ES2902415T3 - Epítopo de anticuerpo - Google Patents

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John Robert Porter
Alastair Lawson
Tracy Lynn Arakaki
Daniel John Lightwood
Rebecca Jayne Wootton
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UCB Biopharma SRL
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Abstract

Un anticuerpo que se une a un epítopo del TNFα trimérico que comprende los restos: (a) L94 y P113; o (b) L94 e Y115; en donde L94 está presente en la cadena A del trímero del TNFα, y P113 e Y115 están presentes en la cadena C del trímero del TNFα, y en donde la numeración del resto es de acuerdo con la SEQ ID NO: 36.

Description

DESCRIPCIÓN
Epítopo de anticuerpo
Campo de la invención
Esta invención se refiere a anticuerpos, en particular, a anticuerpos que reconocen un epítopo específico, que pueden utilizarse para el cribado de moduladores de molécula pequeña del TNFa. La invención se refiere a anticuerpos que se unen selectivamente a dichos complejos moduladores de molécula pequeña del TNFa, y a los usos de dichos anticuerpos. La presente invención también se refiere a ensayos para identificar nuevos moduladores del TNFa mediante el uso de dichos anticuerpos.
Antecedentes de la invención
La superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF, del inglés "Tumour Necrosis Factor") es una familia de proteínas que comparten una función primaria de regulación de la supervivencia y la muerte celulares. Los miembros de la superfamilia del TNF comparten un motivo central común, que consiste en dos láminas p plegadas antiparalelas con cadenas p antiparalelas, que forman una estructura p de tipo "jelly roll" (brazo de gitano). Otra característica común compartida por los miembros de la superfamilia del TNF es la formación de complejos homo o heterotriméricos. Son estas formas triméricas de los miembros de la superfamilia del TNF las que se unen, y activan, receptores de la superfamilia del TNF específicos.
El TNFa es el miembro arquetípico de la superfamilia del TNF. Se ha implicado a la desregulación de la producción del TNFa en una serie de afecciones patológicas de gran importancia médica. Por ejemplo, se ha implicado al TNFa en la artritis reumatoide, enfermedades inflamatorias intestinales (incluyendo la enfermedad de Crohn), psoriasis, enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), dolor, epilepsia, osteoporosis, asma, lupus eritematoso sistémico (LES) y esclerosis múltiple (EM). También se ha implicado a otros miembros de la superfamilia del TNF en afecciones patológicas, incluyendo enfermedades autoinmunitarias.
Los antagonistas convencionales de los miembros de la superfamilia del TNF son macromoleculares y actúan inhibiendo la unión del miembro de la superfamilia del TNF a su receptor. Los ejemplos de antagonistas convencionales incluyen anticuerpos anti-TNFa, particularmente anticuerpos monoclonales, tales como infliximab (Remicade®), adalimumab (Humira®) y certolizumab pegol (Cimzia®), o proteínas de fusión de receptores del TNFa solubles, tales como etanercept (Enbrel®).
Hu et al., (2013) Journal of Biological Chemistry, 288, 27059-27067 divulga una comparación de los mecanismos de inhibición de adalimumab e infliximab en el tratamiento de enfermedades asociadas al factor de necrosis tumoral a. Tracey et al., (2007) Pharmacology and Therapeutics, 117, 244-279 revisan los mecanismos de acción de los antagonistas del factor de necrosis tumoral. El documento US 2009/022659 divulga anticuerpos y fragmentos que tienen especificidad de unión para TNFa. El documento WO 2014/001557 divulga un método de descubrimiento de fármacos. El documento WO 94/18325 divulga muteínas del TNFa y un proceso para su preparación.
Sumario de la invención
Los presentes inventores han identificado clases de entidades moleculares pequeñas (EMP) que modulan el TNFa. Estos compuestos actúan mediante la unión a la forma homotrimérica del TNFa y mediante la inducción y/o estabilización de un cambio conformacional en el homotrímero del TNFa. Por ejemplo, los homotrímeros del TNFa con el compuesto unido se pueden unir a los receptores del TNFa, pero son menos capaces, o incapaces, de iniciar la señalización cadena abajo del receptor del TNFa. Estos compuestos se pueden utilizar en el tratamiento de afecciones mediadas por el TNFa.
Los presentes inventores han desarrollado anticuerpos que se unen selectivamente a complejos que comprenden dichos compuestos y el TNFa. Estos anticuerpos pueden utilizarse para identificar compuestos adicionales que sean capaces de inhibir el TNFa de esta manera, y también pueden utilizarse como biomarcadores de interacción con la diana.
Por consiguiente, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo del TNFa trimérico que comprende los restos:
(a) L94 y P113; o
(b) L94 e Y115;
en donde L94 está presente en la cadena A del trímero del TNFa, y P113 e Y115 están presentes en la cadena C del trímero del TNFa, y en donde la numeración del resto es de acuerdo con la SEQ ID NO: 36.
La presente invención también proporciona:
- Un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo de la invención.
- Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la invención y un adyuvante y/o vehículo farmacéuticamente aceptable.
- Uso de un anticuerpo de la invención como biomarcador de interacción con la diana para la detección de un complejo de compuesto y trímero en una muestra obtenida de un sujeto; en donde dicho anticuerpo es detectable y dicho complejo comprende el TNFa trimérico y un compuesto que es capaz de unirse al TNFa trimérico, por lo que el complejo de compuesto y trímero se une al receptor del TNF y modula la señalización inducida por el trímero a través del receptor.
- Un método para detectar la interacción con la diana de un compuesto con el TNFa trimérico, mediante el cual el complejo de compuesto y trímero se une al receptor del TNF y modula la señalización inducida por el trímero a través del receptor, comprendiendo dicho método:
(a) poner en contacto un anticuerpo de la invención con una muestra que se ha obtenido de un sujeto al que se le administró dicho compuesto y una muestra de control, en donde dicho anticuerpo es detectable;
(b) determinar la cantidad de unión de dicho anticuerpo detectable a dicha muestra y a dicha muestra de control,
en donde la unión de dicho anticuerpo detectable a dicha muestra mayor que la unión de dicho anticuerpo detectable a dicha muestra de control indica la interacción con la diana de dicho compuesto a dicho TNFa trimérico. - Uso de un anticuerpo de la invención en el cribado de un compuesto que induzca un cambio conformacional en un trímero del TNFa, en donde dicho cambio conformacional modula la señalización del receptor del TNF tras la unión del TNFa trimérico.
- Un método para identificar un compuesto que sea capaz de unirse al trímero del TNFa y modular la señalización del trímero a través del receptor del TNF, que comprende las etapas de:
(a) realizar un ensayo de unión para medir la afinidad de unión de un complejo de compuesto de ensayo y trímero que comprende un trímero del TNFa y un compuesto de ensayo a un anticuerpo de la invención que se une selectivamente a dicho complejo en comparación con la unión al compuesto en ausencia del trímero del TNFa y en comparación con la unión al trímero del TNFa en ausencia del compuesto;
(b) comparar la afinidad de unión medida en la etapa (a) con la afinidad de unión de un complejo de compuesto y trímero diferente que se sabe que se une con alta afinidad al anticuerpo mencionado en la etapa (a); y (c) seleccionar el compuesto presente en el complejo de compuesto y trímero de la etapa (a) si su afinidad de unión medida es aceptable cuando se considera a la luz de la comparación a la que se hace referencia en la etapa (b).
Breve descripción de las figuras
La figura 1 destaca los restos N168, I194, F220 y A221 de la estructura cristalina del TNFa humano.
La figura 2 muestra los resultados de los experimentos de HPLC con CA185_01974 mFab y el compuesto (1). Los máximos correspondientes al exceso de Fab aparecen en un exceso de 1,5x y 2,0x. Por lo tanto, se determinó que la estequiometría era 1 Fab: 1 trímero del TNFa.
La figura 3 muestra los resultados de los experimentos de HPLC con CA185_01979 mFab y el compuesto (1). De nuevo, los picos correspondientes al exceso de Fab aparecen en un exceso de 1,5x y 2,03. Por lo tanto, también se determinó que la estequiometría era 1 Fab: 1 trímero del TNFa.
La figura 4 presenta los resultados del ELISA del TNFa total con los compuestos (3), (4) y (5) utilizando un anticuerpo policlonal anti-TNFa comercial.
La figura 5 presenta los resultados del ELISA del TNFa específico de conformación con CA185_01974.0 y los compuestos (3), (4) y (5). Apo TNFa no dio señal en este ensayo, lo que demuestra la naturaleza específica de la unión del anticuerpo CA185_01974 al TNFa unido al compuesto.
La figura 6 muestra gráficos de histograma de la FACS de la tinción con CA185_01974 y CA185_01979 a 1 y 10 mg/ml. Estos gráficos demuestran que los anticuerpos solo reconocen el TNFa que se ha incubado previamente con el compuesto (1). No hay tinción con el control DMSO.
La figura 7 muestra gráficos de histograma FACS de tinción con CA185_01974 para una estirpe celular NS0 parental y una estirpe celular NS0 genomanipulada, que sobreexpresa el TNFa de membrana. Las células se incubaron con el compuesto (1) o DMSO y se tiñeron con el fragmento Fab del anticuerpo. De nuevo, los resultados indican que no hay tinción para el control DMSO (para la estirpe celular parental o genomanipulada). Sin embargo, en presencia del compuesto (1) la tinción se observa para la estirpe celular genomanipulada.
La figura 8 muestra los sensogramas para la determinación de los valores de afinidad para CA185_01974 utilizando el TNFa de macaco cangrejero. Los controles (paneles superiores) contenían el TNFa de macaco cangrejero y DMSO. A continuación, los paneles inferiores presentan experimentos duplicados para el TNFa de macaco cangrejero que forma complejo con el compuesto (4).
La figura 9 muestra sensogramas para la determinación de valores de afinidad para CA185_01974 utilizando el TNFa humano. Los controles (paneles superiores) contenían el TNFa humano y DMSO. A continuación, los paneles inferiores presentan experimentos duplicados para el TNFa humano que forma complejo con el compuesto La figura 10 muestra las estructuras de los compuestos (1)-(7).
La figura 11 muestra la estructura a 2,6 A de resolución de un monómero de TNFa (cadena A) unido al Fab CA185_01979.
La figura 12 muestra la misma vista que la figura 11, pero con un trímero simétrico (es decir, un trímero no distorsionado en ausencia de compuesto) modelado por ordenador. Con este trímero simétrico, la cadena A del trímero conserva la interacción con el fragmento Fab. Sin embargo, hay un enfrentamiento estérico entre el fragmento Fab y la cadena C del trímero.
La figura 13 también muestra la misma estructura que la figura 11, salvo que en este caso se ha modelado por ordenador un trímero no simétrico (es decir, un trímero con una conformación distorsionada). Esta estructura de trímero no simétrico se generó originalmente en presencia del compuesto (6). De nuevo, se conserva la interacción entre el Fab y la cadena A del trímero. Sin embargo, a diferencia del trímero simétrico, no hay enfrentamiento estérico entre el Fab y la cadena C.
La figura 14 muestra en forma de esferas el epítopo determinado experimentalmente de la cadena A del TNFa para el Fab CA185_01979. Se utilizó un punto de corte de 4 A para determinar los restos próximos a las CDR del anticuerpo.
La figura 15 muestra en forma de esferas el epítopo de la cadena C del TNFa para el Fab CA185_01979. El epítopo se dedujo por ordenador a partir de un modelo basado en el trímero del TNF unido al compuesto (compuesto (6)) superpuesto sobre la estructura del Fab-TNFa.
La figura 16 muestra una superposición del epítopo de la figura 14 y la figura 15.
Breve descripción del listado de secuencias
La SEQ ID NO: 1 muestra la LCDR1 de CA185_01974.0.
La SEQ ID NO: 2 muestra la LCDR2 de CA185_01974.0.
La SEQ ID NO: 3 muestra la LCDR3 de CA185_01974.0.
La SEQ ID NO: 4 muestra la HCDR1 de CA185_01974.0.
La SEQ ID NO: 5 muestra la HCDR2 de CA185_01974.0.
La SEQ ID NO: 6 muestra la HCDR3 de CA185_01974.0.
La SEQ ID NO: 7 muestra la secuencia de aminoácidos de la LCVR de CA185_01974.0.
La SEQ ID NO: 8 muestra la secuencia de aminoácidos de la HCVR de CA185_01974.0.
La SEQ ID NO: 9 muestra la secuencia de ADN de la LCVR de CA185_01974.0.
La SEQ ID NO: 10 muestra la secuencia de ADN de la HCVR de CA185_01974.0.
La SEQ ID NO: 11 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera k de CA185_01974.0.
La SEQ ID NO: 12 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada mlgG1 de CA185_01974.0.
La SEQ ID NO: 13 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de mFab (sin bisagra) de CA185_01974.0.
La SEQ ID NO: 14 muestra la secuencia de ADN de la cadena ligera k de CA185_01974.0.
La SEQ ID NO: 15 muestra la secuencia de ADN de la cadena pesada de mlgG1 de CA185_01974.0.
La SEQ ID NO: 16 muestra la secuencia de ADN de la cadena pesada mFab (sin bisagra) de CA185_01974.0. La SEQ ID NO: 17 muestra la LCDR2 de CA185_01979.0.
La SEQ ID NO: 18 muestra la LCDR3 de CA185_01979.0.
La SEQ ID NO: 19 muestra la HCDR1 de CA185_01979.0.
La SEQ ID NO: 20 muestra la HCDR2 de CA185_01979.0.
La SEQ ID NO: 21 muestra la HCDR3 de CA185_01979.0.
La SEQ ID NO: 22 muestra la secuencia de aminoácidos de la LCVR de CA185_01979.0.
La SEQ ID NO: 23 muestra la secuencia de aminoácidos de la HCVR de CA185_01979.0.
La SEQ ID NO: 24 muestra la secuencia de ADN de la LCVR de CA185_01979.0.
La SEQ ID NO: 25 muestra la secuencia de ADN de la HCVR de CA185_01979.0.
La SEQ ID NO: 26 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera k de CA185_01979.0.
La SEQ ID NO: 27 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada mlgG1 de CA185_01979.0.
La SEQ ID NO: 28 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de mFab (sin bisagra) de CA185_01979.0.
La SEQ ID NO: 29 muestra la secuencia de ADN de la cadena ligera k de CA185_01979.0.
La SEQ ID NO: 30 muestra la secuencia de ADN de la cadena pesada de mlgG1 de CA185_01979.0.
La SEQ ID NO: 31 muestra la secuencia de ADN de la cadena pesada mFab (sin bisagra) de CA185_01979.0. La SEQ ID NO: 32 muestra la secuencia de aminoácidos del TNFa de rata.
La SEQ ID NO: 33 muestra la secuencia de aminoácidos del TNFa de ratón.
La SEQ ID NO: 34 muestra la secuencia de aminoácidos del TNFa humano.
La SEQ ID NO: 35 muestra la secuencia de aminoácidos de la forma soluble del TNFa humano.
La SEQ ID NO: 36 muestra la secuencia de aminoácidos de la forma soluble del TNFa humano, pero sin la "S" inicial (que es un artefacto de clonación de la SEQ ID NO: 35).
Descripción detallada de la invención
Moduladores de miembros de la superfamilia del TNF
Se han identificado compuestos de prueba que se unen a las formas triméricas de los miembros de la superfamilia del TNF. La siguiente divulgación se refiere en general a la unión de estos compuestos a cualquier miembro de la superfamilia del TNF, aunque las presentes reivindicaciones se refieren específicamente a la unión de dichos compuestos al TNFa.
Estos compuestos son entidades moleculares pequeñas (EMP) que tienen un peso molecular de 1000 Da o menos, generalmente 750 Da o menos, más adecuadamente 600 Da o menos. El peso molecular puede estar en el intervalo de aproximadamente 50 a aproximadamente 1000 Da, o de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000 Da. Estos compuestos estabilizan una conformación del miembro de la superfamilia del TNF trimérico que se une al receptor de la superfamilia del TNF preciso y modula la señalización del receptor. Algunos ejemplos de dichos compuestos incluyen los compuestos de fórmulas (1)-(7).
El efecto estabilizador de los compuestos sobre las formas triméricas de los miembros de la superfamilia del TNF puede cuantificarse midiendo el punto medio de transición térmica (Tm) de los trímeros en presencia y en ausencia del compuesto. Tm significa la temperatura a la que se despliegan el 50 % de las biomoléculas. Los compuestos que estabilizan los trímeros de miembros de la superfamilia del TNF aumentarán la Tm de los trímeros. La Tm puede determinarse utilizando cualquier técnica adecuada conocida en la materia, por ejemplo, utilizando calorimetría diferencial de barrido (DSC, del inglés "differential scanning calorimetry") o ensayos de desnaturalización térmica con sonda de fluorescencia.
Los compuestos pueden unirse dentro del espacio central presente dentro del trímero de miembros de la superfamilia del TNF (es decir, el núcleo del trímero).
Estos compuestos pueden convertir al miembro de la superfamilia del TNF en un antagonista del receptor de la superfamilia del TNF. Por lo tanto, estos compuestos son capaces de bloquear la señalización del miembro de la superfamilia del TNF sin tener que competir con la interacción de alta afinidad entre el miembro de la superfamilia del TNF y su receptor.
Como alternativa, los compuestos pueden estabilizar una conformación del miembro de la superfamilia del TNF trimérico que se une al receptor de la superfamilia del TNF preciso y potencia la señalización del receptor. Por lo tanto, estos compuestos son capaces de aumentar la señalización del miembro de la superfamilia del TNF sin tener que competir con la interacción de alta afinidad entre el miembro de la superfamilia del TNF y su receptor.
Cuando, en el presente documento, los compuestos se describen como antagonistas, se entenderá que los compuestos pueden ser igualmente agonistas y aumentar la señalización mediante un receptor de la superfamilia del TNF que está unido a un complejo de un trímero de miembro de la superfamilia del TNF y dicho compuesto agonista. De manera similar, donde otra divulgación se refiere a compuestos antagonistas, métodos para identificar dichos compuestos y usos de dichos compuestos, esta divulgación puede referirse igualmente a compuestos agonistas.
Los compuestos descritos en el presente documento son moduladores alostéricos que se unen a los agonistas naturales de los receptores de la superfamilia del TNF, es decir, a formas triméricas de miembros de la superfamilia del TNF e impulsan a estos trímeros a adoptar una conformación que todavía se une al receptor de la superfamilia del TNF preciso y modula la señalización por el receptor. Por modular, se entenderá que el compuesto puede tener un efecto antagonista y, por tanto, disminuir la señalización por un receptor de la superfamilia del TNF, o además un efecto estimulador y así aumentar o potenciar la señalización por un receptor de la superfamilia del TNF.
Estos compuestos pueden convertir los agonistas naturales de los miembros de la superfamilia del TNF en antagonistas. Por otro lado, los antagonistas convencionales de los miembros de la superfamilia del TNF se unen al miembro de la superfamilia del TNF o al receptor de la superfamilia del TNF y evitan la unión del miembro de la superfamilia del TNF al receptor preciso. Como alternativa, los compuestos pueden aumentar la señalización por un receptor de la superfamilia del t Nf cuando el miembro de la superfamilia del TNF está unido en comparación con el nivel de señalización por el receptor de la superfamilia del TNF cuando el miembro de la superfamilia del TNF está unido en ausencia del compuesto. Por lo tanto, los compuestos pueden convertir los agonistas naturales de los miembros de la superfamilia del TNF en los denominados "superagonistas". Por lo tanto, los compuestos también se pueden conocer como moduladores alostéricos de la actividad de ligandos (AMLA, del inglés "allosteric modulators of ligand activity").
Los compuestos no están limitados en términos de su fórmula química o estructura, siempre que se unan al menos a un miembro de la superfamilia del TNF y estabilicen una conformación del miembro de la superfamilia del TNF trimérico que se une al receptor de la superfamilia del TNF preciso y modula la señalización del receptor de la superfamilia del TNF. Por lo tanto, los compuestos se pueden identificar utilizando los anticuerpos y métodos descritos en el presente documento. Los compuestos pueden comprender una fracción de bencimidazol o un isóstero del mismo.
Los compuestos pueden aumentar la afinidad de unión de los miembros de la superfamilia del TNF (en forma de un complejo de compuesto y trímero) al receptor preciso en comparación con la afinidad de unión de los miembros de la superfamilia del TNF al receptor preciso en ausencia de los compuestos.
Los compuestos se unen a las formas triméricas de los miembros de la superfamilia del TNF. Dichos compuestos pueden unirse de manera específica (o de manera selectiva) a las formas triméricas de uno o más miembros de la superfamilia del TNF. Un compuesto puede unirse de manera específica (o de manera selectiva) a solo uno de los miembros de la superfamilia del TNF, pero no a ningún otro miembro de la superfamilia del TNF. Un compuesto también puede unirse de manera específica a dos, tres, cuatro o hasta todos los miembros de la superfamilia del TNF. Por específico (o selectivo), se entenderá que los compuestos se unen a la molécula o moléculas de interés, en este caso la forma trimérica del miembro de la superfamilia del TNF, sin ninguna reactividad cruzada significativa con ninguna otra molécula, que puede incluir otros miembros de la superfamilia del TNF. La reactividad cruzada puede evaluarse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, la resonancia de plasmón superficial. La reactividad cruzada de un compuesto para la forma trimérica de un miembro de la superfamilia del TNF con una molécula distinta de la forma trimérica de ese miembro particular de la superfamilia del TNF puede considerarse significativa si el compuesto se une a la otra molécula al menos aproximadamente un 5 %, un 10 %, un 15 %, un 20 %, un 25 %, un 30 %, un 35 %, un 40 %, un 45 %, un 50 %, un 55 %, un 60 %, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 % o el 100 % de manera tan fuerte como se une a la forma trimérica del miembro de la superfamilia del TNF de interés. Por ejemplo, la reactividad cruzada puede considerarse significativa si el compuesto se une a la otra molécula aproximadamente entre un 5 % y aproximadamente el 100 %, normalmente aproximadamente entre un 20 % y aproximadamente el 100 %, o aproximadamente entre un 50 % y aproximadamente el 100 % de manera tan fuerte como se une a la forma trimérica del miembro de la superfamilia del TNF de interés. Un compuesto que es específico (o selectivo) para la forma trimérica de un miembro de la superfamilia del TNF puede unirse a otra molécula a menos de un 90 %, un 85 %, un 80 %, un 75 %, un 70 %, un 65 %, un 60 %, un 55 %, un 50 %, un 45 %, un 40 %, un 35 %, un 30 %, un 25 % o un 20 % de la fuerza a la que se une a la forma trimérica del miembro de la superfamilia del TNF (hasta cero unión). El compuesto se une de manera adecuada a la otra molécula en menos de aproximadamente un 20 %, menos de aproximadamente un 15 %, menos de aproximadamente un 10 % o menos de aproximadamente un 5 %, menos de aproximadamente un 2 % o menos de aproximadamente un 1 % de la fuerza a la que se une a la forma trimérica del miembro de la superfamilia del TNF (hasta cero unión).
Las velocidades a las que un compuesto de ensayo se une a un miembro de la superfamilia del TNF se denominan en el presente documento velocidad de "asociación", kon-c, y la velocidad a la que el compuesto de ensayo se disocia del miembro de la superfamilia del TNF se denomina en el presente documento velocidad de "disociación" o koff-c. Como se utiliza en el presente documento, el símbolo "Kd-c" representa la afinidad de unión (constante de disociación) de un compuesto de ensayo por un miembro de la superfamilia del TNF. Kd-c se define como kf-c/kon-c. Los compuestos de prueba pueden tener velocidades "de activación" lentas, que pueden medirse en minutos mediante análisis espectral de masas del miembro de la superfamilia del TNF y las intensidades de los máximos del complejo de compuesto y trímero. Los valores de kD-c para un compuesto de ensayo se pueden estimar mediante la repetición de esta medición en diferentes miembros de la superfamilia del TNF: relaciones del complejo de compuesto y trímero. Normalmente, la unión de compuestos a los trímeros de la superfamilia del TNF se caracteriza por unas velocidades "de activación" altas, de manera ideal aproximadamente de 107 M-1s-1, con velocidad de "disociación" lenta, por ejemplo, valores normalmente de 10-3 s-1, 10-4 s-1 o velocidad de "disociación" no medible.
Como se utiliza en el presente documento, el símbolo "kon-r" indica la velocidad (la velocidad de "asociación") a la que un complejo de compuesto y trímero se une a un receptor de la superfamilia del TNF. Como se utiliza en el presente documento, el símbolo "koff-r" representa la velocidad (la velocidad "de inactivación") a la que un complejo de compuesto y trímero se disocia de un receptor de la superfamilia del TNF. Como se utiliza en el presente documento, el símbolo "KD-r" indica la afinidad de unión (constante de disociación) de un complejo de compuesto y trímero por un receptor de la superfamilia. La KD-r se define como koff-r/ kon-r.
El valor KD-r del miembro de la superfamilia del TNF para unirse a su receptor en presencia del compuesto de ensayo (es decir, en forma de un complejo de compuesto y trímero) puede ser al menos aproximadamente 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces inferior al valor KD-r del miembro de la superfamilia del TNF para unirse a su receptor en ausencia del compuesto de ensayo. El valor KD-r del complejo de compuesto y trímero para la unión al miembro de la superfamilia del TNF puede disminuir al menos aproximadamente 1,5 veces, generalmente al menos aproximadamente 3 veces, de manera más adecuada al menos aproximadamente 4 veces valor KD-r del trímero de la superfamilia del TNF que se une al receptor de la superfamilia del TNF en ausencia del compuesto de ensayo, es decir, la afinidad de unión del complejo de compuesto y trímero por el receptor de la superfamilia del TNF puede incrementarse al menos aproximadamente 1,5 veces, generalmente al menos aproximadamente tres veces, de manera más adecuada al menos aproximadamente cuatro veces en comparación con la afinidad de unión del trímero de la superfamilia del TNF al receptor de la superfamilia del TNF en ausencia del compuesto de ensayo.
Un compuesto descrito en el presente documento puede aumentar la afinidad de unión del miembro de la superfamilia del TNF a su receptor en aproximadamente 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o más en comparación con la afinidad de unión del miembro de la superfamilia del TNF a su receptor en ausencia del compuesto.
La afinidad de unión se puede dar en términos de afinidades de unión (Kd-p) y puede darse en las unidades adecuadas, tales como mM, nM o pM. Cuanto menor sea el valor Kd-p, mayor es la afinidad de unión del miembro de la superfamilia del TNF a su receptor.
El valor Kd-p del miembro de la superfamilia del TNF para unirse a su receptor en presencia del compuesto puede ser al menos aproximadamente 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces inferior al valor Kd-p del miembro de la superfamilia del TNF para unirse a su receptor en ausencia del compuesto de ensayo.
La disminución del valor Kd-p del complejo de compuesto y trímero para la unión al receptor de la superfamilia del TNF en comparación con el valor Kd-p del trímero de la superfamilia del TNF solo que se une al receptor de la superfamilia del TNF puede resultar de un aumento en la velocidad de asociación (kon-r) del complejo de compuesto y trímero que se une al receptor de la superfamilia del TNF en comparación con el trímero de la superfamilia del TNF solo, y/o una disminución en la velocidad de disociación (koff-r) en comparación con el trímero de la superfamilia del TNF solo. La velocidad de asociación (kon-r) del complejo de compuesto y trímero que se une al receptor de la superfamilia del TNF generalmente aumenta en comparación con la del trímero de la superfamilia del TNF solo. La velocidad de disociación (koff-r) del complejo de compuesto y trímero que se une al receptor de la superfamilia del TNF generalmente disminuye en comparación con la del trímero de la superfamilia del TNF solo. De la manera más adecuada, la velocidad de asociación (kon-r) del complejo de compuesto y trímero que se une al receptor de la superfamilia del TNF aumenta, y la velocidad de disociación (koff-r) del complejo de compuesto y trímero que se une al receptor de la superfamilia del TNF disminuye, en comparación con el trímero de la superfamilia del TNF solo. El valor de la kon-r del complejo de compuesto y trímero para el receptor de la superfamilia del TNF preciso puede incrementarse al menos aproximadamente 1,5 veces o al menos aproximadamente dos veces, y adecuadamente al menos aproximadamente tres veces en comparación con el valor de la kon-r del trímero de la superfamilia del TNF que se une a su receptor en ausencia del compuesto, y/o el valor de la koff-r del complejo de compuesto y trímero para el receptor de la superfamilia del TNF preciso puede disminuir al menos aproximadamente 1,2 veces, al menos aproximadamente 1,6 veces, al menos aproximadamente dos veces, de manera más adecuada al menos aproximadamente 2,4 veces en comparación con el valor koff-r del trímero de la superfamilia del TNF que se une a su receptor en ausencia del compuesto.
La velocidad de asociación de unión del compuesto al trímero de la superfamilia del TNF (kon-c) es normalmente más rápida que la velocidad de asociación de unión del complejo de compuesto y trímero al receptor de la superfamilia del TNF (kon-r). La velocidad de disociación para la unión del complejo de compuesto y trímero al receptor de la superfamilia del TNF (koff-r) también es normalmente más rápida que la velocidad de disociación de unión del compuesto al trímero de la superfamilia del TNF (kf-c). De la manera más adecuada, la velocidad de activación para la unión del compuesto al trímero de la superfamilia del TNF (kon-c) es más rápida que la velocidad de activación para la unión del complejo de compuesto y trímero al receptor de la superfamilia del TNF (kon-r), y la velocidad de inactivación para la unión del complejo de compuesto y trímero al receptor de la superfamilia del TNF (koff-r) es más rápida que la velocidad de inactivación para la unión del compuesto al trímero de la superfamilia del TNF (kf-c). El valor de la kD-c del compuesto para unirse al trímero de la superfamilia del TNF es generalmente menor que el valor de la Kd-p del complejo de compuesto y trímero para la unión al receptor de la superfamilia del TNF, es decir, el compuesto tiene una mayor afinidad por el trímero que el complejo de compuesto y trímero por el receptor.
Los valores kon-r, koff-ry Kd-p tanto para el complejo de compuesto y trímero como para el trímero de la superfamilia del TNF para el receptor de la superfamilia del TNF preciso pueden determinarse utilizando cualquier técnica adecuada, por ejemplo, la resonancia de plasmón superficial, la espectrometría de masas y la calorimetría isotérmica. El valor de la kD-r del miembro de la superfamilia del TNF para la unión a su receptor en presencia del compuesto de ensayo puede ser 1 mM, 100 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM o menos (normalmente hasta un valor inferior de aproximadamente 1 pM). El valor de la kD-r del miembro de la superfamilia del TNF para la unión a su receptor en presencia del compuesto de ensayo (es decir, en un complejo de compuesto y trímero) puede ser de 1 nM o menos. El valor Kd-p de un complejo de compuesto y trímero para la unión al receptor de la superfamilia del TNF preciso puede ser inferior a 600 pM, más adecuadamente inferior a 500 pM, inferior a 400 pM, inferior a 300 pM, inferior a 200 pM, inferior a 100 pM o inferior a 50 pM (de nuevo hasta un valor inferior de aproximadamente 1 pM). El valor Kd-p de un complejo de compuesto y trímero para la unión al receptor de la superfamilia del TNF preciso puede ser inferior a aproximadamente 200 pM (a aproximadamente 1 pM).
Los compuestos pueden identificarse mediante un ensayo que comprende determinar la Kd-p de la forma trimérica del miembro de la superfamilia del TNF en una muestra del miembro de la superfamilia del TNF y el compuesto; comparando la Kd-p de la forma trimérica del miembro de la superfamilia del TNF en la muestra con una muestra de control; y seleccionar un compuesto.
Los compuestos estabilizan la forma trimérica del miembro de la superfamilia del TNF. Se considera que la estabilización se produce si un compuesto de ensayo aumenta la proporción de trímero en comparación con la cantidad de trímero observada para una muestra que contiene el miembro de la superfamilia del TNF y el agente desestabilizador en ausencia del compuesto de ensayo. El compuesto de ensayo puede aumentar la cantidad de trímero en aproximadamente un 10 %, un 15 %, un 20 %, un 25 %, un 30 %, un 35 %, un 40 %, un 45 %, un 50 %, un 55 %, un 60 %, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 100 %, un 150 %, un 200 %, un 300 %, un 400 % o más en comparación con la cantidad de trímero presente en una muestra que contiene el miembro de la superfamilia del TNF y el agente desestabilizador en ausencia del compuesto de ensayo.
El compuesto de ensayo también puede aumentar la cantidad de trímero en comparación con la observada para una muestra del miembro de la superfamilia del TNF en ausencia tanto del agente desestabilizador como del compuesto de ensayo. El compuesto de ensayo puede aumentar la cantidad de trímero en aproximadamente un 10 %, un 15 %, un 20 %, un 25 %, un 30 %, un 35 %, un 40 %, un 45 %, un 50 %, un 55 %, un 60 %, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 100 %, un 150 %, un 200 %, un 300 %, un 400 % o más en comparación con la cantidad de trímero presente en una muestra que contiene el miembro de la superfamilia del TNF en ausencia tanto del agente desestabilizador como del compuesto de ensayo.
El compuesto de ensayo puede aumentar la cantidad del miembro de la superfamilia del TNF unido a su receptor en aproximadamente un 10 %, un 15 %, un 20 %, un 25 %, un 30 %, un 35 %, un 40 %, un 45 %, un 50 %, un 55 %, un 60 %, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 100 %, un 150 %, un 200 %, un 300 %, un 400 % o más en comparación con la cantidad del miembro de la superfamilia del TNF unido a su receptor en una muestra que contiene el miembro de la superfamilia del TNF en ausencia del compuesto de ensayo.
Los compuestos de ensayo pueden mejorar la estabilidad de la forma trimérica del miembro de la superfamilia del TNF. Se considera que se produce una mayor estabilidad de la forma trimérica del miembro de la superfamilia del TNF si un compuesto de ensayo aumenta el punto medio de transición térmica (Tm) de la forma trimérica del miembro de la superfamilia TNF en comparación con la Tm de la forma trimérica del miembro de la superfamilia del TNF observada para una muestra que contiene el miembro de la superfamilia del TNF y el agente desestabilizador en ausencia del compuesto de ensayo. La Tm de la forma trimérica del miembro de la superfamilia del TNF es la temperatura a la que se despliegan el 50 % de las biomoléculas. La Tm de la forma trimérica del miembro de la superfamilia del TNF en presencia y/o ausencia del compuesto de ensayo puede medirse utilizando cualquier técnica adecuada conocida en la materia, por ejemplo, utilizando calorimetría diferencial de barrido (DSC) o ensayos de desnaturalización térmica con sonda de fluorescencia.
El compuesto de ensayo puede aumentar la Tm de la forma trimérica del miembro de la superfamilia del TNF en al menos 1 °C, al menos 2 °C, al menos 5 °C, al menos 10 °C, al menos 15 °C, al menos 20 °C o más en comparación con la Tm de la forma trimérica del miembro de la superfamilia del TNF en una muestra que contiene el miembro de la superfamilia del TNF en ausencia del compuesto de ensayo. El compuesto de ensayo puede aumentar la Tm de la forma trimérica del miembro de la superfamilia del TNF en al menos 1 °C, normalmente en al menos 10 °C y más adecuadamente entre 10 °C y 20 °C.
Los compuestos pueden inhibir total o parcialmente la señalización a través de un receptor del TNF cuando un miembro de la superfamilia del TNF en forma de un complejo de compuesto y trímero se une al receptor. El compuesto puede actuar para reducir la señalización a través de un receptor de la superfamilia del TNF en al menos aproximadamente un 10 %, un 20 %, un 30 %, un 40 %, un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 % o el 100 %. Como alternativa, los compuestos pueden aumentar la señalización a través de un receptor del TNF cuando un miembro de la superfamilia del TNF en forma de un complejo de compuesto y trímero se une al receptor. El compuesto puede actuar para aumentar la señalización a través de un receptor de la superfamilia del TNF en al menos aproximadamente un 10 %, un 20 %, un 30 %, un 40 %, un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 %, el 100 % o un 200 %. Cualquier cambio en el nivel de señalización puede medirse mediante cualquier técnica adecuada, incluyendo la medición de la actividad de un gen indicador mediante fosfatasa alcalina o luciferasa, la translocación de NF-kB usando máquinas tales como Cellomics Arrayscan, la fosforilación de efectores cadena abajo, el reclutamiento de moléculas de señalización o la muerte celular.
Los compuestos pueden modular al menos uno de los efectos cadena abajo de la señalización a través de un receptor del TNF cuando un miembro de la superfamilia del TNF en forma de un complejo de compuesto y trímero se une al receptor. Dichos efectos se discuten en el presente documento e incluyen la producción de IL-8, IL17A -F, IL2 y VCAM inducidas por la superfamilia del TNF, la activación inducida por la superfamilia del TNF de NF-kB y el reclutamiento de neutrófilos. En la materia se conocen técnicas convencionales para medir los efectos cadena abajo de miembros de la superfamilia del TNF. Los compuestos pueden modular al menos 1,2, 3, 4, 5, 10 o hasta todos los efectos cadena abajo de la señalización a través de un receptor del TNF.
La actividad de los compuestos se puede cuantificar utilizando terminología estándar, tal como la CI50 o los valores de concentración de eficacia semimáxima (CE50). Los valores de CI50 representan la concentración de un compuesto necesaria para una inhibición del 50 % de una función biológica o bioquímica específica. Los valores de CE50 representan la concentración de un compuesto necesaria para conseguir el 50 % de su efecto máximo. Los compuestos pueden tener valores CI50 o CE50 de 500 nM, 400 nM, 300 nM, 200 nM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 100 pM o inferiores (hasta un valor inferior de aproximadamente 10 pM o 1 pM). Los valores de CI50 y CE50 pueden medirse usando cualquier técnica adecuada, por ejemplo, la producción de citocinas puede cuantificarse usando ELISA. Pueden generarse entonces valores de CI50 y CE50 usando un modelo logístico convencional de 4 parámetros también conocido como modelo sigmoideo de respuesta a la dosis.
Como se ha mencionado anteriormente, los ejemplos de los compuestos que son capaces de unirse al TNF y modular la señalización son compuestos de fórmulas (1)-(7).
Complejos de miembros de la superfamilia del TNF y modulador
Se ha identificado que la unión de los compuestos descritos en el presente documento a formas triméricas de miembros de la superfamilia del TNF da como resultado un cambio conformacional en el trímero de la superfamilia del TNF. En particular, el trímero del miembro de la superfamilia del TNF adquiere una conformación deformada o distorsionada cuando se une a un compuesto como se divulga en el presente documento.
Por ejemplo, cuando los compuestos (1)-(7) están unidos al dominio soluble del TNFa humano, el TNF conserva su estructura trimérica pero las subunidades A y C se alejan entre sí y C rota para generar una hendidura entre estas subunidades.
Sin quedar ligados a teoría alguna, se cree que, en ausencia de un compuesto, miembros de la superfamilia del TNF triméricos, incluyendo el TNFa trimérico, son capaces de unirse a tres receptores de miembros de la superfamilia del TNF diméricos separados. Cada uno de los receptores diméricos del miembro de la superfamilia del TNF es capaz de unirse a dos trímeros de la superfamilia del TNF separados. Esto da como resultado la agregación de múltiples trímeros de miembros de la superfamilia del TNF y dímeros de receptores de miembros de la superfamilia del TNF, creando balsas de señalización que inician la señalización cadena abajo.
Cuando el TNFa trimérico se une al compuesto, la conformación del complejo resultante se deforma. Por consiguiente, sin quedar ligados a teoría alguna, se cree que, en presencia de un compuesto como se divulga en el presente documento, miembros de la superfamilia del t Nf triméricos, incluyendo el TNFa trimérico, sólo son capaces de unirse a dos receptores de miembros de la superfamilia del TNF diméricos separados. El hecho de que solo dos, en lugar de tres, receptores de miembros de la superfamilia del TNF diméricos separados se unen al miembro de la superfamilia del TNF trimérico reduce o inhibe la agregación de múltiples trímeros de miembros de la superfamilia del TNF y dímeros de receptores de miembros de la superfamilia del TNF. Esto reduce o inhibe la formación de balsas de señalización y, por lo tanto, reduce o inhibe la señalización cadena abajo.
Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para detectar el TNFa con una conformación distorsionada como resultado de la unión de un compuesto como se divulga en el presente documento. Normalmente, el TNFa con una conformación distorsionada o deformada es TNFa trimérico. Sin embargo, los anticuerpos de la invención también pueden unirse a otras formas del TNFa. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden unirse a monómeros del TNFa.
El TNFa es normalmente TNFa trimérico y puede ser el TNFas (o TNFas trimérico).
Por consiguiente, la divulgación proporciona un complejo que comprende un trímero del TNFa y un compuesto que está unido al mismo, de modo que el complejo de compuesto y trímero se une al receptor del TNFa preciso y modula la señalización inducida por el trímero a través del receptor, en donde dicho complejo se une a un anticuerpo de la invención con una afinidad de al menos 1 nM (es decir, 1 nM o inferior, hasta aproximadamente 1 pM). El miembro de la superfamilia del TNF es normalmente el TNFas.
Adicionalmente, el anticuerpo se une generalmente al complejo con una afinidad que es al menos aproximadamente 100 veces inferior (la afinidad se mejora al menos aproximadamente 100 veces), adecuadamente aproximadamente 200 veces inferior, con respecto a la afinidad por la unión al compuesto en ausencia del trímero del TNFa y/o por la unión al trímero del TNFa en ausencia del compuesto.
La presente divulgación proporciona además un compuesto que es capaz de unirse a un trímero del TNFa para formar un complejo, de modo que el complejo de compuesto y trímero se une al receptor del TNFa preciso y modula la señalización inducida por el trímero a través del receptor, en donde el complejo de compuesto y trímero se une a un anticuerpo de la invención con una KD-ab de 1 nM o inferior (hasta aproximadamente 1 pM). El TNFa es normalmente el TNFas.
Una vez más, el anticuerpo se une normalmente al complejo con una afinidad que es al menos aproximadamente 100 veces inferior (la afinidad se mejora al menos aproximadamente 100 veces), adecuadamente aproximadamente 200 veces inferior, con respecto a la afinidad por la unión al compuesto en ausencia del trímero del TNFa y/o por la unión al trímero del TNFa en ausencia del compuesto.
El complejo de compuesto y trímero puede unirse a cualquier anticuerpo de la invención.
Un compuesto o complejo descrito en el presente documento puede utilizarse en el tratamiento y/o profilaxis de una afección patológica.
Anticuerpos
La invención se refiere a anticuerpos que se unen selectivamente a al menos un complejo de compuesto y trímero que comprende al menos un compuesto divulgado en el presente documento y un trímero del TNFa.
Normalmente, la unión selectiva de un anticuerpo de la invención a un complejo de compuesto-(trímero) se mide con respecto a la unión del anticuerpo al compuesto en ausencia del TNFa, o al TNFa en ausencia del compuesto o a otros complejos (diferentes) de compuesto-(trímero).
El compuesto puede ser cualquier compuesto descrito anteriormente, incluyendo los compuestos (1)-(7) (o sales o solvatos de los mismos). Como se analiza adicionalmente más adelante, el miembro de la superfamilia del TNF es el TNFa. El TNFa normalmente es el TNFa humano, particularmente el TNFa soluble (TNFas). Los TNFas pueden tener la secuencia de la SEQ ID NO: 35 o la SEQ ID n O: 36 (que carece de la "S" aminoterminal de la SEQ ID NO: 35), o puede ser una variante de las mismas. Dichas variantes normalmente conservan al menos aproximadamente un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 % o un 95 % de identidad con la SEQ ID NO: 35 o la SEQ ID NO: 36 (o incluso aproximadamente un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad). En otras palabras, dichas variantes pueden conservar de aproximadamente un 60 % a aproximadamente un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 35 o la SEQ ID NO: 36, de manera adecuada de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 35 o la SEQ ID NO: 36, de manera más adecuada de aproximadamente un 90 % a aproximadamente un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 35 o la SEQ ID NO: 36 y de la manera más adecuada de aproximadamente un 95 % a aproximadamente un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 35 o la SEQ ID NO: 36. Las variantes se describen más adelante.
Como se ha analizado anteriormente, aunque la presente divulgación se refiere en general a la unión de anticuerpos de la invención al TNFa trimérico, los anticuerpos de la invención también pueden unirse a otras formas del TNFa. A modo ilustrativo, los ejemplos de la presente solicitud demuestran que el anticuerpo CA185_0179 se une al TNFa trimérico. Sin embargo, como se muestra en la figura 1 (estructura cristalina del anticuerpo CA185_0179 unido a un monómero del TNFa en presencia del compuesto (1)), el anticuerpo también parece unirse al TNFa monomérico. Sin quedar ligados a teoría alguna, en presencia del compuesto, se cree que el dominio soluble del TNF conserva su estructura trimérica. Sin embargo, las subunidades A y C se alejan entre sí (y la subunidad C gira) para generar una hendidura entre estas dos subunidades. Por lo tanto, aunque los anticuerpos de la invención se unen a trímeros distorsionados, también es posible que los anticuerpos aún puedan unirse si la estructura trimérica se separa en monómeros. (Véase más adelante el análisis de las subunidades "A" y "C").
El término "anticuerpo" al que se hace referencia en el presente documento incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir, la "porción de unión a antígeno") o cadenas simples de los mismos. Un anticuerpo se refiere a una glucoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H, heavy) y dos cadenas ligeras (L, light) interconectadas por enlaces disulfuro, o a una parte de unión a antígeno de las mismas. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como HCVR o Vh) y una región constante de cadena pesada. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como LCVR o Vl) y una región constante de cadena ligera. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interacciona con un antígeno. Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR, del inglés "complementarity determining regions"), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR, "framework regions").
Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina con los tejidos o factores del hospedador, incluyendo diversas células del sistema inmunitario (p. ej., células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico.
Un anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal y normalmente será un anticuerpo monoclonal. Un anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo quimérico, un anticuerpo con CDR injertada, un nanocuerpo, un anticuerpo humano o humanizado o una porción de unión a antígeno de cualquiera de los mismos. Para la producción de anticuerpos tanto monoclonales como policlonales, el animal de experimentación es normalmente un mamífero no humano tal como una cabra, conejo, rata o ratón, pero el anticuerpo también puede producirse en otras especies.
Los anticuerpos policlonales se pueden producir mediante métodos de rutina tales como la inmunización de un animal adecuado, con el antígeno de interés. Posteriormente se puede extraer sangre del animal y purificar la fracción de IgG.
Pueden obtenerse anticuerpos generados contra los complejos de compuesto-trímero de la divulgación, cuando sea necesaria la inmunización de un animal, mediante la administración de los polipéptidos a un animal, por ejemplo, un animal no humano, utilizando protocolos conocidos y rutinarios, véase, por ejemplo, Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), vol. 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, Inglaterra, 1986). Muchos animales de sangre caliente, tales como conejos, ratones, ratas, ovejas, vacas, camellos y cerdos se pueden inmunizar. Sin embargo, los ratones, conejos, cerdos y ratas son en general los más adecuados.
Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante cualquier método conocido en la materia, tal como la técnica del hibridoma (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de linfocitos B humanos (Kozbor, et al., 1983, Immunology Today, 4:72) y la técnica del hibridoma EBV (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, págs. 77 a 96, Alan R. Liss, Inc., 1985).
Los anticuerpos de la invención también se pueden generar utilizando métodos de anticuerpos de linfocitos individuales mediante la clonación y expresión de ADNc de región variable de inmunoglobulina generado a partir de linfocitos individuales seleccionados para la producción de anticuerpos específicos mediante, por ejemplo, los métodos descritos por Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15): 7843-78481; los documentos WO92/02551; WO2004/051268 y WO2004/106377.
Los anticuerpos de la presente invención también se pueden generar usando varios métodos de presentación en fagos conocidos en la materia que incluyen los divulgados por Brinkman. et al. (en J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50), Ames et al. (J. Immunol. Methods, 1995, 184:177-186), Kettleborough et al. (Eur. J. Immunol. 1994, 24:952-958), Persic et al. (Gene, 1997 1879-18), Burton et al. (Advances in Immunology, 1994, 57:191-280) y los documentos w O 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y los documentos US 5698426; 5223409; 5403484; 5580717; 5427908; 5750753; 5821047; 5571698; 5427908; 5516637; 5780225; 5658727; 5.733.743 y 5.969.108.
Los anticuerpos completamente humanos son aquellos anticuerpos en los que las regiones variables y las regiones constantes (cuando están presentes) de las cadenas pesada y ligera son todas de origen humano, o sustancialmente idénticas a secuencias de origen humano, pero no necesariamente del mismo anticuerpo. Los ejemplos de anticuerpos completamente humanos pueden incluir anticuerpos producidos, por ejemplo, mediante los métodos de presentación en fagos descritos anteriormente y los anticuerpos producidos por ratones en los que los genes de la región variable de inmunoglobulina murina, y opcionalmente los de la región constante, se han reemplazado por sus homólogos humanos, por ejemplo, como se describe en términos generales en los documentos EP 0546073, US 5.545.806, US 5.569.825, US 5.625.126, US 5.633.425, US 5.661.016, US 5.770.429, EP 0438474 y EP 0463151.
Como alternativa, un anticuerpo de acuerdo con la invención puede producirse mediante un método que comprende: inmunizar un mamífero no humano con un inmunógeno que comprende un complejo de compuesto y trímero de un TNFa trimérico y un compuesto divulgado en el presente documento; obtener una preparación de anticuerpos de dicho mamífero; derivar a partir de los mismos anticuerpos monoclonales que reconocen selectivamente dicho complejo y cribar la población de anticuerpos monoclonales en busca de anticuerpos monoclonales que se unan al TNFa únicamente en presencia del compuesto.
Las moléculas de anticuerpo de la presente invención pueden comprender una molécula de anticuerpo completa que tiene cadenas ligeras y pesadas de longitud completa o un fragmento o porción de unión a antígeno de la misma. La expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad para unirse de manera selectiva a un antígeno. Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los anticuerpos y fragmentos y porciones de unión a antígeno de los mismos pueden ser, pero sin limitación, Fab, Fab modificado, Fab', Fab' modificado, F(ab')2, Fv, anticuerpos de dominio único (por ejemplo, VH o VL o VHH), scFv, anticuerpos bi, tri o tetravalentes, Bis-scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores (véase, por ejemplo, Holliger y Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9): 1126-1136; Adair y Lawson, 2005, Drug Design Reviews-Online 2 (3), 209-217). Los métodos para crear y fabricar estos fragmentos de anticuerpo son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181). Otros fragmentos de anticuerpo para usar en la presente invención incluyen los fragmentos Fab y Fab' descritos en las solicitudes de patente internacional w O 2005/003169, WO 2005/003170 y WO 2005/003171 y los fragmentos Fab-dAb descritos en la solicitud de patente internacional WO2009/040562. Los anticuerpos multivalentes pueden comprender múltiples especificidades o pueden ser monoespecíficos (véanse, por ejemplo, los documentos Wo 92/22853 y WO 05/113605). Estos fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia y los fragmentos se pueden explorar para determinar la utilidad del mismo modo que los anticuerpos inalterados.
Los dominios de la región constante de la molécula de anticuerpo de la presente invención, si están presentes, pueden seleccionarse teniendo en cuenta la función propuesta de la molécula de anticuerpo, y en particular las funciones efectoras que puedan precisarse. Por ejemplo, los dominios de la región constante pueden ser dominios de IgA, IgD, IgE, IgG o IgM humanas. En particular, se pueden utilizar los dominios de la región constante de IgG humana, especialmente de los isotipos lgG1 e lgG3 cuando la molécula de anticuerpo está destinada a usos terapéuticos y se requieren las funciones efectoras del anticuerpo. Alternativamente, los isotipos lgG2 e lgG4 pueden utilizarse cuando la molécula de anticuerpo está destinada a fines terapéuticos y no se requieren las funciones efectoras del anticuerpo.
Se puede preparar, expresar, crear o aislar un anticuerpo de la invención por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para los genes de la inmunoglobulina de interés o un hibridoma preparado a partir de los mismos, (b) anticuerpos aislados de una célula hospedadora transformada para expresar el anticuerpo de interés, por ejemplo, a partir de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos recombinante y combinatoria, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otro medio que implica el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina a otras secuencias de ADN.
Un anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado. La expresión "anticuerpo humano", como se utiliza en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables en las que tanto las regiones marco conservadas como las CDR provienen de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Asimismo, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también procede de las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis al azar o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo). Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se utiliza en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que secuencias de CDR procedentes de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias marco humanas.
Dicho anticuerpo humano puede ser un anticuerpo monoclonal humano. Dicho anticuerpo monoclonal humano puede producirse por un hibridoma que incluye un linfocito B obtenido a partir de un animal transgénico no humano, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada y un transgén de cadena ligera humanas fusionados a una célula inmortalizada.
Pueden prepararse anticuerpos humanos por inmunización in vitro de linfocitos humanos seguido de transformación de los linfocitos con virus de Epstein-Barr.
La expresión "derivados de anticuerpo humano" se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo humano, por ejemplo, un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo.
La expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a moléculas de anticuerpo injertadas con CDR en las que las secuencias de CDR procedentes de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias marco humanas. Dentro de las secuencias marco conservadas humanas pueden realizarse modificaciones adicionales de la región marco conservada.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "molécula de anticuerpo injertada con CDR" se refiere a una molécula de anticuerpo en donde la cadena pesada y/o ligera contiene una o más CDR (incluyendo, si se desea, una o más CDR modificadas) de un anticuerpo donante (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal murino o de rata) injertado en un marco de región variable de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo aceptor (por ejemplo, un anticuerpo humano). Para una revisión, véase Vaughan et al., Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998. En una realización, en lugar de transferir la CDR completa, solo uno o más de los restos determinantes de la especificidad de cualquiera de las CDR descritas en el presente documento anteriormente se transfieren al marco del anticuerpo humano (véase, por ejemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). En una realización, solo los restos que determinan la especificidad de una o más de las CDR descritas en el presente documento anteriormente se transfieren al marco del anticuerpo humano. En otra realización, solo los restos que determinan la especificidad de cada una de las CDR descritas en el presente documento anteriormente se transfieren al marco del anticuerpo humano.
Cuando se injertan las CDR o los restos determinantes de la especificidad, se puede utilizar cualquier secuencia marco de la región variable aceptora adecuada teniendo en cuenta la clase/tipo de anticuerpo donante del que proceden las CDR, incluyendo regiones marco de ratón, primate y humanas. De manera adecuada, el anticuerpo injertado con CDR de acuerdo con la presente invención tiene un dominio variable que comprende regiones marco aceptoras humanas así como una o más de las CDR o restos determinantes de la especificidad descritos anteriormente. Por lo tanto, en una realización se proporciona un anticuerpo neutralizante injertado con CDR en donde el dominio variable comprende regiones marco aceptoras humanas y CDR donantes no humanas.
Los ejemplos de marcos humanos que se pueden utilizar en la presente invención son KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY y POM (Kabat et al., véase anteriormente). Por ejemplo, se pueden utilizar KOL y NEWM para la cadena pesada, se puede utilizar REI para la cadena ligera y se pueden utilizar UE, LAY y POM tanto para la cadena pesada como para la cadena ligera. Como alternativa, pueden utilizarse secuencias de línea germinal humana; estas están disponibles, por ejemplo, en: http://www.vbase2.org/ (véase Retter et al, Nucl. Acids Res. (2005) 33 (suplemento 1), D671-D674).
En un anticuerpo injertado con CDR de la presente invención, las cadenas ligeras y pesadas del aceptor no necesitan proceder de manera necesaria del mismo anticuerpo y pueden, si se desea, comprender cadenas compuestas que tienen regiones marco procedentes de diferentes cadenas.
También, en un anticuerpo injertado con CDR de la presente invención, las regiones marco no necesitan tener exactamente la misma secuencia que las del anticuerpo aceptor. Por ejemplo, los restos inusuales pueden cambiarse por restos que se producen con mayor frecuencia para esa clase o tipo de cadena aceptora. Como alternativa, los restos seleccionados en las regiones marco aceptoras se pueden cambiar para que correspondan al resto que se encuentra en la misma posición en el anticuerpo donante (véase Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324). Estos cambios deben mantenerse al mínimo necesario para recuperar la afinidad del anticuerpo donante. En el documento WO 91/09967 se establece un protocolo para seleccionar restos en las regiones marco del aceptor que pueden necesitar cambiarse.
Un experto en la materia entenderá también que los anticuerpos pueden sufrir una variedad de modificaciones postraduccionales. El tipo y el alcance de estas modificaciones dependen a menudo de la línea celular hospedadora utilizada para expresar el anticuerpo, así como de las condiciones de cultivo. Dichas modificaciones pueden incluir variaciones en la glucosilación, la oxidación de metionina, la formación de dicetopiperazina, la isomerización de aspartato y desamidación de asparagina. Una modificación frecuente es la pérdida de un resto básico carboxi-terminal (tal como lisina o arginina) debido a la acción de las carboxipeptidasas (como se describe en Harris, R. J. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995).
En una realización, la cadena pesada del anticuerpo comprende un dominio CH1 y la cadena ligera del anticuerpo comprende un dominio CL, k o A.
Las moléculas biológicas, tales como anticuerpos o fragmentos, contienen grupos funcionales ácidos y/o básicos, dando así a la molécula una carga neta positiva o negativa. La cantidad de carga "observada" total dependerá de la secuencia absoluta de aminoácidos de la entidad, el entorno local de los grupos cargados en la estructura 3D y las condiciones ambientales de la molécula. El punto isoeléctrico (pl) es el pH al que una molécula o superficie en particular no porta carga eléctrica neta. En una realización, el anticuerpo o fragmento de acuerdo con la presente divulgación tiene un punto isoeléctrico (pl) de al menos 7. En una realización, el anticuerpo o fragmento tiene un punto isoeléctrico de al menos 8, tal como 8,5, 8,6, 8,7, 8,8 o 9. En una realización, el pl del anticuerpo es 8. Algunos programas, tales como "ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html.(véase Walker, The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005), 571-607), pueden utilizarse para predecir el punto isoeléctrico del anticuerpo o del fragmento.
Los anticuerpos que se unen al epítopo divulgado en el presente documento pueden comprender al menos una, al menos dos o las tres secuencias de CDR de cadena pesada de SEQ ID NO: 4 a 6 (HCDR1/HCDR2/HCDR3 respectivamente). Estas son las secuencias de HCDR1/HCDR2/HCDR3 del anticuerpo CA185_01974 de los ejemplos.
Asimismo, dichos anticuerpos puede comprender al menos una, al menos dos o las tres secuencias de CDR de cadena ligera de SEQ ID NO: 1 a 3 (LCDR1/LCDR2/LCDR3 respectivamente). Estas son las secuencias de LCDR1/LCDR2/LCDR3 del anticuerpo CA185_01974 de los ejemplos.
El anticuerpo comprende adecuadamente al menos una secuencia HCDR3 de la SEQ ID NO: 6.
Normalmente, el anticuerpo comprende al menos una secuencia de CDR de la cadena pesada seleccionada entre las SEQ ID NO: 4 a 6 y al menos una secuencia de CDR de cadena ligera seleccionada de las SEQ ID NO: 1 a 3. El anticuerpo puede comprender al menos dos secuencias de CDR de la cadena pesada seleccionadas entre las SEQ ID NO: 4 a 6 y al menos dos secuencias de CDR de cadena ligera seleccionadas de las SEQ ID NO: 1 a 3. El anticuerpo normalmente comprende las tres secuencias de CDR de la cadena pesada de las SEQ ID NO: 4 a 6 (HCDR1/HCDR2/HCDR3 respectivamente) y las tres secuencias de CDR de cadena ligera de SEQ ID NO: 1 a 3 (LCDR1/LCDR2/LCDR3 respectivamente). Los anticuerpos pueden ser anticuerpos quiméricos, humanos o humanizados.
El anticuerpo también puede comprender al menos una, al menos dos o las tres secuencias de CDR de cadena pesada de SEQ ID NO: 19 a 21 (HCDR1/HCDR2/HCDR3 respectivamente). Estas son las secuencias de HCDR1/HCDR2/HCDR3 del anticuerpo CA185_01979 de los ejemplos.
El anticuerpo normalmente comprende una secuencia HCDR3 de SEQ ID NO: 21.
El anticuerpo también puede comprender al menos una, al menos dos o las tres secuencias de CDR de cadena ligera de SEQ ID NO: 1, 17, 18 (LCDR1/LCDR2/LCDR3 respectivamente). Estas son las secuencias de LCDR1/LCDR2/LCDR3 del anticuerpo CA185_01979 de los ejemplos
Normalmente, el anticuerpo comprende al menos una secuencia de CDR de la cadena pesada seleccionada entre las SEQ ID NO: 19 a 21 y al menos una secuencia de CDR de cadena ligera seleccionada de las SEQ ID NO: 1, 17 y 18. El anticuerpo puede comprender al menos dos secuencias de CDR de la cadena pesada seleccionadas entre las SEQ ID NO: 19 a 21 y al menos dos secuencias de CDR de cadena ligera seleccionadas de las SEQ ID NO: 1, 17 y 18. El anticuerpo de la invención puede comprender las tres secuencias de CDR de la cadena pesada de las SEQ ID NO: 19 a 21 (HCDR1/HCDR2/HCDR3 respectivamente) y las tres secuencias de CDR de cadena ligera de SEQ ID NO: 1, 17, 18 (LCDR1/LCDR2/LCDR3 respectivamente). Los anticuerpos pueden ser anticuerpos quiméricos, humanos o humanizados.
El anticuerpo puede comprender cualquier combinación de secuencias CDR del anticuerpo CA185_01974 y del anticuerpo CA185_01979. En particular, el anticuerpo puede comprender al menos una secuencia HCDR seleccionada entre las SEQ ID NO: 4 a 6 y 19 a 21 y/o al menos una secuencia LCDR seleccionada de las SEQ ID NO: 1 a 3, 17 y 18.
El anticuerpo puede comprender:
- una HCDR1 seleccionada de las SEQ ID NO: 4 y 19; y/o
- una HCDR2 seleccionada de las SEQ ID NO: 5 y 20; y/o
- una HCDR3 seleccionada de las SEQ ID NO: 6 y 21; y/o
- una LCDR1 de SEQ ID NO: 1; y/o
- una LCDR2 seleccionada de las SEQ ID NO: 2 y 17; y/o
- una LCDR3 seleccionada de las SEQ ID NO: 3 y 18.
El anticuerpo puede comprender una secuencia de la región variable de la cadena pesada (HCVR) de la SEQ ID NO: 8 (la HCVR de CA185_01974). El anticuerpo puede comprender una secuencia de la región variable de la cadena ligera (LCVR) de la SEQ ID NO: 7 (la LCVR de CA185_01974). El anticuerpo comprende adecuadamente la secuencia de la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 8 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 7.
El anticuerpo también puede comprender una secuencia de la región variable de la cadena pesada (HCVR) de la SEQ ID NO: 23 (la HCVR de CA185_01979). El anticuerpo puede comprender una secuencia de la región variable de la cadena ligera (LCVR) de la SEQ ID NO: 22 (la LCv R de CA185_01979). El anticuerpo comprende adecuadamente la secuencia de la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 23 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 22.
De nuevo, el anticuerpo puede comprender una combinación de las regiones variables de la cadena pesada y ligera de los anticuerpos c A 185_01974 y CA185_01979. En otras palabras, el anticuerpo puede comprender una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 8 o 23 y/o una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 7 o 22.
El anticuerpo puede comprender una secuencia de la cadena pesada (cadena H) de la SEQ ID NO: 12 (mlgG1 de CA185_01974) o 13 (mFab de CA185_01974 (sin bisagra)). El anticuerpo puede comprender una secuencia de la cadena ligera (cadena L) de la SEQ ID NO: 11 (cadena ligera k CA185_01974). El anticuerpo comprende normalmente la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 12/13 y la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 11. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos quiméricos, humanos o humanizados.
El anticuerpo puede comprender una secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 27 (mlgG1 de CA185_01979) o 28 (mFab de CA185_01979 (sin bisagra)). El anticuerpo puede comprender una secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 26 (cadena ligera k de CA185_01979). En general, el anticuerpo comprende la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 27/28 y la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 26. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos quiméricos, humanos o humanizados. De nuevo, las secuencias de CA185_01974 y CA185_01979 se pueden combinar.
De manera alternativa, el anticuerpo puede ser o puede comprender una variante de una de las secuencias específicas enumeradas anteriormente. Por ejemplo, una variante puede ser una variante de sustitución, eliminación o adición de cualquiera de las secuencias de aminoácidos anteriores.
Un anticuerpo variante puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, hasta 10, hasta 20 o más (normalmente hasta un máximo de 50) sustituciones y/o eliminaciones de aminoácidos de las secuencias específicas indicadas anteriormente. Las variantes de "eliminación" pueden comprender la eliminación de aminoácidos individuales, eliminación de pequeños grupos de aminoácidos tales como 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, o eliminación de regiones de aminoácidos más grandes, tal como la eliminación de dominios de aminoácidos específicos u otras características. Las variantes de "sustitución" implican normalmente el reemplazo de uno o más aminoácidos con el mismo número de aminoácidos y la realización de sustituciones conservadoras de aminoácidos. Por ejemplo, un aminoácido puede sustituirse con un aminoácido alternativo que tenga propiedades similares, por ejemplo, otro aminoácido básico, otro aminoácido ácido, otro aminoácido neutro, otro aminoácido cargado, otro aminoácido hidrófilo, otro aminoácido hidrófobo, otro aminoácido polar, otro aminoácido aromático u otro aminoácido alifático. Algunas propiedades de los 20 aminoácidos principales que se pueden usar para seleccionar sustituyentes adecuados son las siguientes:
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En general, los "derivados" o "variantes" incluyen aquellos en los que, en lugar del aminoácido de origen natural, el aminoácido que aparece en la secuencia es un análogo estructural del mismo. Los aminoácidos usados en las secuencias también pueden derivatizarse o modificarse, por ejemplo, marcarse, siempre que la función del anticuerpo no se vea afectada de manera significativa.
Los derivados y las variantes como se ha descrito anteriormente se pueden preparar durante la síntesis del anticuerpo o mediante una modificación posterior a la producción, o cuando el anticuerpo está en forma recombinante usando las técnicas conocidas de mutagénesis dirigida, mutagénesis aleatoria o escisión enzimática y/o ligamiento de ácidos nucleicos.
Los anticuerpos variantes pueden tener una secuencia de aminoácidos que tenga más de aproximadamente un 60 %, o más de aproximadamente un 70 %, por ejemplo, un 75 u 80 %, normalmente más de aproximadamente un 85 %, por ejemplo, más de aproximadamente un 90 o 95 % de identidad de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento (en particular, las secuencias HCVR/LCVR y las secuencias de cadena H y L). Asimismo, el anticuerpo puede ser una variante que tenga más de aproximadamente un 60 %, o más de aproximadamente un 70 %, por ejemplo, un 75 u 80 %, normalmente más de aproximadamente un 85 %, por ejemplo, más de aproximadamente un 90 o 95 % de identidad de aminoácidos con las secuencias HCVR/LCVR y las secuencias de cadena H y L divulgadas en el presente documento, conservando las CDR exactas divulgadas para estas secuencias. Las variantes pueden conservar al menos aproximadamente un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad con las secuencias HCVR/LCVR y con las secuencias de las cadenas H y L divulgadas en el presente documento (en algunas circunstancias mientras se conservan las CDR exactas).
Las variantes suelen conservar de aproximadamente un 60 % a aproximadamente un 99 % de identidad, de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 99 % de identidad, de aproximadamente un 90 % a aproximadamente un 99 % de identidad o de aproximadamente un 95 % a aproximadamente un 99 % de identidad. Este nivel de identidad de aminoácidos puede verse en toda la longitud de la secuencia SEQ ID NO relevante o en una parte de la secuencia, tal como en aproximadamente 20, 30, 50, 75, 100, 150, 200 aminoácidos o más, dependiendo del tamaño del polipéptido de longitud completa.
En relación con las secuencias de aminoácidos, "identidad de secuencia" se refiere a secuencias que tienen el valor establecido cuando se evalúan usando ClustalW (Thompson et al., 1994, véase anteriormente) con los siguientes parámetros:
Parámetros de alineación por pares - Método: preciso, Matriz: PAM, Penalización por apertura de hueco: 10,00, Penalización por extensión de hueco: 0,10;
Múltiples parámetros de alineación - Matriz: PAM, Penalización por apertura de hueco: 10,00, % de identidad por retraso: 30, Penalizar huecos finales: activado, Distancia de separación de huecos: 0, Matriz negativa: no, Penalización por extensión de hueco: 0,20, Penalizaciones por hueco específico de resto: activado, Penalizaciones por hueco hidrófilo: activado, Restos hidrófilos: GPSNDQEKR. La identidad de secuencia en un resto particular tiene por objeto incluir restos idénticos que simplemente se han derivatizado.
Por lo tanto, se proporcionan anticuerpos que tienen secuencias y variantes específicas que mantienen la función o la actividad de estas cadenas.
La presente divulgación también proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica las regiones variables de cadena pesada y/o ligera de una molécula de anticuerpo de la presente invención.
Una secuencia de ADN aislada de la SEQ ID NO: 10 codifica la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 8. Una secuencia de ADN aislada de la SEQ ID NO: 9 codifica la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 7.
Una secuencia de ADN aislada de la SEQ ID NO: 25 codifica la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 23. Una secuencia de ADN aislada de la SEQ ID NO: 24 codifica la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 22.
La presente divulgación también proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica la(s) cadena(s) pesada y/o ligera de cualquier molécula de anticuerpo de la presente invención. De manera adecuada, la secuencia de a Dn codifica la cadena pesada o ligera de una molécula de anticuerpo de la presente invención.
La secuencias de ADN aisladas de las SEQ ID NO: 15 o 16 codifican las cadenas pesadas de las SEQ ID NO: 12 y 13 respectivamente. La secuencia de ADN aislada de la SEQ ID NO: 14 codifica la cadena ligera de la SEQ ID NO: 11.
La secuencias de ADN aisladas de las SEQ ID NO: 30 o 31 codifican las cadenas pesadas de las SEQ ID NO: 27 y 28 respectivamente. La secuencia de ADN aislada de la SEQ ID NO: 29 codifica la cadena ligera de la SEQ ID NO: 26.
Una secuencia de polinucleótidos adecuada puede ser alternativamente una variante de una de estas secuencias específicas de polinucleótidos. Por ejemplo, una variante puede ser una variante de sustitución, eliminación o adición de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico anteriores. Un polinucleótido variante puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, hasta 10, hasta 20, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 75 o más sustituciones y/o eliminaciones de ácido nucleico de las secuencias dadas en el listado de secuencias. En general, una variante tiene de 1 a 20, de 1 a 50, de 1 a 75 o de 1 a 100 sustituciones y/o eliminaciones.
Las variantes adecuadas pueden ser al menos un 70 % homólogas de un polinucleótido de una cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos divulgadas en el presente documento, normalmente al menos aproximadamente un 80 o un 90 %, y más adecuadamente al menos aproximadamente un 95 %, un 97 % o un 99 % homólogas al mismo. Las variantes pueden conservar al menos aproximadamente un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad. Las variantes suelen conservar de aproximadamente un 60 % a aproximadamente un 99 % de identidad, de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 99 % de identidad, de aproximadamente un 90 % a aproximadamente un 99 % de identidad o de aproximadamente un 95 % a aproximadamente un 99 % de identidad. En general, la homología y la identidad a estos niveles están presentes al menos con respecto a las regiones de codificación de los polinucleótidos. Los métodos para medir la homología son bien conocidos en la materia y los expertos en la materia entenderán que en el presente contexto, la homología se calcula sobre la base de la identidad del ácido nucleico. Dichas homología puede existir en una región de al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 30, por ejemplo, al menos aproximadamente 40, 60, 100, 200 o más nucleótidos contiguos (dependiendo de la longitud). Tal homología puede existir en toda la longitud de la secuencia de polinucleótidos no modificada.
Se conocen en la materia métodos para medir la homología o identidad de los polinucleótidos. Por ejemplo, el paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT que puede usarse para calcular la homología (por ejemplo, usado en sus ajustes por defecto) (Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395).
Los algoritmos PILEUP y BLAST también pueden utilizarse para calcular la homología o secuencias de alineación (normalmente en sus ajustes por defecto), por ejemplo, como se describe en Altschul S.F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10.
El programa informático para realizar el análisis BLAST está disponible al público a través del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar primero un par de secuencias de alta puntuación (HSP, del inglés "high scoring sequence pair") mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta que coinciden o satisfacen alguna puntuación de umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se refiere al umbral de la puntuación de palabra vecina (Altschul et al., véase anteriormente). Estos aciertos de palabra vecina iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP que los contengan. Los aciertos de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia todo el tiempo que pueda aumentarse la puntuación de alineación acumulativa. Las extensiones de los aciertos de palabra en cada dirección se detienen cuando: la puntuación de alineación acumulativa llega a cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de restos con valor negativo; o se alcanza el final de una de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLAST usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919) alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=4 y una comparación de ambas cadenas.
El algoritmo BLAST realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias; véase, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787. Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la que sucedería una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos por casualidad. Por ejemplo, una secuencia se considera similar a otra secuencia si la probabilidad de suma más pequeña en comparación de la primera secuencia con la segunda secuencia es menos de aproximadamente 1, normalmente menos de aproximadamente 0,1, adecuadamente menor de aproximadamente 0,01 y lo más adecuadamente, menor de aproximadamente 0,001. Por ejemplo, la probabilidad de suma más pequeña puede estar en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 0,001, a menudo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,001.
El homólogo puede diferir de una secuencia en el polinucleótido pertinente en menos de aproximadamente 3, 5, 10, 15, 20 o más mutaciones (cada una de las cuales puede ser una sustitución, eliminación o inserción). Por ejemplo, el homólogo puede diferir en 3 a 50 mutaciones, a menudo de 3 a 20 mutaciones. Estas mutaciones se pueden medir en una región de al menos 30, por ejemplo, al menos aproximadamente 40, 60 o 100 o más nucleótidos contiguos del homólogo.
En una realización, una secuencia variante puede variar de las secuencias específicas dadas en el listado de secuencias en virtud de la redundancia en el código genético. El código de ADN tiene 4 restos de ácidos nucleicos primarios (A, T, C y G) y los usa para "deletrear" codones de tres letras que representan los aminoácidos que codifican las proteínas en los genes de un organismo. La secuencia lineal de codones a lo largo de la molécula de ADN se traduce en la secuencia lineal de aminoácidos en la(s) proteína(s) codificada(s) por esos genes. El código está muy degenerado, con 61 codones que codifican los 20 aminoácidos naturales y 3 codones que representan señales de "parada". Por lo tanto, la mayoría de los aminoácidos están codificados por más de un codón; de hecho, varios están codificados por cuatro o más codones diferentes. Por lo tanto, un polinucleótido variante de la invención puede codificar la misma secuencia polipeptídica al igual que otro polinucleótido de la invención, pero puede tener una secuencia de ácido nucleico diferente debido al uso de diferentes codones para codificar los mismos aminoácidos.
La secuencia de ADN de la presente invención puede comprender ADN sintético, por ejemplo, producido mediante procesamiento químico, ADNc, ADN genómico o cualquier combinación de los mismos.
Las secuencias de ADN que codifican una molécula de anticuerpo de la presente invención se pueden obtener mediante métodos bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican parte o la totalidad de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo pueden sintetizarse según se desee a partir de las secuencias de ADN determinadas o basándose en las correspondientes secuencias de aminoácidos.
Los métodos generales por los que se pueden construir los vectores, los métodos de transfección y los métodos de cultivo son bien conocidos por los expertos en la materia. En este sentido, se hace referencia a "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, Nueva York y Manual Maniatis producido por Cold Spring Harbor Publishing.
También se proporciona una célula hospedadora que comprende uno o más vectores de clonación o expresión que comprenden una o más secuencias de ADN que codifican un anticuerpo de la presente invención. Puede utilizarse cualquier sistema de vector/célula hospedadora adecuado para la expresión de las secuencias de ADN que codifican la molécula de anticuerpo de la presente invención. Se pueden usar sistemas bacterianos, por ejemplo, E. coli, y otros sistemas microbianos o eucarióticos, por ejemplo, de mamíferos, también se pueden usar sistemas de expresión de células hospedadoras. Las células hospedadoras de mamífero adecuadas incluyen células CHO, de mieloma o hibridoma.
La presente divulgación también proporciona un proceso para la producción de una molécula de anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación que comprende cultivar una célula hospedadora que contiene un vector de la presente divulgación en unas condiciones adecuadas para dar lugar a la expresión de la proteína a partir del ADN que codifica la molécula de anticuerpo de la presente invención, y aislar la molécula de anticuerpo.
Pueden utilizarse métodos de selección como se describen en el presente documento para identificar anticuerpos adecuados que sean capaces de unirse a un complejo de compuesto y trímero. Por lo tanto, los métodos de selección descritos en el presente documento se pueden llevar a cabo para probar anticuerpos de interés.
Los anticuerpos de la invención se pueden someter a ensayo para determinar su unión a un complejo de compuesto y trímero mediante, por ejemplo, ELISA convencional o transferencia Western. También se puede usar un ensayo ELISA para seleccionar hibridomas que muestren reactividad positiva con la proteína diana. La selectividad de unión de un anticuerpo también puede determinarse controlando la unión del anticuerpo a células que expresan la proteína diana, por ejemplo, mediante citometría de flujo. Por lo tanto, un método de selección puede comprender la etapa de identificar un anticuerpo que sea capaz de unirse a un complejo de compuesto y trímero mediante la realización de un ELISA o una transferencia Western o mediante citometría de flujo.
Los anticuerpos de la invención reconocen selectivamente (o específicamente) un complejo de trímero del TNFacompuesto, es decir, un epítopo dentro del complejo de compuesto y trímero. Un anticuerpo, u otro compuesto, "se une de manera selectiva a" o "reconoce de manera selectiva" una proteína cuando se une con una afinidad preferente o elevada a la proteína para la que es selectivo, pero no se une sustancialmente, o se une con baja afinidad, a otras proteínas. La selectividad de un anticuerpo de la invención para un complejo de compuesto y trímero objetivo puede estudiarse adicionalmente mediante la determinación de si el anticuerpo se une o no a otros complejos de compuestotrímero relacionados, como se analizó anteriormente, o si discrimina entre ellos.
Un anticuerpo puede unirse específicamente (o selectivamente) a complejos de compuesto-trímero que comprenden otras formas triméricas de uno o más miembros de la superfamilia del TNF. Por ejemplo, un anticuerpo puede unirse a complejos de compuesto y trímero que comprenden TNFa, complejos de compuesto y trímero que comprenden TNFp y complejos de compuesto y trímero que comprenden CD40L. Como alternativa, un anticuerpo puede unirse específicamente (o selectivamente) a complejos de compuesto-trímero que comprenden únicamente el TNFa, pero no a los complejos de compuesto y trímero que comprenden cualquier otro miembro de la superfamilia del TNF. Por ejemplo, un anticuerpo puede unirse a complejos de compuesto y trímero que comprenden TNFa, pero no a complejos de compuesto y trímero que comprenden TNFp o a complejos de compuesto y trímero que comprenden CD40L. Un anticuerpo puede unirse de manera específica (o de manera selectiva) a complejos de compuesto y trímero que comprenden hasta dos, tres, cuatro o hasta todos los miembros de la superfamilia del TNF.
Por específico (o selectivo), se entenderá que el anticuerpo se une a los complejos de compuesto y trímero de interés sin reactividad cruzada significativa con ninguna otra molécula, que puede incluir compuestos de ensayo en ausencia de un trímero de la superfamilia del TNF o trímeros de miembros de la superfamilia del TNF en ausencia de un compuesto de ensayo. La reactividad cruzada puede evaluarse mediante cualquier método adecuado descrito en el presente documento. La reactividad cruzada de un anticuerpo para un complejo de compuesto y trímero con una molécula distinta del complejo de compuesto y trímero puede considerarse significativa si el anticuerpo se une a la otra molécula al menos aproximadamente un 5 %, un 10 %, un 15 %, un 20 %, un 25 %, un 30 %, un 35 %, un 40 %, un 45 %, un 50 %, un 55 %, un 60 %, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 % o el 100 % de manera tan fuerte como se une al complejo de compuesto y trímero de interés. Un anticuerpo que es específico (o selectivo) para el complejo de compuesto y trímero puede unirse a otra molécula en menos de aproximadamente un 90 %, un 85 %, un 80 %, un 75 %, un 70 %, un 65 %, un 60 %, un 55 %, un 50 %, un 45 %, un 40 %, un 35 %, un 30 %, un 25 % o un 20 % de la fuerza con la que se une al complejo de compuesto y trímero. El anticuerpo puede unirse a la otra molécula en menos de aproximadamente un 20 %, menos de aproximadamente un 15 %, menos de aproximadamente un 10 % o menos de aproximadamente un 5 %, menos de aproximadamente un 2 % o menos de aproximadamente un 1 % de la fuerza con la que se une al complejo de compuesto y trímero. El anticuerpo se une específicamente (o selectivamente) a un complejo de compuesto y trímero en comparación con (i) la forma trimérica del TNFa en ausencia del compuesto y/o (ii) el compuesto en ausencia del trímero del TNFa.
Las velocidades a las que un anticuerpo se une a un complejo de compuesto y trímero se denominan en el presente documento velocidad de "asociación" o "kon-ab, y la velocidad a la que el anticuerpo se disocia del complejo de compuesto y trímero se denomina en el presente documento velocidad de "disociación" o koff-ab. Como se utiliza en el presente documento, el símbolo "Ko -a b" representa la afinidad de unión (constante de disociación) de un anticuerpo por un complejo de compuesto y trímero. La Kü-ab se define como koff-ab/ kon-ab. Los anticuerpos pueden tener velocidades de "asociación" lentas, que pueden medirse en minutos mediante análisis espectral de masas del complejo de compuesto y trímero y las intensidades de los máximos de anticuerpos. Los valores Kü-ab de un anticuerpo pueden estimarse mediante la repetición de esta medición en diferentes anticuerpos: relaciones del complejo de compuesto y trímero.
El valor Kü-ab del anticuerpo para la unión a un complejo de compuesto y trímero puede ser al menos aproximadamente 1.5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, 200 veces, 300 veces o 400 veces inferior, o inferior, que el valor Kü-ab del anticuerpo para la unión al miembro de la superfamilia del TNF trimérico en ausencia del compuesto y/o el valor Kü-ab del anticuerpo para la unión al compuesto en ausencia del miembro de la superfamilia del t Nf trimérico. El valor Kü-ab del anticuerpo para la unión a un complejo de compuesto y trímero puede disminuir al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 200 veces o al menos aproximadamente 300 veces el valor de la Kü-ab del trímero de la superfamilia del TNF que se une al receptor de la superfamilia del TNF en ausencia del compuesto de ensayo, es decir, la afinidad de unión del anticuerpo por el complejo de compuesto y trímero aumenta normalmente al menos aproximadamente 10 veces, de manera adecuada al menos aproximadamente 100 veces, de manera más adecuada al menos aproximadamente 200 veces, de la manera más adecuada al menos aproximadamente 300 veces en comparación con la afinidad de unión del anticuerpo al miembro de la superfamilia del TNF trimérico en ausencia del compuesto y/o la afinidad de unión del anticuerpo al compuesto en ausencia del miembro de la superfamilia del TNF trimérico.
La afinidad de unión se puede dar en términos de afinidades de unión (Kü-ab) y puede darse en cualquier unidad adecuada, tales como mM, nM o pM. Cuanto menor sea el valor Kü-ab, mayor es la afinidad de unión del anticuerpo al complejo de compuesto y trímero.
El valor Kü-ab del anticuerpo para la unión al complejo de compuesto y trímero puede ser al menos aproximadamente 1.5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces inferior, o incluso inferior al valor Kü-ab del anticuerpo para la unión al miembro de la superfamilia del TNF trimérico en ausencia del compuesto y/o al valor Kü-ab del anticuerpo para la unión al compuesto en ausencia del miembro de la superfamilia del TNF trimérico.
La disminución del valor KD-ab del anticuerpo para la unión al complejo de compuesto y trímero en comparación con el valor KD-ab de la unión del anticuerpo al miembro de la superfamilia del TNF trimérico en ausencia del compuesto y/o el valor KD-ab del anticuerpo para la unión al compuesto en ausencia del miembro de la superfamilia del TNF trimérico puede resultar de un aumento en la velocidad de asociación (kon-ab) de la unión del anticuerpo al complejo de compuesto y trímero en comparación con la unión del anticuerpo al miembro de la superfamilia del TNF trimérico en ausencia del compuesto y/o la unión del anticuerpo al compuesto en ausencia del miembro de la superfamilia del TNF trimérico; y/o una disminución en la velocidad de disociación (koff-ab) en comparación con la unión del anticuerpo al miembro de la superfamilia del TNF trimérico en ausencia del compuesto y/o la unión del anticuerpo al compuesto en ausencia del miembro de la superfamilia del TNF trimérico.
La velocidad de asociación (kon-ab) de la unión del anticuerpo al complejo de compuesto y trímero aumenta en general en comparación con la velocidad de asociación de unión del anticuerpo al miembro de la superfamilia del TNF trimérico en ausencia del compuesto y/o la unión del anticuerpo al compuesto en ausencia del miembro de la superfamilia del TNF trimérico. La velocidad de disociación (koff-ab) de la unión del anticuerpo al complejo de compuesto y trímero disminuye en general en comparación con la velocidad de disociación de la unión del anticuerpo al miembro de la superfamilia del TNF trimérico en ausencia del compuesto y/o la unión del anticuerpo al compuesto en ausencia del miembro de la superfamilia del TNF trimérico. Más normalmente, la velocidad de asociación (kon-ab) de la unión del anticuerpo al complejo de compuesto y trímero aumenta, y la velocidad de disociación (koff-ab) de la unión del anticuerpo al complejo de compuesto y trímero disminuye, en comparación con la unión del anticuerpo al miembro de la superfamilia del TNF trimérico en ausencia del compuesto y/o la unión del anticuerpo al compuesto en ausencia del miembro de la superfamilia del TNF trimérico.
El valor de la kon-ab de la unión del anticuerpo al complejo de compuesto y trímero puede aumentar en al menos aproximadamente 1,5 veces o al menos dos veces, y normalmente al menos aproximadamente tres veces en comparación con el valor de la kon-ab de la unión del anticuerpo al miembro de la superfamilia del TNF trimérico en ausencia del compuesto y/o la unión del anticuerpo al compuesto en ausencia del miembro de la superfamilia del TNF trimérico y/o el valor de la koff-ab de la unión del anticuerpo al complejo de compuesto y trímero puede disminuir en al menos aproximadamente dos veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 60 veces, al menos aproximadamente 70 veces, al menos aproximadamente 80 veces, más adecuadamente al menos aproximadamente 90 veces en comparación con el valor de la koff-ab de la unión del anticuerpo al miembro de la superfamilia del TNF trimérico en ausencia del compuesto y/o la unión del anticuerpo al compuesto en ausencia del miembro de la superfamilia del TNF trimérico.
Los valores kon-ab, koff-ab y KD-ab se pueden determinar utilizando cualquier técnica adecuada, por ejemplo, la resonancia de plasmón superficial, la espectrometría de masas y la calorimetría isotérmica.
El valor KD-ab de la unión del anticuerpo a un complejo de compuesto y trímero puede ser 1 nM, 900 pM, 700 pM, 500 pM, 100 pM, 10 pM o inferior (normalmente hasta aproximadamente 1 pM). Los anticuerpos de la invención se unirán deseablemente a los complejos de compuesto-trímero de la divulgación con una afinidad elevada, por ejemplo, en el intervalo picomolar. El valor KD-ab de la unión del anticuerpo a un complejo de compuesto y trímero puede ser 1 nM o inferior, 900 pM o inferior, 700 pM o inferior, 500 pM o inferior, 400 pM o inferior, 300 pM o inferior, 200 pM o inferior, 100 pM o inferior, 90 pM o inferior, 80 pM o inferior, 70 pM o inferior, 60 pM o inferior, 50 pM o inferior, 40 pM o inferior, 30 pM o inferior, 20 pM o inferior, 10 pM o inferior (de nuevo, hasta aproximadamente 1 pM).
Una vez que se ha identificado y seleccionado un anticuerpo adecuado, la secuencia de aminoácidos del anticuerpo puede identificarse mediante métodos conocidos en la materia. Los genes que codifican el anticuerpo se pueden clonar usando cebadores degenerados. El anticuerpo se puede producir de forma recombinante mediante métodos de rutina.
Los anticuerpos pueden competir por la unión al TNFa con, o unirse al mismo epítopo que, los definidos anteriormente en términos de cadena H/cadena L, HCVR/LCVR o secuencias CDR. En particular, un anticuerpo puede competir por la unión al TNFa con, o unirse al mismo epítopo que, un anticuerpo que comprende una combinación de secuencias HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 de SEQ ID NO: 4/5/6/1/2/3 o SEQ ID NO: 19/20/21/1/17/18. Un anticuerpo puede competir por la unión al TNFa con, o unirse al mismo epítopo que, un anticuerpo que comprende un par de secuencias HCVR y LCVR de SEQ ID NO: 8/7 o SEQ ID NO: 23/22.
El término "epítopo" es una región de un antígeno a la que se une un anticuerpo. Los epítopos pueden definirse como estructurales o funcionales. Los epítopos funcionales son generalmente un subconjunto de los epítopos estructurales y tienen aquellos restos que contribuyen directamente a la afinidad de la interacción. Los epítopos también pueden ser conformacionales, es decir, compuestos de aminoácidos no lineales. En determinadas realizaciones, los epítopos pueden incluir determinantes que son agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, grupos fosforilo o grupos sulfonilo y, en determinadas realizaciones, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas.
Puede determinarse fácilmente si un anticuerpo se une al mismo epítopo que, o compite por la unión con, un anticuerpo de referencia usando métodos rutinarios conocidos en la materia. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de ensayo se une al mismo epítopo que un anticuerpo de referencia de la invención, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una proteína o péptido en condiciones de saturación. A continuación, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de ensayo para unirse a la proteína o péptido. Si el anticuerpo de ensayo es capaz de unirse a la proteína o péptido después de la unión por saturación con el anticuerpo de referencia, puede concluirse que el anticuerpo de ensayo se une a un epítopo diferente del anticuerpo de referencia. Por otro lado, si el anticuerpo de ensayo no es capaz de unirse a la proteína o péptido después de la unión por saturación con el anticuerpo de referencia, entonces el anticuerpo de ensayo puede unirse al mismo epítopo al que se une el anticuerpo de referencia de la invención.
Para determinar si un anticuerpo compite por la unión con un anticuerpo de referencia, se realiza la metodología de unión descrita anteriormente en dos orientaciones. En una primera orientación, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una proteína/péptido en condiciones de saturación seguido por evaluación de la unión del anticuerpo de ensayo a la molécula de proteína/péptido. En una segunda orientación, se permite que el anticuerpo de ensayo se una a la proteína/péptido en condiciones de saturación seguido por evaluación de la unión del anticuerpo de referencia a la proteína/péptido. Si, en ambas orientaciones, solo el primer anticuerpo (de saturación) es capaz de unirse a la proteína/péptido, entonces se concluye que el anticuerpo de ensayo y el anticuerpo de referencia compiten por la unión a la proteína/péptido. Como apreciará el experto en la materia, un anticuerpo que compite por la unión con un anticuerpo de referencia puede que no se una necesariamente al epítopo idéntico al anticuerpo de referencia, sino que puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia mediante la unión a un epítopo solapante o adyacente.
Dos anticuerpos se unen al mismo epítopo o epítopos solapantes si cada uno inhibe (bloquea) competitivamente la unión del otro al antígeno. Es decir, un exceso en un factor de 1, 5, 10, 20 o 100 de un anticuerpo inhibe la unión del otro en al menos un 50 %, un 75 %, un 90 % o incluso un 99 %, según se mide en un ensayo de unión competitiva (véase, por ejemplo, Junghans et al., Cancer Res, 1990:50:1495-1502). Como alternativa, dos anticuerpos tienen el mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácido en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Dos anticuerpos tienen epítopos solapantes si algunas mutaciones de aminoácido que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro.
A continuación, puede realizarse experimentación de rutina adicional (por ejemplo, mutación de péptidos y análisis de unión) para confirmar si la ausencia observada de unión del anticuerpo de ensayo se debe, de hecho, a la unión al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia o si el bloqueo estérico (u otro fenómeno) es responsable de la ausencia de la unión observada. Los experimentos de este tipo pueden realizarse usando ELISA, RIA, resonancia del plasmón superficial, citometría de flujo o cualquier otro ensayo cuantitativo o cualitativo de unión de anticuerpos disponible en la materia.
Los anticuerpos de la invención se unen a un epítopo que comprende al menos L94 y P113, o L94 e Y115, en donde la numeración de los restos corresponde al TNFa de la SEQ ID NO: 36. Como se analiza adicionalmente más adelante, la SEQ ID NO: 36 representa la secuencia del TNFa soluble humano.
Aunque estos restos se proporcionan para una secuencia particular del TNFa soluble humano, el experto podría extrapolar fácilmente las posiciones de estos restos a otras secuencias del TNFa (de ratón o de rata) utilizando técnicas rutinarias. Por lo tanto, la invención también proporciona anticuerpos que se unen a epítopos que comprenden los correspondientes restos dentro de estas otras secuencias del TNF.
Como se analiza adicionalmente en los ejemplos, los restos identificados anteriormente están ocultos (y no accesibles) dentro del trímero del TNFa en ausencia del compuesto. Sin embargo, cuando el trímero del TNF está unido a un compuesto divulgado en este documento, estos restos se vuelven accesibles dentro de la conformación distorsionada del trímero. Por consiguiente, los anticuerpos de la invención que se unen a un epítopo que comprende L94 y P113, o L94 e Y115, reconocerán la conformación distorsionada del trímero (que modula la señalización del TNF), pero no la conformación normal del trímero en ausencia de compuesto.
Los anticuerpos de la invención pueden unirse a un epítopo que comprenda los tres, L94, P113 e Y115, en donde L94 está presente en la cadena A del trímero de TNFa y P113 e Y115 están presentes en la cadena C del trímero de TNFa. Las cadenas "A" y "C" se refieren al primer y tercer monómero, que forman el trímero del TNF. Por lo tanto, los anticuerpos de la invención reconocen normalmente un epítopo conformacional que abarca dos monómeros del trímero del TNF.
Con más detalle, cuando se mira una estructura cristalina de un trímero del TNFa desde el lado, tiene aproximadamente la forma de una pirámide/cono. Cuando se mira hacia abajo en el eje del trímero con los extremos N y C de los extremos del monómero apuntando hacia ti, entonces se mira el extremo "grueso" del trímero. En la estructura distorsionada con el compuesto, se abre una hendidura entre las subunidades A y C en la que, sin quedar ligados a teoría alguna, el Ac de la invención se une.
La cadena A, B o C puede determinarse mediante la medición de tres distancias entre tres átomos C-a de tres restos idénticos, por ejemplo, P117 en cada cadena (G121 también es adecuado).
Las tres distancias forman un triángulo equilátero en apo TNF pero distorsionado cuando el compuesto está unido. La distancia más corta es entre BC y la más larga entre AC (por ejemplo, AC = 13,8 A, AB = 12,3 A, BC = 10,2 A); por lo tanto, si se mira hacia abajo a través del eje de la molécula con los terminales N/C apuntando hacia ti, la distancia más larga define las cadenas C y luego A que van en sentido antihorario, después B y C de nuevo continuando en sentido antihorario.
Los anticuerpos de la invención pueden unirse a un epítopo que comprenda adicionalmente cualquiera de los siguientes restos del TNFa de la SEQ ID NO: 36: T77 (cadena A); T79 (cadena A); Y87 (cadena A); T89 (cadena A); K90 (cadena A); V91 (cadena A); N92 (cadena A); L93 (cadena A); S95 (cadena A); A96 (cadena A); 197 (cadena a ); E135 (cadena A); I136 (cadena A), R138 (cadena A), L63 (cadena C); D143 (cadena C); F144 (cadena C); S147 (cadena C); Q149 (cadena C). De nuevo, estos restos pueden extrapolarse a otras secuencias del TNFa.
Los anticuerpos de la invención pueden unirse a un epítopo que comprenda todos los T77, T79, Y87, T89, K90, V91, N92, L93, s 95, A96, I97, E135, I136 y R138, restos que están presentes en la cadena A de un trímero del TNFa.
Los anticuerpos de la invención también pueden unirse a un epítopo que comprenda todos los L63, D143, F144, S147 y Q149, restos que están presentes en la cadena C de un trímero del TNFa.
En particular, los anticuerpos de la invención pueden unirse a un epítopo que comprenda todos los T77, T79, Y87, T89, K90, V91, N92, L93, S95, A96, I97, E135, I136 y R138, restos que están presentes en la cadena A de un trímero del TNFa, y L63, D143, F144, S147 y Q149, restos que están presentes en la cadena C de un trímero del TNFa.
Adicionalmente, los anticuerpos pueden unirse a un epítopo que comprenda adicionalmente cualquiera de los siguientes restos del TNFa de la SEQ ID NO: 36: L75 (cadena A), S81 (cadena A), R82 (cadena A); 183 (cadena A); 197 (cadena A); D140 (cadena A); P20 (cadena C); F64 (cadena C) y K65 (cadena C). Una vez más, estos restos pueden extrapolarse a otras secuencias del TNFa.
Los anticuerpos de la invención pueden, por tanto, unirse a un epítopo que comprenda todo los T77, T79, Y87, T89, K90, V91, N92, L93, S95, A96, I97, E135, I136, R138, L75, S81, R82, 183, 197 y D140, restos que están presentes en la cadena A de un trímero del TNFa.
Asimismo, los anticuerpos de la invención pueden unirse a un epítopo que comprenda todos los L63, D143, F144, S147, Q149, P20, F64 y K65, restos que están presentes en la cadena C de un trímero del TNFa.
Los anticuerpos de la invención pueden unirse a un epítopo que comprenda todos los T77, T79, Y87, T89, K90, V91, N92, L93, s 95, A96, I97, E135, M36, R138, L75, S81, R82, 183, 197 y D140, restos que están presentes en la cadena A de un trímero del TNFa, y L63, D143, F144, S147, Q149, P20, F64 y K65, restos que están presentes en la cadena C de un trímero del TNFa.
Para cribar anticuerpos que se unen a un epítopo particular, puede realizarse un ensayo rutinario de bloqueo cruzado como el descrito en Antibodies, Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY). Otros métodos incluyen mutantes de cribado de alanina, transferencias de péptidos (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248: 443-63) o análisis por escisión de péptidos. Además, pueden emplearse métodos tales como excisión de epítopos, extracción de epítopos y modificación química de antígenos (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496). Dichos métodos son bien conocidos en la técnica.
Los epítopos de los anticuerpos también pueden determinarse mediante un análisis por cristalografía de rayos X. Los anticuerpos de la presente invención pueden, por tanto, evaluarse mediante el análisis por cristalografía de rayos X del anticuerpo unido al trímero del TNFa. En particular, los epítopos pueden identificarse de esta manera determinando los restos del TNFa dentro de 4 A de un resto parátopo del anticuerpo.
Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para identificar compuestos como se describe en el presente documento. Los anticuerpos de la invención también se pueden usar como biomarcadores de interacción con la diana. Se puede utilizar un biomarcador de interacción con la diana para detectar la interacción, es decir, la unión de un ligando a una diana de interés. En el presente caso, los anticuerpos de la invención se unen únicamente a los complejos de compuestos de la divulgación con TNFa triméricos. Por lo tanto, si un anticuerpo de la invención es capaz de unirse a un complejo de compuesto y trímero, esto es evidencia de que el ligando (compuesto) se ha unido a la diana de interés (trímero del TNFa). Los anticuerpos de la invención se pueden modificar para añadir un marcador detectable como se describe en el presente documento. Por lo tanto, la interacción de un compuesto de la divulgación con un TNFa objetivo puede detectarse usando dicho anticuerpo.
El uso de anticuerpos de la invención como biomarcadores de interacción con la diana es potencialmente útil en un entorno clínico o preclínico, donde se puede tomar una muestra de un sujeto que está siendo tratado. La muestra obtenida del sujeto puede tratarse con un anticuerpo de la invención para determinar si el compuesto utilizado para tratar al sujeto se ha unido al TNFa diana. La muestra obtenida del sujeto puede ser cualquier tejido o líquido adecuado, tal como sangre, plasma u orina. El sujeto puede ser un mamífero, normalmente un ser humano.
Por consiguiente, la invención proporciona el uso de un anticuerpo de la invención como un biomarcador de interacción con la diana para la detección de un complejo de compuesto y trímero que comprende el TNFa trimérico y un compuesto que es capaz de unirse al TNFa trimérico, de modo que el complejo de compuesto y trímero se une al receptor del TNFa y modula la señalización inducida por el trímero a través del receptor en una muestra obtenida de un sujeto. La modulación es adecuadamente el antagonismo de la señalización del TNFR1.
De manera similar, la presente invención proporciona un método para detectar la interacción con la diana de un compuesto con el TNFa trimérico, mediante el cual el complejo de compuesto y trímero se une al receptor del TNF y modula la señalización inducida por el trímero a través del receptor, comprendiendo dicho método:
(a) poner en contacto un anticuerpo de la invención con una muestra que se ha obtenido de un sujeto al que se le administró dicho compuesto y una muestra de control, en donde dicho anticuerpo es detectable;
(b) determinar la cantidad de unión de dicho anticuerpo detectable a dicha muestra y a dicha muestra de control,
en donde la unión de dicho anticuerpo detectable a dicha muestra mayor que la unión de dicho anticuerpo detectable a dicha muestra de control indica la interacción con la diana de dicho compuesto a dicho TNFa trimérico.
Los métodos para detectar anticuerpos y medir la cantidad de unión de un anticuerpo a una diana son bien conocidos en la materia. Normalmente, los anticuerpos se pueden marcar. Dichos marcadores incluyen enzimas, biotina/estreptavidina, proteínas fluorescentes y colorantes fluorescentes.
Se puede medir la unión de un anticuerpo a una diana, por ejemplo, mediante un método de inmunoensayo. Los inmunoensayos incluyen transferencia Western, ELISA, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica y citometría de flujo. Puede utilizarse cualquier técnica adecuada para medir la unión del anticuerpo al TNFa.
En el método descrito anteriormente, la unión del anticuerpo detectable a la muestra de un sujeto al que se le ha administrado el compuesto se compara con la unión del anticuerpo a una muestra de control. La muestra de control puede ser cualquier muestra adecuada. La muestra de control es normalmente un "control negativo" que es representativo de la unión del anticuerpo al TNFa trimérico en ausencia del compuesto. Por ejemplo, la muestra puede obtenerse del paciente antes de la administración del compuesto. El control también puede basarse en mediciones previamente determinadas, por ejemplo, a partir de varias muestras de diferentes sujetos en ausencia del compuesto. Pueden utilizarse mediciones de aproximadamente 5, 10, 20, 50 o 100 sujetos para determinar el valor de control. El control puede ser un valor medio o un intervalo de todos los valores obtenidos.
Las condiciones experimentales, por ejemplo, los métodos de detección, son las mismas para la muestra de un sujeto al que se administra el compuesto y para la muestra de control. El anticuerpo también es el mismo en ambos casos.
Una mayor unión (unión aumentada) del anticuerpo detectable a la muestra del paciente al que se le administró el compuesto en comparación con la unión del anticuerpo a la muestra de control es indicativa de la interacción con la diana del compuesto con el TNFa trimérico. En otras palabras, la unión equivalente o inferior (unión disminuida) para la muestra del paciente al que se le administró el compuesto en relación con el control indica que no hay una interacción con la diana de dicho compuesto. En otras palabras, ninguna diferencia significativa en las dos cantidades indica que no hay interacción con la diana.
El experto en la materia puede determinar fácilmente cuándo hay un aumento de la unión con respecto al control. Por ejemplo, cuando el control es un intervalo de datos, la interacción con la diana puede determinarse en función de la difusión de los datos, la diferencia entre los datos de control y la unión detectada del anticuerpo en la muestra en cuestión, y los niveles de confianza calculados. También es posible identificar la interacción con la diana cuando la unión detectada para la muestra en cuestión es mayor que la cantidad máxima de unión detectada en cualquier control negativo.
La interacción con la diana puede detectarse si la unión del anticuerpo aumenta en aproximadamente un 30 % o más en relación con la cantidad más elevada en el intervalo de control. La interacción con la diana también puede detectarse si la unión del anticuerpo aumenta en aproximadamente un 40 % o más, o aproximadamente un 50 % o más en relación con el intervalo de control. Lo mismo se aplica cuando el control es un valor promedio o un valor único basado en una muestra del paciente antes de la administración del compuesto. Por supuesto, no existe un límite superior para el aumento porcentual en relación con el control.
Puede utilizarse un anticuerpo de la invención para seleccionar un compuesto que provoque un cambio conformacional en el TNFa trimérico, en donde dicho cambio conformacional modula la señalización del receptor del TNFa preciso en la unión del TNFa trimérico. La modulación es de manera adecuada antagonismo de la señalización del TNFR1.
Ensayos de anticuerpos
Como se describe en el presente documento, la presente invención proporciona anticuerpos que se unen selectivamente a al menos un complejo de compuesto y trímero descrito en el presente documento con respecto a su unión al compuesto solo o al TNFa en ausencia del compuesto. Estos anticuerpos pueden utilizarse para identificar otros compuestos o clases de compuestos que tengan las mismas propiedades.
Pueden generarse anticuerpos monoclonales contra el TNFa utilizando las técnicas convencionales descritas en el presente documento. A continuación, estos anticuerpos anti-TNFa pueden cribarse para detectar anticuerpos que se unen a los complejos de compuesto-trímero, o anticuerpos monoclonales para los que la unión al TNFa se inhibe mediante los compuestos como se describen en el presente documento.
Alternativamente, se pueden generar anticuerpos monoclonales contra complejos particulares de trímero del TNFacompuesto. A continuación, estos anticuerpos pueden cribarse para detectar anticuerpos monoclonales que se unan selectivamente al TNFa en presencia del compuesto con respecto a su unión al TNFa en ausencia del compuesto.
Una vez que se ha generado un anticuerpo que se une selectivamente a al menos un complejo de compuesto y trímero con respecto a su unión al compuesto solo o al TNFa en ausencia del compuesto, se puede utilizar para seleccionar otros compuestos que posean la misma actividad que los compuestos de ensayo.
Por consiguiente, la invención proporciona un ensayo para identificar un compuesto que sea capaz de unirse a un trímero del TNFa y modular la señalización del trímero a través del receptor del TNF, que comprende las etapas de:
a) realizar un ensayo de unión para medir la afinidad de unión de un complejo de compuesto de ensayo-trímero que comprende un trímero del TNFa y un compuesto de ensayo a un anticuerpo de la invención que se une selectivamente a dicho complejo en comparación con la unión al compuesto en ausencia del trímero del TNFa y en comparación con la unión al trímero del TNFa en ausencia del compuesto;
b) comparar la afinidad de unión medida en la etapa (a) con la afinidad de unión de un complejo de compuesto y trímero diferente que se sabe que se une con afinidad elevada al anticuerpo al que se hace referencia en la etapa (a); y
c) seleccionar el compuesto presente en el complejo de compuesto y trímero de la etapa (a) si su afinidad de unión medida es aceptable cuando se considera a la luz de la comparación mencionada en la etapa (b).
Como se apreciará, el complejo de compuesto y trímero "diferente" mencionado en la etapa (b) anterior será en general un complejo que contiene el mismo trímero del TNFa que el complejo de compuesto y trímero de la etapa (a), pero un compuesto diferente. El compuesto puede ser cualquiera de los compuestos (l)-(7).
Por "aceptable" en la etapa (c) se entiende que la afinidad de unión del complejo de compuesto y trímero mencionado en la etapa (a) y la afinidad de unión del complejo de compuesto y trímero diferente mencionado en la etapa (b) son aproximadamente comparables. La unión selectiva de dicho anticuerpo a dicho complejo se mide normalmente en relación con la unión de dicho anticuerpo al TNFa en ausencia del compuesto o al compuesto en ausencia del TNFa.
La afinidad de unión del complejo de compuesto y trímero mencionado en la etapa (a) será en general superior a la afinidad de unión del complejo de compuesto y trímero diferente mencionado en la etapa (b). De manera adecuada, la diferencia en la afinidad de unión del complejo de compuesto y trímero mencionado en la etapa (a) con respecto a la afinidad de unión del complejo de compuesto y trímero diferente mencionado en la etapa (b) estará dentro de los límites de 10 veces, 20 veces, 5o veces, 100 veces, 200 veces o 500 veces.
Pueden ensayarse bibliotecas de compuestos usando los anticuerpos de la invención. Los compuestos de la biblioteca se pueden incubar con dicho anticuerpo en presencia y ausencia del TNFa. Un compuesto que forma parte de un complejo de compuesto y trímero que se une a un anticuerpo de la invención solo en presencia tanto del TNFa como del compuesto es un candidato probable para tener la misma actividad que los compuestos descritos en el presente documento. Los ensayos divulgados en el presente documento pueden utilizarse después para verificar si el compuesto de ensayo es un compuesto como se describe en el presente documento.
En el ensayo se pueden utilizar uno o más de los anticuerpos de la invención. En el ensayo de anticuerpos de la invención se puede utilizar un anticuerpo genérico que sea capaz de unirse a complejos de cualquier compuesto de la divulgación con un TNFa particular.
Puede utilizarse un grupo de múltiples anticuerpos de la presente invención que son específicos para diferentes complejos de compuesto y trímero en el ensayo de anticuerpos de la invención. El grupo de anticuerpos puede incluir al menos 5, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 30, al menos 40 o al menos 50 anticuerpos (por ejemplo, hasta 75 anticuerpos).
El ensayo de anticuerpos de la presente invención puede ser un ensayo de alto rendimiento que es capaz de seleccionar un gran número de compuestos de ensayo en un corto espacio de tiempo para identificar compuestos de la presente divulgación.
El TNFa y sus receptores pueden estar purificados o presentes en mezclas, tal como en células cultivadas, muestras de tejido, líquidos corporales o medio de cultivo. Pueden desarrollarse ensayos cualitativos o cuantitativos, siendo este último útil para determinar los parámetros de unión (constantes de afinidad y cinética) del compuesto de ensayo a formas triméricas del TNFa, y también de los parámetros de unión del complejo de compuesto y trímero al receptor del TNF preciso.
La muestra que comprende el TNFa y el compuesto puede comprender además un agente desestabilizador. Los agentes desestabilizadores, también conocidos como caótropos, incluyen concentraciones molares bajas (por ejemplo, 1 M) de urea, guanidina o acetonitrilo, concentraciones elevadas (por ejemplo, 6 M o más) de estos reactivos darán como resultado la disociación completa del trímero del TNFa y el despliegue de las subunidades monoméricas del TNFa constituyentes. El agente desestabilizador puede ser DMSO, normalmente a una concentración del 5 %, 10 % o superior.
Los compuestos de ensayo pueden tener cualquiera o todas las propiedades indicadas anteriormente.
Superfamilia del TNF y sus receptores
Existen 22 miembros de la superfamilia del TNF actualmente conocidos: TNFa (TNFSF1A), TNFp (TNFSF1B), CD40L (TNFSF5), BAFF (TNFSF13B/BlyS), APRIL (TNFSF13), OX40L (TNFSF4), RANKL (TNFSF11/TRANCE), TWEAK (TNFSF12), TRAIL (TNFSF10), TL1A (TNFSF15), LIGHT (TNFSF14), Linfotoxina, Linfotoxina p (TNFSF3), 4-1BBL (TNFSF9), CD27L (TNFSF7), CD30L (TNFSF8), EDA (Ectodisplasina), EDA-A1 (Ectodisplasina A1), EDA-A2 (Ectodisplasina A2), FASL (TNFSF6), NGF y GITRL (TNFSF18).
En la invención, el miembro de la superfamilia del TNF es el TNFa. El TNFa existe tanto en forma soluble (TNFas) como unida a la membrana (TNFam). Cuando se hace referencia a TNFa en el presente documento, esto abarca ambas formas TNFas y TNFam. El TNFa está normalmente en forma de TNFas. El TNFas puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 35 o SEQ ID NO: 36, o una variante de la misma (como se describe anteriormente).
Los ensayos de la invención pueden utilizarse para identificar moduladores del TNFa. De manera específica, los ensayos de la invención pueden utilizarse para identificar compuestos que se unen al TNFa, particularmente formas triméricas del TNFa, y que estabilizan estos trímeros en una conformación que es capaz de unirse al receptor del TNF preciso, y que modulan la señalización a través de dicho receptor. El TNFa puede ser el TNFas.
El compuesto descrito en el presente documento puede ser un modulador de al menos el TNFa. El TNFa es normalmente el TNFas.
El complejo de compuesto y trímero de la divulgación incluye la forma trimérica del TNFa. El TNFa es normalmente el TNFas.
Los miembros de la superfamilia del TNF se unen a los receptores del TNF e inician la señalización a través de ellos. Actualmente existen 34 receptores del TNF conocidos: 4-1BB (TNFRSF9/CD137), NGF R (TNFRSF16), BAFF R (TNFRSF13C), Osteoprotegerina (TNFRSF11B), BCMA (TNFRSF17), OX40 (TNFRSF4), CD27 (TNFRSF7), RANK (TNFRSF11A), CD30 (TNFRSF8), RELT (TNFRSF19L), CD40 (TNFRSF5), TACI (TNFRSF13B), DcR3 (TNFRSF6B), TNFRH3 (TNFRSF26), DcTRAIL R1 (TNFRSF23), DcTRAIL R2 (TNFRSF22), TNF-R1 (TNFRSF1A), TNF-R2 (TNFRSF1B), DR3 (TNFRSF25), TRAIL R1 (TNFRSF10A), DR6 (TNFRSF21), TRAIL R2 (TNFRSF10B), EDAR, TRAIL R3 (TNFRSF10C), Fas (TNFRSF6/CD95), TRAIL R4 (TNFRSF10D), GITR (TNFRSF18), TROY (TNFRSF19), HVEM (TNFRSF14), TWEAK R (TNFRSF12A), TRAMP (TNFRSF25), Linfotoxina p R (TNFRSF3) y XEDAR.
El receptor del TNF es de manera adecuada TNF-R1 (TNFR1) o TNF-R2 (TNFR2). Cuando se hace referencia al TNF-R en el presente documento, esto abarca tanto el TNF-R1 como el TNF-R2, incluyendo el dominio extracelular (ECD, del inglés "extracellular domain") del TNF-R1 y del TNF-R2. Los ensayos de la invención pueden utilizarse para identificar compuestos que modulan la señalización del TNFa a través de cualquier receptor del TNF preciso. Los ensayos de la invención pueden utilizarse para identificar compuestos que modulan la señalización del TNFa a través del TNF-R1 o TNF-R2. El miembro de la superfamilia del TNF puede ser el TNFa, y el receptor del TNF puede ser el TNF-R1. Específicamente, el miembro de la superfamilia del TNF puede ser TNFas y el receptor puede ser TNF es TNF-R1. Los métodos de la invención pueden utilizarse para identificar compuestos que actúan mediante la modulación específica de la señalización del TNFa a través del TNF-R1. En particular, los compuestos pueden actuar mediante la modulación de la señalización del TNFa a través del TNF-R1, pero no tienen ningún efecto sobre la señalización del TNFa a través del TNF-R2.
Indicaciones terapéuticas
El TNFa es el miembro arquetípico de la superfamilia del TNF. El TNFa es una citocina pleiotrópica que media en la regulación inmunitaria y las respuestas inflamatorias. También se sabe que, in vivo, el TNFa está implicado en las respuestas a infecciones bacterianas, parasitarias y víricas. En particular, se sabe que el TNFa tiene un papel en la artritis reumatoide (AR), enfermedades inflamatorias intestinales (incluyendo la enfermedad de Crohn), psoriasis, enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), dolor, epilepsia, osteoporosis, asma, septicemia, fiebre, lupus eritematoso sistémico (LES) y esclerosis múltiple (EM) y cáncer. También se sabe que el TNFa tiene un papel en la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), ictus isquémico, glomerulonefritis mediada por complejos inmunitarios, nefritis lúpica (NL), glomerulonefritis asociada a anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos (ANCA), enfermedad de cambio mínimo, nefropatía diabética (ND), lesión renal aguda (LRA), uropatía obstructiva, rechazo de aloinjerto de riñón, LRA inducida por cisplatino y uropatía obstructiva.
Se sabe que otros miembros de la superfamilia del TNF están implicados en enfermedades autoinmunitarias y deficiencias inmunitarias. En particular, se sabe que los miembros de la superfamilia del TNF están implicados en la AR, LES, cáncer, EM, asma, rinitis, osteoporosis y mieloma múltiple (MM). Se sabe que TL1A desempeña un papel en el rechazo de trasplantes de órganos.
Puede utilizarse un compuesto descrito en el presente documento para tratar, prevenir o mejorar cualquier afección que pueda tratarse, prevenirse o mejorarse mediante un modulador convencional de miembros de la superfamilia del TNF. El compuesto puede utilizarse solo o en combinación con un modulador convencional de miembros de la superfamilia del TNF. Cualquier afección que sea resultado, parcial o totalmente, de la señalización patógena a través de un receptor del TNF por un miembro de la superfamilia del TNF o de una deficiencia en la señalización a través de un receptor del TNF por un miembro de la superfamilia del TNF, en principio, puede tratarse, prevenirse o mejorarse. La señalización patógena a través de un receptor del TNF por un miembro de la superfamilia del TNF incluye una señalización aumentada a través de un receptor del TNF por encima y por debajo del nivel fisiológico normal de señalización, señalización a través de un receptor del TNF que se inicia normalmente, pero que no se detiene en respuesta a las señales fisiológicas normales, y señalización a través de un receptor del TNF que está dentro del intervalo fisiológico normal de magnitud, pero que se inicia por medios no fisiológicos. La divulgación se refiere al tratamiento, la prevención o la mejoría de afecciones mediadas o influidas por el TNFa.
En consecuencia, los compuestos que interactúan con el TNFa son beneficiosos para el tratamiento y/o la prevención de diversas dolencias humanas. Éstas incluyen trastornos autoinmunitarios e inflamatorios; trastornos neurológicos y neurodegenerativos; trastornos del dolor y nociceptivos; y trastornos cardiovasculares.
Los trastornos inflamatorios y autoinmunitarios incluyen trastornos autoinmunitarios sistémicos, trastornos endocrinos autoinmunitarios y trastornos autoinmunitarios específicos de órgano. Los trastornos autoinmunitarios sistémicos incluyen lupus eritematoso sistémico (LES), psoriasis, vasculitis, polimiositis, esclerodermia, esclerosis múltiple, espondilitis anquilosante, artritis reumatoide y síndrome de Sjogren. Los trastornos endocrinos autoinmunitarios incluyen tiroiditis. Algunos trastornos autoinmunitarios específicos de órgano incluyen enfermedad de Addison, anemia hemolítica o perniciosa, glomerulonefritis (incluyendo síndrome de Goodpasture), enfermedad de Graves, púrpura trombocitopénica idiopática, diabetes mellitus insulinodependiente, diabetes juvenil, uveítis, enfermedad inflamatoria intestinal (incluyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), pénfigo, dermatitis atópica, hepatitis autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria, neumonitis autoinmunitaria, carditis autoinmunitaria, miastenia grave, infertilidad espontánea, osteoporosis, asma y distrofia muscular (incluyendo la distrofia muscular de Duchenne).
Algunos trastornos neurológicos y neurodegenerativos incluyen enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, corea de Huntington, accidente cerebrovascular, esclerosis lateral amiotrófica, lesión de la médula espinal, traumatismo craneal, ataques y epilepsia.
Los trastornos cardiovasculares incluyen trombosis, hipertrofia cardíaca, hipertensión, contractilidad irregular del corazón (por ejemplo, durante la insuficiencia cardíaca) y trastornos sexuales (incluyendo disfunción eréctil y disfunción sexual femenina).
En particular, puede utilizarse un compuesto para tratar o prevenir trastornos inflamatorios, trastornos del SNC, trastornos inmunitarios y enfermedades autoinmunitarias, dolor, osteoporosis, fiebre y rechazo de trasplante de órganos. Puede utilizarse un compuesto para tratar o prevenir la artritis reumatoide, enfermedades inflamatorias intestinales (incluyendo la enfermedad de Crohn), psoriasis, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, epilepsia, asma, septicemia, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, asma, rinitis, cáncer y osteoporosis. Puede utilizarse un compuesto para tratar o prevenir la artritis reumatoide (AR), artritis inflamatoria no específica, enfermedad ósea erosiva, condritis, degeneración y/o destrucción de cartílago, artritis inflamatoria juvenil, enfermedad de Still (de aparición juvenil y/o adulta), artritis idiopática juvenil, artritis idiopática juvenil (tanto la forma oligoarticular como la poliarticular), enfermedades inflamatorias intestinales (incluyendo enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colitis indeterminada, reservoritis), psoriasis, artropatía psoriásica, espondilitis anquilosante, síndrome de Sjogren, enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Behget, enfermedad de Parkinson (EP), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), ictus isquémico, dolor, epilepsia, osteoporosis, osteopenia, anemia de la enfermedad crónica, caquexia, diabetes, dislipidemia, síndrome metabólico, asma, enfermedad obstructiva crónica de las vías respiratorias (o pulmonar), septicemia, fiebre, síndrome de dificultad respiratoria, lupus eritematoso sistémico (LES), esclerosis múltiple (EM), glomerulonefritis mediada por complejos inmunitarios, nefritis lúpica (NL), glomerulonefritis asociada a anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos (ANCA), enfermedad de cambio mínimo, nefropatía diabética (ND), lesión renal aguda (LRA), uropatía obstructiva, rechazo de aloinjerto de riñón, LRA inducida por cisplatino y uropatía obstructiva, enfermedades oculares (incluyendo la retinopatía diabética, edema macular diabético, retinopatía de prematuridad, degeneración macular senil, edema macular, retinopatía proliferativa y/o no proliferativa, vascularización corneal incluyendo la neovascularización, oclusión de la vena retiniana, diversas formas de uveítis y queratitis), tiroiditis, trastornos fibrosantes, incluyendo diversas formas de fibrosis hepática, diversas formas de fibrosis pulmonar, esclerosis sistémica, esclerodermia, cáncer y complicaciones asociadas al cáncer (incluyendo complicaciones esqueléticas, caquexia y anemia).
Como se ha analizado anteriormente, los anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar como biomarcadores de interacción con la diana para evaluar la eficacia del tratamiento con un compuesto o complejo como se describe en el presente documento. En una realización, una muestra tomada de un sujeto tratado con un compuesto o complejo descrito en el presente documento puede ponerse en contacto con un anticuerpo de la invención. A continuación, el anticuerpo puede utilizarse para determinar la cantidad de complejo de compuesto y TNFa presente dentro de la muestra. La cantidad de complejo determinada utilizando el anticuerpo puede estar relacionada con la eficacia del tratamiento. Por ejemplo, cuanto más complejo sea detectado por el anticuerpo de la invención, más eficaz será el tratamiento. La cantidad de complejo determinada utilizando el anticuerpo es directamente proporcional a la eficacia del tratamiento. Por ejemplo, duplicar la cantidad de complejo determinada utilizando el anticuerpo puede ser indicativo de duplicar la eficacia del tratamiento.
Puede utilizarse un anticuerpo de la invención para determinar la cantidad de complejo de compuesto y trímero utilizando cualquier técnica adecuada. Se conocen en la materia y se divulgan en el presente documento métodos de multimerización. Por ejemplo, pueden utilizarse ELISA y transferencia Western con un anticuerpo de la invención para determinar la cantidad de complejo de compuesto y trímero.
La cantidad de complejo de compuesto y trímero puede determinarse mediante la medición de la masa del complejo de compuesto y trímero, la concentración del complejo de compuesto y trímero, y la molaridad del complejo de compuesto y trímero. Esta cantidad se puede dar en unidades adecuadas. Por ejemplo, la concentración del complejo de compuesto y trímero puede expresarse en pg/ml, ng/ml o mg/ml. La masa del complejo de compuesto y trímero se puede dar en pg, ng o mg.
La cantidad de complejo de compuesto y trímero en una muestra de interés puede compararse con el nivel del complejo de compuesto y trímero en otra muestra, tal como una muestra de control, como se describe en el presente documento. En dicho método, puede evaluarse la cantidad real del complejo de compuesto y trímero en las muestras, tal como la masa, la cantidad molar, la concentración o la molaridad del complejo de compuesto y trímero. La cantidad de complejo de compuesto y trímero puede compararse con la de otra muestra sin cuantificar la masa, cantidad molar, concentración o molaridad del complejo de compuesto y trímero. Por lo tanto, la cantidad de complejo de compuesto y trímero en una muestra de acuerdo con la invención puede evaluarse como una cantidad relativa, tal como una masa relativa, cantidad molar relativa, concentración relativa o molaridad relativa del complejo de compuesto y trímero basándose en una comparación entre dos o más muestras.
Composiciones farmacéuticas, dosificaciones y pautas posológicas
Se puede proporcionar un anticuerpo de la invención en una composición farmacéutica. La composición farmacéutica será normalmente estéril y normalmente incluirá un portador y/o un adyuvante farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica de la presente invención puede comprender de manera adicional un adyuvante y/o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Como se utiliza en el presente documento, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares, que sean fisiológicamente compatibles. El vehículo puede ser adecuado para la administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraocular, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías de administración parenterales, por ejemplo, mediante inyección o infusión. Como alternativa, el vehículo puede ser adecuado para la administración no parental, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa. El vehículo puede ser adecuado para la administración oral. Dependiendo de la vía de administración, el modulador puede estar recubierto con un material para proteger el compuesto de la acción de los ácidos y otras condiciones naturales que puedan inactivar el compuesto.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que conserva la actividad biológica deseada del compuesto precursor y no confiere ningún efecto toxicológico no deseado. Los ejemplos de dichas sales incluyen sales de adición de ácidos y sales de adición de bases.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables comprenden vehículos o diluyentes acuosos. Los ejemplos de vehículos acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, agua tamponada y solución salina. Los ejemplos de otros vehículos incluyen etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición.
Normalmente, las composiciones terapéuticas deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una elevada concentración de fármaco.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender principios activos adicionales.
También dentro del alcance de la presente divulgación están los kits que comprenden anticuerpos, compuestos y/o complejos e instrucciones de uso. El kit puede contener además uno o más reactivos adicionales, tales como un agente terapéutico o profiláctico adicional como se ha indicado anteriormente.
Los compuestos identificados por los métodos de la invención se pueden administrar para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos.
En aplicaciones terapéuticas, los compuestos se administran a un sujeto que ya padece un trastorno o afección como se describe anteriormente, en una cantidad suficiente para curar, aliviar o detener parcialmente la afección o uno o más de sus síntomas. Dicho tratamiento terapéutico puede dar como resultado una disminución de la gravedad de los síntomas de la enfermedad o un aumento de la frecuencia o duración de los períodos sin síntomas. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una "cantidad terapéuticamente eficaz".
En aplicaciones profilácticas, se administran formulaciones a un sujeto en riesgo de padecer un trastorno o afección como se ha descrito anteriormente, en una cantidad suficiente para prevenir o reducir los efectos posteriores de la afección o uno o más de sus síntomas. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una "cantidad profilácticamente eficaz". Las cantidades eficaces para cada fin dependerán de la gravedad de la enfermedad o lesión, así como del peso y el estado general del sujeto.
Un sujeto para la administración puede ser un ser humano o animal no humano. La expresión "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc. La administración a seres humanos es normal.
Un compuesto o composición farmacéutica puede administrarse a través de una o más vías de administración utilizando uno o más de una diversidad de métodos conocidos en la materia. Como apreciará el experto en la materia, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Los ejemplos de vías de administración para compuestos o composiciones farmacéuticas incluyen vías de administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraocular, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías de administración parenterales, por ejemplo, mediante inyección o infusión. La expresión "administración parenteral" como se usa en el presente documento significa modos de administración diferentes de la administración enteral y tópica, generalmente por inyección. Como alternativa, el compuesto o la composición farmacéutica se puede administrar por vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa. El compuesto o composición farmacéutica puede ser para administración oral.
Una dosificación adecuada de un compuesto o composición farmacéutica puede determinarse por un médico experto. Los niveles de dosificación reales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variar de tal manera para obtener una cantidad del principio activo que sea eficaz para conseguir la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y un modo de administración particulares, sin que sea tóxico para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una diversidad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, la vía de administración, el momento de la administración, la tasa de excreción del compuesto en particular que se esté empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, la afección, el estado de salud general y la anamnesis previa del paciente que se está tratando y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.
Una dosis adecuada puede ser, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal, normalmente de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, del paciente que se ha de tratar. Por ejemplo, una dosificación adecuada puede ser de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por día, o de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal por día.
Pueden ajustarse las pautas posológicas para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse una única dosis, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. La forma farmacéutica unitaria, como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente individuales adecuadas como dosis unitarias para los sujetos que han de tratarse; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico necesario.
La administración puede ser en dosis únicas o múltiples. Pueden administrarse dosis múltiples a través de las mismas o diferentes vías y en el mismo o diferentes lugares. Como alternativa, las dosis pueden ser a través de una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia pueden variar dependiendo de la semivida del antagonista en el paciente y la duración del tratamiento deseado. Como se ha mencionado anteriormente, pueden administrarse de manera conjunta compuestos o composiciones farmacéuticas con uno o más agentes terapéuticos. Por ejemplo, el otro agente puede ser un agente analgésico, anestésico, inmunosupresor o antiinflamatorio.
La administración combinada de dos o más agentes puede conseguirse de varias maneras diferentes. Ambos pueden administrarse juntos en una sola composición, o pueden administrarse en composiciones separadas como parte de una terapia combinada. Por ejemplo, uno puede administrarse antes, después o simultáneamente con el otro.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Síntesis de compuestos
La síntesis del compuesto (1) se divulga en el documento WO 2013/186229 (Ejemplo 44).
La síntesis del compuesto (2) se divulga en el documento WO 2013/186229 (Ejemplo 89).
La síntesis del compuesto (3) se divulga en el documento WO 2014/009295 (Ejemplo 129).
La síntesis del compuesto (4) se divulga en el documento WO 2014/009295 (Ejemplo 173).
La síntesis del compuesto (5) se divulga en el documento WO 2014/009295 (Ejemplo 319).
La síntesis del compuesto (6) se divulga en el documento WO 2013/186229 (Ejemplo 490).
La síntesis del compuesto (7) se divulga en el documento WO 2013/186229 (Ejemplo 156).
Ejemplo 2 Derivación de anticuerpos
Después de la inmunización de 5 ratas Sprague Dawley con TNFa humano en un complejo con el compuesto de bencimidazol (1), se cultivaron linfocitos B inmunitarios en placas de 96 pocillos para inducir la expansión clonal y la secreción de anticuerpos (Tickle, S. et al., High throughput screening for high affinity antibodies Journal of Laboratory Automation 2009 14: 303-307). Los sobrenadantes del cultivo se seleccionaron para detectar anticuerpos IgG que se unían preferentemente a TNFa humano en un complejo con el compuesto (1) (en un exceso molar de 50 veces), en comparación con el apo TNFa humano, en un ensayo FMAT homogéneo basado en perlas. Se presentó TNFa humano (+/- compuesto (1)) en las superficies de las perlas (Bangs Beads recubiertas de superavidina, número de catálogo CP01N) mediante un sistema de captura que utiliza una proteína de fusión TNF-Receptor I-Fc humana (número de catálogo de R&D Systems 372-RI-050), unida con anti-Fc humano biotinilado (número de catálogo de Jackson 109­ 066-098).
Los anticuerpos que demostraron unión preferencial al complejo de TNFa y compuesto (1) se denominaron 'conformación selectiva' y se llevaron adelante para la clonación. Se utilizó el método Fluorescent Foci (Patente de EE. UU. 7993864/Europa EP1570267B1) para identificar y aislar linfocitos B específicos de antígeno de pocillos positivos, y se recogieron genes de región variable de anticuerpos específicos de células individuales mediante PCR de transcripción inversa (RT).
Las secuencias de aminoácidos de dos anticuerpos representativos, CA185_01974 y CA185_01979, que demostraron unión selectiva de conformación al compuesto TNFa tanto humano como de ratón se muestran a continuación: CA185_01974.0 (VR0001837)
Región variable de cadena ligera (LCVR) SEQ ID NO: 7 (CDR subrayadas)
DIOMTOSPASLPASPEEIVTITCOASODIGNWLSWYOOKPGKSPOLL1YGATSL
ADGVPSRFSASRSGTOYSLKISRLOVEDFGIFYCLOGOSTPYTFGAGTKLELK Región variable de cadena pesada (HCVR) SEQ ID NO: 8 (CDR subrayadas)
DVOLVESGGGLVOPGRSLKLSC A ASGFTFSAYYMAWVROAPTKGLEWVASI
NYDGANTFYRDSVKGRFTVSRDNARSSLYLOMDSLRSEDTATYYCTTEA
YGYNSNWFGYWGOGTLVTVSS
CA185_01979.0 (VR0001842)
Región variable de cadena ligera (LCVR) SEQ ID NO: 22 (CDR subrayadas)
DIOMTOSPASLSASLEEIVTITCOASODIGNWLSWYOOKPGKSPHLLIYGTTSL
ADGVPSRFSGSRSGTOYSLK1SGLOVADIGIYVCLOAYSTPFTFGSGTKLEIK
Región variable de cadena pesada (HCVR) SEQ ID NO: 23 (CDR subrayadas)
EVHLVESGPGLVKPSOSLSLTCSVTGYSITNSYWDWIRKFPGNKMEWMGYIN
YSGSTGYNPSLKSRISISRDTSNNOFFLOLNSITTEDTATYYCARGTYGYNAYH
FDYWGRGVMVTVSS
Ejemplo 3 - Posible epítopo de los anticuerpos derivados
Dada la capacidad de los anticuerpos procedentes de rata para unirse al TNFa tanto humano como de ratón en presencia de compuestos, el análisis detallado de las secuencias de aminoácidos de rata, de ratón y humanas, junto con las estructuras cristalinas de rayos X del TNFa, se llevó a cabo para ver si se podía determinar un epítopo probable. Rata UniProt P16599 (SEQ ID NO: 32)
10 20 30 40 50 60
MSTESMIRDV ELAEEALPKK MGGLQNSRRC LCLSLFSFLL VAGATTLFCL LNFGVIGPNK
70 80 90 100 110 120
EEKFPNGLPL ISSMAQTLTL RSSSQNSSDKPVAHWANHQ AEEQLEWLSQ RANALLANGM
130 140 150 160 170 180
DLKDNQLWP ADGLYLIYSQ VLFKGQGCPDYVLLTHTVSR FAISYQEKVS LLSAIKSPCP
190 200 210 220 230
KDTPEGAELK PWYEPMYLGG VFQLEKGDLLSAEVNLPKYL DITESGQVYF GVIAL
Ratón UniProt P06804 (SEQ ID NO: 33)
10 20 30 40 50 60
MSTESMIRDV ELAEEALPQK MGGFQNSRRC LCLSLFSFLL VAGATTLFCL LNFGVIGPQR
70 80 90 100 110 120
DEKFPNGLPL ISSMAQTLTL RSSSQNSSDK PVAHWANHQ VEEQLEWLSQ RANALLANGM
130 140 150 160 170 180
DLKDNQLWP ADGLYLVYSQ VLFKGQGCPD YVLLTHTVSR FAISYQEKVN LLSAVKSPCP
190 200 210 220 230
KDTPEGAELK PWYEPIYLGG VFQLEKGDQL SAEVNLPKYL DFAESGQVYF GVIAL
Humana UniProt P01375 (SEQ ID NO: 34)
10 20 30 40 50 60
MSTESMIRDV ELAEEALPKK TGGPQGSRRC LFLSLFSFLI VAGATTLFCL LHFGVIGPQR
70 80 90 100 110 120
EEFPRDLSLI SPLAQAVRSSSRTPSDKPVA HWANPQAEG QLQWLNRRAN ALLANGVELR
130 140 150 160 170 180
DNQLWPSEG LYLIYSQVLFKGQGCPSTHV LLTHTISRIA VSYQTKVNLL SAIKSPCQRE
190 200 210 220 230
TPEGAEAKPW YEPIYLGGVFQLEKGDRLSA EINRPDYLDF AESGQVYFGI IAL
A partir de las alineaciones y la comparación de las secuencias UniProt del TNFa de rata, de ratón y humanas, ejemplos en dónde la secuencia de aminoácidos de rata difiere de la humana y en dónde las secuencias humana y de ratón son idénticas en el producto escindido y maduro incluyen N168, 1194, F220 y A221 (restos y numeración de la secuencia humana).
Estos restos se destacan en la estructura cristalina del TNFa humano (1TNF) (Figura 1). Es posible que cualquiera de estos aminoácidos esté incluido en el epítopo dirigido por los anticuerpos CA185_01974 y CA185_01979.
Después de la clonación de las regiones variables del anticuerpo en los vectores IgG de ratón y Fab (sin bisagra) de ratón, se confirmó la naturaleza selectiva de conformación de la unión de los anticuerpos CA185_01974 y CA185_01979, utilizando una variedad de compuestos de ensayo unidos al TNFa, en HPLC, BIAcore, ELISA y ensayos basados en células.
En los siguientes ejemplos 9 y 10 se presenta un análisis más completo del epítopo de CA185_01979.
Ejemplo 4 - Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) para determinar las características de los anticuerpos La unión específica de los fragmentos Fab de ratón se demostró mediante la formación de un complejo entre CA185_01974 y el TNFa humano en complejo con el compuesto (1) utilizando cromatografía de exclusión por tamaño. Los resultados se muestran en la figura 2. Como se muestra en esta figura, con un exceso molar de 0,5x de Fab, el máximo predominante corresponde al Fab unido y el complejo de trímero y compuesto (aunque hay un pequeño máximo que muestra la presencia de algún complejo de trímero y compuesto no unido al Fab). A un exceso molar de 1,03 de Fab, existe un único máximo de peso molecular superior correspondiente al Fab unido al complejo de trímero y compuesto. A excesos molares de 1,5x y 2x de Fab, hay un máximo molecular inferior creciente correspondiente al Fab no unido.
Por lo tanto, se determinó que la estequiometría era 1 Fab: 1 trímero del TNFa, apareciendo un exceso de Fab a 1,5x y exceso molar 2x.
También se investigó la unión de CA185_01979 al TNFa humano en complejo con el compuesto (1) ando cromatografía de exclusión por tamaño. Los resultados se muestran en la figura 3. En cuanto a CA185_01974, se determinó que la estequiometría era 1 Fab: 1 trímero del TNFa, apareciendo un exceso de Fab a 1,5x y exceso molar 2x.
Ejemplo 5 - Ensayos BIAcore para determinar las características de los anticuerpos
La resonancia de plasmón superficial se realizó a 25 °C utilizando un BIAcore T200 (GE Healthcare). Se inmovilizó Fc antimurino (Jackson 115-006-071) en un chip sensor CM5 (GE Healthcare) mediante una química de acoplamiento de amina hasta un nivel de captura de ~6000 unidades de respuesta. Se utilizó el tampón HBS-EP (HEPES 10 mM a pH 7,4, NaCI 0,15 M, EDTA 3 mM, 0,05 % (v/v) de tensioactivo P20 - GE Healthcare) 1 % de DMSO como tampón de análisis. Se utilizó una inyección de 10 ml de cada IgG a 1 mg/ml para la captura mediante el Fc antimurino inmovilizado para crear la superficie de unión al TNFa. Se preincubó el TNFa humano o de ratón (interno) a 50 nM con compuesto 2 mM en Hb S-EP (DMSO al 1 %) durante 5 horas.
Se pasó una inyección de 3 minutos de TNFa humano o de ratón /- compuesto de ensayo sobre cada IgG capturada a un caudal de 30 ml/min. La superficie se regeneró a un caudal de 10 ml/min mediante una inyección de 60 s de HCl 40 mM 32 y 30 s de NaOH 5 mM. Las curvas de unión restadas del fondo con doble referencia se analizaron utilizando el programa informático T200 Evaluation (versión 1.0) siguiendo procedimientos convencionales. Los parámetros cinéticos se determinaron a partir del algoritmo de ajuste.
Los datos de unión cinética para el TNFa humano y de ratón en presencia y ausencia de compuestos de ensayo de dos series químicas se muestran en las tablas 1 y 2 a continuación.
Tabla 1 - Datos de BIAcore con TNFa humano
Figure imgf000031_0001
Tanto CA185_01974 como CA185_01979 demostraron una unión selectiva >2 log para el TNFa humano distorsionado por compuestos, con compuestos de ensayo representativos de dos series químicas.
Tabla 2 - Datos de BIAcore con TNFa de ratón
Figure imgf000031_0002
Tanto CA185_01974 como CA185_01979 demostraron una unión selectiva >1,5 y >2 log para el TNFa de ratón con distorsión del compuesto, con compuestos de ensayo representativos de dos series químicas.
Ejemplo 6 - ELISA para determinar las características de los anticuerpos
Se desarrolló un ELISA tipo sándwich para medir la concentración del TNFa unido a compuestos de la invención, utilizando el anticuerpo c A 185_01974.0 que detecta de manera específica la conformación del TNFa cuando está en complejo con estos compuestos. En resumen, se recubrió una placa de microtitulación con CA185_01974.0 para inmovilizar el TNFa en un complejo con un compuesto de ensayo. El TNFa se incubó hasta el día siguiente a 28 °C con un exceso molar de 50x del compuesto de ensayo. Después de esta incubación durante la noche, el TNFa se diluyó en serie en plasma humano puro sin TNFa endógeno, en presencia de bloqueadores de anticuerpos heterófilos y se añadieron a la placa recubierta. Se generaron curvas con un intervalo de concentración de 0,78 pg/ml a 50 pg/ml del TNFa. Se utilizó un anticuerpo anti-TNFa policlonal biotinilado para detectar el TNFa unido, con estreptavidina y peroxidasa y sustrato TMB para dar una señal colorimétrica. La sensibilidad del ensayo se incrementó con el uso de una amplificación de la señal de tiramida, utilizando el kit ELAST de Perkin Elmer, como una etapa adicional entre la estreptavidina y peroxidasa y el sustrato.
También se desarrolló un ELISA para medir el TNFa total (TNFa libre TNFa en complejo con un compuesto de ensayo) en paralelo. Para este ensayo, el anticuerpo de recubrimiento se reemplazó con un anticuerpo policlonal anti-TNFa comercial (Invitrogen AHC3812). El tiempo de incubación de la muestra también se incrementó a 3 horas. Todas las demás etapas fueron idénticas al ensayo específico de conformación. Esto permite calcular la cantidad del TNFa en complejo con un compuesto de ensayo como una proporción del TNFa total.
Los resultados del ELISA del TNFa total con los compuestos (3), (4) y (5) se muestran en la figura 4.
Los resultados del ELISA del TNFa específico de conformación con CA185_01974.0 y los compuestos (3), (4) y (5) se muestran en la figura 5. Apo TNFa no dio señal en este ensayo, lo que demuestra la naturaleza específica de la unión del anticuerpo CA185_01974 al TNFa unido al compuesto. El anticuerpo fue capaz de reconocer el TNFa unido por una variedad de compuestos de ensayo de diferentes series químicas.
Ejemplo 7 - Ensayos basados en células para determinar las características de los anticuerpos
Los anticuerpos recombinantes también se ensayaron para determinar su unión al TNFa distorsionado por compuestos en un ensayo de FACS utilizando células JumpIn de riñón embrionario humano (HEK), que sobreexpresan el TNF-RI después de la inducción con doxiciclina a 1 mg/ml durante 2,5 horas. Las células HEK se tripsinizaron y se incubaron durante 2 h en medio para permitir la recuperación de los niveles del TNFRI digeridos. Se preincubó el TNFa humano a 2 mg/ml con compuesto (1) 40 mM o d Ms O al 0,4 % durante 1 h a 37 °C. La mezcla de preincubación se añadió a las células durante 1 h en hielo (dilución 1:4, concentraciones finales: 0,5 mg/ml de TNFa humano / compuesto (1) -10 mM o DMSO al 0,1 %). Las células se lavaron, se fijaron (PFA al 1,5 %) y se tiñeron con 1 o 10 mg/ml de anticuerpo durante 1 h en hielo. (Anticuerpo secundario: anti-ratón-Alexa488), antes del análisis del TNFa unido al receptor.
Como se muestra en la figura 6, los gráficos del histograma de la FACS de la tinción con CA185_01974 y CA185_01979 a 1 y 10 mg/ml demuestran que los anticuerpos reconocen únicamente el TNFa que se ha preincubado con el compuesto (1). No hay tinción con el control DMSO.
Además, se demostró la unión específica de los fragmentos Fab de CA185_01974 y CA185-01979 con el TNFa unido a la membrana distorsionado por el compuesto. Una estirpe celular NS0 genomanipulada, que sobreexpresa el TNFa de membrana, debido a la inactivación del sitio de escisión TACE, se incubó con compuesto (1) de 0,001 a 10 mM o DMSO al 0,1 % durante 1 h a 37 °C. Las células se lavaron, se fijaron y se tiñeron con fragmentos Fab de anticuerpo a 0,01 o 0,1 mg/ml durante 1 hora en hielo. (El anticuerpo secundario fue Fab anti-ratón-DyeLight488 de Jackson ImmunoResearch).
Los gráficos del histograma FACS de la tinción con los fragmentos Fab de CA185_01974 (Figura 7) y CA185_01979 demuestran que los anticuerpos sólo reconocen el TNF que se ha preincubado con el compuesto (1). No hay tinción con los controles DMSO.
Ejemplo 8 - El anticuerpo CA185 01974 muestra una selectividad de 300 veces para el complejo de TNF humano y compuesto (4)
El compuesto (4) se incubó con TNF humano y de macaco cangrejero y se valoró sobre el anticuerpo de ratón de longitud completa CA185_01974 para determinar un valor de afinidad exacto. El experimento incluyó los siguientes controles: (i) TNF humano o de macaco cangrejero DMSO en 1974; (ii) TNF humano o de macaco cangrejero DMSO en ningún anticuerpo; y (iii) TNF humano o de macaco cangrejero compuesto (4) en ningún anticuerpo. Cada muestra y control se llevó a cabo por duplicado y se utilizaron cuatro concentraciones en cada repetición.
Como se muestra en las figuras 8 y 9, la unión de fondo del hTNF el compuesto (4) y el cTNF el compuesto (4) aumentó en 5 a 10 UR durante el transcurso del ensayo. Esto se observa en la mayor respuesta del h/cTNF compuesto (4) que se une al CA18501974 en el segundo duplicado. La unión de hTNF y cTNF en ausencia del compuesto (4) fue consistentemente muy baja.
La cinética de la IgG CA185_1974_P8 de ratón de longitud completa que se une al hTNF DMSO fue muy similar en este ensayo al análisis previo de concentración única. La afinidad del TNF de macaco cangrejero por la IgG de longitud completa de ratón CA185_1974_P8 es similar, sin embargo, la cinética difiere.
La tabla 3 muestra la cinética de cada analito que se une a CA185_1974_P8. La tabla 4 da los valores promedio y la diferencia de veces /- compuesto (4) de la cinética del TNF para CA185_1974_p8. La figura 8 proporciona los sensogramas de ambos duplicados de cTNF /compuesto (4). La figura 9 proporciona los sensogramas de ambos duplicados de hTNF /compuesto (4).
Tabla 3: Cinética de unión de hTNF cTNF /- com uesto 4 al anticuer o CA185 1974 P8
Figure imgf000033_0001
Tabla 4: Valores medios y diferencias de veces /- compuesto (4) de la cinética de hTNF y cTNF para
A1 1 4
Figure imgf000033_0002
Ejemplo 9 - Estructuras del complejo hTNFa-Fab1979
La forma soluble del TNFa murino (VC 2043, UniProt P01375) se expresó como una proteína de fusión en E. coli y tenía la secuencia final:
SVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVP
SEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETP
EGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
(SEQ ID NO: 35)
La "S" inicial de la SEQ ID NO: 35 es un artefacto de clonación y no forma parte de la secuencia natural del TNF. La numeración de los restos de la SEQ ID NO: 35 comienza, por tanto, por la V, es decir, V1, R2, S3 etc. La SEQ ID NO: 36 representa la SEQ ID NO: 35, pero sin este resto "S" inicial, es decir,
VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQ
LVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQ
RETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIA
L(SEQ ID NO: 36)
Las células se precultivaron a 37 °C en medios ricos, se indujeron con la adición de arabinosa al 0,1 %, y se permitió la expresión hasta el día siguiente a 25 °C en vector pEMB54. Este vector introduce una etiqueta aminoterminal escindible de His6Smt. Las células se lisaron y se purificaron mediante cromatografía de quelato Ni-NTA. La proteína de fusión se eluyó con tampón que contenía imidazol y se escindió mediante la adición de proteasa. La proteína final del TNFa escindida se purificó mediante una etapa de cromatografía de quelato de Ni sustractiva para retirar la etiqueta de fusión y se purificó adicionalmente mediante una cromatografía de exclusión por tamaño para retirar las impurezas restantes. El producto final del TNFa se concentró normalmente hasta 20,0 mg/ml y se ultracongeló en nitrógeno líquido.
Se añadió directamente TNFa humano purificado (38,6 ml, 20,4 mg/ml, VC 2043) al Fab1979 (61,4 ml, 24,4 mg/ml) en tampón HEPES 10 mM a pH 7,5, NaCI 150 mM. El complejo de TNFa y Fab1979 se cristalizó por difusión de vapor de gota sentada mezclando 0,5 ml de complejo con 0,5 ml de MME de PEG 5000 al 6,4 %, 5 % de tacsimato, HEPES 0,1 M, a pH 6,8 sobre 80 ml de la misma solución de cristalización. Se recogieron cristales para la recopilación de datos aproximadamente 2 semanas después de la preparación inicial. Los cristales se empaparon brevemente en etilenglicol y se vitrificaron directamente en nitrógeno líquido para la recopilación de datos.
Los datos de la difracción de rayos X se recopilaron en la fuente avanzada de fotones (APS) a una longitud de onda de 0,9785 A y se registraron con un detector CCD RAYONIX MX300. Los datos de difracción se redujeron con el paquete XDS (Kabsch, 2010). La estructura del complejo de TNFa y Fab1979 se resolvió mediante sustitución molecular utilizando Phaser con cuatro modelos de entrada: 1) Cadena A de la estructura del hTNFa-compuesto (7); 2) Restos 1-105 de la cadena ligera del Fab1974; 3) Restos 110-214 de la cadena ligera del Fab1974; y 4) Restos 1­ 120 de la cadena pesada del Fab1974. Los modelos fueron despojados de ligandos y aguas. La construcción manual iterativa del modelo utilizando Coot (Emsley y Cowtan, 2004) y Phenix (Afonine, P. et al., 2012) continuó hasta que R y Rlibre convergieron. La calidad del modelo se validó usando Coot y MolProbity (Chen et al., 2010). En la tabla 1 se indican las estadísticas finales de procesamiento y perfeccionamiento de datos.
Referencias:
Kabsch, W. 2010. XDS. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. Febrero; 66 (Pt2): 1125-32. PMID: 20124692.
Emsley, P. y Cowtan, K. 2004. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. Diciembre; 60 (Pt 12 Pt 1): 2126-32. PMID: 15572765.
Afonine, P. et al. 2012. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. Abril; 68 (Pt 4): 352-67. PMID: 22505256.
Chen, V. et al. 2010. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. Enero; 66 (Pt 1): 12-21. PMID: 20057044.
Tabla 1. Recopilación de datos y estadísticas de perfeccionamiento.
Recopilación de datos Conjunto de datos 1
Identificación del cristal 253498b02
Línea de haz APS 21-IDG
Fecha de recopilación 20 de marzo de 2014
Amplitud de oscilación (°) 1,0
Marcos 220
Exposición (s) 1
Distancia (mm) 220
Longitud de onda (A) 0,9786
(continuación)
Recopilación de datos Conjunto de datos 1
Procesamiento de datos (cubierta externa)
Grupo espacial C2
Celda elemental (A,°) a=127,63, ó=41,94, c=127,55; p = 108,35
Resolución (A) 50-2,05 (2,10-2,05)
l/a 17,9 (2,9)
Completitud (%) 99,6 (99,9)
Rfusión (%) 0,062 (0,555)
Reflexiones (únicas) 40,691 (2,999)
Multiplicidad 4,5 (4,5)
Estadísticas de perfeccionamiento
Rtrabajo/Rlibre global 18,3/23,1
Enlaces RMSD (A) 0,012
Ángulos RMSD (°) 1,147
Valores atípicos de
Ramachandran (%) 0,0
Ramachandran favorecido (%) 96,5
1,65; Percentil 100*
Puntuación de MolProbity
(N = 725, 2,05 A ± 0,25 A)
Revisión científica externa por: Tracy Arakaki
* El percentil 100 es el mejor entre las estructuras con una resolución comparable; el percentil 0 es el peor.
La figura 11 muestra la estructura del Fab1979 unido a un monómero de TNFa (los límites del cristal permiten dicha unión). Por razones de orientación y estéricas se determinó que el monómero era el equivalente a la subunidad A.
La figura 12 muestra la misma estructura que la figura 11, pero con un trímero simétrico (es decir, un trímero no distorsionado en ausencia de compuesto) modelado por ordenador. Con este trímero simétrico, la cadena A del trímero conserva la interacción con el fragmento Fab. Sin embargo, hay un enfrentamiento estérico entre el fragmento Fab y la cadena C del trímero.
La figura 13 también muestra la misma estructura que la figura 11, salvo que en este caso se ha modelado por ordenador un trímero no simétrico (es decir, un trímero con una conformación distorsionada). Esta estructura de trímero no simétrico se generó originalmente en presencia del compuesto (6). De nuevo, se conserva la interacción entre el Fab y la cadena A del trímero. Sin embargo, a diferencia del trímero simétrico, no hay enfrentamiento estérico entre el Fab y la cadena C.
Ejemplo 10 - Identificación de los restos de epítopo
Se utilizó el programa NCONT (parte del paquete de cristalografía CCP4) para identificar los restos entre el Fab 1979 y el monómero del TNF, dentro de una distancia de 4,0 A. Cualquier átomo del TNFa de un resto dentro de esa distancia fue identificado como un epítopo. Definir un epítopo como los átomos del antígeno que se encuentran a menos de 4 A de los átomos del anticuerpo es algo rutinario en la técnica (véase, por ejemplo, Andersen et al. (2006)), Protein Science, 15, 2258-2567).
Los resultados de este epítopo determinado experimentalmente se presentan en la figura 14. Los restos de la cadena A del TNFa identificados de este modo fueron T77, T79, Y87, T89, K90, V91, N92, L93, L94, S95, A96, I97, E135, I136 y R138. La numeración de los restos se basa en la SEQ ID NO: 36 (la secuencia del TNFa humano soluble que carece del artefacto de clonación "S").
Se identificaron los siguientes restos adicionales de la cadena A (que también pueden formar parte de un epítopo más amplio) dentro de una proximidad de 5 A: L75, S81, R82, 183, 197 y D140. De nuevo, la numeración de los restos se basa en la SEQ ID NO: 36.
Se superpuso una estructura del TNFa unido al compuesto (6) sobre la cadena A del TNFa (del complejo TNFa/Fab1979) utilizando el método LSQ del programa COOT. Esto permitió identificar los restos de la subunidad C del TNFa cercanos a los restos del Fab (figura 15). Éstos también fueron identificados como restos de epítopo. Los restos que se identificaron dentro de los 4 A de la cadena C fueron L63, P113, Y115, D143, F144, S147, Q149. Los restos que se identificaron dentro de los 5 A fueron P20, F64, K65.
Se superpuso una estructura del TNFa simétrico (sin compuesto unido) sobre la subunidad A del TNFa en el complejo Fabl979, simultáneamente con el TNFa unido al compuesto. Los restos que estaban en la superficie en la estructura unida al compuesto, pero que estaban enterrados (una capa de átomos de profundidad), se identificaron mediante inspección visual y se identificaron como no disponibles para la unión.
Los restos no visibles dentro del trímero no distorsionado (sin compuesto unido), y por tanto, inaccesibles para la unión, se identificaron como L94 en la cadena A y los restos P113 e Y l15 en la cadena C.
Conclusiones
Se ha demostrado que los anticuerpos CA185_01974 y CA185_01979 se unen específicamente a un estado del TNFa distorsionado por el compuesto, y serán biomarcadores de interacción con el objetivo útiles para los compuestos de la invención.
Se ha demostrado que los anticuerpos se unen a una conformación del TNFa, que está estabilizado de manera específica por compuestos de diferentes series químicas. Se prevé que estos anticuerpos se convertirán en patrones en la definición de estas, y están estrechamente relacionados, conformaciones biológicamente relevantes, del trímero del TNFa, que se estabilizan mediante una gama más amplia de series químicas que las que se describen en el presente documento. Según los datos mostrados, el trímero del TNFa humano podría considerarse estabilizado en la conformación definida y biológicamente relevante descrita si el anticuerpo CA18501974 o CA185_01979 se une con una Kd mejor que 1 nM en el formato de ensayo BIAcore descrito anteriormente.
Ejemplo 11 - Los compuestos y complejos de Ma et al. (2014) y Silvian et al. (2011) tienen unas características diferentes de los de la presente invención
Como se describe en la página 12458 de Ma et al. (2014) JBC 289:12457-12466, el C87 se descubrió a través de cribado virtual intentando encontrar moléculas que se ajustasen al espacio ocupado por un péptido de 7 aminoácidos del bucle2/dominio2 del TNFR1 en su interacción con la superficie externa de TNFp. El compuesto C87 de Ma et al. y el compuesto BIO8898 de Silvian et al. (2011) ACS Chemical Biology 6:636-647 fueron sometidos a ensayo por los presentes inventores.
Sumario de los hallazgos
Las observaciones de Biacore descritas en Ma et al. para C87 no pudieron repetirse.
No se observó ninguna evidencia de inhibición específica del TNF en las células.
Adicionalmente, no se observó que C87 se uniese mediante espectrometría de masas, que es sensible a afinidades milimolares.
Ensayos de cristalografía exhaustivos solo produjeron apo-TNF (TNF sin compuesto).
En el ensayo de polarización de fluorescencia (PF), C87 no mostró ninguna inhibición significativa por encima del nivel de interferencia del compuesto con la lectura fluorescente.
El termoflúor, que mide la estabilización de la temperatura de fusión térmica del TNFa, mostró una pequeña estabilización para C87.
En resumen, no se descubrió evidencia de que C87 se uniese en el centro del trímero. La abrumadora mayoría de los datos sugirió que no había interacción directa con TNFa. También se encontró que BIO8898 no se unía a TNFa. Células - Ensayo de gen indicador NFKB HEK inducido por TNF
Se preincubó C87 con TNFa durante 1 hora antes de la adición a células HEK-293 transfectadas de forma estable con SEAP con el control de NFkB. También se sometió a ensayo una contraselección adecuada con el fin de detectar la actividad no relacionada con el TNF (fuera de la diana). El ensayo se incubó durante la noche antes de que se midiera la inhibición en comparación con el bloqueo del 100 % mediante un compuesto de control. La concentración máxima de C87 fue de 10.000 nM, con una dilución de 3 veces en serie.
No se pudo detectar ningún efecto inhibidor que no pudiera atribuirse a la actividad fuera de la diana.
Biacore
Se inmovilizó TNF usando un enlazador avi-marcador y se hizo pasar C87 por encima del chip. En un experimento, se realizó una respuesta a la dosis de C87 desde la mayor concentración de 10 mM. No se observó ninguna unión.
En un segundo experimento, el caudal de C87 que pasaba sobre el chip se redujo. Se observó un pequeño desplazamiento, pero la unión global fue insignificante.
Es probable que la unión de C87 al TNF descrita en Ma et al sea superestequiométrica basándose en el valor de UR en el eje Y. A la densidad convencional del TNF en el chip este valor estaba en la región de treinta veces más alto de lo esperado para la unión simple 1:1.
En otro experimento, se sometió a ensayo BIO8898 frente a la forma soluble inmovilizada de CD40L y la forma soluble del TNFa mediante RPS en una máquina Biacore 4000. Se determinó una media geométrica de la CI50 de 17 mM para la unión frente a CD40L, mientras que no se detectó unión a una concentración de hasta 100 mM para el TNFa en este ensayo.
Espectrometría de masas
No hubo pruebas de que C87 se uniese al TNFa humano (20 mM) a una concentración de 400 mM. Una especie de menor peso molecular (~473 Da parece unirse a menos del 5 % de ocupación). C87 tiene un peso molecular de 503 Da. Tomando como base la ocupación a una concentración de 400 mM, se predice una afinidad de las especies de bajo peso molecular superior a 1 mM.
Cristalografía
En general, se hizo un gran esfuerzo para cristalizar C87 con TNFa, incluyendo las condiciones de ensayo que habitualmente funcionan con compuestos que se describen en la presente solicitud. Esto comprendió el establecimiento de un gran número de ensayos de cristalización a diferentes concentraciones de ligandos, diferentes concentraciones de proteínas y diferentes tiempos de remojo. Se observaron algunos cristales que, en el análisis, resultaron ser sal o TNF sin ningún compuesto.
Polarización fluorescente (PF)
Se preincubó C87 con TNFa durante 1 hora antes de someterlo a ensayo frente al compuesto fluorescente (sonda). La competencia con el compuesto fluorescente, ya sea directamente (uniéndose en el mismo sitio) o indirectamente (alterando el TNF) se detecta mediante una reducción en la PF.
La extrapolación de la curva de inhibición produjo una CI50 de aproximadamente 100 mM. Se observó inactivación de la fluorescencia, sin embargo, a las concentraciones más altas de inhibidor que, cuando se restaron, dieron como resultado una inhibición insignificante de C87 en este ensayo.
Termoflúor
El termoflúor mide el cambio de temperatura de fusión (Tf) del TNFa debido a que el compuesto estabiliza o altera la proteína. Se observó un efecto de estabilización de 3,8 °C a una concentración de C87 de 500 mM, lo que sugiere la posibilidad de una unión débil, que puede no ser específica.
Listado de secuencias
SEQ ID NO: 1 (LCDR1 de 1974)
QASQDIGN SEQ ID NO: 2 (LCDR2 de 1974)
GATSLAD SEQ ID NO: 3 (LCDR3 de 1974)
LQGQSTPYT SEQ ID NO: 4 (HCDR1 de 1974)
AYYMA SEQ ID NO: 5 (HCDR2 de 1974)
ASINYDGANTFYRDSVKG SEQ ID NO: 6 (HCDR3 de 1974)
EAYGYNSNWFGY
SEQ ID NO: 7 (LCVR de 1974)
DIQMTQSPASLPASPEEIVTITCQASQDIGNWLSWYQQKPGKSPQLLIYGATSLADGVPSRFSASRSGT QYSLKISRLQVEDFGIFYCLQGQSTPYTFGAGTKLELK
SEQ ID NO: 8 (HCVR de 1974)
DVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSAYYMAWVRQAPTKGLEWVASINYDGANTFYRDSVKGRFT VSRDNARSS LYLQMDS LRSEDTATYYCTTEAYGYNSNWFGYWGQGTLVTVS S
SEQ ID NO: 9 (ADN de LCVR de 1974)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTGCCTCCCTGCCTGCATCCCCGGAAGAAATTGTCACCATCACATGC CAGGCAAGCCAGGACATTGGTAATTGGTTATCATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAATCGCCTCAGCTC CTGATCTATGGTGCAACCAGCTTGGCAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGCCAGTAGATCTGGCACA CAGTACTCTCTTAAGATCAGCAGACTGCAGGTTGAAGATTTTGGAATCTTTTACTGTCTACAGGGTCAA AGTACTCCGTACACGTTTGGAGCTGGGACCAAGCTGGAACTGAAA
SEQ ID NO: 10 (ADN de HCVR de 1974)
GACGTGCAGCTGGTGGAATCTGGAGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAAGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCA GCCTCAGGATTCACTTTCAGTGCCTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAACGAAGGGTCTGGAG TGGGTCGCATCCATTAATTATGATGGTGCTAACACTTTCTATCGCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACT GTCTCCAGAGATAATGCAAGAAGCAGCCTATACCTACAAATGGACAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCC ACTTATTACTGTACAACAGAGGCTTACGGATATAACTCAAATTGGTTTGGTTACTGGGGCCAAGGCACT CTGGTCACTGTCTCGAGC
SEQ ID NO: 11 (LC k completa de 1974)
DIQMTQSPASLPASPEEIVTITCQASQDIGNWLSWYQQKPGKSPQLLIYGATSLADGVPSRFSASRSGT QYSLKISRLQVEDFGIFYCLQGQSTPYTFGAGTKLELKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASWCFLNN FYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVK
SFNRNEC
SEQ ID NO: 12 (HC de mlgG1 completa de 1974)
DVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSAYYMAWVRQAPTKGLEWVASINYDGANTFYRDSVKGRFT VSRDNARSSLYLQMDSLRSEDTATYYCTTEAYGYNSNWFGYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAA QTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAH PASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVWDISKDDPEVQFSWF VDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQ VYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSN WEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
SEQ ID NO: 13 (HC de mFab sin bisagra completa de 1974)
DVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSAYYMAWVRQAPTKGLEWVASINYDGANTFYRDSVKGRFT VSRDNARSSLYLQMDSLRSEDTATYYCTTEAYGYNSNWFGYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAA QTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAH PASSTKVDKKIVPRDC
SEQ ID NO: 14 (ADN de LC k completa de 1974)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTGCCTCCCTGCCTGCATCCCCGGAAGAAATTGTCACCATCACATGC CAGGCAAGCCAGGACATTGGTAATTGGTTATCATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAATCGCCTCAGCTC CTGATCTATGGTGCAACCAGCTTGGCAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGCCAGTAGATCTGGCACA CAGTACTCTCTTAAGATCAGCAGACTGCAGGTTGAAGATTTTGGAATCTTTTACTGTCTACAGGGTCAA AGTACTCCGTACACGTTTGGAGCTGGGACCAAGCTGGAACTGAAACGTACGGATGCTGCACCAACTGTA TCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAAC TTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAAC AGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGAC GAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAG AGCTTCAACAGGAATGAGTGT
SEQ ID NO: 15 (ADN de HC de mlgG1 completa de 1974)
GACGTGCAGCTGGTGGAATCTGGAGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAAGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCA GCCTCAGGATTCACTTTCAGTGCCTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAACGAAGGGTCTGGAG TGGGTCGCATCCATTAATTATGATGGTGCTAACACTTTCTATCGCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACT GTCTCCAGAGATAATGCAAGAAGCAGCCTATACCTACAAATGGACAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCC ACTTATTACTGTACAACAGAGGCTTACGGATATAACTCAAATTGGTTTGGTTACTGGGGCCAAGGCACT CTGGTCACTGTCTCGAGTGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCC CAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACC TGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACT CTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCAC CCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGT ACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTG ACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTT GTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGC TCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAAC AGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAG GTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACA GACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAAC ACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAAC TGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAG AGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAA
SEQ ID NO: 16 (ADN de HC de mFab sin bisagra completo de 1974)
GACGTGCAGCTGGTGGAATCTGGAGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAAGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCA GCCTCAGGATTCACTTTCAGTGCCTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAACGAAGGGTCTGGAG
TGGGTCGCATCCATTAATTATGATGGTGCTAACACTTTCTATCGCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACT GTCTCCAGAGATAATGCAAGAAGCAGCCTATACCTACAAATGGACAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCC ACTTATTACTGTACAACAGAGGCTTACGGATATAACTCAAATTGGTTTGGTTACTGGGGCCAAGGCACT CTGGTCACTGTCTCGAGTGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCC CAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACC TGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTGCAATCTGACCTCTACACT CTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCAC CCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGT
SEQ ID NO: 17 (LCDR2 de 1979)
GTTSLAD SEQ ID NO: 18 (LCDR3 de 1979)
LQAYSTPFTF SEQ ID NO: 19 (HCDR1 de 1979)
NSYWD SEQ ID NO: 20 (HCDR2 de 1979)
YINYSGSTGYNPSLKS SEQ ID NO: 21 (HCDR3 de 1979)
GTYGYNAYHFDY SEQ ID NO: 22 (LCVR de 1979)
SEQ ID NO: 23 (HCVR de 1979)
EVHLVESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITNSYWDWIRKFPGNKMEWMGYINYSGSTGYNPSLKSRISI SRDTSNNQFFLQLNSITTEDTATYYCARGTYGYNAYHFDYWGRGVMVTVSS
SEQ ID NO: 24 (ADN de LCVR de 1979)
GACATCCAAATGACACAGTCTCCTGCCTCCCTGTCTGCATCTCTGGAAGAAATTGTCACCATTACATGC CAGGCAAGCCAGGACATTGGTAATTGGTTATCATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTCACCTC CTGATCTATGGTACCACCAGCTTGGCAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTAGATCTGGTACA CAGTATTCTCTTAAGATCAGCGGACTACAGGTTGCAGATATTGGAATCTATGTCTGTCTACAGGCTTAT AGTACTCCATTCACGTTCGGCTCAGGGACAAAGCTGGAAATAAAA
SEQ ID NO: 25 (ADN de HCVR de 1979)
GAGGTGCACCTGGTGGAGTCTGGACCTGGCCTTGTGAAACCCTCACAGTCACTCTCCCTCACCTGTTCT GTCACTGGTTACTCCATCACTAATAGTTACTGGGACTGGATCCGGAAGTTCCCAGGAAATAAAATGGAG TGGATGGGATACATAAACTACAGTGGTAGCACTGGCTACAACCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCCATT AGTAGAGACACATCGAACAATCAGTTCTTCCTGCAGCTGAACTCTATAACTACTGAGGACACAGCCACA TATTACTGTGCACGAGGGACCTATGGGTATAACGCCTACCACTTTGATTACTGGGGCCGAGGAGTCATG GTCACAGTCTCGAGC
SEQ ID NO: 26 (LC k completa de 1979)
DIQMTQSPASLSASLEEIVTITCQASQDIGNWLSWYQQKPGKSPHLLIYGTTSLADGVPSRFSGSRSGT
QYSLKISGLQVADIGIYVCLQAYSTPFTFGSGTKLEIKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASWCFLNN FYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVK SFNRNEC
SEQ ID NO: 27 (HC de mlgG1 completa de 1979)
EVHLVESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITNSYWDWIRKFPGNKMEWMGYINYSGSTGYNPSLKSRISI SRDTSNNQFFLQLNSITTEDTATYYCARGTYGYNAYHFDYWGRGVMVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQ TNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHP ASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVWDISKDDPEVQFSWFV DDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQV YTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNW EAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
SEQ ID NO: 28 (HC de mFab sin bisagra completa de 1979)
EVHLVESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITNSYWDWIRKFPGNKMEWMGYINYSGSTGYNPSLKSRISI SRDTSNNQFFLQLNSITTEDTATYYCARGTYGYNAYHFDYWGRGVMVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQ TNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHP ASSTKVDKKIVPRDC
SEQ ID NO: 29 (LC k completa de 1979)
GACATCCAAATGACACAGTCTCCTGCCTCCCTGTCTGCATCTCTGGAAGAAATTGTCACCATTACATGC CAGGCAAGCCAGGACATTGGTAATTGGTTATCATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTCACCTC CTGATCTATGGTACCACCAGCTTGGCAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTAGATCTGGTACA CAGTATTCTCTTAAGATCAGCGGACTACAGGTTGCAGATATTGGAATCTATGTCTGTCTACAGGCTTAT AGTACTCCATTCACGTTCGGCTCAGGGACAAAGCTGGAAATAAAACGTACGGATGCTGCACCAACTGTA TCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAAC TTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAAC AGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGAC GAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAG AGCTTCAACAGGAATGAGTGT
SEQ ID NO: 30 (ADN de HC de mlgG1 completa de 1979)
GAGGTGCACCTGGTGGAGTCTGGACCTGGCCTTGTGAAACCCTCACAGTCACTCTCCCTCACCTGTTCT GTCACTGGTTACTCCATCACTAATAGTTACTGGGACTGGATCCGGAAGTTCCCAGGAAATAAAATGGAG TGGATGGGATACATAAACTACAGTGGTAGCACTGGCTACAACCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCCATT AGTAGAGACACATCGAACAATCAGTTCTTCCTGCAGCTGAACTCTATAACTACTGAGGACACAGCCACA TATTACTGTGCACGAGGGACCTATGGGTATAACGCCTACCACTTTGATTACTGGGGCCGAGGAGTCATG GTCACAGTCTCGAGTGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAA ACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGG AACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTG AGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCG GCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACA GTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACT CCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTA GATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCA GTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGT GCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTG TACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGAC TTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACT CAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGG GAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGC CTCTCCCACTCTCCTGGTAAA
SEQ ID NO: 31 (ADN de HC de mFab sin bisagra completo de 1979)
GAGGTGCACCTGGTGGAGTCTGGACCTGGCCTTGTGAAACCCTCACAGTCACTCTCCCTCACCTGTTCT GTCACTGGTTACTCCATCACTAATAGTTACTGGGACTGGATCCGGAAGTTCCCAGGAAATAAAATGGAG TGGATGGGATACATAAACTACAGTGGTAGCACTGGCTACAACCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCCATT AGTAGAGACACATCGAACAATCAGTTCTTCCTGCAGCTGAACTCTATAACTACTGAGGACACAGCCACA TATTACTGTGCACGAGGGACCTATGGGTATAACGCCTACCACTTTGATTACTGGGGCCGAGGAGTCATG GTCACAGTCTCGAGTGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAA ACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGG AACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTGCAATCTGACCTCTACACTCTG AGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCG GCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGT
SEQ ID NO: 32 - TNFa de rata
MSTESMIRDVELAEEALPKKMGGLQNSRRCLCLSLFSFLLVAGATTLFCLLNFGVIGPNKEEKFPNGLP LISSMAQTLTLRSSSQNSSDKPVAHWANHQAEEQLEWLSQRANALLANGMDLKDNQLWPADGLYLIY SQVLFKGQGCPDYVLLTHTVSRFAISYQEKVSLLSAIKSPCPKDTPEGAELKPWYEPMYLGGVFQLEKG DLLSAEVNLPKYLDITESGQVYFGVIAL
SEQ ID NO: 33 - TNFa de ratón

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo que se une a un epítopo del TNFa trimérico que comprende los restos:
(a) L94 y P113; o
(b) L94 e Y115;
en donde L94 está presente en la cadena A del trímero del TNFa, y P113 e Y115 están presentes en la cadena C del trímero del TNFa, y en donde la numeración del resto es de acuerdo con la SEQ ID NO: 36.
2. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, que se une a un epítopo que comprende los tres de L94, P113 e Y115, en donde L94 está presente en la cadena A del trímero de TNFa y P l l3 e Y115 están presentes en la cadena C del trímero de TNFa.
3. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que se une a un epítopo que comprende además:
(a) uno o más restos seleccionados entre los siguientes, restos que están presentes en la cadena A del trímero del TNFa: T77; T79; Y87; T89; K90; V91; N92; L93; S95; A96; 197; E135; I136; y R138; y/o
(b) uno o más restos seleccionados entre los siguientes, restos que están presentes en la cadena C del trímero del TNFa: L63; D143; F144; S147; y Q149; y/o
(c) uno o más restos seleccionados entre los siguientes, restos que están presentes en la cadena A del trímero del TNFa: L75; S81; R82; 183; 197; y D140; y/o
(d) uno o más restos seleccionados entre los siguientes, restos que están presentes en la cadena C del trímero del TNFa: P20; F64; y K65,
en donde la numeración del resto es de acuerdo con la SEQ ID NO: 36.
4. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que se une a un epítopo que comprende además los siguientes restos:
(a) T77, T79, Y87, T89, K90, V91, N92, L93, S95, A96, I97, E135, I136 y R138, restos que están presentes en la cadena A del trímero del TNFa;
(b) T77, T79, Y87, T89, K90, V91, N92, L93, S95, A96, I97, E135, I136, R138, L75, S81, R82, I83, 197 y D140, restos que están presentes en la cadena A del trímero del TNFa;
(c) L63, D143, F144, S147 y Q149, restos que están presentes en la cadena C del trímero del TNFa;
(d) L63, D143, F144, S147, Q149, P20, f64 y K65, restos que están presentes en la cadena C del trímero del TNFa;
(e) T77, T79, Y87, T89, K90, V91, N92, L93, S95, A96, I97, E135, I136 y R138, restos que están presentes en la cadena A del trímero del TNFa, y L63, D143, F144, S147 y Q149, restos que están presentes en la cadena C del trímero del TNFa; o
(f) T77, T79, Y87, T89, K90, V91, N92, L93, S95, A96, I97, E135, I136, R138, L75, S81, R82, I83, 197 y D140, restos que están presentes en la cadena A del trímero del TNFa, y L63, D143, F144, S147, Q149, P20, F64 y K65, restos que están presentes en la cadena C del trímero del TNFa,
en donde la numeración del resto es de acuerdo con la SEQ ID NO: 36.
5. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que:
(a) tiene una afinidad (Kü-ab) de 1 nM o menos, opcionalmente de 200 pM o menos; y/o
(b) es un anticuerpo humanizado; y/o
(c) es un Fab, Fab modificado, Fab', Fab' modificado, F(ab')2, Fv, un anticuerpo de dominio único o un scFv; y/o (d) se une a un complejo del TNFa trimérico y uno cualquiera de los compuestos (1)-(7):
Figure imgf000069_0001
Figure imgf000070_0001
opcionalmente, en donde el anticuerpo tiene una afinidad (KD-ab) de 1 nM o menos por el complejo de trímero y compuesto, opcionalmente de 200 pM o menos.
6. Un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un adyuvante y/o portador farmacéuticamente aceptable.
8. Uso de un anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 como un biomarcador de interacción con el objetivo para la detección de un complejo de compuesto y trímero en una muestra obtenida de un sujeto; en donde dicho anticuerpo es detectable y dicho complejo comprende el TNFa trimérico y un compuesto que es capaz de unirse al TNFa trimérico, por lo que el complejo de compuesto y trímero se une al receptor del TNF y modula la señalización inducida por el trímero a través del receptor.
9. Un método para detectar la interacción con la diana de un compuesto con el TNFa trimérico, mediante el cual el complejo de compuesto y trímero se une al receptor del TNF y modula la señalización inducida por el trímero a través del receptor, comprendiendo dicho método:
(a) poner en contacto un anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 con una muestra que se ha obtenido de un sujeto al que se le ha administrado dicho compuesto y una muestra de control, en donde dicho anticuerpo es detectable;
(b) determinar la cantidad de unión de dicho anticuerpo detectable a dicha muestra y a dicha muestra de control,
en donde la unión de dicho anticuerpo detectable a dicha muestra mayor que la unión de dicho anticuerpo detectable a dicha muestra de control indica la interacción con la diana de dicho compuesto a dicho TNFa trimérico.
10. Uso de un anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el cribado de un compuesto que induzca un cambio conformacional en un trímero del TNFa, en donde dicho cambio conformacional modula la señalización del receptor del TNF tras la unión del TNFa trimérico.
11. Un método para identificar un compuesto que es capaz de unirse a un trímero del TNFa y modular la señalización del trímero a través del receptor del TNF, que comprende las etapas de:
(a) realizar un ensayo de unión para medir la afinidad de unión de un complejo de compuesto de ensayo y trímero que comprende un trímero del TNFa y un compuesto de ensayo a un anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que se une selectivamente a dicho complejo en comparación con la unión al compuesto en ausencia del trímero del TNFa y en comparación con la unión al trímero del TNFa en ausencia del compuesto;
(b) comparar la afinidad de unión medida en la etapa (a) con la afinidad de unión de un complejo de compuesto y trímero diferente que se sabe que se une con alta afinidad al anticuerpo mencionado en la etapa (a); y
(c) seleccionar el compuesto presente en el complejo de compuesto y trímero de la etapa (a) si su afinidad de unión medida es aceptable cuando se considera a la luz de la comparación a la que se hace referencia en la etapa (b).
12. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde:
(a) el anticuerpo se une al complejo de trímero del TNFa y compuesto con una KD-ab que es al menos 100 veces inferior, opcionalmente, además, al menos 200 veces inferior, a la KD-ab para la unión al trímero del TNFa en ausencia del compuesto y/o para la unión al compuesto en ausencia del trímero del TNFa; y/o
(b) el compuesto de ensayo aumenta la estabilidad del trímero del TNFa en comparación con la estabilidad del trímero del TNFa en ausencia del compuesto, opcionalmente en donde:
(i) el aumento de la estabilidad da como resultado un aumento del punto medio de transición térmica (Tm) del trímero del TNFa de al menos 1 °C;
(ii) el aumento de la estabilidad da como resultado un aumento del punto medio de transición térmica (Tm) del trímero del TNFa de al menos 10 °C; o
(iii) el aumento de la Tm del trímero del TNFa está entre 10 °C y 20 °C; y/o
(c) el compuesto de ensayo aumenta la afinidad de unión del trímero del TNFa al receptor del TNF en comparación con la afinidad de unión del trímero del TNFa a su receptor en ausencia del compuesto, opcionalmente en donde:
(a) el compuesto de ensayo aumenta la afinidad de unión del trímero del TNFa al receptor del TNF aumentando la velocidad de activación (kon-r) y/o disminuyendo la velocidad de inactivación (koff-r) en comparación con los valores de kon-r y koff-r para la unión del trímero del TNFa a su receptor en ausencia del compuesto; y/o (ii) el compuesto de ensayo disminuye la KD-r del trímero del TNFa al receptor del TNF en comparación con la KD-r del trímero del TNFa a su receptor en ausencia del compuesto, en donde:
- el compuesto disminuye la KD-r del trímero del TNFa al receptor del TNF en al menos 10 veces en comparación con la KD-r del trímero del TNFa a su receptor en ausencia del compuesto;
- el valor de la KD-r del trímero del TNFa para la unión al receptor del TNF en presencia del compuesto es menor de 10 nM; o
- el compuesto disminuye la KD-r del trímero del TNFa al receptor del TNF en al menos 4 veces en comparación con la KD-r del trímero del TNFa a su receptor en ausencia del compuesto;
- el valor de la KD-r del trímero del TNFa para la unión al receptor del TNF en presencia del compuesto es menor de 600 pM, opcionalmente en donde el valor de la KD-r del trímero del TNFa para la unión al receptor del TNF en presencia del compuesto es menor de 200 pM,
opcionalmente, en donde el método es un ensayo de alto rendimiento.
13. Un método de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en donde:
(a) dicho compuesto de ensayo de tiene un valor de la CI50 de 500 nM o menos; y/o
(b) el compuesto de la etapa (b) se selecciona del grupo que consiste en los compuestos (1)-(7), o sales o solvatos de los mismos.
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