TWI774028B - 抗ａｌｋ２抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

此申請案係提供一種與ALK2蛋白質專一性結合，且具有經由ALK2的BMP訊息傳遞之抑制活性的抗體、該抗體之生產方法、以及含有該抗體的異位性骨化及/或骨發育不全、貧血、或瀰漫型內因性橋腦神經膠細胞瘤(diffuse intrinsic pontine glioma，DIPG)之治療及/或預防用醫藥組成物。

Description

抗ALK2抗體及其用途
本發明係關於有用於作為異位性骨化及/或骨發育不全之治療及/或預防藥的物質、以及異位性骨化及/或骨發育不全之治療及/或預防方法。
進行性肌肉骨化症(fibrodysplasia ossificans progressiva(FOP))係於骨骼肌、或肌腱、韌帶等通常不會形成骨組織的軟組織中異位性地形成軟骨組織或骨組織的遺傳性疾病(非專利文獻1-3)。於本疾病，異位性骨化會於包含顏面的全身中發作，異位性骨組織與原有的骨組織癒合而關節的可動區域顯著地降低，發生身體的變形(非專利文獻1-3)。
FOP中的異位性骨化除了伴隨成長而慢性地進行之外，亦已知伴隨由於肌肉損傷或病毒感染等而產生之稱為症狀突發(flare-up)的症狀而進行的急性之異位性骨化(非專利文獻1)。症狀突發係以炎症反應或經歷長期間的疼痛為主症狀的膨脹，除了因如產生肌損傷的碰撞或跌倒‧肌肉注射等而被誘導之外，原因不明確的突發例亦為已知。FOP因於症狀突發後形成異位性骨組織，故生檢或手術等之侵入性醫療行為被視為禁忌，無法外科性地去除異位性骨組織。又，於FOP形成的異位性骨組織由於係藉由正常的軟骨細胞或造骨細胞(osteoblast)所形成，與正常骨組織同樣地被代謝，故亦無法使用藥物等而內科性地僅去除異位性骨組織。
如抑制FOP之異位性骨化之根本的治療法尚未被確立，僅進行對抗疼痛等的對症療法。因此，去除FOP所形成的異位性骨組織極為困難，正期待於異位性骨化開始前即有可期待的預防效果的藥物之開發。
作為FOP之責任基因(responsible gene)，已鑑定出編碼於含骨骼肌組織的軟組織中誘導異位性骨形成(heterotopic osteogenesis)的骨成形性蛋白質(Bone morphogenetic protein(BMP))之受體之一種的類活化素激酶2(Activin Like Kinase 2(ALK2))基因(非專利文獻4)。ALK2係與稱為活化素A第I型受體1(Activin A type I Receptor 1(ACVR1))的基因相同。由家族性及偶發性FOP病例，發現伴隨有胺基酸取代的ALK2(非專利文獻4)。
人類及小鼠ALK2係具有包含509個胺基酸的訊息胜肽的1次跨膜蛋白質，作為與BMP結合的膜貫通型之絲胺酸/蘇胺酸激酶受體(serine/threonine kinase receptor)而發揮機能(非專利文獻1-3)。於N末端側之細胞外區域結合BMP，藉由細胞內之絲胺酸/蘇胺酸激酶而將下游之細胞內訊息傳遞系統活性化。
BMP之受體因彼等之構造及機能而被分類成含ALK2的I型受體及II型受體之2種類(非專利文獻1-3)。II型受體係即使未結合BMP亦顯示激酶活性的構成性活性型酵素。另一方面，含ALK2的I型受體於未結合BMP的狀態下為不活性型之酵素，顯示與BMP之結合依存性激酶活性。此係認為由於藉由與BMP結合，II型受體之激酶會將I型受體之細胞內結構域(domain)作為基質而磷酸化，使立體構造變化而將I型受體活性化(非專利文獻1-3)。
已知將I型受體之細胞內區域之特定胺基酸作取代時，II型受體非依存性地成為經活性化的構成性活性型受體(非專利文獻1-3)。過度表現此I型受體之構成性活性型突變體時，即使未施加BMP刺激，細胞內訊息傳遞系統亦會被活性化。因此，I型受體被認為是將BMP之情報由細胞外傳遞至細胞內的責任分子(responsible molecules)。
自家族性及典型的偶發性FOP病例鑑定的ALK2之突變係將Arg206取代為His的R206H突變體(非專利文獻4)。迄今，已確認自FOP病例鑑定的基因突變全部皆引起ALK2之細胞內區域的胺基酸突變。此等之FOP病例的突變的大部分係集中於ALK2之細胞內區域的ATP結合區域附近(非專利文獻5)。
使於FOP被鑑定的ALK2突變體於培養細胞中過度表現時，即使未施加BMP刺激，BMP之細胞內訊息傳遞系統亦被活性化(非專利文獻6)。因此，作為FOP之治療藥，已開發對ALK2之激酶的低分子抑制藥、專一性抑制遺傳性突變的ALK2之表現的RNAi或外顯子跳躍(exon skipping)法、ALK2受體之下游的轉錄因子抑制劑、及由BMP訊息所致的造骨細胞分化抑制藥等(專利文獻1及非專利文獻1-3)。
現在已開發的低分子化合物或核酸之FOP治療藥皆被期待透過細胞膜而於細胞內阻礙ALK2訊息。然而，核酸醫藥尚未確立有效果的藥物遞送法，又激酶抑制劑依然有對於與ALK2同一性高的其他ALK受體家族專一性低等之問題。因此，正冀望對於FOP有對ALK2專一性高且新的治療藥之開發。作用於ALK2之細胞外區域而抑制訊息的抗體醫藥係利用生理的免疫系統的高安全性治療法。抗體醫藥係經由血流的安定的藥物遞送為容易的同時，未對同一性高的其他ALK受體家族作用，發揮僅抑制ALK2的專一性為可能的。再者，對於包含ALK2之野生型或新穎的突變體的細胞內區域之各種突變體亦可期待有抑制作用。又，因未抑制如於全身之細胞中表現的ALK3，抗ALK2的專一性抑制抗體係與一般的造骨細胞分化抑制劑不同，可期待成為對於正常骨格組織之成長或維持、再生的影響少的醫藥品。然而，關於與ALK2專一性結合且對FOP顯示治療效果的抗體，迄今尚未知悉。 [先前技術文獻] [專利文獻]
專利文獻1　國際公開第WO2007/123896號 [非專利文獻]
非專利文獻1　T. Katagiri, J.Oral Biosci., 52, 33-41(2010) 非專利文獻2　T. Katagiri, J.Oral Biosci., 54, 119-123(2012) 非專利文獻3　T. Katagiri and S. Tsukamoto, Biol.Chem., 394, 703-714(2013) 非專利文獻4　E.M. Shore et al., Nat.Genet., 38, 525-527(2006) 非專利文獻5　A. Chaikuad et al., J.Biol.Chem., 287, 36990-36998(2012) 非專利文獻6　T. Fukuda et al., J.Biol.Chem., 284, 7149-7156(2009)
[發明欲解決之課題]
本發明之目的在於提供有用於作為異位性骨化及/或骨發育不全之治療及/或預防藥的物質、以及異位性骨化及/或骨發育不全之治療及/或預防方法。 [解決課題之手段]
本發明者們為了解決上述課題而專心進行檢討的結果，成功取得與ALK2專一性結合，具有異位性骨化及/或骨發育不全之治療及/或預防效果的新穎抗體，而完成本發明。
即，本發明包含以下之發明。 (1)一種抗體或該抗體之抗原結合片段，其與以下之(a)至(e)中任一者記載之胺基酸序列中包含至少7個胺基酸的多肽序列專一性結合，且抑制經由ALK2的BMP訊息傳遞， (a)序列識別號84所示的胺基酸序列； (b)包含序列識別號84所示的胺基酸序列之第21至123號的胺基酸殘基的胺基酸序列； (c)序列識別號86所示的胺基酸序列； (d)包含序列識別號86所示的胺基酸序列之第21至123號的胺基酸殘基的胺基酸序列； (e)於(a)至(d)之任一者記載之胺基酸序列伴隨有1至數個胺基酸殘基之取代、缺失或附加的胺基酸序列。 (2)一種抗體或該抗體之抗原結合片段，其與藉由以下之(f)至(j)之任一者記載之核苷酸序列所編碼的胺基酸序列中包含至少7個胺基酸的多肽序列專一性結合，且抑制經由ALK2的BMP訊息傳遞， (f)序列識別號85所示的核苷酸序列； (g)包含序列識別號85所示的核苷酸序列之第728至1036號之核苷酸殘基的核苷酸序列； (h)序列識別號87所示的核苷酸序列； (i)包含序列識別號87所示的核苷酸序列之第728至1036號之核苷酸殘基的核苷酸序列； (j)於嚴格條件下與包含下述核苷酸序列的多核苷酸雜交的多核苷酸之核苷酸序列：與(f)至(i)之任一者記載之核苷酸序列互補的核苷酸序列。 (3)如(1)或(2)記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其中前述多肽序列為ALK2細胞外區域內之序列。 (4)如(1)至(3)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其中前述抗體與野生型ALK2蛋白質及突變型ALK2蛋白質結合。 (5)如(1)至(4)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其中前述抗體為單株抗體或多株抗體。 (6)如(1)至(5)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其中前述抗體及前述抗原結合片段為嵌合抗體、人化抗體、人類抗體、單鏈抗體、雙專一性抗體、或多專一性抗體。 (7)如(1)至(6)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其對於選自包含下列抗體的群組之至少一者之抗體與前述多肽的結合為交叉競爭，上述抗體的群組包含：含有包含序列識別號2所示的胺基酸序列的重鏈可變區、及包含序列識別號4所示的胺基酸序列的輕鏈可變區之抗體；含有包含序列識別號6所示的胺基酸序列的重鏈可變區、及包含序列識別號8所示的胺基酸序列的輕鏈可變區之抗體；含有包含序列識別號10所示的胺基酸序列的重鏈可變區、及包含序列識別號12所示的胺基酸序列的輕鏈可變區之抗體；以及含有包含序列識別號14所示的胺基酸序列的重鏈可變區、及包含序列識別號16所示的胺基酸序列的輕鏈可變區的抗體。 (8)如(1)至(6)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其與選自包含下列抗體的群組之至少一者之抗體所結合的抗原決定位(epitope)結合，上述抗體的群組包含：含有包含序列識別號2所示的胺基酸序列的重鏈可變區、及包含序列識別號4所示的胺基酸序列的輕鏈可變區之抗體；含有包含序列識別號6所示的胺基酸序列的重鏈可變區、及包含序列識別號8所示的胺基酸序列的輕鏈可變區之抗體；含有包含序列識別號10所示的胺基酸序列的重鏈可變區、及包含序列識別號12所示的胺基酸序列的輕鏈可變區之抗體；以及含有包含序列識別號14所示的胺基酸序列的重鏈可變區、及包含序列識別號16所示的胺基酸序列的輕鏈可變區之抗體。 (9)如(1)至(6)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其與包含下列各殘基的抗原決定位結合：序列識別號84所示的胺基酸序列中之第18號之麩胺酸(Glu)、第19號之甘胺酸(Gly)、第39號之異白胺酸(Ile)、第40號之天冬醯胺酸(Asn)、第41號之天冬胺酸(Asp)、第42號之甘胺酸(Gly)、第43號之苯丙胺酸(Phe)、第44號之組胺酸(His)、第45號之纈胺酸(Val)、第46號之酪胺酸(Tyr)、第82號之天冬醯胺酸(Asn)、第84號之蘇胺酸(Thr)、第86號之麩醯胺酸(Gln)、及第87號之白胺酸(Leu)。 (10)如(1)至(6)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其於下列各殘基之間具有相互作用距離：序列識別號84所示的胺基酸序列中之第18號之麩胺酸(Glu)、第19號之甘胺酸(Gly)、第39號之異白胺酸(Ile)、第40號之天冬醯胺酸(Asn)、第41號之天冬胺酸(Asp)、第42號之甘胺酸(Gly)、第43號之苯丙胺酸(Phe)、第44號之組胺酸(His)、第45號之纈胺酸(Val)、第46號之酪胺酸(Tyr)、第82號之天冬醯胺酸(Asn)、第84號之蘇胺酸(Thr)、第86號之麩醯胺酸(Gln)、及第87號之白胺酸(Leu)。 (11)如(1)至(6)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其與包含下列各殘基的抗原決定位結合：序列識別號84所示的胺基酸序列中之第18號之麩胺酸(Glu)、第19號之甘胺酸(Gly)、第20號之白胺酸(Leu)、第39號之異白胺酸(Ile)、第41號之天冬胺酸(Asp)、第42號之甘胺酸(Gly)、第43號之苯丙胺酸(Phe)、第44號之組胺酸(His)、第45號之纈胺酸(Val)、第46號之酪胺酸(Tyr)、及第84號之蘇胺酸(Thr)。 (12)如(1)至(6)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其於下列各殘基之間具有相互作用距離：序列識別號84所示的胺基酸序列中之第18號之麩胺酸(Glu)、第19號之甘胺酸(Gly)、第20號之白胺酸(Leu)、第39號之異白胺酸(Ile)、第41號之天冬胺酸(Asp)、第42號之甘胺酸(Gly)、第43號之苯丙胺酸(Phe)、第44號之組胺酸(His)、第45號之纈胺酸(Val)、第46號之酪胺酸(Tyr)、及第84號之蘇胺酸(Thr)。 (13)如(10)或(12)記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其中相互作用距離為6埃以下。 (14)如(10)或(12)記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其中相互作用距離為4埃以下。 (15)如(1)至(8)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其中重鏈序列含有具CDRH1、CDRH2、及CDRH3的可變區，前述CDRH1包含序列識別號72所示的胺基酸序列，前述CDRH2包含序列識別號73所示的胺基酸序列，前述CDRH3包含序列識別號74所示的胺基酸序列所示的胺基酸序列；及 輕鏈序列含有具CDRL1、CDRL2、及CDRL3的可變區，前述CDRL1包含序列識別號75所示的胺基酸序列，前述CDRL2包含序列識別號76所示的胺基酸序列，前述CDRL3包含序列識別號77所示的胺基酸序列。 (16)如(15)記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其含有：包含序列識別號2所示的胺基酸序列的重鏈可變區序列及包含序列識別號4所示的胺基酸序列的輕鏈可變區序列。 (17)如(1)至(8)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其中重鏈序列含有具CDRH1、CDRH2、及CDRH3的可變區，前述CDRH1包含序列識別號59所示的胺基酸序列，前述CDRH2包含序列識別號60所示的胺基酸序列，前述CDRH3包含序列識別號61所示的胺基酸序列所示的胺基酸序列；及 輕鏈序列含有具CDRL1、CDRL2、及CDRL3的可變區，前述CDRL1包含序列識別號62所示的胺基酸序列，前述CDRL2包含序列識別號63或序列識別號71所示的胺基酸序列，前述CDRL3包含序列識別號64所示的胺基酸序列。 (18)如(17)記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其含有包含序列識別號6所示的胺基酸序列的重鏈可變區序列及包含序列識別號8所示的胺基酸序列或序列識別號36所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列。 (19)如(1)至(10)、(13)至(14)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其中重鏈序列含有具CDRH1、CDRH2、及CDRH3的可變區，前述CDRH1包含序列識別號78所示的胺基酸序列，前述CDRH2包含序列識別號79所示的胺基酸序列，前述CDRH3包含序列識別號80所示的胺基酸序列所示的胺基酸序列；及 輕鏈序列含有具CDRL1、CDRL2、及CDRL3的可變區，前述CDRL1包含序列識別號81所示的胺基酸序列，前述CDRL2包含序列識別號82所示的胺基酸序列，前述CDRL3包含序列識別號83所示的胺基酸序列。 (20)如(19)記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其含有包含序列識別號10所示的胺基酸序列的重鏈可變區序列及包含序列識別號12所示的胺基酸序列的輕鏈可變區序列。 (21)如(1)至(8)、(11)至(14)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其中重鏈序列含有具CDRH1、CDRH2、及CDRH3的可變區，前述CDRH1包含序列識別號65所示的胺基酸序列，前述CDRH2包含序列識別號66所示的胺基酸序列，前述CDRH3包含序列識別號67所示的胺基酸序列所示的胺基酸序列；及 輕鏈序列含有具CDRL1、CDRL2、及CDRL3的可變區，前述CDRL1包含序列識別號68所示的胺基酸序列，前述CDRL2包含序列識別號69所示的胺基酸序列，前述CDRL3包含序列識別號70所示的胺基酸序列。 (22)如(21)記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其含有包含序列識別號14所示的胺基酸序列的重鏈可變區序列及包含序列識別號16所示的胺基酸序列的輕鏈可變區序列。 (23)如(1)至(22)中任一項記載之抗體之抗原結合片段，其選自包含Fab、F(ab’)2 、Fab’及Fv的群組。 (24)如(1)至(22)中任一項記載之抗體，其係scFv。 (25)如(1)至(22)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其係嵌合抗體。 (26)如(1)至(22)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其係經人化。 (27)如(1)至(24)中任一項記載之抗體，其中重鏈包含人類免疫球蛋白G1重鏈、人類免疫球蛋白G2重鏈、或人類免疫球蛋白G4重鏈之恒定區，輕鏈包含人類免疫球蛋白κ輕鏈之恒定區。 (28)如(27)記載之抗體，其中重鏈包含人類免疫球蛋白G1重鏈之恒定區。 (29)如(28)記載之抗體，其中人類免疫球蛋白G1重鏈之第234號之白胺酸(Leu)經丙胺酸(Ala)取代，第235號之白胺酸(Leu)經丙胺酸(Ala)取代。 (30)如(27)記載之抗體，其中重鏈包含人類免疫球蛋白G2重鏈之恒定區。 (31)如(27)記載之抗體，其中重鏈包含人類免疫球蛋白G4重鏈之恒定區。 (32)如(31)記載之抗體，其中人類免疫球蛋白G4重鏈之第241號之絲胺酸(Ser)經脯胺酸(Pro)取代。 (33)一種抗體或該抗體之抗原結合片段，其係與ALK2蛋白質之細胞外區域專一性地結合，且抑制經由ALK2的BMP訊息傳遞的抗體或該抗體之抗原結合片段，其特徵為包含： (a)選自包含以下之胺基酸序列的群組的重鏈可變區序列： a1)包含序列識別號28所示的胺基酸序列之第20至142號之胺基酸殘基的胺基酸序列； a2)包含序列識別號30所示的胺基酸序列之第20至142號之胺基酸殘基的胺基酸序列； a3)包含序列識別號105所示的胺基酸序列之第20至142號之胺基酸殘基的胺基酸序列； a4)與a1)至a3)之胺基酸序列具至少95%之同一性的胺基酸序列； a5)與a1)至a3)之胺基酸序列具至少99%之同一性的胺基酸序列； a6)於a1)至a3)之胺基酸序列有1至數個胺基酸殘基經取代、缺失或附加的胺基酸序列；及 (b)選自包含以下之胺基酸序列的群組的輕鏈可變區序列： b1)包含序列識別號32所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基的胺基酸序列； b2)包含序列識別號34所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基的胺基酸序列； b3)包含序列識別號36所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基的胺基酸序列； b4)包含序列識別號38所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基的胺基酸序列； b5)與選自b1)至b4)中任一者之胺基酸序列具至少95%之同一性的胺基酸序列； b6)與選自b1)至b4)中任一者之胺基酸序列具至少99%之同一性的胺基酸序列； b7)於選自b1)至b4)中任一者之胺基酸序列有1至數個胺基酸殘基經取代、缺失或附加的胺基酸序列。 (34)如(33)記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其係包含下列重鏈及輕鏈之抗體：含有包含序列識別號30所示的胺基酸序列之第20至142號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號36所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；或含有包含序列識別號105所示的胺基酸序列之第20至142號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號36所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈。 (35)如(33)記載之抗體，其係包含下列重鏈及輕鏈之抗體：含有包含序列識別號30所示的胺基酸序列之第20至472號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號36所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；或含有包含序列識別號105所示的胺基酸序列之第20至468號之胺基酸殘基的胺基酸序列之重鏈及含有包含序列識別號36所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈。 (36)如(33)記載之抗體，其係包含下列重鏈及輕鏈之抗體：含有包含序列識別號105所示的胺基酸序列之第20至468號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號36所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈。 (37)一種抗體或該抗體之抗原結合片段，其係與ALK2蛋白質之細胞外區域專一性結合，且抑制經由ALK2的BMP訊息傳遞的抗體或該抗體之抗原結合片段，其特徵為包含： (a)選自包含以下之胺基酸序列的群組的重鏈可變區序列： a1)包含序列識別號40所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列； a2)包含序列識別號42所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列； a3)包含序列識別號44所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列； a4)包含序列識別號46所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列； a5)包含序列識別號48所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列； a6)包含序列識別號107所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列； a7)包含序列識別號109所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列； a8)與選自a1)至a7)中任一者之胺基酸序列具至少95%之同一性的胺基酸序列； a9)與選自a1)至a7)中任一者之胺基酸序列具至少99%之同一性的胺基酸序列； a10)於選自a1)至a7)中任一者之胺基酸序列有1至數個之胺基酸殘基經取代、缺失或附加的胺基酸序列；及 (b)選自包含以下之胺基酸序列的群組的輕鏈可變區序列： b1)包含序列識別號50所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列； b2)包含序列識別號52所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列； b3)包含序列識別號54所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列； b4)包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列； b5)包含序列識別號58所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列； b6)與選自b1)至b5)中任一者之胺基酸序列具至少95%之同一性的胺基酸序列； b7)與選自b1)至b5)中任一者之胺基酸序列具至少99%之同一性的胺基酸序列； b8)於選自b1)至b5)中任一者之胺基酸序列有1至數個之胺基酸殘基經取代、缺失或附加的胺基酸序列。 (38)如(37)記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其係包含下列重鏈及輕鏈之抗體：含有包含序列識別號42所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號52所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號44所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號107所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號52所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；或含有包含序列識別號109所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈。 (39)如(37)記載之抗體，其係包含下列重鏈及輕鏈之抗體：含有包含序列識別號42所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號52所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；或含有包含序列識別號44所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；含有包含序列識別號107所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號52所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；或含有包含序列識別號109所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈。 (40)如(37)記載之抗體，其係包含下列重鏈及輕鏈之抗體：含有包含序列識別號107所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號52所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；或含有包含序列識別號109所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈。 (41)一種抗體或該抗體之抗原結合片段，其係與ALK2蛋白質之細胞外區域專一性結合，且抑制經由ALK2的BMP訊息傳遞的抗體或該抗體之抗原結合片段，其特徵為包含： (a)選自包含以下之胺基酸序列的群組的重鏈可變區序列： a1)包含序列識別號111所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基的胺基酸序列； a2)包含序列識別號113所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基的胺基酸序列； a3)與a1)或a2)之胺基酸序列具至少95%之同一性的胺基酸序列； a4)與a1)或a2)之胺基酸序列具至少99%之同一性的胺基酸序列； a5)於a1)或a2)之胺基酸序列有1至數個之胺基酸殘基經取代、缺失或附加的胺基酸序列；及 (b)選自包含以下之胺基酸序列的群組的輕鏈可變區序列： b1)包含序列識別號115所示的胺基酸序列之第21至128號之胺基酸殘基的胺基酸序列； b2)包含序列識別號117所示的胺基酸序列之第21至128號之胺基酸殘基的胺基酸序列； b3)包含序列識別號119所示的胺基酸序列之第21至128號之胺基酸殘基的胺基酸序列； b4)與選自b1)至b3)中任一者之胺基酸序列具至少95%之同一性的胺基酸序列； b5)與選自b1)至b3)中任一者之胺基酸序列具至少99%之同一性的胺基酸序列； b6)於選自b1)至b3)中任一者之胺基酸序列有1至數個之胺基酸殘基經取代、缺失或附加的胺基酸序列。 (42)一種抗體或該抗體之抗原結合片段，其係與ALK2蛋白質之細胞外區域專一性結合，且抑制經由ALK2的BMP訊息傳遞的抗體或該抗體之抗原結合片段，其特徵為包含： (a)選自包含以下之胺基酸序列的群組的重鏈可變區序列： a1)包含序列識別號121所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基的胺基酸序列； a2)包含序列識別號123所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基的胺基酸序列； a3)與a1)或a2)之胺基酸序列具至少95%之同一性的胺基酸序列； a4)與a1)或a2)之胺基酸序列具至少99%之同一性的胺基酸序列； a5)於a1)或a2)之胺基酸序列有1至數個之胺基酸殘基經取代、缺失或附加的胺基酸序列；及 (b)選自包含以下之胺基酸序列的群組的輕鏈可變區序列： b1)包含序列識別號125所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列； b2)包含序列識別號127所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列； b3)包含序列識別號129所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列； b4)與選自b1)至b3)中任一者之胺基酸序列具至少95%之同一性的胺基酸序列； b5)與選自b1)至b3)中任一者之胺基酸序列具至少99%之同一性的胺基酸序列； b6)於選自b1)至b3)中任一者之胺基酸序列有1至數個之胺基酸殘基經取代、缺失或附加的胺基酸序列。 (43)如(1)至(42)中任一項記載之抗體，其係包含羧基末端之1至數個之胺基酸經缺失的重鏈之抗體。 (44)如(1)至(43)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其係重鏈或輕鏈之胺基末端之胺基酸殘基經焦麩胺醯基(pyroglutamyl)化的抗體。 (45)一種醫藥組成物，其特徵為含有如(1)至(44)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合片段之至少任一者。 (46)如(45)記載之醫藥組成物，其係異位性骨化之治療及/或預防劑。 (47)一種異位性骨化之治療及/或預防用醫藥組成物，其特徵為含有如(1)至(44)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合片段之至少任一者，以及選自包含消炎劑、類固醇劑、雙膦酸鹽(bisphosphonate)、肌肉鬆弛劑、視網酸受體(RAR)γ促效劑的群組之至少任一者。 (48)如(46)或(47)記載之醫藥組成物，其中異位性骨化係進行性肌肉骨化症(FOP)、進行性骨化錯生(progressive osseous heteroplasia，POH)、外傷性之異位性骨化、或人工關節取代術(artificial joint replacement)後之異位性骨化。 (49)如(46)或(47)記載之醫藥組成物，其中異位性骨化為進行性肌肉骨化症(FOP)。 (50)如(45)記載之醫藥組成物，其係貧血之治療及/或預防劑。 (51)如(45)記載之醫藥組成物，其係瀰漫型內因性橋腦神經膠細胞瘤(DIPG)之治療及/或預防劑。 (52)一種異位性骨化之治療及/或預防方法，其特徵為投予如(1)至(44)中任一項記載之抗體、該抗體之抗原結合片段、或如(45)至(49)中任一項記載之醫藥組成物之至少任一者。 (53)一種異位性骨化之治療及/或預防方法，其特徵係同時或互為前後而投與如(1)至(44)中任一項記載之抗體、該抗體之抗原結合片段、或如(45)至(49)中任一項記載之醫藥組成物之至少任一者、以及選自包含消炎劑、類固醇劑、雙膦酸鹽、肌肉鬆弛劑、視網酸受體(RAR)γ促效劑的群組的至少任一者。 (54)如(52)或(53)記載之治療及/或預防方法，其中異位性骨化為進行性肌肉骨化症(FOP)、進行性骨化錯生(POH)、外傷性之異位性骨化、或人工關節取代術後之異位性骨化。 (55)如(52)或(53)記載之治療及/或預防方法，其中異位性骨化為進行性肌肉骨化症(FOP)。 (56)一種貧血之治療及/或預防方法，其特徵為投予如(1)至(44)中任一項記載之抗體、該抗體之抗原結合片段、或者如(45)或(50)記載之醫藥組成物之至少任一者。 (57)一種瀰漫型內因性橋腦神經膠細胞瘤(DIPG)之治療及/或預防方法，其特徵為投予如(1)至(44)中任一項記載之抗體、該抗體之抗原結合片段、或者如(45)或(51)記載之醫藥組成物之至少任一者。 (58)一種多核苷酸，其係編碼如(1)至(44)中任一項記載之抗體。 (59)一種多核苷酸，其特徵為含有： (a)選自包含以下之核苷酸序列的群組的多核苷酸： a1)包含序列識別號27所示的核苷酸序列之第58至426號之核苷酸的核苷酸序列； a2)包含序列識別號29所示的核苷酸序列之第58至426號之核苷酸的核苷酸序列； a3)包含序列識別號104所示的核苷酸序列之第58至426號之核苷酸的核苷酸序列； a4)與a1)至a3)之核苷酸序列具至少95%之同一性的核苷酸序列； a5)與a1)至a3)之核苷酸序列具至少99%之同一性的核苷酸序列； a6)與包含下述核苷酸序列的多核苷酸於嚴格條件下雜交的多核苷酸所保有的核苷酸序列：與a1)至a3)之核苷酸序列互補的核苷酸序列； a7)於a1)或a2)之核苷酸序列有1至數個核苷酸經取代、缺失或附加的核苷酸序列；及/或 (b)選自包含以下之核苷酸序列的群組的多核苷酸： b1)包含序列識別號31所示的核苷酸序列之第86至424號之核苷酸的核苷酸序列； b2)包含序列識別號33所示的核苷酸序列之第86至424號之核苷酸的核苷酸序列； b3)包含序列識別號35所示的核苷酸序列之第86至424號之核苷酸的核苷酸序列； b4)包含序列識別號37所示的核苷酸序列之第86至424號之核苷酸的核苷酸序列； b5)與選自b1)至b4)中任一者之核苷酸序列具至少95%之同一性的核苷酸序列； b6)與選自b1)至b4)中任一者之核苷酸序列具至少99%之同一性的核苷酸序列； b7)與包含下述核苷酸序列的多核苷酸於嚴格條件下雜交的多核苷酸所保有的核苷酸序列：與選自b1)至b4)中任一者之核苷酸序列互補的核苷酸序列； b8)於選自b1)至b4)中任一者之核苷酸序列有1至數個核苷酸經取代、缺失或附加的核苷酸序列。 (60)一種多核苷酸，其特徵為含有： (a)選自包含以下之核苷酸序列的群組的多核苷酸： a1)包含序列識別號39所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列； a2)包含序列識別號41所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列； a3)包含序列識別號43所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列； a4)包含序列識別號45所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列； a5)包含序列識別號47所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列； a6)包含序列識別號106所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列； a7)包含序列識別號108所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列； a8)與選自a1)至a7)中任一者之核苷酸序列具至少95%之同一性的核苷酸序列； a9)與選自a1)至a7)中任一者之核苷酸序列具至少99%之同一性的核苷酸序列； a10)與包含下述核苷酸序列的多核苷酸於嚴格條件下雜交的多核苷酸所保有的核苷酸序列：與選自a1)至a7)中任一者之核苷酸序列互補的核苷酸序列； a11)於選自a1)至a7)中任一者之核苷酸序列有1至數個核苷酸經取代、缺失或附加的核苷酸序列；及/或 (b)選自包含以下之核苷酸序列的群組的多核苷酸： b1)包含序列識別號49所示的核苷酸序列之第86至412號之核苷酸的核苷酸序列； b2)包含序列識別號51所示的核苷酸序列之第86至412號之核苷酸的核苷酸序列； b3)包含序列識別號53所示的核苷酸序列之第86至412號之核苷酸的核苷酸序列； b4)包含序列識別號55所示的核苷酸序列之第86至412號之核苷酸的核苷酸序列； b5)包含序列識別號57所示的核苷酸序列之第86至412號之核苷酸的核苷酸序列； b6)與選自b1)至b5)中任一者之核苷酸序列具有至少95%之同一性的核苷酸序列； b7)與選自b1)至b5)中任一者之核苷酸序列具有至少99%之同一性的核苷酸序列； b8)與包含下述核苷酸序列的多核苷酸於嚴格條件下雜交的多核苷酸所保有的核苷酸序列：與選自b1)至b5)中任一者之核苷酸序列互補的核苷酸序列； b9)於選自b1)至b5)中任一者之核苷酸序列有1至數個核苷酸經取代、缺失或附加的核苷酸序列。 (61)一種多核苷酸，其特徵為含有： (a)選自包含以下之核苷酸序列的群組的多核苷酸： a1)包含序列識別號110所示的核苷酸序列之第58至411號之核苷酸的核苷酸序列； a2)包含序列識別號112所示的核苷酸序列之第58至411號之核苷酸的核苷酸序列； a3)與a1)或a2)之核苷酸序列具至少95%之同一性的核苷酸序列； a4)與a1)或a2)之核苷酸序列具至少99%之同一性的核苷酸序列； a5)與包含下述核苷酸序列的多核苷酸於嚴格條件下雜交的多核苷酸所保有的核苷酸序列：與a1)或a2)之核苷酸序列互補的核苷酸序列； a6)於a1)或a2)之核苷酸序列有1至數個核苷酸經取代、缺失或附加的核苷酸序列；及/或 (b)選自包含以下之核苷酸序列的群組的多核苷酸： b1)包含序列識別號114所示的核苷酸序列之第61至384號之核苷酸的核苷酸序列； b2)包含序列識別號116所示的核苷酸序列之第61至384號之核苷酸的核苷酸序列； b3)包含序列識別號118所示的核苷酸序列之第61至384號之核苷酸的核苷酸序列； b4)與選自b1)至b3)中任一者之核苷酸序列具至少95%之同一性的核苷酸序列； b5)與選自b1)至b3)中任一者之核苷酸序列具至少99%之同一性的核苷酸序列； b6)與包含下述核苷酸序列的多核苷酸於嚴格條件下雜交的多核苷酸所保有的核苷酸序列：與選自b1)至b3)中任一者之核苷酸序列互補的核苷酸序列； b7)於選自b1)至b3)中任一者之核苷酸序列有1至數個核苷酸經取代、缺失或附加的核苷酸序列。 (62)一種多核苷酸，其特徵為含有： (a)選自包含以下之核苷酸序列的群組的多核苷酸： a1)包含序列識別號120所示的核苷酸序列之第58至411號之核苷酸的核苷酸序列； a2)包含序列識別號122所示的核苷酸序列之第58至411號之核苷酸的核苷酸序列； a3)與a1)或a2)之核苷酸序列具至少95%之同一性的核苷酸序列； a4)與a1)或a2)之核苷酸序列具至少99%之同一性的核苷酸序列； a5)與包含下述核苷酸序列的多核苷酸於嚴格條件下雜交的多核苷酸所保有的核苷酸序列：與a1)或a2)之核苷酸序列互補的核苷酸序列； a6)於a1)或a2)之核苷酸序列有1至數個核苷酸經取代、缺失或附加的核苷酸序列；及/或 (b)選自包含以下之核苷酸序列的群組的多核苷酸： b1)包含序列識別號124所示的核苷酸序列之第61至387號之核苷酸的核苷酸序列； b2)包含序列識別號126所示的核苷酸序列之第61至387號之核苷酸的核苷酸序列； b3)包含序列識別號128所示的核苷酸序列之第61至387號之核苷酸的核苷酸序列； b4)與選自b1)至b3)中任一者之核苷酸序列具至少95%之同一性的核苷酸序列； b5)與選自b1)至b3)中任一者之核苷酸序列具至少99%之同一性的核苷酸序列； b6)與包含下述核苷酸序列的多核苷酸於嚴格條件下雜交的多核苷酸所保有的核苷酸序列：與選自b1)至b3)中任一者之核苷酸序列互補的核苷酸序列； b7)於選自b1)至b3)中任一者之核苷酸序列有1至數個核苷酸經取代、缺失或附加的核苷酸序列。 (63)一種載體，其含有如(58)至(62)中任一項記載之任一個之多核苷酸。 (64)一種轉形宿主細胞，其含有如(58)至(62)中任一項記載之任一個之多核苷酸。 (65)一種轉形宿主細胞，其含有如(63)記載之載體。 (66)一種如(1)至(44)中任一項記載之抗體之生產方法，其包含培養如(64)或(65)記載之宿主細胞，自培養產物將抗體純化的步驟。
依據本發明，可獲得異位性骨化及/或骨發育不全之治療劑及/或預防劑。
本說明書包含成為本案優先權基礎的日本專利申請編號2015-017882號揭示的內容。
[實施發明之形態]
1.定義 於本說明書中，所謂「基因」的用語不僅包含DNA，亦包含mRNA、cDNA及cRNA。
於本說明書中，所謂「多核苷酸」的用語係以與核酸相同意義使用，亦包含DNA、RNA、探針、寡核苷酸、及引子。
於本說明書中，「多肽」與「蛋白質」係未區別地使用。
於本說明書中，「RNA劃份(fraction)」係指含有RNA的劃份。
於本說明書中，「細胞」亦包含動物個體內之細胞、培養細胞。
於本說明書中，「ALK2」係以與ALK2蛋白質相同意義使用，包含野生型及突變體(亦稱為突變型)。
本說明書中的「抗體之抗原結合片段」亦稱為「抗體之機能性片段」，意指具有與抗原之結合活性的抗體之部分片段，包含Fab、F(ab’)2 、Fv、scFv、雙體抗體(diabody)、線狀抗體、及由抗體片段所形成的多專一性抗體等。又，為將F(ab’)2 於還原條件下處理的抗體之可變區之一價片段的Fab’亦包含於抗體之抗原結合片段。惟，只要具有與抗原之結合能力，並未限定於此等之分子。又，此等之抗原結合片段不僅包含將抗體蛋白質之全長分子以適當酵素處理者，亦包含使用經基因工程改造的抗體基因而於適當宿主細胞所產生的蛋白質。
本說明書中的「抗原決定位」亦稱為「抗原結合部位」，一般而言指包含抗原之至少7個胺基酸、至少8個胺基酸、至少9個胺基酸、或至少10個胺基酸之抗體所結合的抗原部位，於本說明書中意指特定之抗ALK2抗體所結合的ALK2之部分胜肽或部分立體構造。為前述之ALK2之部分胜肽的抗原決定位可藉由免疫分析法等本項技術領域中具通常知識者熟知的方法來決定，但例如可藉由以下之方法進行。製作ALK2之各式各樣的部分構造。當製作部分構造時，可使用周知之寡肽合成技術。例如，將自ALK2之C末端或N末端以適當長度依序縮短的一連串多肽，使用本項技術領域中具通常知識者周知之基因重組技術來製作後，檢討抗體對彼等之反應性，粗略決定辨識部位後，進一步合成短的胜肽而藉由檢討與彼等胜肽之反應性，可決定抗原決定位。又，為特定之ALK2抗體所結合的ALK2之部分立體構造的抗原決定位，可利用X射線結晶構造解析，藉由特定與前述抗體鄰接的ALK2之胺基酸殘基來決定。只要第二抗ALK2抗體與第一抗ALK2抗體之結合的部分胜肽或部分立體構造結合，則可判定第一抗體與第二抗體具有共通的抗原決定位。又，藉由確認對於第一抗ALK2抗體之對ALK2的結合，第二抗ALK2抗體係進行(交叉)競爭(即，第二抗體會妨礙第一抗體與ALK2之結合)，即使未決定具體的抗原決定位之序列或構造，亦可判定第一抗體與第二抗體具有共通之抗原決定位。再者，第一抗體與第二抗體結合於共通之抗原決定位，且第一抗體具有經由ALK2的BMP訊息的抑制活性等之活性的情形，可期待第二抗體亦具有相同活性。
已知抗體分子之重鏈及輕鏈各自有3處之互補決定區(CDR：Complementarity determining region)。互補決定區亦稱為高度變異區(hypervariable domain)，位於抗體之重鏈及輕鏈之可變區內，為一次構造之變異性特高的部位，於重鏈及輕鏈之多肽鏈的一次構造上，各自分離於3處。於本說明書中，關於抗體之互補決定區，將重鏈之互補決定區自重鏈胺基酸序列之胺基末端側表示為CDRH1、CDRH2、及CDRH3，將輕鏈之互補決定區自輕鏈胺基酸序列之胺基末端側表示為CDRL1、CDRL2、及CDRL3。此等之部位於立體構造上相互接近，決定了對所結合的抗原的專一性。
於本發明，「於嚴格條件下雜交」係指於可藉由下述而鑑定之條件或與其同等之條件下進行雜交：於市售之雜交溶液ExpressHyb Hybridization Solution(Clontech公司製)中，於約50-70℃(例如68℃)進行雜交；或使用固定有DNA的濾膜(filter)，於約0.7-1.0M之NaCl存在下，於約50-70℃(例如68℃)進行雜交後，使用約0.1-2倍濃度之SSC溶液(1倍濃度SSC係指包含150mM NaCl、15mM檸檬酸鈉；又，因應必要，可於該溶液含有約0.1-0.5%SDS)，於約50-70℃(例如68℃)進行洗淨。
於本說明書，有「1至數個」及「1或數個」記載的情形之「數個」係表示2至10個。較佳為10個以下，更佳為5或6個以下，進一步更佳為2或3個。
2.ALK2 ALK2基因係編碼於含骨骼肌組織的軟組織中誘導異位性骨形成的BMP之受體之一種的FOP之責任基因。由家族性及偶發性FOP病例，已發現伴隨有胺基酸取代的突變型ALK2。就人類ALK2之突變型而言，已知有L196P(第196號之白胺酸被取代為脯胺酸的突變)、delP197_F198insL(第197號之脯胺酸及第198號之苯丙胺酸缺失，且插入白胺酸的突變)、R202I(第202號之精胺酸被取代為異白胺酸的突變)、R206H(第206號之精胺酸被取代為組胺酸的突變)、Q207E(第207號之麩醯胺酸被取代為麩胺酸的突變)、R258S(第258號之精胺酸被取代為絲胺酸的突變)、R258G(第258號之精胺酸被取代為甘胺酸的突變)、G325A(第325號之甘胺酸被取代為丙胺酸的突變)、G328E(第328號之甘胺酸被取代為麩胺酸的突變)、G328R(第328號之甘胺酸被取代為精胺酸的突變)、G328W(第328號之甘胺酸被取代為色胺酸的突變)、G356D(第356號之甘胺酸被取代為天冬胺酸的突變)、R375P(第375號之精胺酸被取代為脯胺酸的突變)等。
本發明所使用的ALK2能以活體外合成、或藉由利用基因操作而使其於宿主細胞產生而獲得。具體而言，將ALK2 cDNA併入可表現的載體後，於含有轉錄及轉譯所必要的酵素、基質及能量物質的溶液中加以合成，或者藉由利用使其他之原核生物或真核生物之宿主細胞轉形而使ALK2表現，而可獲得該蛋白質。
本發明所使用的ALK2係源自包含人類或小鼠的哺乳動物之ALK2，例如人類ALK2之胺基酸序列及核苷酸序列可藉由參照GenBank登錄號NM-001105而取得，胺基酸序列亦於本說明書中作為序列識別號84而揭示，核苷酸序列亦作為序列識別號85而揭示。小鼠ALK2之胺基酸序列及核苷酸序列可藉由參照GenBank登錄號NP-001103674而取得，胺基酸序列亦於本說明書中作為序列識別號86而揭示，核苷酸序列亦作為序列識別號87而揭示。又，ALK2有時被稱為ACVR1(活化素A第I型受體1(Activin A type I Receptor 1))或ACTR1(活化素受體第I型(Activin Receptor Type 1))，此等全部表示相同分子。
ALK2之cDNA係可藉由例如，以表現ALK2之cDNA的cDNA庫作為模板，使用專一性放大ALK2之cDNA的引子而進行聚合酶連鎖反應(以下稱為「PCR」)(Saiki, R. K., et al., Science, (1988)239, 487-49)，即所謂的PCR法而取得。
又，與包含「與編碼人類或小鼠之ALK2的核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸」於嚴格條件下雜交，且編碼具有與ALK2同等之生物活性的蛋白質的多核苷酸亦包含於ALK2之cDNA。再者，自人類或小鼠ALK2基因座轉錄的剪接突變體(splicing variant)或與其於嚴格條件下雜交的多核苷酸，且編碼具有與ALK2同等之生物活性的蛋白質的多核苷酸亦包含於ALK2之cDNA。
又，包含下述胺基酸序列，且具有與ALK2同等之生物活性的蛋白質亦包含於ALK2：人類或小鼠之ALK2之胺基酸序列；或於自此等之序列去除訊息序列的胺基酸序列，有1或數個之胺基酸經取代、缺失、或附加的胺基酸序列。再者，包含下述胺基酸序列，且具有與ALK2同等之生物活性的蛋白質亦含於ALK2：於自人類或小鼠ALK2基因座轉錄的剪接突變體中所編碼的胺基酸序列；或於該胺基酸序列，有1或數個之胺基酸經取代、缺失、或附加的胺基酸序列。
3.異位性骨化及/或骨發育不全之檢出 藉由經由ALK2的BMP訊息傳遞，而引起異位性骨化及/或骨發育不全。
「異位性骨化」意指於本來沒有骨骼的部位出現骨骼，「骨發育不全」意指於原有的骨骼之形態或質地有異常者。就「異位性骨化」而言，可列舉進行性肌肉骨化症(FOP)、進行性骨化錯生(POH)、外傷性之異位性骨化、人工關節取代術後之異位性骨化等，就「骨發育不全」而言，可列舉脊椎關節炎(SpA)、僵直性脊椎炎(ankylosing spondylitis)(AS)等，但並未限定於此等。
ALK2係結合BMP的膜貫通型之絲胺酸/蘇胺酸激酶受體，於N末端側之細胞外區域結合BMP，藉由細胞內之絲胺酸/蘇胺酸激酶，將下游之細胞內訊息傳遞系統活性化。骨成形性蛋白質(BMP)係屬於轉形生長因子β(Transforming growth factor-β(TGF-β))超家族的多機能成長因子，已有約20個之BMP家族成員被鑑定出。因BMP已被確認於含骨骼肌組織的軟組織誘導異位性骨形成，故被認為與促進異常骨形成的疾病有關。BMP-2或BMP-4，與ALK2相比，被認為對ALK3親和性較高。ALK3因與ALK2相比為無所不在地表現，故可認為於各種部位誘導異位性骨化的實驗，一般較常使用BMP-2或BMP-4。另一方面，雖認為BMP-7對ALK2的親和性比較高，又BMP-9一般而言對ALK1親和性較高，但了解對ALK2亦具有比較高的親和性。於FOP，因引起經由ALK2的異位性骨化，故認為可藉由驗證抗由「利用BMP-7及BMP-9的經由ALK2的訊息之活性化」所致的異位性骨誘導的藥效，確認對FOP的治療及/或預防效果之有無。
將肌母細胞(C2C12細胞)於BMP存在下培養時，藉由對BMP專一性的細胞內訊息傳遞機構而向成熟肌細胞之分化被抑制，取而代之者為向造骨細胞之分化被誘導。據此，藉由使用C2C12細胞的由BMP所致的向造骨細胞之分化誘導模型，可解析經由ALK2的BMP訊息傳遞。
4.抗ALK2抗體之製造 本發明之抗ALK2的抗體係可藉由例如WO2009/091048、WO2011/027808、或WO2012/133572記載之方法獲得。即，將非人類動物以目的抗原作免疫，自免疫成立後之動物採取淋巴液、淋巴組織、血球試料或來自骨髓之細胞，選擇與目的抗原專一性結合的非人類動物之漿細胞及/或漿母細胞。自獲得的漿細胞及/或漿母細胞採取抗目的抗原的抗體基因，鑑定其鹼基序列，基於鑑定的基因之鹼基序列，可獲得上述抗體或抗體之片段。又，藉由自人類感染患者之血液同樣地獲得漿細胞及/或漿母細胞，可獲得抗體或抗體片段。取得的抗體可藉由試驗對ALK2的結合性，而挑選可適用於人類疾病的抗體。就如此獲得的單株抗體之例而言，可列舉A2-11E、A2-15A、A2-25C、A2-27D。
又，本說明書中，分配於賦予抗體特徵的CDR/FR的胺基酸位置係按照KABAT編號(KABAT et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))而被分配。
又，亦可按照周知之方法(例如，Kohler and Milstein, Nature(1975)256, p.495-497、Kennet, R.ed., Monoclonal Antibodies, p.365-367, Plenum Press, N.Y.(1980))，藉由使產生抗ALK2的抗體的抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合而建立融合瘤，而獲得單株抗體。如此方法之具體例記載於WO2009/48072(2009年4月16日公開)及WO2010/117011(2010年10月14日公開)。然而，取得單株抗體的方法相當於已被確立的領域，並未限定於前述之具體例。
本發明之抗體係除了抗上述ALK2的單株抗體之外，亦包含同樣具有治療/預防效果者，例如多株抗體、或以使對人類的異種抗原性降低等為目的而人為地改造的基因重組型抗體(例如，嵌合(Chimeric)抗體、人化(Humanized)抗體、人類抗體等)。此等之抗體可使用已知方法來製造。
就嵌合抗體而言，可列舉抗體之可變區與恒定區(Fc)係彼此為異種的抗體，例如將來自小鼠或大鼠之抗體可變區與來自人類之恒定區接合的嵌合抗體(參照Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 81, 6851-6855(1984))。就來自A2-15A之嵌合抗體之一例而言，可列舉包含下述重鏈及輕鏈之抗體：具有包含序列表之序列識別號20之第20至472號之胺基酸殘基的胺基酸序列之重鏈、及具有包含序列識別號22之第21至237號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；就來自A2-27D之嵌合抗體之一例而言，可列舉包含下述重鏈及輕鏈之抗體：具有包含序列表之序列識別號24之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列之重鏈、及具有包含序列識別號26之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列之輕鏈。
就人化抗體而言，可列舉僅將CDR併入來自人類之抗體的抗體(參照Nature(1986)321, p.522-525)、藉由CDR移植法而除了CDR之序列以外亦將一部份的框架之胺基酸殘基移植於人類抗體的抗體(國際公開第WO90/07861號小冊)。
就來自A2-15A抗體之人化抗體而言，只要包含A2-15A之6種全部的CDR序列，且具有對ALK2的結合活性，皆包含於本發明之抗體。又，A2-15A抗體之重鏈可變區包含由序列識別號59所示的胺基酸序列所構成的CDRH1(GFTFSHYYMA)、由序列識別號60所示的胺基酸序列所構成的CDRH2(SITNSGGSINYRDSVKG)、及由序列識別號61所示的胺基酸序列所構成的CDRH3(EGGENYGGYPPFAY)。又，A2-15A抗體之輕鏈可變區包含由序列識別號62所示的胺基酸序列所構成的CDRL1(RANQGVSLSRYNLMH)、由序列識別號63所示的胺基酸序列所構成的CDRL2(RSSNLAS)、及由序列識別號64所示的胺基酸序列所構成的CDRL3(QQSRESPFT)。此等之CDR之胺基酸序列亦記載於第11圖。
就來自A2-27D抗體之人化抗體而言，只要包含A2-27D之6種全部之CDR序列，且具有對ALK2的結合活性，皆包含於本發明之抗體。又，A2-27D抗體之重鏈可變區包含由序列識別號65所示的胺基酸序列所構成的CDRH1(GSTFSNYGMK)、由序列識別號66所示的胺基酸序列所構成的CDRH2(SISRSSTYIYYADTVKG)、及由序列識別號67所示的胺基酸序列所構成的CDRH3(AISTPFYWYFDF)。又，A2-27D抗體之輕鏈可變區包含由序列識別號68所示的胺基酸序列所構成的CDRL1(LASSSVSYMT)、由序列識別號69所示的胺基酸序列所構成的CDRL2(GTSNLAS)、及由序列識別號70所示的胺基酸序列所構成的CDRL3(LHLTSYPPYT)。此等之CDR之胺基酸序列亦記載於第12圖。
就來自A2-11E抗體之人化抗體而言，只要包含A2-11E之6種全部之CDR序列，且具有對ALK2的結合活性，皆包含於本發明之抗體。又，A2-11E抗體之重鏈可變區包含由序列識別號72所示的胺基酸序列所構成的CDRH1(GFTFSNYYMY)、由序列識別號73所示的胺基酸序列所構成的CDRH2(SINTDGGSTYYPDSVKG)、及由序列識別號74所示的胺基酸序列所構成的CDRH3(STPNIPLAY)。又，A2-11E抗體之輕鏈可變區包含由序列識別號75所示的胺基酸序列所構成的CDRL1(KASQNIYKYLN)、由序列識別號76所示的胺基酸序列所構成的CDRL2(YSNSLQT)、及由序列識別號77所示的胺基酸序列所構成的CDRL3(FQYSSGPT)。此等之CDR之胺基酸序列亦記載於第13圖。
就來自A2-25C抗體之人化抗體而言，只要包含A2-25C之6種全部之CDR序列，且具有對ALK2的結合活性，皆包含於本發明之抗體。又，A2-25C抗體之重鏈可變區包含由序列識別號78所示的胺基酸序列所構成的CDRH1(GFTFSYYAMS)、由序列識別號79所示的胺基酸序列所構成的CDRH2(SISRGGDNTYYRDTVKG)、及由序列識別號80所示的胺基酸序列所構成的CDRH3(LNYNNYFDY)。又，A2-25C抗體之輕鏈可變區包含由序列識別號81所示的胺基酸序列所構成的CDRL1(QASQDIGNWLS)、由序列識別號82所示的胺基酸序列所構成的CDRL2(GATSLAD)、及由序列識別號83所示的胺基酸序列所構成的CDRL3(LQAYSAPFT)。此等之CDR之胺基酸序列亦記載於第14圖。
又，進一步將各CDR中之1至3個之胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基的CDR改造人化抗體亦只要具有對ALK2的結合活性，皆包含於本發明之抗體。就於CDRL2中的胺基酸取代例而言，可列舉於序列識別號34所示的胺基酸序列，將1個之胺基酸取代的CDRL2。較佳為由序列識別號71所示的胺基酸序列所構成的CDRL2(RSSNLAQ)。此CDR之胺基酸序列亦記載於第11圖。
就來自A2-15A抗體之人化抗體之實例而言，可列舉包含下述重鏈可變區的重鏈及包含下述輕鏈可變區的輕鏈之任意之組合：含有包含序列表之序列識別號28所示的胺基酸序列之第20至142號之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號30所示的胺基酸序列之第20至142號之胺基酸殘基的胺基酸序列、或包含序列表之序列識別號105所示的胺基酸序列之第20至142號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈可變區；及含有包含序列識別號32所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號34所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號36所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基的胺基酸序列、或包含序列識別號38所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈可變區。
就適合的組合而言，可列舉包含下述重鏈及輕鏈之抗體：含有包含序列識別號28所示的胺基酸序列之第20至142號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號32所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號28所示的胺基酸序列之第20至142號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號34所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號30所示的胺基酸序列之第20至142號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號32所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號30所示的胺基酸序列之第20至142號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號34所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號30所示的胺基酸序列之第20至142號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號36所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號30所示的胺基酸序列之第20至142號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號38所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；或含有包含序列識別號105所示的胺基酸序列之第20至142號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號36所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈。
就更適合的組合而言，可列舉包含下述重鏈及輕鏈之抗體：含有包含序列識別號28所示的胺基酸序列之第20至472號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號32所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；含有包含序列識別號28所示的胺基酸序列之第20至472號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號34所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；含有包含序列識別號30所示的胺基酸序列之第20至472號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號32所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；含有包含序列識別號30所示的胺基酸序列之第20至472號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號34所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；含有包含序列識別號30所示的胺基酸序列之第20至472號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號36所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；含有包含序列識別號30所示的胺基酸序列之第20至472號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號38所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；或含有包含序列識別號105所示的胺基酸序列之第20至468號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號36所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈。
就進一步更適合的組合而言，可列舉包含下述重鏈及輕鏈之抗體：含有包含序列識別號30所示的胺基酸序列之第20至142號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號36所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；或含有包含序列識別號105所示的胺基酸序列之第20至142號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號36所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈。
就又進一步更適合的組合而言，可列舉包含下述重鏈及輕鏈之抗體：含有包含序列識別號30所示的胺基酸序列之第20至472號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號36所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；或含有包含序列識別號105所示的胺基酸序列之第20至468號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號36所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈。
就最適合的組合而言，可列舉包含下述重鏈及輕鏈之抗體：含有包含序列識別號105所示的胺基酸序列之第20至468號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號36所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈。
就來自A2-27D抗體之人化抗體之實例而言，可列舉包含下述重鏈可變區的重鏈及包含下述輕鏈可變區的輕鏈之任意之組合：含有包含序列表之序列識別號40所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列表之序列識別號42所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列表之序列識別號44所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列表之序列識別號46所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號48所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號107所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列、或包含序列識別號109所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈可變區；及含有包含序列識別號50所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號52所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號54所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列、或包含序列識別號58所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈可變區。
就適合的組合而言，可列舉包含下述重鏈及輕鏈之抗體：含有包含序列識別號40所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號50所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號40所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號52所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號40所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號54所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號42所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號50所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號42所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號52所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號42所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號54所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號44所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號50所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號44所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號52所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號44所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號54所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號44所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號46所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號54所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號46所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號46所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號58所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；或含有包含序列識別號48所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號107所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號52所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；或含有包含序列識別號109所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈。
就更適合的組合而言，可列舉包含下述重鏈及輕鏈之抗體：含有包含序列識別號40所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號50所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；含有包含序列識別號40所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號52所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；含有包含序列識別號40所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號54所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；含有包含序列識別號42所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號50所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；含有包含序列識別號42所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號52所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；含有包含序列識別號42所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號54所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；含有包含序列識別號44所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號50所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；含有包含序列識別號44所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號52所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；含有包含序列識別號44所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號54所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；含有包含序列識別號44所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；含有包含序列識別號46所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號54所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；含有包含序列識別號46所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；含有包含序列識別號46所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號58所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；或含有包含序列識別號48所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；含有包含序列識別號107所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號52所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；或含有包含序列識別號109所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈。
就進一步適合的組合而言，可列舉包含下述重鏈及輕鏈之抗體：含有包含序列識別號42所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號52所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號44所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號107所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號52所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；或含有包含序列識別號109所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈。
就進一步更適合的組合而言，可列舉包含下述重鏈及輕鏈之抗體：含有包含序列識別號42所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號52所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；含有包含序列識別號44所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；含有包含序列識別號107所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號52所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；或含有包含序列識別號109所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈。
就最適合的組合而言，可列舉包含下述重鏈及輕鏈之抗體：含有包含序列識別號107所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號52所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；或含有包含序列識別號109所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈。
就來自A2-11E抗體之人化抗體之實例而言，可列舉包含下述重鏈可變區的重鏈及包含下述輕鏈可變區的輕鏈之任意之組合：含有包含序列表之序列識別號111所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基的胺基酸序列、或包含序列識別號113所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基的胺基酸序列之重鏈可變區；及含有包含序列識別號115所示的胺基酸序列之第21至128號之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號117所示的胺基酸序列之第21至128號之胺基酸殘基的胺基酸序列、或包含序列識別號119所示的胺基酸序列之第21至128號之胺基酸殘基的胺基酸序列之輕鏈可變區。
就適合的組合而言，可列舉包含下述重鏈及輕鏈之抗體：含有包含序列識別號111所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號115所示的胺基酸序列之第21至128號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號111所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號117所示的胺基酸序列之第21至128號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號111所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號119所示的胺基酸序列之第21至128號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號113所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號115所示的胺基酸序列之第21至128號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號113所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號117所示的胺基酸序列之第21至128號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；或含有包含序列識別號113所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號119所示的胺基酸序列之第21至128號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈。
就更適合的組合而言，可列舉包含下述重鏈及輕鏈之抗體：含有包含序列識別號111所示的胺基酸序列之第20至467號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號115所示的胺基酸序列之第21至233號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；含有包含序列識別號111所示的胺基酸序列之第20至467號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號117所示的胺基酸序列之第21至233號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；含有包含序列識別號111所示的胺基酸序列之第20至467號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號119所示的胺基酸序列之第21至233號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；含有包含序列識別號113所示的胺基酸序列之第20至467號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號115所示的胺基酸序列之第21至233號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；含有包含序列識別號113所示的胺基酸序列之第20至467號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號117所示的胺基酸序列之第21至233號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；或含有包含序列識別號113所示的胺基酸序列之第20至467號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號119所示的胺基酸序列之第21至233號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈。
就來自A2-25C抗體之人化抗體之實例而言，可列舉包含下述重鏈可變區的重鏈及包含下述輕鏈可變區的輕鏈之任意之組合：含有包含序列表之序列識別號121所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基的胺基酸序列、或包含序列識別號123所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基的胺基酸序列之重鏈可變區；及含有包含序列識別號125所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號127所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列、或包含序列識別號129所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列之輕鏈可變區。
就適合的組合而言，可列舉包含下述重鏈及輕鏈之抗體：含有包含序列識別號121所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號125所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號121所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號127所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號121所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號129所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號123所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號125所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號123所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號127所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；或含有包含序列識別號123所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號129所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈。
就更適合的組合而言，可列舉包含下述重鏈及輕鏈之抗體：含有包含序列識別號121所示的胺基酸序列之第20至467號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號125所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；含有包含序列識別號121所示的胺基酸序列之第20至467號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號127所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；含有包含序列識別號121所示的胺基酸序列之第20至467號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號129所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；含有包含序列識別號123所示的胺基酸序列之第20至467號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號125所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；含有包含序列識別號123所示的胺基酸序列之第20至467號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號127所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；或含有包含序列識別號123所示的胺基酸序列之第20至467號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號129所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈。
作為本發明之抗體，可進一步例舉人類抗體。抗ALK2人類抗體意指僅具有來自人類染色體之抗體之基因序列的人類抗體。抗ALK2人類抗體可藉由使用具有含人類抗體之重鏈與輕鏈之基因的人類染色體片段的人類抗體產生小鼠之方法(參照Tomizuka, K.et al., NatureGenetics(1997)16, p.133-143, ； Kuroiwa, Y.et.al., Nucl.Acids Res.(1998)26, p.3447-3448；Yoshida, H.et.al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol.10, p.69-73(Kitagawa, Y., Matsuda, T.andIijima, S.eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999.；Tomizuka, K.et.al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97,p.722-727等)而取得。
此種人類抗體產生小鼠，具體而言，可藉由使內源性免疫球蛋白(endogenous immunoglobulin)重鏈及輕鏈之基因座被破換，經由人類人工染色體(Human artificial chromosome，HAC)載體或小鼠人工染色體(Mouse artificial chromosome，MAC)載體等之載體而導入人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈之基因座作為取代的基因重組動物、基因剔除動物及轉基因動物之製作、及此等動物彼此交配而作出。
又，藉由基因重組技術，利用編碼此種人類抗體之重鏈及輕鏈之各者的cDNA，較佳為利用含該cDNA的載體，來將真核細胞轉形，並培養產生基因重組人類單株抗體的轉形細胞，藉此亦可自培養上清液中獲得此抗體。其中，就宿主而言，可使用例如真核細胞，較佳為CHO細胞、淋巴球、或骨髓瘤等之哺乳動物細胞。
又，取得自人類抗體庫挑選之來自噬菌體顯示(phage display)之人類抗體的方法(參照Wormstone, I.M.et.al, Investigative Ophthalmology & Visual Science.(2002)43(7), p.2301-2308；Carmen, S.et.al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics(2002), 1(2), p.189-203；Siriwardena, D.et.al., Ophthalmology(2002)109(3), p.427-431等)亦為已知。
例如，可使用將人類抗體之可變區作為單鏈抗體(scFv)而使其於噬菌體表面表現，而選擇與抗原結合的噬菌體的噬菌體顯示法(Nature Biotechnology(2005), 23, (9), p.1105-1116)。藉由解析與抗原結合而選擇的噬菌體之基因，可決定編碼與抗原結合的人類抗體之可變區的DNA序列。若與抗原結合的scFv之DNA序列變得清楚，則可藉由製作具有該序列的表現載體，導入適當宿主使其發現，而取得人類抗體(WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388、Annu. Rev. Immunol (1994)12, p.433-455、Nature Biotechnology (2005)23(9), p.1105-1116)。
具有與本發明提供的抗體相同的抗原決定位的抗體亦包含於本發明之抗體。例如，可列舉與A2-11E抗體、A2-15A抗體、A2-25C抗體及/或A2-27D抗體具有相同抗原決定位的抗體。
抗體與抗原之部分高次構造結合或辨識該部分高次構造的情形，該抗體之抗原決定位可使用X射線構造解析，藉由特定與該抗體鄰接的抗原上之胺基酸殘基而決定。例如，藉由使抗體或其片段及抗原或其片段結合而結晶化，進行構造解析，可特定與抗體具有相互作用距離的抗原上之胺基酸殘基。相互作用距離為8埃(Å)以下，適合為6Å以下，更適合為4Å以下。此種具有與抗體之相互作用距離的胺基酸殘基能以1個或其以上來構成抗體之抗原決定位(抗原結合部位)。該胺基酸殘基為2個以上的情形，各胺基酸可於一次序列上彼此未鄰接。
使嵌合A2-27D抗體之Fab片段與含人類ALK2之ECD片段(序列識別號84之胺基酸編號21至123)的胜肽結合，於(2%(v/v)Tacsimate pH7.0，100mM HEPES pH7.5，20%(w/v)聚乙二醇3,350)之條件下使其結晶化時，可獲得於體心單斜晶系(body-centered monoclinic system)，空間群為C121、結晶之單位晶格為a=c=119.39Å、b=37.32Å，β=92.54之結晶。可使用此三次元構造座標而進行分子取代法，來決定位相(參照實施例16)。
A2-27D抗體係辨識人類ALK2上之部分高次構造。人類ALK2之胺基酸序列(序列識別號84)中，與A2-27D抗體具有相互作用距離的胺基酸殘基，即抗原決定位係由第18號之麩胺酸(Glu)、第19號之甘胺酸(Gly)、第39號之異白胺酸(Ile)、第40號之天冬醯胺酸(Asn)、第41號之天冬胺酸(Asp)、第42號之甘胺酸(Gly)、第43號之苯丙胺酸(Phe)、第44號之組胺酸(His)、第45號之纈胺酸(Val)、第46號之酪胺酸(Tyr)、第82號之天冬醯胺酸(Asn)、第84號之蘇胺酸(Thr)、第86號之麩醯胺酸(Gln)、及第87號之白胺酸(Leu)之各殘基所構成。與該抗原決定位結合、或者與該胺基酸殘基具有相互作用距離的抗體、其抗原結合片段或其修飾體亦包含於本發明之抗體、其抗原結合片段或其修飾體。
使嵌合A2-25C抗體之Fab片段與含人類ALK2之ECD片段(序列識別號84之胺基酸編號21至123)的胜肽結合，於(0.15M Li2SO4，0.1M檸檬酸鈉(NaCitrate)pH3.4，18%(w/v)PEG6,000，20%(v/v)乙二醇)之條件結晶化時，可獲得正交晶系(orthorhombic system)，空間群為P212121、結晶之單位晶格為a=74.49Å，b=128.05Å、c=147.73Å之結晶。可使用此三次元構造座標而進行分子取代法，來決定位相(參照實施例21)。
A2-25C抗體係辨識人類ALK2上之部分高次構造。人類ALK2之胺基酸序列(序列識別號84)中，具有與A2-25C抗體相互作用距離的胺基酸殘基，即抗原決定位係由第18號之麩胺酸(Glu)、第19號之甘胺酸(Gly)、第20號之白胺酸(Leu)、第39號之異白胺酸(Ile)、第41號之天冬胺酸(Asp)、第42號之甘胺酸(Gly)、第43號之苯丙胺酸(Phe)、第44號之組胺酸(His)、第45號之纈胺酸(Val)、第46號之酪胺酸(Tyr)、及第84號之蘇胺酸(Thr)之各殘基所構成。與該抗原決定位結合、或者與該胺基酸殘基具有相互作用距離的抗體、其抗原結合片段或其修飾體亦包含於本發明之抗體、其抗原結合片段或其修飾體。
上述之抗體係可藉由實施例2、實施例6、實施例9或實施例10所示的方法等來評價對抗原的結合性，選出適合的抗體。抗體之解離常數係例如1×10-6 -1×10-12 M，但只要可獲得由本發明之抗體所致的目的之治療或預防效果，並未限定於此範圍。抗體與抗原(ALK2)之解離常數可使用將表面電漿共振(SPR)作為檢測原理的Biacore T200(GE Healthcare Bioscience公司)來測量。例如，作為配位體而對固定化的抗原，使設定為適當濃度的抗體與分析物反應，藉由測量其結合及解離，可獲得結合速度常數ka1、解離速度常數kd1及解離常數(KD；KD=kd1/ka1)。對ALK2的結合性評價並未限定於Biacore T200之使用，亦可藉由將表面電漿共振(SPR)作為檢測原理的機器、將動力排除分析法(Kinetic Exclusion Assay)作為檢測原理的KinExA(Sapidyne Instruments公司)、將生物膜層干涉法(Bio-Layer Interferometry)作為檢測原理的BLItz系統(Pall公司)或ELISA(酵素連結免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay))法等。
就比較抗體性質之際之另一指標之一例而言，可列舉抗體之安定性。示差掃描熱析儀(DSC)係可快速或正確地測量作為蛋白之相對構造安定性之良好指標的熱變性中點(Tm)的方法。使用DSC來測量Tm値，藉由比較其値，可比較熱安定性的差異。已知抗體之保存安定性與抗體之熱安定性呈現某程度的相關(Lori Burton, et.al., Pharmaceutical Development and Technology(2007)12, p.265-273)，將熱安定性作為指標，可選出適合的抗體。作為用以選出抗體的其他指標，可列舉適當宿主細胞中的產量高、及於水溶液中之凝集性低。由於例如產量之最高抗體並非皆顯示最高熱安定性，有必要基於以上所述指標而綜合性地判斷，來選出最適合對人類投予的抗體。
又，將抗體之重鏈及輕鏈之全長序列使用適當連結物(linker)來連結，而取得單鏈免疫球蛋白(single chain immunoglobulin)的方法亦為已知(Lee, H-S, et.al., Molecular Immunology(1999)36, p.61-71；Shirrmann,T.et.al., mAbs(2010), 2, (1)p.1-4)。此種單鏈免疫球蛋白藉由作二聚體化，可保持與原本為四聚體的抗體類似的構造及活性。又，本發明之抗體可為具有單一之重鏈可變區，且不具有輕鏈序列的抗體。此種抗體稱為單一結構域抗體(single domain antibody：sdAb)或奈米抗體(nanobody)，已報告實際上於駱駝或駱馬被觀察到，且保持有抗原結合能力(Muyldemans S.et.al., Protein Eng.(1994)7(9), 1129-35, Hamers-Casterman C.et.al.,Nature (1993)363(6428)446-8)。上述之抗體亦可解釋為本發明中的抗體之抗原結合片段之一種。
又，藉由調節與本發明之抗體結合的糖鏈修飾，可增強抗體依存型的細胞毒殺活性(antibody-dependentcellular cytotoxicity)。就抗體之糖鏈修飾之調節技術而言，已知WO99/54342、WO2000/61739、WO2002/31140等，但並未限定於此等。
將抗體基因暫時單離後，導入適當宿主而製作抗體的情形，可使用適當宿主與表現載體之組合。
就抗體基因之具體例而言，可列舉本說明書記載之編碼抗體重鏈序列的基因(或多核苷酸)、編碼輕鏈序列的基因(或多核苷酸)、或者組合彼等基因(或多核苷酸)者。
編碼抗體或抗體構成成分(重鏈或輕鏈)的多核苷酸之具體例如下。 (1)一種多核苷酸，其特徵為包含以下之多核苷酸(a)及/或(b)： (a)選自包含以下之核苷酸序列的群組的多核苷酸： a1)包含序列識別號27所示的核苷酸序列之第58至426號之核苷酸的核苷酸序列； a2)包含序列識別號29所示的核苷酸序列之第58至426號之核苷酸的核苷酸序列； a3)包含序列識別號104所示的核苷酸序列之第58至426號之核苷酸的核苷酸序列； a4)與a1)至a3)之核苷酸序列具至少95%之同一性的核苷酸序列； a5)與a1)至a3)之核苷酸序列具至少99%之同一性的核苷酸序列； a6)與包含「與a1)至a3)之核苷酸序列互補的核苷酸序列」的多核苷酸於嚴格條件下雜交的多核苷酸所保有的核苷酸序列； a7)於a1)或a2)之核苷酸序列有1至數個核苷酸經取代、缺失或附加的核苷酸序列；及/或 (b)選自包含以下之核苷酸序列的群組的多核苷酸： b1)包含序列識別號31所示的核苷酸序列之第86至424號之核苷酸的核苷酸序列； b2)包含序列識別號33所示的核苷酸序列之第86至424號之核苷酸的核苷酸序列； b3)包含序列識別號35所示的核苷酸序列之第86至424號之核苷酸的核苷酸序列； b4)包含序列識別號37所示的核苷酸序列之第86至424號之核苷酸的核苷酸序列； b5)與選自b1)至b4)中任一者之核苷酸序列具至少95%之同一性的核苷酸序列； b6)與選自b1)至b4)中任一者之核苷酸序列具至少99%之同一性的核苷酸序列； b7)與包含「與選自b1)至b4)中任一者之核苷酸序列互補的核苷酸序列」的多核苷酸於嚴格條件下雜交的多核苷酸所保有的核苷酸序列； b8)於選自b1)至b4)中任一者之核苷酸序列有1至數個核苷酸經取代、缺失或附加的核苷酸序列。 (2)一種多核苷酸，其特徵為包含以下之多核苷酸(a)及/或(b)： (a)選自包含以下之核苷酸序列的群組的多核苷酸： a1)包含序列識別號39所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列； a2)包含序列識別號41所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列； a3)包含序列識別號43所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列； a4)包含序列識別號45所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列； a5)包含序列識別號47所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列； a6)包含序列識別號106所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列； a7)包含序列識別號108所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸的核苷酸序列； a8)與選自a1)至a7)中任一者之核苷酸序列具至少95%之同一性的核苷酸序列； a9)與選自a1)至a7)中任一者之核苷酸序列具至少99%之同一性的核苷酸序列； a10)與包含「與選自a1)至a7)中任一者之核苷酸序列互補的核苷酸序列」的多核苷酸於嚴格條件下雜交的多核苷酸所保有的核苷酸序列； a11)於選自a1)至a7)中任一者之核苷酸序列有1至數個核苷酸經取代、缺失或附加的核苷酸序列；及/或 (b)選自包含以下之核苷酸序列的群組的多核苷酸： b1)包含序列識別號49所示的核苷酸序列之第86至412號之核苷酸的核苷酸序列； b2)包含序列識別號51所示的核苷酸序列之第86至412號之核苷酸的核苷酸序列； b3)包含序列識別號53所示的核苷酸序列之第86至412號之核苷酸的核苷酸序列； b4)包含序列識別號55所示的核苷酸序列之第86至412號之核苷酸的核苷酸序列； b5)包含序列識別號57所示的核苷酸序列之第86至412號之核苷酸的核苷酸序列； b6)與選自b1)至b5)中任一者之核苷酸序列具有至少95%之同一性的核苷酸序列； b7)與選自b1)至b5)中任一者之核苷酸序列具有至少99%之同一性的核苷酸序列； b8)與包含「與選自b1)至b5)中任一者之核苷酸序列互補的核苷酸序列」的多核苷酸於嚴格條件下雜交的多核苷酸所保有的核苷酸序列； b9)於選自b1)至b5)中任一者之核苷酸序列有1至數個核苷酸經取代、缺失或附加的核苷酸序列。 (3)一種多核苷酸，其特徵為包含以下之多核苷酸(a)及/或(b)： (a)選自包含以下之核苷酸序列的群組的多核苷酸： a1)包含序列識別號110所示的核苷酸序列之第58至411號之核苷酸的核苷酸序列； a2)包含序列識別號112所示的核苷酸序列之第58至411號之核苷酸的核苷酸序列； a3)與a1)或a2)之核苷酸序列具至少95%之同一性的核苷酸序列； a4)與a1)或a2)之核苷酸序列具至少99%之同一性的核苷酸序列； a5)與包含「與a1)或a2)之核苷酸序列互補的核苷酸序列」的多核苷酸於嚴格條件下雜交的多核苷酸所保有的核苷酸序列； a6)於a1)或a2)之核苷酸序列有1至數個核苷酸經取代、缺失或附加的核苷酸序列；及/或 (b)選自包含以下之核苷酸序列的群組的多核苷酸： b1)包含序列識別號114所示的核苷酸序列之第61至384號之核苷酸的核苷酸序列； b2)包含序列識別號116所示的核苷酸序列之第61至384號之核苷酸的核苷酸序列； b3)包含序列識別號118所示的核苷酸序列之第61至384號之核苷酸的核苷酸序列； b4)與選自b1)至b3)中任一者之核苷酸序列具至少95%之同一性的核苷酸序列； b5)與選自b1)至b3)中任一者之核苷酸序列具至少99%之同一性的核苷酸序列； b6)與包含「與選自b1)至b3)中任一者之核苷酸序列互補的核苷酸序列」的多核苷酸於嚴格條件下雜交的多核苷酸所保有的核苷酸序列； b7)於選自b1)至b3)中任一者之核苷酸序列有1至數個核苷酸經取代、缺失或附加的核苷酸序列。 (4)一種多核苷酸，其特徵為包含以下之多核苷酸(a)及/或(b)： (a)選自包含以下之核苷酸序列的群組的多核苷酸： a1)包含序列識別號120所示的核苷酸序列之第58至411號之核苷酸的核苷酸序列； a2)包含序列識別號122所示的核苷酸序列之第58至411號之核苷酸的核苷酸序列； a3)與a1)或a2)之核苷酸序列具至少95%之同一性的核苷酸序列； a4)與a1)或a2)之核苷酸序列具至少99%之同一性的核苷酸序列； a5)與包含「與a1)或a2)之核苷酸序列互補的核苷酸序列」的多核苷酸於嚴格條件下雜交的多核苷酸所保有的核苷酸序列； a6)於a1)或a2)之核苷酸序列有1至數個核苷酸經取代、缺失或附加的核苷酸序列；及/或 (b)選自包含以下之核苷酸序列的群組的多核苷酸： b1)包含序列識別號124所示的核苷酸序列之第61至387號之核苷酸的核苷酸序列； b2)包含序列識別號126所示的核苷酸序列之第61至387號之核苷酸的核苷酸序列； b3)包含序列識別號128所示的核苷酸序列之第61至387號之核苷酸的核苷酸序列； b4)與選自b1)至b3)中任一者之核苷酸序列具至少95%之同一性的核苷酸序列； b5)與選自b1)至b3)中任一者之核苷酸序列具至少99%之同一性的核苷酸序列； b6)與包含「與選自b1)至b3)中任一者之核苷酸序列互補的核苷酸序列」的多核苷酸於嚴格條件下雜交的多核苷酸所保有的核苷酸序列； b7)於選自b1)至b3)中任一者之核苷酸序列有1至數個核苷酸經取代、缺失或附加的核苷酸序列。
將宿主細胞轉形之際，重鏈序列基因(或多核苷酸)與輕鏈序列基因(或多核苷酸)可被插入同一表現載體，又亦可被插入各別表現載體。將真核細胞作為宿主使用的情形，可使用動物細胞、植物細胞、真核微生物。就動物細胞而言，可列舉哺乳類細胞，例如，為猴細胞的COS細胞(Gluzman, Y.Cell(1981)23, p.175-182、ATCC CRL-1650)、小鼠纖維母細胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)或中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞、ATCC CCL-61)之二氫葉酸還原酵素缺損株(Urlaub, G.and Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1980)77, p.4126-4220)。又，使用原核細胞的情形，可列舉例如，大腸菌、枯草菌。藉由對此等之細胞利用轉形而將為目的之抗體基因導入，將經轉形細胞於活體外培養，可獲得抗體。於以上之培養法有依抗體之序列而產量不同的情形，以產量為指標，可自具有同等結合活性的抗體之中挑選容易作為醫藥生產者。
並無作為本發明之抗體之同型(isotype)的限制，可列舉例如IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(IgA1，IgA2)、IgD或IgE等，但較佳可列舉IgG或IgM，更佳可列舉IgG1、IgG2或IgG4。
使用IgG1作為本發明之抗體之同型的情形，可藉由將恒定區之胺基酸殘基的一部分取代，而調整效應物(effector)機能(參照WO88/07089、WO94/28027、WO94/29351)。就IgG1之突變體而言，可列舉IgG1 LALA(IgG1-L234A，L235A)、IgG1 LAGA(IgG1-L235A，G237A)等，較佳為IgG1 LALA。
使用IgG4作為本發明之抗體之同型的情形，藉由將恒定區之胺基酸殘基之一部分作取代，而IgG4特有的分割被抑制，可延長半衰期(參照Molecular Immunology, 30, 1 105-108(1993))。作為IgG4之突變體，可列舉IgG4 pro(IgG4-S241P)等。
又本發明之抗體可為具有抗體之抗原結合部的抗體之抗原結合片段或其修飾物。將抗體以木瓜酵素、胃蛋白酶等之蛋白質分解酵素處理，或者將抗體基因藉由基因工程手法改造而於適當培養細胞中表現，藉此可獲得該抗體之片段。於此種抗體片段中，可將保持抗體全長分子所具有的機能全部或一部分的片段稱為抗體之抗原結合片段。就抗體之機能而言，一般可列舉抗原結合活性、抑制抗原活性的活性、增強抗原活性的活性、抗體依存型的細胞毒殺活性、補體依存性細胞毒殺活性、及補體依存性細胞性細胞毒殺活性。本發明中的抗體之抗原結合片段所保持的機能為對ALK2的結合活性，較佳為抑制ALK2活性的活性，更佳為抑制經由ALK2的BMP訊息傳遞的活性，最佳為抑制異位性骨化及/或骨發育不全的活性。
例如，就抗體之片段而言，可列舉Fab、F(ab’)2、Fv、或將重鏈及輕鏈之Fv以適當連結物連結的單鏈Fv(scFv)、雙體抗體(diabody或diabodies)、線狀抗體、及由抗體片段所形成的多專一性抗體等。又，作為將F(ab’)2 於還原條件下處理的抗體之可變區之一價片段的Fab’亦包含於抗體之片段。
再者，本發明之抗體可為對至少2種類之相異抗原具有專一性的多專一性抗體。通常此種分子為與2種類之抗原結合者(即，雙專一性抗體(bispecific antibody))，本發明中的「多專一性抗體」係包含對其以上(例如，3種類)之抗原具有專一性的抗體者。
本發明之多專一性抗體可為包含全長的抗體、或此種抗體之片段(例如，雙專一性抗體)。雙專一性抗體可使2種類之抗體之重鏈與輕鏈(HL對)結合而製作，亦可藉由使產生相異的單株抗體的融合瘤融合，而製作產生雙專一性抗體之融合細胞來製作(Millstein et al., Nature(1983)305, p.537-539)。
本發明之抗體可為單鏈抗體(亦記載為scFv)。單鏈抗體可藉由將抗體之重鏈可變區與輕鏈可變區以多肽連結物連結而獲得(Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113(Rosenberg及Moore編, Springer Verlag, New York, p.269-315(1994)、Nature Biotechnology (2005), 23, p.1126-1136)。又，亦可將使2個scFv以多肽連結物結合而製作的BiscFv片段作為雙專一性抗體來使用。
製作單鏈抗體的方法為本項技術領域所周知(例如，參照美國專利第4,946,778號、美國專利第5,260,203號、美國專利第5,091,513號、美國專利第5,455,030號等)。關於此scFv，重鏈可變區與輕鏈可變區係藉由以未作成共軛物的方式之連結物，較佳為藉由多肽連結物而使其連結(Huston, J.S.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1988), 85, p.5879-5883)。scFv中的重鏈可變區及輕鏈可變區可來自相同抗體，亦可來自各別之抗體。就連結可變區的多肽連結物而言，例如可使用包含12～19個殘基的任意之單鏈胜肽。
編碼scFv的DNA係可藉由於編碼前述抗體之重鏈或重鏈可變區的DNA、及編碼輕鏈或輕鏈可變區的DNA中，將編碼彼等序列之中的全部或所冀望的胺基酸序列的DNA部分作為模板，使用規定其兩端的引子對而利用PCR法放大，接著，再將編碼多肽連結物部分的DNA、及以其兩端各自與重鏈、輕鏈連結的方式規定的引子對組合而進行放大來獲得。
又，一旦編碼scFv的DNA被製作時，可藉由通常方法獲得含有彼等的表現載體、及藉由該表現載體轉形的宿主，又，藉由使用其宿主，可按照通常方法獲得scFv。此等之抗體片段可與前述同樣地取得基因而使其表現，藉由宿主而使其產生。
本發明之抗體可為多量化而提高對抗原的親和性者。就多量化的抗體而言，可為1種類之抗體，亦可為辨識同一抗原之複數抗原決定位的複數個抗體。就將抗體多量化的方法而言，可列舉IgG CH3結構域與2個scFv之結合、與鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)的結合、螺旋-轉角-螺旋模體(helix-turn-helix motif)之導入等。
本發明之抗體可為胺基酸序列不同的複數種類之抗ALK2抗體之混合物的多株抗體。就多株抗體之一例而言，可列舉CDR相異的複數種類之抗體之混合物。就此種多株抗體而言，可培養產生相異抗體的細胞之混合物，使用自該培養物純化的抗體(參照WO2004/061104)。
本發明之抗體可為與上述之抗體之重鏈及/或輕鏈比較，具有80%至99%之同一性的抗體。本文中，作為「同一性」的用語具有本項技術領域使用的一般的定義。同一性之%係指將2個胺基酸序列以使胺基酸的一致性程度成為最大的方式並列(alignment)時每一總計胺基酸數(包含缺口)之相同胺基酸數的百分比。可藉由組合顯示與上述之重鏈胺基酸序列及輕鏈胺基酸序列高同一性的序列，而選擇具有與上述之各抗體同等之抗原結合能力、BMP訊息傳遞之抑制作用的抗體。此種同一性一般而言係80%以上之同一性，較佳為90%以上之同一性，更佳為95%以上之同一性，最佳為99%以上之同一性。又，藉由將於重鏈及/或輕鏈之胺基酸序列有1至數個胺基酸殘基經取代、缺失及/或附加的胺基酸序列組合，亦可選擇與上述之各抗體具有同等之各種作用的抗體。經取代、缺失及/或附加的胺基酸殘基數一般而言為10個胺基酸殘基以下，較佳為5至6個胺基酸殘基以下，更佳為2至3個胺基酸殘基以下，最佳為1個胺基酸殘基。
又，於哺乳類培養細胞生產的抗體之重鏈之羧基末端的離胺酸殘基有缺失者為已知(Journal of Chromatography A, 705: 129-134(1995))，又，相同重鏈羧基末端之甘胺酸、離胺酸之2個胺基酸殘基缺失，位於新的羧基末端的脯胺酸殘基被醯胺化者為已知(Analytical Biochemistry, 360: 75-83(2007))。
再者，於抗體之製作時，抗體之重鏈或輕鏈之胺基末端的麩醯胺酸或麩胺酸殘基經焦麩胺醯基(pyroglutamyl)化修飾者為已知，本發明之抗體可具有如此的修飾(WO2013/147153)。
然而，此等重鏈序列之缺失、或重鏈或輕鏈序列之修飾並未影響抗體之抗原結合能及效應物機能(補體之活性化或抗體依存性細胞毒殺作用等)。
據此，本發明亦包含受到該缺失或修飾的抗體，可列舉於重鏈羧基末端有1或2個之胺基酸缺失的缺失體、及經醯胺化的該缺失體(例如，羧基末端部位之脯胺酸殘基經醯胺化的重鏈)、重鏈或輕鏈之胺基末端胺基酸殘基為經焦麩胺醯基化的抗體等。惟，只要保有抗原結合能力及效應物機能，與本發明有關的抗體之重鏈之羧基末端之缺失體並未限定於上述種類。構成與本發明有關的抗體的2條重鏈可為完全長度及選自包含上述缺失體的群組的重鏈之任一種，亦可為將任一者二種組合。各缺失體之量比雖受到產生與本發明有關的抗體的哺乳類培養細胞之種類及培養條件的影響，但作為與本發明有關的抗體之主成分，可列舉於2股重鏈之雙方，羧基末端之1個胺基酸殘基有缺失的情形。
二種類之胺基酸序列間之同一性可藉由使用Blast algorithm version 2.2.2(Altschul, Stephen F., Thomas L.Madden, Alejandro A.Schäffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J.Lipman(1997), 「Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs」, Nucleic Acids Res.25: 3389-3402)之默認參數(defaultparameter)來決定。Blast algorithm亦可藉由於網際網路存取www.ncbi.nlm.nih.gov/blast來使用。又，藉由上述之Blast algorithm，計算同一性(Identity(或Identities))及正確性(Positivity(或Positivities))之2種類之百分比的値。前者係於應求得同一性的二種類之胺基酸序列之間胺基酸殘基為一致的情形之値，後者係亦考慮化學構造類似的胺基酸殘基的數値。於本說明書，將具有胺基酸殘基為一致的情形之同一性(Identity)之値作為同一性之値。
作為抗體之修飾物，亦可使用與聚乙二醇(PEG)等之各種分子結合的抗體。
本發明之抗體進一步可為此等之抗體與其他之藥劑形成結合物者(免疫結合物(Immunoconjugate))。就此種抗體之例而言，可列舉該抗體與放射性物質或具有藥理作用的化合物結合之物(Nature Biotechnology(2005)23, p.1137-1146)。
獲得的抗體可純化至均一。抗體之分離、純化係使用於通常蛋白質使用的分離、純化方法即可。例如若將管柱層析、過濾器過濾、超過率、鹽析、透析、調製用聚丙烯醯胺膠體電泳、等電點電泳等適宜選擇、組合，可將抗體分離、純化(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory CourseManual, Daniel R.Marshak et al.eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)；Antibodies: A LaboratoryManual.Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但未限定於此等。
就層析而言，可列舉親和性層析、離子交換層析、疏水性層析、膠體過濾層析、逆相層析、吸附層析等。
此等之層析可使用HPLC或FPLC等之液體層析來進行。
就於親和性層析使用的管柱而言，可列舉Protein A管柱、Protein G管柱。
例如就使用Protein A管柱的管柱而言，可列舉Hyper D, POROS, Sepharose F.F.(GE HEALTHCARE)等。
又使用將抗原固定化的擔體，而利用對抗原之結合性來純化抗體亦為可能的。
5.含有抗ALK2抗體之醫藥 自以上述之「4.抗ALK2抗體之製造」項目中記載的方法獲得的抗ALK2抗體之中，可獲得抑制ALK2之生物活性的抗體。抑制此等ALK2之生物活性的抗體因於活體內抑制ALK2之生物活性，即抑制經由ALK2的BMP訊息傳遞，故可作為醫藥、作為對異位性骨化及/或骨發育不全的治療及/或預防劑、或對貧血的治療及/或預防劑使用。
就以抗ALK2抗體可能治療及/或預防的疾病而言，可列舉例如，進行性肌肉骨化症(FOP)、進行性骨化錯生(POH)、外傷性之異位性骨化、人工關節取代術後之異位性骨化、脊椎關節炎(SpA)、僵直性脊椎炎(AS)、貧血、瀰漫型內因性橋腦神經膠細胞瘤(diffuse intrinsic pontine glioma，DIPG)、毛髮稀疏等，較佳為進行性肌肉骨化症(FOP)、進行性骨化錯生(POH)、外傷性之異位性骨化、或人工關節取代術後之異位性骨化，更佳為進行性肌肉骨化症(FOP)，但只要為起因於經由ALK2的BMP訊息傳遞的疾病，並未限定於此等。於FOP之患者亦可見手腳的指癒合或變形、頸椎癒合或變形等，亦觀察到聽力損失，但此等亦包含於起因於經由ALK2的BMP訊息傳遞的疾病。
於全部之FOP的患者，皆於ALK2觀察到活性化型突變，迄今已報告10種類以上之突變之種類。已知彼等突變全部為存在於ALK2蛋白質之細胞內區域的胺基酸突變(誤義突變(missense mutation))，於細胞外區域之胺基酸序列無變化。本發明之抗體因與ALK2之細胞外區域結合，故不論突變的種類，可使用作為對全部之FOP患者的治療及/或預防劑。
FOP之治療意指FOP症狀之治癒、症狀之改善、症狀之減輕、或症狀進行之抑制。
FOP之預防意指回避或抑制症狀突發或異位性骨化發病。
又，本發明之抗體因不僅與突變ALK2結合，亦與野生型之ALK2結合，且阻礙下游訊息，故即使對與FOP相異的非遺傳性之異位性骨化，亦可使用作為治療及/或預防劑。就非遺傳性之異位性骨化而言，可列舉腦挫傷後之異位性骨化、脊髓損傷後之異位性骨化、燙傷後之異位性骨化、人工關節取代術後之異位性骨化等。已報告神經胜肽或肥大細胞・巨噬細胞等之免疫系細胞的參與作為彼等非遺傳性之異位性骨化的原因(參照J.Cell. Biochem., 112, 10(2011)、J.Cell. Biochem., 112, 10(2011)、及J.Pathol., 236, 2(2015))，於FOP之患者中的症狀突發，亦暗示同樣的機制有影響(參照Hum.Pahol., 32, 8(2001)、及Histol.Histopathol., 29, 10(2014))。據此，本發明之抗體不僅可使用作為FOP中的異位性骨化之治療及/或預防劑，亦可使用作為非遺傳性之異位性骨化之治療及/或預防劑。
作為藉由貧血之BMP-ALK訊息傳遞路徑而正向控制轉錄的標的基因，已知有鐵調節素(Hepcidin)(參照Blood, 118, 15(2011))。鐵調節素係主要於肝臟產生的胜肽荷爾蒙，控制在消化道表現的與鐵吸收有關的運輸蛋白(鐵轉運蛋白(Ferroportin))之分解(參照Science，306, 5704(2004))。已報告鐵調節素之機能抑制或抑制表現量係經由鐵轉運蛋白之表現量增加而促進自消化道之鐵的攝取，故有成為貧血之治療藥的可能性(參照Pharmacol Ther, 146(2015))。據此，本發明之抗體因經由肝臓中的鐵調節素之表現抑制，而使鐵之吸收增加，亦可使用作為鐵缺乏性之貧血之治療及/或預防劑。
或者，本發明之抗體亦可使用作為瀰漫型內因性橋腦神經膠細胞瘤(DIPG)之治療及/或預防劑。DIPG係集中於腦幹部之橋腦之可見的瀰漫性(浸潤性)之星狀細胞系腫瘤，可謂佔小兒腦幹腫瘤之約75～80%，因腦幹控制呼吸等之必須機能，而有生存率於2年下降至10%左右的報告(Khuong-Quang D-A et al., Acta Neuropathol 124: 439-447, 2012)。本發明之抗體亦可使用作為DIPG之治療及/或預防劑。
就作為上述之醫藥之抗ALK2抗體之例而言，可列舉自A2-15A抗體、A2-27D抗體、A2-11E抗體、或A2-25C抗體藉由「4.抗ALK2抗體之製造」記載的方法所製作的嵌合抗體或人化抗體。又，與A2-15A抗體、A2-27D抗體A2-11E抗體、及/或A2-25C抗體具有相同抗原決定位的嵌合抗體、人化抗體及人類抗體亦可使用作為醫藥。
於活體外之由抗ALK2抗體所致的ALK2之生物活性(BMP訊息抑制活性)，可藉由例如，使用插入有BMP反應序列的報導質體(reporter plasmid)的螢光素酶分析、SMAD1/5/8之磷酸化、BMP標的基因之表現解析、或測量利用由BMP配位體所致的刺激而被誘導向造骨細胞分化的小鼠肌母細胞C2C12中的鹼性磷酸酶活性而確認。
於活體內之利用實驗動物的抗ALK2抗體之對異位性骨化或骨發育不全的治療或預防效果，可藉由例如，對於小鼠肌肉移植含有BMP配位體的丸粒的異位性骨化誘導模型、或導入有突變ALK2的FOP模型小鼠，將抗ALK2抗體皮下或靜脈投予，解析異位性骨之形成來確認。
如此獲得的抗AKL2抗體有用於作為醫藥，特別是以進行性肌肉骨化症(FOP)等之異位性骨化之治療或預防為目的的醫藥組成物。
抗ALK2抗體就一例而言，可對異位性骨化之治療或預防單獨投予該抗體，或者與至少一種之其他異位性骨化治療劑併用來投予。又作為一例而言，抗ALK2抗體可與治療上有效量之治療劑併用來投予。就可與抗ALK2抗體併用的其他異位性骨化治療劑而言，可列舉消炎劑、類固醇劑、雙膦酸鹽、肌肉鬆弛劑、視網酸受體(RAR)γ促效劑等，但未限定於此等。
就消炎劑而言，可列舉阿斯匹林(aspirin)、雙氯芬酸(diclofenac)、吲哚美辛(indomethacin)、伊布洛芬(ibuprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、萘普生(naproxen)、匹若西卡(piroxicam)、羅菲可西保(rofecoxib)、塞來昔布(Celecoxib)、硫唑嘌呤(azathioprine)、青黴胺(penicillamine)、胺甲蝶呤(Methotrexate)、柳氮磺胺吡啶(Sulfasalazine)、來氟米特(leflunomide)、英夫利昔單抗(Infliximab)、依那西普(etanercept)等，較佳為吲哚美辛、伊布洛芬、匹若西卡、或塞來昔布。
就類固醇劑而言，可列舉普賴蘇穠(prednisolone)、氯地米松(beclomethasone)、貝皮質醇(betamethasone)、氟替卡松(fluticasone)、地塞米松(dexamethasone)、氫化可體松(hydrocortisone)等，較佳為普賴蘇穠。
就雙膦酸鹽而言，可列舉阿侖膦酸鹽(alendronate)、斯孟膦酸鹽(cimadronate)、氯屈膦酸鹽(clodronate)、依替膦酸鹽(etidronate)、伊班磷酸鹽(ibandronate)、因卡膦酸鹽(incadronate)、米諾膦酸鹽(minodronate)、奈立膦酸鹽(neridronate)、奥帕膦酸鹽(olpadronate)、帕米膦酸鹽(pamidronate)、吡膦酸鹽(Piridronate)、利塞膦酸鹽(risedronate)、替魯膦酸鹽(tiludronate)、唑來膦酸鹽(Zoledronate)等，較佳為帕米膦酸鹽、或唑來膦酸鹽。
就肌肉鬆弛劑而言，可列舉環苯扎林(cyclobenzaprine)、美他沙酮(metaxalone)、巴氯芬(baclofen)等，較佳為巴氯芬。
就視網酸受體γ促效劑而言，可列舉帕羅伐汀(Palovarotene)等。
按照異位性骨化之狀態或以何種程度之治療及/或預防為目標，亦可投予2、3或其以上之其他治療劑，彼等之其他治療劑可藉由封入相同製劑中而同時投予。其他治療劑與抗ALK2抗體亦可藉由封入同一製劑中而同時投予。又，亦可將抗ALK2抗體與其他治療劑封入各別製劑而同時投予。再者，亦可將其他藥劑與抗ALK2抗體互為前後而各別投予。即，可於投予其他治療劑後再投予含有抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段作為有效成分的治療劑，或者於投予含有抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段作為有效成分的治療劑後再投予其他治療劑。於基因治療而投予的情形，蛋白質性之異位性骨化治療劑之基因與抗ALK2抗體之基因可插入各別或相同啟動子區域的下游，可導入各別或相同載體。
藉由使異位性骨化治療劑對抗ALK2抗體、或者其片段結合，可製造M.C.Garnet「Targeted drug conjugates: principles and progress」, Advanced DrugDelivery Reviews, (2001)53, 171-216記載之標的型藥物複合體。於此目的，除了抗體分子之外，只要ALK2之辨識性未完全消失，亦可適用任一種之抗體片段，可列舉例如，Fab、F(ab’)2 、Fv等之片段作為例子，於本發明亦同樣地可使用抗體及該片段。抗ALK2抗體或該抗體之片段與FOP治療劑之結合樣式可有M.C.Garnet「Targeteddrug conjugates: principles and progress」, Advanced Drug Delivery Reviews, (2001)53, 171-216、G.T.Hermanson「Bioconjugate Techniques」Academic Press, California(1996)、Putnam and J.Kopecek「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」Advances in Polymer Science(1995)122, 55-123等記載的各種形態。即，可列舉使抗ALK2抗體與異位性骨化治療劑化學性直接或介隔寡肽等之間隔物而結合的樣式、或介隔適當藥物擔體而結合的樣式。就藥物擔體之例而言，可列舉脂質體或水溶性高分子。作為介隔此等藥物擔體的樣式，具體而言，可列舉使異位性骨化治療劑包含於脂質體，且該脂質體與抗體結合的樣式；及使異位性骨化治療劑化學性直接或介隔寡肽等之間隔物而與水溶性高分子(分子量1000至10萬左右之化合物)結合，且該水溶性高分子與抗體結合的樣式作為例子。抗體(或該片段)與異位性骨化治療劑、脂質體及水溶性高分子等之藥物擔體之結合可藉由G.T.Hermanson「Bioconjugate Techniques」Academic Press, California(1996)、Putnam and J. Kopecek「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」Advances in Polymer Science(1995)122, 55-123記載之方法等之本項技術領域中具通常知識者周知的方法來實施。異位性骨化治療劑之向脂質體的包含可藉由D.D.Lasic「Liposomes: From Physics to Applications」, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam(1993)等記載之方法等之本項技術領域中具通常知識者周知的方法來實施。異位性骨化治療劑之對水溶性高分子之結合可藉由D.Putnam and J Kopecek「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」Advances in Polymer Science(1995)122, 55-123記載之方法等之本項技術領域中具通常知識者周知的方法來實施。抗體(或該片段)與蛋白質性之異位性骨化治療劑(或該片段)之複合體除了上述之方法外，亦可藉由基因工程上本項技術領域中具通常知識者周知之方法來製作。
本發明亦提供含有治療及/或預防上有效量之抗ALK2抗體與藥學上可容許的稀釋劑、載體、助溶劑、乳化劑、保存劑及/或輔助劑的醫藥組成物。
本發明亦提供含有治療及/或預防上有效量之抗ALK2抗體與治療及/或預防上有效量之至少一種之異位性骨化治療劑及藥學上可容許的稀釋劑、載體、助溶劑、乳化劑、保存劑及/或輔助劑的醫藥組成物。
於本發明之醫藥組成物中作為可容許的製劑所使用的物質，較佳為於投予量或投予濃度對於被投予醫藥組成物者為非毒性者為較佳。
本發明之醫藥組成物可含有用以變更或保持pH、滲透壓、黏度、透明度、顏色、等張性、無菌性、安定性、溶解率、徐放率、吸收率、滲透率之製劑用之物質。就製劑用之物質而言，可列舉以下各者，但未限定於此等：甘胺酸、丙胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸等之胺基酸類、抗菌劑、抗壞血酸、硫酸鈉或亞硫酸氫鈉等之抗氧化劑、磷酸、檸檬酸、硼酸緩衝液、碳酸氫鈉、三羥甲基胺基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)溶液等之緩衝劑、甘露糖醇或甘胺酸等之填充劑、乙二胺四乙酸(EDTA)等之螯合劑、咖啡因、聚乙烯吡咯啶、β-環糊精或羥基丙基-β-環糊精等之錯合劑、葡萄糖、甘露糖或糊精等之增量劑、單糖類、雙糖類等之其他碳水化物、著色劑、香味劑、稀釋劑、乳化劑或聚乙烯吡咯啶等之親水聚合物、低分子量多肽、鹽形成對離子、羥基氯苯胺(benzalkonium chloride)、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸丙酯、洛赫西定(chlorhexidine)、山梨酸或過酸化氫等之防腐劑、甘油、丙二醇或聚乙二醇等之溶媒、甘露糖醇或山梨糖醇等之糖醇、懸浮劑、山梨醇酐酯、聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯80等之聚山梨酸酯、Triton、胺基丁三醇(tromethamine)、卵磷脂或膽固醇等之界面活性劑、蔗糖或山梨糖醇等之安定化增強劑、氯化鈉、氯化鉀或甘露糖醇・山梨糖醇等之彈性增強劑、輸送劑、賦形劑、及/或藥學上之輔助劑。此等製劑用之物質之添加量相對於抗ALK2抗體之重量，較佳為添加0.01～100倍，特佳為添加0.1～10倍者。製劑中之適合的醫藥組成物之組成可依本項技術領域中具通常知識者，因應適用疾病、適用投予路徑等而適當地決定。
醫藥組成物中之賦形劑或載體可為液體亦可為固體。適當賦形劑或載體可為注射用之水或生理食鹽水、人工腦脊髓液或通常使用於非經口投予的其他物質。於載體亦可使用中性之生理食鹽水或含有血清白蛋白的生理食鹽水。於醫藥組成物可含有pH7.0-8.5之Tris緩衝液、pH4.0-5.5之乙酸緩衝液、pH3.0-6.2之檸檬酸緩衝液。又，於此等之緩衝液亦可含有山梨糖醇或其他化合物。於本發明之醫藥組成物，可列舉含抗ALK2抗體的醫藥組成物以及含抗ALK2抗體及至少一種之異位性骨化治療劑的醫藥組成物，本發明之醫藥組成物作為具有所選擇的組成及必要純度的藥劑，係以冷凍乾燥品或液體被準備。含抗ALK2抗體的醫藥組成物以及含抗ALK2抗體及至少一種之異位性骨化治療劑的醫藥組成物亦可成型為使用如蔗糖的適當賦形劑的冷凍乾燥品。
本發明之醫藥組成物可調製為非經口投予用，亦可調製為藉由經口的消化道吸收用。製劑之組成及濃度可依投予方法來決定，本發明之醫藥組成物中所含的抗ALK2抗體之對ALK2的親和性，即相對於對ALK2的解離常數(KD値)，親和性越高(KD値越低)，則即使減少對人類之投予量亦可發揮藥效，因而基於此結果，亦可決定本發明之醫藥組成物之對人類的投予量。投予量於將人類型抗ALK2抗體對人類投予之際，例如只要將約0.1～100mg/kg於1～180日間投予1次或複數次即可。然而，因投予量或投予次數一般應考慮患者之性別、體重、年齡、症狀、嚴重程度、副作用等來決定，故並未限定於上述之用量或用法。
就本發明之醫藥組成物之形態而言，可非限定地列舉例如包含點滴的注射劑、栓劑、經鼻劑、舌下劑、經皮吸收劑等。投予路徑為經口路徑或非經口路徑，非經口路徑可非限定地列舉例如靜脈內、動脈內、肌肉內、直腸內、經黏膜內、皮內等之路徑。 [實施例]
以下，藉由實施例而具體說明本發明，但本發明並未被限定於此等。又，於下述實施例關於基因操作的各操作只要未特別明示，皆藉由「分子選殖(Molecular Cloning)」(Sambrook, J., Fritsch, E.F.及Maniatis, T.著, Cold Spring Harbor Laboratory Press於1989年發刊)記載之方法來進行，或於使用市售之試藥或套組的情形，按照市售品之指示書來使用。
＜實施例1＞ 大鼠抗ALK2抗體(11E2、15A6、25C11、及27D11：以下縮寫為A2-11E、A2-15A、A2-25C、及A2-27D)之製作 1)-1抗原之調製 成為抗原的mALK2-Fc係使用Sino Biological Inc.公司製之小鼠ALK2-His&Fc(Cat.#50297-M03H)。 1)-2動物之免疫 將1mg/mL之小鼠ALK2-His&Fc與TiterMaxGold (TiterMax、USA)等量混合而製作乳劑。於6週齡之Wister雌大鼠2隻每1隻中，將100μg之抗原與佐劑一起，分2次作皮下投予。1〜2週後，僅將抗原溶液40μg作皮下投予，3日後無菌摘出作為抗體產生細胞之脾臓細胞及各種淋巴節，供給於以下之細胞融合。 1)-3與骨髓瘤細胞之細胞融合 將上述之抗體產生細胞與獲自BALB/c小鼠的株化骨髓瘤細胞(P3U1細胞)調整為5：1～10：1之比率，使用50%聚乙二醇1500而使融合3分鐘，之後，花費6分鐘稀釋。融合的細胞係每1隻大鼠使用10盤之96孔盤，與飼養細胞(feeder cell)(胸腺細胞)一起播種。以含補充HAT的含15%FBS之RPMI1640培養基(含有麩醯胺酸、丙酮酸、盤尼西林、鏈黴素)作為培養基來培養。 1)-4融合瘤之選擇 自細胞融合1週後，使用各自之培養上清液，藉由酵素結合免疫吸著法(ELISA)，選擇辨識使用作為抗原的小鼠ALK2-His&Fc的選殖株，再排除僅辨識人類Fc(Sino Biological Inc.公司製)的選殖株。ELISA係如以下方式進行。 首先，於96孔之ELISA用盤(NUNC公司製、Cat.#442404)，將以成為1μg/ml的方式而以PBS稀釋的抗原於室溫固定化2小時、或於4℃固定化一晩。移除固定化液，以溶解於PBS的0.5%脫脂乳溶液，於室溫進行30分鐘之阻斷(blocking)。其次，添加上述融合瘤之培養上清液，於室溫靜置1小時。將平盤洗淨後，添加以0.5%脫脂乳稀釋為1：2500的ALP標識抗大鼠IgG抗體(SBA公司製)，再於室溫靜置1小時。將平盤洗淨後，使苯基磷酸系基質於室溫反應20分鐘後，測量波長492nm之吸光度。 針對選擇的融合瘤，以極限稀釋法進行2次以上之選殖。藉由以上之操作，而將產生單株抗體A2-11E、A2-15A、A2-25C、及A2-27D的融合瘤株單離。 將結果記載於第1圖。顯示融合瘤A2-11E、A2-15A、A2-25C、及A2-27D產生的單株抗體係各自辨識小鼠ALK2-His&Fc，且未與人類Fc結合。
＜實施例2＞ 大鼠抗ALK2抗體(A2-11E、A2-15A、A2-25C、及A2-27D)之活體外評價 2)-1利用流動式細胞測量術之抗體篩選 2)-1-1小鼠及人類ALK2表現細胞之調製 將HEK293A細胞以成為3×104 細胞/cm2 的方式播種於100mm培養皿，於含15%FBS的DMEM培養基中，於37℃、5%CO2 條件下培養一晩。次日，將pcDEF3/小鼠ALK2(WT)-EGFP、pcDEF3/人類ALK2(WT)-EGFP、pcDEF3/人類ALK2(R206H)-EGFP、pcDEF3各自使用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司製)導入至HEK293A細胞，再培養一晩。次日，將調整為1×106 細胞/mL的細胞懸浮液各100μL分注於1.5mL微量離心管，以500g離心5分鐘後，去除上清液。於細胞中添加稀釋為1μg/mL的純化IgG 100μL，於4℃靜置30分鐘。將細胞以PBS洗淨3次後，添加稀釋為1：200的Alexa flour 647山羊抗大鼠IgG(H+L)(Life Technologies公司製)100μL，再於4℃靜置30分鐘。將細胞以PBS洗淨3次後，以流動式細胞儀(FACS Aria II：BD Biosciences公司製)檢測螢光。資料係以BD Diva Software(BD Biosciences公司製)解析，將細胞之表現的EGFP強度、及經染色的Alexa flour 647之螢光強度作圖。 將結果記載於第2A圖～第2D圖。確認了融合瘤A2-11E、A2-15A、A2-25C、及A2-27D產生的單株抗體各自雖未辨識螢光蛋白質EGFP表現細胞(第2A圖)，但專一性地辨識小鼠ALK2表現細胞(第2B圖)、及野生型及FOP之人類ALK2表現細胞(各自於第2C圖及第2D圖)。此結果顯示融合瘤A2-11E、A2-15A、A2-25C、及A2-27D產生的單株抗體係與ALK2之細胞外區域結合的抗體。 2)-2利用免疫染色法之抗體篩選 2)-2-1人類ALK1、ALK2、ALK3、ALK6表現細胞之調製 將小鼠C2C12細胞以成為5×103 細胞/孔的方式，播種於96孔盤(Greiner公司製)，於含15%FBS的DMEM培養基中，於37℃、5%CO2 之條件下培養一晩。次日，將pcDEF3/人類ALK1-EGFP、pcDEF3/人類ALK2-EGFP、pcDEF3/人類ALK3-EGFP、pcDEF3/人類ALK6-EGFP、及對照組之pcDEF3各自使用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司製)導入C2C12細胞，再培養一晩。 2)-2-2人類ALK1、ALK2、ALK3、ALK6之螢光免疫染色 將C2C12細胞，以10%中性福馬林(Nacalai Tesque公司製、日本)，於室溫固定20分鐘後，以10%山羊正常血清進行30分鐘阻斷。去除阻斷液後，添加以阻斷液稀釋為10μg/mL的純化IgG，並於室溫靜置1小時。以PBS清洗3次後，添加以阻斷液稀釋為1：1000的Goat Alexa594-conjugated anti-rat IgG(Invitrogen公司製)，於室溫靜置1小時。以PBS洗淨3次後，以10%中性福馬林於室溫固定15分鐘，使用DAPI(LifeTechnologies公司製)而施予核染色。螢光訊號係使用螢光顯微鏡BZ-9000(Keyence公司製)來觀察。 將結果記載於第3圖。確認了融合瘤A2-11E、A2-15A、A2-25C、及A2-27D產生的單株抗體僅專一性辨識ALK2表現細胞，未辨識ALK1、ALK3、ALK6表現細胞。其結果顯示融合瘤A2-11E、A2-15A、A2-25C、及A2-27D產生的單株抗體係與ALK2專一性結合的抗體。 2)-2-3以FOP鑑定的ALK2突變體表現細胞之調製 將小鼠C2C12細胞以成為0.5×103 細胞/孔的方式，播種於96孔盤(Greiner公司製)，於含15%FBS的DMEM培養基中，於37℃、5%CO2 條件下培養一晩。次日，將併入pcDEF3的人類ALK2 cDNA之野生型、及pcDEF3/人類ALK2-L196P、pcDEF3/人類ALK2-P197_F198delinsL、pcDEF3/人類ALK2-R202I、pcDEF3/人類ALK2-R206H，pcDEF3/人類ALK2-Q207E、pcDEF3/人類ALK2-R258S、pcDEF3/人類ALK2-G325A、pcDEF3/人類ALK2-G328E、pcDEF3/人類ALK2-G328R、pcDEF3/人類ALK2-G328W、pcDEF3/人類ALK2-G356D、及pcDEF3/人類ALK2-R375P之經各FOP鑑定的突變體、及對照組之pcDEF3，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司製)各自導入C2C12細胞，再培養一晩。 2)-2-4以FOP鑑定的ALK2突變體之螢光免疫染色 將C2C12細胞以10%中性福馬林(Nacalai Tesque公司製、日本)，於室溫固定20分鐘後，以10%山羊正常血清進行30分鐘阻斷。去除阻斷液後，添加以阻斷液稀釋為10μg/mL的純化IgG，並於室溫靜置1小時。以PBS洗淨3次後，添加以阻斷液稀釋為1：1000的Goat Alexa594-conjugated anti-rat IgG(Invitrogen公司製)，於室溫靜置1小時。以PBS洗淨3次後，以10%中性福馬林於室溫固定15分鐘，使用DAPI(LifeTechnologies公司製)施予核染色。螢光訊號係使用螢光顯微鏡BZ-9000(Keyence公司製)觀察。 將結果記載於第4圖。確認了融合瘤A2-11E、A2-15A、A2-25C、及A2-27D產生的單株抗體除了辨識野生型之ALK2表現細胞之外，亦辨識經FOP鑑定的12種類之ALK2突變體表現細胞。其結果係顯示融合瘤A2-11E、A2-15A、A2-25C、及A2-27D所產生的單株抗體係與野生型ALK2、及FOP之各ALK2突變體結合的抗體。 2)-3利用螢光素酶報導子試驗(luciferase reporter assay)的抗體篩選 單株抗體之經由ALK2的細胞內訊息之抑制活性係使用BMP專一性螢光素酶報導子來解析。將HEK293A細胞以成為1×104 細胞/孔的方式，播種於螢光素酶・分析用96孔白色盤(Greiner公司製)，於含15%FBS的DMEM培養基中，於37℃、5%CO2 之條件下培養一晩。次日，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司製)將pcDEF3/人類ALK2(WT)-V5-His、或pcDEF3/人類ALK2(R206H)-V5-His、pGL4.26/Id1WT4F-luc(Genes Cells, 7, 949(2002))、phRL SV40(Promega公司製)導入。2.5小時後，將培養基交換為新鮮的OPTI-MEM I(LifeTechnologies公司製)，再培養1小時。之後，交換為含序列稀釋的單株抗體與10ng/mL之BMP7(Milteney公司製)或0.5ng/mL之BMP9(Peprotech公司製)的OPTI-MEM I，再培養一晩。次日，使用Dual-Glo Luciferase Assay System(Promega公司製)，將螢火蟲、及海腎(Renilla)之螢光素酶活性以平盤讀數機GENios(TECAN公司製)測量。 將結果記載於第5圖。確認了融合瘤A2-11E、A2-15A、A2-25C、及A2-27D產生的單株抗體係於ALK2之野生型及過度表現R206H突變型的HEK293A細胞，劑量依存性地抑制BMP7誘導的BMP專一性螢光素酶活性。 2)-4利用BMP之造骨細胞分化誘導分析之抗體篩選 單株抗體之經由內源性ALK2的細胞內訊息之抑制活性係以對於利用BMP之C2C12細胞之向造骨細胞的分化誘導活性的效果來解析。將C2C12細胞，以成為0.5×103 細胞/孔的方式，播種於96孔盤(Greiner公司製)，於含15%FBS的DMEM培養基中，於37℃、5%CO2 之條件下培養一晚。次日，交換為含序列稀釋的單株抗體與200ng/mL之BMP2(Corefront公司製)、200ng/mL之BMP7(Milteney公司製)、或20ng/mL之GDF2/BMP9(Peprotech公司製)的OPTI-MEM I，再培養3日。去除C2C12細胞之培養基，以PBS洗淨後，將細胞以50μL/孔之冰冷的丙酮：乙醇(1：1)溶液處理1分鐘，再以PBS洗淨3次。測量ALP活性作為向造骨細胞用細胞之分化之指標。ALP活性之測量係添加100μL/孔之基質溶液(1mg/mL4-硝基苯基磷酸酯(Sigma-Aldrich公司製)及含1mM MgCl2 的0.1M二乙醇胺(Sigma-Aldrich公司製)-HCl，pH10.0)，並於室溫於攪拌振盪機上使其反應15-30分鐘。反應係添加50μL之3M NaOH而使其停止，使用微量盤讀數機infinite F50(TECAN公司製)而測量波長405nm之吸光度。 將結果記載於第6圖及第7圖。確認了融合瘤A2-11E、A2-15A、A2-25C、及A2-27D產生的單株抗體雖幾乎未抑制BMP2誘導的C2C12細胞之向造骨細胞樣細胞的分化(第6圖)，但劑量依存性地抑制BMP7及GDF2/BMP9誘導的C2C12細胞之向造骨細胞樣細胞之分化(第7圖)。其結果顯示融合瘤A2-11E、A2-15A、A2-25C、及A2-27D產生的單株抗體係抑制C2C12細胞生理性表現的內源性ALK2的抗體。
＜實施例3＞ 編碼大鼠抗ALK2抗體(A2-11E、A2-15A、A2-25C、A2-27D)之可變區的cDNA之核苷酸序列之決定 3)-1編碼A2-11E之可變區的cDNA之核苷酸序列之決定 3)-1-1自A2-11E產生融合瘤之總RNA(total RNA)之調製 為了放大含A2-11E之可變區的cDNA，自A2-11E產生融合瘤，使用TRIzol Reagent(Ambion公司)而調製總RNA。 3)-1-2 cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)之合成 cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)之合成係使用於實施例3)-1-1調製的總RNA之1μg，使用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech公司)來實施。 3)-1-3利用5’-RACE PCR之含A2-11E的重鏈可變區的cDNA之放大及序列之決定 作為將A2-11E之重鏈基因之可變區之cDNA以PCR放大用之引子，使用UPM(Universal Primer A Mix：附屬於SMARTer RACE cDNA Amplification Kit)、及具有5’-CTCCAGAGTTCCAGGTCACGGTGACTGGC-3’(RG2AR3；序列識別號88)之序列的寡核苷酸。UPM係使用附屬於SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech公司)者，RG2AR3係自資料庫之大鼠重鏈之恒定區之序列所設計。 藉由此引子之組合、與將實施例3)-1-2所合成的cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)作為模板的5’-RACE PCR，而將含A2-11E之重鏈之可變區的cDNA放大。PCR係使用KOD-Plus-(TOYOBO公司、日本)作為聚合酶，按照SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech公司)之操作手冊，以遞減PCR(touchdown PCR)程式實施。 將以5’-RACE PCR放大的含重鏈之可變區的cDNA，使用MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN公司)純化後，使用Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(Invitrogen公司)選殖，實施經選殖的含重鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列之定序解析。 作為定序引子，由資料庫之大鼠重鏈之恒定區之序列設計 使用具有5’-CTCCAGAGTTCCAGGTCACGGTGACTGGC-3’(RG2AR3；序列識別號88)之序列的寡核苷酸、及NUP(Nested Universal Primer A：附屬於SMARTer RACE cDNA Amplification Kit)。 定序解析係使用基因序列解析裝置(「ABI PRISM 3700 DNA Analyzer；Applied Biosystems」或「Applied Biosystems 3730xl Analyzer；Applied Biosystems」)來實施，定序反應係使用GeneAmp 9700(Applied Biosystems公司)。 將經決定之編碼A2-11E之重鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列示於序列表之序列識別號1，將胺基酸序列示於序列識別號2。 3)-1-4利用5’-RACE PCR之含A2-11E之輕鏈可變區的cDNA之放大與序列之決定 作為將A2-11E之輕鏈基因之可變區之cDNA以PCR放大用之引子，使用UPM(Universal Primer A Mix：附屬於SMARTer RACE cDNA Amplification Kit)、及具有5’-TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC-3’(RKR5；序列識別號89)之序列的寡核苷酸。UPM係使用附屬於SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech公司)者，RKR5係由資料庫之大鼠輕鏈之恒定區之序列設計。 藉由此引子之組合、及將實施例3)-1-2合成的cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)作為模板的5’-RACE PCR，而將含A2-11E之輕鏈之可變區的cDNA放大。PCR係使用KOD-Plus-(TOYOBO公司、日本)作為聚合酶，按照SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech公司)之操作手冊，以遞減PCR程式實施。 將以5’-RACE PCR放大的含輕鏈之可變區的cDNA，使用MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN公司)純化後，使用Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(Invitrogen公司)選殖，實施經選殖之含輕鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列之定序解析。 作為定序引子，自資料庫之大鼠輕鏈之恒定區之序列設計。 使用具有5’-TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC-3’(RKR5；序列識別號89)之序列的寡核苷酸、及NUP(Nested Universal Primer A：附屬於SMARTer RACE cDNA Amplification Kit)。 定序解析係使用基因序列解析裝置(「ABI PRISM 3700 DNA Analyzer；Applied Biosystems」或「Applied Biosystems 3730xl Analyzer；Applied Biosystems」)來實施，定序反應係使用GeneAmp 9700(Applied Biosystems公司)。 將經決定的編碼A2-11E之輕鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列示於序列表之序列識別號3，將胺基酸序列示於序列識別號4。 3)-2編碼A2-15A之可變區的cDNA之核苷酸序列之決定 3)-2-1自A2-15A產生融合瘤之總RNA之調製 為了放大含A2-15A之可變區的cDNA，自A2-15A生產融合瘤，以與實施例3)-1-1同樣之方法來調製總RNA。 3)-2-2 cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)之合成 cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)之合成係使用於實施例3)-2-1調製的總RNA之1μg，以與實施例3)-1-2同樣之方法來實施。 3)-2-3利用5’-RACE PCR之含A2-15A之重鏈可變區的cDNA之放大及序列之決定 將於實施例3)-2-2合成的cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)作為模板來使用，以與實施例3)-1-3同樣之方法將含A2-15A之重鏈可變區的cDNA放大而決定序列。 將經決定之編碼A2-15A之重鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列示於序列表之序列識別號5，將胺基酸序列示於序列識別號6。 3)-2-4利用5’-RACE PCR之含A2-15A之輕鏈可變區的cDNA之放大與序列之決定 將於實施例3)-2-2合成的cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)作為模板來使用，以與實施例3)-1-4同樣之方法將含A2-15A之輕鏈可變區的cDNA放大而決定序列。 將經決定的編碼A2-15A之輕鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列示於序列表之序列識別號7，將胺基酸序列示於序列識別號8。 3)-3編碼A2-25C之可變區的cDNA之核苷酸序列之決定 3)-3-1自A2-25C產生融合瘤之總RNA之調製 為了放大含A2-25C之可變區的cDNA，自A2-25C生產融合瘤，以與實施例3)-1-1同樣之方法來調製總RNA。 3)-3-2 cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)之合成 cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)之合成係使用於實施例3)-3-1調製的總RNA之1μg，以與實施例3)-1-2同樣之方法來實施。 3)-3-3利用5’-RACE PCR之含A2-25C之重鏈可變區的cDNA之放大與序列之決定 將於實施例3)-3-2合成的cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)作為模板來使用，以與實施例3)-1-3同樣之方法將含A2-25C之重鏈可變區的cDNA放大而決定序列。 將經決定之編碼A2-25C之重鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列示於序列表之序列識別號9，將胺基酸序列示於序列識別號10。 3)-3-4利用5’-RACE PCR之含A2-25C之輕鏈可變區的cDNA之放大與序列之決定 將於實施例3)-3-2合成的cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)作為模板來使用，以與實施例3)-1-4同樣之方法將含A2-25C之輕鏈可變區的cDNA放大而決定序列。 將經決定之編碼A2-25C之輕鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列示於序列表之序列識別號11，將胺基酸序列示於序列識別號12。 3)-4編碼A2-27D之可變區的cDNA之核苷酸序列之決定 3)-4-1自A2-27D產生融合瘤之總RNA之調製 為了將含A2-27D之可變區的cDNA放大，自A2-27D生產融合瘤，以與實施例3)-1-1同樣之方法來調製總RNA。 3)-4-2 cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)之合成 cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)之合成係使用於實施例3)-4-1調製的總RNA之1μg，以與實施例3)-1-2同樣之方法來實施。 3)-4-3利用5’-RACE PCR之含A2-27D之重鏈可變區的cDNA之放大與序列之決定 將於實施例3)-4-2合成的cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)作為模板來使用，以與實施例3)-1-3同樣之方法，將含A2-27D之重鏈可變區的cDNA放大而決定序列。 將經決定之編碼A2-27D之重鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列示於序列表之序列識別號13，將胺基酸序列示於序列識別號14。 3)-4-4利用5’-RACE PCR之含A2-27D之輕鏈可變區的cDNA之放大與序列之決定 將於實施例3)-4-2合成的cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)作為模板使用，以與實施例3)-1-4同樣之方法將含A2-27D之輕鏈可變區的cDNA放大，而決定序列。 將經決定之編碼A2-27D之輕鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列示於序列表之序列識別號15，將胺基酸序列示於序列識別號16。
＜實施例4＞ 大鼠抗ALK2抗體(A2-15A、及A2-27D)之活體內評價 4)-1融合瘤培養上清液之調製 將於實施例1)-4獲得的1.0×106 個之融合瘤於含10%FBS的TIL高葡萄糖培養基培養(T75燒瓶)，之後於INTEGRA CL1000進行高密度培養(10%FBS培養基)。其次，將培養基取代為無血清，進一步進行於INTEGRA CL1000的培養後，取得必要量之融合瘤培養上清液。取得的融合瘤培養上清液係保存於2～8℃直到供給於純化。 4)-2自融合瘤培養上清液之抗體之純化 自實施例4)-1所獲得的培養上清液，將抗體以Protein G親和性層析(4～6℃下)一階段步驟進行純化。Protein G親和性層析純化後之緩衝液取代步驟係於4～6℃下實施。最初，於填充有經PBS平衡化的Protein G(GE Healthcare Bioscience公司)的管柱中施加融合瘤之培養上清液。培養上清液完全進入管柱後，以管柱容量2倍以上之PBS將管柱洗淨。其次，以0.1M甘胺酸/鹽酸水溶液(pH2.7)洗提，收集含抗體之劃份。於收集的劃份中添加1M Tris-HCl(pH9.0)，調製為pH7.0～7.5後，藉由透析(Thermo Scientificsha，Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)進行向HBSor(25mM組胺酸/5%山梨糖醇、pH6.0)之液取代。以Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分劃分子量UF10K，Sartorius公司、4℃下)濃縮，將IgG濃度調製為8mg/ml以上。最後以Minisart-Plus filter(Sartorius公司)過濾，作為純化樣品。 4)-3利用BMP移植之異位性骨化誘導模型 單株抗體之骨骼肌組織中的異位性骨化之抑制活性係以小鼠中的由BMP所致的異位性骨誘導實驗來解析。含有BMP的丸粒係使1μg之BMP7(Milteney公司製)、或1μg之GDF2/BMP9(Peprotech公司製)，浸滲於調整為直徑4mm的I型膠原蛋白海綿(collagen sponge)(Collatape、Zimmer Dental公司製)一晩，以冷凍乾燥機(FDU-810、東京理科器械公司製、日本)進行冷凍乾燥而製作。將8-10週齡之C57BL/6小鼠，使用小動物實驗用簡易吸入麻醉裝置(夏目製作所公司製、日本)及2%異氟醚(isoflurane)(和光純藥工業公司製、日本)進行全身麻醉，於左右下肢之大腿肌肉組織內各移植含有BMP的丸粒1個。將融合瘤A2-15A、及A2-27D產生的單株抗體，自移植1週前，以10mg/kg、1次/週，作皮下投予，至移植後第2週為止，同樣地投予抗體並同時飼育。於對照組，投予等量之溶媒(25mM組胺酸/5%山梨糖醇，pH6.0)。含有BMP的丸粒移植2週後，與大腿骨一起摘出所移植的含有BMP的丸粒，以微米級CT(μCT35，SCANCO公司製)解析異位性骨之形成。 將結果記載於第8圖。於移植BMP7及GDF2/BMP9，且經媒劑(vehicle)處理的小鼠中，藉由微米級CT解析，於大腿骨之右側有異位性骨被誘導。另一方面，於投予融合瘤A2-15A、及A2-27D產生的單株抗體的小鼠，即使移植BMP7及GDF2/BMP9亦未檢測出異位性骨。據此，確認融合瘤A2-15A、及A2-27D產生的單株抗體抑制了BMP7及GDF2/BMP9所誘導的骨骼肌組織中的異位性骨誘導。
＜實施例5＞ 人類嵌合化抗ALK2抗體(cA2-15A、cA2-27D)之製作 5)-1嵌合及人化抗體輕鏈表現載體pCMA-LK之構築 將質體pcDNA3.3-TOPO/LacZ(Invitrogen公司)以限制酵素XbaI及PmeI消化而獲得的約5.4kb之片段、及含序列識別號17所示的編碼人類κ鏈分泌訊息及人類κ鏈恒定區的DNA序列的DNA片段，使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(Clontech公司)加以結合，而製作pcDNA3.3/LK。 將pcDNA3.3/LK作為模板，以下述引子組進行PCR，將獲得的約3.8kb之片段磷酸化後藉由自接合(self-ligation)，構築於CMV啟動子之下游具有訊息序列、選殖位、及人類κ鏈恒定區之嵌合及人化抗體輕鏈表現載體pCMA-LK。 引子組 5’-TATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGC-3’(3.3-F1；序列識別號90) 5’-GCTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCGACGTTG-3’(3.3-R1；序列識別號91) 5)-2嵌合及人化抗體IgG1型重鏈表現載體pCMA-G1之構築 將pCMA-LK以XbaI及PmeI消化而去除κ鏈分泌訊息及人類κ鏈恒定區的DNA片段，及含序列識別號18所之編碼人類重鏈訊息序列及人類IgG1恒定區之胺基酸的DNA序列的DNA片段，使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(Clontech公司)加以結合，而構築於CMV啟動子之下游具有訊息序列、選殖位、人類IgG1重鏈恒定區之嵌合及人化抗體IgG1型重鏈表現載體pCMA-G1。 5)-3 cA2-15A重鏈表現載體之構築 將含實施例3)-2-3所獲得的A2-15A之重鏈之可變區的cDNA作為模板，以KOD-Plus-(TOYOBO公司、日本)與下述之引子組，將含編碼重鏈之可變區的cDNA的DNA片段加以放大，藉由使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，插入至將嵌合及人化IgG1型重鏈表現載體pCMA-G1以限制酵素BlpI切斷之處，而構築cA2-15A重鏈表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-G1/cA2-15A」。將cA2-15A重鏈之核苷酸序列示於序列識別號19，將胺基酸序列示於序列識別號20。 cA2-15A重鏈用引子組 5’-CCAGATGGGTGCTGAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGAG-3’(A2-15AH-F；序列識別號92) 5’-CTTGGTGGAGGCTGAGCTGACAGTGACCAGAGTGCCTTGGCCCCAG-3’(A2-15AH-R；序列識別號93) 5)-4 cA2-15A輕鏈表現載體之構築 將含實施例3)-2-4所獲得的A2-15A之輕鏈之可變區的cDNA作為模板，以KOD-Plus-(TOYOBO公司、日本)與下述之引子組，將含編碼輕鏈之可變區的cDNA的DAN片段放大，而藉由使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，插入至將嵌合及人化輕鏈表現泛用載體pCMA-LK以限制酵素BsiWI切斷之處，而構築cA2-15A之輕鏈表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-LK/cA2-15A」。將cA2-15A之輕鏈之核苷酸序列示於序列表之序列識別號21，將胺基酸序列示於序列識別號22。 cA2-15A輕鏈用引子組 5’-ATCTCCGGCGCGTACGGCGACATTGTCTTGACCCAGTCTCCTGC-3’(A2-15AL-F；序列識別號94) 5’-GGAGGGGGCGGCCACAGCCCGTTTCAGTTCCAGCTTGGTCCCAG-3’(A2-15AL-R；序列識別號95) 5)-5 cA2-27D重鏈表現載體之構築 將含實施例3)-4-3所獲得的A2-27D之重鏈之可變區的cDNA作為模板，以KOD-Plus-(TOYOBO公司、日本)與下述之引子組，將含編碼重鏈之可變區的cDNA的DNA片段放大，藉由使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)而插入至將嵌合及人化IgG1型重鏈表現載體pCMA-G1以限制酵素BlpI切斷之處，而構築cA2-27D重鏈表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-G1/cA2-27D」。將cA2-27D重鏈之核苷酸序列示於序列識別號23，將胺基酸序列示於序列識別號24。 cA2-27D重鏈用引子組 5’-CCAGATGGGTGCTGAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAG-3’(A2-27DH-F；序列識別號96) 5’-CTTGGTGGAGGCTGAGCTCACGGTGACCACGGTTCCTGGGCCCCAG-3’(A2-27DH-R；序列識別號97) 5)-6 cA2-27D輕鏈表現載體之構築 將含實施例3)-4-4所獲得的A2-27D之輕鏈之可變區的cDNA作為模板，以KOD-Plus-(TOYOBO公司、日本)與下述之引子組，將含編碼輕鏈之可變區的cDNA的DAN片段放大，藉由使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)而插入至將嵌合及人化抗體輕鏈表現泛用載體pCMA-LK以限制酵素BsiWI切斷之處，而構築cA2-27D抗體之輕鏈表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-LK/cA2-27D」。將cA2-27D抗體之輕鏈之核苷酸序列示於序列表之序列識別號25，將胺基酸序列示於序列識別號26。 cA2-27D輕鏈用引子組 5’-ATCTCCGGCGCGTACGGCGAAATTGTTCTCACTCAGTCTCCAAC-3’(A2-27DL-F；序列識別號98) 5’-GGAGGGGGCGGCCACAGCCCGTTTCAGTTCCAGCTTGGTCCCAG-3’(A2-15AL-R；序列識別號95) 5)-7 cA2-15A及cA2-27D之生產 FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)係按照操作手冊來進行繼代、培養。將對數增殖期之1.2×109 個之FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)播種於3L Fernbach Erlenmeyer Flask(CORNING公司)，以FreeStyle293 expression medium(Invitrogen公司)加以稀釋而調製為2.0×106 個細胞/ml後，於37℃、8%CO2 培養箱內以90rpm震盪培養1小時。將聚乙亞胺(Polyscience #24765)1.8mg溶解於Opti-Pro SFM培養基(Invitrogen公司)20ml，其次，將使用NucleoBond Xtra(TaKaRa公司、日本)而調製的H鏈表現載體(0.24mg)及L鏈表現載體(0.36mg)添加至20ml之Opti-Pro SFM培養基(Invitrogen公司)。於聚乙亞胺/Opti-Pro SFM混合液20ml中添加表現載體/Opti-Pro SFM混合液20ml並溫和地攪拌，再放置5分鐘後添加FreeStyle 293F細胞。於37℃、8%CO2 培養箱以90rpm震盪培養4小時後，添加600ml之EX-CELL VPRO培養基(SAFC Biosciences公司)、18ml之GlutaMAX I(GIBCO公司)、及30ml之Yeastolate Ultrafiltrate(GIBCO公司)，於37℃、8%CO2 培養箱以90rpm震盪培養7日，將獲得的培養上清液以Disposable Capsule Filter(Advantec #CCS-045-E1H)過濾。 將藉由pCMA-G1/cA2-15A與pCMA-LK/cA2-15A之組合而取得的大鼠抗體A2-15A之嵌合抗體命名為「cA2-15A」，將藉由pCMA-G1/cA2-27D與pCMA-LK/cA2-27D之組合而取得的大鼠抗體A2-27D之嵌合抗體命名為「cA2-27D」。 5)-8 cA2-15A及cA2-27D之二階段步驟純化 自實施例5)-7所獲得的培養上清液將抗體以rProtein A親和性層析(4-6℃下)及陶瓷羥基磷灰石(Ceramic Hydroxyapatite)(室溫下)之二階段步驟加以純化。rProtein A親和性層析純化後與陶瓷羥基磷灰石純化後之緩衝液取代步驟係於4-6℃下實施。於經PBS平衡化的MabSelectSuRe(GE Healthcare Bioscience公司製、HiTrap管柱)施予培養上清液。培養上清液全部進入管柱後，以管柱容量2倍以上之PBS將管柱洗淨。其次，以2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)洗提，收集含抗體的劃份。將此劃份藉由透析(Thermo Scientific公司、Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)取代為PBS後，將以5mM磷酸鈉/50mM MES/pH7.0之緩衝液作5倍稀釋的抗體溶液，施加於經5mM NaPi/50mM MES/30mM NaCl/pH7.0之緩衝液平衡化的陶瓷羥基磷灰石管柱(日本Bio-Rad、Bio-Scale CHT Type-1 Hydroxyapatite Column)。實施利用氯化鈉的直線濃度梯度洗提，收集含抗體之劃份。將其劃份藉由透析(Thermo Scientificsha，Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)進行向HBSor(25mM組胺酸/5%山梨糖醇、pH6.0)之液取代。以Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分劃分子量UF10K，Sartorius公司、4℃下)濃縮，將IgG濃度調整為2mg/ml以上。最後以Minisart-Plus filter(Sartorius公司)過濾，作為純化樣品。
＜實施例6＞ 人類嵌合化抗ALK2抗體(cA2-15A、cA2-27D)之活體外活性評價 6)-1利用螢光素酶報導子試驗之抗體評價 製作的人類嵌合化抗體之經由ALK2的細胞內訊息之抑制活性係使用BMP專一性的螢光素酶報導子來解析。將HEPG2細胞以成為1×104 細胞/孔的方式，播種於螢光素酶・試驗用96孔白色盤(CORNING公司製)，於含10%FBS的DMEM培養基中，於37℃、5%CO2 之條件下培養一晚。次日，將pGL4.26/Id1WT4F-luc(Genes Cells, 7, 949(2002))，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司製)而導入。2.5小時後，將培養基交換為新鮮的OPTI-MEM I(LifeTechnologies公司製)，進一步培養3小時。之後，交換為含序列稀釋的單株抗體及10ng/mL之BMP7(Milteney公司製)的OPTI-MEM I，再培養一晩。次日，使用Dual-Glo Luciferase Assay System(Promega公司製)而將螢光素酶活性以平盤讀數機SpectraMaxM4(MolecularDevices公司製)測量。 將結果記載於第9圖。確認嵌合化抗體cA2-15A、cA2-27D係對BMP7誘導的BMP專一性螢光素酶活性，顯示與各自之大鼠單株抗體A2-15A、A2-27D同等之抑制活性。 6)-2利用BMP之造骨細胞分化誘導分析之抗體評價 製作的人類嵌合化抗體之經由內源性ALK2的細胞內訊息之抑制活性係藉由對由BMP所致的C2C12細胞之向造骨細胞的分化誘導活性的效果來解析。將C2C12細胞以成為5×103 細胞/孔的方式，播種於96孔盤(IWAKI公司製)，於含15%FBS的DMEM培養基中，於37℃、5%CO2 之條件下培養一晚。次日，將培養基交換為新鮮的OPTI-MEM I(LifeTechnologies公司製)，交換為含序列稀釋的單株抗體與2ng/mL之GDF2/BMP9(Peprotech公司製)的OPTI-MEM I，再培養3日。去除C2C12細胞之培養基，以PBS洗淨後，將細胞以50μL/孔之冰冷的丙酮：乙醇(1：1)溶液處理1分鐘，再以PBS洗淨3次。作為向造骨細胞用細胞分化之指標，測量ALP活性。ALP活性之測量係添加100μL/孔之基質溶液(1mg/mL 4-硝基苯基磷酸酯(Sigma-Aldrich公司製)及含1mM MgCl2 的0.1M二乙醇胺(Sigma-Aldrich公司製)-HCl，pH10.0)，於室溫下，於攪拌振盪機上使其反應15-30分鐘。反應係添加50μL之3M NaOH而使其停止，使用平盤讀數機SpectraMaxM4(Molecular Devices公司製)測量波長405nm之吸光度。 將結果記載於第10圖。確認嵌合化抗體cA2-15A、cA2-27D係劑量依存性地抑制藉由BMP誘導的C2C12細胞之向造骨細胞樣細胞的分化。此結果顯示嵌合化抗體cA2-15A、cA2-27D為抑制C2C12細胞生理性表現的內源性ALK2的抗體。又，確認其抑制活性係與各自之大鼠單株抗體A2-15A、A2-27D同等。
＜實施例7＞ 抗ALK2抗體A2-15A、及A2-27D之人化體設計 7)-1人化hA2-15A之設計 7)-1-1 A2-15A之可變區之分子模擬 A2-15A之可變區之分子模擬係藉由作為同一性模擬之周知方法(Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991))來實行。將登錄於蛋白質資料庫(Nuc.Acid Res.35, D301-D303(2007))的人類免疫球蛋白之可變區之1次序列(可取得自X射線結晶構造所衍生的三次元構造)，與上述決定的A2-15A之可變區比較。就結果而言，3KYM與3S35係各自對A2-15A之重鏈及輕鏈之可變區具有最高序列同一性而被選擇。框架區之三次元構造係藉由將對應A2-15A之重鏈及輕鏈的3KYM及3S35之座標組合，獲得「框架模型」而製作。其次，針對各自之CDR之代表性的構形被併入框架模型。 最後，於能量的觀點，為了獲得有A2-15A之可變區之可能性的分子模型，進行用以去除不利的原子間接觸的能量計算。將上述順序使用市售之蛋白質立體構造解析程式Discovery Studio(Accelrys公司製)來進行。 7)-1-2對人化hA2-15A的胺基酸序列之設計 將人化hA2-15A之構築藉由作為CDR接枝(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86, 10029-10033(1989))之一般性周知方法來進行。接受者抗體(acceptor antibody)係基於框架區內之胺基酸同一性而被選擇。 將A2-15A之框架區之序列與人類之子群(subgroup)・一致(consensus)序列之框架區比較。就結果而言，起因於KABAT et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))中既定的人類γ鏈子群3之一致序列與人類κ鏈子群4之一致序列係於此框架區具有高序列同一性，而被選擇作為接受者。使於人類γ鏈子群3之一致序列與人類κ鏈子群4之一致序列之框架區的胺基酸殘基，與於A2-15A之胺基酸殘基並列，鑑定使用相異胺基酸的位置。此等之殘基之位置係使用上述構築的A2-15A之三次元模型而被分析，而且應接枝於接受者上的供給者殘基(donor residue)係藉由依照Queen et al. (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))給予的基準而被選擇。藉由將選擇的幾個之供給者殘基移入至接受者抗體，而將人化hA2-15A之序列以如以下實施例記載的方式構築。 7)-2 A2-15A重鏈之人化 7)-2-1人化hA2-15A-H1型重鏈 將伴隨有將序列識別號20所示的嵌合cA2-15A之重鏈之胺基酸編號35(精胺酸)取代為甘胺酸、胺基酸編號38(離胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號61(蘇胺酸)取代為甘胺酸、胺基酸編號94(丙胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號96(絲胺酸)取代為天冬醯胺酸、胺基酸編號103(天冬胺酸)取代為天冬醯胺酸、胺基酸編號107(絲胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號112(蘇胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號116(蘇胺酸)取代為丙胺酸而設計的人化hA2-15A重鏈命名為「人化hA2-15A-H1型重鏈」(亦稱為「hA2-15A-H1」)。 人化hA2-15A-H1型重鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列識別號28。序列識別號28之胺基酸序列之由第1至19號之胺基酸殘基所構成的序列、由第20至142號之胺基酸殘基所構成的序列、由第143至472號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、重鏈可變區、重鏈恒定區。編碼序列識別號28之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列識別號27。序列識別號27之核苷酸序列之由第1至57號之核苷酸所構成的序列、由第58至426號之核苷酸所構成的序列、由第427至1416號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、重鏈可變區序列、重鏈恒定區序列。序列識別號27之核苷酸序列及序列識別號28之胺基酸序列亦記載於第15圖。 7)-2-2人化hA2-15A-H4型重鏈 將伴隨有將序列識別號20所示的嵌合cA2-15A之重鏈之胺基酸編號35(精胺酸)取代為甘胺酸、胺基酸編號38(離胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號61(蘇胺酸)取代為甘胺酸、胺基酸編號103(天冬胺酸)取代為天冬醯胺酸、胺基酸編號107(絲胺酸)取代為丙胺酸而設計的人化hA2-15A重鏈命名為「人化hA2-15A-H4型重鏈」(亦稱為「hA2-15A-H4」)。 人化hA2-15A-H4型重鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列識別號30。序列識別號30之胺基酸序列之由第1至19號之胺基酸殘基所構成的序列、由第20至142號之胺基酸殘基所構成的序列、由第143至472號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、重鏈可變區、重鏈恒定區。編碼序列識別號30之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列識別號29。序列識別號29之核苷酸序列之由第1至57號之核苷酸所構成的序列、由第58至426號之核苷酸所構成的序列、由第427至1416號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、重鏈可變區序列、重鏈恒定區序列。序列識別號29之核苷酸序列及序列識別號30之胺基酸序列亦記載於第16圖。 7)-3 A2-15A輕鏈之人化 7)-3-1人化hA2-15A-L1型輕鏈 將伴隨有將序列識別號22所示的嵌合cA2-15A之輕鏈之胺基酸編號24(白胺酸)取代為甲硫胺酸、胺基酸編號29(丙胺酸)取代為天冬胺酸、胺基酸編號29-30之間(缺損殘基)取代為絲胺酸、胺基酸編號36(麩醯胺酸)取代為麩胺酸、胺基酸編號41(絲胺酸)取代為天冬醯胺酸、胺基酸編號66(離胺酸)取代為脯胺酸、胺基酸編號81(異白胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號83(丙胺酸)取代為天冬胺酸、胺基酸編號99(天冬醯胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號100(脯胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號101(纈胺酸)取代為白胺酸、胺基酸編號104(天冬胺酸)取代為麩胺酸、胺基酸編號106(異白胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號108(蘇胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號123(丙胺酸)取代為麩醯胺酸、胺基酸編號127(白胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號129(白胺酸)取代為異白胺酸而設計的人化hA2-15A輕鏈命名為「人化hA2-15A-L1型輕鏈」(亦稱為「hA2-15A-L1」)。 人化hA2-15A-L1型輕鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列識別號32。序列識別號32之胺基酸序列之由第1至20號之胺基酸殘基所構成的序列、由第21至133號之胺基酸殘基所構成的序列、由第134至238號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、輕鏈可變區、輕鏈恒定區。編碼序列識別號32之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列識別號31。序列識別號31之核苷酸序列之由第26至85號之核苷酸所構成的序列、由第86至424號之核苷酸所構成的序列、由第425至739號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、輕鏈可變區序列、輕鏈恒定區序列。序列識別號31之核苷酸序列及序列識別號32之胺基酸序列亦記載於第17圖。 7)-3-2人化hA2-15A-L4型輕鏈 將伴隨有將序列識別號22所示的嵌合cA2-15A之輕鏈之胺基酸編號29(丙胺酸)取代為天冬胺酸、胺基酸編號29-30之間(缺損殘基)取代為絲胺酸、胺基酸編號36(麩醯胺酸)取代為麩胺酸、胺基酸編號41(絲胺酸)取代為天冬醯胺酸、胺基酸編號99(天冬醯胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號100(脯胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號108(蘇胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號123(丙胺酸)取代為麩醯胺酸而設計的人化hA2-15A輕鏈命名為「人化hA2-15A-L4型輕鏈」(亦稱為「hA2-15A-L4」)。 人化hA2-15A-L4型輕鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列識別號34。序列識別號34之胺基酸序列之由第1至20號之胺基酸殘基所構成的序列、由第21至133號之胺基酸殘基所構成的序列、由第134至238號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、輕鏈可變區、輕鏈恒定區。編碼序列識別號34之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列識別號33。序列識別號33之核苷酸序列之由第26至85號之核苷酸所構成的序列、由第86至424號之核苷酸所構成的序列、由第425至739號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、輕鏈可變區序列、輕鏈恒定區序列。序列識別號33之核苷酸序列及序列識別號34之胺基酸序列亦記載於第18圖。 7)-3-3人化hA2-15A-L6型輕鏈 將伴隨有將序列識別號22所示的嵌合cA2-15A之輕鏈之胺基酸編號29(丙胺酸)取代為天冬胺酸、胺基酸編號29-30之間(缺損殘基)取代為絲胺酸、胺基酸編號36(麩醯胺酸)取代為麩胺酸、胺基酸編號41(絲胺酸)取代為天冬醯胺酸、胺基酸編號79(絲胺酸)取代為麩醯胺酸、胺基酸編號99(天冬醯胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號100(脯胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號108(蘇胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號123(丙胺酸)取代為麩醯胺酸而設計的人化hA2-15A輕鏈命名為「人化hA2-15A-L6型輕鏈」(亦稱為「hA2-15A-L6」)。 人化hA2-15A-L6型輕鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列識別號36。序列識別號36之胺基酸序列之由第1至20號之胺基酸殘基所構成的序列、由第21至133號之胺基酸殘基所構成的序列、由第134至238號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、輕鏈可變區、輕鏈恒定區。編碼序列識別號36之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列識別號35。序列識別號35之核苷酸序列之由第26至85號之核苷酸所構成的序列、由第86至424號之核苷酸所構成的序列、由第425至739號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、輕鏈可變區序列、輕鏈恒定區序列。序列識別號35之核苷酸序列及序列識別號36之胺基酸序列亦記載於第19圖。 7)-3-4人化hA2-15A-L7型輕鏈 將伴隨有將序列識別號22所示的嵌合cA2-15A之輕鏈之胺基酸編號29(丙胺酸)取代為天冬胺酸、胺基酸編號29-30之間(缺損殘基)取代為絲胺酸、胺基酸編號36(麩醯胺酸)取代為麩胺酸、胺基酸編號41(絲胺酸)取代為天冬醯胺酸、胺基酸編號70(白胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號99(天冬醯胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號100(脯胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號108(蘇胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號123(丙胺酸)取代為麩醯胺酸而設計的人化hA2-15A輕鏈命名為「人化hA2-15A-L7型輕鏈」(亦稱為「hA2-15A-L7」)。 人化hA2-15A-L7型輕鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列識別號38。序列識別號38之胺基酸序列之由第1至20號之胺基酸殘基所構成的序列、由第21至133號之胺基酸殘基所構成的序列、由第134至238號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、輕鏈可變區、輕鏈恒定區。編碼序列識別號38之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列識別號37。序列識別號37之核苷酸序列之由第26至85號之核苷酸所構成的序列、由第86至424號之核苷酸所構成的序列、由第425至739號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、輕鏈可變區序列、輕鏈恒定區序列。序列識別號37之核苷酸序列及序列識別號38之胺基酸序列亦記載於第20圖。 7)-4利用重鏈及輕鏈之組合的人化hA2-15A之設計 設計包含人化hA2-15A-H1型重鏈及人化hA2-15A-L1型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-15A-H1/L1」(亦稱為「hA2-15A-H1/L1」)。設計包含人化hA2-15A-H1型重鏈及人化hA2-15A-L4型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-15A-H1/L4」(亦稱為「hA2-15A-H1/L4」)。設計包含人化hA2-15A-H4型重鏈及人化hA2-15A-L1型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-15A-H4/L1」(亦稱為「hA2-15A-H4/L1」)。設計包含人化hA2-15A-H4型重鏈及人化hA2-15A-L4型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-15A-H4/L4」(亦稱為「hA2-15A-H4/L4」)。設計包含人化hA2-15A-H4型重鏈及人化hA2-15A-L6型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-15A-H4/L6」(亦稱為「hA2-15A-H4/L6」)。設計包含人化hA2-15A-H4型重鏈及人化hA2-15A-L7型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-15A-H4/L7」(亦稱為「hA2-15A-H4/L7」)。藉由以上而設計的抗體係可按照實施例8而製作，按照實施例2及4來評價。 7)-5人化hA2-27D之設計 7)-5-1 A2-27D之可變區之分子模擬 A2-27D之可變區之分子模擬係藉由作為同一性模擬之周知方法(Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991))來實行。將登錄於蛋白質資料庫(Nuc.Acid Res.35, D301-D303(2007))的人類免疫球蛋白之可變區之1次序列(可取得自X射線結晶構造所衍生的三次元構造)，與上述決定的A2-27D之可變區比較。就結果而言，3EYQ與4I9W係各自對A2-27D之重鏈及輕鏈之可變區具有最高序列同一性而被選擇。框架區之三次元構造係藉由將對應A2-27D之重鏈及輕鏈的3EYQ及4I9W之座標組合，獲得「框架模型」而製作。其次，針對各自之CDR之代表性的構形被併入框架模型。 最後，於能量的觀點，為了獲得有A2-27D之可變區之可能性的分子模型，進行用以去除不利的原子間接觸的能量計算。將上述順序使用市售之蛋白質立體構造解析程式Discovery Studio(Accelrys公司製)來進行。 7)-5-2對人化hA2-27D的胺基酸序列之設計 將人化hA2-27D之構築藉由作為CDR接枝(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86, 10029-10033(1989))之一般性周知方法來進行。接受者抗體係基於框架區內之胺基酸同一性而被選擇。 將A2-27D之框架領域之序列與人類之子群・一致序列之框架區比較。就結果而言，起因於KABAT et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5thEd. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))中既定的人類γ鏈子群3之一致序列與人類κ鏈子群4之一致序列係於此框架領域具有高序列同一性，而被選擇作為接受者。使於人類γ鏈子群3之一致序列與人類κ鏈子群3之一致序列之框架領域之胺基酸殘基，與於A2-27D之胺基酸殘基並列，鑑定使用相異胺基酸的位置。此等之殘基之位置係使用上述構築的A2-27D之三次元模型而被分析，而且應接枝於接受者上的供給者殘基係藉由依照Queen et al. (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86, 10029-10033(1989))給予的基準而被選擇。藉由將選擇的幾個之供給者殘基移入至接受者抗體，而將人化hA2-27D之序列以如下之實施例記載的方式構築。 7)-6 A2-27D重鏈之人化 7)-6-1人化hA2-27D-H1型重鏈 將伴隨有將序列識別號24所示的嵌合cA2-27D之重鏈之胺基酸編號35(精胺酸)取代為甘胺酸、胺基酸編號38(離胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號42(白胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號56(異白胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號68(丙胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號94(丙胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號95(精胺酸)取代為離胺酸、胺基酸編號103(蘇胺酸)取代為天冬醯胺酸、胺基酸編號107(絲胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號112(白胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號117(丙胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號132(脯胺酸)取代為麩醯胺酸、胺基酸編號135(纈胺酸)取代為白胺酸而設計的人化hA2-15A重鏈命名為「人化hA2-27D-H1型重鏈」(亦稱為「hA2-27D-H1」)。 人化hA2-27D-H1型重鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列識別號40。序列識別號40之胺基酸序列之由第1至19號之胺基酸殘基所構成的序列、由第20至140號之胺基酸殘基所構成的序列、由第141至470號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、重鏈可變區、重鏈恒定區。編碼序列識別號40之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列識別號39。序列識別號39之核苷酸序列之由第1至57號之核苷酸所構成的序列、由第58至420號之核苷酸所構成的序列、由第421至1410號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、重鏈可變區序列、重鏈恒定區序列。序列識別號39之核苷酸序列及序列識別號40之胺基酸序列亦記載於第21圖。 7)-6-2人化hA2-27D-H2型重鏈 將伴隨有將序列識別號24所示的嵌合cA2-27D之重鏈之胺基酸編號35(精胺酸)取代為甘胺酸、胺基酸編號38(離胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號42(白胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號68(丙胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號94(丙胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號95(精胺酸)取代為離胺酸、胺基酸編號103(蘇胺酸)取代為天冬醯胺酸、胺基酸編號107(絲胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號112(白胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號132(脯胺酸)取代為麩醯胺酸、胺基酸編號135(纈胺酸)取代為白胺酸而設計的人化hA2-27D重鏈命名為「人化hA2-27D-H2型重鏈」(亦稱為「hA2-27D-H2」)。 人化hA2-27D-H2型重鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列識別號42。序列識別號42之胺基酸序列之由第1至19號之胺基酸殘基所構成的序列、由第20至140號之胺基酸殘基所構成的序列、由第141至470號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、重鏈可變區、重鏈恒定區。編碼序列識別號42之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列識別號41。序列識別號41之核苷酸序列之由第1至57號之核苷酸所構成的序列、由第58至420號之核苷酸所構成的序列、由第421至1410號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、重鏈可變區序列、重鏈恒定區序列。序列識別號41之核苷酸序列及序列識別號42之胺基酸序列亦記載於第22圖。 7)-6-3人化hA2-27D-H3型重鏈 將伴隨有將序列識別號24所示的嵌合cA2-27D之重鏈之胺基酸編號35(精胺酸)取代為甘胺酸、胺基酸編號38(離胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號42(白胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號94(丙胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號95(精胺酸)取代為離胺酸、胺基酸編號103(蘇胺酸)取代為天冬醯胺酸、胺基酸編號107(絲胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號112(白胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號132(脯胺酸)取代為麩醯胺酸、胺基酸編號135(纈胺酸)取代為白胺酸而設計的人化hA2-27D重鏈命名為「人化hA2-27D-H3型重鏈」(亦稱為「hA2-27D-H3」)。 人化hA2-27D-H3型重鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列識別號44。序列識別號44之胺基酸序列之由第1至19號之胺基酸殘基所構成的序列、由第20至140號之胺基酸殘基所構成的序列、由第141至470號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、重鏈可變區、重鏈恒定區。編碼序列識別號44之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列識別號43。序列識別號43之核苷酸序列之由第1至57號之核苷酸所構成的序列、由第58至420號之核苷酸所構成的序列、由第421至1410號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、重鏈可變區序列、重鏈恒定區序列。序列識別號43之核苷酸序列及序列識別號44之胺基酸序列亦記載於第23圖。 7)-6-4人化hA2-27D-H4型重鏈 將伴隨有將序列識別號24所示的嵌合cA2-27D之重鏈之胺基酸編號35(精胺酸)取代為甘胺酸、胺基酸編號38(離胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號42(白胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號94(丙胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號95(精胺酸)取代為離胺酸、胺基酸編號103(蘇胺酸)取代為天冬醯胺酸、胺基酸編號107(絲胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號135(纈胺酸)取代為白胺酸而設計的人化hA2-27D重鏈命名為「人化hA2-27D-H4型重鏈」(亦稱為「hA2-27D-H4」)。 人化hA2-27D-H4型重鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列識別號46。序列識別號46之胺基酸序列之由第1至19號之胺基酸殘基所構成的序列、由第20至140號之胺基酸殘基所構成的序列、由第141至470號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、重鏈可變區、重鏈恒定區。編碼序列識別號46之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列識別號45。序列識別號45之核苷酸序列之由第1至57號之核苷酸所構成的序列、由第58至420號之核苷酸所構成的序列、由第421至1410號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、重鏈可變區序列、重鏈恒定區序列。序列識別號45之核苷酸序列及序列識別號46之胺基酸序列亦記載於第24圖。 7)-6-5人化hA2-27D-H5型重鏈 將伴隨有將序列識別號24所示的嵌合cA2-27D之重鏈之胺基酸編號35(精胺酸)取代為甘胺酸、胺基酸編號38(離胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號42(白胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號95(精胺酸)取代為離胺酸、胺基酸編號103(蘇胺酸)取代為天冬醯胺酸、胺基酸編號135(纈胺酸)取代為白胺酸而設計的人化hA2-27D重鏈命名為「人化hA2-27D-H5型重鏈」(亦稱為「hA2-27D-H5」)。 人化hA2-27D-H5型重鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列識別號48。序列識別號48之胺基酸序列之由第1至19號之胺基酸殘基所構成的序列、由第20至140號之胺基酸殘基所構成的序列、由第141至470號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、重鏈可變區、重鏈恒定區。編碼序列識別號48之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列識別號47。序列識別號47之核苷酸序列之由第1至57號之核苷酸所構成的序列、由第58至420號之核苷酸所構成的序列、由第421至1410號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、重鏈可變區序列、重鏈恒定區序列。序列識別號47之核苷酸序列及序列識別號48之胺基酸序列亦記載於第25圖。 7)-7 A2-27D輕鏈之人化 7)-7-1人化hA2-27D-L1型輕鏈 將伴隨有將序列識別號26所示的嵌合cA2-27D之輕鏈之胺基酸編號29(蘇胺酸)取代為甘胺酸、胺基酸編號31(甲硫胺酸)取代為白胺酸、胺基酸編號32(丙胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號33(丙胺酸)取代為白胺酸、胺基酸編號38(離胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號39(纈胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號42(天冬醯胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號59(絲胺酸)取代為脯胺酸、胺基酸編號61(丙胺酸)取代為麩醯胺酸、胺基酸編號62(絲胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號64(離胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號66(色胺酸)取代為白胺酸、胺基酸編號77(纈胺酸)取代為異白胺酸、胺基酸編號79(天冬醯胺酸)取代為天冬胺酸、胺基酸編號89(絲胺酸)取代為天冬胺酸、胺基酸編號90(酪胺酸)取代為苯丙胺酸、胺基酸編號91(絲胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號93(丙胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號96(絲胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號97(甲硫胺酸)取代為白胺酸、胺基酸編號99(丙胺酸)取代為脯胺酸、胺基酸編號102(纈胺酸)取代為苯丙胺酸、胺基酸編號104(蘇胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號120(丙胺酸)取代為麩醯胺酸、胺基酸編號124(白胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號126(白胺酸)取代為異白胺酸而設計的人化hA2-27D輕鏈命名為「人化hA2-27D-L1型輕鏈」(亦稱為「hA2-27D-L1」)。 人化hA2-27D-L1型輕鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列識別號50。序列識別號50之胺基酸序列之由第1至20號之胺基酸殘基所構成的序列、由第21至129號之胺基酸殘基所構成的序列、由第130至234號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、輕鏈可變區、輕鏈恒定區。編碼序列識別號50之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列識別號49。序列識別號49之核苷酸序列之由第26至85號之核苷酸所構成的序列、由第86至412號之核苷酸所構成的序列、由第413至727號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、輕鏈可變區序列、輕鏈恒定區序列。序列識別號49之核苷酸序列及序列識別號50之胺基酸序列亦記載於第26圖。 7)-7-2人化hA2-27D-L2型輕鏈 將伴隨有將序列識別號26所示的嵌合cA2-27D之輕鏈之胺基酸編號29(蘇胺酸)取代為甘胺酸、胺基酸編號31(甲硫胺酸)取代為白胺酸、胺基酸編號32(丙胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號33(丙胺酸)取代為白胺酸、胺基酸編號38(離胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號39(纈胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號42(天冬醯胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號59(絲胺酸)取代為脯胺酸、胺基酸編號61(丙胺酸)取代為麩醯胺酸、胺基酸編號64(離胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號79(天冬醯胺酸)取代為天冬胺酸、胺基酸編號89(絲胺酸)取代為天冬胺酸、胺基酸編號90(酪胺酸)取代為苯丙胺酸、胺基酸編號91(絲胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號93(丙胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號96(絲胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號97(甲硫胺酸)取代為白胺酸、胺基酸編號99(丙胺酸)取代為脯胺酸、胺基酸編號102(纈胺酸)取代為苯丙胺酸、胺基酸編號104(蘇胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號120(丙胺酸)取代為麩醯胺酸、胺基酸編號124(白胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號126(白胺酸)取代為異白胺酸而設計的人化hA2-27D輕鏈命名為「人化hA2-27D-L2型輕鏈」(亦稱為「hA2-27D-L2」)。 人化hA2-27D-L2型輕鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列識別號52。序列識別號52之胺基酸序列之由第1至20號之胺基酸殘基所構成的序列、由第21至129號之胺基酸殘基所構成的序列、由第130至234號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、輕鏈可變區、輕鏈恒定區。編碼序列識別號52之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列識別號51。序列識別號51之核苷酸序列之由第26至85號之核苷酸所構成的序列、由第86至412號之核苷酸所構成的序列、由第413至727號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、輕鏈可變區序列、輕鏈恒定區序列。序列識別號51之核苷酸序列及序列識別號52之胺基酸序列亦記載於第27圖。 7)-7-3人化hA2-27D-L3型輕鏈 將伴隨有將序列識別號26所示的嵌合cA2-27D之輕鏈之胺基酸編號29(蘇胺酸)取代為甘胺酸、胺基酸編號31(甲硫胺酸)取代為白胺酸、胺基酸編號32(丙胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號33(丙胺酸)取代為白胺酸、胺基酸編號38(離胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號39(纈胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號42(天冬醯胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號59(絲胺酸)取代為脯胺酸、胺基酸編號64(離胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號79(天冬醯胺酸)取代為天冬胺酸、胺基酸編號89(絲胺酸)取代為天冬胺酸、胺基酸編號91(絲胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號93(丙胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號96(絲胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號97(甲硫胺酸)取代為白胺酸、胺基酸編號99(丙胺酸)取代為脯胺酸、胺基酸編號102(纈胺酸)取代為苯丙胺酸、胺基酸編號124(白胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號126(白胺酸)取代為異白胺酸而設計的人化hA2-27D輕鏈命名為「人化hA2-27D-L3型輕鏈」(亦稱為「hA2-27D-L3」)。 人化hA2-27D-L3型輕鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列識別號54。序列識別號54之胺基酸序列之由第1至20號之胺基酸殘基所構成的序列、由第21至129號之胺基酸殘基所構成的序列、由第130至234號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、輕鏈可變區、輕鏈恒定區。編碼序列識別號54之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列識別號53。序列識別號53之核苷酸序列之由第26至85號之核苷酸所構成的序列、由第86至412號之核苷酸所構成的序列、由第413至727號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、輕鏈可變區序列、輕鏈恒定區序列。序列識別號53之核苷酸序列及序列識別號54之胺基酸序列亦記載於第28圖。 7)-7-4人化hA2-27D-L4型輕鏈 將伴隨有將序列識別號26所示的嵌合cA2-27D之輕鏈之胺基酸編號29(蘇胺酸)取代為甘胺酸、胺基酸編號32(丙胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號38(離胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號42(天冬醯胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號59(絲胺酸)取代為脯胺酸、胺基酸編號64(離胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號79(天冬醯胺酸)取代為天冬胺酸、胺基酸編號89(絲胺酸)取代為天冬胺酸、胺基酸編號91(絲胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號93(丙胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號96(絲胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號99(丙胺酸)取代為脯胺酸、胺基酸編號102(纈胺酸)取代為苯丙胺酸而設計的人化hA2-27D輕鏈命名為「人化hA2-27D-L4型輕鏈」(亦稱為「hA2-27D-L4」)。 人化hA2-27D-L4型輕鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列識別號56。序列識別號56之胺基酸序列之由第1至20號之胺基酸殘基所構成的序列、由第21至129號之胺基酸殘基所構成的序列、由第130至234號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、輕鏈可變區、輕鏈恒定區。編碼序列識別號56之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列識別號55。序列識別號55之核苷酸序列之由第26至85號之核苷酸所構成的序列、由第86至412號之核苷酸所構成的序列、由第413至727號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、輕鏈可變區序列、輕鏈恒定區序列。序列識別號55之核苷酸序列及序列識別號56之胺基酸序列亦記載於第29圖。 7)-7-5人化hA2-27D-L5型輕鏈 將伴隨有將序列識別號26所示的嵌合cA2-27D之輕鏈之胺基酸編號29(蘇胺酸)取代為甘胺酸、胺基酸編號32(丙胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號38(離胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號91(絲胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號93(丙胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號96(絲胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號99(丙胺酸)取代為脯胺酸、胺基酸編號102(纈胺酸)取代為苯丙胺酸而設計的人化hA2-27D輕鏈命名為「人化hA2-27D-L5型輕鏈」(亦稱為「hA2-27D-L5」)。 人化hA2-27D-L5型輕鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列識別號58。序列識別號58之胺基酸序列之由第1至20號之胺基酸殘基所構成的序列、由第21至129號之胺基酸殘基所構成的序列、由第130至234號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、輕鏈可變區、輕鏈恒定區。編碼序列識別號58之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列識別號57。序列識別號57之核苷酸序列之由第26至85號之核苷酸所構成的序列、由第86至412號之核苷酸所構成的序列、由第413至727號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、輕鏈可變區序列、輕鏈恒定區序列。序列識別號57之核苷酸序列及序列識別號58之胺基酸序列亦記載於第30圖。 7)-8利用重鏈及輕鏈之組合的人化hA2-27D之設計 設計包含人化hA2-27D-H1型重鏈及人化hA2-27D-L1型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-27D-H1/L1」(亦稱為「hA2-27D-H1/L1」)。設計包含人化hA2-27D-H1型重鏈及人化hA2-27D-L2型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-27D-H1/L2」(亦稱為「hA2-27D-H1/L2」)。設計包含人化hA2-27D-H1型重鏈及人化hA2-27D-L3型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-27D-H1/L3」(亦稱為「hA2-27D-H1/L3」)。設計包含人化hA2-27D-H2型重鏈及人化hA2-27D-L1型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-27D-H2/L1」(亦稱為「hA2-27D-H2/L1」)。設計包含人化hA2-27D-H2型重鏈及人化hA2-27D-L2型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-27D-H2/L2」(亦稱為「hA2-27D-H2/L2」)。設計包含人化hA2-27D-H2型重鏈及人化hA2-27D-L3型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-27D-H2/L3」(亦稱為「hA2-27D-H2/L3」)。設計包含人化hA2-27D-H3型重鏈及人化hA2-27D-L1型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-27D-H3/L1」(亦稱為「hA2-27D-H3/L1」)。設計包含人化hA2-27D-H3型重鏈及人化hA2-27D-L2型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-27D-H3/L2」(亦稱為「hA2-27D-H3/L2」)。設計包含人化hA2-27D-H3型重鏈及人化hA2-27D-L3型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-27D-H3/L3」(亦稱為「hA2-27D-H3/L3」)。設計包含人化hA2-27D-H3型重鏈及人化hA2-27D-L4型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-27D-H3/L4」(亦稱為「hA2-27D-H3/L4」)。設計包含人化hA2-27D-H4型重鏈及人化hA2-27D-L3型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-27D-H4/L3」(亦稱為「hA2-27D-H4/L3」)。設計包含人化hA2-27D-H4型重鏈及人化hA2-27D-L4型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-27D-H4/L4」(亦稱為「hA2-27D-H4/L4」)。設計包含人化hA2-27D-H4型重鏈及人化hA2-27D-L5型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-27D-H4/L5」(亦稱為「hA2-27D-H4/L5」)。設計包含人化hA2-27D-H5型重鏈及人化hA2-27D-L4型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-27D-H5/L4」(亦稱為「hA2-27D-H5/L4」)。藉由以上而設計的抗體係可按照實施例8而製作，按照實施例2及4來評價。
＜實施例8＞ 人化A2-15A抗體、及人化A2-27D抗體之表現載體之構築及抗體之調製 8)-1人化A2-15A之重鏈表現載體之構築 8)-1-1人化hA2-15A-H1型重鏈表現載體之構築 合成含有序列識別號27所示的人化hA2-15A-H1之核苷酸序列之核苷酸編號第36至443號所示的編碼人化hA2-15A-H1之可變區的DNA序列的DNA片段(GENEART公司，人工基因合成服務)。將合成的DNA片段作為模板，以KOD-Plus-(TOYOBO公司、日本)與下述之引子組，將含有編碼人化hA2-15A-H1之可變區的DNA序列的DNA片段放大，藉由使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，插入至將嵌合及人化抗體IgG1型重鏈表現載體pCMA-G1以限制酵素BlpI切斷之處，而構築hA2-15A-H1表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-G1/hA2-15A-H1」。 引子組 5’-AGCTCCCAGATGGGTGCTGAGC-3’(EG-Inf-F；序列識別號99) 5’-GGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGC-3’(EG1-Inf-R；序列識別號100) 8)-1-2人化hA2-15A-H4型重鏈表現載體之構築 合成含有序列識別號29所示的人化hA2-15A-H4之核苷酸序列之核苷酸編號第36至443號所示的編碼人化hA2-15A-H4之可變區的DNA序列的DNA片段(GENEART公司，人工基因合成服務)。以與實施例8)-1-1相同之方法，構築人化hA2-15A-H4表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-G1/hA2-15A-H4」。 8)-2人化A2-15A之輕鏈表現載體之構築 8)-2-1人化hA2-15A-L1型輕鏈表現載體之構築 合成含有序列識別號31所示的編碼人化hA2-15A-L1的序列的DNA片段(GENEART公司，基因合成服務)。將合成的DNA片段作為模板，以KOD-Plus-(TOYOBO公司)與下述之引子組，將含有編碼人化hA2-15A-L1的序列的DNA片段放大，藉由使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，插入至將表現載體pCMA-LK以限制酵素XbaI及PmeI消化而去除κ鏈分泌訊息及人類κ鏈恒定區之處，而構築人化hA2-15A-L1表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA/hA2-15A-L1」。 引子組 5’-CCAGCCTCCGGACTCTAGAGCCACC-3’(CM-inf-F；序列識別號101) 5’-AGTTAGCCTCCCCCGTTTAAACTC-3’(CM-inf-R；序列識別號102) 8)-2-2人化hA2-15A-L4型輕鏈表現載體之構築 合成含有序列識別號33所示的編碼人化hA2-15A-L4的序列的DNA片段(GENEART公司，基因合成服務)。以與實施例8)-2-1相同之方法，構築人化hA2-15A-L4表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA/hA2-15A-L4」。 8)-2-3人化hA2-15A-L6型輕鏈表現載體之構築 合成含有序列識別號35所示的編碼人化hA2-15A-L6的序列的DNA片段(GENEART公司，基因合成服務)。以與實施例8)-2-1相同之方法，構築人化hA2-15A-L6表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA/hA2-15A-L6」。 8)-2-4人化hA2-15A-L7型輕鏈表現載體之構築 合成含有序列識別號37所示的編碼人化hA2-15A-L7的序列的DNA片段(GENEART公司，基因合成服務)。以與實施例8)-2-1相同之方法，構築人化hA2-15A-L7表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA/hA2-15A-L7」。 8)-3人化A2-27D之重鏈表現載體之構築 8)-3-1人化hA2-27D-H1型重鏈表現載體之構築 合成含有序列識別號39所示的人化hA2-27D-H1之核苷酸序列之核苷酸編號第36至437號所示的編碼人化hA2-27D-H1之可變區的DNA序列的DNA片段(GENEART公司，人工基因合成服務)。以與實施例8)-1-1相同之方法，構築人化hA2-27D-H1表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-G1/hA2-27D-H1」。 8)-3-2人化hA2-27D-H2型重鏈表現載體之構築 合成含有序列識別號41所示的人化hA2-27D-H2之核苷酸序列之核苷酸編號第36至437號所示的編碼人化hA2-27D-H2之可變區的DNA序列的DNA片段(GENEART公司，人工基因合成服務)。以與實施例8)-1-1相同之方法，構築人化hA2-27D-H2表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-G1/hA2-27D-H2」。 8)-3-3人化hA2-27D-H3型重鏈表現載體之構築 合成含有序列識別號43所示的人化hA2-27D-H3之核苷酸序列之核苷酸編號第36至437號所示的編碼人化hA2-27D-H3之可變區的DNA序列的DNA片段(GENEART公司，人工基因合成服務)。以與實施例8)-1-1相同之方法，構築人化hA2-27D-H3表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-G1/hA2-27D-H3」。 8)-3-4人化hA2-27D-H4型重鏈表現載體之構築 合成含有序列識別號45所示的人化hA2-27D-H4之核苷酸序列之核苷酸編號第36至437號所示的編碼人化hA2-27D-H4之可變區的DNA序列的DNA片段(GENEART公司，人工基因合成服務)。以與實施例8)-1-1相同之方法，構築人化hA2-27D-H4表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-G1/hA2-27D-H4」。 8)-3-5人化hA2-27D-H5型重鏈表現載體之構築 合成含有序列識別號47所示的人化hA2-27D-H5之核苷酸序列之核苷酸編號第36至437號所示的編碼人化hA2-27D-H5之可變區的DNA序列的DNA片段(GENEART公司，人工基因合成服務)。以與實施例8)-1-1相同之方法，構築人化hA2-27D-H5表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-G1/hA2-27D-H5」。 8)-4人化A2-27D之輕鏈表現載體之構築 8)-4-1人化hA2-27D-L1型輕鏈表現載體之構築 合成含有序列識別號49所示的編碼人化hA2-27D-L1的序列的DNA片段(GENEART公司，基因合成服務)。以與實施例8)-2-1相同之方法，構築人化hA2-27D-L1表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA/hA2-27D-L1」。 8)-4-2人化hA2-27D-L2型輕鏈表現載體之構築 合成含有序列識別號51所示的編碼人化hA2-27D-L2的序列的DNA片段(GENEART公司，基因合成服務)。以與實施例8)-2-1相同之方法，構築人化hA2-27D-L2表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA/hA2-27D-L2」。 8)-4-3人化hA2-27D-L3型輕鏈表現載體之構築 合成含有序列識別號53所示的編碼人化hA2-27D-L3的序列的DNA片段(GENEART公司，基因合成服務)。以與實施例8)-2-1相同之方法，構築人化hA2-27D-L3表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA/hA2-27D-L3」。 8)-4-4人化hA2-27D-L4型輕鏈表現載體之構築 合成含有序列識別號55所示的編碼人化hA2-27D-L4的序列的DNA片段(GENEART公司，基因合成服務)。以與實施例8)-2-1相同之方法，構築人化hA2-27D-L4表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA/hA2-27D-L4」。 8)-4-5人化hA2-27D-L5型輕鏈表現載體之構築 合成含有序列識別號57所示的編碼人化hA2-27D-L5的序列的DNA片段(GENEART公司，基因合成服務)。以與實施例8)-2-1相同之方法，構築人化hA2-27D-L5表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA/hA2-27D-L5」。 8)-5人化A2-15A抗體(IgG1)、及人化A2-27D抗體(IgG1)之調製 8)-5-1人化A2-15A抗體(IgG1)、及人化A2-27D抗體(IgG1)之生產 以與實施例5)-7同樣之方法生產。即，藉由實施例8)-1-2構築的pCMA-G1/hA2-15A-H4及實施例8)-2-3構築的pCMA/hA2-15A-L6之組合，取得人化hA2-15A-H4/L6。藉由實施例8)-3-2構築的pCMA-G1/hA2-27D-H2及實施例8)-4-2構築的pCMA/hA2-27D-L2之組合，取得人化hA2-27D-H2/L2。藉由實施例8)-3-3構築的pCMA-G1/hA2-27D-H3及實施例8)-4-4構築的pCMA/hA2-27D-L4之組合，取得人化hA2-27D-H3/L4。 8)-5-2人化A2-15A抗體(IgG1)、及人化A2-27D抗體(IgG1)之二階段步驟純化 將實施例8)-5-1所獲得的培養上清以與實施例5)-8同樣之方法來純化。
＜實施例9＞ 人化A2-15A抗體(IgG1)、及人化A2-27D抗體(IgG1)之活體外活性評價 9)-1利用螢光素酶報導子試驗的抗體評價 實施例8)-5所製作的人化hA2-15A-H4/L6、人化hA2-27D-H2/L2、及人化hA2-27D-H3/L4之經由ALK2的細胞內訊息之抑制活性係使用BMP專一性的螢光素酶報導子來解析。藉由以與實施例6)-1同樣之方法，對HEPG2細胞導入pGL4.26/Id1WT4F-luc(Genes Cells, 7, 949(2002))，3小時後將培養基交換為新鮮的FreeStyle293 expressionmedium(Invitrogen公司)。之後，添加人化抗體及10ng/mL之BMP7(Milteney公司製)，於次日測量螢光素酶活性。 將結果記載於第31圖。確認人化hA2-15A-H4/L6、人化hA2-27D-H2/L2、及人化hA2-27D-H3/L4係劑量依存性地抑制BMP7所誘導的BMP專一性螢光素酶活性。
＜實施例10＞ 人化A2-15A抗體(IgG1)、及人化A2-27D抗體(IgG1)之對人類ALK2的結合性評價 實施例8)-5所製作的人化hA2-15A-H4/L6、人化hA2-27D-H2/L2及人化hA2-27D-H3/L4與抗原(Recombinant Human ALK2 Fc Chimera、Sino Biological Inc.)之解離常數測量係使用Biacore T200(GE HEALTHCARE BIOSCIENCE(股))，將抗原作為配位體而固定化，並將抗體作為分析物來測量。抗原係以1.25μg/mL添加60秒鐘，使其固定化於感應晶片CM5(GE HEALTHCARE BIOSCIENCE(股))。使用HBS-EP+(10mM HEPES pH7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.05%Surfactant P20)作為泳動(running)緩衝液。於將抗原固定化的晶片上，以流速30μl/分鐘添加抗體之稀釋系列溶液(0.2-50nM)300秒鐘，接著監測1800秒鐘間之解離相。以流速10μl/分鐘添加作為再生溶液之10mM甘胺酸鹽酸溶液pH1.5 30秒鐘，進行2次。資料之解析係使用分析軟體(BIAevaluation software，1.0版)之雙價(Bivalent)結合模型，而算出結合速度常數ka、解離速度常數kd及解離常數(KD；KD=kd/ka)。 將結果示於表1。
[表1] 人化A2-15A抗體､及人化A2-27D抗體之解離常數
   名稱 KD(nM)
1 hA2-27D-H2/L2 5.7
2 hA2-27D-H3/L4 4.3
3 hA2-15A-H4/L6 4.3
＜實施例11＞ 人化A2-15A抗體(IgG2)之調製 11)-1人化IgG2型重鏈表現載體pCMA-G2之構築 將實施例5)-1所構築的pCMA-LK以XbaI及PmeI消化而去除κ鏈分泌訊息及人類κ鏈恒定區的DNA片段、與含編碼人類重鏈分泌訊息序列及人類IgG2恒定區之胺基酸序列的核苷酸序列的DNA片段(序列識別號103)，使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(Clontech公司)而結合，而構築於CMV啟動子之下游具有訊息序列、選殖位、人類IgG2重鏈恒定區之嵌合及人化IgG2型重鏈表現載體pCMA-G2。 11)-2人化hA2-15A-H4 IgG2型重鏈表現載體之構築 將實施例8)-1-2所構築的pCMA-G1/hA2-15A-H4作為模板，以KOD-Plus-(TOYOBO公司)及下述之引子組，將含編碼重鏈之可變區的cDNA的DNA片段放大，藉由使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，插入至將人化IgG2型重鏈表現載體pCMA-G2以限制酵素BlpI切斷之處，而構築人化hA2-15A-H4 IgG2型表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-G2/hA2-15A-H4」。 將人化hA2-15A-H4 IgG2型重鏈之核苷酸序列示於序列識別號104、胺基酸序列示於序列識別號105。序列識別號104之核苷酸序列之由第1至57號之核苷酸所構成的序列、由第58至426號之核苷酸所構成的序列、由第427至1404號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、重鏈可變區序列、重鏈恒定區序列。序列識別號105之胺基酸序列之由第1至19號之胺基酸殘基所構成的序列、由第20至142號之胺基酸殘基所構成的序列、由第143至468號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、重鏈可變區、重鏈恒定區。序列識別號104之核苷酸序列及序列識別號105之胺基酸序列亦記載於第32圖。 人化hA2-15A-H4 IgG2型重鏈用引子組 5’-CAGATGGGTGCTGAGCGAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGC-3’(15A-H4-F；序列識別號130) 5’-CTTGGTGCTGGCTGAGCTGACGGTCACGAGGGTGCC-3’(15A-H4-R；序列識別號131) 11)-3人化A2-15A抗體(IgG2)之生產 以與實施例5)-7同樣之方法生產。將藉由實施例11)-2所構築的pCMA-G2/hA2-15A-H4與實施例8)-2-3所構築的pCMA/hA2-15A-L6之組合所取得的人化A2-15A抗體命名為「人化hA2-15A-H4/L6(IgG2)」。 11)-4人化hA2-15A-H4/L6(IgG2)之二階段步驟純化 將實施例11)-3所獲得的培養上清液，藉由以與實施例5)-8同樣之方法純化。
＜實施例12＞ 人化A2-27D抗體(IgG1 LALA)之調製 12)-1人化hA2-27D-H2-LALA型重鏈表現載體之構築 將實施例8)-3-2所構築的pCMA-G1/hA2-27D-H2作為模板，藉由使用下述引子組及KOD -Plus- Mutagenesis Kit(TOYOBO公司)導入突變，而構築hA2-27D-H2-LALA型重鏈表現載體。將構築的表現載體命名為「pCMA-G1/hA2-27D-H2-LALA」。 將人化hA2-27D-H2-LALA型重鏈之核苷酸序列示於序列識別號106、胺基酸序列示於序列識別號107。序列識別號106之核苷酸序列之由第1至57號之核苷酸所構成的序列、由第58至420號之核苷酸所構成的序列、由第421至1410號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、重鏈可變區序列、重鏈恒定區序列。序列識別號107之胺基酸序列之由第1至19號之胺基酸殘基所構成的序列、由第20至140號之胺基酸殘基所構成的序列、由第141至470號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、重鏈可變區、重鏈恒定區。序列識別號106之核苷酸序列及序列識別號107之胺基酸序列亦記載於第33圖。 引子組： 5’-GCGGGGGGACCCTCAGTCTTCCTCTTCCCC-3’(LALA-F；序列識別號132) 5’-GGCTTCAGGTGCTGGGCAGGGTGGGCATGTG-3’(LALA-R；序列識別號133) 12)-2人化hA2-27D-H3-LALA型重鏈表現載體之構築 將實施例8)-3-3所構築的pCMA-G1/hA2-27D-H3作為模板，以與實施例12)-1同樣之方法而構築hA2-27D-H3-LALA型重鏈表現載體。將構築的表現載體命名為「pCMA-G1/hA2-27D-H3-LALA」。 將人化hA2-27D-H3-LALA型重鏈之核苷酸序列示於序列識別號108、胺基酸序列示於序列識別號109。序列識別號108之核苷酸序列之由第1至57號之核苷酸所構成的序列、由第58至420號之核苷酸所構成的序列、由第421至1410號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、重鏈可變區序列、重鏈恒定區序列。序列識別號109之胺基酸序列之由第1至19號之胺基酸殘基所構成的序列、由第20至140號之胺基酸殘基所構成的序列、由第141至470號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、重鏈可變區、重鏈恒定區。序列識別號108之核苷酸序列及序列識別號109之胺基酸序列亦記載於第34圖。 12)-3人化A2-27D抗體(IgG1 LALA)之生產 以與實施例5)-7同樣之方法生產。將藉由實施例12)-1所構築的pCMA-G1/hA2-27D-H2-LALA及實施例8)-4-2所構築的pCMA/hA2-27D-L2之組合所取得的人化A2-27D抗體命名為「人化hA2-27D-H2/L2(IgG1 LALA)」，將藉由實施例12)-2所構築的pCMA-G1/hA2-27D-H3-LALA與實施例8)-4-4所構築的pCMA/hA2-27D-L4之組合而取得的人化A2-27D抗體命名為「人化hA2-27D-H3/L4(IgG1 LALA)」。 12)-4人化A2-27D抗體(IgG1 LALA)之二階段步驟純化 將實施例12)-3所獲得的培養上清液以與實施例5)-8同樣之方法純化。
＜實施例13＞ 人化A2-15A抗體(IgG2)、人化A2-27D抗體(IgG1 LALA)之活體外活性評價 13)-1利用螢光素酶報導子試驗的抗體評價 實施例11)-4所製作的人化A2-15A-H4/L6(IgG2)、實施例12)-4所獲得的人化A2-27D-H2/L2(IgG1 LALA)之經由ALK2的細胞內訊息之抑制活性係使用BMP專一性的螢光素酶報導子來解析。以與實施例6)-1同樣之方法，對HEPG2細胞導入pGL4.26/Id1WT4F-luc(Genes Cells, 7, 949(2002))，3小時後將培養基交換為新鮮的FreeStyle293 expression medium(Invitrogen公司)。之後，添加人化抗體及2.5ng/mL之BMP9，與實施例6)-1同樣地於翌日測量螢光素酶活性。 將結果記載於第35圖。確認人化A2-15A-H4/L6(IgG2)、人化A2-27D-H2/L2(IgG1 LALA)係劑量依存性地抑制BMP7所誘導的BMP專一性的螢光素酶活性。
＜實施例14＞ 人化A2-15A抗體(IgG2)、人化A2-27D抗體(IgG1 LALA)之對人類ALK2的結合性評價 14)-1人類ALK2細胞外結構域之表現純化 將編碼人類ALK2細胞外結構域(由NCBI之蛋白資料庫之登錄號NP_001096之胺基酸序列之第21至123號的胺基酸殘基所構成的多肽)的DNA併入載體pET-28b(+)(NOVAGEN公司，目錄編號：69865)，構築使於C末端側連結有His標籤序列的蛋白表現的質體。使用此質體，將大腸菌SHuffle T7(New England Biolabs公司，目錄編號：C3029H)轉形，以TB培養基(Sigma-Aldrich公司，目錄編號：T0918)培養。培養後，將經超音波破碎的菌體離心分離，將上清液以HisTrap FF crude管柱(GE HEALTHCARE公司，目錄編號：17-5286-01)純化。之後，使用HiLoad 26/600 Superdex 200管柱(GE HEALTHCARE公司，目錄編號：28-9893-36)，純化人類ALK2細胞外結構域直到於電泳成為分子量12kDa之單一帶為止。 14)-2使用人化A2-15A抗體(IgG2)、人化A2-27D抗體(IgG1 LALA)的抗原結合能力之測量 實施例11)-4所製作的人化hA2-15A-H4/L6(IgG2)、實施例12)-4所製作的人化hA2-27D-H2/L2(IgG1 LALA)及人化hA2-27D-H3/L4(IgG1 LALA)與抗原(實施例14)-1所調製的人類ALK2細胞外結構域)之解離常數測量係使用Biacore T200(GE HEALTHCARE BIOSCIENCE(股)、日本)，以於經固定化的抗人類IgG(Fc)抗體將抗體作為配位體來捕捉(capture)，將抗原作為分析物而測量的捕捉法來進行。抗人類IgG(Fc)抗體(Human Antibody Capture kit、GE HEALTHCARE BIOSCIENCE(股))係以胺耦合法使其約1000RU共價結合至感應晶片CM5(GE HEALTHCARE BIOSCIENCE(股))。對於參考胞(reference cell)亦同樣地固定化。使用HBS-EP+(10mM HEPES pH7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.05%Surfactant P20)作為泳動緩衝液。於將抗人類IgG(Fc)抗體固定化的晶片上，添加抗體約1分鐘後，將抗原之稀釋系列溶液(0.78-200nM)以流速30μl/分鐘添加300秒鐘，接著監測600秒鐘間之解離相。將作為再生溶液之3M氯化鎂溶液，以流速10μl/分鐘添加30秒鐘。資料之解析係使用分析軟體(BIAevaluation software，version 1.0)之1：1結合模型，算出結合速度常數ka、解離速度常數kd及解離常數(KD；KD=kd/ka)。 將結果示於表2。
[表2] 人化A2-15A抗體(IgG2)､及人化A2-27D抗體 (IgG1 LALA)之解離常數
   名稱 KD(nM)
1 hA2-15A-H4/L6､IgG2 17.4
2 hA2-27D-H2/L2､IgG1 LALA 13.6
3 hA2-27D-H3/L4､IgG1 LALA 13.3
＜實施例15＞ 人化A2-15A抗體(IgG2)、人化A2-27D抗體(IgG1 LALA)之活體內活性評價 實施例11)-4所製作的人化hA2-15A-H4/L6(IgG2)、及實施例12)-4所製作的人化hA2-27D-H2/L2(IgG1 LALA)之對異位性骨化的抑制活性係使用「使用小鼠的利用BMP7之移植的異位性骨化模型」來解析。使於切取為4mm徑之圓形的CollaTape(Zimmer Dental公司製)中浸滲有BMP7(Milteney公司製)2.5Micro-G(μg)者於-80℃冷凍一晩後，真空乾燥。將小鼠(C57BL/6：8-9週齡)之大腿骨附近皮膚的毛剃除，於異氟醚吸入麻醉下切開，將經冷凍乾燥的濾紙移植於骨骼肌內。於移植起2週後將異位性骨化以微米級CT(Comscan公司製)進行石灰化的異位性骨之解析，之後取出骨骼肌內之異位性骨，測量重量。抗體之投予係以1週1次(將移植日作為第0日，於第1、6日)作皮下投予來實施。投予抗體之濃度係以成為1、3、10mg/kg的方式以溶媒(HBSor)稀釋來進行。對於對照組之小鼠，將IgG(JACKSON IMMUNORESEARCH公司製)以成為10mg/kg的方式以溶媒調製而進行投予。 將結果記載於第36圖。確認人化hA2-15A-H4/L6(IgG2)、及人化hA2-27D-H2/L2(IgG1 LALA)抑制BMP7所誘導的小鼠之骨骼肌組織中的異位性骨誘導。
＜實施例16＞ A2-27D抗體之抗原決定位解析 16)-1人類嵌合cA2-27D Fab片段之製作 使用Pierce Fab Preparation Kit，自實施例5)-8所獲得的人類嵌合cA2-27D抗體來製作Fab片段。 16)-2人類嵌合cA2-27D Fab片段與ALK2-ECD複合體之結晶化及構造解析 將16)-1所獲得的人類嵌合cA2-27D Fab片段與按照實施例14所調製的ALK2-ECD複合體濃縮成2.4mg/mL，用於結晶化。結晶化係使用蒸氣擴散法。將於蛋白質溶液0.5μL中等量添加沉澱劑溶液(2%(v/v)Tacsimate pH7.0，100mM HEPES pH7.5，20%(w/v)聚乙二醇3,350)的溶液，以使兩溶液未互相接觸的方式放入於置入有50μL之沉澱劑溶液的密閉容器中，於20℃靜置。3日後，獲得0.1mm×0.1mm×0.1mm之單結晶。將獲得的結晶浸漬於添加20%(v/v)甘油的沉澱劑溶液中，接著以液化氮冷凍。以高能量加速器研究機構放射光科學研究施設之BL1A，於95K氮氣流下，收集X射線繞射資料。由獲得的繞射像，使用軟體XDS(Acta Cryst.(2010).D66, 125-132)將繞射強度加以數値化，而求得結晶構造因子。結晶係體心單斜晶系(body-centered monoclinic system)，空間群為C121，結晶之單位晶格係a=c=119.39Å、b=37.32Å，β=92.54。使用獲得的構造因子及Fab(利用過去進行結晶構造解析的抗體構造)之三次元構造座標而進行分子取代法，並決定位相。計算係使用軟體phaser(CCP4：Collaborative Computation Project No.4)。結晶係於非對稱單位含有1個複合體。使用軟體refmac5(CCP4)而進行構造之精密化，使用軟體coot而進行模型之修正。重複進行此操作，以2.6Å分解能力獲得最終之R値22.3%、freeR値26.7%。模型係由1個之複合體而成，包含A2-27D Fab之L鏈胺基酸殘基1-211、H鏈胺基酸殘基1-134與141-223、ALK2-ECD之胺基酸殘基11-89、及61個之水分子。自經決定的A2-27D Fab起位於4Å以內的ALK2-ECD之胺基酸殘基係如以下：Glu18、Gly19、Ile39、Asn40、Asp41、Gly42、Phe43、His44、Val45、Tyr46、Asn82、Thr84、Gln86、Leu87。第37圖顯示複合體全體之色帶模型(ribbon model)。
＜實施例17＞ 人化A2-11E抗體、及人化A2-25C抗體之設計 17)-1人化hA2-11E之設計 17)-1-1 A2-11E之可變區之分子模擬 A2-11E之可變區之分子模擬係藉由作為同一性模擬之周知方法(Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991))來實行。將登錄於蛋白質資料庫(Nuc.Acid Res.35, D301-D303(2007))的人類免疫球蛋白之可變區之1次序列(可取得自X射線結晶構造所衍生的三次元構造)，與上述決定的A2-11E之可變區作比較。就結果而言，3BN9係對A2-11E之重鏈與輕鏈之可變區具有最高序列同一性而被選擇。框架領域之三次元構造係藉由將3BN9之座標組合，獲得「框架模型」而製作。其次，針對各自之CDR之代表性的構形被併入框架模型。 最後，於能量的觀點，為了獲得有A2-11E之可變區之可能性的分子模型，進行用以去除不利的原子間接觸的能量最小化計算。將上述順序使用市售之蛋白質立體構造解析程式Discovery Studio(Accelrys公司製)來進行。 17)-1-2對人化hA2-11E的胺基酸序列之設計 將人化hA2-11E之構築藉由作為CDR接枝(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86, 10029-10033(1989))之一般性周知方法來進行。接受者抗體係基於框架區內之胺基酸同一性而被選擇。 將A2-11E之框架領域之序列與人類之子群・一致序列之框架區比較。就結果而言，起因於KABAT et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5thEd. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))中既定的人類γ鏈子群3之一致序列與人類κ鏈子群1之一致序列係於此框架領域具有高序列同一性，而被選擇作為接受者。使於人類γ鏈子群3之一致序列與人類κ鏈子群1之一致序列之框架領域之胺基酸殘基，與於A2-11E之胺基酸殘基並列，鑑定使用相異胺基酸的位置。此等之殘基之位置係使用上述構築的A2-11E之三次元模型而被分析，而且應接枝於接受者上的供給者殘基係藉由依照Queen et al. (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86, 10029-10033(1989))給予的基準而被選擇。藉由將選擇的幾個之供給者殘基移入至接受者抗體，而將人化hA2-11E之序列以如以下之實施例記載的方式構築。 17)-2 A2-11E重鏈之人化 17)-2-1人化hA2-11E-H3型重鏈 將伴隨有將序列表之序列識別號2所示的A2-11E重鏈之胺基酸編號7(蘇胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號16(精胺酸)取代為甘胺酸、胺基酸編號19(離胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號23(纈胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號48(異白胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號61(脯胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號69(丙胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號75(丙胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號76(麩胺酸)取代為離胺酸、胺基酸編號88(絲胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號93(蘇胺酸)取代為纈胺酸而設計的人化hA2-11E重鏈命名為「hA2-11E-H3型重鏈」。 人化hA2-11E-H3型重鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列識別號111。序列識別號111之胺基酸序列之由第1至19號之胺基酸殘基所構成的序列、由第20至137號之胺基酸殘基所構成的序列、由第138至467號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、重鏈可變區、重鏈恒定區。編碼序列識別號111之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列識別號110。序列識別號110之核苷酸序列之由第1至57號之核苷酸所構成的序列、由第58至411號之核苷酸所構成的序列、由第412至1401號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、重鏈可變區序列、重鏈恒定區序列。序列識別號110之核苷酸序列及序列識別號111之胺基酸序列亦記載於第38圖。 17)-2-2人化hA2-11E-H4型重鏈 將伴隨有將序列表之序列識別號2所示的A2-11E重鏈之胺基酸編號7(蘇胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號16(精胺酸)取代為甘胺酸、胺基酸編號19(離胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號23(纈胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號69(丙胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號75(丙胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號76(麩胺酸)取代為離胺酸、胺基酸編號88(絲胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號93(蘇胺酸)取代為纈胺酸而設計的人化hA2-11E重鏈命名為「hA2-11E-H4型重鏈」。 人化hA2-11E-H4型重鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列識別號113。序列識別號113之胺基酸序列之由第1至19號之胺基酸殘基所構成的序列、由第20至137號之胺基酸殘基所構成的序列、由第138至467號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、重鏈可變區、重鏈恒定區。編碼序列識別號113之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列識別號112。序列識別號112之核苷酸序列之由第1至57號之核苷酸所構成的序列、由第58至411號之核苷酸所構成的序列、由第412至1401號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、重鏈可變區序列、重鏈恒定區序列。序列識別號112之核苷酸序列及序列識別號113之胺基酸序列亦記載於第39圖。 17)-3 A2-11E輕鏈之人化 17)-3-1人化hA2-11E-L2型輕鏈 將伴隨有將序列表之序列識別號4所示的A2-11E輕鏈之胺基酸編號10(白胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號21(白胺酸)取代為異白胺酸、胺基酸編號22(絲胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號40(白胺酸)取代為脯胺酸、胺基酸編號42(麩胺酸)取代為離胺酸、胺基酸編號58(異白胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號83(纈胺酸)取代為苯丙胺酸、胺基酸編號85(異白胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號87(苯丙胺酸)取代為酪胺酸、胺基酸編號99(脯胺酸)取代為麩醯胺酸、胺基酸編號103(白胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號105(白胺酸)取代為異白胺酸、胺基酸編號108(丙胺酸)取代為蘇胺酸而設計的人化hA2-11E輕鏈命名為「hA2-11E-L2型輕鏈」。 人化hA2-11E-L2型輕鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列識別號115。序列識別號115之胺基酸序列之由第1至20號之胺基酸殘基所構成的序列、由第21至128號之胺基酸殘基所構成的序列、由第129至233號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、輕鏈可變區、輕鏈恒定區。編碼序列識別號115之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列識別號114。序列識別號114之核苷酸序列之由第1至60號之核苷酸所構成的序列、由第61至384號之核苷酸所構成的序列、由第385至699號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、輕鏈可變區序列、輕鏈恒定區序列。序列識別號114之核苷酸序列及序列識別號115之胺基酸序列亦記載於第40圖。 17)-3-2人化hA2-11E-L3型輕鏈 將伴隨有將序列表之序列識別號4所示的A2-11E輕鏈之胺基酸編號10(白胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號21(白胺酸)取代為異白胺酸、胺基酸編號22(絲胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號40(白胺酸)取代為脯胺酸、胺基酸編號42(麩胺酸)取代為離胺酸、胺基酸編號83(纈胺酸)取代為苯丙胺酸、胺基酸編號85(異白胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號87(苯丙胺酸)取代為酪胺酸、胺基酸編號99(脯胺酸)取代為麩醯胺酸、胺基酸編號103(白胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號105(白胺酸)取代為異白胺酸、胺基酸編號108(丙胺酸)取代為蘇胺酸而設計的人化hA2-11E輕鏈命名為「hA2-11E-L3型輕鏈」。 人化hA2-11E-L3型輕鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列識別號117。序列識別號117之胺基酸序列之由第1至20號之胺基酸殘基所構成的序列、由第21至128號之胺基酸殘基所構成的序列、由第129至233號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、輕鏈可變區、輕鏈恒定區。編碼序列識別號117之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列識別號116。序列識別號116之核苷酸序列之由第1至60號之核苷酸所構成的序列、由第61至384號之核苷酸所構成的序列、由第385至699號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、輕鏈可變區序列、輕鏈恒定區序列。序列識別號116之核苷酸序列及序列識別號117之胺基酸序列亦記載於第41圖。 17)-3-3人化hA2-11E-L4型輕鏈 將伴隨有將序列表之序列識別號4所示的A2-11E輕鏈之胺基酸編號10(白胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號21(白胺酸)取代為異白胺酸、胺基酸編號40(白胺酸)取代為脯胺酸、胺基酸編號83(纈胺酸)取代為苯丙胺酸、胺基酸編號103(白胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號105(白胺酸)取代為異白胺酸、胺基酸編號108(丙胺酸)取代為蘇胺酸而設計的人化hA2-11E輕鏈命名為「hA2-11E-L4型輕鏈」。 人化hA2-11E-L4型輕鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列識別號119。序列識別號119之胺基酸序列之由第1至20號之胺基酸殘基所構成的序列、由第21至128號之胺基酸殘基所構成的序列、由第129至233號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、輕鏈可變區、輕鏈恒定區。編碼序列識別號119之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列識別號118。序列識別號118之核苷酸序列之由第1至60號之核苷酸所構成的序列、由第61至384號之核苷酸所構成的序列、由第385至699號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、輕鏈可變區序列、輕鏈恒定區序列。序列識別號118之核苷酸序列及序列識別號119之胺基酸序列亦記載於第42圖。 17)-4利用重鏈及輕鏈之組合的人化hA2-11E之設計 設計包含人化hA2-11E-H3型重鏈及人化hA2-11E-L2型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-11E-H3/L2」(「亦稱為hA2-11E-H3/L2」)。設計包含人化hA2-11E-H3型重鏈及人化hA2-11E-L3型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-11E-H3/L3」(亦稱為「hA2-11E-H3/L3」)。設計包含人化hA2-11E-H3型重鏈及人化hA2-11E-L4型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-11E-H3/L4」(亦稱為「hA2-11E-H3/L4」)。設計包含人化hA2-11E-H4型重鏈及人化hA2-11E-L2型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-11E-H4/L2」(亦稱為「hA2-11E-H4/L2」)。設計包含人化hA2-11E-H4型重鏈及人化hA2-11E-L3型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-11E-H4/L3」(亦稱為「hA2-11E-H4/L3」)。設計包含人化hA2-11E-H4型重鏈及人化hA2-11E-L4型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-11E-H4/L4」(亦稱為「hA2-11E-H4/L4」)。藉由以上而設計的抗體係可按照實施例18來製作，按照實施例2及4來評價。 17)-5人化hA2-25C之設計 17)-5-1 A2-25C之可變區之分子模擬 A2-25C之可變區之分子模擬係藉由作為同一性模擬之周知方法(Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991))來實行。將登錄於蛋白質資料庫(Nuc.Acid Res.35, D301-D303(2007))的人類免疫球蛋白之可變區之1次序列(可取得自X射線結晶構造所衍生的三次元構造)，與上述決定的AA2-25C之可變區作比較。就結果而言，3BN9係對A2-25C之重鏈與輕鏈之可變區具有最高序列同一性而被選擇。框架領域之三次元構造係藉由將3BN9之座標組合，獲得「框架模型」而製作。其次，針對各自之CDR之代表性的構形被併入框架模型。 最後，於能量的觀點，為了獲得有A2-25C之可變區之可能性的分子模型，進行用以去除不利的原子間接觸的能量最小化計算。將上述順序使用市售之蛋白質立體構造解析程式Discovery Studio(Accelrys公司製)來進行。 17)-5-2對人化hA2-25C的胺基酸序列之設計 將人化hA2-25C之構築藉由作為CDR接枝(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86, 10029-10033(1989))之一般性周知方法來進行。接受者抗體係基於框架區內之胺基酸同一性而被選擇。 將A2-25C之框架區之序列與人類之子群・一致序列之框架區比較。就結果而言，起因於KABAT et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))中既定的人類γ鏈子群3之一致序列與人類κ鏈子群1之一致序列係於此框架區具有高序列同一性，而被選擇作為接受者。使於人類γ鏈子群3之一致序列與人類κ鏈子群1之一致序列之框架區之胺基酸殘基，與於A2-25C之胺基酸殘基並列，鑑定使用相異胺基酸的位置。此等之殘基之位置係使用上述構築的A2-25C之三次元模型而被分析，而且應接枝於接受者上的供給者殘基係藉由依照Queen et al. (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86, 10029-10033(1989))給予的基準而被選擇。藉由將選擇的幾個之供給者殘基移入至接受者抗體，而將人化hA2-25C之序列以如以下實施例記載的方式構築。 17)-6 A2-25C重鏈之人化 17)-6-1人化hA2-25C-H3型重鏈 將伴隨有將序列表之序列識別號10所示的A2-25C重鏈之胺基酸編號19(離胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號38(半胱胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號42(蘇胺酸)取代為甘胺酸、胺基酸編號63(蘇胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號75(丙胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號84(天冬胺酸)取代為天冬醯胺酸、胺基酸編號88(絲胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號93(蘇胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號112(纈胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號113(甲硫胺酸)取代為白胺酸而設計的人化hA2-25C重鏈命名為「hA2-25C-H3型重鏈」。 人化hA2-25C-H3型重鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列識別號121。序列識別號121之胺基酸序列之由第1至19號之胺基酸殘基所構成的序列、由第20至137號之胺基酸殘基所構成的序列、由第138至467號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、重鏈可變區、重鏈恒定區。編碼序列識別號121之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列識別號120。序列識別號120之核苷酸序列之由第1至57號之核苷酸所構成的序列、由第58至411號之核苷酸所構成的序列、由第412至1401號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、重鏈可變區序列、重鏈恒定區序列。序列識別號120之核苷酸序列及序列識別號121之胺基酸序列亦記載於第43圖。 17)-6-2人化hA2-25C-H4型重鏈 將伴隨有將序列表之序列識別號10所示的A2-25C重鏈之胺基酸編號19(離胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號38(半胱胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號42(蘇胺酸)取代為甘胺酸、胺基酸編號63(蘇胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號75(丙胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號84(天冬胺酸)取代為天冬醯胺酸、胺基酸編號88(絲胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號113(甲硫胺酸)取代為白胺酸而設計的人化hA2-25C重鏈命名為「hA2-25C-H4型重鏈」。 人化hA2-25C-H4型重鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列識別號123。序列識別號123之胺基酸序列之由第1至19號之胺基酸殘基所構成的序列、由第20至137號之胺基酸殘基所構成的序列、由第138至467號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、重鏈可變區、重鏈恒定區。編碼序列識別號123之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列識別號122。序列識別號122之核苷酸序列之由第1至57號之核苷酸所構成的序列、由第58至411號之核苷酸所構成的序列、由第412至1401號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、重鏈可變區序列、重鏈恒定區序列。序列識別號122之核苷酸序列及序列識別號123之胺基酸序列亦記載於第44圖。 17)-7 A2-25C輕鏈之人化 17)-7-1人化hA2-25C-L1型輕鏈 將伴隨有將序列表之序列識別號12所示的A2-25C輕鏈之胺基酸編號9(丙胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號15(白胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號16(麩胺酸)取代為甘胺酸、胺基酸編號17(麩胺酸)取代為天冬胺酸、胺基酸編號18(異白胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號43(絲胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號45(麩醯胺酸)取代為離胺酸、胺基酸編號66(精胺酸)取代為甘胺酸、胺基酸編號70(麩醯胺酸)取代為天冬胺酸、胺基酸編號71(酪胺酸)取代為苯丙胺酸、胺基酸編號72(絲胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號74(離胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號77(精胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號79(精胺酸)取代為麩醯胺酸、胺基酸編號80(纈胺酸)取代為脯胺酸、胺基酸編號83(異白胺酸)取代為苯丙胺酸、胺基酸編號84(甘胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號85(異白胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號100(絲胺酸)取代為麩醯胺酸、胺基酸編號104(白胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號109(丙胺酸)取代為蘇胺酸而設計的人化hA2-25C輕鏈命名為「hA2-25C-L1型輕鏈」。 人化hA2-25C-L1型輕鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列識別號125。序列識別號125之胺基酸序列之由第1至20號之胺基酸殘基所構成的序列、由第21至129號之胺基酸殘基所構成的序列、由第130至234號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、輕鏈可變區、輕鏈恒定區。編碼序列識別號125之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列識別號124。序列識別號124之核苷酸序列之由第1至60號之核苷酸所構成的序列、由第61至387號之核苷酸所構成的序列、由第388至702號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、輕鏈可變區序列、輕鏈恒定區序列。序列識別號124之核苷酸序列及序列識別號125之胺基酸序列亦記載於第45圖。 17)-7-2人化hA2-25C-L2型輕鏈 將伴隨有將序列表之序列識別號12所示的A2-25C輕鏈之胺基酸編號9(丙胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號15(白胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號16(麩胺酸)取代為甘胺酸、胺基酸編號17(麩胺酸)取代為天冬胺酸、胺基酸編號18(異白胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號43(絲胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號45(麩醯胺酸)取代為離胺酸、胺基酸編號70(麩醯胺酸)取代為天冬胺酸、胺基酸編號72(絲胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號74(離胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號77(精胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號79(精胺酸)取代為麩醯胺酸、胺基酸編號80(纈胺酸)取代為脯胺酸、胺基酸編號83(異白胺酸)取代為苯丙胺酸、胺基酸編號84(甘胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號85(異白胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號100(絲胺酸)取代為麩醯胺酸、胺基酸編號104(白胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號109(丙胺酸)取代為蘇胺酸而設計的人化hA2-25C輕鏈命名為「hA2-25C-L2型輕鏈」。 人化hA2-25C-L2型輕鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列識別號127。序列識別號127之胺基酸序列之由第1至20號之胺基酸殘基所構成的序列、由第21至129號之胺基酸殘基所構成的序列、由第130至234號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、輕鏈可變區、輕鏈恒定區。編碼序列識別號127之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列識別號126。序列識別號126之核苷酸序列之由第1至60號之核苷酸所構成的序列、由第61至387號之核苷酸所構成的序列、由第388至702號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、輕鏈可變區序列、輕鏈恒定區序列。序列識別號126之核苷酸序列及序列識別號127之胺基酸序列亦記載於第46圖。 17)-7-3人化hA2-25C-L3型輕鏈 將伴隨有將序列表之序列識別號12所示的A2-25C輕鏈之胺基酸編號9(丙胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號15(白胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號16(麩胺酸)取代為甘胺酸、胺基酸編號17(麩胺酸)取代為天冬胺酸、胺基酸編號18(異白胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號45(麩醯胺酸)取代為離胺酸、胺基酸編號72(絲胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號74(離胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號77(精胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號79(精胺酸)取代為麩醯胺酸、胺基酸編號80(纈胺酸)取代為脯胺酸、胺基酸編號83(異白胺酸)取代為苯丙胺酸、胺基酸編號84(甘胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號85(異白胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號104(白胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號109(丙胺酸)取代為蘇胺酸而設計的人化hA2-25C輕鏈命名為「hA2-25C-L3型輕鏈」。 人化hA2-25C-L3型輕鏈之胺基酸序列係記載於序列表之序列識別號129。序列識別號129之胺基酸序列之由第1至20號之胺基酸殘基所構成的序列、由第21至129號之胺基酸殘基所構成的序列、由第130至234號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、輕鏈可變區、輕鏈恒定區。編碼序列識別號129之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列識別號128。序列識別號128之核苷酸序列之由第1至60號之核苷酸所構成的序列、由第61至387號之核苷酸所構成的序列、由第388至702號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、輕鏈可變區序列、輕鏈恒定區序列。序列識別號128之核苷酸序列及序列識別號129之胺基酸序列亦記載於第47圖。 17)-8利用重鏈及輕鏈之組合的人化hA2-25C之設計 設計包含人化hA2-25C-H3型重鏈及人化hA2-25C-L1型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-25C-H3/L1(亦稱為「hA2-25C-H3/L1」)。設計包含人化hA2-25C-H3型重鏈及人化hA2-25C-L2型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-25C-H3/L2」(亦稱為「hA2-25C-H3/L2」)。設計包含人化hA2-125C-H3型重鏈及人化hA2-25C-L3型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-25C-H3/L3」(亦稱為「hA2-25C-H3/L3」)。設計包含人化hA2-25C-H4型重鏈及人化hA2-25C-L1型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-25C-H4/L1」(亦稱為「hA2-25C-H4/L1」)。設計包含人化hA2-25C-H4型重鏈及人化hA2-25C-L2型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-25C-H4/L2」(亦稱為「hA2-25C-H4/L2」)。設計包含人化hA2-25C-H4型重鏈及人化hA2-25C-L3型輕鏈的抗體而命名為「人化hA2-25C-H4/L3」(亦稱為「hA2-25C-H4/L3」)。藉由以上而設計的抗體係可按照實施例18來製作，按照實施例2及4來評價。
＜實施例18＞ 人化A2-11E抗體(IgG1)、及人化A2-25C抗體(IgG1)之載體之構築與調製 18)-1人化A2-11E之重鏈表現載體之構築 18)-1-1人化hA2-11E-H3型重鏈表現載體之構築 合成含有序列識別號110所示的人化hA2-11E-H3之核苷酸序列之核苷酸編號36至428所示的編碼人化hA2-11E-H3之可變區的DNA序列的DNA片段(GENEART公司，人工基因合成服務)。以與實施例8)-1-1相同之方法，構築人化hA2-11E-H3表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-G1/hA2-11E-H3」。 18)-1-2人化hA2-11E-H4型重鏈表現載體之構築 合成含有序列識別號112所示的人化hA2-11E-H4之核苷酸序列之核苷酸編號36至428所示的編碼人化hA2-11E-H4之可變區的DNA序列的DNA片段(GENEART公司，人工基因合成服務)。以與實施例8)-1-1相同之方法，構築人化hA2-11E-H4表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-G1/hA2-11E-H4」。 18)-2人化A2-11E之輕鏈表現載體之構築 18)-2-1人化hA2-11E-L2型輕鏈表現載體之構築 合成含有序列識別號114所示的人化hA2-11E-L2之核苷酸序列之核苷酸編號37至399所示的編碼人化hA2-11E-L2之可變區的DNA序列的DNA片段(GENEART公司，人工基因合成服務)。將合成的DNA片段作為模板，以KOD-Plus-(TOYOBO公司)與下述之引子組，將含有編碼人化hA2-11E-L2之可變區的DNA序列的DNA片段放大，藉由使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，插入至將實施例5)-1所構築的嵌合及人化抗體輕鏈表現載體pCMA-LK以限制酵素BsiWI切斷之處，而構築人化hA2-11E-L2表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA/hA2-11E-L2」。 引子組 5’-CTGTGGATCTCCGGCGCGTACGGC-3’(CM-LKF；序列識別號134) 5’-GGAGGGGGCGGCCACCGTACG-3’(KCL-Inf-R；序列識別號135) 18)-2-2人化hA2-11E-L3型輕鏈表現載體之構築 合成含有序列識別號116所示的人化hA2-11E-L3之核苷酸序列之核苷酸編號37至399所示的編碼人化hA2-11E-L3之可變區的DNA序列的DNA片段(GENEART公司，人工基因合成服務)。以與實施例18)-2-1同樣之方法，構築人化hA2-11E-L3表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA/hA2-11E-L3」。 18)-2-3人化hA2-11E-L4型輕鏈表現載體之構築 合成含有序列識別號118所示的人化hA2-11E-L4之核苷酸序列之核苷酸編號37至339所示的編碼人化hA2-11E-L4之可變區的DNA序列的DNA片段(GENEART公司，人工基因合成服務)。以與實施例18)-2-1同樣之方法，構築人化hA2-11E-L4表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA/hA2-11E-L4」。 18)-3人化A2-25C之重鏈表現載體之構築 18)-3-1人化hA2-25C-H3型重鏈表現載體之構築 合成含有序列識別號120所示的人化hA2-25C-H3之核苷酸序列之核苷酸編號36至428所示的編碼人化hA2-25C-H3之可變區的DNA序列的DNA片段(GENEART公司，人工基因合成服務)。以與實施例8)-1-1相同之方法，構築人化hA2-25C-H3表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-G1/hA2-25C-H3」。 18)-3-2人化hA2-25C-H4型重鏈表現載體之構築 合成含有序列識別號122所示的人化hA2-25C-H4之核苷酸序列之核苷酸編號36至428所示的編碼人化hA2-25C-H4之可變區的DNA序列的DNA片段(GENEART公司，人工基因合成服務)。以與實施例8)-1-1相同之方法，構築人化hA2-25C-H4表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-G1/hA2-25C-H4」。 18)-4人化A2-25C之輕鏈表現載體之構築 18)-4-1人化hA2-25C-L1型輕鏈表現載體之構築 合成含有序列識別號124所示的人化hA2-25C-L1之核苷酸序列之核苷酸編號37至402所示的編碼人化hA2-25C-L1之可變區的DNA序列的DNA片段(GENEART公司，人工基因合成服務)。以與實施例18)-2-1同樣之方法，構築人化hA2-25C-L1表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA/hA2-25C-L1」。 18)-4-2人化hA2-25C-L2型輕鏈表現載體之構築 合成含有序列識別號126所示的人化hA2-25C-L2之核苷酸序列之核苷酸編號37至402所示的編碼人化hA2-25C-L2之可變區的DNA序列的DNA片段(GENEART公司，人工基因合成服務)。以與實施例18)-2-1同樣之方法，構築人化hA2-25C-L2表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA/hA2-25C-L2」。 18)-4-3人化hA2-25C-L3型輕鏈表現載體之構築 合成含有序列識別號128所示的人化hA2-25C-L3之核苷酸序列之核苷酸編號37至402所示的編碼人化hA2-25C-L3之可變區的DNA序列的DNA片段(GENEART公司，人工基因合成服務)。以與實施例18)-2-1同樣之方法，構築人化hA2-25C-L3表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA/hA2-25C-L3」。 18)-5人化A2-11E抗體(IgG1)、及人化A2-25C抗體(IgG1)之小規模生產 FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)係按照操作手冊來進行繼代、培養。 將對數增殖期之1×107 個之FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)以FreeStyle293 expression medium(Invitrogen公司)稀釋為9.6mL後，播種於30mL方形儲存瓶(Nalgene公司)，於37℃、8%CO2 培養箱內以90rpm震盪培養一小時。將聚乙亞胺(Polyscience#24765)30μg溶解於Opti-Pro SFM(Invitrogen公司)200μL，接著將使用NucleoBond Xtra(TaKaRa公司)而調製的輕鏈表現載體(6μg)及重鏈表現載體(4μg)添加於200μL之Opti-Pro SFM(Invitrogen公司)。於聚乙亞胺/Opti-Pro SFM混合液200μL，添加表現載體/Opti-Pro SFM混合液200μL並溫和地攪拌，再放置5分鐘後，添加至FreeStyle 293F細胞。將於37℃、8%CO2 培養箱中以90rpm震盪培養7日所獲得的培養上清液以Minisart-Plus filter(Sartorius公司)過濾作為評價用之樣品。 藉由實施例18)-1-1所構築的pCMA-G1/hA2-11E-H3與實施例18)-2-1所構築的pCMA/hA2-11E-L2之組合，取得人化hA2-11E-H3/L2。藉由實施例18)-1-1所構築的pCMA-G1/hA2-11E-H3與實施例18)-2-2所構築的pCMA/hA2-11E-L3之組合，取得人化hA2-11E-H3/L3。藉由實施例18)-1-1所構築的pCMA-G1/hA2-11E-H3與實施例18)-2-3所構築的pCMA/hA2-11E-L4之組合，取得人化hA2-11E-H3/L4。藉由實施例18)-1-2所構築的pCMA-G1/hA2-11E-H4與實施例18)-2-1所構築的pCMA/hA2-11E-L2之組合，取得人化hA2-11E-H4/L2。藉由實施例18)-1-2所構築的pCMA-G1/hA2-11E-H4與實施例18)-2-2所構築的pCMA/hA2-11E-L3之組合，取得人化hA2-11E-H4/L3。藉由實施例18)-1-2所構築的pCMA-G1/hA2-11E-H4與實施例18)-2-3所構築的pCMA/hA2-11E-L4之組合，取得人化hA2-11E-H4/L4。 藉由實施例18)-3-1所構築的pCMA-G1/hA2-25C-H3與實施例18)-4-1所構築的pCMA-/hA2-25C-L1之組合，取得人化hA2-25C-H3/L1。藉由實施例18)-3-1所構築的pCMA-G1/hA2-25C-H3與實施例18)-4-2所構築的pCMA/hA2-25C-L2之組合，取得人化hA2-25C-H3/L2。藉由實施例18)-3-1所構築的pCMA-G1/hA2-25C-H3與實施例18)-4-3所構築的pCMA/hA2-25C-L3之組合，取得人化hA2-25C-H3/L3。藉由實施例18)-3-2所構築的pCMA-G1/hA2-25C-H4與實施例18)-4-1所構築的pCMA/hA2-25C-L1之組合，取得人化hA2-25C-H4/L1。藉由實施例18)-3-2所構築的pCMA-G1/hA2-25C-H4與實施例18)-4-2所構築的pCMA/hA2-25C-L2之組合，取得人化hA2-25C-H4/L2。藉由實施例18)-3-2所構築的pCMA-G1/hA2-25C-H4與實施例18)-4-3所構築的pCMA/hA2-25C-L3之組合，取得人化hA2-25C-H4/L3。
＜實施例19＞ 人化A2-11E抗體(IgG1)、及人化A2-25C抗體(IgG1)之活體外活性評價 19)-1利用BMP之造骨細胞分化誘導分析之抗體評價 實施例18)-5所製作的人化A2-11E抗體(IgG1)、及人化A2-25C抗體(IgG1)之經由內源性ALK2的細胞內訊息之抑制活性係與實施例6)-2同樣地以對利用BMP的C2C12細胞向造骨細胞之分化誘導活性的效果來解析。於分化誘導係使用2.5ng/mL之GDF2/BMP9(RD‐SYSTEMS公司製)。 將結果記載於第48圖。確認人化A2-11E抗體(IgG1)、及人化A2-25C抗體(IgG1)係劑量依存性地抑制藉由BMP所誘導的C2C12細胞之向造骨細胞樣細胞的分化。
＜實施例20＞ 人化A2-11E抗體(IgG1)、及人化A2-25C抗體(IgG1)之對人類ALK2的結合性評價 實施例18)-5所製作的人化A2-11E抗體(IgG1)、及人化A2-25C抗體(IgG1)與抗原(以實施例14)-1調製的人類ALK2細胞外結構域)之解離常數測量係使用Biacore T200(GE HEALTHCARE BIOSCIENCE(股))，以於經固定化的抗人類IgG(Fc)抗體將抗體作為配位體來捕捉(capture)，將抗原作為分析物而測量的捕捉法來進行。抗人類IgG(Fc)抗體(Human Antibody Capture kit、GE HEALTHCARE BIOSCIENCE(股))係以胺耦合法使其約1000RU共價結合至感應晶片CM5(GE HEALTHCARE BIOSCIENCE(股))。對於參考胞亦同樣地固定化。使用HBS-EP+(10mM HEPES pH7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.05%Surfactant P20)作為泳動緩衝液。於將抗人類IgG(Fc)抗體固定化的晶片上，添加含抗體的培養上清液約1分鐘後，將抗原之稀釋系列溶液(0.78-200nM)以流速30μl/分鐘添加300秒鐘，接著監測600秒鐘之解離相。將作為再生溶液之3M MgCl2 ，以流速10μl/分鐘添加30秒鐘。資料之解析係使用分析軟體(BIAevaluation software，version 1.0)之1：1結合模型，算出結合速度常數ka、解離速度常數kd及解離常數(KD；KD=kd/ka)。 將結果示於表3。
[表3] 人化A2-11E抗體､及人化A2-25C抗體之解離常數
   名稱 KD(nM)
1 hA2-11E-H3/L2 63.1
2 hA2-11E-H3/L3 47.4
3 hA2-11E-H3/L4 31.3
4 hA2-11E-H4/L2 19.9
5 hA2-11E-H4/L3 18.5
6 hA2-11E-H4/L4 11.1
7 hA2-25C-H3/L1 115.8
8 hA2-25C-H3/L2 53.3
9 hA2-25C-H3/L3 64.4
10 hA2-25C-H4/L1 81.8
11 hA2-25C-H4/L2 56.7
12 hA2-25C-H4/L3 27.9
＜實施例21＞ A2-25C抗體之抗原決定位解析 21)-1人類嵌合cA2-25C Fab片段之製作 將與實施例5)-8同樣地調製的人類嵌合cA2-25C，使用木瓜酵素(Sigma-Aldrich)切斷成Fab片段及Fc片段，將其添加至HiTrap Protein A HP管柱(GE Healthcare)。將以流出液(flow through)劃份回收的Fab片段濃縮。 21)-2人類嵌合cA2-25C Fab片段及ALK2-ECD複合體之結晶化與構造解析 將實施例21)-1所獲得的嵌合A2-25C Fab片段與按照實施例14所調製的ALK2-ECD複合體濃縮成3.8mg/mL，用於結晶化。結晶化係使用蒸氣擴散法。將於蛋白質溶液0.5μL中添加等量沉澱劑溶液(0.15M Li2 SO4 ，0.1M NaCitrate pH3.4，18%(w/v)PEG6,000，20%(v/v)乙二醇)的溶液，以使兩溶液未互相接觸的方式放入於置入有50μL之沉澱劑溶液的密閉容器中，於20℃靜置。3日後，獲得0.1mm×0.05mm×0.02mm之單結晶。將獲得的結晶以液化氮冷凍，以SPring8之BL41XU於95K氮氣流下收集X射線繞射資料。由獲得的繞射像，使用軟體mosflm(CCP4：Collaborative Computation Project No.4)將繞射強度加以數値化，求得結晶構造因子。結晶係正交晶系，空間群為P21 21 21 ，結晶之單位晶格係a=74.49Å，b=128.05Å、c=147.73Å。使用獲得的構造因子及Fab(利用過去進行結晶構造解析的抗體構造)之三次元構造座標而進行分子取代法，並決定位相。計算係使用軟體phaser(CCP4：Collaborative Computation Project No.4)。結晶係於非對稱單位含2個複合體。使用軟體refmac5(CCP4)而進行構造之精密化，使用軟體coot而進行模型之修正。重複進行此操作，以2.1Å分解能力獲得最終之R値22.4%、freeR値25.3%。模型係由2個複合體而成，包含A2-25C Fab之L鏈胺基酸殘基1-212、H鏈胺基酸殘基1-219、ALK2-ECD之胺基酸殘基12-52及66-88、及411個之水分子。自經決定的2個A2-25C Fab，共通之4Å以內的ALK2-ECD之胺基酸殘基係如以下：Glu18、Gly19、Leu20、Ile39、Asp41、Gly42、Phe43、His44、Val45、Tyr46、Thr84。於第49圖顯示複合體全體之色帶模型。
＜實施例22＞ A2-27D對各樣各樣的突變ALK2之抑制活性評價 A2-27對迄今自FOP病例鑑定出的13種類之突變體(L196P、delP197_F198insL、R202I、R206H、Q207E、R258S、R258G、G325A、G328E、G328R、G328W、G356D、及R375P)、及野生型ALK2的抑制活性係與實施例2)-3同樣地，以使用HEK293A細胞的BMP專一性的Id1WT4F-luc螢光素酶報導子來解析。基因導入後，於2.5小時後，將培養基交換為含10ng/mL之BMP7(Milteney公司製)、及3μg/mL之大鼠IgG1(R&D Systems公司製)、或A2-27D的新鮮OPTI-MEM I(LifeTechnologies公司製)，而培養一晩。次日，使用Dual-Glo螢光素酶試驗系統(Promega公司製)來測量螢光素酶活性。 將結果記載於第50圖。確認單株抗體A2-27D於野生型及13種類全部之突變體中抑制藉由BMP7所誘導的螢光素酶活性(第50圖)。 [產業上之可利用性]
本發明之嵌合或人化抗ALK2抗體具有經由ALK2的BMP訊息傳遞之抑制作用，含有該抗ALK2抗體的醫藥組成物可成為異位性骨化及/或骨發育不全、貧血、或瀰漫型內因性橋腦神經膠細胞瘤(DIPG)之治療或預防劑。
[序列表之非關鍵詞文字] 序列識別號1：編碼A2-11E之重鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列 序列識別號2：A2-11E之重鏈之可變區之胺基酸序列 序列識別號3：編碼A2-11E之輕鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列 序列識別號4：A2-11E之輕鏈之可變區之胺基酸序列 序列識別號5：編碼A2-15A之重鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列 序列識別號6：A2-15A之重鏈之可變區之胺基酸序列 序列識別號7：編碼A2-15A之輕鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列 序列識別號8：A2-15A之輕鏈之可變區之胺基酸序列 序列識別號9：編碼A2-25C之重鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列 序列識別號10：A2-25C之重鏈之可變區之胺基酸序列 序列識別號11：編碼A2-25C之輕鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列 序列識別號12：A2-25C之輕鏈之可變區之胺基酸序列 序列識別號13：編碼A2-27D之重鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列 序列識別號14：A2-27D之重鏈之可變區之胺基酸序列 序列識別號15：編碼A2-27D之輕鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列 序列識別號16：A2-27D之輕鏈之可變區之胺基酸序列 序列識別號17：含有編碼人類κ鏈分泌訊息及人類κ鏈恒定區之胺基酸的序列的DNA片段之核苷酸序列 序列識別號18：含有編碼人類重鏈分泌訊息及人類IgG1恒定區之胺基酸的序列的DNA片段之核苷酸序列 序列識別號19：人類嵌合cA2-15A之重鏈之核苷酸序列 序列識別號20：人類嵌合cA2-15A之重鏈之胺基酸序列 序列識別號21：人類嵌合cA2-15A之輕鏈之核苷酸序列 序列識別號22：人類嵌合cA2-15A之輕鏈之胺基酸序列 序列識別號23：人類嵌合cA2-27D之重鏈之核苷酸序列 序列識別號24：人類嵌合cA2-27D之重鏈之胺基酸序列 序列識別號25：人類嵌合cA2-27D之輕鏈之核苷酸序列 序列識別號26：人類嵌合cA2-27D之輕鏈之胺基酸序列 序列識別號27：人化hA2-15A-H1之核苷酸序列 序列識別號28：人化hA2-15A-H1之胺基酸序列 序列識別號29：人化hA2-15A-H4之核苷酸序列 序列識別號30：人化hA2-15A-H4之胺基酸序列 序列識別號31：含有編碼人化hA2-15A-L1的序列的DNA片段之核苷酸序列 序列識別號32：人化hA2-15A-L1之胺基酸序列 序列識別號33：含有編碼人化hA2-15A-L4的序列的DNA片段之核苷酸序列 序列識別號34：人化hA2-15A-L4之胺基酸序列 序列識別號35：含有編碼人化hA2-15A-L6的序列的DNA片段之核苷酸序列 序列識別號36：人化hA2-15A-L6之胺基酸序列 序列識別號37：含有編碼人化hA2-15A-L7的序列的DNA片段之核苷酸序列 序列識別號38：人化hA2-15A-L7之胺基酸序列 序列識別號39：人化hA2-27D-H1之核苷酸序列 序列識別號40：人化hA2-27D-H1之胺基酸序列 序列識別號41：人化hA2-27D-H2之核苷酸序列 序列識別號42：人化hA2-27D-H2之胺基酸序列 序列識別號43：人化hA2-27D-H3之核苷酸序列 序列識別號44：人化hA2-27D-H3之胺基酸序列 序列識別號45：人化hA2-27D-H4之核苷酸序列 序列識別號46：人化hA2-27D-H4之胺基酸序列 序列識別號47：人化hA2-27D-H5之核苷酸序列 序列識別號48：人化hA2-27D-H5之胺基酸序列 序列識別號49：含有編碼人化hA2-27D-L1的序列的DNA片段之核苷酸序列 序列識別號50：人化hA2-27D-L1之胺基酸序列 序列識別號51：含有編碼人化hA2-27D-L2的序列的DNA片段之核苷酸序列 序列識別號52：人化hA2-27D-L2之胺基酸序列 序列識別號53：含有編碼人化hA2-27D-L3的序列的DNA片段之核苷酸序列 序列識別號54：人化hA2-27D-L3之胺基酸序列 序列識別號55：含有編碼人化hA2-27D-L4的序列的DNA片段之核苷酸序列 序列識別號56：人化hA2-27D-L4之胺基酸序列 序列識別號57：含有編碼人化hA2-27D-L5的序列的DNA片段之核苷酸序列 序列識別號58：人化hA2-27D-L5之胺基酸序列 序列識別號59：A2-15A之CDRH1之胺基酸序列 序列識別號60：A2-15A之CDRH2之胺基酸序列 序列識別號61：A2-15A之CDRH3之胺基酸序列 序列識別號62：A2-15A之CDRL1之胺基酸序列 序列識別號63：A2-15A之CDRL2之胺基酸序列 序列識別號64：A2-15A之CDRL3之胺基酸序列 序列識別號65：A2-27D之CDRH1之胺基酸序列 序列識別號66：A2-27D之CDRH2之胺基酸序列 序列識別號67：A2-27D之CDRH3之胺基酸序列 序列識別號68：A2-27D之CDRL1之胺基酸序列 序列識別號69：A2-27D之CDRL2之胺基酸序列 序列識別號70：A2-27D之CDRL3之胺基酸序列 序列識別號71：人化hA2-15A-L6之CDRL2之胺基酸序列 序列識別號72：A2-11E之CDRH1之胺基酸序列 序列識別號73：A2-11E之CDRH2之胺基酸序列 序列識別號74：A2-11E之CDRH3之胺基酸序列 序列識別號75：A2-11E之CDRL1之胺基酸序列 序列識別號76：A2-11E之CDRL2之胺基酸序列 序列識別號77：A2-11E之CDRL3之胺基酸序列 序列識別號78：A2-25C之CDRH1之胺基酸序列 序列識別號79：A2-25C之CDRH2之胺基酸序列 序列識別號80：A2-25C之CDRH3之胺基酸序列 序列識別號81：A2-25C之CDRL1之胺基酸序列 序列識別號82：A2-25C之CDRL2之胺基酸序列 序列識別號83：A2-25C之CDRL3之胺基酸序列 序列識別號84：人類ALK2之胺基酸序列 序列識別號85：人類ALK2之核苷酸序列 序列識別號86：小鼠ALK2之胺基酸序列 序列識別號87：小鼠ALK2之核苷酸序列 序列識別號88～102：引子 序列識別號103：包含編碼人類重鏈訊息序列及人類IgG2恒定區之胺基酸的序列的DNA片段之核苷酸序列 序列識別號104：人化hA2-15A-H4 IgG2型之核苷酸序列 序列識別號105：人化hA2-15A-H4 IgG2型之胺基酸序列 序列識別號106：人化hA2-27D-H2-LALA之核苷酸序列 序列識別號107：人化hA2-27D-H2-LALA之胺基序列 序列識別號108：人化hA2-27D-H3-LALA之核苷酸序列 序列識別號109：人化hA2-27D-H3-LALA之胺基序列 序列識別號110：人化hA2-11E-H3之核苷酸序列 序列識別號111：人化hA2-11E-H3之胺基酸序列 序列識別號112：人化hA2-11E-H4之核苷酸序列 序列識別號113：人化hA2-11E-H4之胺基酸序列 序列識別號114：人化hA2-11E-L2之核苷酸序列 序列識別號115：人化hA2-11E-L2之胺基酸序列 序列識別號116：人化hA2-11E-L3之核苷酸序列 序列識別號117：人化hA2-11E-L3之胺基酸序列 序列識別號118：人化hA2-11E-L4之核苷酸序列 序列識別號119：人化hA2-11E-L4之胺基酸序列 序列識別號120：人化hA2-25C-H3之核苷酸序列 序列識別號121：人化hA2-25C-H3之胺基酸序列 序列識別號122：人化hA2-25C-H4之核苷酸序列 序列識別號123：人化hA2-25C-H4之胺基酸序列 序列識別號124：人化hA2-25C-L1之核苷酸序列 序列識別號125：人化hA2-25C-L1之胺基酸序列 序列識別號126：人化hA2-25C-L2之核苷酸序列 序列識別號127：人化hA2-25C-L2之胺基酸序列 序列識別號128：人化hA2-25C-L3之核苷酸序列 序列識別號129：人化hA2-25C-L3之胺基酸序列 序列識別號130～135：引子 本說明書中引用的全部之刊物、專利及專利申請案係直接藉由引用而併入本說明書中。
無。
[第1圖]係顯示融合瘤A2-11E、A2-15A、A2-25C、及A2-27D產生的單株抗體之對小鼠ALK2-His&Fc(「mALK2-Fc」)的辨識、及對人類Fc的結合的圖。使用培養基作為對照(「Control medium」)。 [第2A圖]係顯示融合瘤A2-11E、A2-15A、A2-25C、及A2-27D產生的單株抗體未辨識螢光蛋白質EGFP表現細胞的圖。 [第2B圖]係顯示融合瘤A2-11E、A2-15A、A2-25C、及A2-27D產生的單株抗體辨識野生型之小鼠ALK2表現細胞(mALK2(WT)-EGFP)的圖。 [第2C圖]係顯示融合瘤A2-11E、A2-15A、A2-25C、及A2-27D產生的單株抗體辨識野生型之人類ALK2表現細胞(hALK2(WT)-EGFP)的圖。 [第2D圖]係顯示融合瘤A2-11E、A2-15A、A2-25C、及A2-27D產生的單株抗體辨識FOP突變(R206H)之人類ALK2表現細胞(hALK2(R206H)-EGFP)的圖。 [第3圖]係顯示融合瘤A2-11E、A2-15A、A2-25C、及A2-27D產生的單株抗體專一性地僅辨識ALK2表現細胞，且未辨識ALK1、ALK3、ALK6表現細胞的圖。 [第4圖]係顯示融合瘤A2-11E、A2-15A、A2-25C、及A2-27D產生的單株抗體辨識野生型之ALK2表現細胞、經FOP鑑定的表示之12種類之ALK2突變體表現細胞的圖。 [第5圖]係顯示融合瘤A2-11E、A2-15A、A2-25C、及A2-27D產生的單株抗體於使ALK2之野生型及R206H突變型過度表現的HEK293A細胞中，為劑量依存性地抑制BMP7所誘導的BMP專一性螢光素酶(luc)活性的圖。 [第6圖]係顯示融合瘤A2-11E、A2-15A、A2-25C、及A2-27D產生的單株抗體無法完全地抑制BMP2所誘導的C2C12細胞向造骨細胞樣細胞(osteoblast-like cell)的分化的圖。 [第7圖]係顯示融合瘤A2-11E、A2-15A、A2-25C、及A2-27D產生的單株抗體為劑量依存性地抑制BMP7及GDF2/BMP9所誘導的C2C12細胞向造骨細胞樣細胞的分化的圖。 [第8圖]係顯示融合瘤A2-15A、及A2-27D產生的單株抗體抑制BMP7及GDF2/BMP9所誘導的小鼠之骨骼肌組織中的異位性骨誘導的圖。 [第9圖]係顯示嵌合化抗體cA2-15A、cA2-27D對於BMP7所誘導的BMP專一性螢光素酶(luc)活性，顯示與各自之大鼠單株抗體A2-15A、A2-27D同等之抑制活性的圖。 [第10圖]係顯示嵌合化抗體cA2-15A、cA2-27D為劑量依存性地抑制藉由BMP所誘導之C2C12細胞向造骨細胞樣細胞的分化的圖。 [第11圖]係顯示A2-15A抗體之各CDR序列之胺基酸序列的圖。 [第12圖]係顯示A2-27D抗體之各CDR序列之胺基酸序列的圖。 [第13圖]係顯示A2-11E抗體之各CDR序列之胺基酸序列的圖。 [第14圖]係顯示A2-25C抗體之各CDR序列之胺基酸序列的圖。 [第15圖]係顯示人化hA2-15A-H1之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。 [第16圖]係顯示人化hA2-15A-H4之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。 [第17圖]係顯示含有編碼人化hA2-15A-L1的序列的DNA片段之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。 [第18圖]係顯示含有編碼人化hA2-15A-L4的序列的DNA片段之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。 [第19圖]係顯示含有編碼人化hA2-15A-L6的序列的DNA片段之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。 [第20圖]係顯示含有編碼人化hA2-15A-L7的序列的DNA片段之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。 [第21圖]係顯示人化hA2-27D-H1之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。 [第22圖]係顯示人化hA2-27D-H2之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。 [第23圖]係顯示人化hA2-27D-H3之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。 [第24圖]係顯示人化hA2-27D-H4之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。 [第25圖]係顯示人化hA2-27D-H5之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。 [第26圖]係顯示含有編碼人化hA2-27D-L1的序列的DNA片段之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。 [第27圖]係顯示含有編碼人化hA2-27D-L2的序列的DNA片段之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。 [第28圖]係顯示含有編碼人化hA2-27D-L3的序列的DNA片段之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。 [第29圖]係顯示含有編碼人化hA2-27D-L4的序列的DNA片段之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。 [第30圖]係顯示含有編碼人化hA2-27D-L5的序列的DNA片段之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。 [第31圖]係顯示人化A2-15A抗體(IgG1)及人化A2-27D抗體(IgG1)為劑量依存性地抑制BMP7所誘導的BMP專一性螢光素酶(luc)活性的圖。 [第32圖]係顯示人化hA2-15A-H4 IgG2型之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。 [第33圖]係顯示人化hA2-27D-H2-LALA之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。 [第34圖]係顯示人化hA2-27D-H3-LALA之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。 [第35圖]係顯示人化A2-15A抗體(IgG2)及人化A2-27D抗體(LALA)為劑量依存性地抑制BMP7所誘導的BMP專一性螢光素酶(luc)活性的圖。 [第36圖]係顯示人化A2-15A抗體(IgG2)及人化A2-27D抗體(LALA)抑制BMP7所誘導的小鼠之骨骼肌組織中的異位性骨誘導的圖。 [第37圖]係顯示人類ALK2-ECD與人類嵌合cA2-27D-Fab之複合體之X射線結晶構造的圖。 [第38圖]係顯示人化hA2-11E-H3之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。 [第39圖]係顯示人化hA2-11E-H4之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。 [第40圖]係顯示人化hA2-11E-L2之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。 [第41圖]係顯示人化hA2-11E-L3之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。 [第42圖]係顯示人化hA2-11E-L4之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。 [第43圖]係顯示人化hA2-25C-H3之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。 [第44圖]係顯示人化hA2-25C-H4之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。 [第45圖]係顯示人化hA2-25C-L1之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。 [第46圖]係顯示人化hA2-25C-L2之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。 [第47圖]係顯示人化hA2-25C-L3之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。 [第48圖]係顯示人化A2-11E抗體(IgG1)及人化A2-25C抗體(IgG1)為劑量依存性地抑制藉由BMP所誘導的C2C12細胞向造骨細胞樣細胞的分化的圖。 [第49圖]係顯示人類ALK2-ECD與人類嵌合cA2-25C-Fab之複合體之X射線結晶構造的圖。 [第50圖]係顯示融合瘤A2-27D產生的單株抗體於野生型(WT)及表示之13種類全部的突變體，抑制藉由BMP7所誘導的螢光素酶(Luc)活性的圖。
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<210> 1
<211> 354
<212> DNA
<213> 褐鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<221> 可變區
<222> (1)..(354)
<400> 1
Figure 109125515-A0305-02-0174-1
<210> 2
<211> 118
<212> PRT
<213> 褐鼠
<220>
<221> 可變區
<222> (1)..(118)
<400> 2
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Claims (32)

  1. 一種單株抗體或該抗體之抗原結合片段，其係選自下述(1)至(4)的單株抗體或該抗體之抗原結合片段：(1)重鏈序列含有具CDRH1、CDRH2及CDRH3的可變區，該CDRH1係由序列識別號72所示的胺基酸序列所組成，該CDRH2係由序列識別號73所示的胺基酸序列所組成，該CDRH3係由序列識別號74所示的胺基酸序列所組成；以及輕鏈序列含有具CDRL1、CDRL2及CDRL3的可變區，該CDRL1係由序列識別號75所示的胺基酸序列所組成，該CDRL2係由序列識別號76所示的胺基酸序列所組成，該CDRL3係由序列識別號77所示的胺基酸序列所組成；(2)重鏈序列含有具CDRH1、CDRH2及CDRH3的可變區，該CDRH1係由序列識別號59所示的胺基酸序列所組成，該CDRH2係由序列識別號60所示的胺基酸序列所組成，該CDRH3係由序列識別號61所示的胺基酸序列所組成；以及輕鏈序列含有具CDRL1、CDRL2及CDRL3的可變區，該CDRL1係由序列識別號62所示的胺基酸序列所組成，該CDRL2係由序列識別號63或序列識別號71所示的胺基酸序列所組成，該CDRL3係由序列識別號64所示的胺基酸序列所組成；(3)重鏈序列含有具CDRH1、CDRH2及CDRH3的可變區，該CDRH1係由序列識別號78所示的胺基酸序列所組成，該CDRH2係由序列識別號79所示的胺基酸序列所組成，該CDRH3係由序列識別號80所示的胺基酸序列所組成；以及輕鏈序列含有具CDRL1、CDRL2及CDRL3的可變區，該 CDRL1係由序列識別號81所示的胺基酸序列所組成，該CDRL2係由序列識別號82所示的胺基酸序列所組成，該CDRL3係由序列識別號83所示的胺基酸序列所組成；(4)重鏈序列含有具CDRH1、CDRH2及CDRH3的可變區，該CDRH1係由序列識別號65所示的胺基酸序列所組成，該CDRH2係由序列識別號66所示的胺基酸序列所組成，該CDRH3係由序列識別號67所示的胺基酸序列所組成；以及輕鏈序列含有具CDRL1、CDRL2及CDRL3的可變區，該CDRL1係由序列識別號68所示的胺基酸序列所組成，該CDRL2係由序列識別號69所示的胺基酸序列所組成，該CDRL3係由序列識別號70所示的胺基酸序列所組成。
  2. 如請求項1之單株抗體或該抗體之抗原結合片段，其係下述單株抗體或該抗體之抗原結合片段：重鏈序列含有具CDRH1、CDRH2及CDRH3的可變區，該CDRH1係由序列識別號65所示的胺基酸序列所組成，該CDRH2係由序列識別號66所示的胺基酸序列所組成，該CDRH3係由序列識別號67所示的胺基酸序列所組成；以及輕鏈序列含有具CDRL1、CDRL2及CDRL3的可變區，該CDRL1係由序列識別號68所示的胺基酸序列所組成，該CDRL2係由序列識別號69所示的胺基酸序列所組成，該CDRL3係由序列識別號70所示的胺基酸序列所組成。
  3. 如請求項1之單株抗體或該抗體之抗原結合片段，其係(1)包含下述重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列之抗體：(a)選自包含以下之胺基酸序列的群組的重鏈可變區序列： a1)包含序列識別號28所示的胺基酸序列之第20至142號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a2)包含序列識別號30所示的胺基酸序列之第20至142號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a3)包含序列識別號105所示的胺基酸序列之第20至142號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a4)與a1)至a3)之胺基酸序列具至少95%之同一性的胺基酸序列；a5)與a1)至a3)之胺基酸序列具至少99%之同一性的胺基酸序列；及(b)選自包含以下之胺基酸序列的群組的輕鏈可變區序列：b1)包含序列識別號32所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b2)包含序列識別號34所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b3)包含序列識別號36所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b4)包含序列識別號38所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b5)與選自b1)至b4)中任一者之胺基酸序列具至少95%之同一性的胺基酸序列；b6)與選自b1)至b4)中任一者之胺基酸序列具至少99%之同一性的胺基酸序列；(2)包含下述重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列之抗體：(a)選自包含以下之胺基酸序列的群組的重鏈可變區序列： a1)包含序列識別號40所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a2)包含序列識別號42所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a3)包含序列識別號44所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a4)包含序列識別號46所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a5)包含序列識別號48所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a6)包含序列識別號107所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a7)包含序列識別號109所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a8)與選自a1)至a7)中任一者之胺基酸序列具至少95%之同一性的胺基酸序列；a9)與選自a1)至a7)中任一者之胺基酸序列具至少99%之同一性的胺基酸序列；及(b)選自包含以下之胺基酸序列的群組的輕鏈可變區序列：b1)包含序列識別號50所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b2)包含序列識別號52所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b3)包含序列識別號54所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列； b4)包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b5)包含序列識別號58所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b6)與選自b1)至b5)中任一者之胺基酸序列具至少95%之同一性的胺基酸序列；b7)與選自b1)至b5)中任一者之胺基酸序列具至少99%之同一性的胺基酸序列；(3)包含下述重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列之抗體：(a)選自包含以下之胺基酸序列的群組的重鏈可變區序列：a1)包含序列識別號111所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a2)包含序列識別號113所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a3)與a1)或a2)之胺基酸序列具至少95%之同一性的胺基酸序列；a4)與a1)或a2)之胺基酸序列具至少99%之同一性的胺基酸序列；及(b)選自包含以下之胺基酸序列的群組的輕鏈可變區序列：b1)包含序列識別號115所示的胺基酸序列之第21至128號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b2)包含序列識別號117所示的胺基酸序列之第21至128號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b3)包含序列識別號119所示的胺基酸序列之第21至128號之胺基酸殘基的胺基酸序列； b4)與選自b1)至b3)中任一者之胺基酸序列具至少95%之同一性的胺基酸序列；b5)與選自b1)至b3)中任一者之胺基酸序列具至少99%之同一性的胺基酸序列；或(4)包含下述重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列之抗體：(a)選自包含以下之胺基酸序列的群組的重鏈可變區序列：a1)包含序列識別號121所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a2)包含序列識別號123所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a3)與a1)或a2)之胺基酸序列具至少95%之同一性的胺基酸序列；a4)與a1)或a2)之胺基酸序列具至少99%之同一性的胺基酸序列；及(b)選自包含以下之胺基酸序列的群組的輕鏈可變區序列：b1)包含序列識別號125所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b2)包含序列識別號127所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b3)包含序列識別號129所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b4)與選自b1)至b3)中任一者之胺基酸序列具至少95%之同一性的胺基酸序列； b5)與選自b1)至b3)中任一者之胺基酸序列具至少99%之同一性的胺基酸序列。
  4. 如請求項3之單株抗體或該抗體之抗原結合片段，其係(1)包含下述重鏈及輕鏈之抗體：含有包含序列識別號30所示的胺基酸序列之第20至142號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號36所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；或含有包含序列識別號105所示的胺基酸序列之第20至142號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號36所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；(2)包含下述重鏈及輕鏈之抗體：含有包含序列識別號42所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號52所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號44所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；含有包含序列識別號107所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號52所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈；或含有包含序列識別號109所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈； (3)包含下述重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列之抗體：(a)選自包含以下之胺基酸序列的群組的重鏈可變區序列：a1)包含序列識別號111所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a2)包含序列識別號113所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基的胺基酸序列；及(b)選自包含以下之胺基酸序列的群組的輕鏈可變區序列：b1)包含序列識別號115所示的胺基酸序列之第21至128號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b2)包含序列識別號117所示的胺基酸序列之第21至128號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b3)包含序列識別號119所示的胺基酸序列之第21至128號之胺基酸殘基的胺基酸序列；或(4)包含下述重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列之抗體：(a)選自包含以下之胺基酸序列的群組的重鏈可變區序列：a1)包含序列識別號121所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a2)包含序列識別號123所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基的胺基酸序列；及(b)選自包含以下之胺基酸序列的群組的輕鏈可變區序列：b1)包含序列識別號125所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b2)包含序列識別號127所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列； b3)包含序列識別號129所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的胺基酸序列。
  5. 如請求項3之單株抗體或該抗體之抗原結合片段，其係包含下述重鏈及輕鏈之抗體：含有包含序列識別號107所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列的重鏈及含有包含序列識別號52所示的胺基酸序列之第21至129號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列的輕鏈。
  6. 如請求項1之單株抗體或該抗體之抗原結合片段，其係(1)包含下述重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列之抗體：(a)選自包含以下之胺基酸序列的群組的重鏈可變區序列：a1)包含序列識別號28所示的胺基酸序列之第20至472號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a2)包含序列識別號30所示的胺基酸序列之第20至472號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a3)包含序列識別號105所示的胺基酸序列之第20至468號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a4)與a1)至a3)之胺基酸序列具至少95%之同一性的胺基酸序列；a5)與a1)至a3)之胺基酸序列具至少99%之同一性的胺基酸序列；及(b)選自包含以下之胺基酸序列的群組的輕鏈可變區序列：b1)包含序列識別號32所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基的胺基酸序列； b2)包含序列識別號34所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b3)包含序列識別號36所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b4)包含序列識別號38所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b5)與選自b1)至b4)中任一者之胺基酸序列具至少95%之同一性的胺基酸序列；b6)與選自b1)至b4)中任一者之胺基酸序列具至少99%之同一性的胺基酸序列；(2)包含下述重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列之抗體：(a)選自包含以下之胺基酸序列的群組的重鏈可變區序列：a1)包含序列識別號40所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a2)包含序列識別號42所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a3)包含序列識別號44所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a4)包含序列識別號46所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a5)包含序列識別號48所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a6)包含序列識別號107所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a7)包含序列識別號109所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列； a8)與選自a1)至a7)中任一者之胺基酸序列具至少95%之同一性的胺基酸序列；a9)與選自a1)至a7)中任一者之胺基酸序列具至少99%之同一性的胺基酸序列；及(b)選自包含以下之胺基酸序列的群組的輕鏈可變區序列：b1)包含序列識別號50所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b2)包含序列識別號52所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b3)包含序列識別號54所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b4)包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b5)包含序列識別號58所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b6)與選自b1)至b5)中任一者之胺基酸序列具至少95%之同一性的胺基酸序列；b7)與選自b1)至b5)中任一者之胺基酸序列具至少99%之同一性的胺基酸序列；(3)包含下述重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列之抗體：(a)選自包含以下之胺基酸序列的群組的重鏈可變區序列：a1)包含序列識別號111所示的胺基酸序列之第20至467號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a2)包含序列識別號113所示的胺基酸序列之第20至467號之胺基酸殘基的胺基酸序列； a3)與a1)或a2)之胺基酸序列具至少95%之同一性的胺基酸序列；a4)與a1)或a2)之胺基酸序列具至少99%之同一性的胺基酸序列；及(b)選自包含以下之胺基酸序列的群組的輕鏈可變區序列：b1)包含序列識別號115所示的胺基酸序列之第21至233號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b2)包含序列識別號117所示的胺基酸序列之第21至233號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b3)包含序列識別號119所示的胺基酸序列之第21至233號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b4)與選自b1)至b3)中任一者之胺基酸序列具至少95%之同一性的胺基酸序列；b5)與選自b1)至b3)中任一者之胺基酸序列具至少99%之同一性的胺基酸序列；或(4)包含下述重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列之抗體：(a)選自包含以下之胺基酸序列的群組的重鏈可變區序列：a1)包含序列識別號121所示的胺基酸序列之第20至467號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a2)包含序列識別號123所示的胺基酸序列之第20至467號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a3)與a1)或a2)之胺基酸序列具至少95%之同一性的胺基酸序列；a4)與a1)或a2)之胺基酸序列具至少99%之同一性的胺基酸序列；及 (b)選自包含以下之胺基酸序列的群組的輕鏈可變區序列：b1)包含序列識別號125所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b2)包含序列識別號127所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b3)包含序列識別號129所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b4)與選自b1)至b3)中任一者之胺基酸序列具至少95%之同一性的胺基酸序列；b5)與選自b1)至b3)中任一者之胺基酸序列具至少99%之同一性的胺基酸序列。
  7. 如請求項6之單株抗體或該抗體之抗原結合片段，其係(1)包含下述重鏈及輕鏈之抗體：含有包含序列識別號30所示的胺基酸序列之第20至472號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號36所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；或含有包含序列識別號105所示的胺基酸序列之第20至468號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號36所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；(2)包含下述重鏈及輕鏈之抗體：含有包含序列識別號42所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號52所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；或含有包含序列識別號44所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸 序列的重鏈及含有包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；含有包含序列識別號107所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號52所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；或含有包含序列識別號109所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈；(3)包含下述重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列之抗體：(a)選自包含以下之胺基酸序列的群組的重鏈可變區序列：a1)包含序列識別號111所示的胺基酸序列之第20至467號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a2)包含序列識別號113所示的胺基酸序列之第20至467號之胺基酸殘基的胺基酸序列；及(b)選自包含以下之胺基酸序列的群組的輕鏈可變區序列：b1)包含序列識別號115所示的胺基酸序列之第21至233號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b2)包含序列識別號117所示的胺基酸序列之第21至233號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b3)包含序列識別號119所示的胺基酸序列之第21至233號之胺基酸殘基的胺基酸序列；或(4)包含下述重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列之抗體：(a)選自包含以下之胺基酸序列的群組的重鏈可變區序列： a1)包含序列識別號121所示的胺基酸序列之第20至467號之胺基酸殘基的胺基酸序列；a2)包含序列識別號123所示的胺基酸序列之第20至467號之胺基酸殘基的胺基酸序列；及(b)選自包含以下之胺基酸序列的群組的輕鏈可變區序列：b1)包含序列識別號125所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b2)包含序列識別號127所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列；b3)包含序列識別號129所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列。
  8. 如請求項6之單株抗體或該抗體之抗原結合片段，其係包含下述重鏈及輕鏈之抗體：含有包含序列識別號107所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基的胺基酸序列的重鏈及含有包含序列識別號52所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的胺基酸序列的輕鏈。
  9. 一種單株抗體或該抗體之抗原結合片段，其特徵為，對於如請求項1之至少任一抗體與包含以下之(a)至(d)中任一者記載之胺基酸序列的多肽的結合為交叉競爭：(a)序列識別號84所示的胺基酸序列；(b)包含序列識別號84所示的胺基酸序列之第21至123號的胺基酸殘基的胺基酸序列；(c)序列識別號86所示的胺基酸序列；(d)包含序列識別號86所示的胺基酸序列之第21至123號的胺基酸殘基的胺基酸序列。
  10. 一種單株抗體或該抗體之抗原結合片段，其特徵為其與如請求項1之至少任一抗體所結合的抗原決定位(epitope)結合。
  11. 如請求項1至10中任一項之單株抗體或該抗體之抗原結合片段，其係嵌合抗體、人化抗體、人類抗體、單鏈抗體(scFv)、雙專一性抗體、多專一性抗體、Fab、F(ab’)2、Fab’或Fv。
  12. 如請求項1至10中任一項之單株抗體或該抗體之抗原結合片段，其中重鏈包含人類免疫球蛋白G1重鏈、人類免疫球蛋白G2重鏈、或人類免疫球蛋白G4重鏈之恒定區，輕鏈包含人類免疫球蛋白κ輕鏈之恒定區。
  13. 如請求項12之單株抗體或該抗體之抗原結合片段，其中重鏈包含人類免疫球蛋白G1重鏈之恒定區。
  14. 如請求項12之單株抗體或該抗體之抗原結合片段，其中人類免疫球蛋白G1重鏈之第234號之白胺酸(Leu)經丙胺酸(Ala)取代，第235號之白胺酸(Leu)經丙胺酸(Ala)取代。
  15. 如請求項12之單株抗體或該抗體之抗原結合片段，其中重鏈包含人類免疫球蛋白G2重鏈之恒定區。
  16. 如請求項1至10中任一項之單株抗體或該抗體之抗原結合片段，其係包含羧基末端之1至數個之胺基酸經缺失的重鏈之抗體。
  17. 如請求項11之單株抗體或該抗體之抗原結合片段，其係包含羧基末端之1至數個之胺基酸經缺失的重鏈之抗 體。
  18. 如請求項12之單株抗體或該抗體之抗原結合片段，其係包含羧基末端之1至數個之胺基酸經缺失的重鏈之抗體。
  19. 如請求項13之單株抗體或該抗體之抗原結合片段，其係包含羧基末端之1至數個之胺基酸經缺失的重鏈之抗體。
  20. 如請求項14之單株抗體或該抗體之抗原結合片段，其係包含羧基末端之1至數個之胺基酸經缺失的重鏈之抗體。
  21. 如請求項15之單株抗體或該抗體之抗原結合片段，其係包含羧基末端之1至數個之胺基酸經缺失的重鏈之抗體。
  22. 一種醫藥組成物，其特徵為含有如請求項1至21中任一項之單株抗體或該抗體之抗原結合片段之至少任一者。
  23. 如請求項22之醫藥組成物，其係異位性骨化之治療及/或預防劑。
  24. 一種異位性骨化之治療及/或預防用醫藥組成物，其特徵為含有如請求項1至21中任一項之單株抗體或該抗體之抗原結合片段之至少任一者、以及選自包含消炎劑、類固醇劑、雙膦酸鹽、肌肉鬆弛劑、視網酸受體(RAR)γ促效劑的群組之至少任一者。
  25. 如請求項23或24之醫藥組成物，其中異位性骨化係進行性肌肉骨化症(fibrodysplasia ossificans progressiva，FOP)、進行性骨化錯生(progressive osseous heteroplasia，POH)、外傷性之異位性骨化、或人工關節取代術(artificial joint replacement)後之異位性骨化。
  26. 如請求項23或24之醫藥組成物，其中異位性骨化係進行性肌肉骨化症(FOP)。
  27. 如請求項22之醫藥組成物，其係貧血之治療及/或預防劑。
  28. 如請求項22之醫藥組成物，其係瀰漫型內因性橋腦神經膠細胞瘤(DIPG)之治療及/或預防劑。
  29. 一種如請求項1至21中任一項之單株抗體或該抗體之抗原結合片段之用途，其係用於製造用以治療及/或預防異位性骨化之醫藥組成物。
  30. 如請求項29之用途，其中該醫藥組成物係與選自包含消炎劑、類固醇劑、雙膦酸鹽、肌肉鬆弛劑、及視網酸受體(RAR)γ促效劑的群組的至少任一者同時或互為前後而投與。
  31. 如請求項29或30之用途，其中異位性骨化係進行性肌肉骨化症(FOP)、進行性骨化錯生(POH)、外傷性之異位性骨化、或人工關節取代術後之異位性骨化。
  32. 如請求項29或30之用途，其中異位性骨化係進行性肌肉骨化症(FOP)。
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