ES2895486T3 - Ensayo de modulador - Google Patents

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ES2895486T3 ES15784069T ES15784069T ES2895486T3 ES 2895486 T3 ES2895486 T3 ES 2895486T3 ES 15784069 T ES15784069 T ES 15784069T ES 15784069 T ES15784069 T ES 15784069T ES 2895486 T3 ES2895486 T3 ES 2895486T3
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James Philip O'connell
John Robert Porter
Alastair Lawson
Boris Kroeplien
Stephen Edward Rapecki
Timothy John Norman
Graham John Warrellow
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Abstract

Un método para identificar un compuesto que es capaz de unirse a una proteína trimérica que es un miembro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF), mediante el cual el complejo compuesto-trímero se une al receptor de la superfamilia de TNF requerido y modula la señalización del receptor, en donde el compuesto es una entidad molecular pequeña con un peso molecular de 1000 Da o menos, y en donde el método comprende: a) realizar un ensayo para determinar el punto medio de la transición térmica (Tm) de la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF en una muestra del miembro de la superfamilia de TNF y el compuesto; comparar el Tm de la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF en la muestra con una muestra de control en ausencia de compuesto; y seleccionar un compuesto que aumente la estabilidad de la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF en comparación con la estabilidad de la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF en ausencia del compuesto; y b) medir el nivel de miembro de la superfamilia de TNF trimérico unido al receptor requerido en una muestra que comprende el compuesto y comparar el nivel del miembro de la superfamilia de TNF trimérico unido al receptor requerido con una muestra control; y c) poner en contacto los receptores de la superfamilia de TNF con un miembro de la superfamilia de TNF y un complejo compuesto-trímero y detectar si el compuesto de ensayo previene o reduce la señalización del trímero del miembro de la superfamilia de TNF a través del receptor de la superfamilia de TNF.

Description

DESCRIPCIÓN
Ensayo de modulador
Campo de la invención
Esta invención se refiere a moduladores de la superfamilia de TNF. En particular, la invención se refiere a nuevos moduladores de moléculas pequeñas de la superfamilia del TNF. La presente invención se refiere específicamente a ensayos para identificar nuevos moduladores de la superfamilia de t Nf .
Antecedentes de la invención
La superfamilia del Factor de Necrosis Tumoral (TNF) es una familia de proteínas que comparten una función primaria de regulación de la supervivencia y la muerte celulares. Los miembros de la superfamilia del TNF comparten un motivo central común, que consiste en dos láminas p antiparalelas con cadenas p antiparalelas, que forman una estructura p de tipo "jelly roll" (brazo de gitano). Otra característica común compartida por los miembros de la superfamilia del TNF es la formación de complejos homo- o heterotriméricos. Son estas formas triméricas de los miembros de la superfamilia de TNF las que se unen a, y activan, los receptores de la superfamilia de TNF específicos.
El TNFa es el miembro arquetípico de la superfamilia del TNF. Se ha implicado a la desregulación de la producción de TNFa en una serie de afecciones patológicas de gran importancia médica. Por ejemplo, se ha implicado al TNFa en artritis reumatoide, enfermedades inflamatorias intestinales (incluyendo la enfermedad de Crohn), psoriasis, enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), dolor, epilepsia, osteoporosis, asma, lupus eritematoso sistémico (LES) y esclerosis múltiple (EM). También se ha implicado a otros miembros de la superfamilia del TNF en afecciones patológicas, incluyendo enfermedades autoinmunitarias.
Los antagonistas convencionales de los miembros de la superfamilia del TNF son macromoleculares y actúan inhibiendo la unión del miembro de la superfamilia del TNF a su receptor. Los ejemplos de antagonistas convencionales incluyen anticuerpos anti-TNFa, particularmente anticuerpos monoclonales, tales como infliximab (Remicade®), adalimumab (Humira®) y certolizumab pegol (Cimzia®) o proteínas de fusión de receptores del TNFa solubles, tales como etanercept (Enbrel®).
He et al (2005) Science, 310, 1022-1025 desvela un inhibidor de molécula pequeña de TNFa que promueve el desensamblaje de subunidades. Silvian et al (2011) ACS Chemical Biology, 6, 636-647 desvela la inhibición de moléculas pequeñas del ligando de la citocina CD40 de la familia del TNF a tarvés de un mecanismo de fractura de subunidades. Hoffmann et al (2012) PLOS One, 7, e31298 desvela el análisis de un aglutinante de TNFa basado en ubiquitina. Alzani et al (1995) Biochemistry, 34, 6344-6350 desvela el mecanismo de desoligomerización de TNFa inducida por suramina. Ma et al (2014) Journal of Biological Chemistry, 289, 12457-12466 desvela que un inhibidor de TNF de molécula pequeña atenúa la inflamación en un modelo de ratón con hepatitis. El documento WO 2013/024040 desvela métodos y composiciones para inhibir la trimerización de ligandos que pertenecen a la superfamilia de TNF. El documento WO 2013/186229 desvela una serie de derivados de bencimidazol que son potentes moduladores de la actividad del TNFa humano.
Sumario de la invención
Los presentes inventores han identificado clases de entidades moleculares pequeñas (SME, por sus siglas en inglés) que modulan el TNFa. Estos compuestos actúan uniéndose a la forma homotrimérica de TNFa e induciendo y estabilizando un cambio conformacional en el homotrímero de TNFa. Por ejemplo, los homotrímeros de TNFa con el compuesto unido pueden unirse a los receptores de TNFa, pero son menos capaces, o incapaces, de iniciar la señalización posterior del receptor de TNFa. Estos compuestos pueden usarse en el tratamiento de afecciones mediadas por TNFa. Los presentes inventores también han desarrollado ensayos que pueden identificar compuestos que son capaces de inhibir TNFa de esta manera.
En consecuencia, la presente invención proporciona un método para identificar un compuesto que es capaz de unirse a una proteína trimérica que es un miembro de la superfamilia de TNF, mediante el cual el complejo compuesto-trímero se une al receptor de la superfamilia de TNF requerido y modula la señalización del receptor, en donde el compuesto es una entidad molecular pequeña con un peso molecular de 1000 Da o menos, y en donde el método comprende:
a) realizar un ensayo para determinar el punto medio de la transición térmica (Tm) de la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF en una muestra del miembro de la superfamilia de TNF y el compuesto; comparar el Tm de la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF en la muestra con una muestra de control en ausencia de compuesto; y seleccionar un compuesto que aumente la estabilidad de la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF en comparación con la estabilidad de la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF en ausencia del compuesto; y
b) medir el nivel de miembro de la superfamilia de TNF trimérico unido al receptor requerido en una muestra que comprende el compuesto y comparar el nivel del miembro de la superfamilia de TNF trimérico unido al receptor requerido con una muestra control; y
c) poner en contacto los receptores de la superfamilia de TNF con un miembro de la superfamilia de TNF y un complejo compuesto-trímero y detectar si el compuesto de ensayo previene o reduce la señalización del trímero del miembro de la superfamilia de TNF a través del receptor de la superfamilia de TNF.
Por lo tanto, los métodos de la invención pueden usarse para identificar un compuesto que es capaz de unirse a una proteína trimérica que es un miembro de la superfamilia de TNF, mediante el cual el complejo compuesto-trímero se une al receptor de la superfamilia de TNF requerido y modula la señalización inducida por el trímero a través del receptor. En otras palabras, el complejo compuesto-trímero de acuerdo con la invención modula la señalización del receptor.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra la estructura de un compuesto de fórmula (1) y un compuesto de fórmula (2).
La Figura 2 muestra la estructura de un compuesto de fórmula (3) y un compuesto de fórmula (4).
La Figura 3A muestra los resultados de un cribado (ensayo de descubrimiento de mesoescala, MSD) de compuestos de prueba que afectan a la unión de TNFa al receptor de TNF. Se investigaron múltiples compuestos de prueba y se calculó el nivel del % de inhibición de la unión de TNFa al receptor de TNF. La Figura 3B muestra una curva de respuesta a la dosis para el compuesto de fórmula (1) usando este ensayo. La Figura 3C muestra la curva de respuesta a la dosis para el compuesto de fórmula (2).
La Figura 4A muestra un ensayo de unión receptor-ligando que demuestra la unión potenciada de TNF al dominio extracelular (ECD) de TNFR1 en presencia del compuesto de fórmula (1). La Figura 4B muestra la unión potenciada inducida por el compuesto de fórmula (2) en el mismo ensayo.
La Figura 5 (trazo inferior) muestra el espectrograma de masas desconvolucionado de TNFa en una solución acuosa al 100 %. La Figura 5 (trazo superior) muestra el espectrograma de masas desconvolucionado de TNFa en una solución que contiene DMSO al 10 % v/v. La Figura 5 (trazo medio) muestra el espectrograma de masas desconvolucionado de TNFa en una solución que contiene DMSO al 10 % v/v y compuesto de fórmula (1).
La Figura 6 muestra el espectrograma de masas de TNFa en una solución que contiene el compuesto de fórmula (1).
La Figura 7 muestra una superposición del perfil de elución de un experimento de cromatografía de exclusión por tamaño y posterior análisis espectrométrico de masas de (A) una muestra de TNFa preincubada con el compuesto de fórmula (1) y después mezclada con TNF-R y (B) una muestra de TNFa preincubada con TNF-R y después mezclada con el compuesto de fórmula (1).
La Figura 8 muestra (A) los resultados del análisis calorimétrico isotérmico de la unión de TNFa a TNF-R y (B) los resultados del análisis calorimétrico isotérmico de la unión de TNFa a TNF-R en donde el TNFa se ha preincubado con el compuesto de fórmula (2).
La Figura 9 muestra la estructura cristalina de un complejo compuesto de fórmula (1)-TNFa trimérico.
La Figura 10 muestra un gráfico de la neutralización del TNFa humano por el compuesto de fórmula (1) y el compuesto de fórmula (2) medido en términos de concentración del compuesto de fórmula (1) () y el compuesto de fórmula (2) (0) frente a la concentración residual de TNFa humano (pg/ml) medida usando un ensayo de destrucción de células de fibrosarcoma murino L929.
La Figura 11 muestra un gráfico de la concentración del compuesto de fórmula (1) (nM) frente al % de producción relativa de IL-8 en monocitos humanos tratados con TNFa.
La Figura 12 muestra un gráfico de la concentración del compuesto de fórmula (2) (nM) frente al % de inhibición de la activación de NF-kB en células HEK293 en presencia de (A) TNFa (0,5 ng/ml), (B) IL-1p (0,5 ng/ml) y (C) un anticuerpo de activación de TNF-R1 (300 ng/ml).
La Figura 13A muestra la cinética de unión del compuesto de fórmula (1) con TNFa a lo largo del tiempo medida usando resonancia de plasmón superficial. La Figura 13B muestra la cinética de unión del compuesto de fórmula (2) con TNFa. La Figura 13C muestra la cinética de unión del compuesto de fórmula (3) con TNFa.
La Figura 14 muestra el nivel de reclutamiento de neutrófilos en respuesta a TNFa solo o TNFa que se ha preincubado con concentraciones crecientes de (A) el compuesto de fórmula (1) o (B) el compuesto de fórmula (2) y administrado por inyección intraperitoneal (i.p.).
La Figura 15 muestra el nivel de reclutamiento de neutrófilos en respuesta a TNFa, solo o en presencia de concentraciones crecientes del compuesto de fórmula (1) administrado por vía oral.
La Figura 16 es un gráfico de los resultados de un ensayo de polarización de fluorescencia (FP) usando compuestos de prueba de fórmula (1), (2) y (3). Las concentraciones del compuesto de prueba se representan frente al % de inhibición de la unión del compuesto de fórmula (4) a TNFa.
La Figura 17 (trazo inferior) muestra el espectrograma de masas de CD40L en una solución acuosa al 100 %. La Figura 17 (trazo medio) muestra el espectrograma de masas de CD40L en una solución que contiene dimetilsulfóxido (DMSO) al 10 % v/v. La Figura 17 (trazo superior) muestra el espectrograma de masas de CD40L en una solución que contiene DMSO al 10 % v/v y el compuesto de fórmula (1).
Descripción del Listado de secuencias
SEQ ID NO: 1 muestra la HCVR de C185_01974.0.
SEQ ID NO: 2 muestra la LCVR de C185 01974.0.
SEQ ID NO: 3 muestra la secuencia de aminoácidos de
Figure imgf000004_0001
cadena pesada mIgGI de C185_01974.0. SEQ ID NO: 4 muestra la secuencia de aminoácidos de
Figure imgf000004_0003
a cadena
Figure imgf000004_0002
ligera kappa de C185_01974.0. SEQ ID NO: 5 muestra la HCVR de C185_01979.0.
SEQ ID NO: 6 muestra la LCVR de C185_01979.0.
SEQ ID NO: 7 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada mIgG1 de C185_01979.0. SEQ ID NO: 8 muestra la secuencia de aminoácidos de
Figure imgf000004_0004
la cadena
Figure imgf000004_0005
ligera kappa de C185_01979.0.
Descripción detallada de la invención
Ensayos para identificar moduladores de miembros de la superfamilia de TNF
Los presentes inventores han desarrollado ensayos para identificar moduladores de miembros de la superfamilia de TNF. Un modulador de miembros de la superfamilia de TNF puede ser un antagonista de uno o más miembros de la superfamilia de TNF. De manera específica, los presentes inventores han desarrollado ensayos que pueden usarse para identificar compuestos que se unen a formas triméricas de miembros de la superfamilia de TNF y que estabilizan estos trímeros en una conformación que es capaz de unirse al receptor de TNF requerido y así modular la señalización a través de dicho receptor. En consecuencia, la invención proporciona ensayos que son útiles para identificar moduladores de miembros de la superfamilia de TNF.
En particular, los ensayos descritos en el presente documento pueden usarse para identificar compuestos que se unen a formas triméricas de miembros de la superfamilia de TNF y que forman un complejo compuesto-trímero que se une al receptor de la familia de TNF requerido.
En una realización preferida, los ensayos de la invención identifican compuestos que se unen a la forma trimérica de miembros de la superfamilia de TNF, pero no a la forma monomérica. En una realización particularmente preferida, los compuestos se unen y estabilizan la forma trimérica de los miembros de la superfamilia de TNF, no se unen a la forma monomérica y no estabilizan la forma dimérica del miembro de la superfamilia de TNF. La estabilización de los trímeros de la superfamilia de TNF por los compuestos de prueba puede producirse por el compuesto de prueba que inhibe el intercambio de unidades monoméricas entre los trímeros.
Los ensayos de la invención comprenden determinar si un compuesto de ensayo potencia la unión del miembro de la superfamilia de TNF a su receptor y, por tanto, identificar los moduladores de la superfamilia de TNF. Los ensayos de la invención pueden comprender determinar si un compuesto de prueba mejora la unión del miembro de la superfamilia de TNF a su receptor y, por tanto, identificar los antagonistas de la superfamilia de TNF que actúan aumentando la unión de formas de señalización reducida, o no señalización, de miembros de la superfamilia de TNF a sus receptores.
Los ensayos para identificar moduladores de la superfamilia de TNF de acuerdo con la invención pueden comprender incubar una muestra del miembro de la superfamilia de TNF de interés en condiciones que desestabilicen la formación de trímeros del miembro de la superfamilia de TNF, por ejemplo, en presencia de DMSO, y midiendo el grado en el que un compuesto de prueba estabiliza la formación de trímeros de miembros de la superfamilia de TNF. Como alternativa, los ensayos para identificar moduladores de la superfamilia de TNF de acuerdo con la invención pueden implicar la unión de trímeros de la superfamilia de TNF a un compuesto de prueba y medir el grado de unión del complejo compuesto-trímero al receptor de TNF requerido.
Los miembros de la superfamilia del TNF y sus receptores pueden purificarse o estar presentes en mezclas, tales como en células cultivadas, muestras de tejido, fluidos corporales o medio de cultivo. Pueden desarrollarse ensayos que son cualitativos o cuantitativos, siendo los últimos útiles para determinar los parámetros de unión (constantes de afinidad y cinética) del compuesto de prueba a formas triméricas de miembros de la superfamilia de TNF, y también de los parámetros de unión del complejo compuesto-trímero al receptor de TNF requerido.
La cantidad de formas monoméricas, diméricas y triméricas de los miembros de la superfamilia de TNF pueden determinarse midiendo la masa de las formas monoméricas, diméricas y triméricas, la cantidad molar de las formas monoméricas, diméricas y triméricas, la concentración de las formas monoméricas, diméricas y triméricas, y la molaridad de las formas monoméricas, diméricas y triméricas. Esta cantidad puede darse en unidades apropiadas.
Por ejemplo, la concentración de las formas monoméricas, diméricas y triméricas puede darse en pg/ml, ng/ml o pg/ml.
La masa de las formas monoméricas, diméricas y triméricas puede darse en pg, ng o pg.
La cantidad de las formas monoméricas, diméricas y triméricas de un miembro de la superfamilia de TNF en una muestra de interés puede compararse con el nivel de las formas monoméricas, diméricas y triméricas de un miembro de la superfamilia de TNF en otra muestra, tal como una muestra control, como se describe en el presente documento.
En un método tal, la cantidad real de las formas monoméricas, diméricas y triméricas de un miembro de la superfamilia de TNF, tales como la masa, cantidad molar, concentración o molaridad de las formas monoméricas, diméricas y triméricas de un miembro de la superfamilia de TNF en las muestras puede evaluarse. La cantidad de las formas monoméricas, diméricas y triméricas de un miembro de la superfamilia de TNF pueden compararse con las de otra muestra sin cuantificar la masa, cantidad molar, concentración o molaridad de las formas monoméricas, diméricas y triméricas de un miembro de la superfamilia de TNF. Por lo tanto, la cantidad de las formas monoméricas, diméricas y triméricas de un miembro de la superfamilia de TNF en una muestra de acuerdo con la invención puede evaluarse como una cantidad relativa, tales como una masa relativa, cantidad molar relativa, concentración relativa o molaridad relativa de las formas monoméricas, diméricas y triméricas de un miembro de la superfamilia de TNF basado en una comparación entre dos o más muestras.
En la presente invención, pueden cribarse bibliotecas de compuestos con el fin de identificar moduladores de miembros de la superfamilia de TNF (es decir, usando los ensayos desvelados en el presente documento). Dichas bibliotecas normalmente comprenden al menos 260 compuestos. Preferentemente, tales bibliotecas comprenden al menos 300, al menos 500 o incluso al menos 1000 compuestos.
Ensayos basados en espectrometría de masas
Los presentes inventores han descubierto que la espectrometría de masas puede usarse para identificar compuestos que se unen a formas triméricas de miembros de la superfamilia de TNF y que estabilizan estos trímeros en una conformación que es capaz de unirse al receptor de TNF requerido.
En particular, puede usarse espectrometría de masas para evaluar si un compuesto estabiliza la forma trimérica de los miembros de la superfamilia de TNF.
En consecuencia, los ensayos de la invención pueden incluir identificar un compuesto que es capaz de unirse a una proteína trimérica que es un miembro de la superfamilia de TNF, mediante el cual el complejo compuesto-trímero se une al receptor de la superfamilia de TNF requerido y modula la señalización del receptor que comprende las etapas de identificar la unión de un compuesto de prueba a la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF en una muestra y comparar la unión del compuesto a la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF con los valores correspondientes de las muestras control, que comprende realizar un análisis espectrométrico de masas en una muestra que contiene el miembro de la superfamilia de TNF y el compuesto para detectar la cantidad del trímero de miembro de la superfamilia de TNF y comparar la cantidad de trímero de miembro de la superfamilia de TNF en la muestra con una muestra control y seleccionar un compuesto que sea capaz de unirse a la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF, mediante el cual el complejo compuesto-trímero se une al receptor de la superfamilia de TNF requerido y modula la señalización del receptor. La muestra control puede ser idéntica a la muestra que se está ensayando, excepto que carece del compuesto de prueba. La muestra que comprende el miembro de la superfamilia de TNF y el compuesto puede comprender además un agente desestabilizador.
En la presente invención, puede añadirse un compuesto de prueba a una solución de un miembro de la superfamilia de TNF en presencia de un agente desestabilizador. Los agentes desestabilizadores, también conocidos como caótropos, incluyen concentraciones molares bajas (por ejemplo, 1 M) de urea, guanidina o acetonitrilo, altas concentraciones (por ejemplo, 6 M o más) de estos reactivos darán como resultado la disociación completa del trímero de TNFa y el despliegue de las subunidades monoméricas de TNFa constituyentes. El agente desestabilizador es preferentemente DMSO, normalmente a una concentración del 5 %, el 10 % o más alta. La solución resultante puede analizarse usando espectrometría de masas.
Pueden detectarse complejos no covalentes formados entre miembros de la superfamilia de TNF y compuestos de prueba con afinidades de unión tan débiles como 1 mM. La estequiometría de unión puede obtenerse directamente a partir de la presencia o ausencia de complejos en los que se unen múltiples moléculas del compuesto de prueba. Las afinidades de unión (valores de Kd) pueden determinarse midiendo la relación de concentración de complejo de miembro de la superfamilia de TNF - compuesto de prueba (complejo compuesto-trímero)/miembro de la superfamilia de TNF a concentraciones de compuesto de prueba conocidas.
El compuesto de prueba estabiliza la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF si aumenta la proporción de trímero en comparación con la cantidad de trímero observada para una muestra que contiene el miembro de la superfamilia de TNF y el agente desestabilizador en ausencia del compuesto de prueba. El compuesto de prueba puede aumentar la cantidad de trímero en el 10 %, el 15 %, el 20 %, el 25 %, el 30 %, el 35 %, el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 100 %, el 150 %, el 200 %, el 300 %, el 400 % o más en comparación con la cantidad de trímero presente en una muestra que contiene el miembro de la superfamilia de TNF y el agente desestabilizador en ausencia del compuesto de prueba.
El compuesto de prueba también puede aumentar la cantidad de trímero en comparación con la observada para una muestra del miembro de la superfamilia de TNF en ausencia tanto del agente desestabilizador como del compuesto de prueba. El compuesto de prueba puede aumentar la cantidad de trímero en el 10 %, el 15 %, el 20 %, el 25 %, el 30 %, el 35 %, el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 100 %, el 150 %, el 200 %, el 300 %, el 400 % o más en comparación con la cantidad de trímero presente en una muestra que contiene el miembro de la superfamilia de TNF en ausencia tanto del agente desestabilizador como del compuesto de prueba.
La estabilización del trímero se evidencia de dos formas en el estudio de espectrometría de masas.
En primer lugar, está la disociación física del complejo trímero de TNFa que puede medirse mediante la relación de monómero y trímero observada en el espectro de masas. La especie dimérica no se observa en los presentes estudios. Esta disociación puede ser un artefacto del proceso de alta energía usado para introducir moléculas en el espectrómetro de masas. No obstante, puede usarse para evaluar la capacidad de los compuestos de prueba para estabilizar el complejo trimérico durante los procesos de nebulización e ionización y reducir de esta manera la cantidad de monómero observada en el espectro de masas, usándose la relación monómero/trímero para determinar el grado de estabilización.
En segundo lugar, en condiciones de ionización suaves, se imparte menos energía al complejo trimérico, lo que da como resultado su transmisión intacta al espectrómetro, lo que refleja más de cerca la verdadera composición de la solución. El proceso de ionización por electropulverización da como resultado una carga múltiple de proteínas porque, en modo de ionización positiva, los grupos funcionales básicos dentro de determinados aminoácidos adquieren una carga positiva. Los espectrómetros de masas miden la relación masa/carga. Por lo tanto, por ejemplo, un trímero de TNFa nominalmente de 52.000 Da aparecerá en una relación m/z de 5.200 si lleva 10 cargas. Es este efecto de carga múltiple el que permite que se usen espectrómetros con un intervalo de masa limitado en el estudio de complejos proteicos multiméricos. El software suministrado con el espectrómetro permite al usuario desconvolucionar los datos para dar la masa de la proteína como aparecería si tuviera una sola carga (es decir, su verdadero peso molecular basado en su composición atómica).
En proteínas plegadas donde muchos aminoácidos están enterrados en el núcleo con solo un porcentaje expuesto en la superficie, normalmente se adquieren de 6 a 8 cargas positivas. No predomina una sola especie cargada, a menudo se observan varias especies (iones) dentro de un intervalo pequeño, estos comprenden lo que se conoce como la envolvente del estado de carga. En el otro extremo, cuando una proteína está totalmente desnaturalizada (es decir, desplegada), entonces se exponen muchos más aminoácidos y el número típico de cargas adquiridas puede ser tan alto como 20, la envolvente del estado de carga también comprende una mayor cantidad de especies cargadas, ya que estadísticamente ahora hay más sitios disponibles para aceptar una carga. Por lo tanto, el número de cargas y el número de especies cargadas que comprenden la envolvente del estado de carga son lecturas sensibles del grado de plegamiento de proteínas. Además, si una proteína plegada puede existir en múltiples conformaciones que difieren en el número relativo de aminoácidos expuestos en la superficie, los desplazamientos en la envolvente del estado de carga reflejarán estas diferencias.
En condiciones de ionización de nanoelectropulverización suave, los estudios de espectrometría de masas de proteína TNFa plegada intacta muestran que se detecta casi el 100 % del trímero de TNFa, se detecta muy poco del monómero TNFa mientras que la especie dimérica está completamente ausente.
En condiciones de ionización más severas, o cuando se añade un agente desestabilizador a la muestra de TNFa, se observan niveles aumentados del TNFa monomérico con una reducción concomitante en los niveles del trímero. Solo se observa una cantidad muy pequeña de dímero.
La espectrometría de masas también puede usarse para determinar si el compuesto de prueba se une a las formas monoméricas, diméricas y triméricas del miembro de la superfamilia de TNF.
La espectrometría de masas también puede usarse para determinar la estequiometría de los compuestos de prueba con miembros de la superfamilia de TNF, es decir, cuántas moléculas del compuesto de prueba se unen al miembro de la superfamilia de TNF.
La espectrometría de masas también puede usarse para determinar si el complejo compuesto - trímero del miembro de la superfamilia de TNF se une al receptor de TNF requerido.
La espectrometría de masas también puede usarse para medir las velocidades a las que un compuesto de prueba se une a un miembro de la superfamilia de TNF (la velocidad "de activación" "on" kon-c) y la velocidad a la que el compuesto de prueba se disocia del miembro de la superfamilia de TNF (la velocidad de "inactivación" "off' o koff-c). Como se usa en el presente documento, el símbolo "Kd-c" denota la afinidad de unión (constante de disociación) de un compuesto de prueba por un miembro de la superfamilia de TNF. Kd-c se define como koff-c/kon-c. Los compuestos de prueba pueden tener velocidades "de activación" lentas, que pueden medirse en minutos mediante análisis espectral de masas del miembro de la superfamilia de TNF y las intensidades máximas del complejo compuesto-trímero. Los valores Kd-c para un compuesto de prueba pueden estimarse repitiendo esta medición en diferentes relaciones de miembro de la superfamilia de TNF: complejo compuesto-trímero. En una realización preferida, la unión de compuestos a los trímeros de la superfamilia de TNF se caracteriza por velocidades "de activación", de forma ideal aproximadamente 107 M'V , con velocidad "de inactivación", por ejemplo, con valores típicamente de 10-3 s-1, 10-4 s-1o velocidad "de inactivación" no medible.
También puede usarse espectrometría de masas para determinar si el compuesto de prueba se une al miembro de la superfamilia de TNF en presencia del receptor requerido. Esto puede implicar la incubación del compuesto de prueba con un miembro de la superfamilia de t Nf que se ha preincubado con su receptor. La muestra que contiene el compuesto de prueba y el miembro y el receptor de la superfamilia de TNF preincubado puede fraccionarse para separar moléculas de acuerdo con su tamaño molecular, por ejemplo mediante filtración analítica en gel. Las fracciones resultantes pueden analizarse usando espectrometría de masas para determinar si el compuesto de prueba se une al miembro de la superfamilia de TNF en presencia del receptor requerido. El compuesto eluirá en la misma fracción que el miembro de la superfamilia de TNF si está unido al miembro de la superfamilia de TNF. El compuesto eluirá en una fracción diferente al miembro de la superfamilia de TNF si no está unido al miembro de la superfamilia de TNF. En este caso, el compuesto normalmente eluirá en una fracción de filtración en gel posterior a la del miembro de la superfamilia de TNF.
Los métodos de espectrometría de masas pueden incluir, por ejemplo, espectrometría de masas con desorción/ionización láser asistida por matriz (EM DILAM), espectrometría de masas con desorción/ionización láser potenciada para superficie (EM DILPS), espectrometría de masas de tiempo de vuelo (EM TDV) y cromatografía líquida espectrometría de masas (CL EM).
Ensayos de unión de receptor-ligando
Los antagonistas de la superfamilia de TNF convencionales actúan inhibiendo la unión del miembro de la superfamilia de TNF a su receptor. Los presentes inventores han usado ensayos de unión de receptor-ligando para determinar si un compuesto de prueba potencia la unión del miembro de la superfamilia de TNF a su receptor. Dichos ensayos de unión de receptor-ligando pueden usarse para identificar, por lo tanto, los antagonistas de la superfamilia de t Nf que actúan aumentando la unión de formas de señalización reducida o no señalización, de miembros de la superfamilia de TNF a sus receptores.
En consecuencia, los ensayos de la invención pueden incluir identificar un compuesto que es capaz de unirse a una proteína trimérica que es un miembro de la superfamilia de TNF, mediante el cual el complejo compuesto-trímero se une al receptor de la superfamilia de TNF requerido y modula la señalización del receptor que comprende la etapa de medir el nivel de miembro de la superfamilia de TNF trimérico unido al receptor requerido en una muestra que comprende un compuesto de prueba y comparar el nivel de miembro de la superfamilia de TNF unido al receptor requerido a los valores correspondientes de las muestras de control, que comprende realizar un ensayo de unión receptor-ligando en el que una muestra del miembro de la superfamilia de TNF y el compuesto, se aplica al receptor de TNF requerido que se ha unido a una superficie y se compara la cantidad de trímero de miembro de la superfamilia de TNF unido al receptor de TNF requerido con una muestra de control y se selecciona un compuesto que es capaz de unirse a la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF, mediante el cual el complejo compuesto-trímero se une al receptor de la superfamilia de TNF requerido y modula la señalización del receptor. La muestra control puede ser idéntica a la muestra que se está ensayando, excepto que carece del compuesto de prueba y/o contiene un compuesto conocido. La muestra que comprende el miembro de la superfamilia de TNF y el compuesto puede comprender además un agente desestabilizador.
Puede añadirse un compuesto de prueba a una solución que comprende un miembro de la superfamilia de TNF y un agente desestabilizador. El nivel de unión del receptor de la superfamilia de TNF en presencia del agente desestabilizador solo (en una muestra control) puede compararse con el nivel de unión del miembro de la superfamilia de TNF a su receptor en presencia del agente desestabilizador y el compuesto de prueba. El compuesto de prueba mejora la unión del miembro de la superfamilia de TNF a su receptor si aumenta la proporción del miembro de la superfamilia de TNF unido a su receptor en comparación con el nivel de unión del miembro de la superfamilia de TNF a su receptor observado para una muestra que contiene el miembro la superfamilia de TNF y el agente desestabilizador en ausencia del compuesto de prueba.
El compuesto de prueba puede aumentar la cantidad del miembro de la superfamilia de TNF unido a su receptor en el 10 %, el 15 %, el 20 %, el 25 %, el 30 %, el 35 %, el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 100 %, el 150 %, el 200 %, el 300 %, el 400 % o más en comparación con la cantidad del miembro de la superfamilia de TNF unido a su receptor en una muestra que contiene el miembro de la superfamilia de TNF en ausencia del compuesto de prueba.
El ensayo de unión receptor-ligando de la invención requiere normalmente un receptor de la superfamilia de TNF unido a un soporte. El receptor de la superfamilia de TNF puede unirse directamente al soporte, o indirectamente, usando una molécula enlazadora, tales como avidina o estreptavidina. El nivel de unión del miembro de la superfamilia de TNF a su receptor puede ensayarse después añadiendo una solución del miembro de la superfamilia de TNF con un agente desestabilizador. Los agentes desestabilizadores, también conocidos como caótropos, incluyen concentraciones molares bajas (por ejemplo, 1 M) de urea, guanidina o acetonitrilo, altas concentraciones (por ejemplo, 6 M o más) de estos reactivos darán como resultado la disociación completa del trímero de TNFa y el despliegue de las subunidades monoméricas de TNFa constituyentes. El agente desestabilizador es preferentemente DMSO, normalmente a una concentración del 5 %, el 10 % o más alta.
La unión del miembro de la superfamilia de TNF a su receptor se determina normalmente usando un anticuerpo que es específico para el miembro de la superfamilia de TNF y que está unido a un marcador. El marcador puede ser cualquier molécula detectable. Por ejemplo, el marcador puede ser un isótopo radiactivo (por ejemplo 125I, 32P, 35S y 3H), colorante fluorescente (por ejemplo, fluoresceína, rodamina), conjugado enzimático y similares. Se usa un sustrato para la enzima para cuantificar la cantidad del miembro de la superfamilia de TNF unido al receptor unido a la superficie. Otros marcadores incluyen marcadores moleculares que pueden activarse para producir luz al exponerse a ciertos estímulos, tales como la electricidad. La elección de un marcador dependerá del sistema de detección usado.
Los ensayos de unión de receptor-ligando pueden llevarse a cabo en varios formatos, incluyendo los ensayos de unión basados en células, ensayos en fase de solución e inmunoensayos. Los soportes sólidos para las reacciones de unión receptor-ligando contienen preferentemente pocillos. En general, los complejos compuesto de prueba-trímero se incuban con el receptor de la superfamilia de TNF requerido durante un período de tiempo especificado seguido de la medición de la cantidad del complejo compuesto-trímero que está unido al receptor. El nivel de complejo compuestotrímero unido puede calcularse midiendo el marcador usando microscopía, fluorimetría, un contador de centelleo o cualquier inmunoensayo disponible.
Como se usa en el presente documento, el símbolo "kon-r" denota la velocidad (la velocidad "de activación") a la que un complejo compuesto-trímero se une a un receptor de la superfamilia de TNF. Como se usa en el presente documento, el símbolo "koff-r" denota la velocidad (la velocidad "de inactivación") a la que un complejo compuestotrímero se disocia de un receptor de la superfamilia de TNF. Como se usa en el presente documento, el símbolo "Kd-r" denota la afinidad de unión (constante de disociación) de un complejo compuesto-trímero por un receptor de la superfamilia. KD-r se define como kf - r /kon-r.
Pueden usarse ensayos de unión receptor-ligando para medir la afinidad de unión de los complejos compuesto-trímero al receptor de la superfamilia de TNF requerido. En particular, pueden usarse ensayos de competición para comparar los valores de kon-r y koff-r de los complejos compuesto-trímero para el receptor de la superfamilia de t Nf requerido y los valores de kon-r y koff-r del miembro de la superfamilia de TNF que se une a su receptor en ausencia del compuesto de prueba, y para determinar los valores de KD-r para la unión de complejos compuesto-trímero al receptor de la superfamilia de TNF requerido.
Ensayos de estabilidad
Los presentes inventores han desarrollado métodos para determinar el efecto de los compuestos de prueba sobre la estabilidad de los miembros de la superfamilia de TNF. En consecuencia, la invención incluye un ensayo para identificar un compuesto que es capaz de unirse a una proteína trimérica que es un miembro de la superfamilia de TNF, mediante el cual el complejo compuesto-trímero se une al receptor de la superfamilia de TNF requerido y modula la señalización del receptor que comprende la etapa de medir la estabilidad de la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF en una muestra que comprende el compuesto y comparar la estabilidad de la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF con los valores correspondientes de muestras control, que comprende realizar un ensayo para determinar la Tm de la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF en una muestra del miembro de la superfamilia de TNF y el compuesto, comparando la Tm de la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF con una muestra control y seleccionando un compuesto que sea capaz de unirse a la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF, mediante el cual el complejo compuesto-trímero se une al receptor de la superfamilia de TNF requerido y modula la señalización del receptor. La muestra control es idéntica a la muestra que se está ensayando, excepto que carece del compuesto de prueba. La muestra que comprende el miembro de la superfamilia de TNF y el compuesto puede comprender además un agente desestabilizador.
Puede añadirse un compuesto de prueba a una solución que comprende un miembro de la superfamilia de TNF y un agente desestabilizador. La estabilidad de la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF en presencia del agente desestabilizador solo (en una muestra control) puede compararse con la estabilidad de la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF en presencia del agente desestabilizador y el compuesto de prueba. El compuesto de prueba mejora la estabilidad de la forma trimérica del miembro de la superfamilia TNF si aumenta el punto medio de transición térmica (Tm) de la forma trimérica del miembro de la superfamilia TNF en comparación con Tm de la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF observada para una muestra que contiene el miembro de la superfamilia de TNF y el agente desestabilizador en ausencia del compuesto de prueba. La Tm de la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF es la temperatura a la que se despliega el 50 % de las biomoléculas. La Tm de la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF en presencia y/o ausencia del compuesto de prueba puede medirse usando cualquier técnica apropiada conocida en la técnica, por ejemplo, usando calorimetría diferencial de barrido (DSC) o ensayos de desnaturalización térmica con sonda de fluorescencia.
El compuesto de prueba puede aumentar la Tm de la forma trimérica del miembro de la superfamilia TNF en al menos 1 °C, al menos 2 °C, al menos 5 °C, al menos 10 °C, al menos 15 °C, al menos 20 °C o más en comparación con la Tm de la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF en una muestra que contiene el miembro de la superfamilia de TNF en ausencia del compuesto de prueba. Preferentemente el compuesto de prueba aumenta la Tm de la forma trimérica del miembro de la superfamilia TNF en al menos 1 °C, más preferentemente en al menos 10 °C e incluso más preferentemente entre 10 °C y 20 °C.
Los agentes desestabilizadores, también conocidos como caótropos, incluyen concentraciones molares bajas (por ejemplo, 1 M) de urea, guanidina o acetonitrilo, altas concentraciones (por ejemplo, 6 M o más) de estos reactivos darán como resultado la disociación completa del trímero de TNFa y el despliegue de las subunidades monoméricas de TNFa constituyentes. El agente desestabilizador es preferentemente DMSO, normalmente a una concentración del 5 %, el 10 % o más alta.
Ensayos de calorimetría isotérmica
Los presentes inventores han desarrollado métodos de calorimetría isotérmica para determinar el efecto de los compuestos de prueba sobre la afinidad de unión de los miembros de la superfamilia de TNF por sus receptores. En consecuencia, la invención puede incluir un ensayo para identificar un compuesto capaz de unirse a una proteína trimérica que es un miembro de la superfamilia de Tn F, mediante el cual el complejo compuesto-trímero se une al receptor de la superfamilia de TNF requerido y modula la señalización del receptor que comprende la etapa de medir el nivel de miembro de la superfamilia de TNF trimérico unido al receptor requerido en una muestra que comprende el compuesto y comparar el nivel de miembro de la superfamilia de TNF unido al receptor requerido a los valores correspondientes de las muestras de control, que comprende realizar un análisis calorimétrico isotérmico para medir la afinidad de unión del miembro de la superfamilia de TNF por el receptor requerido en presencia del compuesto; y comparar la afinidad de unión del miembro de la superfamilia de TNF por el receptor requerido con una muestra control y seleccionar un compuesto capaz de unirse a una proteína trimérica que es un miembro de la superfamilia de TNF, mediante el cual el complejo compuesto-trímero se une al receptor de la superfamilia de TNF requerido y modula la señalización del receptor. La muestra control puede ser idéntica a la muestra que se está ensayando, excepto que carece del compuesto de prueba y/o contiene un compuesto conocido.
Pueden añadirse secuencialmente alícuotas de un miembro de la superfamilia de TNF a un depósito del receptor de TNF requerido. El volumen de las alícuotas puede estar en cualquier intervalo apropiado. Las alícuotas pueden ser de cualquier volumen apropiado, tal como de 0,1 pl a 10 pl. En una realización preferida, las alícuotas pueden tener un volumen de 0,5 pl, 1,0 pl o 3,0 pl. Puede ser posible usar volúmenes más grandes dependiendo del volumen de la jeringa.
Cada adición del miembro de la superfamilia de TNF dará como resultado la liberación o absorción de una pequeña cantidad de calor a medida que los trímeros de la superfamilia de TNF se unen al receptor. Normalmente, cada adición del miembro de la superfamilia de TNF dará como resultado la liberación de una pequeña cantidad de calor a medida que los trímeros de la superfamilia de TNF se unen al receptor. La cantidad de liberación de calor puede medirse usando calorimetría isotérmica, y esta información se usa para obtener la afinidad de unión del miembro de la superfamilia de TNF con su receptor.
Este proceso puede repetirse usando adiciones secuenciales de una solución que comprende un miembro de la superfamilia de TNF y un compuesto de prueba a un depósito del receptor de la superfamilia de TNF. Preferentemente el miembro de la superfamilia de TNF y el compuesto de prueba estarán en forma de un complejo compuesto-trímero. De nuevo, la cantidad de liberación de calor puede medirse usando calorimetría isotérmica, y esta información se usa para obtener la afinidad de unión del miembro de la superfamilia de TNF con su receptor.
Las afinidades de unión del miembro de la superfamilia de TNF y el complejo compuesto-trímero pueden compararse para determinar si el compuesto aumenta la afinidad de unión del miembro de la superfamilia de TNF a su receptor.
El compuesto de prueba puede aumentarla afinidad de unión del miembro de la superfamilia de TNF a su receptor 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o más en comparación con la afinidad de unión del miembro de la superfamilia de TNF a su receptor en ausencia del compuesto de prueba.
La afinidad de unión puede darse en términos de afinidades de unión (Kd-p) y puede darse en cualquier unidad apropiada, tales como pM, nM o pM. Cuanto menor es el valor de Kd-p, mayor es la afinidad de unión del miembro de la superfamilia de TNF a su receptor.
El valor de Kd-p del miembro de la superfamilia de TNF para unirse a su receptor en presencia del compuesto de prueba puede ser al menos 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces más bajo que el valor de Kd-p del miembro de la superfamilia de TNF para unirse a su receptor en ausencia del compuesto de prueba.
El valor de Kd-p del miembro de la superfamilia de TNF para unirse a su receptor en presencia del compuesto de prueba puede ser 1 pM, 100 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM o menos. En una realización preferida el valor de Kd-p del miembro de la superfamilia de TNF para unirse a su receptor en presencia del compuesto de prueba es 1 nM o menos.
Ensayos de competición
Los presentes inventores han desarrollado métodos para identificar compuestos que son capaces de unirse una proteína trimérica que es un miembro de la superfamilia de TNF, mediante el cual el complejo compuesto-trímero se une al receptor de la superfamilia de TNF requerido y modula la señalización del receptor investigando la capacidad de un compuesto de prueba para competir con un compuesto sonda para unirse a un miembro de la superfamilia de TNF trimérico. En consecuencia, la invención puede incluir un ensayo que comprende medir la competencia de un compuesto de prueba con un compuesto sonda para unirse a la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF y comparar el nivel de competición observado de esta manera con los valores correspondientes de las muestras control y seleccionar un compuesto que sea capaz de unirse a una proteína trimérica que es un miembro de la superfamilia de TNF, mediante el cual el complejo compuesto-trímero se une al receptor de la superfamilia de TNF requerido y modula la señalización del receptor.
El compuesto sonda puede comprender un compuesto de acuerdo con la divulgación que está radiomarcado. Los radionúcleos que pueden usarse en las sondas de la presente invención incluyen tritio (3H), 14C, 18F, 22Na, 32P, 33P, 35g 36c | 125i 1311 y 99mTc
En particular, el ensayo de competición puede ser un ensayo de polarización de fluorescencia (FP), donde el grado de polarización de la fluorescencia está relacionado con el tiempo de relajación rotacional de una molécula fluorescente y, por tanto, tamaño molecular. Las moléculas grandes exhiben un mayor grado de polarización que las moléculas pequeñas. Por lo tanto, los ensayos de FP pueden usarse para medir la interacción de un pequeño ligando o sonda fluorescente, con una proteína más grande, tal como un miembro de la superfamilia TNF. El grado de polarización proporciona una medida directa de la relación unido/libre del ligando fluorescente.
La invención puede incluir por lo tanto un método para identificar un compuesto que es capaz de unirse a una proteína trimérica que es un miembro de la superfamilia de TNF, mediante el cual el complejo compuesto-trímero se une al receptor de la superfamilia de TNF requerido y modula la señalización del receptor que comprende las etapas de medir la competición del compuesto con un compuesto sonda para unirse a la forma trimérica de un miembro de la superfamilia de TNF, comparar el nivel de competición observado con los valores correspondientes de una muestra control y seleccionar un compuesto que sea capaz de unirse a una proteína trimérica que sea un miembro de la superfamilia de TNF, mediante el cual el complejo compuesto-trímero se une al receptor de la superfamilia de TNF requerido y modula la señalización del receptor, en donde dicho método comprende realizar un ensayo de polarización de fluorescencia usando el compuesto y un compuesto sonda, comparar el grado de polarización del compuesto sonda en presencia del compuesto con el grado de polarización en una muestra control.
La capacidad de un compuesto de prueba para competir con una sonda o ligando puede cuantificarse usando terminología convencional, tal como la concentración inhibitoria semimáxima (CI50). En este contexto, los valores de CI50 representan la concentración de un compuesto que se requiere para dar como resultado una inhibición del 50 % de la unión de la sonda al miembro de la superfamilia de TNF trimérico. Los compuestos de prueba pueden tener valores de CI50 de 500 nM, 400 nM, 300 nM, 200 nM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 100 pM o menos. Preferentemente, los compuestos de prueba tienen un valor de CI50 de 200 nM o menos. Más preferentemente, los compuestos de prueba tienen un valor de CI50 de 150 nM o menos o un valor de CI50 de 100 nM o menos.
Como se ha mencionado anteriormente, en la presente invención, una biblioteca de compuestos se somete típicamente a uno o más de los ensayos descritos en el presente documento para identificar moduladores de miembros de la superfamilia de TNF. Dichas bibliotecas, que pueden comprender al menos 260 compuestos, al menos 300, al menos 500 o incluso al menos 1000 compuestos, pueden cribarse usando polarización de fluorescencia.
Cuando se analiza una biblioteca de compuestos mediante polarización de fluorescencia, el método puede comprender seleccionar un compuesto como modulador del miembro de la superfamilia de TNF si el compuesto da como resultado un valor de CI50 particular. Por ejemplo, un compuesto puede identificarse como un modulador del miembro de la superfamilia de TNF si el compuesto da como resultado un valor de CI50 de menos de 50 pM. En algunos aspectos, los compuestos se identifican cuando dan como resultado un valor de CI50 de menos de 500 nM, menos de 200 nM o incluso menos de 100 nM.
Un compuesto de una biblioteca también puede identificarse como un modulador de un miembro de la superfamilia de TNF si tiene el valor de CI50 más bajo de todos los compuestos de la biblioteca que se prueban. Igualmente, un compuesto puede identificarse como un modulador de un miembro de la superfamilia de t Nf cuando tiene un valor de CI50 bajo (es decir, un valor de CI50 mejor) en comparación con otros compuestos de la biblioteca. Por ejemplo, el 50 % de los compuestos de la biblioteca que dan como resultado los valores de CI50 más bajos pueden identificarse como moduladores. En algunos aspectos, el 25 % o incluso el 10 % de los compuestos de la biblioteca que dan como resultado los valores de CI50 más bajos pueden identificarse como moduladores.
En una realización, el compuesto sonda comprende un compuesto de la divulgación conjugado con un ligando fluorescente. Adecuadamente, el ligando fluorescente es un tinte fluorescente que tiene una vida útil de fluorescencia de 10 ns o menos. Los ejemplos típicos de tintes fluorescentes adecuados incluyen fluoresceína, rodamina, un tinte Cy (por ejemplo Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 o Cy7), un tinte Alexa Fluor® (por ejemplo, Alexa Fluor® 350, 405, 430, 488, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 635, 647, 660, 680, 700, 750 o 790) o un tinte BODIPY® (por ejemplo, BODIPY FL, BODIPY R6G, BODIPY TMR o BODIPY TR). Un ejemplo específico de un compuesto sonda es el compuesto de fórmula (4) como se representa en la Figura 2.
La muestra control puede ser idéntica a la muestra que se está ensayando, excepto que carece del compuesto de prueba y/o contiene un compuesto conocido.
La muestra que comprende el miembro de la superfamilia de TNF y el compuesto puede comprender además un agente desestabilizador. Los agentes desestabilizadores, también conocidos como caótropos, incluyen concentraciones molares bajas (por ejemplo, 1 M) de urea, guanidina o acetonitrilo, altas concentraciones (por ejemplo, 6 M o más) de estos reactivos darán como resultado la disociación completa del trímero de TNFa y el despliegue de las subunidades monoméricas de TNFa constituyentes. El agente desestabilizador es preferentemente DMSO, normalmente a una concentración del 5 %, el 10 % o más alta.
Aunque la polarización de fluorescencia puede usarse para identificar moduladores de miembros de la superfamilia de TNF, en algunos aspectos de la invención dichos moduladores pueden identificarse mediante cualquier ensayo descrito en el presente documento excluyendo la polarización de fluorescencia (es decir, mediante un método que no sea polarización de fluorescencia). En particular, la unión de un compuesto a un miembro de la superfamilia de TNF trimérico y la competición de un compuesto con un compuesto sonda para unirse a la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF, puede determinarse por cualquier método distinto de por polarización de fluorescencia.
Señalización a través de receptores de la superfamilia de TNF
La invención implica un método para identificar un compuesto que puede modular (es decir, prevenir, reducir) la señalización por receptores de la superfamilia de TNF unidos a miembros de la superfamilia de TNF.
La invención comprende poner en contacto los receptores de la superfamilia de TNF con un miembro de la superfamilia de TNF y un complejo compuesto-trímero y detectar si el compuesto de ensayo previene o reduce la señalización del trímero del miembro de la superfamilia de TNF a través del receptor de la superfamilia de TNF. La cantidad de señalización de los receptores de la superfamilia de TNF tratados con el complejo compuesto-trímero puede compararse con la cantidad de señalización de los receptores de la superfamilia de TNF tratados únicamente con el miembro de la superfamilia de TNF.
Para detectar el nivel de señalización, pueden realizarse ensayos que midan los efectos posteriores a la señalización de receptores de la superfamilia del TNF. Por ejemplo, puede usarse un ensayo de destrucción de células de fibrosarcoma murino L929 para evaluar la estimulación de la muerte celular por t Nf . La inhibición de la producción de IL-8 inducida por TNF por monocitos humanos también puede usarse para evaluar si un compuesto de prueba inhibe la señalización de TNF a través de su receptor.
Anticuerpos para identificar complejos trímero-compuesto
Los presentes inventores desarrollaron anticuerpos que se unen selectivamente a complejos que comprenden compuestos de la divulgación y un miembro de la superfamilia del TNF trimérico. Estos anticuerpos pueden usarse para identificar compuestos adicionales que son capaces de inhibir el TNF
En particular, los presentes inventores han identificado dos anticuerpos, denominados CA185_01974 y CA185_01979, que se generaron contra el TNFa humano en complejo con un compuesto de la divulgación. La región variable de la cadena pesada (HCVR) de CA185_01974 se muestra en SEQ ID NO: 1 y la región variable de la cadena ligera (LCVR) de CAl85_01974 se muestra en SEQ ID NO: 2. La cadena pesada de IgG1 de longitud completa se muestra en SEQ ID NO: 3 (1974 HC mIgGI completa) y la cadena ligera de longitud completa (1974 LC kappa completa) se muestra en SEQ ID NO: 4.
La HCVR de CA185_01979 se muestra en SEQ ID NO: 5 y la LCVR de CA185_01979 se muestra en SEQ ID NO: 6. La cadena pesada de IgG1 de longitud completa de CA185_01979 se muestra en SEQ ID NO: 7 (1979 HC mIgG1 completa) y la cadena ligera de longitud completa en SEQ ID NO: 8 (1979 LC Kappa completa).
Los anticuerpos que comprenden las HCVR/LCVR anteriores o pares de secuencias de longitud completa pueden generarse fácilmente por la persona experta usando técnicas convencionales.
Los métodos de la invención para determinar compuestos que sean capaces de unirse a una proteína trimérica que es un miembro de la superfamilia del TNF y modular la señalización a través del receptor pueden implicar, por tanto, identificar si un anticuerpo con un par HCVR/LCVR de SEQ ID NO: 1/2 o 5/6 se une al complejo trímero-compuesto. Igualmente, los métodos pueden implicar identificar si un anticuerpo con un par de secuencias de SEQ ID NO: 3/4 o 7/8 se une al complejo trímero-compuesto. Pueden usarse ensayos de anticuerpos además de los otros ensayos descritos en el presente documento.
Los anticuerpos de la divulgación pueden someterse a ensayo para determinar su unión a un complejo compuestotrímero mediante, por ejemplo, ELISA convencional o transferencia Western. La selectividad de unión de un anticuerpo también puede determinarse controlando la unión del anticuerpo a células que expresan la proteína diana, por ejemplo, mediante citometría de flujo. Por lo tanto, un método de cribado de la invención puede comprender la etapa de identificar un anticuerpo que sea capaz de unirse a un complejo compuesto-trímero mediante la realización de un ELISA o transferencia Western o mediante citometría de flujo.
Los anticuerpos que se describen en el presente documento reconocen selectivamente (o específicamente) al menos un complejo compuesto-trímero, es decir, epítopos dentro de un complejo compuesto-trímero. Un anticuerpo, u otro compuesto, "se une selectivamente a" o "reconoce selectivamente" una proteína cuando se une con una afinidad preferente o alta a la proteína para la que es selectivo, pero no se une sustancialmente, o se une con baja afinidad, a otras proteínas.
En el presente caso, un complejo compuesto-trímero puede unirse normalmente a un anticuerpo con un par HCVR/LCVR de SEQ ID NO: 1/2 o 5/6 (o con pares de secuencias de SEQ ID NO: 3/4 o 7/8) con una afinidad de menos de 1 nM. En otras palabras, los métodos de la invención pueden implicar determinar que un compuesto es capaz de unirse a una proteína trimérica que es un miembro de la superfamilia del TNF y modular la señalización a través del receptor mediante la identificación de que un anticuerpo con un par HCVR/LCVR de SEQ ID NO: 1/2 o 5/6 (o pares de secuencias de SEQ ID NO: 3/4 o 7/8) se une al complejo trímero-compuesto con una Kü-ab de menos de 1 nM. En algunos casos, la KD-ab puede ser menos de 500 pM o menos de 200 pM. La afinidad puede determinarse mediante resonancia de plasmón superficial. El TNF es normalmente TNFa humano.
Igualmente, un complejo de la divulgación puede ser un complejo de un miembro de la superfamilia del TNF trimérico y un compuesto, en donde el complejo compuesto-trímero se une a un anticuerpo con un par HCVR/LCVR de SEQ ID NO: 1/2 o 5/6 (o pares de secuencias de s Eq ID NO: 3/4 o 7/8). De nuevo, el TNF es normalmente TNF a humano y la afinidad de unión es normalmente menos de 1 nM (o menos de 500 pM/200 pM). La afinidad de unión se determina normalmente por resonancia de plasmón superficial.
Moduladores de miembros de la superfamilia TNF
Usando los ensayos descritos en el presente documento, los presentes inventores han identificado compuestos de prueba que se unen a formas triméricas de los miembros de la superfamilia de TNF. Estos compuestos son pequeñas entidades moleculares (PYME) que tienen un peso molecular de 1000 Da o menos, preferentemente 750 Da o menos, más preferentemente 600 Da o menos. Estos compuestos estabilizan una conformación del miembro de la superfamilia de TNF trimérico que se une al receptor de la superfamilia de TNF requerido y modula la señalización del receptor.
El efecto estabilizador de los compuestos de la divulgación sobre las formas triméricas de los miembros de la superfamilia de TNF puede cuantificarse midiendo el punto medio de transición térmica (Tm) de los trímeros en presencia y ausencia del compuesto. Tm significa la temperatura a la que se despliega el 50 % de las biomoléculas. Los compuestos que estabilizan los trímeros de miembros de la superfamilia de TNF aumentarán la Tm de los trímeros. La Tm puede determinarse usando cualquier técnica apropiada conocida en la técnica, por ejemplo, usando calorimetría diferencial de barrido (DSC) o ensayos de desnaturalización térmica con sonda de fluorescencia.
Los compuestos pueden unirse dentro del espacio central presente dentro del trímero de miembros de la superfamilia del TNF (es decir, el núcleo del trímero).
Estos compuestos pueden convertir al miembro de la superfamilia de TNF en un antagonista del receptor de la superfamilia de TNF. Estos compuestos son por lo tanto capaces de bloquear la señalización del miembro de la superfamilia de TNF sin tener que competir con la interacción de alta afinidad entre el miembro de la superfamilia de TNF y su receptor.
Los compuestos identificados por los métodos de la invención son moduladores alostéricos que se unen a los agonistas naturales de los receptores de la superfamilia de TNF, es decir, a formas triméricas de miembros de la superfamilia de TNF e impulsa a estos trímeros a adoptar una conformación que todavía se une al receptor de la superfamilia de TNF requerido y modula la señalización por el receptor. Por modular, se entenderá que el compuesto puede tener un efecto antagonista y, por lo tanto, disminuir la señalización por un receptor de la superfamilia de TNF.
Los compuestos identificados por los métodos de la invención pueden convertir los agonistas naturales de los miembros de la superfamilia del TNF en antagonistas. Por otro lado, los antagonistas de miembros de la superfamilia de TNF convencionales se unen al miembro de la superfamilia de TNF o al receptor de la superfamilia de TNF y evitan la unión del miembro de la superfamilia de TNF al receptor requerido. Por lo tanto, los compuestos identificados por los métodos de la invención también pueden conocerse como moduladores alostéricos de la actividad del ligando (AMLA).
Los compuestos identificados por los métodos de la invención no están limitados en términos de su fórmula o estructura química, con la condición de que se unan al menos a un miembro de la superfamilia de TNF y estabilicen una conformación del miembro de la superfamilia de TNF trimérico que se une al receptor de la superfamilia de TNF requerido y modula la señalización del receptor de la superfamilia de TNF. Los compuestos identificados mediante los métodos de la invención pueden por lo tanto identificarse usando los ensayos y métodos descritos en el presente documento. Los compuestos identificados por los métodos de la invención pueden comprender un resto de bencimidazol o un isóstero del mismo, por ejemplo los compuestos de fórmulas (1), (2) y (3).
Los compuestos identificados por los métodos de la invención pueden aumentar la afinidad de unión de los miembros de la superfamilia de TNF (en forma de un complejo compuesto-trímero) al receptor requerido en comparación con la afinidad de unión de los miembros de la superfamilia de TNF al receptor requerido en ausencia de los compuestos.
Los compuestos identificados mediante los métodos de la invención se unen a las formas triméricas de los miembros de la superfamilia de TNF. Dichos compuestos pueden unirse específicamente a las formas triméricas de uno o más miembros de la superfamilia de TNF. Un compuesto identificado por los métodos de la invención puede unirse específicamente a solo uno de los miembros de la superfamilia de TNF, pero no a ningún otro miembro de la superfamilia de TNF. Un compuesto identificado mediante los métodos de la invención también puede unirse específicamente a dos, tres, cuatro o hasta todos los miembros de la superfamilia de TNF. Por específico, se entenderá que los compuestos se unen a la molécula o moléculas de interés, en este caso la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF, sin ninguna reactividad cruzada significativa con ninguna otra molécula, que puede incluir otros miembros de la superfamilia de TNF. La reactividad cruzada puede evaluarse por cualquier método adecuado, por ejemplo, resonancia de plasmón superficial. La reactividad cruzada de un compuesto para la forma trimérica de un miembro de la superfamilia de TNF con una molécula distinta de la forma trimérica de ese miembro particular de la superfamilia de TNF puede considerarse significativa si el compuesto se une a la otra molécula al menos el 5 %, el 10 %, el 15 %, el 20 %, el 25 %, el 30 %, el 35 %, el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 % o el 100 % tan fuertemente como se une a la forma trimérica del miembro de la superfamilia del TNF de interés. Un compuesto que es específico para la forma trimérica de un miembro de la superfamilia de TNF puede unirse a otra molécula a menos del 90 %, el 85 %, el 80 %, el 75 %, el 70 %, el 65 %, el 60 %, el 55 %, el 50 %, el 45 %, el 40 %, el 35 %, el 30 %, el 25 % o el 20 % de la fuerza con la que se une a la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF. Preferentemente, el compuesto se une a la otra molécula a menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 % o menos del 5 %, menos del 2 % o menos del 1 % de la fuerza con la que se une a la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF.
El valor de Kd-p del miembro de la superfamilia de TNF para unirse a su receptor en presencia del compuesto de prueba (es decir, en forma de un complejo compuesto-trímero) puede ser al menos 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces más bajo que el valor de Kd-p del miembro de la superfamilia de TNF para unirse a su receptor en ausencia del compuesto de prueba. En una realización preferida, el valor de Kd-p del complejo compuesto-trímero para la unión al miembro de la superfamilia de TNF disminuye al menos 1,5 veces, preferentemente al menos 3 veces, más preferentemente al menos 4 veces el valor de Kd-p del trímero de la superfamilia de TNF que se une al receptor de la superfamilia de TNF en ausencia del compuesto de prueba, es decir, la afinidad de unión del complejo compuesto-trímero por el receptor de la superfamilia de TNF aumenta preferentemente al menos 1,5 veces, preferentemente al menos tres veces, más preferentemente al menos cuatro veces en comparación con la afinidad de unión del trímero de la superfamilia de TNF al receptor de la superfamilia de TNF en ausencia del compuesto de prueba.
La disminución del valor de Kd-p del complejo compuesto-trímero para la unión al receptor de la superfamilia de TNF en comparación con el valor de Kd-p del trímero de la superfamilia de TNF solo que se une al receptor de la superfamilia de TNF puede resultar de un aumento en la velocidad de activación (kon-r) del complejo compuesto-trímero que se une al receptor de la superfamilia de TNF en comparación con el trímero de la superfamilia de TNF solo, y/o una disminución en la velocidad de inactivación (koff-r) en comparación con el trímero de la superfamilia de TNF solo. En una realización preferida, la velocidad de activación (kon-r) del complejo compuesto-trímero que se une al receptor de la superfamilia de TNF aumenta en comparación con el trímero de la superfamilia de TNF solo. En otra realización, la velocidad de inactivación (koff-r) del complejo compuesto-trímero que se une al receptor de la superfamilia de TNF se reduce en comparación con el trímero de la superfamilia de TNF solo. En una realización adicional, la velocidad de activación (kon-r) del complejo compuesto-trímero que se une al receptor de la superfamilia de TNF aumenta y la velocidad de inactivación (koff-r) del complejo compuesto-trímero que se une al receptor de la superfamilia de TNF disminuye, en comparación con el trímero de la superfamilia de TNF solo. El valor de kon-r del complejo compuestotrímero para el receptor de la superfamilia de TNF requerido puede aumentar al menos 1,5 veces o al menos dos veces y preferentemente al menos tres veces en comparación con el valor de kon-r del trímero de la superfamilia de TNF que se une a su receptor en ausencia del compuesto y/o el valor de koff-r del complejo compuesto-trímero para el receptor de la superfamilia de TNF requerido puede reducirse al menos en 1,2 veces, al menos 1,6 veces, al menos dos veces, más preferentemente al menos 2,4 veces en comparación con el valor de koff-r del trímero de la superfamilia de TNF que se une a su receptor en ausencia del compuesto.
En una realización, la velocidad de activación para la unión del compuesto al trímero de la superfamilia de TNF (kon-c) es más rápida que la velocidad de activación para la unión del complejo compuesto-trímero al receptor de la superfamilia de TNF (kon-r). En otra realización, la velocidad de inactivación para la unión del complejo compuestotrímero al receptor de la superfamilia de TNF (koff-r) es más rápida que la velocidad de inactivación para la unión del compuesto al trímero de la superfamilia de TNF (koff-c). En una realización adicional, la velocidad de activación para la unión del compuesto al trímero de la superfamilia de TNF (kon-c) es más rápida que la velocidad de activación para la unión del complejo compuesto-trímero al receptor de la superfamilia de TNF (kon-r) y la velocidad de inactivación para la unión del complejo compuesto-trímero al receptor de la superfamilia de TNF (koff-r) es más rápida que la velocidad de inactivación para la unión del compuesto al trímero de la superfamilia de TNF (koff-c). En una realización preferida, el valor de Kd-c del compuesto para unirse al trímero de la superfamilia de TNF es menor que el valor de Kd-p del complejo compuesto-trímero para la unión al receptor de la superfamilia de TNF, es decir, el compuesto tiene una mayor afinidad por el trímero que el complejo compuesto-trímero por el receptor.
Los valores de kon-r, koff-r y Kd-p tanto para el complejo compuesto-trímero como para el trímero de la superfamilia de TNF para el receptor de la superfamilia de TNF requerido pueden determinarse usando cualquier técnica apropiada, por ejemplo, resonancia de plasmón superficial, espectrometría de masas y calorimetría isotérmica, como se describe en los Ejemplos en el presente documento. El valor de Kd-p del miembro de la superfamilia de TNF para unirse a su receptor en presencia del compuesto de prueba puede ser 1 pM, 100 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM o menos. En una realización preferida el valor de Kd-p del miembro de la superfamilia de TNF para unirse a su receptor en presencia del compuesto de prueba (es decir, en un complejo compuesto-trímero) es 1 nM o menos. En una realización más preferida, el valor de Kd-p de un complejo compuesto-trímero para unirse al receptor de la superfamilia de TNF requerido es menor de 600 pM, más preferentemente menos de 500 pM, menos de 400 pM, menos de 300 pM, menos de 200 pM, menos de 100 pM o menos de 50 pM. En una realización lo más preferida el valor de Kd-p de un complejo compuesto-trímero para unirse al receptor de la superfamilia de TNF requerido es menor de 200 pM.
Los compuestos identificados por los métodos de la invención pueden identificarse mediante un ensayo que comprende determinar la Kd-p de la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF en una muestra del miembro de la superfamilia de TNF y el compuesto; comparando la Kd-p de la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF en la muestra con una muestra control; y seleccionar un compuesto.
Los compuestos identificados mediante los métodos de la invención pueden inhibir completa o parcialmente la señalización a través de un receptor de TNF cuando un miembro de la superfamilia de TNF en forma de un complejo compuesto-trímero se une al receptor. El compuesto puede actuar reduciendo la señalización a través de un receptor de la superfamilia de TNF en al menos el 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 % o el 100 %. Cualquier cambio en el nivel de señalización puede medirse mediante cualquier técnica adecuada, incluyendo la medición de la actividad de un gen indicador mediante fosfatasa alcalina o luciferasa, translocación de NF-kB usando máquinas tales como Cellomics Arrayscan, fosforilación de efectores posteriores, reclutamiento de moléculas de señalización o muerte celular.
Los compuestos identificados mediante los métodos de la invención pueden modular al menos uno de los efectos posteriores a la señalización a través de un receptor de TNF cuando un miembro de la superfamilia de TNF en forma de un complejo compuesto-trímero se une al receptor. Dichos efectos se analizan en el presente documento e incluyen producción de IL-8, IL17A -F, IL2 y VCAM inducida por la superfamilia de TNF, activación de NF-kB inducida por la superfamilia de TNF y reclutamiento de neutrófilos. En la técnica se conocen técnicas convencionales para medir los efectos posteriores de miembros de la superfamilia de TNF. Los compuestos identificados mediante los métodos de la invención pueden modular al menos 1, 2, 3, 4, 5, 10 o hasta todos los efectos posteriores a la señalización a través de un receptor de TNF.
La actividad de los compuestos identificados por los métodos de la invención puede cuantificarse usando terminología convencional, tales como CI50 o los valores de concentración eficaz semimáxima (CE50). Los valores de CI50 representan la concentración de un compuesto que es necesaria para una inhibición del 50 % de una función biológica o bioquímica específica. Los valores de CE50 representan la concentración de un compuesto que es necesaria para conseguir el 50 % de su efecto máximo. Los compuestos identificados mediante los métodos de la invención pueden tener valores de CI50 o CE50 de 500 nM, 400 nM, 300 nM, 200 nM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 100 pM o menos. Los valores de CI50 y CE50 pueden medirse usando cualquier técnica apropiada, por ejemplo, la producción de citocinas puede cuantificarse usando ELISA. Pueden generarse después valores de CI50 y CE50 usando un modelo logístico convencional de 4 parámetros también conocido como modelo sigmoideo de respuesta a la dosis.
Superfamilia de TNF y sus receptores
Hay 22 miembros de la superfamilia de TNF actualmente conocidos: TNFa (TNFSF1A), TNFp (TNFSF1B), CD40L (TNFSF5), BAFF (TNFSF13B/BlyS), APRIL (TNFSF13), OX40L (TNFSF4), RANKL (TNFSF11/TRANCE), TWEAK (TNFSF12), TRAIL (TNFSF10), TL1A(TNFSF15), LIGHT (TNFSF14), Linfotoxina, Linfotoxina p (TNFSF3), 4-1BBL (TNFSF9), CD27L (TNFSF7), CD30L (TNFSF8), EDA (Ectodisplasina), EDA-A1 (Ectodisplasina A1), EDA-A2 (Ectodisplasina A2), FASL (TNFSF6), NGF y GITRL (TNFSF18).
En una realización preferida el miembro de la superfamilia de TNF es TNFa. El TNFa existe tanto en forma soluble (TNFas) como unida a membrana (TNFam). Cuando se hace referencia a TNFa en el presente documento esto abarca tanto la forma TNFas como TNFam. En una realización particularmente preferida, el TNFa está en la forma TNFas .
Los ensayos de la invención pueden usarse para identificar moduladores de al menos uno de cualquiera de los miembros de la superfamilia de TNF, incluyendo los 22 miembros conocidos de la superfamilia de TNF. De manera específica, los ensayos de la invención pueden usarse para identificar compuestos que se unen a cualquier miembro de la superfamilia de TNF, particularmente a formas triméricas de miembros de la superfamilia de TNF y que estabilizan estos trímeros en una conformación que es capaz de unirse al receptor de TNF requerido y que modula la señalización a través de dicho receptor. En una realización preferida, el ensayo de la invención se usa para identificar moduladores de TNFa o CD40L, más preferentemente TNFa, incluso más preferentemente TNFas .
El compuesto identificado por los métodos de la invención puede ser un modulador de al menos uno de cualquiera de los miembros de la superfamilia de TNF, incluyendo los 22 miembros conocidos de la superfamilia de TNF. En una realización preferida, el miembro de la superfamilia de TNF es TNFa o CD40L, más preferentemente TNFa incluso más preferentemente TNFas .
El complejo compuesto-trímero puede incluir la forma trimérica de cualquier miembro de la superfamilia de TNF, incluyendo los 22 miembros conocidos de la superfamilia de TNF. En una realización preferida, el miembro de la superfamilia de TNF es TNFa o CD40L. Más preferentemente el miembro de la superfamilia de TNF es TNFa, incluso más preferentemente TNFas .
Los miembros de la superfamilia de TNF se unen a e inician la señalización a través de los receptores de TNF. Actualmente hay 34 receptores de TNF conocidos: 4-1BB (TNFRSF9/CD137), NGF R (TNFRSF16), BAFF R (TNFRSF13C), Osteoprotegerina (TNFRSF11B), BCMA (TNFRSF17), OX40 (TNFRSF4), CD27 (TNFRSF7), RANK (TNFRSF11A), CD30 (TNFRSF8), RELT (TNFRSF19L), CD40 (TNFRSF5), TACI (TNFRSF13B), DcR3 (TNFRSF6B), TNFRH3 (TNFRSF26), DcTRAIL R1 (TNFRSF23), DcTRAIL R2 (TNFRSF22), TNF-R1 (TNFRSF1A), TNF-R2 (TNFRSF1B), DR3 (TNFRSF25), TRAIL R1 (TNFRSF10A), DR6 (TNFRSF21), TRAIL R2 (TNFRSF10B), EDAR, TRAIL R3 (TNFRSF10C), Fas (TNFRSF6/CD95), TRAIL R4 (TNFRSF10D), GITR (TNFRSF18), TROY (TNFRSF19), HVEM (TNFRSF14), TWEAK R (TNFRSF12A), TRAMP (TNFRSF25), Linfotoxina p R (TNFRSF3) y XEDAR.
En una realización preferida el receptor de TNF es TNF-R1 o TNF-R2. Cuando se hace referencia a TNF-R en el presente documento este abarca tanto TNF-R1 como TNF-R2, incluyendo el dominio extracelular (ECD) de TNF-R1 y TNF-R2. Los ensayos de la invención pueden usarse para identificar compuestos que modulan la señalización de miembros de la superfamilia de TNF a través de cualquier receptor de superfamilia de TNF requerido. En una realización preferida, los ensayos de la invención pueden usarse para identificar compuestos que modulan la señalización de los miembros de la superfamilia de TNF a través de TNF-R1, TNF-R2 o CD40. En una realización más preferida, el miembro de la superfamilia de TNF es TNFa y el receptor de TNF es TNF-R1 o TNF-R2. En una realización incluso más preferida, el miembro de la superfamilia de TNF es TNFa y el receptor de TNF es TNF-R1. En una realización incluso más preferida, el miembro de la superfamilia de TNF es TNFas y el receptor de TNF es TNF-R1. Los ensayos de la invención pueden usarse para identificar compuestos que actúan modulando específicamente la señalización de los miembros de la superfamilia de TNF a través de TNF-R1. En particular, los compuestos pueden actuar modulando la señalización de los miembros de la superfamilia de TNF a través de TNF-R1, pero no tienen efecto sobre la señalización de miembros de la superfamilia de TNF a través de TNF-R2. En una realización incluso más preferida, el miembro de la superfamilia de TNF es TNFas y el receptor de TNF es TNF-R1.
El complejo compuesto-trímero puede modular la señalización de los miembros de la superfamilia de TNF a través de al menos un receptor de TNF, incluyendo los 34 receptores de TNF conocidos. En una realización preferida, el receptor de TNF es TNF-R1, TNF-R2 o CD40L.
En una realización más preferida, el miembro de la superfamilia de TNF es TNFa y el receptor de TNF es TNF-R1 o TNF-R2. En una realización incluso más preferida, el miembro de la superfamilia de TNF es TNFa y el receptor de TNF es TNF-R1. En una realización incluso más preferida, el miembro de la superfamilia de TNF es TNFas y el receptor de TNF es TNF-R1.
Indicaciones terapéuticas
El TNFa es el miembro arquetípico de la superfamilia del TNF. El TNFa es una citocina pleiotrópica que media en la regulación inmunitaria y las respuestas inflamatorias. In vivo, también se sabe que el TNFa está implicado en las respuestas a infecciones bacterianas, parasitarias y víricas. En particular, se sabe que el TNFa tiene un papel en la artritis reumatoide (AR), enfermedades inflamatorias intestinales (incluyendo la enfermedad de Crohn), psoriasis, enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), dolor, epilepsia, osteoporosis, asma, septicemia, fiebre, Lupus eritematoso sistémico (LES) y Esclerosis múltiple (EM) y cáncer. También se sabe que el TNFa tiene un papel en Esclerosis lateral amiotrófica (ELA), ictus isquémico, glomerulonefritis mediada por complejos inmunitarios, nefritis lúpica (NL), glomerulonefritis asociada a anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos (ANCA), enfermedad de cambio mínimo, nefropatía diabética (ND), lesión renal aguda (LRA), uropatía obstructiva, rechazo de aloinjerto de riñón, LRA inducida por cisplatino y uropatía obstructiva.
Se sabe que otros miembros de la superfamilia de TNF están implicados en enfermedades autoinmunitarias y deficiencias inmunitarias. En particular, se sabe que los miembros de la superfamilia de TNF están implicados en AR, LES, cáncer, EM, asma, rinitis, osteoporosis y mieloma múltiple (MM). Se sabe que TL1A juega un papel en el rechazo de trasplantes de órganos.
Puede usarse un compuesto identificado por los métodos de la invención o un complejo para tratar, prevenir o mejorar cualquier afección que pueda tratarse, prevenirse o mejorarse mediante un modulador convencional de miembros de la superfamilia de TNF. El compuesto identificado por los métodos de la invención o el complejo puede usarse solo o en combinación con un modulador de miembro de la superfamilia de TNF convencional. Cualquier afección que sea resultado, parcial o totalmente, de la señalización patógena a través de un receptor de TNF por un miembro de la superfamilia de TNF o de una deficiencia en la señalización a través de un receptor de TNF por un miembro de la superfamilia de TNF, en principio, puede tratarse, prevenirse o mejorarse. La señalización patógena a través de un receptor de TNF por un miembro de la superfamilia del TNF incluye una señalización aumentada a través de un receptor de TNF por encima y por debajo del nivel fisiológico normal de señalización, señalizando a través de un receptor de TNF que se inicia normalmente, pero que no se detiene en respuesta a las señales fisiológicas normales, y señalizando a través de un receptor de TNF que está dentro del intervalo fisiológico normal de magnitud, pero que se inicia por medios no fisiológicos. En un aspecto preferido, la divulgación se refiere al tratamiento, prevención o mejoría de afecciones mediadas o influenciadas por TNFa o CD40L.
Los compuestos identificados por los métodos de la presente invención que interactúan con TNFa son en consecuencia beneficiosos en el tratamiento y/o prevención de diversas dolencias humanas. Estas incluyen trastornos autoinmunitarios e inflamatorios; trastornos neurológicos y neurodegenerativos; dolor y trastornos nociceptivos; y trastornos cardiovasculares.
Los trastornos inflamatorios y autoinmunitarios incluyen trastornos autoinmunitarios sistémicos, trastornos endocrinos autoinmunitarios y trastornos autoinmunitarios específicos de órgano. Los trastornos autoinmunitarios sistémicos incluyen lupus eritematoso sistémico (LES), psoriasis, vasculitis, polimiositis, esclerodermia, esclerosis múltiple, espondilitis anquilosante, artritis reumatoide y síndrome de Sjogren. Los trastornos endocrinos autoinmunitarios incluyen tiroiditis. Los trastornos autoinmunitarios específicos de órgano incluyen enfermedad de Addison, anemia hemolítica o perniciosa, glomerulonefritis (incluyendo síndrome de Goodpasture), enfermedad de Grave, púrpura trombocitopénica idiopática, diabetes mellitus insulinodependiente, diabetes juvenil, uveítis, enfermedad inflamatoria intestinal (incluyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), pénfigo, dermatitis atópica, hepatitis autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria, neumonitis autoinmunitaria, carditis autoinmunitaria, miastenia grave, infertilidad espontánea, osteoporosis, asma y distrofia muscular (incluyendo distrofia muscular de Duchenne).
Los trastornos neurológicos y neurodegenerativos incluyen enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, ictus, esclerosis lateral amiotrófica, lesión de la médula espinal, traumatismo craneal, ataques y epilepsia.
Los trastornos cardiovasculares incluyen trombosis, hipertrofia cardíaca, hipertensión, contractilidad irregular del corazón (por ejemplo, durante insuficiencia cardíaca) y trastornos sexuales (incluyendo disfunción eréctil y disfunción sexual femenina).
En particular, un compuesto identificado por los métodos de la invención o un complejo puede usarse para tratar o prevenir trastornos inflamatorios, trastornos del SNC, trastornos inmunitarios y enfermedades autoinmunitarias, dolor, osteoporosis, fiebre y rechazo de trasplante de órganos. Un compuesto identificado por los métodos de la invención o un complejo puede usarse para tratar o prevenir artritis reumatoide, enfermedades inflamatorias intestinales (incluyendo la enfermedad de Crohn), psoriasis, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, epilepsia, asma, septicemia, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, asma, rinitis, cáncer y osteoporosis. Un compuesto identificado por los métodos de la invención o un complejo puede usarse para tratar o prevenir artritis reumatoide (RA), artritis inflamatoria no específica, enfermedad ósea erosiva, condritis, degeneración y/o destrucción de cartílago, artritis inflamatoria juvenil, enfermedad de Still (inicio juvenil y/o en adulto), artritis idiopática juvenil, artritis idiopática juvenil (tanto la forma oligoarticular como la poliarticular), enfermedad inflamatoria intestinal (incluyendo enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colitis indeterminada, reservoritis), psoriasis, artropatía psoriásica, espondilitis anquilosante, enfermedad de Sjogren, enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Behcet, enfermedad de Parkinson (EP), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), ictus isquémico, dolor, epilepsia, osteoporosis, osteopenia, anemia de enfermedades crónicas, caquexia, diabetes, dislipidemia, síndrome metabólico, asma, enfermedad obstructiva crónica de las vías respiratorias (o pulmonar), septicemia, fiebre, síndrome de dificultad respiratoria, lupus eritematoso sistémico (LES), esclerosis múltiple (EM), glomerulonefritis mediada por complejos inmunitarios, nefritis lúpica (NL), glomerulonefritis asociada a anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos (ANCA), enfermedad de cambio mínimo, nefropatía diabética (ND), lesión renal aguda (LRA), uropatía obstructiva, rechazo de aloinjerto de riñón, LRA inducida por cisplatino y uropatía obstructiva, enfermedades oculares (incluyendo la retinopatía diabética, edema macular diabético, retinopatía de prematuridad, degeneración macular senil, edema macular, retinopatía proliferativa y/o no proliferativa, vascularización corneal incluyendo la neovascularización, oclusión de la vena retiniana, diversas formas de uveítis y queratitis), tiroiditis, trastornos fibrosantes, incluyendo diversas formas de fibrosis hepática, diversas formas de fibrosis pulmonar, esclerosis sistémica, esclerodermia, cáncer y complicaciones asociadas al cáncer (incluyendo complicaciones esqueléticas, caquexia y anemia).
Composiciones farmacéuticas, dosificaciones y regímenes de dosificación
Los compuestos identificados por los métodos de la invención y complejos compuesto-trímero normalmente se formularán en composiciones farmacéuticas, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Como se usa en el presente documento, un "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares, que sean fisiológicamente compatibles. El vehículo puede ser adecuado para la administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraocular, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías de administración parenterales, por ejemplo, mediante inyección o infusión. Como alternativa, el vehículo puede ser adecuado para la administración no parental, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa. El vehículo puede ser adecuado para la administración oral. Dependiendo de la vía de administración, el modulador puede estar recubierto con un material para proteger el compuesto de la acción de los ácidos y otras condiciones naturales que puedan inactivar el compuesto.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que conserva la actividad biológica deseada del compuesto parental y no confiere ningún efecto toxicológico no deseado. Los ejemplos de dichas sales incluyen sales de adición de ácidos y sales de adición de bases.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables preferidos comprenden vehículos o diluyentes acuosos. Los ejemplos de vehículos acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas incluyen agua, agua tamponada y solución salina. Los ejemplos de otros vehículos incluyen etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición.
Las composiciones terapéuticas normalmente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco.
Las composiciones farmacéuticas pueden comprender principios activos adicionales.
También dentro del alcance de la presente divulgación están los kits que comprenden compuestos identificados por los métodos de la invención y los complejos de la divulgación y las instrucciones de uso. El kit puede contener además uno o más reactivos adicionales, tales como un agente terapéutico o profiláctico adicional como se ha analizado anteriormente.
Los compuestos identificados por los métodos de la invención y los complejos compuesto-trímero o formulaciones o composiciones de los mismos pueden administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos.
En aplicaciones terapéuticas, se administran compuestos y complejos compuesto-trímero a un sujeto que ya padece un trastorno o afección como se ha descrito anteriormente, en una cantidad suficiente para curar, aliviar o detener parcialmente la afección o uno o más de sus síntomas. Dicho tratamiento terapéutico puede dar como resultado una disminución de la gravedad de los síntomas de la enfermedad o un aumento de la frecuencia o duración de los períodos sin síntomas. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una "cantidad terapéuticamente eficaz".
En aplicaciones profilácticas, se administran formulaciones a un sujeto en riesgo de padecer un trastorno o afección como se ha descrito anteriormente, en una cantidad suficiente para prevenir o reducir los efectos posteriores de la afección o uno o más de sus síntomas. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una "cantidad profilácticamente eficaz". Las cantidades eficaces para cada fin dependerán de la gravedad de la enfermedad o lesión, así como del peso y el estado general del sujeto.
Un sujeto para la administración puede ser un ser humano o animal no humano. La expresión "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc. Se prefiere la administración a seres humanos.
Un compuesto identificado por los métodos de la invención o un complejo compuesto-trímero de la presente divulgación puede administrarse a través de una o más vías de administración usando uno o más de una diversidad de métodos conocidos en la técnica. Como apreciará el experto en la materia, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Los ejemplos de vías de administración para compuestos o complejos compuesto-trímero incluyen intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraocular, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías de administración parenterales, por ejemplo, mediante inyección o infusión. La expresión "administración parenteral" como se usa en el presente documento significa modos de administración distintos de administración enteral y tópica, habitualmente por inyección. Como alternativa, un compuesto identificado por los métodos de la invención o un complejo compuesto-trímero puede administrarse a través de una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa. En un aspecto preferido el compuesto identificado por los métodos de la invención o un complejo compuesto-trímero es para administración oral.
Un médico experto puede determinar una dosificación adecuada de un compuesto identificado por los métodos de la invención o un complejo compuesto-trímero. Los niveles de dosificaciones reales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse de tal manera que se obtenga una cantidad del principio activo que es eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, una composición y un modo de administración particulares, sin que sea tóxico para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una diversidad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares empleadas, la vía de administración, el momento de la administración, la tasa de excreción del compuesto en particular que se esté empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, afección, estado de salud general y el historial médico previo del paciente que se está tratando y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.
Una dosis adecuada puede estar, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 0,01 pg/kg a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal, normalmente de aproximadamente 0,1 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, del paciente que se va a tratar. Por ejemplo, una dosificación adecuada puede ser de aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por día o de aproximadamente 10 pg/kg a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal por día.
Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse una única dosis, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. La forma de dosificación unitaria, como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente individuales adecuadas como dosis unitarias para los sujetos que han de tratarse; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico necesario.
La administración puede ser en dosis únicas o múltiples. Pueden administrarse dosis múltiples a través de las mismas o diferentes vías y en el mismo o diferentes lugares. Como alternativa, las dosis pueden ser a través de una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia pueden variar dependiendo de la semivida del antagonista en el paciente y la duración del tratamiento deseado.
Como se ha mencionado anteriormente, los compuestos identificados por los métodos de la invención o los complejos compuesto-trímero pueden coadministrarse con uno u otros más agentes terapéuticos distintos. Por ejemplo, el otro agente puede ser un agente analgésico, anestésico, inmunosupresor o antiinflamatorio.
La administración combinada de dos o más agentes puede conseguirse de varias maneras diferentes. Ambos pueden administrarse juntos en una sola composición, o pueden administrarse en composiciones separadas como parte de una terapia combinada. Por ejemplo, el uno puede administrarse antes, después o simultáneamente con el otro.
Los siguientes Ejemplos ilustran la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Síntesis de los compuestos de fórmula (1), (2) y (3)
Intermedio 1: 1-(2,5-D¡metilbenc¡l) -1H-bencimidazol
Se añadieron carbonato de cesio (22,0 g, 100,0 mmol) y yoduro de n-butilamonio (12,5 g, 34,0 mmol) a una solución de bencimidazol (4,0 g, 34,0 mmol) en DMF (60 ml) a 0 °C. La mezcla de reacción se agitó durante 10 minutos a 0 °C y después se añadió bromuro de 2,5-dimetilbencilo (6,7 g, 34,0 mmol). La mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante 3 h. La mezcla se inactivó con agua helada (50 ml) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 40 ml). Las capas orgánicas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro y el disolvente se retiró al vacío para proporcionar el compuesto del título (8,0 g, 75 %) como un sólido blanquecino. 8h (d6-DMSO) 8,23 (s, 1H), 7,68­ 7,66 (m, 1H), 7,43-7,41 (m, 1H), 7,21-7,19 (m, 2H), 7,10 (d, J 7,6 Hz, 1H), 7,01 (d, J 7,6 Hz, 1H), 6,67 (s, 1H), 5,45 (s, 2H), 2,25 (s, 3H), 2,14 (s, 3H). CLEM (EN+) 237 (M+H)+.
Intermedio 2: 5-Bromo-2-n¡troan¡l¡na
Se añadió 2-fluoro-4-bromo-1-nitrobenceno (0,5 g, 2,2 mmol) a amoniaco metanólico (10 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 18 h. La mezcla de reacción después se concentró al vacío y el residuo se trituró con isohexano, produciendo el compuesto del título (0,48 g, 97 %) como un sólido amarillo. Sh (d6-DMSO) 7,88 (d, J 8,8 Hz, 1H), 7,53 (s a, 2H), 7,25 (d, J 3,0 Hz, 1H), 6,75 (dd, J 9,2, 2,0 Hz, 1H).
Intermedio 3: 5-Bromo-N-(2,5-dimetilbencil)-2-nitroanilina
Se añadió hidruro de sodio (dispersión al 60 % en aceite, 0,82 g, 20,7 mmol) a una solución agitada de Intermedio 2 (5,0 g, 23,0 mmol) en DMF (50 ml) a 0 °C. Se añadió bromuro de 2,5-dimetilbencilo (4,56 g, 23,0 mmol) y la mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 5 h. La mezcla de reacción se inactivó con una solución acuosa saturada de cloruro de amonio, se extrajo con acetato de etilo (3 x 50 ml), se lavó con agua (2 x 30 ml), se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró al vacío. El residuo se purificó por cromatografía en columna (SiO2, 5 % de EtOAc/isohexano), produciendo el compuesto del título (4,89 g, 63 %) como un sólido amarillo.
5h (d6-DMSO) 8,42 (s a, 1H), 8,01 (d, J 8,8 Hz, 1H), 7,12-6,86 (m, 4H), 6,85 (d, J 7,2, 1,6 Hz, 1H), 4,54 (d, J 5,6 Hz, 2H), 2,28 (s, 3H), 2,21 (s, 3H).
Intermedio 4: 5-Bromo-^-(2,5-dimetilbencil)benceno-1,2-diamina
SnCl2 (20,2 g, 89,4 mmol) a una solución agitada de Intermedio 3 (10,0 g, 29,8 mmol) en EtOH (200 ml) y la mezcla de reacción se calentó a 80 °C durante 5 h. La mezcla de reacción se concentró después al vacío y el residuo se neutralizó con una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio y se extrajo con DCM (3 x 100 ml). Los orgánicos combinados se lavaron con agua (2 x 50 ml), se extrajeron, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro y se concentraron al vacío. El residuo se purificó por cromatografía en columna (S¡O2, 5 % de MeOH/DCM), produciendo el compuesto del título (5,4 g, 69 %) como un aceite marrón oscuro. 8h (d6-DMSO) 7,08 (s, 1H), 7,06 (d, J 7,6 Hz, 2H), 6,97 (d, J 7,6 Hz, 1H), 6,53 (dd, J 8,4, 2,0 Hz, 1H), 6,47 (d, J 8,0 Hz, 1H), 6,45 (d, J 2,0 Hz, 1H), 5,06 (t, J 5,4 Hz, 1H), 4,77 (s a, 2H), 4,15 (d, J 5,2 Hz, 1H), 2,27 (s, 3H), 2,22 (s, 3H). CLEM (EN+) 305 (M+H)+.
Intermedio 5: 6-Bromo-1-(2,5-dimetilbencil)-1H-bencimidazol
Una mezcla de Intermedio 4 (0,40 g, 1,31 mmol) y ácido fórmico (10 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 18 h. La mezcla de reacción se concentró al vacío y el residuo se repartió entre acetato de etilo y una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró al vacío. El residuo bruto se purificó por cromatografía en columna (SO 2, 20-75 % de EtOAc/isohexano), produciendo el compuesto del título (0,20 g, 48 %) como un sólido blanco. Sh (d6-DMSO) 8,24 (s, 1H), 7,74 (d, J 1,7 Hz, 1H), 7,64 (d, J 8,6 Hz, 1H), 7,34 (dd, J 8,6, 1,9 Hz, 1H), 7,12 (d, J 7,7 Hz, 1H), 7,02 (d, J7,8 Hz, 1H), 6,61 (s, 1H), 5,47 (s, 2H), 2,24 (s, 3H), 2,15 (s, 3H). CLEM (ES+) 316 (M+H)+.
Intermedio 6: [6-Bromo-1-(2,5-dimetilbencil)-1H-bencimidazol-2-il](piridin-4-il)metanol
A diisopropilamina (2,8 ml) en THF (10 ml), enfriada a 0 °C, se añadió n-BuLi (12,5 ml, 1,6 M en hexanos) y la mezcla resultante se agitó a 0 °C durante 10 minutos. Se añadió una alícuota de este LDA recién preparado (1,8 ml, 1,62 mmol) a una solución de Intermedio 5 (0,25 g, 0,81 mmol) en THF (5 ml) a -78 °C. La mezcla de reacción se agitó durante 2 h a -78 °C, después se añadió piridin-4-carboxaldehído (0,15 ml, 1,62 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a -78 °C durante 10 minutos. La mezcla se inactivó con una solución acuosa saturada de cloruro de sodio y se dejó calentar a temperatura ambiente. La mezcla se extrajo con acetato de etilo (3 x 40 ml). Las capas orgánicas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro y se concentraron al vacío. El residuo se purificó por cromatografía en columna (SiO2, 0-10 % de MeOH/DCM), proporcionando el compuesto del título (0,18 g, 51 %) como un sólido blanco. CLEM (EN+) 423 (M+H)+.
Intermedio 7: 5-(3-fluoro-4-nitrofen¡l)-2-metox¡p¡r¡d¡na
Ácido 6-metoxipiridin-3-ilborónico (40,0 g, 262 mmol), 4-bromo-2-fluoro-1-nitrobenceno (52,3 g, 238 mmol) y Na2CO3 (76 g, 713 mmol) se mezclaron en 1,2-dimetoxietano (1200 ml) y agua (300 ml). La mezcla de reacción se purgó con argón. Se añadió Pd(PPh3)2Cl2 (8,34 g, 11,89 mmol) y la mezcla se calentó a 90 °C durante 1,5 h. Se añadieron EtOAc y agua. La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo dos veces con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 , después de lo cual el disolvente se retiró al vacío. El residuo se recristalizó a partir de tolueno, proporcionando el compuesto del título (42,00 g, 169,2 mmol, 71 %). EM [ESI+] mlz: 249 [M+H]+.
Intermedio 8: N-[2-(Difluorometoxi)bencil]-5-(6-metoxipiridin-3-il)-2-nitroanilina
Se disolvió 2-(difluorometoxi)bencilamina (2,093 g, 12,09 mmol) en NMP (20 ml). Se añadieron intermedio 7 (2 g, 8,06 mmol) y K2CO3 (1,336 g, 9,67 mmol). Esta mezcla se calentó en irradiación de microondas a 150 °C durante 30 minutos. Se añadieron EtOAc y agua. La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo dos veces con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavaron tres veces con agua y dos veces con salmuera. Después de secar sobre Na2SO4 , el disolvente se retiró al vacío. El residuo se recristalizó a partir de heptano/EtOAc (100/25 ml), para proporcionar el compuesto del título (2,513 g, 6,26 mmol, 78 %). EM [ESI+] m/z: 402 [M+H]+.
Intermedio 9: NV2-(Difluorometoxi)bencil]-5-(6-metoxipiridin-3-il)benceno-1,2-diamina
Se añadió paladio sobre carbono (1,10 g, 10 % en peso) a una solución de Intermedio 8 (2,512 g, 6,26 mmol) en EtOAc (150 ml), lavado con argón. La atmósfera fue reemplazada por una atmósfera H2 y la mezcla de reacción se agitó a 100 kPa (1 bar) de H2 durante 1 h. La mezcla se filtró a través de una capa de tierra de diatomeas. El filtrado se concentró al vacío. La purificación usando cromatografía en columna ultrarrápida con EtOAc al 7-60 % en heptano proporcionó el compuesto del título (2,07 g, 5,57 mmol, 89 %). EM [ESI+] mlz: 372 [M+H]+.
Intermedio 10: 5-(4-Am¡no-3-r2-íd¡fluorometox¡)benc¡lam¡nolfen¡l)p¡rid¡n-2í1H)-ona
Se añad¡ó clorh¡drato de p¡r¡d¡na (10,64 g, 92 mmol) al Intermedio 9 (6,84 g, 18,42 mmol). La mezcla de reacc¡ón se calentó a 165 °C en un rec¡p¡ente ab¡erto durante 3 m¡nutos. Se añad¡ó etanol y la mezcla se somet¡ó a ultrason¡dos. El prec¡p¡tado se separó por f¡ltrac¡ón y después se tr¡turó en aceton¡tr¡lo h¡rv¡endo. La f¡ltrac¡ón del prec¡p¡tado proporc¡onó el compuesto del título (3,822 g, 9,95 mmol, 54 %). EM [ESI+] m/z: 358 [M+H]+.
Compuesto (1):f1-(2.5-d¡met¡lbenc¡l)-1H-benc¡m¡dazol-2-¡ll(p¡r¡d¡n-4-¡l)metanol
A una soluc¡ón de Intermedio 1 (0,25 g, 1,06 mmol) en THF (10 ml) a -78 °C se añad¡ó n-but¡l-l¡t¡o (0,79 ml, 1,27 mmol) 1,6 M gota a gota lentamente y la mezcla de reacc¡ón se ag¡tó durante 20 m¡nutos. Se añad¡ó gota a gota lentamente ¡son¡cot¡naldehído (0,17 g, 1,59 mmol) en THF (1 ml). Después de 10 m¡nutos ad¡c¡onales, la mezcla de reacc¡ón se ¡nact¡vó con agua (1 ml) y se dejó calentar a temperatura amb¡ente. La mezcla de reacc¡ón se vert¡ó en acetato de et¡lo/agua. La capa orgán¡ca se separó, se secó (MgSO4) y se concentró al vacío. El res¡duo se pur¡f¡có por cromatografía en columna (S¡O2, 0-30 % de MeOH/DCM), produc¡endo el compuesto del título (0,2 g, 55 %) como un sól¡do blanquec¡no. Sh (CDCl3) 8,31 (d, J 5,9 Hz, 2H), 7,69 (d, J 8,0 Hz, 1H), 7,28-7,16 (m, 4H), 7,00-6,95 (m, 2H), 6,87-6,85 (m, 1H), 6,16 (s, 2H), 5,84 (s, 1H), 5,35-5,09 (dd, Ja b 17,0 Hz, 2H), 2,25 (s, 3H), 1,89 (s, 3H). CLEM (ES+) 344 (M+H)+.
Compuesto (2): [1-(2,5-D¡met¡lbenc¡l)-6-(1-met¡l-1H-p¡razol-4-¡l)-1H-benc¡m¡dazol-2-¡n(p¡r¡d¡n-4-¡l)metanol
1-Met¡l-4-(4,4,5,5-tetramet¡l-[1,3,2] d¡oxaborolan-2-¡l)-1H-p¡razol (0,15 g, 0,71 mmol) y una soluc¡ón 2 M de carbonato de sod¡o (2 ml) se añad¡eron a una soluc¡ón de Intermedio 6 (0,15 g, 0,36 mmol), en 1,4-d¡oxano:agua (4:1, 5 ml) y la reacc¡ón se desgas¡f¡có durante 10 m¡nutos. Se añad¡ó PdCb(dppf) (0,01 g, 0,05 mmol) y la mezcla de reacc¡ón se desgas¡f¡có durante 10 m¡nutos, después se calentó a 100 °C durante 60 m¡nutos en un reactor de m¡croondas B¡otage. Se añad¡ó acetato de et¡lo y la mezcla de reacc¡ón se f¡ltró a través de una almohad¡lla de Cel¡te. La capa orgán¡ca se separó, se secó sobre sulfato de sod¡o anh¡dro y se concentró al vacío. El res¡duo se pur¡f¡có por HPLC preparat¡va, produc¡endo el compuesto del título como un sól¡do blanco. Sh (d6-DMSO) 8,39 (d, J 4,5, 1,6 Hz, 2H), 8,03 (s, 1H), 7,76 (s, 1H), 7,64 (d, J 8,8 Hz, 1H), 7,44-7,41 (m, 2H), 7,28 (d, J 5,6 Hz, 2H), 7,06 (d, J 7,7 Hz, 1H), 6,87 (d, J 6,8 Hz, 1H), 6,70 (d, J 5,5 Hz, 1H), 6,01 (d, J 5,5 Hz, 1H), 5,83 (s, 1H), 5,63-5,43 (m, 2H), 3,82 (s, 3H), 2,33 (s, 3H), 1,92 (s, 3H). CLEM (EN+) 424 (M+H)+.
Compuesto (3): 5-(1-[2-(D¡fluorometox¡)benc¡ll-2-{[3-(2-oxo-p¡rrol¡d¡n-1-¡l)fenox¡lmet¡l}-1H-benc¡m¡dazol-6-¡l)-p¡r¡d¡n-2(1H)-ona
Se añad¡ó ác¡do 2-[3-(2-oxop¡rrol¡d¡n-1-¡l)fenox¡]acét¡co (2 equ¡valentes) a una soluc¡ón de HATU (2 equ¡valentes) en DMF (2 ml). La mezcla se ag¡tó durante 30 m¡nutos. Se añad¡ó una soluc¡ón de Intermedio 9 (1 equ¡valente) en DMF (2 ml) y la mezcla se ag¡tó a temperatura amb¡ente durante 24 h. La temperatura se elevó después a 50 °C y se cont¡nuó la ag¡tac¡ón durante 24 h. El d¡solvente se evaporó y el res¡duo se d¡solv¡ó en ác¡do acét¡co (4 ml) y se calentó a 80 °C durante 5 h. El ác¡do acét¡co se ret¡ró por evaporac¡ón. El res¡duo se repart¡ó entre agua/cloroformo (1:1,6 ml) a 50 °C. Las capas se separaron usando un separador de fases. La capa acuosa se lavó con cloroformo (4 ml) y la capa orgán¡ca se evaporó a sequedad. El res¡duo se recog¡ó en DMSO (1 ml) y se pur¡f¡có por CLEM preparativa para produc¡r el compuesto del título.
Ejemplo 2 - Síntesis del conjugado de fórmula (4)
Intermed¡o 10: 1-(2.5-D¡met¡lbenc¡l)-6-[4-(p¡peraz¡n-1-¡lmet¡l)-fen¡ll-2-(p¡r¡d¡n-4-¡lmet¡l)-1 H-benc¡m¡dazol
Se s¡ntet¡zó por una secuenc¡a de etapas correspondentes a la preparac¡ón de los Intermedios 7, 8 y 9, segu¡do de la preparac¡ón del Compuesto (3), ut¡l¡zando el ác¡do borón¡co aprop¡ado, la am¡na aprop¡ada y el ác¡do carboxíl¡co aprop¡ado.
Conjugado (4)
El Intermedio 10 (27,02 mg, 0,0538 mmol) se d¡solv¡ó en DMSO (2 ml). El éster de 5(-6)succ¡n¡m¡l carbox¡-fluoresceína (24,16 mg, 0,0510 mmol) (número de catálogo de Inv¡trogen: C1311) se d¡solv¡ó en DMSO (1 ml) para dar una soluc¡ón de color amar¡llo br¡llante. Las dos soluc¡ones se mezclaron a temperatura amb¡ente, tornándose la mezcla de color rojo. La mezcla se ag¡tó a temperatura amb¡ente. Poco después de mezclar se ret¡ró una alícuota de 20 pl y se d¡luyó en una mezcla 80:20 de AcOH:H2O para el anál¡s¡s de CL-EM en el s¡stema de CL-EM 1200RR-6140. El cromatograma mostró dos p¡cos de eluc¡ón cercanos en t¡empos de retenc¡ón de 1,42 y 1,50 m¡nutos, ambos con una masa (M+H)+ = 860,8 uma, correspondente a los dos productos formados con el grupo carbox¡fluoresceína 5 y 6 sust¡tu¡do. Un máx¡mo ad¡c¡onal en el t¡empo de retenc¡ón de 2,21 m¡nutos tuvo una masa de (M+H)+ = 502,8 uma, que correspondía al Intermedio 10. No se observó n¡ngún máx¡mo para el éster de succ¡n¡m¡lo 5(-6) carbox¡fluoresceína s¡n reacc¡onar. Las áreas máx¡mas fueron el 22,0 %, el 39,6 % y el 31,4 % para las tres señales, ¡nd¡cando una convers¡ón del 61,6 % en los dos ¡sómeros del conjugado de fluorescenc¡a deseado en ese punto temporal. Se extrajeron alícuotas adicionales de 20 |jl después de varias horas y después, después de agitar durante la noche, se diluyeron como antes y se sometieron a análisis CL-EM. El porcentaje de conversión se determinó como el 79,8 % y el 88,6 % respectivamente en estos puntos temporales. La mezcla se purificó en un sistema de HPLC preparativa dirigida por UV. Las fracciones purificadas reunidas se secaron por congelación para retirar el exceso de disolvente. Después de secarse por congelación, se recuperó un sólido naranja (23,3 mg), equivalente a 0,027 mmol de producto, correspondiente a un rendimiento global del 53 % para la reacción y la purificación por HPLC preparativa.
Ejemplo 3 - Cribados para compuestos que se unen a TNFa
Los compuestos de fórmulas (1) y (2) se han cribado usando el siguiente ensayo.
Se recubrieron placas Meso Scale Discovery (MSD) de 384 pocillos sin recubrir (unión convencional) durante la noche con el dominio extracelular de TNFR (TNFR-ECD) (10 jl, 1 ug/ml en PBS). Para asegurar una distribución uniforme, las placas se centrifugaron a 1000 rpm durante 2 minutos. A continuación, se sellaron las placas y se almacenaron a 4 °C durante la noche.
Los pocillos de las placas se lavaron después tres veces en 50 j l de solución salina tamponada con fosfato, pH 6,5 (PB), con Tween 20 al 0,05 % (tampón de lavado) y después se bloquearon con 50 j l de BSA al 2 %. A continuación, las placas se incubaron a temperatura ambiente en un agitador (600 rpm) durante 2 horas. Después de esta incubación se lavaron las placas (3 x 50 j l de tampón de lavado por pocillo).
Durante la incubación de bloqueo, los compuestos de fórmulas (1) y (2) se preincubaron con TNF (R&D Systems) antes de la adición a las placas MSD prebloqueadas y lavadas. Para un ensayo de un solo punto como se muestra en la Figura 3A los compuestos se ensayaron a una concentración final de 100 jM (DMSO final al 5 % v/v).
Para la determinación de los valores de CE50 (Figura 3B y 3C) los compuestos de fórmulas (1) y (2) se diluyeron doble o triplemente en DMSO de tal manera que cuando se añadieron al ensayo la concentración más alta del compuesto de prueba fue 50 o 100 jM (DMSO al 5 % final v/v). Se añadieron compuestos prediluidos de fórmulas (1) y (2) en una relación de 1:1 a 4 ng/ml de TNF (concentración final 2 ng/ml) y después se incubaron a temperatura ambiente en un agitador a 600 rpm durante 1 hora.
Se añadieron 10 j l de mezclas preincubadas del compuesto de fórmulas (1) o (2) con TNFa a la placa MSD preparada y se incubaron a temperatura ambiente en un agitador durante 1 hora.
A continuación, las placas se lavaron con tampón de lavado (3 x 50 j l por pocillo). Después se añadió anticuerpo policlonal anti-TNF etiquetado con sulfo a cada pocillo y las placas se incubaron durante 1,5 horas más a temperatura ambiente en un agitador.
Las placas se lavaron después (3 x 50 j l de tampón de lavado por pocillo), seguido de la adición de 50 j l de tampón de lectura MSD T más tensioactivo (diluido 1 en 2 en H2O) y la lectura en un SECTOR Imager 6000.
Para los ensayos de un solo punto, se calculó el porcentaje de inhibición usando una muestra control sin compuesto.
Para la determinación de CE50 los resultados se calcularon por medios convencionales usando un modelo logístico de 4 parámetros (modelo de respuesta a dosis sigmoidea).
Como puede verse a partir de la Figura 3A, el compuesto marcado "SPD-304", que es representativo de los antagonistas de TNFa conocidos en la técnica, tiene un valor de % de inhibición del 80 %, indicando que este compuesto inhibe la unión de TNFa a su receptor. Por otro lado, varios de los compuestos probados, tienen valores de % de inhibición negativos, lo que indica que estos compuestos potencian la unión de TNFa al receptor de TNF.
Igualmente, las respuestas de dosis para los compuestos de fórmula (1) (Figura 3B) y fórmula (2) (Figura 3C) producen curvas de inhibición negativas. En otras palabras, la unión de TNFa al ECD-TNFR inmovilizado parece mejorar a medida que aumentan las concentraciones de los compuestos. Por esta razón, debe calcularse una CE50 (concentración de compuesto que da el 50 % del efecto total) en lugar de una CI50. En este caso la CE50 para el compuesto de fórmula (1) fue 4,6 jM y la CE50 para el compuesto de fórmula (2) fue 3,7 jM .
El BIA (análisis de interacción biomolecular) que usa resonancia de plasmón de superficie también puede usarse para medir la unión mejorada inducida por el compuesto de TNFa al receptor de TNF. Para este fin se usó un Biacore A100/4000. En lo que se denomina un ensayo de competición/mejora en solución, el dominio extracelular del receptor de TNF (ECD-TNFR) se inmovilizó a pH 5 a un nivel de 1 KRU en un sensor CM5 en tampón HBS-P (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 0,15 M, Tensioactivo P20 al 0,005 %, BIAcore, GE Healthcare).
Los compuestos se diluyeron en serie dos veces de modo que la concentración más alta en el ensayo fuera 20 jM . Por ejemplo, un ensayo típico puede usar una solución 20 jM , 10 jM , 5 jM , 2,5 jM , 1,25 jM , 0,625 jM , 0,312 jM , 0,156 jM , 0,078 jM , 0,039 jM de compuesto. Los compuestos se mezclaron con TNFa 0,5-1 nM y se equilibraron durante al menos 5 horas. Los compuestos control se probaron cada 10-15 ciclos. La mezcla de TNFa/compuesto se hizo fluir sobre TNFR inmovilizado durante 3 minutos seguido de regeneración de la superficie después de cada ciclo con una inyección de 30 ml de HCL 10 mM a un caudal de 30 ml/min. Las curvas de unión de sustracción de fondo se analizaron usando el software BIAevaluation siguiendo procedimientos convencionales. Los datos de CE50 se determinaron utilizando un ajuste logístico de cuatro parámetros. La Figura 4A y la Figura 4B muestran las curvas de progreso para los compuestos de fórmula (1) y fórmula (2), respectivamente. El valor de UR (unidad de resonancia) para TNFa en ausencia de compuesto se restó de las curvas, por lo que ahora solo muestran el aumento en la unión inducida por los compuestos. Las curvas de progreso se estabilizan a valores de UR más altos a medida que aumenta la concentración de compuesto. A partir de esto, puede calcularse un valor de CE50 determinando la concentración de compuesto que da un efecto máximo del 50 % utilizando el modelo de ajuste logístico de 4 parámetros. En estos experimentos se calculó que la CE50 para el compuesto de fórmula (1) era 298 nM y la del compuesto de fórmula (2) era 280 nM.
Cabe señalar que las CE50 muestran variabilidad entre ensayos y las condiciones para los ensayos Biacore y los ensayos MSD son muy diferentes. Como resultado, no se espera que las CE50 medidas sean idénticas para los dos formatos de ensayo.
Ejemplo 4 -Análisis espectrométrico de masas de la unión del compuesto 1 a TNFa
La espectrometría de masas se realizó típicamente usando un espectrómetro de masas Waters LCT-premier Time-of-Flight o un espectrómetro de masas Waters SynaptG2 Q-TOF. Las muestras se introdujeron usando un dispositivo de infusión de nanoflujo de nanomatos Advion Triversa que sustituye a la fuente de espectrómetro convencional, la inyección de la muestra se realizó mediante un chip de la serie "A" con un tamaño de boquilla de 5 pM a un caudal nominal de 100 nl/min. Las modificaciones adicionales al espectrómetro de masas de tiempo de vuelo de Waters LCT incluyen un dispositivo de enfriamiento de la fuente personalizado que permite un control preciso de la temperatura de la fuente y un dispositivo de regulación de la presión comercial que proporciona un control preciso sobre las condiciones de vacío en la región de la fuente. Juntas, estas modificaciones ayudan a retener el trímero de TNFa en una conformación nativa, plegada y facilitan la detección de complejos formados con compuestos de prueba de afinidades débiles. Los ajustes típicos fueron Temperatura de la fuente: 10 °C, presión de la fuente 0,374 e ’ 3 kPa (3,74 e ’ 3 mbar), presión del analizador 0,154 e ’ 6 kPa (1,54 e ’ 6 mbar).
Los iones se generaron usando condiciones convencionales de electropulverización de iones positivos que dieron como resultado una carga múltiple de TNFa.
La espectrometría de masas es muy sensible a las sales tampón presentes en la muestra de proteína. Las sales tampón típicas, como los fosfatos de potasio o sodio, tienen un efecto muy perjudicial sobre la ionización. En consecuencia, las muestras de proteína se pretrataron para eliminar estas sales usando una columna de centrifugación de desalinización Zeba, intercambiándose la proteína en un sistema tampón compatible con espectrometría de masas, normalmente acetato de amonio 50 mM a pH 6,8.
En condiciones de ionización suave cuando se observa una transmisión del 100 % de las especies triméricas, en condiciones nativas en un entorno acuoso al 100 %, la forma trimérica se observa como una envolvente de estado de carga que comprende los iones 12, 13 y 14, con la adición de DMSO al 5 % v/v la envolvente del estado de carga cambia a m/z más bajo (z más alto), lo que indica que, como se esperaba, el codisolvente orgánico provoca un desplegamiento parcial en solución de las especies triméricas, también se detecta un aumento del nivel del monómero. Cuando se añade DMSO al 10 % v/v, sólo se observa la envolvente del estado de carga asociada con la forma monomérica, lo que indica que este nivel de DMSO interrumpe la formación de trímero en solución. Normalmente, los compuestos de prueba se presentaron como soluciones madre de DMSO 10 mM de tal manera que cuando se incuban con TNFa en solución, la concentración final de DMSO es del 5 %. En condiciones de ionización blanda se observa que la envolvente del estado de carga cambia a m/z más alto (z más bajo) en comparación no solo con el espectro de control de DMSO al 5 %, sino también con el espectro adquirido bajo 100 % acuoso lo que indica que los compuestos de prueba son capaces de superar el efecto desestabilizador del DMSO al 5 % y proporcionan una estabilización por encima de la observada en condiciones nativas. Esto se evidencia por los cambios en el número de cargas adquiridas por la proteína en las diversas condiciones descritas.
La velocidad "de activación" medida es un producto aritmético de la constante de velocidad kon y la concentración del compuesto de prueba, a concentraciones elevadas del compuesto de ensayo la velocidad observada es mayor que a concentraciones bajas. La medición experimental de la velocidad observada por espectrometría de masas a diferentes concentraciones del compuesto de prueba permite el valor de la constante de velocidad (kon) que se derivará. En un experimento típico, se prepara una mezcla del compuesto de prueba y el trímero de TNFa a la concentración deseada usando un robot Advion Triversa Nanomate a partir de soluciones madre de TNFa y el compuesto de prueba. A continuación, la muestra se infunde en el espectrómetro de masas durante varios minutos, tiempo durante el cual se registra la relación de las señales de TNFa libre y complejo TNFa/compuesto de prueba en el espectro de masas. Esto se repite para varias proporciones diferentes de compuesto de prueba/TNFa.
Los datos registrados para diferentes proporciones de compuesto de prueba/TNFa se ajustan después a la curva de asociación logarítmica de una fase teórica usando Graphpad PRISM v.5 para derivar el valor de kon. Esto confirmó el bajo valor de kon observado en el Biacore.
Los compuestos de prueba se prepararon como soluciones 10 mM en dimetilsulfóxido (DMSO). Por lo tanto, era necesario establecer el efecto de DMSO sobre el trímero de TNFa nativo en ausencia de un compuesto de prueba. Se añadió DMSO a una solución acuosa de trímero de TNFa para dar una concentración final del 5 % v/v y se adquirió el espectro de masas.
En un ambiente 100 % acuoso, es decir, en ausencia de DMSO, existe una gran proporción de TNFa en forma trimérica, con una proporción significativa del monómero TNFa. En un ambiente 100 % acuoso, la forma trimérica de TNFa se observa como una envolvente de estado de carga que comprende los iones 12, 13 y 14 (Figura 5, trazo inferior).
Se observó menos TNFa trimérico con la adición de DMSO al 5 % v/v. La envolvente del estado de carga cambió a una relación masa/carga más baja (m/z), lo que indica que el DMSO provocó el despliegue parcial de la especie trimérica. También se detectó un nivel aumentado de TNFa monomérico en presencia de DMSO al 5 % v/v.
Cuando se añadió DMSO al 10 % v/v, sólo se observó la envolvente del estado de carga asociada con la forma monomérica, lo que indica que este nivel de DMSO interrumpe la formación de trímeros de TNFa (Figura 5, trazo superior).
El compuesto de fórmula (1) se añadió a una solución que contenía TNFa y DMSO al 5 % v/v y se adquirió el espectro de masas. Se encontró que existía TNFa trimérico en la solución de DMSO al 5 % v/v en presencia del compuesto de fórmula (1) (Figura 5, trazo medio). La envoltura del estado de carga observada para el compuesto de TNFa unido a la fórmula 1 cambia a valores m/z más altos (exclusivamente 12 y 11), revelando que el compuesto de fórmula (1) no solo superó la débil influencia de despliegue del DMSO sobre el TNFa, sino que también dio como resultado una estabilización del complejo de TNFa trimérico por encima de la observada en ausencia de DMSO.
Para abordar la preocupación de que era necesario tener DMSO presente para debilitar el complejo de TNFa trimérico lo suficiente antes de que los compuestos de prueba pudieran unirse, se repitió el experimento con un compuesto soluble en agua en condiciones acuosas al 100 %. En ausencia de DMSO, el compuesto unido al complejo trimérico provocó el mismo cambio a una relación m/z más alta que se observó cuando estaba presente DMSO (datos no mostrados). Esto confirmó que los compuestos de prueba no necesitan que esté presente DMSO para unirse al trímero de TNFa y pueden ejercer su efecto estabilizador independientemente de la presencia de un agente desestabilizador.
Se obtuvo evidencia adicional de la estabilización de la forma trimérica de TNFa por los compuestos de prueba analizando las muestras en condiciones de ionización más severas que tienden a favorecer la descomposición de la forma trimérica nativa en monómeros. Cuando se unió TNFa al compuesto de fórmula (1), la cantidad de monómero de TNFa detectado en estas condiciones se redujo significativamente (datos no mostrados). Esto sugiere que los compuestos de prueba protegen al trímero de TNFa de la alteración espectrométrica de masas.
Ejemplo 5 - Estequiometría del complejo TNFa- el compuesto de fórmula (1)
La incubación de una biblioteca de compuestos de prueba, incluyendo el compuesto de fórmula (1) con TNFa se controló mediante espectrometría de masas en condiciones de ionización suave. Los datos muestran la estequiometría de la unión como una molécula del compuesto de fórmula (1) por trímero de TNFa (Figura 6). No se observó que el compuesto de fórmula (1) se uniera a la forma monomérica de TNFa. No hubo evidencia de estabilización de la forma dimérica de TNFa. Esto confirma que los compuestos de prueba, incluyendo el compuesto de fórmula (1), tienen un modo de acción diferente al de los compuestos conocidos, que estabilizan la forma dimérica de TNFa.
Ejemplo 6 - Intercambio de monómeros en trímeros de TNFa
Homotrímeros humanos y de ratón de TNFa (H3 y M3 respectivamente) se incubaron juntos y se monitorizaron alícuotas de la solución mediante espectrometría de masas del aspecto de los heterotrímeros de especies cruzadas. El análisis de espectrometría de masas confirmó que el intercambio de monómeros entre los trímeros de TNFa nativos podía producirse en solución. El tipo de cambio fue lento y se controló durante un transcurso de 4 horas antes de que se lograra el equilibrio completo (datos no mostrados). El mecanismo es desconocido, aunque es poco probable que implique la formación de formas diméricas ya que no se observó ninguna de estas. Es probable que se produzca un intercambio de monómeros entre los trímeros puros de humanos y ratones, la mezcla de trímeros de ratón y humanos simplemente hace que este intercambio sea visible por espectrometría de masas.
En una segunda serie de experimentos, se incubó un exceso del compuesto de fórmula (1) con TNFa humano, después se retiró el exceso de compuesto de fórmula (1). El análisis espectral de masas confirmó que se había formado un complejo 1:1 entre el compuesto de fórmula (1) y h-TNFa. Se añadió ahora TNFa de ratón a esta muestra que luego se sometió a análisis espectral de masas durante varias horas. Después de 18 horas no se observó ningún cambio en la composición de la muestra. Cabe destacar que no se ha producido ningún intercambio de subunidades de monómero, no se observó la formación de la especie heterotrimérica mixta libre como MH2 y M2H o ligada como MH2L y M2HL. Además, no hubo evidencia de formación de la especie M3L ni evidencia de formación de la especie H3 no ligada. Esto sugiere fuertemente que una vez que el compuesto de fórmula (1) se une a h-TNFa, no hay una velocidad de inactivación medible. Por lo tanto, cuando se preincubó con h-TNFa, el compuesto de fórmula (1) bloqueó el trímero humano, por lo tanto no se observó intercambio de subunidades de monómeros de especies cruzadas.
El experimento se repitió después a la inversa. El exceso de compuesto de fórmula 1 se incubó con TNFa de ratón, después se retiró el exceso de compuesto de fórmula (1). El análisis espectral de masas confirmó que se había formado un complejo 1:1 entre el compuesto de fórmula (1) y m-TNFa. Se añadió ahora TNFa humano a esta muestra que se sometió después a análisis espectral de masas durante varias horas. Los datos muestran claramente que puede producirse un intercambio de subunidades de monómeros, se observó la formación de la especie heterotrimérica mixta tanto en el estado libre (MH2 y M2H) como el estado ligado (MH2L y M2HL). Además, hubo evidencia de formación del homotrímero humano ligado (H3L), el homotrímero de ratón no ligado (M3) y para el compuesto no unido de fórmula (1) (L). Esto sugiere que aunque se formó un complejo 1:1 entre el compuesto de fórmula (1) y el homotrímero de TNFa de ratón, hay una velocidad de inactivación medible. Una vez que este complejo (M3L) se ha disociado, el intercambio de subunidades de monómero entre las especies H3 y M3 continúa y el ligando liberado es capaz de formar complejos con las 4 especies de trímeros presentes en solución. Por lo tanto, cuando se preincubó con m-TNFa el compuesto de fórmula (1) no evitó el intercambio de subunidades de monómeros y se observó la formación de heterotrímeros mixtos. Estos dos experimentos se repitieron después con el compuesto de fórmula (2) en lugar del compuesto de fórmula (1). Los resultados cuando el compuesto de fórmula (2) se preincubó con h-TNFa para dar un complejo 1:1 y luego se mezcló con m-TNFa no ligado fueron los mismos que con el compuesto de fórmula (1). No se observó intercambio de subunidades de monómero, después de 18 horas solo se observaron las especies H3L y M3 en solución, lo que confirma que el compuesto de fórmula (2) tampoco tiene una tasa de desviación medible cuando forma complejo con h-TNFa. Por lo tanto, cuando se preincubó con h-TNFa, el compuesto de fórmula (2) bloqueó el trímero humano, por lo tanto no se observó intercambio de subunidades de monómeros de especies cruzadas.
Sin embargo, a diferencia del compuesto de fórmula (1), cuando el compuesto de fórmula (2) se preincubó con m-TNFa para formar un complejo 1:1 y después se mezcló con h-TNFa no ligado no se observó intercambio de subunidades de monómero, después de 18 horas solo se observaron las especies M3L y H3 en solución. Esto sugiere que el compuesto de fórmula (2) tampoco tiene una tasa de desviación medible cuando forma complejo con m-TNFa. Por lo tanto, cuando se preincuban con m-TNFa, el compuesto de fórmula (2) bloqueó el trímero de ratón, por lo tanto no se observó intercambio de subunidades de monómeros de especies cruzadas.
Juntos, estos datos sugieren que, si bien el compuesto de fórmula (1) y el compuesto de fórmula (2) tienen afinidades similares por el TNFa humano, los compuestos tienen diferentes afinidades por el trímero de TNFa de ratón, uniéndose el compuesto de fórmula (2) más estrechamente que el compuesto de fórmula (1) a este último.
Ejemplo 7 - Análisis espectrométrico de masas de fracciones de experimentos de exclusión por tamaño usando TNFa, TNF-R y el compuesto de fórmula (1)
Las fracciones de la separación cromatográfica de exclusión por tamaño de mezclas de TNFa, TNF-R y el compuesto de fórmula (1) se analizaron mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (CL-EM). Se prepararon dos muestras para cromatografía de exclusión por tamaño. En la primera muestra, el compuesto de fórmula (1) se incubó previamente con TNFa antes de la adición del complejo compuesto-trímero a TNF-R. En la segunda muestra, se añadió el compuesto de fórmula (1) a un complejo preformado de TNFa y TNF-R. El análisis CL-EM reveló que el compuesto de fórmula (1) estaba asociado con aquellas fracciones que contienen las dos proteínas (Figura 7), lo que sugiere que independientemente del orden de adición, el compuesto de fórmula (1) todavía es capaz de unirse a TNFa, es decir, que el compuesto de fórmula (1) se une a TNFa incluso en presencia de TNF-R.
Ejemplo 8 - Análisis calorimétrico isotérmico de TNFa y los complejos de compuesto de fórmula (2) - trímero de TNFa que se unen a TNF-R
TNFa (128 |jM) en tampón ITC (HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) se incubó durante 60 minutos con una solución madre de DMSO del compuesto 2 dando una concentración final de compuesto de 300 mM en DMSO al 5 % (muestra de prueba). También se incubó una muestra de control en la que se añadió DMSO pero no compuesto a la muestra de TNFa durante 60 minutos (control).
Después de la incubación, las muestras se filtraron en gel en una columna de exclusión por tamaño Nap 5 (GE Healthcare). La columna se equilibró con 15 ml de tampón ITC antes de la adición de 500 j l de muestra que se pasó a la columna y después se eluyó usando 1 ml de tampón ITC. Este proceso separa el TNF y el TNF unido al compuesto del compuesto libre y DMSO.
Se usaron lecturas de absorbancia a 280 nm para determinar la concentración de TNFa en la muestra de prueba o el control después de la elución de la columna NAP 5 y las muestras se diluyeron hasta una concentración de TNFa de 64 jM .
Se cargaron 200 |jl del dominio extracelular (ECD) de TNFR1 (10 mM) en la celda de muestra de un AutoITC200 (GE Healthcare) automáticamente (usando el protocolo Plates Standard B). En 2 experimentos se cargaron 40 j l de la muestra de prueba o del control en la jeringa de inyección automáticamente usando el mismo protocolo.
Los experimentos de ITC se realizaron utilizando el protocolo de inyección de ITC descrito en los gráficos de Isotermas (Figura 8A y B) a 25 grados centígrados agitando a 1000 rpm.
Los datos se recopilaron y analizaron utilizando aplicaciones de GE Healthcare ITC en el software Origin 4.0 y los resultados se calcularon usando un algoritmo de unión de un sitio.
Se calculó que la Kd de la unión de TNFa a TNF-R en ausencia de cualquier compuesto de prueba era 77 nM (Figura 8A). La Kd de la unión de TNFa a TNF-R en presencia del compuesto de fórmula (2) estaba por debajo del intervalo de sensibilidad del calorímetro y, por lo tanto, no pudo calcularse con precisión. Sin embargo, el calorímetro tiene un límite de sensibilidad más bajo de aproximadamente 1 nM. Por lo tanto, la Kd de unión de TNFa a TNF-R en presencia del compuesto de fórmula (2) debe ser 1 nM o menor (véase la Figura 8B).
Ejemplo 9 - Estructura cristalina del TNFa trimérico unido al compuesto de fórmula (1)
Se preincubó TNFa con el compuesto de fórmula (1) y se cristalizó el complejo compuesto-trímero resultante. La estructura cristalina del complejo compuesto-trímero TNFa se determinó usando cristalografía de rayos X. La estructura cristalina del complejo con una resolución de 2,2 A se muestra en la Figura 9. El compuesto puede verse en el medio del trímero que ya no es simétrico.
Ejemplo 10 - Neutralización de TNFa por compuestos de la invención
Los ensayos de neutralización de L929 se llevaron a cabo utilizando el protocolo descrito en Baarsch MJJ et al (Immunol Methods 1991; 140: 15-22) y Galloway CJ et al J (Immunol Methods 1991; 140: 37-43).
Brevemente, se cultivaron células L929 (ECACC, 85011425) en medio de cultivo que consistía en RPMI 1640 (Gibco) que contenía FCS (PAA) al 10 %, glutamina 2 mM (Gibco), penicilina 50 U/ml (Gibco) y estreptomicina 50 jg/m l (Gibco). Cuando se subcultivaron, las células se lavaron tres veces con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin calcio y magnesio (Gibco) y después se añadieron 3 ml de tripsina-EDTA (Gibco) durante 2 minutos para retirar las células del matraz. Se añadió medio de cultivo para neutralizar la tripsina y las células se pipetearon hacia arriba y hacia abajo para retirar cualquier grumo.
Las células L929 se dividieron 1/2 o 1/3 el día antes de su uso y se cultivaron durante 24 horas más. Los matraces se tripsinizaron después como se indicó anteriormente y se añadieron 2x104 células en 100 j l por pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos (Becton Dickinson). Las placas se cultivaron durante 24 horas antes de que se estableciera el ensayo.
Se hicieron diluciones en serie a partir de reservas de DMSO de los compuestos. Por lo general, se generaría una curva de valoración de 9 puntos diluyendo dos veces a partir de una solución concentrada de compuesto para obtener una concentración de ensayo final de 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,56, 0,78, 0,39, 0,2, 0,1 jM
El medio de ensayo era el mismo que el medio de cultivo pero también contenía 1 jg/m l de actinomicina D (Sigma). El medio se retiró de las placas y las muestras de ensayo más TNFa, los patrones y los controles se añadieron en volúmenes de 100 j l por duplicado. Las placas se incubaron durante 16 horas más y después se añadieron 10 j l por pocillo de solución de metiltiazol-tetrazolio (MTT; Sigma) 5 mg/ml en medio de cultivo durante 4 horas más. La reacción se detuvo mediante la adición de 100 j l de tampón de solubilización que contenía dodecilsulfato de sodio al 20 % (SDS, BDH) disuelto en dimetilformamida al 50 % (DMF; BDH) y agua desionizada al 50 %.
Después de la incubación durante la noche a 37 °C para permitir que el tinte se disuelva, las placas se leyeron en un lector de placas Multiskan EX (Labsystem) a 570 nm con sustracción a 630 nm. Los datos se analizaron usando el paquete de software Genesis.
Tanto el compuesto de fórmula (1) como el compuesto de fórmula (2) inhibieron la actividad destructora de células del TNFa humano (Figura 10), lo que indica que tanto el compuesto de fórmula (1) como el compuesto de fórmula (2) fueron capaces de inhiben la señalización inducida por TNFa humano a través de TNF-R. En este caso, el compuesto de fórmula (1) dio un valor de CI50 de 306 nM y el compuesto de fórmula (2) dio un valor de CI50 de 125 nM. El protocolo se repitió usando el compuesto de fórmula (3), que también se encontró que inhibe la señalización inducida por TNFa humano a través de TNF-R. Por lo tanto, el compuesto de fórmula (3) dio un valor de CI50 de 21 nM.
Ejemplo 11 - Inhibición de la producción de IL-8 inducida por TNFa por el compuesto de fórmula (1)
La sangre venosa de donantes sanos se recogió por venupuntura en tubos que contenían sodio/heparina (BD Biosciences). Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll Paque (Amersham Biosciences). Brevemente, se diluyeron 10 ml de sangre 1:1 (v/v) con RPMI 1640 (Gibco) y se colocaron cuidadosamente en capas sobre 20 ml de Ficoll Paque. Las células se centrifugaron durante 30 minutos (min) a 470 g, se recogieron las PBMC, se lavaron una vez en RPMI 1640 y los eritrocitos contaminantes restantes se lisaron en tampón de lisis de eritrocitos (KHCO31 g/l, NH4Cl 8,3 g/l, EDTA 0,0372 g/l). El aislamiento de monocitos de las PBMC se realizó usando Microperlas magnéticas CD14+ (Miltenyi Biotec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, Las PBMC se resuspendieron en medio de Eagle modificado de Dulbecco que contenía BSA al 5 % (Sigma) y EDTA 2 mM (Sigma) a 1x107 células/ml. 25 pl de microperlas CD14 por 107 células totales se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente. La separación magnética se realizó usando una columna LS (Miltenyi Biotec). Antes de la aplicación de la mezcla de células/perlas a la columna, la columna se colocó en el campo magnético y se lavó dos veces con 5 ml de tampón. La suspensión celular se aplicó después a la columna, en el campo magnético. Los monocitos que se unen a las microperlas de CD14+ se retuvieron en la columna LS mientras que las PBMC restantes pasaron a través de la columna. Para aislar monocitos, la columna (que contenía las células retenidas) se retiró del imán y se colocó en un tubo de recogida. Se añadieron 5 ml de tampón a la columna y las células CD14+ se recogieron de la columna aplicando un émbolo de jeringa en la parte superior de la columna. Las células recogidas se lavaron una vez en RPMI 1640.
Se realizó una dilución en serie triple de 11 puntos (incluyendo el blanco) de los compuestos (concentración de reserva 10 mM) en DMSO en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Los monocitos purificados se lavaron por centrifugación (300 g durante 5 minutos) y se resuspendieron en medio completo a una concentración de 1x106 células/ml. Se incubaron 160 pl de esta población celular a 37 °C en una placa de fondo redondo de 96 pocillos con 40 pl de los compuestos y TNFa (concentración final ~1 ng/ml) en RPMI 1640 o controles relevantes por triplicado.
Después de 18 horas, se centrifugó la placa (300 g, 5 min) y se recogieron los sobrenadantes para la medición de citocinas.
La IL-8 humana se midió en los sobrenadantes del cultivo celular usando kits de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) de R&D Systems Ltd. de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El sustrato usado para los ELISA fue TM Blue (Serologicals Corporation). Las placas se leyeron a una longitud de onda de 630 nm con corrección a 470 nm. El compuesto de fórmula (1) inhibió la producción de IL-8 inducida por TNFa de una manera dependiente de la concentración (Figura 11), con un valor de CI50 de 454,1 nM.
Ejemplo 12 - Inhibición de la activación de NF-kB inducida por TNFa por el compuesto de fórmula (2)
La estimulación de células HEK-293 por TNF-alfa conduce a la activación de la ruta de NF-kB. La línea celular indicadora usada para determinar la actividad de TNF alfa se adquirió de Invivogen. HEK-BlueTM CD40L es un transfectante estable que expresa SEAP (fosfatasa alcalina secretada) bajo el control del promotor mínimo de IFN-beta fusionado con 5 sitios de unión a NF-kB. La secreción de SEAP por estas células se estimula de una manera dependiente de la concentración por TNF-alfa (0,5 ng/ml), IL-1-beta (0,5 ng/ml) y un anticuerpo activador anti-TNFR1 humano (300 ng/ml).
Los compuestos se diluyeron a partir de reservas de DMSO 10 mM (concentración de ensayo final de 0,3 %) para generar una curva de dilución en serie triple de 10 puntos (concentración final de 30.000 nM a 2 nM). Se mezclaron con ligando estimulante durante 1 hora en una placa de microtitulación de 384 pocillos. Se añadieron células recién descongeladas y lavadas a la mezcla de compuesto/estímulo y se incubaron adicionalmente durante 18 horas. La actividad SEAP se determinó en el sobrenadante utilizando el sustrato colorimétrico Quanti-blue TM (Invivogen).
Se calcularon los porcentajes de inhibiciones para diluciones del compuesto entre un control de DMSO e inhibición máxima (por exceso de compuesto de control) y una CI50 calculada usando xlfit (modelo logístico de 4 parámetros) en ActivityBase.
La actividad específica de cada compuesto contra la respuesta de TNF-alfa se comparó con la observada con las pantallas de contraste (IL-1beta y anticuerpo anti-TNFR1 humano).
El compuesto de fórmula (2) inhibió la activación de NF-kB por TNFa de una manera dependiente de la concentración, con una CI50 de 113 nm (Figura 12A). Por otro lado, el compuesto de fórmula (2) no inhibió la activación de NF-kB por IL-1p (Figura 12B) o el anticuerpo activador de TNF-R1 (Figura 12C). Se obtuvieron valores de CI50 en cada caso de más de 30.000 nM. Por lo tanto, el compuesto de fórmula (2) inhibe específicamente la señalización inducida por TNFa a través del TNF-R1, pero no tiene ningún efecto sobre la activación de NF-kB inducida por otras rutas de señalización (como por IL-1 p), o cuando se omite el inicio de la señalización del TNF-R1 por TNFa (por ejemplo, mediante el uso de un anticuerpo de activación de TNF-R1).
Ejemplo 13 - Determinación de la cinética de unión a TNFa
Se usó resonancia de plasmón de superficie para medir la velocidad de asociación, la velocidad de disociación y la afinidad de los compuestos de fórmulas (1) y (2) por TNFa (Figura 13A y B). Para el fin de este estudio se usó un Biacore T100/T200.
Se inmovilizó TNFa a pH5 a un nivel de 5-8 KRU en un sensor CM5 en tampón HBS-P (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCI 0,15 M, Tensioactivo P20 al 0,005 %, BIAcore, GE Healthcare). El TNFa se equilibró después en HBS-P con DMSO al 5 % durante al menos 5 horas. Las muestras se diluyeron a partir de soluciones madre 10 mM en tampón emparejado con DMSO y se dejaron solubilizar durante al menos 5 horas. El caudal fue de 30 pl/min.
Este ensayo se realizó añadiendo 4 o 5 concentraciones de compuesto partiendo de una concentración más alta de 25 pM para el compuesto de fórmula (1) y 1 pM para el compuesto de fórmula (2) y después diluyendo en serie esta muestra. Las curvas de unión de sustracción de fondo se analizaron usando el software BIAevaluation siguiendo procedimientos convencionales. Los parámetros de unión, cinéticos y de afinidad se determinaron usando el software Biacore. Los datos cinéticos se ajustaron utilizando el algoritmo de levenberg marquardt.
El experimento mostró que estos compuestos se unen al TNFa inmovilizado muy lentamente como lo demuestra una kon de 2,668e3 M'V para el compuesto de fórmula (1) (Figura 13A) y 1,119e3 M' 1s' 1 para el compuesto de fórmula (2) (Figura 13B). También tienen velocidad de disociación notablemente lentas, lo que parece ser una característica de los compuestos con este modo de acción. La constante de velocidad de disociación (koff) para el compuesto de fórmula (1) es 9,46e-5 s-1 y para el compuesto de fórmula (2) es igual a 2,24e-5 s-1. Esto equivale a una semivida de disociación (t1/2) de más de 2 horas y 8 horas, respectivamente. La constante de disociación (Kd ) puede calcularse a partir de la relación de las dos constantes koff/kon. En este experimento los valores de Kd para el compuesto de fórmula (1) y para el compuesto de fórmula (2) son 35 nM y 2 nM, respectivamente. Esto es significativamente más bajo que las CE50 determinadas en el Biacore que se muestra en el Ejemplo 4 y es probable que refleje las diferencias en el formato de los ensayos. Adicionalmente la forma de TNFa difiere en que en el ensayo cinético del Ejemplo 13 se inmoviliza el TNFa.
El experimento se repitió para medir la velocidad de asociación, la velocidad de disociación y la afinidad del compuesto de fórmula (3) por TNFa (Figura 13C). Se encontró que el compuesto de fórmula (3) tenía una kon de 5470 M' V , una constante de velocidad de disociación de 4,067e' 5 s_1 y una Kd de 7 nM.
Ejemplo 14 - El compuesto de fórmula (1) y el compuesto de fórmula (2) antagonizan la actividad de TNFa in vivo
En estudios separados, los compuestos de fórmula (1) y fórmula (2) se mezclaron con soluciones 20 pM de TNFa disuelto en solución salina tamponada con fosfato (PBS) hasta una concentración de 2 pM, 20 pM y 200 pM. La relación de cada compuesto con TNFa fue, por lo tanto, 0,1:1 (muestra 1), 1:1 (muestra 2) y 10:1 (muestra 3). Las soluciones se incubaron a temperatura ambiente durante 3 horas para permitir que los compuestos se unieran al TNFa, antes de la filtración en gel usando una columna de desalación Zeba Spin (Thermo Scientific). Este proceso separa el compuesto unido a la proteína y el compuesto libre. Una muestra de control que contenía solo PBS se procesó de la misma manera para proporcionar un control de vehículo para el estudio. La concentración de proteína eluida se determinó usando un Nanodrop (ND-1000). Los complejos de TNFa:compuesto se diluyeron en PBS hasta una concentración para inyección de 0,03 pg/kg.
Para el estudio, normalmente, cada grupo contenía 10 ratones macho Balb/c (Charles River) además de un control positivo de anticuerpo anti-TNFa humano, que usó un conjunto de 5 ratones. Se administró anti-hTNFa a ratones de control de anticuerpos a 10 mg/kg (100 pl) mediante inyección intraperitoneal (i.p.) cinco minutos antes (t = -5) de recibir una inyección i.p. de PBS o hTNFa a 0,1 pg/kg (t = 0).
Los ratones de prueba se inyectaron i.p. a t = 0 con 100 pl de vehículo filtrado en gel (PBS), hTNFa (0,03 pg/kg) o muestras 1, 2 y 3 (compuesto unido a TNFa en una proporción de 0,1:1, 1:1 y 10:1, respectivamente).
También se incluyeron en el estudio ratones con compuesto solo para evaluar el efecto del compuesto sobre el reclutamiento de neutrófilos.
Todos los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical dos horas después de la inyección de hTNFa (t = 2 h) y la cavidad peritoneal se lavó con 3 ml de tampón FACS (500 ml de PBS que contenía 2 g de albúmina de suero bovino, 6 ml de tampón HEPES y 500 ml de EDTA). Se aspiró el líquido de lavado y se evaluó el número de neutrófilos tiñendo las células con anti-Grl Pe y anti-CD45 FITC por FACS como se detalla a continuación.
Se dividieron en alícuotas de 100 pl de líquido de lavado de cada muestra en tubos FACS. El cóctel AFACS se preparó usando PE anti-GR-1 (BD n.° de cat. 553128 n.° de lote 75542) a una dilución de 1 en 39 y anti-CD45 FITC (BD n.° de cat. 553080 n.° de lote 80807) a una dilución de 1 en 19 en tampón FACS. Se preparó bloque Fc (BD n.° de cat.
553142 n.° de lote 87810) 1 en 10 con tampón FACS y se añadieron 10 pl a cada muestra 5 minutos antes de añadir el cóctel de anticuerpos. Se añadieron 10 pl de cóctel de anticuerpos a cada tubo que contenía los 100 pl de muestra. Las muestras se dejaron después en hielo durante 20 min. Se añadió 1 ml de solución de lisis FACS (BD n.° de cat.
349202 n.° de lote 29076, diluido 1:10 en dH20) a cada tubo, se mezcló y se dejó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se añadió después 1 ml de tampón FACS a cada tubo y se centrifugó a 400 g durante 5 minutos. El tampón FACS se vertió cuidadosamente después y se frotó la punta del tubo con papel absorbente para dejar el tubo completamente seco. A continuación, se añadieron a cada tubo 300 |jl de solución de perlas de referencia 1 en 10 (Sigma n.° de cat. P2477 n.° de lote 116K1612) diluida en tampón Fa Cs .
Las muestras se analizaron mediante el software FACScalibur II y FloJo.
La Figura 14 muestra los resultados para el compuesto de fórmula (1) (A) y el compuesto de fórmula (2) (B). El vehículo solo tuvo un efecto insignificante sobre el reclutamiento de neutrófilos al igual que el compuesto solo (ligeramente superior en (B)). La muestra 1 de cada estudio (proporción de compuesto: TNFa 0,1:1) no fue significativamente diferente de la adición de TNFa en ausencia del compuesto. La muestra 2 (1:1) y la muestra 3 (10:1) mostraron una inhibición significativa del reclutamiento de neutrófilos, (86 % y 85 %, respectivamente). De forma análoga, la muestra 2 y la muestra 3 del compuesto de fórmula (2) mostraron una inhibición significativa del reclutamiento de neutrófilos, (101 % y 102 %, respectivamente). Los ratones de control de anticuerpos mostraron una inhibición del 100 % del reclutamiento de neutrófilos (datos no mostrados).
En un experimento adicional, los ratones se trataron con hTNFa (0,3 jg/m l) y el compuesto de fórmula (1) se administró por vía oral (p.o.).
El compuesto de fórmula (1) se preparó en una suspensión en un vehículo de metilcelulosa al 1 % usando una máquina Covaris.
También se utilizó un anticuerpo monoclonal anti-TNFa humano (anti-hTNFa, UCB) como un control positivo en este estudio.
Se usaron diez ratones Balb/c macho por grupo excepto en el grupo que recibió anti-hTNFa para el que se usaron 4 ratones.
Los ratones recibieron 100 j l de vehículo (metilcelulosa al 1 %) o compuesto de fórmula (1) a 30 mg/kg o 100 mg/kg p.o. 30 minutos (t = -30) o anti-hTNFa a 10 mg/kg i.p. 5 minutos (t = -5) antes de inyectarse con TNFa humano. A t = 0, los ratones se inyectaron con 100 j l i.p. de PBS o hTNFa a 0,03 jg/kg.
Todos los ratones se sacrificaron por dislocación cervical dos horas después de la inyección de hTNFa (t = 2 h) y se lavó la cavidad peritoneal y se midió el número de neutrófilos como se describió anteriormente.
La administración oral de 30 mg/kg y 100 mg/kg del compuesto de fórmula (1) redujo el reclutamiento de neutrófilos estimulado por TNFa en la cavidad peritoneal en un 49 % y un 79 %, respectivamente (Figura 15). El anticuerpo de control positivo (10 mg/kg) administrado mediante inyección i.p. inhibió completamente el reclutamiento de neutrófilos. Por lo tanto, el compuesto de fórmula (1) puede antagonizar la actividad de TNFa in vivo no solo cuando se premezcla con el TNFa y se administra por vía i.p., sino también cuando se administra por vía oral.
Ejemplo 15 - Análisis de la estabilización del trímero de TNFa por los compuestos de fórmulas (1) y (2)
Se realizó un ensayo de desnaturalización térmica con sonda de fluorescencia para evaluar el efecto de los compuestos sobre la estabilidad térmica del TNFa como medida de la unión del compuesto. La mezcla de reacción contenía 5 j l de colorante naranja SYPRO® 30x (Invitrogen) y 5 j l de TNFa (a 1,0 mg/ml), 37,5 j l de PBS, pH 7,4 y 2,5 j l de compuesto (a 2 mM en DMSO). Se dispensaron 10 j l de la mezcla por cuadruplicado en una placa de 384 pocillos ópticos de PCR y se procesaron en un sistema de PCR en tiempo real rápida 7900HT (Agilent Technologies). El dispositivo de calentamiento del sistema PCR se fijó entre 20 °C y 99 °C con una velocidad de rampa de 1,1 °C/min; los cambios de fluorescencia en los pocillos se controlaron mediante un dispositivo de carga acoplada (CCD). El aumento de la intensidad de la fluorescencia se representó en función de la temperatura y la Tm calculado como el punto medio de esta curva de desnaturalización (determinado como el punto de inflexión) (Tabla 1).
La estabilización del TNFa está indicada por un aumento de Tm. Los compuestos de fórmulas (1) y (2) aumentan ambos la Tm de TNFa (como se muestra en la Tabla 1). Por lo tanto, ambos compuestos de fórmulas (1) y (2) aumentan la estabilidad del trímero de TNFa.
La Tabla 1 muestra el punto medio de la transición térmica (Tm) de TNFa en presencia de cualquiera del compuesto
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Ejemplo 16 - Ensayo de polarización de fluorescencia para determinar el efecto de compuestos de fórmula (1), (2) y (3) sobre la unión del compuesto de fórmula (4) a TNFa
El compuesto de fórmula (1) se probó a 10 concentraciones a partir de 100 pM a una concentración final de DMSO al 5 %, por preincubación con TNFa durante 60 minutos a temperatura ambiente en Tris 20 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,05 %, antes de la adición del compuesto de fórmula (4) y una incubación adicional a temperatura ambiente durante la noche. Las concentraciones finales de TNFa y el compuesto de fórmula (4) fueron 50 nM y 10 nM respectivamente en un volumen de ensayo total de 25 pl. Las placas se leyeron en un lector Analyst HT. Se calculó una CI50 usando xlfit (modelo logístico de 4 parámetros) en Activity Base.
Los resultados se ilustran gráficamente en la Figura 16. El compuesto de fórmula (1) pudo inhibir la unión del compuesto de fórmula (4) a TNFa con un valor de CI50 de 167 nM.
El experimento se repitió usando los compuestos de fórmula (2) y (3). El compuesto de fórmula (2) pudo inhibir la unión del compuesto de fórmula (4) a TNFa con un valor de CI50 de 102 nM. El compuesto de fórmula (3) pudo inhibir la unión del compuesto de fórmula (4) a TNFa con un valor de CI50 de 20 nM.
Ejemplo 17 - Estudios preliminares con otros miembros de la superfamilia TNF
El análisis espectrométrico de masas ha demostrado que CD40L, que también forma homo-trímeros, se desestabiliza por DMSO, dando como resultado una cantidad reducida de CD40L trimérico. El protocolo de ensayo usado fue el mismo que el descrito en el Ejemplo 3 para TNFa, pero usando CD40L en su lugar. Se ha demostrado que el compuesto de fórmula (1) estabiliza el CD40L trimérico en presencia de DMSO (Figura 17). Esto indica que las técnicas de espectrometría de masas aplicadas al estudio de TNFa, su conformación en presencia de agentes desestabilizadores y los efectos de los compuestos según la invención son aplicables a otros miembros de la superfamilia de TNF.
Ejemplo 18 - Los compuestos y complejos de Ma et al (2014) y Silvian et al (2011) tienen características diferentes a aquellos de la presente invención
Como se describe en la página 12458 de Ma et al. (2014) JBC 289:12457-12466, C87 se descubrió a través de cribado virtual intentando encontrar moléculas que se ajustasen al espacio ocupado por un péptido de 7 aminoácidos del bucle2/dominio2 del TNFR1 en su interacción con la superficie externa de TNFp. El compuesto C87 de Ma et al. y el compuesto BIO8898 de Silvian et al. (2011) ACS Chemical Biology 6:636-647 se probaron por los presentes inventores.
Sumario de los descubrimientos
Las observaciones de Biacore descritas en Ma et al. para C87 no pudieron repetirse.
No se observaron evidencias de inhibición específica de TNF en las células.
Adicionalmente no se observó que C87 se uniese mediante espectrometría de masas, que es sensible a afinidades milimolares.
Los ensayos de cristalografía exhaustivos solo produjeron apo-TNF (TNF sin compuesto).
En el ensayo de polarización de fluorescencia (PF), C87 no mostró ninguna inhibición significativa por encima del nivel de interferencia del compuesto con la lectura fluorescente.
El termoflúor, que mide la estabilización de la temperatura de fusión térmica de TNFa, mostró una pequeña estabilización para C87.
En resumen, no se descubrió evidencia de que C87 se una en el centro del trímero. La abrumadora mayoría de los datos sugirió que no había interacción directa con TNFa. También se encontró que BIO8898 no se unía a TNFa.
Células - Ensayo de gen indicador HEK NFKB inducido por TNF
C87 se preincubó con TNFa durante 1 hora antes de la adición a células HEK-293 transfectadas de forma estable con SEAP con el control de NFkB. También se probó un contra-cribado apropiado con el fin de detectar actividad no relacionada con TNF (inespecífica). El ensayo se incubó durante la noche antes de que se midiera la inhibición en comparación con el bloqueo del 100 % mediante un compuesto control. La concentración máxima de C87 fue de 10.000 nM, con una dilución triple en serie.
No pudo detectarse ningún efecto inhibidor que no pudiera atribuirse a la actividad inespecífica.
Biacore
Se inmovilizó TNF usando un enlazador con etiqueta avi y se hizo pasar C87 por encima del chip. En un experimento, se realizó una respuesta a la dosis de C87 a partir de una concentración máxima de 10 pM. No se observó ninguna unión.
En un segundo experimento, el caudal de C87 que pasaba sobre el chip se redujo. Se observó un pequeño desplazamiento pero la unión global fue insignificante.
Es probable que la unión de C87 al TNF descrita en Ma et al sea súper estequiométrica basándose en el valor de UR en el eje Y. A la densidad convencional de TNF en el chip este valor estaba en la región de treinta veces más alto de lo esperado para la unión simple 1:1.a
En otro experimento, BIO8898 se probó frente a la forma soluble inmovilizada de CD40L y la forma soluble de TNFa mediante SPR en una máquina Biacore 4000. Se determinó una media geométrica de CI50 de 17 pM para la unión frente a CD40L mientras que no se detectó ninguna unión a una concentración de hasta 100 pM para TNFa en este ensayo.
Espectrometría de masas
No hubo evidencias de que C87 se uniese al TNFa humano (20 pM) a una concentración de 400 pM. Una especie de menor peso molecular (~473 Da) parece unirse a menos del 5 % de ocupación. C87 tiene un peso molecular de 503 Da. Basándose en la ocupación a una concentración de 400 pM, se predice una afinidad de la especie de bajo peso molecular en exceso de 1 mM.
Cristalografía
En general se hizo un gran esfuerzo para cristalizar C87 con TNFa, incluyendo las condiciones de ensayo que habitualmente funcionan con compuestos que se describen en la presente solicitud. Esto comprendió el establecimiento de un gran número de ensayos de cristalización a diferentes concentraciones de ligandos, diferentes concentraciones de proteínas y diferentes tiempos de remojo. Se observaron algunos cristales que, en el análisis, resultaron ser sal o TNF sin ningún compuesto.
Polarización fluorescente (PF)
C87 se preincubó con TNFa durante 1 hora antes de someterlo a ensayo frente al compuesto fluorescente (sonda). La competición con el compuesto fluorescente, ya sea directa (uniéndose en el mismo sitio) o indirectamente (alterando el TNF) se detecta mediante una reducción en la PF.
La extrapolación de la curva de inhibición produjo una CI50 de aproximadamente 100 pM. Se observó inactivación de la fluorescencia, sin embargo, a las concentraciones más altas de inhibidor que, cuando se restaron, dieron como resultado una inhibición insignificante de C87 en este ensayo.
Termoflúor
El termoflúor mide el cambio de temperatura de fusión (Tf) de TNFa debido a que el compuesto estabiliza o altera la proteína. Se observó un efecto de estabilización de 3,8 °C a una concentración de C87 500 pM, lo que sugiere la posibilidad de una unión débil, que puede no ser específica.
Listado de secuencias
SEQ ID NO: 1 (HCVR de 1974)
DVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSAYYMAWVRQAPTKGLEWVASINYDGANTFYRDSVKGRFTVSRD
NARSSLYLQMDSLRSEDTATYYCTTEAYGYNSNWFGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 2 (LCVR de 1974)
DIQM TQSPASLPASPEEIVTITCQASQDIGNW LSW YQQKPGKSPQLLIYGATSLADGVPSRFSASRSGTQYSL
KISRLQVEDFGIFYCLQGQSTPYTFGAGTKLELK
SEQ ID NO: 3 (1974 HC de mIgG1 completa)

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para identificar un compuesto que es capaz de unirse a una proteína trimérica que es un miembro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF), mediante el cual el complejo compuesto-trímero se une al receptor de la superfamilia de TNF requerido y modula la señalización del receptor, en donde el compuesto es una entidad molecular pequeña con un peso molecular de 1000 Da o menos, y en donde el método comprende:
a) realizar un ensayo para determinar el punto medio de la transición térmica (Tm) de la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF en una muestra del miembro de la superfamilia de TNF y el compuesto; comparar el Tm de la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF en la muestra con una muestra de control en ausencia de compuesto; y seleccionar un compuesto que aumente la estabilidad de la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF en comparación con la estabilidad de la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF en ausencia del compuesto; y
b) medir el nivel de miembro de la superfamilia de TNF trimérico unido al receptor requerido en una muestra que comprende el compuesto y comparar el nivel del miembro de la superfamilia de TNF trimérico unido al receptor requerido con una muestra control; y
c) poner en contacto los receptores de la superfamilia de TNF con un miembro de la superfamilia de TNF y un complejo compuesto-trímero y detectar si el compuesto de ensayo previene o reduce la señalización del trímero del miembro de la superfamilia de TNF a través del receptor de la superfamilia de TNF.
2. El método de la reivindicación 1, que comprende además medir la competición del compuesto con un compuesto sonda para unirse a la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF y comparar el nivel de competición observado con un valor correspondiente de una muestra control.
3. El método de la reivindicación 1, que comprende además:
a) llevar a cabo un análisis espectrométrico de masas en una muestra que contiene el miembro de la superfamilia de TNF y el compuesto para detectar la cantidad del trímero del miembro de la superfamilia de TNF; y b) comparar la cantidad de trímero de miembro de la superfamilia de TNF en la muestra con una muestra control.
4. El método de la reivindicación 1, que comprende:
a) realizar un ensayo de unión receptor-ligando en el que se aplica una muestra del miembro de la superfamilia de TNF y el compuesto al receptor de TNF requerido que se ha unido a una superficie; y
b) comparar la cantidad de trímero de miembro de la superfamilia de TNF unido al receptor de TNF requerido con una muestra control.
5. El método de la reivindicación 2, que comprende:
a) realizar un ensayo de polarización de fluorescencia usando el compuesto y un compuesto sonda; y b) comparar el grado de polarización del compuesto sonda en presencia del compuesto con el grado de polarización en una muestra control.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la muestra que contiene el miembro de la superfamilia de TNF y el compuesto comprende además un agente desestabilizador, opcionalmente en donde el agente desestabilizador es dimetilsulfóxido (DMSO).
7. El método de la reivindicación 1, que comprende:
a) realizar un análisis calorimétrico isotérmico para medir la unión del miembro de la superfamilia de TNF por el receptor requerido en presencia del compuesto; y
b) comparar la unión del miembro de la superfamilia de TNF por el receptor requerido con una muestra control.
8. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa (b) comprende medir la afinidad de unión del miembro de la superfamilia de TNF trimérico al receptor requerido en una muestra que comprende el compuesto.
9. El método de la reivindicación 1 u 8, que comprende:
a) realizar un ensayo para determinar la afinidad de unión por un receptor de la superfamilia (Kü-r) de la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF en una muestra del miembro de la superfamilia de TNF y el compuesto;
y b) comparar la Kü-r de la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF en la muestra con una muestra control.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el aumento de la estabilidad da como resultado un aumento de la Tm de la forma trimérica del miembro de la superfamilia de TNF:
(a) de al menos 1 °C;
(b) de al menos 10 °C; o
(c) entre 10 °C y 20 °C.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el compuesto aumenta la afinidad de unión del miembro de la superfamilia de TNF al receptor requerido en comparación con la afinidad de unión del miembro de la superfamilia de TNF a su receptor en ausencia del compuesto.
12. El método de la reivindicación 11, en donde:
(a) el compuesto aumenta la afinidad de unión del miembro de la superfamilia de TNF al receptor requerido al aumentar la velocidad de activación (kon-r) y/o disminuyendo la velocidad de inactivación (koff-r) comparado con los valores de kon-r y koff-r para la unión del miembro de la superfamilia de TNF a su receptor en ausencia del compuesto; o
(b) el compuesto aumenta la afinidad de unión del miembro de la superfamilia de TNF al receptor requerido al aumentar la velocidad de activación (kon-r) comparado con el valor de kon-r para la unión del miembro de la superfamilia de TNF a su receptor en ausencia del compuesto.
13. El método de la reivindicación 11 o 12, en donde:
(a) el compuesto disminuye la KD-r del miembro de la superfamilia de TNF al receptor requerido en comparación con la KD-r del miembro de la superfamilia de TNF a su receptor en ausencia del compuesto, en donde:
(i) el compuesto disminuye la KD-r del miembro de la superfamilia de TNF al receptor requerido en al menos 10 veces en comparación con la KD-r del miembro de la superfamilia de TNF a su receptor en ausencia del compuesto;
(ii) el valor de KD-r del miembro de la superfamilia de TNF para unirse al receptor requerido en presencia del compuesto es menos de 10 nM; o
(b) el compuesto disminuye la KD-r del miembro de la superfamilia de TNF al receptor requerido en comparación con la KD-r del miembro de la superfamilia de TNF a su receptor en ausencia del compuesto, en donde:
(i) el compuesto disminuye la KD-r del miembro de la superfamilia de TNF al receptor requerido en al menos 4 veces en comparación con la KD-r del miembro de la superfamilia de TNF a su receptor en ausencia del compuesto;
(ii) el valor de KD-r del miembro de la superfamilia de TNF para unirse al receptor requerido en presencia del compuesto es menos de 600 pM, opcionalmente menos de 200 pM.
14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho compuesto tiene un valor de CI50 de 500 nM o menos.
15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el miembro de la superfamilia de TNF es TNFa y el receptor es el receptor de TNF.
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