KR20180012863A - 항체 - Google Patents

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제임스 필립 오코넬
존 로버트 포터
알라스테어 로손
다니엘 존 라이트우드
레베카 제인 우튼
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유씨비 바이오파마 에스피알엘
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Abstract

특정 화합물이 TNF에 결합하고 TNF 수용체에 결합하는 삼량체 TNF의 입체구조를 안정화시킨다는 것이 입증되었다. 이러한 화합물과 TNF 수퍼패밀리 구성원의 복합체에 선택적으로 결합하는 항체가 개시된다. 이 항체는 동일한 활성을 갖는 추가 화합물을 검출하는 데 사용될 수 있고 표적 인게이지먼트 바이오마커로서 사용될 수 있다.

Description

항체
본 발명은 TNF 수퍼패밀리(superfamily) 구성원과 함께 복합체를 형성하는 TNF 수퍼패밀리의 소분자 조절제를 스크리닝하는 데 사용될 수 있는 항체에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 이러한 복합체에 선택적으로 결합하는 항체, 및 이러한 항체의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 항체를 사용하여 TNF 수퍼패밀리의 신규 조절제를 확인하는 어세이에 관한 것이다.
종양 괴사 인자(TNF) 수퍼패밀리는 세포 생존 및 세포 사멸을 조절하는 일차적 기능을 공유하는 단백질들의 패밀리이다. TNF 수퍼패밀리의 구성원들은 "젤리 롤(jelly roll)" β-구조를 형성하는, 역평행 β-가닥을 갖는 2개의 역평행 β-주름 시트로 구성된 공통된 코어 모티프를 공유한다. TNF 수퍼패밀리의 구성원들에 의해 공유된 또 다른 공통된 특징은 동종삼량체 또는 이종삼량체 복합체의 형성이다. TNF 수퍼패밀리 구성원의 이러한 삼량체 형태가 특정 TNF 수퍼패밀리 수용체에 결합하여 이를 활성화시킨다.
TNFα는 TNF 수퍼패밀리의 전형적인 구성원이다. TNFα 생성의 이상조절은 상당히 의학적으로 중요한 다수의 병적 상태들과 관련되어 있다. 예를 들면, TNFα는 류마티스성 관절염, (크론병을 포함하는) 염증성 장 질환, 건선, 알츠하이머병(AD), 파킨슨병(PD), 통증, 간질, 골다공증, 천식, 전신 홍반성 루푸스(SLE) 및 다발성 경화증(MS)과 관련되어 있다. TNF 수퍼패밀리의 다른 구성원들도 자가면역 질환을 포함하는 병적 상태와 관련되어 있다.
TNF 수퍼패밀리 구성원의 종래의 길항제는 거대분자이고 TNF 수퍼패밀리 구성원과 이의 수용체의 결합을 억제함으로써 작용한다. 종래의 길항제의 예로는 항-TNFα 항체, 특히 단클론 항체, 예컨대, 인플릭시맙(infliximab)(레미케이드(Remicade)®), 아달리무맙(adalimumab)(휴미라(Humira)®) 및 세르톨리주맙 페골(certolizumab pegol)(심지아(Cimzia)®), 또는 가용성 TNFα 수용체 융합 단백질, 예컨대, 에타네르셉트(etanercept)(엔브렐(Enbrel)®)가 있다.
본 발명자들은 TNFα를 조절하는 소분자 물질(SME)의 클래스를 확인하였다. 이 화합물은 동종삼량체 형태의 TNFα에 결합하고 TNFα의 동종삼량체의 입체구조적 변화를 유도하고/하거나 안정화시킴으로써 작용한다. 예를 들면, TNFα의 동종삼량체는 결합된 화합물과 함께 TNFα 수용체에 결합할 수 있으나, TNFα 수용체의 신호전달 다운스트림을 더 적은 정도로 시작할 수 있거나 시작할 수 없다. 이 화합물은 TNFα에 의해 매개된 병태의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명자들은 이러한 화합물 및 TNF 수퍼패밀리 구성원을 포함하는 복합체에 선택적으로 결합하는 항체를 개발하였다. 이 항체는 이 방식으로 TNFα를 억제할 수 있는 추가 화합물을 확인하는 데 사용될 수 있고, 표적 인게이지먼트(target engagement) 바이오마커로서도 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 (i) TNF 수퍼패밀리 구성원인 삼량체 단백질 및 (ii) TNF 수퍼패밀리 구성원인 삼량체 단백질에 결합할 수 있는 화합물을 포함하는 복합체에 선택적으로 결합하는 항체로서, 화합물-삼량체 복합체는, 필요한 TNF 수퍼패밀리 수용체에 결합하고 이 수용체를 통해 상기 삼량체에 의해 유도되는 신호전달을 조절하는 것인 항체를 제공한다.
본 발명은 (i) 인간 TNFα 및 (ii) 화합물 (1) 내지 (6)으로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물, 또는 이의 염 또는 용매화물을 포함하는 복합체에 선택적으로 결합하는 항체도 제공한다.
추가로, 본 발명은
- TNFα에의 결합에 대해 본 발명의 다른 항체와 경쟁하거나 본 발명의 다른 항체와 동일한, TNFα 상의 에피토프에 결합하는 항체,
- 본 발명의 항체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드,
- 요법에 의한 인체 또는 동물체의 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 항체,
- 본 발명의 항체 및 약학적으로 허용되는 보조제 및/또는 담체를 포함하는 약학 조성물,
- 대상체로부터 얻은 샘플 중의 화합물-삼량체 복합체를 검출하기 위한 표적 인게이지먼트 바이오마커로서의 본 발명의 항체의 용도로서, 상기 항체는 검출가능하고 상기 복합체는 TNF 수퍼패밀리 구성원인 삼량체 단백질 및 TNF 수퍼패밀리 구성원인 삼량체 단백질에 결합할 수 있는 화합물을 포함하며, 화합물-삼량체 복합체는, 필요한 TNF 수퍼패밀리 수용체에 결합하고 이 수용체를 통해 삼량체에 의해 유도되는 신호전달을 조절하는 것인 용도,
- (a) 화합물을 투여받은 대상체로부터 샘플을 얻는 단계;
(b) 검출 가능한 본 발명의 항체를 상기 샘플 및 대조군 샘플과 접촉시키는 단계; 및
(c) 상기 검출 가능한 항체와 상기 샘플 및 상기 대조군 샘플의 결합의 양을 측정하는 단계
를 포함하는, 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원에 대한 화합물의 표적 인게이지먼트를 검출하는 방법으로서, 화합물-삼량체 복합체는, 필요한 수용체에 결합하고 이 수용체를 통해 삼량체에 의해 유도되는 신호전달을 조절하고, 상기 검출 가능한 항체와 상기 대조군 샘플의 결합보다 더 큰, 상기 검출 가능한 항체와 상기 샘플의 결합은, 상기 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원에 대한 상기 화합물의 표적 인게이지먼트를 나타내는 것인 방법,
- 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원의 입체구조적 변화를 유발하는 화합물을 스크리닝하는 데 있어서의 본 발명의 항체의 용도로서, 상기 입체구조적 변화는 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원의 결합 시 필요한 TNF 수퍼패밀리 수용체의 신호전달을 조절하는 것인 용도,
- TNF 수퍼패밀리 구성원인 삼량체 단백질 및 이에 결합된 화합물을 포함하고 1 nM 이하의 KD-ab로 본 발명의 항체에 결합하는 복합체로서, 화합물-삼량체 복합체는, 필요한 TNF 수퍼패밀리 수용체에 결합하고 이 수용체를 통해 삼량체에 의해 유도되는 신호전달을 조절하는 것인 복합체,
- TNFR1에 결합할 수 있고 1 nM 이하의 KD-ab로 하기 항체들 중 어느 하나 또는 둘 다에 결합하는 TNFα 삼량체로서, 상기 결합된 TNFR1로부터의 신호전달이 약화되거나 길항되는 것인 TNFα 삼량체:
(i) 서열번호 27의 중쇄 및 서열번호 26의 경쇄를 갖는 항체; 또는
(ii) 서열번호 12의 중쇄 및 서열번호 11의 경쇄를 갖는 항체,
- TNF 수퍼패밀리 구성원인 삼량체 단백질에 결합하여 복합체를 형성할 수 있는 화합물로서, 화합물-삼량체 복합체는, 필요한 TNF 수퍼패밀리 수용체에 결합하고 이 수용체를 통해 삼량체에 의해 유도되는 신호전달을 조절하고 화합물-삼량체 복합체는 1 nM 이하의 KD-ab로 본 발명의 항체에 결합하는 것인 화합물,
- 인체 또는 동물체에 대해 실시되는 요법에 사용하기 위한, 상기 정의된 복합체, 상기 정의된 삼량체 또는 상기 정의된 화합물, 및
- (a) TNF 수퍼패밀리 구성원인 삼량체 단백질 및 테스트 화합물을 포함하는 테스트 화합물-삼량체 복합체가 상기 복합체에 선택적으로 결합하는 항체에 대해 나타내는 결합 친화성을 측정하기 위해 결합 어세이를 수행하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 측정된 결합 친화성을, 단계 (a)에서 언급된 항체에 고친화성으로 결합하는 것으로 알려진 상이한 화합물-삼량체 복합체의 결합 친화성과 비교하는 단계; 및
(c) 단계 (b)에서 언급된 비교에 비추어 고려할 때 측정된 결합 친화성이 허용 가능한 경우 단계 (a)의 화합물-삼량체 복합체에 존재하는 화합물을 선택하는 단계
를 포함하는, TNF 수퍼패밀리 구성원인 삼량체 단백질에 결합하고 수용체를 통한 삼량체 단백질의 신호전달을 조절할 수 있는 화합물을 확인하는 방법
을 제공한다.
도 1은 인간 TNFα의 결정 구조 상의 잔기 N168, I194, F220 및 A221을 강조한다.
도 2는 CA185_01974 mFab 및 화합물 (1)을 사용한 HPLC 실험의 결과를 보여준다. 과량의 Fab에 상응하는 피크는 1.5배 및 2.0배 과량에서 나타난다. 따라서, 화학량론은 1 Fab : 1 TNFα 삼량체인 것으로 확인되었다.
도 3은 CA185_01979 mFab 및 화합물 (1)을 사용한 HPLC 실험의 결과를 보여준다. 마찬가지로, 과량의 Fab에 상응하는 피크는 1.5배 및 2.0배 과량에서 나타난다. 따라서, 화학량론도 1 Fab : 1 TNFα 삼량체인 것으로 확인되었다.
도 4는 시판되는 항-TNFα 다클론 항체를 화합물 (3), (4) 및 (5)와 함께 사용한 총 TNFα ELISA의 결과를 제공한다.
도 5는 CA185_01974.0 및 화합물 (3), (4) 및 (5)를 사용한 입체구조 특이적 TNFα ELISA의 결과를 제공한다. Apo TNFα는 이 어세이에서 신호를 제공하지 않았는데, 이것은 항체 CA185_01974와 화합물에 결합된 TNFα의 결합의 특이적 성질을 입증한다.
도 6은 1 및 10 ㎍/㎖의 CA185_01974 및 CA185_01979에 의한 염색의 FACS 막대그래프 도표를 보여준다. 이 도표는 항체가 화합물 (1)과 함께 사전 인큐베이션된 TNFα만을 인식한다는 것을 입증한다. DMSO 대조군에 의한 염색은 없다.
도 7은 모 NS0 세포주 및 막 TNFα를 과발현하는 조작된 NS0 세포주에 대한 CA185_01974에 의한 염색의 FACS 막대그래프 도표를 보여준다. 세포를 화합물 (1) 또는 DMSO와 함께 인큐베이션하고 항체 Fab 단편으로 염색하였다. 마찬가지로, 결과는 (모 또는 조작된 세포주의 경우) DMSO 대조군에 의한 염색이 없음을 나타낸다. 그러나, 화합물 (1)의 존재 하에서, 조작된 세포주의 경우 염색이 관찰된다.
도 8은 사이노몰구스(cynomolgus) TNFα를 사용하여 CA185_01974에 대한 친화성 값을 측정한 것에 대한 센소그램을 보여준다. 대조군(상부 패널)은 사이노몰구스 TNFα 및 DMSO를 함유하였다. 그 다음, 하부 패널은 화합물 (4)와 함께 복합체를 형성한 사이노몰구스 TNFα에 대한 중복된 실험을 제공한다.
도 9는 인간 TNFα를 사용하여 CA185_01974에 대한 친화성 값을 측정한 것에 대한 센소그램을 보여준다. 대조군(상부 패널)은 인간 TNFα 및 DMSO를 함유하였다. 그 다음, 하부 패널은 화합물 (4)와 함께 복합체를 형성한 인간 TNFα에 대한 중복된 실험을 제공한다.
도 10은 화합물 (1) 내지 (6)의 구조를 보여준다.
서열목록의 간단한 설명
서열번호 1은 CA185_01974.0의 LCDR1을 보여준다.
서열번호 2는 CA185_01974.0의 LCDR2를 보여준다.
서열번호 3은 CA185_01974.0의 LCDR3을 보여준다.
서열번호 4는 CA185_01974.0의 HCDR1을 보여준다.
서열번호 5는 CA185_01974.0의 HCDR2를 보여준다.
서열번호 6은 CA185_01974.0의 HCDR3을 보여준다.
서열번호 7은 CA185_01974.0의 LCVR의 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 8은 CA185_01974.0의 HCVR의 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 9는 CA185_01974.0의 LCVR의 DNA 서열을 보여준다.
서열번호 10은 CA185_01974.0의 HCVR의 DNA 서열을 보여준다.
서열번호 11은 CA185_01974.0의 카파 경쇄의 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 12는 CA185_01974.0의 mIgG1 중쇄의 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 13은 CA185_01974.0의 mFab(힌지 없음) 중쇄의 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 14는 CA185_01974.0의 카파 경쇄의 DNA 서열을 보여준다.
서열번호 15는 CA185_01974.0의 mIgG1 중쇄의 DNA 서열을 보여준다.
서열번호 16은 CA185_01974.0의 mFab(힌지 없음) 중쇄의 DNA 서열을 보여준다.
서열번호 17은 CA185_01979.0의 LCDR2를 보여준다.
서열번호 18은 CA185_01979.0의 LCDR3을 보여준다.
서열번호 19는 CA185_01979.0의 HCDR1을 보여준다.
서열번호 20은 CA185_01979.0의 HCDR2를 보여준다.
서열번호 21은 CA185_01979.0의 HCDR3을 보여준다.
서열번호 22는 CA185_01979.0의 LCVR의 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 23은 CA185_01979.0의 HCVR의 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 24는 CA185_01979.0의 LCVR의 DNA 서열을 보여준다.
서열번호 25는 CA185_01979.0의 HCVR의 DNA 서열을 보여준다.
서열번호 26은 CA185_01979.0의 카파 경쇄의 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 27은 CA185_01979.0의 mIgG1 중쇄의 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 28은 CA185_01979.0의 mFab(힌지 없음) 중쇄의 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 29는 CA185_01979.0의 카파 경쇄의 DNA 서열을 보여준다.
서열번호 30은 CA185_01979.0의 mIgG1 중쇄의 DNA 서열을 보여준다.
서열번호 31은 CA185_01979.0의 mFab(힌지 없음) 중쇄의 DNA 서열을 보여준다.
서열번호 32는 래트 TNFα의 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 33은 마우스 TNFα의 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 34는 인간 TNFα의 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 35는 가용성 형태의 인간 TNFα의 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 36은 (서열번호 35의 클로닝 인공물인) 첫 글자 "S"를 갖지 않는, 가용성 형태의 인간 TNFα의 아미노산 서열을 보여준다.
TNF 수퍼패밀리 구성원의 조절제
본 발명자들은 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태에 결합하는 테스트 화합물을 확인하였다. 이 화합물은 1000 Da 이하, 일반적으로 750 Da 이하, 보다 적합하게는 600 Da 이하의 분자량을 갖는 소분자 물질(SME)이다. 분자량은 약 50 내지 약 1000 Da, 또는 약 100 내지 약 1000 Da의 범위 내에 있을 수 있다. 이 화합물은 필요한 TNF 수퍼패밀리 수용체에 결합하고 이 수용체의 신호전달을 조절하는 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원의 입체구조를 안정화시킨다. 이러한 화합물의 예로는 화학식 (1) 내지 (6)의 화합물이 있다.
TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태에 대한 본 발명의 화합물의 안정화 효과는 이 화합물의 존재 및 부재 하에서 삼량체의 열 전이 중간점(Tm)을 측정함으로써 정량될 수 있다. Tm은 생체분자의 50%가 폴딩되지 않는 온도를 의미한다. TNF 수퍼패밀리 구성원 삼량체를 안정화시키는 화합물은 이 삼량체의 Tm을 증가시킬 것이다. Tm은 당분야에서 공지된 임의의 적절한 기법을 이용함으로써, 예를 들면, 시차 주사 열량측정(DSC) 또는 형광 프로빙된 열 변성 어세이를 이용함으로써 측정될 수 있다.
상기 화합물은 TNF 수퍼패밀리 구성원 삼량체 내에 존재하는 중심 공간(즉, 삼량체의 코어) 내부에 결합할 수 있다.
이 화합물은 TNF 수퍼패밀리 구성원을 TNF 수퍼패밀리 수용체 길항제로 전환시킬 수 있다. 따라서, 이 화합물은 TNF 수퍼패밀리 구성원과 이의 수용체 사이의 고친화성 상호작용과 경쟁할 필요 없이 TNF 수퍼패밀리 구성원 신호전달을 차단할 수 있다.
대안적으로, 상기 화합물은 필요한 TNF 수퍼패밀리 수용체에 결합하고 이 수용체의 신호전달을 향상시키는 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원의 입체구조를 안정화시킬 수 있다. 따라서, 이 화합물은 TNF 수퍼패밀리 구성원과 이의 수용체 사이의 고친화성 상호작용과 경쟁할 필요 없이 TNF 수퍼패밀리 구성원 신호전달을 증가시킬 수 있다.
본원에서 화합물이 길항제로서 기재되는 경우, 화합물은 동등하게 아고니스트일 수 있고 TNF 수퍼패밀리 구성원 삼량체와 이러한 아고니스트 화합물의 복합체에 결합되는 TNF 수퍼패밀리 수용체에 의한 신호전달을 증가시킬 수 있다는 것이 이해될 것이다. 유사하게, 다른 개시내용이 길항성 화합물, 이러한 화합물을 확인하는 방법 및 이러한 화합물의 용도를 언급하는 경우, 이 개시내용은 동등하게 아고니스트 화합물을 언급할 수 있다.
본원에 기재된 화합물은 TNF 수퍼패밀리 수용체의 천연 아고니스트, 즉 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태에 결합하고 이 삼량체가 필요한 TNF 수퍼패밀리 수용체에 여전히 결합하고 이 수용체에 의한 신호전달을 조절하는 입체구조를 채택하도록 유도하는 알로스테릭(allosteric) 조절제이다. 조절에 의해, 상기 화합물은 길항 효과를 가짐으로써 TNF 수퍼패밀리 수용체에 의한 신호전달을 감소시킬 수 있거나, 자극 효과를 가짐으로써 TNF 수퍼패밀리 수용체에 의한 신호전달을 증가시킬 수 있거나 향상시킬 수 있다는 것이 이해될 것이다.
이 화합물은 천연 TNF 수퍼패밀리 구성원 아고니스트를 길항제로 전환시킬 수 있다. 대조적으로, 종래의 TNF 수퍼패밀리 구성원 길항제는 TNF 수퍼패밀리 구성원 또는 TNF 수퍼패밀리 수용체에 결합하고 TNF 수퍼패밀리 구성원과 필요한 수용체의 결합을 방해한다. 대안적으로, 화합물은 TNF 수퍼패밀리 구성원이 결합될 때 TNF 수퍼패밀리 수용체에 의한 신호전달을, TNF 수퍼패밀리 구성원이 상기 화합물의 부재 하에서 결합될 때 TNF 수퍼패밀리 수용체에 의한 신호전달의 수준에 비해 증가시킬 수 있다. 따라서, 화합물은 천연 TNF 수퍼패밀리 아고니스트를 소위 "수퍼-아고니스트"로 전환시킬 수 있다. 따라서, 화합물은 리간드 활성의 알로스테릭 조절제(AMLA)로서도 공지되어 있을 수 있다.
화합물이 적어도 하나의 TNF 수퍼패밀리 구성원에 결합하고, 필요한 TNF 수퍼패밀리 수용체에 결합하고 TNF 수퍼패밀리 수용체의 신호전달을 조절하는 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원의 입체구조를 안정화시키는 한, 상기 화합물은 그의 화학식 또는 화학구조의 면에서 한정되지 않는다. 따라서, 화합물은 본원에 기재된 항체 및 방법을 이용함으로써 확인될 수 있다. 화합물은 벤즈이미다졸 모이어티(moiety) 또는 이의 등배전자체를 포함할 수 있다.
화합물은 필요한 수용체에 대한 (화합물-삼량체 복합체 형태의) TNF 수퍼패밀리 구성원의 결합 친화성을, 이 화합물의 부재 하에서의 필요한 수용체에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 결합 친화성에 비해 증가시킬 수 있다.
화합물은 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태에 결합한다. 이러한 화합물은 삼량체 형태의 하나 이상의 TNF 수퍼패밀리 구성원에 특이적으로(또는 선택적으로) 결합할 수 있다. 화합물은 TNF 수퍼패밀리 구성원들 중 하나에만 특이적으로(또는 선택적으로) 결합할 수 있고 임의의 다른 TNF 수퍼패밀리 구성원에는 결합할 수 없다. 화합물은 2종, 3종, 4종 또는 최대 모든 종류의 TNF 수퍼패밀리 구성원들에 특이적으로 결합할 수도 있다. 특이적(또는 선택적)에 의해, 화합물은 TNF 수퍼패밀리의 다른 구성원을 포함할 수 있는 임의의 다른 분자에 대한 유의한 교차반응성을 갖지 않으면서 관심있는 분자 또는 분자들, 이 경우 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태에 결합한다는 것이 이해될 것이다. 교차반응성은 임의의 적합한 방법, 예를 들면, 표면 플라스몬 공명에 의해 평가될 수 있다. 화합물이 관심있는 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태에 결합할 때 강도의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 100%만큼 강하게 다른 분자에 결합하는 경우, TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태에 대한 화합물과 그 특정 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태 이외의 분자의 교차반응성은 유의한 것으로서 간주될 수 있다. 예를 들면, 화합물이 관심있는 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태에 결합할 때 강도의 약 5% 내지 약 100%, 전형적으로 약 20% 내지 약 100%, 또는 약 50% 내지 약 100%만큼 강하게 다른 분자에 결합하는 경우, 교차반응성은 유의한 것으로서 간주될 수 있다. TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태에 특이적인(또는 선택적인) 화합물은 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태에 결합하는 강도의 약 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25% 또는 20% 미만(최소 제로 결합)의 강도로 또 다른 분자에 결합할 수 있다. 화합물은 적합하게는 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태에 결합하는 강도의 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만 또는 약 5% 미만, 약 2% 미만 또는 약 1% 미만(최소 제로 결합)의 강도로 다른 분자에 결합한다.
테스트 화합물이 TNF 수퍼패밀리 구성원에 결합하는 속도는 본원에서 "결합" 속도 또는 kon-c로서 지칭되고, 테스트 화합물이 TNF 수퍼패밀리 구성원으로부터 해리되는 속도는 본원에서 "해리" 속도 또는 koff-c로서 지칭된다. 본원에서 사용될 때, 기호 "KD-c"는 TNF 수퍼패밀리 구성원에 대한 테스트 화합물의 결합 친화성(해리 상수)을 의미한다. KD-c는 koff-c/kon-c로서 정의된다. 테스트 화합물은 TNF 수퍼패밀리 구성원 및 화합물-삼량체 복합체 피크 강도의 질량 분광 분석에 의해 분 단위로 측정될 수 있는 느린 "결합" 속도를 가질 수 있다. 테스트 화합물에 대한 KD-c 값은 상이한 TNF 수퍼패밀리 구성원 : 화합물-삼량체 복합체 비에서 이 측정을 반복함으로써 추정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 화합물과 TNF 수퍼패밀리 삼량체의 결합은 느린 "해리" 속도, 예를 들면, 전형적으로 10-3 s-1 또는 10-4 s-1의 값, 또는 측정불가능한 "해리" 속도와 함께 빠른 "결합" 속도, 이상적으로 약 107 M-1s-1를 특징으로 한다.
본원에서 사용될 때, 기호 "kon-r"은 화합물-삼량체 복합체가 TNF 수퍼패밀리 수용체에 결합하는 속도("결합" 속도)를 의미한다. 본원에서 사용될 때, 기호 "koff-r"은 화합물-삼량체 복합체가 TNF 수퍼패밀리 수용체로부터 해리되는 속도("해리" 속도)를 의미한다. 본원에서 사용될 때, 기호 "KD-r"은 수퍼패밀리 수용체에 대한 화합물-삼량체 복합체의 결합 친화성(해리 상수)을 의미한다. KD-r은 koff-r/kon-r로서 정의된다.
테스트 화합물(즉, 화합물-삼량체 복합체 형태)의 존재 하에서의 그 수용체에의 결합에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 KD-r 값은 테스트 화합물의 부재 하에서의 그 수용체에의 결합에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 KD-r 값보다 적어도 약 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배 또는 100배일 수 있다. TNF 수퍼패밀리 구성원에의 결합에 대한 화합물-삼량체 복합체의 KD-r 값은 테스트 화합물의 부재 하에서 TNF 수퍼패밀리 수용체에 결합하는 TNF 수퍼패밀리 삼량체의 KD-r 값의 적어도 약 1.5배, 일반적으로 적어도 약 3배, 보다 적합하게는 적어도 약 4배 감소될 수 있고, 즉 TNF 수퍼패밀리에 대한 화합물-삼량체 복합체의 결합 친화성은 테스트 화합물의 부재 하에서의 TNF 수퍼패밀리 수용체에 대한 TNF 수퍼패밀리 삼량체의 결합 친화성에 비해 적어도 약 1.5배, 일반적으로 적어도 약 3배, 보다 적합하게는 적어도 약 4배 증가될 수 있다.
본원에 기재된 화합물은 TNF 수퍼패밀리 구성원의 그 수용체에 대한 결합 친화성을, 상기 화합물의 부재 하에서의 TNF 수퍼패밀리 구성원의 그 수용체에 대한 결합 친화성에 비해 약 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배 또는 100배 이상 증가시킬 수 있다.
결합 친화성은 결합 친화성(KD-r)의 면에서 제공될 수 있고 임의의 적절한 단위, 예컨대, μM, nM 또는 pM로 제공될 수 있다. KD-r 값이 작을수록 TNF 수퍼패밀리 구성원의 그 수용체에 대한 결합 친화성이 커진다.
화합물의 존재 하에서의 그 수용체에의 결합에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 KD-r 값은 테스트 화합물의 부재 하에서의 그 수용체에의 결합에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 KD-r 값보다 적어도 약 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배 또는 100배 더 낮을 수 있다.
TNF 수퍼패밀리 수용체에 결합하는 TNF 수퍼패밀리 삼량체 단독의 KD-r 값에 비해 TNF 수퍼패밀리 수용체에의 결합에 대한 화합물-삼량체 복합체의 KD-r 값의 감소는 TNF 수퍼패밀리 삼량체 단독에 비해 TNF 수퍼패밀리 수용체에 결합하는 화합물-삼량체 복합체의 결합 속도(kon-r)의 증가, 및/또는 TNF 수퍼패밀리 삼량체 단독에 비해 해리 속도(koff-r)의 감소로부터 비롯될 수 있다. TNF 수퍼패밀리 수용체에 결합하는 화합물-삼량체 복합체의 결합 속도(kon-r)는 일반적으로 TNF 수퍼패밀리 삼량체 단독에 비해 증가된다. TNF 수퍼패밀리 수용체에 결합하는 화합물-삼량체 복합체의 해리 속도(koff-r)는 일반적으로 TNF 수퍼패밀리 삼량체 단독에 비해 감소된다. 가장 적합하게는, TNF 수퍼패밀리 수용체에 결합하는 화합물-삼량체 복합체의 결합 속도(kon-r)는 TNF 수퍼패밀리 삼량체 단독에 비해 증가되고, TNF 수퍼패밀리 수용체에 결합하는 화합물-삼량체 복합체의 해리 속도(koff-r)는 TNF 수퍼패밀리 삼량체 단독에 비해 감소된다. 필요한 TNF 수퍼패밀리 수용체에 대한 화합물-삼량체 복합체의 kon-r 값은 화합물의 부재 하에서 그 수용체에 결합하는 TNF 수퍼패밀리 삼량체의 kon-r 값에 비해 적어도 약 1.5배 또는 적어도 약 2배, 적합하게는 적어도 약 3배 증가될 수 있고/있거나, 필요한 TNF 수퍼패밀리 수용체에 대한 화합물-삼량체 복합체의 koff-r 값은 화합물의 부재 하에서 그 수용체에 결합하는 TNF 수퍼패밀리 삼량체의 koff-r 값에 비해 적어도 약 1.2배, 적어도 약 1.6배, 적어도 약 2배, 보다 적합하게는 적어도 약 2.4배 감소될 수 있다.
TNF 수퍼패밀리 삼량체에 결합하는 화합물에 대한 결합 속도(kon-c)는 TNF 수퍼패밀리 수용체에 결합하는 화합물-삼량체 복합체에 대한 결합 속도(kon-r)보다 전형적으로 더 빠르다. TNF 수퍼패밀리 수용체에 결합하는 화합물-삼량체 복합체에 대한 해리 속도(koff-r)도 TNF 수퍼패밀리 삼량체에 결합하는 화합물에 대한 해리 속도(koff-c)보다 전형적으로 더 빠르다. 가장 적합하게는, TNF 수퍼패밀리 삼량체에 결합하는 화합물에 대한 결합 속도(kon-c)는 TNF 수퍼패밀리 수용체에 결합하는 화합물-삼량체 복합체에 대한 결합 속도(kon-r)보다 더 빠르고, TNF 수퍼패밀리 수용체에 결합하는 화합물-삼량체 복합체에 대한 해리 속도(koff-r)는 TNF 수퍼패밀리 삼량체에 결합하는 화합물에 대한 해리 속도(koff-c)보다 더 빠르다. TNF 수퍼패밀리 삼량체에의 결합에 대한 화합물의 KD-c 값은 TNF 수퍼패밀리 수용체에의 결합에 대한 화합물-삼량체 복합체의 KD-r 값보다 일반적으로 더 낮고, 즉 삼량체에 대한 화합물의 친화성은 수용체에 대한 화합물-삼량체 복합체의 친화성보다 더 높다.
필요한 TNF 수퍼패밀리 수용체에 대한 화합물-삼량체 복합체 및 TNF 수퍼패밀리 삼량체 둘 다의 kon-r, koff-r 및 KD-r 값은 임의의 적합한 기법, 예를 들면, 표면 플라스몬 공명, 질량 분광측정 및 등온 열량측정을 이용함으로써 측정될 수 있다. 테스트 화합물의 존재 하에서의 그 수용체에의 결합에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 KD-r 값은 1 μM, 100 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 100 pM 또는 10 pM 이하(전형적으로 최소 약 1 pM의 보다 낮은 값)일 수 있다. 테스트 화합물(즉, 화합물-삼량체 복합체)의 존재 하에서의 그 수용체에의 결합에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 KD-r 값은 1 nM 이하일 수 있다. 필요한 TNF 수퍼패밀리 수용체에의 결합에 대한 화합물-삼량체 복합체의 KD-r 값은 600 pM 미만, 보다 바람직하게는 500 pM 미만, 400 pM 미만, 300 pM 미만, 200 pM 미만, 100 pM 미만 또는 50 pM 미만(마찬가지로, 최소 약 1 pM의 보다 낮은 값)일 수 있다. 필요한 TNF 수퍼패밀리 수용체에의 결합에 대한 화합물-삼량체 복합체의 KD-r 값은 약 200 pM 미만(약 1 pM)일 수 있다.
화합물은 TNF 수퍼패밀리 구성원 및 화합물의 샘플에서 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태의 KD-r을 측정하는 단계; 샘플에서의 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태의 KD-r을 대조군 샘플과 비교하는 단계; 및 화합물을 선택하는 단계를 포함하는 어세이에 의해 확인될 수 있다.
화합물은 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태를 안정화시킨다. 테스트 화합물이 삼량체의 비율을, 테스트 화합물의 부재 하에서 TNF 수퍼패밀리 구성원 및 불안정화제를 함유하는 샘플에 대해 관찰된 삼량체의 양에 비해 증가시키는 경우 안정화가 일어난 것으로 간주된다. 테스트 화합물은 삼량체의 양을, 테스트 화합물의 부재 하에서 TNF 수퍼패밀리 구성원 및 불안정화제를 함유하는 샘플에 존재하는 삼량체의 양에 비해 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 300% 또는 400% 이상 증가시킬 수 있다.
테스트 화합물은 삼량체의 양을, 불안정화제 및 테스트 화합물 둘 다의 부재 하에서 TNF 수퍼패밀리 구성원의 샘플에 대해 관찰된 삼량체의 양에 비해 증가시킬 수도 있다. 테스트 화합물은 삼량체의 양을, 불안정화제 및 테스트 화합물 둘 다의 부재 하에서 TNF 수퍼패밀리 구성원을 함유하는 샘플에 존재하는 삼량체의 양에 비해 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 300% 또는 400% 이상 증가시킬 수 있다.
테스트 화합물은 그 수용체에 결합된 TNF 수퍼패밀리 구성원의 양을, 테스트 화합물의 부재 하에서 TNF 수퍼패밀리 구성원을 함유하는 샘플 중의 그 수용체에 결합된 TNF 수퍼패밀리 구성원의 양에 비해 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 300% 또는 400% 이상 증가시킬 수 있다.
테스트 화합물은 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태의 안정성을 향상시킬 수 있다. 테스트 화합물이 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태의 열 전이 중간점(Tm)을, 테스트 화합물의 부재 하에서 TNF 수퍼패밀리 구성원 및 불안정화제를 함유하는 샘플에 대해 관찰된 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태의 Tm에 비해 증가시키는 경우, TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태의 향상된 안정성이 일어난 것으로 간주된다. TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태의 Tm은 생체분자의 50%가 폴딩되지 않는 온도이다. 테스트 화합물의 존재 및/또는 부재 하에서 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태의 Tm은 당분야에서 공지된 임의의 적절한 기법을 이용함으로써, 예를 들면, 시차 주사 열량측정(DSC) 또는 형광 프로빙된 열 변성 어세이를 이용함으로써 측정될 수 있다.
테스트 화합물은 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태의 Tm을, 테스트 화합물의 부재 하에서 TNF 수퍼패밀리 구성원을 함유하는 샘플에서의 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태의 Tm에 비해 적어도 1℃, 적어도 2℃, 적어도 5℃, 적어도 10℃, 적어도 15℃ 또는 적어도 20℃ 이상 증가시킬 수 있다. 테스트 화합물은 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태의 Tm을 적어도 1℃, 전형적으로 적어도 10℃, 보다 적합하게는 10℃ 내지 20℃ 증가시킬 수 있다.
화합물은 화합물-삼량체 복합체 형태의 TNF 수퍼패밀리 구성원이 수용체에 결합할 때 TNF 수용체를 통한 신호전달을 완전히 또는 부분적으로 억제할 수 있다. 화합물은 TNF 수퍼패밀리 수용체를 통한 신호전달을 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 감소시키도록 작용할 수 있다. 대안적으로, 화합물은 화합물-삼량체 복합체 형태의 TNF 수퍼패밀리 구성원이 수용체에 결합할 때 TNF 수용체를 통한 신호전달을 증가시킬 수 있다. 화합물은 TNF 수퍼패밀리 수용체를 통한 신호전달을 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 200% 증가시키도록 작용할 수 있다. 신호전달 수준의 임의의 변화는 알칼리성 포스파타제(phosphatase) 또는 루시퍼라제(luciferase)에 의한 레포터 유전자 활성, 기계, 예컨대, 셀로믹스 어레이스캔(Cellomics Arrayscan)을 이용한 NF-κB 전위, 다운스트림 이펙터의 인산화, 신호전달 분자의 모집 또는 세포 사멸의 측정을 포함하는 임의의 적절한 기법에 의해 측정될 수 있다.
화합물은 화합물-삼량체 복합체 형태의 TNF 수퍼패밀리 구성원이 수용체에 결합할 때 TNF 수용체를 통한 신호전달의 다운스트림 효과 중 적어도 하나의 다운스트림 효과를 조절할 수 있다. 이러한 효과는 본원에 논의되어 있고 TNF 수퍼패밀리에 의해 유도된 IL-8, IL17A/F, IL2 및 VCAM 생성, TNF 수퍼패밀리에 의해 유도된 NF-κB 활성화 및 호중구 동원을 포함한다. TNF 수퍼패밀리 구성원의 다운스트림 효과를 측정하는 표준 기법은 당분야에서 공지되어 있다. 화합물은 TNF 수용체를 통한 신호전달의 다운스트림 효과 중 적어도 1종, 2종, 3종, 4종, 5종, 10종 또는 최대 모든 종류의 효과를 조절할 수 있다.
화합물의 활성은 표준 용어, 예컨대, IC50 또는 절반 최대 유효 농도(EC50) 값을 이용함으로써 정량될 수 있다. IC50 값은 특정된 생물학적 또는 생화학적 기능의 50% 억제를 위해 요구되는 화합물의 농도를 나타낸다. EC50 값은 화합물의 최대 효과의 50%를 위해 요구된 화합물의 농도를 나타낸다. 화합물은 500 nM, 400 nM, 300 nM, 200 nM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM 또는 100 pM 이하(최소 약 10 pM 또는 1 pM의 보다 낮은 값)의 IC50 또는 EC50 값을 가질 수 있다. IC50 및 EC50 값은 임의의 적절한 기법을 이용함으로써 측정될 수 있고, 예를 들면, 사이토카인 생성은 ELISA를 이용함으로써 정량될 수 있다. 그 후, IC50 및 EC50 값은 S자형 용량 반응 모델로서도 알려진 표준 4-파라미터 로지스틱 모델을 이용함으로써 생성될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, TNF에 결합할 수 있고 신호전달을 조절할 수 있는 화합물의 예는 화학식 (1) 내지 (6)의 화합물이다.
조절제-TNF 수퍼패밀리 구성원 복합체
본 발명자들은 본원에 기재된 화합물과 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태의 결합이 TNF 수퍼패밀리 삼량체의 입체구조적 변화를 야기한다는 것을 발견하였다. 구체적으로, TNF 수퍼패밀리 구성원 삼량체는 본원에 개시된 화합물에 의해 결합될 때 변형된 또는 비틀어진 입체구조를 취한다.
예를 들면, 화합물 (1) 내지 (6)이 인간 TNFα의 가용성 도메인에 결합될 때, TNF는 그의 삼량체 구조를 보유하나, A 서브유닛과 C 서브유닛은 서로 떨어지도록 이동하고 C는 회전하여 이들 서브유닛들 사이의 갈라진 틈을 생성한다.
이론에 의해 구속되지 않지만, 화합물의 부재 하에서 삼량체 TNFα를 포함하는 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원은 3개의 별개의 이량체 TNF 수퍼패밀리 구성원 수용체들에 결합할 수 있다고 생각된다. 각각의 이량체 TNF 수퍼패밀리 구성원 수용체는 2개의 별개의 TNF 수퍼패밀리 삼량체들에 결합할 수 있다. 이것은 다수의 TNF 수퍼패밀리 구성원 삼량체와 TNF 수퍼패밀리 구성원 수용체 이량체의 응집을 초래하여, 다운스트림 신호전달을 시작하는 신호전달 래프트(raft)를 생성한다.
삼량체 TNFα가 화합물에 결합될 때, 생성된 복합체의 입체구조는 변형된다. 따라서, 이론에 의해 구속되지 않지만, 본원에 개시된 화합물의 존재 하에서 삼량체 TNFα를 포함하는 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원은 2개의 별개의 이량체 TNF 수퍼패밀리 구성원 수용체들에만 결합할 수 있다고 생각된다. 3개보다 오히려 단지 2개의 별개의 이량체 TNF 수퍼패밀리 구성원 수용체들이 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원에 결합한다는 사실은 다수의 TNF 수퍼패밀리 구성원 삼량체와 TNF 수퍼패밀리 구성원 수용체 이량체의 응집을 감소시키거나 억제한다. 이것은 신호전달 래프트의 형성을 감소시키거나 억제함으로써, 다운스트림 신호전달을 감소시키거나 억제한다.
본 발명의 항체는 본원에 개시된 화합물의 결합의 결과로서 비틀어진 입체구조를 갖는 TNF 수퍼패밀리 구성원을 검출하는 데 사용될 수 있다. 전형적으로, 비틀어진 또는 변형된 입체구조를 갖는 TNF 수퍼패밀리 구성원은 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원이다. 그러나, 본 발명의 항체는 다른 형태의 TNF 수퍼패밀리 구성원에도 결합할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 TNF 수퍼패밀리 단량체에 결합할 수 있다.
TNF 수퍼패밀리 구성원은 전형적으로 TNFα이고, 삼량체 TNFα(특히 TNFαs)일 수 있다.
따라서, 본 발명은 TNF 수퍼패밀리 구성원인 삼량체 단백질 및 이에 결합된 화합물을 포함하고 적어도 1 nM(즉, 1 nM 이하, 최소 약 1 pM)의 친화성으로 본 발명의 항체에 결합하는 복합체로서, 화합물-삼량체 복합체가, 필요한 TNF 수퍼패밀리 수용체에 결합하고 이 수용체를 통해 삼량체에 의해 유도되는 신호전달을 조절하는 것인 복합체를 제공한다. TNF 수퍼패밀리 구성원은 전형적으로 TNFα, 보다 구체적으로 TNFαs이다.
나아가, 항체는 일반적으로 TNF 삼량체의 부재 하에서의 화합물에의 결합 및/또는 화합물의 부재 하에서의 TNF 삼량체에의 결합에 대한 친화성에 비해 적어도 약 100배 더 낮은(친화성이 적어도 약 100배 개선됨), 적합하게는 약 200배 더 낮은 친화성으로 복합체에 결합한다.
본 발명은 TNF 수퍼패밀리 구성원인 삼량체 단백질에 결합하여 복합체를 형성할 수 있는 화합물로서, 화합물-삼량체 복합체가, 필요한 TNF 수퍼패밀리 수용체에 결합하고 이 수용체를 통해 삼량체에 의해 유도되는 신호전달을 조절하고, 화합물-삼량체 복합체가 1 nM 이하(최소 약 1 pM)의 KD-ab로 본 발명의 항체에 결합하는 것인 화합물도 제공한다. TNF 수퍼패밀리 구성원은 전형적으로 TNFα, 가장 구체적으로 TNFαs이다.
항체는 전형적으로 TNF 삼량체의 부재 하에서의 화합물에의 결합 및/또는 화합물의 부재 하에서의 TNF 삼량체에의 결합에 대한 친화성에 비해 적어도 약 100배 더 낮은(친화성이 적어도 약 100배 개선됨), 보다 적합하게는 약 200배 더 낮은 친화성으로 복합체에 결합한다.
화합물-삼량체 복합체는 본 발명의 임의의 항체에 결합할 수 있다. 구체적으로, 화합물-삼량체 복합체는 본원에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 항체에 결합할 수 있다.
본원에 기재된 화합물 또는 복합체는 병적 상태의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다. 따라서, 인체 또는 동물체에 대해 실시되는 요법에 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 복합체가 제공된다. 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 복합체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 요법도 제공한다. 본 발명의 화합물 또는 복합체는 본원에 기재된 임의의 치료 적응증 및/또는 약학 조성물에서 사용될 수 있다.
항체
본 발명은 본원에 개시된 적어도 하나의 화합물 및 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원을 포함하는 적어도 하나의 화합물-삼량체 복합체에 선택적으로 결합하는 항체를 제공한다.
전형적으로, 본 발명의 항체와 화합물-(삼량체) 복합체의 선택적 결합은 TNF 수퍼패밀리 구성원의 부재 하에서의 상기 항체와 상기 화합물의 결합, 또는 상기 화합물의 부재 하에서의 상기 항체와 TNF 수퍼패밀리 구성원의 결합, 또는 상기 항체와 다른 (상이한) 화합물-(삼량체) 복합체의 결합에 비해 측정된다.
구체적으로, 본 발명은 (i) TNF 수퍼패밀리 구성원인 삼량체 단백질 및 (ii) TNF 수퍼패밀리 구성원인 삼량체 단백질에 결합할 수 있는 화합물을 포함하는 복합체에 선택적으로 결합하는 항체로서, 화합물-삼량체 복합체가, 필요한 TNF 수퍼패밀리 수용체에 결합하고 이 수용체를 통해 삼량체에 의해 유도되는 신호전달을 조절하는 것인 항체를 제공한다. 전형적으로, 상기 항체는 화합물의 부재 하에서의 TNF 수퍼패밀리 구성원에의 그의 결합, 또는 TNF 수퍼패밀리 구성원의 부재 하에서의 화합물에의 그의 결합에 비해 상기 복합체에 선택적으로 결합한다.
화합물은 화합물 (1) 내지 (6)(또는 이들의 염 또는 용매화물)을 포함하는 전술한 임의의 화합물일 수 있다. 아래에 더 논의되어 있는 바와 같이, TNF 수퍼패밀리 구성원은 수퍼패밀리 구성원들 중 임의의 수퍼패밀리 구성원일 수 있으나, 전형적으로 TNFα이다. 보다 구체적으로, TNFα는 인간 TNFα, 특히 가용성 TNFα(TNFαS)이다. TNFαS는 서열번호 35 또는 서열번호 36의 서열을 가질 수 있거나, 서열번호 35 또는 서열번호 36의 변이체일 수 있다. 이러한 변이체는 전형적으로 서열번호 35 또는 서열번호 36에 대한 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95%의 동일성(또는 심지어 약 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성)을 갖는다. 다시 말해, 이러한 변이체는 서열번호 35 또는 서열번호 36에 대한 약 60% 내지 약 99%의 동일성, 적합하게는 서열번호 35 또는 서열번호 36에 대한 약 80% 내지 약 99%의 동일성, 보다 적합하게는 서열번호 35 또는 서열번호 36에 대한 약 90% 내지 약 99%의 동일성, 가장 적합하게는 서열번호 35 또는 서열번호 36에 대한 약 95% 내지 약 99%의 동일성을 가질 수 있다. 변이체는 아래에 더 기재되어 있다.
용어 "상응하는 서열"은 TNFα가 임의의 공지된 동물 또는 인간 TNFα, 특히 인간 TNFα, 예를 들면, 서열번호 36의 야생형 아미노산 서열을 가질 수 있다는 것을 나타낸다. 이것은 가용성 TNFα(sTNFα) 또는 막 결합형 TNFα, 또는 이들 둘 다일 수 있다. (TACE에 의해 절단된 sTNFα, 예컨대, 서열번호 36에 비해 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산만큼 연장될 수 있거나 절두될 수 있는 상응하는 가용성 TNFα 서열을 생성할 수 있는 다른 프로테이나제, 예컨대, ADAM10, ADAM19, 매트릭스 메탈로프로테이나제 7 및 프로테이나제 3도 sTNF를 방출시킬 수 있지만) 가용성 동종삼량체 TNFα(sTNF)는 메탈로프로테아제 TNF 알파 전환 효소(TACE/ADAM17)에 의한 단백질분해성 절단을 통해 막 결합형 동종삼량체 TNFα(mTNF)로부터 방출된다. 가용성 52 kDa 삼량체 sTNF는 삼각형 피라미드 형태를 취한다. 용어 mTNF에 의해 포괄되는 인간 서열은 서열번호 34로 제시되어 있고, 용어 sTNF(서열번호 34에 대한 TACE 작용의 생성물)에 의해 포괄되는 인간 서열은 서열번호 36으로 제시되어 있다. 래트 및 마우스 mTNFα의 상응하는 서열은 각각 서열번호 32 및 33으로 제시되어 있다. 다른 동물로부터의 TNFα의 상응하는 서열(또는 인간 서열의 공지된 변이체)은 서열번호 36의 서열과 용이하게 중첩될 수 있고 (본원에서 TNFα 아미노산의 넘버링에서 사용된) 서열번호 36에 대한 아미노산 넘버링과 동일한 아미노산 넘버링을 제공받을 수 있다. 예를 들면, 다양한 동물들로부터의 서열은 인간 서열 P01375 및 Q5STB3을 포함하는 유니프롯(Uniprot) 데이터베이스(www.uniprot.org) 내에서 발견될 수 있다. 상응하는 sTNFα 서열은 (서열번호 36으로서) mTNFα 서열의 157 아미노산 C-말단일 수 있거나, 1개, 2개 또는 3개의 아미노산만큼 더 길 수 있거나 더 짧을 수 있다(래트 및 마우스 서열은 156개의 아미노산이다). 상응하는 sTNFα 서열은 서열번호 36에 비해 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개 또는 40개의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 상응하는 sTNFα 서열은 서열번호 36의 길이에 걸쳐 서열번호 36에 대한 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 본 개시내용이 일반적으로 본 발명의 항체와 TNF 수퍼패밀리 구성원 삼량체의 결합에 관한 것일지라도, 본 발명의 항체는 다른 형태의 TNF 수퍼패밀리 구성원에도 결합할 수 있다. 예증하기 위해, 본원의 실시예는 CA185_0179 항체가 삼량체 TNF에 결합한다는 것을 입증한다. 그러나, 도 1에 나타낸 바와 같이(화합물 (1)의 존재 하에서 TNFα 단량체에 결합된 CA185_0179 항체의 결정 구조), 상기 항체는 단량체 TNFα에도 결합하는 듯하다. 이론에 의해 구속되지 않지만, 화합물의 존재 하에서, TNF의 가용성 도메인은 그의 삼량체 구조를 보유한다고 생각된다. 그러나, A 서브유닛과 C 서브유닛은 서로 떨어지도록 이동하여(그리고 C 서브유닛은 회전하여) 이들 2개의 서브유닛들 사이의 갈라진 틈을 생성한다. 따라서, 본 발명의 항체가 비틀어진 삼량체에 결합할지라도, 삼량체 구조가 단량체로 분리되도록 강제되는 경우 상기 항체는 여전히 결합할 수 있다는 것도 가능하다.
"A" 서브유닛과 "C" 서브유닛의 경우, 측면으로부터 TNFα 삼량체의 결정 구조를 볼 때, 상기 구조는 대략적으로 피라미드/원뿔과 유사한 형태를 갖는다. 관찰자가 관찰자를 향하여 가리키는 단량체 말단의 N-말단 및 C-말단을 갖는 삼량체 축을 내려다 볼 때, 관찰자는 삼량체의 "퉁퉁한" 말단을 바라본다. 이론에 의해 구속되지 않지만, 화합물을 갖는 비틀어진 구조에서, 갈라진 틈은 본 발명의 Ab가 결합하는 A 서브유닛과 C 서브유닛 사이에서 개방된다.
어느 쇄가 A, B 또는 C인지는 각각의 쇄에서 3개 동일한 잔기들, 예를 들면, P117(G121도 적절함)의 3개 C-알파 원자들 사이의 3개 거리를 측정함으로써 확인될 수 있다.
상기 3개의 거리는 apo TNF에서 등변이지만 화합물이 결합될 때 비틀어지는 삼각형을 형성한다. 가장 짧은 거리는 BC 사이의 거리이고 가장 긴 거리는 AC 사이의 거리이므로(예를 들면, AC=13.8 Å, AB=12.3 Å, BC=10.2 Å); 관찰자를 향하여 가리키는 N/C 말단을 갖는 분자의 축을 통해 내려다 볼 때, 가장 긴 거리는 C 쇄에 이어 A 쇄가 반시계 방향으로 이어진 후, B 및 C가 다시 반시계 방향으로 연속되도록 한정한다.
따라서, 본 발명은 인간 TNFα, 및 화합물 (1) 내지 (6)으로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물, 또는 이의 염 또는 용매화물을 포함하는 복합체에 선택적으로 결합하는 항체도 제공한다. 인간 TNFα는 전형적으로 가용성 TNFα(TNFαS)이다. TNFαS는 서열번호 35 또는 서열번호 36의 서열, 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 이러한 변이체는 서열번호 35 또는 서열번호 36에 대한 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 가질 수 있다(전술한 내용을 참조하고 변이체를 확인하는 방법은 아래에 기재되어 있다). TNFα는 삼량체 TNFα일 수 있다.
본원에서 지칭된 용어 "항체"는 전체 항체 및 이의 임의의 항원 결합 단편(즉, "항원 결합 부분") 또는 단일 쇄를 포함한다. 항체는 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질, 또는 이의 항원 결합 부분을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로서 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로서 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. VH 및 VL 영역은 골격 영역(FR)으로서 명명된, 보다 더 보존된 영역에 의해 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)으로서 명명된 초가변 영역으로 더 세분될 수 있다.
항체의 불변 영역은 면역글로불린과, 면역계의 다양한 세포들(예를 들면, 이펙터 세포) 및 전형적인 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자의 결합을 매개할 수 있다.
본 발명의 항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있고, 전형적으로 단클론 항체일 것이다. 본 발명의 항체는 키메라 항체, CDR-이식된 항체, 나노바디, 인간 또는 인간화된 항체 또는 이들 중 임의의 항체의 항원 결합 부분일 수 있다. 단클론 항체 및 다클론 항체 둘 다의 생성을 위해, 실험 동물은 전형적으로 비인간 포유동물, 예컨대, 염소, 토끼, 래트 또는 마우스이나, 항체는 다른 종에서 생성될 수도 있다.
다클론 항체는 상용적인 방법, 예컨대, 관심있는 항원을 사용한 적합한 동물의 면역화에 의해 생성될 수 있다. 그 후, 동물로부터 혈액을 제거할 수 있고 IgG 분획을 정제할 수 있다.
동물의 면역화가 필요한 경우, 잘 알려된 상용적인 프로토콜을 이용하여 폴리펩티드를 동물, 예를 들면, 비인간 동물에게 투여함으로써 본 발명의 화합물-삼량체 복합체에 대해 생성된 항체를 수득할 수 있다(예를 들면, 문헌(Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986) 참조). 많은 온혈 동물들, 예컨대, 토끼, 마우스, 래트, 양, 소, 낙타 또는 돼지가 면역화될 수 있다. 그러나, 마우스, 토끼, 돼지 및 래트가 일반적으로 가장 적합하다.
단클론 항체는 당분야에서 공지된 임의의 방법, 예컨대, 하이브리도마 기법(Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), 트리오마 기법, 인간 B 세포 하이브리도마 기법(Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72) 및 EBV-하이브리도마 기법(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985)에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 항체는 예를 들면, 문헌(Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15): 7843-7848l); 국제 특허출원 공보 제WO92/02551호; 국제 특허출원 공보 제WO2004/051268호; 및 국제 특허출원 공보 제WO2004/106377호에 기재된 방법에 의한 특이적 항체의 생성을 위해 선택된 단일 림프구로부터 생성된 면역글로불린 가변 영역 cDNA를 클로닝하고 발현함으로써, 단일 림프구 항체 방법의 이용을 통해 생성될 수도 있다.
본 발명의 항체는 당분야에서 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법들을 이용함으로써 생성될 수도 있고 문헌(Brinkman et al. (in J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50)), 문헌(Ames et al. (J. Immunol. Methods, 1995, 184:177-186)), 문헌(Kettleborough et al. (Eur. J. Immunol. 1994, 24:952-958)), 문헌(Persic et al. (Gene, 1997 187 9-18)), 문헌(Burton et al. (Advances in Immunology, 1994, 57:191-280)); 국제 특허출원 공보 제WO 90/02809호; 국제 특허출원 공보 제WO 91/10737호; 국제 특허출원 공보 제WO 92/01047호; 국제 특허출원 공보 제WO 92/18619호; 국제 특허출원 공보 제WO 93/11236호; 국제 특허출원 공보 제WO 95/15982호; 국제 특허출원 공보 제WO 95/20401호; 미국 특허 제5,698,426호; 미국 특허 제5,223,409호; 미국 특허 제5,403,484호; 미국 특허 제5,580,717호; 미국 특허 제5,427,908호; 미국 특허 제5,750,753호; 미국 특허 제5,821,047호; 미국 특허 제5,571,698호; 미국 특허 제5,427,908호; 미국 특허 제5,516,637호; 미국 특허 제5,780,225호; 미국 특허 제5,658,727호; 미국 특허 제5,733,743호; 및 미국 특허 제5,969,108호에 개시된 항체들을 포함할 수 있다.
전체 인간 항체는 중쇄 및 경쇄 둘 다의 가변 영역 및 불변 영역(존재하는 경우)이 모두 인간으로부터 유래되거나, 인간으로부터 유래되되, 반드시 동일한 항체로부터 유래될 필요가 없는 서열과 실질적으로 동일한 항체로부터 유래될 필요가 없는 항체이다. 전체 인간 항체의 예로는 예를 들면, 전술한 파지 디스플레이 방법에 의해 생성된 항체, 및 뮤린 면역글로불린 가변 및 임의적으로 불변 영역 유전자들이 예를 들면, 유럽 특허 제0546073호, 미국 특허 제5,545,806호, 미국 특허 제5,569,825호, 미국 특허 제5,625,126호, 미국 특허 제5,633,425호, 미국 특허 제5,661,016호, 미국 특허 제5,770,429호, 유럽 특허 제0438474호 및 유럽 특허 제0463151호에 일반적인 용어로 기재된 그들의 인간 대응물로 대체되어 있는 마우스에 의해 생성된 항체가 있을 수 있다.
대안적으로, 본 발명에 따른 항체는 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원 및 본원에 개시된 화합물의 화합물-삼량체 복합체를 포함하는 면역원으로 비인간 포유동물을 면역화시키는 단계; 상기 포유동물로부터 항체 제제를 얻는 단계; 이로부터 상기 복합체를 선택적으로 인식하는 단클론 항체를 유도하는 단계; 및 화합물의 존재 하에서만 TNF 수퍼패밀리 구성원에 결합하는 단클론 항체에 대해 단클론 항체의 집단을 스크리닝하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성될 수 있다.
본 발명의 항체 분자는 전장 중쇄 및 경쇄를 갖는 완전한 항체 분자, 또는 이의 단편 또는 항원 결합 부분을 포함할 수 있다. 용어 항체의 "항원 결합 부분"은 항원에 선택적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 항체, 및 이의 단편 및 항원 결합 부분은 Fab, 변형된 Fab, Fab', 변형된 Fab', F(ab')2, Fv, 단일 도메인 항체(예를 들면, VH 또는 VL 또는 VHH), scFv, 2가, 3가 또는 4가 항체, Bis-scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 이들 중 임의의 것의 에피토프 결합 단편일 수 있으나, 이들로 한정되지 않는다(예를 들면, 문헌(Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136); 및 문헌(Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217) 참조). 이들 항체 단편을 생성하고 제조하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있다(예를 들면, 문헌(Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181) 참조). 본 발명에서 사용될 다른 항체 단편은 국제 특허출원 공보 제WO 2005/003169호, 국제 특허출원 공보 제WO 2005/003170호 및 국제 특허출원 공보 제WO 2005/003171호에 기재된 Fab 및 Fab' 단편, 및 국제 특허출원 공보 제WO 2009/040562호에 기재된 Fab-dAb 단편을 포함한다. 다가 항체는 다중 특이성을 포함할 수 있거나 단일특이적일 수 있다(예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO 92/22853호 및 국제 특허출원 공보 제WO 05/113605호 참조). 이들 항체 단편은 당분자에게 공지된 종래의 기법을 이용함으로써 얻을 수 있고, 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝될 수 있다.
존재하는 경우 본 발명의 항체 분자의 불변 영역 도메인은 항체 분자의 제안된 기능 및 특히 요구될 수 있는 이펙터 기능을 유념하면서 선택될 수 있다. 예를 들면, 불변 영역 도메인은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인일 수 있다. 구체적으로, 항체 분자가 치료적 용도를 위한 것이고 항체 이펙터 기능이 요구될 때, 특히 IgG1 및 IgG3 아이소타입의 인간 IgG 불변 영역 도메인이 사용될 수 있다. 대안적으로, 항체 분자가 치료적 목적을 위한 것이고 항체 이펙터 기능이 요구되지 않을 때, IgG2 및 IgG4 아이소타입이 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 재조합 수단에 의해 제조될 수 있거나, 발현될 수 있거나, 생성될 수 있거나 단리될 수 있다(예컨대, (a) 관심있는 면역글로불린 유전자에 대한 유전자이식 또는 염색체이식 동물(예를 들면, 마우스), 또는 이로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, (b) 관심있는 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들면, 형질감염종(transfectoma)으로부터 단리된 항체, (c) 재조합 조합적 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 다른 DNA 서열로의 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되었거나, 발현되었거나, 생성되었거나 단리된 항체).
본 발명의 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체일 수 있다. 본원에서 사용될 때, 용어 "인간 항체"는 골격 및 CDR 영역 둘 다가 인간 생식세포주 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 포함하기 위한 것이다. 나아가, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우, 불변 영역도 인간 생식세포주 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식세포주 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기(예를 들면, 시험관내에서의 무작위적 또는 부위 특이적 돌연변이유발, 또는 생체내에서의 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 사용될 때, 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대, 마우스의 생식세포주로부터 유래된 CDR 서열이 인간 골격 서열 상으로 이식되어 있는 항체를 포함하기 위한 것이 아니다.
이러한 인간 항체는 인간 단클론 항체일 수 있다. 이러한 인간 단클론 항체는 불멸화된 세포에 융합된, 인간 중쇄 전이유전자 및 경쇄 전이유전자를 포함하는 게놈을 갖는 유전자이식 비인간 동물, 예를 들면, 유전자이식 마우스로부터 얻은 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성될 수 있다.
인간 항체는 인간 림프구의 시험관내 면역화 후 엡스테인-바 바이러스를 사용한 림프구의 형질전환에 의해 제조될 수 있다.
용어 "인간 항체 유도체"는 임의의 변형된 형태의 인간 항체, 예를 들면, 항체와 또 다른 물질 또는 항체의 접합체를 지칭한다.
용어 "인간화된 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대, 마우스의 생식세포주로부터 유래된 CDR 서열이 인간 골격 서열 상으로 이식되어 있는 CDR-이식된 항체 분자를 지칭하기 위한 것이다. 추가 골격 영역 변형은 인간 골격 서열 내에서 만들어질 수 있다.
본원에서 사용될 때, 용어 'CDR-이식된 항체 분자'는 중쇄 및/또는 경쇄가 수용자 항체(예를 들면, 인간 항체)의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 골격 내로 이식된, 기증자 항체(예를 들면, 뮤린 또는 래트 단클론 항체)로부터의 (원하는 경우, 하나 이상의 변형된 CDR을 포함하는) 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체 분자를 지칭한다. 검토를 위해, 문헌(Vaughan et al., Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998)을 참조한다. 한 실시양태에서, 전체 CDR이 전달되기 보다는 오히려, 본원에 기재된 CDR들 중 어느 한 CDR로부터의 하나 이상의 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 골격으로 전달된다(예를 들면, 문헌(Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34) 참조). 한 실시양태에서, 본원에 기재된 CDR들 중 하나 이상의 CDR로부터의 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 골격으로 전달된다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 CDR들 각각으로부터의 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 골격으로 전달된다.
CDR 또는 특이성 결정 잔기가 이식될 때, CDR이 유래된 기증자 항체의 클래스/유형을 유념하면서 마우스, 영장류 및 인간 골격 영역을 포함하는 임의의 적절한 수용자 가변 영역 골격 서열을 사용할 수 있다. 적합하게는, 본 발명에 따른 CDR-이식된 항체는 전술한 CDR들 또는 특이성 결정 잔기들 중 하나 이상의 CDR 또는 특이성 결정 잔기뿐만 아니라 인간 수용자 골격 영역도 포함하는 가변 도메인을 갖는다. 따라서, 한 실시양태에서, 가변 도메인이 인간 수용자 골격 영역 및 비인간 기증자 CDR을 포함하는 중화 CDR-이식된 항체가 제공된다.
본 발명에서 사용될 수 있는 인간 골격의 예는 KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY 및 POM(Kabat et al., supra)이다. 예를 들면, KOL 및 NEWM은 중쇄를 위해 사용될 수 있고, REI는 경쇄를 위해 사용될 수 있고, EU, LAY 및 POM은 중쇄 및 경쇄 둘 다를 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 인간 생식세포주 서열이 사용될 수 있고; 이들은 예를 들면, http://www.vbase2.org/(문헌(Retter et al, Nucl. Acids Res. (2005) 33 (supplement 1), D671-D674) 참조)에서 입수될 수 있다.
본 발명의 CDR-이식된 항체에서, 수용자 중쇄 및 경쇄는 반드시 동일한 항체로부터 유래될 필요가 없고, 원하는 경우, 상이한 쇄로부터 유래된 골격 영역을 갖는 복합 쇄를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 CDR-이식된 항체에서, 골격 영역은 수용자 항체의 골격 영역과 정확히 동일한 서열을 가질 필요가 없다. 예를 들면, 희귀 잔기는 그 수용자 쇄 클래스 또는 유형에서 더 흔히 존재하는 잔기로 교체될 수 있다. 대안적으로, 수용자 골격 영역 내의 선택된 잔기는 기증자 항체 내의 동일한 위치에서 발견된 잔기에 상응하도록 교체될 수 있다(문헌(Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324) 참조). 이러한 교체는 기증자 항체의 친화성을 회복하기 위해 필요한 최소한의 수준으로 유지되어야 한다. 수용자 골격 영역에서 교체될 필요가 있을 수 있는 잔기를 선택하는 프로토콜은 국제 특허출원 공보 제WO 91/09967호에 기재되어 있다.
당분야에서 당업자는 항체가 다양한 번역후 변형을 겪을 수 있다는 것도 이해할 것이다. 이들 변형의 유형 및 정도는 종종 항체를 발현하는 데 사용된 숙주 세포주 및 배양 조건에 의해 좌우된다. 이러한 변형은 글리코실화, 메티오닌 산화, 디케토피페라진 형성, 아스파르테이트 이성질체화 및 아스파라긴 탈아미드화의 변형을 포함할 수 있다. 빈번한 변형은 (문헌(Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995)에 기재된 바와 같이) 카복시펩티다제의 작용으로 인한 카복시-말단 염기성 잔기(예컨대, 라이신 또는 아르기닌)의 상실이다.
한 실시양태에서, 항체 중쇄는 CH1 도메인을 포함하고, 항체 경쇄는 카파 또는 람다 CL 도메인을 포함한다.
생물학적 분자, 예컨대, 항체 또는 단편은 산성 작용기 및/또는 염기성 작용기를 함유함으로써, 순 양전하 또는 음전하를 분자에게 제공한다. 전체 "관찰된" 전하의 양은 물질의 절대적인 아미노산 서열, 3D 구조에서 하전된 기의 국소 환경, 및 분자의 환경적 조건에 의해 좌우될 것이다. 등전점(pI)은 특정 분자 또는 표면이 순 전기 전하를 갖지 않는 pH이다. 한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 항체 또는 단편은 적어도 7의 등전점(pI)을 갖는다. 한 실시양태에서, 항체 또는 단편은 적어도 8, 예컨대, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8 또는 9의 등전점을 갖는다. 한 실시양태에서, 항체의 pI는 8이다. 프로그램, 예컨대, ** ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html(문헌(Walker, The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005), 571-607) 참조)가 항체 또는 단편의 등전점을 예측하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 4 내지 6(각각 HCDR1/HCDR2/HCDR3)의 적어도 1개, 적어도 2개 또는 3개 모두의 중쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다. 이들은 실시예의 CA185_01974 항체의 HCDR1/HCDR2/HCDR3 서열이다.
나아가, 본 발명의 항체는 서열번호 1 내지 3(각각 LCDR1/LCDR2/LCDR3)의 적어도 1개, 적어도 2개 또는 3개 모두의 경쇄 CDR 서열들을 포함할 수 있다. 이들은 실시예의 CA185_01974 항체의 LCDR1/LCDR2/LCDR3 서열이다.
본 발명의 항체는 적합하게는 적어도 서열번호 6의 HCDR3 서열을 포함한다.
전형적으로, 본 발명의 항체는 서열번호 4 내지 6으로부터 선택되는 적어도 1개의 중쇄 CDR 서열 및 서열번호 1 내지 3으로부터 선택되는 적어도 1개의 경쇄 CDR 서열을 포함한다. 본 발명의 항체는 서열번호 4 내지 6으로부터 선택되는 적어도 2개의 중쇄 CDR 서열 및 서열번호 1 내지 3으로부터 선택되는 적어도 2개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 전형적으로 서열번호 4 내지 6(각각 HCDR1/HCDR2/HCDR3)의 3개 모두의 중쇄 CDR 서열 및 서열번호 1 내지 3(각각 LCDR1/LCDR2/LCDR3)의 3개 모두의 경쇄 CDR 서열을 포함한다. 항체는 키메라, 인간 또는 인간화된 항체일 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 19 내지 21(각각 HCDR1/HCDR2/HCDR3)의 적어도 1개, 적어도 2개 또는 3개 모두의 중쇄 CDR 서열도 포함할 수 있다. 이들은 실시예의 CA185_01979 항체의 HCDR1/HCDR2/HCDR3 서열이다.
항체는 전형적으로 서열번호 21의 HCDR3 서열을 포함한다.
본 발명의 항체는 서열번호 1, 17 및 18(각각 LCDR1/LCDR2/LCDR3)의 적어도 1개, 적어도 2개 또는 3개 모두의 경쇄 CDR 서열도 포함할 수 있다. 이들은 실시예의 CA185_01979 항체의 LCDR1/LCDR2/LCDR3 서열이다.
전형적으로, 본 발명의 항체는 서열번호 19 내지 21로부터 선택되는 적어도 1개의 중쇄 CDR 서열 및 서열번호 1, 17 및 18로부터 선택되는 적어도 1개의 경쇄 CDR 서열을 포함한다. 본 발명의 항체는 서열번호 19 내지 21로부터 선택되는 적어도 2개의 중쇄 CDR 서열 및 서열번호 1, 17 및 18로부터 선택되는 적어도 2개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 전형적으로 서열번호 19 내지 21(각각 HCDR1/HCDR2/HCDR3)의 3개 모두의 중쇄 CDR 서열 및 서열번호 1, 17 및 18(각각 LCDR1/LCDR2/LCDR3)의 3개 모두의 경쇄 CDR 서열을 포함한다. 항체는 키메라, 인간 또는 인간화된 항체일 수 있다.
본 발명의 항체는 CA185_01974 항체 및 CA185_01979 항체의 CDR 서열들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 항체는 서열번호 4 내지 6 및 19 내지 21로부터 선택되는 적어도 1개의 HCDR 서열 및/또는 서열번호 1 내지 3, 17 및 18로부터 선택되는 적어도 1개의 LCDR 서열을 포함할 수 있다.
항체는
- 서열번호 4 및 19로부터 선택되는 HCDR1; 및/또는
- 서열번호 5 및 20으로부터 선택되는 HCDR2; 및/또는
- 서열번호 6 및 21로부터 선택되는 HCDR3; 및/또는
- 서열번호 1의 LCDR1; 및/또는
- 서열번호 2 및 17로부터 선택되는 LCDR2; 및/또는
- 서열번호 3 및 18로부터 선택되는 LCDR3
을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 8의 중쇄 가변 영역(HCVR)(CA185_01974의 HCVR) 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 서열번호 7의 경쇄 가변 영역(LCVR)(CA185_01974의 LCVR) 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 적합하게는 서열번호 8의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 7의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
본 발명의 항체는 서열번호 23의 중쇄 가변 영역(HCVR)(CA185_01979의 HCVR) 서열도 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 서열번호 22의 경쇄 가변 영역(LCVR)(CA185_01979의 LCVR) 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 적합하게는 서열번호 23의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 22의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
마찬가지로, 본 발명의 항체는 CA185_01974 및 CA185_01979 항체로부터의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 조합을 포함할 수 있다. 다시 말해, 본 발명의 항체는 서열번호 8 또는 23의 중쇄 가변 영역 및/또는 서열번호 7 또는 22의 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 12(CA185_01974 mIgG1) 또는 13(CA185_01974 mFab(힌지 없음))의 중쇄(H-쇄) 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 서열번호 11의 경쇄(L-쇄) 서열(CA185_01974 카파 경쇄)을 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 전형적으로 서열번호 12/13의 중쇄 서열 및 서열번호 11의 경쇄 서열을 포함한다. 항체는 키메라, 인간 또는 인간화된 항체일 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 27(CA185_01979 mIgG1) 또는 28(CA185_01979 mFab(힌지 없음))의 중쇄 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 서열번호 26의 경쇄 서열(CA185_01979 카파 경쇄)을 포함할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 항체는 서열번호 27/28의 중쇄 서열 및 서열번호 26의 경쇄 서열을 포함한다. 항체는 키메라, 인간 또는 인간화된 항체일 수 있다. 마찬가지로, CA185_01974 및 CA185_01979로부터의 서열들은 조합될 수 있다.
항체는 대안적으로 상기 언급된 특정 서열들 중 한 서열의 변이체일 수 있거나 이러한 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 변이체는 상기 아미노산 서열들 중 임의의 아미노산 서열의 치환, 결실 또는 추가 변이체일 수 있다.
변이체 항체는 상기 논의된 특정 서열로부터의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 최대 10개, 최대 20개 또는 더 많은 수(전형적으로 최대 50개)의 아미노산 치환 및/또는 결실을 포함할 수 있다. "결실" 변이체는 개별 아미노산의 결실, 작은 군의 아미노산, 예컨대, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산의 결실, 또는 보다 더 큰 아미노산 영역의 결실, 예컨대, 특정 아미노산 도메인 또는 다른 특징의 결실을 포함할 수 있다. "치환" 변이체는 전형적으로 하나 이상의 아미노산을 동일한 수의 아미노산으로 대체하고 보존적 아미노산 치환을 만드는 것을 포함한다. 예를 들면, 아미노산은 유사한 성질을 갖는 대안적 아미노산, 예를 들면, 또 다른 염기성 아미노산, 또 다른 산성 아미노산, 또 다른 중성 아미노산, 또 다른 하전된 아미노산, 또 다른 친수성 아미노산, 또 다른 소수성 아미노산, 또 다른 극성 아미노산, 또 다른 방향족 아미노산 또는 또 다른 지방족 아미노산으로 치환될 수 있다. 적합한 치환기를 선택하는 데 사용될 수 있는, 20종의 주요 아미노산들의 일부 특성은 다음과 같다:
Figure pct00001
"유도체" 또는 "변이체"는 일반적으로 서열에서 나타나는 아미노산이 천연 생성 아미노산 대신에 이의 구조적 유사체인 서열을 포함한다. 항체의 기능이 유의하게 악영향을 받지 않는 한, 서열에서 사용된 아미노산은 유도체화될 수도 있거나 변형될, 예를 들면, 표지될 수도 있다.
전술한 유도체 및 변이체는 공지된 기법인 부위 지정 돌연변이유발, 무작위적 돌연변이유발, 또는 핵산의 효소 절단 및/또는 라이게이션(ligation)을 이용함으로써, 항체의 합성 동안 또는 생성후 변형에 의해, 또는 항체가 재조합 형태로 존재할 때 제조될 수 있다.
변이체 항체는 본원에 개시된 아미노산 서열(특히, HCVR/LCVR 서열, 및 H-쇄 및 L-쇄 서열)에 대한 약 60% 초과, 약 70% 초과, 예를 들면, 75% 또는 80%, 바람직하게는 약 85% 초과, 예를 들면, 약 90% 또는 95% 초과의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 나아가, 항체는 본원에 개시된 HCVR/LCVR 서열, 및 H-쇄 및 L-쇄 서열에 대해 개시된 정확한 CDR들을 보유하면서, 이들 서열들에 대한 약 60% 초과, 약 70% 초과, 예를 들면, 약 75% 또는 80%, 전형적으로 약 85% 초과, 예를 들면, 약 90% 또는 95% 초과의 아미노산 동일성을 갖는 변이체일 수 있다. 변이체는 (일부 환경에서 정확한 CDR들을 보유하면서) 본원에 개시된 HCVR/LCVR 서열, 및 H-쇄 및 L-쇄 서열에 대한 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 가질 수 있다.
변이체는 전형적으로 약 60% 내지 약 99%의 동일성, 약 80% 내지 약 99%의 동일성, 약 90% 내지 약 99%의 동일성, 또는 약 95% 내지 약 99%의 동일성을 갖는다. 이 수준의 아미노산 동일성은 전장 폴리펩티드의 크기에 따라 관련 서열번호 서열의 전체 길이 또는 서열의 부분에 걸쳐, 예컨대, 약 20개, 30개, 50개, 75개, 100개, 150개 또는 200개 이상의 아미노산에 걸쳐 확인될 수 있다.
아미노산 서열과 관련하여, "서열 동일성"은 하기 파라미터를 갖는 ClustalW(Thompson et al., 1994, supra)를 이용함으로써 평가되었을 때 언급된 값을 갖는 서열을 지칭한다:
쌍별 정렬 파라미터 -방법: 정확성, 매트릭스: PAM, 갭 개방 벌점(Gap open penalty): 10.00, 갭 연장 벌점(Gap extension penalty): 0.10;
다중 정렬 파라미터 -매트릭스: PAM, 갭 개방 벌점: 10.00, 지연에 대한 % 동일성: 30, 말단 갭의 벌점화: on, 갭 분리 거리: 0, 음성 매트릭스: no, 갭 연장 벌점: 0.20, 잔기 특이적 갭 벌점: on, 친수성 갭 벌점: on, 친수성 잔기: GPSNDQEKR. 특정 잔기에서의 서열 동일성은 단순히 유도체화된 동일한 잔기를 포함하기 위한 것이다.
따라서, 본 발명은 이들 쇄들의 기능 또는 활성을 유지하는 특정 서열 및 변이체를 갖는 항체를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 항체 분자의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역(들)을 코딩하는 단리된 DNA 서열도 제공한다. 따라서, 본 발명은 서열번호 8의 중쇄 가변 영역을 코딩하는, 서열번호 10의 단리된 DNA 서열을 제공한다. 본 발명은 서열번호 7의 경쇄 가변 영역을 코딩하는, 서열번호 9의 단리된 DNA 서열도 제공한다.
본 발명은 서열번호 23의 중쇄 가변 영역을 코딩하는, 서열번호 25의 단리된 DNA 서열도 제공한다. 본 발명은 서열번호 22의 경쇄 가변 영역을 코딩하는, 서열번호 24의 단리된 DNA 서열도 제공한다.
본 발명은 본 발명의 항체 분자의 중쇄(들) 및/또는 경쇄(들)를 코딩하는 단리된 DNA 서열도 제공한다. 적합하게는, DNA 서열은 본 발명의 항체 분자의 중쇄 또는 경쇄를 코딩한다. 따라서, 본 발명은 각각 서열번호 12 및 13의 중쇄를 코딩하는 서열번호 15 또는 16의 단리된 DNA 서열을 제공한다. 본 발명은 서열번호 11의 경쇄를 코딩하는, 서열번호 14의 단리된 DNA 서열도 제공한다.
본 발명은 각각 서열번호 27 및 28의 중쇄를 코딩하는, 서열번호 30 또는 31의 단리된 DNA 서열도 제공한다. 본 발명은 서열번호 26의 경쇄를 코딩하는, 서열번호 29의 단리된 DNA 서열도 제공한다.
적합한 폴리뉴클레오티드 서열은 대안적으로 이들 특정 폴리뉴클레오티드 서열들 중 하나의 변이체일 수 있다. 예를 들면, 변이체는 상기 핵산 서열들 중 임의의 핵산 서열의 치환, 결실 또는 추가 변이체일 수 있다. 변이체 폴리뉴클레오티드는 서열목록에 제공된 서열로부터의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 최대 10개, 최대 20개, 최대 30개, 최대 40개, 최대 50개, 최대 75개 또는 더 많은 수의 핵산 치환 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 일반적으로, 변이체는 1개 내지 20개, 1개 내지 50개, 1개 내지 75개 또는 1개 내지 100개의 치환 및/또는 결실을 갖는다.
적합한 변이체는 본원에 개시된 핵산 서열들 중 어느 한 핵산 서열의 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 70%, 전형적으로 적어도 약 80% 또는 90%, 보다 적합하게는 적어도 약 95%, 97% 또는 99% 상동할 수 있다. 변이체는 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 가질 수 있다. 변이체는 전형적으로 약 60% 내지 약 99%의 동일성, 약 80% 내지 약 99%의 동일성, 약 90% 내지 약 99%의 동일성, 또는 약 95% 내지 약 99%의 동일성을 갖는다. 이 수준의 상동성 및 동일성은 일반적으로 적어도 폴리뉴클레오티드의 코딩 영역에 대해 존재한다. 상동성을 측정하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있고, 당업자는 본 문맥에서 핵산 동일성을 기초로 상동성을 계산한다는 것을 이해할 것이다. 이러한 상동성은 (길이에 따라) 적어도 약 15개, 적어도 약 30개, 예를 들면, 적어도 약 40개, 60개, 100개 또는 200개 이상의 연속 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐 존재할 수 있다. 이러한 상동성은 비변형 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 존재할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 상동성 또는 동일성을 측정하는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면, UWGCG 팩키지는 상동성을 계산하는 데 사용될 수 있는(예를 들면, 그의 디폴트 환경에서 사용될 수 있는) BESTFIT 프로그램을 제공한다(Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395).
PILEUP 및 BLAST 알고리즘은 예를 들면, 문헌(Altschul S.F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10)에 기재된 바와 같이 (전형적으로 그들의 디폴트 환경에서) 상동성을 계산하거나 서열을 일렬로 세우는 데 사용될 수도 있다.
BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공개적으로 입수될 수 있다. 이 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어와 정렬될 때 일부 양의 값을 갖는 역치 점수 T와 일치하거나 이를 충족시키는 길이 W의 짧은 단어를 질의 서열에서 확인함으로써 고득점 서열 쌍(HSP)을 확인하는 단계를 포함한다. T는 이웃 단어 점수 역치로서 지칭된다(Altschul et al, supra). 이 초기 이웃 단어 히트(hit)는 이를 함유하는 HSP를 찾기 위해 검색을 시작하기 위한 시드(seed)로서 작용한다. 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한, 단어 히트는 각각의 서열을 따라 양 방향으로 연장된다. 각각의 방향에서 단어 히트에 대한 연장은 누적 정렬 점수가 하나 이상의 음의 점수화 잔기 정렬의 축적으로 인해 0 이하까지 이르거나; 어느 한 서열의 말단이 도달된 때 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 민감성 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 11의 단어 길이(W), 50의 BLOSUM62 점수화 매트릭스(문헌(Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919) 참조) 정렬(B), 10의 기대치(E), M=5, N=4, 및 두 가닥들의 비교를 사용한다.
BLAST 알고리즘은 2개의 서열들 사이의 유사성의 통계학적 분석을 수행한다(예를 들면, 문헌(Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787) 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성의 한 척도는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열들 사이의 일치가 우연히 일어날 확률의 표시를 제공하는 최소 합계 확률(P(N))이다. 예를 들면, 제1 서열과 제2 서열의 비교 시 최소 합계 확률이 약 1 미만, 전형적으로 약 0.1 미만, 적합하게는 약 0.01 미만, 가장 적합하게는 약 0.001 미만인 경우 서열은 또 다른 서열과 유사한 것으로 간주된다. 예를 들면, 최소 합계 확률은 약 1 내지 약 0.001, 종종 약 0.01 내지 약 0.001의 범위 내에 있을 수 있다.
상동체는 약 3개, 5개, 10개, 15개, 20개 또는 더 많은 수 미만의 돌연변이(이들 각각은 치환, 결실 또는 삽입일 수 있음)에 의해 관련 폴리뉴클레오티드의 서열과 상이할 수 있다. 예를 들면, 상동체는 3개 내지 50개의 돌연변이, 종종 3개 내지 20개의 돌연변이에 의해 상이할 수 있다. 이들 돌연변이는 상동체의 적어도 30개, 예를 들면, 적어도 약 40개, 60개 또는 100개 이상의 연속 뉴클레오티드들의 영역에 걸쳐 측정될 수 있다.
한 실시양태에서, 변이체 서열은 유전 코드의 중복에 의해 서열목록에서 제공된 특정 서열과 상이할 수 있다. DNA 코드는 4종의 주요 핵산 잔기들(A, T, C 및 G)을 갖고 이들을 사용하여 유기체의 유전자에 코딩된 단백질의 아미노산을 나타내는 3 문자 코돈을 "철자로 적는다". DNA 분자를 따라 코돈의 선형 서열은 유전자에 의해 코딩된 단백질(들)의 선형 아미노산 서열로 번역된다. 코드는 20종의 천연 아미노산들을 코딩하는 61개의 코돈들 및 "정지" 신호를 표시하는 3개의 코돈들을 가지면서 고도로 축퇴되어 있다. 따라서, 대다수의 아미노산들이 하나 초과의 코돈에 의해 코딩된다 - 사실상, 여러 아미노산들이 4개 이상의 상이한 코돈들에 의해 코딩된다. 따라서, 본 발명의 변이체 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 또 다른 폴리뉴클레오티드와 동일한 폴리펩티드 서열을 코딩할 수 있으나, 동일한 아미노산을 코딩하기 위한 상이한 코돈의 사용으로 인해 상이한 핵산 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 DNA 서열은 예를 들면, 화학적 프로세싱에 의해 생성된 합성 DNA, cDNA, 게놈 DNA 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA 서열은 당분야에서 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들면, 항체 중쇄 및 경쇄의 부분 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열을, 결정된 DNA 서열로부터 또는 상응하는 아미노산 서열을 기초로 원하는 대로 합성할 수 있다.
벡터를 구축할 수 있는 일반적인 방법, 형질감염 방법 및 배양 방법은 당분야에서 당업자에게 잘 알려져 있다. 이와 관련하여, 문헌("Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing)을 참조한다.
본 발명의 항체를 코딩하는 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포도 제공된다. 본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA 서열을 발현시키기 위해 임의의 적합한 숙주 세포/벡터 시스템을 사용할 수 있다. 세균, 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli) 및 다른 미생물 시스템을 사용할 수 있거나, 진핵, 예를 들면, 포유동물 숙주 세포 발현 시스템도 사용할 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포는 CHO, 골수종 또는 하이브리도마 세포를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA로부터 단백질의 발현을 이끌어내기에 적합한 조건 하에서 본 발명의 벡터를 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 항체 분자를 단리하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 분자를 제조하는 방법도 제공한다.
본원에 기재된 스크리닝 방법은 화합물-삼량체 복합체에 결합할 수 있는 적합한 항체를 확인하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 스크리닝 방법은 관심있는 항체를 테스트하기 위해 수행될 수 있다.
본 발명의 항체는 예를 들면, 표준 ELISA 또는 웨스턴 블롯팅에 의해 화합물-삼량체 복합체에의 결합에 대해 테스트될 수 있다. ELISA 어세이는 표적 단백질과 양성 반응성을 보이는 하이브리도마를 스크리닝하는 데 이용될 수도 있다. 항체의 결합 선택성도 항체와, 표적 단백질을 발현하는 세포의 결합을, 예를 들면, 유동 세포측정(flow cytometry)으로 모니터링함으로써 측정될 수 있다. 따라서, 본 발명의 스크리닝 방법은 ELISA 또는 웨스턴 블롯을 수행함으로써, 또는 유동 세포측정으로 화합물-삼량체 복합체에 결합할 수 있는 항체를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 적어도 하나의 화합물-삼량체 복합체, 즉 화합물-삼량체 복합체 내의 에피토프를 선택적으로(또는 특이적으로) 인식한다. 항체 또는 다른 화합물은 그가 선택성을 보이는 단백질에 우선적 또는 높은 친화성으로 결합하되, 다른 단백질에 실질적으로 결합하지 않거나 낮은 친화성으로 결합할 때 단백질에 "선택적으로 결합하거나" 단백질을 "선택적으로 인식한다". 항체가 상기 논의된 바와 같이 다른 관련 화합물-삼량체 복합체들에 결합하는지 아니면 결합하지 않는지, 또는 상기 항체가 이들을 구별하는지를 확인함으로써 표적인 화합물-삼량체 복합체에 대한 본 발명의 항체의 선택성을 더 연구할 수 있다.
본 발명의 항체는 하나 이상의 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태를 포함하는 화합물-삼량체 복합체에 특이적으로(또는 선택적으로) 결합할 수 있다. 예를 들면, 항체는 TNFα를 포함하는 화합물-삼량체 복합체, TNFβ를 포함하는 화합물-삼량체 복합체 및 CD40L을 포함하는 화합물-삼량체 복합체에 결합할 수 있다. 대안적으로, 항체는 TNF 수퍼패밀리 구성원들 중 하나만을 포함하는 화합물-삼량체 복합체에 특이적으로(또는 선택적으로) 결합할 수 있으나, 임의의 다른 TNF 수퍼패밀리 구성원을 포함하는 화합물-삼량체 복합체에 특이적으로(또는 선택적으로) 결합할 수 없다. 예를 들면, 항체는 TNFα를 포함하는 화합물-삼량체 복합체에 결합할 수 있으나, TNFβ를 포함하는 화합물-삼량체 복합체 또는 CD40L을 포함하는 화합물-삼량체 복합체에 결합할 수 없다. 항체는 최대 2종, 3종, 4종 또는 최대 모든 종류의 TNF 수퍼패밀리 구성원들을 포함하는 화합물-삼량체 복합체에 특이적으로(또는 선택적으로) 결합할 수 있다.
특이적(또는 선택적)에 의해, 항체가 TNF 수퍼패밀리 삼량체의 부재 하에서 테스트 화합물을 포함할 수 있거나 테스트 화합물의 부재 하에서 TNF 수퍼패밀리 구성원 삼량체를 포함할 수 있는 임의의 다른 분자에 대한 유의한 교차반응성을 갖지 않으면서 관심있는 화합물-삼량체 복합체에 결합한다는 것이 이해될 것이다. 교차반응성은 본원에 기재된 임의의 적합한 방법에 의해 평가될 수 있다. 화합물-삼량체 복합체에 대한 항체와, 화합물-삼량체 복합체를 제외한 분자의 교차반응성은 항체가 관심있는 화합물-삼량체 복합체에 결합하는 강도의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 100%만큼 강하게 다른 분자에 결합하는 경우 유의한 것으로서 간주될 수 있다. 화합물-삼량체 복합체에 특이적인(또는 선택적인) 항체는 화합물-삼량체 복합체에 결합하는 강도의 약 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25% 또는 20% 미만의 강도로 또 다른 분자에 결합할 수 있다. 항체는 화합물-삼량체 복합체에 결합하는 강도의 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만 또는 약 5% 미만, 약 2% 미만 또는 약 1% 미만의 강도로 다른 분자에 결합할 수 있다. 항체는 (i) 화합물의 부재 하에서의 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태 및/또는 (ii) TNF 수퍼패밀리 구성원 삼량체의 부재 하에서의 화합물에 비해 화합물-삼량체 복합체에 특이적으로(또는 선택적으로) 결합한다.
항체가 화합물-삼량체 복합체에 결합하는 속도는 본원에서 "결합" 속도 또는 kon-ab로서 지칭되고, 항체가 화합물-삼량체 복합체로부터 해리되는 속도는 본원에서 "해리" 속도 또는 koff-ab로서 지칭된다. 본원에서 사용될 때, 기호 "KD-ab"는 화합물-삼량체 복합체에 대한 항체의 결합 친화성(해리 상수)을 의미한다. KD-ab는 koff-ab/kon-ab로서 정의된다. 항체는 화합물-삼량체 복합체 및 항체 피크 강도의 질량 분광 분석에 의해 분 단위로 측정될 수 있는 느린 "결합" 속도를 가질 수 있다. 항체에 대한 KD-ab 값은 상이한 항체 : 화합물-삼량체 복합체 비에서 이 측정을 반복함으로써 평가될 수 있다.
화합물-삼량체 복합체에의 결합에 대한 항체의 KD-ab 값은 화합물의 부재 하에서의 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원에의 결합에 대한 항체의 KD-ab 값 및/또는 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원의 부재 하에서의 화합물에의 결합에 대한 항체의 KD-ab 값보다 적어도 약 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배 또는 400배 더 낮을 수 있다. 화합물-삼량체 복합체에의 결합에 대한 항체의 KD-ab 값은 테스트 화합물의 부재 하에서의 TNF 수퍼패밀리 수용체에 결합하는 TNF 수퍼패밀리 삼량체의 KD-ab 값의 적어도 약 10배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배 또는 적어도 약 300배 감소될 수 있다. 즉, 화합물-삼량체 복합체에 대한 항체의 결합 친화성은 전형적으로 화합물의 부재 하에서의 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원에 대한 항체의 결합 친화성 및/또는 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원의 부재 하에서의 화합물에 대한 항체의 결합 친화성에 비해 적어도 약 10배, 적합하게는 적어도 약 100배, 보다 적합하게는 적어도 약 200배, 가장 적합하게는 적어도 약 300배 증가된다.
결합 친화성은 결합 친화성(KD-ab)의 면에서 제공될 수 있고 임의의 적절한 단위, 예컨대, μM, nM 또는 pM으로 제공될 수 있다. KD-ab 값이 작을수록 화합물-삼량체 복합체에 대한 항체의 결합 친화성이 커진다.
화합물-삼량체 복합체에의 결합에 대한 항체의 KD-ab 값은 화합물의 부재 하에서의 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원에의 결합에 대한 항체의 KD-ab 값 및/또는 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원의 부재 하에서의 화합물에의 결합에 대한 항체의 KD-ab 값보다 적어도 약 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배 또는 100배 더 낮을 수 있거나 훨씬 더 낮을 수 있다.
화합물의 부재 하에서의 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원에의 결합에 대한 항체의 KD-ab 값 및/또는 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원의 부재 하에서의 화합물에의 결합에 대한 항체의 KD-ab 값에 비해 화합물-삼량체 복합체에의 결합에 대한 항체의 KD-ab 값의 감소는 화합물의 부재 하에서 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원에 결합하는 항체 및/또는 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원의 부재 하에서 화합물에 결합하는 항체에 비해 화합물-삼량체 복합체에 결합하는 항체의 결합 속도(kon-ab)의 증가; 및/또는 화합물의 부재 하에서 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원에 결합하는 항체 및/또는 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원의 부재 하에서 화합물에 결합하는 항체에 비해 해리 속도(koff-ab)의 감소로부터 비롯될 수 있다.
화합물-삼량체 복합체에 결합하는 항체의 결합 속도(kon-ab)는 일반적으로 화합물의 부재 하에서 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원에 결합하는 항체 및/또는 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원의 부재 하에서 화합물에 결합하는 항체의 결합 속도에 비해 증가된다. 화합물-삼량체 복합체에 결합하는 항체의 해리 속도(koff-ab)는 일반적으로 화합물의 부재 하에서 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원에 결합하는 항체 및/또는 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원의 부재 하에서 화합물에 결합하는 항체의 해리 속도에 비해 감소된다. 가장 전형적으로, 화합물-삼량체 복합체에 결합하는 항체의 결합 속도(kon-ab)는 화합물의 부재 하에서 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원에 결합하는 항체 및/또는 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원의 부재 하에서 화합물에 결합하는 항체에 비해 증가되고, 화합물-삼량체 복합체에 결합하는 항체의 해리 속도(koff-ab)는 화합물의 부재 하에서 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원에 결합하는 항체 및/또는 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원의 부재 하에서 화합물에 결합하는 항체에 비해 감소된다.
화합물-삼량체 복합체에 결합하는 항체의 kon-ab 값은 화합물의 부재 하에서 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원에 결합하는 항체 및/또는 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원의 부재 하에서 화합물에 결합하는 항체의 kon-ab 값에 비해 적어도 약 1.5배 또는 적어도 2배, 전형적으로 적어도 약 3배 증가될 수 있고/있거나, 화합물-삼량체 복합체에 결합하는 항체의 koff-ab 값은 화합물의 부재 하에서 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원에 결합하는 항체 및/또는 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원의 부재 하에서 화합물에 결합하는 항체의 koff-ab 값에 비해 적어도 약 2배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 보다 적합하게는 적어도 약 90배 감소될 수 있다.
임의의 적절한 기법, 예를 들면, 표면 플라스몬 공명, 질량 분광측정 및 등온 열량측정을 이용하여 kon-ab, koff-ab 및 KD-ab 값을 측정할 수 있다.
화합물-삼량체 복합체에 결합하는 항체의 KD-ab 값은 1 nM, 900 pM, 700 pM, 500 pM, 100 pM 또는 10 pM 이하(전형적으로 최소 약 1 pM)일 수 있다. 본 발명의 항체는 바람직하게는 고친화성, 예를 들면, 피코몰 범위 내의 친화성으로 본 발명의 화합물-삼량체 복합체에 결합할 것이다. 화합물-삼량체 복합체에 결합하는 항체의 KD-ab 값은 1 nM 이하, 900 pM 이하, 700 pM 이하, 500 pM 이하, 400 pM 이하, 300 pM 이하, 200 pM 이하, 100 pM 이하, 90 pM 이하, 80 pM 이하, 70 pM 이하, 60 pM 이하, 50 pM 이하, 40 pM 이하, 30 pM 이하, 20 pM 이하 또는 10 pM 이하(마찬가지로, 최소 약 1 pM)일 수 있다.
일단 적합한 항체가 확인되고 선택되면, 항체의 아미노산 서열을 당분야에서 공지된 방법으로 확인될 수 있다. 축퇴 프라이머를 사용하여 항체를 코딩하는 유전자를 클로닝할 수 있다. 항체를 상용적인 방법으로 재조합적으로 생성할 수 있다.
본 발명의 항체는 H-쇄/L-쇄, HCVR/LCVR 또는 CDR 서열의 면에서 상기 정의된 항체와 TNFα에의 결합에 대해 경쟁할 수 있거나, 이러한 항체와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 구체적으로, 항체는 서열번호 4/5/6/1/2/3 또는 서열번호 19/20/21/1/17/18의 HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 서열 조합을 포함하는 항체와 TNFα에의 결합에 대해 경쟁할 수 있거나, 이러한 항체와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 항체는 서열번호 8/7 또는 서열번호 23/22의 HCVR 및 LCVR 서열 쌍을 포함하는 항체와 TNFα에의 결합에 대해 경쟁할 수 있거나, 이러한 항체와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
용어 "에피토프"는 항체에 의해 결합되는 항원의 영역이다. 에피토프는 구조적 또는 기능적 에피토프로서 정의될 수 있다. 기능적 에피토프는 일반적으로 구조적 에피토프의 서브세트이고 상호작용의 친화성에 직접적으로 기여하는 잔기를 갖는다. 에피토프는 입체구조적 에피토프일 수도 있고, 즉 비선형 아미노산들로 구성될 수도 있다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 분자의 화학적 활성 표면 기, 예컨대, 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 기 또는 설포닐 기인 결정인자를 포함할 수 있고, 일부 실시양태에서 특정 3차원적 구조적 특징 및/또는 특정 전하 특징을 가질 수 있다.
당분야에서 공지된 통상적인 방법을 이용함으로써 항체가 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하거나 기준 항체와 결합에 대해 경쟁하는지를 용이하게 확인할 수 있다. 예를 들면, 테스트 항체가 본 발명의 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지를 확인하기 위해, 기준 항체가 포화 조건 하에서 단백질 또는 펩티드에 결합하게 한다. 그 다음, 단백질 또는 펩티드에 결합하는 테스트 항체의 능력을 평가한다. 테스트 항체가 기준 항체와의 포화 결합 후 단백질 또는 펩티드에 결합할 수 있는 경우, 테스트 항체가 기준 항체와 상이한 에피토프에 결합한다는 결론을 내릴 수 있다. 다른 한편으로, 테스트 항체가 기준 항체와의 포화 결합 후 단백질 또는 펩티드에 결합할 수 없는 경우, 테스트 항체는 본 발명의 기준 항체에 의해 결합되는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
항체가 기준 항체와 결합에 대해 경쟁하는지를 확인하기 위해, 전술한 결합 방법을 두 배향으로 수행한다. 제1 배향에서, 기준 항체가 포화 조건 하에서 단백질/펩티드에 결합하게 한 후, 테스트 항체와 단백질/펩티드 분자의 결합을 평가한다. 제2 배향에서, 테스트 항체가 포화 조건 하에서 단백질/펩티드에 결합하게 한 후, 기준 항체와 단백질/펩티드의 결합을 평가한다. 두 배향에서 제1 (포화) 항체만이 단백질/펩티드에 결합할 수 있는 경우, 테스트 항체와 기준 항체는 단백질/펩티드에의 결합에 대해 경쟁한다는 결론을 내린다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 기준 항체와 결합에 대해 경쟁하는 항체는 반드시 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하지 않을 수 있으나, 중첩 또는 인접 에피토프에 결합함으로써 기준 항체의 결합을 입체적으로 차단할 수 있다.
두 항체들은 각각의 항체가 다른 항체와 항원의 결합을 경쟁적으로 억제(차단)하는 경우 동일한 또는 중첩 에피토프에 결합한다. 즉, 경쟁 결합 어세이에서 측정될 때 1배, 5배, 10배, 20배 또는 100배 과량의 한 항체는 다른 항체의 결합을 적어도 50%, 75%, 90% 또는 심지어 99%까지 억제한다(예를 들면, 문헌(Junghans et al., Cancer Res, 1990:50:1495-1502) 참조). 대안적으로, 한 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는, 항원의 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이들이 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, 두 항체들은 동일한 에피토프를 갖는다. 한 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 일부 아미노산 돌연변이들이 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, 두 항체들은 중첩 에피토프를 갖는다.
그 다음, 테스트 항체의 결합의 관찰된 결여가 사실상 기준 항체와 동일한 에피토프에의 결합에 기인하는지, 또는 입체적 차단(또는 또 다른 현상)이 관찰된 결합의 결여의 원인인지를 확인하기 위해 추가 상용적인 실험(예를 들면, 펩티드 돌연변이 및 결합 분석)을 수행할 수 있다. ELISA, RIA, 표면 플라스몬 공명, 유동 세포측정, 또는 당분야에서 이용가능한 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체 결합 어세이를 이용하여 이 종류의 실험을 수행할 수 있다.
본 발명의 항체는 본원에 기재된 본 발명의 화합물을 확인하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 표적 인게이지먼트 바이오마커로서 사용될 수도 있다. 표적 인게이지먼트 바이오마커는 인게이지먼트, 즉 리간드와 관심있는 표적의 결합을 검출하는 데 사용될 수 있다. 본 경우에서, 본 발명의 항체는 본 발명의 화합물과 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태의 복합체에만 결합한다. 따라서, 본 발명의 항체가 화합물-삼량체 복합체에 결합할 수 있는 경우, 이것은 리간드(화합물)가 관심있는 표적(TNF 수퍼패밀리 구성원 삼량체)에 결합하였다는 증거이다. 본 발명의 항체는 본원에 기재된 검출 가능한 마커를 추가하도록 변형될 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물과 표적 TNF 수퍼패밀리 구성원의 인게이지먼트는 이러한 항체를 사용함으로써 검출될 수 있다.
샘플이 본 발명에 따라 치료되는 대상체로부터 채취될 수 있는 경우, 표적 인게이지먼트 바이오마커로서의 본 발명의 항체의 사용은 임상 또는 임상전 환경에서 잠재적으로 유용하다. 대상체를 치료하기 위해 사용된 화합물이 표적 TNF 수퍼패밀리 구성원에 결합하였는지를 확인하기 위해 대상체로부터 얻은 샘플을 본 발명의 항체로 처리할 수 있다. 대상체로부터 얻은 샘플은 임의의 적절한 조직 또는 체액, 예컨대, 혈액, 혈장 또는 소변일 수 있다. 대상체는 포유동물, 전형적으로 인간일 수 있다.
따라서, 본 발명은, 대상체로부터 얻은 샘플에서, TNF 수퍼패밀리 구성원인 삼량체 단백질 및 TNF 수퍼패밀리 구성원인 삼량체 단백질에 결합할 수 있는 화합물을 포함하는 화합물-삼량체 복합체를 검출하기 위한 표적 인게이지먼트 바이오마커로서의 본 발명의 항체의 용도로서, 상기 화합물-삼량체 복합체는, 필요한 TNF 수퍼패밀리 수용체에 결합하고 상기 수용체를 통해 삼량체에 의해 유도되는 신호전달을 조절하는 것인 용도를 제공한다. 수퍼패밀리 구성원은 적합하게는 TNFα이고/이거나 조절은 TNFR1 신호전달의 길항작용이다.
유사하게, 본 발명은
(a) 화합물을 투여받은 대상체로부터 샘플을 얻는 단계;
(b) 검출 가능한 본 발명의 항체를 상기 샘플 및 대조군 샘플과 접촉시키는 단계; 및
(c) 상기 검출 가능한 항체와 상기 샘플 및 상기 대조군 샘플의 결합의 양을 측정하는 단계
를 포함하는, 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원에 대한 화합물의 표적 인게이지먼트를 검출하는 방법으로서, 화합물-삼량체 복합체는, 필요한 수용체에 결합하고 이 수용체를 통해 삼량체에 의해 유도되는 신호전달을 조절하고, 상기 검출 가능한 항체와 상기 대조군 샘플의 결합보다 더 큰, 상기 검출 가능한 항체와 상기 샘플의 결합은, 상기 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원에 대한 상기 화합물의 표적 인게이지먼트를 나타내는 것인 방법을 제공한다.
항체를 검출하는 방법 및 항체와 표적의 결합의 양을 측정하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있다. 전형적으로, 항체는 표지될 수 있다. 이러한 표지는 효소, 바이오틴/스트렙타비딘, 형광 단백질 및 형광 염료를 포함한다.
항체와 표적의 결합은 예를 들면, 면역어세이 방법에 의해 측정될 수 있다. 면역어세이는 웨스턴 블롯팅, ELISA, 면역형광, 면역조직화학 및 유동 세포측정을 포함한다. 임의의 적절한 기법이 항체와 TNF 수퍼패밀리 구성원의 결합을 측정하는 데 이용될 수 있다.
전술한 방법에서, 검출 가능한 항체와, 화합물을 투여받은 대상체로부터의 샘플의 결합을 상기 항체와 대조군 샘플의 결합과 비교한다. 대조군 샘플은 임의의 적절한 샘플일 수 있다. 대조군 샘플은 전형적으로 화합물의 부재 하에서 항체와 TNF 수퍼패밀리 구성원의 결합을 대표하는 "음성 대조군"이다. 예를 들면, 샘플은 화합물의 투여 전에 환자로부터 얻을 수 있다. 대조군은 예를 들면, 화합물의 부재 하에서 상이한 대상체로부터의 다수의 샘플들로부터 미리 결정된 측정치에 기초할 수도 있다. 약 5명, 10명, 20명, 50명 또는 100명의 대상체들로부터의 측정치가 대조군 값을 결정하는 데 사용될 수 있다. 대조군은 평균 값, 또는 수득된 모든 값들의 범위일 수 있다.
실험 조건, 예를 들면, 검출 방법은 화합물을 투여받은 대상체로부터의 샘플의 경우와 대조군 샘플의 경우에서 동일하다. 항체도 두 경우들에서 동일하다.
항체와 대조군 샘플의 결합에 비해 검출 가능한 항체와 화합물을 투여받은 환자로부터의 샘플의 더 큰 결합(증가된 결합)은 화합물과 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원의 표적 인게이지먼트를 나타낸다. 다시 말해, 대조군에 비해 화합물을 투여받은 환자로부터의 샘플에 대한 동등한 또는 더 낮은 결합(감소된 결합)은 상기 화합물의 표적 인게이지먼트가 없다는 것을 나타낸다. 다시 말해, 두 양들의 유의한 차이가 없다는 것은 표적 인게이지먼트가 없다는 것을 나타낸다.
당업자는 언제 대조군에 비해 증가된 결합이 있는지를 용이하게 확인할 수 있다. 예를 들면, 대조군이 데이터의 범위일 때, 데이터의 퍼짐, 대조군 데이터와 해당 샘플에서의 항체의 검출된 결합의 차이, 및 계산된 신뢰 수준을 기초로 표적 인게이지먼트를 확인할 수 있다. 해당 샘플에 대한 검출된 결합이 임의의 음성 대조군에서 검출된 결합의 최대량보다 더 높을 때 표적 인게이지먼트를 확인하는 것도 가능하다.
항체의 결합이 대조군 범위에서 가장 높은 양에 비해 약 30% 이상 증가되는 경우, 표적 인게이지먼트가 검출될 수 있다. 항체의 결합이 대조군 범위에 비해 약 40% 이상 또는 약 50% 이상 증가되는 경우, 표적 인게이지먼트가 검출될 수도 있다. 이것은 대조군이 평균 값이거나, 화합물의 투여 전 환자로부터의 샘플에 기초한 단일 값일 때 적용된다. 당연히 대조군에 비해 백분율 증가에 대한 상한은 없다.
본 발명의 항체는 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원의 입체구조적 변화를 유도하는 화합물을 스크리닝하는 데 사용될 수 있고, 이때 상기 입체구조적 변화는 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원의 결합 시 필요한 TNF 수퍼패밀리 수용체의 신호전달을 조절한다. 수퍼패밀리 구성원은 전형적으로 TNFα이고/이거나, 조절은 TNFR1 신호전달의 길항작용이다.
본 발명의 항체는 병적 상태의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다. 따라서, 인체 또는 동물체에 대해 실시되는 요법에 사용하기 위한 본 발명의 항체가 제공된다. 본 발명은 본 발명의 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 요법도 제공한다. 본 발명의 항체는 본원에 기재된 임의의 치료 적응증 및/또는 약학 조성물에서 사용될 수 있다.
항체 어세이
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명은 화합물 단독에의 결합 또는 화합물의 부재 하에서의 TNF 수퍼패밀리 구성원에의 결합에 비해 본원에 기재된 적어도 하나의 화합물-삼량체 복합체에 선택적으로 결합하는 항체를 제공한다. 이 항체는 동일한 성질을 갖는 추가 화합물 또는 화합물의 클래스를 확인하는 데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 표준 기법을 이용하여 TNF 수퍼패밀리 구성원에 대한 단클론 항체를 생성할 수 있다. 그 다음, 이 항-TNF 수퍼패밀리 구성원 항체를 본 발명의 화합물-삼량체 복합체에 결합하는 항체, 또는 TNF 수퍼패밀리 구성원에의 결합이 본원에 기재된 화합물에 의해 억제되는 단클론 항체에 대해 스크리닝할 수 있다.
대안적으로, 특정 TNF 수퍼패밀리 구성원 삼량체-화합물 복합체에 대한 단클론 항체를 생성할 수 있다. 그 다음, 이 항체를 화합물의 부재 하에서의 TNF 수퍼패밀리 구성원에의 결합에 비해 화합물의 존재 하에서 TNF 수퍼패밀리 구성원에 선택적으로 결합하는 단클론 항체에 대해 스크리닝할 수 있다.
일단 화합물 단독에의 결합 또는 화합물의 부재 하에서의 TNF 수퍼패밀리 구성원에의 결합에 비해 본 발명의 적어도 하나의 화합물-삼량체 복합체에 선택적으로 결합하는 항체가 생성되면, 이 항체는 테스트 화합물과 동일한 활성을 갖는 다른 화합물을 스크리닝하는 데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은
a) 결합 어세이를 수행하여 본 발명의 항체에 대한 테스트 화합물-삼량체 복합체의 결합 친화성을 측정하는 단계;
b) 단계 (a)에서 측정된 결합 친화성을, 단계 (a)에서 언급된 항체에 고친화성으로 결합하는 것으로 알려진 상이한 화합물-삼량체 복합체의 결합 친화성과 비교하는 단계; 및
c) 그의 측정된 결합 친화성이 단계 (b)에서 언급된 비교에 비추어 고려할 때 허용 가능한 경우, 단계 (a)의 화합물-삼량체 복합체에 존재하는 화합물을 선택하는 단계
를 포함하는, 본 발명의 화합물을 확인하는 어세이를 제공한다.
인식될 바와 같이, 상기 단계 (b)에서 언급된 "상이한" 화합물-삼량체 복합체는 일반적으로 단계 (a)의 화합물-삼량체 복합체와 동일한 삼량체를 함유하되 상이한 화합물을 함유하는 복합체일 것이다. 화합물은 화합물 (1) 내지 (6) 중 임의의 화합물일 수 있다.
단계 (c)에서 "허용 가능한"은 단계 (a)에서 언급된 화합물-삼량체 복합체의 결합 친화성 및 단계 (b)에서 언급된 상이한 화합물-삼량체 복합체의 결합 친화성이 대략적으로 비교 가능하다는 것을 의미한다. 상기 항체와 상기 복합체의 선택적 결합은 전형적으로 화합물의 부재 하에서의 상기 항체와 TNF 수퍼패밀리 구성원의 결합 또는 TNF 수퍼패밀리 구성원의 부재 하에서의 상기 항체와 화합물의 결합과 비교함으로써 측정된다.
단계 (a)에서 언급된 화합물-삼량체 복합체의 결합 친화성은 일반적으로 단계 (b)에서 언급된 상이한 화합물-삼량체 복합체의 결합 친화성보다 더 우수할 것이다. 적합하게는, 단계 (b)에서 언급된 상이한 화합물-삼량체 복합체의 결합 친화성에 비해 단계 (a)에서 언급된 화합물-삼량체 복합체의 결합 친화성의 차이는 10배, 20배, 50배, 100배, 200배 또는 500배의 한계 이내에 있을 것이다.
본 발명의 항체를 사용하여 화합물의 라이브러리를 분석할 수 있다. 라이브러리 화합물을 TNF 수퍼패밀리 구성원의 존재 및 부재 하에서 상기 항체와 함께 인큐베이션할 수 있다. TNF 수퍼패밀리 구성원 및 화합물 둘 다의 존재 하에서만 본 발명의 항체에 결합하는 화합물-삼량체 복합체의 부분을 형성하는 화합물은 본원에 기재된 화합물과 동일한 활성을 갖는 후보일 가능성이 높다. 그 다음, 본원에 개시된 어세이를 이용하여 테스트 화합물이 본원에 기재된 화합물인지를 확인할 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 항체가 어세이에서 사용될 수 있다. 본 발명의 임의의 화합물과 특정 TNF 수퍼패밀리 구성원의 복합체에 결합할 수 있는 일반적인 항체는 본 발명의 항체 어세이에서 사용될 수 있다.
상이한 화합물-삼량체 복합체에 특이적인 본 발명의 다수의 항체들의 패널은 본 발명의 항체 어세이에서 사용될 수 있다. 항체의 패널은 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개 또는 적어도 50개의 항체들(예를 들면, 최대 75개의 항체들)을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 어세이는 짧은 시간에 걸쳐 많은 수의 테스트 화합물들을 스크리닝하여 본 발명의 화합물을 확인할 수 있는 고속대량 어세이(high throughput assay)일 수 있다.
TNF 수퍼패밀리 구성원들 및 이들의 수용체는 정제될 수 있거나 혼합물, 예컨대, 배양된 세포, 조직 샘플, 체액 또는 배양 배지에 존재할 수 있다. 정성적 또는 정량적 어세이가 개발될 수 있고, 이때 정량적 어세이는 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태에 대한 테스트 화합물의 결합 파라미터(친화성 상수 및 동역학), 및 필요한 TNF 수용체에 대한 화합물-삼량체 복합체의 결합 파라미터를 확인하는 데 유용하다.
TNF 수퍼패밀리 구성원 및 화합물을 포함하는 샘플은 불안정화제를 추가로 포함할 수 있다. 카오트로프(chaotrope)로도 알려진 불안정화제는 낮은 몰 농도(예를 들면, 1 M)의 우레아, 구아니딘 또는 아세토니트릴을 포함하고, 높은 농도(예를 들면, 6 M 이상)의 이들 시약들은 TNFα 삼량체의 완전한 해리 및 성분 TNFα 단량체 서브유닛의 비폴딩을 야기할 것이다. 불안정화제는 전형적으로 5% 또는 10% 이상의 농도의 DMSO일 수 있다.
테스트 화합물은 상기 논의된 성질들 중 임의의/모든 성질들을 가질 수 있다.
TNF 수퍼패밀리 및 이들의 수용체
현재 공지된 22종의 TNF 수퍼패밀리 구성원들이 존재한다: TNFα(TNFSF1A), TNFβ(TNFSF1B), CD40L(TNFSF5), BAFF(TNFSF13B/BlyS), APRIL(TNFSF13), OX40L(TNFSF4), RANKL(TNFSF11/TRANCE), TWEAK(TNFSF12), TRAIL(TNFSF10), TL1A(TNFSF15), LIGHT(TNFSF14), 림프독소(Lymphotoxin), 림프독소 β(TNFSF3), 4-1BBL(TNFSF9), CD27L(TNFSF7), CD30L(TNFSF8), EDA(엑토디스플라신(Ectodysplasin)), EDA-A1(엑토디스플라신 A1), EDA-A2(엑토디스플라신 A2), FASL(TNFSF6), NGF 및 GITRL(TNFSF18).
TNF 수퍼패밀리 구성원은 전형적으로 TNFα이다. TNFα는 가용성 형태(TNFαs) 및 막 결합형 형태(TNFαm) 둘 다로 존재한다. TNFα가 본원에서 언급될 때, 이것은 TNFαs 형태 및 TNFαm 형태 둘 다를 포괄한다. TNFα는 가장 적합하게는 TNFαs 형태로 존재한다. TNFαs는 (전술한 바와 같이) 서열번호 35 또는 서열번호 36의 서열, 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
본 발명의 어세이는 22종의 공지된 TNF 수퍼패밀리 구성원들을 포함하는 임의의 TNF 수퍼패밀리 구성원들 중 적어도 하나의 TNF 수퍼패밀리 구성원의 조절제를 확인하는 데 이용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 어세이는 임의의 TNF 수퍼패밀리 구성원, 특히 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태에 결합하고 필요한 TNF 수용체에 결합할 수 있는 입체구조로 이 삼량체를 안정화시키고 상기 수용체를 통한 신호전달을 조절하는 화합물을 확인하는 데 이용될 수 있다. 특히, 본 발명의 어세이는 TNFα 또는 CD40L, 특히 TNFα 또는 심지어 TNFαs의 조절제를 확인하는 데 이용된다.
본원에 기재된 화합물은 22종의 공지된 TNF 수퍼패밀리 구성원들을 포함하는 임의의 TNF 수퍼패밀리 구성원들 중 적어도 하나의 TNF 수퍼패밀리 구성원의 조절제일 수 있다. 구체적으로, TNF 수퍼패밀리 구성원은 TNFα 또는 CD40L, 특히 TNFα 또는 심지어 TNFαs이다.
본 발명의 화합물-삼량체 복합체는 22종의 공지된 TNF 수퍼패밀리 구성원들을 포함하는 삼량체 형태의 임의의 TNF 수퍼패밀리 구성원을 포함할 수 있다. TNF 수퍼패밀리 구성원은 전형적으로 TNFα 또는 CD40L이다. TNF 수퍼패밀리 구성원은 TNFα, 가장 적합하게는 TNFαs일 수 있다.
TNF 수퍼패밀리의 구성원은 TNF 수용체에 결합하고 이 수용체를 통해 신호전달을 시작한다. 현재 34종의 공지된 TNF 수용체들이 존재한다: 4-1BB(TNFRSF9/CD137), NGF R(TNFRSF16), BAFF R(TNFRSF13C), 오스테오프로테게린(Osteoprotegerin)(TNFRSF11B), BCMA(TNFRSF17), OX40(TNFRSF4), CD27(TNFRSF7), RANK(TNFRSF11A), CD30(TNFRSF8), RELT(TNFRSF19L), CD40(TNFRSF5), TACI(TNFRSF13B), DcR3(TNFRSF6B), TNFRH3(TNFRSF26), DcTRAIL R1(TNFRSF23), DcTRAIL R2(TNFRSF22), TNF-R1(TNFRSF1A), TNF-R2(TNFRSF1B), DR3(TNFRSF25), TRAIL R1(TNFRSF10A), DR6(TNFRSF21), TRAIL R2(TNFRSF10B), EDAR, TRAIL R3(TNFRSF10C), Fas(TNFRSF6/CD95), TRAIL R4(TNFRSF10D), GITR(TNFRSF18), TROY(TNFRSF19), HVEM(TNFRSF14), TWEAK R(TNFRSF12A), TRAMP(TNFRSF25), 림프독소 β R(TNFRSF3) 및 XEDAR.
TNF 수용체는 적합하게는 TNF-R1(TNFR1) 또는 TNF-R2(TNFR2)이다. TNF-R이 본원에서 언급될 때, 이것은 TNF-R1 및 TNF-R2의 세포외 도메인(ECD)을 포함하는 TNF-R1 및 TNF-R2 둘 다를 포괄한다. 본 발명의 어세이는 임의의 필요한 TNF 수퍼패밀리 수용체를 통한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 신호전달을 조절하는 화합물을 확인하는 데 이용될 수 있다. 본 발명의 어세이는 TNF-R1, TNF-R2 또는 CD40을 통한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 신호전달을 조절하는 화합물을 확인하는 데 이용될 수 있다. TNF 수퍼패밀리 구성원은 TNFα일 수 있고, TNF 수용체는 TNF-R1 또는 TNF-R2일 수 있다. 구체적으로, TNF 수퍼패밀리 구성원은 TNFα일 수 있고, TNF 수용체는 TNF-R1일 수 있다. 보다 구체적으로, TNF 수퍼패밀리 구성원은 TNFαs일 수 있고, TNF 수용체는 TNF-R1일 수 있다. 본 발명의 어세이는 TNF-R1을 통한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 신호전달을 특이적으로 조절함으로써 작용하는 화합물을 확인하는 데 이용될 수 있다. 구체적으로, 화합물은 TNF-R1을 통한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 신호전달을 조절함으로써 작용할 수 있으나, TNF-R2를 통한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 신호전달에 영향을 미치지 않을 수 있다.
본 발명의 화합물-삼량체 복합체는 34종의 공지된 TNF 수용체들을 포함하는 적어도 하나의 TNF 수용체를 통한 TNF 수퍼패밀리 구성원 신호전달을 조절할 수 있다. TNF 수용체는 전형적으로 TNF-R1, TNF-R2 또는 CD40L이다.
구체적으로, TNF 수퍼패밀리 구성원은 TNFα이고, TNF 수용체는 TNF-R1 또는 TNF-R2이다. TNF 수퍼패밀리 구성원은 보다 적합하게는 TNFα이고, TNF 수용체는 TNF-R1이다. 가장 적합하게는, TNF 수퍼패밀리 구성원은 TNFαs이고, TNF 수용체는 TNF-R1이다.
치료 적응증
TNFα는 TNF 수퍼패밀리의 전형적인 구성원이다. TNFα는 면역 조절 및 염증성 반응을 매개하는 다면발현성 사이토카인이다. 생체내에서, TNFα는 세균, 기생충 및 바이러스 감염에 대한 반응에도 관여하는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, TNFα는 류마티스성 관절염(RA), (크론병을 포함하는) 염증성 장 질환, 건선, 알츠하이머병(AD), 파킨슨병(PD), 통증, 간질, 골다공증, 천식, 패혈증, 열병, 전신 홍반성 루푸스(SLE) 및 다발성 경화증(MS), 및 암에서 역할을 하는 것으로 알려져 있다. TNFα는 근위축성 측삭 경화증(ALS), 허혈성 졸중, 면역 복합체 매개 사구체신염, 루푸스 신염(LN), 항호중구 세포질 항체(ANCA-) 관련 사구체신염, 최소 변화 질환, 당뇨병성 신장병증(DN), 급성 신장 손상(AKI), 폐쇄성 요로병증, 신장 동종이식 거부, 시스플라틴에 의해 유도된 AKI 및 폐쇄성 요로병증에서도 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
TNF 수퍼패밀리의 다른 구성원은 자가면역 질환 및 면역 결핍에 관여하는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, TNF 수퍼패밀리의 구성원은 RA, SLE, 암, MS, 천식, 비염, 골다공증 및 다발성 골수종(MM)에 관여하는 것으로 알려져 있다. TL1A는 장기 이식 거부에서 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
본원에 기재된 화합물은 종래의 TNF 수퍼패밀리 구성원 조절제에 의해 치료될 수 있거나, 예방될 수 있거나 완화될 수 있는 임의의 병태를 치료하거나, 예방하거나 완화하는 데 사용될 수 있다. 상기 화합물은 단독으로 사용될 수 있거나, 종래의 TNF 수퍼패밀리 구성원 조절제와 함께 사용될 수 있다. 부분적으로 또는 전체적으로 TNF 수퍼패밀리 구성원에 의한 TNF 수용체를 통한 병원성 신호전달, 또는 TNF 수퍼패밀리 구성원에 의한 TNF 수용체를 통한 신호전달의 결핍으로부터 비롯되는 임의의 병태는 원칙적으로 본 발명에 따라 치료될 수 있거나, 예방될 수 있거나 완화될 수 있다. TNF 수퍼패밀리 구성원에 의한 TNF 수용체를 통한 병원성 신호전달은 정상적인 생리학적 수준의 신호전달을 초과하는, TNF 수용체를 통한 증가된 신호전달; 정상적으로 시작되었으나 정상적인 생리학적 신호에 반응하여 중단하지 못한, TNF 수용체를 통한 신호전달; 및 정상적인 생리학적 크기 범위 내에 있으나 비생리학적 수단에 의해 시작되는, TNF 수용체를 통한 신호전달을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 TNFα 또는 CD40L에 의해 매개되었거나 영향을 받은 병태의 치료, 예방 또는 완화에 관한 것이다.
따라서, TNFα와 상호작용하는 화합물은 다양한 인간 질환들의 치료 및/또는 예방에 유익하다. 이들은 자가면역 및 염증성 질환; 신경학적 및 신경변성 질환; 통증 및 통각 수용성 질환; 및 심혈관 질환을 포함한다.
염증성 질환 및 자가면역 질환은 전신 자가면역 질환, 자가면역 내분비 질환 및 장기 특이적 자가면역 질환을 포함한다. 전신 자가면역 질환은 전신 홍반성 루푸스(SLE), 건선, 혈관염, 다발근육염, 피부경화증, 다발성 경화증, 강직 척추염, 류마티스성 관절염 및 쇼그렌 증후군을 포함한다. 자가면역 내분비 질환은 갑상선염을 포함한다. 장기 특이적 자가면역 질환은 애디슨병, 용혈성 또는 악성 빈혈, (굿파스처 증후군을 포함하는) 사구체신염, 그레이브스병, 특발성 혈소판감소성 자반병, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 소아 당뇨병, 포도막염, (크론병 및 궤양성 결장염을 포함하는) 염증성 장 질환, 천포창, 아토피성 피부염, 자가면역 간염, 원발성 담즙성 경변증, 자가면역 폐렴, 자가면역 심장염, 중증 근무력증, 자연발생적 불임, 골다공증, 천식 및 (뒤시엔느(Duchenne) 근육 위축증을 포함하는) 근육 위축증을 포함한다.
신경학적 및 신경변성 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 졸중, 근위축성 측삭 경화증, 척수 손상, 머리 외상, 발작 및 간질을 포함한다.
심혈관 질환은 혈전증, 심장 비대, 고혈압, (예를 들면, 심부전 동안) 심장의 불규칙한 수축, 및 (발기 부전 및 여성 성 기능부전을 포함하는) 성 장애를 포함한다.
구체적으로, 화합물은 염증성 질환, CNS 질환, 면역 질환 및 자가면역 질환, 통증, 골다공증, 열병 및 장기 이식 거부를 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있다. 화합물은 류마티스성 관절염, (크론병을 포함하는) 염증성 장 질환, 건선, 알츠하이머병, 파킨슨병, 간질, 천식, 패혈증, 전신 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 천식, 비염, 암 및 골다공증을 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있다. 화합물은 류마티스성 관절염(RA), 비특이적 염증성 관절염, 부식성 골 질환, 연골염, 연골 변성 및/또는 파괴, 소아 염증성 관절염, 스틸병(소아 및/또는 성인 발병), 소아 특발성 관절염, 소아 특발성 관절염(올리고관절 및 다발관절 형태 둘 다), (크론병, 궤양성 결장염, 불확정 결장염, 낭염을 포함하는) 염증성 장 질환, 건선, 건선성 관절병증, 강직성 척추염, 쇼그렌병, 알츠하이머병(AD), 베체트병, 파킨슨병(PD), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 허혈성 졸중, 통증, 간질, 골다공증, 골감소증, 만성 질환의 빈혈, 악액질, 당뇨병, 이상지질혈증, 대사 증후군, 천식, 만성 폐쇄성 기도(또는 폐) 질환, 패혈증, 열병, 호흡 곤란 증후군, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 다발성 경화증(MS), 면역 복합체-매개된 사구체신염, 루푸스 신염(LN), 항호중구 세포질 항체(ANCA-) 관련 사구체신염, 최소 변화 질환, 당뇨병성 신장병증(DN), 급성 신장 손상(AKI), 폐쇄성 요로병증, 신장 동종이식 거부, 시스플라틴에 의해 유도된 AKI 및 폐쇄성 요로병증, (당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 미숙아의 망막병증, 연령 관련 황반 변성, 황반 부종, 증식성 및/또는 비증식성 망막병증, 혈관신생을 포함하는 각막 혈관신생, 망막 정맥 폐색, 다양한 형태의 포도막염 및 각막염을 포함하는) 안 질환, 갑상선염, 다양한 형태의 간 섬유증 및 다양한 형태의 폐 섬유증을 포함하는 섬유화 질환, 전신 경화증, 피부경화증, 암 및 (골격 합병증, 악액질 및 빈혈을 포함하는) 암 관련 합병증을 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 본 발병의 항체는 본원에 기재된 화합물 또는 복합체를 사용한 치료의 효능을 평가하기 위한 표적 인게이지먼트 바이오마커로서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 화합물 또는 복합체로 치료된 대상체로부터 채취된 샘플을 본 발명의 항체와 접촉시킬 수 있다. 그 다음, 상기 항체를 사용하여 샘플 내에 존재하는 TNF 수퍼패밀리 구성원-화합물 복합체의 양을 측정할 수 있다. 상기 항체를 사용하여 측정한 복합체의 양은 치료의 효과와 관련되어 있을 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체에 의해 검출된 복합체가 많을수록, 치료의 효과가 더 높다. 상기 항체를 사용하여 측정한 복합체의 양은 치료의 효과와 정비례한다. 예를 들면, 상기 항체를 사용하여 측정한 복합체의 양의 배가는 치료의 효과의 배가를 표시할 수 있다.
본 발명의 항체는 임의의 적절한 기법을 이용하여 화합물-삼량체 복합체의 양을 측정하는 데 사용될 수 있다. 표준 기법이 당분야에서 공지되어 있고 본원에 개시되어 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체를 사용한 ELISA 및 웨스턴 블롯팅을 이용하여 화합물-삼량체 복합체의 양을 측정할 수 있다.
화합물-삼량체 복합체의 양은 화합물-삼량체 복합체의 질량, 화합물-삼량체 복합체의 농도 및 화합물-삼량체 복합체의 몰농도를 측정함으로써 결정될 수 있다. 이 양은 임의의 적절한 단위로 제공될 수 있다. 예를 들면, 화합물-삼량체 복합체의 농도는 pg/㎖, ng/㎖ 또는 ㎍/㎖로 제공될 수 있다. 화합물-삼량체 복합체의 질량은 pg, ng 또는 ㎍으로 제공될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 관심있는 샘플에서의 화합물-삼량체 복합체의 양을 또 다른 샘플, 예컨대, 대조군 샘플에서의 화합물-삼량체 복합체의 수준과 비교할 수 있다. 이러한 방법에서, 샘플 중의 화합물-삼량체 복합체의 실제 양, 예컨대, 화합물-삼량체 복합체의 질량, 몰량, 농도 또는 몰농도를 평가할 수 있다. 화합물-삼량체 복합체의 질량, 몰량, 농도 또는 몰농도를 정량하지 않으면서 화합물-삼량체 복합체의 양을 또 다른 샘플에서의 화합물-삼량체 복합체의 양과 비교할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 샘플에서의 화합물-삼량체 복합체의 양은 2개 이상의 샘플들 사이의 비교에 기초한 화합물-삼량체 복합체의 상대적 양, 예컨대, 상대적 질량, 상대적 몰량, 상대적 농도 또는 상대적 몰농도로서 평가될 수 있다.
약학 조성물, 용량 및 투약법
본 발명의 항체, 화합물 또는 복합체는 약학 조성물로 제공될 수 있다. 약학 조성물은 통상적으로 멸균될 것이고 전형적으로 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 보조제를 포함할 것이다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 보조제 및/또는 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용될 때, "약학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 적합한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제, 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 담체는 예를 들면, 주사 또는 주입에 의한 비경구, 예를 들면, 정맥내, 근육내, 피내, 안구내, 복강내, 피하, 척추 또는 다른 비경구 경로의 투여에 적합할 수 있다. 대안적으로, 담체는 비-비경구 투여, 예컨대, 국소, 표피 또는 점막 경로의 투여에 적합할 수 있다. 담체는 경구 투여에 적합할 수 있다. 투여 경로에 따라, 조절제는 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산 및 다른 천연 조건의 작용으로부터 화합물을 보호하기 위한 물질로 코팅될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 염을 포함할 수 있다. "약학적으로 허용되는 염"은 모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 보유하고 임의의 원치않는 독성학적 효과를 부여하지 않는 염을 지칭한다. 이러한 염의 예로는 산 부가 염 및 염기 부가 염을 포함한다.
약학적으로 허용되는 담체는 수성 담체 또는 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에서 사용될 수 있는 적합한 수성 담체의 예로는 물, 완충된 물 및 식염수가 있다. 다른 담체의 예로는 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대, 올리브유, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대, 에틸 올레에이트가 있다. 많은 경우들에서, 등장제, 예를 들면, 당, 폴리알코올, 예컨대, 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다.
치료 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에서 멸균 상태이어야 하고 안정해야 한다. 조성물은 용액, 미세유화액, 리포좀, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정돈된 구조물로서 제형화될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 추가 활성 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체, 화합물 및/또는 복합체 및 사용 설명서를 포함하는 키트도 본 발명의 범위 내에 있다. 상기 키트는 하나 이상의 추가 시약, 예컨대, 상기 논의된 추가 치료제 또는 예방제도 함유할 수 있다.
본 발명의 방법 및/또는 항체에 의해 확인된 화합물, 및 본 발명의 항체 또는 이의 제제 또는 조성물은 예방적 및/또는 치료적 치료를 위해 투여될 수 있다.
치료적 적용에서, 화합물은 전술한 질환 또는 병태를 이미 앓고 있는 대상체에게, 이 병태 또는 하나 이상의 이의 증상을 치유하거나, 완화하거나 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로 투여된다. 이러한 치료적 치료는 질환 증상의 중증도를 감소시킬 수 있거나, 무증상 기간의 빈도 또는 지속시간을 증가시킬 수 있다. 이를 달성하기에 적절한 양은 "치료 유효량"으로서 정의된다.
예방적 적용에서, 제제는 전술한 질환 또는 병태의 위험을 갖는 대상체에게, 상기 병태 또는 이의 하나 이상의 증상의 후속 효과를 예방하거나 감소시키기에 효과적인 양으로 투여된다. 이를 달성하기에 적절한 양은 "예방 유효량"으로서 정의된다. 각각의 목적을 위한 유효량은 질환 또는 손상의 중증도, 및 대상체의 체중 및 일반적인 상태에 의해 좌우될 것이다.
투여 대상체는 인간 또는 비인간 동물일 수 있다. 용어 "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들면, 포유동물 및 비포유동물, 예컨대, 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다. 인간에게의 투여가 전형적이다.
당분야에서 공지된 다양한 방법들 중 하나 이상의 방법을 이용하여 하나 이상의 투여 경로를 통해 본 발명의 화합물 또는 약학 조성물을 투여할 수 있다. 숙련된 당업자가 이해하는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 화합물 또는 약학 조성물에 대한 투여 경로의 예로는 예를 들면, 주사 또는 주입에 의한 정맥내, 근육내, 피내, 안구내, 복강내, 피하, 척추 또는 다른 비경구 투여 경로가 있다. 본원에서 사용될 때 어구 "비경구 투여"는 통상적으로 주사에 의한, 장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미한다. 대안적으로, 본 발명의 화합물 또는 약학 조성물은 비-비경구 경로, 예컨대, 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물 또는 약학 조성물은 경구 투여될 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 약학 조성물의 적합한 용량은 숙련된 의사에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물 중의 활성 성분의 실제 용량 수준은 환자에게 독성을 나타내지 않으면서 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대한 원하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 얻도록 변경될 수 있다. 선택된 용량 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료 지속시간, 사용되는 특정 조성물과 함께 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 선행 의료 이력, 및 의학 분야에서 잘 알려진 기타 요인을 포함하는 다양한 약력학적 요인들에 의해 좌우될 것이다.
적합한 용량은 예를 들면, 치료될 환자의 체중 kg당 약 0.01 ㎍ 내지 약 1000 mg, 전형적으로 치료될 환자의 체중 kg당 약 0.1 ㎍ 내지 약 100 mg의 범위 내에 있을 수 있다. 예를 들면, 적합한 용량은 하루당 약 1 ㎍/kg 체중 내지 약 10 mg/kg 체중, 또는 하루에 약 10 ㎍/kg 체중 내지 약 5 mg/kg 체중일 수 있다.
투약법은 최적 원하는 반응(예를 들면, 치료 반응)을 제공하도록 조절될 수 있다. 예를 들면, 단회 용량이 투여될 수 있거나, 여러 분할된 용량이 시간의 경과에 따라 투여될 수 있거나, 용량이 치료 상황의 위급에 의해 표시된 바와 같이 비례적으로 감소될 수 있거나 증가될 수 있다. 본원에서 사용된 용량 유닛 형태는 치료될 대상체를 위한 단위 용량으로서 적합한 물리적으로 구분된 유닛을 지칭하고; 각각의 유닛은 요구된 약학 담체와 함께 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정의 양의 활성 화합물을 함유한다.
투여는 단회 용량 또는 다회 용량으로 수행될 수 있다. 다회 용량은 동일한 또는 상이한 경로를 통해 동일한 또는 상이한 위치에 투여될 수 있다. 대안적으로, 용량은 지속 방출 제제를 통해 투여될 수 있고, 이 경우 보다 덜 빈번한 투여가 요구된다. 용량 및 빈도는 환자에서의 길항제의 반감기 및 원하는 치료의 지속시간에 따라 달라질 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 화합물 또는 약학 조성물은 하나 이상의 다른 치료제와 함께 공-투여될 수 있다. 예를 들면, 다른 치료제는 진통제, 마취제, 면역억제제 또는 소염제일 수 있다.
2종 이상의 물질들의 조합된 투여는 다수의 상이한 방식들로 달성될 수 있다. 둘 다가 단일 조성물로 함께 투여될 수 있거나, 조합된 요법의 부분으로서 별도의 조성물로 투여될 수 있다. 예를 들면, 한 물질은 다른 물질 전 또는 후에, 또는 다른 물질과 함께 투여될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 예증한다.
실시예
실시예 1 - 화합물의 합성
화합물 (1)의 합성은 국제 특허출원 공보 제WO 2013/186229호(실시예 44)에 개시되어 있다.
화합물 (2)의 합성은 국제 특허출원 공보 제WO 2013/186229호(실시예 89)에 개시되어 있다.
화합물 (3)의 합성은 국제 특허출원 공보 제WO 2014/009295호(실시예 129)에 개시되어 있다.
화합물 (4)의 합성은 국제 특허출원 공보 제WO 2014/009295호(실시예 173)에 개시되어 있다.
화합물 (5)의 합성은 국제 특허출원 공보 제WO 2014/009295호(실시예 319)에 개시되어 있다.
화합물 (6)의 합성은 국제 특허출원 공보 제WO 2013/186229호(실시예 490)에 개시되어 있다.
실시예 2 - 항체 유도
벤즈이미다졸 화합물 (1)과의 복합체 형태로 인간 TNFα를 사용하여 5마리의 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 래트들을 면역화시킨 후, 면역 B 세포를 96웰 플레이트에서 배양하여 클론 증폭 및 항체 분비를 유도하였다(Tickle, S. et al., High throughput screening for high affinity antibodies Journal of Laboratory Automation 2009 14: 303-307). 균질한 비드-기초의 FMAT 어세이에서 배양 상청액을, apo 인간 TNFα에 비해 화합물 (1)(50배 몰 과량)과의 복합체 형태의 인간 TNFα에 우선적으로 결합하는 IgG 항체에 대해 스크리닝하였다. 바이오티닐화된 항-인간 Fc(Jackson 카탈로그 번호 109-066-098)에 결합된 인간 TNF-수용체 I-Fc 융합 단백질(R&D Systems 카탈로그 번호 372-Rl-050)을 사용하여 포획 시스템으로 인간 TNFα(+/- 화합물 (1))를 비드 표면(수퍼아비딘-코팅된 뱅스(Bangs) 비드, 카탈로그 번호 CP01N) 상에서 제시하였다.
TNFα-화합물 (1) 복합체에의 우선적 결합을 나타내는 항체를 '입체구조 선택적' 항체로서 명명하였고 향후 클로닝을 위해 수득하였다. 형광 초점 방법(미국 특허 제7993864호/유럽 특허 제1570267B1호)을 이용하여 양성 웰로부터 항원 특이적 B 세포를 확인하고 단리하였고, 특이적 항체 가변 영역 유전자를 역전사(RT)-PCR로 단일 세포로부터 회수하였다.
인간 및 마우스 TNFα + 화합물 둘 다에의 입체구조 선택적 결합을 나타내는 두 대표적인 항체들인 CA185_01974 및 CA185_01979의 아미노산 서열은 하기 표시되어 있다:
CA185_01974.0(VR0001837)
경쇄 가변 영역(LCVR) 서열번호 7(밑줄친 CDR)
Figure pct00002
중쇄 가변 영역(HCVR) 서열번호 8(밑줄친 CDR)
Figure pct00003
CA185_01979.0(VR0001842)
경쇄 가변 영역(LCVR) 서열번호 22(밑줄친 CDR)
Figure pct00004
중쇄 가변 영역(HCVR) 서열번호 23(밑줄친 CDR)
Figure pct00005
실시예 3 - 유도된 항체의 잠재적 에피토프
화합물의 존재 하에서 인간 및 마우스 TNFα 둘 다에 결합하는 래트-유래된 항체의 능력을 고려하여, TNFα의 X-선 결정 구조와 함께 래트, 마우스 및 인간 아미노산 서열의 상세한 분석을 착수함으로써, 가능성 높은 에피토프가 확인될 수 있는지를 알아보았다.
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
래트, 마우스 및 인간 TNFα 유니프롯 서열들의 정렬 및 비교로부터, 래트 아미노산 서열이 인간과 상이한 위치 및 인간 및 마우스 서열이 성숙 절단된 생성물에서 동일한 위치의 예로는 N168, I194, F220 및 A221(인간 서열로부터의 잔기 및 넘버링)이 있다.
이들 잔기들은 인간 TNFα(1TNF)의 결정 구조 상에서 강조되어 있다(도 1). 이들 아미노산들 중 임의의 아미노산이 항체 CA185_01974 및 CA185_01979에 의해 표적화된 에피토프에 포함될 가능성이 있다.
항체 가변 영역을 마우스 IgG 및 마우스 Fab(힌지 없음) 벡터 내로 클로닝한 후, HPLC, 비아코어(BIAcore), ELISA 및 세포에 기초한 어세이에서 TNFα에 결합된 다양한 테스트 화합물들을 사용하여 항체 CA185_01974 및 CA185_01979의 결합의 입체구조 선택적 성질을 확인하였다.
실시예 4 - 항체 특징을 확인하기 위한 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)
크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 CA185_01974와, 화합물 (1)과 복합체화된 인간 TNFα 사이의 복합체 형성으로 마우스 Fab 단편의 특이적 결합을 입증하였다. 결과는 도 2에 제시되어 있다. 이 도면에 나타낸 바와 같이, (비록 Fab에 결합되지 않은 일부 삼량체-화합물 복합체의 존재를 보이는 작은 피크가 존재하지만) 0.5배 몰 과량의 Fab의 사용 시 우세한 피크는 결합된 Fab 및 삼량체-화합물 복합체에 상응한다. 1.0배 몰 과량의 Fab에서, 삼량체-화합물 복합체에 결합된 Fab에 상응하는 단일 고분자량 피크가 존재한다. 1.5배 및 2배 몰 과량의 Fab에서, 비결합된 Fab에 상응하는 성장하는 저분자량 피크가 존재한다.
따라서, 1.5배 및 2배 몰 과량으로 나타나는 과량의 Fab의 사용 시, 화학량론은 1 Fab : 1 TNFα 삼량체인 것으로 확인되었다.
크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 CA185_01979와, 화합물 (1)과 복합체화된 인간 TNFα의 결합도 조사하였다. 결과는 도 3에 제시되어 있다. CA185_01974의 경우, 1.5배 및 2배 몰 과량으로 나타나는 과량의 Fab의 사용 시, 화학량론은 1 Fab : 1 TNFα 삼량체인 것으로 확인되었다.
실시예 5 - 항체 특징을 확인하기 위한 비아코어 어세이
비아코어 T200(GE Healthcare)을 이용하여 25℃에서 표면 플라스몬 공명을 수행하였다. 아민 커플링 화학반응을 통해 항-마우스 Fc(Jackson 115-006-071)를 CM5 센서 칩(GE Healthcare) 상에 약 6000 반응 유닛의 포획 수준까지 고정시켰다. HBS-EP 완충제(10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05%(v/v) 계면활성제 P20 - GE Healthcare) + 1% DMSO를 런닝 완충제로서 사용하였다. 1 ㎍/㎖의 각각의 IgG의 10 ㎕ 주사를 고정된 항-마우스 Fc에 의한 포획에 사용하여 TNFα 결합 표면을 생성하였다. 50 nM의 인간 또는 마우스 TNFα(사내제작)를 5시간 동안 HBS-EP+(1% DMSO)에서 2 μM의 화합물과 함께 사전 인큐베이션하였다.
인간 또는 마우스 TNFα +/- 테스트 화합물의 3분 주사를 30 ㎕/분의 유속으로 각각의 포획된 IgG 상에 통과시켰다. 40 mM HCl을 2회 60초 주사하고 5 mM NaOH을 30초 주사하여 10 ㎕/분의 유속으로 표면을 재생시켰다. 표준 절차에 따라 T200 에발루션(Evaluation) 소프트웨어(버전 1.0)를 사용하여 이중 기준 배경 공제된 결합 곡선을 분석하였다. 피팅 알고리즘으로부터 동역학 파라미터를 측정하였다.
두 화학적 계열로부터의 테스트 화합물의 존재 및 부재 하에서 인간 및 마우스 TNFα에 대한 동역학 결합 데이터는 하기 표 1 및 2에 제시되어 있다.
Figure pct00009
CA185_01974 및 CA185_01979 둘 다가 두 화학적 계열로부터의 대표적인 테스트 화합물들을 사용하였을 때 화합물-비틀어진 인간 TNFα에 대한 2 로그 초과의 선택적 결합을 나타내었다.
Figure pct00010
CA185_01974 및 CA185_01979 둘 다가 두 화학적 계열로부터의 대표적인 테스트 화합물들을 사용하였을 때 화합물-비틀어진 마우스 TNFα에 대한 1.5 로그 초과 및 2 로그 초과의 선택적 결합을 나타내었다.
실시예 6 - 항체 특징을 확인하기 위한 ELISA
본 발명의 화합물에 결합된 TNFα의 농도를 측정하기 위해 이 화합물과의 복합체 형태로 존재할 때 TNFα의 입체구조를 특이적으로 검출하는 항체 CA185_01974.0을 사용하여 샌드위치 ELISA를 개발하였다. 요약하면, 마이크로타이터 플레이트를 CA185_01974.0으로 코팅하여 테스트 화합물과의 복합체 형태로 TNFα를 고정시켰다. TNFα를 50배 몰 과량의 테스트 화합물과 함께 28℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이 밤샘 인큐베이션 후, TNFα를 이종친화성(heterophilic) 항체 차단제의 존재 하에서 내생성 TNFα가 고갈된 순수한 인간 혈장으로 연속적으로 희석하고 코팅된 플레이트에 첨가하였다. 곡선을 0.78 pg/㎖ 내지 50 pg/㎖ TNFα의 농도 범위로 생성하였다. 비색 신호를 제공하기 위해 스트렙타비딘-퍼록시다제 및 TMB 기질과 함께 바이오티닐화된 다클론 항-TNFα 항체를 사용하여 결합된 TNFα를 검출하였다. 스트렙타비딘-퍼록시다제와 기질 사이의 추가 단계로서, 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)로부터의 ELAST 키트를 사용한 티라마이드 신호 증폭을 이용하여 어세이의 민감성을 증가시켰다.
총 TNFα(유리 TNFα + 테스트 화합물과의 복합체 형태의 TNFα)를 동시에 측정하기 위한 ELISA도 개발하였다. 이 어세이를 위해, 코팅 항체를 시판되는 항-TNFα 다클론 항체(Invitrogen AHC3812)로 대체하였다. 샘플 인큐베이션 시간도 3시간 증가시켰다. 모든 다른 단계들은 입체구조 특이적 어세이와 동일하였다. 이것은 테스트 화합물과의 복합체 형태로 존재하는 TNFα의 양이 총 TNFα의 비율로서 계산될 수 있게 한다.
화합물 (3), (4) 및 (5)의 사용 시 총 TNFα ELISA에 대한 결과는 도 4에 제시되어 있다.
CA185_01974.0 및 화합물 (3), (4) 및 (5)의 사용 시 입체구조 특이적 TNFα ELISA의 결과는 도 5에 제시되어 있다. Apo TNFα는 이 어세이에서 신호를 제공하지 않았는데, 이것은 항체 CA185_01974와 화합물에 결합된 TNFα의 결합의 특이적 성질을 입증한다. 상기 항체는 상이한 화학적 계열의 다양한 테스트 화합물들에 의해 결합된 TNFα를 인식할 수 있었다.
실시예 7 - 항체 특징을 확인하기 위한 세포에 기초한 어세이
2.5시간 동안 1 ㎍/㎖의 독시사이클린으로 유도한 후 TNF-RI을 과발현하는 인간 배아 신장(HEK) JumpIn 세포를 사용하는 FACS 어세이에서 화합물-비틀어진 TNFα에의 결합에 대해 재조합 항체도 테스트하였다. HEK 세포를 트립신으로 처리하고 배지에서 2시간 동안 인큐베이션하여 분해된 TNFRI 수준의 회복을 가능하게 하였다. 2 ㎍/㎖의 인간 TNFα를 37℃에서 1시간 동안 40 μM 화합물 (1) 또는 0.4% DMSO와 함께 사전 인큐베이션하였다. 사전 인큐베이션 혼합물을 얼음 위에서 1시간 동안 세포에 첨가하였다(희석 1:4, 최종 농도: 0.5 ㎍/㎖ 인간 TNFα +/- 10 μM 화합물 (1) 또는 0.1% DMSO). 수용체에 결합된 TNFα에 대한 분석 전, 세포를 세척하고 고정시키고(1.5% PFA) 얼음 위에서 1시간 동안 1 또는 10 ㎍/㎖의 항체로 염색하였다(이차 항체: 항-마우스-Alexa488).
도 6에 나타낸 바와 같이, 1 및 10 ㎍/㎖의 CA185_01974 및 CA185_01979에 의한 염색의 FACS 막대그래프 도표는 항체가 화합물 (1)과 사전 인큐베이션된 TNFα만을 인식한다는 것을 입증한다. DMSO 대조군에 의한 염색은 없다.
추가로, CA185_01974 및 CA185-01979 Fab 단편의 특이적 결합은 화합물-비틀어진 막 결합형 TNFα에 의해 입증되었다. TACE 절단 부위의 넉-아웃으로 인해 막 TNFα를 과발현하는 조작된 NS0 세포주를 37℃에서 1시간 동안 0.001 내지 10 μM 화합물 (1) 또는 0.1% DMSO와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고 고정시키고 얼음 위에서 1시간 동안 0.01 또는 0.1 ㎍/㎖의 항체 Fab 단편으로 염색하였다(이차 항체는 잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch)로부터의 항-마우스 Fab-DyeLight488이었다).
CA185_01974(도 7) 및 CA185_01979 Fab 단편에 의한 염색의 FACS 막대그래프 도표는 항체가 화합물 (1)과 사전 인큐베이션된 TNF만을 인식한다는 것을 입증한다. DMSO 대조군에 의한 염색은 없다.
실시예 8 - 항체 CA185_01974는 인간 TNF-화합물 (4) 복합체에 대해 300배 선택성을 보인다 .
화합물 (4)를 인간 및 사이노몰구스 TNF와 함께 인큐베이션하고 마우스 전장 항체 CA185_01974에 대해 적정하여 정확한 친화성 값을 측정하였다. 실험은 하기 대조군들을 포함하였다: (i) 1974에 대한 인간 또는 사이노몰구스 TNF + DMSO; (ii) 항체 부재에 대한 인간 또는 사이노몰구스 TNF + DMSO; 및 (iii) 항체 부재에 대한 인간 또는 사이노몰구스 TNF + 화합물 (4). 각각의 샘플 및 대조군을 이중으로 수행하였고 각각의 반복실험에서 4종의 농도를 사용하였다.
도 8 및 9에 나타낸 바와 같이, hTNF + 화합물 (4) 및 cTNF + 화합물 (4)의 배경 결합은 어세이의 과정에 걸쳐 5-10RU 증가하였다. 이것은 제2 이중실험에서 CA185_01974에 결합하는 h/cTNF + 화합물 (4)의 보다 더 높은 반응에서 확인된다. 화합물 (4)의 부재 하에서 hTNF 및 cTNF의 결합은 일관되게 매우 낮았다.
hTNF + DMSO 결합 마우스 전장 IgG CA185_1974_P8의 동역학은 이 어세이에서 이전 단일 농도 분석과 매우 유사하였다. 마우스 전장 IgG CA185_1974_P8에 대한 사이노몰구스 TNF의 친화성은 유사하나, 동역학은 상이하다.
표 3은 CA185_1974_P8에 결합하는 각각의 분석물의 동역학을 제공한다. 표 4는 CA185_1974_p8에 대한 TNF 동역학의 평균 값 및 배수 차이 +/- 화합물 (4)를 제공한다. 도 8은 cTNF +/- 화합물 (4)의 두 이중실험의 센소그램을 제공한다. 도 9는 hTNF +/- 화합물 (4)의 두 이중실험의 센소그램을 제공한다.
Figure pct00011
Figure pct00012
결론
항체 CA185_01974 및 CA185_01989는 화합물-비틀어진 상태의 TNFα에 특이적으로 결합하는 것으로 입증되었고, 본 발명의 화합물에 대한 표적 인게이지먼트 바이오마커로서 유용할 것이다.
상기 항체들은 상이한 화학적 계열로부터의 화합물에 의해 특이적으로 안정화되는, TNFα의 입체구조에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 이들 항체들은 이것, 및 본원에 기재된 화학적 계열보다 더 넓은 범위의 화학적 계열에 의해 안정화되는, TNFα 삼량체의 밀접하게 관련된 생물학적으로 적절한 입체구조를 정의하는 데 있어서 표준물이 될 것이라는 것이 예상된다. 제시된 데이터에 기초할 때, CA185_01974 또는 CA185_01989 항체가 전술한 비아코어 어세이 포맷에서 1 nM보다 더 우수한 KD로 결합하는 경우, 인간 TNFα 삼량체는 기재되어 있는 정의된 생물학적으로 적절한 입체구조로 안정화는 것으로 간주될 수 있었다.
실시예 9 - 문헌(Ma et al (2014)) 및 문헌(Silvian et al (2011))의 화합물 및 복합체는 본 발명의 화합물 및 복합체와 상이한 특징을 갖는다 .
문헌(Ma et al. (2014) JBC 289:12457-12466)의 제12458면에 기재된 바와 같이, TNFβ의 외부 표면과의 상호작용에서 TNFR1의 루프2/도메인2로부터의 7 아미노산 펩티드에 의해 점유된 공간에 맞는 분자를 찾고자 시도함으로써 가상 스크리닝을 통해 C87을 발견하였다. 본 발명자들은 문헌(Ma et al.)으로부터의 C87 화합물 및 문헌(Silvian et al. (2011) ACS Chemical Biology 6:636-647)으로부터의 BIO8898 화합물을 테스트하였다.
발견의 요약
C87에 대해 문헌(Ma et al.)에 기재된 비아코어 관찰은 반복될 수 없었다.
세포에서의 TNF 특이적 억제의 증거는 관찰되지 않았다.
추가로, C87은 밀리몰 친화성 수준까지 민감한 질량 분광측정에 의해 결합하는 것으로 관찰되지 않았다.
광범위한 결정학 시험은 오로지 apo-TNF(화합물이 없는 TNF)만을 생성하였다.
형광 분극(FP) 어세이에서, C87은 형광 판독 시 화합물의 간섭 수준을 초과하는 유의한 억제를 보이지 않았다.
TNFα의 열 용융 온도의 안정화를 측정하는 써모플루오르(Thermofluor)는 C87에 대한 작은 안정화를 보였다.
요약하면, C87은 삼량체의 중심에서 결합한다는 증거는 발견되지 않았다. 압도적으로 대다수의 데이터는 TNFα와의 직접적인 상호작용을 암시하지 않았다. BIO8898도 TNFα에 결합하지 않는 것으로 확인되었다.
세포 - TNF에 의해 유도된 HEK NFKB 레포터 유전자 어세이
C87을 NFκB의 조절 하에서 SEAP로 안정하게 형질감염된 HEK-293 세포에 첨가하기 전에 1시간 동안 TNFα와 함께 사전 인큐베이션하였다. 비-TNF 관련(표적 이탈) 활성을 검출하기 위해 적절한 반대-스크린도 테스트하였다. 대조군 화합물에 의한 100% 차단에 비해 억제가 측정되기 전에 어세이를 밤새 인큐베이션하였다. 3배 연속 희석 시, 최대 C87 농도는 10,000 nM이었다.
표적 이탈 활성에 기인할 수 없는 억제 효과는 검출될 수 없었다.
비아코어
avi-태그 링커를 사용하여 TNF를 고정시켰고, C87을 칩 상에 통과시켰다. 한 실험에서, 최고 농도인 10 μM로부터 C87의 용량 반응을 수행하였다. 결합은 관찰되지 않았다.
제2 실험에서, 칩 상을 통과하는 C87의 유속은 감소되었다. 작은 변동이 관찰되었으나, 전체 결합은 무시할 정도이었다.
문헌(Ma et al.)에 기재된 C87과 TNF의 결합은 Y-축 상의 RU 값에 기초할 때 화학량론적 비를 초과할 가능성이 높았다. 칩 상의 표준 TNF 밀도에서 이 값은 단순한 1:1 결합에 대해 예상된 범위보다 30배 더 높은 범위 내에 있었다.
또 다른 실험에서, 비아코어 4000 기계 상에서 SPR로 BIO8898을 고정된 가용성 형태의 CD40L 및 가용성 형태의 TNFα에 대해 테스트하였다. CD40L에 대한 결합에 대해 17 μM의 기하평균 IC50이 측정된 반면, 이 어세이에서 TNFα에 대한 결합은 최대 100 μM의 농도에서 검출되지 않았다.
질량 분광측정
400 μM의 농도에서 C87이 인간 TNFα(20 μM)에 결합한다는 증거는 없었다. 보다 더 낮은 분자량(약 473 Da)의 종은 5% 미만의 점유율로 결합하는 듯하다. C87은 503 Da의 분자량을 갖는다. 400 μM 농도에서의 점유에 기초할 때, 1 mM 초과의 저분자량 종의 친화성이 예상된다.
결정학적 분석
종합하면, C87을 TNFα로 결정화하기 위해 본원에 기재된 화합물과 함께 상용적으로 사용되는 조건의 테스트를 포함하는 많은 노력이 기울여졌다. 이것은 상이한 리간드 농도, 상이한 단백질 농도 및 상이한 침지 시간에서 다수의 결정화 시험들을 준비하는 것을 포함하였다. 분석 시 화합물을 갖지 않는 염 또는 TNF인 것으로 입증된 몇몇 결정들이 관찰되었다.
형광 분극(FP)
형광 화합물(프로브)에 대한 어세이 전에 1시간 동안 C87을 TNFα와 함께 사전 인큐베이션하였다. 직접적으로(동일한 부위에서 결합하는) 또는 간접적으로(TNF를 파괴하는) 형광 화합물을 사용한 경쟁은 FP의 감소에 의해 검출된다.
억제 곡선의 외삽은 100 μM의 IC50을 생성하였다. 그러나, 형광 소광은 공제되었을 때 이 어세이에서 C87의 무시할만한 억제를 야기한 최고 억제제 농도에서 관찰되었다.
써모플루오르
써모플루오르는 단백질을 안정화시키거나 파괴하는 화합물로 인한 TNFα의 용융 온도(Tm)의 변화를 측정한다. 3.8℃의 안정화 효과가 500 μM C87의 농도에서 관찰되었는데, 이것은 특이적이지 않을 수 있는 약한 결합의 가능성을 암시한다.
서열목록
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Figure pct00017
SEQUENCE LISTING <110> UCB Biopharma SPRL <120> Antibody <130> N400213WO <150> GB 1418776.9 <151> 2014-10-22 <150> GB 1418774.4 <151> 2014-10-22 <150> GB 1418773.6 <151> 2014-10-22 <150> GB 1418781.9 <151> 2014-10-22 <150> GB 1510758.4 <151> 2015-06-18 <160> 36 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 of 1974/1979 <400> 1 Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 of 1974 <400> 2 Gly Ala Thr Ser Leu Ala Asp 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 of 1974 <400> 3 Leu Gln Gly Gln Ser Thr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 of 1974 <400> 4 Ala Tyr Tyr Met Ala 1 5 <210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 of 1974 <400> 5 Ala Ser Ile Asn Tyr Asp Gly Ala Asn Thr Phe Tyr Arg Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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ccgccaggct 120 ccaacgaagg gtctggagtg ggtcgcatcc attaattatg atggtgctaa cactttctat 180 cgcgactccg tgaagggccg attcactgtc tccagagata atgcaagaag cagcctatac 240 ctacaaatgg acagtctgag gtctgaggac acggccactt attactgtac aacagaggct 300 tacggatata actcaaattg gtttggttac tggggccaag gcactctggt cactgtctcg 360 agc 363 <210> 11 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1974 LC kappa full <400> 11 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Pro Ala Ser Pro Glu 1 5 10 15 Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ala 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Arg Leu Gln Val 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ile Phe Tyr Cys Leu Gln Gly Gln Ser Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Asp Ala Ala 100 105 110 Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly 115 120 125 Gly Ala 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Tyr Glu Pro Met Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp 195 200 205 Leu Leu Ser Ala Glu Val Asn Leu Pro Lys Tyr Leu Asp Ile Thr Glu 210 215 220 Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Val Ile Ala Leu 225 230 235 <210> 33 <211> 235 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 33 Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala 1 5 10 15 Leu Pro Gln Lys Met Gly Gly Phe Gln Asn Ser Arg Arg Cys Leu Cys 20 25 30 Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Leu Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe 35 40 45 Cys Leu Leu Asn Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Asp Glu Lys Phe 50 55 60 Pro Asn Gly Leu Pro Leu Ile Ser Ser Met Ala Gln Thr Leu Thr Leu 65 70 75 80 Arg Ser Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val 85 90 95 Ala Asn His Gln Val Glu Glu Gln Leu Glu Trp Leu Ser Gln Arg Ala 100 105 110 Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Met Asp Leu Lys Asp Asn Gln Leu Val 115 120 125 Val Pro Ala Asp Gly Leu Tyr Leu Val Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys 130 135 140 Gly Gln Gly Cys Pro Asp Tyr Val Leu Leu Thr His Thr Val Ser Arg 145 150 155 160 Phe Ala Ile Ser Tyr Gln Glu Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Val Lys 165 170 175 Ser Pro Cys Pro Lys Asp Thr Pro Glu Gly Ala Glu Leu Lys Pro Trp 180 185 190 Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp 195 200 205 Gln Leu Ser Ala Glu Val Asn Leu Pro Lys Tyr Leu Asp Phe Ala Glu 210 215 220 Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Val Ile Ala Leu 225 230 235 <210> 34 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala 1 5 10 15 Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe 20 25 30 Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe 35 40 45 Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro 50 55 60 Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser 65 70 75 80 Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu 100 105 110 Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser 115 120 125 Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly 130 135 140 Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala 145 150 155 160 Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro 165 170 175 Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu 180 185 190 Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu 195 200 205 Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly 210 215 220 Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 225 230 <210> 35 <211> 158 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Ser Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His 1 5 10 15 Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg 20 25 30 Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln 35 40 45 Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu 50 55 60 Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr 65 70 75 80 Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser 85 90 95 Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala 100 105 110 Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu 115 120 125 Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp 130 135 140 Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 145 150 155 <210> 36 <211> 157 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val 1 5 10 15 Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg 20 25 30 Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu 35 40 45 Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile 65 70 75 80 Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala 85 90 95 Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys 100 105 110 Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys 115 120 125 Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe 130 135 140 Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 145 150 155

Claims (77)

  1. (i) TNF 수퍼패밀리(superfamily) 구성원인 삼량체 단백질 및 (ii) TNF 수퍼패밀리 구성원인 삼량체 단백질에 결합할 수 있는 화합물을 포함하는 복합체에 선택적으로 결합하는 항체로서, 화합물-삼량체 복합체는, 필요한 TNF 수퍼패밀리 수용체에 결합하고 이 수용체를 통해 상기 삼량체에 의해 유도되는 신호전달을 조절하는 것인 항체.
  2. 제1항에 있어서, 화합물이 수용체를 통해 삼량체에 의해 유도되는 신호전달을 길항하는 것인 항체.
  3. 제2항에 있어서, 화합물이 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태의 안정성을, 화합물의 부재 하에서의 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태의 안정성에 비해 증가시키는 것인 항체.
  4. 제3항에 있어서, 안정성의 증가는 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태의 열 전이 중간점(Tm)을 적어도 1℃ 증가시키는 것인 항체.
  5. 제4항에 있어서, 안정성의 증가는 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태의 열 전이 중간점(Tm)을 적어도 10℃ 증가시키는 것인 항체.
  6. 제5항에 있어서, TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태의 Tm의 증가가 10℃ 내지 20℃인 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이, 필요한 수용체에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 결합 친화성을, 화합물의 부재 하에서의 TNF 수퍼패밀리 구성원의 그 수용체에 대한 결합 친화성에 비해 증가시키는 것인 항체.
  8. 제7항에 있어서, 화합물이 화합물의 부재 하에서의 TNF 수퍼패밀리 구성원의 그 수용체의 결합에 대한 결합 속도(kon-r) 및 해리 속도(koff-r) 값에 비해 kon-r을 증가시키고/시키거나 koff-r을 감소시킴으로써, 필요한 수용체에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 결합 친화성을 증가시키는 것인 항체.
  9. 제8항에 있어서, 화합물이 화합물의 부재 하에서의 TNF 수퍼패밀리 구성원의 그 수용체의 결합에 대한 결합 속도(kon-r) 값에 비해 kon-r을 증가시킴으로써, 필요한 수용체에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 결합 친화성을 증가시키는 것인 항체.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이, 필요한 수용체에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 KD-r을, 화합물의 부재 하에서의 그 수용체에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 KD-r에 비해 감소시키며, 이 때
    a) 화합물이, 필요한 수용체에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 KD-r을, 화합물의 부재 하에서의 그 수용체에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 KD-r에 비해 적어도 10배 감소시키고;
    b) 화합물의 존재 하에서의 필요한 수용체에의 결합에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 KD-r 값이 10 nM 미만인 항체.
  11. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이, 필요한 수용체에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 KD-r을, 화합물의 부재 하에서의 그 수용체에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 KD-r에 비해 감소시키며, 이 때
    a) 화합물이, 필요한 수용체에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 KD-r을, 화합물의 부재 하에서의 그 수용체에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 KD-r에 비해 적어도 4배 감소시키고;
    b) 화합물의 존재 하에서의 필요한 수용체에의 결합에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 KD-r 값이 600 pM 미만인 항체.
  12. 제11항에 있어서, 화합물의 존재 하에서의 필요한 수용체에의 결합에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 KD-r 값이 200 pM 미만인 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 500 nM 이하의 IC50 값을 갖는 것인 항체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 하기 화합물 (1) 내지 (6), 또는 이들의 염 또는 용매화물로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 항체:
    Figure pct00018

    Figure pct00019

    Figure pct00020
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, TNF 수퍼패밀리 구성원 삼량체의 부재 하에서의 화합물에의 결합 및/또는 화합물의 부재 하에서의 TNF 수퍼패밀리 구성원 삼량체에의 결합에 비해 삼량체-화합물 복합체에 선택적으로 결합하는 항체.
  16. 제15항에 있어서, 화합물의 부재 하에서의 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원에의 결합 및/또는 TNF 수퍼패밀리 구성원의 부재 하에서의 화합물에의 결합에 대한 KD-ab보다 적어도 100배 더 낮은 KD-ab로 삼량체-화합물 복합체에 결합하는 항체.
  17. 제16항에 있어서, 화합물의 부재 하에서의 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원에의 결합 및/또는 TNF 수퍼패밀리 구성원의 부재 하에서의 화합물에의 결합에 대한 KD-ab보다 적어도 200배 더 낮은 KD-ab로 삼량체-화합물 복합체에 결합하는 항체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, TNF 수퍼패밀리 구성원이 TNFα이고 수용체가 TNF 수용체인 항체.
  19. 제18항에 있어서, 수용체가 TNFR1인 항체.
  20. (i) 인간 TNFα 및 (ii) 화합물 (1) 내지 (6), 또는 이들의 염 또는 용매화물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물을 포함하는 복합체에 선택적으로 결합하는 항체.
  21. 제20항에 있어서, TNFα가 TNFαS인 항체.
  22. 제21항에 있어서, TNFαS가 서열번호 35 또는 서열번호 36의 서열, 또는 이의 변이체를 포함하는 것인 항체.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, TNFα가 삼량체인 항체.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, TNFα의 부재 하에서의 화합물에의 결합 및/또는 화합물의 부재 하에서의 TNFα에의 결합에 비해 TNFα-화합물 복합체에 선택적으로 결합하는 항체.
  25. 제24항에 있어서, 화합물의 부재 하에서의 TNFα에의 결합 및/또는 TNFα의 부재 하에서의 화합물에의 결합에 대한 KD-ab보다 적어도 100배 더 낮은 KD-ab로 TNFα-화합물 복합체에 결합하는 항체.
  26. 제25항에 있어서, 화합물의 부재 하에서의 TNFα에의 결합 및/또는 TNFα의 부재 하에서의 화합물에의 결합에 대한 KD-ab보다 적어도 200배 더 낮은 KD-ab로 TNFα-화합물 복합체에 결합하는 항체.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 4 내지 6 및 19 내지 21로부터 선택되는 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 서열 및/또는 서열번호 1 내지 3, 17 및 18로부터 선택되는 적어도 하나의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 서열을 포함하는 항체.
  28. 제27항에 있어서, 서열번호 6 또는 서열번호 21의 HCDR3 서열을 포함하는 항체.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 서열번호 8/7 또는 서열번호 23/22의 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR) 쌍 내에 포함된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함하는 항체.
  30. 제29항에 있어서, HCDR1/HCDR2/HCDR3 서열 조합이 서열번호 4/5/6 및 서열번호 19/20/21로부터 선택되고/되거나, LCDR1/LCDR2/LCDR3 서열 조합이 서열번호 1/2/3 및 서열번호 1/17/18로부터 선택되는 것인 항체.
  31. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 4/5/6/1/2/3 또는 서열번호 19/20/21/1/17/18의 HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 서열 조합을 포함하는 항체.
  32. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 8 또는 23의 중쇄 가변 영역(HCVR) 서열 및/또는 서열번호 7 또는 22의 경쇄 가변 영역(LCVR) 서열, 또는 이들과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 항체.
  33. 제32항에 있어서, 서열번호 8/7 또는 서열번호 23/22의 HCVR 및 LCVR 서열 쌍, 또는 이들과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 항체.
  34. 제33항에 있어서,
    (a) HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 서열이 서열번호 4/5/6/1/2/3으로 구성되고 HCVR 및 LCVR의 나머지가 각각 서열번호 8 및 7에 대한 적어도 95%의 동일성을 포함하거나;
    (b) HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 서열이 서열번호 19/20/21/1/17/18로 구성되고 HCVR 및 LCVR의 나머지가 각각 서열번호 23 및 22에 대한 적어도 95%의 동일성을 포함하는 것인 항체.
  35. 제32항에 있어서, 서열번호 12, 13, 27 또는 28의 중쇄 및/또는 서열번호 11 또는 26의 경쇄, 또는 이들과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 항체.
  36. 제35항에 있어서, 서열번호 12/11, 13/11, 27/26 또는 28/26의 중쇄 및 경쇄 쌍, 또는 이들과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 항체.
  37. 제36항에 있어서,
    (a) HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 서열이 서열번호 4/5/6/1/2/3으로 구성되고 중쇄 및 경쇄의 나머지가 각각 서열번호 12 및 11에 대한 적어도 95%의 동일성을 포함하거나;
    (b) HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 서열이 서열번호 4/5/6/1/2/3으로 구성되고 중쇄 및 경쇄의 나머지가 각각 서열번호 13 및 11에 대한 적어도 95%의 동일성을 포함하거나;
    (c) HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 서열이 서열번호 19/20/21/1/17/18로 구성되고 중쇄 및 경쇄의 나머지가 각각 서열번호 27 및 26에 대한 적어도 95%의 동일성을 포함하거나;
    (d) HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 서열이 서열번호 19/20/21/1/17/18로 구성되고 중쇄 및 경쇄의 나머지가 각각 서열번호 28 및 26에 대한 적어도 95%의 동일성을 포함하는 것인 항체.
  38. TNFα에의 결합에 대해 제27항 내지 제37항 중 어느 한 항에 정의된 항체와 경쟁하거나 상기 항체와 동일한, TNFα 상의 에피토프에 결합하는 항체.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화된 항체인 항체.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, Fab, 변형된 Fab, Fab', 변형된 Fab', F(ab')2, Fv, 단일 도메인 항체 또는 scFv인 항체.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 정의된 항체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  42. 요법에 의한 인체 또는 동물체의 치료 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 정의된 항체.
  43. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 정의된 항체 및 약학적으로 허용되는 보조제 및/또는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  44. 대상체로부터 얻은 샘플 중의 화합물-삼량체 복합체의 검출을 위한 표적 인게이지먼트(target engagement) 바이오마커로서의 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 정의된 항체의 용도로서, 상기 항체는 검출 가능하고, 상기 복합체는 TNF 수퍼패밀리 구성원인 삼량체 단백질 및 TNF 수퍼패밀리 구성원인 삼량체 단백질에 결합할 수 있는 화합물을 포함하며, 화합물-삼량체 복합체는, 필요한 TNF 수퍼패밀리 수용체에 결합하고 이 수용체를 통해 삼량체에 의해 유도되는 신호전달을 조절하는 것인 용도.
  45. 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원에 대한 화합물의 표적 인게이지먼트를 검출하는 방법으로서, 화합물-삼량체 복합체는, 필요한 수용체에 결합하고 이 수용체를 통해 삼량체에 의해 유도되는 신호전달을 조절하고, 상기 방법은
    (a) 상기 화합물을 투여받은 대상체로부터 샘플을 얻는 단계;
    (b) 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 정의된 항체를 상기 샘플 및 대조군 샘플과 접촉시키는 단계로서, 상기 항체는 검출 가능한 것인 단계; 및
    (c) 상기 샘플 및 상기 대조군 샘플에 대한 상기 검출 가능한 항체의 결합의 양을 측정하는 단계
    를 포함하며, 상기 샘플에 대한 상기 검출 가능한 항체의 결합이 상기 대조군에 대한 상기 검출 가능한 항체의 결합보다 큰 것은, 상기 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원에 대한 상기 화합물의 표적 인게이지먼트를 나타내는 것인 방법.
  46. 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원의 입체구조적 변화를 유도하는 화합물을 스크리닝하는 데 있어서의 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 정의된 항체의 용도로서, 상기 입체구조적 변화는, 삼량체 TNF 수퍼패밀리 구성원의 결합 시 필요한 TNF 수퍼패밀리 수용체의 신호전달을 조절하는 것인 용도.
  47. TNF 수퍼패밀리 구성원인 삼량체 단백질 및 이에 결합된 화합물을 포함하는 복합체로서, 화합물-삼량체 복합체는, 필요한 TNF 수퍼패밀리 수용체에 결합하고 이 수용체를 통해 삼량체에 의해 유도되는 신호전달을 조절하고, 1 nM 이하의 KD-ab로 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 정의된 항체에 결합하는 것인 복합체.
  48. 제47항에 있어서, TNF 수퍼패밀리 구성원이 TNFα인 복합체.
  49. TNFR1에 결합할 수 있는 TNFα 삼량체로서, 결합된 TNFR1로부터의 신호전달은 약화되거나 길항되며, 상기 TNFα 삼량체는 1 nM 이하의 KD-ab로 하기 항체들 중 어느 하나 또는 둘 다에 결합하는 것인 TNFα 삼량체:
    (i) 서열번호 27의 중쇄 및 서열번호 26의 경쇄를 갖는 항체; 또는
    (ii) 서열번호 12의 중쇄 및 서열번호 11의 경쇄를 갖는 항체.
  50. 제49항에 있어서, TNFα 서브유닛이 서열번호 36의 아미노산 서열 또는 상응하는 서열을 포함하는 것인 TNFα 삼량체.
  51. TNF 수퍼패밀리 구성원인 삼량체 단백질에 결합하여 복합체를 형성할 수 있는 화합물로서, 화합물-삼량체 복합체는, 필요한 TNF 수퍼패밀리 수용체에 결합하고 이 수용체를 통해 삼량체에 의해 유도되는 신호전달을 조절하고, 화합물-삼량체 복합체는 1 nM 이하의 KD-ab로 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 정의된 항체에 결합하는 것인 화합물.
  52. 제51항에 있어서, TNF 수퍼패밀리 구성원이 TNFα인 화합물.
  53. 제47항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 인체 또는 동물체에 대해 실시되는 요법에 사용하기 위한 복합체, 삼량체 또는 화합물.
  54. 제53항에 있어서, 자가면역 및 염증성 질환; 신경학적 및 신경변성 질환; 통증 및 통각 수용성 질환; 및 심혈관 질환 중 하나 이상의 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 복합체, 삼량체 또는 화합물.
  55. 제54항에 있어서, 류마티스성 관절염, 크론병, 건선, 전신 홍반성 루푸스, 알츠하이머병, 파킨슨병 및 간질 중 하나 이상의 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 복합체, 삼량체 또는 화합물.
  56. 제47항 또는 제48항에 따른 복합체, 제49항 또는 제50항에 따른 삼량체, 또는 제51항 또는 제52항에 따른 화합물을, 자가면역 및 염증성 질환; 신경학적 및 신경변성 질환; 통증 및 통각 수용성 질환; 및 심혈관 질환 중 하나 이상의 질환의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 직접적으로 또는 간접적으로 투여함으로써 상기 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법.
  57. 제56항에 있어서, 류마티스성 관절염, 크론병, 건선, 전신 홍반성 루푸스, 알츠하이머병, 파킨슨병 및 간질 중 하나 이상의 질환이 치료 및/또는 예방되는 것인 방법.
  58. 제53항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 요법이 인체에 대해 실시되거나 환자가 인간인 복합체, 삼량체, 화합물 또는 방법.
  59. TNF 수퍼패밀리 구성원인 삼량체 단백질에 결합하고 수용체를 통한 삼량체 단백질의 신호전달을 조절할 수 있는 화합물을 확인하는 방법으로서,
    (a) TNF 수퍼패밀리 구성원인 삼량체 단백질 및 테스트 화합물을 포함하는 테스트 화합물-삼량체 복합체의, 이 복합체에 선택적으로 결합하는 항체에 대한 결합 친화성을 측정하기 위해 결합 어세이를 수행하는 단계;
    (b) 단계 (a)에서 측정된 결합 친화성을, 단계 (a)에서 언급된 항체에 고친화성으로 결합하는 것으로 알려진 상이한 화합물-삼량체 복합체의 결합 친화성과 비교하는 단계; 및
    (c) 단계 (b)에서 언급된 비교에 비추어 고려할 때 측정된 결합 친화성이 허용 가능한 경우 단계 (a)의 화합물-삼량체 복합체에 존재하는 화합물을 선택하는 단계
    를 포함하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 항체가 TNF 수퍼패밀리 구성원 삼량체의 부재 하에서의 화합물에의 결합 및/또는 화합물의 부재 하에서의 TNF 수퍼패밀리 구성원 삼량체에의 결합에 비해 TNF 삼량체-화합물 복합체에 선택적으로 결합하는 것인 방법.
  61. 제60항에 있어서, 항체가 화합물의 부재 하에서의 TNF 수퍼패밀리 구성원 삼량체에의 결합 및/또는 TNF 수퍼패밀리 구성원 삼량체의 부재 하에서의 화합물에의 결합에 대한 KD-ab보다 적어도 100배 더 낮은 KD-ab로 TNF 수퍼패밀리 구성원 삼량체-화합물 복합체에 결합하는 것인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 항체가 화합물의 부재 하에서의 TNF 수퍼패밀리 구성원 삼량체에의 결합 및/또는 TNF 수퍼패밀리 구성원 삼량체의 부재 하에서의 화합물에의 결합에 대한 KD-ab보다 적어도 200배 더 낮은 KD-ab로 TNF 수퍼패밀리 구성원 삼량체-화합물 복합체에 결합하는 것인 방법.
  63. 제59항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 정의된 것인 방법.
  64. 제59항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 고속대량 어세이(high throughput assay)인 방법.
  65. 제59항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 테스트 화합물이 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태의 안정성을, 화합물의 부재 하에서의 TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태의 안정성에 비해 증가시키는 것인 방법.
  66. 제65항에 있어서, 안정성의 증가는, TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태의 열 전이 중간점(Tm)을 적어도 1℃ 증가시키는 것인 방법.
  67. 제66항에 있어서, 안정성의 증가는, TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태의 열 전이 중간점(Tm)을 적어도 10℃ 증가시키는 것인 방법.
  68. 제67항에 있어서, TNF 수퍼패밀리 구성원의 삼량체 형태의 Tm의 증가가 10℃ 내지 20℃인 방법.
  69. 제59항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 테스트 화합물이, 필요한 수용체에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 결합 친화성을, 화합물의 부재 하에서의 TNF 수퍼패밀리 구성원의 그 수용체에 대한 결합 친화성에 비해 증가시키는 것인 방법.
  70. 제69항에 있어서, 테스트 화합물이, 화합물의 부재 하에서의 TNF 수퍼패밀리 구성원의 그 수용체의 결합에 대한 결합 속도(kon-r) 및 해리 속도(koff-r) 값에 비해 kon-r을 증가시키고/시키거나 koff-r을 감소시킴으로써, 필요한 수용체에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 결합 친화성을 증가시키는 것인 방법.
  71. 제69항에 있어서, 테스트 화합물이 화합물의 부재 하에서의 TNF 수퍼패밀리 구성원의 그 수용체의 결합에 대한 결합 속도(kon-r) 값에 비해 kon-r을 증가시킴으로써, 필요한 수용체에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 결합 친화성을 증가시키는 것인 방법.
  72. 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 테스트 화합물이, 필요한 수용체에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 KD-r을, 화합물의 부재 하에서의 그 수용체에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 KD-r에 비해 감소시키며, 이 때
    a) 화합물이, 필요한 수용체에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 KD-r을, 화합물의 부재 하에서의 그 수용체에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 KD-r에 비해 적어도 10배 감소시키고;
    b) 화합물의 존재 하에서의 필요한 수용체에의 결합에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 KD-r 값이 10 nM 미만인 방법.
  73. 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 테스트 화합물이, 필요한 수용체에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 KD-r을, 화합물의 부재 하에서의 그 수용체에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 KD-r에 비해 감소시키며, 이 때
    a) 화합물이, 필요한 수용체에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 KD-r을, 화합물의 부재 하에서의 그 수용체에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 KD-r에 비해 적어도 4배 감소시키고;
    b) 화합물의 존재 하에서의 필요한 수용체에의 결합에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 KD-r 값이 600 pM 미만인 방법.
  74. 제73항에 있어서, 화합물의 존재 하에서의 필요한 수용체에의 결합에 대한 TNF 수퍼패밀리 구성원의 KD-r 값이 200 pM 미만인 방법.
  75. 제59항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 테스트 화합물이 500 nM 이하의 IC50 값을 갖는 것인 방법.
  76. 제59항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)의 화합물이 화합물 (1) 내지 (6), 또는 이들의 염 또는 용매화물로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  77. 제59항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, TNF 수퍼패밀리 구성원이 TNFα이고 수용체가 TNF 수용체인 방법.
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