환된 것),
(2) 서열번호 2의 56번째 위치 또는 서열번호 3의 55번째 위치에 해당하는 아미노산이 아르기닌 또는 라이신이거나 (또는 아르기닌 또는 라이신으로 치환된 것), 또는
(3) (1) 및 (2) 모두인 것이고,
하기 변이를 더 포함하는 것일 수 있다:
서열번호 2의 80번째 위치 또는 서열번호 3의 79번째 위치에 해당하는 아미노산의 다른 아미노산(예를 들어, 아스파르트산)으로의 치환.
일 구체예에서, 상기 SIRPα 변이체는 서열번호 5 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 SIRPα 변이체는 서열번호 5 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 필수적으로 포함하여 이루어지는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 SIRPα, SIRPα V2 도메인, SIRPα V2 도메인 단편, 및 SIRPα 변이체의 아미노산 서열을 아래의 표 1에 예시하였다:
| Description | 아미노산 서열 (N→C) | 서열번호 |
| Wild-type SIRPα | MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSFTCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHSTAKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVPPTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVSRTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVEHDGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIVVGVVCTLLVALLMAALYLVRIRQKKAQGSTSSTRLHEPEKNAREITQDTNDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSPQPASEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQVPRK | 1 |
| Wild-type SIRPα V2 domain (1-118 a.a) |
EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS | 2 |
| Wild-type SIRPα V2 domain 단편 (2-116 a.a) | EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAK | 3 |
| SIRPα V2 domain 단편에 H56R, N80D 변이 도입 | EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGRFPRVTTVSESTKRENMDFSISISDITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAK | 5 |
| SIRPα V2 domain 단편에 H56K, N80D 변이 도입 | EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGKFPRVTTVSESTKRENMDFSISISDITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAK | 6 |
| SIRPα V2 domain 단편에 I31K, N80D 변이 도입 | EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLKPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISDITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAK | 7 |
| SIRPα V2 domain 단편에 I31Y, N80D 변이 도입 | EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLYPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISDITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAK | 8 |
| SIRPα V2 domain 단편에 I31K, H56R, N80D 변이 도입 | EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLKPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGRFPRVTTVSESTKRENMDFSISISDITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAK | 9 |
| SIRPα V2 domain 단편에 I31K, H56K, N80D 변이 도입 | EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLKPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGKFPRVTTVSESTKRENMDFSISISDITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAK | 10 |
| SIRPα V2 domain 단편에 I31Y, H56R, N80D 변이 도입 | EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLYPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGRFPRVTTVSESTKRENMDFSISISDITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAK | 11 |
| SIRPα V2 domain 단편에 I31Y, H56K, N80D 변이 도입 | EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLYPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGKFPRVTTVSESTKRENMDFSISISDITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAK | 12 |
융합 단백질
본 출원의 다른 예는 앞서 설명한 SIRPα 변이체와 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 상기 융합 단백질은, 앞서 설명한 변이를 포함하지 않는 SIRPα (예컨대, 야생형 SIRPα)를 포함하는 경우와 비교하여, CD47에 대한 결합력이 우수한 것일 수 있고, SIRPα와 CD47 간의 결합 억제, 대식 세포의 대식 작용 증진 및/또는 면역 반응 증진 효과를 가질 수 있고, 우수한 항암 효과를 가질 수 있다.
상기 SIRPα 변이체는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 면역글로불린은 인간 면역글로불린일 수 있다.
면역글로불린은, 주요 클래스, 즉, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 IgG와 IgA는 추가로 서브클래스 (이소타입)를 가진다 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2).
본 출원에서, 상기 면역글로불린은 IgA (예, IgA1 및 IgA2), IgD, IgE, IgG (예, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4), 및 IgM로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있고, 보다 구체적으로, IgG (예, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 면역글로불린의 Fc 영역은 앞서 설명한 면역글로불린의 CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 CH2 도메인 및 CH3 도메인 모두를 포함할 수 있다. 이에 더하여, 상기 면역글로불린의 Fc 영역은 앞서 설명한 면역글로불린의 힌지 영역을 포함하거나 포함하지 않는 것일 수 있다. 힌지 영역이 포함되는 경우, 상기 힌지 영역은 면역글로불린의 Fc 영역의 N-말단 부위에 위치하는 것일 수 있다.
상기 융합 단백질은 SIRPα 변이체 및 면역글로불린의 Fc 영역을 순서에 상관없이 포함할 수 있다. 즉, 상기 융합 단백질은, N-말단에서 C-말단 방향으로, SIRPα 변이체 및 면역글로불린의 Fc 영역을 순서대로 포함하거나, 면역글로불린의 Fc 영역 및 SIRPα 변이체를 순서대로 포함할 수 있다. 일 예에서, 상기 융합 단백질은, N-말단에서 C-말단 방향으로, SIRPα 변이체 및 면역글로불린의 Fc 영역을 순서대로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 상기 힌지 영역은 서열번호 13으로 표현될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예에서, Fc 영역 (힌지 불포함)은 IgG Fc, 예컨대, IgG1 Fc일 수 있으며, 야생형 (예컨대, 서열번호 14) 또는 변이형일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 변이형 IgG1 Fc는 하나 이상의 아미노산 잔기, 예컨대, K392, K409, E356, 및 D399로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 (1개, 2개, 3개, 또는 4개)이 다른 아미노산으로 치환된 것, 예컨대, 음이온성 아미노산 (아스파르트산 또는 글루탐산)이 양이온성 아미노산 (라이신 또는 아르기닌)으로 치환 및/또는 양이온성 아미노산이 음이온성 아미노산으로 치환된 것을 포함할 수 있으며, 예컨대, K392D 및/또는 K409D, 또는 E356K 및/또는 D399K를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예에서, 상기 변이형 IgG Fc (예컨대, 변이형 IgG1 Fc)는, 두 개의 Fc 간의 짝지음을 유리하게 하거나 및/또는 안정성을 향상시키기 위하여, 하나 이상의 노브(knob) 및/또는 하나 이상의 홀(hole)을 형성하는 아미노산 잔기를 포함하도록 변이(knobs-into-holes 변이)된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 두 개의 Fc 중 어느 하나는 하나 이상의 노브(knob)를 형성하는 아미노산을 가지도록 변이(노브 변이)되고, 다른 하나는 하나 이상의 홀(hole)을 형성하는 아미노산 잔기를 가지도록 변이(홀 변이)된 것일 수 있다. 상기 하나 이상의 노브를 형성하는 아미노산과 하나 이상의 홀을 형성하는 아미노산은 CH3 도메인에 위치할 수 있으며 (예컨대, 두 개의 Fc 중 어느 하나(제1 Fc)의 CH3 도메인의 하나 이상의 아미노산이 노브를 형성하는 아미노산으로 치환되고, 다른 하나(제2 Fc)의 CH3 도메인의 하나 이상의 아미노산이 홀을 형성하는 아미노산으로 치환됨), 이들은 서로 대응(상호작용)하는 위치에 존재하여 두 개의 Fc 간에 하나 이상의 knob-into-hole 아미노산 쌍이 형성될 수 있다. 상기 노브를 형성하는 아미노산은 주변 아미노산 잔기보다 상대적으로 큰 측쇄를 가지고 돌출된 구조를 생성할 수 있는 아미노산 잔기로서, Arg, Phe, Tyr, 및 Trp으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 홀을 형성하는 아미노산 잔기는 주변 아미노산 잔기보다 상대적으로 작은 측쇄를 가지고 함몰된 구조를 생성할 수 있는 잔기로서 Ala, Ser, Thr, Gly 및 Val으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예컨대, 상기 Fc 영역 (힌지 불포함)은 서열번호 14 (IgG1 Fc 야생형), 서열번호 49 (IgG1 Fc의 K392D 및 K409D 변이체), 서열번호 50 (IgG1 Fc의 E356K 및 D399K 변이체), 서열번호 51 (IgG1 Fc의 T366W 변이체; 노브 변이체) 및/또는 서열번호 52 (IgG1 Fc의 T366S, L368A 및 Y407V 변이체; 홀 변이체)로 표현될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
사용 가능한 힌지 및 Fc 영역 (힌지 불포함)의 아미노산 서열을 아래의 표 2에 예시하였다:
| 아미노산 서열 (N→C) | 서열번호 | |
| 힌지 (Hinge) | DKTHTCPPCP | 13 |
| IgG1 Fc (wild-type) | APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 14 |
| IgG1 Fc (K392D, K409D variant) | APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 49 |
| IgG1 Fc (E356K, D399K variant) | APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 50 |
| IgG1 Fc (knob variant) | APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 51 |
| IgG1 Fc (hole variant) | APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 52 |
일 구체예에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 17 내지 24, 및 53 내지 84로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 출원에서 제공되는 융합 단백질의 아미노산 서열을 다음의 표 3에 예시하였다:
| 아미노산 서열 (N→C) | 서열번호 |
| EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGRFPRVTTVSESTKRENMDFSISISDITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 17 |
| EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGKFPRVTTVSESTKRENMDFSISISDITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 18 |
| EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLKPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISDITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 19 |
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일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 융합 단백질은 모노머 (예컨대, 단일사슬 폴리펩타이드)일 수 있다. 다른 예에서, 상기 융합 단백질은 2개 이상이 Fc 영역 (예컨대, CH3 도메인) 및/또는 힌지 영역에서 결합(다합체화)된 다합체일 수 있고, 예컨대, 2개의 융합 단백질이 Fc 영역 (예컨대, CH3 도메인) 및/또는 힌지 영역에서 결합(이합체화)된 다이머 (예컨대, 호모다이머 및/또는 헤테로다이머)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
폴리뉴클레오타이드, 재조합 벡터, 및 재조합 세포
본 명세서에서 제공되는 SIRPα 변이체 또는 이를 포함하는 융합 단백질은 재조합적 또는 화학적 합성에 의하여 생산된 것일 수 있다.
일 예는 상기 SIRPα 변이체 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 상기 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에서 발현시키기 위한 발현 벡터일 수 있다.
다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다. 상기 재조합 세포는 숙주 세포에 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터가 도입된 것일 수 있다.
다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 적절한 숙주 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는 상기 SIRPα 변이체 또는 융합 단백질의 제조 방법을 제공한다. 상기 발현시키는 단계는 상기 폴리뉴클레오타이드 (예컨대 재조합 벡터에 포함됨)를 포함하는 재조합 세포를 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하는 것에 의하여 수행될 수 있다. 상기 제조 방법은 상기 발현시키는 단계 또는 배양하는 단계 이후에, 배양 배지로부터 상기 SIRPα 변이체 또는 융합 단백질을 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 SIRPα 변이체 또는 융합 단백질은 앞서 설명한 바와 같다.
본 명세서에서 제공되는 SIRPα 변이체 또는 융합 단백질이 재조합적으로 생산되는 경우, 정제를 위하여 통상의 시그날 펩타이드, 절단부위, tag 등이 결합된 형태일 수 있다. 따라서, 비제한적인 일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 SIRPα 변이체 또는 융합 단백질은 단백질의 재조합적 생산 과정에 통상적으로 사용 가능한 시그날 펩타이드, 절단부위, tag (예컨대, His tag, GST (glutathione-s-transferase) tag, MBP (maltose binding protein) tag 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는 형태이거나, 이들이 제거된 정제된 형태일 수 있다.
용어 "벡터 (vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자 (DNA 또는 RNA)를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 바이러스 벡터 등을 예시할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 벡터는 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 (AAV), 뮤린 백혈병 바이러스 벡터, SFG 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 엡스타인 바르 바이러스 벡터, 파포바바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 단순 포진 바이러스 벡터 등으로 이루어진 군에서 선택된 바이러스 벡터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 재조합 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pBR 시리즈, pUC 시리즈, pBluescriptII 시리즈, pGEM 시리즈, pGEX 시리즈, pTZ 시리즈, pCL, pcDNA 시리즈, pET 시리즈 등; 보다 구체적으로, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pcDNA3.1, pcDNA3.3 등 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 재조합 벡터에서 상기 핵산 분자는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된 (operatively linked)"은 뉴클레오타이드 발현 조절 서열 (예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 "작동 가능하게 연결 (operatively linked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ 프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, HSV의 tk 프로모터 등)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
상기 재조합 세포는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110 등의 대장균, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모 (Saccharomyces cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO (Chinese hamster ovary) 세포 (예컨대, CHO K1, CHO DG44, CHO-S, CHO DXB11, CHO GS-KO), HEK293, Vero, PER.C6, W138, BHK, COS-7, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 핵산 분자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반 (도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
의약 용도
본 명세서에서 제공되는 SIRPα 변이체 및/또는 융합 단백질은, CD47에 대한 결합력이 우수하고, SIRPα와 CD47 간의 결합 억제, 대식 세포의 대식 작용 증진 및/또는 면역 반응 증진 효과를 가질 수 있고, 우수한 항암 효과를 가질 수 있다.
다른 예는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 CD47-SIRPα 간의 결합 억제 및/또는 면역 증진을 위한 약학적 조성물을 제공한다: (1) 상기 SIRPα 변이체, (2) 상기 융합 단백질, (3) 상기 SIRPα 변이체 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, (4) 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 (5) 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
다른 예는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 약학적 유효량을 CD47-SIRPα 간의 결합 억제 및/또는 면역 증진이 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, CD47-SIRPα 간의 결합 억제 및/또는 면역 증진 방법을 제공한다: (1) 상기 SIRPα 변이체, (2) 상기 융합 단백질, (3) 상기 SIRPα 변이체 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, (4) 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 (5) 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
다른 예는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 CD47-SIRPα 간의 결합 억제 및/또는 면역 증진을 위한 용도 또는 CD47-SIRPα 간의 결합 억제 및/또는 면역 증진을 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 용도를 제공한다: (1) 상기 SIRPα 변이체, (2) 상기 융합 단백질, (3) 상기 SIRPα 변이체 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, (4) 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 (5) 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
상기 면역 증진용 약학적 조성물의 면역 증진은 CD47-SIRPα 간의 결합 억제 및/또는 대식 세포의 대식 작용 활성화에 의한 것일 수 있다.
다른 예는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다: (1) 상기 SIRPα 변이체, (2) 상기 융합 단백질, (3) 상기 SIRPα 변이체 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, (4) 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 (5) 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
다른 예는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 약학적 유효량을 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료가 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다: (1) 상기 SIRPα 변이체, (2) 상기 융합 단백질, (3) 상기 SIRPα 변이체 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, (4) 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 (5) 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
다른 예는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 용도 또는 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 용도를 제공한다: (1) 상기 SIRPα 변이체, (2) 상기 융합 단백질, (3) 상기 SIRPα 변이체 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, (4) 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 (5) 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
상기 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료는 CD47-SIRPα 간의 결합 억제 및/또는 대식 세포의 대식 작용 활성화 및/또는 면역 반응 증진에 의한 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 면역 관련 질병은 암일 수 있다.
다른 예는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 암의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다: (1) 상기 SIRPα 변이체, (2) 상기 융합 단백질, (3) 상기 SIRPα 변이체 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, (4) 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 (5) 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
다른 예는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 약학적 유효량을 암의 예방 및/또는 치료가 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다: (1) 상기 SIRPα 변이체, (2) 상기 융합 단백질, (3) 상기 SIRPα 변이체 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, (4) 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 (5) 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
다른 예는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 암의 예방 및/또는 치료를 위한 용도 또는 암의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 용도를 제공한다: (1) 상기 SIRPα 변이체, (2) 상기 융합 단백질, (3) 상기 SIRPα 변이체 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, (4) 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 (5) 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
본 명세서에서 제공되는 약학 조성물은, 유효성분 (SIRPα 변이체 및/또는 융합 단백질)에 더하여, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 또한 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물 또는 유효성분 (SIRPα 변이체 및/또는 융합 단백질)의 유효량은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 또는 병변부위 국소 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포 (예컨대, 암세포)로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 SIRPα 변이체 및/또는 융합 단백질은 약학적 유효량으로 상기 약학 조성물 내에 포함되거나 환자에게 투여될 수 있다. 본 명세서에서 “약학적 유효량”은 상기 유효성분 (SIRPα 변이체 및/또는 융합 단백질)이 목적하는 효과 (예컨대, 항암효과)를 발휘할 수 있는 유효성분의 양을 의미할 수 있다. 상기 약학적 유효량은 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 배설 속도, 반응 감응성, 제제화 방법, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 투여 방식 등의 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 상기 유효성분의 1회 투여량은 0.005 μg/kg 내지 1000 mg/kg, 0.005 μg/kg 내지 500 mg/kg, 0.005 μg/kg 내지 250 mg/kg, 0.005 μg/kg 내지 100 mg/kg, 0.005 μg/kg 내지 75 mg/kg, 0.005 μg/kg 내지 50 mg/kg, 0.01 μg/kg 내지 1000 mg/kg, 0.01 μg/kg 내지 500 mg/kg, 0.01 μg/kg 내지 250 mg/kg, 0.01 μg/kg 내지 100 mg/kg, 0.01 μg/kg 내지 75 mg/kg, 0.01 μg/kg 내지 50 mg/kg, 0.05 μg/kg 내지 1000 mg/kg, 0.05 μg/kg 내지 500 mg/kg, 0.05 μg/kg 내지 250 mg/kg, 0.05 μg/kg 내지 100 mg/kg, 0.05 μg/kg 내지 75 mg/kg, 또는 0.05 μg/kg 내지 50 mg/kg 범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1회 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
상기 약학 조성물은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 주사제, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 조성물 및/또는 방법의 적용 대상은 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등을 포함하는 포유류일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 조성물 및/또는 방법의 예방 및/또는 치료 대상 암 (종양을 포함)은 고형암 또는 혈액암일 수 있으며, 이에 제한되지 않지만, 유방암, 폐암, 전립선암, 난소암, 뇌암 (예를 들어, 뇌수막종 (meningioma), 성상세포종 (astrocytoma), 교모세포종 (glioblastoma), 수모세포종 (medulloblastoma) 등), 간암, 대장암, 결장암, 결장직장암, 직장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁암, 신장암, 콩팥모세포종, 피부암, 구강 편평 상피암, 표피암, 비인두암, 두경부암, 골암, 식도암, 방광암, 림프관암 (예를 들어, 호지킨 림프종 또는 비-호지킨 림프종), 위암, 췌장암, 고환암, 갑상선암, 갑상샘소포암, 흑색종, 골수종, 다발성 골수종, 중피종, 골육종, 골수이형성 증후군, 간엽 기원의 종양, 연조직 육종, 지방육종, 위장 기질 육종, 악성 말초 신경집 종양 (MPNST), 유잉 육종, 평활근육종, 간엽 연골육종, 림포육종, 섬유육종, 횡문근육종, 기형암종, 신경모세포종, 수모 세포종, 신경교종, 피부의 양성 종양, 백혈병 등을 예시할 수 있다. 폐암은, 예를 들어 소세포폐암종 (SCLC) 또는 비-소세포폐암종 (NSCLC)일 수 있다. 백혈병은, 예를 들어 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 림프구성 백혈병 (ALL) 또는 만성 림프구성 백혈병 (CLL)일 수 있다. 상기 암은 원발성 암 또는 전이성 암일 수 있다.
본 명세서에서 암 및/또는 종양의 치료 또는 항암 활성은 암세포 및/또는 종양세포의 증식 저해, 사멸, 전이 억제 등과 같이 암 및/또는 종양의 증상의 악화를 방지하거나 완화 또는 호전시키거나, 암 및/또는 종양을 부분적 또는 전부 소멸시키는 모든 항암 및/또는 항종양 작용을 의미하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 SIRPα 변이체 및/또는 이를 포함하는 융합 단백질은 CD47에 대한 결합력이 우수하여, SIRPα와 CD47 간의 결합을 억제 및/또는 대식 세포의 대식 작용 증진활성을 가지고, 우수한 면역 반응 증진, 및/또는 항암 효과를 발휘할 수 있어서, 면역 항암제와 같은 의약 분야에 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질들에 대한 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 2는 SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질들의 인간 CD47에 대한 결합 친화도를 ELISA로 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질들의 인간 종양 세포에 대한 ADCP (Antibody-dependent cellular phagocytosis) 활성을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질들의 인간 종양 세포 에 대한 ADCC (Antibody-dependent cellular cytotoxicity) 활성을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질들의 인간 CD47에 대한 결합 친화도를 ELISA로 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질들의 인간 종양 세포에 대한 ADCP (Antibody-dependent cellular phagocytosis) 활성을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질들의 인간 종양 세포 에 대한 ADCC (Antibody-dependent cellular cytotoxicity) 활성을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. SIRPα 변이체 및 이를 포함하는 융합 단백질의 제작
1.1. SIRPα 변이체 서열 탐색
인간 SIRPα 단백질 (GenBank Accession No. AAH38510.1; BC038510.2에 의하여 코딩됨)의 각 아미노산 잔기를 다양한 아미노산으로 치환한 변이들 중에서, CD47-SIRPα 복합체 구조 형성에 영향이 없으면서 CD47과의 결합을 증가시킬 것으로 예측되는 변이를 선별하고, 이를 토대로 SIRPα 변이체를 도출하였다(표 4 참조). 또한, 상기 선별된 SIRPα 변이체와 융합 가능한 힌지 및 Fc (인간 IgG1 Fc)의 아미노산 서열을 표 5에 예시하고, 상기 SIRPα 변이체와 힌지를 포함하는 Fc와 융합된 SIRPα-Fc 융합 단백질 (“SOM”으로 표시함)의 아미노산 서열을 표 6에, 이의 코딩 DNA 서열을 표 7에 각각 기재하였다:
| 아미노산 서열 (N→C) | 서열번호 | 코딩 핵산 서열번호 | |
| Wild-type SIRPα | MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSFTCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHSTAKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVPPTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVSRTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVEHDGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIVVGVVCTLLVALLMAALYLVRIRQKKAQGSTSSTRLHEPEKNAREITQDTNDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSPQPASEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQVPRK | 1 | 25 |
| Wild-type SIRPα V2 domain (1-118 a.a) | EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS | 2 | 26 |
| Wild-type SIRPα V2 domain 단편 (2-116 a.a) | EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAK | 3 | 27 |
| Variant 1: SIRPα V2 domain 단편 (2-116 a.a)의 N80D 변이체 | EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISDITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAK | 4 | 28 |
| Variant 2: SIRPα V2 domain 단편 (2-116 a.a)의 H56R, N80D 변이체 | EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGRFPRVTTVSESTKRENMDFSISISDITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAK | 5 | 29 |
| Variant 3: SIRPα V2 domain 단편 (2-116 a.a)의 H56K, N80D 변이체 | EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGKFPRVTTVSESTKRENMDFSISISDITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAK | 6 | 30 |
| Variant 4: SIRPα V2 domain 단편 (2-116 a.a)의 I31K, N80D 변이체 | EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLKPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISDITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAK | 7 | 31 |
| Variant 5: SIRPα V2 domain 단편 (2-116 a.a)의 I31Y, N80D 변이체 | EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLYPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISDITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAK | 8 | 32 |
| Variant 6: SIRPα V2 domain 단편 (2-116 a.a)의 I31K, H56R, N80D 변이체 | EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLKPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGRFPRVTTVSESTKRENMDFSISISDITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAK | 9 | 33 |
| Variant 7: SIRPα V2 domain 단편 (2-116 a.a)의 I31K, H56K, N80D 변이체 | EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLKPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGKFPRVTTVSESTKRENMDFSISISDITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAK | 10 | 34 |
| Variant 8: SIRPα V2 domain 단편 (2-116 a.a)의 I31Y, H56R, N80D 변이체 | EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLYPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGRFPRVTTVSESTKRENMDFSISISDITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAK | 11 | 35 |
| Variant 9: SIRPα V2 domain 단편 (2-116 a.a)의 I31Y, H56K, N80D 변이체 | EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLYPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGKFPRVTTVSESTKRENMDFSISISDITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAK | 12 | 36 |
(표 4에서, H56R은 Wild-type SIRPα V2 도메인 (1-118 a.a) (서열번호 2)를 기준으로 N-말단으로부터 56번째 아미노산 잔기인 H가 R로 치환된 아미노산 치환 변이를 의미함, 다른 아미노한 치환 변이도 동일한 방식으로 해석됨)
| 아미노산 서열 (N→C) | 서열번호 | 코딩 핵산 서열번호 | |
| 힌지 (Hinge) | DKTHTCPPCP | 13 | 37 |
| IgG1 Fc | APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 14 | 38 |
| 융합 단백질 | SIRPα 변이 | 아미노산 서열 (N→C) | 서열번호 |
| SOM1 | - | EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 15 |
| SOM2 | Variant 1 | EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISDITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 16 |
| SOM3 | Variant 2 | EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGRFPRVTTVSESTKRENMDFSISISDITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 17 |
| SOM4 | Variant 3 | EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGKFPRVTTVSESTKRENMDFSISISDITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 18 |
| SOM5 | Variant 4 | EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLKPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISDITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 19 |
| SOM6 | Variant 5 | EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLYPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISDITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 20 |
| SOM7 | Variant 6 | EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLKPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGRFPRVTTVSESTKRENMDFSISISDITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 21 |
| SOM8 | Variant 7 | EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLKPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGKFPRVTTVSESTKRENMDFSISISDITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 22 |
| SOM9 | Variant 8 | EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLYPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGRFPRVTTVSESTKRENMDFSISISDITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 23 |
| SOM10 | Variant 9 | EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLYPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGKFPRVTTVSESTKRENMDFSISISDITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 24 |
| 융합 단백질 | 서열번호 |
| SOM1 | 39 |
| SOM2 | 40 |
| SOM3 | 41 |
| SOM4 | 42 |
| SOM5 | 43 |
| SOM6 | 44 |
| SOM7 | 45 |
| SOM8 | 46 |
| SOM9 | 47 |
| SOM10 | 48 |
1.2. SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질의 제조
1.2.1. SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질의 발현을 위한 유전자 클로닝
㈜마크로젠사에 의뢰하여 표 6의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열 (ExpiCHO 세포에서의 발현을 위한 코돈 최적화된 서열임)을 합성하고, 상기 핵산 서열을 제한효소 ClaI, XhoI를 이용하여 클로닝한 pcDNA 3.3 (Invitrogen) 발현 벡터를 준비하고, 이를 ExpiCHO 세포 (ExpiCHO-S™ cells, Thermo Fisher, Cat# A29127)에 도입하여, 표 6의 SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질을 발현시켰다.
1.2.2. ExpiCHO 세포에서의 SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질의 발현
SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질을 발현시키기 위해, ExpiCHO 임시발현 시스템을 이용하였다. ExpiCHO 세포 (ExpiCHO-S™ cells, Thermo Fisher, Cat# A29127)를 3일마다 계대 배양하면서 0.2x106 ~ 0.3x106 viable cells/mL의 early log-phage 상태로 유지하였다. Transfection 전날 3x106 ~ 4x106 cells/mL (viable cells/mL)로 split 하여 계대 배양하였다. 계대 배양한 세포의 수가 7x106 ~ 10x106 viable cells/mL이며 95% 이상의 viability를 가지는지 측정하였다. Pre-warmed된 fresh ExpiCHOTM expression medium (Gibco, Cat# A29100-01)에 6x106 viable cells/mL로 희석한 후, 35 mL 생산 기준으로 아래의 20 μg DNA 를 cold OptiPro SFM (Gibco, Cat# 12309-050) 1 mL에 첨가하였다. OptiPro SFM medium 0.92 mL에 ExpiFectamineTM CHO Reagent (Gibco, Cat# A29129) 80 μL 첨가한 뒤, DNA 와 희석된 ExpiFectamineTM CHO Reagent 을 혼합하여 상온에서 5분 동안 놓아둔 후 세포에 첨가하였다. 37℃, 8% CO2 조건 하에서 125 rpm 으로 shaking 하면서 1 일간 배양하였다. 1 일 배양 후 Enhancer 150 μL와 Feed 4 mL을 배양액에 첨가하고 난 다음 32℃, 5% CO2 조건 하에서 125 rpm 으로 4일간 배양하였다. 4일 배양 이후 Feed 4 mL을 추가적으로 배양액에 첨가 후 6 일간 추가 배양하였으며 viability가 70% 일 때 배양한 ExpiCHO cells을 회수하였다.
1.2.3. SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질의 정제
SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질 (발현된 융합 단백질은 힌지 부분에서 이합체화된 호모다이머 형태로 존재함)을 정제하기 위해 해당 배양액을 4℃에서 4,800 rpm 으로 30분간 원심분리 하였다. 배양 상등액은 0.22 μm filter (Millipore)로 여과하여 회수하였다. 정제 시스템은 AKTA Go (Cytiva)를 사용하였고, 3 mL의 Protein A resin (KANEKA, Cat# KPA02-B500)을 충전한 후 DPBS 완충액을 이용하여 1 mL/min 유속으로 30분간 컬럼을 평형화 하였다. 회수한 배양액은 Protein A 친화 크로마토그래피 컬럼에 0.5 mL/min 유속으로 로딩하였다. DPBS 완충액을 이용하여 1 mL/min 유속으로 1시간 동안 칼럼을 세척한 후, 0.1 M glycine, pH 3.3 완충액으로 단백질을 각각 용출하였고 용출된 분획을 분석하였다. 고순도의 SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질이 존재하는 부분을 모은 다음 최종 완충액 DPBS로 4℃에서 밤새 투석하였다. 투석이 끝난 후 50,000 MW 컷오프 원심분리 필터를 사용하여, 3000 rpm, 4℃에서 농축하였다. SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질 농도는 UV 정량분석으로 측정하였다.
1.2.4. SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질의 SEC-HPLC 분석
HPLC system (Thermo, Ultimate 3000)의 pump A에 전개용매를 연결 후 시스템을 구동하였다. 전개용매로 교환한 후 SEC column (Sepax, SRT-C SEC 300, 7.8x300 mm 5 μm, 300 Å)을 연결하였다. 컬럼 안정화를 시키기 위해 1 ml/min의 속력으로 1시간 동안 가동하여 안정화하였다. 크로마토그램에서 베이스라인이 안정화가 되었는지 확인하며 전개 용매를 흘려 주었다. 분석할 단백질을 0.22 μm 필터로 필터 후 20 μg 샘플을 Injection하여 단백질의 순도를 SEC-HPLC로 분석한 결과를 표 8에 나타내었다:
| 융합단백질 | Purity (%) |
| SOM1 | 87.5 |
| SOM2 | 90.8 |
| SOM3 | 93.5 |
| SOM4 | 95.4 |
| SOM5 | 95.1 |
| SOM6 | 91.7 |
| SOM7 | 97.6 |
| SOM8 | 97.7 |
| SOM9 | 93.3 |
| SOM10 | 94.7 |
실시예 2. SIRPα deglycosylation (N80D mutation)에 의한 효과
2.1. SIRPα의 deglycosylation 변이에 의한 효과 (SDS-PAGE 분석)
정제된 SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질의 순도를 확인하기 위해 환원 및 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE를 수행하였다. 상기 실시예 1.2.3에서 정제된 SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질들 각각 3 μg을 비환원성 샘플완충액 (60 mM Tris HCl, 25% Glycerol, 2% SDS, 0.1% bromophenol blue) 및 환원성 샘플완충액 (60 mM Tris HCl, 25% Glycerol, 2% SDS, 0.1% bromophenol blue, 14.4 mM β-mercaptoethanol)과 혼합하고 70°C에서 5분간 가열하였다. 변성된 단백질을 SDS-PAGE 겔에 (GenScript, ExpressPlus™ PAGE Gels, 4 ~ 20%, Cat# M42010) 로딩하여 90V에서 140분간 전기영동을 진행한 후, 겔 상의 단백질을 시각화하기 위해 Comassie blue 용액으로 염색하였다. 얻어진 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타난 바와 같이, SOM1은 2개의 밴드가 나타난 반면, SOM2 내지 SOM10은 1개의 밴드만 나타났다. 이로부터 SIRPα의 deglycosylation (N80D mutation)이 단백질의 물성 개선에 기여함을 확인하였다.
2.2. SIRPα의 deglycosylation 변이에 의한 효과 (CE-SDS 분석)
SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질의 순도를 LabChip GXII (PerkinElmer)을 활용한 CE-SDS로 분석하였다. 상기 실시예 1.2.3에서 정제된 SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질은 제조사의 가이드에 따라 HT Protein Express Reagent Kit (PerkinElmer, Cat# CLS960008)을 이용하여 준비하였으며, 얻어진 결과는 LabChip GX Software를 이용하여 분석하였다. 분석 결과를 표 9에 나타내었다.
| 융합 단백질 | Purity (%) | |
| 비환원 | 환원 | |
| SOM1 | 38.0 | 60.5 |
| SOM2 | 94.8 | 94.5 |
| SOM3 | 96.6 | 95.7 |
| SOM4 | 96.5 | 94.0 |
| SOM5 | 96.4 | 88.4 |
| SOM6 | 96.5 | 95.8 |
| SOM7 | 97.9 | 95.6 |
| SOM8 | 98.4 | 97.5 |
| SOM9 | 95.3 | 93.7 |
| SOM10 | 97.5 | 96.5 |
표 9에 나타난 바와 같이, SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질 중에서 SIRPα의 deglycosylation (N80D mutation) 변이를 포함하는 융합 단백질(SOM2 내지 SOM10)은, SOM1 대비, 비환원 조건과 환원 조건 모두에서 순도가 보다 개선됨을 확인하였다.
실시예 3. SIRPα의 특정 mutation에 의한 활성 개선 확인
3.1 SIRPα의 특정 mutation에 의한 인간 CD47에 대한 결합력 개선 효과 확인
3.1.1 인간 CD47에 대한 결합력 평가 (ELISA 분석)
SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질의 인간 CD47 단백질에 대한 결합력을 확인하기 위해 ELISA 분석을 수행하였다.
보다 구체적으로, 인간 CD47 단백질(Accession # NP_942088.1)을 50 ng/100 μL/well씩 96웰 플레이트 (Nunc, Cat# 469949)에 분주하고 4°C 에서 16시간 코팅하였다. 워싱 버퍼 (PBST)로 3번 세척 후 블록킹 버퍼 (3% BSA가 포함된 PBST)를 각 웰당 200 μL씩 넣어 상온에서 2시간동안 반응시켰다. 워싱 버퍼로 3번 세척 후 농도별로 희석한 SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질을 100 μL/well을 넣고 상온에서 2시간동안 반응시켰다. 이후 워싱 버퍼로 3번 세척 후, HRP가 결합된 항 human IgG1 항체 (Jackson IR, Cat# 109-035-098)를 처리하고 상온에서 1시간 반응시켰다. 마지막으로 워싱 버퍼로 3번 세척 후, TMB 용액 (Bio-rad, Cat# 172-1066) 100 μL를 넣어 5분간 발색시켰다. 2 N H2SO4 100 μL를 넣어 반응을 정지하였고, 450 nm/595 nm에서 흡광도를 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 도 2 및 표 10에 나타내었다:
| 융합 단백질 | EC50 (nM) |
| SOM1 | 0.115 |
| SOM2 | 0.148 |
| SOM3 | 0.022 |
| SOM4 | 0.032 |
| SOM5 | 0.023 |
| SOM6 | 0.022 |
| SOM7 | 0.015 |
| SOM8 | 0.018 |
| SOM9 | 0.017 |
| SOM10 | 0.018 |
표 10에 나타난 바와 같이, 특정 SIRPα 변이 (H56R, H56K, I31K, 및/또는 I31Y)를 가진 SIRPα 변이체를 포함하는 8종 융합 단백질들, 즉, SOM3, SOM4, SOM5, SOM6, SOM7, SOM8, SOM9, 및 SOM10은 SOM1 및 SOM2 대비 인간 CD47에 대한 결합 친화도가 개선되는 것을 확인하였다.
3.1.2. 인간 CD47에 대한 결합력 평가 (SPR 분석)
SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질의 인간 CD47 단백질에 대한 결합력을 BIACORE T200 (Cytiva)을 사용하여 수행하였다. 표면 플라즈몬 공명 (surface plasmon resonance, SPR) 을 이용한 실험 조건은 다음과 같다. 각각의 SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질이 고정화된 CM5 chip (GE Healthcare, Cat# BR100530)을 사용하였으며, Regeneration buffer는 20 mM NaOH, Running buffer와 항체 희석, 항원 희석 완충액으로는 HBS-EP, pH 7.4 (GE Healthcare, Cat# BR100669)를 사용하였다. 인간 CD47 단백질 (Novoprotein, Cat# C321)은 100 nM부터 2배씩 순차적으로 희석하여, 0 nM 포함 총 9개 농도에서 분석하였다. 인간 CD47 단백질의 association phase에서는 association time을 300초, flow rate를 30 μL/min으로 하였으며, dissociation phase에서는 dissociation time을 300초, flow rate를 30 μL/min으로 하였다. Regeneration phase에서는 flow rate를 100 μL/min로 하여, flow time을 30초로 설정하였다. 분석프로그램은 BIACORE Evaluation software를 사용하였으며, 1:1 binding model을 이용하여 fitting 하였다.
상기 얻어진 결과를 표 11에 나타내었다.
| KD (M) | ka (1/Ms) | kd (1/s) | |
| SOM1 | 3.162 x 10-8 | 2.303 x 105 | 7.282 x 10-3 |
| SOM2 | 2.790 x 10-8 | 2.526 x 105 | 7.046 x 10-3 |
| SOM3 | 8.912 x 10-9 | 2.892 x 105 | 2.577 x 10-3 |
| SOM9 | 3.264 x 10-9 | 1.599 x 105 | 5.218 x 10-4 |
| SOM10 | 5.119 x 10-9 | 1.718 x 105 | 8.796 x 10-4 |
표 11에서와 같이, 시험된 5종 융합 단백질 중에서, SOM1 및 SOM2 대비, SOM3, SOM9, 및 SOM10의 CD47에 대한 결합력 (KD)이 크게 개선되었음을 확인하였다.
실시예 4. SIRPα의 특정 mutation에 의한 인간 CD47 발현 종양세포에 대한 ADCP 활성 확인
SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질의 FcγRIIa-H 신호전달에 의한 종양 세포의 항체 의존성 세포매개 식작용 (ADCP, Antibody-dependent cellular phagocytosis)을 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 본 시험은 FcγRIIa-H ADCP Bioassay kit (Promega, Cat# G9996)를 활용하였으며, 제조사에서 권고한 프로토콜에 근거하여 실시하였다. 표적 세포로서, 인간 유래 유방암 세포인 MDA-MB-231 세포주 (ATCC, Cat# HTB-26)를 96웰 분석 플레이트에 각 웰 당 10,000개씩 분주하여 16시간 동안 37℃ CO2 인큐베이터에 배양하였다. 표적세포의 배양 배지를 상기 키트에 포함된 4%의 low IgG serum이 첨가된 RPMI1640 배지로 교체 한 후, 1000 nM 부터 3배씩 총 10개 구간으로 희석한 SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질을 표적세포에 처리하여 15분간 반응시켰다. 효능세포인 FcγRIIa-H effector 세포를 종양 세포 (상기 준비된 MDA-MB-231 세포)와 약 5:1의 비율이 되도록 분주하여 37°C CO2 인큐베이터에서 6시간 동안 배양한 후, Bio-GloTM 시약을 각 웰에 75 μL씩 분주하여 10분간 상온에서 반응시켰다. 발광 (Luminescence) 측정이 가능한 마이크로플레이트리더 (Molecular Devices, SpectraMax L)로 반응값 (RLU, relative light unit)을 측정하여 ADCP 효능을 평가하였다.
상기 얻어진 결과를 도 3 및 표 12에 나타내었다:
| 융합단백질 | EC50 (nM) | Fold increase (SOM1 대비) |
| SOM1 | 3.46 | 1.00 |
| SOM2 | 4.07 | 0.85 |
| SOM3 | 2.28 | 1.52 |
| SOM4 | 2.34 | 1.48 |
| SOM5 | 2.73 | 1.27 |
| SOM6 | 2.53 | 1.37 |
| SOM7 | 1.85 | 1.87 |
| SOM8 | 1.80 | 1.92 |
| SOM9 | 2.28 | 1.52 |
| SOM10 | 1.62 | 2.14 |
도 3 및 표 12에 나타난 바와 같이, SOM1과 SOM2를 비교하였을 때 SIRPα deglycosylation은 ADCP 활성에 영향을 미치지 않으며, SOM2와 비교하여, SOM3, SOM4, SOM5, SOM6, SOM7, SOM8, SOM9, 및 SOM10 모두 ADCP 활성이 개선됨을 확인하였다.
실시예 5. SIRPα의 특정 mutation에 의한 인간 CD47 발현 종양세포에 대한 ADCC 활성 확인
SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질의 FcγRIIIa 신호전달에 의한 종양 세포의 항체 의존성 세포매개 세포사멸 (ADCC, Antibody-dependent cellular cytotoxicity)을 평가하기 위해 상기 실험을 수행하였다. 해당 시험은 Promega사의 FcγRIIIa ADCC Bioassay kit (Promega, Cat# G7018)를 활용하였으며, 제조사에서 권고한 수행법에 근거하여 실시하였다. 표적 세포로서, 인간 유래 유방암 세포인 MDA-MB-231 세포를 96웰 플레이트에 각 웰당 10,000 세포씩 분주하고 16시간동안 37℃ CO2 인큐베이터에 배양하였다. 96웰 플레이트의 배지를 제거하고 4%의 low IgG serum을 포함하는 RPMI1640 배지를 25 μL씩 분주하였다. SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질을 300 nM부터 5배 연속 희석하여 시료를 준비하였고, 96웰 플레이트에 희석된 시료를 25 μL씩 분주한 뒤 37℃ 인큐베이터에서 15분 동안 반응시켰다. ADCC (FcγRIIIa) effector 세포를 1x106 cells/mL의 농도로 준비하고 인큐베이터에서 96웰 플레이트를 꺼내어 각 웰마다 25 μL씩 분주하였다. 최종적으로 SIRPα 변이체를 포함하는 융합 단백질은 100 nM부터 5배 연속 희석되어 처리되었으며, 96웰 플레이트를 다시 37℃ CO2 인큐베이터에 6시간 동안 반응시켰다. 96웰 플레이트를 상온으로 꺼내고 Bio-Glo 시약을 처리하여 10분간 정치하고, 발광 (Luminescence) 측정이 가능한 마이크로플레이트리더 (Molecular Devices, SpectraMax L)로 반응값 (RLU, relative light unit)을 측정하여 ADCC 효능을 평가하였다.
상기 얻어진 결과를 도 4 및 표 13에 나타내었다:
| EC50 (nM) | Fold increase (SOM1 대비) | |
| SOM1 | 0.16 | 1.00 |
| SOM2 | 0.28 | 0.57 |
| SOM3 | 0.05 | 3.20 |
| SOM4 | 0.07 | 2.29 |
| SOM5 | 0.03 | 5.33 |
| SOM6 | 0.04 | 4.00 |
| SOM7 | 0.02 | 8.00 |
| SOM8 | 0.02 | 8.00 |
| SOM9 | 0.02 | 8.00 |
| SOM10 | 0.03 | 5.33 |
도 4 및 표 13에 나타난 바와 같이, SOM1과 SOM2를 비교하였을 때 SIRPα deglycosylation은 ADCC 활성에 영향을 미치지 않으며, SOM2와 비교하여, SOM3, SOM4, SOM5, SOM6, SOM7, SOM8, SOM9, 및 SOM10 모두 ADCC 활성이 개선됨을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (18)
- SIRPα (Signal regulatory protein alpha) 중의 서열번호 2의 SIRPα V2 도메인을 포함하는 118개 이상의 연속하는 아미노산 또는 서열번호 3의 SIRPα V2 도메인 단편을 포함하는 115개 이상의 연속하는 아미노산으로 이루어지고,
상기 SIRPα V2 도메인 또는 SIRPα V2 도메인 단편은,
(1) 서열번호 2의 31번째 위치 또는 서열번호 3의 30번째 위치에 해당하는 아미노산,
(2) 서열번호 2의 56번째 위치 또는 서열번호 3의 55번째 위치에 해당하는 아미노산, 또는
(3) (1) 및 (2) 모두
가 다른 아미노산으로 치환된 것인,
SIRPα 변이체. - 제1항에 있어서, 상기 SIRPα V2 도메인 또는 SIRPα V2 도메인 단편은,
(1) 서열번호 2의 31번째 위치 또는 서열번호 3의 30번째 위치에 해당하는 아미노산이 타이로신 또는 라이신이거나,
(2) 서열번호 2의 56번째 위치 또는 서열번호 3의 55번째 위치에 해당하는 아미노산이 아르기닌 또는 라이신이거나, 또는
(3) (a) 서열번호 2의 31번째 위치 또는 서열번호 3의 30번째 위치에 해당하는 아미노산이 타이로신 또는 라이신이고, (b) 서열번호 2의 56번째 위치 또는 서열번호 3의 55번째 위치에 해당하는 아미노산이 아르기닌 또는 라이신인,
SIRPα 변이체. - 제1항에 있어서, 하기 변이를 더 포함하는, SIRPα 변이체:
서열번호 2의 80번째 위치 또는 서열번호 3의 79번째 위치에 해당하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환. - 제2항에 있어서, 하기 변이를 더 포함하는, SIRPα 변이체:
서열번호 2의 80번째 위치 또는 서열번호 3의 79번째 위치에 해당하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환. - 제1항에 있어서, 하기 변이를 더 포함하는, SIRPα 변이체:
서열번호 2의 80번째 위치 또는 서열번호 3의 79번째 위치에 해당하는 아미노산의 아스파르트산으로의 치환. - 제2항에 있어서, 하기 변이를 더 포함하는, SIRPα 변이체:
서열번호 2의 80번째 위치 또는 서열번호 3의 79번째 위치에 해당하는 아미노산의 아스파르트산으로의 치환. - 제6항에 있어서, 서열번호 5 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, SIRPα 변이체.
- (i) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 SIRPα 변이체; 및
(ii) 면역글로불린의 Fc 영역
을 포함하는, 융합 단백질. - 제8항에 있어서, 상기 면역글로불린의 Fc 영역은 힌지 영역을 포함하는 것인, 융합 단백질.
- 제8항에 있어서, 상기 면역글로불린의 Fc 영역은 힌지 영역을 포함하지 않는 것인, 융합 단백질.
- 다음을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드:
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 SIRPα 변이체, 또는
상기 SIRPα 변이체 및 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질. - 제11항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
- 제11항의 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는, 재조합 세포.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 SIRPα 변이체,
상기 SIRPα 변이체 및 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질,
상기 SIRPα 변이체 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드,
상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및
상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포
로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는,
암의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제14항에 있어서, 상기 암의 예방 또는 치료는 CD47-SIRPα 간의 결합 억제, 대식 세포의 대식 작용 활성화, 또는 이들 모두에 의한 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제14항에 있어서, 상기 암은 유방암, 폐암, 전립선암, 난소암, 뇌암, 간암, 대장암, 결장암, 결장직장암, 직장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁암, 신장암, 콩팥모세포종, 피부암, 구강 편평 상피암, 표피암, 비인두암, 두경부암, 골암, 식도암, 방광암, 림프관암, 위암, 췌장암, 고환암, 갑상선암, 갑상샘소포암, 흑색종, 골수종, 다발성 골수종, 중피종, 골육종, 골수이형성 증후군, 간엽 기원의 종양, 연조직 육종, 지방육종, 위장 기질 육종, 악성 말초 신경집 종양 (MPNST), 유잉 육종, 평활근육종, 간엽 연골육종, 림포육종, 섬유육종, 횡문근육종, 기형암종, 신경모세포종, 수모 세포종, 신경교종, 피부의 양성 종양, 및 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 SIRPα 변이체,
상기 SIRPα 변이체 및 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질,
상기 SIRPα 변이체 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드,
상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및
상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포
로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는,
면역 증진용 약학 조성물. - 제17항에 있어서, 상기 면역 증진은 CD47-SIRPα 간의 결합 억제, 대식 세포의 대식 작용 활성화, 또는 이들 모두에 의한 것인, 면역 증진용 약학 조성물.
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