CN107810419A - 调节剂测定 - Google Patents

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Abstract

已经证明某些化合物结合TNF并稳定与TNF受体结合的三聚体TNF的构象。因此，这些化合物可以用作TNF的调节剂。还公开了用这种作用机制鉴定化合物的新测定法。

Description

调节剂测定
发明领域
本发明涉及TNF超家族的调节剂。具体而言，本发明涉及TNF超家族的新型小分子调节剂。本发明还涉及用于鉴定TNF超家族的新调节剂的测定法。
背景技术
肿瘤坏死因子(TNF)超家族是共有调节细胞存活和细胞死亡的主要功能的蛋白质家族。TNF超家族的成员共有共同的核心基序，其由两个反平行的β折叠片(具有反平行的β链)组成，形成“果冻卷(jellyroll)”β结构。TNF超家族成员共有的另一个共同特征是形成同源或异源三聚体复合物。TNF超家族成员的这些三聚体形式结合并激活特定的TNF超家族受体。
TNFα是TNF超家族的原型成员。TNFα生产的失调牵涉到许多具有重大医学重要性的病理状况。例如，TNFα牵涉到类风湿性关节炎、炎性肠病(包括克罗恩氏病)、牛皮癣、阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森病(PD)、疼痛、癫痫、骨质疏松症、哮喘、系统性红斑狼疮(SLE)和多发性硬化症(MS)。TNF超家族的其他成员也牵涉到病理状况，包括自身免疫性疾病。
TNF超家族成员的常规拮抗剂是大分子的并且通过抑制TNF超家族成员与其受体的结合起作用。常规拮抗剂的实例包括抗-TNFα抗体，特别是单克隆抗体，例如英夫利昔单抗阿达木单抗和赛妥珠单抗或可溶性TNFα受体融合蛋白，例如依那西普
发明内容
本发明人已经鉴定了调节TNFα的小分子实体(SME)的类别。这些化合物通过结合TNFα的同三聚体形式，诱导和稳定TNFα同源三聚体的构象变化而起作用。例如，TNFα与同化合物结合的同源三聚体可以与TNFα受体结合，但不太能或不能启动TNFα受体下游的信号传导。这些化合物可以用于治疗由TNFα介导的病症。本发明人还开发了能够以这种方式鉴定能够抑制TNFα的化合物的测定。
因此，本发明提供了一种鉴定能够与TNF超家族成员三聚体蛋白质结合的化合物的方法，由此该化合物-三聚体复合物与必需的TNF超家族受体结合并调节该受体的信号传导，该方法包括：
a)鉴定化合物与样品中TNF超家族成员的三聚体形式的结合；和/或
b)测量包含该化合物的样品中TNF超家族成员的三聚体形式的稳定性；和/或
c)测量包含所述化合物的样品中结合至所需受体的三聚体TNF超家族成员的水平；和/或
d)测定化合物与探针化合物结合TNF超家族成员的三聚体形式的竞争性；
(a)中该化合物与TNF超家族成员的三聚体形式的结合和/或(b)中TNF超家族成员的三聚体形式的稳定性和/或三聚体TNF超家族成员的水平(c)中必需的受体结合，和/或(d)中观察到的竞争水平与对照样品的相应值相比较，并选择能够结合三聚体蛋白的化合物，即TNF超家族成员化合物-三聚体复合物结合必需的TNF超家族受体并调节受体的信号传导。
因此，本发明的方法可以用于鉴定能够与作为TNF超家族成员的三聚体蛋白质结合的化合物，由此化合物-三聚体复合物结合必需的TNF超家族受体并调节由TNF超家族成员诱导的信号传导三聚体通过受体。换言之，根据本发明的化合物-三聚体复合物调节受体的信号传导。
本发明还提供了一种复合物，其包含(或由其组成)作为TNF超家族成员的三聚体蛋白质和与其结合的化合物，由此化合物-三聚体复合物结合必需的TNF超家族受体并调节受体的信号传导。
本发明还提供了一种包含TNF超家族成员和能够与作为TNF超家族成员的三聚体蛋白质结合的化合物的复合物，由此化合物-三聚体复合物结合必需的TNF超家族受体并调节受体，用于在人体或动物体上实施的治疗方法中。
本发明还提供了一种药物组合物，其包含能与TNF超家族成员三聚体蛋白质结合的化合物的复合物，由此该化合物-三聚体复合物与必需的TNF超家族受体结合并调节受体的信号传导作为TNF超家族成员的三聚体蛋白质和药学上可接受的载体。
附图的简要说明
图1显示了式(1)化合物和式(2)化合物的结构。
图2显示了式(3)的化合物和式(4)的化合物的结构。
图3A显示了影响TNFα与TNF受体结合的测试化合物的筛选(Mesoscale Discoveryassay，MSD)结果。研究了多种测试化合物，计算了TNFα与TNF受体结合的％抑制水平。图3B显示使用该测定法的式(1)化合物的剂量响应曲线。图3C显示式(2)化合物的剂量响应曲线。
图4A显示了受体-配体结合测定，证实在式(1)化合物存在下，TNF与TNFR1的胞外结构域(ECD)的结合增强。图4B显示了式(2)的化合物在相同的测定中诱导的增强的结合。
图5(底部曲线)显示了在100％水溶液中TNFα的解卷积质谱图。图5(上图)显示了含有10％v/v DMSO的溶液中TNFα的解卷积质谱图。图5(中间曲线)显示了含有10％v/vDMSO和式(1)化合物的溶液中TNFα的解卷积质谱图。
图6显示了含有式(1)化合物的溶液中TNFα的质谱图。
图7显示尺寸排阻色谱法实验的洗脱曲线的覆盖图，以及随后的(A)与式(1)化合物预温育的TNFα样品然后与TNF-R混合的质谱分析和(B)用TNF-R预温育的TNFα样品，然后与式(1)化合物混合。
图8显示了(A)TNFα与TNF-R结合的等温量热分析结果和(B)TNFα与TNF-R结合的等温量热分析结果，其中TNFα已经与式(2)的化合物。
图9显示了式(1)-三聚体TNFα复合物的晶体结构。
图10显示了针对残余人TNFα浓度(pg/ml)在式(1)化合物和式(2)化合物浓度上测量的式(1)化合物和式(2)化合物对人TNFα的中和的图，使用L929鼠纤维肉瘤细胞杀伤测定法测量。
图11显示了式(1)化合物的浓度(nM)相对于TNFα处理的人单核细胞中％相对IL-8产量的图。
图12显示了在(A)TNFα(0.5ng/mL)，(B)IL-1β(0.5ng/mL)和(C)活化性TNF-R1抗体(300ng/mL)存在下，式(2)化合物的浓度(nM)相对于HEK293细胞中NF-κB活化的％抑制的图。
图13A显示了使用表面等离子体共振测量的式(1)化合物与TNFα随时间的结合动力学。图13B显示式(2)化合物与TNFα的结合动力学。图13C显示式(3)化合物与TNFα的结合动力学。
图14显示了响应于单独的TNFα或已经用浓度逐渐增加的(A)式(1)化合物或(B)式(2)化合物预孵育的TNFα的嗜中性粒细胞募集水平，并通过腹膜内注射(ip.)。
图15显示了单独或在增加浓度的式(1)化合物存在下口服施用对TNFα反应的嗜中性粒细胞募集水平。
图16是使用式(1)，(2)和(3)的测试化合物的荧光偏振(FP)测定的结果的图。对测试化合物的浓度对式(4)化合物对TNFα的抑制％抑制作图。
图17(底部曲线)显示了CD40L在100％水溶液中的质谱图。图17(中间曲线)显示了在含有10％v/v二甲基亚砜(DMSO)的溶液中的CD40L质谱图。图17(上图)显示了含有10％v/v DMSO和式(1)化合物的溶液中CD40L的质谱图。
序列表说明
SEQ ID NO：1显示C185_01974.0的HCVR。
SEQ ID NO：2显示C185_01974.0的LCVR。
SEQ ID NO：3显示了C185_01974.0的mIgG1重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4显示了C185_01974.0的κ轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5显示C185_01979.0的HCVR。
SEQ ID NO：6显示C185_01979.0的LCVR。
SEQ ID NO：7显示C185_01979.0的mIgG1重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：8显示了C185_01979.0的κ轻链的氨基酸序列。
发明详述
用于鉴定TNF超家族成员的调节剂的测定
本发明人已经开发了用于鉴定TNF超家族成员的调节剂的测定法。TNF超家族成员的调节剂可以包括TNF超家族成员的激动剂和拮抗剂。TNF超家族成员的调节剂可以是一种或多种TNF超家族成员的拮抗剂。或者，TNF超家族成员的调节剂可以是一种或多种TNF超家族成员的激动剂。具体而言，本发明人已经开发了可用于鉴定结合三聚体形式的TNF超家族成员的化合物，并且使这些三聚体稳定在能够结合必需的TNF受体的构象中，并且因此通过所述受体。因此，本发明提供了用于鉴定TNF超家族成员的调节剂的测定法。
具体而言，本文所述的测定法可用于鉴定结合三聚体形式的TNF超家族成员并且形成与必需的TNF家族受体结合的化合物-三聚体复合物的化合物。
在一个优选的实施方案中，本发明的测定法鉴定与TNF超家族成员的三聚体形式结合但不与单体形式结合的化合物。在特别优选的实施方案中，所述化合物结合并稳定TNF超家族成员的三聚体形式，不结合单体形式并且不稳定TNF超家族成员的二聚体形式。测试化合物对TNF超家族三聚体的稳定作用可以通过抑制三聚体之间单体单元交换的测试化合物来实现。
本发明的测定可以包括确定测试化合物是否增强TNF超家族成员与其受体的结合，并因此鉴定TNF超家族调节剂。在一个优选的实施方案中，本发明的测定可以包括确定测试化合物是否增强TNF超家族成员与其受体的结合，并因此鉴定通过增加还原信号传导或非信号传导形式的结合起作用的TNF超家族拮抗剂TNF超家族成员的受体。
用于鉴定根据本发明的TNF超家族调节剂的测定法可以包括在使肿瘤坏死因子超家族成员的三聚体的形成不稳定的条件下(例如在DMSO的存在下)孵育目的TNF超家族成员的样品，并测量测试化合物稳定TNF超家族成员三聚体的形成。或者，根据本发明的用于鉴定TNF超家族调节剂的测定可以涉及TNF超家族三聚体与测试化合物的结合，并测量化合物-三聚体复合物与必需的TNF受体的结合程度。
TNF超家族成员及其受体可以纯化或以混合物存在，例如在培养细胞，组织样品，体液或培养基中。可以开发定性或定量分析，其中后者可用于确定测试化合物对TNF超家族成员的三聚体形式的结合参数(亲和常数和动力学)，以及化合物-三聚体复合物的结合参数到必需的TNF受体。
TNF超家族成员的单体，二聚体和三聚体形式的量可以通过测量单体，二聚体和三聚体形式的质量，单体，二聚体和三聚体形式的摩尔量，单体，二聚体和三聚体形式，以及单体，二聚体和三聚体形式的摩尔浓度。这个数额可以用任何适当的单位给出。例如，单体，二聚体和三聚体形式的浓度可以以pg/ml，ng/ml或μg/ml给出。单体，二聚体和三聚体形式的质量可以以pg，ng或μg给出。
可以将目的样品中TNF超家族成员的单体，二聚体或三聚体形式的量与另一样品(例如对照样品)中的TNF超家族成员的单体，二聚体或三聚体形式的水平比较，在此描述。在这种方法中，TNF超家族成员的单体，二聚体或三聚体形式的实际量，例如样品中TNF超家族成员的单体，二聚体或三聚体形式的质量，摩尔量，浓度或摩尔浓度被评估。可以将TNF超家族成员的单体，二聚体或三聚体形式的量与另一个样品中的量比较，而不量化TNF超家族成员的单体，二聚体或三聚体形式的质量，摩尔量，浓度或摩尔浓度。因此，根据本发明的样品中TNF超家族成员的单体，二聚体或三聚体形式的量可以评估为相对量，例如单体的相对质量，相对摩尔量，相对浓度或相对摩尔浓度，基于两个或更多个样品之间的比较的TNF超家族成员的二聚体或三聚体形式。
在本发明中，可筛选化合物文库以鉴定TNF超家族成员的调节剂(即使用本文公开的测定法)。这样的文库通常包含至少260种化合物。优选地，这样的文库包含至少300，至少500或甚至至少1000个化合物。
基于质谱的测定
本发明人已经发现质谱法可以用于鉴定结合三聚体形式的TNF超家族成员的化合物，并且使这些三聚体稳定在能够结合必需的TNF受体的构象中。
具体而言，质谱法可用于评估化合物是否稳定TNF超家族成员的三聚体形式。
因此，本发明提供了用于鉴定能够结合作为TNF超家族成员的三聚体蛋白的化合物的测定法，由此化合物-三聚体复合物结合必需的TNF超家族受体并调节受体的信号传导，包括步骤鉴定测试化合物与样品中TNF超家族成员的三聚体形式的结合，并比较该化合物与TNF超家族成员的三聚体形式与来自对照样品的相应值的结合，其包括进行质谱分析在含有TNF超家族成员和化合物的样品上检测TNF超家族成员三聚体的量，并将样品中TNF超家族成员三聚体的量与对照样品比较，并选择能够结合三聚体形式的化合物的TNF超家族成员，由此化合物-三聚体复合物结合所需的TNF突变rfamily受体并调节受体的信号传导。对照样品可以与待测样品相同，只是它缺少测试化合物。包含TNF超家族成员和化合物的样品可以进一步包含去稳定剂。
在本发明中，可以在去稳定剂存在下，将测试化合物加入到TNF超家族成员的溶液中。去稳定剂(也称为离液剂)包括低摩尔浓度(例如1M)尿素，胍或乙腈，这些试剂的高浓度(例如6M或更高)将导致TNFα三聚体的完全解离和组成性TNFα单体的解折叠亚基。去稳定剂优选为DMSO，通常浓度为5％，10％或更高。可以使用质谱分析所得到的溶液。
可以检测TNF超家族成员与结合亲和力低至1mM的测试化合物之间形成的非共价复合物。结合化学计量可以直接从存在或不存在其中结合有多个测试化合物分子的复合物获得。结合亲和力(KD值)可以通过在已知测试化合物浓度下测量TNF超家族成员-测试化合物复合物(化合物-三聚体复合物)/TNF超家族成员浓度比来确定。
如果与不存在测试化合物的含有TNF超家族成员的样品和去稳定剂的样品所观察到的三聚体的量相比，测试化合物稳定TNF超家族成员的三聚体形式。与不存在测试化合物的包含TNF超家族成员和去稳定剂的样品中存在的三聚体的量相比，测试化合物可使三聚体的量增加10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，100％，150％，200％，300％，400％或更多。
与不存在去稳定剂和测试化合物的情况相比，测试化合物还可以增加对于TNF超家族成员样品观察到的三聚体的量。与不存在去稳定剂和测试化合物的包含TNF超家族成员的样品中存在的三聚体的量相比，测试化合物可使三聚体的量增加10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,100％,150％,200％,300％,400％或更多。
三聚体稳定在质谱研究中以两种方式被证明。
首先存在TNFα三聚体复合物的物理分解，其可以通过在质谱中观察到的单体和三聚体的比率来测量。在我们的研究中没有观察到二聚体。这种分解可能是用于将分子引入质谱仪的高能过程的人造物质。无论如何，它可用于评估测试化合物在雾化和电离过程中稳定三聚复合物的能力，从而减少质谱中观察到的单体的量，单体/三聚体比例用于确定稳定的程度。
其次，在软电离条件下，较少的能量被赋予三聚体复合物，导致其完全透射到光谱仪中，从而更密切地反映真实的溶液组成。电喷雾电离过程导致蛋白质多次充电，因为在正离子化模式下，某些氨基酸内的碱性官能团获得正电荷。质谱仪测量质荷比。因此，例如标称52,000DaTNFα三聚体如果携带10次电荷，则其将以m/z比率5,200出现。正是这种多次充电效应使得质谱范围有限的质谱仪可用于多聚体蛋白质复合物的研究。与光谱仪一起提供的软件允许用户去卷积数据以给出蛋白质的质量，因为如果它只携带单一电荷(即基于其原子组成的真实分子量)，就会出现蛋白质的质量。
在折叠的蛋白质中，许多氨基酸埋藏在核心中，只有暴露在表面上的百分比通常获得6至8个正电荷。没有一个单一的带电物质占主导地位，通常在很小的范围内观察到几种物质(离子)，这些包括所谓的电荷态包络。在另一个极端，在蛋白质完全变性(即展开)的情况下，则暴露更多的氨基酸，并且获得的电荷的典型数量可能高达20，电荷状态包络也包括更大数量的电荷物质现在有更多可用的网站来接受收费。因此，电荷的数量和构成电荷态包膜的带电物质的数量是蛋白质折叠程度的敏感读数。此外，如果折叠的蛋白质可以以表面暴露的氨基酸的相对数量不同的多种构象存在，那么电荷状态包迹的偏移将反映这些差异。
在软纳米电喷雾离子化条件下，对完整折叠的TNFα蛋白质进行质谱研究表明几乎100％的TNFα三聚体被检测到，只有很少的TNFα单体被检测到，而二聚体完全不存在。
在更苛刻的电离条件下，或当向TNFα样品中添加去稳定剂时，观察到单体TNFα的水平升高，伴随三聚体水平的降低。只观察到非常少量的二聚体。
质谱也可用于确定测试化合物是否结合TNF超家族成员的单体，二聚体和三聚体形式。
质谱也可以用来确定测试化合物与TNF超家族成员的化学计量，即有多少分子的测试化合物与TNF超家族成员结合。
质谱也可用于确定化合物-TNF超家族成员三聚体复合物是否结合必需的TNF受体。
质谱也可以用于测量测试化合物结合TNF超家族成员的速率(“缔合”速率“kon-c”)和测试化合物从TNF超家族成员解离的速率(“解离”率或koff-c)。如本文所用，符号“KD-c”表示测试化合物对TNF超家族成员的结合亲和力(解离常数)。KD-c被定义为koff-c/kon-c。测试化合物可具有缓慢的“缔合”速率，其可通过TNF超家族成员的质谱分析和化合物-三聚体复合物峰强度以分钟测量。测试化合物的KD-c值可以通过在不同的TNF超家族成员：化合物-三聚体复合物比率下重复该测量来估计。在一个优选的实施方案中，本发明化合物与TNF超家族三聚体的结合特征在于快速的“缔合”速率，理想的是约107M-1s-1，具有慢的“关闭”速率，例如通常为10-3s-1，10-4s-1，或者没有可测量的“解离”率。
质谱也可以用于确定测试化合物在必需的受体存在下是否与TNF超家族成员结合。这可能涉及将测试化合物与已经与其受体预温育的TNF超家族成员一起温育。然后可以将含有测试化合物和预温育的TNF超家族成员和受体的样品分级以根据分子大小分离分子，例如通过分析性凝胶过滤。可以使用质谱法分析所得的级分以确定测试化合物在所需受体存在下是否结合TNF超家族成员。如果与TNF超家族成员结合，该化合物将以与TNF超家族成员相同的级分洗脱。如果不与TNF超家族成员结合，该化合物将以与TNF超家族成员不同的部分洗脱。在这种情况下，该化合物通常会在比TNF超家族成员更晚的凝胶过滤级分中洗脱出来。
质谱方法可以包括例如基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDIMS)，表面增强激光解吸/电离质谱(SELDI MS)，飞行时间质谱(TOFMS)和液相色谱质谱光谱法(LC MS)。
受体-配体结合测定
常规的TNF超家族拮抗剂通过抑制TNF超家族成员与其受体的结合起作用。本发明人已经使用受体-配体结合测定来确定测试化合物是否增强TNF超家族成员与其受体的结合。这样的受体-配体结合测定法可用于鉴定通过增加TNF超家族成员的还原信号传导或非信号传导形式与其受体的结合而起作用的TNF超家族拮抗剂。也可以使用受体-配体结合测定来鉴定激动剂，其通过增加TNF超家族成员与其受体的结合起作用并增强TNF超家族受体的信号传导。
因此，本发明提供了用于鉴定能够与作为TNF超家族成员的三聚体蛋白质结合的化合物的测定法，由此化合物-三聚体复合物结合必需的TNF超家族受体并调节受体的信号传导，包括步骤在包含测试化合物的样品中测量与必需受体结合的三聚体TNF超家族成员的水平，并将结合所需受体的三聚体TNF超家族成员的水平与来自对照样品的相应值进行比较，该方法包括进行受体-配体结合其中将TNF超家族成员的样品和化合物应用于已经结合到表面上的必需TNF受体并将与所需TNF受体结合的TNF超家族成员三聚体的量与对照样品进行比较，并选择化合物其能够结合TNF超家族成员的三聚体形式，三聚体复合物结合必需的TNF超家族受体并调节受体的信号传导。对照样品可以与待测样品相同，只是它缺少测试化合物和/或其含有已知化合物。包含TNF超家族成员和化合物的样品可以进一步包含去稳定剂。
可将测试化合物加入到包含TNF超家族成员和去稳定剂的溶液中。在失稳剂单独存在下(在对照样品中)，TNF超家族受体的结合水平可以与在去稳定剂和测试化合物存在下TNF超家族成员与其受体的结合水平。如果TNF超家族成员与其受体结合的比例超过TNF超家族成员与其受体结合的水平，那么该超家族成员与其受体的结合增强了TNF超家族成员与其受体结合的比例在不存在测试化合物的情况下使用去稳定剂。
与在不存在测试化合物的情况下含有TNF超家族成员的样品中结合于其受体的TNF超家族成员的量相比，测试化合物可使与其受体结合的TNF超家族成员的量增加10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，100％，150％，200％，300％，400％或更多。
本发明的受体-配体结合测定通常需要结合于支持物的TNF超家族受体。TNF超家族受体可以直接与载体结合，或间接使用接头分子如抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素结合。然后可以通过添加TNF超家族成员与去稳定剂的溶液来测定TNF超家族成员与其受体的结合水平。去稳定剂(也称为离液剂)包括低摩尔浓度(例如1M)尿素，胍或乙腈，这些试剂的高浓度(例如6M或更高)将导致TNFα三聚体的完全解离和组成性TNFα单体的解折叠亚基。去稳定剂优选为DMSO，通常浓度为5％，10％或更高。
TNF超家族成员与其受体的结合通常使用对TNF超家族成员是特异性的并且与标记结合的抗体来确定。标记可以是任何可以被检测到的分子。例如，标记可以是放射性同位素(例如125I,32P,35S和3H))，荧光染料(例如荧光素，罗丹明)，酶缀合物等。酶的底物用于定量与表面结合的受体结合的TNF超家族成员的量。其他标记包括分子标记，当暴露于某些刺激(例如电)时，其可以被激活以产生光。标记的选择取决于所使用的检测系统。
受体-配体结合测定可以以几种形式进行，包括基于细胞的结合测定，溶液相测定和免疫测定。受体-配体结合反应的固体载体优选含有孔。一般来说，将测试化合物-三聚体复合物与必需的TNF超家族受体温育一段指定的时间，随后测量与受体结合的化合物-三聚体复合物的量。结合的化合物-三聚体复合物的水平可以通过使用显微镜，荧光测定法，闪烁计数器或任何可用的免疫测定法测量标记来计算。
如本文所用，符号“kon-r”表示化合物-三聚体复合物结合TNF超家族受体的速率(“缔合”速率)。如本文所用，符号“koff-r”表示化合物-三聚体复合物从TNF超家族受体解离的速率(“解离”速率)。如本文所用，符号“KD-r”表示用于超家族受体的化合物-三聚体复合物的结合亲和力(解离常数)。KD-r被定义为koff-r/kon-r。
可使用受体-配体结合测定来测量本发明的化合物-三聚体复合物与必需的TNF超家族受体的结合亲和力。具体而言，竞争测定法可用于比较本发明的化合物-三聚体复合物与必需的TNF超家族受体的kon-r和koff-r值以及TNF超家族成员与结合其受体在不存在测试化合物的情况下测定，并且测定本发明的化合物-三聚体复合物与必需的TNF超家族受体的结合的KD-r值。
稳定性分析
本发明人已经开发了测定测试化合物对TNF超家族成员稳定性的影响的方法。因此，本发明提供了用于鉴定能够结合作为TNF超家族成员的三聚体蛋白的化合物的测定法，由此化合物-三聚体复合物结合必需的TNF超家族受体并调节受体的信号传导，包括步骤测量包含该化合物的样品中TNF超家族成员的三聚体形式的稳定性，并比较TNF超家族成员的三聚体形式与对照样品的相应值的稳定性，其包括进行测定以确定三聚体的Tm TNF超家族成员的样品中的TNF超家族成员和化合物的形式，比较TNF超家族成员的三聚体形式的Tm与对照样品，并选择能够结合TNF三聚体形式的化合物超家族成员，由此化合物-三聚体复合物结合必需的TNF超家族受体并调节受体的信号传导。对照样品可以与待测样品相同，只是它缺少测试化合物和/或其含有已知化合物。包含TNF超家族成员和化合物的样品可以进一步包含去稳定剂。
可将测试化合物加入到包含TNF超家族成员和去稳定剂的溶液中。在仅有去稳定剂存在下(在对照样品中)，TNF超家族成员的三聚体形式的稳定性可以与存在去稳定剂和测试化合物的情况下TNF超家族成员的三聚体形式的稳定性进行比较。如果与在不存在测试化合物的情况下含有TNF超家族成员和去稳定剂的样品中观察到的TNF超家族成员的三聚体形式的Tm相比，测试化合物增加TNF超家族成员的三聚体形式的热转变中点(Tm)，则其增强了TNF超家族成员的三聚体形式的稳定性。TNF超家族成员的三聚体形式的Tm是50％的生物分子展开的温度。在存在和/或不存在测试化合物的情况下，TNF超家族成员的三聚体形式的Tm可以使用本领域已知的任何适当的技术，例如使用差示扫描量热法(DSC)或荧光探针热变性测定来测量。
与不存在测试化合物的含有TNF超家族成员的样品中TNF超家族成员的三聚体形式的Tm相比，测试化合物可使TNF超家族成员的三聚体形式的Tm增加至少1℃，至少2℃，至少5℃，至少10℃，至少15℃，至少20℃或更高。优选地，测试化合物将TNF超家族成员的三聚体形式的Tm提高至少1℃，更优选至少10℃，甚至更优选10℃至20℃。
去稳定剂(也称为离液剂)包括低摩尔浓度(例如1M)尿素，胍或乙腈，这些试剂的高浓度(例如6M或更高)将导致TNFα三聚体的完全解离和组成性TNFα单体的解折叠亚基。去稳定剂优选为DMSO，通常浓度为5％，10％或更高。
等温量热分析
本发明人已经开发了用于确定测试化合物对TNF超家族成员对其受体的结合亲和力的影响的等温量热法。
因此，本发明提供了用于鉴定能够结合作为TNF超家族成员的三聚体蛋白质的化合物的测定法，由此化合物-三聚体复合物结合必需的TNF超家族受体并调节受体的信号传导，包括测量在包含所述化合物的样品中结合至所需受体的三聚体TNF超家族成员的水平，并将结合至所需受体的三聚体TNF超家族成员的水平与来自对照样品的对应值进行比较，所述方法包括进行等温量热分析以测量结合亲和力在存在化合物的情况下，TNF超家族成员的必需受体；并将TNF超家族成员对必需受体的结合亲和力与对照样品进行比较，并选择能够与作为TNF超家族成员的三聚体蛋白质结合的化合物，由此化合物-三聚体复合物结合必需的TNF超家族受体和调节受体的信号传导。对照样品可以与待测样品相同，只是它缺少测试化合物和/或其含有已知化合物。
TNF超家族成员的等分试样可以依次加入必需的TNF受体的储库。等分试样的体积可以在任何适当的范围内。等分试样可以是任何合适的体积，例如0.1μl至10μl。在一个优选的实施方案中，等分试样的体积可以是0.5μl，1.0μl或3.0μl。根据注射器的体积，可能会使用更大的体积。
由于TNF超家族三聚体与受体结合，因此TNF超家族成员的每次添加将导致释放或吸收少量热量。典型地，当TNF超家族三聚体与受体结合时，TNF超家族成员的每次添加将导致少量热量的释放。可以使用等温量热法测量放热量，并且该信息用于获得TNF超家族成员与其受体的结合亲和力。
该过程可以重复使用，将TNF超家族成员和测试化合物的溶液顺序添加到TNF超家族受体的储库中。TNF超家族成员和测试化合物优选为化合物-三聚体复合物的形式。此外，放热量可以用等温量热法测量，并且这些信息用于获得TNF超家族成员与其受体的结合亲和力。
可以比较TNF超家族成员和化合物-三聚体复合物的结合亲和力以确定化合物是否增加TNF超家族成员对其受体的结合亲和力。
与不存在测试化合物的情况下TNF超家族成员与其受体的结合亲和力相比，测试化合物可使TNF超家族成员与其受体的结合亲和力提高2倍，3倍，4倍，5倍，10倍，20倍，30倍，40倍，50倍，60倍，70倍，80倍，90倍，100倍或更多。
结合亲和力可以以结合亲和力(KD-r)的形式给出，并且可以以任何合适的单位给出，例如μM，nM或pM。KD-r值越小，TNF超家族成员对其受体的结合亲和力越大。
与在不存在测试化合物的情况下TNF超家族成员与其受体结合的KD-r值相比，TNF受体超家族成员在测试化合物存在下与其受体结合的KD-r值可以是至少1.5倍，2倍，3倍，4倍，5倍，10倍，20倍，30倍，40倍，50倍，60倍，70倍，80倍，90倍，100倍更低。
在测试化合物存在下，TNF超家族成员与其受体结合的KD-r值可以是1μM，100nM，10nM，5nM，1nM，100pM，10pM或更少。在一个优选的实施方案中，在测试化合物存在下，TNF超家族成员与其受体结合的KD-r值为1nM或更小。
竞争测定
本发明人已经开发了用于鉴定能够与作为TNF超家族成员的三聚体蛋白结合的化合物的方法，由此化合物-三聚体复合物结合所需的TNF超家族受体并通过研究与探针化合物竞争结合三聚体TNF超家族成员的测试化合物。因此，本发明提供了一种测定方法，包括测定测试化合物与探针化合物结合TNF超家族成员的三聚体形式的竞争性，并将由此观察到的竞争水平与对照样品的相应值进行比较，能够结合TNF超家族成员的三聚体蛋白质，由此化合物-三聚体复合物结合必需的TNF超家族受体并调节受体的信号传导。
探针化合物可以包含放射性标记的根据本发明的化合物。可用于本发明探针的放射性核包括氚(3H),14C,18F,22Na,32P,33P,35S,36Cl,125I,131I和99mTc。
具体而言，竞争测定可以是荧光偏振(FP)测定，其中荧光偏振的程度与荧光分子的旋转弛豫时间相关，并因此与分子大小有关。大分子表现出比小分子更高的偏振度。因此，FP测定可以用于测量小荧光配体或探针与更大的蛋白质如TNF超家族成员的相互作用。偏振度提供了一个直接测量荧光配体。
因此，本发明提供了一种鉴定能够与作为TNF超家族成员的三聚体蛋白质结合的化合物的方法，由此化合物-三聚体复合物结合必需的TNF超家族受体并调节受体的信号转导，所述方法包括以下步骤：测量化合物与探针化合物结合TNF超家族成员三聚体形式的竞争性，将观察到的竞争水平与对照样品的相应值进行比较，并选择能够结合三聚体蛋白质的化合物，所述三聚体蛋白质是TNF超家族成员，其中所述化合物-三聚体复合物结合所需的TNF超家族受体并调节所述受体的信号传导，其中所述方法包括使用所述化合物和探针化合物进行荧光偏振测定，比较探针化合物在偏振度为i的化合物存在下进行对照样本。
测试化合物与探针或配体竞争的能力可使用标准术语(例如半数最大抑制浓度(IC50))来量化。在这种情况下，IC50值代表导致探针与三聚体TNF超家族成员结合50％抑制所需的化合物的浓度。测试化合物可具有500nM，400nM，300nM，200nM，100nM，90nM，80nM，70nM，60nM，50nM，40nM，30nM，20nM，10nM，5nM，1nM，100pM或更低的IC50值。优选地，测试化合物具有200nM或更小的IC50值。更优选地，测试化合物具有150nM或更小的IC50值或100nM或更小的IC50值。
如上所述，在本发明中，化合物文库通常进行一个或多个本文所述的测定以鉴定TNF超家族成员的调节剂。可以包含至少260种化合物，至少300种，至少500种或甚至至少1000种化合物的这样的文库可以使用荧光偏振进行筛选。
当使用荧光偏振筛选化合物文库时，该方法可以包括如果化合物产生特定的IC50值，则选择化合物作为TNF超家族成员的调节剂。例如，如果化合物导致IC50值小于50μM，则化合物可以被鉴定为TNF超家族成员的调节剂。在一些方面，鉴定其中导致IC50值小于500nM，小于200nM或甚至小于100nM的化合物。
如果来自文库的所有化合物的IC50值最低，那么来自文库的化合物也可以被鉴定为TNF超家族成员的调节剂。同样，与文库的其它化合物相比，可以将化合物鉴定为TNF超家族成员的调节剂，其中它具有低IC50值(即更好的IC50值)。例如，导致最低IC50值的文库化合物的50％可以被鉴定为调节剂。在一些方面，导致最低IC50值的文库化合物的25％或甚至10％可以被鉴定为调节剂。
在一个实施方案中，探针化合物包含与荧光配体缀合的根据本发明的化合物。合适地，荧光配体是具有10ns或更少的荧光寿命的荧光染料。合适的荧光染料的典型实例包括荧光素，罗丹明，Cy染料(例如Cy2，Cy3，Cy3B，Cy3.5，Cy5，Cy5.5或Cy7)，染料(例如Alexa350,405,430,488,532,546,555,568,594,610,633,635,647,660,680,700,750或790)或染料(例如BODIPY FL，BODIPY R6G，BODIPY TMR或BODIPY FL)。本发明的探针化合物的具体实例是如图2所示的式(4)的化合物。
对照样品可以与待测样品相同，只是它缺少测试化合物和/或其含有已知化合物。
包含TNF超家族成员和化合物的样品可以进一步包含去稳定剂。去稳定剂(也称为离液剂)包括低摩尔浓度(例如1M)尿素，胍或乙腈，这些试剂的高浓度(例如6M或更高)将导致TNFα三聚体的完全解离和组成性TNFα单体的解折叠亚基。去稳定剂优选为DMSO，通常浓度为5％，10％或更高。
尽管可以使用荧光偏振来鉴定TNF超家族成员的调节剂，但是在本发明的一些方面中，可以通过除了荧光偏振(即，不是荧光偏振的方法)之外的本文所述的任何测定来鉴定这样的调节剂。特别地，化合物与三聚体TNF超家族成员的结合以及化合物与探针化合物与TNF超家族成员的三聚体形式的结合的竞争可以通过除荧光偏振之外的任何方法来确定。
通过TNF超家族受体发信号
本发明可涉及鉴定可调节(即阻止，降低或增强)TNF超家族成员结合的TNF超家族受体的信号传导的化合物的方法。
在一个实施方案中，本发明可以涉及鉴定可以阻止或减少TNF超家族成员结合的TNF超家族受体的信号传导的化合物的方法。这种方法可以包括使TNF超家族受体与TNF超家族成员和化合物-三聚体复合物接触，并检测测试化合物是否通过TNF超家族受体阻止或减少TNF超家族成员三聚体信号传导。用化合物-三聚体复合物处理的TNF超家族受体的信号传导量可以与仅用TNF超家族成员处理的TNF超家族受体的信号传导量相比较。
或者，本发明可以涉及鉴定能够增强TNF超家族成员结合的TNF超家族受体的信号传导的化合物的方法。这种方法可以包括使TNF超家族受体与TNF超家族成员和化合物-三聚体复合物接触，并检测测试化合物是否通过TNF超家族受体增加TNF超家族成员三聚体信号传导。用化合物-三聚体复合物处理的TNF超家族受体的信号传导量可以与仅用TNF超家族成员处理的TNF超家族受体的信号传导量相比较。
为了检测信号水平，可以进行测量TNF超家族受体信号传导的下游效应的测定。例如，可以使用L929鼠纤维肉瘤细胞杀伤测定来评估TNF刺激细胞死亡。通过人单核细胞抑制TNF诱导的IL-8产生也可用于评估测试化合物是否通过其受体抑制TNF信号传导。
用于鉴定三聚体化合物复合物的抗体
本发明人开发了选择性结合包含本发明化合物和三聚体TNF超家族成员的复合物的抗体。这些抗体可用于鉴定能够抑制TNF的其他化合物。
具体而言，本发明人已经鉴定了称为CA185_01974和CA185_01979的两种抗体，其与本发明化合物复合的人TNFα产生。CA185_01974的重链可变区(HCVR)显示在SEQ ID NO：1中，CA185_01974的轻链可变区(LCVR)显示在SEQ ID NO：2中。全长IgG1重链显示在SEQ IDNO：3(1974HC1gG1全长)和全长轻链(1974LC kappa全长)示于SEQ ID NO：4。
CA185_01979的HCVR显示在SEQ ID NO：5中，CA185_01979的LCVR显示在SEQ IDNO：6中。CA185_01979的全长IgG1重链显示在SEQ ID NO：7(1979HC mIgG1全长)中，并且全长轻链SEQ ID NO：8(1979LCKappa全长)。
包含上述HCVR/LCVR或全长序列对的抗体可以由技术人员使用标准技术容易地生成。
用于确定能够结合TNF超家族成员的三聚体蛋白并通过受体调节信号传导的化合物的本发明的方法因此可以包括鉴定具有SEQ IDNO：1/2的HCVR/LCVR对的抗体或5/6结合三聚体化合物复合物。同样，方法可能涉及鉴定具有SEQ ID Nos：3/4或7/8的序列对的抗体是否结合三聚化合物复合物。除了本文所述的其他测定之外，还可以使用抗体测定。
可以通过例如标准ELISA或Western印迹来测试本发明的抗体与化合物-三聚体复合物的结合。还可以通过监测抗体与表达靶蛋白的细胞的结合(例如通过流式细胞术)来确定抗体的结合选择性。因此，本发明的筛选方法可以包括通过进行ELISA或Western印迹或通过流式细胞术来鉴定能够结合化合物-三聚体复合物的抗体的步骤。
本文所述的抗体选择性(或特异性)识别至少一种化合物-三聚体复合物，即化合物-三聚体复合物内的表位。当抗体或其它化合物以优先或高亲和力与其选择性结合的蛋白质“结合”或“选择性识别”蛋白质时，其与其它蛋白质基本上不结合或以低亲和力结合。
在本实例中，化合物-三聚体复合物通常可以将抗体与SEQ ID NO：1/2或5/6的HCVR/LCVR对(或与SEQ ID NO：3/4或7/8的序列对)以亲和力小于1nM结合。换句话说，本发明的方法可涉及确定化合物能够结合作为TNF超家族成员的三聚体蛋白质并通过鉴定具有SEQ ID NOs：1/2或5/6(或SEQ ID NO：3/4或7/8的序列对)的HCVR/LCVR对的抗体以小于1nM的KD-ab结合三聚体化合物复合物来调节通过受体的信号传导。在一些情况下，KD-ab可小于500pM，或小于200pM。亲和力可以通过表面等离子体共振确定。TNF通常是人TNFα。
同样，本发明的复合物可以是三聚体TNF超家族成员与化合物的复合物，其中所述化合物-三聚体复合物将抗体与SEQ ID NO：1/2或5/6(或其等价物)的HCVR/LCVR对SEQ IDNos：3/4或7/8的序列对)。此外，TNF通常是人TNFα，并且结合亲和力通常小于1nM(或小于500pM/200pM)。结合亲和力通常由表面等离子体共振确定。
TNF超家族成员的调节剂
使用本文所述的测定，本发明人已经鉴定了结合三聚体形式的TNF超家族成员的测试化合物。这些化合物是分子量为1000Da或更小，优选750Da或更小，更优选600Da或更小的小分子实体(SME)。这些化合物稳定了与所需的TNF超家族受体结合并调节受体信号的三聚体TNF超家族成员的构象。
本发明化合物对TNF超家族成员的三聚体形式的稳定作用可以通过在有和没有化合物的情况下测量三聚体的热转变中点(Tm)来定量。Tm表示50％的生物分子展开时的温度。稳定TNF超家族成员三聚体的化合物将增加三聚体的Tm。Tm可以使用本领域已知的任何适当的技术来确定，例如使用差示扫描量热法(DSC)或荧光探针热变性分析。
该化合物可以结合在TNF超家族成员三聚体(即三聚体的核心)内的中央空间内。
这些化合物可使TNF超家族成员变成TNF超家族受体拮抗剂。因此，这些化合物能够阻断TNF超家族成员信号而不必与TNF超家族成员与其受体之间的高亲和力相互作用竞争。
或者，所述化合物可以稳定与所需的TNF超家族受体结合的三聚体TNF超家族成员的构象并增强受体的信号传导。因此，这些化合物能够增加TNF超家族成员信号而不必与TNF超家族成员与其受体之间的高亲和力相互作用竞争
在本文中化合物被描述为拮抗剂的情况下，应该理解的是，所述化合物可以同样是激动剂并增加与TNF超家族成员三聚体和这种激动剂化合物的复合物结合的TNF超家族受体的信号传导。类似地，在其它公开内容涉及拮抗性化合物，鉴定此类化合物的方法和此类化合物的用途的情况下，本公开内容可同样地指激动剂化合物。
通过本发明的方法鉴定的化合物是变构调节剂，其与TNF超家族受体的天然激动剂结合，即与TNF超家族成员的三聚体形式结合，并驱使这些三聚体采用仍然结合必需的TNF超家族受体的构象，并且通过受体调节信号传导。通过调节，可以理解该化合物可能具有拮抗作用，从而减少TNF超家族受体的信号传导，或者具有刺激作用，从而增加或增强TNF超家族受体的信号传导。
通过本发明的方法鉴定的化合物可以将天然的TNF超家族成员激动剂转化成拮抗剂。相反，常规的TNF超家族成员拮抗剂结合TNF超家族成员或TNF超家族受体并阻止TNF超家族成员与必需的受体结合。或者，当TNF超家族成员被结合时，与TNF超家族成员的信号传导水平相比，通过本发明的方法鉴定的化合物可以增加TNF超家族受体的信号传导化合物。因此，通过本发明的方法鉴定的化合物可以将天然的TNF超家族成员激动剂转化为所谓的“超激动剂”。由本发明的方法鉴定的化合物因此也可以称为配体活性的变构调节剂(AMLAs)。
通过本发明的方法鉴定的化合物在其化学式或结构方面不受限制，条件是它们与至少一个TNF超家族成员结合并稳定与所需的TNF超家族受体结合的三聚TNF超家族成员的构象并调节TNF超家族受体的信号传导。因此可以使用本文所述的测定和方法鉴定通过本发明的方法鉴定的化合物。通过本发明的方法鉴定的化合物可以包含苯并咪唑部分或其电子等排物，例如式(1)，(2)和(3)的化合物。
通过本发明的方法鉴定的化合物可以提高TNF超家族成员(以化合物-三聚体复合物的形式)与必需受体的结合亲和力，与TNF超家族成员与所需受体的结合亲和力相比的化合物
通过本发明的方法鉴定的化合物结合TNF超家族成员的三聚体形式。这样的化合物可以特异性结合一个或多个TNF超家族成员的三聚体形式。通过本发明的方法鉴定的化合物可以仅与TNF超家族成员中的一个特异性结合，而不与任何其他TNF超家族成员结合。通过本发明的方法鉴定的化合物还可以特异性结合2、3、4或甚至全部的TNF超家族成员。就特异性而言，应该理解，所述化合物结合一种或多种感兴趣的分子(在这种情况下是TNF超家族成员的三聚体形式)，与任何其他分子(其可以包括TNF超家族成员的其他分子)没有显著的交叉反应性。交叉反应性可以通过任何合适的方法评估，例如表面等离子体共振。针对三聚体形式的TNF超家族成员的化合物与该特定三聚体形式的TNF超家族成员以外的分子的交叉反应性可以被认为是显著的，如果该化合物与其他分子的结合与其结合感兴趣的三聚体形式的TNF超家族成员至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％或100％一样强的话。对TNF超家族成员的三聚体形式特异的化合物可以以小于90％，85％，80％，75％，70％，65％，60％，55％，50％，45％，40％，35％，30％，25％或20％的其结合三聚体形式的TNF超家族成员的强度结合另一种分子。优选地，所述化合物以小于20％，小于15％，小于10％或小于5％，小于2％或小于1％的其结合三聚体形式的TNF超家族成员的强度结合另一种分子。
在测试化合物存在下(即以化合物-三聚体复合物形式)，TNF超家族成员与其受体结合的KD-r值可以比在没有测试化合物的情况下TNF超家族成员的KD-r值低至少1.5倍，2倍，3倍，4倍，5倍，10倍，20倍，30倍，40倍，50倍，60倍，70倍，80倍，90倍，100倍。在优选的实施方案中，用于与TNF超家族成员结合的化合物-三聚体复合物的KD-r值可以与在不存在测试化合物的情况下与TNF超家族受体结合的TNF超家三聚体的KD-r值相比降低TNF超家族的KD-r值的至少1.5倍，优选至少3倍，更优选地至少4倍，即化合物-三聚体复合物对TNF超家族受体的结合亲和力可以与不存在测试化合物时TNF超家族三聚体与TNF超家族受体的结合亲和力相比增加至少1.5倍，优选至少三倍，更优选至少四倍。
与单独结合TNF超家族受体的TNF超家族三聚体的KD-r值相比，化合物-三聚体复合物结合TNF超家族受体的KD-r值的降低可能是由于与单独的TNF超家族三聚体相比与TNF超家族受体结合的化合物-三聚体复合物的缔合速率(kon-r)增加，和/或与单独的TNF超家族三聚体相比解离速率(koff-r)降低。在优选的实施方案中，与TNF超家族受体结合的化合物-三聚体复合物的缔合速率(kon-r)比单独的TNF超家族三聚体增加。在另一个实施方案中，与TNF超家族受体结合的化合物-三聚体复合物的解离速率(koff-r)比单独的TNF超家族三聚体降低。在另一个实施方案中，与单独的TNF超家族三聚体相比，与TNF超家族受体结合的化合物-三聚体复合物的缔合速率(kon-r)增加，并且与TNF超家族受体结合的化合物-三聚体复合物的解离速率(koff-r)降低。与在不存在所述化合物的情况下与其受体结合的TNF超家族三聚体结合的kon-r值相比，化合物-三聚体复合物对必需的TNF超家族受体的kon-r值可以增加至少1.5倍或至少2倍，优选地至少3倍，和/或与在不存在所述化合物的情况下与其受体结合的TNF超家族三聚体结合的koff-r值相比，化合物-三聚体复合体对必需的TNF超家族受体的koff-r值可以降低至少1.2倍，至少1.6倍，至少2倍，更合适地至少2.4倍。
在一个实施方案中，与TNF超家族三聚体结合的化合物的缔合速率(kon-c)比结合TNF超家族受体的化合物-三聚体复合物的缔合速率(kon-r)更快。在另一个实施方案中，结合TNF超家族受体的化合物-三聚体复合物的解离速率(koff-r)也快于与TNF超家族三聚体结合的化合物的解离速率(koff-c)。在另一个实施方案中，与TNF超家族三聚体结合的化合物的缔合速率(kon-c)比结合于TNF超家族受体的化合物三聚体复合物的缔合速率(kon-r)更快，化合物三聚体与TNF超家族三聚体的复合物缔合速率(koff-r)快于TNF超家族三聚体与化合物结合的解离速率(koff-c)。在优选的实施方案中，化合物结合TNF超家族三聚体的KD-c值低于与TNF超家族受体结合的化合物-三聚体复合物的KD-r值，即化合物对三聚体的亲和力高于化合物-三聚体复合体对受体的亲和力。
化合物-三聚体复合物和TNF超家族三聚体与必需的TNF超家族受体的kon-r，koff-r和KD-r值可使用任何合适的技术来确定，例如表面等离子体共振，质谱和等温量热法，如本文实施例描述的。TNF超家族成员在测试化合物存在下与其受体结合的KD-r值可以是1μM，100nM，10nM，5nM，1nM，100pM，10pM或更低。在优选的实施方案中，在测试化合物存在下(即在化合物-三聚体复合物中)，TNF超家族成员与其受体结合的KD-r值是1nM或更小。在更优选的实施方案中，用于结合所需TNF超家族受体的化合物-三聚体复合物的KD-r值小于600pM，更优选小于500pM，小于400pM，小于300pM，小于200pM，小于100pM或小于50pM。在最优选的实施方案中，用于结合必需的TNF超家族受体的化合物-三聚体复合物的KD-r值小于200pM。
本发明的方法鉴定的化合物可通过测定来鉴定，所述测定包括测定TNF超家族成员和化合物样品中TNF超家族成员的三聚体形式的KD-r；比较样品中TNF超家族成员的三聚体形式的KD-r与对照样品；并选择一个本发明的化合物。
当化合物-三聚体复合物形式的TNF超家族成员与受体结合时，通过本发明方法鉴定的化合物可以完全或部分地抑制通过TNF受体的信号传导。该化合物可以起到减少至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％的通过TNF超家族受体的信号传导的作用。或者，当化合物-三聚体复合物形式的TNF超家族成员与受体结合时，通过本发明方法鉴定的化合物可增加通过TNF受体的信号传导。该化合物可以起到通过TNF超家族受体的信号增加至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％或200％的作用。可通过任何适当的技术来测量信号水平的任何改变，包括通过碱性磷酸酶或萤光素酶测量报告基因活性，使用机器如Cellomics Arrayscan的NF-κB易位，下游效应物的磷酸化，信号分子的募集或细胞死亡。
当以化合物-三聚体复合物形式的TNF超家族成员结合受体时，通过本发明的方法鉴定的化合物可以调节通过TNF受体的信号传导的下游作用中的至少一种。这些效应在本文中讨论并且包括TNF超家族诱导的IL-8，IL17A/F，IL2和VCAM产生，TNF超家族诱导的NF-κB活化和嗜中性粒细胞募集。本领域已知用于测量TNF超家族成员的下游效应的标准技术。通过本发明的方法鉴定的化合物可以调节通过TNF受体的信号转导的至少1、2、3、4、5、10或全部下游效应。
可以使用标准术语例如IC50或半数有效浓度(EC50)值来量化通过本发明的方法鉴定的化合物的活性。IC50值代表50％抑制特定生物或生物化学功能所需的化合物的浓度。EC50值表示其最大效应的50％所需的化合物的浓度。通过本发明的方法鉴定的化合物可具有500nM，400nM，300nM，200nM，100nM，90nM，80nM，70nM，60nM，50nM，40nM，30nM，20nM，10nM，5nM，1nM，100pM或更低的IC50或EC50值。可以使用任何适当的技术测量IC50和EC 50值，例如可以使用ELISA定量细胞因子的产生。然后可以使用也被称为S形剂量响应模型的标准4-参数逻辑模型生成IC50和EC 50值。
肿瘤坏死因子超家族及其受体
目前已知有22种TNF超家族成员：TNFα(TNFSF1A)，TNFβ(TNFSF1B)，CD40L(TNFSF5)，BAFF(TNFSF13B/BlyS)，APRIL(TNFSF13)，OX40L(TNFSF4)，RANKL(TNFSF11/TRANCE)，TWEAK(TNFSF12)，TRAIL(TNFSF10)，TL1A(TNFSF15)，LIGHT(TNFSF14)，淋巴毒素，淋巴毒素β(TNFSF3)，4-1BBL(TNFSF9)，CD27L(TNFSF7)，CD30L(TNFSF8)，EDA(Ectodysplasin)A1(Ectodysplasin A1)，EDA-A2(Ectodysplasin A2)，FASL(TNFSF6)，NGF和GITRL(TNFSF18)。
在一个优选的实施方案中，TNF超家族成员是TNFα。TNFα以可溶性(TNFαs)和膜结合形式(TNFαm)存在。当本文提到TNFα时，这包括TNFαs和TNFαm两种形式。在一个特别优选的实施方案中，TNFα是TNFαs形式。
本发明的测定可用于鉴定任何TNF超家族成员中的至少一个的调节剂，包括22种已知的TNF超家族成员。具体而言，本发明的测定法可用于鉴定与任何TNF超家族成员结合的化合物，特别是与TNF超家族成员的三聚体形式结合的化合物，并使这些三聚体稳定在能够结合所需TNF受体的构象中，其通过所述受体调节信号传导。在一个优选的实施方案中，本发明的测定法用于鉴定TNFα或CD40L，更优选TNFα，甚至更优选TNFαs的调节剂。
通过本发明的方法鉴定的化合物可以是任何TNF超家族成员中的至少一个的调节剂，包括22种已知的TNF超家族成员。在一个优选的实施方案中，TNF超家族成员是TNFα或CD40L，更优选TNFα，甚至更优选TNFαs。
本发明的化合物-三聚体复合物可以包括任何TNF超家族成员的三聚体形式，包括22种已知的TNF超家族成员。在一个优选的实施方案中，TNF超家族成员是TNFα或CD40L。更优选TNF超家族成员是TNFα，甚至更优选TNFαs。
TNF超家族的成员结合并启动通过TNF受体的信号传导。目前已知有34种TNF受体：4-1BB(TNFRSF9/CD137)，NGFR(TNFRSF16)，BAFFR(TNFRSF13C)，骨保护素(TNFRSF11B)，BCMA(TNFRSF17)，OX40(TNFRSF4)，CD27(TNFRSF7)(TNFRSF11)，CD30(TNFRSF8)，RELT(TNFRSF19L)，CD40(TNFRSF5)，TACI(TNFRSF13B)，DcR3(TNFRSF6B)，TNFRH3(TNFRSF26)，DcTRAILR1(TNFRSF23)，TNF-(TNFRSF1A)，TNF-R2(TNFRSF1B)，DR3(TNFRSF25)，TRAILR1(TNFRSF10A)，DR6(TNFRSF21)，TRAILR2(TNFRSF10B)，EDAR，TRAILR3(TNFRSF10C)TNFRSF10D)，GITR(TNFRSF18)，TROY(TNFRSF19)，HVEM(TNFRSF14)，TWEAK R(TNFRSF12A)，TRAMP(TNFRSF25)，淋巴毒素βR(TNFRSF3)和XEDAR。
在一个优选的实施方案中，TNF受体是TNF-R1或TNF-R2。当在此涉及TNF-R时，这包括TNF-R1和TNF-R2，包括TNF-R1和TNF-R2的细胞外结构域(ECD)。本发明的测定可用于鉴定调节信号传导的化合物的TNF超家族成员通过任何必需的TNF超家族受体。在一个优选的实施方案中，本发明的测定可用于鉴定通过TNF-R1，TNF-R2或CD40调节TNF超家族成员的信号转导的化合物。在更优选的实施方案中，TNF超家族成员是TNFα，TNF受体是TNF-R1或TNF-R2。在甚至更优选的实施方案中，TNF超家族成员是TNFα，TNF受体是TNF-R1。在甚至更优选的实施方案中，TNF超家族成员是TNFα，TNF受体是TNF-R1。本发明的测定可用于鉴定通过TNF-R1特异性调节TNF超家族成员的信号发挥作用的化合物。具体而言，这些化合物可以通过TNF-R1调节TNF超家族成员的信号传导而起作用，但对通过TNF-R2的TNF超家族成员的信号传导没有影响。在甚至更优选的实施方案中，TNF超家族成员是TNFαs，TNF受体是TNF-R1。
本发明的化合物-三聚体复合物可以通过至少一种TNF受体(包括已知的34种TNF受体)调节TNF超家族成员的信号传导。在一个优选的实施方案中，TNF受体是TNF-R1，TNF-R2或CD40L。
在更优选的实施方案中，TNF超家族成员是TNFα，TNF受体是TNF-R1或TNF-R2。在甚至更优选的实施方案中，TNF超家族成员是TNFα，TNF受体是TNF-R1。在甚至更优选的实施方案中，TNF超家族成员是TNFαs，TNF受体是TNF-R1。
治疗适应症
TNFα是TNF超家族的原型成员。TNFα是介导免疫调节和炎症反应的多效细胞因子。在体内，已知TNFα参与对细菌、寄生虫和病毒感染的应答。具体而言，已知TNFα在类风湿性关节炎(RA)，炎症性肠病(包括克罗恩氏病)，牛皮癣，阿尔茨海默病(AD)，帕金森病(PD)，疼痛，癫痫，骨质疏松症，哮喘，脓毒症，发热，系统性红斑狼疮(SLE)和多发性硬化症(MS)和癌症中起作用。也已知TNFα在肌萎缩侧索硬化(ALS)，缺血性中风，免疫复合物介导的肾小球肾炎，狼疮性肾炎(LN)，抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA-)相关肾小球肾炎，微小病变，糖尿病性肾病(DN)，急性肾损伤(AKI)，梗阻性尿路病，肾同种异体移植排斥，顺铂诱导的AKI和梗阻性尿路疾病。
已知TNF超家族的其他成员涉及自身免疫性疾病和免疫缺陷。特别是已知TNF超家族成员参与RA，SLE，癌症，MS，哮喘，鼻炎，骨质疏松症和多发性骨髓瘤(MM)。已知TL1A在器官移植排斥中发挥作用。
通过本发明的方法鉴定的化合物或本发明的复合物可用于治疗，预防或改善可由常规TNF超家族成员调节剂治疗，预防或改善的任何疾病。通过本发明的方法鉴定的化合物或本发明的复合物可以单独使用或与常规的TNF超家族成员调节剂组合使用。原则上，根据本发明可以治疗、预防或改善部分或全部由TNF超家族成员通过TNF受体的致病性信号传导或通过TNF超家族成员通过TNF受体的信号传导缺陷导致的任何病症。TNF超家族成员通过TNF受体的致病信号传导包括超过正常生理水平的信号传导的通过TNF受体的信号传导增加，正常启动的通过TNF受体的信号传导但不响应正常的生理信号而停止，和处于正常生理范围内但是由非生理手段启动的通过TNF受体的信号传导。本发明涉及治疗，预防或改善由TNFα介导或CD40L影响的病症。
由本发明的方法鉴定的与TNFα相互作用的化合物因此有益于治疗和/或预防各种人类疾病。这些包括自身免疫和炎性疾病；神经和神经退行性疾病；疼痛和伤害性疾病；和心血管疾病。
炎性和自身免疫性疾病包括全身性自身免疫性疾病，自身免疫性内分泌疾病和器官特异性自身免疫性疾病。系统性自身免疫病症包括系统性红斑狼疮(SLE)，牛皮癣，血管炎，多肌炎，硬皮病，多发性硬化症，强直性脊柱炎，类风湿性关节炎和舍格伦综合征。自身免疫性内分泌疾病包括甲状腺炎。器官特异性自身免疫性疾病包括艾迪生病，溶血性或恶性贫血，肾小球性肾炎(包括古德帕斯彻氏综合征)，格雷夫斯病，特发性血小板减少性紫癜，胰岛素依赖性糖尿病，青少年糖尿病，葡萄膜炎，炎性肠病(包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)，天疱疮，特应性皮炎，自身免疫性肝炎，原发性胆汁性肝硬化，自身免疫性肺炎，自身免疫性心脏炎，重症肌无力，自发性不育，骨质疏松症，哮喘和肌营养不良(包括杜氏肌营养不良)。
神经和神经退行性疾病包括阿尔茨海默病，帕金森病，亨廷顿舞蹈病，中风，肌萎缩性侧索硬化，脊髓损伤，头部创伤，癫痫发作和癫痫。
心血管疾病包括血栓形成，心脏肥大，高血压，心脏不规则收缩(例如在心力衰竭期间)和性功能障碍(包括勃起功能障碍和女性性功能障碍)。
特别地，通过本发明的方法鉴定的化合物或本发明的复合物可用于治疗或预防炎性病症，CNS病症，免疫病症和自身免疫病，疼痛，骨质疏松症，发热和器官移植排斥。在一个优选的实施方案中，通过本发明的方法鉴定的化合物或本发明的复合物可以用于治疗或预防类风湿性关节炎，炎性肠病(包括克罗恩氏病)，牛皮癣，阿尔茨海默病，帕金森病，癫痫，哮喘，败血症，系统性红斑狼疮，多发性硬化症，哮喘，鼻炎，癌症和骨质疏松症。在另一个优选的实施方案中，通过本发明的方法鉴定的化合物或本发明的复合物可用于治疗或预防类风湿性关节炎(RA)，非特异性炎性关节炎，糜烂性骨疾病，软骨炎，软骨退化和/或破坏，幼年炎性关节炎，斯蒂尔病(幼年和/或成人发作)，幼年特发性关节炎，少年特发性关节炎(少关节和多关节形式)，炎症性肠病(包括克罗恩病，溃疡性结肠炎，不确定结肠炎，囊袋炎)，牛皮癣，银屑病性关节炎，强直性脊柱炎，舍格伦氏病，阿尔茨海默氏病(AD)，白塞病，帕金森病(PD)，肌萎缩侧索硬化症(ALS)，缺血性中风，疼痛，癫痫，骨质疏松症，骨质缺乏，慢性病贫血，恶病质，糖尿病，血脂异常，代谢综合征，哮喘，慢性阻塞呼吸道(或肺)疾病，败血症，发热，呼吸窘迫综合征，系统性红斑狼疮(SLE)，多发性硬化(MS)免疫复合物介导的肾小球性肾炎，狼疮性肾炎(LN)，抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA-)相关肾小球肾炎，微小病变，糖尿病性肾病(DN)，急性肾损伤(AKI)，梗阻性尿路病，肾同种异体移植排斥，顺铂诱导的AKI和梗阻性尿路疾病，眼病(包括糖尿病性视网膜病，糖尿病性黄斑水肿，早产儿视网膜病，年龄相关性黄斑变性，黄斑水肿，增生性和/或非增殖性视网膜病，角膜血管化包括新血管形成，视网膜静脉阻塞，各种形式的葡萄膜炎和角膜炎)，甲状腺炎，纤维化疾病包括各种形式的肝纤维化，各种形式的肺纤维化，系统性硬化症，硬皮病，癌症和癌症相关的并发症(包括骨骼并发症，恶病质和贫血)。
药物组合物，剂量和剂量方案
通过本发明的方法鉴定的化合物和本发明的化合物-三聚体复合物通常将与药学上可接受的载体一起配制成药物组合物。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂，分散介质，包衣，抗细菌剂和抗真菌剂，等渗剂和吸收延迟剂等。该载体可适用于肠胃外，例如，静脉内，肌肉内，皮内，眼内，腹膜内，皮下，脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。或者，载体可适用于非肠胃外给药，例如局部给药，表皮给药或粘膜给药途径。在一个优选的实施方案中，载体适合于口服给药。取决于施用途径，可以将调节剂涂覆在材料中以保护化合物免受可使化合物失活的酸和其它自然条件的作用。
本发明的药物组合物可以包含一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所需生物学活性并且不赋予任何不希望的毒理学作用的盐。这种盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。
优选的药学上可接受的载体包含水性载体或稀释剂可以在本发明的药物组合物中使用的合适的含水载体的例子包括水，缓冲水和盐水。其它载体的实例包括乙醇，多元醇(如甘油，丙二醇，聚乙二醇等)及其合适的混合物，植物油如橄榄油和可注射的有机酯如油酸乙酯。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖，多元醇如甘露醇，山梨糖醇或氯化钠。
治疗组合物通常在制造和储存条件下必须是无菌的和稳定的。该组合物可以配制成适合于高药物浓度的溶液，微乳剂，脂质体或其它有序结构。
本发明的药物组合物可以包含另外的活性成分。
同样在本发明的范围内的是包含通过本发明的方法鉴定的化合物和本发明的复合物以及使用说明的试剂盒。试剂盒可以进一步含有一种或多种另外的试剂，如上面讨论的另外的治疗剂或预防剂。
通过本发明的方法鉴定的化合物和本发明的化合物-三聚体复合物或其制剂或组合物可以用于预防性和/或治疗性治疗。
在治疗应用中，化合物和化合物-三聚体复合物以足以治愈，缓解或部分阻止病症或其一种或多种症状的量施用于已经患有如上所述的病症或病症的受试者。这种治疗可能导致疾病症状的严重程度降低，或无症状期的频率或持续时间增加。足以实现这一点的量被定义为“治疗有效量”。
在预防性应用中，将制剂以足以预防或减轻病症或其一种或多种症状的后续影响的量施用于处于如上所述的病症或病症风险的受试者。足以实现这一点的量被定义为“预防有效量”。每个目的的有效量将取决于疾病或受伤的严重程度以及受试者的体重和一般状态。
施用对象可以是人类或非人类的动物。术语“非人动物”包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物，绵羊，狗，猫，马，牛，鸡，两栖动物，爬行动物等。。
通过本发明的方法鉴定的化合物或本发明的化合物-三聚体复合物可以通过一种或多种施用途径使用本领域已知的多种方法中的一种或多种来施用。如本领域技术人员将理解的，施用的途径和/或模式将取决于期望的结果而变化。本发明的化合物或化合物-三聚体复合物的给药途径的实例包括静脉内，肌肉内，皮内，眼内，腹膜内，皮下，脊髓或其他肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。本文使用的短语“肠胃外施用”是指除肠内和局部施用之外的施用模式，通常通过注射。或者，通过本发明的方法鉴定的化合物或本发明的本发明的化合物-三聚体复合物可以通过非肠胃外途径施用，例如局部，表皮或粘膜施用途径。在一个优选的实施方案中，通过本发明的方法鉴定的化合物或本发明的化合物-三聚体复合物用于口服给药。
由本发明的方法鉴定的化合物或本发明的化合物-三聚体复合物的合适剂量可由熟练的医师确定。本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以获得有效实现对于特定患者，组合物和给药模式的所需治疗反应的活性成分的量，而无需对病人有毒。所选择的剂量水平将取决于各种药物代谢动力学因素，包括所用本发明特定组合物的活性，给药途径，给药时间，所用具体化合物的排泄速率，治疗，与所用特定组合物联合使用的其他药物，化合物和/或材料，所治疗患者的年龄，性别，体重，状况，一般健康状况和既往病史，以及医学领域众所周知的类似因素。
合适的剂量可以是例如约0.01μg/kg至约1000mg/kg体重，典型地约0.1μg/kg至约100mg/kg体重的待治疗患者的范围。例如，合适的剂量可以是每天约1μg/kg至约10mg/kg体重或每天约10μg/kg至约5mg/kg体重。
可以调整剂量方案以提供最佳的期望响应(例如治疗响应)。例如，可以施用单一剂量，可以随着时间的推移施用几个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急情况的指示按比例减少或增加剂量。本文使用的剂量单位形式是指适合作为待治疗对象的单位剂量的物理上分立的单位；每个单位含有预定量的活性化合物，其经计算与所需的药物载体结合产生所需的治疗效果。
可以单剂量或多剂量给药。多个剂量可以通过相同或不同的途径和相同或不同的位置施用。或者，剂量可以通过缓释制剂，在这种情况下，需要较少的频率给药。剂量和频率可以根据拮抗剂在患者中的半衰期和期望的治疗持续时间而变化。
如上所述，通过本发明的方法鉴定的化合物或本发明的化合物-三聚体复合物可以与一种或多种其它治疗剂共同施用。例如，其他药剂可以是镇痛剂，麻醉剂，免疫抑制剂或抗炎剂。
两种或更多种药剂的联合给药可以以许多不同的方式实现。两者可以一起施用于单一组合物中，或者可以作为组合疗法的一部分以分开的组合物施用。例如，可以在另一个之前，之后或同时给药。
以下实施例说明了本发明。
实施例
实施例1-式(1)，(2)和(3)的化合物的合成
中间体1：1-(2，5-二甲基苄基)-1H-苯并咪唑
在0℃下，将碳酸铯(22.0g，100.0mmol)和碘化正丁基铵(12.5g，34.0mmol)加入到苯并咪唑(4.0g，34.0mmol)的DMF(60ml)溶液中。将反应混合物在0℃下搅拌10分钟，然后加入2，5-二甲基苄基溴(6.7g，34.0mmol)。使反应混合物温热至室温并搅拌3小时。用冰水(50ml)淬灭混合物并用乙酸乙酯(3×40ml)萃取。有机层用无水硫酸钠干燥，真空除去溶剂，得到标题化合物(8.0g，75％)，为灰白色固体。δH(d6-DMSO)8.23(s,1H),7.68-7.66(m,1H),7.43-7.41(m,1H),7.21-7.19(m,2H),7.10(d,J 7.6Hz,1H),7.01(d,J 7.6Hz,1H),6.67(s,1H),5.45(s,2H),2.25(s,3H),2.14(s,3H).LCMS(ES+)237(M+H)+。
中间体2：5-溴-2-硝基苯胺
将2-氟-4-溴-1-硝基苯(0.5g，2.2mmol)加入甲醇氨(10ml)中并在室温下搅拌。持续18小时。然后将反应混合物真空浓缩并将残余物用异己烷研磨，得到黄色固体的标题化合物(0.48g，97％)。δH(d6-DMSO)7.88(d,J 8.8Hz,1H),7.53(br s,2H),7.25(d,J 3.0Hz,1H),6.75(dd,J 9.2,2.0Hz,1H)。
中间体3：5-溴-N-(2，5-二甲基苄基)-2-硝基苯胺
在0℃下，将氢化钠(60％的油分散液，0.82g，20.7mmol)加入搅拌的中间体2(5.0g，23.0mmol)的DMF(50ml)溶液中。加入2，5-二甲基苄基溴(4.56g，23.0mmol)，将反应混合物温热至室温并搅拌5小时。反应混合物用饱和氯化铵水溶液淬灭，用乙酸乙酯(3×50ml)萃取，用水(2×30ml)洗涤，用无水硫酸钠干燥并真空浓缩。通过柱色谱法(SiO 2，5％EtOAc/异己烷)纯化残余物，产生呈黄色固体的标题化合物(4.89g，63％)。δH(d6-DMSO)8.42(br s,1H),8.01(d,J8.8Hz,1H),7.12-6.86(m,4H),6.85(d,J 7.2,1.6Hz,1H),4.54(d,J5.6Hz,2H),2.28(s,3H),2.21(s,3H)。
中间体4：5-溴-N1-(2，5-二甲基苄基)苯-1，2-二胺
将SnCl 2(20.2g，89.4mmol)加入到搅拌的中间体3(10.0g，29.8mmol)的EtOH(200ml)溶液中，并将反应混合物加热至80℃5小时。然后将反应混合物真空浓缩并将残余物用饱和碳酸氢钠水溶液中和并用DCM(3×100ml)萃取。将合并的有机物用水(2×50ml)洗涤，萃取，用无水硫酸钠干燥并真空浓缩。通过柱色谱法(SiO 2，5％MeOH/DCM)纯化残余物，产生呈深棕色油状的标题化合物(5.4g，69％)。δH(d6-DMSO)7.08(s,1H),7.06(d,J 7.6Hz,2H),6.97(d,J 7.6Hz,1H),6.53(dd,J 8.4,2.0Hz,1H),6.47(d,J 8.0Hz,1H),6.45(d,J2.0Hz,1H),5.06(t,J 5.4Hz,1H),4.77(br s,2H),4.15(d,J 5.2Hz,1H),2.27(s,3H),2.22(s,3H).LCMS(ES+)305(M+H)+。
中间体5：6-溴-1-(2，5-二甲基苄基)-1H-苯并咪唑
中间体4(0.40g，1.31mmol)和甲酸(10ml)的混合物在室温下搅拌。持续18小时。将反应混合物真空浓缩，残余物在乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠水溶液之间分配。有机层用无水硫酸钠干燥并真空浓缩。通过柱色谱法(SiO 2，20-75％EtOAc/异己烷)纯化粗残余物，得到呈白色固体的标题化合物(0.20g，48％)。δH(d6-DMSO)8.24(s,1H),7.74(d,J 1.7Hz,1H),7.64(d,J 8.6Hz,1H),7.34(dd,J 8.6,1.9Hz,1H),7.12(d,J 7.7Hz,1H),7.02(d,J 7.8Hz,1H),6.61(s,1H),5.47(s,2H),2.24(s,3H),2.15(s,3H).LCMS(ES+)316(M+H)+。
中间体6：[6-溴-1-(2，5-二甲基苄基)-1H-苯并咪唑-2-基](吡啶-4-基)甲醇
向冷却至0℃的THF(10ml)中的二异丙胺(2.8ml)溶液中加入n-BuLi(12.5ml，己烷中1.6M)，所得混合物在0℃下搅拌10分钟。将新鲜制备的LDA的等分部分(1.8ml，1.62mmol)在-78℃加入到中间体5(0.25g，0.81mmol)的THF(5ml)溶液中。将反应混合物在-78℃下搅拌2小时，然后加入吡啶-4-甲醛(0.15ml，1.62mmol)，将反应混合物在-78℃下搅拌10分钟。用饱和氯化钠水溶液淬灭混合物并升温至室温。用乙酸乙酯(3×40毫升)萃取混合物。有机层用无水硫酸钠干燥并真空浓缩。通过柱色谱法(SiO 2，0-10％MeOH/DCM)纯化残余物，得到呈白色固体的标题化合物(0.18g，51％)。LCMS(ES+)423(M+H)+。
中间体7：5-(3-氟-4-硝基苯基)-2-甲氧基吡啶
将6-甲氧基吡啶-3-基硼酸(40.0g，262mmol)，4-溴-2-氟-1-硝基苯(52.3g，238mmol)和Na 2CO 3(76g，713mmol)二甲氧基乙烷(1200mL)和水(300mL)中。用氩气吹扫反应混合物。加入Pd(PPh 3)2Cl 2(8.34g，11.89mmol)，将混合物加热至90℃保持1.5小时。加入EtOAc和水。将有机相分离并将水相用EtOAc萃取两次。将合并的有机层用Na 2SO 4干燥，然后真空除去溶剂。将残余物从甲苯中重结晶，得到标题化合物(42.00g，169.2mmol，71％)。MS[ESI+]m/z:249[M+H]+。
中间体8：N-[2-(二氟甲氧基)苄基]-5-(6-甲氧基吡啶-3-基)-2-硝基苯胺
将2-(二氟甲氧基)苄胺(2.093g，12.09mmol)溶于NMP(20mL)中。加入中间体7(2g，8.06mmol)和K 2CO 3(1.336g，9.67mmol)。该混合物在微波照射下在150℃下加热30分钟。加入EtOAc和水。将有机相分离并将水相用EtOAc萃取两次。将合并的有机层用水洗涤三次并用盐水洗涤两次。用Na 2SO 4干燥后，真空除去溶剂。将残余物从庚烷/EtOAc(100/25mL)中重结晶，得到标题化合物(2.513g，6.26mmol，78％)。MS[ESI+]m/z:402[M+H]+。
中间体9：N1-[2-(二氟甲氧基)苄基]-5-(6-甲氧基吡啶-3-基)苯-1，2-二胺
将钯碳(1.10g，10wt％)加入到中间体8(2.512g，6.26mmol)的EtOAc(150mL)溶液中，用氩气冲洗。用H 2气氛代替气氛，并将反应混合物在1巴H 2下搅拌1小时。混合物通过一层硅藻土过滤。将滤液真空浓缩。使用快速柱色谱法用7-60％EtOAc的庚烷溶液进行纯化，得到标题化合物(2.07g，5.57mmol，89％)。MS[ESI+]m/z:358[M+H]+。
中间体10：5-{4-氨基-3-[2-(二氟甲氧基)苄基氨基]苯基}吡啶-2(1H)-酮
向中间体9(6.84g，18.42mmol)中加入吡啶盐酸盐(10.64g，92mmol)。将反应混合物在敞口容器中加热至165℃3分钟。加入水并将混合物超声处理。滤出沉淀，然后在沸腾的乙腈中研磨。过滤沉淀，得到标题化合物(3.822g，9.95mmol，54％)。MS[ESI+]m/z：358[M+H]+。
化合物(1)：[1-(2，5-二甲基苄基)-1H-苯并咪唑-2-基](吡啶-4-基)甲醇
在-78℃向中间体1(0.25g，1.06mmol)的THF(10ml)溶液中缓慢滴加1.6M正丁基锂(0.79ml，1.27mmol)，搅拌反应混合物20分钟。缓慢滴加异烟碱醛(0.17g，1.59mmol)的THF(1ml)溶液。再过10分钟后，将反应混合物用水(1ml)淬灭并升温至室温。将反应混合物倒入乙酸乙酯/水中。将有机层分离，干燥(MgSO 4)并真空浓缩。通过柱色谱(SiO 2，0-30％MeOH/DCM)纯化残余物，得到灰白色固体的标题化合物(0.2g，55％)。δH(CDCl3)8.31(d,J5.9Hz,2H),7.69(d,J 8.0Hz,1H),7.28-7.16(m,4H),7.00-6.95(m,2H),6.87-6.85(m,1H),6.16(s,2H),5.84(s,1H),5.35-5.09(dd,JAB 17.0Hz,2H),2.25(s,3H),1.89(s,3H).LCMS(ES+)344(M+H)+。
化合物(2)：[1-(2，5-二甲基苄基)-6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1H-苯并咪唑-2-基](吡啶-4-基)甲醇
将1-甲基-4-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(0.15g，0.71mmol)和2M碳酸钠2毫升)添加到中间体6(0.15克，0.36毫摩尔)在1，4-二氧六环：水(4:1，5毫升)中的溶液中并将反应物脱气10分钟。加入PdCl 2(dppf)(0.01g，0.05mmol)，将反应混合物脱气10分钟，然后在Biotage微波反应器中加热至100℃达60分钟。加入乙酸乙酯，反应混合物通过硅藻土垫过滤。将有机层分离，用无水硫酸钠干燥，真空浓缩。残留物经制备型HPLC纯化，得到标题化合物，为白色固体。δH(d6-DMSO)8.39(dd,J4.5,1.6Hz,2H),8.03(s,1H),7.76(s,1H),7.64(d,J 8.8Hz,1H),7.44-7.41(m,2H),7.28(d,J 5.6Hz,2H),7.06(d,J 7.7Hz,1H),6.87(d,J 6.8Hz,1H),6.70(d,J 5.5Hz,1H),6.01(d,J 5.5Hz,1H),5.83(s,1H),5.63-5.43(m,2H),3.82(s,3H),2.33(s,3H),1.92(s,3H).LCMS(ES+)424(M+H)+。
化合物(3)：5-(1-[2-(二氟甲氧基)苄基]-2-{[3-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯氧基]甲基}-1H-苯并咪唑-6-基)吡啶-2(1H)-酮
将2-[3-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯氧基]乙酸(2当量)加入到HATU(2当量)的DMF(2mL)溶液中。将该混合物搅拌30分钟。加入中间体9(1当量)在DMF(2mL)中的溶液，并将混合物在室温下搅拌24小时。然后升温至50℃，继续搅拌24小时。蒸发溶剂并将残余物溶于乙酸(4mL)中并加热至80℃5小时。通过蒸发除去乙酸。将残余物在50℃下在水/氯仿(1：1，6mL)之间分配。使用分相器分离各层。用氯仿(4mL)洗涤水层，并将有机层蒸发至干燥。将残余物吸收在DMSO(1mL)中并通过制备型LCMS纯化，得到标题化合物。
实施例2-式(4)的缀合物的合成
中间体10：1-(2，5-二甲基苄基)-6-[4-(哌嗪-1-基甲基)-苯基]-2-(吡啶-4-基甲基)-1H-苯并咪唑
通过对应于制备中间体7，8和9的一系列步骤合成，随后使用合适的硼酸，合适的胺和合适的羧酸制备化合物(3)。
共轭物(4)
将中间体10(27.02mg，0.0538mmol)溶于DMSO(2mL)中。5(-6)将羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(24.16mg，0.0510mmol)(Invitrogen目录号：C1311)溶于DMSO(1mL)中，得到亮黄色溶液。两种溶液在室温下混合，混合物变成红色。混合物在室温下搅拌。在混合之后不久，将20μL等分样品移出并在AcOH:H2O的80:20混合物中稀释，以在1200RR-6140LC-MS系统上进行LC-MS分析。色谱图显示保留时间为1.42和1.50分钟的两个密切洗脱峰，质量(M+H)+＝860.8amu，对应于用5-和6-取代的羧基荧光素基团形成的两种产物。保留时间2.21分钟处的另一峰具有对应于中间体10的(M+H)+＝502.8amu的质量。未反应的5(-6)羧基荧光素琥珀酰亚胺酯没有观察到峰。三个信号的峰面积分别为22.0％，39.6％和31.4％，表明在该时间点期望的产物的两种异构体转化率为61.6％。进一步将20μL等分试样在数小时后提取，然后搅拌过夜后，如前稀释并进行LC-MS分析。在这些时间点，转换百分比分别为79.8％和88.6％。混合物在UV指导的制备型HPLC系统上纯化。将合并的纯化级分冷冻干燥以除去过量的溶剂。冷冻干燥后，回收橙色固体(23.3mg)，相当于0.027mmol产物，对于反应和制备性HPLC纯化，总产率为53％。
实施例3-筛选与TNFα结合的化合物
式(1)和(2)的化合物已经使用以下测定来筛选。
将384孔未包被平板(标准结合)用TNFR胞外域(TNFR-ECD)(10μl，在PBS中1ug/mL)包被过夜的Meso Scale Discovery平板(MSD)。为了确保均匀的分布板以1000rpm离心2分钟。然后将平板密封并在+4℃下储存过夜。
然后在含有0.05％Tween 20(洗涤缓冲液)的50μl磷酸盐缓冲盐水(pH6.5)(PB)中洗板3次，然后用50μl2％BSA封闭。然后将板在室温下在振荡器(600rpm)上孵育2小时。孵育后，将板洗涤(每孔3×50μl洗涤缓冲液)。
在封闭温育期间，将式(1)和(2)的化合物与TNF(R&D Systems)预温育，然后加入到预封闭和洗涤的MSD板中。对于如图3A所示的单点测定法，化合物以100μM的最终浓度(5％最终v/v DMSO)测定。
为了测定EC 50值(图3B和3C)，将式(1)和(2)的化合物在DMSO中双倍或三倍稀释，使得当加入到测定中时，测试化合物的最高浓度为50或100μM 5％最终v/v DMSO)。以1：1至4ng/mL TNF(最终浓度2ng/ml)的比例加入式(1)和(2)的预稀释化合物，然后在室温下在600rpm摇床上温育1小时。
将10μl式(1)或(2)的化合物与TNFα的预温育的混合物加入制备的MSD板中并在室温下在振荡器上温育1小时。
然后用洗涤缓冲液(每孔3×50μl)洗涤平板。然后将磺基标记的抗-TNF多克隆抗体加入到每个孔中，并将平板在室温下在摇床上再温育1.5小时。
然后洗涤平板(每孔3×50μl洗涤缓冲液)，接着加入50μlMSDRead缓冲液T加表面活性剂(在H 2O中稀释1倍)，并在SECTORImager 6000上读数。
对于单点测定，使用没有化合物的对照样品计算百分比抑制。
对于EC 50，使用4参数逻辑模型(S形剂量响应模型)通过标准方法计算测定结果。
从图3A可以看出，代表本领域已知的TNFα拮抗剂的标记为“SPD-304”的化合物具有+80％的抑制％值，表明该化合物抑制TNFα与其受体的结合。相反，所测试的几种化合物具有负的％抑制值，表明这些化合物增强了TNFα与TNF受体的结合。
类似地，式(1)(图3B)和式(2)(图3C)化合物的剂量响应产生阴性抑制曲线。换句话说，TNFα与固定的ECD-TNFR的结合似乎随着化合物浓度的增加而增强。由于这个原因，必须计算EC50(化合物的浓度达到总效应的50％)，而不是IC50。在这种情况下，式(1)化合物的EC50为4.6μM，式(2)化合物的EC50为3.7μM。
使用表面等离子体共振的BIA(生物分子相互作用分析)也可用于测量化合物诱导的TNFα与TNF受体的结合增强。为此，使用Biacore A100/4000。在所谓的溶液内竞争/增强测定中，将TNF受体的细胞外结构域(ECD-TNFR)在pH5下固定在1KRU的水平上到HBS-P缓冲液(10mM HEPES pH7.4，0.15M NaCl，0.005％表面活性剂P20，BIAcore，GE Healthcare)。
将化合物连续稀释两倍，以使测定中最高浓度为20μM。例如，典型的测定可以使用20μM，10μM，5μM，2.5μM，1.25μM，0.625μM，0.312μM，0.156μM，0.078μM，0.039μM的化合物溶液。将化合物与0.5-1nMTNFα混合并平衡至少5小时。每10-15个循环测试对照化合物。使TNFα/化合物混合物在固定化的TNFR上流动3分钟，然后在每个循环之后进行表面再生，其中以30mL/min的流速注射一次30ml的10mM HCL。按照标准程序使用BIAevaluation软件分析背景扣除结合曲线。EC50数据使用四参数逻辑拟合确定。
图4A和图4B分别显示了式(1)和式(2)的化合物的进展曲线。从曲线中减去不存在化合物的情况下TNFα的RU(共振单位)值，所以这些现在仅显示化合物诱导的结合的增加。随着化合物浓度的增加，在更高的RU值下，进展曲线平稳。由此可以通过使用4参数对数拟合模型确定给出50％最大效应的化合物浓度来计算EC 50值。在这些实验中，计算式(1)化合物的EC 50为298nM，式(2)化合物的EC 50为280nM。
可以注意到，EC50显示批间变异性，并且Biacore测定和MSD测定的条件是非常不同的。因此，对于两种测定形式，测得的EC50预计不会相同。
实施例4-化合物1与TNFα结合的质谱分析
质谱通常使用Waters LCT-premier飞行时间质谱仪或Waters SynaptG2Q-TOF质谱仪进行。使用替代常规光谱仪源的Advion Triversa Nanomate纳流注入装置来引入样品，样品注射是通过具有50μM喷嘴尺寸的“A”系列芯片以100nl/min的标称流速进行的。对Waters LCT-premier飞行时间质谱仪的进一步修改包括一个定制的源冷却装置，允许精确控制源温度，以及一个商业压力调节装置，可精确控制源区的真空条件。这些修饰一起帮助保持天然折叠构象的TNFα三聚体，并促进检测与弱亲和力的测试化合物形成的复合物。典型设置是源温度：10℃，源压力3.74e-3mbar，分析器压力1.54e-6mbar。
使用标准阳离子电喷雾条件产生离子，导致多次给药TNFα。
质谱对蛋白质样品中存在的缓冲盐非常敏感。典型的缓冲盐例如磷酸钾或磷酸钠对离子化具有严重的不利影响。因此，使用Zeba脱盐旋转柱对蛋白质样品进行预处理以除去这些盐，将蛋白质交换成质谱兼容的缓冲液体系，通常为pH 6.8的50mM乙酸铵。
在软离子化条件下，当观察到三聚物的100％透射时，在100％含水环境中的天然条件下，观察到三聚体形式为包含+12，+13和+14离子的电荷状态包膜，加入5％v/v DMSO电荷状态包络转移到较低的am/z(较高的z)，表明如预期的那样，有机共溶剂引起三聚体物质溶液的部分展开，也检测到单体水平的增加。当添加10％v/v DMSO时，仅观察到与单体形式相关的电荷状态包膜，表明该水平的DMSO破坏溶液中三聚体形成。通常，测试化合物以10mMDMSO储备溶液形式存在，使得当它们与溶液中的TNFα一起温育时，最终的DMSO浓度为5％。在软离子化条件下，观察到电荷状态包络不仅与5％DMSO对照谱相比更高的m/z(低z)，而且与在100％水相下获得的谱相比，表明测试化合物能够克服5％DMSO的去稳定作用，并且在天然条件下观察到的稳定性高于和高于稳定性。蛋白质在所述的各种条件下获得的电荷数量的变化证明了这一点。
测量的“缔合”速率是速率常数kon和测试化合物的浓度的算术乘积，在测试化合物的高浓度下观察到的速率比在低浓度时大。通过在不同测试化合物浓度下通过质谱分析观察到的速率的实验测量允许导出速率常数(kon)的值。在一个典型的实验中，使用来自TNFα储备溶液和测试化合物的Advion Triversa Nanomate机器人以所需浓度制备测试化合物和TNFα三聚体的混合物。然后将样品在数分钟内注入质谱仪，在此期间记录质谱中游离的TNFα和TNFα/测试化合物复合物信号的比例。对于几种不同的测试化合物/TNFα比例重复这一点。
然后使用Graphpad PRISM v.5将针对不同测试化合物/TNFα比率记录的数据拟合至理论单相对数关联曲线以得出kon值。这证实了在Biacore上观察到的低kon值。
将测试化合物制备成在二甲基亚砜(DMSO)中的10mM溶液。因此，有必要确定在不存在测试化合物的情况下DMSO对天然TNFα三聚体的影响。将DMSO加入到TNFα三聚体的水溶液中以得到5％v/v的最终浓度并获得质谱。
在100％水性环境中，即在不存在DMSO的情况下，大部分TNFα以三聚体形式存在，具有显着比例的TNFα单体。在100％水性环境中，观察到TNFα的三聚体形式为包含+12，+13和+14离子的电荷状态包膜(图5，底部迹线)。
添加5％v/v DMSO观察到三聚体TNFα较少。电荷状态包络转移到较低的质量/电荷比(m/z)，表明DMSO引起三聚物的部分展开。在5％v/v DMSO存在下也检测到单体TNFα水平的增加。
当加入10％v/v DMSO时，仅观察到与单体形式相关的电荷状态包膜，表明该水平的DMSO破坏TNFα的三聚体形成(图5，顶部痕迹)。
将式(1)化合物加入到含有TNFα和5％v/v DMSO的溶液中，获得质谱。在式(1)化合物存在下，发现TNFα存在于5％v/v DMSO溶液中(图5，中间轨迹)。观察到式I结合的TNFα化合物的电荷状态包络转移到较高的m/z值(排他性地为+12和+11)，表明式(1)的化合物不仅克服了DMSO弱的去折叠影响TNFα，而且还导致三聚体TNFα复合物的稳定性超过和不存在DMSO时所观察到的。
为了解决为了在测试化合物能够结合之前充分减弱三聚体TNFα复合物而存在DMSO的担忧，在100％含水条件下用水溶性化合物重复实验。在不存在与三聚体复合物结合的DMSO化合物时，导致当存在DMSO时观察到更高的m/z比(数据未显示)。这证实了测试化合物不需要DMSO存在以结合TNFα三聚体，并且可以发挥其稳定作用，而不管存在去稳定剂。
测试化合物稳定三聚体形式的TNFα的进一步证据是通过在苛刻的电离条件下分析样品而获得的，所述条件倾向于倾向于将天然三聚体形式分解为单体。当TNFα与式(1)化合物结合时，在这些条件下检测到的TNFα单体的量显着减少(数据未显示)。这表明测试化合物保护TNFα三聚体免受质谱破坏。
实施例5-TNFα-式(1)化合物的化学计量配合物
在软电离条件下通过质谱法监测包括式(1)化合物在内的测试化合物文库与TNFα的孵育。数据显示每个TNFα三聚体作为式(1)化合物的一个分子的结合的化学计量(图6)。没有观察到式(1)的化合物结合TNFα的单体形式。没有证据表明TNFα的二聚体形式稳定。这证实了包括式(1)化合物在内的测试化合物与已知化合物具有不同的作用模式，其稳定了TNFα的二聚体形式。
实施例6-在TNFα三聚体中的单体交换
将TNFα(分别为H3和M3)的人和小鼠同源三聚体一起温育，并通过质谱仪外观杂交异源三聚体监测溶液的等分试样。质谱分析证实天然TNFα三聚体之间的单体交换能够在溶液中发生。交换速度缓慢，并在达到完全平衡之前的4小时内监测(数据未显示)。机制是未知的，虽然是不可能涉及形成二聚体形式，因为没有观察到这些。单体交换可能在纯人和小鼠三聚体之间发生，小鼠和人三聚体的混合仅仅使得这种交换通过质谱可见。
在第二系列实验中，将过量的式(1)化合物与人TNFα一起温育，然后除去过量的式(1)化合物。质谱分析证实在式(1)化合物和h-TNFα之间形成了1:1络合物。现在将小鼠TNFα加入到该样品中，然后在数小时内进行质谱分析。18小时后，样品的组成没有观察到变化。值得注意的是，没有发生单体亚单位交换，没有观察到形成混合异三聚体物质，如MH2和M2H游离或者作为MH2L和M2HL连接。另外，没有证据表明M3L物种的形成，也没有形成未结合的H3物种的证据。这强烈地表明，一旦式(1)的化合物与h-TNFα结合，就没有可测量的解离速率。因此，当与h-TNFα预孵育时，式(1)的化合物锁定人三聚体，因此未观察到交叉物种单体亚单位交换。
然后反过来重复实验。将过量的式1化合物与小鼠TNFα温育，然后除去过量的式(1)化合物。质谱分析证实在式(1)化合物和m-TNFα之间形成了1：1配合物。现在将人TNFα加入到该样品中，然后在数小时内进行质谱分析。数据清楚地显示可以发生单体亚单位交换，在游离(MH2和M2H)和连接(MH2L和M2HL)两种状态下观察到混合异三聚体物质的形成。此外，有证据表明连接的人同源三聚体(H3L)，未连接的小鼠同源三聚体(M3)和未结合的式(1)(L)的化合物。这表明虽然在式(1)化合物与小鼠TNFα同源三聚体之间形成1：1复合物，但存在可测量的解离速率。一旦该复合物(M3L)解离，H3和M3物质之间的单体亚基交换就会进行，释放的配体则能够与存在于溶液中的所有4种三聚物形成复合物。因此，当用m-TNFα预孵育时，式(1)化合物不阻止单体亚单位交换，并观察到混合异三聚体的形成。
然后用式(2)化合物代替式(1)化合物重复这两个实验。当式(2)化合物与h-TNFα预温育得到1：1复合物，然后与未连接的m-TNFα混合时的结果与式(1)化合物相同。未观察到单体亚单位交换，18小时后，在溶液中仅观察到H3L和M3种类，证实式(2)化合物在与h-TNFα复合时也没有可测量的解离速率。因此，当与h-TNFα预温育时，式(2)化合物锁定人三聚体，因此没有观察到交叉物种单体亚单位交换。
然而，与式(1)化合物相比，当式(2)化合物与m-TNFα预孵育形成1:1复合物，然后与未连接的h-TNFα混合时，未观察到单体亚单位交换18小时内只观察到M3L和H3物质在溶液中。这表明式(2)的化合物在与m-TNFα复合时也没有可测量的解离速率。因此，当用m-TNFα预孵育时，式(2)的化合物锁定小鼠三聚体，因此没有观察到交叉物种单体亚单位交换。
这些数据一起表明，尽管式(1)化合物和式(2)化合物对人TNFα具有相似的亲和力，但是该化合物对小鼠TNFα三聚体具有不同的亲和力，式(2)化合物结合更紧密(1)化合物转化为后者。
实施例7-使用TNFα，TNF-R和式(1)的化合物对来自尺寸排阻实验的部分进行质谱分析，
通过液相色谱-质谱法(LC-MS)分析来自TNFα，TNF-R和式(1)化合物的混合物的尺寸排阻色谱分离的级分。制备两个样品用于尺寸排阻色谱。在第一个样品中，在向TNF-R中加入化合物-三聚体复合物之前，将式(1)的化合物与TNFα一起预温育。在第二个样品中，将式(1)的化合物加入预先形成的TNFα和TNF-R的复合物中。LC-MS分析显示式(1)化合物与含有两种蛋白质的那些级分相关(图7)，表明无论加入顺序如何，式(1)化合物仍然能够与即即使在TNF-R存在下，式(1)的化合物也与TNFα结合。
实施例8-TNFα和式(2)化合物的等温量热分析-TNFα三聚体复合物结合TNF-R
在ITC缓冲液(50mM HEPES，150mM NaCl，pH7.4)中的TNFα(128μM)与化合物2的DMSO储备液孵育60分钟，得到在5％DMSO中的300mM的最终化合物浓度(测试样品)。将其中DMSO而非化合物添加至TNFα样品的对照样品也温育60分钟(对照)。
温育后，将样品在Nap5大小排阻柱(GE Healthcare)上进行凝胶过滤。在加入500μl进入柱的样品之前，用15ml ITC缓冲液平衡该柱，然后用1ml ITC缓冲液洗脱。该过程从游离化合物和DMSO中分离TNF和化合物结合的TNF。
使用280nm处的吸光度读数来测定测试样品或从NAP 5柱洗脱后的对照中的TNFα浓度，并将样品稀释至64μM的TNFα浓度。
将200μlTNFR1的细胞外结构域(ECD)(10mM)自动加载到AutoITC200(GEHealthcare)的样品池中(使用标准板B方案)。在2个实验中，使用相同的方案将40μl的测试样品或对照自动加载到注射器中。
ITC实验使用在等温线图(图8A和B)上描述的ITC注射方案在25摄氏度下以1000rpm搅拌进行。
使用GE Healthcare ITC在原始4.0软件中的应用收集和分析数据，并使用单站点结合算法计算结果。
计算出在不存在任何测试化合物的情况下与TNF-R结合的TNFα的KD为77nM(图8A)。在式(2)化合物存在下，与TNF-R结合的TNFα的KD低于量热计的灵敏度范围，因此不能准确计算。然而，热量计具有约1nM的较低灵敏度边界。因此，式(2)化合物存在下结合TNF-R的TNFα的KD必须是1nM或更低(见图8B)。
实施例9-结合式(1)化合物的三聚TNFα的晶体结构
将TNFα与式(1)的化合物预温育，并使得到的化合物-三聚体复合物结晶。使用X射线晶体学测定化合物-三聚体TNFα复合物的晶体结构。图9显示了分辨率为2.2的配合物的晶体结构。在不再对称的三聚体的中间可以看到该化合物。
实施例10-通过本发明化合物中和TNFα
使用Baarsch MJJ等(Immunol Methods 1991；140：15-22)和Galloway CJ等J(Immunol Methods 1991；140：37-43)中公开的方案进行L929中和测定。
简言之，将L929细胞(ECACC，85011425)在含有10％FCS(PAA)，2mM谷氨酰胺(Gibco)，50U/ml青霉素(Gibco)和50μg/ml链霉素(Gibco)的RPMI 1640GIBCO)。当传代培养时，细胞用10mL不含钙和镁的Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水(Gibco)洗涤3次，然后加入3ml胰蛋白酶-EDTA(Gibco)2分钟以从烧瓶中除去细胞。加入培养基中和胰蛋白酶，上下移取细胞以除去任何团块。
使用前一天将L929细胞分开1/2或1/3，再培养24小时。然后如上所述将培养瓶进行胰蛋白酶消化，并在96孔平底平板(BectonDickinson)的每孔中加入100μl中的2x10 4个细胞。在建立测定之前将平板培养24小时。
从化合物的DMSO储备液中进行连续稀释。典型地，通过从浓缩化合物溶液中双倍稀释产生9点滴定曲线，得到25，12.5，6.25，3.125，1.56，0.78，0.39，0.2，0.1μM的最终测定浓度。
测定培养基与培养基相同，但也含有1μg/ml放线菌素D(Sigma)。将培养基从平板上轻轻摇动，将测定样品加TNFα，标准品和对照以100μl体积加入，一式两份。将平板进一步温育16小时，然后每孔加入10μl5mg/ml甲基噻唑四唑(MTT；Sigma)的培养基溶液4小时。通过加入100μl溶于50％二甲基甲酰胺(DMF；BDH)和50％去离子水的含有20％十二烷基硫酸钠(SDS，BDH)的增溶缓冲液来终止反应。
在37℃孵育过夜以使染料溶解后，在570nm下用Multiskan EX读板仪(Labsystem)在630nm处减去读板。数据使用Genesis软件包进行分析。
式(1)化合物和式(2)化合物均抑制人TNFα的细胞杀伤活性(图10)，表明式(1)化合物和式(2)化合物都能够通过TNF-R抑制人TNFα诱导的信号传导。在这种情况下，式(1)化合物的IC50值为306nM，式(2)化合物的IC50值为125nM。使用式(3)的化合物重复该方案，其也发现通过TNF-R抑制人TNFα诱导的信号传导。因此，式(3)的化合物给出21nM的IC50值。
实施例11-式(1)化合物抑制TNFα诱导的IL-8产生
通过针刺收集来自健康供体的静脉血进入含有钠/肝素的管(BD Biosciences)。通过用Ficoll Paque(Amersham Biosciences)密度梯度离心分离外周血单核细胞(PBMC)。简言之，用RPMI 1640(Gibco)以1：1(v/v)稀释10mL血液并小心地铺在20mL Ficoll Paque上。将细胞在470g离心30分钟(min)，收集PBMC，在RPMI 1640中洗涤一次，并将任何剩余的污染红细胞溶解在红细胞裂解缓冲液(1g/L KHCO 3，8.3g/L NH 4Cl，0.0372g/L EDTA)。根据制造商的说明，使用CD14+磁性微珠(Miltenyi Biotec)从PBMC中分离单核细胞。简而言之，将PBMC以1x10 7个细胞/ml重悬于含有5％BSA(Sigma)和2mM EDTA(Sigma)的Dulbecco's改良Eagle培养基中。每107个总细胞中25μL的CD14微珠在室温下温育15分钟。使用LS柱(Miltenyi Biotec)进行磁分离。在将细胞/珠混合物应用于柱之前，将柱置于磁场中并用5mL缓冲液洗涤两次。然后将细胞悬浮液在磁场中施加到柱上。单核细胞结合CD14+微珠保留在LS柱上，而剩余的PBMC通过柱子。为了分离单核细胞，然后将柱子(包含保留的细胞)从磁体中取出并置于收集管中。将5mL缓冲液添加到柱中，并通过将注射器柱塞施加到柱的顶部从柱中收集CD14+细胞。收集的细胞在RPMI 1640中洗涤一次。
在96孔圆底平板中，在DMSO中进行11点3倍系列稀释(包括空白)的化合物(原液浓度10mM)。
纯化的单核细胞通过离心(300g，5分钟)洗涤并以1×10 6个细胞/mL的浓度重悬于完全培养基中。将160μL的这种细胞群在含有40μL化合物和TNFα的RPMI 1640或相关对照中一式三份在96孔圆底平板中在37℃温育。
18小时后，将平板离心(300g，5分钟)，收集上清液用于测量细胞因子。
使用来自R&D Systems Ltd.的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒，根据制造商的说明在细胞培养上清液中测量人IL-8。用于ELISA的底物是Tm Blue(SerologicalsCorporation)。在630nm的波长读取平板，在470nm进行校正。式(1)化合物以浓度依赖性方式抑制TNFα诱导的IL-8产生(图11)，IC50值为454.1nM。
实施例12-式(2)化合物对TNFα诱导的NF-κB活化的抑制
通过TNF-α刺激HEK-293细胞导致NF-kB途径的激活。用于确定TNFα活性的报道细胞系购自Invivogen。HEK-Blue Tm CD40L是一种稳定的转染子，表达在与5个NF-kB结合位点融合的IFN-β最小启动子控制下的SEAP(分泌的碱性磷酸酶)。通过TNF-α(0.5ng/ml)，IL-1-β(0.5ng/ml)和活化的抗人TNFR1抗体(300ng/ml)以浓度依赖性方式刺激这些细胞分泌SEAP。
将化合物从10mM DMSO原液(最终测定浓度0.3％)稀释以产生10点3倍连续稀释曲线(30，000nM至2nM终浓度)。将它们与刺激性配体在384孔微量滴定板中混合1小时。将新鲜解冻并洗涤的细胞加入到化合物/刺激混合物中，并进一步温育18小时。使用比色底物Quanti-blue Tm(Invivogen)在上清液中测定SEAP活性。
在DMSO对照和最大抑制(通过过量的对照化合物)之间计算化合物稀释的抑制百分数，并使用xlfit(4参数逻辑模型)在活性基质中计算IC50。
将每种化合物对TNF-α应答的特异性活性与对抗屏幕(IL-1β和抗人TNFR1抗体)所观察到的比较进行比较。
式(2)的化合物以浓度依赖性方式抑制TNFα对NF-κB的活化，IC50为113nM(图12A)。相反，式(2)化合物不抑制IL-1β(图12B)或激活的TNF-R1抗体(图12C)对NF-κB的活化。在每种情况下获得超过30，000nM的IC50值。因此，式(2)的化合物通过TNF-R1特异性地抑制TNFα诱导的信号传导，但对其他信号传导途径(例如IL-1β)诱导的NF-κB活化没有影响，或者当信号传导的开始(例如通过使用激活的TNF-R1抗体)旁路TNF-R1。
实施例13-测定结合TNFα的动力学
使用表面等离子体共振来测量式(1)和(2)化合物对TNFα的缔合速率，解离速率和亲和力(图13A和B)。为了研究的目的，使用Biacore T100/T200。
在HBS-P缓冲液(10mM HEPES pH7.4，0.15M NaCl，0.005％表面活性剂P20，BIAcore，GE Healthcare)中，将TNFα在pH5下固定至5-8KRU的水平。然后用5％DMSO在HBS-P中平衡TNFα至少5小时。将样品从10mM储备液稀释到DMSO匹配的缓冲液中并使其溶解至少5小时。流量为30 L/min。
通过从对于式(1)的化合物的最高浓度为25μM和对于式(2)的化合物以1μM开始添加4或5个浓度的化合物并且然后连续稀释该样品来进行该测定。按照标准程序使用BIAevaluation软件分析背景扣除结合曲线。使用Biacore软件确定结合，亲和力和动力学参数。动力学数据使用levenberg marquardt算法拟合。
实验显示这些化合物非常缓慢地结合固定化的TNFα，如通过式(1)的化合物(图13A)的2.668e3M-1s-1和式(2)的化合物的1.119e3M-1s-(图13B)。它们也具有显着缓慢的解离速率，这似乎是具有这种作用模式的化合物的特征。式(1)化合物的解离速率常数(koff)为9.46e-5s-1，式(2)化合物的解离速率常数(koff)等于2.24e-5s-1。这等同于分解半衰期(t1/2)分别超过2小时和8小时。解离常数(KD)可以由两个常数koff/kon的比值来计算。在该实验中，式(1)化合物和式(2)化合物的KD值分别为35nM和2nM。这显着低于实施例4中所示的在Biacore上确定的EC 50，并且可能反映了测定形式的差异。此外，TNFα的形式不同于实施例13的动力学测定，TNFα被固定。
重复该实验以测量式(3)化合物对TNFα的缔合速率，解离速率和亲和力(图13C)。发现式(3)的化合物具有5470M-1s-1的kon，解离速率常数为4.067e-5s-1，KD为7nM。
实施例14-式(1)化合物和式(2)化合物在体内拮抗TNFα活性
在分开的研究中，将式(1)和式(2)的化合物与溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的20μMTNFα溶液混合至浓度为2μM，20μM和200μM。因此，每种化合物与TNFα的比例为0.1:1(样品1)，1:1(样品2)和10:1(样品3)。在使用Zeba Spin脱盐柱(ThermoScientific)进行凝胶过滤之前，将溶液在室温下温育3小时以使化合物结合TNFα。这个过程分离蛋白质结合的化合物和游离化合物。仅含有PBS的对照样品以相同的方式处理以提供用于研究的载体对照。使用Nanodrop(ND-1000)测定洗脱蛋白质的浓度。将TNFα：化合物复合物在PBS中稀释至注射浓度为0.03μg/kg。
对于该研究，通常，除了使用一组5只小鼠的抗人TNFα抗体阳性对照以外，每组包含10只雄性Balb/c小鼠(Charles River)。给予抗体对照小鼠5分钟前(t＝-5)腹膜内(i.p.)注射10mg/kg(100μL)的抗hTNFαα给予i.p.以0.1μg/kg(t＝0)注射PBS或hTNFα。
试验小鼠腹膜内注射。在t＝0时，用100μL凝胶过滤载体(PBS)，hTNFα(0.03μg/kg)或样品1，2和3(化合物与TNFα的比例为0.1:1，1:1和10：1)。
该研究中还包括仅有化合物的小鼠以评估化合物对嗜中性粒细胞募集的作用。
所有小鼠在注射hTNFα(t＝2h)两小时后颈椎脱臼处死，并用3mL FACS缓冲液(500mL含有2g牛血清白蛋白的PBS，6mL HEPES缓冲液和500mL EDTA)灌洗腹腔。抽吸灌洗液并通过如下详述的通过FACS对抗Gr1PE和抗CD45FITC染色细胞来评估嗜中性粒细胞数目。
将100μl来自每个样品的灌洗液分装到FACS管中。使用抗-GR-1PE(BD目录号553128批次#75542)以1:19稀释度和抗-CD45FITC(BD目录号553080批次#80807)在FACS缓冲液中稀释19倍制备FACS鸡尾酒。使用FACS缓冲液以1:10制备Fc区(BD Cat#553142批次#87810)，并在加入抗体混合物之前5分钟将10μL添加至每个样品。每个含有100μL样品的试管中加入10μl抗体混合物。样品在冰上放置20分钟。将1mL FACS裂解液(BD Cat#349202批号29076，在dH 2O中以1:10稀释)加入到每个管中，混合并在室温下放置5分钟。然后将1mLFACS缓冲液加入到每个管中，并以400g离心5分钟。然后小心地倒出FACS缓冲液，并将管的尖端在吸水纸上擦拭以使管完全干燥。然后将300μl在FACS缓冲液中稀释的10μl参比珠子溶液(Sigma目录号#P2477批号#116K1612)加入到每个试管中。
使用FACScalibur II和FloJo软件分析样品。
图14显示式(1)(A)化合物和式(2)(B)化合物的结果。单独载体对于嗜中性粒细胞募集的影响可以忽略不计，如同单独使用化合物(在(B)中略高)。来自每个研究的样品1(比例化合物：TNFα0.1：1)与没有化合物时加入TNFα没有显着不同。样品2(1：1)和样品3(10：1)显示显着抑制嗜中性粒细胞募集(分别为86％和85％)。类似地，式(2)化合物的样品2和样品3显示出对嗜中性粒细胞募集的显着抑制(分别为101％和102％)。抗体对照小鼠显示嗜中性粒细胞募集的100％抑制(数据未显示)。
在进一步的实验中，用hTNFα(0.3μg/ml)处理小鼠，口服给药(p.o.)式(1)的化合物。
使用共面机将式(1)的化合物制成在1％甲基纤维素载体中的悬浮液。
在本研究中，还使用抗人TNFα单克隆抗体(抗hTNFα，UCB)作为阳性对照。
除了接受抗hTNFα的组中使用了十只雄性Balb/c小鼠外，其中使用了4只小鼠。
小鼠以30mg/kg或100mg/kg口服接受100μL载体(1％甲基纤维素)或式(1)化合物。30分钟(t＝-30)或10mg/kg i.p.的抗hTNFα。在注射人TNFα之前5分钟(t＝-5)。在t＝0时，给小鼠注射100μLi.p.的0.03μg/kg的PBS或hTNFα。
所有小鼠在注射hTNFα(t＝2h)两小时后颈椎脱臼处死，腹膜腔被灌洗并且如上所述测量嗜中性粒细胞数目。
式(1)化合物的30mg/kg和100mg/kg的口服给药分别使TNFα刺激的嗜中性粒细胞募集到腹膜腔中减少49％和79％(图15)。i.p.给予的阳性对照抗体(10mg/kg)注射完全抑制了嗜中性粒细胞的招募。
因此，式(1)的化合物不仅在与TNFα预先混合并通过i.p途径给药时，而且在口服给药时也能拮抗体内的TNFα活性。
实施例15-通过式(1)和(2)的化合物对TNFα三聚体稳定化的分析
进行荧光探针热变性测定以评估化合物对TNFα热稳定性的影响，作为化合物结合的量度。反应混合物含有5μl30xOrange染料(Invitrogen)和5μlTNFα(1.0mg/ml)，37.5μlPBS，pH7.4和2.5μl化合物(在DMSO中2mM)。将10μl混合物一式四份分配到384PCR光学孔板中，并在7900HT Fast实时PCR系统(AgilentTechnologies)上运行。PCR系统加热装置设定在20oC至99oC，升温速率为1.1oC/min；通过电荷耦合器件(CCD)监测孔中的荧光变化。将荧光强度增加绘制为温度的函数，并且将Tm计算为该变性曲线的中点(作为拐点确定)(表1)。
通过Tm的增加来表示稳定TNFα。式(1)和(2)的化合物都能增加TNFα的Tm(如表1所示)。因此，式(1)和(2)的化合物都增加了TNFα三聚体的稳定性。
表1显示了存在化合物(1)或(2)时TNFα的热转变中点(Tm)。
实施例16-确定式(1)，(2)和(3)的化合物对式(4)的化合物与TNFα的结合的作用的荧光偏振测定
通过在20mM Tris，150mM NaCl，0.05％Tween 20中在环境温度下与TNFα预先温育60分钟，从终浓度为5％DMSO的100μM开始，以10个浓度对式(1)在加入式(4)的化合物之前和在环境温度下进一步温育过夜。在25μl的总测定体积中，TNFα和式(4)化合物的终浓度分别为50nM和10nM。在Analyst HT阅读器上读板。在活性基质中使用xlfit(4参数逻辑模型)计算IC50。
结果如图16所示。式(1)的化合物能够抑制式(4)化合物与TNFα的结合，IC50值为167nM。
使用式(2)和(3)的化合物重复该实验。式(2)化合物能够抑制式(4)化合物与TNFα的结合，IC50值为102nM。式(3)的化合物能够以20nM的IC50值抑制式(4)的化合物与TNFα的结合。
实施例17-与TNF超家族的其他成员的初步研究
质谱分析已经显示，也形成同型三聚体的CD40L被DMSO去稳定化，导致三聚体CD40L的量减少。使用的测定方案与实施例3中描述的TNFα相同，但是使用CD40L代替。已经显示式(1)的化合物在DMSO的存在下稳定三聚体CD40L(图17)。这表明应用于TNFα研究的质谱技术，在去稳定剂存在下的构象和根据本发明的化合物的作用适用于TNF超家族的其他成员。
实施例18-Ma等人(2014)和Silvian等人(2011)的化合物和复合物具有与本发明不同的特征
如Ma等人(2014)JBC 289:12457-12466的第12458页所述，为了试图找到在与TNFβ的外表面的相互作用中由TNFR1的环2/结构域2的7个氨基酸的肽所占据的空间的分子，通过虚拟筛选发现C87。Ma等人的C87化合物和来自Silvian等人(2011)ACS ChemicalBiology6:636-647的BIO8898化合物由本发明人测试。
发现结果概述
在Ma等人描述的对于C87的Biacore观察不能重复。
没有观察到细胞中TNF特异性抑制的证据。
另外，通过对毫摩尔亲和力敏感的质谱，C87未被观察到结合。
广泛的晶体学试验仅产生apo-TNF(没有化合物的TNF)。
在荧光偏振(FP)测定中，C87在荧光读出的化合物的干扰水平以上没有显示出显著的抑制。
测量TNFα的热解链温度稳定性的Thermofluor对于C87显示出小的稳定性。
总之，没有证据表明C87结合在三聚体的中心。绝大多数数据表明与TNFα没有直接的相互作用。BIO8898也被发现不与TNFα结合。
细胞-TNF诱导的HEK NFκB报告基因测定
C87与TNFα预培养1小时，然后加入在NFκB控制下用SEAP稳定转染的HEK-293细胞。为了检测非TNF相关(非目标)活性，还测试了合适的反筛选。将测定孵育过夜，然后测量与对照化合物的100％阻断相比的抑制。最大C87浓度是10,000nM，连续稀释3倍。
没有检测到不能归因于脱靶活性的抑制作用。
Biacore
使用avi-标签接头固定TNF，并将C87通过芯片。在一个实验中，进行了来自最高浓度10μM的C87的剂量响应。没有观察到结合。
在第二个实验中，C87通过芯片的流速降低了。观察到一个小的转变，但整体结合可以忽略不计。
Ma等人描述的C87与TNF的结合很可能是基于Y轴上RU值的超化学计量。在芯片上的标准TNF密度下，该值比单纯1：1结合的预期值高出三十倍。
在另一个实验中，BIO8898在Biacore 4000机器上通过SPR针对固定的可溶形式的CD40L和可溶形式的TNFα进行了测试。测定了与CD40L的结合的17μM的几何IC50，而在该测定中，在浓度高达100μM的TNFα下未检测到结合。
质谱
在400μM的浓度下没有C87与人TNFα(20μM)结合的证据。一种较低分子量的物质(约473Da似乎在低于5％的占有率时结合)。C87具有503Da的分子量。基于400μM浓度的占有率，预测低分子量物质超过1mM的亲和力。
结晶学
总的来说，将大量努力用于使TNFα与C87结晶，包括常规使用本申请中描述的化合物的测试条件。这包括在不同配体浓度，不同蛋白质浓度和不同浸泡时间下进行大量结晶试验。观察到一些晶体，经分析证明是盐或TNF，没有化合物。
荧光偏振(FP)
在针对荧光化合物(探针)进行测定之前，C87与TNFα预孵育1小时。通过FP的降低来检测与荧光化合物直接(在相同位点结合)或间接(破坏TNF)的竞争。
抑制曲线的外推产生约100μM的IC50。然而，在抑制剂的最高浓度下观察到荧光猝灭，当在该测定中其被扣除时导致抑制C87的作用可忽略不计。
Thermofluor
Thermofluor测量由于化合物稳定或破坏蛋白质而导致的TNFα的解链温度(Tm)的变化。当浓度为500μM C87时，观察到3.8℃的稳定效应，表明弱结合的可能性，这可能不是特异性的。
序列表
SEQ ID NO:1(1974的HCVR)
DVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSAYYMAWVRQAPTKGLEWVASINYDGANTFYRDSVKGRFTVSRDNARSSLYLQMDSLRSEDTATYYCTTEAYGYNSNWFGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:2(1974的LCVR)
DIQMTQSPASLPASPEEIVTITCQASQDIGNWLSWYQQKPGKSPQLLIYGATSLADGVPSRFSASRSGTQYSLKISRLQVEDFGIFYCLQGQSTPYTFGAGTKLELK
SEQ ID NO:3(1974HC mIgG1全长)
DVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSAYYMAWVRQAPTKGLEWVASINYDGANTFYRDSVKGRFTVSRDNARSSLYLQMDSLRSEDTATYYCTTEAYGYNSNWFGYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
SEQ ID NO:4(1974LC kappa全长)
DIQMTQSPASLPASPEEIVTITCQASQDIGNWLSWYQQKPGKSPQLLIYGATSLADGVPSRFSASRSGTQYSLKISRLQVEDFGIFYCLQGQSTPYTFGAGTKLELKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
SEQ ID NO:5(1979的HCVR)
EVHLVESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITNSYWDWIRKFPGNKMEWMGYINYSGSTGYNPSLKSRISISRDTSNNQFFLQLNSITTEDTATYYCARGTYGYNAYHFDYWGRGVMVTVSS
SEQ ID NO:6(1979LCVR)
DIQMTQSPASLSASLEEIVTITCQASQDIGNWLSWYQQKPGKSPHLLIYGTTSLADGVPSRFSGSRSGTQYSLKISGLQVADIGIYVCLQAYSTPFTFGSGTKLEIK
SEQ ID NO:7(1979HC mIgG1全长)
EVHLVESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITNSYWDWIRKFPGNKMEWMGYINYSGSTGYNPSLKSRISISRDTSNNQFFLQLNSITTEDTATYYCARGTYGYNAYHFDYWGRGVMVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
SEQ ID NO:8(1979LC Kappa全长)
DIQMTQSPASLSASLEEIVTITCQASQDIGNWLSWYQQKPGKSPHLLIYGTTSLADGVPSRFSGSRSGTQYSLKISGLQVADIGIYVCLQAYSTPFTFGSGTKLEIKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
序列表
<110> UCB Biopharma SPRL
<120> 调节剂测定
<130> N114274F-WO
<150> GB 1418774.4
<151> 2014-10-22
<150> GB 1418773.6
<151> 2014-10-22
<150> GB 1418776.9
<151> 2014-10-22
<150> GB 1418781.9
<151> 2014-10-22
<150> GB 1510758.4
<151> 2015-06-18
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCVR of 1974
<400> 1
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Asn Tyr Asp Gly Ala Asn Thr Phe Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Ser Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Glu Ala Tyr Gly Tyr Asn Ser Asn Trp Phe Gly Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCVR of 1974
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Pro Ala Ser Pro Glu
1 5 10 15
Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ala
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Arg Leu Gln Val
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ile Phe Tyr Cys Leu Gln Gly Gln Ser Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 3
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1974 HC mIgG1 full
<400> 3
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Asn Tyr Asp Gly Ala Asn Thr Phe Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Ser Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Glu Ala Tyr Gly Tyr Asn Ser Asn Trp Phe Gly Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser
115 120 125
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val
130 135 140
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro
195 200 205
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly
210 215 220
Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu
290 295 300
Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg
305 310 315 320
Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro
340 345 350
Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr
355 360 365
Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly
385 390 395 400
Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu
405 410 415
Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn
420 425 430
His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 4
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1974 LC kappa full
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Pro Ala Ser Pro Glu
1 5 10 15
Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ala
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Arg Leu Gln Val
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ile Phe Tyr Cys Leu Gln Gly Gln Ser Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130 135 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145 150 155 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 5
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCVR of 1979
<400> 5
Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Asn Ser
20 25 30
Tyr Trp Asp Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Met Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Gly Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Asn Asn Gln Phe Phe Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Ile Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Thr Tyr Gly Tyr Asn Ala Tyr His Phe Asp Tyr Trp Gly Arg
100 105 110
Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCVR of 1979
<400> 6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Glu
1 5 10 15
Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro His Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Thr Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Gly Leu Gln Val
65 70 75 80
Ala Asp Ile Gly Ile Tyr Val Cys Leu Gln Ala Tyr Ser Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 7
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1979 HC mIgG1 full
<400> 7
Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Asn Ser
20 25 30
Tyr Trp Asp Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Met Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Gly Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Asn Asn Gln Phe Phe Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Ile Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Thr Tyr Gly Tyr Asn Ala Tyr His Phe Asp Tyr Trp Gly Arg
100 105 110
Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val
115 120 125
Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala
195 200 205
Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys
210 215 220
Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro
290 295 300
Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val
305 310 315 320
Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
325 330 335
Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys
340 345 350
Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp
355 360 365
Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser
385 390 395 400
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Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His
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His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
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<210> 8
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1979 LC Kappa full
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Glu
1 5 10 15
Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro His Leu Leu Ile
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Tyr Gly Thr Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Gly Leu Gln Val
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130 135 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145 150 155 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210

Claims (40)

1.一种鉴定能够结合TNF超家族成员三聚体蛋白质的化合物的方法，由此化合物-三聚体复合物结合必需的TNF超家族受体并调节所述受体的信号传导，所述方法包括：
a)鉴定所述化合物与样品中三聚体形式的TNF超家族成员的结合；和/或
b)测量包含所述化合物的样品中三聚体形式的TNF超家族成员的稳定性；和/或
c)测量包含所述化合物的样品中结合至必需受体的三聚体TNF超家族成员的水平；和/或
d)测量化合物与探针化合物对结合三聚体形式的TNF超家族成员的竞争性；
以及将(a)中所述化合物与三聚体形式的TNF超家族成员的结合和/或(b)中三聚体形式的TNF超家族成员的稳定性和/或(c)中结合至必需受体的三聚体TNF超家族成员的水平，和/或(d)中观察到的竞争水平与对照样品的相应值相比较，并选择能够结合TNF超家族成员三聚体蛋白质的化合物，由此化合物-三聚体复合物结合必需的TNF超家族受体并调节受体的信号传导。
2.权利要求1的方法，其包括：
a)对含有TNF超家族成员和所述化合物的样品进行质谱分析，以检测TNF超家族成员三聚体的量；
b)与对照样品比较样品中TNF超家族成员三聚体的量；和
c)选择能够结合TNF超家族成员三聚体蛋白质的化合物，由此化合物-三聚体复合物结合必需的TNF超家族受体并调节受体的信号传导。
3.权利要求1的方法，其包括：
a)进行受体-配体结合测定，其中将TNF超家族成员和化合物的样品施加至已结合至表面的必需TNF受体；
b)与对照样品比较与必需TNF受体结合的TNF超家族成员三聚体的量；和
c)选择能够结合TNF超家族成员三聚体蛋白的化合物，由此化合物-三聚体复合物结合必需的TNF超家族受体并调节受体的信号传导。
4.权利要求1的方法，其包括：
a)进行测定以确定TNF超家族成员和化合物的样品中三聚体形式的TNF超家族成员的Tm；
b)与对照样品比较样品中三聚体形式的TNF超家族成员的Tm；和
c)选择能够结合TNF超家族成员三聚体蛋白的化合物，由此化合物-三聚体复合物结合必需的TNF超家族受体并调节受体的信号传导。
5.权利要求1的方法，其包括：
a)使用所述化合物和探针化合物进行荧光偏振测定；
b)将所述探针化合物在所述化合物存在下的偏振度与对照样品中的偏振度进行比较；和
c)选择能够结合TNF超家族成员三聚体蛋白的化合物，由此化合物-三聚体复合物结合必需的TNF超家族受体并调节受体的信号传导。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中含有TNF超家族成员和所述化合物的样品进一步包含去稳定剂。
7.权利要求6的方法，其中所述去稳定剂是DMSO。
8.权利要求1的方法，其包括：
a)进行等温量热分析以测量在所述化合物存在下TNF超家族成员对必需受体的结合；
b)与对照样品比较TNF超家族成员对必需受体的结合；和
c)选择能够结合TNF超家族成员三聚体蛋白的化合物，由此化合物-三聚体复合物结合必需的TNF超家族受体并调节受体的信号传导。
9.权利要求1的方法，其中步骤(c)包括测量包含所述化合物的样品中的三聚体TNF超家族成员与必需受体的结合亲和力。
10.权利要求1或9的方法，其包括：
a)进行测定以确定TNF超家族成员和所述化合物的样品中三聚体形式的TNF超家族成员的KD-r；
b)与对照样品比较样品中三聚体形式的TNF超家族成员的KD-r；和
c)选择能够结合TNF超家族成员三聚体蛋白的化合物，由此化合物-三聚体复合物结合必需的TNF超家族受体并调节受体的信号传导。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中与不存在所述化合物的情况下三聚体形式的TNF超家族成员的稳定性相比，所述化合物增加所述三聚体形式的TNF超家族成员的稳定性。
12.前述权利要求中任一项的方法，其中所述稳定性的增加导致所述三聚体形式的TNF超家族成员的热转换中点(Tm)增加至少1℃。
13.权利要求12的方法，其中所述稳定性的增加导致所述三聚体形式的TNF超家族成员的热转换中点(Tm)增加至少10℃。
14.权利要求13的方法，其中所述三聚体形式的TNF超家族成员的Tm的增加为10℃至20℃。
15.前述权利要求中任一项的方法，其中与不存在所述化合物的情况下TNF超家族成员与其受体的结合亲和力相比，所述化合物增加所述TNF超家族成员与必需受体的结合亲和力。
16.权利要求15的方法或化合物，其中所述化合物通过相较于在不存在所述化合物的情况下TNF超家族成员与其受体结合的缔合速率(kon-r)和解离速率(koff-r)值增加缔合速率(kon-r)和/或降低解离速率(koff-r)来增加所述TNF超家族成员与必需受体的结合亲和力。
17.权利要求15的方法，其中所述化合物通过相较于在不存在所述化合物的情况下TNF超家族成员与其受体结合的缔合速率(kon-r)值增加缔合速率(kon-r)来增加所述TNF超家族成员与必需受体的结合亲和力。
18.权利要求15、16或17的方法，其中与不存在所述化合物的情况下TNF超家族成员对其受体的KD-r相比，所述化合物降低所述TNF超家族成员对必需受体的KD-r，其中：
a)与不存在所述化合物的情况下所述TNF超家族成员的KD-r相比，所述化合物降低所述TNF超家族成员对必需受体的KD-r至少10倍；
b)在所述化合物的存在下TNF超家族成员与必需受体结合的KD-r值小于10nM。
19.权利要求15、16或17的方法，其中与不存在所述化合物的情况下TNF超家族成员对其受体的KD-r相比，所述化合物降低所述TNF超家族成员对必需受体的KD-r，其中：
a)与不存在所述化合物的情况下所述TNF超家族成员的KD-r相比，所述化合物降低所述TNF超家族成员对必需受体的KD-r至少4倍；
b)在所述化合物的存在下TNF超家族成员与必需受体结合的KD-r值小于600pM。
20.权利要求19的方法，其中在所述化合物的存在下TNF超家族成员与必需受体结合的KD-r值小于200pM。
21.前述权利要求中任一项的方法，其中所述化合物具有500nM或更低的IC50值。
22.前述权利要求中任一项的方法，其中所述TNF超家族成员是TNFα，并且所述受体是TNF受体。
23.一种包含TNF超家族成员三聚体蛋白质和能够结合TNF超家族成员三聚体蛋白质的化合物的复合物，由此化合物-三聚体复合物结合必需的TNF超家族受体并调节由所述三聚体通过所述受体诱导的信号转导。
24.权利要求23的复合物，其中所述化合物拮抗由所述三聚体通过所述受体诱导的信号传导。
25.权利要求24的复合物，其中与不存在所述化合物的情况下三聚体形式的TNF超家族成员的稳定性相比，所述化合物增加所述三聚体形式的TNF超家族成员的稳定性。
26.权利要求25的复合物，其中所述稳定性的增加导致所述三聚体形式的TNF超家族成员的热转换中点(Tm)增加至少1℃。
27.权利要求26的复合物，其中所述稳定性的增加导致所述三聚体形式的TNF超家族成员的热转换中点(Tm)增加至少10℃。
28.权利要求27的复合物，其中三聚体形式的TNF超家族成员的Tm的增加为10℃至20℃。
29.权利要求23至28中任一项的复合物，其中与不存在所述化合物的情况下TNF超家族成员与其受体的结合亲和力相比，所述化合物增加所述TNF超家族成员与必需受体的结合亲和力。
30.权利要求29的复合物，其中所述化合物通过相较于在不存在所述化合物的情况下TNF超家族成员与其受体结合的缔合速率(kon-r)和解离速率(koff-r)值增加缔合速率(kon-r)和/或降低解离速率(koff-r)来增加所述TNF超家族成员与必需受体的结合亲和力。
31.权利要求30的复合物，其中所述化合物通过相较于在不存在所述化合物的情况下TNF超家族成员与其受体结合的缔合速率(kon-r)值增加缔合速率(kon-r)来增加所述TNF超家族成员与必需受体的结合亲和力。
32.权利要求29至31中任一项的复合物，其中与不存在所述化合物的情况下TNF超家族成员对其受体的KD-r相比，所述化合物降低所述TNF超家族成员对必需受体的KD-r，其中：
a)与不存在所述化合物的情况下所述TNF超家族成员的KD-r相比，所述化合物降低所述TNF超家族成员对必需受体的KD-r至少10倍；
b)在所述化合物的存在下TNF超家族成员与必需受体结合的KD-r值小于10nM。
33.权利要求29至31中任一项的复合物，其中与不存在所述化合物的情况下TNF超家族成员对其受体的KD-r相比，所述化合物降低所述TNF超家族成员对必需受体的KD-r，其中：
a)与不存在所述化合物的情况下所述TNF超家族成员的KD-r相比，所述化合物降低所述TNF超家族成员对必需受体的KD-r至少4倍；
b)在所述化合物的存在下TNF超家族成员与必需受体结合的KD-r值小于600pM。
34.权利要求33的复合物，其中在所述化合物的存在下TNF超家族成员与必需受体结合的KD-r值小于200pM。
35.权利要求23至34中任一项的复合物，其中所述化合物具有500nM或更低的IC50值。
36.权利要求23至35中任一项的复合物，其中所述TNF超家族成员是TNFα，并且所述受体是TNF受体。
37.权利要求23至36中任一项所定义的复合物，其用于在人体或动物体上实施的治疗方法中。
38.权利要求37的复合物，其中所述化合物拮抗由所述三聚体通过所述受体诱导的信号传导，用于治疗和/或预防自身免疫性和炎症性疾病；神经和神经退行性疾病；疼痛和伤害性疾病；和心血管疾病。
39.权利要求38的复合物，其用于治疗和/或预防类风湿性关节炎，克罗恩氏病，牛皮癣，系统性红斑狼疮，阿尔茨海默病，帕金森病和癫痫症。
40.一种药物组合物，其包含权利要求23至36中任一项的复合物和药学上可接受的载体。
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