ES2836769T3 - Mecanismo de acción - Google Patents

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John Robert Porter
Alastair Lawson
Boris Kroeplien
Stephen Edward Rapecki
Timothy John Norman
David James Mcmillan
Graham John Warrellow
Daniel Christopher Brookings
Rikki Peter Alexander
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Abstract

Un método de identificación de un compuesto que es capaz de unirse a una proteína trimérica que es un miembro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF) y modular la señalización de la proteína trimérica a través del receptor de la superfamilia del TNF necesario, comprendiendo el método determinar el número promedio de receptores unidos por cada complejo trímero-compuesto y, de este modo, identificar si el compuesto es capaz de modular la señalización a través del receptor.

Description

DESCRIPCIÓN
Mecanismo de acción
Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos para identificar compuestos que modulan la señalización de trímeros de miembros de la superfamilia del TNF a través de receptores del TNF. En particular, la invención se refiere a la identificación de nuevos moduladores de molécula pequeña. La invención también se refiere a compuestos identificados mediante dichos métodos y a complejos de los compuestos y trímeros. Los compuestos y complejos pueden usarse terapéuticamente.
Antecedentes de la invención
La superfamilia del Factor de Necrosis Tumoral (TNF) es una familia de proteínas que comparten una función primaria de regulación de la supervivencia y la muerte celulares. Los miembros de la superfamilia del TNF comparten un motivo núcleo común, que consiste en dos láminas p antiparalelas con cadenas p antiparalelas, formando una estructura p de tipo "jelly roll" (brazo de gitano). Otra característica común compartida por los miembros de la superfamilia del TNF es la formación de complejos homo o heterotriméricos. Son estas formas triméricas de los miembros de la superfamilia del TNF las que se unen a receptores de la superfamilia del TNF específicos y los activan.
El TNFa es el miembro arquetípico de la superfamilia del TNF. Se ha implicado a la desregulación de la producción de TNFa en una serie de afecciones patológicas de gran importancia médica. Por ejemplo, se ha implicado al TNFa en la artritis reumatoide, enfermedades inflamatorias intestinales (incluyendo la enfermedad de Crohn), psoriasis, enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), dolor, epilepsia, osteoporosis, asma, lupus eritematoso sistémico (LES) y esclerosis múltiple (EM). También se ha implicado a otros miembros de la superfamilia del TNF en afecciones patológicas, incluyendo enfermedades autoinmunitarias.
Los antagonistas convencionales de los miembros de la superfamilia del TNF son macromoleculares y actúan inhibiendo la unión del miembro de la superfamilia del TNF a su receptor. Los ejemplos de antagonistas convencionales incluyen anticuerpos anti-TNFa, particularmente anticuerpos monoclonales, tales como infliximab (Remicade®), adalimumab (Humira®) y certolizumab pegol (Cimzia®), o proteínas de fusión de receptores del TNFa solubles, tales como etanercept (Enbrel®).
Silvian et al. (ACS Chemical biology 6.6 (2011); 636-647) se refiere a la inhibición por molécula pequeña de la unión al ligando de la citocina CD40 de la familia del TNF a través de un mecanismo de fractura de subunidades. He et al. (Science 310.5750 (2005); 1022-1025) se refiere a la inhibición por molécula pequeña del TNFa. Ganesan et al (Die Pharmazie-An International Journal o f Pharmaceutical Science 67.5 (2012); 374-379) se refiere a la evaluación computacional exploratoria de los posibles modos de unión de los inhibidores de molécula pequeña de la interacción coestimuladora CD40-CD154. Hoffman et al. (PLOS One 7.2 (2012); e31298) se refiere a un nuevo modo de unión a TNFa revelado por la proteína de unión artificial basada en la ubiquitina. Alzani et al. (Biochemistry 34.19 (1995): 6344­ 6350) se refiere al mecanismo de desoligomerización inducida por suramina del factor de necrosis tumoral a. El documento WO 2014/009295 se refiere a derivados de imidazopiridina como moduladores de la actividad del TNF.
Sumario de la invención
Cuando los receptores están presentes en una concentración equivalente o en exceso en comparación con los monómeros de TNF (es decir, en una relación molar (concentración) de al menos 1:1 (receptores:monómeros); al menos 3:1 (receptores:trímeros)), un trímero de TNF normalmente se une a tres receptores. Los presentes inventores han identificado entidades de molécula pequeña (SME, por sus siglas en inglés) que modulan la señalización del TNF. Estos compuestos SME actúan mediante la unión a la forma trimérica del TNF e induciendo y/o estabilizando un cambio conformacional en el trímero. Los trímeros con los compuestos unidos tienen una afinidad alterada por los receptores necesarios, especialmente una afinidad reducida para los receptores segundo y tercero, lo que disminuye el número de receptores que se unen por cada complejo trímero-compuesto. En consecuencia, la señalización corriente abajo a través de los receptores se reduce. Por tanto, estos compuestos pueden usarse en el tratamiento de afecciones mediadas por TNF. Los presentes inventores también han desarrollado métodos que pueden identificar compuestos que son capaces de modular la señalización del TNF de esta manera.
La presente invención, por tanto, proporciona un método de identificación de un compuesto que es capaz de unirse a una proteína trimérica que es un miembro de la superfamilia del TNF y modular la señalización de la proteína trimérica a través del receptor de la superfamilia del TNF necesario, comprendiendo el método determinar el número promedio de receptores unidos por cada complejo trímero-compuesto y, de este modo, identificar si el compuesto es capaz de modular la señalización a través del receptor.
La invención también proporciona:
- un compuesto de fórmula (5), o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptables del mismo;
- un complejo que comprende una proteína trimérica que es un miembro de la superfamilia del TNF y un compuesto como se ha definido anteriormente;
- un compuesto o complejo como se ha definido anteriormente para su uso en un método de terapia del cuerpo humano o animal; y
- una composición farmacéutica que comprende el compuesto o complejo definido anteriormente y un vehículo farmacéutico aceptable.
Breve descripción de las figuras
En la Figura 1 se muestran las interacciones implicadas en la señalización de TNFa/TNF-R1 en ausencia de compuesto. Los trímeros de TNFa se unen a los dos primeros receptores con una Kd de 93 pM, y se unen al tercer receptor con una Kd de aproximadamente 1 pM. Estos complejos de trímero y receptores (con tres receptores unidos) forman entonces estructuras de balsa a través de la dimerización de los receptores, que dan como resultado la señalización corriente abajo.
La Figura 2 muestra una estructura cristalina con solo dos dímeros receptores que interactúan con un trímero de TNFa estabilizado por compuesto.
La Figura 3 muestra los efectos de dos tipos de compuestos (A y B) sobre la señalización de TNFa/TNF-R1. Ambos compuestos no tienen ningún efecto sobre la formación de los dímeros de receptores, sino que inducen y/o estabilizan la formación de trímeros con conformaciones distorsionadas. Los trímeros con el primer tipo de compuesto (A) se unen al primer y al segundo receptor, pero tienen una afinidad reducida por el tercer receptor. En consecuencia, se forman trímeros con solo dos receptores unidos. Los trímeros con el segundo compuesto (B) se unen al primer receptor, pero tienen una afinidad reducida por el segundo y el tercer receptor. Por tanto, los trímeros se forman con un solo receptor unido. La disminución del número de receptores que se unen por cada trímero interfiere con la formación de la balsa.
La Figura 4 muestra estructuras de compuestos que son capaces de modular la señalización de los trímeros de miembros de la superfamilia del TNF a través de receptores del TNF. La Figura 4A muestra la estructura de un compuesto de fórmula (1), La Figura 4B muestra la estructura de un compuesto de fórmula (2), La Figura 4C muestra la estructura de un compuesto de fórmula (3), La Figura 4D muestra la estructura de un compuesto de fórmula (4) y la Figura 4E muestra la estructura de un compuesto de fórmula (5).
La Figura 5 muestra resultados de experimentos de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, por sus siglas en inglés) usando compuesto (2), TNFa y TNFR1 (en un exceso de 3,2 veces con respecto al complejo trímerocompuesto). A bajas concentraciones del compuesto (90 pM) el pico predominante corresponde a la unión de tres receptores por cada complejo trímero-compuesto. Este pico tiene un ligero hombro, lo que indica que algunos complejos trímero-compuesto se unen a dos receptores. Cuando la concentración del compuesto aumenta y está presente en exceso (690 pM) con respecto a la concentración de los trímeros de TNF, el pico predominante corresponde a la unión de dos receptores por cada complejo trímero-compuesto. El ligero hombro en el pico indica que algunos trímeros todavía se unen a los tres receptores. En la figura, también se presentan resultados para controles que comprenden TNFa solamente, y TNFa y TNFR1 (controles negativos en ausencia de compuesto). En los controles negativos de TNFa y TNFR1, se unen tres receptores por cada complejo trímero-compuesto. Esto se consigue preincubando un exceso de 3,2 de TNFR1 sobre el trímero de TNFa. En la Figura 6 se presentan más datos.
La Figura 6 muestra el control para los experimentos de SEC que se describen en la Figura 5. Se incubó TNFa con concentraciones variables de TNFR1 (que varían en un exceso de 1,2-5 veces de receptores:trímeros). A medida que se añade una concentración creciente de TNFR1, el peso molecular del complejo con TNFa aumenta (se desplaza hacia la izquierda). La adición de un exceso de 5 veces de TNFR1 por encima de la concentración de trímeros de TNFa no aumenta el peso molecular del complejo por encima de cuando se usa un exceso de 3,2 veces. Esto sugiere que el TNFa está saturado en una relación molar de 3 TNFR1 a 3 monómeros de TNFa (3 TNFR1 por cada trímero).
La Figura 7 muestra los resultados de experimentos de SEC usando compuesto (5), TNFa y TNFR1 (en un exceso de 3,5 veces con respecto a la concentración del complejo trímero-compuesto). También se presentan resultados para los controles, el primero de los cuales es TNFa y receptores en ausencia de compuesto. Los controles segundo y tercero siguen siendo TNFa y receptores en ausencia de compuesto, pero el TNFa está mutado para interrumpir las interacciones en los sitios de unión a receptor tercero, tercero y segundo. El control que es TNFa y los receptores muestra un pico que indica la unión de tres receptores por cada trímero. El control con una mutación en un sitio de unión a receptor muestra un pico correspondiente a la unión de dos receptores por cada trímero, y el control con mutaciones en dos sitios muestra un pico correspondiente a la unión de un receptor por cada trímero. El pico obtenido en presencia del compuesto (5) está a mitad de camino entre los controles segundo y tercero y, por tanto, indica la unión de trímeros a una mezcla de dos receptores y un receptor, respectivamente.
Las Figuras 8A-8D muestran los resultados de experimentos de cristalografía, que revelan la unión de dos receptores por cada complejo trímero-compuesto en presencia de compuesto (1). Las partes (A)-(D) son vistas alternativas de la misma estructura cristalina.
La Figura 9 muestra los resultados de experimentos de TERF con concentraciones crecientes de compuesto (3). La inhibición completa, como se observaría con un anticuerpo bloqueante, daría como resultado la unión de ningún receptor a TNFa, es decir, la inhibición completa de una señal de TERF. En este caso, la señal de TERF está parcialmente inhibida. A las concentraciones más altas del compuesto, la inhibición máxima es del 29 %, lo que sugiere que uno de los tres receptores está inhibido para la unión al trímero de TNF.
La Figura 10 muestra los resultados de experimentos de TERF con concentraciones crecientes de compuesto (4). De nuevo, la señal de TERF está parcialmente inhibida. A las concentraciones más altas del compuesto, la inhibición máxima es del 36 %. Similar a la observación descrita en la Figura 9, esto sugiere que uno de los tres receptores está inhibido para la unión al trímero de TNF.
La Figura 11 muestra un análisis de estequiometría de unión a receptor mediante espectrometría de masas de movilidad iónica. En el control (que comprende TNFa y un exceso de TNFR1), se muestra que se unen tres receptores en promedio por cada complejo trímero-compuesto. Por el contrario, en presencia de compuesto (3) la estequiometría del receptor se reduce y predominantemente se unen dos receptores por cada complejo trímerocompuesto.
La Figura 12 muestra la determinación de constantes de disociación en una muestra de control con TNFa y TNFR1. A medida que se añaden concentraciones crecientes de TNFR1 a TNFa aparecen y después desaparecen diferentes especies de masa, que corresponden a la aparición en primer lugar de 1 TNFR1 unido a TNFa, seguido de 2 TNFR1 unidos a TNFa y por último 3 TNFR1 unidos a TNFa.
La Figura 13 muestra la determinación de constantes de disociación en una muestra con TNFa, TNFR1 y compuesto (3). Esto muestra una interacción significativamente peor (menor afinidad) del TNFR1 con TNFa del tercer receptor (de 0,22 nM a 9,612 nM).
Descripción del listado de secuencias
Las SEQ ID NO: 1 y 2 muestran las secuencias utilizadas en los Ejemplos.
La SEQ ID NO: 3 muestra la HCVR de C185_01974.0.
La SEQ ID NO: 4 muestra la LCVR de C185_01974.0.
La SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada mIgG1 de C185_01974.0.
La SEQ ID NO: 6 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera kappa de C185_01974.0.
La SEQ ID NO: 7 muestra la HCVR de C185_01979.0.
La SEQ ID NO: 8 muestra la LCVR de C185_01979.0.
La SEQ ID NO: 9 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada mIgG1 de C185_01979.0.
La SEQ ID NO: 10 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera kappa de C185_01979.0.
Descripción detallada de la invención
Debe entenderse que las diferentes aplicaciones de los métodos y productos que se desvelan pueden adaptarse a las necesidades específicas de la técnica. Además, como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", "el" y "la" incluyen las referencias en plural a menos que el contenido indique claramente lo contrario.
Métodos para identificar moduladores de miembros de la superfamilia del TNF
La presente invención se refiere a métodos de (ensayos de) identificación de compuestos que son capaces de unirse a una proteína trimérica que es un miembro de la superfamilia del TNF y modular la señalización de la proteína trimérica a través del receptor de la superfamilia del TNF necesario. Por tanto, los compuestos identificados mediante los métodos de la invención se conocen también como moduladores.
Como se describe adicionalmente a continuación, los compuestos identificados mediante los métodos de la invención generalmente impiden o disminuyen (inhiben) la señalización del TNF a través de los receptores necesarios. Dichos compuestos son antagonistas de la señalización del TNF. Sin embargo, los métodos de la invención también pueden usarse para identificar compuestos agonistas, que aumentan (potencian) la señalización del TNF a través de los receptores necesarios. En ambos casos, los compuestos son capaces de modular la señalización del TNF sin tener que competir con la interacción de alta afinidad entre el miembro de la superfamilia del TNF y su receptor.
Los compuestos identificados mediante los métodos de la invención se unen a las formas triméricas de los miembros de la superfamilia del TNF. Por tanto, los compuestos son moduladores alostéricos que se unen a los agonistas naturales de los receptores de la superfamilia del TNF, es decir, a formas triméricas de miembros de la superfamilia del TNF. Se analizan adicionalmente a continuación métodos de cribado para compuestos que son capaces de unirse a trímeros de TNF.
Existen 22 miembros de la superfamilia del TNF actualmente conocidos, que son TNFa (TNFSF1A), TNFp (TNFSF1B), CD40L (TNFSF5), BAFF (TNFSF13B/BlyS), APRIL (TNFSF13), OX40L (TNFSF4), RANKL (TNFSF11/TRANCE), TWEAK (TNFSF12), TRAIL (TNFSF10), TL1A (TNFSF15), LIGHT (TNFSF14), Linfotoxina, Linfotoxina p (TNFSF3), 4-1BBL (TNFSF9), CD27L (TNFSF7), CD30L (TNFSF8), EDA (Ectodisplasina), EDA-A1 (Ectodisplasina A1), EDA-A2 (Ectodisplasina A2), FASL (TNFSF6), NGF y GITRL (TNFSF18).
Los métodos de la invención pueden usarse para identificar compuestos que modulan la señalización de cualquier miembro de la superfamilia del TNF, incluyendo los 22 miembros conocidos de la superfamilia del TNF. Los compuestos identificados usando los métodos de la invención pueden unirse específicamente a las formas triméricas de uno o más miembros de la superfamilia del TNF. Los compuestos identificados mediante los métodos de la invención pueden unirse específicamente a solo uno de los miembros de la superfamilia del TNF, pero no a ningún otro miembro de la superfamilia del TNF. Los compuestos identificados mediante los métodos de la invención también pueden unirse específicamente a dos, tres, cuatro o hasta todos los miembros de la superfamilia del TNF.
Por "específico", se entenderá que los compuestos se unen a la molécula o moléculas de interés, en este caso la forma trimérica del miembro de la superfamilia del TNF, sin ninguna reactividad cruzada significativa con ninguna otra molécula, que puede incluir otros miembros de la superfamilia del TNF. La reactividad cruzada puede evaluarse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, la resonancia de plasmón superficial. La reactividad cruzada de un compuesto para la forma trimérica de un miembro de la superfamilia del TNF con una molécula distinta de la forma trimérica de ese miembro particular de la superfamilia del TNF puede considerarse significativa si el compuesto se une a la otra molécula al menos un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 100 % tan fuertemente como se une a la forma trimérica del miembro de la superfamilia del TNF de interés. Un compuesto que es específico para la forma trimérica de un miembro de la superfamilia del TNF puede unirse a otra molécula a menos del 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 % o 20 % de la fuerza con la que se une a la forma trimérica del miembro de la superfamilia del TNF. Preferentemente, el compuesto se une a la otra molécula a menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 % o menos del 5 %, menos del 2 % o menos del 1 % de la fuerza con la que se une a la forma trimérica del miembro de la superfamilia del TNF.
Preferentemente, el miembro de la superfamilia del TNF es TNFa. El TNFa existe tanto en forma soluble (TNFas) como en forma unida a membrana (TNFam). Cuando se hace referencia a TNFa en el presente documento, esto abarca ambas formas TNFas y TNFam. Particular y preferentemente, El TNFa está en la forma TNFas.
Actualmente existen 34 receptores del TNF conocidos, que son 4-1BB (TNFRSF9/CD137), NGF R (TNFRSF16), BAFF R (TNFRSF13C), Osteoprotegerina (TNFRSF11B), BCMA (TNFRSF17), OX40 (TNFRSF4), CD27 (TNFRSF7), RANK (TNFRSF11A), CD30 (TNFRSF8), RELT (TNFRSF19L), CD40 (TNFRSF5), TACI (TNFRSF13B), DcR3 (TNFRSF6B), TNFRH3 (TNFRSF26), DcTRAIL R1 (TNFRSF23), DcTRAIL R2 (TNFRSF22), TNF-R1 (TNFRSF1A), TNF-R2 (TNFRSF1B), DR3 (TNFRSF25), TRAIL R1 (TNFRSF10A), DR6 (TNFRSF21), TRAIL R2 (TNFRSF10B), EDAR, TRAIL R3 (TNFRSF10C), Fas (TNFRSF6/CD95), TRAIL R4 (TNFRSF10D), GITR (TNFRSF18), TROY (TNFRSF19), HVEM (TNFRSF14), TWEAK R (TNFRSF12A), TRAMP (TNFRSF25), Linfotoxina p R (TNFRSF3) y XEDAR.
Un receptor necesario es un receptor que actúa en conjunto con un miembro particular de la superfamilia del TNF. En particular, un receptor necesario es un receptor que es activado por un miembro de la superfamilia del TNF. Los trímeros de miembros de la superfamilia del TNF se unen al receptor y la activación del receptor da como resultado una señalización corriente abajo. Se conocen en la técnica combinaciones de miembros de la superfamilia del TNF y sus receptores necesarios.
Preferentemente, los métodos de la invención se usan para identificar compuestos que modulan la señalización a través de TNF-R1 (TNFR1) y TNF-R2 (TNFR2). Cuando se hace referencia al TNF-R en el presente documento, esto abarca tanto el TNF-R1 como el TNF-R2, incluyendo el dominio extracelular (ECD) de t Nf -R1 y de TNF-R2. Más preferentemente, el miembro de la superfamilia del TNF es TNFa y el receptor del TNF es TNF-R1 o TNF-R2. Aún más preferentemente, el miembro de la superfamilia del TNF es TNFa y el receptor del TNF es TNF-R1. Mucho más preferentemente, el miembro de la superfamilia del TNF es TNFas y el receptor del TNF es TNF-R1.
Los métodos de la invención pueden usarse para identificar compuestos que actúan modulando específicamente la señalización de miembros de la superfamilia del TNF a través del TNF-R1. En particular, los compuestos pueden actuar modulando la señalización de los miembros de la superfamilia del TNF a través del TNF-R1, pero no tienen efecto sobre la señalización de miembros de la superfamilia del TNF a través del TNF-R2.
Los miembros de la superfamilia del TNF y sus receptores pueden estar purificados o presentes en mezclas, tal como en células cultivadas, muestras de tejido, fluidos corporales o medio de cultivo.
En los métodos de la invención, se identifican compuestos que modulan la señalización de la proteína trimérica a través de los receptores necesarios. La modulación de la señalización puede referirse a un aumento (potenciación) de la señalización a través de los receptores necesarios. Los compuestos que aumentan la señalización son compuestos agonistas. Sin embargo, los compuestos identificados usando los métodos de la invención generalmente impiden o disminuyen (inhiben) la señalización a través de los receptores necesarios. Estos compuestos se conocen como antagonistas.
Para detectar el nivel de señalización, pueden realizarse ensayos que midan los efectos corriente abajo de la señalización de receptores de la superfamilia del TNF. Por ejemplo, puede usarse un ensayo de destrucción de células de fibrosarcoma murino L929 para evaluar la estimulación de la muerte celular por TNF. También puede usarse la inhibición mediante monocitos humanos de la producción de IL-8 inducida por t Nf para evaluar si un compuesto de ensayo inhibe la señalización del TNF a través de su receptor. Dichos ensayos son bien conocidos en la técnica.
Los compuestos identificados mediante los métodos de la invención pueden inhibir total o parcialmente la señalización a través de un receptor del TNF cuando un miembro de la superfamilia del TNF en forma de un complejo compuestotrímero se une al receptor. El compuesto puede actuar reduciendo la señalización a través de un receptor de la superfamilia del TNF en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %. Cualquier cambio en el nivel de señalización puede medirse mediante una técnica adecuada, incluyendo la medición de la actividad de un gen indicador mediante fosfatasa alcalina o luciferasa, la translocación de NF-kB usando máquinas tales como Cellomics Arrayscan, la fosforilación de efectores corriente abajo, el reclutamiento de moléculas de señalización o la muerte celular.
Los compuestos identificados mediante los métodos de la invención pueden modular al menos uno de los efectos corriente abajo de la señalización a través de un receptor del TNF cuando un miembro de la superfamilia del TNF en forma de un complejo compuesto-trímero se une al receptor. Dichos efectos se analizan en el presente documento e incluyen la producción inducida por la superfamilia del TNF de IL-8, IL17A/F, IL2 y VCAM, la activación inducida por la superfamilia del TNF de NF-kB y el reclutamiento de neutrófilos. En la técnica se conocen técnicas convencionales para medir los efectos corriente abajo de miembros de la superfamilia del TNF. Los compuestos identificados mediante los métodos de la invención pueden modular al menos 1, 2, 3, 4, 5, 10 o hasta todos los efectos corriente abajo de la señalización a través de un receptor del TNF.
La actividad de los compuestos identificados mediante los métodos de la invención puede cuantificarse usando terminología convencional, tal como la CI50 o los valores de concentración de eficacia semimáxima (CE50). Los valores de CI50 representan la concentración de un compuesto necesaria para una inhibición del 50 % de una función biológica o bioquímica específica. Los valores de CE50 representan la concentración de un compuesto necesaria para conseguir el 50 % de su efecto máximo. Los compuestos identificados mediante los métodos de la invención pueden tener valores de CI50 o CE50 de 500 nM, 400 nM, 300 nM, 200 nM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 100 pM o menos. Los valores de CI50 y CE50 pueden medirse usando cualquier técnica adecuada, por ejemplo, la producción de citocinas puede cuantificarse usando ELISA. Pueden generarse entonces valores de CI50 y CE50 usando un modelo logístico convencional de 4 parámetros también conocido como modelo sigmoideo de respuesta a la dosis.
En la presente invención, pueden cribarse bibliotecas de compuestos con el fin de identificar moduladores de miembros de la superfamilia del TNF (es decir, usando los métodos que se desvelan en el presente documento). Dichas bibliotecas normalmente comprenden al menos 260 compuestos. Preferentemente, dichas bibliotecas comprenden al menos 300, al menos 500 o incluso al menos 1000 compuestos.
En los métodos de la invención, se determina el número promedio de receptores unidos por cada complejo trímerocompuesto con el fin de identificar compuestos capaces de modular la señalización del TNF. En ausencia de cualquier compuesto, cuando los receptores están presentes en una concentración equivalente o en exceso en comparación con los monómeros de t Nf (en una relación molar superior a 1:1 (receptores:monómeros); superior a 3:1 (receptores:trímeros)) normalmente se unen tres receptores por cada trímero de TNF. Estos complejos de trímeros y receptores forman balsas a través de la formación de dímeros de receptores. Las balsas son responsables de la señalización corriente abajo.
Esto se ilustra en la Figura 1, que muestra las interacciones entre trímeros de TNF y receptores, y la formación de balsas, implicada en la señalización del TNFa y TNF-R1. Como se muestra en la Figura, los trímeros de TNFa se unen a los receptores necesarios primero y segundo con una afinidad (Kd) de aproximadamente 93 pM. Los trímeros se unen entonces a los receptores tercero y último con una Kd de aproximadamente 1 pM.
Los compuestos identificados usando los métodos de la presente invención inducen y/o estabilizan cambios conformacionales dentro de los trímeros de TNF. Estos trímeros tienen afinidades alteradas por los receptores; especialmente por los receptores segundo y tercero donde existe una afinidad reducida. Esta afinidad reducida da como resultado una disminución del número de receptores que se unen por cada complejo trímero-compuesto. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 2, solo dos dímeros de receptores pueden unirse por cada complejo trímerocompuesto (en lugar de los tres receptores que se unirían en condiciones normales).
La Figura 3 muestra los efectos de dos tipos de compuestos sobre la señalización de TNFa/TNF-R1. Ambos compuestos no tienen ningún efecto sobre la formación de los dímeros de receptores, sino que inducen y/o estabilizan la formación de trímeros con conformaciones distorsionadas. Los trímeros con el primer tipo de compuesto se unen al primer y al segundo receptor, pero tienen una afinidad reducida por el tercer receptor. En consecuencia, se forman trímeros con solo dos receptores unidos. Los trímeros con el segundo compuesto se unen al primer receptor, pero tienen una afinidad reducida por el segundo y el tercer receptor. Por tanto, los trímeros se forman con un solo receptor unido. Por tanto, ambos tipos de compuestos interfieren con la formación de balsas de señalización debido a la disminución del número de receptores que se unen por cada trímero.
En vista de esto, los métodos de la presente invención implican la determinación del número promedio de receptores unidos por cada complejo trímero-compuesto con el fin de identificar compuestos que modulen la señalización del TNF. El término "promedio" refleja el hecho de que casi seguro habrá presente una población mixta de trímeros/receptores en una muestra. Por ejemplo, como algunos compuestos reducen la afinidad de los trímeros por el receptor tres, algunos trímeros pueden todavía unirse a los tres receptores en presencia del compuesto, pero la mayoría de los trímeros solo tendrán dos receptores unidos.
El término "promedio" puede referirse a un valor modal, es decir, el número de receptores unidos por cada complejo trímero-compuesto que se produce con mayor frecuencia en una muestra. Un valor modal puede determinarse visualmente a partir de resultados experimentales. Esto se ilustra en la sección de Ejemplos a continuación.
T ambién es posible resolver los datos experimentales con el fin de identificar una medición cuantitativa de la proporción (porcentaje) de trímeros en una muestra con tres, dos, uno o cero receptores unidos. Dichos métodos son habituales en la técnica. Por ejemplo, usando cromatografía de exclusión por tamaño es posible resolver picos a diferentes volúmenes de elución, correspondiendo cada uno de ellos a trímeros con un número diferente de receptores unidos. Después pueden calcularse las áreas bajo los picos y las áreas pueden usarse para determinar las proporciones (porcentajes) de trímeros en una muestra que se unen a tres, dos, uno o cero receptores. El promedio modal se refiere entonces al número de receptores que se unen por cada trímero que se produce en el porcentaje más alto.
El término "promedio" también puede referirse a un valor medio.
Para ilustrar valores promedio tanto medios como modales, si un método (tal como los que se desvelan a continuación) identifica que el 5 % de los trímeros presentes en una muestra tienen 1 receptor unido, el 75 % tiene dos receptores unidos y el 20 % tiene tres receptores unidos, el valor modal será de dos receptores unidos por cada trímero. El valor medio será de 2,15 receptores unidos por cada trímero ((5x1 75x2 20x3)/100).
Cuando se determinan valores medios de esta manera, se considera que un resultado de 0-0,4 indica que, en promedio, hay cero receptores unidos por cada trímero, se considera que un resultado de 0,5-1,4 indica que, en promedio, hay un receptor unido por cada trímero, se considera que un resultado de 1,5-2,4 indica que, en promedio, hay dos receptores unidos por cada trímero y se considera que un resultado superior a 2,5 indica que, en promedio, hay tres receptores unidos por cada trímero.
En los métodos de la invención, el número promedio de receptores unidos por cada complejo trímero-compuesto normalmente se determina en comparación con un control. La muestra de control se trata de la misma manera que la muestra con el compuesto de ensayo. En particular, la muestra de control se somete a las mismas condiciones experimentales que la muestra que comprende el compuesto de ensayo, incluyendo las mismas concentraciones de reactivos, trímeros y receptores. Además, el número promedio de receptores unidos por cada trímero para el control se determina usando el mismo método experimental que para el compuesto de ensayo.
El número promedio de receptores unidos por cada trímero por lo general se determina al mismo tiempo para la muestra de ensayo y para el control. En otras palabras, los experimentos se realizan en paralelo. Sin embargo, también pueden determinarse valores para el número promedio de receptores unidos por cada trímero en un control antes de realizar experimentos en la muestra de ensayo. Dichos valores pueden registrarse, por ejemplo, en un ordenador.
Con el fin de permitir una comparación eficaz entre los resultados, el número promedio de receptores unidos por cada trímero para un control se calcula de la misma manera que para la muestra de ensayo (es decir, valores modales o valores medios como se ha analizado anteriormente).
La muestra de control puede comprender trímeros de miembros de la superfamilia del TNF y los receptores necesarios en ausencia de compuesto (un control negativo). En otras palabras, la muestra de control es idéntica a la muestra de compuesto de ensayo, excepto porque no hay ningún compuesto de ensayo presente. Los trímeros de miembros de la superfamilia del TNF y los receptores necesarios pueden ser cualquiera de los analizados anteriormente, pero son iguales en la muestra de control y la muestra de ensayo (y están presentes en las mismas concentraciones).
Preferentemente, cuando la muestra de control comprende trímeros de miembros de la superfamilia del TNF y los receptores necesarios en ausencia de compuesto, una disminución/reducción en el número promedio de receptores unidos por cada complejo trímero-compuesto en la muestra de ensayo en comparación con el control identifica que el compuesto es capaz de modular la señalización a través del receptor. En otras palabras, se identifica que un compuesto de ensayo es capaz de modular la señalización de la proteína trimérica a través del receptor si se identifica que hay un número inferior de receptores unidos en promedio por cada trímero en la muestra con el compuesto de ensayo en comparación con la muestra de control.
Por ejemplo, cuando se calcula usando un valor modal si se determina que el control tiene un promedio de tres receptores unidos por cada trímero, puede identificarse que un compuesto de ensayo es capaz de modular la señalización si se determina que hay dos o menos receptores unidos en promedio por cada complejo trímerocompuesto. Debe encontrarse que un control negativo que comprende trímeros de miembros de la superfamilia del TNF, y los receptores necesarios, en ausencia de compuesto, se une a un promedio de tres receptores por cada trímero (cuando los receptores están presentes en una concentración equivalente o en exceso en comparación con los monómeros de TNF; en una relación molar de al menos 1:1 (receptores:monómeros) o 3:1 (receptores:trímeros).
No obstante, si se identifica que el control tiene un promedio de dos receptores unidos por cada trímero, se identificará que un compuesto de ensayo es capaz de modular la señalización si se determina que hay uno o cero receptores unidos en promedio por cada complejo trímero-compuesto. Por último, si se identifica que el control tiene un promedio de un receptor unido por cada trímero, se identificará que un compuesto de ensayo es capaz de modular la señalización si se determina que hay cero receptores unidos en promedio por cada complejo trímero-compuesto.
El mismo razonamiento se aplica cuando se usan valores medios como el promedio, como se ha calculado anteriormente.
Una disminución en el número promedio de receptores unidos por cada trímero, con respecto al control negativo, también puede calcularse sencillamente basándose en el porcentaje de trímeros en una muestra que se une a tres, dos, uno o cero receptores. En este caso, es necesario identificar en primer lugar el porcentaje de trímeros tanto en la muestra de control como en la muestra que contiene el compuesto de ensayo que tiene tres, dos, uno o cero receptores unidos. Se identifica entonces que un compuesto de ensayo es capaz de modular la señalización si la presencia del compuesto da como resultado un cambio en el porcentaje de trímeros que tienen un determinado número de receptores unidos. Dichos cálculos normalmente se basan en el porcentaje de trímeros en una muestra que tiene tres receptores unidos, donde un porcentaje reducido de trímeros que tienen tres receptores unidos sería indicativo de un compuesto antagonista que modula la señalización (el porcentaje de trímeros que se unen a dos, uno o cero receptores debe aumentar simultáneamente).
A modo ilustrativo, en un control negativo que comprende solo receptores y trímeros (sin compuesto) puede encontrarse que el 90 % de los trímeros se unen a tres receptores y el 10 % de los trímeros se unen a dos receptores. Entonces, puede identificarse que un compuesto de ensayo es capaz de modular la señalización si el compuesto da como resultado que menos del 90 % de los trímeros se unen a tres receptores. Si se une un porcentaje inferior de trímeros a tres receptores, el porcentaje de trímeros que se unen a dos, uno o cero receptores deben haber aumentado. En consecuencia, el número promedio de receptores unidos por cada complejo trímero-compuesto disminuye con respecto al control.
Preferentemente, se identifica que un compuesto de ensayo es capaz de modular la señalización si en la muestra de compuesto de ensayo el porcentaje de trímeros que tienen tres receptores unidos disminuye en al menos un 10 % (es decir, al menos un 10 % inferior), al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % en comparación con el porcentaje de trímeros que tienen tres receptores unidos en la muestra de control negativo (que comprende el miembro de la superfamilia del TNF y receptores en ausencia de compuesto).
Como alternativa, el control puede comprender trímeros de miembros de la superfamilia del TNF, los receptores necesarios y un compuesto que se sabe que modula la señalización a través de los receptores (un denominado "control positivo"). El compuesto que se sabe que modula la señalización a través del receptor puede ser cualquier compuesto que se sepa que disminuye el número promedio de receptores unidos por cada trímero a dos, uno o cero (en condiciones en las que los trímeros se unirían a tres receptores en ausencia de cualquier compuesto). Dichos compuestos pueden identificarse usando los métodos que se describen en el presente documento. Son ejemplos de compuestos que se sabe que disminuyen el número promedio de receptores a dos por cada trímero los compuestos (1)-(4) y un ejemplo de un compuesto que se sabe que disminuye el número promedio de receptores a más próximo a uno por cada trímero es el compuesto (5). El control positivo puede comprender uno cualquiera de estos compuestos de ejemplo.
Como se ha descrito anteriormente, la muestra de control positivo se trata de la misma manera que la muestra con el compuesto de ensayo y se usan las mismas condiciones experimentales, métodos y cálculos tanto para la muestra de control como para la muestra de compuesto de ensayo. El número promedio de receptores unidos por cada complejo trímero-compuesto por lo general se determina al mismo tiempo para la muestra de compuesto de ensayo y para el control, pero también podría determinarse antes de realizar experimentos en la muestra de compuesto de ensayo.
Preferentemente, cuando la muestra de control positivo comprende trímeros de miembros de la superfamilia del TNF, los receptores necesarios y un compuesto que se sabe que es capaz de modular la señalización a través del receptor, un número promedio equivalente de receptores unidos por cada complejo trímero-compuesto en la muestra de ensayo en comparación con el control, o una disminución en el número promedio de receptores unidos por cada complejo trímero-compuesto en la muestra de ensayo en comparación con el control, identifica que el compuesto es capaz de modular la señalización a través del receptor. En otras palabras, se identifica que un compuesto de ensayo es capaz de modular la señalización de la proteína trimérica a través del receptor si se identifica que hay un número idéntico o inferior de receptores en promedio unidos por cada trímero en la muestra con el compuesto de ensayo en comparación con el control positivo.
Por ejemplo, cuando se calcula usando un valor modal (descrito anteriormente) si se determina que el control positivo tiene un promedio de dos receptores unidos por cada trímero, se identificará que un compuesto de ensayo es capaz de modular la señalización si se determina que hay dos o menos receptores (dos receptores, un receptor o cero receptores) unidos en promedio por cada complejo trímero-compuesto. Análogamente, si se identifica que el control tiene un promedio de un receptor unido por cada trímero, se identificará que un compuesto de ensayo es capaz de modular la señalización si se determina que hay uno o cero receptores unidos en promedio por cada complejo trímerocompuesto. Si se identifica que el control tiene un promedio de cero receptores unidos por cada trímero, se identificará que un compuesto de ensayo es capaz de modular la señalización si se determina además que hay cero receptores unidos en promedio por cada complejo trímero-compuesto.
El mismo razonamiento se aplica cuando se usan valores medios como el promedio.
Un número promedio equivalente de receptores unidos por cada trímero, o una disminución del número promedio de receptores unidos por cada trímero, en comparación con un control positivo, también puede calcularse usando las proporciones (porcentajes) de trímeros en una muestra que se unen a tres, dos, uno o cero receptores. Como se ha descrito anteriormente, es necesario identificar en primer lugar el porcentaje de trímeros tanto en la muestra de control como en la muestra que contiene el compuesto de ensayo que tiene tres, dos, uno o cero receptores unidos. Se identifica entonces que un compuesto de ensayo es capaz de modular la señalización si la presencia del compuesto da como resultado un porcentaje equivalente, o un porcentaje aumentado/mayor, de trímeros que tienen el número deseado de receptores unidos (o un número inferior de receptores unidos) en comparación con el control. Dichos cálculos pueden centrarse en el porcentaje de trímeros de una muestra que tiene dos o menos receptores unidos, uno o menos receptores unidos o cero receptores unidos.
A modo ilustrativo, en una muestra de control positivo un compuesto puede dar como resultado que el 30 % de los trímeros presentes se unan a tres receptores y el 70 % de los trímeros presentes se unan a dos receptores. Entonces, puede identificarse que un compuesto de ensayo es capaz de modular la señalización si el compuesto da como resultado que al menos el 70 % de los trímeros presentan una unión de dos o menos receptores (dos, uno o cero).
"Un porcentaje equivalente" en este contexto se refiere normalmente a valores que están dentro del 10 % o menos entre sí, preferentemente el 5 % o menos. Por ejemplo, un compuesto de ensayo que da como resultado un 70 % de trímeros que se unen a dos receptores puede considerarse que da como resultado un porcentaje equivalente de trímeros que se unen a dos receptores como un control en el que el 75 % de los trímeros se unen a dos receptores.
También puede identificarse que un compuesto es capaz de modular la señalización simplemente basándose en la determinación del número de receptores que se unen por cada complejo trímero-compuesto, sin una comparación directa con un control.
En este escenario, puede identificarse que un compuesto es capaz de modular la señalización de la proteína trimérica a través del receptor si se determina que se une un promedio de menos de tres receptores por cada complejo trímerocompuesto. El número promedio de receptores unidos por cada complejo trímero-compuesto puede ser un valor medio o un valor modal, como se ha descrito anteriormente. Se identifica preferentemente que los compuestos son capaces de modular la señalización de la proteína trimérica a través del receptor si el compuesto da como resultado la unión de un promedio de dos receptores por cada trímero. Más preferentemente, se identifica que un compuesto es capaz de modular la señalización de la proteína trimérica a través del receptor si el compuesto da como resultado la unión de un promedio de un receptor por cada trímero. También puede identificarse que un compuesto es capaz de modular la señalización de la proteína trimérica a través del receptor si el compuesto da como resultado la unión de un promedio de cero receptores por cada trímero. A continuación se analizan con más detalle ejemplos de dichos compuestos.
El número promedio de receptores que se unen por cada complejo trímero-compuesto normalmente se determina aproximadamente a una concentración equivalente (una relación molar 1:1) de receptores con respecto a monómeros de TNF. Una relación 1:1 de receptores:monómeros corresponde a una relación 3:1 de receptores:trímeros.
La concentración de los receptores puede estar ligeramente en exceso en comparación con la concentración de monómeros. Se realizan preferentemente experimentos en una relación molar de hasta aproximadamente 10:1 (receptores:trímeros). Pueden realizarse experimentos en cualquier relación molar dentro de un intervalo de entre aproximadamente 3:1 y 10:1 (receptores:trímeros). Preferentemente, se realizan ensayos en relaciones de aproximadamente 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 o 10:1 (receptores:trímeros). En algunos casos, se realizan ensayos a concentraciones múltiples de receptores:trímeros, por ejemplo, aproximadamente 3:1, 6:1 y 10:1. Estas titulaciones se ilustran con más detalle en la sección de Ejemplos.
Normalmente, se realizan experimentos para determinar el número promedio de receptores que se unen por cada complejo trímero-compuesto cuando el compuesto está presente en una concentración de compuesto que garantiza la ocupación completa de los trímero con compuesto. Como se analiza a continuación, la ocupación de los trímeros con compuesto puede determinarse usando espectrometría de masas. El compuesto puede estar presente en una concentración igual en comparación con la concentración de trímeros (una relación 1:1 de compuesto:trímeros; una relación 1:3 de compuestos:monómeros de TNF). El compuesto, sin embargo, normalmente está presente en exceso con respecto a la concentración de los trímeros de TNF. Por ejemplo, el compuesto puede estar presente en un exceso de entre 1,5 veces y 500 veces con respecto a la concentración de trímeros. Preferentemente, el compuesto está presente en un exceso de entre 5 veces y 100 veces con respecto a la concentración de trímeros, más preferentemente en un exceso de entre 10 veces y 50 veces con respecto a la concentración de trímeros. El compuesto puede estar presente en un exceso de al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 250 veces o al menos 500 veces con respecto a la concentración de trímeros de TNF.
Pueden realizarse experimentos con un intervalo de concentraciones de compuesto, como se muestra en los Ejemplos a continuación.
El número promedio de receptores que se unen por cada trímero puede determinarse usando cualquier técnica adecuada, por ejemplo, usando espectrometría de masas de movilidad iónica, cromatografía de exclusión por tamaño, un ensayo de agregación, Transferencia de Energía de Resonancia Forster y/o cristalografía. Estas técnicas pueden usarse solas o, preferentemente, en combinación con el fin de determinar el número promedio de receptores que se unen por cada trímero. Por ejemplo, pueden usarse juntas cualesquiera dos, tres, cuatro o las cinco técnicas.
La espectrometría de masas de movilidad iónica (EMI-EM) combina la espectrometría de movilidad iónica y la espectrometría de masas con el fin de identificar los componentes dentro de una muestra de ensayo. Se conocen bien en la técnica y se ilustran adicionalmente en la sección de Ejemplos a continuación métodos para realizar EMI-EM y para resolver los datos obtenidos.
En un procedimiento de ejemplo, el compuesto de ensayo se incuba con TNF durante la noche a temperatura ambiente. Se registra en primer lugar un espectro de masas nativo para garantizar que el compuesto tenga una ocupación del 100 % del TNF antes de la adición del compuesto. En otras palabras, el espectro de masas nativo garantiza que el compuesto se une a los trímeros. El compuesto normalmente está presente en exceso con respecto a la concentración de trímeros, como se ha descrito anteriormente. Después, los receptores del TNF necesarios se añaden y se incuban antes de recoger el espectro de masas de movilidad iónica de la muestra.
Los ensayos de espectrometría de masas de movilidad iónica se realizan en cualquier relación adecuada de receptores:trímeros, normalmente en relaciones aproximadas de entre 3:1 y 10:1, por ejemplo, 3:1, 6:1 y/o 10:1 (receptores:trímeros). En muchos casos, los ensayos de espectrometría de masas de movilidad iónica se realizan en una serie de relaciones de concentración para una muestra de ensayo.
La espectrometría de masas de movilidad iónica también puede usarse para proporcionar datos de afinidad para la unión de los tres receptores a los trímeros de TNF. Esto se ilustra en la sección de Ejemplos a continuación.
Otra técnica que puede usarse para determinar el número de receptores que se unen en promedio por cada trímero de TNF es la cromatografía de exclusión por tamaño. En la técnica se conocen bien métodos de cromatografía de exclusión por tamaño e implican la separación de componentes en una solución basándose en su tamaño. Los componentes más pequeños en la solución eluyen más lentamente y requieren un mayor volumen de elución en comparación con los componentes más grandes.
Un trímero de TNF que se une a tres receptores será más grande que uno que solo se une a dos. Por tanto, los trímeros que se unen a tres receptores eluyen en un volumen menor en comparación con los trímeros que se unen a dos receptores o a un receptor. Por tanto, los picos a diferentes volúmenes de elución pueden usarse para identificar el número promedio de receptores unidos por cada trímero. Esto se ilustra en más detalle en la sección de Ejemplos a continuación.
En un procedimiento de cromatografía de exclusión por tamaño de ejemplo, los trímeros de TNF se incuban con un exceso de compuesto. La ocupación de los trímeros de TNF con compuesto puede determinarse mediante EMI-EM, como se ha descrito anteriormente. Después, las muestras se incuban con receptores y se analizan mediante HPLC de exclusión por tamaño.
Normalmente, se realizan experimentos de cromatografía de exclusión por tamaño en relaciones aproximadas de entre 3:1 y 10:1, por ejemplo, 3:1,6:1 y/o 10:1 receptores:trímeros. Preferentemente, un compuesto se somete a ensayo en un intervalo de relaciones de concentraciones.
En la sección de Ejemplos a continuación se ilustran controles para establecer las posiciones de migración (pico) para trímeros con dos receptores unidos, o un solo receptor unido. Estos controles comprenden TNFa mutante, que tiene impedida la unión de los receptores tercero, o segundo y tercero.
Otra técnica que puede usarse para determinar el número promedio de receptores que se unen por cada trímero de TNF es un ensayo de agregación.
Otro ensayo adecuado para determinar el número promedio de receptores unidos por cada trímero es la T ransferencia de Energía de Resonancia Forster (TERF). Puede usarse TERF para determinar si dos fluoróforos (donador y aceptor) están en proximidad estrecha entre sí.
En el ensayo de la presente invención, los receptores pueden marcarse, por ejemplo, con el fluoróforo donador. Después, los trímeros se marcan, por ejemplo, con el fluoróforo aceptor (posiblemente a través de un enlazador). Los experimentos se realizan normalmente en una relación de 1:1 receptores:monómeros, pero también pueden realizarse titulaciones de receptores. Análogamente, pueden realizarse experimentos con el compuesto de ensayo presente en una diversidad de concentraciones. Esto se ilustra en los Ejemplos a continuación.
Por último, puede usarse cristalografía con el fin de determinar el número promedio de receptores que se unen por cada trímero. Las técnicas de cristalografía son bien conocidas en la técnica.
Todos los métodos de la invención implican proporcionar un resultado que identifica que el compuesto es capaz de modular la señalización a través del receptor. El resultado puede ser un registro de información, por ejemplo, en un cuaderno de laboratorio. El resultado también puede ser el registro de información en un ordenador.
Compuestos y complejos
La presente invención también se refiere a compuestos que son capaces de unirse a una proteína trimérica que es un miembro de la superfamilia del TNF y modular la señalización del miembro de la superfamilia del TNF a través del receptor necesario. Los compuestos dan como resultado el correspondiente número promedio, o un cambio en el número promedio, de receptores unidos por cada complejo trímero-compuesto en comparación con un control. Dichos compuestos pueden identificarse mediante los métodos descritos anteriormente.
Los miembros de la superfamilia del TNF y los receptores necesarios pueden ser cualesquiera de los descritos anteriormente.
Los compuestos pueden ser cribarse fácilmente para determinar su unión a un trímero de TNF usando métodos habituales conocidos en la técnica, tales como la espectrometría de masas. La espectrometría de masas también puede usarse para identificar la presencia de los propios trímeros de TNF en una muestra.
Los métodos de espectrometría de masas pueden incluir, por ejemplo, espectrometría de masas con desorción/ionización láser asistida por matriz (EM DILAM), espectrometría de masas con desorción/ionización láser potenciada para superficie (EM DILPS), espectrometría de masas de tiempo de vuelo (EM TDV) y cromatografía líquida espectrometría de masas (CL EM).
Los compuestos no se limitan en términos de su fórmula química o estructura. Los compuestos son normalmente entidades moleculares pequeñas (EMP) que tienen un peso molecular de 1000 Da o menos, preferentemente 750 Da o menos, más preferentemente 600 Da o menos. Los compuestos pueden unirse dentro del espacio central presente dentro del trímero de miembros de la superfamilia del TNF (es decir, el núcleo del trímero). La unión de un compuesto dentro del núcleo del trímero puede detectarse usando métodos habituales, por ejemplo, usando cristalografía. Los compuestos pueden comprender un resto bencimidazol o un isóstero del mismo.
Los compuestos se unen al menos a un miembro de la superfamilia del TNF y modulan la señalización del miembro de la superfamilia del TNF a través del receptor necesario. La modulación de la señalización se ha descrito anteriormente en el contexto de los métodos de la presente invención. En una relación molar 1:1 de receptores:monómeros, o en presencia de un exceso de receptores, un trímero de TNF por lo general se une a un promedio de tres receptores. Los compuestos de la presente divulgación modulan la señalización dando como resultado un número promedio equivalente de receptores unidos por cada complejo trímero-compuesto, o un cambio en el número promedio de receptores unidos por cada complejo trímero-compuesto, en comparación con un control.
Como se ha descrito anteriormente, el control puede incluir trímeros de miembros de la superfamilia del TNF y receptores en ausencia del compuesto (un control negativo). Los trímeros de miembros de la superfamilia del TNF y los receptores son los mismos tanto para el compuesto de ensayo como para el control, y la muestra de compuesto de ensayo y el control se someten a las mismas condiciones experimentales (por ejemplo, concentraciones de reactivos) y métodos.
El control puede realizarse en paralelo a la muestra que comprende el compuesto de ensayo. Como alternativa, el control puede realizarse antes de la muestra de compuesto de ensayo.
Cuando el control comprende trímeros de miembros de la superfamilia del TNF y receptores en ausencia de compuesto, se esperaría que se unan tres receptores en promedio por cada trímero cuando los ensayos se realicen en una relación molar equivalente (1:1) de monómeros de TNF:receptores, o cuando los receptores estén presentes en exceso en comparación con la concentración de monómeros. Un compuesto antagonista da como resultado una disminución del número promedio de receptores que se unen por cada trímero en dichas condiciones. Se han analizado anteriormente métodos de determinación de la disminución del número promedio de receptores que se unen por cada trímero.
Como alternativa, el control puede comprender trímeros de miembros de la superfamilia del TNF, los receptores necesarios y un compuesto que se sepa que modula la señalización de los trímeros a través de los receptores (un control positivo). De nuevo, los trímeros de miembros de la superfamilia del TNF y los receptores son los mismos tanto para el compuesto de ensayo como para el control, y la muestra de compuesto de ensayo y el control se someten a las mismas condiciones experimentales (por ejemplo, concentraciones de reactivos) y métodos. Normalmente, el control se realiza en paralelo al compuesto de ensayo. Sin embargo, el control también puede realizarse antes de la muestra de compuesto de ensayo.
Cuando el control comprende trímeros de miembros de la superfamilia del TNF, los receptores necesarios y un compuesto que se sabe que modula la señalización de los trímeros a través de los receptores, se identifica que un compuesto es capaz de modular la señalización si da como resultado un número promedio equivalente de receptores unidos por cada complejo trímero-compuesto en comparación con el control, o una disminución del número promedio de receptores unidos por cada complejo trímero-compuesto en comparación con el control. Se han descrito anteriormente métodos de identificación de compuestos de esta manera.
Los compuestos antagonistas dan como resultado la unión de un promedio de menos de tres receptores por cada complejo trímero-compuesto (en condiciones en las que, en ausencia de compuesto, se unirían tres receptores en promedio por cada complejo trímero-compuesto). Preferentemente, en dichas condiciones, un compuesto de ensayo da como resultado la unión de un promedio de dos receptores por cada complejo trímero-compuesto. Los ejemplos de dichos compuestos incluyen los compuestos (1)-(4). Estos compuestos pueden usarse como compuestos de control positivo, cuando se evalúa si otro compuesto de ensayo es capaz de modular la señalización.
Más preferentemente, un compuesto de ensayo da como resultado la unión de un promedio de un receptor por cada complejo trímero-compuesto. Los ejemplos de dichos compuestos incluyen el compuesto (5), que da como resultado un cambio hacia la unión de un solo receptor por cada trímero. De nuevo, estos compuestos pueden usarse como compuestos de control positivo cuando se evalúa si otro compuesto de ensayo es capaz de modular la señalización.
Un compuesto de ensayo también puede dar como resultado la unión de un promedio de cero receptores por cada complejo trímero-compuesto.
La presente invención también se refiere a un complejo que comprende una proteína trimérica que es un miembro de la superfamilia del TNF y un compuesto. La proteína trimérica que es un miembro de la superfamilia del TNF, y el compuesto, pueden ser cualesquiera de los descritos anteriormente.
Anticuerpos para identificar complejos trímero-compuesto
Los presentes inventores desarrollaron anticuerpos que se unen selectivamente a complejos que comprenden compuestos de la divulgación y un miembro de la superfamilia del TNF trimérico. Estos anticuerpos pueden usarse para identificar compuestos adicionales capaces de inhibir el TNF.
En particular, los presentes inventores han identificado dos anticuerpos, denominados CA185_01974 y CA185_01979, que se generaron contra el TNFa humano en complejo con un compuesto de la divulgación. La región variable de la cadena pesada (HCVR) de CA185_01974 se muestra en la SEQ ID NO: 3 y la región variable de la cadena ligera (LCVR) de CA185_01974 se muestra en la SEQ ID NO: 4. La cadena pesada de IgG1 de longitud completa se muestra en la SEQ ID NO: 5 (1974 HC mIgGI completa) y la cadena ligera de longitud completa (1974 LC kappa completa) se muestra en la SEQ ID NO: 6.
La HCVR de CA185_01979 se muestra en la SEQ ID NO: 7 y la LCVR de CA185_01979 se muestra en la SEQ ID NO: 8. La cadena pesada de IgG1 de longitud completa de CA185_01979 se muestra en la SEQ ID NO: 9 (HC mIgGI de 1979 completa) y la cadena ligera de longitud completa en la SEQ ID NO: 10 (LC Kappa de 1979 completa).
Los anticuerpos que comprenden las HCVR/LCVR anteriores o pares de secuencias de longitud completa pueden ser generados fácilmente por el experto usando técnicas convencionales.
Los métodos de la invención para determinar compuestos que sean capaces de unirse a una proteína trimérica que es un miembro de la superfamilia del TNF y modular la señalización a través del receptor pueden implicar, por tanto, identificar si un anticuerpo con un par HCVR/LCVR de las SEQ ID NO: 3/4 o 7/8 se une al complejo trímero-compuesto. Análogamente, los métodos pueden implicar identificar si un anticuerpo con un par de secuencias de las SEQ ID NO: 5/6 o 9/10 se une al complejo trímero-compuesto. Pueden usarse ensayos de anticuerpos además de los otros ensayos que se describen en el presente documento.
Los anticuerpos de la divulgación pueden someterse a ensayo para determinar su unión a un complejo compuestotrímero mediante, por ejemplo, ELISA convencional o transferencia Western. La selectividad de unión de un anticuerpo también puede determinarse controlando la unión del anticuerpo a células que expresan la proteína diana, por ejemplo, mediante citometría de flujo. Por tanto, un método de cribado de la invención puede comprender la etapa de identificar un anticuerpo que sea capaz de unirse a un complejo compuesto-trímero mediante la realización de un ELISA o transferencia Western o mediante citometría de flujo.
Los anticuerpos que se describen en el presente documento reconocen selectivamente (o específicamente) al menos un complejo compuesto-trímero, es decir, epítopos dentro de un complejo compuesto-trímero. Un anticuerpo, u otro compuesto, "se une selectivamente a" o "reconoce selectivamente" una proteína cuando se une con una afinidad preferente o alta a la proteína para la que es selectivo, pero no se une sustancialmente, o se une con baja afinidad, a otras proteínas.
En el presente caso, un complejo compuesto-trímero puede unirse normalmente a un anticuerpo con un par HCVR/LCVR de las SEQ ID NO: 3/4 o 7/8 (o con pares de secuencias de las SEQ ID NO: 5/6 o 9/10) con una afinidad de menos de 1 nM. En otras palabras, los métodos de la invención pueden implicar determinar que un compuesto es capaz de unirse a una proteína trimérica que es un miembro de la superfamilia del TNF y modular la señalización a través del receptor mediante la identificación de que un anticuerpo con un par HCVR/LCVR de las SEQ ID NO: 3/4 o 7/8 (o pares de secuencias de las SEQ ID NO: 5/6 o 9/10) se une al complejo trímero-compuesto con una KD-ab de menos de 1 nM. En algunos casos, la KD-ab puede ser inferior a 500 pM, o inferior a 200 pM. La afinidad puede determinarse mediante resonancia de plasmón superficial. El TNF es normalmente TNFa humano.
Análogamente, un complejo de la divulgación puede ser un complejo de un miembro de la superfamilia del TNF trimérico y un compuesto, en donde el complejo compuesto-trímero se une a un anticuerpo con un par HCVR/LCVR de las SEQ ID NO: 3/4 o 7/8 (o pares de secuencias de las SEQ ID NO: 5/6 o 9/10). De nuevo, el TNF es normalmente TNF a humano, y la afinidad de unión es normalmente inferior a 1 nM (o inferior a 500 pM/200 pM). La afinidad de unión se determina normalmente mediante resonancia de plasmón superficial.
Indicaciones terapéuticas
El TNFa es el miembro arquetípico de la superfamilia del TNF. El TNFa es una citocina pleiotrópica que media en la regulación inmunitaria y las respuestas inflamatorias. También se sabe que, in vivo, el TNFa está implicado en las respuestas a infecciones bacterianas, parasitarias y víricas. En particular, se sabe que el TNFa tiene un papel en la artritis reumatoide (AR), enfermedades inflamatorias intestinales (incluyendo la enfermedad de Crohn), psoriasis, enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), dolor, epilepsia, osteoporosis, asma, septicemia, fiebre, lupus eritematoso sistémico (LES) y esclerosis múltiple (EM) y cáncer. También se sabe que el TNFa tiene un papel en la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), ictus isquémico, glomerulonefritis mediada por complejos inmunitarios, nefritis lúpica (NL), glomerulonefritis asociada a anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos (ANCA), enfermedad de cambio mínimo, nefropatía diabética (ND), lesión renal aguda (LRA), uropatía obstructiva, rechazo de aloinjerto de riñón, LRA inducida por cisplatino y uropatía obstructiva.
Se sabe que otros miembros de la superfamilia del TNF están implicados en enfermedades autoinmunitarias y deficiencias inmunitarias. En particular, se sabe que los miembros de la superfamilia del TNF están implicados en la AR, LES, cáncer, EM, asma, rinitis, osteoporosis y mieloma múltiple (MM). Se sabe que TL1A desempeña un papel en el rechazo de trasplantes de órganos.
Un compuesto identificado usando los métodos de la invención, o un complejo de trímero de TNF y compuesto, puede usarse en un método de terapia del cuerpo humano o animal. Puede usarse un compuesto o complejo para tratar, prevenir o mejorar cualquier afección que pueda tratarse, prevenirse o mejorarse mediante un modulador convencional de miembros de la superfamilia del Tn F. El compuesto o complejo puede usarse solo o en combinación con un modulador convencional de miembros de la superfamilia del TNF.
Cualquier afección que sea resultado, parcial o totalmente, de la señalización patógena a través de un receptor del TNF por un miembro de la superfamilia del TNF o de una deficiencia en la señalización a través de un receptor del TNF por un miembro de la superfamilia del TNF, en principio, puede tratarse, prevenirse o mejorarse de acuerdo con la presente divulgación. La señalización patógena a través de un receptor del TNF por un miembro de la superfamilia del TNF incluye una señalización aumentada a través de un receptor del TNF por encima y por debajo del nivel fisiológico normal de señalización, señalizando a través de un receptor del TNF que se inicia normalmente, pero que no se detiene en respuesta a las señales fisiológicas normales, y señalizando a través de un receptor del TNF que está dentro del intervalo fisiológico normal de magnitud, pero que se inicia por medios no fisiológicos. Un aspecto de la divulgación se refiere al tratamiento, la prevención o la mejoría de afecciones mediadas o influenciadas por el TNFa.
En consecuencia, los compuestos que interactúan con el TNFa son beneficiosos para el tratamiento y/o la prevención de diversas dolencias humanas. Éstas incluyen trastornos autoinmunitarios e inflamatorios; trastornos neurológicos y neurodegenerativos; trastornos del dolor y nociceptivos; y trastornos cardiovasculares.
Los trastornos inflamatorios y autoinmunitarios incluyen trastornos autoinmunitarios sistémicos, trastornos endocrinos autoinmunitarios y trastornos autoinmunitarios específicos de órgano. Los trastornos autoinmunitarios sistémicos incluyen el lupus eritematoso sistémico (LES), psoriasis, vasculitis, polimiositis, esclerodermia, esclerosis múltiple, espondilitis anquilosante, artritis reumatoide y síndrome de Sjogren. Los trastornos endocrinos autoinmunitarios incluyen la tiroiditis. Los trastornos autoinmunitarios específicos de órgano incluyen la enfermedad de Addison, anemia hemolítica o perniciosa, glomerulonefritis (incluyendo el síndrome de Goodpasture), enfermedad de Graves, púrpura trombocitopénica idiopática, diabetes mellitus insulinodependiente, diabetes juvenil, uveítis, enfermedad inflamatoria intestinal (incluyendo la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa), pénfigo, dermatitis atópica, hepatitis autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria, neumonitis autoinmunitaria, carditis autoinmunitaria, miastenia grave, infertilidad espontánea, osteoporosis, asma y distrofia muscular (incluyendo la distrofia muscular de Duchenne).
Los trastornos neurológicos y neurodegenerativos incluyen la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, ictus, esclerosis lateral amiotrófica, lesión de la médula espinal, traumatismo craneal, ataques y epilepsia.
Los trastornos cardiovasculares incluyen trombosis, hipertrofia cardíaca, hipertensión, contractilidad irregular del corazón (por ejemplo, durante la insuficiencia cardíaca) y trastornos sexuales (incluyendo disfunción eréctil y disfunción sexual femenina).
En particular, puede usarse un compuesto o un complejo para tratar o prevenir trastornos inflamatorios, trastornos del SNC, trastornos inmunitarios y enfermedades autoinmunitarias, dolor, osteoporosis, fiebre y rechazo de trasplante de órganos. En una realización preferida, puede usarse un compuesto o un complejo para tratar o prevenir la artritis reumatoide, enfermedades inflamatorias intestinales (incluyendo la enfermedad de Crohn), psoriasis, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, epilepsia, asma, septicemia, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, asma, rinitis, cáncer y osteoporosis. En otra realización preferida, puede usarse un compuesto o un complejo para tratar o prevenir la artritis reumatoide (AR), artritis inflamatoria no específica, enfermedad ósea erosiva, condritis, degeneración y/o destrucción de cartílago, artritis inflamatoria juvenil, enfermedad de Still (inicio juvenil y/o adulto), artritis idiopática juvenil, artritis idiopática juvenil (tanto la forma oligoarticular como la poliarticular), enfermedades inflamatorias intestinales (incluyendo la enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colitis indeterminada, reservoritis), psoriasis, artropatía psoriásica, espondilitis anquilosante, enfermedad de Sjogren, enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Behcet, enfermedad de Parkinson (EP), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), ictus isquémico, dolor, epilepsia, osteoporosis, osteopenia, anemia de enfermedades crónicas, caquexia, diabetes, dislipidemia, síndrome metabólico, asma, enfermedad obstructiva crónica de las vías respiratorias (o pulmonar), septicemia, fiebre, síndrome de dificultad respiratoria, lupus eritematoso sistémico (LES), esclerosis múltiple (EM), glomerulonefritis mediada por complejos inmunitarios, nefritis lúpica (NL), glomerulonefritis asociada a anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos (ANCA), enfermedad de cambio mínimo, nefropatía diabética (ND), lesión renal aguda (LRA), uropatía obstructiva, rechazo de aloinjerto de riñón, LRA inducida por cisplatino y uropatía obstructiva, enfermedades oculares (incluyendo la retinopatía diabética, edema macular diabético, retinopatía de prematuridad, degeneración macular senil, edema macular, retinopatía proliferativa y/o no proliferativa, vascularización corneal incluyendo la neovascularización, oclusión de la vena retiniana, diversas formas de uveítis y queratitis), tiroiditis, trastornos fibrosantes, incluyendo diversas formas de fibrosis hepática, diversas formas de fibrosis pulmonar, esclerosis sistémica, esclerodermia, cáncer y complicaciones asociadas al cáncer (incluyendo complicaciones esqueléticas, caquexia y anemia).
Composiciones farmacéuticas, Dosificaciones y pautas posológicas
Los compuestos identificados usando los métodos de la invención y complejos compuesto-trímero normalmente se formularán en composiciones farmacéuticas, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y agentes retardantes de la absorción, y similares, que sean fisiológicamente compatibles. El vehículo puede ser adecuado para la administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraocular, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías parenterales de administración, por ejemplo, mediante inyección o infusión. Como alternativa, el vehículo puede ser adecuado para la administración no parental, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa. En un aspecto de la divulgación, el vehículo es adecuado para la administración oral. Dependiendo de la vía de administración, el modulador puede estar recubierto con un material para proteger el compuesto de la acción de los ácidos y otras condiciones naturales que puedan inactivar el compuesto.
Las composiciones farmacéuticas de la divulgación pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que conserva la actividad biológica deseada del compuesto precursor y no confiere ningún efecto toxicológico no deseado. Los ejemplos de dichas sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de base.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables preferidos comprenden vehículos o diluyentes acuosos. Los ejemplos de vehículos acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la divulgación incluyen agua, agua tamponada y solución salina. Los ejemplos de otros vehículos incluyen etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición.
Normalmente, las composiciones terapéuticas deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse en forma de una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para la alta concentración de fármaco.
Las composiciones farmacéuticas de la divulgación pueden comprender principios activos adicionales.
En el presente documento también se describen kits que comprenden compuestos o complejos e instrucciones de uso. El kit puede contener además uno o más reactivos adicionales, tales como un agente terapéutico o profiláctico adicional como se ha analizado anteriormente.
Los compuestos y los complejos compuesto-trímero o formulaciones o composiciones de los mismos pueden administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos.
En aplicaciones terapéuticas, se administran compuestos y complejos compuesto-trímero a un sujeto que ya padece un trastorno o afección como se ha descrito anteriormente, en una cantidad suficiente para curar, aliviar o detener parcialmente la afección o uno o más de sus síntomas. Dicho tratamiento terapéutico puede dar como resultado una disminución de la gravedad de los síntomas de la enfermedad o un aumento de la frecuencia o duración de los períodos sin síntomas. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una "cantidad terapéuticamente eficaz".
En aplicaciones profilácticas, se administran formulaciones a un sujeto en riesgo de padecer un trastorno o afección como se ha descrito anteriormente, en una cantidad suficiente para prevenir o reducir los efectos posteriores de la afección o uno o más de sus síntomas. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una "cantidad profilácticamente eficaz". Las cantidades eficaces para cada fin dependerán de la gravedad de la enfermedad o lesión, así como del peso y el estado general del sujeto.
Un sujeto para la administración puede ser un ser humano o animal no humano. La expresión "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc. Se prefiere la administración a seres humanos.
Un compuesto o un complejo compuesto-trímero puede administrarse a través de una o más vías de administración usando uno o más de una diversidad de métodos conocidos en la técnica. Como apreciarán los expertos en la materia, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Los ejemplos de vías de administración para compuestos o complejos compuesto-trímero de la divulgación incluyen la administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraocular, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías parenterales de administración, por ejemplo, mediante inyección o infusión. La expresión "administración parenteral" como se usa en el presente documento significa modos de administración diferentes de la administración enteral y tópica, generalmente por inyección. Como alternativa, un compuesto identificado mediante los métodos de la invención o un complejo compuesto-trímero puede administrarse a través de una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa. En un aspecto, el compuesto identificado mediante los métodos de la invención o un complejo compuesto-trímero de la divulgación es para su administración oral.
Una dosificación adecuada de un compuesto o un complejo compuesto-trímero puede ser determinada por un médico experto. Los niveles de dosificación reales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden variar de manera de obtener una cantidad del principio activo que sea eficaz para conseguir la respuesta terapéutica deseada para un paciente, una composición y un modo de administración particulares, sin que sea tóxico para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una diversidad de factores farmacocinéticos incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente divulgación empleadas, la vía de administración, el momento de administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se está empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, afección, estado de salud general e historial médico previo del paciente que se está tratando, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.
Una dosis adecuada puede ser, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 0,01 pg/kg a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal, normalmente de aproximadamente 0,1 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, del paciente que se ha de tratar. Por ejemplo, una dosificación adecuada puede ser de aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por día o de aproximadamente 10 pg/kg a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal por día.
Pueden ajustarse las pautas posológicas para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse una única dosis, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. La forma farmacéutica unitaria como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente individuales adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos que han de tratarse; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico necesario.
La administración puede ser en dosis únicas o múltiples. Pueden administrarse dosis múltiples a través de las mismas o diferentes vías y en el mismo o diferentes lugares. Como alternativa, las dosis pueden ser a través de una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia pueden variar dependiendo de la semivida del antagonista en el paciente y la duración del tratamiento deseado.
Como se ha mencionado anteriormente, pueden coadministrarse compuestos o complejos compuesto-trímero con uno o más agentes terapéuticos. Por ejemplo, el otro agente puede ser un agente analgésico, anestésico, inmunosupresor o antiinflamatorio.
La administración combinada de dos o más agentes puede conseguirse de varias maneras diferentes. Ambos pueden administrarse juntos en una sola composición, o pueden administrarse en composiciones separadas como parte de una terapia combinada. Por ejemplo, uno puede administrarse antes, después o simultáneamente con el otro.
Los siguientes Ejemplos ilustran la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1(A) - Síntesis de los compuestos de las fórmulas (1), (2), (3) y (4)
La síntesis del compuesto (1)
Figure imgf000016_0002
desvela en
Figure imgf000016_0001
documento WO 2013/186229 (Ejemplo 490). La síntesis del compuesto (2)
Figure imgf000016_0003
desvela en
Figure imgf000016_0004
documento WO 2013/186229 (Ejemplo 2). La síntesis del compuesto (3)
Figure imgf000016_0006
desvela en
Figure imgf000016_0005
documento WO 2014/009295 (Ejemplo 4). La síntesis del compuesto (4)
Figure imgf000016_0007
desvela en
Figure imgf000016_0008
documento WO 2013/186229 (Ejemplo 89). Ejemplo 1(B) - Síntesis del compuesto de fórmula (5).
Nomenclatura
Los compuestos se nombraron con la ayuda de ACD/Name Batch (Network) ver. 12.0 o Accelyrs Draw 4.0 Abreviaturas
DCM: Diclorometano EtOAc: Acetato de etilo
DMF: N,N-Dimetilformamida MeOH: Metanol
DMSO: Dimetilsulfóxido SiO2: Sílice
Et2O: Dietil éter h: Hora
THF: Tetrahidrofurano TR: tiempo de retención
t.a.: Temperatura ambiente MeCN: Acetonitrilo
a.: Ancho M: Masa
Salmuera: Solución acuosa saturada de cloruro de sodio
HPLC: Cromatografía líquida de alto rendimiento
CLEM: Cromatografía líquida Espectrometría de masas
IEN+: Ionización positiva por electronebulización
TEA: Trietilamina
CCF: cromatografía de capa fina
Condiciones analíticas
Todas las RMN se obtuvieron a 300 MHz o 400 MHz.
Todas las reacciones que implican reactivos sensibles al aire o la humedad se realizaron en una atmósfera de nitrógeno usando disolventes y materiales de vidrio secados.
Todos los datos de CLEM de los compuestos se determinaron usando el método a continuación.
Método 1:
Waters Acquity-SQD, Waters Acquity UPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, columna de 1,7 pm
Fase móvil A: Formiato de amonio 10 mM 0,1 % de amoniaco
Fase móvil B: 95 % de MeCN 5 % de H2O 0,1 % de amoníaco
Programa de gradiente (Caudal 1,0 ml/min, Temperatura de columna 40 °C):
Tiempo % de A % de B
0.00 95 5
0.50 95 5
1.75 5 95
2.00 5 95
2.25 95 5
Será evidente para un experto en la materia que pueden obtenerse tiempos de retención (TR) diferentes para datos de CLEM si se usan condiciones analíticas diferentes.
Las rotaciones ópticas se midieron usando un polarímetro Optical Activity PolAAR 2001.
INTERMEDIO 1
Figure imgf000017_0001
(6-Bromo-7-fluoro-2-metilimidazo[1.2-a1piridin-3-il)[2-(difluorometoxi)fenil1-metanol - Enantiómero A
El compuesto de título racémico se preparó siguiendo el procedimiento descrito en la solicitud de patente WO 2014/009295. La mezcla racémica preparada de este modo se separó en los enantiómeros constitutivos mediante cromatografía quiral como se detalla a continuación:
El compuesto del título se aisló mediante purificación de (6-Bromo-7-fluoro-2-metilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)[2-(difluorometoxi)fenil]-metanol racémico en condiciones LC en Chiralpak AD (100*500 mm*mm, flujo 300 ml/min. 30 °C, 2-PrOH/heptano 1/9. inyección de 230 ml de solución a una concentración de 7.5 g/l). Se recogió el primer enantiómero en eluir (TR 27 min) y se evaporaron las fracciones para producir enantiómero A. [a] - 12.8°. Se recogió el segundo enantiómero en eluir (TR 50 min) y se evaporaron las fracciones para producir enantiómero B. [a] 12.7°
INTERMEDIO 2
Figure imgf000017_0002
3-(trifluoromet¡l)azet¡d¡n-3-ol
A una solución de 1-boc-3-azetidinona (11.3 g. 58.4 mmol.) y (trifluorometil)trimetilsilano (9.22 g. 64.3 mmol) en THF (100 ml) enfriada a ~-5 °C en un baño de hielo/salmuera se le añadió fluoruro de cesio (9.77 g. 64.3 mmol) en porciones. La mezcla resultante se dejó en agitación a t.a.. el análisis por CCF después de 4 horas indicó el consumo total del material de partida y un componente menos polar. La reacción se interrumpió mediante la adición de una solución acuosa saturada de cloruro de amonio (100 ml) y la fase acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml). La fase orgánica se separó. se secó sobre sulfato sódico. se filtró y los extractos volátiles se retiraron al vacío para proporcionar un aceite en bruto. El aceite obtenido de este modo se disolvió en DCM (100 ml) y se añadió ácido trifluoroacético (40 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 h. Los extractos volátiles se retiraron al vacío y el residuo se destiló azeotrópicamente con tolueno (3 x 150 ml) para proporcionar la sal trifluoroacetato del compuesto del título en forma de un sólido de color pardo (15 g). RMN de 1H (400 MHz. d6 DMSO): 5/ppm 9.48 (s. 2H). 7.95 (d. J 0.3 Hz.
1H). 4.28 (d. J 13.1 Hz. 2H). 4.06 (m. 2H).
El compuesto obtenido de este modo se usó en la reacción posterior sin purificación adicional.
INTERMEDIO 3
Figure imgf000018_0001
1-[5-(4.4.5.5-tetramet¡l-1.3.2-d¡oxaborolan-2-¡l)p¡r¡m¡d¡n-2-¡l1-3-(tr¡fluoromet¡l)azet¡d¡n-3-ol
A una soluc¡ón de Intermed¡o 2 (12 g) en aceton¡tr¡lo (150 ml) se le añad¡eron TEA (30 ml) y 2-cloro-5-(4.4.5.5-tetramet¡l-1.3.2-d¡oxaborolan-2-¡l)p¡r¡m¡d¡na (16 g) y la reacc¡ón se ag¡tó a 65 °C durante 18 h. Los d¡solventes se ret¡raron al vacío y el res¡duo sól¡do se tr¡turó y se lavó con agua dest¡lada para proporc¡onar un sól¡do de color be¡ge y se secó a alto vacío para proporc¡onar el compuesto del título en forma de un sól¡do de color be¡ge (18.5 g). RMN de 1H (300 MHz. d6 DMSO): 8/ppm 8.53 (2H. s). 7.46 (1H. s). 4.33-4.31 (2H. m). 4.10-4.08 (2H. m). 1.29 (12H. s). CLEM (EN+). TR 1.14 m¡n. 346.0 (M+H)+.
COMPUESTO (5)
Figure imgf000018_0002
1-[5-[3-[(S)-[2-(d¡fluorometox¡)fen¡l1-h¡drox¡-met¡l1-7-fluoro-2-met¡l-¡m¡dazo[1.2-a1p¡r¡d¡n-6-¡l1p¡r¡m¡d¡na-2-¡l1-3-(tr¡fluoromet¡l)azet¡d¡n-3-ol (enantiómero A)
Una mezcla de Intermedio 1 (0.7 g. 2 mmol). Intermedio 3 (0.7 g. 2 mmol). complejo de d¡cloruro de 1.1'-b¡s(d¡fen¡lfosf¡no)ferroceno-palad¡o (II) d¡clorometano (36 mg. 0.044 mmol) y carbonato de sod¡o 2 M (2 ml) en d¡oxano (12 ml) se desgas¡f¡có y se somet¡ó a reflujo durante 3 h. La mezcla de reacc¡ón enfr¡ada se d¡luyó con EtOAc y se lavó dos veces con salmuera. la capa orgán¡ca se secó (MgSO4) y se concentró al vacío. El res¡duo se somet¡ó a cromatografía en columna ultrarráp¡da (S¡O2.0-90 % de EtOAc/heptano). produc¡endo el compuesto del título en forma de un sól¡do de color crema (500 mg. 50 %). RMN de 1H (300 MHz. DMSO-d6): 88.51 (m. 3 H). 7.95 (dd. J 12.3 Hz. J26.7 Hz. 1H). 7.46 (m. 2H). 7.36 (m. 2H). 7.12 (m. 2H). 6.42 (d. J 4.4 Hz. 1H). 6.18 (d. J 4.4 Hz. 1H). 4.35 (m. 2H).
4.13 (d, J 10.2 Hz. 2H). 2.12 (s. 3 H). CLEM (EN+). TR 1.34 m¡n. 540.0 (M+H)+. [a1 39.7°.
Ejemplo 2 - Cromatografía analítica de exclusión por tamaño (CET) de complejos TNFa/TNFR1/compuesto
Se usó cromatografía de exclus¡ón por tamaño para determ¡nar el número de receptores TNFR1 un¡dos a TNFa en ausenc¡a o presenc¡a de d¡ferentes compuestos. El compuesto (2) se somet¡ó a ensayo en las cond¡c¡ones que se descr¡ben en el protocolo 1 a cont¡nuac¡ón. El compuesto (5) se somet¡ó a ensayo como se descr¡be en el protocolo 2.
Protocolo 1
Se añad¡ó compuesto (2) a 300 pM de trímero de TNFa fus¡onado en un ¡ntervalo de concentrac¡ones f¡nal de 90 pM a 690 pM de compuesto con la concentrac¡ón de DMSO manten¡da constante al 1.0 %. La muestra de TNFa y el compuesto se ¡ncubaron durante la noche a una temperatura de 4 °C.
Se añad¡ó receptor a una concentrac¡ón f¡nal de 240 pM (3.2 veces en exceso sobre los trímeros) al complejo compuesto-trímero 75 pM preparado como se ha descr¡to anter¡ormente. La concentrac¡ón f¡nal de DMSO fue del 0.25 %. La mezcla se ¡ncubó durante 1 hora a 22 °C.
Las cond¡c¡ones para la exclus¡ón por tamaño analít¡ca usando HPLC fueron las s¡gu¡entes: volumen de ¡nyecc¡ón: 50 |jl; TSK G3000SW L * D.I. columna de 30 cm x 7,5 mm, tamaño de partícula de 10 |jm; tampón de HEPES 10 mM, pH 7,5, NaCI 150 mM. Para las proteínas, una única cadena polipeptídica de TNFa humano trimérico compuesto por restos de TNFa humano V77-L233 seguidos de dos repeticiones adicionales de restos de TNFa humano D86-L233 unidos entre sí por Ser-Gly-Ser (secuencia basada en UniProt P10375). El TNFR1 humano (V43-N184)(N54D, C182S) estaba basado en la secuencia P19438 (UniProt).
Los resultados se presentan en la Figura 5. En la figura, los números 1 - 3 se refieren al número de receptores unidos a trímeros de TNFa. Como se muestra en esta Figura, la adición de concentraciones crecientes de compuesto (2) dio como resultado que el número de receptores unidos se redujese de tres en promedio por cada trímero a dos en promedio por cada trímero. En particular, a bajas concentraciones del compuesto (90 jM), se observa un pico que muestra la unión de tres receptores por cada trímero (con un ligero hombro para la unión de dos receptores por cada trímero). A una concentración en exceso del compuesto (690 jM ) el pico predominante corresponde a la unión de dos receptores por cada trímero, con un ligero hombro que corresponde a un pico para la unión de tres receptores por cada trímero. Por tanto, a esta concentración del compuesto, la mayoría de los complejos de trímero y compuesto se unen a dos receptores.
En un experimento separado para observar la migración esperada de uno, dos y tres receptores unidos a TNFa, se añadió al TNFa un intervalo de concentraciones de TNFR1 (1,2, 2,2, 3,2 y 5 veces en exceso con respecto a la concentración de trímero de TNFa). Los resultados se presentan en la Figura 6. Como se muestra en esta Figura, el aumento de la concentración de receptores aumenta el peso molecular del complejo (se desplaza hacia la izquierda), lo que sugiere que el número de receptores que se unen por cada trímero se desplaza desde uno, hasta tres. Tres receptores ocupan al máximo el trímero de TNFa puesto que el aumento de la concentración de TNFR1 no tiene ningún efecto adicional.
Protocolo 2
Se añadió compuesto (5) a 20 jM de trímero de TNFa a una concentración final de 200 jM (relación de 1:10 trímeros:compuesto) con la concentración de DMSO mantenida constante al 2,0 %. La muestra de TNFa y compuesto se incubó durante la noche a una temperatura de 4 °C. Se añadieron receptores a una concentración final de 35 jM a complejo trímero-compuesto 10 jM (3,5 veces en exceso de los receptores sobre el complejo trímero-compuesto). La concentración final de DMSO fue del 1,0 %. La mezcla se incubó durante 1 hora a 22 °C.
Las condiciones para la exclusión por tamaño analítica usando HPLC fueron como se indican a continuación: volumen de inyección: 50 jl; Superdex 200HR 10/300, L * D.I. columna de 30 cm x 10 mm, tamaño de partícula de 13-15 jm ; y un tampón de He Pe S 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM.
El TNFa era una única cadena polipeptídica de TNFa humano trimérico compuesto por restos de TNFa humano V77-L233 seguidos de dos repeticiones adicionales de restos de TNFa humano D86-L233 unidos entre sí por Ser-Gly-Ser (las secuencias se basan en UniProt P10375). El TNFR1 humano era (V43-N184)(N54D, C182S) basado en la secuencia UniProt P19438.
Para establecer marcadores para la migración esperada de uno, dos y tres receptores unidos a TNFa, se añadieron mutantes puntuales de TNFa humano que interrumpían las interacciones en uno, dos y tres sitios de unión de receptores a 3,5x receptores (un exceso de 3,5 de receptores con respecto a trímeros) en tampón que contenía la misma concentración final de DMSO al 1,0 %.
La Figura 7 muestra una superposición del trazo del compuesto (5) con el trazo del control que demuestra que el TNFa mutado se une a 1, 2 y 3 receptores. En comparación con el compuesto (2), el pico que contenía compuesto (5) se había acercado más a 1 receptor unido.
Ejemplo 3 - Cristalografía que muestra el complejo ternario de TNFa murino-TNFRI-compuesto (1)
La forma soluble de TNFa de ratón (VC 6535, UniProt P06804) se expresó como una proteína de fusión en E. coli y tiene la secuencia final:
D K P V A H V V A N H Q V E E Q L E W L S Q R A N A L L A N G M D L K D N Q L V V P A D G L Y L V Y S Q V L
F K G Q G C P D Y V L L T H T V SR F A IS Y Q E K V N L L S A V K S P C P K D T P E G A E L K P W Y E P IY L G
G V F Q L E K G D Q L S A E V N L P K Y L D F A E S G Q V Y F G V IA L (SE Q ID N O :l) .
Las células se precultivaron a 37 °C en medios ricos, inducidas con la adición de arabinosa al 0,1 % y se permitió la expresión durante la noche a 25 °C en vector pEMB54. Este vector introduce un His6Smt-marcador N-terminal escindible. Las células se lisaron y se purificaron mediante cromatografía de quelato Ni-NTA. La proteína de fusión se eluyó con tampón que contenía imidazol y se escindió mediante la adición de proteasa. La proteína de TNFa final escindida se purificó mediante una etapa de cromatografía de quelato de Ni sustractiva para retirar el marcador de fusión y se purificó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño para retirar las impurezas restantes. El producto de TNFa final se concentró a 20,5 mg/ml y se congeló ultrarrápido en nitrógeno líquido.
El dominio extracelular de TNFR1 humano (VC 5602, UniProt P19438) se expresó como una proteína secretada en células de insectos infectadas por baculovirus y tiene la secuencia final:
GSVCPQGKYIHPQDNSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGQDTDCRECESGSFT
ASENHFRHCFSCSKCRKEMGQVEISSCTVDRDTVCGCRKNQYRHYWSENF
FQCFNCSLCLNGTVHLSCQEKQNTVCTCHAGFFLRENECVSSSN (SEQ ID NO: 2)
El plásmido de proteína de fusión se clonó en el vector de expresión pEMB50, que codifica una señal de secreción N-terminal escindible y proteína de fusión marcada con His. Se generó virus usando el sistema de expresión de baculovirus. Las células de insecto infectadas secretaron la proteína de fusión en el medio. La proteína de fusión se purificó mediante cromatografía de quelato Ni-NTA y eluyó de la columna de Ni usando un gradiente de imidazol. La proteína eluida se escindió con proteasa para liberar el marcador de His-fusión N-terminal. El TNFR1 escindido se purificó posteriormente mediante una etapa de cromatografía sustractiva de quelato de Ni y se purificó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño. El producto de TNFR final se concentró a 8,8 mg/ml y se congeló ultrarrápido en nitrógeno líquido.
Se incubó TNFa de ratón purificado (20,5 mg/ml, VC 6535) con compuesto (1) (100 mM en DMSO) en 6 molar en exceso a 37 °C durante 3 horas, seguido de incubación durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se añadió TNFR1 humano (8,8 mg/ml, VC 5602) para una relación molar final de 3 monómeros de TNFa (equivalente a 1 trímero):3 receptores TNFR1. El complejo ternario (citocina, ligando, receptor) se incubó durante 1 hora antes de cargarlo en la columna de exclusión por tamaño Superdex 200 (23 ml) que se preequilibró con HEPES 10 mM pH 7,5, NaCl 150 mM. El complejo ternario purificado final se concentró a 18,5 mg/ml y se usó inmediatamente en ensayos de cristalización.
El complejo ternario se cristalizó mediante difusión de vapor de gota sedente mezclando 0,5 pl de complejo con 0,5 pl de tartrato de sodio y potasio 800 mM, PEG5000 MME al 0,5 %, Tris 100 mM pH 8,5 sobre 100 pl de la misma solución de cristalización. Se recogieron cristales para la recopilación de datos aproximadamente 2 meses después de la preparación inicial. Se empaparon brevemente en aceite de parafina y se congelaron directamente en nitrógeno líquido para la recogida de datos el 17/08/2012 en Argonne Photon Source, línea de haz 21-IDF.
La estructura del complejo de TNFa de ratón (VC 6535) y TNFR humano (VC 5602) con compuesto (1) se resolvió mediante reemplazo molecular usando Phaser con modelos de entrada basados en una estructura de TNFa humano en forma de complejo. Los datos se integraron en XDS y se escalaron usando SCALA. La determinación inicial de la estructura y el refinamiento usaron datos a 3,15 A de resolución de un solo cristal. La construcción de modelos manuales iterativos usando Coot (Emsley, P. y Cowtan, K. 2004. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. Dic; 60 (Pt 12 Pt 1): 2126-32. PMID: 15572765) y en Refmac (Murshudov, G.N., Vagin, A.A. y Dodson, E.J. 1997. Refinement o f macromolecular structures by the maximum-likelihood method. 1 de Mayo; 53 (Pt3): 240-55. PMID: 15299926) continuó hasta que R y Rubre alcanzaron R = 0,222, Rnbre= 0,272. La calidad del modelo se validó usando Coot y MolProbity (Lovell, S.C., Davis, I.W., Arendall W.B., de Bakker, P.I., Word, J.M., Prisant, M. G., Richardson, J.S. y Richardson, D.C. 2003. Structure validation by Dalpha geometry: phi, psi and Cbeta deviation. Proteins. 15 de febrero; 50(3): 437-50. PMID: 12557186). En la Tabla 1 se enumeran las estadísticas finales de procesamiento y perfeccionamiento de datos.
Tabla 1: Recogida de datos y estadísticas de perfeccionamiento.
Recogida de datos Conjunto de datos 1
Identificación de cristal 234879c07
Línea de haz APS 21-IDF
Fecha de recogida 17/08/2012
Ancho de oscilación (°)
Figure imgf000020_0001
1,0
Marcos 60
Exposición (s) 3
Distancia (mm) 300
Longitud de onda (A) 0,97872
Procesamiento de datos (cubierta externa)
Figure imgf000020_0002
Grupo espacial P 41212
Célula unitaria (A, °)
Figure imgf000020_0003
a=b=133,577, c=141,445; a=P=Y=90
Resolución (A) 3,15
I/a 8,3 (1,8)
Completitud (%) 99,9 (100)
Mirp 0,095 (0,45)
(continuación)
Recogida de datos Conjunto de datos 1
Rcombinación (%) 0,19 (0,90)
Reflexiones (únicas) 18.167 (1.314)
Figure imgf000021_0001
Multiplicidad 4,8 (5,0)
Estadísticas de perfeccionamiento
Rtrabajo/Rlibre global 22,2/27,2
Enlaces RMSD (A) 0,011
ángulos RMSD (°) 1,222
Valores atípicos de Ramachandran (%) 0,9
Ramachandran favorecido (%) 95,9
Puntuación de MolProbity 1,91; Percentil 100*
(N=2048, 3,15Á ± 0,25Á)
Revisado por pares por: David Fox
* El percentil 100 es el mejor entre las estructuras de resolución comparable; el percentil 0 es el peor.
Las estructuras cristalinas, como se presentan en la Figura 8A-D, muestran dos receptores unidos por cada complejo trímero-compuesto.
Ejemplo 4 - TNFa - TNFR1 TERF-RT
Se desarrolló un ensayo homogéneo de Transferencia de Energía de Resonancia Fluorescente Resuelta en el Tiempo (TERF-RT) para medir la reducción mediada por compuesto en la unión del Receptor 1 del TNF (dominio extracelular (ECD) de TNFR1) a un trímero de TNFa fusionado.
La estreptavidina marcada con terbio, en complejo con un trímero de TNFa fusionado biotinilado, formaron la porción donadora del par de TERF. Se usó TNFR1 (ECD) conjugado con Alexa Fluor 488 (AF488) como aceptor de TERF.
T l 2 n r i n r ín m r r r n TERF
Figure imgf000021_0002
Cada una de las proteínas marcadas se diluyó hasta una concentración final de ensayo de 7,5 nM (una relación de concentración 1:1 de monómeros de TNF:receptores) en una solución tampón (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,05 %, pH 7,2). Se sometieron a ensayo compuestos en una titulación de 10 puntos con una dilución de tres veces. La concentración de compuesto máxima en el ensayo final fue de 25 pM. La concentración final de DMSO del ensayo fue del 5 % en volumen.
Después de incubar durante veinte horas la placa se leyó usando un lector de placas LJL Analyst. Las muestras se excitaron a 330 nm y se tomaron lecturas de fluorescencia a 495 nm y 520 nm, las longitudes de onda de emisión del donador Terbio y del aceptador AF488, respectivamente. Se calculó una relación de TERF dividiendo los recuentos de aceptor por los recuentos de donador y multiplicando por 10.000.
En ausencia de una molécula interferente TNFR1 formará un complejo con el trímero de TNFa fusionado generando una señal de TERF. Una molécula interferente impedirá que el t Nf R1 se una y posteriormente inhibirá la señal de TERF.
La inhibición de TERF puede ser completa o parcial, por lo que hay una reducción del TNFR1 (ECD) unido, lo que indica una reducción de la estequiometría TNFa-TNFR1 (ECD). La inhibición completa mediante un anticuerpo es del 100 %.
Las Figuras 9 y 10 representan una inhibición parcial observada con el compuesto (3) y el compuesto (4). A la concentración más alta del compuesto, la inhibición máxima es del 29 % y el 36 %, respectivamente. Esto corresponde a una inhibición promedio de una de las tres posibles uniones de receptor (se espera que sea del 33 %)
Ejemplo 5 - Análisis de estequiometría de unión de receptores del TNF mediante espectrometría de masas de movilidad iónica
Se desalinizó TNFa humano y el tampón se cambió por acetato de amonio 20 mM, pH 7,4 antes de su uso. Una combinación de columnas de espín de Zeba (Thermo-Fisher, 7 kDa PML) seguida de microdiálisis (mini unidades de diálisis Thermo slide-a-lyzer, 10 kDa PML) garantizó que la proteína se desalinizara totalmente y produjera señales bien resueltas mediante espectrometría de masas nativa. Se añadió TNFa (20 j M) 1:1 (v:v) con un inhibidor de TNFa de molécula pequeña (compuesto (3)), 200 j M, DMSO al 2 %. El compuesto se diluyó a partir de una solución madre de DMSO 10 mM usando acetato de amonio 20 mM, pH 7,4). También se preparó un control solo de DMSO en el que se añadió TNFa (20 j M) 1:1 (v:v) con tampón (20 mM, acetato de amonio, pH 7,4, DMSO al 2 %). Ambas soluciones se incubaron a temperatura ambiente durante la noche, después de lo cual la muestra que contenía moléculas pequeñas se analizó mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo no covalente (Waters LCT Premier, equipado con fuente Advion TriVersa NanoMate) para confirmar que el TNFa estaba totalmente unido.
Se preparó TNFR1 humano (restos 41-184, C182S, desglicosilado) para el análisis por EM nativa mediante cambio de tampón en acetato de amonio 20 mM, pH 7,4 usando una columna de espín de Zeba (Thermo-Fisher, 7 kDa PML). Se añadió receptor 1:1 (v:v) a alícuotas de las muestras de TNFa preparadas anteriormente, para proporcionar tres muestras por cada experimento que contenían TNFR 5, 10 y 23 j M (la concentración final TNFa en cada muestra era 5 j M). Las muestras se incubaron durante 2 horas y se analizaron mediante espectrometría de masas de movilidad iónica (espectrómetro de masas Waters Synapt G2 Q-TOF, equipado con fuente Advion TriVersa NanoMate).
La estequiometría de receptores puede determinarse únicamente mediante espectrometría de masas debido a las importantes diferencias de masa que se obtienen cuando se unen 1, 2 o 3 receptores a TNFa. Sin embargo, hay problemas debido a la superposición de los estados de carga en la escala de masa a carga (m/z) utilizada, por ejemplo, el mismo valor de m/z de 2000 se obtendría de un analito (PM 20.000 Da) con 20 cargas, que de un analito (PM 32.000) con 16 cargas. Por tanto, la espectrometría de masas de movilidad iónica es necesaria para estos experimentos debido al grado extra de separación obtenido mediante la medición tanto del "tiempo de deriva" como de la masa a carga. El tiempo de deriva de un analito depende de su masa, carga y conformación, y se mide como el tiempo que tarda cada analito en atravesar una célula de movilidad llena de gas dentro del espectrómetro. Los gráficos bidimensionales resultantes de m/z frente a tiempo de deriva permiten una asignación inequívoca de la estequiometría de receptores.
En el experimento de control, cuando el exceso molar de TNFR añadido era superior al triple de la concentración de TNFa, se observó que se unían tres receptores por cada trímero de TNFa. En presencia de un inhibidor de TNFa de molécula pequeña tal como el compuesto (3), la estequiometría de los receptores se redujo y predominantemente se unieron dos receptores por cada trímero de TNFa (véase la Figura 11).
Ejemplo 6 - Análisis por espectrometría de masas que mide los efectos del compuesto (3) sobre la afinidad de TNFR1 por TNFa
Solución madre de compuesto:
2 j l de solución madre de DMSO 10 mM, más 2 j l de DMSO se añadieron a 96 j l de tampón de acetato de amonio 20 mM para proporcionar 100 j l de compuesto 200 j M (3), DMSO al 4 %.
Soluciones madre de proteína:
Se desalinizó TNF usando 2x columna de Zeba seguido de diálisis en acetato de amonio 20 mM pH 7,4. Se desalinizó TNFR usando 2x columna de Zeba seguido de diálisis en acetato de amonio 20 mM pH 7,4. Se tomó una medición A280 para confirmar la concentración final de muestras de proteína.
Se añadieron compuestos 1:1 (v:v) al TNF (40 j M) y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente. (Concentración final de DMSO = 2 %)
También se preparó una muestra de control de DMSO solamente.
Para cada muestra, se añadieron 5 j l de TNF más compuesto o TNF más DMSO solamente a 5 j l de TNFR en cada concentración especificada. La [TNF] final fue de 5 j M.
Las muestras se incubaron con TNFR durante 2 horas antes del análisis.
Se titularon soluciones que contenían hTNFa 5000 nM y hTNFa 5000 nM en presencia de compuesto (3) con hTNFR1 (dominio extracelular que comprendía los restos 41 a 184) en el intervalo de concentraciones de 1000, 2000, 4000, 6000, 8000, 10000 y 23000 nM.
Se realizó un análisis del espectro de masas de movilidad iónica en el instrumento Advion Nanomate - Waters Synapt G2. Se utilizaron los siguientes parámetros del instrumento.
Cono = 50 V
Temp. de la fuente = 20 °C
Energía de colisión de trampa/transferencia = apagado
Flujo de gas de trampa = 0,4 ml/min
Célula de helio = 180 ml/min,
EMI (N2) = 90 ml/min
Sesgo de CC de la trampa = 40 V
Liberación manual de la trampa de movilidad - no activada
Retraso de la onda de EMI = 450 us
Velocidad de la onda de EMI = 750 m/s
Altura de la onda de EMI = 40 V
Soporte = 6,21 hPa (6,21 mbar)
trampa 2,05e-2 hPa (2,05e-2 mbar)
EMI 3,47 hPa (3,47 mbar)
TDV 1,2e-6 hPa (1,2e-6 mbar)
Perfil cuádruple:
4000, 5000, 6000 (permanencia 30, rampa 30)
Intervalo 500-8000
Los datos se analizaron extrayendo los espectros de masa para cada especie con el software Driftscope. Los espectros resultantes se suavizaron (50/5) y las alturas de pico se sumaron sobre todos los estados de carga.
Se midieron los recuentos de iones de los picos correspondientes a las especies TNF (sin receptor unido), TNF+1R (un receptor unido), TNF+2R (dos receptores unidos) y TNF+3R (tres receptores unidos). Los recuentos de iones normalizados se calcularon como la fracción de iones de cada especie dividida por la cantidad total de iones contados. Estos valores se usaron como equivalentes a la fracción molar de cada especie en equilibrio. Los datos de los dos experimentos se resumen en las tablas a continuación:
Tabla 3:
Figure imgf000023_0002
Tabla 4:
Figure imgf000023_0001
Con el fin de obtener constantes de equilibrio a partir de estos datos, el sistema en equilibrio se representó mediante las transformaciones:
TNF R <--- K -- 1 -> TNF+1R
K2
TNF+1R R «------- > TNF+2R
K3
TNF+2R R <------- > TNF+3R
Para calcular el conjunto de constantes de disociación K1, K2 y K3 de acuerdo con los datos de espectrometría de masas nativa, se obtuvieron valores de K1, K2, K3 que producían fracciones molares de las especies TNF, TNF+1R, TNF+2R y TNF+3R más cercanas a las fracciones molares medidas de esas especies mediante la minimización de la función:
Error (K1,K2,K3)
ZTO.Rmáx
, [( f r N F calc - Í T N Fobs)2 í f T N F l R calc ~ f T N F l R o bsY TO.Rm.rn
+ (fTNF+2Rcaic ÍTNF 2Robs) ¿ + (.Ít NF 3Rcaic Í t NF+3Robs) 2 ] t 0, R
donde T0 representa la cantidad inicial de TNF y Rmín, R, Rmáx representan la concentración inicial del receptor R sometido a ensayo comenzando por Rmín y terminando en Rmáx. Las fracciones fobs son las fracciones molares de las especies TNF, TNF+1R, TNF+2R y TNF+3R observadas en equilibrio (por ejemplo, frNFobs) mediante mediciones de espectrometría de masas nativa. fcatc son las fracciones molares de cada especie (por ejemplo, frNFcatc) calculadas resolviendo las ecuaciones de equilibrio usando la herramienta de modelización BioNetGen BNGL (Blinov, M. L., Faeder, J. R., Goldstein, B. y Hlavacek, W. S. (2004) BioNetGen: software for rule-based modeling o f signal transduction based on the interactions o f molecular domains. Bioinformatics 20, 3289-3291) y tomando como entrada los valores de T0, R0 y K1, K2 y K3. La función de error se minimizó usando la utilidad de minimización de fuerza bruta implementada en el marco de SciPy/NumPy (http://docs.scipy.org/doc/numpy/index.html). Todo el análisis de procesamiento de datos se implementó en el lenguaje de programación Python (https://www.python.org/) llamando rutinas de BioNetGen cuando fue necesario.
Después del análisis de datos, se calcularon tres constantes de equilibrio (K1, K2 y K3) correspondientes a los tres eventos de unión de receptores para las mezclas de TNF y receptor con y sin compuesto (3). Los datos se visualizaron trazando en el eje "Y" las fracciones molares de todas las especies en equilibrio y en el eje "X", la concentración de receptor añadida a una concentración inicial fija de TNF. Los símbolos representan las fracciones molares observadas de las especies medidas en el experimento de espectrometría de masas nativa y los trazos corresponden a las concentraciones esperadas calculadas a partir de las constantes de equilibrio K1, K2 y K3. Estos gráficos se presentan en las Figuras 12 y 13.
Tabla 5:
Figure imgf000024_0001
Ejemplo 7 - Compuestos y complejos de Ma et al (2014) y Silvian et al (2011) tienen características diferentes a las de la presente divulgación
Como se describe en la página 12458 de Ma et al. (2014) JBC 289: 12457-12466, se descubrió C87 a través de cribado virtual intentando encontrar moléculas que se ajustasen al espacio ocupado por un péptido de 7 aminoácidos del bucle2/dominio2 del TNFR1 en su interacción con la superficie externa de TNFp. El compuesto C87 de Ma et al. y el compuesto BIO8898 de Silvian et al. (2011) ACS Chemical Biology 6: 636-647 fueron sometidos a ensayo por los presentes inventores.
Sumario de los hallazgos
Las observaciones de Biacore descritas en Ma et al. para C87 no pudieron repetirse.
No se observaron pruebas de inhibición específica del TNF en las células.
Adicionalmente, no se observó que C87 se uniese mediante espectrometría de masas, que es sensible a afinidades milimolares.
Ensayos de cristalografía exhaustivos solo produjeron apo-TNF (TNF sin compuesto).
En el ensayo de polarización de fluorescencia (PF), C87 no mostró ninguna inhibición significativa por encima del nivel de interferencia del compuesto con la lectura fluorescente.
El termoflúor, que mide la estabilización de la temperatura de fusión térmica de TNFa, mostró una pequeña estabilización para C87.
En resumen, no se descubrió evidencia de que C87 se uniese en el centro del trímero. La abrumadora mayoría de los datos sugirió que no había interacción directa con TNFa. También se encontró que BIO8898 no se unía a TNFa.
Células - Ensayo de gen indicador HEK NFKB inducido por TNF
Se preincubó C87 con TNFa durante 1 hora antes de la adición a células HEK-293 transfectadas de forma estable con SEAp con el control de NFkB. También se sometió a ensayo un contra-cribado apropiado con el fin de detectar actividad no relacionada con TNF (fuera de la diana). El ensayo se incubó durante la noche antes de que se midiera la inhibición en comparación con el bloqueo del 100 % mediante un compuesto de control. La concentración máxima de C87 fue de 10.000 nM, con una dilución triple en serie.
No se pudo detectar ningún efecto inhibidor que no pudiera atribuirse a la actividad fuera de la diana.
Biacore
Se inmovilizó TNF usando un enlazador avi-marcador y se hizo pasar C87 por encima del chip. En un experimento, se realizó una respuesta a la dosis de C87 a partir de una concentración máxima de 10 pM. No se observó ninguna unión.
En un segundo experimento, el caudal de C87 que pasaba sobre el chip se redujo. Se observó un pequeño desplazamiento, pero la unión global fue insignificante.
Es probable que la unión de C87 al TNF descrita en Ma et al sea súper estequiométrica basándose en el valor de UR en el eje Y. A la densidad convencional de TNF en el chip este valor estaba en la región de treinta veces más alto de lo esperado para la unión simple 1:1.
En otro experimento, Se sometió a ensayo BIO8898 frente a la forma soluble inmovilizada de CD40L y la forma soluble de TNFa mediante RPS en una máquina Biacore 4000. Se determinó una media geométrica de Cl50 de 17 pM para la unión frente a CD40L, mientras que no se detectó ninguna unión a una concentración de hasta 100 pM para TNFa en este ensayo.
Espectrometría de masas
No hubo pruebas de que C87 se uniese al TNFa humano (20 pM) a una concentración de 400 pM. Una especie de menor peso molecular (~473 Da parece unirse a menos del 5 % de ocupación). C87 tiene un peso molecular de 503 Da. Basándose en la ocupación a una concentración de 400 pM, se predice una afinidad de las especies de bajo peso molecular superior a 1 mM.
Cristalografía
En general, se hizo un gran esfuerzo para cristalizar C87 con TNFa, incluyendo las condiciones de ensayo que habitualmente funcionan con compuestos que se describen en la presente solicitud. Esto comprendió el establecimiento de un gran número de ensayos de cristalización a diferentes concentraciones de ligandos, diferentes concentraciones de proteínas y diferentes tiempos de remojo. Se observaron algunos cristales que, en el análisis, resultaron ser sal o TNF sin ningún compuesto.
Polarización fluorescente (PF)
Se preincubó C87 con TNFa durante 1 hora antes de someterlo a ensayo frente al compuesto fluorescente (sonda). La competencia con el compuesto fluorescente, ya sea directamente (uniéndose en el mismo sitio) o indirectamente (alterando el TNF) se detecta mediante una reducción en la PF.
La extrapolación de la curva de inhibición produjo una CI50 de aproximadamente 100 pM. Se observó inactivación de la fluorescencia, sin embargo, a las concentraciones más altas de inhibidor que, cuando se restaron, dieron como resultado una inhibición insignificante de C87 en este ensayo.
Termoflúor
El termoflúor mide el cambio de temperatura de fusión (Tf) de TNFa debido a que el compuesto estabiliza o altera la proteína. Se observó un efecto de estabilización de 3,8 °C a una concentración de C87 500 pM, lo que sugiere la posibilidad de una unión débil, que puede no ser específica.
Listado de secuencias
SEQ ID NO: 1
DKPVAHWANHQVEEQLEWLSQRANALLANGMDLKDNQLVVPADGLYLVYSQVLFKGQGCPDYVLLTH TVSRFAISYQEKVNLLSAVKSPCPKDTPEGAELKPWYEPIYLGGVFQLEKGDQLSAEVNLPKYLDFAE SGQVYFGVIAL
SEQ ID NO: 2
GSVCPQGKYIHPQDNSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGQDTDCRECESGSFTASENHLRHCLSCSKCRKE MGQVEISSCTVDRDTVCGCRKNQYRHYWSENLFQCFNCSLCLNGTVHLSCQEKQNTVCTCHAGFFLRE NECVSSSN
SEQ ID NO: 3 (HCVR de 1974)
DVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSAYYMAWVRQAPTKGLEWVASINYDGANTFYRDSVKGRFTVSRDNA RSSLYLQMDSLRSEDTATYYCTTEAYGYNSNWFGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 4 (LCVR de 1974)
DIQMTQSPASLPASPEEIVTITCQASQDIGNWLSWYQQKPGKSPQLLIYGATSLADGVPSRFSASRSGTQYSLKI SRLQVEDFGIFYCLQGQSTPYTFGAGTKLELK
SEQ ID NO: 5 (1974 HC mIgG1 completa)
DVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSAYYMAWVRQAPTKGLEWVASINYDGANTFYRDSVKGRFTVSRDNA RSSLYLQMDSLRSEDTATYYCTTEAYGYNSNWFGYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLV KGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGC KPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVWDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRS VSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDI TVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
SEQ ID NO: 6 (1974 LC kappa completa)
DIQMTQSPASLPASPEEIVTITCQASQDIGNWLSWYQQKPGKSPQLLIYGATSLADGVPSRFSASRSGTQYSLKI SRLQVEDFGIFYCLQGQSTPYTFGAGTKLELKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASWCFLNNFYPKDINVKWKI DGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
SEQ ID NO: 7 (HCVR de 1979)
EVHLVESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITNSYWDWIRKFPGNKMEWMGYINYSGSTGYNPSLKSRISISRDTSN NQFFLQLNSITTEDTATYYCARGTYGYNAYHFDYWGRGVMVTVSS
SEQ ID NO: 8 (LCVR de 1979)
DIQMTQSPASLSASLEEIVTITCQASQDIGNWLSWYQQKPGKSPHLLIYGTTSLADGVPSRFSGSRSGTQYSLKI SGLQVADIGIYVCLQAYSTPFTFGSGTKLEIK
SEQ ID NO: 9 (HC mIgG1 de 1979 completa)
EVHLVESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITNSYWDWIRKFPGNKMEWMGYINYSGSTGYNPSLKSRISISRDTSN NQFFLQLNSITTEDTATYYCARGTYGYNAYHFDYWGRGVMVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVK GYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCK PCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVWDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSV SELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDIT VEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método de identificación de un compuesto que es capaz de unirse a una proteína trimérica que es un miembro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF) y modular la señalización de la proteína trimérica a través del receptor de la superfamilia del TNF necesario, comprendiendo el método determinar el número promedio de receptores unidos por cada complejo trímero-compuesto y, de este modo, identificar si el compuesto es capaz de modular la señalización a través del receptor.
2. El método de la reivindicación 1, que comprende determinar el número promedio de receptores unidos por cada complejo trímero-compuesto en comparación con un control.
3. El método de la reivindicación 2, en donde el control comprende trímeros de miembros de la superfamilia del TNF y los receptores necesarios en ausencia del compuesto, opcionalmente en donde una disminución en el número promedio de receptores unidos por cada complejo trímero-compuesto en comparación con el control identifica que el compuesto es capaz de modular la señalización a través del receptor.
4. El método de la reivindicación 2, en donde el control comprende trímeros de miembros de la superfamilia del TNF, los receptores necesarios y un compuesto que se sabe que modula la señalización de los trímeros a través de los receptores, opcionalmente en donde un número promedio equivalente de receptores unidos por cada complejo trímero-compuesto en comparación con el control, o una disminución del número promedio de receptores unidos por cada complejo trímero-compuesto en comparación con el control, identifica que el compuesto es capaz de modular la señalización a través del receptor.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el número promedio de receptores unidos por cada complejo trímero-compuesto se determina en una relación molar de entre 3:1 y 10:1 (receptores:trímeros).
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde se identifica que un compuesto es capaz de modular la señalización de la proteína trimérica a través del receptor si se determina que se une un promedio de menos de tres receptores por cada complejo trímero-compuesto.
7. El método de la reivindicación 6, en donde se identifica que un compuesto es capaz de modular la señalización de la proteína trimérica a través del receptor si se determina que se une un promedio de dos receptores por cada complejo trímero-compuesto.
8. El método de la reivindicación 6, en donde se identifica que un compuesto es capaz de modular la señalización de la proteína trimérica a través del receptor si se determina que se une un promedio de un receptor por cada complejo trímero-compuesto.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el número de receptores unidos por cada complejo trímero-compuesto se determina mediante:
(a) espectrometría de masas de movilidad iónica; y/o
(b) cromatografía de exclusión por tamaño; y/o
(c) un ensayo de agregación; y/o
(d) Transferencia de Energía de Resonancia Forster; y/o
(e) cristalografía.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el miembro de la superfamilia del TNF es TNFa y el receptor es un TNF-R.
11. Un compuesto de fórmula (5), o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptables del mismo:
Figure imgf000043_0001
12. Un complejo que comprende una proteína trimérica que es un miembro de la superfamilia del TNF y un compuesto como se define en la reivindicación 11.
13. Un compuesto como se define en la reivindicación 11 o un complejo como se define en la reivindicación 12 para su uso en un método de terapia del cuerpo humano o animal.
14. El compuesto o complejo para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el compuesto antagoniza la señalización inducida por el trímero a través del receptor, para su uso en el tratamiento y/o la prevención de trastornos autoinmunitarios e inflamatorios; trastornos neurológicos y neurodegenerativos; trastornos del dolor y nociceptivos; y trastornos cardiovasculares, opcionalmente en donde el compuesto o complejo se usa en el tratamiento y/o la prevención de artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, psoriasis, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y epilepsia.
15. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de la reivindicación 11, o el complejo de la reivindicación 12, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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