JP6781718B2 - モジュレータアッセイ - Google Patents

Description

本発明は、ＴＮＦスーパーファミリーのモジュレータに関する。特に、本発明は、ＴＮＦスーパーファミリーの新規低分子モジュレータに関する。本発明はまた、ＴＮＦスーパーファミリーの新規モジュレータを同定するためのアッセイにも関する。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーは、細胞生存及び細胞死を調節する主な機能を共有するタンパク質ファミリーである。ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーは、「ジェリーロール」β構造を形成する、逆平行β鎖を含む２つの逆平行βプリーツシートを含む、共通のコアモチーフを共有する。ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーにより共有される別の共通の特徴は、ホモ又はヘテロトリマー複合体の形成である。それは、特定のＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合し、活性化するＴＮＦスーパーファミリーメンバーのこれらのトリマー形態である。

ＴＮＦαは、ＴＮＦスーパーファミリーの典型的なメンバーである。ＴＮＦα産生の調節異常は、有意に医学的に重要ないくつかの病状に関与してきた。例えば、ＴＮＦαは、関節リウマチ、炎症性腸疾患（クローン病を含む）、乾癬、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、疼痛、てんかん、骨粗鬆症、喘息、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及び多発性硬化症（ＭＳ）に関与してきた。ＴＮＦスーパーファミリーの他のメンバーも、自己免疫疾患を含む病状に関与してきた。

ＴＮＦスーパーファミリーメンバーの従来のアンタゴニストは、大分子であり、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーの、その受容体に対する結合を阻害することによって作用する。従来のアンタゴニストの例としては、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））及びセルトリズマブペゴール（Ｃｉｍｚｉａ（登録商標））などの抗ＴＮＦα抗体、特に、モノクローナル抗体、又はエタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））などの可溶性ＴＮＦα受容体融合タンパク質が挙げられる。

本発明者らは、ＴＮＦαを調節する低分子実体（ＳＭＥ）のクラスを同定した。これらの化合物は、ホモトリマー形態のＴＮＦαに結合し、ＴＮＦαのホモトリマーのコンフォメーション変化を誘導し、安定化することによって作用する。例えば、ＴＮＦαと、結合した化合物とのホモトリマーは、ＴＮＦα受容体に結合することができるが、ＴＮＦα受容体の下流のシグナル伝達を開始することがほとんどできないか、又は開始することができない。これらの化合物を、ＴＮＦαによって媒介される状態の処置において使用することができる。本発明者らはまた、この様式でＴＮＦαを阻害することができる化合物を同定することができるアッセイを開発した。

したがって、本発明は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質に結合することができる化合物を同定するための方法であって、化合物−トリマー複合体は、必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合し、受容体のシグナル伝達を調節することができ、前記方法は、
ａ）試料中での化合物の、トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーへの結合を同定するステップ；及び／又は
ｂ）化合物を含む試料中でのトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーの安定性を測定するステップ；及び／又は
ｃ）化合物を含む試料中での必要な受容体に結合したトリマーＴＮＦスーパーファミリーメンバーのレベルを測定するステップ；及び／又は
ｄ）トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーへの結合に関する化合物とプローブ化合物との競合を測定するステップ
を含み、並びに、（ａ）における化合物の、トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーへの結合、及び／又は（ｂ）におけるトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーの安定性、及び／又は（ｃ）における必要な受容体に結合したトリマーＴＮＦスーパーファミリーメンバーのレベル、及び／又は（ｄ）で観察された競合のレベルを、対照試料に由来する対応する値と比較するステップ、及びＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質に結合することができる化合物を選択するステップであって、化合物−トリマー複合体は、必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合し、受容体のシグナル伝達を調節する、ステップ
を含む、上記方法を提供する。

したがって、本発明の方法を使用して、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質に結合することができ、それによって、化合物−トリマー複合体が、必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合し、受容体を介してトリマーによって誘導されるシグナル伝達を調節する化合物を同定することができる。換言すれば、本発明による化合物−トリマー複合体は、受容体のシグナル伝達を調節する。

本発明はまた、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質と、それに結合する化合物とを含む（又はからなる）複合体であって、それによって、化合物−トリマー複合体が、必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合し、受容体のシグナル伝達を調節する、上記複合体も提供する。

本発明はまた、ヒト又は動物の身体に対して実行される治療方法における使用のための、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーと、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質に結合することができ、それによって、化合物−トリマー複合体が、必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合し、受容体のシグナル伝達を調節する化合物とを含む複合体も提供する。

本発明はまた、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質に結合することができ、それによって、化合物−トリマー複合体が、必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合し、受容体のシグナル伝達を調節する化合物と、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質との複合体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も提供する。

式（１）の化合物及び式（２）の化合物の構造を示す。 式（３）の化合物及び式（４）の化合物の構造を示す。 ＴＮＦ受容体へのＴＮＦαの結合に影響を与える試験化合物のスクリーニング（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙアッセイ、ＭＳＤ）の結果を示す。複数の試験化合物を調査し、ＴＮＦ受容体へのＴＮＦαの結合に対する阻害％レベルを計算した。 前記アッセイを使用した、式（１）の化合物についての用量応答曲線を示す。 式（２）の化合物についての用量応答曲線を示す。 式（１）の化合物の存在下における、ＴＮＦＲ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）へのＴＮＦの結合の増強を実証する受容体−リガンド結合アッセイを示す。 同じアッセイにおける式（２）の化合物により誘導された結合の増強を示す。 （下部トレース）は、１００％水溶液中のＴＮＦαのデコンボリューションされた質量スペクトル画像を示す。図５（上部トレース）は、１０％ｖ／ｖ ＤＭＳＯを含有する溶液中のＴＮＦαのデコンボリューションされた質量スペクトル画像を示す。図５（中部トレース）は、１０％ｖ／ｖ ＤＭＳＯ及び式（１）の化合物を含有する溶液中のＴＮＦαのデコンボリューションされた質量スペクトル画像を示す。 式（１）の化合物を含有する溶液中のＴＮＦαの質量スペクトル画像を示す。 式（１）の化合物とプレインキュベートし、次いで、ＴＮＦ−Ｒと混合したＴＮＦα試料の、サイズ排除クロマトグラフィー実験及びそれに続く質量分析解析の溶出プロファイルの重ね合わせを示す。 ＴＮＦ−Ｒとプレインキュベートし、次いで、式（１）の化合物と混合したＴＮＦα試料の、サイズ排除クロマトグラフィー実験及びそれに続く質量分析解析の溶出プロファイルの重ね合わせを示す。 ＴＮＦ−ＲへのＴＮＦαの結合の等温熱量解析の結果を示す。 ＴＮＦ−Ｒへの、式（２）の化合物とプレインキュベートしたＴＮＦαの結合の等温熱量解析の結果を示す。 式（１）の化合物−トリマーＴＮＦα複合体の結晶構造を示す。 Ｌ９２９マウス線維肉腫細胞殺傷アッセイを使用して測定される残余のヒトＴＮＦα濃度（ｐｇ／ｍｌ）に対する式（１）の化合物及び式（２）の化合物の濃度で測定するときの、式（１）（△）の化合物及び式（２）（◇）の化合物によるヒトＴＮＦαの中和のグラフを示す。 ＴＮＦα処理されたヒト単球における相対ＩＬ−８産生％に対する式（１）の化合物の濃度（ｎＭ）のグラフを示す。 ＨＥＫ２９３細胞におけるＴＮＦα（０．５ｎｇ／ｍＬ）の存在下でのＮＦ−κＢ活性化の阻害％に対する式（２）の化合物の濃度（ｎＭ）のグラフを示す。 ＨＥＫ２９３細胞におけるＩＬ−１β（０．５ｎｇ／ｍＬ）の存在下でのＮＦ−κＢ活性化の阻害％に対する式（２）の化合物の濃度（ｎＭ）のグラフを示す。 ＨＥＫ２９３細胞における活性化ＴＮＦ−Ｒ１抗体（３００ｎｇ／ｍＬ）の存在下でのＮＦ−κＢ活性化の阻害％に対する式（２）の化合物の濃度（ｎＭ）のグラフを示す。 表面プラズモン共鳴を使用して測定される経時的な式（１）の化合物とＴＮＦαとの結合動態を示す。 式（２）の化合物とＴＮＦαとの結合動態を示す。 式（３）の化合物とＴＮＦαとの結合動態を示す。 ＴＮＦα単独、又は増大濃度の式（１）の化合物と共にプレインキュベートしたＴＮＦαの、腹腔内注入（ｉｐ．）による投与に対して応答した好中球動員のレベルを示す。 ＴＮＦα単独、又は増大濃度の式（２）の化合物と共にプレインキュベートしたＴＮＦαの、腹腔内注入（ｉｐ．）による投与に対して応答した好中球動員のレベルを示す。 単独の、又は増大濃度の式（１）の化合物の存在下におけるＴＮＦαの、経口投与に対して応答した好中球動員のレベルを示す。 式（１）、（２）及び（３）の試験化合物を使用した蛍光偏光（ＦＰ）アッセイの結果のグラフである。試験化合物の濃度が、ＴＮＦαへの式（４）の化合物の結合の阻害％に対してプロットされている。 （下部トレース）は、１００％水溶液中のＣＤ４０Ｌの質量スペクトル画像を示す。図１７（中部トレース）は、１０％ｖ／ｖジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する溶液中のＣＤ４０Ｌの質量スペクトル画像を示す。図１７（上部トレース）は、１０％ｖ／ｖＤＭＳＯ及び式（１）の化合物を含有する溶液中のＣＤ４０Ｌの質量スペクトル画像を示す。

配列表の簡単な説明
配列番号１は、Ｃ１８５＿０１９７４．０のＨＣＶＲを示す。
配列番号２は、Ｃ１８５＿０１９７４．０のＬＣＶＲを示す。
配列番号３は、Ｃ１８５＿０１９７４．０のｍＩｇＧ１重鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、Ｃ１８５＿０１９７４．０のカッパ軽鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、Ｃ１８５＿０１９７９．０のＨＣＶＲを示す。
配列番号６は、Ｃ１８５＿０１９７９．０のＬＣＶＲを示す。
配列番号７は、Ｃ１８５＿０１９７９．０のｍＩｇＧ１重鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、Ｃ１８５＿０１９７９．０のカッパ軽鎖のアミノ酸配列を示す。

ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのモジュレータを同定するためのアッセイ
本発明者らは、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのモジュレータを同定するためのアッセイを開発した。ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのモジュレータは、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのアゴニスト及びアンタゴニストを含んでもよい。ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのモジュレータは、１又は複数のＴＮＦスーパーファミリーメンバーのアンタゴニストであってもよい。或いは、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのモジュレータは、１又は複数のＴＮＦスーパーファミリーメンバーのアゴニストであってもよい。具体的には、本発明者らは、トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合し、必要なＴＮＦ受容体に結合することができ、前記受容体を介するシグナル伝達を調節するコンフォメーションにこれらのトリマーを安定化する化合物を同定するために使用することができるアッセイを開発した。したがって、本発明は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのモジュレータを同定するのに有用であるアッセイを提供する。

特に、本明細書に記載のアッセイを使用して、トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合し、必要なＴＮＦファミリー受容体に結合する化合物−トリマー複合体を形成する化合物を同定することができる。

好ましい実施形態では、本発明のアッセイは、トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合するが、モノマー形態には結合しない化合物を同定する。特に好ましい実施形態では、化合物は、トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合し、これを安定化し、モノマー形態に結合せず、ダイマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーを安定化しない。試験化合物によるＴＮＦスーパーファミリートリマーの安定化は、トリマー間のモノマー単位の交換を阻害する試験化合物によって生じてもよい。

本発明のアッセイは、試験化合物がＴＮＦスーパーファミリーメンバーのその受容体に対する結合を増強するかどうかを決定することを含んでもよく、したがって、ＴＮＦスーパーファミリーモジュレータを同定する。好ましい実施形態では、本発明のアッセイは、試験化合物がＴＮＦスーパーファミリーメンバーの、その受容体への結合を増強するかどうかを決定することを含んでもよく、したがって、シグナル伝達が減少した、又はシグナル伝達がない形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーの、その受容体への結合を増加させることによって作用するＴＮＦスーパーファミリーアンタゴニストを同定する。

本発明によるＴＮＦスーパーファミリーモジュレータを同定するためのアッセイは、例えば、ＤＭＳＯの存在下で、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのトリマーの形成を不安定化する条件下で目的のＴＮＦスーパーファミリーメンバーの試料をインキュベートすること、及び試験化合物がＴＮＦスーパーファミリーメンバートリマーの形成を安定化する程度を測定することを含んでもよい。或いは、本発明によるＴＮＦスーパーファミリーモジュレータを同定するためのアッセイは、ＴＮＦスーパーファミリーのトリマーを試験化合物に結合させること、及び化合物−トリマー複合体の、必要なＴＮＦ受容体への結合の程度を測定することを含んでもよい。

ＴＮＦスーパーファミリーメンバー及びその受容体は精製されるか、又は培養細胞、組織試料、体液若しくは培養培地中などの混合物中に存在することができる。定性的又は定量的であるアッセイを開発することができ、後者は試験化合物のトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに対する結合パラメータ（親和性定数及び動力学）、及びまた、化合物−トリマー複合体の、必要なＴＮＦ受容体結合パラメータを決定するのに有用である。

モノマー、ダイマー及びトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーの量を、モノマー、ダイマー及びトリマー形態の質量、モノマー、ダイマー及びトリマー形態のモル量、モノマー、ダイマー及びトリマー形態の濃度、並びにモノマー、ダイマー及びトリマー形態のモル濃度を測定することによって決定することができる。この量を、任意の適切な単位で与えることができる。例えば、モノマー、ダイマー及びトリマー形態の濃度を、ｐｇ／ｍｌ、ｎｇ／ｍｌ又はμｇ／ｍｌで与えることができる。モノマー、ダイマー及びトリマー形態の質量を、ｐｇ、ｎｇ又はμｇで与えることができる。

目的の試料中のモノマー、ダイマー又はトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーの量を、本明細書に記載のような対照試料などの別の試料中のモノマー、ダイマー又はトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーのレベルと比較することができる。そのような方法では、試料中のモノマー、ダイマー又はトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーの質量、モル量、濃度又はモル濃度などの、モノマー、ダイマー又はトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーの実際の量を評価することができる。モノマー、ダイマー又はトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーの量を、モノマー、ダイマー又はトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーの質量、モル量、濃度又はモル濃度を定量することなく、別の試料中でのそれと比較することができる。したがって、本発明による試料中のモノマー、ダイマー又はトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーの量を、２つ以上の試料間の比較に基づいて、モノマー、ダイマー又はトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーの相対質量、相対モル量、相対濃度又は相対モル濃度などの、相対量として評価することができる。

本発明では、化合物のライブラリーをスクリーニングして、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのモジュレータを同定することができる（すなわち、本明細書に開示されるアッセイを使用する）。そのようなライブラリーは、典型的には、少なくとも２６０種の化合物を含む。好ましくは、そのようなライブラリーは、少なくとも３００種、少なくとも５００種又はさらには少なくとも１０００種の化合物を含む。

質量分析に基づくアッセイ
本発明者らは、質量分析を使用して、トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合し、これらのトリマーを、必要なＴＮＦ受容体に結合することができるコンフォメーションで安定化する化合物を同定することができることを見出した。

特に、質量分析を使用して、化合物がトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーを安定化するかどうかを評価することができる。

したがって、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質に結合することができ、それによって、化合物−トリマー複合体が必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合し、受容体のシグナル伝達を調節するためのアッセイであって、試料中での試験化合物のトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに対する結合を同定するステップと、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー及び化合物を含有する試料上で質量分析を行って、ＴＮＦスーパーファミリーメンバートリマーの量を検出することと、試料中のＴＮＦスーパーファミリーメンバートリマーの量と、対照試料とを比較することとを含む、化合物のトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに対する結合を、対照試料に由来する対応する値と比較するステップと、トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合することができ、それによって、化合物−トリマー複合体が必要なＴＮＦ受容体に結合し、受容体のシグナル伝達を調節する化合物を選択するステップとを含む、上記アッセイを提供する。対照試料は、それが試験化合物を欠くことを除いて、アッセイされる試料と同一であってもよい。ＴＮＦスーパーファミリーメンバー及び化合物を含む試料は、不安定化剤をさらに含んでもよい。

本発明では、試験化合物を、不安定化剤の存在下でＴＮＦスーパーファミリーメンバーの溶液に添加することができる。カオトロピックとしても知られる不安定化剤は、低モル濃度（例えば、１Ｍ）の尿素、グアニジン又はアセトニトリル、高濃度（例えば、６Ｍ以上）のこれらの試薬を含み、ＴＮＦαトリマーの完全な解離及び構成するＴＮＦαモノマーサブユニットのアンフォールディングをもたらす。不安定化剤は、好ましくは、ＤＭＳＯであり、典型的には、５％、１０％以上の濃度である。得られる溶液を、質量分析を使用して分析することができる。

１ｍＭ程度の結合親和性でＴＮＦスーパーファミリーメンバーと試験化合物との間で形成された非共有複合体を検出することができる。試験化合物の複数の分子が結合する複合体の存在又は非存在から直接、結合化学量論を取得することができる。結合親和性（Ｋ_Ｄ値）を、既知の試験化合物濃度でＴＮＦスーパーファミリーメンバー−試験化合物複合体（化合物−トリマー複合体）／ＴＮＦスーパーファミリーメンバー濃度の比を測定することによって決定することができる。

試験化合物は、それが、試験化合物の非存在下でＴＮＦスーパーファミリーメンバー及び不安定化剤を含有する試料について観察されるトリマーの量と比較した、トリマーの割合を増加させる場合、トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーを安定化する。試験化合物は、試験化合物の非存在下でＴＮＦスーパーファミリーメンバー及び不安定化剤を含有する試料中に存在するトリマーの量と比較して、トリマーの量を１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％以上増加させてもよい。

試験化合物はまた、不安定化剤と試験化合物の両方の非存在下でＴＮＦスーパーファミリーメンバーの試料について観察されるものと比較してトリマーの量を増加させてもよい。試験化合物は、不安定化剤と試験化合物の両方の非存在下でＴＮＦスーパーファミリーメンバーを含有する試料中に存在するトリマーの量と比較して、トリマーの量を１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％以上増加させてもよい。

トリマーの安定化は、質量分析研究において２つの方法で証明される。

第１に、質量スペクトル中に観察されるモノマーとトリマーの比によって測定することができる、ＴＮＦαトリマー複合体の物理的解離が存在する。ダイマー種は、本発明者らの研究では観察されていない。この解離は、分子を質量分析計に導入するために使用される高エネルギープロセスの人工物であってもよい。それにも拘わらず、それを使用して、試験化合物が、噴霧及びイオン化プロセス中にトリマー複合体を安定化し、それによって、質量スペクトル中に観察されるモノマーの量、安定化の程度を決定するために使用されるモノマー／トリマー比を減少させる能力を評価することができる。

第２に、ソフトイオン化条件下では、少ないエネルギーがトリマー複合体に与えられ、質量分析計に対するその無傷での移行をもたらし、それにより、真の溶液組成をより密接に反映する。陽性イオン化モードでは、ある特定のアミノ酸内の塩基性官能基は正電荷を獲得するため、電子スプレーイオン化プロセスは、タンパク質の複数の帯電をもたらす。質量分析計は質量／電荷比を測定する。したがって、例えば、名目上５２，０００ＤａのＴＮＦαトリマーは、それが１０個の電荷を担持している場合、５，２００のｍ／ｚ比に出現する。それは、マルチマータンパク質複合体の研究において使用される限界質量範囲を有する分光計を可能にするこの複数帯電効果である。分光計に同梱されているソフトウェアにより、ユーザーはデータを解析して、それが単一の電荷のみを担持することであった場合に出現する時にタンパク質の質量を得ることができる（すなわち、その原子組成に基づくその真の分子量）。

多くのアミノ酸がコア中に埋没し、わずかなパーセンテージが表面上に露出した折り畳まれたタンパク質では、典型的には、６〜８個の正電荷が獲得される。一方の単一の荷電した種は優位でなく、いくつかの種（イオン）は小さい範囲内に観察されることが多く、これらのものは電荷状態エンベロープとして知られるものを含む。タンパク質が全体として変性し（すなわち、アンフォールディングされる）、次いで、多くのさらなるアミノ酸が露出し、獲得される電荷の典型数が２０に達し得る場合、電荷状態エンベロープはまた、統計的には、電荷を受け入れるより多くの利用可能な部位が現在存在するため、より多数の荷電した種を含む。したがって、電荷の数及び電荷状態エンベロープを含む荷電した種の数は、タンパク質フォールディングの程度に関する高感度のリードアウトである。さらに、折り畳まれたタンパク質が、表面に露出したアミノ酸の相対数が異なる複数のコンフォメーションで存在することができる場合、電荷状態エンベロープのシフトはこれらの差異を反映するであろう。

ソフトナノ電子スプレーイオン化条件下では、無傷の折り畳まれたＴＮＦαタンパク質の質量分析研究は、ほぼ１００％のＴＮＦαトリマーが検出され、非常に少ないＴＮＦαモノマーが検出されるが、ダイマー種は完全に存在しないことを示す。

より厳しいイオン化条件下では、又は不安定化剤がＴＮＦα試料に添加される場合、トリマーのレベルの同時的低下と共に、モノマーＴＮＦαレベルの増加が観察される。ほんの少量のダイマーが観察される。

質量分析を使用して、試験化合物がモノマー、ダイマー及びトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合するかどうかを決定することもできる。

質量分析を使用して、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーを含む試験化合物の化学量論、すなわち、どれほど多くの試験化合物分子がＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合するかを決定することもできる。

質量分析を使用して、化合物−ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのトリマー複合体が、必要なＴＮＦ受容体に結合するかどうかを決定することもできる。

質量分析を使用して、試験化合物がＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合する速度（「結合」速度、ｋ_ｏｎ−ｃ）及び試験化合物がＴＮＦスーパーファミリーメンバーから解離する速度（「解離」速度又はｋ_{ｏｆｆ−ｃ}）を測定することもできる。本明細書で使用される記号「Ｋ_Ｄ−ｃ」は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーに対する試験化合物の結合親和性（解離定数）を示す。Ｋ_Ｄ−ｃは、ｋ_{ｏｆｆ−ｃ}／ｋ_ｏｎ−ｃと定義される。試験化合物は、遅い「結合」速度を有してもよく、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー及び化合物−トリマー複合体ピーク強度の質量分析によって分で測定することができる。試験化合物に関するＫ_Ｄ−ｃ値を、異なるＴＮＦスーパーファミリーメンバー：化合物−トリマー複合体比でこの測定を繰り返すことによって見積もることができる。好ましい実施形態では、本発明の化合物の、ＴＮＦスーパーファミリーのトリマーへの結合は、理想的には約１０^７Ｍ^−１ｓ^−１の速い「結合」速度と共に、遅い「解離」速度、例えば、典型的には、１０^−３ｓ^−１、１０^−４ｓ^−１の値、又は測定可能な「解離」速度がないことを特徴とする。

質量分析を使用して、試験化合物が、必要な受容体の存在下でＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合するかどうかを決定することもできる。これは、試験化合物を、その受容体と共に予めインキュベートしたＴＮＦスーパーファミリーメンバーと共にインキュベートすることを含んでもよい。次いで、試験化合物を含有する試料、並びに予めインキュベートしたＴＮＦスーパーファミリーメンバー及び受容体を分画して、例えば、分析的ゲル濾過によって、その分子サイズに応じて分子を分離することができる。得られる画分を、質量分析を使用して分析して、試験化合物が必要な受容体の存在下でＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合するかどうかを決定することができる。化合物は、それがＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合する場合、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーと同じ画分中に溶出する。化合物は、それがＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合しない場合、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーとは異なる画分中に溶出する。この場合、化合物は、典型的には、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーより後のゲル濾過画分中に溶出する。

質量分析法としては、例えば、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ ＭＳ）、表面増強レーザー脱離／イオン化質量分析（ＳＥＬＤＩ ＭＳ）、飛行時間質量分析（ＴＯＦ ＭＳ）及び液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ ＭＳ）が挙げられる。

受容体−リガンド結合アッセイ
従来のＴＮＦスーパーファミリーアンタゴニストは、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのその受容体に対する結合を阻害することによって作用する。本発明者らは、受容体−リガンド結合アッセイを使用して、試験化合物が本発明のＴＮＦスーパーファミリーメンバーの、その受容体に対する結合を増強するかどうかを決定した。したがって、そのような受容体−リガンド結合アッセイを使用して、シグナル伝達が減少した、又はシグナル伝達がない形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーの、その受容体への結合を増加させることによって作用するＴＮＦスーパーファミリーアンタゴニストを同定することができる。したがって、受容体−リガンド結合アッセイを使用して、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーの、その受容体への結合を増加させることによって作用し、ＴＮＦスーパーファミリー受容体によるシグナル伝達を増強するアゴニストを同定することもできる。

したがって、本発明は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質に結合することができ、それによって、化合物−トリマー複合体が、必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合し、受容体のシグナル伝達を調節する化合物を同定するためのアッセイであって、試験化合物を含む試料中の必要な受容体に結合したトリマーＴＮＦスーパーファミリーメンバーのレベルを測定するステップ及び必要な受容体に結合したトリマーＴＮＦスーパーファミリーメンバーのレベルと、対照試料に由来する対応する値とを比較するステップを含み、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー及び化合物の試料を、表面に結合した必要なＴＮＦ受容体に加える受容体−リガンド結合アッセイを実行するステップ、及び必要なＴＮＦ受容体に結合したＴＮＦスーパーファミリーのトリマーの量と、対照試料とを比較するステップ、及びトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合することができる化合物を選択するステップであって、化合物−トリマー複合体が、必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合し、受容体のシグナル伝達を調節する、ステップを含む、上記アッセイを提供する。対照試料は、それが試験化合物を欠くこと、及び／又はそれが既知の化合物を含有することを除いて、アッセイされる試料と同一であってもよい。ＴＮＦスーパーファミリーメンバー及び化合物を含む試料は、不安定化剤をさらに含んでもよい。

試験化合物を、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー及び不安定化剤を含む溶液に添加することができる。不安定化剤のみの存在下でのＴＮＦスーパーファミリー受容体の結合のレベル（対照試料中）を、不安定化剤及び試験化合物の存在下でのＴＮＦスーパーファミリーメンバーのその受容体に対する結合のレベルと比較することができる。試験化合物は、それが試験化合物の非存在下でＴＮＦスーパーファミリーメンバー及び不安定化剤を含有する試料について観察されるＴＮＦスーパーファミリーメンバーのその受容体に対する結合のレベルと比較して、その受容体に結合したＴＮＦスーパーファミリーメンバーの割合を増加させる場合、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのその受容体に対する結合を増強する。

試験化合物は、試験化合物の非存在下でのＴＮＦスーパーファミリーメンバーを含有する試料中のその受容体に結合したＴＮＦスーパーファミリーメンバーの量と比較して、その受容体に結合したＴＮＦスーパーファミリーメンバーの量を、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％以上増加させることができる。

本発明の受容体−リガンド結合アッセイは、典型的には、支持体に結合したＴＮＦスーパーファミリー受容体を必要とする。ＴＮＦスーパーファミリー受容体を、支持体に直接的に、又はアビジン若しくはストレプトアビジンなどのリンカー分子を使用して間接的に結合させることができる。次いで、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのその受容体に対する結合のレベルを、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーの溶液を不安定化剤と共に添加することによってアッセイすることができる。カオトロピックとしても知られる不安定化剤は、低モル濃度（例えば、１Ｍ）の尿素、グアニジン又はアセトニトリル、高濃度（例えば、６Ｍ以上）のこれらの試薬を含み、ＴＮＦαトリマーの完全な解離及び構成するＴＮＦαモノマーサブユニットのアンフォールディングをもたらす。不安定化剤は、好ましくは、ＤＭＳＯであり、典型的には、５％、１０％以上の濃度である。

ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのその受容体に対する結合は、典型的には、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーに特異的であり、マーカーに結合する抗体を使用して決定される。マーカーは、検出することができる任意の分子であってもよい。例えば、マーカーは、放射性同位体（例えば、^１２５Ｉ、^３２Ｐ、^３５Ｓ及び^３Ｈ）、蛍光染料（例えば、フルオレセイン、ローダミン）、酵素コンジュゲートなどであってよい。酵素のための基質を使用して、表面結合した受容体に結合したＴＮＦスーパーファミリーメンバーの量を定量する。他のマーカーとしては、電気などのある特定の刺激に対する曝露に際して光を産生するように活性化することができる分子標識が挙げられる。マーカーの選択は、使用される検出系に依存する。

受容体−リガンド結合アッセイを、細胞に基づく結合アッセイ、溶液相アッセイ及びイムノアッセイなどのいくつかの形式で実行することができる。受容体−リガンド結合反応のための固体支持体は、好ましくは、ウェルを含有する。一般的には、試験化合物−トリマー複合体を、特定の期間にわたって必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体と共にインキュベートした後、受容体に結合する化合物−トリマー複合体の量を測定する。結合した化合物−トリマー複合体のレベルを、顕微鏡、蛍光計、シンチレーションカウンター、又は任意の利用可能なイムノアッセイを使用してマーカーを測定することによって算出することができる。

本明細書で使用される記号「ｋ_ｏｎ−ｒ」は、化合物−トリマー複合体がＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合する速度（「結合」速度）を指す。本明細書で使用される記号「ｋ_{ｏｆｆ−ｒ}」は、化合物−トリマー複合体がＴＮＦスーパーファミリー受容体から解離する速度（「解離」速度）を指す。本明細書で使用される記号「Ｋ_Ｄ−ｒ」は、化合物−トリマー複合体の、スーパーファミリー受容体に対する結合親和性（解離定数）を指す。Ｋ_Ｄ−ｒは、ｋ_{ｏｆｆ−ｒ}／ｋ_ｏｎ−ｒと定義される。

受容体−リガンド結合アッセイを使用して、本発明の化合物−トリマー複合体の必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体に対する結合親和性を測定することができる。特に、競合アッセイを使用して、必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体に対する本発明の化合物−トリマー複合体のｋ_ｏｎ−ｒ及びｋ_{ｏｆｆ−ｒ}値と、試験化合物の非存在下でのその受容体に結合するＴＮＦスーパーファミリーメンバーのｋ_ｏｎ−ｒ及びｋ_{ｏｆｆ−ｒ}値とを比較し、本発明の化合物−トリマー複合体の必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体に対する結合に関するＫ_Ｄ−ｒ値を決定することができる。

安定性アッセイ
本発明者らは、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーの安定性に対する試験化合物の効果を決定するための方法を開発した。したがって、本発明は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質に結合することができる化合物を同定するためのアッセイであって、それにより、化合物−トリマー複合体が必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合し、受容体のシグナル伝達を調節し、化合物を含む試料中でのトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーの安定性を測定するステップと、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー及び化合物の試料中のトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＴｍを決定するためのアッセイを実施すること、トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＴｍと対照試料とを比較することを含む、トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーの安定性を、対照試料に由来する対応する値と比較するステップと、トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合することができ、それによって、化合物−トリマー複合体が必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合し、受容体のシグナル伝達を調節する化合物を選択するステップとを含む、上記アッセイを提供する。対照試料は、それが試験化合物を欠くこと、及び／又はそれが既知の化合物を含有することを除いて、アッセイされる試料と同一であってもよい。ＴＮＦスーパーファミリーメンバー及び化合物を含む試料は、不安定化剤をさらに含んでもよい。

試験化合物を、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー及び不安定化剤を含む溶液に添加することができる。不安定化剤のみの存在下でのトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーの安定性（対照試料中）を、不安定化剤及び試験化合物の存在下でのトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーの安定性と比較することができる。試験化合物は、それが試験化合物の非存在下でＴＮＦスーパーファミリーメンバー及び不安定化剤を含有する試料について観察されるトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＴ_ｍと比較して、トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーの温度遷移中点（Ｔ_ｍ）を増大させる場合、トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーの安定性を増強する。トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＴ_ｍは、生物分子の５０％がアンフォールディングされる温度である。試験化合物の存在下及び／又は非存在下でのトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＴ_ｍを、当業界で公知の任意の好適な技術を使用して、例えば、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）又は蛍光プローブ熱変性アッセイを使用して測定することができる。

試験化合物は、試験化合物の非存在下、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーを含有する試料中でのトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＴ_ｍと比較して、トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＴ_ｍを少なくとも１℃、少なくとも２℃、少なくとも５℃、少なくとも１０℃、少なくとも１５℃、少なくとも２０℃以上増加させることができる。好ましくは、試験化合物は、トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＴ_ｍを、少なくとも１℃、より好ましくは少なくとも１０℃、さらにより好ましくは１０℃〜２０℃増加させる。

カオトロピックとしても知られる不安定化剤は、低モル濃度（例えば、１Ｍ）の尿素、グアニジン又はアセトニトリル、高濃度（例えば、６Ｍ以上）のこれらの試薬を含み、ＴＮＦαトリマーの完全な解離及び構成するＴＮＦαモノマーサブユニットのアンフォールディングをもたらす。不安定化剤は、好ましくは、ＤＭＳＯであり、典型的には、５％、１０％以上の濃度である。

等温熱量測定アッセイ
本発明者らは、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのその受容体に対する結合親和性に対する試験化合物の効果を決定するための等温熱量測定法を開発した。

したがって、本発明は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質に結合することができ、それによって、化合物−トリマー複合体が、必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合し、受容体のシグナル伝達を調節する化合物を同定するためのアッセイであって、化合物を含む試料中の必要な受容体に結合したトリマーＴＮＦスーパーファミリーメンバーのレベルを測定するステップ及び必要な受容体に結合したトリマーＴＮＦスーパーファミリーメンバーのレベルと、対照試料に由来する対応する値とを比較するステップを含み、等温熱量測定分析を実行して、化合物の存在下でのＴＮＦスーパーファミリーメンバーの必要な受容体に対する結合親和性を測定するステップ；及びＴＮＦスーパーファミリーメンバーの、必要な受容体に対する結合親和性と、対照試料とを比較するステップ及びＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質に結合することができる化合物を選択するステップであって、化合物−トリマー複合体が、必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合し、受容体のシグナル伝達を調節する、ステップを含む、上記アッセイを提供する。対照試料は、それが試験化合物を含まない、及び／又はそれが既知の化合物を含有することを除いて、アッセイされる試料と同一であってもよい。

ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのアリコートを、必要なＴＮＦ受容体の容器に連続的に添加することができる。アリコートの容量は、任意の適切な範囲にあってもよい。アリコートは、０．１μｌ〜１０μｌなどの任意の適切な容量のものであってもよい。好ましい実施形態では、アリコートは、０．５μｌ、１．０μｌ、又は３．０μｌの容量であってもよい。シリンジ容量に応じて、より大きい容量を使用することが可能である。

ＴＮＦスーパーファミリーメンバーの各添加は、ＴＮＦスーパーファミリートリマーが受容体に結合する時に少量の熱の放出又は吸収をもたらす。典型的には、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーの各添加は、ＴＮＦスーパーファミリートリマーが受容体に結合する時に少量の熱の放出をもたらす。熱放出の量を、等温熱量測定を使用して測定し、この情報を使用して、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーとその受容体との結合親和性を取得することができる。

このプロセスを、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーと試験化合物を含む溶液の、ＴＮＦスーパーファミリー受容体の容器への連続的添加を使用して繰り返すことができる。好ましくは、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー及び試験化合物は、化合物−トリマー複合体の形態にある。再度、熱放出の量を、等温熱量測定を使用して測定し、この情報を使用して、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーとその受容体との結合親和性を取得することができる。

ＴＮＦスーパーファミリーメンバー及び化合物−トリマー複合体の結合親和性を比較して、化合物がＴＮＦスーパーファミリーメンバーのその受容体に対する結合親和性を増加させるかどうかを決定することができる。

試験化合物は、試験化合物の非存在下でのＴＮＦスーパーファミリーメンバーのその受容体に対する結合親和性と比較して、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのその受容体に対する結合親和性を２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍以上増加させることができる。

結合親和性を、結合親和性（Ｋ_Ｄ−ｒ）を単位として与えることができ、μＭ、ｎＭ又はｐＭなどの任意の適切な単位で与えることができる。Ｋ_Ｄ−ｒ値が小さいほど、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのその受容体に対する結合親和性が大きい。

試験化合物の存在下でのその受容体に対する結合に関するＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＫ_Ｄ−ｒ値は、試験化合物の非存在下でのその受容体に対する結合に関するＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＫ_Ｄ−ｒ値の少なくとも１．５分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１、２０分の１、３０分の１、４０分の１、５０分の１、６０分の１、７０分の１、８０分の１、９０分の１、１００分の１でもよい。

試験化合物の存在下でのその受容体に対する結合に関するＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＫ_Ｄ−ｒ値は、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭ以下であってもよい。好ましい実施形態では、試験化合物の存在下でのその受容体に対する結合に関するＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＫ_Ｄ−ｒ値は、１ｎＭ以下である。

競合アッセイ
本発明者らは、試験化合物がトリマーＴＮＦスーパーファミリーメンバーに対する結合についてプローブ化合物と競合する能力を調査することによって、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質に結合することができ、それによって、化合物−トリマー複合体が必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合し、受容体のシグナル伝達を調節する化合物を同定するための方法を開発した。したがって、本発明は、トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに対する結合について、試験化合物と、プローブ化合物との競合を測定することと、それにより観察された競合のレベルを対照試料に由来する対応する値と比較することと、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質に結合することができ、それによって、化合物−トリマー複合体が必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合し、受容体のシグナル伝達を調節する化合物を選択することとを含むアッセイを提供する。

プローブ化合物は、放射標識された本発明による化合物を含んでもよい。本発明のプローブ中で使用することができる放射性核としては、トリチウム（^３Ｈ）、^１４Ｃ、^１８Ｆ、^２２Ｎａ、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^３５Ｓ、^３６Ｃｌ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ及び^９９ｍＴｃが挙げられる。

特に、競合アッセイは、蛍光偏光度が蛍光分子の回転緩和時間、したがって、分子サイズと関連する蛍光偏光（ＦＰ）アッセイであってもよい。大きい分子は、小さい分子よりも高い偏光度を示す。したがって、ＦＰアッセイを使用して、小さい蛍光リガンド又はプローブと、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーなどのより大きなタンパク質との相互作用を測定することができる。偏光度は、蛍光リガンドの結合／遊離比の直接的尺度を提供する。

本発明は、したがって、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質に結合することができ、それによって、化合物−トリマー複合体が必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合し、受容体のシグナル伝達を調節する化合物を同定するための方法であって、トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに対する結合について、化合物とプローブ化合物との競合を測定するステップ、観察された競合のレベルを、対照試料に由来する対応する値と比較するステップ、及びＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質に結合することができ、それによって、化合物−トリマー複合体が必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合し、受容体のシグナル伝達を調節する化合物を選択するステップを含み、化合物及びプローブ化合物を使用して蛍光偏光アッセイを実施すること、化合物の存在下でのプローブ化合物の偏光度と、対照試料中での偏光度とを比較することを含む、上記方法を提供する。

試験化合物がプローブ又はリガンドと競合する能力を、半数最大阻害濃度（ＩＣ_５０）などの標準的な用語を使用して定量することができる。この文脈では、ＩＣ_５０値は、プローブのトリマーＴＮＦスーパーファミリーメンバーに対する結合の５０％の阻害をもたらすのに必要とされる化合物の濃度を表す。試験化合物は、５００ｎＭ、４００ｎＭ、３００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ以下のＩＣ_５０値を有してもよい。好ましくは、試験化合物は、２００ｎＭ以下のＩＣ_５０値を有する。より好ましくは、試験化合物は、１５０ｎＭ以下のＩＣ_５０値又は１００ｎＭ以下のＩＣ_５０値を有する。

上記のように、本発明では、化合物のライブラリーを、典型的には、１又は複数の本明細書に記載のアッセイにかけて、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのモジュレータを同定する。少なくとも２６０種の化合物、少なくとも３００種、少なくとも５００種又はさらには少なくとも１０００種の化合物を含んでもよいそのようなライブラリーを、蛍光偏光を使用してスクリーニングすることができる。

化合物のライブラリーを、蛍光偏光を使用してアッセイする場合、方法は、化合物が特定のＩＣ_５０値をもたらす場合に、化合物をＴＮＦスーパーファミリーメンバーのモジュレータとして選択することを含んでもよい。例えば、化合物が５０μＭ未満のＩＣ_５０値をもたらす場合、化合物をＴＮＦスーパーファミリーメンバーのモジュレータと同定することができる。一部の態様では、化合物が５００ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、又はさらには１００ｎＭ未満のＩＣ_５０値をもたらす場合、それらが同定される。

ライブラリーに由来する化合物が試験されるライブラリーの全ての化合物のうちで最も低いＩＣ_５０値を有する場合、それをＴＮＦスーパーファミリーメンバーのモジュレータと同定することもできる。同様に、化合物がライブラリーの他の化合物と比較して低いＩＣ_５０値（すなわち、より良好なＩＣ_５０値）を有する場合、それをＴＮＦスーパーファミリーメンバーのモジュレータと同定することができる。例えば、最も低いＩＣ_５０値をもたらすライブラリーの化合物の５０％を、モジュレータと同定することができる。一部の態様では、最も低いＩＣ_５０値をもたらすライブラリーの化合物の２５％又はさらには１０％を、モジュレータと同定することができる。

一実施形態では、プローブ化合物は、蛍光リガンドにコンジュゲートされた本発明による化合物を含む。好適には、蛍光リガンドは、１０ｎｓ以下の蛍光寿命を有する蛍光染料である。好適な蛍光染料の典型例としては、フルオレセイン、ローダミン、Ｃｙ染料（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５若しくはＣｙ７）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）染料（例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、４０５、４３０、４８８、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６３５、６４７、６６０、６８０、７００、７５０若しくは７９０）又はＢＯＤＩＰＹ（登録商標）染料（例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ若しくはＢＯＤＩＰＹ ＴＲ）が挙げられる。本発明のプローブ化合物の特定例は、図２に記載される式（４）の化合物である。

対照試料は、それが試験化合物を欠くこと、及び／又はそれが既知の化合物を含有することを除いて、アッセイされる試料と同一であってもよい。

ＴＮＦスーパーファミリーメンバー及び化合物を含む試料は、不安定化剤をさらに含んでもよい。カオトロピックとしても知られる不安定化剤は、低モル濃度（例えば、１Ｍ）の尿素、グアニジン又はアセトニトリル、高濃度（例えば、６Ｍ以上）のこれらの試薬を含み、ＴＮＦαトリマーの完全な解離及び構成するＴＮＦαモノマーサブユニットのアンフォールディングをもたらす。不安定化剤は、好ましくは、ＤＭＳＯであり、典型的には、５％、１０％以上の濃度である。

蛍光偏光を使用して、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのモジュレータを同定することができるが、本発明の一部の態様では、そのようなモジュレータを、蛍光偏光を除く本明細書に記載の任意のアッセイによって（すなわち、蛍光偏光ではない方法によって）同定することができる。特に、化合物のトリマーＴＮＦスーパーファミリーメンバーに対する結合、及びトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに対する結合に関する化合物とプローブ化合物との競合を、蛍光偏光以外の任意の方法によって決定することができる。

ＴＮＦスーパーファミリー受容体を介するシグナル伝達
本発明は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合したＴＮＦスーパーファミリー受容体によるシグナル伝達を調節する（すなわち、防止する、減少させる、又は増強する）ことができる化合物を同定するための方法を含んでもよい。

一実施形態では、本発明は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合したＴＮＦスーパーファミリー受容体によるシグナル伝達を防止するか、又は減少させることができる化合物を同定するための方法を含んでもよい。そのような方法は、ＴＮＦスーパーファミリー受容体を、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーと化合物−トリマー複合体の両方と接触させることと、試験化合物がＴＮＦスーパーファミリー受容体を介するＴＮＦスーパーファミリーメンバートリマーシグナル伝達を防止するか、又は減少させるかどうかを検出することとを含んでもよい。化合物−トリマー複合体で処理されたＴＮＦスーパーファミリー受容体からのシグナル伝達の量を、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのみで処理されたＴＮＦスーパーファミリー受容体からのシグナル伝達の量と比較することができる。

或いは、本発明は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合したＴＮＦスーパーファミリー受容体によるシグナル伝達を増強することができる化合物を同定するための方法を含んでもよい。そのような方法は、ＴＮＦスーパーファミリー受容体を、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーと化合物−トリマー複合体の両方と接触させること、及び試験化合物がＴＮＦスーパーファミリー受容体を介するＴＮＦスーパーファミリーメンバーのトリマーのシグナル伝達を増加させるかどうかを検出することを含んでもよい。化合物−トリマー複合体で処理されたＴＮＦスーパーファミリー受容体からのシグナル伝達の量を、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのみで処理されたＴＮＦスーパーファミリー受容体からのシグナル伝達の量と比較することができる。

ＴＮＦスーパーファミリー受容体シグナル伝達の下流の効果を測定するアッセイを実施して、シグナル伝達のレベルを検出することができる。例えば、Ｌ９２９マウス線維肉腫細胞殺傷アッセイを使用して、ＴＮＦによる細胞死の刺激を評価することができる。ヒト単球によるＴＮＦ誘導性ＩＬ−８産生の阻害を使用して、試験化合物がその受容体によるＴＮＦシグナル伝達を阻害するかどうかを評価することもできる。

トリマー−化合物複合体を同定するための抗体
本発明者らは、本発明の化合物と、トリマーＴＮＦスーパーファミリーメンバーとを含む複合体に選択的に結合する抗体を開発した。これらの抗体を使用して、ＴＮＦを阻害することができるさらなる化合物を同定することができる。

特に、本発明者らは、本発明の化合物との複合体にある、ヒトＴＮＦαに対して生じた、ＣＡ１８５＿０１９７４及びＣＡ１８５＿０１９７９と呼ばれる、２つの抗体を同定した。ＣＡ１８５＿０１９７４の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）は配列番号１に示され、ＣＡ１８５＿０１９７４の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）は配列番号２に示される。完全長ＩｇＧ１重鎖は配列番号３（１９７４ＨＣ ｍＩｇＧ１フル）に示され、完全長軽鎖（１９７４ＬＣカッパフル）は配列番号４に示される。

ＣＡ１８５＿０１９７９のＨＣＶＲは配列番号５に示され、ＣＡ１８５＿０１９７９のＬＣＶＲは配列番号６に示される。ＣＡ１８５＿０１９７９の完全長ＩｇＧ１重鎖は配列番号７（１９７９ＨＣ ｍＩｇＧ１フル）に示され、完全長軽鎖は配列番号８（１９７９ＬＣカッパフル）に示される。

当業者であれば、上記のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ又は完全長配列対を含む抗体を、標準的な技術を使用して容易に生成することができる。

ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質に結合し、受容体を介するシグナル伝達を調節することができる化合物を決定するための本発明の方法は、したがって、配列番号１／２又は５／６のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を有する抗体がトリマー−化合物複合体に結合するかどうかを同定することを含んでもよい。同様に、方法は、配列番号３／４又は７／８の配列対を有する抗体がトリマー化合物複合体に結合するかどうかを同定することを含んでもよい。抗体アッセイを、本明細書に記載の他のアッセイに加えて使用してもよい。

本発明の抗体を、例えば、標準的なＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロッティングにより、化合物−トリマー複合体への結合について試験することができる。例えば、フローサイトメトリーにより、標的タンパク質を発現する細胞への抗体の結合をモニタリングすることによって、抗体の結合選択性を決定することもできる。したがって、本発明のスクリーニング方法は、ＥＬＩＳＡ若しくはウェスタンブロットを実行することにより、又はフローサイトメトリーにより、化合物−トリマー複合体に結合することができる抗体を同定するステップを含んでもよい。

本明細書に記載の抗体は、少なくとも１つの化合物−トリマー複合体、すなわち、化合物−トリマー複合体中のエピトープを選択的（又は特異的）に認識する。抗体、又は他の化合物は、それが選択的であるが、他のタンパク質に実質的に結合しない、又は低い親和性で結合するタンパク質に優先的な、又は高い親和性で結合する場合、タンパク質に「選択的に結合する」又はそれを「選択的に認識する」。

本発明の例では、化合物−トリマー複合体は、典型的には、１ｎＭ未満の親和性で、配列番号１／２若しくは５／６のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対（又は配列番号３／４若しくは７／８の配列対）を有する抗体に結合することができる。換言すれば、本発明の方法は、配列番号１／２若しくは５／６のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対（又は配列番号３／４若しくは７／８の配列対）を有する抗体が、１ｎＭ未満のＫ_Ｄ−ａｂでトリマー−化合物複合体に結合することを同定することによって、化合物がＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質に結合し、受容体を介するシグナル伝達を調節することができることを決定することを含んでもよい。いくつかの例では、Ｋ_Ｄ−ａｂは、５００ｐＭ未満、又は２００ｐＭ未満であってもよい。親和性を、表面プラズモン共鳴によって決定することができる。ＴＮＦは、典型的には、ヒトＴＮＦαである。

同様に、本発明の複合体は、化合物−トリマー複合体が配列番号１／２若しくは５／６のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対（又は配列番号３／４若しくは７／８の配列対）を有する抗体に結合する、トリマーＴＮＦスーパーファミリーメンバーの複合体であってもよい。再度、ＴＮＦは、典型的にはヒトＴＮＦαであり、結合親和性は、典型的には１ｎＭ未満（又は５００ｐＭ／２００ｐＭ未満）である。結合親和性は、典型的には、表面プラズモン共鳴によって決定される。

ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのモジュレータ
本明細書に記載のアッセイを使用して、本発明者らは、トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合する試験化合物を同定した。これらの化合物は、１０００Ｄａ以下、好ましくは７５０Ｄａ以下、より好ましくは６００Ｄａ以下の分子量を有する低分子実体（ＳＭＥ）である。これらの化合物は、必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合し、受容体のシグナル伝達を調節するトリマーＴＮＦスーパーファミリーメンバーのコンフォメーションを安定化する。

トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに対する本発明の化合物の安定化効果を、化合物の存在下及び非存在下でのトリマーの温度遷移中点（Ｔｍ）を測定することによって定量することができる。Ｔｍは、生物分子の５０％がアンフォールディングされる温度を表す。ＴＮＦスーパーファミリーメンバートリマーを安定化する化合物は、トリマーのＴｍを増加させる。Ｔｍを、当業界で公知の任意の適切な技術を使用して、例えば、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）又は蛍光プローブ熱変性アッセイを使用して決定することができる。

化合物は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバートリマー内に存在する中心空間の内側（すなわち、トリマーのコア）に結合することができる。

これらの化合物は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーをＴＮＦスーパーファミリー受容体アンタゴニストに向かわせることができる。これらの化合物は、したがって、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーとその受容体との高親和性相互作用と競合する必要なく、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーシグナル伝達を遮断することができる。

或いは、化合物は、必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合し、受容体のシグナル伝達を増強するトリマーＴＮＦスーパーファミリーメンバーのコンフォメーションを安定化することができる。これらの化合物は、したがって、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーとその受容体との結合親和性相互作用と競合する必要なく、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーシグナル伝達を増加させることができる。

本明細書において化合物がアンタゴニストとして記載される場合、化合物は同等にアゴニストであってもよく、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのトリマーと、そのようなアゴニスト化合物との複合体に結合するＴＮＦスーパーファミリー受容体によるシグナル伝達を増加させることが理解される。同様に、他の開示が拮抗化合物、そのような化合物を同定する方法及びそのような化合物の使用を指す場合、本開示は同等にアゴニスト化合物を指してもよい。

本発明の方法によって同定される化合物は、ＴＮＦスーパーファミリー受容体の天然のアゴニスト、すなわち、トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合し、これらのトリマーに、必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体に依然として結合し、受容体によるシグナル伝達を調節するコンフォメーションを採用させるアロステリックなモジュレータである。調節することにより、化合物は拮抗効果を有し、したがって、ＴＮＦスーパーファミリー受容体によるシグナル伝達を減少させるか、又は他には刺激効果を有し、したがって、ＴＮＦスーパーファミリー受容体によるシグナル伝達を増加若しくは増強してもよいことが理解される。

本発明の方法によって同定される化合物は、天然のＴＮＦスーパーファミリーメンバーアゴニストをアンタゴニストに変換することができる。対照的に、従来のＴＮＦスーパーファミリーメンバーアンタゴニストは、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー又はＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合し、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーの必要な受容体に対する結合を防止する。別の方法では、本発明の方法によって同定される化合物は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーが化合物の非存在下で結合する場合のＴＮＦスーパーファミリー受容体によるシグナル伝達のレベルと比較して、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーが結合する場合のＴＮＦスーパーファミリー受容体によるシグナル伝達を増加させることができる。本発明の方法によって同定される化合物は、したがって、天然のＴＮＦスーパーファミリーメンバーアゴニストを、いわゆる「スーパーアゴニスト」に変換することができる。本発明の方法によって同定される化合物は、したがって、リガンド活性のアロステリックモジュレータ（ＡＭＬＡ）としても公知であってよい。

本発明の方法によって同定される化合物は、それらが少なくとも１つのＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合し、必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合し、ＴＮＦスーパーファミリー受容体のシグナル伝達を調節するトリマーＴＮＦスーパーファミリーメンバーのコンフォメーションを安定化するという条件で、その化学式又は構造に関して限定されない。本発明の方法によって同定される化合物は、したがって、本明細書に記載のアッセイ及び方法を使用して同定することができる。本発明の方法によって同定される化合物は、ベンゾイミダゾール部分又はそのイソスター、例えば、式（１）、（２）及び（３）の化合物を含んでもよい。

本発明の方法によって同定される化合物は、化合物の非存在下での必要な受容体に対するＴＮＦスーパーファミリーメンバーの結合親和性と比較して、必要な受容体に対するＴＮＦスーパーファミリーメンバー（化合物−トリマー複合体の形態にある）の結合親和性を増加させることができる。

本発明の方法によって同定される化合物は、トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合する。そのような化合物は、トリマー形態の１又は複数のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに特異的に結合することができる。本発明の方法によって同定される化合物は、ただ１つのＴＮＦスーパーファミリーメンバーに特異的に結合することができるが、他の任意のＴＮＦスーパーファミリーメンバーには結合しない。本発明の方法によって同定される化合物はまた、２つ、３つ、４つ、又は最大で全てのＴＮＦスーパーファミリーメンバーに特異的に結合することもできる。特異的とは、化合物が、ＴＮＦスーパーファミリーの他のメンバーを含んでもよい、他の任意の分子との有意な交差反応性なしに、目的の分子又は複数の分子に、この場合、トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合することが理解される。交差反応性を、任意の好適な方法、例えば、表面プラズモン共鳴によって評価することができる。トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーの化合物と、トリマー形態のその特定のＴＮＦスーパーファミリーメンバー以外の分子との交差反応を、化合物がトリマー形態の目的のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合する強さの少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は１００％の強さで他の分子に結合する場合、有意と考えることができる。トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに特異的である化合物は、それがトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合する強さの９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％又は２０％未満で別の分子に結合することができる。好ましくは、化合物は、それがトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合する強さの２０％未満、１５％未満、１０％未満又は５％未満、２％未満又は１％未満で他の分子に結合する。

試験化合物（すなわち、化合物−トリマー複合体の形態にある）の存在下でのその受容体に対する結合に関するＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＫ_Ｄ−ｒ値は、試験化合物の非存在下でのその受容体に対する結合に関するＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＫ_Ｄ−ｒ値の少なくとも１．５分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１、２０分の１、３０分の１、４０分の１、５０分の１、６０分の１、７０分の１、８０分の１、９０分の１、１００分の１でもよい。好ましい実施形態では、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーに対する結合に関する化合物−トリマー複合体のＫ_Ｄ−ｒ値は、試験化合物の非存在下でＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合するＴＮＦスーパーファミリートリマーのＫ_Ｄ−ｒ値の少なくとも１．５分の１、好ましくは、少なくとも３分の１、より好ましくは少なくとも４分の１に減少する、すなわち、ＴＮＦスーパーファミリー受容体に対する化合物−トリマー複合体の結合親和性は、好ましくは、試験化合物の非存在下でのＴＮＦスーパーファミリー受容体に対するＴＮＦスーパーファミリートリマーの結合親和性と比較して、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも４倍増加する。

受容体に結合するＴＮＦスーパーファミリートリマーのみのＫ_Ｄ−ｒ値と比較した、ＴＮＦスーパーファミリー受容体に対する結合に関する化合物−トリマー複合体のＫ_Ｄ−ｒ値の減少は、ＴＮＦスーパーファミリートリマーのみと比較した、ＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合する化合物−トリマー複合体の結合速度（ｋ_ｏｎ−ｒ）の増加、及び／又はＴＮＦスーパーファミリートリマーのみと比較した解離速度（ｋ_{ｏｆｆ−ｒ}）の減少の結果であってよい。好ましい実施形態では、ＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合する化合物−トリマー複合体の結合速度（ｋ_ｏｎ−ｒ）は、ＴＮＦスーパーファミリートリマーのみと比較して増加する。別の実施形態では、ＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合する化合物−トリマー複合体の解離速度（ｋ_{ｏｆｆ−ｒ}）は、ＴＮＦスーパーファミリートリマーのみと比較して減少する。さらなる実施形態では、ＴＮＦスーパーファミリートリマーのみと比較して、ＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合する化合物−トリマー複合体の結合速度（ｋ_ｏｎ−ｒ）は増加し、ＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合する化合物−トリマー複合体の解離速度（ｋ_{ｏｆｆ−ｒ}）は減少する。必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体に対する化合物−トリマー複合体のｋ_ｏｎ−ｒ値は、化合物の非存在下でのその受容体に結合するＴＮＦスーパーファミリートリマーのｋ_ｏｎ−ｒ値と比較して少なくとも１．５倍又は少なくとも２倍、好ましくは少なくとも３倍増加してもよく、必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体に対する化合物−トリマー複合体のｋ_{ｏｆｆ−ｒ}値は、化合物の非存在下でその受容体に結合するＴＮＦスーパーファミリートリマーのｋ_{ｏｆｆ−ｒ}値と比較して少なくとも１．２分の１、少なくとも１．６分の１、少なくとも２分の１、より好ましくは少なくとも２．４分の１に減少してもよい。

一実施形態では、ＴＮＦスーパーファミリートリマーに結合する化合物の結合速度（ｋ_ｏｎ−ｃ）は、ＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合する化合物−トリマー複合体の結合速度（ｋ_ｏｎ−ｒ）よりも速い。別の実施形態では、ＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合する化合物−トリマー複合体の解離速度（ｋ_{ｏｆｆ−ｒ}）は、ＴＮＦスーパーファミリートリマーに結合する化合物の解離速度（ｋ_{ｏｆｆ−ｃ}）よりも速い。さらなる実施形態では、ＴＮＦスーパーファミリートリマーに結合する化合物の結合速度（ｋ_ｏｎ−ｃ）はＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合する化合物−トリマー複合体の結合速度（ｋ_ｏｎ−ｒ）よりも速く、ＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合する化合物−トリマー複合体の解離速度（ｋ_{ｏｆｆ−ｒ}）はＴＮＦスーパーファミリートリマーに結合する化合物の解離速度（ｋ_{ｏｆｆ−ｃ}）よりも速い。好ましい実施形態では、ＴＮＦスーパーファミリートリマーに対する結合に関する化合物のＫ_Ｄ−ｃ値は、ＴＮＦスーパーファミリー受容体に対する結合に関する化合物−トリマー複合体のＫ_Ｄ−ｒ値よりも低い、すなわち、化合物は、化合物−トリマー複合体が受容体に対して有するものよりも高いトリマーに対する親和性を有する。

必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体に対する化合物−トリマー複合体とＴＮＦスーパーファミリートリマーの両方に関するｋ_ｏｎ−ｒ、ｋ_{ｏｆｆ−ｒ}、及びＫ_Ｄ−ｒ値を、任意の好適な技術、例えば、本明細書の例に記載されるような、表面プラズモン共鳴、質量分析及び等温熱量測定を使用して決定することができる。試験化合物の存在下でのその受容体結合に関するＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＫ_Ｄ−ｒ値は、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭ以下であってもよい。好ましい実施形態では、試験化合物の存在下（すなわち、化合物−トリマー複合体中）でのその受容体に対する結合に関するＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＫ_Ｄ−ｒ値は、１ｎＭ以下である。より好ましい実施形態では、必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体に対する結合に関する化合物−トリマー複合体のＫ_Ｄ−ｒ値は、６００ｐＭ未満、より好ましくは５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満又は５０ｐＭ未満である。最も好ましい実施形態では、必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体に対する結合に関する化合物−トリマー複合体のＫ_Ｄ−ｒ値は、２００ｐＭ未満である。

本発明の方法によって同定される化合物を、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー及び化合物の試料中のトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＫ_Ｄ−ｒを決定すること；試料中のトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＫ_Ｄ−ｒを対照試料と比較すること；並びに本発明の化合物を選択することを含むアッセイによって同定することができる。

本発明の方法によって同定される化合物は、化合物−トリマー複合体の形態にあるＴＮＦスーパーファミリーメンバーが受容体に結合する場合、ＴＮＦ受容体を介するシグナル伝達を完全に、又は部分的に阻害することができる。化合物は、ＴＮＦスーパーファミリー受容体を介するシグナル伝達を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減少させるように作用することができる。或いは、本発明の方法によって同定される化合物は、化合物−トリマー複合体の形態にあるＴＮＦスーパーファミリーメンバーが受容体に結合する場合、ＴＮＦ受容体を介するシグナル伝達を増加させることができる。化合物は、ＴＮＦスーパーファミリー受容体を介するシグナル伝達を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は２００％増加させるように作用することができる。シグナル伝達のレベルの任意の変化を、アルカリホスファターゼ又はルシフェラーゼによるレポーター遺伝子活性、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ Ａｒｒａｙｓｃａｎなどの機械を使用するＮＦ−κＢ転座、下流エフェクターのリン酸化、シグナル伝達分子の動員、又は細胞死の測定を含む任意の適切な技術によって測定することができる。

本発明の方法によって同定される化合物は、化合物−トリマー複合体の形態にあるＴＮＦスーパーファミリーメンバーが受容体に結合する場合、ＴＮＦ受容体を介するシグナル伝達の下流の効果の少なくとも１つを調節することができる。そのような効果は、本明細書で考察され、ＴＮＦスーパーファミリー誘導性ＩＬ−８、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＩＬ２及びＶＣＡＭ産生、ＴＮＦスーパーファミリー誘導性ＮＦ−κＢ活性化及び好中球動員を含む。ＴＮＦスーパーファミリーメンバーの下流の効果を測定するための標準的な技術が当業界で公知である。本発明の方法によって同定される化合物は、ＴＮＦ受容体を介するシグナル伝達の少なくとも１、２、３、４、５、１０又は最大で全部の下流の効果を調節することができる。

本発明の方法によって同定される化合物の活性を、ＩＣ_５０又は半数最大効果濃度（ＥＣ_５０）値などの標準的な用語を使用して定量することができる。ＩＣ_５０値は、特定の生物学的又は生化学的機能の５０％の阻害に必要とされる化合物の濃度である。ＥＣ_５０値は、その最大効果の５０％に必要とされる化合物の濃度である。本発明の方法によって同定される化合物は、５００ｎＭ、４００ｎＭ、３００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ以下のＩＣ_５０又はＥＣ_５０値を有してもよい。ＩＣ_５０及びＥＣ_５０値を、任意の適切な技術を使用して測定することができ、例えば、サイトカイン産生を、ＥＬＩＳＡを使用して定量することができる。次いで、ＩＣ_５０及びＥＣ_５０値を、シグモイド型用量応答モデルとしても知られる標準的な４パラメータロジスティックモデルを使用して生成することができる。

ＴＮＦスーパーファミリー及びその受容体
現在公知の２２種のＴＮＦスーパーファミリーメンバーが存在する：ＴＮＦα（ＴＮＦＳＦ１Ａ）、ＴＮＦβ（ＴＮＦＳＦ１Ｂ）、ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）、ＢＡＦＦ（ＴＮＦＳＦ１３Ｂ／ＢｌｙＳ）、ＡＰＲＩＬ（ＴＮＦＳＦ１３）、ＯＸ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ４）、ＲＡＮＫＬ（ＴＮＦＳＦ１１／ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＷＥＡＫ（ＴＮＦＳＦ１２）、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦＳＦ１０）、ＴＬ１Ａ（ＴＮＦＳＦ１５）、ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）、リンホトキシン、リンホトキシンβ（ＴＮＦＳＦ３）、４−１ＢＢＬ（ＴＮＦＳＦ９）、ＣＤ２７Ｌ（ＴＮＦＳＦ７）、ＣＤ３０Ｌ（ＴＮＦＳＦ８）、ＥＤＡ（エクトジスプラシン）、ＥＤＡ−Ａ１（エクトジスプラシンＡ１）、ＥＤＡ−Ａ２（エクトジスプラシンＡ２）、ＦＡＳＬ（ＴＮＦＳＦ６）、ＮＧＦ及びＧＩＴＲＬ（ＴＮＦＳＦ１８）。

好ましい実施形態では、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーは、ＴＮＦαである。ＴＮＦαは、可溶性（ＴＮＦα_ｓ）と膜結合型（ＴＮＦα_ｍ）の両方で存在する。本明細書でＴＮＦαを言う場合、これはＴＮＦα_ｓとＴＮＦα_ｍ型の両方を包含する。特に好ましい実施形態では、ＴＮＦαは、ＴＮＦα_ｓ型にある。

本発明のアッセイを使用して、２２種の公知のＴＮＦスーパーファミリーメンバーを含む、任意のＴＮＦスーパーファミリーメンバーのうちの少なくとも１つのモジュレータを同定することができる。具体的には、本発明のアッセイを使用して、任意のＴＮＦスーパーファミリーメンバー、特に、トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合し、必要なＴＮＦ受容体に結合することができ、前記受容体を介するシグナル伝達を調節するコンフォメーションにこれらのトリマーを安定化する化合物を同定することができる。好ましい実施形態では、本発明のアッセイは、ＴＮＦα又はＣＤ４０Ｌ、より好ましくは、ＴＮＦα、又はさらにより好ましくはＴＮＦα_ｓのモジュレータを同定するために使用される。

本発明の方法によって同定される化合物は、２２種の公知のＴＮＦスーパーファミリーメンバーを含む、任意のＴＮＦスーパーファミリーメンバーのうちの少なくとも１つのモジュレータであってもよい。好ましい実施形態では、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーは、ＴＮＦα又はＣＤ４０Ｌ、より好ましくはＴＮＦα、又はさらにより好ましくはＴＮＦα_ｓである。

本発明の化合物−トリマー複合体は、２２種の公知のＴＮＦスーパーファミリーメンバーを含む、任意のＴＮＦスーパーファミリーメンバーのトリマー形態を含んでもよい。好ましい実施形態では、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーは、ＴＮＦα又はＣＤ４０Ｌである。より好ましくはＴＮＦスーパーファミリーメンバーはＴＮＦαであり、さらにより好ましくはＴＮＦα_ｓである。

ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーは、ＴＮＦ受容体に結合し、それを介するシグナル伝達を開始させる。現在、３４種の公知のＴＮＦ受容体が存在する：４−１ＢＢ（ＴＮＦＲＳＦ９／ＣＤ１３７）、ＮＧＦ Ｒ（ＴＮＦＲＳＦ１６）、ＢＡＦＦ Ｒ（ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ）、オステオプロテゲリン（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＢＣＭＡ（ＴＮＦＲＳＦ１７）、ＯＸ４０（ＴＮＦＲＳＦ４）、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７）、ＲＡＮＫ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ）、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＲＥＬＴ（ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ）、ＣＤ４０（ＴＮＦＲＳＦ５）、ＴＡＣＩ（ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ）、ＤｃＲ３（ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ）、ＴＮＦＲＨ３（ＴＮＦＲＳＦ２６）、ＤｃＴＲＡＩＬ Ｒ１（ＴＮＦＲＳＦ２３）、ＤｃＴＲＡＩＬ Ｒ２（ＴＮＦＲＳＦ２２）、ＴＮＦ−Ｒ１（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）、ＴＮＦ−Ｒ２（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、ＤＲ３（ＴＮＦＲＳＦ２５）、ＴＲＡＩＬ Ｒ１（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）、ＤＲ６（ＴＮＦＲＳＦ２１）、ＴＲＡＩＬ Ｒ２（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）、ＥＤＡＲ、ＴＲＡＩＬ Ｒ３（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ）、Ｆａｓ（ＴＮＦＲＳＦ６／ＣＤ９５）、ＴＲＡＩＬ Ｒ４（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ）、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＴＲＯＹ（ＴＮＦＲＳＦ１９）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４）、ＴＷＥＡＫ Ｒ（ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ）、ＴＲＡＭＰ（ＴＮＦＲＳＦ２５）、リンホトキシンβ Ｒ（ＴＮＦＲＳＦ３）及びＸＥＤＡＲ。

好ましい実施形態では、ＴＮＦ受容体は、ＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２である。本明細書に記載されるＴＮＦ−Ｒは、ＴＮＦ−Ｒ１とＴＮＦ−Ｒ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）などの、ＴＮＦ−Ｒ１とＴＮＦ−Ｒ２の両方を包含する。本発明のアッセイを使用して、任意の必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体を介するＴＮＦスーパーファミリーメンバーのシグナル伝達を調節する化合物を同定することができる。好ましい実施形態では、本発明のアッセイを使用して、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦ−Ｒ２又はＣＤ４０を介するＴＮＦスーパーファミリーメンバーのシグナル伝達を調節する化合物を同定することができる。より好ましい実施形態では、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーはＴＮＦαであり、ＴＮＦ受容体はＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２である。さらにより好ましい実施形態では、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーはＴＮＦα_ｓであり、ＴＮＦ受容体はＴＮＦ−Ｒ１である。本発明のアッセイを使用して、ＴＮＦ−Ｒ１を介するＴＮＦスーパーファミリーメンバーのシグナル伝達を特異的に調節することによって作用する化合物を同定することができる。特に、化合物は、ＴＮＦ−Ｒ１を介するＴＮＦスーパーファミリーメンバーのシグナル伝達を調節することによって作用することができるが、ＴＮＦ−Ｒ２を介するＴＮＦスーパーファミリーメンバーのシグナル伝達に対する効果はない。さらにより好ましい実施形態では、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーはＴＮＦα_ｓであり、ＴＮＦ受容体はＴＮＦ−Ｒ１である。

本発明の化合物−トリマー複合体は、３４種の公知のＴＮＦ受容体を含む、少なくとも１つのＴＮＦ受容体を介するＴＮＦスーパーファミリーメンバーのシグナル伝達を調節することができる。好ましい実施形態では、ＴＮＦ受容体は、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦ−Ｒ２又はＣＤ４０Ｌである。

より好ましい実施形態では、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーはＴＮＦαであり、ＴＮＦ受容体はＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２である。さらにより好ましい実施形態では、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーはＴＮＦαであり、ＴＮＦ受容体はＴＮＦ−Ｒ１である。さらにより好ましい実施形態では、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーはＴＮＦα_ｓであり、ＴＮＦ受容体はＴＮＦ−Ｒ１である。

治療指標
ＴＮＦαは、ＴＮＦスーパーファミリーの典型的なメンバーである。ＴＮＦαは、免疫調節及び炎症応答を媒介する多面的なサイトカインである。ｉｎ ｖｉｖｏでは、ＴＮＦαは細菌、寄生虫及びウイルス感染に対する応答に関与することも知られている。特に、ＴＮＦαは、関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（クローン病を含む）、乾癬、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、疼痛、てんかん、骨粗鬆症、喘息、敗血症、発熱、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及び多発性硬化症（ＭＳ）並びにがんにおいて役割を有することが知られている。ＴＮＦαはまた、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、虚血性脳卒中、免疫複合体媒介性糸球体腎炎、ループス腎炎（ＬＮ）、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ−）関連糸球体腎炎、微小変化型疾患、糖尿病性腎症（ＤＮ）、急性腎傷害（ＡＫＩ）、閉塞性尿路疾患、腎同種移植拒絶、シスプラチン誘導性ＡＫＩ及び閉塞性尿路疾患における役割を有することが知られている。

ＴＮＦスーパーファミリーの他のメンバーは、自己免疫疾患及び免疫不全に関与することが知られている。特に、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーは、ＲＡ、ＳＬＥ、がん、ＭＳ、喘息、鼻炎、骨粗鬆症及び多発性ミエローマ（ＭＭ）に関与することが知られている。ＴＬ１Ａは、臓器移植片拒絶において役割を果たすことが知られている。

本発明の方法により同定される化合物又は本発明の複合体を使用して、従来のＴＮＦスーパーファミリーメンバーモジュレータによって処置、防止又は改善することができる任意の状態を処置、防止又は改善することができる。本発明の方法によって同定される化合物又は本発明の複合体を、単独で、又は従来のＴＮＦスーパーファミリーメンバーモジュレータと組み合わせて使用することができる。原理的には、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーによるＴＮＦ受容体を介する病的シグナル伝達から、又はＴＮＦスーパーファミリーメンバーによるＴＮＦ受容体を介するシグナル伝達の欠陥から、部分的又は全体的に生じる任意の状態を、本発明に従って処置、防止又は改善することができる。ＴＮＦスーパーファミリーメンバーによるＴＮＦ受容体を介する病的シグナル伝達は、正常な生理学的レベルのシグナル伝達を超えるＴＮＦ受容体を介するシグナル伝達の増加、最初は正常であったが、正常な生理学的シグナルに応答して停止することができないＴＮＦ受容体を介するシグナル伝達及び正常の生理学的規模範囲内にあるが、非生理的手段によって開始するＴＮＦ受容体を介するシグナル伝達を含む。好ましい実施形態では、本発明は、ＴＮＦα又はＣＤ４０Ｌによって媒介又は影響される状態の処置、防止又は改善に関する。

ＴＮＦαと相互作用する本発明の方法によって同定される化合物は、したがって、様々なヒトの病気の処置及び／又は防止において有益である。これらのものとしては、自己免疫障害及び炎症障害；神経障害及び神経変性障害；疼痛障害及び侵害障害；並びに心血管障害が挙げられる。

炎症障害及び自己免疫障害としては、全身性自己免疫障害、自己免疫性内分泌障害及び臓器特異的自己免疫障害が挙げられる。全身性自己免疫障害としては、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、乾癬、血管炎、多発性筋炎、強皮症、多発性硬化症、強直性脊椎炎、関節リウマチ及びシェーグレン症候群が挙げられる。自己免疫性内分泌障害としては、甲状腺炎が挙げられる。臓器特異的自己免疫障害としては、アジソン病、溶血性貧血又は悪性貧血、糸球体腎炎（グッドパスチャー症候群を含む）、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病、インスリン依存性糖尿病、若年性糖尿病、ブドウ膜炎、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む）、天疱瘡、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肺炎、自己免疫性心臓炎、重症筋無力症、自然不妊症、骨粗鬆症、喘息及び筋ジストロフィー（デュシェンヌ型筋ジストロフィーを含む）が挙げられる。

神経障害及び神経変性障害としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、脳卒中、筋萎縮性側索硬化症、脊髄損傷、頭部外傷、発作及びてんかんが挙げられる。

心血管障害としては、血栓症、心臓肥大、高血圧、心臓の不規則収縮（例えば、心不全中の）、及び性的障害（勃起障害及び女性性的機能障害を含む）が挙げられる。

特に、本発明の方法によって同定される化合物又は本発明の複合体を使用して、炎症障害、ＣＮＳ障害、免疫障害及び自己免疫障害、疼痛、骨粗鬆症、発熱及び臓器移植拒絶を処置又は防止することができる。好ましい実施形態では、本発明の方法によって同定される化合物又は本発明の複合体を使用して、関節リウマチ、炎症性腸疾患（クローン病を含む）、乾癬、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、喘息、敗血症、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、喘息、鼻炎、がん及び骨粗鬆症を処置又は防止することができる。別の好ましい実施形態では、本発明の方法によって同定される化合物又は本発明の複合体を使用して、関節リウマチ（ＲＡ）、非特異的炎症性関節炎、浸食性骨疾患、軟骨炎、軟骨変性及び／又は破壊、若年性炎症性関節炎、スティル病（若年及び／又は成人開始型）、若年性特発性関節炎、若年性特発性関節炎（少関節炎型と多関節炎型の両方）、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎、不確定大腸炎、回腸嚢炎を含む）、乾癬、乾癬性関節症、強直性脊椎炎、シェーグレン病、アルツハイマー病（ＡＤ）、ベーチェット病、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、虚血性脳卒中、疼痛、てんかん、骨粗鬆症、骨減少症、慢性疾患の貧血、悪液質、糖尿病、脂質異常症、代謝症候群、喘息、慢性閉塞性気道（又は肺）疾患、敗血症、発熱、呼吸窮迫症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、免疫複合体媒介性糸球体腎炎、ループス腎炎（ＬＮ）、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ−）関連糸球体腎炎、微小変化型疾患、糖尿病性腎症（ＤＮ）、急性腎傷害（ＡＫＩ）、閉塞性尿路疾患、腎同種移植拒絶、シスプラチン誘導性ＡＫＩ及び閉塞性尿路疾患、眼疾患（糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、未熟児網膜症、加齢黄斑変性、黄斑浮腫、増殖性及び／又は非増殖性網膜症、新血管形成を含む角膜血管新生、網膜静脈閉塞、様々な形態のブドウ膜炎及び角膜炎を含む）、甲状腺炎、様々な形態の肝線維症、様々な形態の肺線維症を含む線維化障害、全身硬化症、強皮症、がん並びにがん関連合併症（骨格合併症、悪液質及び貧血を含む）を処置又は防止することができる。

医薬組成物、用量及び用量レジメン
本発明の方法によって同定される化合物及び本発明の化合物−トリマー複合体を、典型的には、薬学的に許容される担体と共に、医薬組成物に製剤化することができる。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、生理的に適合する任意且つ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。担体は、例えば、注射又は輸注による、非経口、例えば、静脈内、筋肉内、皮内、眼内、腹腔内、皮下、脊髄又は他の非経口投与経路にとって好適であってよい。或いは、担体は、局所、表皮又は粘膜投与経路などの非非経口（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）投与にとって好適であってよい。好ましい実施形態では、担体は、経口投与にとって好適である。投与経路に応じて、モジュレータを、酸の作用及び化合物を不活化し得る他の自然条件から化合物を保護するための材料中でコーティングすることができる。

本発明の医薬組成物は、１又は複数の薬学的に許容される塩を含んでもよい。「薬学的に許容される塩」とは、親化合物の望ましい生物活性を保持し、いかなる望ましくない毒性効果も与えない塩を指す。そのような塩の例としては、酸付加塩及び塩基付加塩が挙げられる。

好ましい薬学的に許容される担体は、水性担体又は希釈剤を含む。本発明の医薬組成物中で用いることができる好適な水性担体の例としては、水、緩衝化水及び塩水が挙げられる。他の担体の例としては、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びその好適な混合物、オリーブ油などの植物油、並びにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。

治療組成物は、典型的には、製造及び保存の条件下で無菌性であり、安定でなければならない。組成物を、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高い薬物濃度にとって好適な他の規則的構造として製剤化することができる。

本発明の医薬組成物は、さらなる活性成分を含んでもよい。

また、本発明の方法によって同定される化合物及び本発明の複合体と、使用のための指示書とを含むキットも本発明の範囲内にある。キットは、上記で考察されたさらなる治療剤又は予防剤などの、１又は複数のさらなる試薬をさらに含有してもよい。

本発明の方法によって同定される化合物及び本発明の化合物−トリマー複合体又はその製剤若しくは組成物を、予防的及び／又は治療的処置のために投与することができる。

治療的適用では、化合物及び化合物−トリマー複合体を、状態又は１若しくは複数のその症状を治癒させる、軽減する、又は部分的に停止させるのに十分な量で、上記の障害又は状態に既に罹患している対象に投与する。そのような治療的処置は、疾患症状の重症度の低下、又は無症状期間の頻度若しくは持続時間の増大をもたらし得る。これを達成するのに十分な量を、「治療有効量」と定義する。

予防的適用では、製剤を、状態又は１若しくは複数のその症状のその後の効果を防止する、又は減少させるのに十分な量で、上記の障害又は状態のリスクがある対象に投与する。これを達成するのに十分な量を、「予防有効量」と定義する。それぞれの目的のための有効量は、疾患又は傷害の重症度並びに対象の体重及び全身状態に依存する。

投与のための対象は、ヒト又は非ヒト動物であってもよい。用語「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物及び非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、は虫類などを含む。ヒトに対する投与が好ましい。

本発明の方法によって同定される化合物又は本発明の化合物−トリマー複合体を、当業界で公知の１又は複数の様々な方法を使用して、１又は複数の投与経路により投与することができる。当業者であれば理解できるように、投与の経路及び／又は様式は、所望の結果に応じて変化する。化合物又は本発明の化合物−トリマー複合体のための投与経路の例としては、例えば、注射又は輸注による、静脈内、筋肉内、皮内、眼内、腹腔内、皮下、脊髄又は他の非経口投与経路が挙げられる。本明細書で使用される語句「非経口投与」は、通常は注射による、腸内投与及び局所投与以外の投与様式を意味する。或いは、本発明の方法によって同定される化合物又は本発明の本発明の化合物−トリマー複合体を、局所、表皮又は粘膜投与経路などの、非非経口経路により投与することができる。好ましい実施形態では、本発明の方法によって同定される化合物又は本発明の化合物−トリマー複合体は、経口投与のためのものである。

本発明の方法によって同定される化合物又は本発明の化合物−トリマー複合体の好適な用量を、技術のある医師によって決定することができる。本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、患者にとって毒性的であることなく、特定の患者のための望ましい治療応答、組成、及び投与様式を達成するのに有効である活性成分の量を得るために変化し得る。選択される用量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与の時間、用いられる特定の化合物の排出速度、処置の持続時間、用いられる特定の組成物と共に使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、年齢、性別、体重、状態、処置される患者の全身の健康及び以前の病歴、並びに医学界で周知の因子などの、様々な薬物動態学的因子に依存する。

好適な用量は、例えば、処置される患者の約０．０１μｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ体重、典型的には、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であってもよい。例えば、好適な用量は、１日当たり約１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重又は１日当たり約１０μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ体重であってもよい。

用量レジメンを、最適な望ましい応答（例えば、治療応答）を提供するように調整することができる。例えば、治療状況の緊急性によって示されるように、単回用量を投与してもよく、数回に分割された用量を経時的に投与してもよく、又は用量を比例的に減少若しくは増加させてもよい。本明細書で使用される用量単位形態とは、処置される対象にとって単一用量として適する物理的に個別の単位を指す；それぞれの単位は、必要とされる薬学的担体と関連する所望の治療効果をもたらすように算出される活性化合物の所定量を含有する。

投与は、単一又は複数の用量にあってもよい。複数用量を、同じか、又は異なる経路により、同じか、又は異なる位置に投与することができる。或いは、用量は、持続放出製剤によるものであってもよく、その場合、低頻度の投与が必要である。用量及び頻度は、患者におけるアンタゴニストの半減期及び望ましい処置の持続時間に応じて変化してもよい。

上記のように、本発明の方法によって同定される化合物又は本発明の化合物−トリマー複合体を、１又は複数の他の治療剤と共に同時投与することができる。例えば、他の薬剤は、鎮痛剤、麻酔剤、免疫抑制剤又は抗炎症剤であってもよい。

２つ以上の薬剤の組合せ投与を、いくつかの異なる方法で達成することができる。両方とも単一の組成物中で一緒に投与するか、又はそれらを組合せ治療の一部として別々の組成物中で投与してもよい。例えば、一方を、他方の前、後に、又はそれと同時に投与してもよい。

以下の例は、本発明を例証するものである。

（例１） − 式（１）、（２）及び（３）の化合物の合成
中間体１：１−（２，５−ジメチルベンジル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール
炭酸セシウム（２２．０ｇ、１００．０ｍｍｏｌ）及びヨウ化ｎ−ブチルアンモニウム（１２．５ｇ、３４．０ｍｍｏｌ）を、ベンゾイミダゾール（４．０ｇ、３４．０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（６０ｍｌ）中溶液に０℃で加えた。反応混合物を０℃で１０分間撹拌し、次いで２，５−ジメチルベンジルブロミド（６．７ｇ、３４．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温に温め、３時間撹拌した。混合物を氷冷水（５０ｍｌ）でクエンチし、酢酸エチル（３×４０ｍｌ）で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を真空中で除去して標題化合物（８．０ｇ、７５％）をオフホワイト色固体として得た。δ_H (d₆-DMSO) 8.23 (s, 1H), 7.68-7.66 (m, 1H), 7.43-7.41 (m, 1H), 7.21-7.19 (m, 2H), 7.10 (d, J 7.6 Hz, 1H), 7.01 (d, J 7.6 Hz, 1H), 6.67 (s, 1H), 5.45 (s, 2H), 2.25 (s, 3H), 2.14 (s, 3H). LCMS (ES⁺) 237 (M+H)⁺.

中間体２：５−ブロモ−２−ニトロアニリン
２−フルオロ−４−ブロモ−１−ニトロベンゼン（０．５ｇ、２．２ｍｍｏｌ）を、メタノール・アンモニア（１０ｍｌ）に加え、室温で１８時間撹拌した。次いで反応混合物を真空中で濃縮し、残渣をイソヘキサンと粉砕し、標題化合物（０．４８ｇ、９７％）を黄色固体として得た。δ_H (d₆-DMSO) 7.88 (d, J 8.8 Hz, 1H), 7.53 (br s, 2H), 7.25 (d, J 3.0 Hz, 1H), 6.75 (dd, J 9.2, 2.0 Hz, 1H).

中間体３：５−ブロモ−Ｎ−（２，５−ジメチルベンジル）−２−ニトロアニリン
水素化ナトリウム（６０％油中分散液、０．８２ｇ、２０．７ｍｍｏｌ）を、中間体２（５．０ｇ、２３．０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５０ｍｌ）中撹拌溶液に０℃で加えた。２，５−ジメチルベンジルブロミド（４．５６ｇ、２３．０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温に温め、５時間撹拌した。反応混合物を飽和塩化アンモニウム水溶液でクエンチし、酢酸エチル（３×５０ｍｌ）で抽出し、水（２×３０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２、５％ＥｔＯＡｃ／イソヘキサン）により精製し、標題化合物（４．８９ｇ、６３％）を黄色固体として得た。δ_H (d₆-DMSO) 8.42 (br s, 1H), 8.01 (d, J 8.8 Hz, 1H), 7.12-6.86 (m, 4H), 6.85 (d, J 7.2, 1.6 Hz, 1H), 4.54 (d, J 5.6 Hz, 2H), 2.28 (s, 3H), 2.21 (s, 3H).

中間体４：５−ブロモ−Ｎ ^１ −（２，５−ジメチルベンジル）ベンゼン−１，２−ジアミン
ＳｎＣｌ_２（２０．２ｇ、８９．４ｍｍｏｌ）を、中間体３（１０．０ｇ、２９．８ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（２００ｍｌ）中撹拌溶液に加え、反応混合物を８０℃へ５時間加熱した。次いで反応混合物を真空中で濃縮し、残渣を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和してＤＣＭ（３×１００ｍｌ）で抽出した。合わせた有機物を水（２×５０ｍｌ）で洗浄し、抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２、５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製し、標題化合物（５．４ｇ、６９％）を暗褐色の油として得た。δ_H (d₆-DMSO) 7.08 (s, 1H), 7.06 (d, J 7.6 Hz, 2H), 6.97 (d, J 7.6 Hz, 1H), 6.53 (dd, J 8.4, 2.0 Hz, 1H), 6.47 (d, J 8.0 Hz, 1H), 6.45 (d, J 2.0 Hz, 1H), 5.06 (t, J 5.4 Hz, 1H), 4.77 (br s, 2H), 4.15 (d, J 5.2 Hz, 1H), 2.27 (s, 3H), 2.22 (s, 3H). LCMS (ES⁺) 305 (M+H)⁺.

中間体５：６−ブロモ−１−（２，５−ジメチルベンジル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール
中間体４（０．４０ｇ、１．３１ｍｍｏｌ）とギ酸（１０ｍｌ）との混合物を室温で１８時間撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、残渣を酢酸エチルと飽和炭酸水素ナトリウム水溶液との間で分配した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空中で濃縮した。粗残渣をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２、２０〜７５％ＥｔＯＡｃ／イソヘキサン）により精製し、標題化合物（０．２０ｇ、４８％）を白色固体として得た。δ_H (d₆-DMSO) 8.24 (s, 1H), 7.74 (d, J 1.7 Hz, 1H), 7.64 (d, J 8.6 Hz, 1H), 7.34 (dd, J 8.6, 1.9 Hz, 1H), 7.12 (d, J 7.7 Hz, 1H), 7.02 (d, J 7.8 Hz, 1H), 6.61 (s, 1H), 5.47 (s, 2H), 2.24 (s, 3H), 2.15 (s, 3H). LCMS (ES⁺) 316 (M+H)⁺.

中間体６：［６−ブロモ−１−（２，５−ジメチルベンジル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル］（ピリジン−４−イル）メタノール
０℃へ冷却したＴＨＦ（１０ｍｌ）中のジイソプロピルアミン（２．８ｍｌ）に、ｎ−ＢｕＬｉ（１２．５ｍｌ、ヘキサン中１．６Ｍ）を加え、得られた混合物を０℃で１０分間撹拌した。この新たに調製したＬＤＡ（１．８ｍｌ、１．６２ｍｍｏｌ）のアリコートを、中間体５（０．２５ｇ、０．８１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５ｍｌ）中溶液に−７８℃で加えた。反応混合物を−７８℃で２時間撹拌し、次いでピリジン−４−カルボキシアルデヒド（０．１５ｍｌ、１．６２ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を−７８℃で１０分間撹拌した。混合物を飽和塩化ナトリウム水溶液でクエンチし、室温に温めた。混合物を酢酸エチル（３×４０ｍｌ）で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２、０〜１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製し、標題化合物（０．１８ｇ、５１％）を白色固体として得た。LCMS (ES⁺) 423 (M+H)⁺.

中間体７：５−（３−フルオロ−４−ニトロフェニル）−２−メトキシピリジン
６−メトキシピリジン−３−イルボロン酸（４０．０ｇ、２６２ｍｍｏｌ）、４−ブロモ−２−フルオロ−１−ニトロベンゼン（５２．３ｇ、２３８ｍｍｏｌ）及びＮａ_２ＣＯ_３（７６ｇ、７１３ｍｍｏｌ）を、１，２−ジメトキシエタン（１２００ｍＬ）及び水（３００ｍＬ）中で混合した。反応混合物をアルゴンでパージした。Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_２Ｃｌ_２（８．３４ｇ、１１．８９ｍｍｏｌ）を加え、混合物を９０℃へ１．５時間加熱した。ＥｔＯＡｃ及び水を加えた。有機相を分離し、水相をＥｔＯＡｃで２回抽出した。合わせた有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、その後、溶媒を真空中で除去した。残渣をトルエンから再結晶化し、標題化合物（４２．００ｇ、１６９．２ｍｍｏｌ、７１％）を得た。MS [ESI+] m/z: 249 [M+H]⁺.

中間体８：Ｎ−［２−（ジフルオロメトキシ）ベンジル］−５−（６−メトキシピリジン−３−イル）−２−ニトロアニリン
２−（ジフルオロメトキシ）ベンジルアミン（２．０９３ｇ、１２．０９ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（２０ｍｌ）に溶解した。中間体７（２ｇ、８．０６ｍｍｏｌ）及びＫ_２ＣＯ_３（１．３３６ｇ、９．６７ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物をマイクロ波照射下で１５０℃で３０分間加熱した。ＥｔＯＡｃ及び水を加えた。有機相を分離し、水相をＥｔＯＡｃで２回抽出した。合わせた有機層を水で３回、ブラインで２回洗浄した。Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させた後、溶媒を真空中で除去した。残渣をヘプタン／ＥｔＯＡｃ（１００／２５ｍｌ）から再結晶化し、標題化合物（２．５１３ｇ、６．２６ｍｍｏｌ、７８％）を得た。MS [ESI+] m/z: 402 [M+H]⁺.

中間体９：Ｎ ^１ −［２−（ジフルオロメトキシ）ベンジル］−５−（６−メトキシピリジン−３−イル）ベンゼン−１，２−ジアミン
パラジウム炭素（１．１０ｇ、１０ｗｔ％）を、中間体８（２．５１２ｇ、６．２６ｍｍｏｌ）のＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）中溶液に加え、アルゴンでフラッシュした。雰囲気をＨ_２雰囲気で置き換え、反応混合物を１バールのＨ_２下で１時間撹拌した。混合物を珪藻土の層を通して濾過した。濾液を真空中で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィーを使用してヘプタン中７〜６０％のＥｔＯＡｃで精製し、標題化合物（２．０７ｇ、５．５７ｍｍｏｌ、８９％）を得た。MS [ESI+] m/z: 372 [M+H]⁺.

中間体１０：５−｛４−アミノ−３−［２−（ジフルオロメトキシ）ベンジルアミノ］フェニル｝ピリジン−２（１Ｈ）−オン
ピリジン塩酸塩（１０．６４ｇ、９２ｍｍｏｌ）を中間体９（６．８４ｇ、１８．４２ｍｍｏｌ）に加えた。反応混合物を開放容器中で１６５℃へ３分間加熱した。水を加え、混合物を超音波処理した。沈殿物を濾取し、次いで沸騰アセトニトリル中で粉砕した。沈殿物を濾過し、標題化合物（３．８２２ｇ、９．９５ｍｍｏｌ、５４％）を得た。MS [ESI+] m/z: 358 [M+H]⁺.

化合物（１）：［１−（２，５−ジメチルベンジル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル］（ピリジン−４−イル）メタノール
中間体１（０．２５ｇ、１．０６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍｌ）中溶液に−７８℃で１．６Ｍのｎ−ブチルリチウム（０．７９ｍｌ、１．２７ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴加し、反応混合物を２０分間撹拌した。ＴＨＦ（１ｍｌ）中のイソニコチンアルデヒド（０．１７ｇ、１．５９ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴加した。さらに１０分後、反応混合物を水（１ｍｌ）でクエンチし、室温に温めた。反応混合物を酢酸エチル／水中に注いだ。有機層を分離し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２、０〜３０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製し、標題化合物（０．２ｇ、５５％）をオフホワイト色固体として得た。δ_H (CDCl₃) 8.31 (d, J 5.9 Hz, 2H), 7.69 (d, J 8.0 Hz, 1H), 7.28-7.16 (m, 4H), 7.00-6.95 (m, 2H), 6.87-6.85 (m, 1H), 6.16 (s, 2H), 5.84 (s, 1H), 5.35-5.09 (dd, J_AB17.0 Hz, 2H), 2.25 (s, 3H), 1.89 (s, 3H). LCMS (ES⁺) 344 (M+H)⁺.

化合物（２）：［１−（２，５−ジメチルベンジル）−６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル］（ピリジン−４−イル）メタノール
１−メチル−４−（４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］ジオキサボロラン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール（０．１５ｇ、０．７１ｍｍｏｌ）、及び２Ｍの炭酸ナトリウム溶液（２ｍｌ）を、中間体６（０．１５ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン：水（４：１、５ｍｌ）中溶液に加え、反応を１０分間脱気した。ＰｄＣｌ_２（ｄｐｐｆ）（０．０１ｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を１０分間脱気し、Ｂｉｏｔａｇｅマイクロ波反応器中で１００℃へ６０分間加熱した。酢酸エチルを加え、反応混合物を、セライトパッドを通して濾過した。有機層を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣を分取ＨＰＬＣにより精製し、標題化合物を白色固体として得た。δ_H (d₆-DMSO) 8.39 (dd, J 4.5, 1.6 Hz, 2H), 8.03 (s, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.64 (d, J 8.8 Hz, 1H), 7.44-7.41 (m, 2H), 7.28 (d, J 5.6 Hz, 2H), 7.06 (d, J 7.7 Hz, 1H), 6.87 (d, J 6.8 Hz, 1H), 6.70 (d, J 5.5 Hz, 1H), 6.01 (d, J 5.5 Hz, 1H), 5.83 (s, 1H), 5.63-5.43 (m, 2H), 3.82 (s, 3H), 2.33 (s, 3H), 1.92 (s, 3H). LCMS (ES⁺) 424 (M+H)⁺.

化合物（３）：５−（１−［２−（ジフルオロメトキシ）ベンジル］−２−｛［３−（２−オキソ−ピロリジン−１−イル）フェノキシ］メチル｝−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−６−イル）−ピリジン−２（１Ｈ）−オン
２−［３−（２−オキソピロリジン−１−イル）フェノキシ］酢酸（２当量）を、ＨＡＴＵ（２当量）のＤＭＦ（２ｍＬ）中溶液に添加した。混合物を３０分間撹拌した。中間体９（１当量）のＤＭＦ（２ｍＬ）中溶液を加え、混合物を室温で２４時間撹拌した。次いで温度を５０℃へ上昇させ、撹拌を２４時間継続した。溶媒を蒸発させ、残渣を酢酸（４ｍＬ）中に溶解させ、８０℃へ５時間加熱した。酢酸を蒸発によって除去した。残渣を水／クロロホルム（１：１、６ｍＬ）間で、５０℃で分配した。層を相分離器の使用により分離した。水層をクロロホルム（４ｍＬ）で洗浄し、有機層を蒸発により乾燥させた。残渣をＤＭＳＯ（１ｍＬ）中に取り、分取ＬＣＭＳにより精製して、標題化合物を得た。

（例２） − 式（４）のコンジュゲートの合成
中間体１０：１−（２，５−ジメチルベンジル）−６−［４−（ピペラジン−１−イルメチル）−フェニル］−２−（ピリジン−４−イルメチル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール
中間体７、８及び９の調製に相当する一連のステップによる合成の後、適切なボロン酸、適切なアミン、及び適切なカルボン酸を利用して化合物（３）を調製した。

コンジュゲート（４）
中間体１０（２７．０２ｍｇ、０．０５３８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解した。５（−６）カルボキシフルオレセインスクシニミルエステル（２４．１６ｍｇ、０．０５１０ｍｍｏｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号：Ｃ１３１１）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解し、明黄色の溶液を得た。２つの溶液を室温で混合すると、混合物が赤色になった。混合物を室温で撹拌した。混合後すぐに、２０μＬのアリコートを取り出し、ＡｃＯＨ：Ｈ_２Ｏの８０：２０混合物で希釈して、１２００ＲＲ−６１４０ＬＣ−ＭＳシステムでＬＣ−ＭＳ解析した。クロマトグラムは、１．４２及び１．５０分の保持時間の２つの近い溶出ピークを示し、これらのピークは両方とも質量（Ｍ＋Ｈ）^＋＝８６０．８ａｍｕであり、５−及び６−置換カルボキシフルオレセイン基で形成された２つの生成物に相当した。保持時間２．２１分でのさらなるピークは、（Ｍ＋Ｈ）^＋＝５０２．８ａｍｕの質量を有し、中間体１０に相当した。未反応の５（−６）カルボキシフルオレセインスクシニミルエステルについてのピークは観察されなかった。ピーク面積は、３つのシグナルについて２２．０％、３９．６％及び３１．４％であり、その時間点で６１．６％が所望の生成物の２つの異性体に変換されていることが示された。さらに２０μＬのアリコートを数時間後に抽出し、次いで一晩撹拌した後、先のように希釈し、ＬＣ−ＭＳ解析を行った。これらの時間点で、変換の割合はそれぞれ７９．８％及び８８．６％と決定された。混合物を、ＵＶ指示分取ＨＰＬＣシステムで精製した。プールされた精製画分を凍結乾燥し、過剰の溶媒を除去した。凍結乾燥後、オレンジ色の固体（２３．３ｍｇ）が収集され、これは０．０２７ｍｍｏｌの生成物と同等であり、反応及び分取ＨＰＬＣ精製に対して全収率５３％に相当した。

（例３） − ＴＮＦαに結合する化合物のスクリーニング
式（１）及び（２）の化合物を、以下のアッセイを使用してスクリーニングした。

３８４ウェルの未コーティングプレート（標準結合）Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙプレート（ＭＳＤ）を、ＴＮＦＲの細胞外ドメイン（ＴＮＦＲ−ＥＣＤ）（１０μｌ、ＰＢＳ中１ｕｇ／ｍＬ）で一晩コーティングした。均一な分布を確実にするために、プレートを１０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。次いでプレートを密閉し、＋４℃で一晩保存した。

プレートのウェルを、次いで０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０μｌのリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ６．５（ＰＢ）（洗浄バッファー）で３回洗浄し、次いで５０μｌの２％ＢＳＡでブロックした。次いで、プレートを室温で振とう器（６００ｒｐｍ）において２時間インキュベートした。このインキュベーション後、プレートを洗浄した（ウェル当たり３×５０μｌの洗浄バッファー）。

ブロッキングインキュベーションの間、式（１）及び（２）の化合物を、ＴＮＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とプレインキュベートしてから、予めブロックした洗浄ＭＳＤプレートに加えた。図３Ａに示すシングルポイントアッセイのため、化合物を、最終濃度１００μＭ（５％最終ｖ／ｖ ＤＭＳＯ）でアッセイした。

ＥＣ５０値の決定図３Ｂ及び３Ｃ）のため、アッセイに加えるときに試験化合物の最高濃度が５０又は１００μＭ（５％最終ｖ／ｖ ＤＭＳＯ）となるように、式（１）及び（２）の化合物をＤＭＳＯで２倍又は３倍希釈した。予め希釈した式（１）及び（２）の化合物を、１：１の比率で４ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）に加え、次いで室温で６００ｒｐｍの振とう器において１時間インキュベートした。

式（１）又は（２）の化合物とＴＮＦαとの１０μｌのプレインキュベート混合物を、調製したＭＳＤプレートに加え、室温で振とう器において１時間インキュベートした。

次いで、プレートを洗浄バッファー（ウェル当たり３×５０μｌ）で洗浄した。次いでスルホタグ化抗ＴＮＦポリクローナル抗体を各ウェルに加え、プレートを室温で振とう器においてさらに１．５時間インキュベートした。

次いでプレートを洗浄し（ウェル当たり３×５０μｌの洗浄バッファー）、その後、５０μｌのＭＳＤ ＲｅａｄバッファーＴと界面活性剤（Ｈ_２Ｏで２分の１に希釈）を加え、ＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ６０００で読み取った。

シングルポイントアッセイのため、阻害パーセンテージを、化合物を含まない対照試料を使用して計算した。

ＥＣ５０のため、判定結果を、４パラメータロジスティックモデル（シグモイド型用量応答モデル）を使用して標準的手段により計算した。

図３Ａから分かるように、当技術分野で既知のＴＮＦαアンタゴニストの代表例である「ＳＰＤ−３０４」と標識された化合物は、＋８０％の阻害値％を有し、このことから、この化合物がＴＮＦαのその受容体への結合を阻害することが示される。対照的に、試験した化合物のいくつかは、負の阻害値％を有し、このことから、これらの化合物がＴＮＦ受容体へのＴＮＦαの結合を増強することが示される。

同様に、式（１）の化合物図３Ｂ）及び式（２）の化合物図３Ｃ）の用量応答は、負の阻害曲線を生じる。別言すると、固定化ＥＣＤ−ＴＮＦＲへのＴＮＦαの結合は、化合物の濃度が増加するにつれて増強されるようである。この理由により、ＩＣ５０でなくＥＣ５０（全効果の５０％を与える化合物の濃度）を計算する必要がある。この場合に、式（１）の化合物のＥＣ５０は４．６μＭであり、式（２）の化合物のＥＣ５０は３．７μＭであった。

また表面プラズモン共鳴を使用するＢＩＡ（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用して、化合物誘導性のＴＮＦ受容体へのＴＮＦαの結合増強を測定することができる。この目的のために、Ｂｉａｃｏｒｅ Ａ１００／４０００を使用した。いわゆる溶液内競合／増強アッセイにおいて、ＴＮＦ受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ−ＴＮＦＲ）を、ｐＨ５で、ＨＢＳ−Ｐバッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、ＢＩＡｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中のＣＭ５センサに１ＫＲＵのレベルまで固定化した。

化合物は、アッセイにおける最高濃度が２０μＭとなるように、段階的に２倍希釈した。例えば、典型的アッセイでは、２０μＭ、１０μＭ、５μＭ、２．５μＭ、１．２５μＭ、０．６２５μＭ、０．３１２μＭ、０．１５６μＭ、０．０７８μＭ、０．０３９μＭの化合物溶液を使用しうる。化合物を、０．５〜１ｎＭのＴＮＦαと混合し、少なくとも５時間平衡化した。対照化合物を、１０〜１５サイクル毎に試験した。ＴＮＦα／化合物混合物を、固定化されたＴＮＦＲ上に３分間流動し、続けて表面再生を各サイクル後に１０ｍＭのＨＣＬ１回３０ｍＬを流量３０ｍＬ／分で注入して行った。バックグラウンド減算結合曲線を、標準的手法に従って、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して解析した。ＥＣ５０データは、４パラメータロジスティック適応を使用して決定した。図４Ａ及び図４Ｂは、式（１）及び式（２）の化合物についての進行曲線をそれぞれ示している。化合物の非存在下でのＴＮＦαに対するＲＵ（共鳴単位）値を曲線から差し引いているため、化合物により誘導された結合の増加のみがここで示されている。化合物の濃度が増加するにつれて、より高いＲＵ値で進行曲線はプラトーに達する。この曲線から、４パラメータロジスティック適応モデルを使用して、５０％の最大効果を与える化合物の濃度を決定することにより、ＥＣ５０値を計算することができる。これらの実験において、式（１）の化合物のＥＣ５０は２９８ｎＭであり、式（２）の化合物のＥＣ５０は２８０ｎＭであると計算された。

ＥＣ５０がアッセイ間変動を示すこと並びにＢｉａｃｏｒｅアッセイ及びＭＳＤアッセイについての条件が非常に異なっていることに注意を要する場合がある。結果として、測定されたＥＣ５０は、２つのアッセイ形式について一致するとは予測されない。

（例４） − ＴＮＦαへの化合物１の結合の質量分析解析
質量分析は、典型的に、Ｗａｔｅｒｓ ＬＣＴ−ｐｒｅｍｉｅｒ飛行時間型質量分析計又はＷａｔｅｒｓ ＳｙｎａｐｔＧ２ Ｑ−ＴＯＦ質量分析計を使用して行った。試料を、従来の分析計に代わるＡｄｖｉｏｎ Ｔｒｉｖｅｒｓａ Ｎａｎｏｍａｔｅナノフロー注入装置を使用して導入し、試料注入は、公称流量１００ｎｌ／分の５μＭノズルサイズを有する「Ａ」シリーズチップを介した。Ｗａｔｅｒｓ ＬＣＴ−ｐｒｅｍｉｅｒ飛行時間型質量分析計へのさらなる改変は、供給源温度の正確な制御を可能にするカスタマイズされた供給源冷却装置及び供給源領域における真空状態に正確な制御を与える市販の圧力制御装置を含む。これらの改変はまとまって、ＴＮＦαトリマーが天然のフォールディングされたコンフォメーションを保持することを助け、弱い親和性で試験化合物と形成される複合体の検出を容易にする。典型的な設定は、供給源温度：１０℃、供給源圧力３．７４ｅ^−３ｍｂａｒ、解析機圧力１．５４ｅ^−６ｍｂａｒであった。

イオンは、ＴＮＦαに複数の電荷をもたらす標準的な正イオンエレクトロスプレー条件を使用して生成した。

質量分析は、タンパク質試料中に存在するバッファー塩に対して非常に敏感である。リン酸カリウム又はリン酸ナトリウムなどの典型的なバッファー塩は、イオン化に深刻な有害作用を有する。したがって、タンパク質を質量分析適合バッファー系、典型的にはｐＨ６．８の５０ｍＭの酢酸アンモニウムへと交換するＺｅｂａ脱塩スピンカラムを使用してタンパク質試料を前処理し、これらの塩を除去した。

ソフトイオン化条件下でトリマー種の１００％透過が観察されるとき、トリマー形態が＋１２、＋１３及び＋１４イオンを含む荷電状態エンベロープとして観察される１００％水性環境の天然条件下で５％ｖ／ｖ ＤＭＳＯを添加すると、荷電状態エンベロープがより低いｍ／ｚ（より高いｚ）に移行し、予測されたように、有機共溶媒が溶液中でトリマー種の一部のアンフォールディングを生じさせることが示され、モノマーレベルの上昇も検出される。１０％ｖ／ｖ ＤＭＳＯを添加すると、モノマー形態に関連する荷電状態エンベロープのみが観察され、このレベルのＤＭＳＯが溶液中のトリマー形成を妨害することが示される。典型的に、試験化合物は、１０ｍＭのＤＭＳＯストック溶液として存在させたため、それらを溶液中のＴＮＦαとインキュベートするとき、最終ＤＭＳＯ濃度は５％である。ソフトイオン化条件下で、荷電状態エンベロープは、５％ＤＭＳＯ対照スペクトルだけでなく１００％水性下で取得されるスペクトルと比較しても、より高いｍ／ｚ（より低いｚ）へ移行することが観察され、試験化合物が５％ＤＭＳＯの不安定化効果を克服できること及び天然条件下での観察を上回る安定化を与えることができることが示される。このことは、記載される様々な条件下でタンパク質によって取得される電荷の数が変化することによって証拠付けられる。

測定される「結合」速度は、速度定数ｋ_ｏｎと試験化合物の濃度との算術積であり、高濃度の試験化合物で観察される速度は、低濃度で観察される速度よりも大きい。質量分析により様々な試験化合物濃度で観察される速度を実験的に測定することにより、誘導すべき速度定数（ｋ_ｏｎ）の値が与えられる。典型的な実験では、試験化合物とＴＮＦαトリマーとの混合物を、Ａｄｖｉｏｎ Ｔｒｉｖｅｒｓａ Ｎａｎｏｍａｔｅロボットを使用して、ＴＮＦα及び試験化合物のストック溶液から所望の濃度で調製する。次いで、試料を、質量分析計に数分間にわたって注入し、その期間、遊離ＴＮＦαとＴＮＦα／試験化合物複合体の質量スペクトルのシグナル比率を記録する。この作業をいくつかの様々な試験化合物／ＴＮＦα比について繰り返す。

様々な試験化合物／ＴＮＦα比について記録したデータを、Ｇｒａｐｈｐａｄ ＰＲＩＳＭ ｖ．５を使用して、理論単相対数会合曲線（ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｏｎｅ ｐｈａｓｅ ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ）に適応させてｋ_ｏｎ値を導出した。これにより、Ｂｉａｃｏｒｅで観察された低いｋ_ｏｎ値が確認された。

試験化合物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の１０ｍＭ溶液として調製した。したがって、試験化合物の非存在下で天然のＴＮＦαトリマーに対するＤＭＳＯの影響を確立する必要があった。ＤＭＳＯをＴＮＦαトリマーの水溶液に加えて最終濃度を５％ｖ／ｖとし、質量スペクトルを取得した。

１００％水性環境において、つまりＤＭＳＯの非存在下で、大部分のＴＮＦαはトリマー形態で存在するが、有意な割合でＴＮＦαモノマーが存在する。１００％水性環境において、ＴＮＦαのトリマー形態は、＋１２、＋１３及び＋１４イオンを含む荷電状態エンベロープとして観察される図５、下部トレース）。

５％ｖ／ｖ ＤＭＳＯの添加で、観察されるトリマーＴＮＦαはより少なくなった。荷電状態エンベロープは、より低い質量／電荷比（ｍ／ｚ）に移行し、ＤＭＳＯがトリマー種の部分的なアンフォールディングを引き起こしたことが示される。モノマーＴＮＦαのレベルの上昇が、５％ｖ／ｖ ＤＭＳＯの存在下においても検出された。

１０％ｖ／ｖ ＤＭＳＯを添加したとき、モノマー形態に関係する荷電状態エンベロープのみが観察され、このレベルのＤＭＳＯがＴＮＦαのトリマー形成を妨害することが示される図５、上部トレース）。

式（１）の化合物を、ＴＮＦα及び５％ｖ／ｖ ＤＭＳＯを含む溶液に加え、質量スペクトルを取得した。トリマーＴＮＦαは、式（１）の化合物の存在下で５％ｖ／ｖ ＤＭＳＯの溶液中に存在することが分かった図５、中央トレース）。式１の化合物が結合されたＴＮＦαについて観察される荷電状態エンベロープは、より高いｍ／ｚ値（専ら＋１２及び＋１１）に移行し、式（１）の化合物が、ＤＭＳＯのＴＮＦαに対する弱いアンフォールディング作用を克服するだけでなく、ＤＭＳＯの非存在下で観察されるものを上回るトリマーＴＮＦα複合体の安定化に至ることを明らかにする。

試験化合物が結合する前に十分にトリマーＴＮＦα複合体を弱めるためにＤＭＳＯを存在させることが必要かという疑問に対処するために、１００％水溶性条件下で水溶性化合物を用いて実験を繰り返した。ＤＭＳＯの非存在下において、トリマー複合体に結合された化合物は、ＤＭＳＯが存在したときの観察と同じ高いｍ／ｚ比への移行を生じさせた（データ示さず）。これにより、試験化合物が、ＴＮＦαトリマーへ結合するためにＤＭＳＯの存在を必要としないこと、及び不安定化剤の存在にかかわらずそれらの安定化効果を発揮しうることが確認された。

試験化合物によるＴＮＦαのトリマー形態の安定化のさらなる証拠を、天然のトリマー形態のモノマーへの分解に有利な傾向である、より厳しいイオン化条件下で試料を解析することから取得した。ＴＮＦαが式（１）の化合物と結合するとき、これらの条件下で検出されるＴＮＦαモノマーの量は顕著に減少した（データ示さず）。このことは、試験化合物が、ＴＮＦαトリマーを質量分析法による妨害から保護することを示唆する。

（例５） − ＴＮＦα−式（１）の化合物複合体の化学量論
式（１）の化合物を含む試験化合物のライブラリーとＴＮＦαとのインキュベーションを、ソフトイオン化条件下で質量分析によりモニターした。データは、ＴＮＦαトリマー当たり１分子の式（１）の化合物としての結合化学量論を示す図６。式（１）の化合物は、ＴＮＦαのモノマー形態への結合は観察されなかった。ＴＮＦαのダイマー形態の安定化について証拠となるものはなかった。このことは、式（１）の化合物を含む試験化合物が、ＴＮＦαのダイマー形態を安定化する既知の化合物とは異なる作用様式を有することを立証する。

（例６） − ＴＮＦαトリマーにおけるモノマー交換
ヒト及びマウスのＴＮＦαホモトリマー（それぞれＨ_３及びＭ_３）を一緒にインキュベートし、溶液のアリコートを、交差種のヘテロトリマーの出現について、質量分析によりモニターした。質量分析の解析により、天然ＴＮＦαトリマー間のモノマー交換が溶液中で生じうることが確認された。交換速度は遅く、完全な平衡が達成されるまでに４時間の経過にわたってモニターした（データ示さず）。機構は不明であるが、ダイマー形態は何ら観察されなかったので、ダイマー形態の形成が関与している可能性は低い。モノマー交換は、純粋なヒトトリマーとマウストリマーとの間で生じているようであり、マウストリマーとヒトトリマーとを単純に混合するだけで、この交換が質量分析により確認できるようになる。

第２の一連の実験において、過剰な式（１）の化合物をヒトＴＮＦαとインキュベートし、次いで、過剰な式（１）の化合物を除去した。質量スペクトル解析により、１：１複合体が、式（１）の化合物とｈ−ＴＮＦαとの間で形成されていることが確認された。マウスＴＮＦαをこの試料に加え、次いで、数時間にわたって質量スペクトル解析に供した。１８時間後、試料の組成の変化は観察されなかった。モノマーサブユニット交換は特に生じず、ＭＨ_２及びＭ_２Ｈのような遊離体又はＭＨ_２Ｌ及びＭ_２ＨＬのようなライゲート体のいずれの混合ヘテロトリマー種の形成も観察されなかった。さらに、Ｍ_３Ｌ種の形成の証拠はなく、ライゲートされていないＨ_３種の形成の証拠もなかった。このことは、式（１）の化合物がｈ−ＴＮＦαに一旦結合すると、測定可能な解離速度がないことを強く示唆する。そのように、ｈ−ＴＮＦαと共にプレインキュベートするとき、式（１）の化合物はヒトトリマーを閉鎖し、それゆえ、交差種モノマーサブユニット交換が観察されなかった。

次いで、実験を逆方向で繰り返した。過剰な式１の化合物をマウスＴＮＦαとインキュベートし、次いで、過剰な式（１）の化合物を除去した。質量スペクトル解析により、１：１複合体が、式（１）の化合物とｍ−ＴＮＦαとの間で形成されていることが確認された。ヒトＴＮＦαをここでこの試料に加え、次いで、数時間にわたって質量スペクトル解析に供した。データからモノマーサブユニット交換が生じうることが明確に示され、混合ヘテロトリマー種の形成が、遊離体（ＭＨ_２及びＭ_２Ｈ）並びにライゲート体（ＭＨ_２Ｌ及びＭ_２ＨＬ）状態の両方で観察された。さらに、ライゲートされたヒトホモトリマー（Ｈ_３Ｌ）、ライゲートされていないマウスホモトリマー（Ｍ_３）及び未結合の式（１）の化合物（Ｌ）の証拠があった。このことから、式（１）の化合物とマウスＴＮＦαホモトリマーとの間で１：１複合体は形成されるが、測定可能な解離速度があることが示唆される。一旦この複合体（Ｍ_３Ｌ）が解離すると、Ｈ_３種とＭ_３種との間とのモノマーサブユニット交換が進行し、解放されたリガンドは溶液中に存在する４つ全てのトリマー種と複合体を形成することができるようになる。そのように、ｍ−ＴＮＦαとプレインキュベートするとき、式（１）の化合物はモノマーサブユニット交換を阻止せず、混合ヘテロトリマーの形成が観察された。

次いで、これらの２つの実験を、式（１）の化合物に代えて式（２）の化合物を用いて繰り返した。式（２）の化合物をｈ−ＴＮＦαとプレインキュベートし、１：１複合体を得て、その後、ライゲートされていないｍ−ＴＮＦαと混合したときの結果は、式（１）の化合物を用いた場合と同じであった。モノマーサブユニット交換は観察されず、１８時間後、Ｈ_３Ｌ種及びＭ_３種のみが溶液中で観察され、式（２）の化合物はまた、ｈ−ＴＮＦαと複合体化されたとき、測定可能な解離速度を有しないことが確認された。そのように、ｈ−ＴＮＦαとプレインキュベートするとき、式（２）の化合物はヒトトリマーを閉鎖し、それゆえ、交差種モノマーサブユニット交換が観察されなかった。

しかしながら、式（１）の化合物とは対照的に、式（２）の化合物をｍ−ＴＮＦαとプレインキュベートしたとき、１：１複合体が形成され、次いでライゲートされていないｈ−ＴＮＦαと混合すると、モノマーサブユニット交換は観察されず、１８時間後、Ｍ_３Ｌ種及びＨ_３種のみが溶液中で観察された。このことは、式（２）の化合物は、ｍ−ＴＮＦαと複合体化されたときも、測定可能な解離速度を有しないことを示唆する。そのように、ｍ−ＴＮＦαとプレインキュベートするとき、式（２）の化合物はマウストリマーを閉鎖し、それゆえ、交差種モノマーサブユニット交換が観察されなかった。

まとめると、これらのデータから、式（１）の化合物と式（２）の化合物とはヒトＴＮＦαに対して同様の親和性を有する一方で、マウスＴＮＦαトリマーに対しては異なる親和性を有し、式（２）の化合物は、マウスＴＮＦαトリマーに対して、式（１）の化合物よりも強固に結合することが示唆される。

（例７） − ＴＮＦα、ＴＮＦ−Ｒ及び式（１）の化合物を使用するサイズ排除実験からの画分の質量分析の解析
ＴＮＦα、ＴＮＦ−Ｒ及び式（１）の化合物の混合物のサイズ排除クロマトグラフィーからの画分を、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により解析した。２つの試料をサイズ排除クロマトグラフィーのために調製した。第１の試料では、式（１）の化合物をＴＮＦαとプレインキュベートした後、化合物−トリマー複合体をＴＮＦ−Ｒに加えた。第２の試料では、式（１）の化合物を、ＴＮＦαとＴＮＦ−Ｒとの予め形成された複合体に加えた。ＬＣ−ＭＳ解析により、式（１）の化合物が、２つのタンパク質を含有するこれらの化合物画分と会合していることが分かり図７、このことから、添加の順序にかかわらず、式（１）の化合物が依然としてＴＮＦαに結合できること、つまり、式（１）の化合物が、ＴＮＦ−Ｒの存在下であってもＴＮＦαに結合することが示唆される。

（例８） − ＴＮＦ−ＲへのＴＮＦα及び式（２）の化合物−ＴＮＦαトリマー複合体の結合の等温熱量解析
ＩＴＣバッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中のＴＮＦα（１２８μＭ）を、化合物２のＤＭＳＯストックと６０分間インキュベートし、５％ＤＭＳＯ中３００ｍＭの最終化合物濃度を得た（試験試料）。また化合物でなくＤＭＳＯをＴＮＦα試料に加えた対照試料を６０分間インキュベートした（対照）。

インキュベーション後、試料を、Ｎａｐ５サイズ排除カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でゲル濾過した。カラムを１５ｍｌのＩＴＣバッファーで平衡化した後、５００μｌの試料を加えてカラムに流し、１ｍｌのＩＴＣバッファーを使用して溶出した。このプロセスは、ＴＮＦ及び化合物結合ＴＮＦを、遊離化合物及びＤＭＳＯから分離する。

２８０ｎｍでの吸光度読取りを使用して、ＮＡＰ５カラムから溶出された後の試験試料又は対照中のＴＮＦα濃度を決定し、試料を６４μＭのＴＮＦα濃度へ希釈した。

２００μｌのＴＮＦＲ１（１０ｍＭ）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、（Ｐｌａｔｅｓ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｂプロトコルを使用して）自動的にＡｕｔｏＩＴＣ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の試料セルに装着した。２つの実験において、４０μｌの試験試料又は対照のいずれかを、同じプロトコルを使用して自動的に注入シリンジに装填した。

ＩＴＣ実験を、等温プロット図８Ａ及びＢ）で説明されているＩＴＣ注入プロトコルを使用して、１０００ｒｐｍで撹拌しながら２５℃で実施した。

データを収集し、Ｏｒｉｇｉｎ４．０ ＳｏｆｔｗａｒｅのＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＩＴＣアプリケーションを使用して解析し、結果を、１部位結合アルゴリズムを使用して計算した。

試験化合物の非存在下におけるＴＮＦ−ＲへのＴＮＦαの結合のＫ_Ｄは７７ｎＭと計算された図８Ａ）。式（２）の化合物の存在下におけるＴＮＦ−ＲへのＴＮＦαの結合のＫ_Ｄは、熱量計の感度の範囲未満であり、正確に計算することはできなかった。しかしながら、熱量計の検出下限は約１ｎＭである。したがって、式（２）の化合物の存在下におけるＴＮＦ−ＲへのＴＮＦαの結合のＫ_Ｄは、１ｎＭ以下であるはずである図８Ｂ参照）。

（例９） − 式（１）の化合物へ結合されたトリマーＴＮＦαの結晶構造
ＴＮＦαを式（１）の化合物とプレインキュベートして、得られた化合物−トリマー複合体を結晶化した。化合物−トリマーＴＮＦα複合体の結晶構造を、Ｘ線結晶解析を使用して決定した。複合体の２．２Åの分解能での結晶構造を、図９に示す。化合物が、もはや対称でないトリマーの中央に見える。

（例１０） − 本発明の化合物によるＴＮＦαの中和
Ｌ９２９中和アッセイを、Baarsch MJJ et al（Immunol Methods 1991; 140: 15-22）及びGalloway CJ et al J（Immunol Methods 1991; 140: 37-43）に開示されているプロトコルを使用して実施した。

簡単に述べると、Ｌ９２９細胞（ＥＣＡＣＣ、８５０１１４２５）を、１０％のＦＣＳ（ＰＡＡ）、２ｍＭのグルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン（Ｇｉｂｃｏ）及び５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）からなる培養培地で培養した。継代されたとき、細胞をカルシウム及びマグネシウムを含まない１０ｍＬのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｇｉｂｃｏ）で３回洗浄し、次いで３ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を２分間加え、細胞をフラスコから取り出した。培養培地を加えてトリプシンを中和し、細胞をピペットで上下して、あらゆる塊を除去した。

Ｌ９２９細胞は、使用の前日に１／２又は１／３に分割し、さらに２４時間培養した。次いで、フラスコを上記のようにトリプシン処理し、９６ウェルの平底プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のウェル毎に１００μｌ中２×１０^４個の細胞を加えた。プレートは、アッセイを設置する前に２４時間培養した。

段階希釈液を、化合物のＤＭＳＯストックから作製した。典型的には、化合物の濃縮溶液から２倍希釈して、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６、０．７８、０．３９、０．２、０．１μＭの最終アッセイ濃度を得ることにより、９点滴定曲線を作成する。

アッセイ培地は培養培地と同じであるが、１μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ）を含んだ。培地をプレートからはじき飛ばし、アッセイ試料プラスＴＮＦα、標準及び対照を１００μｌの体積に２連で加えた。プレートをさらに１６時間インキュベートし、次いで、ウェル当たり１０μｌの５ｍｇ／ｍｌメチルチアゾールテトラゾリウム（ＭＴＴ；Ｓｉｇｍａ）の培養培地中溶液をさらに４時間加えた。反応を、５０％のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；ＢＤＨ）及び５０％脱イオン水に溶解した２０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、ＢＤＨ）を含有する１００μｌの溶解バッファーの添加により停止した。

３７℃で一晩インキュベートして色素を溶解させた後、プレートをＭｕｌｔｉｓｋａｎ ＥＸプレートリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ）で、５７０ｎｍで読み取り、６３０ｎｍでの読取りを減算した。データを、Ｇｅｎｅｓｉｓソフトウェアパッケージを使用して分析した。

式（１）の化合物と式（２）の化合物の両方がヒトＴＮＦαの細胞殺傷活性を阻害し図１０、このことから、式（１）の化合物と式（２）の化合物の両方がＴＮＦ−Ｒを通じたヒトＴＮＦα誘導性シグナル伝達を阻害することができることが示された。この例において、式（１）の化合物のＩＣ_５０値は３０６ｎＭであり、式（２）の化合物のＩＣ_５０値は１２５ｎＭであった。またＴＮＦ−Ｒを通じたヒトＴＮＦα誘導性シグナル伝達を阻害することが同じく分かった式（３）の化合物を使用して、プロトコルを繰り返した。したがって、式（３）の化合物のＩＣ_５０値は２１ｎＭであった。

（例１１） − 式（１）の化合物によるＴＮＦα誘導性ＩＬ−８産生の阻害
健常ドナー由来の静脈血を、静脈穿刺（ｖｅｎｕｐｕｎｃｔｕｒｅ）によりナトリウム／ヘパリン含有チューブ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に収集した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、密度勾配遠心分離により単離した。簡単に述べると、１０ｍＬの血液を、ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）を用いて１：１（ｖ／ｖ）希釈し、２０ｍＬのＦｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ上に慎重に積層した。細胞を３０分間（ｍｉｎ）４７０ｇでスピンして沈降させ、ＰＢＭＣを収集し、ＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄し、任意の残余の混入赤血球を、赤血球溶解バッファー（１ｇ／ＬのＫＨＣＯ_３、８．３ｇ／ＬのＮＨ_４Ｃｌ、０．０３７２ｇ／ＬのＥＤＴＡ）で溶解した。ＰＢＭＣからの単球の単離は、製造業者の説明書に従って、ＣＤ１４＋Ｍａｇｎｅｔｉｃ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して実施した。簡単に述べると、ＰＢＭＣを、５％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）及び２ｍＭのＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を含有するダルベッコ変法イーグル培地に１×１０^７細胞／ｍｌで再懸濁した。１０^７個の全細胞当たり２５μＬのＣＤ１４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを、室温で１５分間インキュベートした。磁気分離を、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して実施した。細胞／ビーズ混合物をカラムに適用する前に、カラムを磁場に置き、５ｍＬのバッファーで２回洗浄した。次いで、細胞懸濁液を磁場中でカラムにかけた。ＣＤ１４^＋ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓに結合する単球はＬＳカラムに保持され、一方で残余のＰＢＭＣをカラムに通過させた。単球を単離するために、カラム（保持された細胞を含む）を、磁石から取り出して、収集チューブに入れた。５ｍＬのバッファーをカラムに加え、ＣＤ１４^＋細胞を、カラムの上部にシリンジプランジャーを適用することにより、カラムから収集した。収集した細胞をＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。

化合物（ストック濃度１０ｍＭ）の１１点３倍段階希釈（ブランクを含む）を、９６ウェルの丸底プレート中で、ＤＭＳＯで行った。精製された単球を、遠心分離（３００ｇで５分間）によって洗浄し、１×１０^６細胞／ｍＬの濃度で完全培地に再懸濁した。１６０μＬのこの細胞集団を、９６ウェルの丸底プレート中で、４０μＬの化合物及びＲＰＭＩ１６４０中のＴＮＦα（最終濃度（約１ｎｇ／ｍｌ）又は適切な対照とともに、３７℃で三連にてインキュベートした。

１８時間後、プレートをスピンダウンし（３００ｇ、５分間）、上清をサイトカイン測定のために収集した。

ヒトＩＬ−８を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ．からの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを使用して、製造業者の説明書に従って細胞培養上清中で測定した。ＥＬＩＳＡのために使用した基質は、ＴＭ Ｂｌｕｅ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）であった。プレートを６３０ｎｍの波長で読み取り、４７０ｎｍで補正した。式（１）の化合物は、濃度依存的様式でＴＮＦα誘導性のＩＬ−８産生を阻害し図１１、ＩＣ_５０値は４５４．１ｎＭであった。

（例１２） − 式（２）の化合物によるＴＮＦα誘導性ＮＦ−κＢ活性化の阻害−レポーター遺伝子アッセイ
ＴＮＦ−アルファによるＨＥＫ−２９３細胞の刺激により、ＮＦ−ｋＢ経路の活性化が導かれる。ＴＮＦアルファ活性を決定するために使用したレポーター細胞系を、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎから購入した。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＣＤ４０Ｌは、５ＮＦ−ｋＢ結合部位に融合されたＩＦＮ−ベータ最小プロモーターの制御下でＳＥＡＰ（分泌アルカリ性ホスファターゼ）を発現する安定な形質転換体である。これらの細胞によるＳＥＡＰの分泌は、濃度依存的様式で、ＴＮＦ−アルファ（０．５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１−ベータ（０．５ｎｇ／ｍｌ）及び活性化抗ヒトＴＮＦＲ１抗体（３００ｎｇ／ｍｌ）により刺激される。

化合物を、１０ｍＭのＤＭＳＯストック（最終アッセイ濃度０．３％）から希釈し、１０点３倍段階希釈曲線（３０，０００ｎＭから２ｎＭの最終濃度）を作成した。それら化合物希釈液を、３８４ウェルのマイクロタイタープレート中で１時間、刺激リガンドと混合した。新たに解凍して洗浄した細胞を、化合物／刺激物の混合物に加え、さらに１８時間インキュベートした。ＳＥＡＰ活性を、比色定量基質Ｑｕａｎｔｉ−ｂｌｕｅ（商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用して上清中で決定した。

化合物希釈液の阻害パーセンテージを、ＤＭＳＯ対照及び最大阻害（過剰の対照化合物による）と、Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｂａｓｅのｘｌｆｉｔ（４パラメータロジスティックモデル）を使用して計算したＩＣ５０との間で計算した。

各化合物のＴＮＦ−アルファ応答に対する比活性を、カウンタースクリーン（ｃｏｕｎｔｅｒｓｃｒｅｅｎ）（ＩＬ−１ベータ及び抗ヒトＴＮＦＲ１抗体）で見られる比活性と比較した。

式（２）の化合物は、ＴＮＦαによるＮＦ−κＢの活性化を濃度依存的様式で阻害し、ＩＣ_５０は１１３ｎＭであった図１２Ａ）。対照的に、式（２）の化合物は、ＩＬ−１βによるＮＦ−κＢの活性化図１２Ｂ）又はＴＮＦ−Ｒ１抗体の活性化図１２Ｃ）を阻害しなかった。３０，０００ｎＭを超えるＩＣ_５０値がそれぞれの場合で得られた。したがって、式（２）の化合物は、ＴＮＦ−Ｒ１を介するＴＮＦα誘導性シグナル伝達を特異的に阻害するが、他のシグナル伝達経路により（例えば、ＩＬ−１βにより）誘導されるか又はＴＮＦαによるＴＮＦ−Ｒ１からのシグナル伝達の開始が（例えば、活性化ＴＮＦ−Ｒ１抗体の使用により）バイパスされるときのＮＦ−κＢ活性化には影響を与えない。

（例１３） − ＴＮＦαへの結合動態の決定
表面プラズモン共鳴を使用して、式（１）及び（２）の化合物のＴＮＦαへの会合速度、解離速度及び親和性を測定した図１３Ａ及びＢ）。この試験の目的のために、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００／Ｔ２００を使用した。

ＴＮＦαを、ＨＢＳ−Ｐバッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、ＢＩＡｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中ｐＨ５で５〜８ＫＲＵのレベルまでＣＭ５センサ上に固定化した。次いで、ＴＮＦαを、ＨＢＳ−Ｐ中、５％ＤＭＳＯと共に少なくとも５時間平衡化した。試料を、１０ｍＭのストックからＤＭＳＯ対応バッファーに希釈し、少なくとも５時間放置して溶解させた。流量は３０μＬ／分であった。

このアッセイは、式（１）の化合物について２５μＭ及び式（２）の化合物について１μＭの最高濃度から開始して、次いでこの試料を段階的に希釈し、４又は５つの濃度の化合物を加えることにより実施した。バックグラウンド減算結合曲線を、標準的手法に従って、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して解析した。結合、親和性、及び動態パラメータを、Ｂｉａｃｏｒｅソフトウェアを使用して決定した。動態データを、ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムを使用して適応させた。

実験により、式（１）の化合物について２．６６８ｅ^３Ｍ^−１ｓ^−１のｋ_ｏｎ図１３Ａ）及び式（２）の化合物について１．１１９ｅ^３Ｍ^−１ｓ^−１のｋ_ｏｎ図１３Ｂ）で証拠付けられるように、これらの化合物が、固定化されたＴＮＦαに非常にゆっくり結合することが示された。またこれらの化合物は、この作用様式を有する化合物に特徴的とみられる非常に遅い解離速度を有する。式（１）の化合物についての解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ）は９．４６ｅ^−５ｓ^−１であり、式（２）の化合物についての解離速度定数は、２．２４ｅ^−５ｓ^−１と等しい。これは、それぞれ２時間及び８時間を超える解離半減期（ｔ_１／２）に等しい。解離定数（Ｋ_Ｄ）は、２つの定数の比ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎから計算することができる。この実験では、式（１）の化合物及び式（２）の化合物についてのＫ_Ｄ値はそれぞれ３５ｎＭ及び２ｎＭであった。これは、例４に示されるＢｉａｃｏｒｅで決定されたＥＣ_５０より有意に低く、アッセイ形式の違いを反映しているようである。さらにＴＮＦαの形態が、例１３の動態アッセイではＴＮＦαが固定化されている点で異なっている。

式（３）の化合物のＴＮＦαへの会合速度、解離速度及び親和性を測定するために、実験を繰り返した図１３Ｃ）。式（３）の化合物は、５４７０Ｍ^−１ｓ^−１のｋ_ｏｎ、４．０６７ｅ^−５ｓ^−１の解離速度定数、及び７ｎＭのＫ_Ｄを有することが分かった。

（例１４） − 式（１）の化合物及び式（２）の化合物は、ｉｎ ｖｉｖｏでＴＮＦα活性に拮抗する。
別の試験で、式（１）及び式（２）の化合物を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解させたＴＮＦαの２０μＭ溶液と混合し、２μＭ、２０μＭ及び２００μＭの濃度にした。したがって、各化合物のＴＮＦαに対する比率は、０．１：１（試料１）、１：１（試料２）及び１０：１（試料３）であった。この溶液を、室温で３時間インキュベートして、化合物をＴＮＦαに結合させ、その後、Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してゲル濾過した。この処理は、タンパク質結合化合物と遊離化合物とを分離する。ＰＢＳのみを含む対照試料を同様に処理して、試験のためのビヒクル対照を得た。溶出タンパク質の濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（ＮＤ−１０００）を使用して決定した。ＴＮＦα：化合物複合体をＰＢＳで希釈して、０．０３μｇ／ｋｇの注入濃度にした。

試験について、典型的に、各グループは１０匹の雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を含み、これとは別に、抗ヒトＴＮＦα抗体陽性対照では１セット５匹のマウスを使用した。抗体対照マウスに、抗ｈＴＮＦαを１０ｍｇ／ｋｇ（１００μＬ）で腹腔内（ｉ．ｐ．）注入により投与し、５分後（ｔ＝−５）、ＰＢＳ又はｈＴＮＦαのいずれかを０．１μｇ／ｋｇ（ｔ＝０）でｉ．ｐ．注入により与えた。

試験マウスに、ｔ＝０で、ゲル濾過ビヒクル（ＰＢＳ）、ｈＴＮＦα（０．０３μｇ／ｋｇ）又は試料１、２及び３（ＴＮＦαとそれぞれ０．１：１、１：１及び１０：１の比で結合した化合物）のいずれかを１００μＬでｉ．ｐ．注入した。

好中球動員に対する化合物の効果を評価するために、化合物のみのマウスも試験に含めた。

全てのマウスを、ｈＴＮＦαの注入２時間後（ｔ＝２ｈ）で頚椎脱臼により殺傷し、腹腔を、３ｍＬのＦＡＣＳバッファー（２ｇのウシ血清アルブミンを含む５００ｍＬのＰＢＳ、６ｍＬのＨＥＰＥＳバッファー、及び５００ｍＬのＥＤＴＡ）で洗浄した。洗浄液を吸引し、好中球数を、下記に詳述するようなＦＡＣＳにより抗Ｇｒ１ＰＥ及び抗ＣＤ４５ＦＩＴＣで細胞を染色することによって評価した。

各試料からの１００μＬの洗浄液をＦＡＣＳチューブに分割した。ＦＡＣＳカクテルを、ＦＡＣＳバッファー中で抗ＧＲ−１ＰＥ（ＢＤ ｃａｔ＃５５３１２８ Ｌｏｔ＃７５５４２）を１対３９希釈及び抗ＣＤ４５ＦＩＴＣ（ＢＤ ｃａｔ＃５５３０８０ Ｌｏｔ＃８０８０７）を１対１９希釈で使用して作製した。Ｆｃブロック（ＢＤ Ｃａｔ＃５５３１４２ Ｌｏｔ＃８７８１０）をＦＡＣＳバッファー中、１対１０希釈で調製し、１０μＬを、抗体カクテルの添加の５分前に各試料に加えた。１０μｌの抗体カクテルを、１００μＬの試料を含有する各チューブに加えた。試料を氷上で２０分間放置した。１ｍＬのＦＡＣＳ溶解溶液（ＢＤ Ｃａｔ＃３４９２０２ Ｌｏｔ＃２９０７６、ｄＨ_２０中で１：１０に希釈）を各チューブに加え、混合し、室温で５分間放置した。１ｍＬのＦＡＣＳバッファーを次いで各チューブに加え、４００ｇで５分間遠心分離した。次いで、ＦＡＣＳバッファーを慎重に注ぎ出し、チューブの先端を吸収紙上で軽くたたいて、チューブを完全に乾燥させた。次いで、ＦＡＣＳバッファー中で１対１０希釈した３００μＬの参照ビーズ溶液（Ｓｉｇｍａ ｃａｔ＃Ｐ２４７７ Ｌｏｔ＃１１６Ｋ１６１２）を各チューブに加えた。

試料をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ ＩＩ及びＦｌｏＪｏソフトウェアを使用して解析した。

図１４は、式（１）の化合物（Ａ）及び式（２）の化合物（Ｂ）についての結果を示す。ビヒクル単独は、化合物単独と同様に（（Ｂ）がわずかに高い）、好中球動員に対してほとんど影響を与えなかった。各試験の試料１（化合物：ＴＮＦα比０．１：１）は、化合物の非存在下でＴＮＦαを加えた場合と有意な違いはなかった。試料２（１：１）及び試料３（１０：１）は、好中球動員の有意な阻害を示した（それぞれ８６％及び８５％）。同様に、式（２）の化合物の試料２及び試料３は、好中球動員の有意な阻害を示した（それぞれ１０１％及び１０２％）。抗体対照マウスは、好中球動員の１００％阻害を示した（データ示さず）。

さらなる実験において、マウスをｈＴＮＦα（０．３μｇ／ｍｌ）で処理し、式（１）の化合物を経口（ｐ．ｏ．）で投与した。

式（１）の化合物を、ｃｏｖａｒｉｓ機を使用して、１％メチルセルロースビヒクル中懸濁液にした。

抗ヒトＴＮＦαモノクローナル抗体（抗ｈＴＮＦα、ＵＣＢ）を、この試験で陽性対照として利用した。

４匹のマウスを使用した抗ｈＴＮＦαを与えた群を除いて、１群当たり１０匹の雄Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用した。

マウスに、ビヒクル（１％メチルセルロース）又は式（１）の化合物のいずれか１００μＬを３０ｍｇ／ｋｇ又は１００ｍｇ／ｋｇでｐ．ｏ．で３０分間（ｔ＝−３０）又は抗ｈＴＮＦαを１０ｍｇ／ｋｇでｉ．ｐ．で５分間（ｔ＝−５）与えてから、ヒトＴＮＦαを注入した。ｔ＝０で、マウスに、０．０３μｇ／ｋｇのＰＢＳ又はｈＴＮＦαのいずれか１００μＬをｉ．ｐ．で注入した。

全てのマウスを、ｈＴＮＦαの注入２時間後（ｔ＝２ｈ）で頚椎脱臼により殺傷し、腹腔を洗浄し、上記のように好中球数を測定した。

３０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇの式（１）の化合物の経口投与により、腹腔へのＴＮＦα刺激好中球動員が、それぞれ４９％及び７９％に減少した図１５。ｉ．ｐ．注入によって与えた陽性対照抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）は、好中球動員を完全に阻害した。

したがって、式（１）の化合物は、ＴＮＦαと予め混合し、ｉ．ｐ経路により投与したときだけでなく、経口により投与したときも、ｉｎ ｖｉｖｏでＴＮＦα活性を拮抗することができる。

（例１５） − 式（１）及び（２）の化合物によるＴＮＦα安定化の解析
蛍光プローブ温度変性アッセイを実施して、化合物結合の尺度として、ＴＮＦαの熱安定性に対する化合物の効果を評価した。反応混合物は、５μｌの３０×ＳＹＰＲＯ（登録商標）オレンジ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、並びに５μｌのＴＮＦａ（１．０ｍｇ／ｍｌ）、３７．５μｌのＰＢＳ、ｐＨ７．４、及び２．５μｌの化合物（ＤＭＳＯ中２ｍＭ）を含んだ。１０μｌの混合物を３８４ＰＣＲ光学ウェルプレートに四連で分注し、７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にかけた。ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ加熱装置を２０℃〜９９℃に傾斜率１．１℃／分で設定し、ウェルの蛍光変化を電荷結合素子（Ｃｈａｒｇｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｄｅｖｉｃｅ（ＣＣＤ））によりモニターした。蛍光強度の増加を、温度の関数としてプロットし、Ｔ_ｍをこの変性曲線の中点（変曲点として決定）として計算した（表１）。

ＴＮＦαの安定化が、Ｔｍの増加により示される。式（１）及び（２）の化合物の両方がＴＮＦαのＴｍを増加させる（表１に示されるように）。したがって、式（１）及び（２）の化合物の両方が、ＴＮＦαトリマーの安定性を高める。

表１は、化合物（１）又は（２）のいずれかの存在下におけるＴＮＦαの温度遷移中点（Ｔｍ）を示す。

（例１６） − ＴＮＦαへの式（４）の化合物の結合に対する式（１）、（２）及び（３）の化合物の効果を決定するための蛍光偏光アッセイ
式（１）の化合物を、５％ＤＭＳＯに対して１００μＭの最終濃度から開始して１０種の濃度で、６０分間、周囲温度で、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０中で、ＴＮＦαと共にプレインキュベートした後、式（４）の化合物を添加し、さらに周囲温度で一晩インキュベートすることによって、試験した。ＴＮＦα及び式（４）の化合物の最終濃度は、２５μＬの全アッセイ体積でそれぞれ５０ｎＭ及び１０ｎＭであった。プレートをＡｎａｌｙｓｔＨＴリーダーで読み取った。ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅのｘｌｆｉｔ（４パラメータロジスティックモデル）を使用して、ＩＣ５０を計算した。

結果を、図１６にグラフで示す。式（１）の化合物は、ＴＮＦαへの式（４）の化合物の結合を、１６７ｎＭのＩＣ_５０値で阻害することができた。

実験を、式（２）及び（３）の化合物を使用して繰り返した。式（２）の化合物は、ＴＮＦαへの式（４）の化合物の結合を、１０２ｎＭのＩＣ_５０値で阻害することができた。式（３）の化合物は、ＴＮＦαへの式（４）の化合物の結合を、２０ｎＭのＩＣ_５０値で阻害することができた。

（例１７） − ＴＮＦスーパーファミリーの他のメンバーを用いた予備試験
質量分析の解析により、ホモトリマーも形成するＣＤ４０Ｌが、ＤＭＳＯにより不安定化され、トリマーＣＤ４０Ｌの量の減少に至ることが示された。使用したアッセイプロトコルは、ＴＮＦαについての実施例３に記載のプロトコルと同様であるが、代わりにＣＤ４０Ｌを使用した。式（１）の化合物は、ＤＭＳＯの存在下で、トリマーＣＤ４０Ｌを安定化することが示された（図１７）。このことは、ＴＮＦαの試験に適用された質量分析技術、不安定化剤の存在下におけるそのコンフォメーション、及び本発明による化合物の効果が、ＴＮＦスーパーファミリーの他のメンバーにも適用可能であることを示している。

（例１８） − Ｍａら（２０１４）及びＳｉｌｖｉａｎら（２０１１）の化合物及び複合体は、本発明の化合物及び複合体と異なる特徴を有する
Ｍａら（２０１４）ＪＢＣ２８９：１２４５７−１２４６６の１２４５８頁に記載されているように、Ｃ８７は、ＴＮＦβの外部表面との相互作用において、ＴＮＦＲ１のループ２／ドメイン２由来の７アミノ酸ペプチドによって占められる空間に適応する分子を見つけることを試みるバーチャルスクリーニングを通じて発見された。ＭａらからのＣ８７化合物、及びSilvian et al. (2011) ACS Chemical Biology 6:636-647からのＢＩＯ８８９８化合物を、本発明者によって試験した。

知見の要約
Ｍａらで記載されたＣ８７についてのＢｉａｃｏｒｅ観察結果は再現することができなかった。
細胞におけるＴＮＦ特異的阻害の証拠は観察されなかった。
さらにＣ８７は、ミリモルの親和性に感受性である質量分析で結合が観察されなかった。
広範な結晶学的試みで、アポ−ＴＮＦ（化合物なしのＴＮＦ）のみが製造された。
蛍光偏光（ＦＰ）アッセイにおいて、Ｃ８７は、蛍光読出しを有する化合物の干渉レベルを超える有意な阻害を示さなかった。
ＴＮＦαの熱融解温度の安定化を測定するＴｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒで、Ｃ８７についての小さな安定化が示された。
要約すると、トリマーの中心にＣ８７が結合している証拠は見つからなかった。圧倒的多数のデータが、ＴＮＦαとの直接的相互作用がないことを示唆した。ＢＩＯ８８９８もＴＮＦαに結合しないことが分かった。

細胞−ＴＮＦ誘導性ＨＥＫ ＮＦＫＢレポーター遺伝子アッセイ
Ｃ８７を、ＴＮＦαと１時間プレインキュベートしてから、ＮＦκＢの制御下にＳＥＡＰで安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞に加えた。適切なカウンタースクリーンも、非ＴＮＦ関連（オフターゲット）活性を検出するために試験した。アッセイを一晩インキュベートした後、阻害を、対照化合物による１００％ブロッキングと比較して測定した。最大Ｃ８７濃度は１０，０００ｎＭであり、３倍段階希釈した。

阻害効果は検出されず、オフターゲット活性に帰属させることはできなかった。

Ｂｉａｃｏｒｅ
ａｖｉ−タグリンカーを使用してＴＮＦを固定化し、Ｃ８７にチップを通過させた。一実験では、最高濃度の１０μＭからＣ８７の用量応答を行った。結合は何ら観察されなかった。

第２の実験では、チップを通過するＣ８７の流量は減少した。小さなシフトが観察されたが、全体的な結合は無視できる程度であった。

Ｍａらに記載のＴＮＦへのＣ８７の結合は、Ｙ軸上のＲＵ値に基づいた超化学量論である可能性が高かった。チップ上の標準ＴＮＦ密度で、この値は、単純な１：１結合について、予測されるよりも３０倍高い領域にあった。

別の実験では、ＢＩＯ８８９８を、Ｂｉａｃｏｒｅ４０００機器のＳＰＲにより、ＣＤ４０Ｌの固定化可溶性形態及びＴＮＦαの可溶性形態に対して試験した。１７μＭの幾何平均ＩＣ５０がＣＤ４０Ｌに対する結合について決定され、一方で、このアッセイにおいて、ＴＮＦαに対する結合は１００μＭまでの濃度で検出されなかった。

質量分析
４００μＭの濃度でＣ８７のヒトＴＮＦα（２０μＭ）への結合の証拠はなかった。より低い分子量（約４７３Ｄａ）種が、５％未満の占有率で結合しているようである。Ｃ８７は、５０３Ｄａの分子量を有する。４００μＭの濃度での占有率に基づいて、低分子量種の１ｍＭを超える親和性が予測される。

結晶学
全体的に、ＴＮＦαとのＣ８７の結晶化について、本出願に記載の化合物における通常的手段の試験条件を含め、多大な努力が注がれた。これには、様々リガンド濃度、様々なタンパク質濃度、及び様々な浸漬時間での多数の結晶化の試みの設定が含まれる。いくつかの結晶が観察され、解析によって、塩、つまり化合物を有しないＴＮＦであることが分かった。

蛍光偏光（ＦＰ）
Ｃ８７を、蛍光化合物（プローブ）に対するアッセイの前に１時間、ＴＮＦαと共にプレインキュベートした。蛍光化合物との直接的（同じ部位で結合する）又は間接的（ＴＮＦを妨害する）のいずれかの競合が、ＦＰの減少により検出される。

阻害曲線の外挿により、約１００μＭのＩＣ５０が得られた。しかしながら、最高濃度の阻害剤で蛍光消光が観察され、差し引くと、このアッセイでＣ８７の阻害は無視できる程度となった。

Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ
Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒは、タンパク質を安定化又は妨害のいずれかをする化合物によるＴＮＦαの融解温度（Ｔｍ）の変化を測定する。３．８℃での安定化効果が５００μＭの濃度のＣ８７で観察されることから、非特異的でありうる弱い結合の可能性が示唆される。

Sequence listing

SEQ ID NO: 1 (HCVR of 1974)

DVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSAYYMAWVRQAPTKGLEWVASINYDGANTFYRDSVKGRFTVSRDNARSSLYLQMDSLRSEDTATYYCTTEAYGYNSNWFGYWGQGTLVTVSS


SEQ ID NO: 2 (LCVR of 1974)

DIQMTQSPASLPASPEEIVTITCQASQDIGNWLSWYQQKPGKSPQLLIYGATSLADGVPSRFSASRSGTQYSLKISRLQVEDFGIFYCLQGQSTPYTFGAGTKLELK


SEQ ID NO: 3 (1974 HC mIgG1 full)

DVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSAYYMAWVRQAPTKGLEWVASINYDGANTFYRDSVKGRFTVSRDNARSSLYLQMDSLRSEDTATYYCTTEAYGYNSNWFGYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK


SEQ ID NO: 4 (1974 LC kappa full)

DIQMTQSPASLPASPEEIVTITCQASQDIGNWLSWYQQKPGKSPQLLIYGATSLADGVPSRFSASRSGTQYSLKISRLQVEDFGIFYCLQGQSTPYTFGAGTKLELKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC


SEQ ID NO: 5 (HCVR of 1979)

EVHLVESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITNSYWDWIRKFPGNKMEWMGYINYSGSTGYNPSLKSRISISRDTSNNQFFLQLNSITTEDTATYYCARGTYGYNAYHFDYWGRGVMVTVSS


SEQ ID NO: 6 (LCVR of 1979)

DIQMTQSPASLSASLEEIVTITCQASQDIGNWLSWYQQKPGKSPHLLIYGTTSLADGVPSRFSGSRSGTQYSLKISGLQVADIGIYVCLQAYSTPFTFGSGTKLEIK


SEQ ID NO: 7 (1979 HC mIgG1 full)

EVHLVESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITNSYWDWIRKFPGNKMEWMGYINYSGSTGYNPSLKSRISISRDTSNNQFFLQLNSITTEDTATYYCARGTYGYNAYHFDYWGRGVMVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK


SEQ ID NO: 8 (1979 LC Kappa full)

DIQMTQSPASLSASLEEIVTITCQASQDIGNWLSWYQQKPGKSPHLLIYGTTSLADGVPSRFSGSRSGTQYSLKISGLQVADIGIYVCLQAYSTPFTFGSGTKLEIKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

Claims (15)

1. ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質に結合することができる化合物を同定するための方法であって、化合物−トリマー複合体は、必要な腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリー受容体に結合し、受容体のシグナル伝達を調節することができ、
   前記化合物は、１０００Ｄａ以下の分子量を有する低分子実体（ＳＭＥ）であり、
   ａ）前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーと前記化合物との試料中での前記トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーの温度遷移中点（Ｔ_ｍ）を決定するためのアッセイを実行するステップ；
   ｂ）前記試料中での前記トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＴ_ｍと、対照試料とを比較するステップ；及び
   ｃ）前記化合物の非存在下での前記トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーの安定性と比較して、前記トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーの安定性を増加させる化合物を選択するステップ
   を含む、方法。
2. i）前記化合物を含む試料中での必要な受容体に結合したトリマーＴＮＦスーパーファミリーメンバーのレベルを測定するステップ；及び／又は
   ii）前記トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーへの結合に関する化合物とプローブ化合物との競合を測定するステップ；並びに
   i）における必要な受容体に結合したトリマーＴＮＦスーパーファミリーメンバーのレベル、及び／又はii）で観察された競合のレベルを、対照試料に由来する対応する値と比較するステップ
   をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバー及び前記化合物を含有する試料に対して質量分析を行って、前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのトリマーの量を検出するステップ；及び
   試料中の前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのトリマーの量と、対照試料とを比較するステップ
   をさらに含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーと前記化合物との試料を、表面に結合した前記必要なＴＮＦ受容体に加える受容体−リガンド結合アッセイを実行するステップ；及び
   前記必要なＴＮＦ受容体に結合した前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのトリマーの量と、対照試料とを比較するステップ
   を含む、請求項２に記載の方法。
5. 前記化合物と前記プローブ化合物とを使用して蛍光偏光アッセイを実行するステップ；及び
   前記化合物の存在下での前記プローブ化合物の偏光度と、対照試料中での偏光度とを比較するステップ
   を含む、請求項２に記載の方法。
6. 前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバー及び前記化合物を含有する試料が、不安定化剤をさらに含み、前記不安定化剤が、任意でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
7. 等温熱量測定分析を実行して、前記化合物の存在下での前記必要な受容体に対する前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーの結合を測定するステップ；及び
   前記必要な受容体に対する前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーの結合と、対照試料とを比較するステップ
   を含む、請求項１に記載の方法。
8. ステップi）が、前記化合物を含む試料中での前記トリマーＴＮＦスーパーファミリーメンバーの、前記必要な受容体に対する結合親和性を測定することを含む、請求項２に記載の方法。
9. 前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーと前記化合物との試料中でのトリマー形態の前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのスーパーファミリー受容体に対する結合親和性（Ｋ_Ｄ−ｒ）を決定するためのアッセイを実行するステップ；及び
   前記試料中での前記トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＫ_Ｄ−ｒと、対照試料とを比較するステップ
   を含む、請求項２又は８に記載の方法。
10. 前記安定性の増加が、
    少なくとも１℃、
    少なくとも１０℃、又は
    １０℃〜２０℃
    の前記トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーの温度遷移中点（Ｔ_ｍ）の増加をもたらす、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
11. 前記化合物が、前記化合物の非存在下での前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーの、その受容体に対する結合親和性と比較して、前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーの、前記必要な受容体に対する結合親和性を増加させる、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
12. 前記化合物が、前記化合物の非存在下でのその受容体に対する前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーの結合に関するｋ_ｏｎ−ｒ及びｋ_{ｏｆｆ−ｒ}値と比較して、結合速度（ｋ_ｏｎ−ｒ）を増加させること、及び／又は解離速度（ｋ_{ｏｆｆ−ｒ}）を減少させることにより、前記必要な受容体に対する前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーの結合親和性を増加させる、請求項１１に記載の方法。
13. 前記化合物が、前記化合物の非存在下でのその受容体に対する前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＫ_Ｄ−ｒと比較して、前記必要な受容体に対するＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＫ_Ｄ−ｒを減少させ、
    前記化合物が、前記化合物の非存在下でのその受容体に対するＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＫ_Ｄ−ｒと比較して、前記必要な受容体に対するＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＫ_Ｄ−ｒを１０分の１以下に減少させ、
    前記化合物の存在下での前記必要な受容体への結合に関する前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＫ_Ｄ−ｒ値が１０ｎＭ未満であるか、あるいは
    前記化合物が、前記化合物の非存在下でのその受容体に対する前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＫ_Ｄ−ｒと比較して、前記必要な受容体に対する前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＫ_Ｄ−ｒを減少させ、
    前記化合物が、前記化合物の非存在下でのその受容体に対する前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＫ_Ｄ−ｒと比較して、前記必要な受容体に対する前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＫ_Ｄ−ｒを４分の１以下に減少させ、
    前記化合物の存在下での前記必要な受容体への結合に関する前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＫ_Ｄ−ｒ値が６００ｐＭ未満、場合によっては２００ｐＭ未満である、
    請求項１１又は１２に記載の方法。
14. 前記化合物が５００ｎＭ以下のＩＣ_５０値を有する、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の方法。
15. 前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーがＴＮＦαであり、受容体がＴＮＦ受容体である、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の方法。