ES2948915T3 - Novedosa estructura de TNFá para su uso en terapia - Google Patents

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John Robert Porter
Alastair Lawson
Boris Kroeplien
Stephen Edward Rapecki
Timothy John Norman
Graham John Warrellow
Tracy Lynn Arakaki
Alex Buntin Burgin
William Ross Pitt
Mark Daniel Calmiano
David Andreas Schubert
Daniel John Lightwood
Rebecca Jayne Wootton
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Abstract

Se divulga una nueva estructura trimérica estable de TNFα con simetría distorsionada que puede unirse al receptor TNFR1 para atenuar la señalización del mismo, que puede usarse en el tratamiento y/o prevención de enfermedades asociadas con la interacción TNFα/TNFR1 soluble. El TNFα unido a membrana no se ve afectado en su capacidad de enviar señales a través de TNFR2 y, por lo tanto, la nueva estructura del TNFα puede usarse en terapias que no aumentan significativamente el riesgo de infección o malignidad. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Novedosa estructura de TNFα para su uso en terapia
Campo de la invención
Esta invención se refiere a novedosas estructuras de TNFα estables, asimétricas y triméricas y su uso en terapia. La invención se refiere en particular a complejos de estructuras de TNFα triméricas con moléculas pequeñas que pueden unirse al receptor TNFR1, pero atenuar la señalización a partir del mismo, que se puede usar en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades. La divulgación se refiere además a cristales de las estructuras y complejos de TNFα triméricos asimétricos. La invención también se refiere al uso de modelos de estructura en 3-D obtenidos a partir de dichos cristales en métodos para la determinación de novedosos inhibidores de TNFα trimérico.
Antecedentes de la invención
La superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF, del inglés "Tumour Necrosis Factor") es una familia de proteínas que comparten una función primaria de regulación de la supervivencia y la muerte celulares. Los miembros de la superfamilia del TNF comparten un motivo central común, que consiste en dos láminas β plegadas antiparalelas con cadenas β antiparalelas, que forman una estructura β de tipo "jelly roll" (brazo de gitano). Otra característica común compartida por los miembros de la superfamilia del TNF es la formación de complejos homo o heterotriméricos. Son estas formas triméricas de los miembros de la superfamilia del TNF las que se unen, y activan, receptores de la superfamilia del TNF específicos.
El TNFα es el miembro arquetípico de la superfamilia del TNF, que forma un homotrímero simétrico. Se ha implicado a la desregulación de la producción del TNFα en una serie de afecciones patológicas de gran importancia médica. Por ejemplo, se ha implicado al TNFα en la artritis reumatoide, enfermedades inflamatorias intestinales (incluyendo la enfermedad de Crohn), psoriasis, enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), dolor, epilepsia, osteoporosis, asma, lupus eritematoso sistémico (LES) y esclerosis múltiple (EM). También se ha implicado a otros miembros de la superfamilia del TNF en afecciones patológicas, incluyendo enfermedades autoinmunitarias.
Los antagonistas convencionales de los miembros de la superfamilia del TNF son macromoleculares y actúan inhibiendo la unión del miembro de la superfamilia del TNF a su receptor. Los ejemplos de antagonistas convencionales incluyen anticuerpos anti-TNFα, particularmente anticuerpos monoclonales, tales como infliximab (Remicade®), adalimumab (Humira®) y certolizumab pegol (Cimzia®), o proteínas de fusión de receptores del TNFα solubles, tales como etanercept (Enbrel®). Ambos inhiben el TNFα soluble y su interacción con el receptor TNFR1 (responsable de la inflamación) y el TNFα unido a membrana y su interacción con el receptor TNFR2 (implicado en la respuesta inmunitaria).
Hc et al (2005) Science, 310, 1022-1025 desvela un inhibidor de molécula pequeña de TNFα que promueve el desensamblaje de subunidades. El documento US 2002/110868 desvela proteínas con actividad antagonista de TNFα y ácidos nucleicos que codifican estas proteínas. El documento US 7.993.636 desvela mutantes de TNFα. Vol et al (1989) The Journal of Biological Chemistry, 264, 17595-17605 desvela la estructura del TNFα.
Sumario de la invención
Los presentes inventores han obtenido un amplio entendimiento estructural de una nueva, estructura trimérica asimétrica estable de TNFα. Este trímero del TNFα actúa uniéndose a TNFR1, pero es menos capaz, o incapaz, de iniciar la señalización cadena abajo de TNFR1. Este trímero del TNFα puede adoptar esta estructura formando un complejo con una clase de pequeñas entidades moleculares (SME) en el centro del trímero. Los presentes inventores también han obtenido un amplio entendimiento estructural de dichos compuestos, el farmacóforo que puede inducir la estructura asimétrica de TNFα trimérico, y las interacciones clave de los residuos dentro del trímero del TNFα que contactan con el farmacóforo para inducir el trímero del TNFα asimétrico. Estos trímeros y complejos de TNFα asimétricos pueden usarse en el tratamiento de afecciones mediadas por TNFα. Los presentes inventores también han descubierto que los trímeros y complejos de TNFα unidos a la membrana no interrumpen la señalización cadena abajo de TNFR2. Por último, los presentes inventores han identificado formas cristalinas del trímero del TNFα asimétricas novedosas que se pueden usar en métodos basados en estructuras de diseño racional de fármacos para determinar compuestos novedosos que pueden inducir el trímero del TNFα asimétrico.
Por consiguiente, la presente invención proporciona un complejo que comprende un trímero del TNFα asimétrico de una subunidad de proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36, o la secuencia correspondiente, y un compuesto que es capaz de unirse al trímero del TNFα, en donde:
- dicho trímero del TNFα adopta una conformación, cuando se determina mediante radiocristalografía, con los átomos de Cα de los residuos 12-18, 47-50, 54-64, 76-82, 91-97, 117-125, 129-137 y 150-156 de la SEQ ID NO: 36, o la secuencia correspondiente, para todas las subunidades dentro de 0,9 Å RMSD de los mismos átomos del Compuesto34.pdb de estructura de referencia; y
el compuesto, como se determina mediante radiocristalografía, comprende un farmacóforo que se une dentro del trímero del TNFα de modo que está dentro de 4 Å de todos los siguientes residuos de la SEQ ID NO: 36: Leu57 de la subunidad A; Tyr119 de la subunidad B; Gly121 de la subunidad B; Gly122 de la subunidad B; Tyr59 de la subunidad C; Leu120 de la subunidad C; y Tyr151 de la subunidad C, o los residuos correspondientes de la secuencia correspondiente, y en donde el farmacóforo consiste en 2 anillos fusionados ("R3" y "R2"), en donde R3 es un anillo heteroaromático o aromático de seis miembros y R2 es un anillo heteroaromático de cinco miembros, y R2 tiene un aceptor de enlaces H ("A1") y que también está sustituido, a través de un átomo de enlace que no es hidrógeno, a un anillo de 5 o 6 miembros adicional ("R4"),
en donde dicho complejo es capaz de unirse a TNFR1, pero en donde la señalización de dicho TNFR1 unido se atenúa o antagoniza, para su uso en un método de terapia puesto en práctica en el cuerpo humano o animal.
En el presente documento, las expresiones "trímero asimétrico de TNFα", "trímero del TNFα asimétrico" o "trímero del TNFα de la invención" se usan indistintamente para significar lo mismo. En el presente documento, el trímero del TNFα de la invención es de origen no natural (dada la naturaleza de su conformación asimétrica). "Antagonistas" o "antagonismo" del receptor TNFR1 pueden entenderse a partir del uso de los términos en el presente documento, y, por ejemplo, tienen la intención general de representar los medios que dan como resultado una prevención o reducción funcional de la señalización de TNFR1 independientemente del mecanismo de acción (salvo que se indique lo contrario). En el presente documento "y/o" significa "y u o".
La invención también proporciona un ordenador que comprende un código ejecutable para:
a) usar las coordenadas estructurales de un trímero del TNFα de acuerdo con cualquiera de Compuesto1.pdb a Compuesto64.pdb como un modelo tridimensional de un trímero del TNFα asimétrico;
b) analizar un bolsillo de unión en el centro del trímero en el modelo tridimensional; y
c) cribar in silico la biblioteca para moléculas pequeñas que encajen en dicho sitio de unión.
Además, la invención proporciona un método para identificar un inhibidor potencial de un trímero de apo TNFα, que comprende las etapas de:
a) usar las coordenadas estructurales de un trímero del TNFα de acuerdo con cualquiera de Compuesto1.pdb a Compuesto64.pdb para generar un modelo tridimensional de un trímero del TNFα asimétrico;
b) identificar residuos de un bolsillo de unión en el centro del trímero en el modelo tridimensional;
c) generar una diana en 3-D específica usando los residuos del sitio de unión;
d) emplear la diana en 3-D específica para diseñar o seleccionar un inhibidor potencial del trímero del TNFα; e) obtener el inhibidor potencial; y
f) poner en contacto el inhibidor potencial con un trímero de apo TNFα in vitro para determinar la capacidad de dicho inhibidor potencial para interactuar con dicho trímero de apo TNFα,
de modo que la capacidad de interactuar es una indicación de que se determina dicho inhibidor potencial del trímero de apo TNFα.
Finalmente, la invención proporciona un método para diseñar un compuesto que se une a un trímero de apo TNFα que comprende las etapas de:
a) usar las coordenadas atómicas de un trímero del TNFα de acuerdo con cualquiera de Compuesto1.pdb a Compuesto64.pdb para construir un modelo informático tridimensional de un bolsillo de unión en el centro del trímero del TNFα;
b) evaluar la complementariedad estereoquímica entre un compuesto y el bolsillo de unión;
c) optimizar la complementariedad estereoquímica en un enfoque iterativo mediante la observación de cambios en la proteína o compuesto que afectan a las asociaciones proteína/compuesto; y
d) diseñar un compuesto que optimice dicha complementariedad estereoquímica proteína/compuesto.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra las estructuras de los compuestos de fórmulas (1) -(64) y (65).
La Figura 2A muestra los resultados de un cribado (ensayo de descubrimiento de mesoescala, MSD) de compuestos de prueba que afectan a la unión de TNFα al receptor de TNF. Se investigaron múltiples compuestos de prueba y se calculó el nivel del % de inhibición de la unión de TNFα al receptor de TNF. La Figura 2B muestra una curva de respuesta a la dosis para el compuesto de fórmula (3) usando este ensayo. La Figura 2C muestra la curva de respuesta a la dosis para el compuesto de fórmula (15).
La Figura 3A muestra un ensayo de unión receptor-ligando que demuestra la unión potenciada de TNF al dominio extracelular (ECD) de TNFR1 en presencia del compuesto de fórmula (3). La Figura 4B muestra la unión potenciada inducida por el compuesto de fórmula (15) en el mismo ensayo.
La Figura 4 (trazo inferior) muestra el espectrograma de masas desconvolucionado de TNFα en una solución acuosa al 100 %. La Figura 4 (trazo superior) muestra el espectrograma de masas desconvolucionado de TNFα en una solución que contiene DMSO al 10 % v/v. La Figura 4 (trazo medio) muestra el espectrograma de masas desconvolucionado de TNFα en una solución que contiene DMSO al 10 % v/v y compuesto de fórmula (3).
La Figura 5 muestra el espectrograma de masas de TNFα en una solución que contiene el compuesto de fórmula (3).
La Figura 6 muestra una superposición del perfil de elución de un experimento de cromatografía de exclusión por tamaño y posterior análisis espectrométrico de masas de (A) una muestra de TNFα preincubada con el compuesto de fórmula (3) y después mezclada con TNF-R y (B) una muestra de TNFα preincubada con TNF-R y después mezclada con el compuesto de fórmula (3).
La Figura 7 muestra (A) los resultados del análisis calorimétrico isotérmico de la unión de TNFα a TNF-R y (B) los resultados del análisis calorimétrico isotérmico de la unión de TNFα a TNF-R en donde el TNFα se ha preincubado con el compuesto de fórmula (15).
La Figura 8 muestra la estructura cristalina de un complejo compuesto de fórmula (3)-TNFα trimérico.
La Figura 9 muestra un gráfico de la neutralización del TNFα humano por el compuesto de fórmula (3) y el compuesto de fórmula (15) medido en términos de concentración del compuesto de fórmula (3) y el compuesto de fórmula (15) frente a la concentración residual de TNFα humano (μg/ml) medida usando un ensayo de destrucción de células de fibrosarcoma murino L929.
La Figura 10 muestra un gráfico de la concentración del compuesto de fórmula (3) (nM) frente al % de producción relativa de IL-8 en monocitos humanos tratados con TNFα.
La Figura 11 muestra un gráfico de la concentración del compuesto de fórmula (15) (nM) frente al % de inhibición de la activación de NF-κB en células HEK293 en presencia de (A) TNFα (0,5 ng/ml), (B) IL-1 β (0,5 ng/ml) y (C) un anticuerpo de activación de TNF-R1 (300 ng/ml).
La Figura 12A muestra la cinética de unión del compuesto de fórmula (3) con TNFα a lo largo del tiempo medida usando resonancia de plasmón superficial. La Figura 12B muestra la cinética de unión del compuesto de fórmula (15) con TNFα. La Figura 12C muestra la cinética de unión del compuesto de fórmula (39) con TNFα.
La Figura 13 muestra el nivel de reclutamiento de neutrófilos en respuesta a TNFα solo o TNFα que se ha preincubado con concentraciones crecientes de (A) el compuesto de fórmula (3) o (B) el compuesto de fórmula (15) y administrado por inyección intraperitoneal (i.p.).
La Figura 14 muestra el nivel de reclutamiento de neutrófilos en respuesta a TNFα, solo o en presencia de concentraciones crecientes del compuesto de fórmula (3) administrado por vía oral.
La Figura 15 es un gráfico de los resultados de un ensayo de polarización de fluorescencia (FP) usando compuestos de prueba de fórmula (3), (15) y (39). Las concentraciones del compuesto de prueba se representan frente al % de inhibición de la unión del conjugado de fluorescencia a TNFα.
La Figura 16 muestra una superposición de RMSD de los átomos de Cα de las láminas β de las estructuras del trímero del TNFα distorsionadas, el Compuesto 1-33,35-63 con el Compuesto 34 de estructura de referencia en negrita.
La Figura 17 muestra una superposición de RMSD de los átomos de Cα de las láminas β de la estructura del trímero del TNFα distorsionada, el Compuesto 64 con el Compuesto 34 de estructura de referencia en negrita. La Figura 18 muestra un gráfico que ilustra el porcentaje de ligandos de las 64 estructuras del trímero del TNFα distorsionadas que están dentro de 4 Å de un residuo específico en el trímero del TNFα.
La Figura 19 muestra una imagen del núcleo de la estructura del trímero del TNFα distorsionada del Compuesto 1 que resalta todos los residuos que están dentro de 4 Å del ligando en el 100 % de las 64 estructuras.
La Figura 20 muestra un ejemplo del farmacóforo que puede encajar dentro de la estructura del trímero del TNFα distorsionada de la invención que muestra la posición de los centros R2, R3 y R4 de las tres características del anillo, y la posición de la característica A1 del aceptor de enlaces de hidrógeno dentro del anillo R2.
La Figura 21 es un gel que muestra el efecto de los compuestos descritos en el presente documento (que inducen la estructura del trímero del TNFα soluble distorsionada) sobre la señalización de TNFR2 proximal y cadena abajo inducida por TNFα de membrana; la unión de los compuestos al TNFα de membrana sobreexpresado en células NS0 no afecta a la señalización proximal a la membrana específica de TNFR2 (reclutamiento de TRAF-2 a TNFR2) y cadena abajo (presencia de pNFxB en lisados de células enteras).
Breve descripción del listado de secuencias
La SEQ ID NO: 1 muestra la LCDR1 de CA185_01974.0.
La SEQ ID NO: 2 muestra la LCDR2 de CA185_01974.0.
La SEQ ID NO: 3 muestra la LCDR3 de CA185_01974.0.
La SEQ ID NO: 4 muestra la HCDR1 de CA185_01974.0.
La SEQ ID NO: 5 muestra la HCDR2 de CA185_01974.0.
La SEQ ID NO: 6 muestra la HCDR3 de CA185_01974.0.
La SEQ ID NO: 7 muestra la secuencia de aminoácidos de la LCVR de CA185_01974.0.
La SEQ ID NO: 8 muestra la secuencia de aminoácidos de la HCVR de CA185_01974.0.
La SEQ ID NO: 9 muestra la secuencia de ADN de la LCVR de CA185_01974.0.
La SEQ ID NO: 10 muestra la secuencia de ADN de la HCVR de CA185_01974.0.
La SEQ ID NO: 11 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera κ de CA185_01974.0.
La SEQ ID NO: 12 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada mIgG1 de CA185_01974.0.
La SEQ ID NO: 13 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de mFab (sin bisagra) de CA185_01974.0.
La SEQ ID NO: 14 muestra la secuencia de ADN de la cadena ligera κ de CA185_01974.0.
La SEQ ID NO: 15 muestra la secuencia de ADN de la cadena pesada de mIgG1 de CA185_01974.0.
La SEQ ID NO: 16 muestra la secuencia de ADN de la cadena pesada mFab (sin bisagra) de CA185_01974.0. La SEQ ID NO: 17 muestra la LCDR2 de CA185_01979.0.
La SEQ ID NO: 18 muestra la LCDR3 de CA185_01979.0.
La SEQ ID NO: 19 muestra la HCDR1 de CA185_01979.0.
La SEQ ID NO: 20 muestra la HCDR2 de CA185_01979.0.
La SEQ ID NO: 21 muestra la HCDR3 de CA185_01979.0.
La SEQ ID NO: 22 muestra la secuencia de aminoácidos de la LCVR de CA185_01979.0.
La SEQ ID NO: 23 muestra la secuencia de aminoácidos de la HCVR de CA185_01979.0.
La SEQ ID NO: 24 muestra la secuencia de ADN de la LCVR de CA185_01979.0.
La SEQ ID NO: 25 muestra la secuencia de ADN de la HCVR de CA185_01979.0.
La SEQ ID NO: 26 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera κ de CA185_01979.0.
La SEQ ID NO: 27 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada mIgG1 de CA185_01979.0. La SEQ ID NO: 28 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de mFab (sin bisagra) de CA185_01979.0.
La SEQ ID NO: 29 muestra la secuencia de ADN de la cadena ligera κ de CA185_01979.0.
La SEQ ID NO: 30 muestra la secuencia de ADN de la cadena pesada de mIgG1 de CA185_01979.0.
La SEQ ID NO: 31 muestra la secuencia de ADN de la cadena pesada mFab (sin bisagra) de CA185_01979.0. La SEQ ID NO: 32 muestra la secuencia de aminoácidos del TNFα de rata.
La SEQ ID NO: 33 muestra la secuencia de aminoácidos del TNFα de ratón.
La SEQ ID NO: 34 muestra la secuencia de aminoácidos del TNFα humano.
La SEQ ID NO: 35 muestra la secuencia de aminoácidos de la forma soluble del TNFα humano.
La SEQ ID NO: 36 muestra la secuencia de aminoácidos de la forma soluble del TNFα humano, pero sin la "S" inicial (que es un artefacto de clonación en la SEQ ID NO: 35)
Descripción detallada de la invención
La invención se refiere a un trímero asimétrico de TNFα de una subunidad de proteína que comprende (o consiste en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36, o la secuencia correspondiente, en donde dicho trímero del TNFα adopta una conformación, cuando se determina mediante radiocristalografía, con los átomos de Cα de los residuos 12-18, 47-50, 54-64, 76-82, 91-97, 117-125, 129-137 y 150-156 de la SEQ ID NO: 36, o la secuencia correspondiente, para todas las subunidades dentro de 0,9 Å RMSD [desviación cuadrática media] de los mismos átomos del Compuesto34.pdb de estructura de referencia, pudiendo unirse dicho trímero de TNF-α a TNFR1, pero en donde la señalización de dicho TNFR1 unido se atenúa o antagoniza, para su uso en un método de terapia puesto en práctica en el cuerpo humano o animal.
El trímero del TNFα asimétrico o el trímero del TNFα distorsionado o el trímero del TNFα de la presente invención son estructuras novedosas de TNFα donde el eje de simetría triple normal entre las subunidades en el trímero del TNFα simétrico o apo (Eck y Sprang 1989 JBC 264:17595-605) se altera de modo que el trímero todavía se une a TNFR1, pero en donde la señalización de dicho TNFR1 unido se atenúa o se antagoniza o se inhibe completamente. Las estructuras del trímero apo TNFα son bien conocidas en la técnica, tales como 1A8M del Banco de Datos de Proteínas (PDB).
La expresión "secuencia correspondiente" indica que el trímero del TNFα de la invención puede tener la secuencia de amino de tipo silvestre de cualquier TNFα animal o humano conocido, en particular el TNFα humano, por ejemplo, la SEQ ID NO: 36. Puede ser TNFα soluble (sTNFα) o TNFα unido a membrana, o ambos. El TNFα homotrimérico soluble (sTNF) se libera del TNFα homotrimérico unido a la membrana (mTNF) mediante escisión proteolítica por la enzima convertidora de metaloproteasa TNF alfa (TACE/ADAM17; aunque otras proteinasas también pueden liberar sTNF tales como ADAM10, ADAM19, metaloproteinasa 7 de matriz y proteinasa 3 que pueden producir secuencias del TNFα solubles correspondientes que pueden extenderse o truncarse en 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos en relación con un sTNFα escindido con TACE tal como la SEQ ID NO: 36). El sTNF trimérico soluble de 52 kDa adopta una forma de pirámide triangular. Una secuencia humana abarcada por el término mTNF se muestra en la SEQ ID NO: 34, y una secuencia humana abarcada por el término sTNF (el producto de la acción de TACE sobre la SEQ ID NO: 34) se muestra en la SEQ ID NO: 36. Las secuencias correspondientes del mTNFα de rata y ratón se presentan en las SEQ ID NO: 32 y 33, respectivamente. Las secuencias correspondientes del TNFα de otros animales (o variantes conocidas de la secuencia humana) pueden superponerse fácilmente con la secuencia SEQ ID NO: 36 y recibir la misma numeración de aminoácidos que para la SEQ ID NO: 36 (utilizada en la numeración de los aminoácidos del TNFα en el presente documento). Por ejemplo, la secuencia de varios animales se puede encontrar en la base de datos de Uniprot (www.uniprot.org) que incluye las secuencias humanas P01375 y Q5STB3. Las secuencias del sTNFα correspondientes pueden ser el extremo C-terminal de 157 aminoácidos de la secuencia del mTNFα (como la SEQ ID NO: 36) o pueden ser más largas o más cortas en uno, dos o tres aminoácidos (las secuencias de rata y ratón son de 156 aminoácidos). La secuencia del sTNFα correspondiente puede tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 sustituciones de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 36. La secuencia del sTNFα correspondiente puede tener una identidad de secuencia de aminoácidos de un 80, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % con la SEQ ID NO: 36 a lo largo de la SEQ ID NO: 36.
Los trímeros de TNFα de la invención tienen una estructura asimétrica común, como se determina mediante radiocristalografía (por ejemplo, por los métodos detallados en los Ejemplos 18 y 19). Los trímeros de TNFα de la invención se pueden confirmar superponiendo las coordenadas atómicas de los átomos de Cα de los residuos 12-18, 47-50, 54-64, 76-82, 91-97, 117-125, 129-137 y 150- 156 (los residuos de lámina β) de la SEQ ID NO: 36, o la secuencia correspondiente, para todas las subunidades y estableciendo que están dentro de 0,9 Å RMSD [desviación cuadrática media] de los mismos átomos del Compuesto34.pdb de estructura de referencia (por ejemplo, como se describe en el ejemplo 19).
Las secuencias correspondientes de los residuos de lámina β de cualquier secuencia de TNFα pueden determinarse fácilmente. Por ejemplo, las secuencias de sTNFα de rata y ratón son los 156 aminoácidos C-terminales de mTNFα en lugar de los 157 de la SEQ ID NO:36. Se puede determinar fácilmente que los correspondientes residuos de lámina β para la superposición en, por ejemplo, la secuencia de sTNFα de rata (de la secuencia de mTNFα SEQ ID NO:32) son los residuos 12-18, 47-50, 54-64, 75-81, 90-96, 116-124, 128-136 y 149-155.
Las coordenadas atómicas para 64 estructuras se dan en los Datos complementarios de la presente invención, a cada estructura se le dio el nombre de "Compuesto X", que es equivalente al término "CompuestoX.pdb", siendo X el número de fórmula (X) del Compuesto de la Figura 1 que se encuentra en el centro de cada trímero. Las coordenadas atómicas para el Compuesto34.pdb de estructura de referencia (la estructura que es la más promedio de las 64) pueden cargarse fácilmente en el software apropiado para que tenga lugar la superposición.
Al llevar a cabo la superposición, las cadenas de subunidades del trímero deberán asignarse con las etiquetas de subunidad A, B y C. Qué cadena es A, B o C pueden determinarse midiendo tres distancias en la estructura determinada por radiocristalografía entre tres átomos C-alfa de tres residuos idénticos, por ejemplo, P117 en cada cadena (P116 en la secuencia de sTNFα de ratón); (G121 también es apropiado).
Las tres distancias forman un triángulo que es equilátero en apo TNFα pero distorsionado en las estructuras asimétricas de TNFα de la invención. La distancia más corta es entre BC y la más larga entre AC (por ejemplo, AC = 13,8 Å, AB = 12,3 Å, BC = 10,2 Å); por lo tanto, si se mira hacia abajo a través del eje de la molécula con los terminales N/C apuntando hacia ti, la distancia más larga define las cadenas C y luego A que van en sentido antihorario, después B y C de nuevo continuando en sentido antihorario.
La determinación de que los trímeros de TNF-α de la invención pueden unirse a TNFR1, pero la señalización de dicho TNFR1 unido se atenúa o antagoniza, puede llevarse a cabo mediante cualquiera de los métodos apropiados analizados en el presente documento (por ejemplo, en los ejemplos 6, 7, 8, 9, 10 [el Ensayo de gen indicador], 12). Dadas las ventajosas propiedades de los trímeros de TNF-α de la invención, son para su uso en un método de terapia puesto en práctica en el cuerpo humano o animal.
Los trímeros de TNF-α de la invención pueden administrarse al cuerpo humano o animal directa o indirectamente. Por "indirectamente" se entiende que el trímero de TNF-α simétrico que ya se encuentra en el animal o ser humano puede convertirse en trímeros de TNF-α asimétrico de la invención que pueden usarse para terapia. En una realización, los trímeros de TNF-α de la invención pueden administrarse indirectamente al cuerpo humano o animal mediante la administración al animal o ser humano de un compuesto descrito en el presente documento [por ejemplo, los compuestos (1)-(65)], que pueden, por ejemplo, provocar la formación de un complejo de la invención como se describe en el presente documento que puede usarse en terapia.
El trímero del TNFα de la invención puede ser para su uso en el tratamiento y/o la prevención de uno o más trastornos autoinmunitarios, trastornos inflamatorios, trastornos neurológicos, trastornos neurodegenerativos, trastornos de dolor, trastornos nociceptivos o trastornos cardiovasculares. Por ejemplo, para su uso en el tratamiento y/o la prevención de uno o más de artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, psoriasis, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y epilepsia.
En un aspecto en el presente documento, la RMSD está dentro de 0,85, 0,8, 0,7, 0,65, 0,6, 0,5 o 0,47 Å.
En un aspecto adicional de la divulgación se proporciona, de forma similar, un método para tratar y/o prevenir uno o más de trastornos autoinmunitarios, trastornos inflamatorios, trastornos neurológicos, trastornos neurodegenerativos, trastornos de dolor, trastornos nociceptivos o trastornos cardiovasculares, administrando directa o indirectamente a un paciente que lo necesite un trímero del TNFα asimétrico de una subunidad de proteína que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36, o la secuencia correspondiente, en donde dicho trímero del TNFα adopta una conformación, cuando se determina mediante radiocristalografía, con los átomos de Cα de los residuos 12-18, 47-50, 54-64, 76-82, 91-97, 117-125, 129-137 y 150-156 de la SEQ ID NO: 36, o la secuencia correspondiente, para todas las subunidades dentro de 0,9 Å RMSD de los mismos átomos del Compuesto34.pdb de estructura de referencia, pudiendo unirse dicho trímero de TNF-α a TNFR1, pero en donde la señalización de dicho TNFR1 unido se atenúa o antagoniza.
En un aspecto de la realización anterior, la conformación del trímero del TNFα de la invención se puede obtener o se obtiene a través del trímero del TNFα que forma un complejo con uno cualquiera de los compuestos (1)-(65).
En realizaciones particulares de la invención: el trímero del TNFα antagoniza la señalización del receptor TNFR1 (medida, por ejemplo, mediante métodos desvelados en el presente documento); el trímero del TNFα tiene una mayor estabilidad en comparación con la estabilidad de un trímero del TNFα simétrico (medida, por ejemplo, mediante métodos desvelados en el presente documento), por ejemplo el aumento de la estabilidad da como resultado un aumento del punto medio de transición térmica (Tm) del trímero del TNFα de al menos 1 °C, de al menos 10 °C, o está entre 10 °C y 20 °C (medido, por ejemplo, mediante métodos desvelados en el presente documento); el trímero del TNFα tiene una mayor afinidad de unión al receptor TNFR1 en comparación con la afinidad de unión de un trímero del TNFα simétrico al receptor TNFR1 (medida, por ejemplo, mediante métodos desvelados en el presente documento); el trímero del TNFα tiene una mayor afinidad de unión al receptor TNFR1 aumentando la velocidad de asociación (konr) y/o disminuyendo la velocidad de disociación (koff-r) en comparación con los valores de kon-r y koff-r para la unión del trímero del TNFα simétrico al receptor TNFR1 (medida, por ejemplo, mediante métodos desvelados en el presente documento); el trímero del TNFα tiene una mayor afinidad de unión al receptor TNFR1 aumentando la velocidad de asociación (kon-r) en comparación con el valor de kon-r para la unión del trímero del TNFα simétrico al receptor TNFR1 (medida, por ejemplo, mediante métodos desvelados en el presente documento).
En una realización adicional, y como se describe más adelante en el presente documento, la KD-r del trímero del TNFα al receptor TNFR1 se reduce en comparación con la KD-r del trímero del TNFα simétrico al receptor TNFR1, en donde: a) la KD-r del trímero del TNFα al receptor TNFR1 se reduce en al menos 10 veces en comparación con la KD-r del trímero del TNFα simétrico al receptor TNFR1;
b) el valor de KD-r del trímero del TNFα al receptor TNFR1 es menor de 10 nM.
En una realización adicional, y como se describe más adelante en el presente documento, la KD-r del trímero del TNFα al receptor TNFR1 se reduce en comparación con la KD-r del trímero del TNFα simétrico al receptor TNFR1, en donde: a) la KD-r del trímero del TNFα al receptor TNFR1 se reduce en al menos 4 veces en comparación con la KD-r del trímero del TNFα simétrico al receptor TNFR1;
b) el valor de KD-r del trímero del TNFα al receptor TNFR1 es menor de 600 pM, por ejemplo, menor de 200 pM. En una realización adicional, el trímero del TNFα de la invención se une a cualquiera de los siguientes anticuerpos con una KD-ab de 1 nM o menos: CA185_1979 con una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 26 y cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 27; o CA185_1974 con una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 11 y cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 12 (véase en el presente documento, para métodos de medición e información adicional sobre estos anticuerpos que son específicos para el trímero del TNFα de la invención). Puede decirse que mediante dicha unión, el trímero del TNFα de la invención ha adoptado una conformación asimétrica "estable".
El gran número de estructuras cristalinas desveladas en el presente documento ha dado como resultado el entendimiento estructural del trímero del TNFα de la invención, en particular, un entendimiento claro de la naturaleza de la hendidura o cavidad o sitio de unión en el centro del trímero del TNFα de la invención (véase el ejemplo 20 y 21). En particular, la forma de la cavidad se puede ocupar con un compuesto que forma un complejo con el trímero del TNFα de la invención para estabilizar su ventajosa conformación asimétrica. El ejemplo 20 describe los residuos del trímero del TNFα que siempre están implicados en establecer contactos <4 Å con dichos compuestos (por ejemplo, los compuestos (1)-(64)), y el ejemplo 21 describe un farmacóforo que puede estar comprendido dentro de un compuesto que se entiende que es necesario para establecer estos contactos. Este entendimiento permite fácilmente a los expertos en la materia utilizar el farmacóforo como base para diseñar muchos compuestos diferentes que pueden estabilizar los complejos de la presente invención.
Tal como se ha expuesto anteriormente, la invención proporciona un complejo que comprende un trímero del TNFα asimétrico de una subunidad de proteína que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36, o la secuencia correspondiente, y un compuesto que es capaz de unirse al trímero del TNFα, de modo que el complejo compuesto-trímero se une a TNFR1 y atenúa o antagoniza la señalización inducida por el trímero a través de TNFR1, en donde el trímero es como se define en las reivindicaciones y en donde el compuesto, como se determina mediante radiocristalografía, comprende un farmacóforo que se une dentro del trímero del TNFα de modo que está dentro de 4 Å de todos los siguientes residuos: Leu57 de la subunidad A; Tyr119 de la subunidad B; Gly121 de la subunidad B; Gly122 de la subunidad B; Tyr59 de la subunidad C; Leu120 de la subunidad C; y Tyr 15 1 de la subunidad C, y en donde el farmacóforo consiste en 2 anillos fusionados ("R3" y "R2"), en donde R3 es un anillo heteroaromático o aromático de seis miembros y R2 es un anillo heteroaromático de cinco miembros, y R2 tiene un aceptor de enlaces H ("A1") y que también está sustituido, a través de un átomo de enlace que no es hidrógeno, a un anillo de 5 o 6 miembros adicional (con centro en "R4"). El complejo es para su uso en un método de terapia puesto en práctica en el cuerpo humano o animal.
El farmacóforo puede tener uno o más de: el anillo R4 que es de 5 o 6 miembros; el anillo R3 que es aromático; el anillo R4 que es aromático; el anillo R2 que es heteroaromático; el anillo R3 que es heteroaromático; el anillo R4 que es heteroaromático; los anillos fusionados que comparten 2 átomos; el átomo de enlace que no es hidrógeno que es carbono, nitrógeno u oxígeno (que a su vez puede ser parte de un anillo adicional del compuesto que enlaza el anillo R2 con el anillo R4 para formar, por ejemplo, un compuesto tricíclico que comprende tres anillos fusionados - véanse los compuestos 48, 49, 51, 52, 60, 61 o 63 por ejemplo); la característica A1 que es a través de un átomo de nitrógeno u oxígeno en el anillo R2 (que puede formar enlaces de hidrógeno con la cadena lateral de Tyr151 en la subunidad C del trímero del TNFα).
Adecuadamente, el sistema pi del anillo R2 heteroaromático forma una interacción CH-pi con (adecuadamente el grupo C-Beta CH2 de) la cadena lateral de Tyr59 en la subunidad C del trímero TNFα.
Adecuadamente, el sistema pi del anillo R3 aromático/heteroaromático forma una interacción de apilamiento pi con el anillo aromático de la cadena lateral de Tyr59 en la subunidad C del trímero TNFα.
Adecuadamente, el sistema pi del anillo R3 aromático/heteroaromático forma una interacción CH-pi con (adecuadamente el grupo C-Delta CH2 de) la cadena lateral de Leu57 en la subunidad A del trímero TNFα.
Generalmente, R4 es un anillo de 5 o 6 miembros.
En una realización, R4 es un anillo de 5 miembros. En un aspecto de esa realización, R4 es un anillo aromático de 5 miembros. En otro aspecto de esa realización, R4 es un anillo heteroaromático de 5 miembros.
En otra realización, R4 es un anillo de 6 miembros. En un aspecto de esa realización, R4 es un anillo aromático de 6 miembros. En otro aspecto de esa realización, R4 es un anillo heteroaromático de 6 miembros.
Adecuadamente, el sistema pi del anillo R4 aromático/heteroaromático forma una interacción CH-pi con (adecuadamente el grupo C-Delta CH2 de) la cadena lateral de Leu57 en la subunidad A del trímero TNFα.
Generalmente, los anillos R3 y R2 fusionados comparten 2 átomos.
En general, el átomo de enlace que no es hidrógeno (el átomo único que enlaza [y por tanto no forma parte de] los anillos R2 y R4) es carbono, nitrógeno u oxígeno. En una primera realización, el átomo de enlace que no es hidrógeno es carbono. En una segunda realización, el átomo de enlace que no es hidrógeno es nitrógeno. En una tercera realización, el átomo de enlace que no es hidrógeno es oxígeno.
Generalmente, A1 es un átomo de nitrógeno u oxígeno en (es decir, parte de) el anillo R2. Adecuadamente, A1 se une con enlaces de hidrógeno a la cadena lateral de Tyr151 en la subunidad C del trímero del TNFα.
Será evidente para el experto en la materia que el farmacóforo representa las características estructurales y/o químicas mínimas del complejo compuesto-trímero y, por lo tanto, que el compuesto puede incluir características estructurales adicionales.
Por ejemplo, el compuesto del complejo compuesto-trímero puede comprender el farmacóforo como se definió anteriormente en donde el átomo de enlace que no es hidrógeno se incorpora en un anillo adicional que enlaza el anillo R2 con el anillo R4, formando así un compuesto tricíclico fusionado (véanse los compuestos 48, 49, 51, 52, 60, 61 o 63, por ejemplo).
El farmacóforo puede tener el anillo R2, R3 y R4, y características A1 dispuestas dentro de la estructura del trímero del TNFα de acuerdo con la siguiente tabla:
Figure imgf000008_0001
En un aspecto adicional, el farmacóforo puede tener una o más de las distancias entre el R2, R3, R4 y características A1 alrededor de, exactamente o dentro del 10 % del valor de acuerdo con la siguiente tabla:
Figure imgf000009_0002
En un aspecto más adicional, el farmacóforo puede tener uno o más de los ángulos entre el R2, R3, R4 y características A1 alrededor de, exactamente o dentro del 10 % del valor de acuerdo con la siguiente tabla:
Figure imgf000009_0001
Ventajosamente, el ángulo R3-R2-R4 del farmacóforo define una forma de plátano que puede estar implicada en la desimetrización del trímero del TNFα de la invención.
El compuesto que comprende el farmacóforo puede tener 20-41 átomos no de hidrógeno y, por ejemplo, puede ser cualquiera de los compuestos (1)-(65).
Como se describe en el presente documento, el complejo de la invención puede ser de manera similar para su uso en un método de terapia puesto en práctica en el cuerpo humano o animal (mediante administración directa [administración del complejo] o indirecta [administración del compuesto]), o puede administrarse directa o indirectamente a un paciente que lo necesite en un método para tratar y/o prevenir uno o más trastornos autoinmunitarios, trastornos inflamatorios, trastornos neurológicos, trastornos neurodegenerativos, trastornos de dolor, trastornos nociceptivos y/o trastornos cardiovasculares; por ejemplo en el tratamiento y/o la prevención de uno o más de artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, psoriasis, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y/o epilepsia.
Como se describe en el presente documento, el complejo de la invención puede comprender de manera similar subunidades de proteína que comprenden o consisten en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36, o la secuencia correspondiente.
El complejo de la invención comprende el trímero del TNFα de la invención.
En realizaciones particulares de la invención: el compuesto dentro del complejo antagoniza la señalización inducida por el trímero del TNFα a través del receptor TNFR1 (medida, por ejemplo, mediante métodos desvelados en el presente documento): el compuesto aumenta la estabilidad del trímero del TNFα en comparación con la estabilidad del trímero del TNFα en ausencia del compuesto (medida, por ejemplo, mediante métodos desvelados en el presente documento), por ejemplo el aumento de la estabilidad da como resultado un aumento del punto medio de transición térmica (Tm) del trímero del TNFα de al menos 1 °C, de al menos 10 °C, o está entre 10 °C y 20 °C; el compuesto aumenta la afinidad de unión del trímero del TNFα al receptor TNFR1 en comparación con la afinidad de unión del trímero del TNFα a al receptor TNFR1 en ausencia del compuesto (medida, por ejemplo, mediante métodos desvelados en el presente documento), por ejemplo el compuesto aumenta la afinidad de unión del trímero del TNFα al receptor TNFR1 aumentando la velocidad de asociación (kon-r) y/o disminuyendo la velocidad de disociación (koff-r) en comparación con los valores de kon-r y koff-r para la unión del trímero del TNFα a al receptor TNFR1 en ausencia del compuesto (como se describe en el presente documento); el compuesto aumenta la afinidad de unión del trímero del TNFα al receptor TNFR1 aumentando la velocidad de asociación (kon-r) en comparación con el valor de kon-r para la unión del trímero del TNFα al receptor TNFR1 en ausencia del compuesto (medida, por ejemplo, mediante métodos desvelados en el presente documento).
En una realización adicional, y como se describe más adelante en el presente documento, el compuesto disminuye la KD-r del trímero del TNFα al receptor TNFR1 en comparación con la KD-r del trímero del TNFα al receptor TNFR1 en ausencia del compuesto, en donde:
a) el compuesto disminuye la KD-r del trímero del TNFα al receptor TNFR1 en al menos 10 veces en comparación con la KD-r del trímero del TNFα al receptor TNFR1 en ausencia del compuesto;
b) el valor de KD-r del trímero del TNFα al receptor TNFR1 en presencia del compuesto es menor de 10 nM. En una realización adicional, y como se describe más adelante en el presente documento, el compuesto disminuye la KD-r del trímero del TNFα al receptor TNFR1 en comparación con la KD-r del trímero del TNFα al receptor TNFR1 en ausencia del compuesto, en donde:
a) el compuesto disminuye la KD-r del trímero del TNFα al receptor TNFR1 en al menos 4 veces en comparación con la KD-r del trímero del TNFα al receptor TNFR1 en ausencia del compuesto;
b) el valor de KD-r del trímero del TNFα al receptor TNFR1 en presencia del compuesto es menor de 600 pM, por ejemplo menor de 200 pM.
En una realización adicional, el compuesto tiene un valor de CI50 de 500 nM o menos (medido, por ejemplo, mediante métodos desvelados en el presente documento).
En una realización adicional de la invención, el complejo se une a cualquiera de los siguientes anticuerpos con una KD-ab de 1 nM o menos: CA185_1979 con una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 26 y cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 27; o CA185_1974 con una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 11 y cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 12 (véase en el presente documento, para métodos de medición e información adicional sobre estos anticuerpos que son específicos para los complejos y el trímero del TNFα de la invención). Puede decirse que mediante dicha unión, el complejo de la invención adopta una conformación asimétrica "estable".
En un aspecto adicional de la divulgación, se proporciona una composición farmacéutica que comprende el complejo de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Los inventores presentan datos que respaldan que el trímero del TNFα de la invención y el complejo de la invención pueden usarse en terapia sin un efecto secundario significativo de las terapias con TNFα existentes.
Los inhibidores del TNFα existentes se unen y neutralizan tanto el TNFα soluble como el unido a la membrana (sTNFα y mTNFα, respectivamente) (Nesbitt et al. Inflamm Bowel Dis 200713:1323-1332).
Se sabe que el sTNFα tiene especificidad por el receptor TNFR1 y el mTNFα por el receptor TNFR2 (Grell et al. Cell 199583:793-802).
Los inhibidores existentes tienen advertencias de recuadro negro en sus etiquetas que describen las posibles consecuencias graves de su uso en el contexto de una infección grave (particularmente TB [tuberculosis], septicemia bacteriana e infecciones fúngicas) y neoplasia maligna (incluyendo linfoma).
Se sabe que la respuesta inmunitaria a la TB (así como a la Listeria) está impulsada por mTNFα (Garcia et al. Capítulo 20 p187-201 "Roles of Soluble and Membrane TNF and Related Ligands in Mycobacterial Infections: Effects of Selective and Non-selective TNF Inhibitors During Infection" en D. Wallach et al. (eds.), Advances in TNF Family Research, Advances in Experimental Medicine and Biology 691, DOI 10.1007/978-1-4419-6612-4_20).
Un inhibidor del TNFα en desarrollo que inhibe selectivamente sTNFα pero no mTNFα tiene las características de atenuar la artritis experimental sin suprimir la inmunidad innata a la infección (Zalevsky et al. J of Immunology 2007 179:1872-1883).
El ejemplo 22 investiga cómo la conformación de mTNFα tras la unión de los compuestos descritos en el presente documento no afecta a la función de TNFR2; la señalización proximal y cadena abajo de TNFR2 no se ve alterada. Por consiguiente, el trímero del TNFα de la invención o el complejo de la invención, puede ser para su uso en un método de terapia puesto en práctica en el cuerpo humano o animal, en donde el uso no induce ni hace que empeore una infección y/o neoplasia maligna. Por ejemplo, la infección es tuberculosis y/o septicemia bacteriana y/o infección fúngica y/o la neoplasia maligna es linfoma.
De forma similar, los inventores prevén en los métodos que la administración al paciente que lo necesite no induzca ni provoque el empeoramiento de una infección y/o neoplasia maligna en dicho paciente. Por ejemplo, la infección es tuberculosis y/o septicemia bacteriana y/o infección fúngica y/o la neoplasia maligna es linfoma.
Ensayos para identificar antagonistas: TNFα de la invención y complejo de la invención
Los presentes inventores han desarrollado ensayos para identificar antagonistas del TNFα. Específicamente, los presentes inventores han desarrollado ensayos que pueden usarse para identificar compuestos que se unen a formas apo triméricas del TNFα y que estabilizan estos trímeros en una conformación que es capaz de unirse al receptor de TNF requerido (TNFR1) y así antagonizar la señalización a través de dicho receptor. Por consiguiente, se desvelan ensayos que son útiles para identificar antagonistas del TNFα.
En particular, los ensayos descritos en el presente documento pueden usarse para identificar compuestos que se unen a formas apo triméricas del TNFα, y que forman un complejo compuesto-trímero que se une al TNFR1.
En un aspecto preferido, los ensayos identifican compuestos que se unen a la forma trimérica del TNFα, pero no a la forma monomérica. En un aspecto particularmente preferido, los compuestos se unen a y estabilizan la forma trimérica del TNFα, no se unen a la forma monomérica y no estabilizan la forma dimérica del TNFα. La estabilización de los trímeros del TNFα por los compuestos de prueba puede producirse por el compuesto de prueba que inhibe el intercambio de unidades monoméricas entre los trímeros.
Los ensayos pueden comprender determinar si un compuesto de prueba potencia la unión del TNFα (trímeros y complejos del TNFα de la invención) a su receptor y, por lo tanto, identificar antagonistas del TNFα. En un aspecto preferido, los ensayos de la divulgación pueden comprender determinar si un compuesto de prueba mejora la unión del TNFα a TNFR1 y, por lo tanto, identificar antagonistas del TNFα que actúan aumentando la unión de formas del TNFα de señalización reducida, o de no señalización, (trímeros y complejos del TNFα de la invención) a TNFR1. Los ensayos para identificar antagonistas del TNFα de acuerdo con la invención pueden comprender incubar una muestra de TNFα en condiciones que desestabilicen la formación de trímeros del TNFα, por ejemplo, en presencia de DMSO, y medir el grado en el que un compuesto de prueba estabiliza la formación de trímeros del TNFα. Como alternativa, los ensayos para identificar los antagonistas del TNFα de acuerdo con la invención pueden implicar la unión de TNFα a un compuesto de prueba y la medición del grado de unión del trímero del TNFα de la invención o el complejo compuesto-trímero al TNFR1.
TNFα y TNFR1 pueden estar purificados o presentes en mezclas, tal como en células cultivadas, muestras de tejido, líquidos corporales o medio de cultivo. Pueden desarrollarse ensayos cualitativos o cuantitativos, siendo este último útil para determinar los parámetros de unión (constantes de afinidad y cinética) del compuesto de prueba a formas triméricas del TNFα, y también de los parámetros de unión del trímero del TNFα de la invención o complejo compuestotrímero al receptor de TNF requerido.
La cantidad de las formas monoméricas, diméricas y triméricas de TNFα pueden determinarse midiendo la masa de las formas monoméricas, diméricas y triméricas, la cantidad molar de las formas monoméricas, diméricas y triméricas, la concentración de las formas monoméricas, diméricas y triméricas, y la molaridad de las formas monoméricas, diméricas y triméricas. Esta cantidad se puede dar en unidades adecuadas. Por ejemplo, la concentración de las formas monoméricas, diméricas y triméricas se pueden dar en μg/ml, ng/ml o µg/ml. La masa de las formas monoméricas, diméricas y triméricas se pueden dar en μg, ng o µg.
La cantidad de las formas monoméricas, diméricas o triméricas de TNFα en una muestra de interés puede compararse con el nivel de las formas monoméricas, diméricas o triméricas de TNFα en otra muestra, tal como una muestra de control, como se describe en el presente documento. En dicho método, la cantidad real de las formas monoméricas, diméricas o triméricas de TNFα, tal como la masa, cantidad molar, concentración o molaridad de las formas monoméricas, diméricas o triméricas de TNFα en las muestras puede evaluarse. La cantidad de las formas monoméricas, diméricas o triméricas de TNFα puede compararse con las de otra muestra sin cuantificar la masa, cantidad molar, concentración o molaridad de las formas monoméricas, diméricas o triméricas de TNFα. Así pues, la cantidad de las formas monoméricas, diméricas o triméricas de TNFα en una muestra de acuerdo con la invención pueden evaluarse como una cantidad relativa, tal como una masa relativa, cantidad molar relativa, concentración relativa o molaridad relativa de las formas monoméricas, diméricas o triméricas de TNFα basándose en una comparación entre dos o más muestras.
En la presente invención, pueden cribarse bibliotecas de compuestos con el fin de identificar antagonistas de TNFα (es decir, usando los ensayos desvelados en el presente documento). Dichas bibliotecas normalmente comprenden al menos 260 compuestos. Preferentemente, dichas bibliotecas comprenden al menos 300, al menos 500 o incluso al menos 1000 compuestos.
Ensayos basados en espectrometría de masas
Los presentes inventores han descubierto que la espectrometría de masas puede usarse para identificar compuestos que se unen a formas triméricas de TNFα y que estabilizan estos trímeros en una conformación (trímero del TNFα o complejo de la invención) que es capaz de unirse a TNFR1.
En particular, puede usarse espectrometría de masas para evaluar si un compuesto estabiliza la forma trimérica de TNFα.
Por consiguiente, la divulgación proporciona un ensayo para identificar un compuesto que es capaz de unirse a una proteína TNFα trimérica, de modo que el complejo compuesto-trímero (o trímero del TNFα de la invención) se une a TNFR1 y antagoniza la señalización del receptor que comprende las etapas de identificar la unión de un compuesto de prueba a la forma trimérica de TNFα en una muestra y comparar la unión del compuesto a la forma trimérica de TNFα a los valores correspondientes de muestras de control, que comprende llevar a cabo un análisis espectrométrico de masas en una muestra que contiene el TNFα y el compuesto para detectar la cantidad de trímero del TNFα y comparar la cantidad de trímero del TNFα en la muestra con una muestra de control y seleccionar un compuesto que sea capaz de unirse a la forma trimérica de TNFα, de modo que el complejo compuesto-trímero (o trímero del TNFα de la invención) se une a TNFR1 y antagoniza la señalización del receptor. La muestra control puede ser idéntica a la muestra que se está ensayando, excepto que carece del compuesto de prueba. La muestra que comprende el TNFα y el compuesto puede comprender además un agente desestabilizador.
Puede añadirse un compuesto de prueba a una solución de TNFα en presencia de un agente desestabilizador. Los agentes desestabilizadores, también conocidos como caótropos, incluyen concentraciones molares bajas (por ejemplo, 1 M) de urea, guanidina o acetonitrilo, concentraciones elevadas (por ejemplo, 6 M o más) de estos reactivos darán como resultado la disociación completa del trímero del TNFα y el despliegue de las subunidades monoméricas del TNFα constituyentes. El agente desestabilizador es preferentemente DMSO, normalmente a una concentración del 5 %, 10 % o superior. La solución resultante puede analizarse usando espectrometría de masas.
Pueden detectarse complejos no covalentes formados entre TNFα y compuestos de prueba con afinidades de unión tan débiles como 1 mM. La estequiometría de unión puede obtenerse directamente a partir de la presencia o ausencia de complejos en los que se unen múltiples moléculas del compuesto de prueba. Las afinidades de unión (valores de KD) pueden determinarse midiendo la relación de concentración de complejo de TNFα - compuesto de prueba (complejo compuesto-trímero)/TNFα a concentraciones de compuesto de prueba conocidas.
El compuesto de prueba estabiliza la forma trimérica de TNFα si aumenta la proporción de trímero en comparación con la cantidad de trímero observada para una muestra que contiene el TNFα y el agente desestabilizador en ausencia del compuesto de prueba. El compuesto de prueba puede aumentar la cantidad de trímero en el 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 % o más en comparación con la cantidad de trímero presente en una muestra que contiene el TNFα y el agente desestabilizador en ausencia del compuesto de prueba.
El compuesto de prueba también puede aumentar la cantidad de trímero en comparación con la observada para una muestra del TNFα en ausencia tanto del agente desestabilizador como del compuesto de prueba. El compuesto de prueba puede aumentar la cantidad de trímero en el 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 % o más en comparación con la cantidad de trímero presente en una muestra que contiene el TNFα en ausencia tanto del agente desestabilizador como del compuesto de prueba.
La estabilización del trímero se evidencia de dos formas en el estudio de espectrometría de masas.
En primer lugar, está la disociación física del complejo trímero del TNFα (o trímero del TNFα de la invención) que puede medirse mediante la relación de monómero y trímero observada en el espectro de masas. La especie dimérica no se observa en los presentes estudios. Esta disociación puede ser un artefacto del proceso de alta energía usado para introducir moléculas en el espectrómetro de masas. No obstante, puede usarse para evaluar la capacidad de los compuestos de prueba para estabilizar el complejo trimérico durante los procesos de nebulización e ionización y reducir de esta manera la cantidad de monómero observada en el espectro de masas, usándose la relación monómero/trímero para determinar el grado de estabilización.
En segundo lugar, en condiciones de ionización suaves, se imparte menos energía al complejo trimérico (o trímero del TNFα de la invención), lo que da como resultado su transmisión intacta al espectrómetro, lo que refleja más de cerca la verdadera composición de la solución. El proceso de ionización por electropulverización da como resultado una carga múltiple de proteínas porque, en modo de ionización positiva, los grupos funcionales básicos dentro de determinados aminoácidos adquieren una carga positiva. Los espectrómetros de masas miden la relación masa/carga. Por lo tanto, por ejemplo, un trímero de TNFα nominalmente de 52.000 Da aparecerá en una relación m/z de 5.200 si lleva 10 cargas. Es este efecto de carga múltiple el que permite que se usen espectrómetros con un intervalo de masa limitado en el estudio de complejos proteicos multiméricos (o trímeros del TNFα de la invención). El software suministrado con el espectrómetro permite al usuario desconvolucionar los datos para dar la masa de la proteína como aparecería si tuviera una sola carga (es decir, su verdadero peso molecular basado en su composición atómica). En proteínas plegadas donde muchos aminoácidos están enterrados en el núcleo con solo un porcentaje expuesto en la superficie, normalmente se adquieren de 6 a 8 cargas positivas. No predomina una sola especie cargada, a menudo se observan varias especies (iones) dentro de un intervalo pequeño, estos comprenden lo que se conoce como la envolvente del estado de carga. En el otro extremo, cuando una proteína está totalmente desnaturalizada (es decir, desplegada), entonces se exponen muchos más aminoácidos y el número típico de cargas adquiridas puede ser tan alto como 20, la envolvente del estado de carga también comprende una mayor cantidad de especies cargadas, ya que estadísticamente ahora hay más sitios disponibles para aceptar una carga. Por lo tanto, el número de cargas y el número de especies cargadas que comprenden la envolvente del estado de carga son lecturas sensibles del grado de plegamiento de proteínas. Asimismo, si una proteína plegada puede existir en múltiples conformaciones que difieren en el número relativo de aminoácidos expuestos en la superficie, los desplazamientos en la envolvente del estado de carga reflejarán estas diferencias.
En condiciones de ionización de nanoelectropulverización suave, estudios de espectrometría de masas proteína TNFα intacta plegada muestran que se detecta casi el 100 % del trímero del TNFα, se detecta muy poco del monómero TNFα mientras que la especie dimérica está completamente ausente.
En condiciones de ionización más severas, o cuando se añade un agente desestabilizador a la muestra de TNFα, se observan niveles aumentados del TNFα monomérico con una reducción concomitante en los niveles del trímero. Solo se observa una cantidad muy pequeña de dímero.
La espectrometría de masas también se puede usar para determinar si el compuesto de prueba se une a las formas monoméricas, diméricas y triméricas de TNFα.
La espectrometría de masas también puede usarse para determinar la estequiometría de los compuestos de prueba con TNFα, es decir, cuántas moléculas del compuesto de prueba se unen al TNFα.
La espectrometría de masas también puede usarse para determinar si el complejo compuesto - trímero del TNFα (o trímero del TNFα de la invención) se une a TNFR1.
La espectrometría de masas también puede usarse para medir las velocidades a las que un compuesto de prueba se une a TNFα (la velocidad "de asociación" "on" kon-c) y la velocidad a la que el compuesto de prueba se disocia del TNFα (la velocidad de "disociación" "off" o koff-c). Tal como se usa en el presente documento, el símbolo "KD-c", indica la afinidad de unión (constante de disociación) de un compuesto de prueba para TNFα. KD-c se define como koff-c/kon-c. Los compuestos de prueba pueden tener velocidades de "asociación" lentas, lo que puede medirse en minutos mediante análisis espectral de masas de las intensidades máximas del TNFα y del complejo compuesto-trímero (o trímero del TNFα de la invención). Los valores de kD-C para un compuesto de prueba se pueden estimar mediante la repetición de esta medición en diferentes relaciones de TNFα: complejo compuesto-trímero. En una realización preferida, la unión de los compuestos de la invención a los trímeros del TNFα se caracteriza por velocidades de "asociación" rápidas, de manera ideal aproximadamente de 107 M-1s-1, con velocidad de "disociación" lenta, por ejemplo, valores normalmente de 10-3 s-1, 10-4 s-1 o velocidad de "disociación" no medible.
También puede usarse espectrometría de masas para determinar si el compuesto de prueba se une al TNFα en presencia de TNFR1. Esto puede implicar la incubación del compuesto de prueba con TNFα que se ha preincubado con su receptor. La muestra que contiene el compuesto de prueba y TNFα y el receptor preincubado puede fraccionarse para separar moléculas de acuerdo con su tamaño molecular, por ejemplo, mediante filtración analítica en gel. Las fracciones resultantes pueden analizarse usando espectrometría de masas para determinar si el compuesto de prueba se une a TNFα en presencia del receptor requerido. El compuesto se eluirá en la misma fracción que el TNFα si se está unido al TNFα. El compuesto se eluirá en una fracción diferente a la del TNFα si no está unido al TNFα. En este caso, el compuesto normalmente eluirá en una fracción de filtración en gel posterior a la del TNFα. Los métodos de espectrometría de masas pueden incluir, por ejemplo, espectrometría de masas con desorción/ionización láser asistida por matriz (EM DILAM), espectrometría de masas con desorción/ionización láser potenciada para superficie (EM DILPS), espectrometría de masas de tiempo de vuelo (EM TDV) y cromatografía líquida espectrometría de masas (CL EM).
Ensayos de unión de receptor-ligando
Los antagonistas convencionales actúan inhibiendo la unión del TNFα a su receptor. Los presentes inventores han usado ensayos de unión de receptor-ligando para determinar si un compuesto de prueba mejora la unión del trímero del TNFα de la invención o del complejo de la invención a su receptor. Dichos ensayos de unión de receptor-ligando pueden usarse para identificar antagonistas de TNFα que actúan aumentando la unión de formas de TNFα de señalización reducida o no señalización a TNFR1.
Por consiguiente, la divulgación proporciona un ensayo para identificar un compuesto que es capaz de unirse a una proteína trimérica que es TNFα, mediante el cual el complejo compuesto-trímero se une al TNFR1 y antagoniza la señalización del receptor que comprende la etapa de medir el nivel de TNFα trimérico unido al receptor requerido en una muestra que comprende un compuesto de prueba y comparar el nivel de TNFα trimérico unido al receptor requerido a los valores correspondientes de las muestras de control, que comprende realizar un ensayo de unión receptor-ligando en el que una muestra de TNFα y el compuesto, se aplica a TNFR1 que se ha unido a una superficie y se compara la cantidad de trímero del TNFα unido a TNFR1 con una muestra de control y se selecciona un compuesto que es capaz de unirse a la forma trimérica de TNFα, de modo que el complejo compuesto-trímero se une al TNFR1 y antagoniza la señalización del receptor. La muestra control puede ser idéntica a la muestra que se está ensayando, excepto que carece del compuesto de prueba y/o contiene un compuesto conocido. La muestra que comprende el TNFα y el compuesto puede comprender además un agente desestabilizador.
Se puede añadir un compuesto de prueba a una solución que comprende TNFα y agente desestabilizador. El nivel de unión de TNFR1 en presencia del agente desestabilizador solo (en una muestra control) puede compararse con el nivel de unión de TNFα a su receptor en presencia del agente desestabilizador y el compuesto de prueba. El compuesto de prueba mejora la unión de TNFα a su receptor si aumenta la proporción de TNFα unido a su receptor en comparación con el nivel de unión de TNFα a su receptor observado para una muestra que contiene TNFα y el agente desestabilizador en ausencia del compuesto de prueba.
El compuesto de prueba puede aumentar la cantidad de TNFα unido a su receptor en un 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 % o más en comparación con la cantidad de TNFα unido a su receptor en una muestra que contiene TNFα en ausencia del compuesto de prueba.
El ensayo de unión receptor-ligando normalmente requiere que el receptor de TNFα se una a un soporte. El receptor de TNFα puede unirse directamente al soporte, o indirectamente, usando una molécula enlazadora, tal como avidina o estreptavidina. A continuación, se puede ensayar el nivel de unión de TNFα a su receptor añadiendo una solución de TNFα con un agente desestabilizador. Los agentes desestabilizadores, también conocidos como caótropos, incluyen concentraciones molares bajas (por ejemplo, 1 M) de urea, guanidina o acetonitrilo, concentraciones elevadas (por ejemplo, 6 M o más) de estos reactivos darán como resultado la disociación completa del trímero del TNFα y el despliegue de las subunidades monoméricas del TNFα constituyentes. El agente desestabilizador es preferentemente DMSO, normalmente a una concentración del 5 %, 10 % o superior.
La unión de TNFα a su receptor normalmente se determina usando un anticuerpo que es específico de TNFα y que se une a un marcador. El marcador puede ser cualquier molécula detectable. Por ejemplo, el marcador puede ser un isótopo radiactivo (por ejemplo 125I, 32P, 35S y 3H), colorante fluorescente (por ejemplo, fluoresceína, rodamina), conjugado enzimático y similares. Se usa un sustrato para la enzima para cuantificar la cantidad de TNFα unido al receptor unido a la superficie. Otros marcadores incluyen marcadores moleculares que pueden activarse para producir luz al exponerse a ciertos estímulos, tales como la electricidad. La elección de un marcador dependerá del sistema de detección usado.
Los ensayos de unión de receptor-ligando pueden llevarse a cabo en varios formatos, incluyendo los ensayos de unión basados en células, ensayos en fase de solución e inmunoensayos. Los soportes sólidos para las reacciones de unión receptor-ligando contienen preferentemente pocillos. En general, los complejos de compuesto de prueba-trímero (o trímeros del TNFα de la invención) se incuban con el receptor de TNFα durante un período de tiempo específico seguido de la medición de la cantidad del complejo compuesto-trímero que se une al receptor. El nivel de complejo compuesto-trímero unido (o trímero de TNFα de la invención) se puede calcular midiendo el marcador usando microscopía, fluorimetría, un contador de centelleo o cualquier inmunoensayo disponible.
Tal como se usa en el presente documento, el símbolo "kon-r" indica la velocidad (la velocidad de "asociación") a la que un complejo compuesto-trímero (o trímero del TNFα de la invención) se une a un receptor de TNFα. Tal como se usa en el presente documento, el símbolo "koff-r" indica la velocidad (la velocidad de "disociación") a la que un complejo compuesto-trímero (o trímero del TNFα de la invención) se disocia de un receptor de TNFα. Tal como se usa en el presente documento, el símbolo "KD-r" indica la afinidad de unión (constante de disociación) de un complejo compuesto-trímero (o TNFα de la invención) por su receptor. La KD-r se define como koff-r/ kon-r.
Pueden usarse ensayos de unión de receptor-ligando para medir la afinidad de unión de los complejos compuestotrímero de la invención (o trímeros del TNFα de la invención) a TNFR1. En particular, se pueden utilizar ensayos de competición para comparar los valores de kon-r y koff-r para complejos compuesto-trímero de la invención (o trímeros del TNFα de la invención) para TNFR1 y los valores de kon-r y koff-r de la unión de TNFα a su receptor en ausencia del compuesto de prueba (o apo TNFα), y para determinar valores de KD-r para la unión de complejos compuesto-trímero de la invención (o trímero del TNFα de la invención) al receptor.
Ensayos de estabilidad
Los presentes inventores han desarrollado métodos para determinar el efecto de los compuestos de prueba sobre la estabilidad de TNFα (o la estabilidad de los trímeros del TNFα de la invención en relación con el trímero de apo TNFα). Por consiguiente, la divulgación proporciona un ensayo para identificar un compuesto que es capaz de unirse a una proteína TNFα trimérica, mediante el cual el complejo compuesto-trímero se une al receptor de TNFα requerido y modula la señalización del receptor que comprende la etapa de medir la estabilidad del TNFα trimérico en una muestra que comprende el compuesto y comparar la estabilidad del TNFα trimérico con los valores correspondientes de muestras de control, que comprende realizar un ensayo para determinar la Tm de la forma trimérica de TNFα en una muestra de TNFα y el compuesto, comparar la Tm de la forma trimérica de TNFα con una muestra de control y seleccionar un compuesto que sea capaz de unirse a la forma trimérica de TNFα, de modo que el complejo compuestotrímero se une al receptor de TNFα y antagoniza la señalización del receptor. La muestra control puede ser idéntica a la muestra que se está ensayando, excepto que carece del compuesto de prueba y/o contiene un compuesto conocido. La muestra que comprende el TNFα y el compuesto puede comprender además un agente desestabilizador.
Se puede añadir un compuesto de prueba a una solución que comprende TNFα y agente desestabilizador. La estabilidad de la forma trimérica de TNFα en presencia del agente desestabilizador solo (en una muestra control) puede compararse con la estabilidad de la forma trimérica de TNFα en presencia del agente desestabilizador y el compuesto de prueba. El compuesto de prueba potencia la estabilidad de la forma trimérica de TNFα si aumenta el punto medio de transición térmica (Tm) de la forma trimérica de TNFα en comparación con la Tm de la forma trimérica de TNFα observada para una muestra que contenía el TNFα y el agente desestabilizador en ausencia del compuesto de prueba (o trímero del TNFα asimétrico de la invención frente a TNFα simétrico). La tmde la forma trimérica de TNFα es la temperatura a la que se despliegan el 50 % de las biomoléculas. La Tm de la forma trimérica de TNFα en presencia y/o ausencia del compuesto de prueba puede medirse utilizando cualquier técnica adecuada conocida en la materia, por ejemplo, utilizando calorimetría diferencial de barrido (DSC) o ensayos de desnaturalización térmica con sonda de fluorescencia.
El compuesto de prueba puede aumentar la Tm de la forma trimérica de TNFα en al menos 1 °C, al menos 2 °C, al menos 5 °C, al menos 10 °C, al menos 15 °C, al menos 20 °C o más en comparación con la Tm de la forma trimérica de TNFα en una muestra que contiene TNFα en ausencia del compuesto de prueba (o trímero del TNFα asimétrico de la invención frente a TNFα simétrico). Preferentemente, el compuesto de prueba aumenta la Tm de la forma trimérica de TNFα en al menos 1 °C, más preferentemente en al menos 10 °C y aún más preferentemente entre 10 °C y 20 °C. Los agentes desestabilizadores, también conocidos como caótropos, incluyen concentraciones molares bajas (por ejemplo, 1 M) de urea, guanidina o acetonitrilo, concentraciones elevadas (por ejemplo, 6 M o más) de estos reactivos darán como resultado la disociación completa del trímero del TNFα y el despliegue de las subunidades monoméricas del TNFα constituyentes. El agente desestabilizador es preferentemente DMSO, normalmente a una concentración del 5 %, 10 % o superior.
Ensayos de calorimetría isotérmica
Los presentes inventores han desarrollado métodos de calorimetría isotérmica para determinar el efecto de los compuestos de prueba sobre la afinidad de unión del TNFα por sus receptores (o el efecto de los trímeros del TNFα asimétricos de la invención frente a los trímeros del TNFα simétricos sobre la unión al receptor).
Por consiguiente, la divulgación proporciona un ensayo para identificar un compuesto capaz de unirse a TNFα trimérico, mediante el cual el complejo compuesto-trímero se une a TNFR1 y antagoniza la señalización del receptor que comprende la etapa de medir el nivel de TNFα trimérico unido al receptor en una muestra que comprende el compuesto y comparar el nivel de TNFα trimérico unido al receptor con valores correspondientes a partir de muestras de control (o comparar la unión del trímero del TNFα asimétrico de la invención con el TNFα simétrico), que comprende realizar un análisis calorimétrico isotérmico para medir la afinidad de unión de TNFα por el receptor en presencia del compuesto; y comparar la afinidad de unión del TNFα por el receptor con una muestra de control y seleccionar un compuesto capaz de unirse a un TNFα trimérico, de modo que el complejo compuesto-trímero se une al receptor y antagoniza la señalización del receptor. La muestra control puede ser idéntica a la muestra que se está ensayando, excepto que carece del compuesto de prueba y/o contiene un compuesto conocido.
Pueden añadirse secuencialmente alícuotas de TNFα a un depósito del receptor. El volumen de las alícuotas puede estar en cualquier intervalo apropiado. Las alícuotas pueden ser de cualquier volumen apropiado, tal como de 0,1 µl a 10 µl. En un aspecto preferido, las alícuotas pueden tener un volumen de 0,5 µl, 1,0 µl o 3,0 µl. Puede ser posible usar volúmenes más grandes dependiendo del volumen de la jeringa.
Cada adición de TNFα dará como resultado la liberación o absorción de una pequeña cantidad de calor a medida que los trímeros del TNFα se unen al receptor. Normalmente, cada adición de TNFα dará como resultado la liberación de una pequeña cantidad de calor a medida que los trímeros del TNFα se unen al receptor. La cantidad de liberación de calor puede medirse usando calorimetría isotérmica, y esta información se usa para obtener la afinidad de unión de TNFα con su receptor.
Este proceso puede repetirse usando adiciones secuenciales de una solución que comprende TNFα y un compuesto de prueba a un depósito del receptor. Preferentemente, el TNFα y el compuesto de prueba estarán en forma de un complejo compuesto-trímero (o un trímero del TNFα asimétrico de la invención). De nuevo, la cantidad de liberación de calor puede medirse usando calorimetría isotérmica, y esta información se usa para obtener la afinidad de unión del TNFα con su receptor.
Las afinidades de unión de TNFα y el complejo compuesto-trímero (o el trímero del TNFα simétrico frente al asimétrico de la invención) pueden compararse para determinar si el compuesto aumenta la afinidad de unión de TNFα a su receptor.
El compuesto de prueba puede aumentar la afinidad de unión de TNFα a su receptor en 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o más en comparación con la afinidad de unión de TNFα a su receptor en ausencia del compuesto de prueba (o trímero del TNFα asimétrico de la invención frente a trímero del TNFα simétrico).
La afinidad de unión se puede dar en términos de afinidades de unión (KD-r) y puede darse en las unidades adecuadas, tales como µM, nM o pM. Cuanto menor sea el valor KD-r, mayor es la afinidad de unión de TNFα a su receptor. El valor de KD-r de TNFα para unirse a su receptor en presencia del compuesto de prueba puede ser al menos 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces menor que el valor de KD-r del TNFα para unirse a su receptor en ausencia del compuesto de prueba (o trímero del TNFα asimétrico de la invención frente a trímero del TNFα simétrico).
El valor de KD-r de TNFα para unirse a su receptor en presencia del compuesto de prueba puede ser 1 µM, 100 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM o menos. En una realización preferida, el valor de KD-r de TNFα para unirse a su receptor en presencia del compuesto de prueba es 1 nM o menos (o trímero del TNFα asimétrico de la invención frente a trímero del TNFα simétrico).
Ensayos de competición
Los presentes inventores han desarrollado métodos para identificar compuestos que son capaces de unirse a un TNFα trimérico, de modo que el complejo compuesto-trímero se une a TNFR1 y antagoniza la señalización del receptor investigando la capacidad de un compuesto de prueba para competir con un compuesto sonda para unirse a un TNFα trimérico. Por consiguiente, la divulgación proporciona un ensayo que comprende medir la competencia de un compuesto de prueba con un compuesto sonda para unirse a la forma trimérica de TNFα y comparar el nivel de competición observado de esta manera con los valores correspondientes de muestras control y seleccionar un compuesto que sea capaz de unirse a una proteína TNFα trimérica, de modo que el complejo compuesto-trímero se une al receptor TNFR1 y antagoniza la señalización del receptor.
El compuesto sonda puede comprender un compuesto de acuerdo con la invención que está radiomarcado. Los radionúcleos que pueden usarse en las sondas de la presente invención incluyen tritio (3H), 14C, 18F, 22Na, 32P, 33P, 35S, 36Cl, 125I, 131I y 99mTc.
En particular, el ensayo de competición puede ser un ensayo de polarización de fluorescencia (FP), donde el grado de polarización de la fluorescencia está relacionado con el tiempo de relajación rotacional de una molécula fluorescente y, por tanto, tamaño molecular. Las moléculas grandes exhiben un mayor grado de polarización que las moléculas pequeñas. Así pues, los ensayos de FP pueden usarse para medir la interacción de un pequeño ligando o sonda fluorescente, con una proteína más grande, tal como TNFα. El grado de polarización proporciona una medida directa de la relación unido/libre del ligando fluorescente.
Por lo tanto, la divulgación proporciona un método para identificar un compuesto que es capaz de unirse a una proteína TNFα trimérica, mediante el cual el complejo compuesto-trímero se une al receptor TNFR1 y antagoniza la señalización del receptor que comprende las etapas de medir la competición del compuesto con un compuesto sonda para unirse a la forma trimérica de TNFα, comparar el nivel de competición observado con los valores correspondientes de una muestra control y seleccionar un compuesto que sea capaz de unirse a una proteína TNFα trimérica, de modo que el complejo compuesto-trímero se une a TNFR1 y antagoniza la señalización del receptor, en donde dicho método comprende realizar un ensayo de polarización de fluorescencia usando el compuesto y un compuesto sonda, comparar el grado de polarización del compuesto sonda en presencia del compuesto con el grado de polarización en una muestra control.
La capacidad de un compuesto de prueba para competir con una sonda o ligando puede cuantificarse usando terminología convencional, tal como la concentración inhibitoria semimáxima (CI50). En este contexto, los valores de CI50 representan la concentración de un compuesto que se requiere para dar como resultado una inhibición del 50 % de la unión de la sonda al TNFα trimérico. Los compuestos de prueba pueden tener valores de CI50 de 500 nM, 400 nM, 300 nM, 200 nM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 100 pM o menos. Preferentemente, los compuestos de prueba tienen un valor de CI50 de 200 nM o menos. Más preferentemente, los compuestos de prueba tienen un valor de CI50 de 150 nM o menos o un valor de CI50 de 100 nM o menos.
Tal como se ha mencionado anteriormente, en la presente invención, una biblioteca de compuestos se somete típicamente a uno o más de los ensayos descritos en el presente documento para identificar antagonistas de TNFα. Dichas bibliotecas, que pueden comprender al menos 260 compuestos, al menos 300, al menos 500 o incluso al menos 1000 compuestos, pueden cribarse usando polarización de fluorescencia.
Cuando se analiza una biblioteca de compuestos mediante polarización de fluorescencia, el método puede comprender seleccionar un compuesto como un antagonista del TNFα si el compuesto da como resultado un valor de CI50 particular. Por ejemplo, un compuesto puede identificarse como un antagonista de TNFα si el compuesto da como resultado un valor de CI50 de menos de 50 µM. En algunos aspectos, los compuestos se identifican cuando dan como resultado un valor de CI50 de menos de 500 nM, menos de 200 nM o incluso menos de 100 nM.
Un compuesto de una biblioteca también puede identificarse como un antagonista de TNFα si tiene el valor de CI50 más bajo de todos los compuestos de la biblioteca que se prueban. Análogamente, un compuesto puede identificarse como un antagonista de TNFα cuando tiene un valor de CI50 bajo (es decir, un valor de CI50 mejor) en comparación con otros compuestos de la biblioteca. Por ejemplo, el 50 % de los compuestos de la biblioteca que dan como resultado los valores de CI50 más bajos pueden identificarse como antagonistas. En algunos aspectos, el 25 % o incluso el 10 % de los compuestos de la biblioteca que dan como resultado los valores de CI50 más bajos pueden identificarse como antagonistas.
En un aspecto, el compuesto sonda comprende un compuesto de acuerdo con la invención conjugado con un ligando fluorescente. De manera adecuada, el ligando fluorescente es un tinte fluorescente que tiene una vida útil de fluorescencia de 10 ns o menos. Los ejemplos típicos de tintes fluorescentes adecuados incluyen fluoresceína, rodamina, un tinte Cy (por ejemplo, Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 o Cy7), un tinte Alexa Fluor® (por ejemplo, Alexa Fluor® 350, 405, 430, 488, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 635, 647, 660, 680, 700, 750 o 790) o un tinte BODIPY® (por ejemplo, BODIPY FL, BODIPY R6G, BODIPY TMR o BODIPY TR). Un ejemplo específico de un compuesto sonda se describe en el ejemplo 14.
La muestra control puede ser idéntica a la muestra que se está ensayando, excepto que carece del compuesto de prueba y/o contiene un compuesto conocido.
La muestra que comprende TNFα y el compuesto puede comprender además un agente desestabilizador. Los agentes desestabilizadores, también conocidos como caótropos, incluyen concentraciones molares bajas (por ejemplo, 1 M) de urea, guanidina o acetonitrilo, concentraciones elevadas (por ejemplo, 6 M o más) de estos reactivos darán como resultado la disociación completa del trímero del TNFα y el despliegue de las subunidades monoméricas del TNFα constituyentes. El agente desestabilizador es preferentemente DMSO, normalmente a una concentración del 5 %, 10 % o superior.
Aunque la polarización de fluorescencia puede usarse para identificar antagonistas de TNFα, en algunos aspectos dichos antagonistas pueden identificarse mediante cualquier ensayo descrito en el presente documento excluyendo la polarización de fluorescencia (es decir, mediante un método que no sea polarización de fluorescencia). En particular, unión de un compuesto a un TNFα trimérico, y competencia de un compuesto con un compuesto sonda para unirse a la forma trimérica de TNFα, puede determinarse por cualquier método distinto de por polarización de fluorescencia. Señalización a través del receptor de TNFα TNFR1
La invención puede implicar un método para identificar un compuesto que puede antagonizar (es decir, prevenir o reducir) la señalización por TNFR1 unido a TNFα.
En una realización, la invención puede implicar un método para identificar un compuesto que puede prevenir o reducir la señalización por TNFR1 unido a TNFα. Dicho método puede comprender poner en contacto TNFR1 con TNFα y un complejo compuesto-trímero y detectar si el compuesto de prueba previene o reduce la señalización del trímero TNFα a través del TNFR1. La cantidad de señalización a partir de TNFR1 tratado con el complejo compuesto-trímero se puede comparar con la cantidad de señalización a partir de TNFR1 tratado con TNFα solo (o trímero del TNFα asimétrico de la invención frente a trímero del TNFα simétrico).
Para detectar el nivel de señalización, se pueden realizar ensayos que miden los efectos cadena abajo de la señalización de TNFR1. Por ejemplo, puede usarse un ensayo de destrucción de células de fibrosarcoma murino L929 para evaluar la estimulación de la muerte celular por TNFα. La inhibición de la producción de IL-8 inducida por TNFα por monocitos humanos también puede usarse para evaluar si un compuesto de prueba inhibe la señalización de TNFα a través de su receptor.
Antagonistas de TNFα
Usando los ensayos descritos en el presente documento, los presentes inventores han identificado compuestos de prueba que se unen a formas triméricas de TNFα. Estos compuestos son pequeñas entidades moleculares (SME) que tienen un peso molecular de 1000 Da o menos, 750 Da o menos o 600 Da o menos. Estos compuestos estabilizan una conformación del TNFα trimérico que se une a TNFR1 y antagoniza la señalización del receptor.
El efecto estabilizador de los compuestos de la invención sobre las formas triméricas de TNFα puede cuantificarse midiendo el punto medio de transición térmica (Tm) de los trímeros en presencia y ausencia del compuesto (o de manera similar, el trímero del TNFα asimétrico de la invención frente a un trímero del TNFα simétrico). Tm significa la temperatura a la que se despliegan el 50 % de las biomoléculas. Los compuestos que estabilizan los trímeros del TNFα aumentarán la Tm de los trímeros. La Tm puede determinarse utilizando cualquier técnica adecuada conocida en la materia, por ejemplo, utilizando calorimetría diferencial de barrido (DSC) o ensayos de desnaturalización térmica con sonda de fluorescencia.
Los compuestos pueden unirse dentro del espacio central presente dentro del trímero del TNFα (es decir, el núcleo del trímero).
Estos compuestos pueden convertir el TNFα en un antagonista de TNFR1. Por lo tanto, estos compuestos son capaces de bloquear la señalización de TNFα sin tener que competir con la interacción de alta afinidad entre el TNFα y su receptor.
Los compuestos identificados por los métodos descritos en el presente documento son antagonistas alostéricos que se unen a los agonistas naturales del receptor TNFR1, es decir, a formas triméricas de TNFα e impulsar estos trímeros a adoptar una conformación que todavía se une al TNFR1 y antagoniza la señalización por el receptor.
Los compuestos identificados por los métodos descritos en el presente documento pueden convertir los agonistas naturales de TNFα en antagonistas. Por el contrario, los antagonistas de TNFα convencionales se unen al TNFα o al receptor de TNF y evitan la unión del TNFα al receptor.
Los compuestos identificados por los métodos descritos en el presente documento no están limitados en términos de su fórmula química o estructura (excepto lo dispuesto en el presente documento), siempre que se unan a TNFα y estabilicen una conformación del TNFα trimérico (por ejemplo, un trímero del TNFα de la invención) que se une a TNFR1 y antagoniza la señalización del receptor. Los compuestos identificados mediante los métodos descritos en el presente documento pueden por lo tanto identificarse usando los ensayos y métodos descritos en el presente documento. Los compuestos identificados por los métodos descritos en el presente documento pueden comprender un resto de bencimidazol o un isóstero del mismo, por ejemplo los compuestos de fórmulas (1)-(65).
Los compuestos identificados por los métodos descritos en el presente documento pueden aumentar la afinidad de unión de TNFα (en forma de un complejo compuesto-trímero) a TNFR1 en comparación con la afinidad de unión de TNFα al receptor en ausencia de los compuestos.
Los compuestos identificados por los métodos descritos en el presente documento se unen a las formas triméricas de TNFα. Dichos compuestos pueden unirse específicamente a las formas triméricas de uno o más TNFα. Un compuesto identificado por los métodos descritos en el presente documento puede unirse específicamente a solo uno de los miembros de la superfamilia TNF (por ejemplo, TNFα), pero no a ningún otro miembro de la superfamilia del TNF. Un compuesto identificado mediante los métodos descritos en el presente documento también puede unirse específicamente a dos, tres, cuatro o hasta todos los miembros de la superfamilia del TNF. Por específico, se entenderá que los compuestos se unen a la molécula o moléculas de interés, en este caso la forma trimérica de TNFα, sin ninguna reactividad cruzada significativa con ninguna otra molécula, que puede incluir otros miembros de la superfamilia del TNF. La reactividad cruzada puede evaluarse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, la resonancia de plasmón superficial. La reactividad cruzada de un compuesto para la forma trimérica de TNFα con una molécula distinta de la forma trimérica de ese miembro particular de la superfamilia de TNF puede considerarse significativa si el compuesto se une a la otra molécula al menos el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 100 % tan fuertemente como se une a la forma trimérica de TNFα. Un compuesto que es específico para la forma trimérica de TNFα puede unirse a otra molécula a menos del 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 % o 20 % de la fuerza con la que se une a la forma trimérica de TNFα. Preferentemente, el compuesto se une a la otra molécula a menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 % o menos del 5 %, menos del 2 % o menos del 1 % de la fuerza con la que se une a la forma trimérica de TNFα.
El valor de KD-r de TNFα para unirse a su receptor en presencia del compuesto de prueba (es decir, en forma de un complejo compuesto-trímero) puede ser al menos 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces inferior al valor de KD-r de TNFα para unirse a su receptor en ausencia del compuesto de prueba. En una realización preferida, el valor de KD-r del complejo compuesto-trímero para la unión a TNFα disminuye al menos 1,5 veces, preferentemente al menos 3 veces, más preferentemente al menos 4 veces el valor de KD-r del trímero del TNFα que se une al TNFR1 en ausencia del compuesto de prueba, es decir, la afinidad de unión del complejo compuesto-trímero por el TNFR1 aumenta preferentemente al menos 1,5 veces, preferentemente al menos tres veces, más preferentemente al menos cuatro veces en comparación con la afinidad de unión del trímero del TNFα a TNFR1 en ausencia del compuesto de prueba.
La disminución del valor de KD-r del complejo compuesto-trímero para la unión a TNFR1 en comparación con el valor KD-r del trímero del TNFα solo que se une al receptor puede resultar de un aumento en la velocidad de asociación (konr) del complejo compuesto-trímero que se une al receptor en comparación con el trímero del TNFα solo, y/o una disminución en la velocidad de disociación (koff-r) en comparación con el trímero del TNFα solo. En una realización preferida, la velocidad de asociación (kon-r) del complejo compuesto-trímero que se une al receptor aumenta en comparación con el trímero del TNFα solo. En otra realización, la velocidad de disociación (koff-r) del complejo compuesto-trímero que se une al receptor se reduce en comparación con el trímero del TNFα solo. En una realización adicional, la velocidad de asociación (kon-r) del complejo compuesto-trímero que se une al receptor aumenta, y la velocidad de disociación (koff-r) del complejo compuesto-trímero que se une al receptor disminuye, en comparación con el trímero del TNFα solo. El valor de kon-r del complejo compuesto-trímero para TNFR1 puede aumentar al menos 1,5 veces o al menos dos veces y preferentemente al menos tres veces en comparación con el valor de kon-r del trímero del TNFα que se une a su receptor en ausencia del compuesto y/o el valor de koff-r del complejo compuesto-trímero para TNFR1 puede reducirse al menos en 1,2 veces, al menos 1,6 veces, al menos dos veces, más preferentemente al menos 2,4 veces en comparación con el valor de koff-r del trímero del TNFα que se une a su receptor en ausencia del compuesto. De manera similar, los trímeros del TNFα asimétricos de la invención pueden compararse con los trímeros del TNFα simétricos.
En una realización, la velocidad de asociación para la unión del compuesto al trímero del TNFα (kon-c) es más rápida que la velocidad de asociación para la unión del complejo compuesto-trímero a TNFR1 (kon-r). En otra realización, la velocidad de disociación para la unión del complejo compuesto-trímero a TNFR1 (koff-r) es más rápida que la velocidad de disociación para la unión del compuesto al trímero del TNFα (koff-c). En una realización adicional, la velocidad de asociación para la unión del compuesto al trímero del TNFα (kon-c) es más rápida que la velocidad de asociación para la unión del complejo compuesto-trímero a TNFR1 (kon-r), y la velocidad de disociación para la unión del complejo compuesto-trímero a TNFR1 (koff-r) es más rápida que la velocidad de disociación para la unión del compuesto al trímero del TNFα (koff-c). En una realización preferida, el valor de KD-c del compuesto para unirse al trímero del TNFα es menor que el valor de KD-r del complejo compuesto-trímero para la unión a TNFR1, es decir, el compuesto tiene una mayor afinidad por el trímero que el complejo compuesto-trímero por el receptor.
Los valores de kon-r, koff-ry kD-r para el complejo compuesto-trímero y el trímero del TNFα para TNFR1 pueden determinarse usando cualquier técnica apropiada, por ejemplo, la resonancia de plasmón superficial, espectrometría de masas y calorimetría isotérmica, como se describe en los Ejemplos en el presente documento. El valor de KD-r de TNFα para unirse a su receptor en presencia del compuesto de prueba puede ser 1 µM, 100 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM o menos. En una realización preferida el valor de KD-r de TNFα para unirse a su receptor en presencia del compuesto de prueba (es decir, en un complejo compuesto-trímero) es 1 nM o menos. En una realización más preferida, el valor de KD-r de un complejo compuesto-trímero para unirse a TNFR1 es menor de 600 pM, más preferentemente menor de 500 pM, menor de 400 pM, menor de 300 pM, menor de 200 pM, menor de 100 pM o menor de 50 pM. En una realización lo más preferida el valor de KD-r de un complejo compuesto-trímero para unirse a TNFR1 requerido es menor de 200 pM. Esto puede hacerse de manera similar para los trímeros del TNFα asimétricos de la invención frente a los trímeros del TNFα simétricos.
Los compuestos identificados por los métodos descritos en el presente documento pueden identificarse mediante un ensayo que comprende determinar la KD-r de la forma trimérica de TNFα en una muestra de TNFα y el compuesto; comparar la KD-r de la forma trimérica de TNFα en la muestra con una muestra de control; y seleccionar un compuesto de la invención.
Los compuestos identificados por los métodos pueden inhibir completa o parcialmente la señalización a través de TNFR1 cuando el TNFα en forma de un complejo compuesto-trímero se une al receptor. El compuesto puede actuar para reducir la señalización a través de TNFR1 en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %. Cualquier cambio en el nivel de señalización puede medirse mediante cualquier técnica adecuada, incluyendo la medición de la actividad de un gen indicador mediante fosfatasa alcalina o luciferasa, la translocación de NF-κB usando máquinas tales como Cellomics Arrayscan, la fosforilación de efectores cadena abajo, el reclutamiento de moléculas de señalización o la muerte celular.
Los compuestos identificados por los métodos pueden antagonizar al menos uno de los efectos cadena abajo de la señalización a través de TNFR1 cuando el TNFα en forma de complejo compuesto-trímero se une al receptor. Dichos efectos se analizan en el presente documento e incluyen la producción de IL-8, IL17NF, IL2 y VCAM inducida por TNFα, la activación de NF-κB inducida por TNFα y el reclutamiento de neutrófilos. En la materia se conocen técnicas convencionales para medir los efectos cadena abajo de TNFα. Los compuestos identificados mediante los métodos de la invención pueden antagonizar al menos 1, 2, 3, 4, 5, 10 o hasta todos los efectos cadena abajo a la señalización a través de TNFR1.
La actividad de los compuestos identificados por los métodos puede cuantificarse usando terminología convencional, tal como la CI50 o los valores de concentración de eficacia semimáxima (CE50). Los valores de CI50 representan la concentración de un compuesto necesaria para una inhibición del 50 % de una función biológica o bioquímica específica. Los valores de CE50 representan la concentración de un compuesto necesaria para conseguir el 50 % de su efecto máximo. Los compuestos identificados mediante los métodos pueden tener valores de CI50 o CE50 de 500 nM, 400 nM, 300 nM, 200 nM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 100 pM o menos. Los valores de CI50 y CE50 pueden medirse usando cualquier técnica adecuada, por ejemplo, la producción de citocinas puede cuantificarse usando ELISA. Pueden generarse entonces valores de CI50 y CE50 usando un modelo logístico convencional de 4 parámetros también conocido como modelo sigmoideo de respuesta a la dosis.
Ensayos de anticuerpos
Los anticuerpos para su uso en los ensayos de la presente divulgación son:
• CA185_1979 con una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 26 y cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 27; o • CA185_1974 con una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 11 y cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 12. Los anticuerpos de la divulgación pueden someterse a ensayo para determinar su unión a un complejo compuestotrímero mediante, por ejemplo, ELISA convencional o transferencia Western. También se puede usar un ensayo ELISA para seleccionar hibridomas que muestren reactividad positiva con la proteína diana. La selectividad de unión de un anticuerpo también puede determinarse controlando la unión del anticuerpo a células que expresan la proteína diana, por ejemplo, mediante citometría de flujo.
Los anticuerpos de la divulgación reconocen de manera selectiva (o de manera específica) al menos un complejo compuesto-trímero, es decir, epítopos dentro de un complejo compuesto-trímero (o epítopos dentro de los trímeros del TNFα asimétricos de la invención). Un anticuerpo, u otro compuesto, "se une de manera selectiva a" o "reconoce de manera selectiva" una proteína cuando se une con una afinidad preferente o elevada a la proteína para la que es selectivo, pero no se une sustancialmente, o se une con baja afinidad, a otras proteínas. La selectividad de un anticuerpo de la invención para un complejo compuesto-trímero diana puede estudiarse adicionalmente mediante la determinación de si el anticuerpo se une o no a otros complejos compuesto-trímero relacionados o si discrimina entre ellos.
Un anticuerpo puede unirse específicamente (o selectivamente) a complejos compuesto-trímero que comprenden la forma trimérica de TNFα (o el trímero del TNFα asimétrico de la invención).
Por específico (o selectivo), se entenderá que el anticuerpo se une a los complejos compuesto-trímero (o trímero del TNFα asimétrico de la invención) de interés sin ninguna reactividad cruzada significativa con ninguna otra molécula, que puede incluir compuestos de prueba en ausencia de trímero del TNFα o trímeros de TNFα en ausencia de un compuesto de prueba (TNFα simétrico). La reactividad cruzada puede evaluarse mediante cualquier método adecuado descrito en el presente documento. La reactividad cruzada de un anticuerpo para un complejo compuesto-trímero con una molécula distinta del complejo compuesto-trímero puede considerarse significativa si el anticuerpo se une a la otra molécula al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 100 % tan fuertemente como se une al complejo compuesto-trímero de interés. Un anticuerpo que es específico (o selectivo) para el complejo compuesto-trímero puede unirse a otra molécula en menos de aproximadamente un 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 % o 20 % de la fuerza con la que se une al complejo compuesto-trímero. El anticuerpo puede unirse a la otra molécula en menos de aproximadamente un 20 %, menos de aproximadamente un 15 %, menos de aproximadamente un 10 % o menos de aproximadamente un 5 %, menos de aproximadamente un 2 % o menos de aproximadamente un 1 % de la fuerza con la que se une al complejo compuesto-trímero. El anticuerpo se une específicamente (o selectivamente) a un complejo compuesto-trímero en comparación con (i) la forma trimérica de TNFα en ausencia del compuesto y/o (ii) el compuesto en ausencia del trímero TNFα (o al trímero del TNFα asimétrico de la invención frente al trímero del TNFα simétrico).
Las velocidades a las que un anticuerpo se une a un complejo compuesto-trímero (o trímero del TNFα asimétrico de la invención) se denominan en el presente documento la velocidad de "asociación" " kon-ab y la velocidad a la que el anticuerpo se disocia del complejo compuesto-trímero (o trímero del TNFα asimétrico de la invención) se denomina en el presente documento la velocidad de "disociación" o koff-ab. Tal como se usa en el presente documento, el símbolo "KD-ab" indica la afinidad de unión (constante de disociación) de un anticuerpo por un complejo compuesto-trímero (o trímero del TNFα asimétrico de la invención). La KD-ab se define como koff-ab/ kon-ab. Los anticuerpos pueden tener velocidades de "asociación" lentas, que pueden medirse en minutos mediante análisis espectral de masas del complejo compuesto-trímero y las intensidades de los máximos de anticuerpos. Los valores KD-ab de un anticuerpo pueden estimarse mediante la repetición de esta medición en diferentes anticuerpos: relaciones del complejo compuestotrímero.
El valor de KD-ab del anticuerpo para unirse a un complejo compuesto-trímero (o trímero del TNFα asimétrico de la invención) puede ser al menos aproximadamente 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, 200 veces, 300 veces o 400 veces inferior, o inferior, que el valor de KD-ab del anticuerpo para la unión al TNFα trimérico en ausencia del compuesto (TNFα simétrico) y/o el valor de KD-ab del anticuerpo para la unión al compuesto en ausencia del TNFα trimérico. El valor de KD-ab del anticuerpo para unirse a un complejo compuesto-trímero (o trímero del TNFα asimétrico de la invención) puede reducirse al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 200 veces, al menos aproximadamente 300 veces el valor de KD-ab del trímero del TNFα que se une al receptor TNFR1 en ausencia del compuesto de prueba, es decir, la afinidad de unión del anticuerpo por el complejo compuesto-trímero (o el trímero del TNFα asimétrico de la invención) normalmente aumenta al menos aproximadamente 10 veces, de manera adecuada al menos aproximadamente 100 veces, de manera más adecuada al menos aproximadamente 200 veces, de la manera más adecuada al menos aproximadamente 300 veces en comparación con la afinidad de unión del anticuerpo por el TNFα trimérico en ausencia del compuesto (o TNFα simétrico) y/o la afinidad de unión del anticuerpo por el compuesto en ausencia del TNFα trimérico.
La afinidad de unión se puede dar en términos de afinidades de unión (KD-ab) y puede darse en cualquier unidad adecuada, tal como µM, nM o pM. Cuanto menor sea el valor KD-ab, mayor será la afinidad de unión del anticuerpo al complejo compuesto-trímero (o trímero del TNFα asimétrico de la invención).
El valor de KD-ab del anticuerpo para unirse al complejo compuesto-trímero (o trímero del TNFα asimétrico de la invención) puede ser al menos aproximadamente 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces menor, o incluso menor que al valor de KD-ab del anticuerpo para la unión al TNFα trimérico en ausencia del compuesto (TNFα simétrico) y/o el valor de KD-ab del anticuerpo para la unión al compuesto en ausencia del TNFα trimérico.
La disminución del valor de KD-ab del anticuerpo para unirse al complejo compuesto-trímero (o trímero del TNFα asimétrico de la invención) en comparación con el valor de KD-ab de la unión del anticuerpo al TNFα trimérico en ausencia del compuesto (o TNFα simétrico) y/o el valor de KD-ab del anticuerpo para unirse al compuesto en ausencia del TNFα trimérico puede resultar de un aumento en la velocidad de asociación (kon-ab) del anticuerpo que se une al complejo compuesto-trímero (o trímero del TNFα asimétrico de la invención) en comparación con el anticuerpo que se une al TNFα trimérico en ausencia del compuesto (TNFα simétrico) y/o el anticuerpo que se une al compuesto en el ausencia del TNFα trimérico; y/o una disminución en la velocidad de disociación (koff-ab) en comparación con la unión del anticuerpo al TNFα trimérico en ausencia del compuesto (o trímero del TNFα simétrico) y/o la unión del anticuerpo al compuesto en ausencia del TNFα trimérico.
La velocidad de asociación (kon-ab) de la unión del anticuerpo al complejo compuesto-trímero (o trímero del TNFα asimétrico de la invención) generalmente aumentó en comparación con la velocidad de asociación del anticuerpo que se une al TNFα trimérico en ausencia del compuesto (TNFα simétrico) y/o el anticuerpo que se une al compuesto en ausencia del TNFα trimérico. La velocidad de disociación (koff-ab) de la unión del anticuerpo al complejo compuestotrímero (o trímero del TNFα asimétrico de la invención) generalmente disminuyó en comparación con la velocidad de disociación del anticuerpo que se une al TNFα trimérico en ausencia del compuesto (TNFα simétrico) y/o el anticuerpo que se une al compuesto en ausencia del TNFα trimérico. Más normalmente, la velocidad de asociación (kon-ab) del anticuerpo que se une al complejo compuesto-trímero (o al trímero del TNFα asimétrico de la invención) aumenta, y la velocidad de disociación (koff-ab) del anticuerpo que se une al complejo compuesto-trímero (o trímero del TNFα asimétrico de la invención) disminuye, en comparación con el anticuerpo que se une al TNFα trimérico en ausencia del compuesto (o TNFα simétrico) y/o el anticuerpo que se une al compuesto en ausencia del TNFα trimérico.
El valor de Kon-ab del anticuerpo que se une al complejo compuesto-trímero (o al trímero del TNFα asimétrico de la invención) puede aumentar al menos aproximadamente 1,5 veces o al menos dos veces y normalmente al menos aproximadamente tres veces en comparación con el valor de kon-ab del anticuerpo que se une al TNFα trimérico en ausencia del compuesto (TNFα simétrico) y/o el anticuerpo que se une al compuesto en ausencia del TNFα trimérico y/o el valor de koff-ab del anticuerpo que se une al complejo compuesto-trímero (o al trímero del TNFα asimétrico de la invención) puede disminuir al menos aproximadamente dos veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 60 veces, al menos aproximadamente 70 veces, al menos aproximadamente 80 veces, más adecuadamente al menos aproximadamente 90 veces en comparación con el valor de koff-ab del anticuerpo que se une al TNFα trimérico en ausencia del compuesto (TNFα simétrico) y/o el anticuerpo que se une al compuesto en ausencia del TNFα trimérico.
Los valores kon-ab, koff-ab y KD-ab se pueden determinar utilizando cualquier técnica adecuada, por ejemplo, la resonancia de plasmón superficial, la espectrometría de masas y la calorimetría isotérmica.
El valor de KD-ab del anticuerpo que se une a un complejo compuesto-trímero (o trímero del TNFα asimétrico de la invención) puede ser 1 nM, 900 pM, 700 pM, 500 pM, 100 pM, 10 pM o inferior (normalmente hasta aproximadamente 1 pM). Los anticuerpos de la divulgación se unirán deseablemente a los complejos compuesto-trímero de la invención (o trímeros del TNFα asimétricos de la invención) con alta afinidad, por ejemplo, en el intervalo picomolar. El valor de KD-ab del anticuerpo que se une a un complejo compuesto-trímero (o trímero del TNFα asimétrico de la invención) puede ser 1 nM o inferior, 900 pM o inferior, 700 pM o inferior, 500 pM o inferior, 400 pM o inferior, 300 pM o inferior, 200 pM o inferior, 100 pM o inferior, 90 pM o inferior, 80 pM o inferior, 70 pM o inferior, 60 pM o inferior, 50 pM o inferior, 40 pM o inferior, 30 pM o inferior, 20 pM o inferior, 10 pM o inferior (de nuevo, hasta aproximadamente 1 pM). El anticuerpo se puede producir de forma recombinante mediante métodos de rutina.
El término "epítopo" es una región de un antígeno a la que se une un anticuerpo. Los epítopos pueden definirse como estructurales o funcionales. Los epítopos funcionales son generalmente un subconjunto de los epítopos estructurales y tienen aquellos restos que contribuyen directamente a la afinidad de la interacción. Los epítopos también pueden ser conformacionales, es decir, compuestos de aminoácidos no lineales. En determinadas realizaciones, los epítopos pueden incluir determinantes que son agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, grupos fosforilo o grupos sulfonilo y, en determinadas realizaciones, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Puede determinarse fácilmente si un anticuerpo se une al mismo epítopo que, o compite por la unión con, un anticuerpo de referencia usando métodos rutinarios conocidos en la materia. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de ensayo se une al mismo epítopo que un anticuerpo de referencia de la invención, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una proteína o péptido en condiciones de saturación. A continuación, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de ensayo para unirse a la proteína o péptido. Si el anticuerpo de ensayo es capaz de unirse a la proteína o péptido después de la unión por saturación con el anticuerpo de referencia, puede concluirse que el anticuerpo de ensayo se une a un epítopo diferente del anticuerpo de referencia. Por otro lado, si el anticuerpo de ensayo no es capaz de unirse a la proteína o péptido después de la unión por saturación con el anticuerpo de referencia, entonces el anticuerpo de ensayo puede unirse al mismo epítopo que el epítopo al que se une el anticuerpo de referencia. Para determinar si un anticuerpo compite por la unión con un anticuerpo de referencia, se realiza la metodología de unión descrita anteriormente en dos orientaciones. En una primera orientación, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una proteína/péptido en condiciones de saturación seguido por evaluación de la unión del anticuerpo de ensayo a la molécula de proteína/péptido. En una segunda orientación, se permite que el anticuerpo de ensayo se una a la proteína/péptido en condiciones de saturación seguido por evaluación de la unión del anticuerpo de referencia a la proteína/péptido. Si, en ambas orientaciones, solo el primer anticuerpo (de saturación) es capaz de unirse a la proteína/péptido, entonces se concluye que el anticuerpo de ensayo y el anticuerpo de referencia compiten por la unión a la proteína/péptido. Como apreciará el experto en la materia, un anticuerpo que compite por la unión con un anticuerpo de referencia puede que no se una necesariamente al epítopo idéntico al anticuerpo de referencia, sino que puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia mediante la unión a un epítopo solapante o adyacente.
Dos anticuerpos se unen al mismo epítopo o epítopos solapantes si cada uno inhibe (bloquea) competitivamente la unión del otro al antígeno. Es decir, un exceso en un factor de 1, 5, 10, 20 o 100 de un anticuerpo inhibe la unión del otro en al menos un 50 %, 75 %, 90 % o incluso 99 %, según se mide en un ensayo de unión competitiva (véase, por ejemplo, Junghans et al., Cáncer Res, 1990:50:1495-1502). Como alternativa, dos anticuerpos tienen el mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácido en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Dos anticuerpos tienen epítopos solapantes si algunas mutaciones de aminoácido que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro.
A continuación, puede llevarse a cabo experimentación rutinaria adicional (por ejemplo, mutación de péptidos y análisis de unión) para confirmar si la falta de unión del anticuerpo de prueba observada se debe, de hecho, a la unión al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia o si el bloqueo estérico (u otro fenómeno) es responsable de la falta de unión observada. Los experimentos de este tipo pueden realizarse usando ELISA, RIA, resonancia del plasmón superficial, citometría de flujo o cualquier otro ensayo cuantitativo o cualitativo de unión de anticuerpos disponible en la materia.
Los anticuerpos pueden usarse para identificar compuestos de la invención (o complejos de la invención o trímeros del TNFα de la invención) como se describe en el presente documento. Los anticuerpos también se pueden usar como biomarcadores de interacción con la diana. Se puede utilizar un biomarcador de interacción con la diana para detectar la interacción, es decir, la unión de un ligando a una diana de interés. En el presente caso, los anticuerpos solo se unen a los complejos de compuestos de la invención con formas triméricas del TNFα. Por lo tanto, si un anticuerpo de la divulgación es capaz de unirse a un complejo compuesto-trímero, esto es evidencia de que el ligando (compuesto) se ha unido a la diana de interés (trímero del TNFα). Los anticuerpos de la divulgación se pueden modificar para añadir un marcador detectable como se describe en el presente documento. Por lo tanto, la interacción de un compuesto de la invención con un TNFα diana puede detectarse usando dicho anticuerpo.
El uso de anticuerpos de la divulgación como biomarcadores de interacción con la diana es potencialmente útil en un entorno clínico o preclínico, donde se puede tomar una muestra de un sujeto que está siendo tratado de acuerdo con la presente invención. La muestra obtenida del sujeto puede tratarse con un anticuerpo de la divulgación para determinar si el compuesto utilizado para tratar al sujeto se ha unido al TNFα diana (o si se ha formado en el sujeto el trímero del TNFα asimétrico de la invención). La muestra obtenida del sujeto puede ser cualquier tejido o líquido adecuado, tal como sangre, plasma u orina. El sujeto puede ser un mamífero, normalmente un ser humano.
Por consiguiente, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo de la divulgación como un biomarcador de interacción diana para la detección de un complejo compuesto-trímero (o que se ha formado un trímero del TNFα asimétrico de la invención) que comprende una proteína TNFα trimérica y un compuesto que es capaz de unirse a la proteína TNFα trimérica, de modo que el complejo compuesto-trímero (o trímero del TNFα asimétrico de la invención) se une a TNFR1 y antagoniza la señalización inducida por el trímero a través del receptor en una muestra obtenida de un sujeto.
De forma similar, la presente divulgación proporciona un método para detectar la interacción con la diana de un compuesto con un TNFα trimérico, de modo que el complejo compuesto-trímero se une a TNFR1 y antagoniza la señalización inducida por el trímero a través del receptor, comprendiendo dicho método:
(a) obtener una muestra de un sujeto al que se administró dicho compuesto;
(b) poner en contacto un anticuerpo de la divulgación con dicha muestra y una muestra de control, en donde dicho anticuerpo es detectable;
(c) determinar la cantidad de unión de dicho anticuerpo detectable a dicha muestra y a dicha muestra de control, en donde la unión de dicho anticuerpo detectable a dicha muestra mayor que la unión de dicho anticuerpo detectable a dicha muestra de control indica la interacción con la diana de dicho compuesto a dicho TNFα trimérico.
Métodos para detectar anticuerpos y medir la cantidad de unión de un anticuerpo a una diana, son bien conocidos en la técnica. Normalmente, los anticuerpos se pueden marcar. Dichos marcadores incluyen enzimas, biotina/estreptavidina, proteínas fluorescentes y colorantes fluorescentes.
Se puede medir la unión de un anticuerpo a una diana, por ejemplo, mediante un método de inmunoensayo. Los inmunoensayos incluyen transferencia Western, ELISA, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica y citometría de flujo. Puede utilizarse cualquier técnica adecuada para medir la unión del anticuerpo al TNFα.
En el método descrito anteriormente, la unión del anticuerpo detectable a la muestra de un sujeto al que se le ha administrado el compuesto se compara con la unión del anticuerpo a una muestra de control. La muestra de control puede ser cualquier muestra adecuada. La muestra de control es normalmente un "control negativo" que es representativo de la unión del anticuerpo al TNFα en ausencia del compuesto. Por ejemplo, la muestra puede obtenerse del paciente antes de la administración del compuesto. El control también puede basarse en mediciones previamente determinadas, por ejemplo, a partir de varias muestras de diferentes sujetos en ausencia del compuesto. Pueden utilizarse mediciones de aproximadamente 5, 10, 20, 50 o 100 sujetos para determinar el valor de control. El control puede ser un valor medio o un intervalo de todos los valores obtenidos.
Las condiciones experimentales, por ejemplo, los métodos de detección son las mismas para la muestra de un sujeto al que se administra el compuesto y para la muestra de control. El anticuerpo también es el mismo en ambos casos. Una mayor unión (unión aumentada) del anticuerpo detectable a la muestra del paciente al que se le administró el compuesto en comparación con la unión del anticuerpo a la muestra de control es indicativa de la interacción con la diana del compuesto con el TNFα trimérico. En otras palabras, la unión equivalente o inferior (unión disminuida) para la muestra del paciente al que se le administró el compuesto en relación con el control indica que no hay una interacción con la diana de dicho compuesto. En otras palabras, ninguna diferencia significativa en las dos cantidades indica que no hay interacción con la diana.
El experto en la materia puede determinar fácilmente cuándo hay un aumento de la unión con respecto al control. Por ejemplo, cuando el control es un intervalo de datos, la interacción con la diana puede determinarse en función de la difusión de los datos, la diferencia entre los datos de control y la unión detectada del anticuerpo en la muestra en cuestión, y los niveles de confianza calculados. También es posible identificar la interacción con la diana cuando la unión detectada para la muestra en cuestión es mayor que la cantidad máxima de unión detectada en cualquier control negativo.
La interacción con la diana puede detectarse si la unión del anticuerpo aumenta en aproximadamente un 30 % o más en relación con la cantidad más elevada en el intervalo de control. La interacción con la diana también puede detectarse si la unión del anticuerpo aumenta en aproximadamente un 40 % o más, o aproximadamente un 50 % o más en relación con el intervalo de control. Lo mismo se aplica cuando el control es un valor promedio o un valor único basado en una muestra del paciente antes de la administración del compuesto. Por supuesto, no existe un límite superior para el aumento porcentual en relación con el control.
Se puede usar un anticuerpo de la divulgación para detectar un compuesto que provoca un cambio conformacional en un TNFα trimérico (generando un trímero del TNFα asimétrico de la invención), en donde dicho cambio conformacional antagoniza la señalización de TNFR1 en la unión del TNFα trimérico.
Ensayos de anticuerpos adicionales
Como se describe en el presente documento, la presente divulgación proporciona anticuerpos que se unen selectivamente a al menos un complejo compuesto-trímero (o trímero del TNFα asimétrico de la invención) descrito en el presente documento en relación con su unión al compuesto solo o al TNFα en ausencia del compuesto (o TNFα simétrico). Estos anticuerpos pueden utilizarse para identificar otros compuestos o clases de compuestos que tengan las mismas propiedades.
Por consiguiente, la divulgación proporciona un ensayo para identificar un compuesto de la invención que comprende las etapas de:
a) realizar un ensayo de unión para medir la afinidad de unión de un complejo de trímero y compuesto de prueba a un anticuerpo de la divulgación;
b) comparar la afinidad de unión medida en la etapa (a) con la afinidad de unión de un complejo compuesto-trímero diferente que se sabe que se une con afinidad elevada al anticuerpo al que se hace referencia en la etapa (a); y c) seleccionar el compuesto presente en el complejo compuesto-trímero de la etapa (a) si su afinidad de unión medida es aceptable cuando se considera a la luz de la comparación mencionada en la etapa (b).
Como se apreciará, el complejo compuesto-trímero "diferente" al que se hace referencia en la etapa (b) anterior será en general un complejo que contiene el mismo trímero que el complejo compuesto-trímero de la etapa (a), pero un compuesto diferente. El compuesto puede ser cualquiera de los compuestos (1)-(65).
Por "aceptable" en la etapa (c) se entiende que la afinidad de unión del complejo compuesto-trímero al que se hace referencia en la etapa (a) y la afinidad de unión del complejo compuesto-trímero diferente al que se hace referencia en la etapa (b) son aproximadamente comparables. La unión selectiva de dicho anticuerpo a dicho complejo se mide normalmente en relación con la unión de dicho anticuerpo a TNFα en ausencia del compuesto o al compuesto en ausencia de TNFα.
La afinidad de unión del complejo compuesto-trímero mencionado en la etapa (a) será en general superior a la afinidad de unión del complejo compuesto-trímero diferente mencionado en la etapa (b). De manera adecuada, la diferencia en la afinidad de unión del complejo compuesto-trímero mencionado en la etapa (a) con respecto a la afinidad de unión del complejo compuesto-trímero diferente mencionado en la etapa (b) estará dentro de los límites de 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces o 500 veces.
Pueden ensayarse bibliotecas de compuestos usando los anticuerpos de la divulgación. Los compuestos de la biblioteca se pueden incubar con dicho anticuerpo en presencia y ausencia del TNFα. Un compuesto que forma parte de un complejo compuesto-trímero que se une a un anticuerpo de la divulgación solo en presencia tanto del TNFα como del compuesto es un candidato probable para tener la misma actividad que los compuestos descritos en el presente documento. Los ensayos divulgados en el presente documento pueden utilizarse después para verificar si el compuesto de prueba es un compuesto como se describe en el presente documento.
En el ensayo se pueden utilizar uno o más de los anticuerpos de la divulgación. Se puede utilizar un anticuerpo genérico que es capaz de unirse a complejos de cualquier compuesto de la invención con el TNFα en el ensayo de anticuerpos de la divulgación.
El ensayo de anticuerpos de la presente divulgación puede ser un ensayo de alto rendimiento que es capaz de seleccionar un gran número de compuestos de prueba en un corto espacio de tiempo para identificar compuestos de la presente invención.
El TNFα y sus receptores pueden estar purificados o presentes en mezclas, tal como en células cultivadas, muestras de tejido, líquidos corporales o medio de cultivo. Pueden desarrollarse ensayos cualitativos o cuantitativos, siendo este último útil para determinar los parámetros de unión (constantes de afinidad y cinética) del compuesto de prueba a formas triméricas de TNFα, y también de los parámetros de unión del complejo compuesto-trímero a TNFR1.
La muestra que comprende el TNFα y el compuesto puede comprender además un agente desestabilizador. Los agentes desestabilizadores, también conocidos como caótropos, incluyen concentraciones molares bajas (por ejemplo, 1 M) de urea, guanidina o acetonitrilo, concentraciones elevadas (por ejemplo, 6 M o más) de estos reactivos darán como resultado la disociación completa del trímero del TNFα y el despliegue de las subunidades monoméricas del TNFα constituyentes. El agente desestabilizador puede ser DMSO, normalmente a una concentración del 5 %, 10 % o superior.
Los compuestos de prueba pueden tener cualquiera o todas las propiedades indicadas anteriormente.
Indicaciones terapéuticas
El TNFα es el miembro arquetípico de la superfamilia del TNF. El TNFα es una citocina pleiotrópica que media en la regulación inmunitaria y las respuestas inflamatorias. También se sabe que, in vivo, el TNFα está implicado en las respuestas a infecciones bacterianas, parasitarias y víricas. En particular, se sabe que el TNFα tiene un papel en la artritis reumatoide (AR), enfermedades inflamatorias intestinales (incluyendo la enfermedad de Crohn), psoriasis, enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), dolor, epilepsia, osteoporosis, asma, septicemia, fiebre, lupus eritematoso sistémico (LES) y esclerosis múltiple (EM) y cáncer. También se sabe que el TNFα tiene un papel en la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), ictus isquémico, glomerulonefritis mediada por complejos inmunitarios, nefritis lúpica (NL), glomerulonefritis asociada a anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos (ANCA), enfermedad de cambio mínimo, nefropatía diabética (ND), lesión renal aguda (LRA), uropatía obstructiva, rechazo de aloinjerto de riñón, LRA inducida por cisplatino y uropatía obstructiva.
Los complejos de la invención pueden usarse (directa o indirectamente) para tratar, prevenir o mejorar cualquier afección que pueda tratarse, prevenirse o mejorarse por un antagonista convencional de TNFα. El complejo de la invención se puede usar solo o en combinación con un antagonista de TNFα convencional. Cualquier afección que sea resultado, parcial o totalmente, de la señalización patógena a través de un receptor de TNF por TNFα en principio puede tratarse, prevenirse o mejorarse de acuerdo con la presente invención. La señalización patógena a través de un receptor del TNF por TNFα incluye una señalización aumentada a través de un receptor del TNF por encima y por debajo del nivel fisiológico normal de señalización, señalización a través de un receptor del TNF que se inicia normalmente, pero que no se detiene en respuesta a las señales fisiológicas normales, y señalización a través de un receptor del TNF que está dentro del intervalo fisiológico normal de magnitud, pero que se inicia por medios no fisiológicos.
Por consiguiente, los complejos de la invención son beneficiosos en el tratamiento y/o la prevención de diversas dolencias humanas. Éstas incluyen trastornos autoinmunitarios e inflamatorios; trastornos neurológicos y neurodegenerativos; trastornos del dolor y nociceptivos; y trastornos cardiovasculares.
Los trastornos inflamatorios y autoinmunitarios incluyen trastornos autoinmunitarios sistémicos, trastornos endocrinos autoinmunitarios y trastornos autoinmunitarios específicos de órgano. Los trastornos autoinmunitarios sistémicos incluyen lupus eritematoso sistémico (LES), psoriasis, vasculitis, polimiositis, esclerodermia, esclerosis múltiple, espondilitis anquilosante, artritis reumatoide y síndrome de Sjögren. Los trastornos endocrinos autoinmunitarios incluyen tiroiditis. Algunos trastornos autoinmunitarios específicos de órgano incluyen enfermedad de Addison, anemia hemolítica o perniciosa, glomerulonefritis (incluyendo síndrome de Goodpasture), enfermedad de Graves, púrpura trombocitopénica idiopática, diabetes mellitus insulinodependiente, diabetes juvenil, uveítis, enfermedad inflamatoria intestinal (incluyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), pénfigo, dermatitis atópica, hepatitis autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria, neumonitis autoinmunitaria, carditis autoinmunitaria, miastenia grave, infertilidad espontánea, osteoporosis, asma y distrofia muscular (incluyendo la distrofia muscular de Duchenne).
Algunos trastornos neurológicos y neurodegenerativos incluyen enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, accidente cerebrovascular, esclerosis lateral amiotrófica, lesión de la médula espinal, traumatismo craneal, ataques y epilepsia.
Los trastornos cardiovasculares incluyen trombosis, hipertrofia cardíaca, hipertensión, contractilidad irregular del corazón (por ejemplo, durante la insuficiencia cardíaca) y trastornos sexuales (incluyendo disfunción eréctil y disfunción sexual femenina).
En particular, un complejo de la invención puede usarse para tratar o prevenir trastornos inflamatorios, trastornos del SNC, trastornos inmunitarios y enfermedades autoinmunitarias, dolor, osteoporosis, fiebre y rechazo de trasplante de órganos. En una realización preferida, un complejo de la invención puede usarse para tratar o prevenir artritis reumatoide, enfermedades inflamatorias intestinales (incluyendo la enfermedad de Crohn), psoriasis, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, epilepsia, asma, septicemia, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, asma, rinitis, cáncer y osteoporosis. En otra realización preferida, un complejo de la invención puede usarse para tratar o prevenir artritis reumatoide (AR), artritis inflamatoria no específica, enfermedad ósea erosiva, condritis, degeneración y/o destrucción de cartílago, artritis inflamatoria juvenil, enfermedad de Still (de aparición juvenil y/o adulta), artritis idiopática juvenil, artritis idiopática juvenil (tanto la forma oligoarticular como la poliarticular), enfermedades inflamatorias intestinales (incluyendo enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colitis indeterminada, reservoritis), psoriasis, artropatía psoriásica, espondilitis anquilosante, síndrome de Sjögren, enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Behçet, enfermedad de Parkinson (EP), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), ictus isquémico, dolor, epilepsia, osteoporosis, osteopenia, anemia de enfermedades crónicas, caquexia, diabetes, dislipidemia, síndrome metabólico, asma, enfermedad obstructiva crónica de las vías respiratorias (o pulmonar), septicemia, fiebre, síndrome de dificultad respiratoria, lupus eritematoso sistémico (LES), esclerosis múltiple (EM), glomerulonefritis mediada por complejos inmunitarios, nefritis lúpica (NL), glomerulonefritis asociada a anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos (ANCA), enfermedad de cambio mínimo, nefropatía diabética (ND), lesión renal aguda (LRA), uropatía obstructiva, rechazo de aloinjerto de riñón, LRA inducida por cisplatino y uropatía obstructiva, enfermedades oculares (incluyendo la retinopatía diabética, edema macular diabético, retinopatía de prematuridad, degeneración macular senil, edema macular, retinopatía proliferativa y/o no proliferativa, vascularización corneal incluyendo la neovascularización, oclusión de la vena retiniana, diversas formas de uveítis y queratitis), tiroiditis, trastornos fibrosantes, incluyendo diversas formas de fibrosis hepática, diversas formas de fibrosis pulmonar, esclerosis sistémica, esclerodermia, cáncer y complicaciones asociadas al cáncer (incluyendo complicaciones esqueléticas, caquexia y anemia). Composiciones farmacéuticas, dosificaciones y pautas posológicas
Los compuestos identificados por los métodos de la divulgación y los complejos compuesto-trímero de la invención y los trímeros del TNFα de la invención se formularán normalmente en composiciones farmacéuticas, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Tal como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares, que sean fisiológicamente compatibles. El vehículo puede ser adecuado para la administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraocular, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías de administración parenterales, por ejemplo, mediante inyección o infusión. Como alternativa, el vehículo puede ser adecuado para la administración no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa. En una realización preferida, el vehículo es adecuado para la administración oral. Dependiendo de la vía de administración, el antagonista puede estar revestido con un material para proteger el compuesto de la acción de los ácidos y otras condiciones naturales que puedan inactivar el compuesto.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que conserva la actividad biológica deseada del compuesto precursor y no confiere ningún efecto toxicológico no deseado. Los ejemplos de dichas sales incluyen sales de adición de ácidos y sales de adición de bases.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables preferidos comprenden vehículos o diluyentes acuosos. Los ejemplos de vehículos acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas incluyen agua, agua tamponada y solución salina. Los ejemplos de otros vehículos incluyen etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. Normalmente, las composiciones terapéuticas deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse en forma de una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco.
Las composiciones farmacéuticas pueden comprender principios activos adicionales.
También están dentro del alcance de la presente divulgación kits que comprenden compuestos identificados por los métodos de la divulgación y complejos de la invención (o trímeros del TNFα de la invención) e instrucciones de uso. El kit puede contener además uno o más reactivos adicionales, tales como un agente terapéutico o profiláctico adicional como se ha indicado anteriormente.
Los compuestos identificados por los métodos de la divulgación y los complejos compuesto-trímero de la presente invención (o trímeros del TNFα de la invención) o formulaciones o composiciones de los mismos pueden administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos.
En aplicaciones terapéuticas, los complejos compuesto-trímero se administran (directa o indirectamente) a un sujeto que ya padece un trastorno o afección como se ha descrito anteriormente, en una cantidad suficiente para curar, aliviar o detener parcialmente la afección o uno o más de sus síntomas. Dicho tratamiento terapéutico puede dar como resultado una disminución de la gravedad de los síntomas de la enfermedad o un aumento de la frecuencia o duración de los períodos sin síntomas. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una "cantidad terapéuticamente eficaz".
En aplicaciones profilácticas, se administran formulaciones a un sujeto en riesgo de padecer un trastorno o afección como se ha descrito anteriormente, en una cantidad suficiente para prevenir o reducir los efectos posteriores de la afección o uno o más de sus síntomas. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una "cantidad profilácticamente eficaz". Las cantidades eficaces para cada fin dependerán de la gravedad de la enfermedad o lesión, así como del peso y el estado general del sujeto.
Un sujeto para la administración puede ser un ser humano o animal no humano. La expresión "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc. Se prefiere la administración a seres humanos.
Un complejo compuesto-trímero de la presente invención se puede administrar a través de una o más vías de administración utilizando uno o más de una diversidad de métodos conocidos en la materia. Como apreciará el experto en la materia, la vía y/o el modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Los ejemplos de vías de administración para compuestos o complejos compuesto-trímero de la invención incluyen la administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraocular, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías de administración parenterales, por ejemplo, mediante inyección o infusión. La expresión "administración parenteral" como se usa en el presente documento significa modos de administración diferentes de la administración enteral y tópica, generalmente por inyección. Como alternativa, un complejo compuesto-trímero de la presente invención puede administrarse mediante una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa. En una realización, el complejo compuesto-trímero de la invención es para la administración oral. La administración indirecta también puede tener lugar como se describe en el presente documento.
Un médico especialista experto puede determinar una dosificación adecuada de un complejo compuesto-trímero de la invención. Los niveles reales de dosificación de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas pueden variarse para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para conseguir la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particular, sin que sean tóxicos para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una diversidad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares empleadas, la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se está empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, la afección, estado de salud general e historial médico previo del paciente que se está tratando, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.
Una dosis adecuada puede ser, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 0,01 µg/kg a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal, normalmente de aproximadamente 0,1 µg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, del paciente que se ha de tratar. Por ejemplo, una dosificación adecuada puede ser de aproximadamente 1 µg/kg a aproximadamente 10mg/kg de peso corporal por día, o de aproximadamente 10 µg/kg a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal por día.
Las pautas posológicas pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse una única dosis, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. La forma farmacéutica unitaria, como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente individuales adecuadas como dosis unitarias para los sujetos que han de tratarse; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido.
La administración puede ser en dosis únicas o múltiples. Pueden administrarse dosis múltiples a través de las mismas o diferentes vías y en el mismo o diferentes lugares. Como alternativa, las dosis pueden ser a través de una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia pueden variar dependiendo de la semivida del antagonista en el paciente y la duración del tratamiento deseado. Tal como se ha mencionado anteriormente, los complejos compuesto-trímero de la invención se pueden coadministrar con uno u otros agentes terapéuticos más. Por ejemplo, el otro agente puede ser un agente analgésico, anestésico, inmunosupresor o antiinflamatorio.
La administración combinada de dos o más agentes puede conseguirse de varias maneras diferentes. Ambos pueden administrarse juntos en una sola composición, o pueden administrarse en composiciones separadas como parte de una terapia combinada. Por ejemplo, uno puede administrarse antes, después o simultáneamente con el otro.
Cristales, determinación estructural usando los mismos, y métodos usando modelos en 3D
Los presentes inventores han descubierto que el trímero del TNFα de la invención (o los complejos de la invención) pueden cristalizarse con novedosos cristales adecuados para la difracción de rayos X y para la determinación estructural de los trímeros. Con cantidad de información estructural disponible, por primera vez la presente invención permite el uso de técnicas moleculares para identificar, seleccionar y diseñar entidades químicas (incluyendo los inhibidores, incluyendo los que comprenden los farmacóforos de la invención) que son capaces de unirse a la cavidad en el centro del trímero del TNFα de la invención.
Por consiguiente, se proporciona un cristal de trímero del TNFα con el grupo espacial P 212121 (el más común), P 21212, o P 1211. Los cristales se pueden fabricar de acuerdo con cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, descritos en el ejemplo 18 (o variaciones menores de los mismos).
En un aspecto, los cristales comprenden sTNFα, en particular sTNFα humano, por ejemplo, un polipéptido que comprende o consiste en residuos de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 35 o 36.
En aspectos de la divulgación, el cristal puede tener dimensiones de celda unitaria a = 54 Å ± 1-2 Å, b = 81 Å ± 1-2 Å, c = 93 Å ± 1-2 Å, alfa = 90 grados, beta = 90 grados y gamma = 90 grados (más común) o a = 47,7 Å ± 1-2 Å, b = 95,8 Å ± 1-2 Å, c = 100,7 Å ± 1-2 Å, alfa = 90 grados, beta = 99,1 grados y gamma = 90 grados.
En un aspecto, el cristal comprende cualquiera de los compuestos (1) -(64).
Los cristales se pueden usar para determinar la estructura del complejo o el trímero del TNFα de la invención en su interior, y el modelo en 3D resultante se puede almacenar en un ordenador y se puede usar en métodos para determinar compuestos de funcionamiento similar dentro de los complejos de la invención.
Así pues, además se proporciona un ordenador que comprende un código ejecutable para:
a) usar las coordenadas estructurales de un trímero del TNFα de acuerdo con cualquiera de Compuesto1.pdb a Compuesto64.pdb como un modelo tridimensional de un trímero del TNFα asimétrico;
b) analizar un bolsillo de unión en el centro del trímero en el modelo tridimensional; y
c) cribar in silico la biblioteca para moléculas pequeñas que encajen en dicho sitio de unión.
En una realización adicional, se proporciona un método para identificar un inhibidor potencial de un trímero de apo TNFα, que comprende las etapas de:
a) usar las coordenadas estructurales de un trímero del TNFα de acuerdo con cualquiera de Compuesto1.pdb a Compuesto64.pdb para generar un modelo tridimensional de un trímero del TNFα asimétrico;
b) identificar residuos de un bolsillo de unión en el centro del trímero en el modelo tridimensional;
c) generar una diana en 3-D específica usando los residuos del sitio de unión;
d) emplear la diana en 3-D específica para diseñar o seleccionar un inhibidor potencial del trímero del TNFα; e) obtener el inhibidor potencial; y
f) poner en contacto el inhibidor potencial con un trímero de apo TNFα in vitro para determinar la capacidad de dicho inhibidor potencial para interactuar con dicho trímero de apo TNFα,
de modo que la capacidad de interactuar es una indicación de que se determina dicho inhibidor potencial del trímero de apo TNFα.
También se proporciona un método para diseñar un compuesto que se une a un trímero de apo TNFα que comprende las etapas de:
a) usar las coordenadas atómicas de un trímero del TNFα de acuerdo con cualquiera de Compuesto1.pdb a Compuesto64.pdb para construir un modelo informático tridimensional de un bolsillo de unión en el centro del trímero del TNFα;
b) evaluar la complementariedad estereoquímica entre un compuesto y el bolsillo de unión;
c) optimizar la complementariedad estereoquímica en un enfoque iterativo mediante la observación de cambios en la proteína o compuesto que afectan a las asociaciones proteína/compuesto; y
d) diseñar un compuesto que optimice dicha complementariedad estereoquímica proteína/compuesto.
Además, se proporciona un método para identificar un inhibidor candidato que interactúa con un bolsillo de unión en el centro de un trímero de apo TNFα, que comprende las etapas de:
a) obtener un cristal de la invención;
b) obtener las coordenadas estructurales de aminoácidos del cristal de la etapa a);
c) generar un modelo en 3-D de un trímero del TNFα usando las coordenadas estructurales de los aminoácidos generados en la etapa b),
d) determinar un bolsillo de unión en el centro del trímero del TNFα a partir del modelo en 3-D;
e) realizar un análisis de ajuste informático para diseñar o identificar el inhibidor candidato que interactúa con el bolsillo de unión; y
f) poner en contacto el inhibidor candidato diseñado o identificado con un trímero de apo TNFα in vitro para determinar el efecto del inhibidor sobre la actividad de TNFα.
También se proporciona un método para identificar compuestos que se unen al trímero de apo TNFα, que comprende las etapas de:
a) obtener un modelo molecular en 3-D de un trímero del TNFα usando los cristales de la invención;
b) usar el modelo de a) en un método de diseño racional de fármacos para identificar compuestos candidatos que pueden unirse en el centro del trímero del TNFα; y
c) ensayar la actividad de TNFα en presencia de los compuestos candidatos de unión identificados en la etapa b) para identificar de este modo los compuestos que se unen al trímero de apo TNFα.
En general, se proporciona un uso de los cristales de la invención (o de las coordenadas estructurales de cualquiera de Compuesto1.pdb a Compuesto64.pdb) en la identificación de un inhibidor de un trímero de apo TNFα.
En el presente documento se describen ensayos para determinar si un compuesto se une a un complejo o TNFα de la invención.
El diseño de entidades químicas que se unen a o inhiben el bolsillo de unión de TNFα de acuerdo con esta invención generalmente implica la consideración de dos factores. En primer lugar, la entidad debe ser capaz de asociarse física y estructuralmente con partes o la totalidad del bolsillo de unión. Las interacciones moleculares no covalentes importantes en esta asociación incluyen enlaces de hidrógeno, interacciones de Van der Waals, interacciones hidrófobas e interacciones electrostáticas.
En segundo lugar, la entidad debe ser capaz de asumir una conformación que le permita asociarse directamente con el bolsillo de unión de TNFα. Aunque ciertas porciones de la entidad no participarán directamente en estas asociaciones, esas porciones de la entidad aún pueden influir en la conformación general de la molécula. Esto, a su vez, puede tener un impacto en la potencia. Dichos requisitos de conformación incluyen la estructura tridimensional general y la orientación de la entidad química en relación con la totalidad o una porción del bolsillo de unión, o la separación entre los grupos funcionales de una entidad que comprende varias entidades químicas que interactúan directamente con el bolsillo de unión de TNFα.
El efecto inhibidor o de unión potencial de una entidad química sobre el bolsillo de unión de TNFα puede analizarse antes de su síntesis real y probarse mediante el uso de técnicas de modelización por ordenador. Si la estructura teórica de la entidad dada sugiere una interacción y asociación insuficientes entre ella y el bolsillo de unión, se obvia la prueba de la entidad. Sin embargo, si la modelización por ordenador indica una fuerte interacción, el compuesto puede entonces sintetizarse y analizarse en cuanto a su capacidad para unirse al bolsillo de unión. Esto se puede lograr probando la capacidad de la molécula para inhibir la proteína TNFα usando los ensayos descritos en el presente documento. De esta manera, puede evitarse la síntesis de compuestos inoperantes.
Un inhibidor potencial del bolsillo de unión de TNFα puede evaluarse computacionalmente por medio de una serie de etapas en las que las entidades o fragmentos químicos se criban y seleccionaron por su capacidad para asociarse con el bolsillo de unión de TNFα.
Un experto en la materia puede usar uno de varios métodos para cribar entidades químicas o fragmentos por su capacidad para asociarse con el bolsillo de unión de TNFα. Este proceso puede comenzar con la inspección visual de, por ejemplo, un bolsillo de unión de TNFα en la pantalla del ordenador basado en las coordenadas de la estructura de TNFα en Compyesto1.pdb a Compuesto64.pdb, u otras coordenadas que definen una forma similar generada a partir de un medio de almacenamiento legible por máquina. Los fragmentos o entidades químicas seleccionados pueden colocarse en una variedad de orientaciones o acoplarse, dentro de ese bolsillo de unión. El acoplamiento se puede lograr utilizando software tal como QUANTA(R) [Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA; ahora parte de Accelrys, San Diego, CA] y SYBYL(R) [Tripos Associates, St. Louis, MO], seguido de minimización de energía y dinámica molecular con campos de fuerza de mecánica molecular estándar, tal como CHARMm(R) [Accelrys, San Diego, CA] y AMBER.
Los programas informáticos especializados también pueden ayudar en el proceso de selección de fragmentos o entidades químicas. Estas incluyen:
1. GRID [P. J. Goodford, "A Computational Procedure for Determining Energetically Favorable Binding Sites on Biologically Important Macromolecules", J. Med. Chem., 28, págs. 849-857 (1985)]. GRID está disponible en la Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido.
2. MCSS [A. Miranker et al, "Functionality Maps of Binding Sites: A Multiple Copy Simultaneous Search Method". Proteins: Structure, Function, and Genetics, 11, págs. 29-34 (1991)]. MCSS está disponible en Molecular Simulations, San Diego, CA.3. AUTODOCK [D. S. Goodsell et al, "Automated Docking of Substrates to Proteins by Simulated Annealing", Proteins: Structure, Function, and Genetics, 8, págs.195-202 (1990)]. AUTODOCK está disponible en el Instituto de Investigación Scripps, La Jolla, CA.
4. DOCK [I. D. Kuntz et al, "A Geometric Approach to Macromolecule-Ligand Interactions", J. Mol. Biol, 161, págs.
269-288 (1982)]. DOCK está disponible en la Universidad de California, San Francisco, CA.
5. GLIDE [Schrodinger, Portland, Oregón 97204, EE. UU.; Thomas A. Halgren, Robert B. Murphy, Richard A. Friesner, Hege S. Beard, Lea L. Frye, W. Thomas Pollard y Jay L. Banks "Glide: A New Approach for Rapid, Accurate Docking and Scoring.2. Enrichment Factors in Database Screening", J. Med. Chem., 47 (7), págs.1750 -1759 (2004)]
Una vez seleccionados los fragmentos o entidades químicas adecuadas, se pueden ensamblar en un solo compuesto o en un complejo de compuestos. El ensamblaje puede estar precedido por una inspección visual de la relación de los fragmentos entre sí en la imagen tridimensional presentada en una pantalla de ordenador en relación con las coordenadas de estructura de la proteína TNFα. A esto le seguiría la construcción manual de modelos utilizando software tal como QUANTA(R) y DISCOVERY STUDIO(R) [Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA; ahora parte de Accelrys, San Diego, CA], SYBYL(R) [Tripos Associates, St. Louis, MO] o MAESTRO [Schrodinger, Portland, Oregón 97204, EE. UU.], u OPENEYE [Copyright (C) 1997-2006, OpenEye Scientific Software, Santa Fe, NM 87508, EE. UU.].
Programas útiles para ayudar a los expertos en la materia a construir un inhibidor de un bolsillo de unión de TNFα de forma gradual, incluyendo un fragmento o entidad química a la vez, incluyen:
1. CAVEAT [P. A. Bartlett et al, "CAVEAT: A Program to Facilitate the Structure-Derived Design of Biologically Active Molecules", en Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems", Pub. Especial, Royal Chem. Soc, 78, págs. 182-196 (1989); G. Lauri y P. A. Bartlett, "CAVEAT: a Program to Facilitate the Design of Organic Molecules", J. Comput. Aided Mol. Des., 8, págs. 51-66 (1994)]. CAVEAT está disponible en la Universidad de California, Berkeley, CA.
2. Sistemas de base de datos en 3D tales como ISIS (MDL Information Systems, San Leandro, CA). Esta área se revisa en Y. C. Martin, "3D Database Searching in Drug Design", J. Med. Chem., 35, págs.2145-2154 (1992). 3. HOOK [M. B. Eisen et al., "HOOK: A Program for Finding Novel Molecular Architectures that Satisfy the Chemical and Steric Requirements of a Macromolecule Binding Site", Proteins: Struct., Fund, Genet., 19, págs. 199-221 (1994)]. HOOK está disponible en Molecular Simulations, San Diego, CA.
En lugar de proceder a construir un inhibidor de un bolsillo de unión de TNFα en forma gradual, un fragmento o entidad química a la vez como se ha descrito anteriormente, los compuestos inhibidores u otros compuestos que se unen al TNFα pueden diseñarse como un todo o "de novo" usando un bolsillo de unión vacío u opcionalmente incluyendo algunas porciones de un inhibidor conocido o que comprende el farmacóforo descrito en el presente documento. Hay muchos métodos de diseño de ligandos de novo que incluyen:
1. LUDI [H.-J. Bohm, "The Computer Program LUDI: A New Method for the De Novo Design of Enzyme Inhibitors", J. Comp. Aid. Molec. Design, 6, págs.61-78 (1992)]. LUDI está disponible en Molecular Simulations Incorporated, San Diego, CA; ahora Accelrys, San Diego,CA.
2. LEGEND [Y. Nishibata et al, Tetrahedron, 47, pág. 8985 (1991)]. LEGEND está disponible en Molecular Simulations Incorporated, San Diego, CA; ahora Acclerys, San Diego, CA.
3. LEAPFROG(R) [disponible en Tripos Associates, St. Louis, MO].
4. SPROUT [V. Gillet et al, "SPROUT: A Program for Structure Generation)", J. Comput. Aided Mol Design, 7, págs.
127-153 (1993)]. SPROUT está disponible en la Universidad de Leeds, Reino Unido.
5. NEWLEAD (V. Tschinke y N.C. Cohen, "The NEWLEAD Program: A New Method for the Design of Candidate Structures from Pharmacophoric Hypotheses", J. Med. Chem., 36, 3863-3870 (1993)).
También se pueden emplear otras técnicas de modelización molecular de acuerdo con esta invención [véase, por ejemplo, NC Cohen et al., "Molecular Modeling Software and Methods for Medicinal Chemistry, J. Med. Chem., 33, págs.883-894 (1990); véase también, M. A. Navia y M. A. Murcko, "The Use of Structural Information in Drug Design", Current Opinions in Structural Biology, 2, págs.202-210 (1992); L. M. Balbes et al., "A Perspective of Modern Methods in Computer-Aided Drug Design", Reviews in Computational Chemistry, Vol. 5, K. B. Lipkowitz y D. B. Boyd, Eds., VCH, Nueva York, págs.337-380 (1994); véase también, W. C. Guida, "Software For Structure-Based Drug Design", Curr. Opin. Struct. Biology, 4, págs.777-781 (1994)].
Una vez que una entidad química ha sido diseñada o seleccionada por los métodos anteriores, la eficiencia con la que esa entidad química puede unirse a un bolsillo de unión de TNFα puede probarse y optimizarse mediante evaluación computacional. Por ejemplo, un inhibidor del bolsillo de unión de TNFα eficaz debe demostrar preferentemente una diferencia de energía relativamente pequeña entre sus estados unido y libre (es decir, una pequeña energía de deformación de unión). Así pues, los inhibidores del bolsillo de unión al TNFα más eficientes deben diseñarse preferentemente con una energía de deformación de unión no mayor de aproximadamente 10 kcal/mol, más preferentemente, no mayor de 7 kcal/mol. Los inhibidores del bolsillo de unión de TNFα pueden interactuar con el bolsillo de unión en más de una conformación que es similar en la energía de unión general. En esos casos, la energía de deformación de unión se toma como la diferencia entre la energía de la entidad libre y la energía media de las conformaciones observadas cuando el inhibidor se une a la proteína.
Una entidad diseñada o seleccionada para unirse a un bolsillo de unión de TNFα puede optimizarse computacionalmente de manera que en su estado unido preferentemente carecería de interacción electrostática repulsiva con la enzima diana y con las moléculas de agua circundantes. Dichas interacciones electrostáticas no complementarias incluyen interacciones repulsivas carga-carga, dipolo-dipolo y carga-dipolo.
El software informático específico está disponible en la técnica para evaluar la energía de deformación del compuesto y las interacciones electrostáticas. Ejemplos de programas diseñados para dichos usos incluyen: Gaussian 94, revisión C [M. J. Frisch, Gaussian, Inc., Pittsburgh, PA (C) 1995]; AMBER, versión 4.1 [P. A. Kollman, Universidad de California en San Francisco, (C)1995]; QUAANTA(R)/ CHARMm(R) [Accelrys, San Diego, CA]; Insight II(R)/Discovery Studio(R) [Accelrys, San Diego, CA (C) 2001,2002]; DelPhi [Accelrys, San Diego, CA (C) 2001, 2002]; y AMSOL [Quantum Chemistry Program Exchange, Universidad de Indiana]. Estos programas pueden ser implementados, por ejemplo, utilizando una estación de trabajo Silicon Graphics(R) como una INDIG02 con gráficos "IMPACT™". Los expertos en la materia conocerán otros sistemas de hardware y paquetes de software.
Otro enfoque habilitado por esta invención es el cribado computacional de bases de datos de moléculas pequeñas para entidades químicas o compuestos que pueden unirse en su totalidad o en parte, a un bolsillo de unión de TNFα. En este cribado, la calidad del ajuste de dichas entidades al bolsillo de unión puede juzgarse por la complementariedad de la forma o por la energía de interacción estimada [EC Meng et al., J. Comp. Chem., 13, págs.505-524 (1992)]. De acuerdo con otra realización, la invención proporciona compuestos que se asocian con un bolsillo de unión al TNFα producido o identificado por el método expuesto anteriormente.
Otra técnica de diseño de fármacos particularmente útil que permite esta invención es el diseño iterativo de fármacos. El diseño iterativo de fármacos es un método para optimizar las asociaciones entre una proteína y un compuesto determinando y evaluando las estructuras tridimensionales de conjuntos sucesivos de complejos proteína/compuesto. En el diseño iterativo de fármacos, se obtienen cristales de una serie de proteínas o complejos proteicos y a continuación se resuelven las estructuras tridimensionales de cada cristal. Dicho enfoque proporciona información sobre la asociación entre las proteínas y los compuestos de cada complejo. Esto se logra seleccionando compuestos con actividad inhibidora, obteniendo cristales de este nuevo complejo proteína/compuesto, resolviendo la estructura tridimensional del complejo y comparando las asociaciones entre el nuevo complejo proteína/compuesto y los complejos proteína/compuesto resueltos previamente. Al observar cómo los cambios en el compuesto afectaron a las asociaciones proteína/compuesto, estas asociaciones pueden optimizarse. Las estructuras Compuesto1.pdb-Compuesto64.pdb se proporcionan para este propósito.
En algunos casos, el diseño iterativo de fármacos se lleva a cabo mediante la formación de complejos proteínacompuesto sucesivos y a continuación cristalizando cada nuevo complejo. Como alternativa, un cristal de proteína preformado se empapa en presencia de un inhibidor, formando así un complejo proteína/compuesto y obviando la necesidad de cristalizar cada complejo proteína/compuesto individual.
Los siguientes Ejemplos ilustran la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Síntesis de los compuestos de las fórmulas (1) -(64) y (65)
Ejemplo 1(A) - Síntesis de los compuestos de las fórmulas (1) -(63) y (65)
Figure imgf000031_0001
(continuación)
Figure imgf000032_0001
(continuación)
Figure imgf000033_0001
Ejemplo 1(B) - Síntesis del compuesto de fórmula (64).
Nomenclatura
Los compuestos se nombraron con la ayuda de ACD/Name Batch (Network) ver.12.0 o Accelyrs Draw 4.0 Abreviaturas
DCM: Diclorometano EtOAc: Acetato de
etilo
DMF: N,N-dimetilformamida MeOH: Metanol
DMSO: Dimetilsulfóxido SiO2: Sílice
Et2O: Dietil éter h: Hora
THF: Tetrahidrofurano TR: tiempo de
retención
t.a.: Temperatura ambiente MeCN: Acetonitrilo
a.: Ancho M: Masa
Salmuer
a: Solución acuosa saturada de cloruro de sodio
HPLC: Cromatografía líquida de alto rendimiento
CLEM: Cromatografía líquida-Espectrometría de masas
EN+: Ionización positiva por electronebulización
TEA: Trietilamina
CCF: cromatografía de capa fina
Condiciones analíticas
Todas las RMN se obtuvieron ya sea a 300 MHz o a 400 MHz.
Todas las reacciones que implican reactivos sensibles al aire o la humedad se realizaron en una atmósfera de nitrógeno usando disolventes y materiales de vidrio secados.
Todos los datos de CLEM de los compuestos se determinaron usando el método a continuación.
Método 1:
Waters Acquity-SQD, Waters Acquity UPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, columna de 1,7 µm
Fase móvil A: Formiato amónico 10 mM Amoniaco al 0,1 %
Fase móvil B: MeCN al 95 % H2O al 5 % Amoniaco al 0,1 %
Programa de gradiente (Caudal 1,0 ml/min, temperatura de la columna 40 °C):
Tiempo % de A % de B
0,00 95 5
0,50 95 5
1,75 5 95
2,00 5 95
2,25 95 5
Será evidente para un experto en la materia que pueden obtenerse tiempos de retención (TR) diferentes para datos de CLEM si se usan condiciones analíticas diferentes.
Las rotaciones ópticas se midieron usando un polarímetro Optical Activity PolAAR 2001.
PRODUCTO INTERMEDIO 1
Figure imgf000034_0001
(6-Bromo-7-fluoro-2-metilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)[2-(difluorometoxi)fenil]-metanol - Enantiómero A
El compuesto del título racémico se preparó siguiendo el procedimiento descrito en la solicitud de patente WO 2014/009295. La mezcla racémica preparada de este modo se separó en los enantiómeros constitutivos mediante cromatografía quiral como se detalla a continuación:
El compuesto del título se aisló mediante purificación de (6-Bromo-7-fluoro-2-metilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)[2-(difluorometoxi)fenil]-metanol racémico en condiciones LC en Chiralpak AD (100*500 mm*mm, flujo 300 ml/min, 30 °C, 2-PrOH/heptano 1/9, inyección de 230 ml de solución a una concentración de 7,5 g/l). Se recogió el primer enantiómero en eluir (TR 27 min) y se evaporaron las fracciones para producir enantiómero A. [α] -12,8°. Se recogió el segundo enantiómero en eluir (TR 50 min) y se evaporaron las fracciones para producir enantiómero B. [α] 12,7°
PRODUCTO INTERMEDIO 2
Figure imgf000034_0002
3-(trifluorometil)azetidin-3-ol
A una solución de 1-boc-3-azetidinona (11,3 g, 58,4 mmol,) y (trifluorometil)trimetilsilano (9,22g, 64,3 mmol) en THF (100 ml) enfriada a ~-5 °C en un baño de hielo/salmuera se le añadió fluoruro de cesio (9,77g, 64,3 mmol) en porciones. La mezcla resultante se dejó en agitación a t.a., el análisis por CCF después de 4 horas indicó el consumo total del material de partida y un componente menos polar. La reacción se interrumpió mediante la adición de una solución acuosa saturada de cloruro de amonio (100 ml) y la fase acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml). La fase orgánica se separó, se secó sobre sulfato sódico, se filtró y los extractos volátiles se retiraron al vacío para proporcionar un aceite en bruto. El aceite obtenido de este modo se disolvió en DCM (100 ml) y se añadió ácido trifluoroacético (40ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 h. Los extractos volátiles se retiraron al vacío y el residuo se destiló azeotrópicamente con tolueno (3 x 150 ml) para proporcionar la sal trifluoroacetato del compuesto del título en forma de un sólido de color pardo (15 g). RMN de 1H (400 MHz, d6 DMSO): δ/ppm 9,48 (s, 2H), 7,95 (d, J 0,3 Hz, 1H), 4,28 (d, J 13,1 Hz, 2H), 4,06 (m, 2H).
El compuesto obtenido de este modo se usó en la reacción posterior sin purificación adicional.
Figure imgf000035_0001
1-[5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)pirimidin-2-il]-3-(trifluorometil)azetidin-3-ol
A una solución de Intermedio 2 (12 g) en acetonitrilo (150 ml) se le añadieron TEA (30 ml) y 2-cloro-5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)pirimidina (16 g) y la reacción se agitó a 65 °C durante 18 h. Los disolventes se retiraron al vacío y el residuo sólido se trituró y se lavó con agua destilada para proporcionar un sólido de color beige y se secó a alto vacío para proporcionar el compuesto del título en forma de un sólido de color beige (18,5 g). RMN de 1H (300 MHz, d6 DMSO): δ/ppm 8,53 (2H, s), 7,46 (1H, s), 4,33-4,31 (2H, m), 4,10-4,08 (2H, m), 1,29 (12H, s). CLEM (EN+), TR 1,14 min, 346,0 (M+H)+.
COMPUESTO (64)
Figure imgf000035_0002
1-[5-[3-[(S)-[2-(difluorometoxi)fenil]-hidroxi-metil]-7-fluoro-2-metil-imidazo[1,2-a]piridin-6-il]pirimidina-2-il]-3-(trifluorometil)azetidin-3-ol (enantiómero A)
Una mezcla de Intermedio 1 (0,7 g, 2 mmol), El Intermedio 3 (0,7 g, 2 mmol), complejo de dicloruro de 1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno-paladio (II) diclorometano (36 mg, 0,044 mmol) y carbonato de sodio 2 M (2 ml) en dioxano (12 ml) se desgasificó y se sometió a reflujo durante 3 h. La mezcla de reacción enfriada se diluyó con EtOAc y se lavó dos veces con salmuera, la capa orgánica se secó (MgSO4) y se concentró al vacío. El residuo se sometió a cromatografía en columna ultrarrápida (SiO2, 0-90 % de EtOAc/heptano), produciendo el compuesto del título en forma de un sólido de color crema (500 mg, 50 %). RMN de 1H (300 MHz, DMSO-d6): δ 8,51 (m, 3H), 7,95 (dd, J1 = 2,3 Hz, J2 6,7 Hz, 1H), 7,46 (m, 2H), 7,36 (m, 2H), 7,12 (m, 2H), 6,42 (d, J 4,4 Hz, 1H), 6,18 (d, J 4,4 Hz, 1H), 4,35 (m, 2H), 4,13 (d, J 10,2 Hz, 2H), 2,12 (s, 3H). CLEM (EN+), TR 1,34 min, 540,0 (M+H)+. [α] 39,7°.
Ejemplo 2 - Cribados para compuestos que se unen a TNFα
Los compuestos de fórmulas (3) y (15) se han cribado usando el siguiente ensayo.
Se revistieron placas Meso Scale Discovery (MSD) de 384 pocillos sin revestir (unión convencional) durante la noche con el dominio extracelular de TNFR (TNFR-ECD) (10 µl, 1 ug/ml en PBS). Para asegurar una distribución uniforme, las placas se centrifugaron a 1000 rpm durante 2 minutos. A continuación, se sellaron las placas y se almacenaron a 4 C durante la noche.
Los pocillos de las placas se lavaron después tres veces en 50 µl de solución salina tamponada con fosfato, pH 6,5 (PB), con Tween 20 al 0,05 % (tampón de lavado) y después se bloquearon con 50 µl de BSA al 2 %. A continuación, las placas se incubaron a temperatura ambiente en un agitador (600 rpm) durante 2 horas. Después de esta incubación se lavaron las placas (3 x 50 µl de tampón de lavado por pocillo).
Durante la incubación de bloqueo, los compuestos de fórmulas (3) y (15) se preincubaron con TNF (R&D Systems) antes de la adición a las placas MSD prebloqueadas y lavadas. Para un ensayo de un solo punto como se muestra en la Figura 2A los compuestos se ensayaron a una concentración final de 100 µM (DMSO final al 5 % v/v).
Para la determinación de los valores de CE50 (Figura 2B y 2C) los compuestos de fórmulas (3) y (15) se diluyeron doble o triplemente en DMSO de tal manera que cuando se añadieron al ensayo la concentración más alta del compuesto de prueba fue 50 o 100 µM (DMSO al 5 % final v/v). Se añadieron compuestos prediluidos de fórmulas (3) y (15) en una relación de 1:1 a 4 ng/ml de TNF (concentración final 2 ng/ml) y después se incubaron a temperatura ambiente en un agitador a 600 rpm durante 1 hora.
Se añadieron 10 µl de mezclas preincubadas del compuesto de fórmulas (3) o (15) con TNFα a la placa MSD preparada y se incubaron a temperatura ambiente en un agitador durante 1 hora.
A continuación, las placas se lavaron con tampón de lavado (3 x 50 µl por pocillo). Después se añadió anticuerpo policlonal anti-TNF etiquetado con sulfo a cada pocillo y las placas se incubaron durante 1,5 horas más a temperatura ambiente en un agitador.
Las placas se lavaron después (3 x 50 µl de tampón de lavado por pocillo), seguido de la adición de 50 µl de tampón de lectura MSD T más tensioactivo (diluido 1 en 2 en H2O) y la lectura en un SECTOR Imager 6000.
Para los ensayos de un solo punto, se calculó el porcentaje de inhibición usando una muestra control sin compuesto. Para la determinación de CE50 los resultados se calcularon por medios convencionales usando un modelo logístico de 4 parámetros (modelo de respuesta a dosis sigmoidea).
Como puede observarse en la figura 2A, el compuesto marcado "SPD-304", que es representativo de los antagonistas de TNFα conocidos en la técnica, tiene un valor de % de inhibición de 80 %, indicando que este compuesto inhibe la unión de TNFα a su receptor. Por el contrario, varios de los compuestos probados, tienen valores de % de inhibición negativos, lo que indica que estos compuestos potencian la unión de TNFα al receptor de TNF.
Análogamente, las respuestas de concentración para los compuestos de fórmula (3) (Figura 2B) y fórmula (15) (Figura 2C) producen curvas de inhibición negativas. En otras palabras, la unión de TNFα al ECD-TNFR inmovilizado parece mejorar a medida que aumentan las concentraciones de los compuestos. Por esta razón, debe calcularse una CE50 (concentración de compuesto que da el 50 % del efecto total) en lugar de una CI50. En este caso la CE50 para el compuesto de fórmula (3) fue 4,6 µM y la CE50 para el compuesto de fórmula (15) fue 3,7 µM.
El BIA (análisis de interacción biomolecular) que usa resonancia de plasmón superficial también puede usarse para medir la unión mejorada inducida por el compuesto de TNFα al receptor de TNF. Para este fin se usó un Biacore A100/4000. En lo que se denomina un ensayo de competición/mejora en solución, el dominio extracelular del receptor de TNF (ECD-TNFR) se inmovilizó a pH 5 a un nivel de 1 KRU en un sensor CM5 en tampón HBS-P (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 0,15 M, Tensioactivo P20 al 0,005 %, BIAcore, GE Healthcare).
Los compuestos se diluyeron en serie dos veces de modo que la concentración más alta en el ensayo fuera 20 µM. Por ejemplo, un ensayo típico puede usar solución 20 µM, 10 µM, 5 µM, 2,5 µM, 1,25 µM, 0,625 µM, 0,312 µM, 0,156 µM, 0,078 µM, 0,039 µM de compuesto. Los compuestos se mezclaron con TNFα 0,5-1 nM y se equilibraron durante al menos 5 horas. Los compuestos control se probaron cada 10-15 ciclos. La mezcla de TNFα/compuesto se hizo fluir sobre TNFR inmovilizado durante 3 minutos seguido de regeneración de la superficie después de cada ciclo con una inyección de 30 ml de HCL 10 mM a un caudal de 30 ml/min. Las curvas de unión de sustracción de fondo se analizaron usando el software BIAevaluation siguiendo procedimientos convencionales. Los datos de CE50 se determinaron utilizando un ajuste logístico de cuatro parámetros. La Figura 3A y la Figura 3B muestran las curvas de progreso para los compuestos de fórmula (3) y fórmula (15), respectivamente. El valor de UR (unidad de resonancia) para TNFα en ausencia de compuesto se restó de las curvas, por lo que ahora solo muestran el aumento en la unión inducida por los compuestos. Las curvas de progreso se estabilizan a valores de UR más altos a medida que aumenta la concentración de compuesto. A partir de esto, puede calcularse un valor de CE50 determinando la concentración de compuesto que da un efecto máximo del 50 % utilizando el modelo de ajuste logístico de 4 parámetros. En estos experimentos se calculó que la CE50 para el compuesto de fórmula (3) era 298 nM y la del compuesto de fórmula (15) era 280 nM.
Cabe señalar que las CE50 muestran variabilidad entre ensayos y las condiciones para los ensayos Biacore y los ensayos MSD son muy diferentes. Como resultado, no se espera que las CE50 medidas sean idénticas para los dos formatos de ensayo.
Ejemplo 3 - Análisis espectrométrico de masas de la unión del compuesto 3 a TNFα
La espectrometría de masas se realizó típicamente usando un espectrómetro de masas Waters LCT-premier Time-of-Flight o un espectrómetro de masas Waters SynaptG2 Q-TOF. Las muestras se introdujeron usando un dispositivo de infusión de nanoflujo de nanomatos Advion Triversa que sustituye a la fuente de espectrómetro convencional, la inyección de la muestra se realizó mediante un chip de la serie "A" con un tamaño de boquilla de 5 µM a un caudal nominal de 100 nl/min. Las modificaciones adicionales al espectrómetro de masas de tiempo de vuelo de Waters LCT incluyen un dispositivo de enfriamiento de la fuente personalizado que permite un control preciso de la temperatura de la fuente y un dispositivo de regulación de la presión comercial que proporciona un control preciso sobre las condiciones de vacío en la región de la fuente. Juntas, estas modificaciones ayudan a retener el trímero TNFα en una conformación nativa, plegada y facilitan la detección de complejos formados con compuestos de prueba de afinidades débiles. Los ajustes típicos fueron Temperatura de la fuente: 10 °C, presión de la fuente 0,374 e -3 kPa (3,74 e -3 mbar), presión del analizador 0,154 e -6 kPa (1,54 e -6 mbar).
Los iones se generaron usando condiciones convencionales de electropulverización de iones positivos que dieron como resultado una carga múltiple de TNFα.
La espectrometría de masas es muy sensible a las sales tampón presentes en la muestra de proteína. Las sales tampón típicas, como los fosfatos de potasio o sodio, tienen un efecto muy perjudicial sobre la ionización. En consecuencia, las muestras de proteína se pretrataron para eliminar estas sales usando una columna de centrifugación de desalinización Zeba, intercambiándose la proteína en un sistema tampón compatible con espectrometría de masas, normalmente acetato de amonio 50 mM a pH 6,8.
En condiciones de ionización suave cuando se observa una transmisión del 100 % de las especies triméricas, en condiciones nativas en un entorno acuoso al 100 %, la forma trimérica se observa como una envolvente de estado de carga que comprende los iones 12, 13 y 14, con la adición de DMSO al 5 % v/v la envolvente del estado de carga cambia a m/z más bajo (z más alto), lo que indica que, como se esperaba, el codisolvente orgánico provoca un desplegamiento parcial en solución de las especies triméricas, también se detecta un aumento del nivel del monómero. Cuando se añade DMSO al 10 % v/v, sólo se observa la envolvente del estado de carga asociada con la forma monomérica, lo que indica que este nivel de DMSO interrumpe la formación de trímero en solución. Normalmente, los compuestos de prueba se presentaron como soluciones madre de DMSO 10 mM de tal manera que cuando se incuban con TNFα en solución, la concentración final de DMSO es del 5 %. En condiciones de ionización blanda se observa que la envolvente del estado de carga cambia a m/z más alto (z más bajo) en comparación no solo con el espectro de control de DMSO al 5 %, sino también con el espectro adquirido bajo 100 % acuoso lo que indica que los compuestos de prueba son capaces de superar el efecto desestabilizador del DMSO al 5 % y proporcionan una estabilización por encima de la observada en condiciones nativas. Esto se evidencia por los cambios en el número de cargas adquiridas por la proteína en las diversas condiciones descritas.
La velocidad "de asociación" medida es un producto aritmético de la constante de velocidad kon y la concentración del compuesto de prueba, a concentraciones elevadas del compuesto de prueba la velocidad observada es mayor que a concentraciones bajas. La medición experimental de la velocidad observada por espectrometría de masas a diferentes concentraciones del compuesto de prueba permite el valor de la constante de velocidad (kon) que se derivará. En un experimento típico, se prepara una mezcla del compuesto de prueba y el trímero de TNFα a la concentración deseada usando un robot Advion Triversa Nanomate a partir de soluciones madre de TNFα y el compuesto de prueba. A continuación, la muestra se infunde en el espectrómetro de masas durante varios minutos, tiempo durante el cual se registra la relación de las señales de TNFα libre y complejo TNFα/compuesto de prueba en el espectro de masas. Esto se repite para varias proporciones diferentes de compuesto de prueba/TNFα.
Los datos registrados para diferentes proporciones de compuesto de prueba/TNFα se ajustan después a la curva de asociación logarítmica de una fase teórica usando Graphpad PRISM v.5 para derivar el valor de kon. Esto confirmó el bajo valor de kon observado en el Biacore.
Los compuestos de prueba se prepararon como soluciones 10 mM en dimetilsulfóxido (DMSO). Por lo tanto, era necesario establecer el efecto de DMSO sobre el trímero de TNFα nativo en ausencia de un compuesto de prueba. Se añadió DMSO a una solución acuosa de trímero de TNFα para dar una concentración final del 5 % v/v y se adquirió el espectro de masas.
En un entorno acuoso al 100 %, es decir, en ausencia de DMSO, existe una gran proporción de TNFα en forma trimérica, con una proporción significativa del monómero TNFα. En un entorno acuoso al 100 %, la forma trimérica de TNFα se observa como una envolvente del estado de carga que comprende los iones 12, 13 y 14 (Figura 4, trazo inferior).
Se observó menos TNFα trimérico con la adición de DMSO al 5 % v/v. La envolvente del estado de carga cambió a una relación masa/carga más baja (m/z), lo que indica que el DMSO provocó el despliegue parcial de la especie trimérica. También se detectó un nivel aumentado de TNFα monomérico en presencia de DMSO al 5 % v/v.
Cuando se añadió DMSO al 10 % v/v, sólo se observó la envolvente del estado de carga asociada con la forma monomérica, lo que indica que este nivel de DMSO interrumpe la formación de trímeros de TNFα (Figura 4, trazo superior).
El compuesto de fórmula (3) se añadió a una solución que contenía TNFα y DMSO al 5 % v/v y se adquirió el espectro de masas. Se encontró que existía TNFα trimérico en la solución de DMSO al 5 % v/v en presencia del compuesto de fórmula (3) (Figura 4, trazo medio). La envolvente del estado de carga observada para el compuesto de TNFα unido a la fórmula 3 cambia a valores m/z más altos (exclusivamente 12 y 11), revelando que el compuesto de fórmula (3) no solo superó la débil influencia de despliegue del DMSO sobre el TNFα, sino que también dio como resultado una estabilización del complejo de TNFα trimérico por encima de la observada en ausencia de DMSO.
Para abordar la preocupación de que era necesario tener DMSO presente para debilitar el complejo de TNFα trimérico lo suficiente antes de que los compuestos de prueba pudieran unirse, se repitió el experimento con un compuesto soluble en agua en condiciones acuosas al 100 %. En ausencia de DMSO, el compuesto unido al complejo trimérico provocó el mismo cambio a una relación m/z más alta que se observó cuando estaba presente DMSO (datos no mostrados). Esto confirmó que los compuestos de prueba no necesitan que esté presente DMSO para unirse al trímero de TNFα y pueden ejercer su efecto estabilizador independientemente de la presencia de un agente desestabilizador. Se obtuvo evidencia adicional de la estabilización de la forma trimérica de TNFα por los compuestos de prueba analizando las muestras en condiciones de ionización más severas que tienden a favorecer la descomposición de la forma trimérica nativa en monómeros. Cuando se unió TNFα al compuesto de fórmula (3), la cantidad de monómero de TNFα detectado en estas condiciones se redujo significativamente (datos no mostrados). Esto sugiere que los compuestos de prueba protegen al trímero de TNFα de la alteración espectrométrica de masas.
Ejemplo 4 - Estequiometría del complejo TNFα- el compuesto de fórmula (3)
La incubación de una biblioteca de compuestos de prueba, incluyendo el compuesto de fórmula (3) con TNFα se controló mediante espectrometría de masas en condiciones de ionización suave. Los datos muestran la estequiometría de la unión como una molécula del compuesto de fórmula (3) por trímero de TNFα (Figura 5). No se observó que el compuesto de fórmula (3) se uniera a la forma monomérica de TNFα. No hubo evidencia de estabilización de la forma dimérica de TNFα. Esto confirma que los compuestos de prueba, incluyendo el compuesto de fórmula (3), tienen un modo de acción diferente al de los compuestos conocidos, que estabilizan la forma dimérica de TNFα.
Ejemplo 5 - Intercambio de monómeros en trímeros de TNFα
Homotrímeros humanos y de ratón de TNFα (H3 y M3 respectivamente) se incubaron juntos y se monitorizaron alícuotas de la solución mediante espectrometría de masas del aspecto de los heterotrímeros de especies cruzadas. El análisis de espectrometría de masas confirmó que el intercambio de monómeros entre los trímeros de TNFα nativos podía producirse en solución. El tipo de cambio fue lento y se controló durante un transcurso de 4 horas antes de que se lograra el equilibrio completo (datos no mostrados). El mecanismo es desconocido, aunque es poco probable que implique la formación de formas diméricas ya que no se observó ninguna de estas. Es probable que se produzca un intercambio de monómeros entre los trímeros puros de humanos y ratones, la mezcla de trímeros de ratón y humanos simplemente hace que este intercambio sea visible por espectrometría de masas.
En una segunda serie de experimentos, se incubó un exceso del compuesto de fórmula (3) con TNFα humano, después se retiró el exceso de compuesto de fórmula (3). El análisis espectral de masas confirmó que se había formado un complejo 1:1 entre el compuesto de fórmula (3) y h-TNFα. Se añadió ahora TNFα de ratón a esta muestra que se sometió después a análisis espectral de masas durante varias horas. Después de 18 horas no se observó ningún cambio en la composición de la muestra. Cabe destacar que no se ha producido ningún intercambio de subunidades de monómero, no se observó la formación de la especie heterotrimérica mixta libre como MH2 y M2H o ligada como MH2L y M2HL. Adicionalmente, no hubo evidencia de formación de la especie M3L ni evidencia de formación de la especie H3 no ligada. Esto sugiere fuertemente que una vez que el compuesto de fórmula (3) se une a h-TNFα, no hay una velocidad de disociación medible. Así pues, cuando se preincubó con h-TNFα, el compuesto de fórmula (3) bloqueó el trímero humano, por lo tanto, no se observó intercambio de subunidades de monómeros de especies cruzadas.
El experimento se repitió después a la inversa. El exceso de compuesto de fórmula 3 se incubó con TNFα de ratón, después se retiró el exceso de compuesto de fórmula (3). El análisis espectral de masas confirmó que se había formado un complejo 1:1 entre el compuesto de fórmula (3) y m-TNFα. Se añadió ahora TNFα humano a esta muestra que se sometió después a análisis espectral de masas durante varias horas. Los datos muestran claramente que puede producirse un intercambio de subunidades de monómeros, se observó la formación de la especie heterotrimérica mixta tanto en el estado libre (MH2 y M2H) como el estado ligado (MH2L y M2HL). Además, hubo evidencia de formación del homotrímero humano ligado (H3L), el homotrímero de ratón no ligado (M3) y para el compuesto no unido de fórmula (3) (L). Esto sugiere que, aunque se formó un complejo 1:1 entre el compuesto de fórmula (3) y el homotrímero del TNFα de ratón, hay una velocidad de disociación medible. Una vez que este complejo (M3L) se ha disociado, el intercambio de subunidades de monómero entre las especies H3 y M3 continúa y el ligando liberado es capaz de formar complejos con las 4 especies de trímeros presentes en solución. Así pues, cuando se preincuban con m-TNFα, el compuesto de fórmula (3) no evitó el intercambio de subunidades de monómeros y se observó la formación de heterotrímeros mixtos.
Estos dos experimentos se repitieron después con el compuesto de fórmula (15) en lugar del compuesto de fórmula (3). Los resultados cuando el compuesto de fórmula (15) se preincubó con h-TNFα para dar un complejo 1:1 y luego se mezcló con m-TNFα no ligado fueron los mismos que con el compuesto de fórmula (3). No se observó intercambio de subunidades de monómero, después de 18 horas solo se observaron las especies H3L y M3 en solución, lo que confirma que el compuesto de fórmula (15) tampoco tiene una tasa de desviación medible cuando forma complejo con h-TNFα. Así pues, cuando se preincubó con h-TNFα, el compuesto de fórmula (15) bloqueó el trímero humano, por lo tanto, no se observó intercambio de subunidades de monómeros de especies cruzadas.
Sin embargo, a diferencia del compuesto de fórmula (3), cuando el compuesto de fórmula (15) se preincubó con m-TNFα para formar un complejo 1:1 y después se mezcló con h-TNFα no ligado no se observó intercambio de subunidades de monómero, después de 18 horas solo se observaron las especies M3L y H3 en solución. Esto sugiere que el compuesto de fórmula (15) tampoco tiene una tasa de desviación medible cuando forma complejo con m-TNFα. Así pues, cuando se preincuban con m-TNFα, el compuesto de fórmula (15) bloqueó el trímero de ratón, por lo tanto, no se observó intercambio de subunidades de monómeros de especies cruzadas.
Juntos, estos datos sugieren que, si bien el compuesto de fórmula (3) y el compuesto de fórmula (15) tienen afinidades similares por el TNFα humano, los compuestos tienen diferentes afinidades por el trímero de TNFα de ratón, uniéndose el compuesto de fórmula (15) más estrechamente que el compuesto de fórmula (3) a este último.
Ejemplo 6 - Análisis espectrométrico de masas de fracciones de experimentos de exclusión por tamaño usando TNFα, TNF-R y el compuesto de fórmula (3)
Las fracciones de la separación cromatográfica de exclusión por tamaño de mezclas de TNFα, TNF-R y el compuesto de fórmula (3) se analizaron mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (CL-EM). Se prepararon dos muestras para cromatografía de exclusión por tamaño. En la primera muestra, el compuesto de fórmula (3) se incubó previamente con TNFα antes de la adición del complejo compuesto-trímero a TNF-R. En la segunda muestra, se añadió el compuesto de fórmula (3) a un complejo preformado de TNFα y TNF-R. El análisis CL-EM reveló que el compuesto de fórmula (3) estaba asociado con aquellas fracciones que contienen las dos proteínas (Figura 6), lo que sugiere que independientemente del orden de adición, el compuesto de fórmula (3) todavía es capaz de unirse a TNFα, es decir, que el compuesto de fórmula (3) se une a TNFα incluso en presencia de TNF-R.
Ejemplo 7 - Análisis calorimétrico isotérmico de TNFα y los complejos de compuesto de fórmula (15) - trímero de TNFα que se unen a TNF-R
TNFα (128 µM) en tampón ITC (HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) se incubó durante 60 minutos con una solución madre de DMSO del compuesto 2 dando una concentración final de compuesto de 300 mM en DMSO al 5 % (muestra de prueba). También se incubó una muestra de control en la que se añadió DMSO pero no compuesto a la muestra de TNFα durante 60 minutos (control).
Después de la incubación, las muestras se filtraron en gel en una columna de exclusión por tamaño Nap 5 (GE Healthcare). La columna se equilibró con 15 ml de tampón ITC antes de la adición de 500 µl de muestra que se pasó a la columna y después se eluyó usando 1 ml de tampón ITC. Este proceso separa el TNF y el TNF unido al compuesto del compuesto libre y DMSO.
Se usaron lecturas de absorbancia a 280 nm para determinar la concentración de TNFα en la muestra de prueba o el control después de la elución de la columna NAP 5 y las muestras se diluyeron hasta una concentración de TNFα de 64 µM.
Se cargaron 200 µl del dominio extracelular (ECD) de TNFR1 (10 mM) en la celda de muestra de un AutoITC200 (GE Healthcare) automáticamente (usando el protocolo Plates Standard B). En 2 experimentos se cargaron 40 µl de la muestra de prueba o del control en la jeringa de inyección automáticamente usando el mismo protocolo.
Los experimentos de ITC se realizaron utilizando el protocolo de inyección de ITC descrito en los gráficos de Isotermas (Figura 7A y B) a 25 grados centígrados agitando a 1000 rpm.
Los datos se recopilaron y analizaron utilizando aplicaciones de GE Healthcare ITC en el software Origin 4.0 y los resultados se calcularon usando un algoritmo de unión de un sitio.
Se calculó que la KD de la unión de TNFα a TNF-R en ausencia de cualquier compuesto de prueba era 77 nM (Figura 7A). La KD de la unión de TNFα a TNF-R en presencia del compuesto de fórmula (15) estaba por debajo del intervalo de sensibilidad del calorímetro y, por lo tanto, no pudo calcularse con precisión. Sin embargo, el calorímetro tiene un límite de sensibilidad más bajo de aproximadamente 1 nM. Por lo tanto, la KD de unión de TNFα a TNF-R en presencia del compuesto de fórmula (15) debe ser 1 nM o menor (véase la Figura 7B).
Ejemplo 8 - Neutralización de TNFα por compuestos de la invención
Los ensayos de neutralización de L929 se llevaron a cabo utilizando el protocolo descrito en Baarsch MJJ et al (Immunol Methods 1991; 140: 15-22) y Galloway CJ et al J (Immunol Methods 1991; 140: 37-43).
Brevemente, se cultivaron células L929 (ECACC, 85011425) en medio de cultivo que consistía en RPMI 1640 (Gibco) que contenía FCS (PAA) al 10 %, glutamina 2 mM (Gibco), penicilina 50 U/ml (Gibco) y estreptomicina 50 µg/ml (Gibco). Cuando se subcultivaron, las células se lavaron tres veces con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin calcio y magnesio (Gibco) y después se añadieron 3 ml de tripsina-EDTA (Gibco) durante 2 minutos para retirar las células del matraz. Se añadió medio de cultivo para neutralizar la tripsina y las células se pipetearon hacia arriba y hacia abajo para retirar cualquier grumo.
Las células L929 se dividieron 1/2 o 1/3 el día antes de su uso y se cultivaron durante 24 horas más. Los matraces se tripsinizaron después como se indicó anteriormente y se añadieron 2x104 células en 100 µl por pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos (Becton Dickinson). Las placas se cultivaron durante 24 horas antes de que se estableciera el ensayo.
Se hicieron diluciones en serie a partir de reservas de DMSO de los compuestos. Normalmente, se generaría una curva de valoración de 9 puntos diluyendo dos veces a partir de una solución concentrada de compuesto para obtener una concentración de ensayo final de 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,56, 0,78, 0,39, 0,2, 0,1 µM.
El medio de ensayo era el mismo que el medio de cultivo, pero también contenía 1 µg/ml de actinomicina D (Sigma). El medio se retiró de las placas y las muestras de ensayo más TNFα, los patrones y los controles se añadieron en volúmenes de 100 µl por duplicado. Las placas se incubaron durante 16 horas más y a continuación se añadieron 10 µl por pocillo de 5 mg/ml de solución de metiltiazol-tetrazolio (MTT; Sigma) en medio de cultivo durante 4 horas más. La reacción se detuvo mediante la adición de 100 µl de tampón de solubilización que contenía dodecilsulfato de sodio al 20 % (SDS, BDH) disuelto en dimetilformamida al 50 % (DMF; BDH) y agua desionizada al 50 %.
Después de la incubación durante la noche a 37 °C para permitir que el tinte se disuelva, las placas se leyeron en un lector de placas Multiskan EX (Labsystem) a 570 nm con sustracción a 630 nm. Los datos se analizaron usando el paquete de software Genesis.
Tanto el compuesto de fórmula (3) como el compuesto de fórmula (15) inhibieron la actividad destructora de células del TNFα humano (Figura 9), lo que indica que tanto el compuesto de fórmula (3) como el compuesto de fórmula (15) fueron capaces de inhiben la señalización inducida por TNFα humano a través de TNF-R. En este caso, el compuesto de fórmula (3) dio un valor de CI50 de 306 nM y el compuesto de fórmula (15) dio un valor de CI50 de 125 nM. El protocolo se repitió usando el compuesto de fórmula (39), que también se encontró que inhibe la señalización inducida por TNFα humano a través de TNF-R. Por lo tanto, el compuesto de fórmula (39) dio un valor de CI50 de 21 nM. Ejemplo 9 - Inhibición de la producción de IL-8 inducida por TNFα por el compuesto de fórmula (3)
La sangre venosa de donantes sanos se recogió por venupuntura en tubos que contenían sodio/heparina (BD Biosciences). Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll Paque (Amersham Biosciences). Brevemente, se diluyeron 10 ml de sangre 1:1 (v/v) con RPMI 1640 (Gibco) y se colocaron cuidadosamente en capas sobre 20 ml de Ficoll Paque. Las células se centrifugaron durante 30 minutos (min) a 470 g, se recogieron las PBMC, se lavaron una vez en RPMI 1640 y los eritrocitos contaminantes restantes se lisaron en tampón de lisis de eritrocitos (KHCO31 g/l, NH4Cl 8,3 g/l, EDTA 0,0372 g/l). El aislamiento de monocitos de las PBMC se realizó usando Microperlas magnéticas CD14+ (Miltenyi Biotec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, Las PBMC se resuspendieron en medio de Eagle modificado de Dulbecco que contenía BSA al 5 % (Sigma) y EDTA 2 mM (Sigma) a 1x107 células/ml.25 µl de microperlas CD14 por 107 células totales se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente. La separación magnética se realizó usando una columna LS (Miltenyi Biotec). Antes de la aplicación de la mezcla de células/perlas a la columna, la columna se colocó en el campo magnético y se lavó dos veces con 5 ml de tampón. La suspensión celular se aplicó después a la columna, en el campo magnético. Los monocitos que se unen a las microperlas de CD14+ se retuvieron en la columna LS mientras que las PBMC restantes pasaron a través de la columna. Para aislar monocitos, la columna (que contenía las células retenidas) se retiró del imán y se colocó en un tubo de recogida. Se añadieron 5 ml de tampón a la columna y las células CD14+ se recogieron de la columna aplicando un émbolo de jeringa en la parte superior de la columna. Las células recogidas se lavaron una vez en RPMI 1640.
Se realizó una dilución en serie triple de 11 puntos (incluyendo el blanco) de los compuestos (concentración de reserva 10 mM) en DMSO en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Los monocitos purificados se lavaron por centrifugación (300 g durante 5 minutos) y se resuspendieron en medio completo a una concentración de 1 x106 células/ml. Se incubaron 160 µl de esta población celular a 37 °C en una placa de fondo redondo de 96 pocillos con 40 µl de los compuestos y TNFα (concentración final ~1ng/ml) en RPMI 1640 o controles relevantes por triplicado. Después de 18 horas, se centrifugó la placa (300 g, 5 min) y se recogieron los sobrenadantes para la medición de citocinas.
La IL-8 humana se midió en los sobrenadantes del cultivo celular usando kits de ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) de R&D Systems Ltd. de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El sustrato usado para los ELISA fue TM Blue (Serologicals Corporation). Las placas se leyeron a una longitud de onda de 630 nm con corrección a 470 nm. El compuesto de fórmula (3) inhibió la producción de IL-8 inducida por TNFα de una manera dependiente de la concentración (Figura 10), con un valor de CI50 de 454,1 nM.
Ejemplo 10 - Inhibición de la activación de NF-κB inducida por TNFα por los compuestos de fórmulas (1)-(64) - el ensayo de gen indicador
La estimulación de células HEK-293 por TNF-alfa conduce a la activación de la ruta de NF-kB. La línea celular indicadora usada para determinar la actividad de TNF alfa se adquirió de Invivogen. HEK-BlueTM CD40L es un transfectante estable que expresa SEAP (fosfatasa alcalina secretada) bajo el control del promotor mínimo de IFN-beta fusionado con 5 sitios de unión a NF-kB. La secreción de SEAP por estas células se estimula de una manera dependiente de la concentración por TNF-alfa (0,5 ng/ml), IL-1-beta (0,5 ng/ml) y un anticuerpo activador anti-TNFR1 humano (300 ng/ml).
Los compuestos se diluyeron a partir de reservas de DMSO 10 mM (concentración de ensayo final de 0,3 %) para generar una curva de dilución en serie triple de 10 puntos (concentración final de 30.000 nM a 2 nM). Se mezclaron con ligando estimulante durante 1 hora en una placa de microtitulación de 384 pocillos. Se añadieron células recién descongeladas y lavadas a la mezcla de compuesto/estímulo y se incubaron adicionalmente durante 18 horas. La actividad SEAP se determinó en el sobrenadante utilizando el sustrato colorimétrico Quanti-blue TM (Invivogen). Se calcularon los porcentajes de inhibiciones para diluciones del compuesto entre un control de DMSO e inhibición máxima (por exceso de compuesto de control) y una CI50 calculada usando xlfit (modelo logístico de 4 parámetros) en ActivityBase.
La actividad específica del compuesto de fórmula (15) contra la respuesta de TNF-alfa se comparó con la observada con las pantallas de contraste (IL-1beta y anticuerpo anti-TNFR1 humano).
El compuesto de fórmula (15) inhibió la activación de NF-κB por TNFα de una manera dependiente de la concentración, con una CI50 de 113 nm (Figura 11A). Por el contrario, el compuesto de fórmula (15) no inhibió la activación de NF-κB por IL-1β (Figura 11B) o el anticuerpo de activación de TNF-R1 (Figura 11C). Por lo tanto, el compuesto de fórmula (15) inhibe específicamente la señalización inducida por TNFα a través del TNF-R1, pero no tiene ningún efecto sobre la activación de NF-κB inducida por otras rutas de señalización (como por IL-1 β), o cuando se omite el inicio de la señalización del TNF-R1 por TNFα (por ejemplo, mediante el uso de un anticuerpo de activación de TNF-R1).
Asimismo, cuando se someten a ensayo en el ensayo de gen indicador, también se encontró que los compuestos de fórmulas (1)-(64) inhibían la activación de NF-κB por TNFα de una manera dependiente de la concentración, que exhiben valores de CI50 de 50 µM o menos.
Ejemplo 11 - Determinación de la cinética de unión a TNFα
Se usó resonancia de plasmón superficial para medir la velocidad de asociación, la velocidad de disociación y la afinidad de los compuestos de fórmulas (3) y (15) por TNFα (Figura 12A y B). Para el fin de este estudio se usó un Biacore T100/T200.
Se inmovilizó TNFα a pH5 a un nivel de 5-8 KRU en un sensor CM5 en tampón HBS-P (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 0,15 M, Tensioactivo P20 al 0,005 %, BIAcore, GE Healthcare). El TNFα se equilibró después en HBS-P con DMSO al 5 % durante al menos 5 horas. Las muestras se diluyeron a partir de soluciones madre 10 mM en tampón emparejado con DMSO y se dejaron solubilizar durante al menos 5 horas. El caudal fue de 30 µl/min.
Este ensayo se realizó añadiendo 4 o 5 concentraciones de compuesto partiendo de una concentración más alta de 25 µM para el compuesto de fórmula (3) y 1 µM para el compuesto de fórmula (15) y después diluyendo en serie esta muestra. Las curvas de unión de sustracción de fondo se analizaron usando el software BIAevaluation siguiendo procedimientos convencionales. Los parámetros de unión, cinéticos y de afinidad se determinaron usando el software Biacore. Los datos cinéticos se ajustaron utilizando el algoritmo de levenberg marquardt.
El experimento mostró que estos compuestos se unen al TNFα inmovilizado muy lentamente como lo demuestra una kon de 15,668e3 M-1s-1 para el compuesto de fórmula (3) (Figura 12A) y 1,119e3 M-1s-1 para el compuesto de fórmula (2) (Figura 12B). También tienen velocidad de disociación notablemente lentas, lo que parece ser una característica de los compuestos con este modo de acción. La constante de velocidad de disociación (koff) para el compuesto de fórmula (3) es 9,46e-5 s-1 y para el compuesto de fórmula (15) es igual a 2,24e-5 s-1. Esto equivale a una semivida de disociación (t1/2) de más de 2 horas y 8 horas, respectivamente. La constante de disociación (KD) puede calcularse a partir de la relación de las dos constantes koff/kon. En este experimento los valores de KD para el compuesto de fórmula (3) y para el compuesto de fórmula (15) son 35 nM y 2 nM, respectivamente. Esto es significativamente más bajo que las CE50 determinadas en el Biacore que se muestra en el Ejemplo 3 y es probable que refleje las diferencias en el formato de los ensayos. Adicionalmente la forma de TNFα difiere en que en el ensayo cinético del Ejemplo 11 se inmoviliza el TNFα.
El experimento se repitió para medir la velocidad de asociación, la velocidad de disociación y la afinidad del compuesto de fórmula (39) por TNFα (Figura 12C). Se encontró que el compuesto de fórmula (39) tenía una kon de 5470 M-1s-1, una constante de velocidad de disociación de 4,067e-5 s-1 y una KD de 7 nM.
Ejemplo 12 - El compuesto de fórmula (3) y el compuesto de fórmula (15) antagonizan la actividad de TNFα in vivo En estudios separados, los compuestos de fórmula (3) y fórmula (15) se mezclaron con soluciones 20 µM de TNFα disuelto en solución salina tamponada con fosfato (PBS) hasta una concentración de 2 µM, 20µM y 200µM. La relación de cada compuesto con TNFα fue, por lo tanto, 0,1:1 (muestra 1), 1:1 (muestra 2) y 10:1 (muestra 3). Las soluciones se incubaron a temperatura ambiente durante 3 horas para permitir que los compuestos se unieran al TNFα, antes de la filtración en gel usando una columna de desalación Zeba Spin (Thermo Scientific). Este proceso separa el compuesto unido a la proteína y el compuesto libre. Una muestra de control que contenía solo PBS se procesó de la misma manera para proporcionar un control de vehículo para el estudio. La concentración de proteína eluida se determinó usando un Nanodrop (ND-1000). Los complejos de TNFα: compuesto se diluyeron en PBS hasta una concentración para inyección de 0,03 µg/kg.
Para el estudio, normalmente, cada grupo contenía 10 ratones macho Balb/c (Charles River) además de un control positivo de anticuerpo anti-TNFα humano, que usó un conjunto de 5 ratones. Se administró anti-hTNFα a ratones de control de anticuerpos a 10 mg/kg (100 µl) mediante inyección intraperitoneal (i.p.) cinco minutos antes (t = -5) de recibir una inyección i.p. de PBS o hTNFα a 0,1 µg/kg (t = 0).
Los ratones de prueba se inyectaron i.p. a t = 0 con 100 µl de vehículo filtrado en gel (PBS), hTNFα (0,03 µg/kg) o muestras 1, 2 y 3 (compuesto unido a TNFα en una proporción de 0,1:1, 1:1 y 10:1, respectivamente).
También se incluyeron en el estudio ratones con compuesto solo para evaluar el efecto del compuesto sobre el reclutamiento de neutrófilos.
Todos los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical dos horas después de la inyección de hTNFα (t = 2 h) y la cavidad peritoneal se lavó con 3 ml de tampón FACS (500 ml de PBS que contenía 2 g de albúmina de suero bovino, 6 ml de tampón HEPES y 500 ml de EDTA). Se aspiró el líquido de lavado y se evaluó el número de neutrófilos tiñendo las células con anti-Gr1 PE y anti-CD45 FITC por FACS como se detalla a continuación.
Se dividieron en alícuotas de 100 µl de líquido de lavado de cada muestra en tubos FACS. El cóctel AFACS se preparó usando PE anti-GR-1 (BD n.º de cat.553128 n.º de lote 75542) a una dilución de 1 en 39 y anti-CD45 FITC (BD n.º de cat. 553080 n.º de lote 80807) a una dilución de 1 en 19 en tampón FACS. Se preparó bloque Fc (BD n.º de cat.
553142 n.º de lote 87810) 1 en 10 con tampón FACS y se añadieron 10 µl a cada muestra 5 minutos antes de añadir el cóctel de anticuerpos. Se añadieron 10 µl de cóctel de anticuerpos a cada tubo que contenía los 100 µl de muestra. Las muestras se dejaron después en hielo durante 20 min. Se añadió 1 ml de solución de lisis FACS (BD n.º de cat.
349202 n.º de lote 29076, diluido 1:10 en dH20) a cada tubo, se mezcló y se dejó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se añadió después 1 ml de tampón FACS a cada tubo y se centrifugó a 400 g durante 5 minutos. El tampón FACS se vertió cuidadosamente después y se frotó la punta del tubo con papel absorbente para dejar el tubo completamente seco. A continuación, se añadieron a cada tubo 300 µl de solución de perlas de referencia 1 en 10 (Sigma n.º de cat. P2477 n.º de lote 116K1612) diluida en tampón FACS.
Las muestras se analizaron mediante el software FACScalibur II y FloJo.
La Figura 13 muestra los resultados para el compuesto de fórmula (3) (A) y el compuesto de fórmula (15) (B). El vehículo solo tuvo un efecto insignificante sobre el reclutamiento de neutrófilos al igual que el compuesto solo (ligeramente superior en (B)). La muestra 1 de cada estudio (proporción de compuesto: TNFα 0,1:1) no fue significativamente diferente de la adición de TNFα en ausencia del compuesto. La muestra 2 (1:1) y la muestra 3 (10:1) mostraron una inhibición significativa del reclutamiento de neutrófilos, (86 % y 85 % respectivamente). De forma similar, la muestra 2 y la muestra 3 del compuesto de fórmula (15) mostraron una inhibición significativa del reclutamiento de neutrófilos, (101 % y 102 % respectivamente). Los ratones de control de anticuerpos mostraron una inhibición del 100 % del reclutamiento de neutrófilos (datos no mostrados).
En un experimento adicional, los ratones se trataron con hTNFα (0,3 µg/ml) y el compuesto de fórmula (3) se administró por vía oral (p.o.).
El compuesto de fórmula (3) se preparó en una suspensión en un vehículo de metilcelulosa al 1 % usando una máquina Covaris.
También se utilizó un anticuerpo monoclonal anti-TNFα humano (anti-hTNFα, UCB) como un control positivo en este estudio.
Se usaron diez ratones Balb/c macho por grupo excepto en el grupo que recibió anti-hTNFα para el que se usaron 4 ratones.
Los ratones recibieron 100 µl de vehículo (metilcelulosa al 1 %) o compuesto de fórmula (3) a 30 mg/kg o 100 mg/kg p.o.30 minutos (t = -30) o anti-hTNFα a 10 mg/kg i.p.5 minutos (t = -5) antes de inyectarse con TNFα humano. A t = 0, los ratones se inyectaron con 100 µl i.p. de PBS o hTNFα a 0,03 µg/kg.
Todos los ratones se sacrificaron por dislocación cervical dos horas después de la inyección de hTNFα (t = 2 h) y se lavó la cavidad peritoneal y se midió el número de neutrófilos como se describió anteriormente.
La administración oral de 30 mg/kg y 100 mg/kg del compuesto de fórmula (3) redujo el reclutamiento de neutrófilos estimulado por TNFα en la cavidad peritoneal en un 49 % y un 79 %, respectivamente (Figura 14). El anticuerpo de control positivo (10 mg/kg) administrado mediante inyección i.p. inhibió completamente el reclutamiento de neutrófilos. Por lo tanto, el compuesto de fórmula (3) puede antagonizar la actividad de TNFα in vivo no solo cuando se premezcla con el TNFα y se administra por vía i.p., sino también cuando se administra por vía oral.
Ejemplo 13 - Análisis de la estabilización del trímero de TNFα por los compuestos de fórmulas (3) y (15)
Se realizó un ensayo de desnaturalización térmica con sonda de fluorescencia para evaluar el efecto de los compuestos sobre la estabilidad térmica del TNFα como medida de la unión del compuesto. La mezcla de reacción contenía 5 µl de colorante naranja SYPRO® 30x (Invitrogen) y 5 µl de TNFα (a 1,0 mg/ml), 37,5 µl de PBS, pH 7,4 y 2,5 µl de compuesto (a 2 mM en DMSO). Se dispensaron 10 µl de la mezcla por cuadruplicado en una placa de 384 pocillos ópticos de PCR y se procesaron en un sistema de PCR en tiempo real rápida 7900HT (Agilent Technologies). El dispositivo de calentamiento del sistema PCR se configuró entre 20 °C y 99 °C con una velocidad de rampa de 1,1 °C/min; los cambios de fluorescencia en los pocillos se controlaron mediante un dispositivo de carga acoplada (CCD). El aumento de la intensidad de la fluorescencia se representó en función de la temperatura y la Tm calculado como el punto medio de esta curva de desnaturalización (determinado como el punto de inflexión) (Tabla 1). La estabilización del TNFα está indicada por un aumento de Tm. Los compuestos de fórmulas (3) y (15) aumentan ambos la Tm de TNFα (como se muestra en la Tabla 1). Por lo tanto, ambos compuestos de fórmulas (3) y (15) aumentan la estabilidad del trímero de TNFα.
La Tabla 1 muestra el punto medio de la transición térmica (Tm) de TNFα en presencia de cualquiera del compuesto 3 o 15.
Figure imgf000043_0001
Ejemplo 14 - Ensayo de polarización de fluorescencia para determinar el efecto de los compuestos de fórmula (1)-(64) sobre la unión de un conjugado de fluorescencia a TNFα
Preparación del compuesto (A)
1-(2,5-Dimetilbencil)-6-[4-(piperazin-1-ilmetil)fenil]-2-(piridin-4-il-metil)-1H-benzoimidazol - denominado a continuación "Compuesto (A)" - se preparó mediante el procedimiento descrito en el Ejemplo 499 del documento WO 2013/186229 (publicado el 19 de diciembre de 2013).
Preparación de conjugado de fluorescencia
Compuesto (A) (27,02 mg, 0,0538 mmol) se disolvió en DMSO (2 ml). El éster de 5(-6)succinimil carboxi-fluoresceína (24,16 mg, 0,0510 mmol) (número de catálogo de Invitrogen: C1311) se disolvió en DMSO (1 ml) para dar una solución de color amarillo brillante. Las dos soluciones se mezclaron a temperatura ambiente, tornándose la mezcla de color rojo. La mezcla se agitó a temperatura ambiente. Poco después de mezclar se retiró una alícuota de 20 µl y se diluyó en una mezcla 80:20 de AcOH:H2O para el análisis de CL-EM en el sistema de CL-EM 1200RR-6140. El cromatograma mostró dos picos de elución cercanos en tiempos de retención de 1,42 y 1,50 minutos, ambos con una masa (M+H)+ = 860,8 uma, correspondiente a los dos productos formados con el grupo carboxifluoresceína 5 y 6 sustituido. Un máximo adicional en el tiempo de retención de 2,21 minutos tuvo una masa de (M+H)+ = 502,8 uma, correspondiente al Compuesto (A). No se observó ningún máximo para el éster de succinimilo 5(-6) carboxifluoresceína sin reaccionar. Las áreas máximas fueron el 22,0 %, el 39,6 % y el 31,4 % para las tres señales, lo que indica una conversión del 61,6 % en los dos isómeros del conjugado de fluorescencia deseado en ese punto temporal. Se extrajeron alícuotas adicionales de 20 µl después de varias horas y a continuación, después de agitar durante la noche, se diluyeron como antes y se sometieron a análisis CL-EM. El porcentaje de conversión se determinó como el 79,8 % y el 88,6 % respectivamente en estos puntos temporales. La mezcla se purificó en un sistema de HPLC preparativa dirigida por UV. Las fracciones purificadas reunidas se secaron por congelación para retirar el exceso de disolvente. Después de secarse por congelación, se recuperó un sólido naranja (23,3 mg), equivalente a 0,027 mmol de conjugado de fluorescencia, correspondiente a un rendimiento global del 53 % para la reacción y la purificación por HPLC preparativa.
Inhibición de la unión de conjugados de fluorescencia a TNFα
Los compuestos se sometieron a ensayo a 10 concentraciones a partir de 25 µM en una concentración final de ensayo de DMSO al 5 %, por preincubación con TNFα durante 60 minutos a temperatura ambiente en Tris 20 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,05 %, antes de la adición del conjugado de fluorescencia y una incubación adicional durante 20 horas a temperatura ambiente. Las concentraciones finales de TNFα y el conjugado de fluorescencia fueron 10 nM y 10 nM respectivamente en un volumen total de ensayo de 25 µl. Las placas se leyeron en un lector de placas capaz de detectar polarización de fluorescencia (por ejemplo, un lector de placas Analyst HT; o un lector de placas Envision). Se calculó un valor de CI50 utilizando XLfit™ (modelo logístico de 4 parámetros) en ActivityBase.
Cuando se sometieron a ensayo en el ensayo de polarización de fluorescencia, se encontró que todos los compuestos de fórmulas (1)-(64) de los Ejemplos adjuntos exhibían valores de CI50 de 50 µM o menos.
En un experimento adicional, el compuesto de fórmula (3) se probó a 10 concentraciones a partir de 100 µM a una concentración final de DMSO al 5 %, por preincubación con TNFα durante 60 minutos a temperatura ambiente en Tris 20 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,05 %, antes de la adición del conjugado de fluorescencia y una incubación adicional a temperatura ambiente durante la noche. Las concentraciones finales de TNFα y el conjugado de fluorescencia fueron 50 nM y 10 nM respectivamente en un volumen de ensayo total de 25 µl. Las placas se leyeron en un lector Analyst HT. Se calculó una CI50 usando xlfit (modelo logístico de 4 parámetros) en Activity Base.
Los resultados se ilustran gráficamente en la Figura 15. El compuesto de fórmula (3) pudo inhibir la unión del conjugado de fluorescencia a TNFα con un valor de CI50 de 167 nM.
El experimento se repitió usando los compuestos de fórmula (15) y (39). El compuesto de fórmula (15) pudo inhibir la unión del conjugado de fluorescencia a TNFα con un valor de CI50 de 102 nM. El compuesto de fórmula (39) pudo inhibir la unión del conjugado de fluorescencia a TNFα con un valor de CI50 de 20 nM.
Ejemplo 15 Derivación de anticuerpos
Después de la inmunización de 5 ratas Sprague Dawley con TNFα humano en un complejo con el compuesto de bencimidazol (15), se cultivaron linfocitos B inmunitarios en placas de 96 pocillos para inducir la expansión clonal y la secreción de anticuerpos (Tickle, S. et al., High throughput screening for high affinity antibodies Journal of Laboratory Automation 200914: 303-307). Los sobrenadantes del cultivo se seleccionaron para detectar anticuerpos IgG que se unían preferentemente a TNFα humano en un complejo con el compuesto (15) (en un exceso molar de 50 veces), en comparación con el apo TNFα humano, en un ensayo FMAT homogéneo basado en perlas. Se presentó TNFα humano (+/- compuesto (15)) en las superficies de las perlas (Bangs Beads revestidas de superavidina, número de catálogo CP01N) mediante un sistema de captura que utiliza una proteína de fusión TNF-Receptor I-Fc humana (número de catálogo de R&D Systems 372-R1-050), unida con Fc antihumano biotinilado (número de catálogo de Jackson 109-066-098).
Los anticuerpos que demostraron unión preferencial al complejo de TNFα y compuesto (15) se denominaron 'conformación selectiva' y se llevaron adelante para la clonación. Se utilizó el método Fluorescent Foci (Patente de EE. UU. 7993864/Europa EP1570267B1) para identificar y aislar linfocitos B específicos de antígeno de pocillos positivos, y se recogieron genes de región variable de anticuerpos específicos de células individuales mediante PCR de transcripción inversa (RT).
Las secuencias de aminoácidos de dos anticuerpos representativos, CA185_01974 y CA185_01979, que demostraron unión selectiva de conformación al compuesto TNFα tanto humano como de ratón se muestran a continuación: CA185_01974.0 (VR0001837)
Región variable de cadena ligera (LCVR) SEQ ID NO: 7 (CDR subrayadas)
Figure imgf000044_0001
Región variable de cadena pesada (HCVR) SEQ ID NO: 8 (CDR subrayadas)
Figure imgf000045_0002
CA185_01979.0 (VR0001842)
Región variable de cadena ligera (LCVR) SEQ ID NO: 22 (CDR subrayadas)
Figure imgf000045_0003
Región variable de cadena pesada (HCVR) SEQ ID NO: 23 (CDR subrayadas)
Figure imgf000045_0001
Ejemplo 16 - Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) para determinar las características de los anticuerpos
La unión específica de los fragmentos Fab de ratón se demostró mediante la formación de un complejo entre CA185_01974 y el TNFα humano en complejo con el compuesto (15) utilizando cromatografía de exclusión por tamaño (datos no mostrados). Con un exceso molar de 0,5x de Fab, el máximo predominante corresponde al Fab unido y el complejo de trímero y compuesto (aunque hay un pequeño máximo que muestra la presencia de algún complejo de trímero y compuesto no unido a Fab). A un exceso molar de 1,0x de Fab, existe un único máximo de peso molecular superior correspondiente al Fab unido al complejo de trímero y compuesto. A excesos molares de 1,5x y 2x de Fab, hay un máximo molecular inferior creciente correspondiente al Fab no unido.
Por lo tanto, se determinó que la estequiometría era 1 Fab: 1 trímero del TNFα, apareciendo un exceso de Fab a 1,5x y exceso molar 2x.
También se investigó la unión de CA185_01979 al TNFα humano en complejo con el compuesto (15) ando cromatografía de exclusión por tamaño (datos no mostrados). En cuanto a CA185_01974, se determinó que la estequiometría era 1 Fab: 1 trímero del TNFα, apareciendo un exceso de Fab a 1,5x y exceso molar 2x.
Ejemplo 17 - Ensayos BIAcore para determinar las características de los anticuerpos
La resonancia de plasmón superficial se realizó a 25 °C utilizando un BIAcore T200 (GE Healthcare). Se inmovilizó Fc antimurino (Jackson 115-006-071) en un chip sensor CM5 (GE Healthcare) mediante una química de acoplamiento de amina hasta un nivel de captura de ~6000 unidades de respuesta. Se utilizó tampón HBS-EP (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % (v/v) - GE Healthcare) DMSO al 1 % como tampón de desplazamiento. Se utilizó una inyección de 10 µl de cada IgG a 1 µg/ml para la captura por el Fc antirratón inmovilizado para crear la superficie de unión al TNFα. Se incubó de manera previa TNFα humano o de ratón (interno) a 50 nM con compuesto 2 µM en HBS-EP+ (DMSO al 1 %) durante 5 horas.
Se pasó una inyección de 3 minutos de TNFα humano o de ratón /- compuesto de prueba sobre cada IgG capturada a un caudal de 30 μl/min. La superficie se regeneró a un caudal de 10 µl/min mediante una inyección de 60 s de HCl 40 mM x2 y 30 s de NaOH 5 mM. Las curvas de unión restadas del fondo con doble referencia se analizaron utilizando el programa informático T200 Evaluation (versión 1.0) siguiendo procedimientos convencionales. Los parámetros cinéticos se determinaron a partir del algoritmo de ajuste.
Los datos de unión cinética para el TNFα humano y de ratón en presencia y ausencia de compuestos de prueba de dos series químicas se muestran en las tablas 2 y 3 a continuación.
Tabla 2 - Datos de BIAcore con TNFα humano
Figure imgf000046_0002
Tanto CA185_01974 como CA185_01979 demostraron una unión selectiva >2 log para el TNFα humano distorsionado por compuestos, con compuestos de prueba representativos de dos series químicas.
Tabla 3 - Datos de BIAcore con TNFα de ratón
Figure imgf000046_0003
Tanto CA185_01974 como CA185_01979 demostraron una unión selectiva >1,5 y >2 log para el TNFα de ratón con distorsión del compuesto, con compuestos de prueba representativos de dos series químicas.
Conclusiones
Se ha demostrado que los anticuerpos CA185_01974 y CA185_01989 se unen específicamente a un estado del TNFα distorsionado por el compuesto, y serán biomarcadores de interacción con el objetivo útiles para los detectar la estructura trimérica distorsionada de TNFα de la invención.
Se ha demostrado que los anticuerpos se unen a una conformación del TNFα, que está estabilizado de manera específica por compuestos de diferentes series químicas. Se prevé que estos anticuerpos se convertirán en patrones en la definición de estas, y están estrechamente relacionados, conformaciones biológicamente relevantes, del trímero del TNFα, que se estabilizan mediante una gama más amplia de series químicas que las que se describen en el presente documento. Según los datos mostrados, el trímero del TNFα humano podría considerarse estabilizado en la conformación biológicamente relevante definida descrita si el anticuerpo CA185_01974 o CA185_01989 se une con una KD mejor que 1 nM en el formato de ensayo BIAcore descrito anteriormente.
Ejemplo 18 - Estructuras cristalinas del TNFα trimérico unido a los compuestos de fórmulas (1)-(64)
La forma soluble del TNFα murino (VC 2043, UniProt P01375) se expresó como una proteína de fusión en E. coli y tenía la secuencia final:
Figure imgf000046_0001
La "S" inicial de la SEQ ID NO: 35 es un artefacto de clonación y no forma parte de la secuencia natural del TNF. La numeración de los restos de la SEQ ID NO: 35 comienza, por tanto, por la V, es decir, V1, R2, S3 etc. La SEQ ID NO: 36 representa la SEQ ID NO: 35, pero sin este resto "S" inicial, es decir,
Figure imgf000047_0001
Las células se precultivaron a 37 °C en medios ricos, se indujeron con la adición de arabinosa al 0,1 %, y se permitió la expresión hasta el día siguiente a 25 °C en vector pEMB54. Este vector introduce una etiqueta aminoterminal escindible de His6Smt. Las células se lisaron y se purificaron mediante cromatografía de quelato Ni-NTA. La proteína de fusión se eluyó con tampón que contenía imidazol y se escindió mediante la adición de proteasa. La proteína final del TNFα escindida se purificó mediante una etapa de cromatografía de quelato de Ni sustractiva para retirar la etiqueta de fusión y se purificó adicionalmente mediante una cromatografía de exclusión por tamaño para retirar las impurezas restantes. El producto final del TNFα se concentró normalmente hasta 20,0 mg/ml y se ultracongeló en nitrógeno líquido.
Se diluyó TNF humano purificado (20,0 mg/ml, VC 2043) a 4-7 mg/ml en tampón HEPES 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, seguido de una incubación durante la noche a 4 °C con compuesto 0,3-0,5 mM (exceso molar 1-2). Los complejos de compuestos de TNF se cristalizaron mediante difusión de vapor por gota sentada mezclando 0,5 µl de complejo con 0,5 µl de PEG 3350 al 21,44 %, Tris 100 mM, pH 9,0 (UCB1474433); o PEG 3350 al 22,0 %, glicina 100 mM, Tris 100 mM, pH 8,5 (UCB1480595); o PEG 3350 al 25,6 %, Tris 100 mM, pH 8,3, xilitol al 3 % (UCB5143079) u otra formulación con una concentración variable de precipitante o aditivos sobre 100 µl de la misma solución de cristalización. Otras formulaciones para otros compuestos incluyen un intervalo de PEG 3350 del 8-28 %. Otros aditivos similares a PEG incluyen PEG 1000 (8-18 %) o PEG 2000 (10-13 %). Otros aditivos incluyen MPD (5-13 %) o NaCl 200 mM. Otros tampones incluyen Hepes 100 mM (pH 7-8), Tris o bis-Tris 100 mM (pH 6,7-9,0). Otras soluciones de cristalización que no son PEG 3350 consisten en PEG 2000 (14-19 %), Hepes 100 mM, pH 8, arginina 25 mM; o PEG 10000 al 17 %, acetato de amonio 200 mM, bis-tris de 100 mM, pH 5,5; o PEG 2000 al 30 % MME, acetato de sodio 100 mM, Mes 100 mM, pH 6,5. Más detalles de las condiciones de cristalización y las celdas unitarias para cada compuesto se enumeran en la Tabla 4.
Los cristales se empaparon brevemente en etilenglicol y/o se vitrificaron directamente en nitrógeno líquido para la recopilación de datos.
Los datos de difracción de rayos X se recopilaron de una fuente de sincrotrón a una longitud de onda, lo más frecuentemente, de 0,976484 Å y registrado en el detector CCD. Los datos de difracción se redujeron con el paquete XDS (Kabsch, 2010a). La estructura del TNF□ humano (VC 2043) complejado con el compuesto se resolvió mediante reemplazo molecular utilizando Phaser con el modelo de entrada de 1TNF. Los datos se integraron en XDS y se escalaron usando XSCALE (Kabsh, 2010b). La construcción manual iterativa del modelo utilizando Coot (Emsley y Cowtan, 2004) y Refmac (Murshudov et al., 1997) continuó hasta que R y Rlibre convergieron. La calidad del modelo se validó usando Coot y MolProbity (Chen et al., 2010). La resolución de las estructuras fue con mayor frecuencia alrededor de 2,15 Å.
Las coordenadas atómicas para las 64 estructuras se dan en los Datos complementarios de la presente invención, cada estructura recibe el nombre de "Compuesto X" o "CompuestoX.pdb", siendo X el número de fórmula (X) del Compuesto en la Figura 1 que se encuentra en el centro de cada trímero.
Referencias:
Kabsch, W.2010a. XDS. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. Febrero; 66 (Pt 2): 1125-32. PMID: 20124692.
Kabsch W. 2010b. Integration, scaling, space-group assignment and post-refinement. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. Febrero; 66 (Pt 2): 133-44. PMID: 20124693.
Emsley, P. y Cowtan, K. 2004. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. Diciembre; 60 (Pt 12 Pt 1): 2126-32. PMID: 15572765.
Murshudov, G.N., Vagin, A.A. y Dodson, E.J. 1997. Refinement of macromolecular structures by the maximumlikelihood method. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr.1 de mayo; 53 (Pt 3): 240-55. PMID: 15299926.
Chen et al.2010. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. Enero; 66 (Pt 1): 12-21. PMID: 20057044.
Tabla 4.
Figure imgf000048_0001
(continuación)
Figure imgf000049_0001
(continuación)
Figure imgf000050_0001
Cuando el TNFα se preincubó con el compuesto de fórmula (3), el complejo compuesto-trímero resultante cristalizó, y la estructura cristalina del complejo compuesto-trímero de TNFα se determinó usando radiocristalografía, la estructura cristalina del complejo (resuelto a una resolución de 2,2 Å) se puede ver en la Figura 8. El compuesto puede verse en el medio del trímero que ya no es simétrico.
Con más detalle, cuando se mira una estructura cristalina de un trímero del TNFα desde el lado, tiene aproximadamente la forma de una pirámide/cono. Cuando se mira hacia abajo en el eje del trímero con los extremos N y C de los extremos del monómero apuntando hacia ti, entonces se mira el extremo "grueso" del trímero. En la estructura distorsionada con el compuesto, se abre una hendidura entre las subunidades A y C en la que, sin quedar ligados a teoría alguna, los Ab CA185_01974 y CA185_01979 se unen.
La cadena A, B o C puede determinarse mediante la medición de tres distancias entre tres átomos C-α de tres restos idénticos, por ejemplo, P117 en cada cadena (G121 también es adecuado).
Las tres distancias forman un triángulo equilátero en apo TNF, pero distorsionado cuando el compuesto está unido. La distancia más corta es entre BC y la más larga entre AC (por ejemplo, AC = 13,8 Å, AB = 12,3 Å, BC = 10,2 Å); por lo tanto, si se mira hacia abajo a través del eje de la molécula con los terminales N/C apuntando hacia ti, la distancia más larga define las cadenas C y luego A que van en sentido antihorario, después B y C de nuevo continuando en sentido antihorario.
Se ha identificado que la unión de los compuestos descritos en el presente documento a formas triméricas de TNF da como resultado un cambio conformacional en el trímero de TNF. En particular, el trímero de TNF adquiere una conformación deformada o distorsionada cuando se une a un compuesto como se divulga en el presente documento. Por ejemplo, cuando los compuestos (1)-(64) están unidos al dominio soluble del TNFα humano, el TNF conserva su estructura trimérica pero las subunidades A y C se alejan entre sí y A rota para generar una hendidura entre estas subunidades. Sin quedar ligados a teoría alguna, se cree que esta distorsión explica la capacidad del trímero para unirse a TNFR1 sin la activación normal del receptor.
Este movimiento de las subunidades también da como resultado un agrandamiento de la cavidad en el centro del trímero donde se unen los compuestos. Los compuestos (1)-(64) tienen entre 20 y 41 átomos que no son hidrógeno. Normalmente, el aumento en el área de superficie dentro de las estructuras de trímero de TNFα distorsionadas en relación con la estructura de apo TNFα 1A8M (usando el sistema The PYMOL Molecular Graphics System, Versión 1.7 Schrödinger, LLC; usando los comandos y ajustes: solvent_radius = 1.4Å, dot_solvent = 1, get_area) está entre 500-1000 Å2.
Ejemplo 19 - Análisis de estructuras cristalinas de TNFα trimérico unido a los compuestos de fórmulas (1)-(63), y determinación de que la estructura del trímero de TNFα distorsionado "Compuesto 64.pdb" está dentro de las estructuras del trímero de TNFα de la invención
Se llevaron a cabo cálculos de desviación cuadrática media (RMSD) para determinar la distancia de cada una de las estructuras cristalinas del trímero de TNFα distorsionado a una estructura de referencia.
Los cálculos de RMSD se realizaron usando el programa PyMOL (www.pymol.org). En este ejemplo, se usó la versión 1.7. El comando de PyMOL cmd.rms se usó con pares definidos de átomos. Los átomos usados fueron los Cα del esqueleto de ciertos residuos dentro de las cadenas β de TNFα. Los números de residuos utilizados se muestran a continuación:
12-18, 47-50, 54-64, 76-82, 91-97, 117-125, 129-137, 150-156
Estos números de residuos son los que están dentro de la estructura publicada de TNFα con código PDB 1A8M y dentro de las estructuras del trímero de TNFα distorsionado de esta invención. Los números de residuos también están de acuerdo con la secuencia de la SEQ ID NO:36. Se usaron los residuos en cada una de las tres cadenas con las estructuras de TNFα, (etiquetadas A, B, y C según nuestras instrucciones).
El comando cmd.rms se utilizó con los siguientes argumentos:
rms = cmd.rms("(en movimiento)", "(diana)", identificador de compatibilidad=4, silencioso=0, ciclos=0) donde "(en movimiento)" es la selección de átomos en una estructura de TNFα dada y "(diana)" es la selección de átomos equivalentes dentro de la estructura de referencia.
La RMSD se calculó para cada estructura contra todas las demás. Se eligió la "estructura representativa" o "Estructura de referencia" para que fuera la que tuviera la suma de RMSD más baja que todas las demás: la estructura "Compuesto 34" o "Compuesto34.pdb".
Los valores de RMSD, medidos en Angstroms, para las 63 estructuras restantes con referencia a la estructura del Compuesto 34 se muestran a continuación en la Tabla 5. La figura 16 muestra una superposición de las estructuras con la Estructura de referencia en negrita; las estructuras se agrupan muy cerca de la estructura de referencia, lo que indica la disposición trimérica de TNFα distorsionada común para las 64 estructuras.
Tabla 5
Figure imgf000052_0001
continuación
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La RMSD a la Estructura de Referencia de la forma apo del trímero de TNFα publicado como código PDB 1A8M es 2,35 Å.
Ejemplo 19-b): Determinación de que la estructura del trímero de TNFα distorsionado "Compuesto 64" está dentro de las estructuras del trímero de TNFα de la invención
La Estructura de referencia (Compuesto 34) y la Estructura de consulta (Compuesto 64) se superpusieron (véase la Figura 17 con la Estructura de referencia en negrita) mediante:
1. Lectura de archivos pdb para ambas estructuras cristalinas en PyMol
2. Crear selecciones para los átomos c-alfa residuales identificados para el Compuesto 64 (Compuesto64.pdb), por ejemplo "(en movimiento)" y la estructura de referencia (Compuesto34.pdb), por ejemplo, Estructuras cristalinas "(diana)". Debe haber 183 átomos seleccionados en cada estructura.
3. Cálculo de la desviación cuadrática media (RMSD) en Angstroms usando el comando rms dominio.
4. La RMSD es inferior a 0,9 Å (0,22 Å), por lo que la estructura de TNFα distorsionado del Compuesto 64 está dentro del alcance de la presente invención.
Registro de las entradas y respuestas de PyMol:
PyMOL> cargar Compuesto34.pdb
CmdLoad: "Compuesto34.pdb" cargado como "Compuesto34".
PyMOL> cargar Compuesto64.pdb
CmdLoad: "Compuesto64.pdb" cargado como " Compuesto64".
PyMOL>seleccionar en movimiento, Compuesto64 y nombre CA y (alt A o alt "\") y (resi 12-18 o resi 47-50 o resi 54-64 o resi 76-82 o resi 91-97 o resi 117-125 o resi 129-137 o resi 150-156) y (cadena A o cadena B o cadena C) Selector: selección "en movimiento2" definida con 183 átomos.
PyMOL>seleccionar diana, Compuesto34 y nombre CA y (alt A o alt "\") y (resi 12-18 o resi 47-50 o resi 54-64 o resi 76-82 o resi 91-97 o resi 117-125 o resi 129-137 o resi 150-156) y (cadena A o cadena B o cadena C) Selector: selección "diana2" definida con 183 átomos.
PyMOL>desde pymol import cmd
PyMOL>cmd.rms("(en movimiento)","(diana)",identificador de compatibilidad=4, silencioso=0, ciclos=0) Ejecutivo: RMS = 0,219 (183 a 183 átomos)
Ejemplo 19 c): Resolución de la estructura del trímero de TNFα distorsionado complejado con el Compuesto 65, y determinación de que la estructura está dentro de las estructuras del trímero de TNFα de la invención
TNFα humano purificado (30,0 mg/ml, VC 2043) [producido como se ha descrito anteriormente] se diluyó a 4 mg/ml en tampón HEPES 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, seguido de una incubación durante la noche a 4 °C con el compuesto 650,5 mM (exceso molar 1-2). El complejo TNFα-compuesto 65 se cristalizó por difusión de vapor por gota sentada mezclando 0,5 µl de complejo con 0,5 µl de PEG 2000 al 19 %, PEG 1000 al 15 %, L-arginina 20 mM, HEPES 0,1 M, a pH 8,0 sobre 100 µl de la misma solución de cristalización. Se recogieron cristales para la recopilación de datos aproximadamente 2 semanas después de la preparación inicial. Estos se empaparon brevemente en etilenglicol y se vitrificaron directamente en nitrógeno líquido para la recopilación de datos. La determinación de la estructura fue como se ha descrito anteriormente. Las estadísticas se muestran en la Tabla 5b a continuación.
Tabla 5b. Recopilación de datos y estadísticas del refinado
Figure imgf000054_0001
(continuación)
Figure imgf000055_0001
Se superpusieron la Estructura de Referencia (Compuesto 34) y la Estructura de Consulta (como se determinó anteriormente para el Compuesto 65) como se describe en el Ejemplo 19 b). La RMSD fue inferior a 0,9 Å (0,62 Å) y, por lo tanto, la estructura de TNFα distorsionado del Compuesto 65 estaba dentro del alcance de la presente invención. En cuanto a las estructuras descritas en el Ejemplo 21, el farmacóforo de la invención dentro del Compuesto 65 estaba dentro de los 4 Å de los mismos 7 residuos de TNFα.
Ejemplo 19 d) - Resultados de estructuras adicionales
Se generaron estructuras del trímero de TNFα distorsionado adicionales con compuestos adicionales y se analizaron como se ha descrito anteriormente. Todas tenían una RMSD inferior a 0,9 Å en comparación con la estructura de referencia (siendo la mayor de 0,85 Å.
Ejemplo 20 - Análisis de las cavidades dentro de estructuras cristalinas de TNFα trimérico distorsionado
El análisis de una estructura cristalina de un complejo Anticuerpo/Antígeno implica detallar interacciones importantes en la interfase parátopo/epítopo buscando contactos dentro de 4 Å. De forma similar, las 64 estructuras de TNFα trimérico distorsionado pueden analizarse en busca de aquellas interacciones importantes que se establecen consistentemente entre los residuos de TNFα y los compuestos en el centro del trímero.
Maestro del programa Schrodinger (Lanzamiento de Schrödinger 2014-4: Maestro, versión 10.0, Schrodinger, LLC., Nueva York, NY, 2014.) se utilizó para analizar las 64 estructuras cristalinas del trímero de TNFα distorsionado. Para cada estructura, se seleccionó un radio de 4 Å alrededor del ligando y todos los residuos del trímero de TNFα, situados dentro de este radio de 4 Å, se registraron.
La Figura 18 muestra un gráfico que ilustra el porcentaje de ligandos de las 64 estructuras del trímero del TNFα distorsionadas que están dentro de 4 Å de un residuo específico (específico de subunidad) en el trímero del TNFα. Se observó que 7 residuos siempre están dentro de 4 Å del ligando: Leu57 de la subunidad A, Tyr119 de la subunidad B, Gly121 de la subunidad B, Gly122 de la subunidad B, Leu120 de la subunidad C y Tyr151 de la subunidad C. Cabe señalar que los residuos de las tres subunidades siempre están implicados en la interacción; posiblemente una de las razones por las que se estabiliza la estructura del TNFα trimérico.
La Figura 19 muestra una imagen del núcleo de la estructura del trímero de TNFα distorsionado del Compuesto 1 que resalta todos los residuos anteriores que rodean al Compuesto 1.
Ejemplo 21 - Análisis del ajuste de farmacóforo en el centro de las estructuras del trímero de TNFα distorsionado de la invención
Se puede describir un farmacóforo de un ligando que interactúa con los 7 residuos de TNFα que siempre están dentro de 4 Å del ligando usando las estructuras de los Compuestos (1)-(64) y el programa Phase (Paquete de descubrimiento de fármacos de molécula pequeña 2015-1: Phase, versión 4.2, Schrodinger, LLC., Nueva York, NY, 2015; Dixon, S.L.; Smondyrev, A.M.; Knoll, E.H.; Rao, S.N.; Shaw, D.E.; Friesner, R.A., "PHASE: ANew Engine for Pharmacophore Perception, 3D QSAR Model Development, and 3D Database Screening.1. Methodology and Preliminary Results", J. Comput. Aided Mol. Des., 2006, 20, 647-671; Dixon, S.L.; Smondyrev, A.M.; Rao, S.N., "PHASE: A Novel Approach to Pharmacophore Modeling and 3D Database Searching", Chem. Biol. Drug Des., 2006, 67, 370-372).
Las características del farmacóforo dilucidado fueron las siguientes:
1) 2 anillos fusionados de 5 o 6 miembros (con centros en "R3" y "R2"), un anillo (con el centro en R2) con un aceptor de enlaces H ("A1") [que forma un enlace de hidrógeno con la cadena lateral de Tyr151 de la subunidad C] y que también se sustituye mediante un enlace de un átomo que no es hidrógeno a un anillo de 5 o 6 miembros adicional (con centro en "R4");
2) Donde las características pueden disponerse dentro de la estructura del trímero de TNFα distorsionado de acuerdo con la Tabla 6;
3) Donde uno o más de los anillos pueden ser aromáticos;
4) Donde uno o más de los anillos pueden ser heteroaromáticos;
5) Donde los anillos fusionados comparten 2 átomos;
6) Cuando el anillo R3 puede tener 5 o 6 miembros, el anillo R2 puede tener 5 o 6 miembros y el anillo R4 puede tener 5 o 6 miembros;
7) Donde el átomo de enlace que no es hidrógeno puede ser carbono, nitrógeno u oxígeno;
8) Donde A1 puede ser a través de un átomo de nitrógeno u oxígeno en el anillo R2;
9) Donde el sistema pi del anillo R2 puede formar una interacción CH-pi con la cadena lateral de Tyr59 en la subunidad C del trímero de TNFα;
10) Donde el sistema pi del anillo R3 puede formar una interacción de apilamiento pi con la cadena lateral de Tyr59 en la subunidad C del trímero de TNFα;
11) Donde el sistema pi del anillo R3 puede formar una interacción CH-pi con la cadena lateral de Leu57 en la subunidad A del trímero de TNFα;
12) Donde el sistema pi del anillo R4 puede formar una interacción CH-pi con la cadena lateral de Leu57 en la subunidad A del trímero de TNFα;
13) Donde una o más de las distancias entre las características R1, R2, R3 y A1 pueden estar de acuerdo con las de la Tabla 7 (aproximadamente, exactamente o dentro del 10 %);
14) Donde uno o más de los ángulos entre las características R1, R2, R3 y A1 pueden estar de acuerdo con las de la Tabla 8 (aproximadamente, exactamente o dentro del 10 %); definiendo el ángulo R3-R2-R4 una forma de plátano que puede estar involucrada en la desimetrización del trímero de TNFα;
15) Cuando el ligando que comprende el farmacóforo puede tener 20-41 átomos que no son hidrógeno.
Tabla 6
Figure imgf000056_0001
Tabla 7
Figure imgf000056_0003
Tabla 8
Figure imgf000056_0002
continuación
Figure imgf000057_0001
La Figura 20 muestra un ejemplo ilustrativo del farmacóforo que puede encajar dentro de la estructura del trímero del TNFα distorsionada de la invención que muestra la posición de los centros R2, R3 y R4 de las tres características del anillo, y la posición de la característica A1 del aceptor de enlaces de hidrógeno dentro del anillo R2. En este ejemplo, todas las características del anillo son aromáticas (siendo el anillo R2 heteroaromático), el átomo de enlace entre el anillo R2 y el anillo R4 es carbono, la característica A1 dentro del anillo R2 es un átomo de nitrógeno, el anillo R2 es un anillo de cinco miembros, los anillos R3 y R4 son de seis miembros, y con distancias y ángulos entre características de acuerdo con las Tablas 7 y 8.
Ejemplo 22 Efectos de moléculas pequeñas de TNF sobre TNF de membrana - señalización de TNFR2
Los inhibidores del TNFα existentes se unen y neutralizan tanto el TNFα soluble como el unido a la membrana (sTNFα y mTNFα, respectivamente) (Nesbitt et al. Inflamm Bowel Dis 200713:1323-1332).
Se sabe que el sTNFα tiene especificidad por el receptor TNFR1 y el mTNFα por el receptor TNFR2 (Grell et al. Cell 199583:793-802).
Los inhibidores existentes tienen advertencias de recuadro negro en sus etiquetas que describen las posibles consecuencias graves de su uso en el contexto de una infección grave (particularmente TB [tuberculosis], septicemia bacteriana e infecciones fúngicas) y neoplasia maligna (incluyendo linfoma).
Se sabe que la respuesta inmunitaria a la TB (así como a la Listeria) está impulsada por mTNFα (Garcia et al. Capítulo 20 p187-201 "Roles of Soluble and Membrane TNF and Related Ligands in Mycobacterial Infections: Effects of Selective and Non-selective TNF Inhibitors During Infection" en D. Wallach et al. (eds.), Advances in TNF Family Research, Advances in Experimental Medicine and Biology 691, DOI 10.1007/978-1-4419-6612-4_20).
Un inhibidor del TNFα en desarrollo que inhibe selectivamente sTNFα pero no mTNFα tiene las características de atenuar la artritis experimental sin suprimir la inmunidad innata a la infección (Zalevsky et al. J of Immunology 2007 179:1872-1883).
El presente ejemplo investiga cómo la conformación de mTNFα tras la unión de los compuestos descritos en el presente documento no afecta a la función de TNFR2; la señalización proximal y cadena abajo de TNFR2 no se ve alterada.
Se utilizó una línea de linfocitos B murinos (NS0-mTNF) que expresaba de manera estable TNF de membrana humano no escindible debido a una mutación en el sitio de escisión de TACE para desencadenar la señalización de TNFR2 en linfocitos T humanos primarios expandidos con PHA-L e IL-2. Los linfocitos T se expandieron a partir de PBMC que se aislaron inicialmente de sangre completa mediante centrifugación en gradiente de Ficoll y mostraron mayores niveles de TNFR2 después de la activación y expansión con PHA-L e IL-2. TNFR1 también estaba presente en estas células, pero se bloqueó utilizando un anticuerpo 5R16 anti-TNFR1 humano de ratón UCB.
Las células NS0-mTNF se cultivaron con NCE 10 µM durante 1 hora para permitir la unión de los Compuestos al TNF de membrana. A continuación, los linfocitos T se mezclaron con las células NS0-mTNF y después de un breve centrifugado para permitir el contacto célula-célula, las células se incubaron durante 5 minutos y a continuación se lisaron en tampón de lisis. El lisado se analizó en busca de dos eventos de señalización proximales y cadena abajo que demostraran la señalización de TNFR2. El primer reclutamiento de TRAF-2 al receptor TNFR2 se midió en experimentos de coinmunoprecipitación como medida de la señalización proximal a la membrana. Después de la lisis de las células, se aisló TNFR2 a partir del lisado usando anticuerpos policlonales de cabra anti-TNFR2 humano seguidos de purificación con perlas de proteína G Sepharose. A continuación, se midió TRAF-2 asociado a TNFR2 en inmunotransferencias después de desplazar la preparación de TNFR2 purificada en una SDS-PAGE. Adicionalmente, también se tomaron muestras del lisado celular completo para determinar la presencia de pNFκB usando SDS-PAGE e inmunotransferencias específicas de pNFκB.
Las células NSO-wt se usaron como control y mostraron un reclutamiento de TRAF-2 muy limitado al receptor TNFR2, así como una señalización baja de pNFκB cuando se mezclaron con linfocitos T primarios humanos expandidos. Por el contrario, la presencia de TNF de membrana en las células NS0 conduce a un fuerte reclutamiento de TRAF-2 y a una posible ubiquitinación debido al efecto de escalonamiento observado, que indica señalización proximal a la membrana específica de TNFR2. Además, se midió el aumento de los niveles de pNFκB en el lisado celular completo, que muestra la señalización TNFR2 cadena abajo. La presencia de los Compuestos no alteró la señalización proximal y descendente específica de TNFR2 y condujo a un reclutamiento similar de TRAF-2 a TNFR2 y niveles similares de pNFκB en lisados de células enteras. Por lo tanto, estos resultados muestran que la unión de los compuestos al TNF de membrana sobreexpresado en células NS0 no afecta a la señalización proximal a la membrana específica de TNFR2 (reclutamiento de TRAF-2 a TNFR2) y cadena abajo (presencia de pNFxB en lisados de células enteras). Parte detallada del método:
Cultivo de linfocitos T:
• Se cultivaron PBMC de 3 tres donantes diferentes en placas de 6 pocillos con 10 × 10^6 células por pocillo en 5 ml de RPMI1640 complementado con FCS al 10 %, suero humano al 1 %, HEPES GlutaMAX, 25 U/ml de hIL-2 (Roche) y 2 µg/ml de PHA-L (Sigma) para hacer crecer los linfocitos T
• después de 3 días, las células se resuspendieron y se cultivaron en matraces P2 de 75 cm con los mismos medios que antes, pero sin el PHA-L
• se controló el crecimiento del cultivo y se cambió el medio cada 3 días.
Cultivo de células NS0-mTNF y NSO-wt
• NSO-wt: DMEM con FCS y 10 %, NEAA y GlutaMAX
• NS0-mTNF: DMEM con FCS y 10 %, NEAA (las células se cultivaron sin GlutaMAX ya que se introdujo TNF de membrana en las células en un vector que expresa glutamina sintetasa para producir tanto glutamina como TNF de membrana; el uso de medios deficientes en glutamina mantiene las células seleccionadas para las células que expresan TNF de membrana.
IP y procedimiento de transferencia:
• preparar 500 µl de medio que contenga 10x10^6 células NS0-mTMF en RPMI FCS al 10 % HEPES GlutMAX - 20 µM (Compuesto 15, Compuesto 43 o Compuesto 39) o DMSO e incube durante 1 h a 37 °C para permitir la carga del compuesto en TNF. Esta es una solución 2x
• preparar 500 µl de 10x 10^6 células NSO-wt
• Después de 1 h, añadir 500 µl de linfocitos T humanos (50x10^6 células/prueba) en medios humanos a 37 °C. Los linfocitos T se preincubaron durante 15 minutos a 37 °C con 50 µg/ml de Fab-PEG anti-TNFR15R16 para bloquear la señalización a través de TNFR1 antes de añadirlas a las células NS0. Mezclar, centrifugar brevemente para que las células entren en contacto e incubar durante 5 min a 37 °C, centrifugar e inmediatamente lisar resuspendiendo el sedimento con 1 ml de tampón de lisis enfriado con hielo y lisar durante 1 h: NP-40 al 1 %, NaCl 150 mM, Tris 50 mM pH 8,0, NaF 25 mM Vanadato 1 mM -> a 10 ml de este tampón se le añadieron 100 µl de inhibidor de fosfatasa (Sigma P5726-5 ml) y 100 µl de inhibidor de fosfatasa (Sigma P2850), así como 20 µl de cóctel inhibidor de proteasa (Sigma-P8430)
• centrifugar 15 min a máxima velocidad en microcentrífuga y usar el sobrenadante. Guarde algo del sobrenadante para buscar pNFkB en transferencias
• añadir 5 µg de anti-hTNFR2 de cabra policlonal (R&D) e incubar durante la noche mientras se hace girar a 4 °C, a la mañana siguiente, añadir 20 µl de perlas de protG Sepharose durante otra hora a 4 °C mientras se ha girar • centrifugar y lavar las perlas 3 veces con tampón de lisis, a continuación, centrifugar y retirar la mayor cantidad de líquido posible, añadir tampón de muestra reductor de SDS-PAGE y hervir durante 10 minutos
• cargar 15 µl en un gel Bis-Tris al 4-12 % y desplazarlo durante 55 min a 200 V en tampón MOPS
• realizar transferencia usando el protocolo iBlot de 7 min en membrana de nitrocelulosa y bloquee en leche al 5 % en TBS/Tween al 0,05 % durante 2 h
• añadir anticuerpo primario (anti-TRAF-2 - 1:250 sc-136999 - Santa Cruz) en tampón de bloqueo e incubar durante la noche a 4 °C en incubadora roller en 5 ml
• lavar 3 veces con TBS/Tween al 0,05 %
• añadir anti-ratón-HRP secundario (1:2000) en el tampón de bloqueo durante 2 h a temperatura ambiente mientras se agita
• lavar 5 veces con TBS/Tween al 0,05 % y revelar
análisis de pNFkB:
• desplazar 10 µl de sup en gel Bis-Tris al 4-12 % en tampón MOPS durante 1 h a 200 V en condiciones reductoras y realizar transferencia en una membrana de nitrocelulosa usando el programa iBlot de 7 min.
• bloquear durante 2 horas a temperatura ambiente mientras se agita con leche al 5 % en TBS/Tween al 0,05 % • añadir anticuerpo anti-pNFkB 1:1000 (NEB-3033) y anti-GAPDH (1:4000 NEB) e incubar durante la noche a 4 °C en Falcon de 50 ml en incubadora roller
• lavar 3 veces con TBS/Tween al 0,05 % y añadir anti-HRP de conejo secundario (1:2000) en tampón de bloqueo durante 2 h a temperatura ambiente mientras se agita
• lavar 5 veces con TBS/Tween al 0,05 % y revelar
La Figura 21 es un gel que muestra el efecto de los Compuestos 15, 43 y 39 unidos a TNFα de membrana-indujeron señalización proximal y cadena abajo por TNFR2; la unión de los compuestos al TNFα de membrana sobreexpresado en células NS0 no afecta a la señalización proximal a la membrana específica de TNFR2 (reclutamiento de TRAF-2 a TNFR2) y cadena abajo (presencia de pNFxB en lisados de células enteras).
Ejemplo 23 - Los compuestos y complejos de Ma et al., (2014) y Silvian et al., (2011) tienen características diferentes a las de la presente divulgación
Como se describe en la página 12458 de Ma et al. (2014) JBC 289:12457-12466, se descubrió C87 a través de una selección virtual intentando encontrar moléculas que se ajustasen al espacio ocupado por un péptido de 7 aminoácidos del bucle 2/dominio 2 del TNFR1 en su interacción con la superficie externa del TNFβ. El compuesto C87 de Ma et al. y el compuesto BIO8898 de Silvian et al. (2011) ACS Chemical Biology 6:636-647 fueron sometidos a ensayo por los presentes inventores.
Sumario de los hallazgos
• Las observaciones de Biacore descritas en Ma et al. para C87 no pudieron repetirse.
• No se observó ninguna evidencia de inhibición específica del TNF en las células.
• Adicionalmente, no se observó que C87 se uniese mediante espectrometría de masas, que es sensible a afinidades milimolares.
• Ensayos de cristalografía exhaustivos solo produjeron apo-TNF (TNF sin compuesto).
• En el ensayo de polarización de fluorescencia (FP), C87 no mostró ninguna inhibición significativa por encima del nivel de interferencia del compuesto con la lectura fluorescente.
• El termoflúor, que mide la estabilización de la temperatura de fusión térmica del TNFα, mostró una pequeña estabilización para C87.
• Resumiendo, no se descubrió evidencia de que C87 se uniese en el centro del trímero. La abrumadora mayoría de los datos sugirió que no había interacción directa con TNFα. También se encontró que BIO8898 no se unía a TNFα.
Células - Ensayo de gen indicador HEK NFKB inducido por TNF
Se preincubó C87 con TNFα durante 1 hora antes de la adición a células HEK-293 transfectadas de forma estable con SEAP con el control de NFκB. También se sometió a ensayo una contraselección adecuada con el fin de detectar la actividad no relacionada con el TNF (fuera de la diana). El ensayo se incubó durante la noche antes de que se midiera la inhibición en comparación con el bloqueo del 100 % mediante un compuesto de control. La concentración máxima de C87 fue de 10.000 nM, con una dilución de 3 veces en serie. No se pudo detectar ningún efecto inhibidor que no pudiera atribuirse a la actividad fuera de la diana.
Biacore
Se inmovilizó TNF usando un enlazador avi-marcador y se hizo pasar C87 por encima del chip. En un experimento, se realizó una respuesta a la dosis de C87 a partir de una concentración máxima de 10 µM. No se observó ninguna unión. En un segundo experimento, el caudal de C87 que pasaba sobre el chip se redujo. Se observó un pequeño desplazamiento, pero la unión global fue insignificante. Es probable que la unión de C87 al TNF descrita en Ma et al sea superestequiométrica basándose en el valor de UR en el eje Y. A la densidad convencional del TNF en el chip este valor estaba en la región de treinta veces más alto de lo esperado para la unión simple 1:1.
En otro experimento, se sometió a ensayo BIO8898 frente a la forma soluble inmovilizada de CD40L y la forma soluble del TNFα mediante RPS en una máquina Biacore 4000. Se determinó una media geométrica de CI50 de 17 µM para la unión frente a CD40L, mientras que no se detectó ninguna unión a una concentración de hasta 100 µM para el TNFα en este ensayo.
Espectrometría de masas
No hubo pruebas de que C87 se uniese al TNFα humano (20 µM) a una concentración de 400 µM. Una especie de menor peso molecular (~473 Da parece unirse a menos del 5 % de ocupación). C87 tiene un peso molecular de 503 Da. Basándose en la ocupación a una concentración de 400 µM, se predice una afinidad de las especies de bajo peso molecular superior a 1 mM.
Cristalografía
En general, se hizo un gran esfuerzo para cristalizar C87 con TNFα, incluyendo las condiciones de ensayo que habitualmente funcionan con compuestos que se describen en la presente solicitud. Esto comprendió el establecimiento de un gran número de ensayos de cristalización a diferentes concentraciones de ligandos, diferentes concentraciones de proteínas y diferentes tiempos de remojo. Se observaron algunos cristales que, en el análisis, resultaron ser sal o TNF sin ningún compuesto.
Polarización fluorescente (FP)
Se preincubó C87 con TNFα durante 1 hora antes de someterlo a ensayo frente al compuesto fluorescente (sonda). La competencia con el compuesto fluorescente ya sea directamente (uniéndose en el mismo sitio) o indirectamente (alterando el TNF) se detecta mediante una reducción en la FP.
La extrapolación de la curva de inhibición produjo una CI50 de aproximadamente 100 µM. Se observó inactivación de la fluorescencia, sin embargo, a las concentraciones más altas de inhibidor que, cuando se restaron, dieron como resultado una inhibición insignificante de C87 en este ensayo.
Termoflúor
El termoflúor mide el cambio de temperatura de fusión (Tf) del TNFα debido a que el compuesto estabiliza o altera la proteína. Se observó un efecto de estabilización de 3,8 °C a una concentración de C87500 µM, lo que sugiere la posibilidad de una unión débil, que puede no ser específica.
Listado de secuencias
SEQ ID NO: 1 (LCDR1 de 1974)
QASQDIGN SEQ ID NO: 2 (LCDR2 de 1974)
GATSLAD SEQ ID NO: 3 (LCDR3 de 1974)
LQGQSTPYT SEQ ID NO: 4 (HCDR1 de 1974)
AYYMA SEQ ID NO: 5 (HCDR2 de 1974)
ASINYDGANTFYRDSVKG SEQ ID NO: 6 (HCDR3 de 1974)
EAYGYNSNWFGY SEQ ID NO: 7 (LCVR de 1974)
Figure imgf000060_0001
SEQ ID NO: 8 (HCVR de 1974)
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SEQ ID NO: 9 (ADN de LCVR de 1974)
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SEQ ID NO: 10 (ADN de HCVR de 1974)
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SEQ ID NO: 11 (LC κ completa de 1974)
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SEQ ID NO: 12 (HC de mIgG1 completa de 1974)
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SEQ ID NO: 13 (HC de mFab sin bisagra completa de 1974)
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SEQ ID NO: 14 (ADN de LC κ completa de 1974)
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SEQ ID NO: 15 (ADN de HC de mIgG1 completa de 1974)
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SEQ ID NO: 16 (ADN de HC de mFab sin bisagra completo de 1974)
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SEQ ID NO: 17 (LCDR2 de 1979)
GTTSLAD SEQ ID NO: 18 (LCDR3 de 1979)
LQAYSTPFTF SEQ ID NO: 19 (HCDR1 de 1979)
NSYWD SEQ ID NO: 20 (HCDR2 de 1979)
YINYSGSTGYNPSLKS SEQ ID NO: 21 (HCDR3 de 1979)
GTYGYNAYHFDY SEQ ID NO: 22 (LCVR de 1979)
Figure imgf000062_0003
SEQ ID NO: 23 (HCVR de 1979)
Figure imgf000062_0004
SEQ ID NO: 24 (ADN de LCVR de 1979)
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SEQ ID NO: 25 (ADN de HCVR de 1979)
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SEQ ID NO: 26 (LC κ completa de 1979)
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SEQ ID NO: 27 (HC de mIgG1 completa de 1979)
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SEQ ID NO: 28 (HC de mFab sin bisagra completa de 1979)
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SEQ ID NO: 29 (LC κ completa de 1979)
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SEQ ID NO: 30 (ADN de HC de mIgG1 completa de 1979)
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SEQ ID NO: 31 (ADN de HC de mFab sin bisagra completo de 1979)
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SEQ ID NO: 32 - TNFα de rata
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SEQ ID NO: 33 - TNFα de ratón
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SEQ ID NO: 34 - TNFα humano
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SEQ ID NO: 35 - Forma soluble de TNFα humano
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SEQ ID NO: 36 - Forma soluble de TNFα humano, pero sin el artefacto de clonación "S" de la SEQ ID NO: 35
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Datos complementarios: las coordenadas de la estructura atómica de las 64 estructuras de TNF alfa soluble humano complejado con los Compuestos (1) -(64) derivados por difracción de rayos X de los cristales. Las estructuras también se denominan Compuesto1.pdb - Compuesto64.pdb en el presente documento. Las coordenadas se pueden encontrar a continuación o en la memoria descriptiva PCT publicada de la que se deriva esta solicitud de patente.
COMPUESTO (1)
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COMPUESTO (2)
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COMPUESTO (3)
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COMPUESTO (4)
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COMPUESTO (5)
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COMPUESTO (6)
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COMPUESTO (7)
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COMPUESTO (8)
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COMPUESTO (9)
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COMPUESTO (10)
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COMPUESTO (11)
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COMPUESTO (12)
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COMPUESTO (13)
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COMPUESTO (15)
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COMPUESTO (16)
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COMPUESTO (17)
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COMPUESTO (18)
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COMPUESTO (19)
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COMPUESTO (20)
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COMPUESTO (21)
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COMPUESTO (22)
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COMPUESTO (23)
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COMPUESTO (24)
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COMPUESTO (25)
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COMPUESTO (26)
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COMPUESTO (27)
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COMPUESTO (28)
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COMPUESTO (29)
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COMPUESTO (32)
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COMPUESTO (33)
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COMPUESTO (34)
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COMPUESTO (35)
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COMPUESTO (36)
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COMPUESTO (37)
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COMPUESTO (38)
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COMPUESTO (39)
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COMPUESTO (40)
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COMPUESTO (41)
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COMPUESTO (42)
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COMPUESTO (43)
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COMPUESTO (44)
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COMPUESTO (45)
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COMPUESTO (46)
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COMPUESTO (47)
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COMPUESTO (48)
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COMPUESTO (49)
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COMPUESTO (50)
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COMPUESTO (51)
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COMPUESTO (52)
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COMPUESTO (53)
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COMPUESTO (54)
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COMPUESTO (55)
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COMPUESTO (56)
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COMPUESTO (57)
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COMPUESTO (58)
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COMPUESTO (59)
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COMPUESTO (60)
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COMPUESTO (61)
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COMPUESTO (62)
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COMPUESTO (63)
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COMPUESTO (64)
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Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un complejo que comprende un trímero del TNFα asimétrico de una subunidad de proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36, o la secuencia correspondiente, y un compuesto que es capaz de unirse al trímero del TNFα, en donde:
- dicho trímero del TNFα adopta una conformación, cuando se determina mediante radiocristalografía, con los átomos de Cα de los residuos 12-18, 47-50, 54-64, 76-82, 91-97, 117-125, 129-137 y 150-156 de la SEQ ID NO: 36, o la secuencia correspondiente, para todas las subunidades dentro de 0,9 Å RMSD de los mismos átomos del Compuesto34.pdb de estructura de referencia; y
el compuesto, como se determina mediante radiocristalografía, comprende un farmacóforo que se une dentro del trímero del TNFα de modo que está dentro de 4 Å de todos los siguientes residuos de la SEQ ID NO: 36: Leu57 de la subunidad A; Tyr119 de la subunidad B; Gly121 de la subunidad B; Gly122 de la subunidad B; Tyr59 de la subunidad C; Leu120 de la subunidad C; y Tyr151 de la subunidad C, o los residuos correspondientes de la secuencia correspondiente, y en donde el farmacóforo consiste en 2 anillos fusionados ("R3" y "R2"), en donde R3 es un anillo heteroaromático o aromático de seis miembros y R2 es un anillo heteroaromático de cinco miembros, y R2 tiene un aceptor de enlaces H ("A1") y que también está sustituido, a través de un átomo de enlace que no es hidrógeno, a un anillo de 5 o 6 miembros adicional ("R4"),
en donde dicho complejo es capaz de unirse a TNFR1, pero en donde la señalización de dicho TNFR1 unido se atenúa o antagoniza, para su uso en un método de terapia puesto en práctica en el cuerpo humano o animal.
2. El complejo para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el complejo es para su uso en el tratamiento y/o la prevención de uno o más trastornos autoinmunitarios e inflamatorios; trastornos neurológicos y neurodegenerativos; trastornos del dolor y nociceptivos; y trastornos cardiovasculares, tales como uno o más de artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, psoriasis, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y epilepsia.
3. El complejo para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde:
(a) la RMSD está dentro de 0,85, 0,8, 0,7, 0,65, 0,6, 0,5 o 0,47 Å; o
(b) la conformación se puede obtener o se obtiene a través del trímero del TNFα que forma un complejo con cualquiera de los compuestos (1)-(64), en donde los compuestos (1)-(64) tienen las siguientes estructuras:
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(continuación)
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4. El complejo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la secuencia correspondiente tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de un 80, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % con la SEQ ID NO: 36 a lo largo de la SEQ ID NO: 36.
5. El complejo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde:
(a) el anillo R4 es aromático o heteroaromático;
(b) los anillos fusionados comparten 2 átomos;
(c) el átomo de enlace que no es hidrógeno es carbono, nitrógeno u oxígeno;
(d) la característica A1 es a través de un átomo de nitrógeno u oxígeno en el anillo R2;
(e) la característica A1 presenta enlaces de hidrógeno con la cadena lateral de Tyr151 en la subunidad C del trímero del TNFα;
(f) el anillo R2, R3 y R4, y las características A1 están dispuestas dentro de la estructura del trímero del TNFα de acuerdo con la siguiente tabla:
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(g) una o más de las distancias entre las características R2, R3, R4 y A1 es/son exactamente o están dentro del 10 % del valor de acuerdo con la siguiente tabla:
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continuación
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(h) uno o más de los ángulos entre las caractersticas R2, R3, R4 y A1 esson exactamente o están dentro del 10 % del valor de acuerdo con la siguiente tabla:
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(i) el ángulo R3-R2-R4 define una forma de plátano involucrada en la desimetrización del trímero del TNFα; y/o (j) el compuesto que comprende el farmacóforo tiene 20-41 átomos que no son hidrógeno.
6. El complejo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la terapia es sobre el cuerpo humano.
7. El complejo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde:
(a) el trímero del TNFα antagoniza la señalización del receptor TNFR1; y/o
(b) el trímero del TNFα tiene una mayor estabilidad en comparación con la estabilidad de un trímero del TNFα simétrico, opcionalmente en donde el aumento de la estabilidad da como resultado un aumento del punto medio de transición térmica (Tm) del trímero del TNFα de al menos 1 °C, de al menos 10 °C, o está entre 10 °C y 20 °C; y/o
(c) el trímero del TNFα tiene una mayor afinidad de unión al receptor TNFR1 en comparación con la afinidad de unión de un trímero del TNFα simétrico al receptor TNFR1, opcionalmente en donde:
(i) el trímero del TNFα tiene una mayor afinidad de unión al receptor TNFR1 aumentando la velocidad de asociación (kon-r) y/o disminuyendo la velocidad de disociación (koff-r) en comparación con los valores de kon-r y koff-r para la unión del trímero del TNFα simétrico al receptor TNFR1; y/o
(ii) la KD-r del trímero del TNFα al receptor TNFR1 se reduce en comparación con la KD-r del trímero del TNFα simétrico al receptor TNFR1, en donde:
- la KD-r del trímero del TNFα al receptor TNFR1 se reduce en al menos 10 veces en comparación con la KD-r del trímero del TNFα simétrico al receptor TNFR1;
- el valor de KD-r del trímero del TNFα al receptor TNFR1 es menor de 10 nM; o
- la KD-r del trímero del TNFα al receptor TNFR1 se reduce en al menos 4 veces en comparación con la KD-r del trímero del TNFα simétrico al receptor TNFR1;
- el valor de KD-r del trímero del TNFα al receptor TNFR1 es menor de 600 pM, opcionalmente en donde el valor de KD-r del trímero del TNFα al receptor TNFR1 es menor de 200 pM.
8. El complejo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde:
(a) dicho trímero del TNFα se une a cualquiera de los siguientes anticuerpos con una KD-ab de 1 nM o menos: CA185_1979 con una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 26 y cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 27; o CA185_1974 con una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 11 y cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 12; y/o
(b) el trímero del TNFα es TNFα soluble, TNFα unido a membrana, o tanto TNFα soluble como TNFα unido a membrana; y/o
(c) el trímero del TNFα comprende o consiste en la secuencia proteica de la SEQ ID NO:36.
9. El complejo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el uso no induce ni hace que empeore una infección y/o neoplasia maligna.
10. El complejo para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la infección es TB y/o septicemia bacteriana y/o infección fúngica o la neoplasia maligna es linfoma.
11. Un ordenador que comprende código ejecutable para:
a) usar las coordenadas estructurales de un trímero del TNFα de acuerdo con cualquiera de Compuesto1.pdb a Compuesto64.pdb como un modelo tridimensional de un trímero del TNFα asimétrico;
b) analizar un bolsillo de unión en el centro del trímero en el modelo tridimensional; y
c) cribar in silico la biblioteca para moléculas pequeñas que encajen en dicho sitio de unión.
12. Un método para identificar un inhibidor potencial de un trímero de apo TNFα, que comprende las etapas de: a) usar las coordenadas estructurales de un trímero del TNFα de acuerdo con cualquiera de Compuesto1.pdb a Compuesto64.pdb para generar un modelo tridimensional de un trímero del TNFα asimétrico;
b) identificar residuos de un bolsillo de unión en el centro del trímero en el modelo tridimensional;
c) generar una diana en 3-D específica usando los residuos del sitio de unión;
d) emplear la diana en 3-D específica para diseñar o seleccionar un inhibidor potencial del trímero del TNFα; e) obtener el inhibidor potencial; y
f) poner en contacto el inhibidor potencial con un trímero de apo TNFα in vitro para determinar la capacidad de dicho inhibidor potencial para interactuar con dicho trímero de apo TNFα,
de modo que la capacidad de interactuar es una indicación de que se determina dicho inhibidor potencial del trímero de apo TNFα.
13. Un método para diseñar un compuesto que se une a un trímero de apo TNFα que comprende las etapas de: a) usar las coordenadas atómicas de un trímero del TNFα de acuerdo con cualquiera de Compuesto1.pdb a Compuesto64.pdb para construir un modelo informático tridimensional de un bolsillo de unión en el centro del trímero del TNFα;
b) evaluar la complementariedad estereoquímica entre un compuesto y el bolsillo de unión;
c) optimizar la complementariedad estereoquímica en un enfoque iterativo mediante la observación de cambios en la proteína o compuesto que afectan a las asociaciones proteína/compuesto; y
d) diseñar un compuesto que optimice dicha complementariedad estereoquímica proteína/compuesto.
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