KR20150099576A - 키메라 항원 수용체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항원이 T 세포 보조억제 단백질, 예컨대, CTLA4 또는 PD-1로부터 유래되는 경막 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합할 때 면역 세포, 예를 들면, T 림프구를 표적 항원으로 향하게 할 수 있고 T 세포가 증식하게 할 수 있거나 항원을 디스플레이하는 세포를 사멸시키게 할 수 있는 치료 폴리펩티드, 예를 들면, 키메라 항원 수용체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드를 발현하는 T 림프구, 및 질환, 예컨대, 암을 치료하기 위한 이러한 T 림프구의 용도에 관한 것이다.

Description

키메라 항원 수용체{CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS}
본원은 2012년 12월 20일자로 출원된 미국 가출원 제61/740,113호, 및 2013년 3월 13일자로 출원된 미국 가출원 제61/779,925호(이들 각각은 전체로서 본원에 참고로 도입됨)를 우선권 주장한다.
본 발명은 면역학 분야, 보다 구체적으로 T 림프구 또는 다른 면역 세포의 변경에 관한 것이다.
면역 시스템의 세포, 예컨대, T 림프구(T 세포로서도 지칭됨)는 특이적 항원을 인식하거나 이러한 항원과 상호작용할 때 세포의 활성화를 야기하는 수용체 또는 수용체 복합체를 통해 이러한 항원을 인식하고 이러한 항원과 상호작용한다. 이러한 수용체의 일례는 8개의 단백질들의 복합체인 항원-특이적 T 림프구 수용체 복합체(TCR/CD3)이다. T 세포 수용체(TCR)는 T 림프구의 표면 상에서 발현된다. 불변 구조를 갖는 한 성분인 CD3은 리간드에 의한 TCR의 점유 후 세포내 신호전달을 책임진다. 항원에 대한 T 림프구 수용체-CD3 복합체(TCR/CD3)는 주조직적합성 복합체(MHC)의 단백질에 의해 그 자신에게 제시된 항원성 펩티드를 인식한다. MHC와 펩티드의 복합체는 항원 제시 세포 및 다른 T 림프구 표적의 표면 상에서 발현된다. TCR/CD3 복합체의 자극은 T 림프구를 활성화시키고 결과적으로 항원-특이적 면역 반응을 활성화시킨다. TCR/CD3 복합체는 면역 시스템의 효과기 기능 및 조절에 있어서 중추적인 역할을 수행한다.
T 림프구는 전체적으로 활성 상태가 되기 위해 제2 보조자극 신호를 요구한다. 이러한 신호 없이 T 림프구는 TCR에 결합하는 항원에 반응하지 않거나 무반응성을 나타내게 된다. 예를 들면, 이러한 보조자극 신호는 항원 생성 세포 상의 CD80 및 CD86과 상호작용하는 T 림프구 단백질인 CD28에 의해 제공된다. 또 다른 T 림프구 단백질인 ICOS(유도성 보조자극제)는 ICOS 리간드에 결합할 때 보조자극 신호를 제공한다. CD152로서도 공지되어 있는 CTLA4(세포독성 T 림프구 항원 4)는 T 세포 활성을 하향조절하는, 헬퍼 T 세포 및 CD4+ T 세포의 표면 상에서 발현되는 수용체이다. CTLA4와 그의 동족 리간드인 CD80 및 CD86의 결합은 감소된 T 세포 활성화 및 증식을 초래한다. CD279로서도 공지되어 있는 PD-1(프로그래밍된 세포 사멸-1)은 T 세포 수용체(TCR) 신호를 음성적으로 조절하고 면역 반응을 넓게 음성적으로 조절하는 것으로 현재 이해된다.
TCR 복합체의 본질적인 항원-결합, 신호전달 및 자극 기능은 유전적 재조합 방법에 의해 일반적으로 키메라 항원 수용체(CAR)로서 지칭되는 단일 폴리펩티드 쇄까지 감소된다. 예를 들면, 미국 특허 제7,741,465호(Eshhar) 및 미국 특허출원 공개 제2012/0093842호(Eshhar)를 참조한다. 이러한 CAR을 보유하는 T 림프구는 일반적으로 CAR T 림프구로서 지칭된다. CAR은 구체적으로 CAR이 결합하는 특이적 항원에 반응하여 T 세포 활성화 및 증식을 자극하도록 구축된다.
한 양태에서, 본원은 면역 시스템 세포, 예를 들면, T 림프구(T 세포)에 의해 발현될 수 있고 이러한 면역 시스템 세포에서 막-결합되어 있고 억제 신호를 이러한 면역 시스템 세포에게 정상적으로 전달하는 면역 시스템 단백질의 경막 도메인, 예를 들면, CTLA4(세포독성 T 림프구 항원 4 또는 세포독성 T 림프구-관련 단백질 4) 또는 PD-1(프로그래밍된 세포 사멸-1)로부터 유래되는 경막 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 예를 들면, 키메라 항원 수용체(예를 들면, 미국 특허 제7,741,465호(Eshhar) 참조)를 제공한다.
한 실시양태에서, 본원은 (i) CTLA4(예를 들면, 진뱅크(GenBank) 수탁번호 NM_005214.4(CTLA4 세포독성 T 림프구-관련 단백질 4(호모 사피엔스); 유전자 ID: 1493)) 또는 PD-1(예를 들면, 진뱅크 수탁번호 NM_005018.2(프로그래밍된 세포 사멸 1(호모 사피엔스); 유전자 ID: 5133))로부터 유래되는 경막 도메인을 포함하는 경막 도메인, 또는 이의 부분, (ii) 림프구의 활성화 및/또는 증식을 유발하는, 상기 림프구의 표면 상에서 발현되는 내생성 단백질의 세포내 도메인(예를 들면, 세포질 도메인), 및 (iii) 관심있는 항원에 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 제공하는데, 이때 상기 경막 도메인이 CTLA4로부터 유래될 때, 상기 폴리펩티드의 세포내 도메인 및 세포외 도메인은 CTLA4로부터 유래되지 않고; 상기 경막 도메인이 PD-1로부터 유래될 때, 상기 폴리펩티드의 세포내 도메인 및 세포외 도메인은 PD-1로부터 유래되지 않는다. 구체적인 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 구체적인 실시양태에서, 상기 폴리펩티드를 발현하는 T 림프구 또는 본원에 기재된 임의의 이러한 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드가 상기 항원에 결합할 때 증식하도록 활성화되거나 자극된다. 구체적인 실시양태에서, T 림프구의 표면 상에서 발현될 때 상기 폴리펩티드는 T 림프구가 상기 항원을 발현하는 세포를 사멸하도록 유도한다.
구체적인 실시양태에서, 본원은 CTLA4로부터의 경막 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 제공하는데, 이때 상기 CTLA4 경막 도메인은 인간 CTLA4 유전자(예를 들면, 진뱅크 수탁번호 NM_005214.4(CTLA4 세포독성 T 림프구-관련 단백질 4(호모 사피엔스); 유전자 ID: 1493))의 엑손 3에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열이다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드의 CTLA4 경막 도메인은 아미노산 서열 PEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKM(3-문자 코드, Pro-Glu-Pro-Cys-Pro-Asp-Ser-Asp-Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val-Ser-Leu-Ser-Lys-Met)(서열번호 1)이거나 이러한 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드의 CTLA4 경막 도메인은 진뱅크 수탁번호 NM_005214.4(CTLA4 세포독성 T 림프구-관련 단백질 4(호모 사피엔스); 유전자 ID: 1493)의 뉴클레오티드 610 내지 722에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열이거나 이러한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드의 CTLA4 경막 도메인은 아미노산 서열 PDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSL(3-문자 코드, Pro-Asp-Ser-Asp-Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val-Ser-Leu)(서열번호 2)이거나 이러한 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드의 CTLA4 경막 도메인은 진뱅크 수탁번호 NM_005214.4(CTLA4 세포독성 T 림프구-관련 단백질 4(호모 사피엔스); 유전자 ID: 1493)의 뉴클레오티드 636 내지 699에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열이거나 이러한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드의 CTLA4 경막 도메인은 아미노산 서열 FLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAV(3-문자 코드, Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val)(서열번호 3)이거나 이러한 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드의 CTLA4 경막 도메인은 폴리펩티드 서열 FLLWILAAVSSGLFFYSFLLT(3-문자 코드, Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr)(서열번호 4)이거나 이러한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드의 CTLA4 경막 도메인은 폴리펩티드 서열 FLLWILVAVSLGLFFYSFLVSAVSLS(3-문자 코드, Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Val-Ala-Val-Ser-Leu-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Val-Ser-Ala-Val-Ser-Leu-Ser)(서열번호 5)이거나 이러한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드의 CTLA4 경막 도메인은 폴리펩티드 서열 LGIGNGTQIYVIDPEPSPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKM(3-문자 코드, Leu-Gly-Ile-Gly-Asn-Gly-Thr-Gln-Ile-Tyr-Val-Ile-Asp-Pro-Glu-Pro-Ser-Pro-Asp-Ser-Asp-Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val-Ser-Leu-Ser-Lys-Met)(서열번호 9)이거나 이러한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드의 CTLA4 경막 도메인은 폴리펩티드 서열 FLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKM(3-문자 코드, Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val-Ser-Leu-Ser-Lys-Met)(서열번호 10)이거나 이러한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드의 PD-1 경막 도메인은 아미노산 서열 TLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAA(3-문자 코드, Thr-Leu-Val-Val-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Gly-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Trp-Val-Leu-Ala-Val-Ile-Cys-Ser-Arg-Ala-Ala)(서열번호 6)이거나 이러한 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드의 PD-1 경막 도메인은 아미노산 서열 VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI(3-문자 코드, Val-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Gly-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Trp-Val-Leu-Ala-Val-Ile)(서열번호 7)이거나 이러한 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드의 PD-1 경막 도메인은 아미노산 서열 FQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI(3-문자 코드, Phe-Glu-Thr-Leu-Val-Val-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Gly-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Trp-Val-Leu-Ala-Val-Ile)(서열번호 8)이거나 이러한 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드의 PD-1 경막 도메인은 아미노산 서열 FQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAA(3-문자 코드, Phe-Gln-Thr-Leu-Val-Val-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Gly-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Trp-Val-Leu-Ala-Val-Ile-Cys-Ser-Arg-Ala-Ala)(서열번호 11)이거나 이러한 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기재된 CTLA4 및 PD-1 경막 도메인 서열(즉, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11)에 의해 예시된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 경막 도메인은 그 자신이 유래된 단백질(즉, CTLA4 또는 PD-1)의 세포외 도메인의 하나 이상의 아미노산 및/또는 세포내 도메인의 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 경막 도메인은 그 자신이 유래된 단백질(즉, CTLA-4 또는 PD-1)의 세포외 도메인의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 경막 도메인은 그 자신이 유래된 단백질(즉, CTLA-4 또는 PD-1)의 세포내 도메인의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 경막 도메인은 (i) 그 자신이 유래된 단백질(즉, CTLA-4 또는 PD-1)의 세포외 도메인의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개 아미노산, 및 (ii) 그 자신이 유래된 단백질(즉, CTLA-4 또는 PD-1)의 세포내 도메인의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개 아미노산을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11에 개시된 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 21개 이상의 연속 아미노산들이거나 이러한 아미노산들을 포함하는 경막 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11과 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상 동일한 경막 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 폴리펩티드의 경막 도메인 내에 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 돌연변이, 예를 들면, 보존적 아미노산 돌연변이(예를 들면, 상이한 소수성 아미노산으로 돌연변이된 소수성 아미노산)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원은 본원에 개시된 폴리펩티드들 중 하나를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 본원은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11에 개시된 임의의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 본원에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로서, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11에 개시된 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 21개 이상의 연속 아미노산들을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11과 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드의 세포외 도메인은 항원에 결합하는 수용체 또는 수용체의 부분을 포함한다. 세포외 도메인은 예를 들면, 상기 항원에 결합하는 수용체 또는 수용체의 부분일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하거나 이러한 항체 또는 이의 항원-결합 부분이다. 구체적인 실시양태에서, 세포외 도메인은 단일-쇄 Fv 도메인을 포함하거나 이러한 단일-쇄 Fv 도메인이다. 단일-쇄 Fv 도메인은 예를 들면, 유연성 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함할 수 있고, 이때 상기 V L 및 V H 는 상기 항원에 결합하는 항체로부터 유래된다.
폴리펩티드의 세포외 도메인이 결합하는 항원은 임의의 관심있는 항원, 예를 들면, 종양 세포 상의 항원일 수 있다. 종양 세포는 예를 들면, 고형 종양의 세포 또는 비-고형 종양의 세포, 예를 들면, 혈액암의 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 종양-관련 항원 또는 종양-특이적 항원이다. 구체적인 실시양태에서, 종양-관련 항원 또는 종양-특이적 항원은 Her2, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 알파-태아단백질(AFP), 암배아 항원(CEA), 암 항원-125(CA-125), CA19-9, 칼레티닌(calretinin), MUC-1, 상피 막 단백질(EMA), 상피 종양 항원(ETA), 티로시나제(tyrosinase), 흑색종-관련 항원(MAGE), CD34, CD45, CD99, CD117, 크로모그라닌(chromogranin), 사이토케라틴(cytokeratin), 데스민(desmin), 신경아교 원섬유 산성 단백질(GFAP), 육안적 낭포증(gross cystic disease) 유체 단백질(GCDFP-15), HMB-45 항원, 단백질 멜란(melan)-A(T 림프구에 의해 인식되는 흑색종 항원; MART-1), myo-D1, 근육-특이적 액틴(MSA), 신경필라멘트, 신경-특이적 에놀라제(enolase)(NSE), 태반 알칼리성 포스파타제(phosphatase), 시냅토파이시스(synaptophysis), 티로글로불린, 갑상선 전사 인자-1, 피루베이트 키나제 동종효소 유형 M2의 이량체 형태(종양 M2-PK), CD19, CD22, CD27, CD30, CD70, GD2(강글리오사이드 G2), EGFRvIII(표피 성장 인자 변이체 III), 정자 단백질 17(Sp17), 메소텔린(mesothelin), PAP(전립선 산 포스파타제), 프로스테인(prostein), TARP(T 세포 수용체 감마 대안적 판독 프레임 단백질), Trp-p8, STEAP1(전립선의 6-경막 상피 항원 1), 비정상적 ras 단백질 또는 비정상적 p53 단백질이나, 이들로 한정되지 않는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 종양-관련 항원 또는 종양-특이적 항원은 인테그린(integrin) αvβ3(CD61), 갈락틴(galactin), K-Ras(V-Ki-ras2 키르스텐(Kirsten) 래트 육종 바이러스 발암유전자) 또는 Ral-B이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드의 세포외 도메인은 연결제, 스페이서 또는 힌지 폴리펩티드/펩티드 서열, 예를 들면, CH2CH3 힌지 서열, 또는 CD8, CD28, CTLA4 또는 PD-1의 서열에 의해 폴리펩티드의 경막 도메인에 연결된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드의 세포내 도메인은 T 세포의 표면 상에서 발현되고 상기 T 세포의 활성화 및/또는 증식을 유발하는 단백질의 세포내 도메인이거나 이러한 세포내 도메인을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 세포내 도메인은 CD3ζ 세포내 신호전달 도메인이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포내 도메인은 림프구 수용체 쇄, TCR/CD3 복합체 단백질, Fc 수용체 서브유닛 또는 IL-2 수용체 서브유닛으로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 예를 들면, 폴리펩티드의 세포내 도메인의 부분으로서 하나 이상의 보조자극 도메인을 추가로 포함한다. 하나 이상의 보조자극 도메인은 보조자극 CD27 폴리펩티드 서열, 보조자극 CD28 폴리펩티드 서열, 보조자극 OX40(CD134) 폴리펩티드 서열, 보조자극 4-1BB(CD137) 폴리펩티드 서열 및 보조자극 유도성 T 세포 보조자극(ICOS) 폴리펩티드 서열 중 하나 이상의 폴리펩티드 서열일 수 있거나 이러한 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 (i) 항원-결합 도메인(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원에 결합하는 항원-결합 도메인); (ii) CD28 또는 CTLA4 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 또는 PD-1 경막 도메인; (iv) 보조자극 도메인; 및 (v) 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 폴리펩티드의 항원-결합 도메인은 CD19에 결합한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 (i) 항원-결합 도메인(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원에 결합하는 항원-결합 도메인); (ii) CH2CH3 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 또는 PD-1 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 (i) 항원-결합 도메인(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원에 결합하는 항원-결합 도메인); (ii) CD28 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 또는 PD-1 경막 도메인; (iv) 4-1BB 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 (i) 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 관심있는 항원(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원)에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) CD28 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 (i) 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 관심있는 항원(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원)에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) CTLA4 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 (i) 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 관심있는 항원(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원)에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) CD28 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) PD-1 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 (i) 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 관심있는 항원(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원)에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) CTLA4 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) PD-1 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 (i) 항원-결합 도메인(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원에 결합하는 항원-결합 도메인); (ii) PD-1 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 또는 PD-1 경막 도메인; (iv) 보조자극 도메인; 및 (v) 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 (i) 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 관심있는 항원(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원)에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) PD-1 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 (i) 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 관심있는 항원(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원)에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) PD-1 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) PD-1 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원은 막-결합된 폴리펩티드를 포함하는, 예를 들면, 그의 세포 표면 상에서 발현하는 T 림프구, 예를 들면, T 세포를 제공하는데, 이때 상기 폴리펩티드는 (i) CTLA4 또는 PD-1로부터의 경막 도메인을 포함하는 경막 도메인, 또는 이의 부분, (ii) 림프구의 표면 상에서 발현되고 상기 림프구의 활성화 및/또는 증식을 유발하는 내생성 단백질의 세포내 도메인, 및 (iii) 관심있는 항원에 결합하는 세포외 도메인을 포함하고, 이때 상기 경막 도메인이 CTLA4로부터 유래될 때, 상기 폴리펩티드의 세포내 도메인 및 세포외 도메인(임의적으로 CTLA4 연결제를 배제함)은 CTLA4로부터 유래되지 않고; 상기 경막 도메인이 PD-1로부터 유래될 때, 상기 폴리펩티드의 세포내 도메인 및 세포외 도메인은 PD-1로부터 유래되지 않는다. 구체적인 실시양태에서, 폴리펩티드는 키메라 항원 수용체(CAR)이다.
구체적인 실시양태에서, 본원은 CTLA4로부터의 경막 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 T 림프구를 제공하는데, 이때 상기 CTLA4 경막 도메인은 인간 CTLA4 유전자(예를 들면, 진뱅크 수탁번호 NM_005214.4(CTLA4 세포독성 T 림프구-관련 단백질 4(호모 사피엔스); 유전자 ID: 1493))의 엑손 3에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열이다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 CTLA4로부터의 경막 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 T 림프구를 제공하는데, 이때 상기 CTLA4 경막 도메인은 아미노산 서열 PEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKM(3-문자 코드, Pro-Glu-Pro-Cys-Pro-Asp-Ser-Asp-Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val-Ser-Leu-Ser-Lys-Met)(서열번호 1)이거나 이러한 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 CTLA4로부터의 경막 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 T 림프구를 제공하는데, 이때 상기 CTLA4 경막 도메인은 진뱅크 수탁번호 NM_005214.4(CTLA4 세포독성 T 림프구-관련 단백질 4(호모 사피엔스); 유전자 ID: 1493)의 뉴클레오티드 610-722에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열이거나 이러한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 CTLA4로부터의 경막 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 T 림프구를 제공하는데, 이때 상기 CTLA4 경막 도메인은 아미노산 서열 PDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSL(3-문자 코드, Pro-Asp-Ser-Asp-Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val-Ser-Leu)(서열번호 2)이거나 이러한 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 CTLA4로부터의 경막 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 T 림프구를 제공하는데, 이때 상기 CTLA4 경막 도메인은 진뱅크 수탁번호 NM_005214.4(CTLA4 세포독성 T 림프구-관련 단백질 4(호모 사피엔스); 유전자 ID: 1493)의 뉴클레오티드 636-699에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열이거나 이러한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 CTLA4로부터의 경막 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 T 림프구를 제공하는데, 이때 상기 CTLA4 경막 도메인은 아미노산 서열 FLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAV(3-문자 코드, Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val)(서열번호 3)이거나 이러한 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 CTLA4로부터의 경막 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 T 림프구를 제공하는데, 이때 상기 CTLA4 경막 도메인은 폴리펩티드 서열 FLLWILAAVSSGLFFYSFLLT(3-문자 코드, Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr)(서열번호 4)이거나 이러한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 CTLA4로부터의 경막 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 T 림프구를 제공하는데, 이때 상기 CTLA4 경막 도메인은 폴리펩티드 서열 FLLWILVAVSLGLFFYSFLVSAVSLS(3-문자 코드, Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Val-Ala-Val-Ser-Leu-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Val-Ser-Ala-Val-Ser-Leu-Ser)(서열번호 5)이거나 이러한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 CTLA4로부터의 경막 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 T 림프구를 제공하는데, 이때 상기 CTLA4 경막 도메인은 폴리펩티드 서열 LGIGNGTQIYVIDPEPSPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKM(3-문자 코드, Leu-Gly-Ile-Gly-Asn-Gly-Thr-Gln-Ile-Tyr-Val-Ile-Asp-Pro-Glu-Pro-Ser-Pro-Asp-Ser-Asp-Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val-Ser-Leu-Ser-Lys-Met)(서열번호 9)이거나 이러한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 CTLA4로부터의 경막 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 T 림프구를 제공하는데, 이때 상기 CTLA4 경막 도메인은 폴리펩티드 서열 FLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKM(3-문자 코드, Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val-Ser-Leu-Ser-Lys-Met)(서열번호 10)이거나 이러한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 PD-1로부터의 경막 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 T 림프구를 제공하는데, 이때 상기 PD-1 경막 도메인은 아미노산 서열 TLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAA(3-문자 코드, Thr-Leu-Val-Val-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Gly-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Trp-Val-Leu-Ala-Val-Ile-Cys-Ser-Arg-Ala-Ala)(서열번호 6)이거나 이러한 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 PD-1로부터의 경막 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 T 림프구를 제공하는데, 이때 상기 PD-1 경막 도메인은 아미노산 서열 VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI(3-문자 코드, Val-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Gly-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Trp-Val-Leu-Ala-Val-Ile)(서열번호 7)이거나 이러한 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 PD-1로부터의 경막 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 T 림프구를 제공하는데, 이때 상기 PD-1 경막 도메인은 아미노산 서열 FQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI(3-문자 코드, Phe-Glu-Thr-Leu-Val-Val-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Gly-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Trp-Val-Leu-Ala-Val-Ile)(서열번호 8)이거나 이러한 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 PD-1로부터의 경막 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 T 림프구를 제공하는데, 이때 상기 PD-1 경막 도메인은 아미노산 서열 FQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAA(3-문자 코드, Phe-Gln-Thr-Leu-Val-Val-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Gly-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Trp-Val-Leu-Ala-Val-Ile-Cys-Ser-Arg-Ala-Ala)(서열번호 11)이거나 이러한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 T 림프구(즉, 본원에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 T 림프구)에 의해 발현되거나 코딩된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11에 개시된 임의의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 경막 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 T 림프구를 제공하는데, 이때 상기 경막 도메인은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11에 개시된 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 21개 이상의 연속 아미노산들이거나 이들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원은 본원에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 T 림프구를 제공하는데, 상기 핵산은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11에 개시된 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 21개 이상의 연속 아미노산들을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 T 림프구에 의해 발현되는 폴리펩티드의 세포외 도메인은 관심있는 항원에 결합하는 수용체, 또는 수용체의 부분을 포함한다. 세포외 도메인은 예를 들면, 상기 항원에 결합하는 수용체, 또는 수용체의 부분일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하거나, 항체 또는 이의 항원-결합 부분이다. 구체적인 실시양태에서, 세포외 도메인은 단일-쇄 Fv 도메인을 포함하거나 단일-쇄 Fv 도메인이다. 예를 들면, 단일-쇄 Fv 도메인은 유연성 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함할 수 있는데, 이때 상기 V L 및 V H 는 상기 항원에 결합하는 항체로부터 유래된다.
본원에서 제공된 T 림프구에 의해 발현된 폴리펩티드의 세포외 도메인이 결합하여 T 세포가 상기 폴리펩티드에 의해 향하게 되는 항원은 관심있는 임의의 항원, 예를 들면, 종양 세포 상의 항원일 수 있다. 종양 세포는 예를 들면, 고형 종양의 세포, 또는 비-고형 종양의 세포, 예를 들면, 혈액암의 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 종양-관련 항원 또는 종양-특이적 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 카파, 람다, CD19, CD22, CD27, CD30, CD70, GD2, HER2, CEA, EGFRvIII, 정자 단백질 17, PSCA, 메소텔린, PAP(전립선 산 포스파타제), 프로스테인, TARP(T 세포 수용체 감마 대안적 판독 프레임 단백질), Trp-p8, STEAP1(전립선의 6-경막 상피 항원 1) 및/또는 MUC-1 중 하나 이상이다. 다양한 구체적인 실시양태에서, 종양-관련 항원 또는 종양-특이적 항원은 Her2, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 알파-태아단백질(AFP), 암배아 항원(CEA), 암 항원-125(CA-125), CA19-9, 칼레티닌, MUC-1, 상피 막 단백질(EMA), 상피 종양 항원(ETA), 티로시나제, 흑색종-관련 항원(MAGE), CD34, CD45, CD99, CD117, 크로모그라닌, 사이토케라틴, 데스민, 신경아교 원섬유 산성 단백질(GFAP), 육안적 낭포증 유체 단백질(GCDFP-15), HMB-45 항원, 단백질 멜란-A(T 림프구에 의해 인식되는 흑색종 항원; MART-1), myo-D1, 근육-특이적 액틴(MSA), 신경필라멘트, 신경-특이적 에놀라제(NSE), 태반 알칼리성 포스파타제, 시냅토파이시스, 티로글로불린, 갑상선 전사 인자-1, 피루베이트 키나제 동종효소 유형 M2의 이량체 형태(종양 M2-PK), 비정상적 ras 단백질 또는 비정상적 p53 단백질이나, 이들로 한정되지 않는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 종양-관련 항원 또는 종양-특이적 항원은 인테그린 αvβ3(CD61), 갈락틴, K-Ras(V-Ki-ras2 키르스텐 래트 육종 바이러스 발암유전자), 또는 Ral-B이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 T 림프구에 의해 발현된 폴리펩티드의 세포외 도메인은 연결제, 스페이서 또는 힌지 폴리펩티드 서열, 예를 들면, CD8, CD28, CTLA4 또는 PD-1의 서열에 의해 폴리펩티드의 상기 경막 도메인에 연결된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 T 림프구에 의해 발현된 폴리펩티드의 세포내 도메인은 T 세포의 표면 상에서 정상적으로 발현되고 상기 T 세포의 활성화 및/또는 증식을 유발하는 단백질의 세포내 도메인이거나 이러한 세포내 도메인을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 세포내 도메인은 CD3ζ 세포내 신호전달 도메인이다. 또 다른 실시양태에서, 세포내 도메인은 림프구 수용체 쇄, TCR/CD3 복합체 단백질, Fc 수용체 서브유닛 또는 IL-2 수용체 서브유닛으로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 T 림프구에 의해 발현된 폴리펩티드는 예를 들면, 폴리펩티드의 세포내 도메인의 일부로서 하나 이상의 보조자극 도메인을 추가로 포함한다. 하나 이상의 보조자극 도메인은 보조자극 CD27 폴리펩티드 서열, 보조자극 CD28 폴리펩티드 서열, 보조자극 OX40(CD134) 폴리펩티드 서열, 보조자극 4-1BB(CD137) 폴리펩티드 서열 및 보조자극 유도성 T 세포 보조자극(ICOS) 폴리펩티드 서열 중 하나 이상의 폴리펩티드 서열일 수 있거나 이러한 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.
구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 T 림프구는 (i) 항원-결합 도메인(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원에 결합하는 항원-결합 도메인); (ii) CD28 또는 CTLA4 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 또는 PD-1 경막 도메인; (iv) 보조자극 도메인; 및 (v) 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함하는 폴리펩티드를 발현하거나 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 폴리펩티드의 항원-결합 도메인은 CD19에 결합한다.
구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 T 림프구는 (i) 항원-결합 도메인(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원에 결합하는 항원-결합 도메인); (ii) CH2CH3 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 또는 PD-1 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함하는 폴리펩티드를 발현하거나 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 폴리펩티드의 항원-결합 도메인은 HER2에 결합한다.
구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 T 림프구는 (i) 항원-결합 도메인(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원에 결합하는 항원-결합 도메인); (ii) CH2CH3 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 또는 PD-1 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함하는 폴리펩티드를 발현하거나 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 폴리펩티드의 항원-결합 도메인은 HER2에 결합한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 T 림프구는 (i) 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 관심있는 항원(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원)에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) CD28 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함하는 폴리펩티드를 발현하거나 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 T 림프구는 (i) 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 관심있는 항원(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원)에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) CTLA4 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함하는 폴리펩티드를 발현하거나 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 T 림프구는 (i) 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 관심있는 항원(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원)에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) CD28 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) PD-1 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함하는 폴리펩티드를 발현하거나 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 T 림프구는 (i) 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 관심있는 항원(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원)에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) CTLA4 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) PD-1 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함하는 폴리펩티드를 발현하거나 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 T 림프구는 (i) 항원-결합 도메인(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원에 결합하는 항원-결합 도메인); (ii) PD-1 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 또는 PD-1 경막 도메인; (iv) 보조자극 도메인; 및 (v) 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함하는 폴리펩티드를 발현하거나 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 T 림프구는 (i) 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 관심있는 항원(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원)에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) PD-1 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함하는 폴리펩티드를 발현하거나 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 T 림프구는 (i) 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 관심있는 항원(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원)에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) PD-1 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) PD-1 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함하는 폴리펩티드를 발현하거나 포함한다.
구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드들 중 하나 이상의 폴리펩티드를 발현하거나 포함하는 본원에서 제공된 T 림프구는 상기 폴리펩티드가 이 폴리펩티드의 항원-결합 도메인 또는 단일-쇄 Fv 도메인에 대한 특이성을 갖는 항원에 결합할 때 증식하도록 활성화되거나 자극된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드들 중 하나 이상의 폴리펩티드를 발현하거나 포함하는 본원에서 제공된 T 림프구는 T 림프구가 상기 항원 발현 세포와 접촉할 때 상기 폴리펩티드의 항원-결합 도메인 또는 단일-쇄 Fv 도메인에 대한 특이성을 갖는 항원을 발현하거나 포함하는 세포를 사멸시킨다.
또 다른 양태에서, 본원은 질환 또는 장애를 갖는 개체를 치료하는 방법으로서, 본원에서 제공된 T 림프구들 중 하나 이상의 T 림프구, 즉 본원에 기재된 폴리펩티드를 포함하거나 발현하는 T 림프구를 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공하는데, 이러한 방법은 상기 질환 또는 장애를 특징으로 하거나, 항원을 발현하는 세포를 특징으로 할 수 있다.
도 1은 CAR을 발현하는 렌티바이러스 벡터를 사용한 T 세포의 형질도입으로부터 3일 후, T 세포에 의한 CAR의 발현을 보여준다.
도 2는 (i) 휴면 상태에서(제1 막대), (ii) 항-CD28에의 노출 후(제2 막대), (iii) 0.25 ㎍/㎖ HER2-Fc에의 노출 후, (iv) 0.5 ㎍/㎖ HER2-Fc에의 노출 후, 및 (v) 1.0 ㎍/㎖ HER2-Fc에의 노출 후, CAR T 세포에 의한 인터류킨-2(IL-2) 생성을 보여준다.
도 3은 (i) 휴면 상태에서(제1 막대), (ii) CD28에의 노출 후(제2 막대), (iii) 0.25 ㎍/㎖ HER2-Fc에의 노출 후, (iv) 0.5 ㎍/㎖ HER2-Fc에의 노출 후, 및 (v) 1.0 ㎍/㎖ HER2-Fc에의 노출 후, CAR T 세포에 의한 GM-CSF 생성을 보여준다.
도 4는 (i) 휴면 상태에서(제1 막대), (ii) CD28에의 노출 후(제2 막대), (iii) 0.25 ㎍/㎖ HER2-Fc에의 노출 후, (iv) 0.5 ㎍/㎖ HER2-Fc에의 노출 후, 및 (v) 1.0 ㎍/㎖ HER2-Fc에의 노출 후, CAR T 세포에 의한 인터페론-감마(IFN-γ) 생성을 보여준다.
도 5는 1.0 ㎍/㎖ HER2-Fc에의 다회 노출 후, CAR T 세포에 의한 세포내 종양 괴사 인자 알파(TNF-α) 생성을 보여준다.
도 6은 HER2-Fc를 사용한 자극의 부재(상부 패널) 및 존재(하부 패널) 하에서 일부 항-HER2 CAR 또는 모의 대조군을 발현하는 CAR T 세포의 백분율을 보여준다. 도 6a는 모의 대조군, HER2-28TMζ 또는 HER2-28TM28ζ를 발현하는 항-HER2 CAR T 세포의 백분율을 보여준다. 도 6b는 HER2-CTLA4TM28ζ 또는 HER2-4-1BBTM28ζ를 발현하는 항-HER2 CAR T 세포의 백분율을 보여준다.
도 7은 CAR을 발현하는 렌티바이러스 벡터를 사용한 T 세포의 형질도입으로부터 11일 후, T 세포에 의한 CAR의 발현을 보여준다.
도 8은 (i) 휴면 상태에서, (ii) 0.25, 0.5 또는 1.0 ㎍/㎖ HER2-Fc에의 노출 후, 또는 (iii) CD3/CD28 연결 후, CAR T 세포에 의한 IL-2, TNF-α 및 IFN-γ 생성을 보여준다. 각각의 군에서 제1(가장 좌측) 막대: 모의 형질도입된 세포(발현된 CAR 없음); 각각의 군에서 제2 막대: HER-PD1TM-CD28-CD3으로 표기된 CAR로 형질도입된 세포; 각각의 군에서 제3 막대: HER-CTLA4(189)TM-41BB-CD3으로 표기된 CAR로 형질도입된 세포; 각각의 군에서 제4 막대: HER-PD1TM-41BB-CD3으로 표기된 CAR로 형질도입된 세포; 각각의 군에서 제5(가장 우측) 막대: HER2-CD28TM-CD28-CD3으로 표기된 CAR로 형질도입된 세포.
도 9는 (i) 휴면 상태, (ii) 0.25, 0.5 또는 1.0 ㎍/㎖ HER2-Fc에의 노출 후, 또는 (iii) CD3/CD28 연결 후, CAR T 세포에 의한 GM-CSF, 그랜자임(Granzyme) B 및 IL-13 생성을 보여준다. 각각의 군에서 제1(가장 좌측) 막대: 모의 형질도입된 세포(발현된 CAR 없음); 각각의 군에서 제2 막대: HER-PD1TM-CD28-CD3으로 표기된 CAR로 형질도입된 세포; 각각의 군에서 제3 막대: HER-CTLA4(189)TM-41BB-CD3으로 표기된 CAR로 형질도입된 세포; 각각의 군에서 제4 막대: HER-PD1TM-41BB-CD3으로 표기된 CAR로 형질도입된 세포; 각각의 군에서 제5(가장 우측) 막대: HER2-CD28TM-CD28-CD3으로 표기된 CAR로 형질도입된 세포.
도 10은 HER2-Fc를 사용한 자극 후, 생존 T 세포 수를 보여준다. 제1(가장 좌측) 막대: HER2-CD28TM-CD28-CD3으로 표기된 CAR로 형질도입된 세포; 제2 막대: HER-PD1TM-CD28-CD3으로 표기된 CAR로 형질도입된 세포; 제3 막대: HER-CTLA4(189)TM-41BB-CD3으로 표기된 CAR로 형질도입된 세포; 제4 막대: HER-PD1TM-41BB-CD3으로 표기된 CAR로 형질도입된 세포; 제5(가장 우측) 막대: 모의 형질도입된 세포(발현된 CAR 없음).
한 양태에서, 본원은 면역 시스템 세포, 예를 들면, T 림프구(T 세포)에 의해 발현될 수 있고 이러한 면역 시스템 세포에서 막-결합되어 있고 억제 신호를 이러한 면역 시스템 세포에게 정상적으로 전달하는 면역 시스템 단백질의 경막 도메인, 예를 들면, CTLA4(세포독성 T 림프구 항원 4 또는 세포독성 T 림프구-관련 단백질 4) 또는 PD-1(프로그래밍된 세포 사멸-1)의 경막 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 예를 들면, 키메라 항원 수용체(예를 들면, 미국 특허 제7,741,465호(Eshhar) 참조)를 제공한다. 추가로, 본원은 본원에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 또한, 본원은 이러한 폴리펩티드를 발현하는 면역 시스템 세포, 예를 들면, T 림프구(예를 들면, T 세포)를 제공한다.
본원에서 제공된 폴리펩티드는 항원, 예를 들면, 세포 상의 항원에 결합하는 세포외 도메인, 경막 도메인, 및 일차 활성화 신호를 면역 세포에게 전달하는 세포내(세포질) 신호전달 도메인을 포함한다. 본원에서 제공된 폴리펩티드가 예를 들면, T 림프구의 표면 상에서 발현되고 CAR의 세포외 도메인이 항원에 결합할 때, 세포내 신호전달 도메인은 T 림프구가 활성화하고/하거나 증식하도록 신호를 전달하고, 항원이 세포 표면 상에 존재하는 경우 T 림프구가 상기 항원을 발현하는 세포를 사멸시키도록 신호를 전달한다. T 림프구가 전체적으로 활성화되기 위해 2개의 신호, 즉 일차 활성화 신호 및 보조자극 신호를 요구하기 때문에, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 항원과 세포외 도메인의 결합이 일차 활성화 신호 및 보조자극 신호 둘다의 전달을 야기하도록 보조자극 도메인을 포함할 수 있다.
본원에서 제공된 폴리펩티드, 예를 들면, CAR은 T 세포 보조억제 단백질, 예를 들면, CTLA4 또는 PD-1로부터의 경막 도메인을 포함하는 기능성 면역 자극 폴리펩티드이다. 한 양태에서, 본원은 (i) CTLA4 또는 PD-1로부터 유래되는 경막 도메인, (ii) 림프구의 표면 상에서 발현되고 상기 림프구의 활성화 및/또는 증식을 유발하는 내생성 단백질의 세포내 도메인(예를 들면, 세포질 도메인), 및 (iii) 항원에 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 제공하는데, 이때 상기 경막 도메인이 CTLA4로부터 유래될 때, 상기 폴리펩티드의 세포내 도메인 및 세포외 도메인은 CTLA4로부터 유래되지 않고; 상기 경막 도메인이 PD-1로부터 유래될 때, 상기 폴리펩티드의 세포내 도메인 및 세포외 도메인은 PD-1로부터 유래되지 않는다. 구체적인 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드를 발현하는 T 림프구는 상기 폴리펩티드가 이 폴리펩티드에 대한 특이성을 갖는 항원(즉, 상기 폴리펩티드의 세포외 도메인에 의해 결합되는 항원)에 결합할 때 증식하도록 활성화되거나 자극된다. 구체적인 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 T 림프구의 표면 상에서 발현될 때 T 림프구가 상기 항원을 발현하는 세포를 사멸시키도록 유도한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 CTLA4 또는 PD-1로부터의 경막 도메인, 또는 이의 부분을 포함하는데, 이때 CTLA4 또는 PD-1 경막 도메인은 포유동물 CTLA4 또는 PD-1, 예를 들면, 인간, 영장류 또는 설치류, 예를 들면, 뮤린 CTLA4 또는 PD-1로부터 유래된다. 구체적인 실시양태에서, 경막 도메인은 CTLA4 또는 PD-1의 세포내 도메인, 세포외 도메인, 또는 세포내 또는 세포외 도메인의 아미노산을 포함하지 않는다. CTLA4 또는 PD-1 경막 도메인 서열의 구체적인 비-한정적 예는 하기 제공되어 있다.
구체적인 실시양태에서, 본원은 CTLA4로부터의 경막 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 제공하는데, 이때 CTLA4 경막 도메인은 인간 CTLA4 유전자(예를 들면, 진뱅크 수탁번호 NM_005214.4(CTLA4 세포독성 T 림프구-관련 단백질 4(호모 사피엔스); 유전자 ID: 1493))의 엑손 3에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열이다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드의 CTLA4 경막 도메인은 아미노산 서열 PEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKM(3-문자 코드, Pro-Glu-Pro-Cys-Pro-Asp-Ser-Asp-Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val-Ser-Leu-Ser-Lys-Met)(서열번호 1)이거나 이러한 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드의 CTLA4 경막 도메인은 진뱅크 수탁번호 NM_005214.4(CTLA4 세포독성 T 림프구-관련 단백질 4(호모 사피엔스); 유전자 ID: 1493)의 뉴클레오티드 610 내지 722에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열이거나 이러한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드의 CTLA4 경막 도메인은 아미노산 서열 PDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSL(3-문자 코드, Pro-Asp-Ser-Asp-Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val-Ser-Leu)(서열번호 2)이거나 이러한 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드의 CTLA4 경막 도메인은 진뱅크 수탁번호 NM_005214.4(CTLA4 세포독성 T 림프구-관련 단백질 4(호모 사피엔스); 유전자 ID: 1493)의 뉴클레오티드 636 내지 699에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열이거나 이러한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드의 CTLA4 경막 도메인은 아미노산 서열 FLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAV(3-문자 코드, Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val)(서열번호 3)이거나 이러한 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드의 CTLA4 경막 도메인은 폴리펩티드 서열 FLLWILAAVSSGLFFYSFLLT(3-문자 코드, Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr)(서열번호 4)이거나 이러한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드의 CTLA4 경막 도메인은 폴리펩티드 서열 FLLWILVAVSLGLFFYSFLVSAVSLS(3-문자 코드, Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Val-Ala-Val-Ser-Leu-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Val-Ser-Ala-Val-Ser-Leu-Ser)(서열번호 5)이거나 이러한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드의 CTLA4 경막 도메인은 폴리펩티드 서열 LGIGNGTQIYVIDPEPSPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKM(3-문자 코드, Leu-Gly-Ile-Gly-Asn-Gly-Thr-Gln-Ile-Tyr-Val-Ile-Asp-Pro-Glu-Pro-Ser-Pro-Asp-Ser-Asp-Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val-Ser-Leu-Ser-Lys-Met)(서열번호 9)이거나 이러한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드의 CTLA4 경막 도메인은 폴리펩티드 서열 FLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKM(3-문자 코드, Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val-Ser-Leu-Ser-Lys-Met)(서열번호 10)이거나 이러한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드의 PD-1 경막 도메인은 아미노산 서열 TLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAA(3-문자 코드, Thr-Leu-Val-Val-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Gly-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Trp-Val-Leu-Ala-Val-Ile-Cys-Ser-Arg-Ala-Ala)(서열번호 6)이거나 이러한 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드의 PD-1 경막 도메인은 아미노산 서열 VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI(3-문자 코드, Val-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Gly-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Trp-Val-Leu-Ala-Val-Ile)(서열번호 7)이거나 이러한 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드의 PD-1 경막 도메인은 아미노산 서열 FQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI(3-문자 코드, Phe-Glu-Thr-Leu-Val-Val-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Gly-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Trp-Val-Leu-Ala-Val-Ile)(서열번호 8)이거나 이러한 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드의 PD-1 경막 도메인은 아미노산 서열 FQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAA(3-문자 코드, Phe-Gln-Thr-Leu-Val-Val-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Gly-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Trp-Val-Leu-Ala-Val-Ile-Cys-Ser-Arg-Ala-Ala)(서열번호 11)이거나 이러한 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기재된 CTLA4 및 PD-1 경막 도메인 서열(즉, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11)에 의해 예시된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 경막 도메인은 그 자신이 유래된 단백질(즉, CTLA-4 또는 PD-1)의 세포외 도메인의 하나 이상의 아미노산 및/또는 세포내 도메인의 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 경막 도메인은 그 자신이 유래된 단백질(즉, CTLA-4 또는 PD-1)의 세포외 도메인의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 경막 도메인은 그 자신이 유래된 단백질(즉, CTLA-4 또는 PD-1)의 세포내 도메인의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 경막 도메인은 (i) 그 자신이 유래된 단백질(즉, CTLA-4 또는 PD-1)의 세포외 도메인의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개 아미노산, 및 (ii) 그 자신이 유래된 단백질(즉, CTLA-4 또는 PD-1)의 세포내 도메인의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개 아미노산을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11에 개시된 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 21개 이상의 연속 아미노산들이거나 이러한 아미노산들을 포함하는 경막 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11과 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상 동일한 경막 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원은 본원에 개시된 폴리펩티드들 중 하나를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 본원은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11에 개시된 임의의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 본원에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로서, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11에 개시된 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 21개 이상의 연속 아미노산들을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11과 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드의 구축에 있어서, 인간 서열은 비-인간 서열과 조합될 수 있다. 예를 들면, 인간 세포외 도메인 아미노산 서열 및 세포내 도메인 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 비-인간 종의 경막 도메인, 예를 들면, 뮤린 CTLA4 경막 도메인 또는 뮤린 PD-1 경막 도메인을 포함할 수 있다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 세포외 도메인 및 세포내 도메인에 대한 인간 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 경막 도메인을 포함한다.
본원에서 제공된 폴리펩티드의 세포외 도메인은 관심있는 항원에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드의 세포외 도메인은 상기 항원에 결합하는 수용체, 또는 수용체의 부분을 포함한다. 세포외 도메인은 예를 들면, 상기 항원에 결합하는 수용체, 또는 수용체의 부분일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하거나, 항체 또는 이의 항원-결합 부분이다. 구체적인 실시양태에서, 세포외 도메인은 단일-쇄 Fv 도메인을 포함하거나 단일-쇄 Fv 도메인이다. 단일-쇄 Fv 도메인은 예를 들면, 유연성 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함할 수 있는데, 이때 상기 V L 및 V H 는 상기 항원에 결합하는 항체로부터 유래된다.
본원에서 제공된 폴리펩티드의 세포외 도메인이 결합/인식하는 항원은 관심있는 임의의 항원, 예를 들면 종양 세포 상의 항원일 수 있다. 종양 세포는 예를 들면, 고형 종양의 세포, 또는 비-고형 종양의 세포, 예를 들면, 혈액암의 세포일 수 있다. 항원은 임의의 종류의 종양 또는 암의 세포, 예를 들면, 림프종, 폐암, 유방암, 전립선암, 부신피질암종, 갑상선암종, 코인두암종, 흑색종, 예를 들면, 악성 흑색종, 피부암종, 대장암종, 데스모이드(desmoid) 종양, 결합조직형성(desmoplastic) 둥근 소세포 종양, 내분비 종양, 유잉(Ewing) 육종, 말초 원시 신경외배엽 종양, 고형 생식세포 종양, 간모세포종, 신경모세포종, 비-횡문근육종 연조직 육종, 골육종, 망막모세포종, 횡문근육종, 윌름스 종양, 신경아교모세포종, 점액종, 섬유종, 지방종 등의 세포 상에서 발현되는 임의의 항원일 수 있다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 림프종은 만성 림프구성 백혈병(소림프구성 림프종), B 세포 전구림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 비장 변연부 림프종, 형질세포 골수종, 형질세포종, 림프절외 변역부 B 세포 림프종, MALT 림프종, 림프절 변연부 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 맨틀 세포 림프종, 미만성 B 대세포 림프종, 중격 (흉선) B 대세포 림프종, 혈관내 B 대세포 림프종, 일차 삼출 림프종, 버킷 림프종, T 림프구 전구림프구성 백혈병, T 림프구 대과립 림프구성 백혈병, 공격성 NK 세포 백혈병, 성인 T 림프구 백혈병/림프종, 림프절외 NK/T 림프구 림프종, 코 유형 장병증 유형 T 림프구 림프종, 간비장 T 림프구 림프종, 모세포성 NK 세포 림프종, 균상 식육종, 세자리(Sezary) 증후군, 일차 피부 역형성 대세포 림프종, 림프종모양 구진증, 혈관면역모세포성 T 림프구 림프종, 말초 T 림프구 림프종(비특정됨), 역형성 대세포 림프종, 호지킨 림프종, 또는 비-호지킨 림프종일 수 있다. 일부 암들에 대한 특이성을 갖는 항원뿐만 아니라 이러한 항원을 확인하는 방법도 당분야에서 공지되어 있다.
암이 만성 림프구성 백혈병(CLL)인 구체적인 실시양태에서, CLL의 B 세포는 정상 핵형을 갖는다. 암이 만성 림프구성 백혈병(CLL)인 다른 구체적인 실시양태에서, CLL의 B 세포는 17p 결실, 11q 결실, 12q 삼염색체증, 13q 결실 또는 p53 결실을 보유한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드의 세포외 도메인에 의해 인식되는 항원은 종양-관련 항원(TAA) 또는 종양-특이적 항원(TSA)이다. 다양한 구체적인 실시양태에서, 종양-관련 항원 또는 종양-특이적 항원은 Her2, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 알파-태아단백질(AFP), 암배아 항원(CEA), 암 항원-125(CA-125), CA19-9, 칼레티닌, MUC-1, 상피 막 단백질(EMA), 상피 종양 항원(ETA), 티로시나제, 흑색종-관련 항원(MAGE), CD19, CD22, CD27, CD30, CD34, CD45, CD70, CD99, CD117, EGFRvIII(표피 성장 인자 변이체 III), 메소텔린, PAP(전립선 산 포스파타제), 프로스테인, TARP(T 세포 수용체 감마 대안적 판독 프레임 단백질), Trp-p8, STEAP1(전립선의 6-경막 상피 항원 1), 크로모그라닌, 사이토케라틴, 데스민, 신경아교 원섬유 산성 단백질(GFAP), 육안적 낭포증 유체 단백질(GCDFP-15), HMB-45 항원, 단백질 멜란-A(T 림프구에 의해 인식되는 흑색종 항원; MART-1), myo-D1, 근육-특이적 액틴(MSA), 신경필라멘트, 신경-특이적 에놀라제(NSE), 태반 알칼리성 포스파타제, 시냅토파이시스, 티로글로불린, 갑상선 전사 인자-1, 피루베이트 키나제 동종효소 유형 M2의 이량체 형태(종양 M2-PK), 비정상적 ras 단백질, 또는 비정상적 p53 단백질이나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드의 세포외 도메인에 의해 인식되는 TAA 또는 TSA는 인테그린 αvβ3(CD61), 갈락틴 또는 Ral-B이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드의 세포외 도메인에 의해 인식되는 TAA 또는 TSA는 암/정소(CT) 항원, 예를 들면, BAGE, CAGE, CTAGE, FATE, GAGE, HCA661, HOM-TES-85, MAGEA, MAGEB, MAGEC, NA88, NY-ESO-1, NY-SAR-35, OY-TES-1, SPANXB1, SPA17, SSX, SYCP1 또는 TPTE이다.
일부 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드의 세포외 도메인에 의해 인식되는 TAA 또는 TSA는 탄수화물 또는 강글리오사이드, 예를 들면, fuc-GM1, GM2(종양태아 항원-면역원성-1; OFA-I-1), GD2(OFA-I-2), GM3, GD3 등이다.
일부 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드의 세포외 도메인에 의해 인식되는 TAA 또는 TSA는 알파-액티닌-4, Bage-1, BCR-ABL, Bcr-Abl 융합 단백질, 베타-카테닌, CA 125, CA 15-3(CA 27.29＼BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, Casp-8, cdc27, cdk4, cdkn2a, CEA, coa-1, dek-can 융합 단백질, EBNA, EF2, 엡스테인 바(Epstein Barr) 바이러스 항원, ETV6-AML1 융합 단백질, HLA-A2, HLA-A11, hsp70-2, KIAAO205, Mart2, Mum-1, Mum-2, Mum-3, neo-PAP, 미요신(myosin) 클래스 I, OS-9, pml-RARα 융합 단백질, PTPRK, K-ras, N-ras, 트라이오세포스페이트 이소머라제(isomerase), Gage 3,4,5,6,7, GnTV, Herv-K-mel, Lage-1, NA-88, NY-Eso-1/Lage-2, SP17, SSX-2, TRP2-Int2, gp100(Pmel 17), 티로시나제, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, RAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15(58), RAGE, SCP-1, Hom/Mel-40, PRAME, p53, H-Ras, HER-2/neu, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, 인간 유두종바이러스(HPV) 항원 E6 및 E7, TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 13-카테닌, Mum-1, p16, TAGE, PSMA, CT7, 텔로머라제(telomerase), 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 13HCG, BCA225, BTAA, CD68＼KP1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733(EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB＼70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90, TAAL6, TAG72, TLP 또는 TPS이다. 다른 종양-관련 항원 및 종양-특이적 항원은 당업자에게 공지되어 있다.
TSA 및 TAA에 결합하는 항체 및 scFv는 이들을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 마찬가지로 당분야에서 공지되어 있다.
일부 구체적인 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드의 세포외 도메인에 의해 인식되는 항원은 TSA 또는 TAA인 것으로 간주되지 않음에도 불구하고 종양 세포 또는 종양에 의해 야기된 손상과 관련되어 있는 항원이다. 일부 실시양태에서, 예를 들면, 항원은 예를 들면, 성장 인자, 사이토카인 또는 인터류킨, 예를 들면, 혈관신생 또는 혈관형성과 관련된 성장 인자, 사이토카인 또는 인터류킨이다. 이러한 성장 인자, 사이토카인 또는 인터류킨은 예를 들면, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 혈소판으로부터 유래된 성장 인자(PDGF), 간세포 성장 인자(HGF), 인슐린 유사 성장 인자(IGF) 또는 인터류킨-8(IL-8)을 포함할 수 있다. 종양은 종양에 국한되는 저산소성 환경을 생성할 수도 있다. 따라서, 다른 구체적인 실시양태에서, 항원은 저산소증 관련 인자, 예를 들면, HIF-1α, HIF-1β, HIF-2α, HIF-2β, HIF-3α 또는 HIF-3β이다. 종양은 정상 조직에 국한된 손상을 야기하여 손상-관련 분자 패턴 분자(DAMP; 알라민(alarmin)으로서도 공지되어 있음)로서 공지되어 있는 분자의 방출을 야기할 수도 있다. 따라서, 일부 다른 구체적인 실시양태에서, 항원은 DAMP, 예를 들면, 열 충격 단백질, 염색질 관련 단백질 고이동성 군 박스 1(HMGB1), S100A8(MRP8, 칼그래뉼린(calgranulin) A), S100A9(MRP14, 칼그래뉼린 B), 또는 혈청 아밀로이드 A(SAA)이거나, 데옥시리보핵산, 아데노신 트라이포스페이트, 요산 또는 헤파린 설페이트일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드의 세포외 도메인은 연결제, 스페이서 또는 힌지 폴리펩티드 서열, 예를 들면, CD28의 서열 또는 CTLA4의 서열에 의해 상기 폴리펩티드의 경막 도메인에 연결된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드의 세포내 도메인은 T 세포의 표면 상에서 발현되고 상기 T 세포의 활성화 및/또는 증식을 유발하는 단백질의 세포내 도메인 또는 모티프이거나 이러한 세포내 도메인 또는 모티프를 포함한다. 이러한 도메인 또는 모티프는 항원과 CAR의 세포외 부분의 결합에 반응하여 T 림프구의 활성화에 필요한 일차 항원-결합 신호를 전달할 수 있다. 전형적으로, 이 도메인 또는 모티프는 ITAM(면역수용체 티로신-기초 활성화 모티프)을 포함하거나 이러한 ITAM이다. CAR에 적합한 ITAM-함유 폴리펩티드는 예를 들면, 제타 CD3 쇄(CD3ζ) 또는 이의 ITAM-함유 부분을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 세포내 도메인은 CD3ζ 세포내 신호전달 도메인이다. 다른 구체적인 실시양태에서, 세포내 도메인은 림프구 수용체 쇄, TCR/CD3 복합체 단백질, Fc 수용체 서브유닛 또는 IL-2 수용체 서브유닛으로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 예를 들면, 폴리펩티드의 세포내 도메인의 부분으로서 하나 이상의 보조자극 도메인 또는 모티프를 추가로 포함한다. 상기 하나 이상의 보조자극 도메인 또는 모티프는 보조자극 CD27 폴리펩티드 서열, 보조자극 CD28 폴리펩티드 서열, 보조자극 OX40(CD134) 폴리펩티드 서열, 보조자극 4-1BB(CD137) 폴리펩티드 서열, 보조자극 유도성 T 세포 보조자극(ICOS) 폴리펩티드 서열 및 다른 보조자극 도메인 또는 모티프 중 하나 이상의 보조자극 도메인 또는 모티프일 수 있거나 이러한 보조자극 도메인 또는 모티프를 포함할 수 있다.
구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 (i) 항원-결합 도메인(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원에 결합하는 항원-결합 도메인); (ii) CD28 또는 CTLA4 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 또는 PD-1 경막 도메인; (iv) 보조자극 도메인; 및 (v) 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 (i) 항원-결합 도메인(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원에 결합하는 항원-결합 도메인); (ii) CH2CH3 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 또는 PD-1 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 (i) 항원-결합 도메인(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원에 결합하는 항원-결합 도메인); (ii) CD28 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 또는 PD-1 경막 도메인; (iv) 4-1BB 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 (i) 항원-결합 도메인(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원에 결합하는 항원-결합 도메인); (ii) PD-1 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 또는 PD-1 경막 도메인; (iv) 보조자극 도메인; 및 (v) 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 (i) 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 관심있는 항원(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원)에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) CD28 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 (i) 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 관심있는 항원(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원)에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) CTLA4 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 (i) 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 관심있는 항원(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원)에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) CD28 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) PD-1 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 (i) 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 관심있는 항원(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원)에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) CTLA4 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) PD-1 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 (i) 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 관심있는 항원(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원)에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) CTLA4 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) PD-1 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 (i) 항원-결합 도메인(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원에 결합하는 항원-결합 도메인); (ii) PD-1 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 또는 PD-1 경막 도메인; (iv) 보조자극 도메인; 및 (v) 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 (i) 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 관심있는 항원(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원)에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) PD-1 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 (i) 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 관심있는 항원(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원)에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) PD-1 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) PD-1 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 (i) 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 관심있는 항원(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원)에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) CTLA4 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 경막 도메인; (iv) 4-1BB 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 폴리펩티드는 (i) 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 관심있는 항원(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원)에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) CD28 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) PD-1 경막 도메인; (iv) 4-1BB 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 폴리펩티드는 (i) 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 관심있는 항원(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원)에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) CTLA4 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) PD-1 경막 도메인; (iv) 4-1BB 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 폴리펩티드는 (i) 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 관심있는 항원(예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 예를 들면, 전술된 종양 세포 상의 항원)에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) PD-1 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 경막 도메인; (iv) 4-1BB 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함한다.
1. 단리된 폴리펩티드( 키메라 항원 수용체)
CTLA4 또는 PD-1 경막 도메인을 포함하는 본원에서 제공된 T 림프구 자극 폴리펩티드는 예를 들면, 아실화, 아미드화, 글리코실화, 메틸화, 인산화, 설페이트화, 수모일화, 유비퀴틸화 등에 의해 변경될 수 있다. 상기 폴리펩티드는 검출가능한 신호를 제공할 수 있는 표지, 예를 들면, 방사성 동위원소 및 형광 화합물로 표지될 수 있다. 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드의 하나 이상의 측쇄는 예를 들면, 석신산 또는 다른 카복실산 무수물에 의한 라이시닐 및 아미노 말단 잔기의 유도체화, 또는 예를 들면, 이미도에스터, 예컨대, 메틸 피콜린이미데이트; 피리독살 포스페이트; 피리독살; 클로로보로하이드라이드; 트라이니트로벤젠설폰산; O-메틸이소우레아; 2,4-펜탄다이온; 및 글리옥실레이트와의 트랜스아미나제(transaminase)-촉진된 반응에 의한 유도체화에 의해 유도체화될 수 있다. 카복실 측쇄인 아스파르틸 또는 글루타밀은 카보다이이미드(R-N=C=N-R'), 예컨대, 1-사이클로헥실-3-(2-모르폴리닐-(4-에틸)카보다이이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-다이메틸펜틸)카보다이이미드와의 반응에 의해 선택적으로 변경될 수 있다.
2. 단리된 핵산
본원은 본원에서 제공된 폴리펩티드들 중 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열(폴리뉴클레오티드)을 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 면역 세포, 예를 들면, T 림프구의 형질전환에 적합한 임의의 폴리뉴클레오티드 벡터 내에 함유될 수 있다. 예를 들면, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드(예를 들면, 키메라 수용체)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 합성 벡터, 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터, 자율 복제 플라스미드, 바이러스(예를 들면, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스) 등을 사용하여 T 림프구를 형질전환시킬 수 있다. T 림프구의 형질전환에 적합한 렌티바이러스 벡터는 예를 들면, 미국 특허 제5,994,136호, 제6,165,782호, 제6,428,953호, 제7,083,981호 및 제7,250,299호(이들의 개시내용은 전체로서 본원에 참고로 도입됨)에 기재된 렌티바이러스 벡터들을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. T 림프구의 형질전환에 적합한 HIV 벡터는 예를 들면, 미국 특허 제5,665,577호(이의 개시내용은 전체로서 본원에 참고로 도입됨)에 기재된 벡터들을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
예를 들면, 변경된 T 림프구 내에서 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 생성하는 데에 유용한 핵산은 DNA, RNA 또는 핵산 유사체를 포함한다. 핵산 유사체는 염기 모이어티(moiety), 당 모이어티 또는 포스페이트 골격에서 변경될 수 있고, 데옥시타이미딘을 데옥시유리딘으로 치환시키는 것, 및 데옥시사이티딘을 5-메틸-2'-데옥시사이티딘 또는 5-브로모-2'-데옥시사이티딘으로 치환시키는 것을 포함할 수 있다. 당 모이어티의 변경은 2'-O-메틸 또는 2'-O-알릴 당을 형성하기 위한 리보스 당의 2' 하이드록실의 변경을 포함할 수 있다. 데옥시리보스 포스페이트 골격은 모르폴리노 핵산을 생성하도록 변경될 수 있고, 이때 각각의 염기 모이어티는 6원 모르폴리노 고리 또는 펩티드 핵산에 연결되고, 이때 데옥시포스페이트 골격은 슈도펩티드 골격으로 대체되고, 4개의 염기는 보유된다. 예를 들면, 문헌[Summerton and Weller (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7:187-195] 및 문헌[Hyrup et al. (1996) Bioorgan. Med. Chain. 4:5-23]을 참조한다. 추가로, 데옥시포스페이트 골격은 예를 들면, 포스포로티오에이트 또는 포스포로다이티오에이트 골격, 포스포로아미다이트, 또는 알킬 포스포트라이에스터 골격으로 대체될 수 있다.
3. T 림프구
본원은 본원에서 제공된 폴리펩티드를 포함하는 면역 세포, 예를 들면, T 림프구를 제공한다. 본원에서 제공된 T 림프구는 천연 T 림프구 또는 MHC-제한된 T 림프구일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 T 림프구는 종양 침윤 림프구(TIL)이다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 T 림프구는 종양 생검으로부터 단리되었거나, 종양 생검으로부터 단리된 T 림프구로부터 증폭되었다. 일부 다른 실시양태에서, 본원에서 제공된 T 림프구는 말초혈, 제대혈 또는 림프로부터 증폭된 T 림프구로부터 단리되었거나 증폭되었다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드를 포함하는 본원에서 제공된 면역 세포, 예를 들면, 변경된 T 림프구는 이 변경된 T 림프구가 투여될 개체에 대한 자가성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 변경된 T 림프구는 이 변경된 T 림프구가 투여될 개체에 대한 동종이형성을 갖는다. 동종이형성 T 림프구가 변경된 T 림프구를 제조하는 데에 사용되는 경우, 개체에서 이식편-대-숙주 질환(GVHD)의 가능성을 감소시킬 T 림프구가 선택될 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 변경된 T 림프구의 제조를 위해 바이러스-특이적 T 림프구가 선택될 수 있고; 이러한 림프구는 임의의 수용자 항원에 결합하여 이러한 수용자 항원에 의해 활성화되는 천연 능력이 크게 감소될 것으로 예상될 것이다. 일부 실시양태에서, 동종이형성 T 림프구의 수용자-매개된 거부는 하나 이상의 면역억제제, 예를 들면, 사이클로스포린, 타크롤리무스, 시롤리무스, 사이클로포스프아미드 등을 숙주에게 공-투여함으로써 감소될 수 있다.
한 실시양태에서, T 림프구는 개체로부터 수득되고 임의적으로 증폭된 후, 본원에 기재된 CTLA4 또는 PD-1 경막 도메인 함유 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환되고 임의적으로 증폭된다. 또 다른 실시양태에서, T 림프구는 개체로부터 수득되고 임의적으로 증폭된 후, 본원에 기재된 CTLA4 또는 PD-1 경막 도메인 함유 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 후, 임의적으로 1회 이상 증폭된다. 선별 마커를 사용하여 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포를 선별할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변경된 T 림프구는 CTLA4 또는 PD-1 경막 도메인-함유 폴리펩티드 이외에 천연 TCR 복합체를 형성할 수 있는 천연 TCR 단백질, 예를 들면, TCR-α 및 TCR-β를 발현하거나 포함한다. 일부 다른 실시양태에서, 변경된 T 림프구에서 TCR-α 및 TCR-β를 코딩하는 천연 유전자들 중 어느 하나 또는 둘다가 비-기능적이도록 변경된다(예를 들면, 일부 또는 전부가 결실되거나, 돌연변이가 삽입된다).
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 T 림프구는 종양 병변으로부터 단리되고(예를 들면, 종양 침윤 림프구이고); 이러한 T 림프구는 TSA 또는 TAA에 대한 특이성을 가질 것으로 예상된다.
일부 실시양태에서, CTLA4 또는 PD-1 경막 도메인-함유 폴리펩티드, 예를 들면, CAR의 신호전달 모티프를 사용하여 본원에 기재된 변경된 T 림프구의 증식 및 증폭을 촉진할 수 있다. 예를 들면, CD3 및 CD28에 대한 항체들, 예를 들면, 비드 또는 세포 배양 플레이트의 표면에 부착된 항체들을 사용하여 비변경된 T 림프구, 및 CD3ζ 신호전달 도메인 및 CD28 보조자극 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 T 림프구를 증폭할 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제5,948,893호, 제6,534,055호, 제6,352,694호, 제6,692,964호, 제6,887,466호 및 제6,905,681호 참조). 일부 실시양태에서, CTLA4 또는 PD-1 경막 도메인-함유 폴리펩티드의 세포외 도메인이 결합하는 항원을 사용하여 상기 폴리펩티드를 발현하는 T 림프구의 선별적 증폭을 촉진할 수 있다. 예를 들면, 항원이 TSA인 한 실시양태에서, TSA, 예를 들면, 가용성 형태의 TSA의 존재 하에서 배양된 폴리펩티드를 포함하는 T 림프구는 TSA의 부재 하에서의 배양에 비해 증가된 증식을 초래한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 세포외 항원-결합 도메인에 의해 결합될 수 있는 항원과 커플링된 폴리펩티드 상의 신호전달 도메인에 결합하는 항체를 사용하여 본원에 기재된 CTLA4 또는 PD-1 경막 도메인-함유 폴리펩티드를 포함하는 T 림프구를 증식하도록 자극한다. 예를 들면, 폴리펩티드의 신호전달 도메인이 CD3ζ이고 상기 폴리펩티드에 결합하는 항원이 TSA인 실시양태에서, CD3ζ에 결합하는 항체와 함께 TSA(예를 들면, 가용성 형태의 TSA)의 존재 하에서 세포를 배양함으로써 상기 폴리펩티드를 포함하는 T 림프구를 증식하도록 자극한다.
상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에서, 항원 및/또는 항체는 T 림프구가 배양되는 배지에서 자유 상태로 존재할 수 있거나, 이들 중 어느 하나 또는 둘다가 고체 지지체, 예를 들면, 조직 배양 플라스틱 표면, 비드 등에 부착될 수 있다.
본원에 기재된 CTLA4 또는 PD-1 경막 도메인-함유 폴리펩티드를 포함하는 T 림프구는 원하는 경우 모든 또는 실질적으로 모든 T 림프구들의 사멸을 가능하게 하는 "자살 유전자" 또는 "안전 스위치"를 임의적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변경된 T 림프구는 간사이클로비르(gancyclovir)와의 접촉 시 변경된 T 림프구의 사멸을 야기하는 HSV 타이미딘 키나제 유전자(HSV-TK)를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 변경된 T 림프구는 특정 소분자 약제를 사용한 이량체화를 가능하게 하는 유도성 캐스페이즈(caspase), 예를 들면, 유도성 캐스페이즈 9(icaspase9), 예를 들면, 캐스페이즈 9와 인간 FK506 결합 단백질의 융합 단백질을 발현하거나 포함한다. 문헌[Straathof et al., Blood 105(11):4247-4254 (2005)]을 참조한다.
4. 변경된 T 림프구를 사용하는 방법
CTLA4 또는 PD-1 경막 도메인-함유 폴리펩티드, 예를 들면, CAR을 포함하는 본원에서 제공된 변경된 면역 세포, 예를 들면, 변경된 T 림프구를 사용하여 T 림프구에 의해 표적화되고자 하는 1종 이상의 세포, 예를 들면, 사멸될 1종 이상의 세포를 갖는 개체를 치료할 수 있다. 일부 실시양태에서, 사멸될 세포는 암세포, 예를 들면, 종양 세포이다. 일부 실시양태에서, 암세포는 고형 종양의 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 림프종, 폐암, 유방암, 전립선암, 부신피질암종, 갑상선암종, 코인두암종, 흑색종, 예를 들면, 악성 흑색종, 피부암종, 대장암종, 데스모이드 종양, 결합조직형성 둥근 소세포 종양, 내분비 종양, 유잉 육종, 말초 원시 신경외배엽 종양, 고형 생식세포 종양, 간모세포종, 신경모세포종, 비-횡문근육종 연조직 육종, 골육종, 망막모세포종, 횡문근육종, 윌름스 종양, 신경아교모세포종, 점액종, 섬유종, 지방종 등의 세포이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 림프종은 만성 림프구성 백혈병(소림프구성 림프종), B 세포 전구림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 비장 변연부 림프종, 형질세포 골수종, 형질세포종, 림프절외 변역부 B 세포 림프종, MALT 림프종, 림프절 변연부 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 맨틀 세포 림프종, 미만성 B 대세포 림프종, 중격 (흉선) B 대세포 림프종, 혈관내 B 대세포 림프종, 일차 삼출 림프종, 버킷 림프종, T 림프구 전구림프구성 백혈병, T 림프구 대과립 림프구성 백혈병, 공격성 NK 세포 백혈병, 성인 T 림프구 백혈병/림프종, 림프절외 NK/T 림프구 림프종, 코 유형 장병증 유형 T 림프구 림프종, 간비장 T 림프구 림프종, 모세포성 NK 세포 림프종, 균상 식육종, 세자리 증후군, 일차 피부 역형성 대세포 림프종, 림프종모양 구진증, 혈관면역모세포성 T 림프구 림프종, 말초 T 림프구 림프종(비특정됨), 역형성 대세포 림프종, 호지킨 림프종 또는 비-호지킨 림프종일 수 있다.
T 림프구에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 장애를 갖는 개체, 예를 들면, 암을 갖는 개체에게 투여한 후 본원에 기재된 변경된 T 림프구의 효능을, 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있는, 상기 특정 질환 또는 장애에 대해 특이적인 하나 이상의 기준(상기 질환 또는 장애의 진행을 표시함)으로 평가할 수 있다. 일반적으로, 이러한 개체에게의 본원에 기재된 변경된 T 림프구의 투여는 하나 이상의 상기 기준이 질환 상태 값 또는 범위를 정상 값 또는 범위 쪽으로 검출가능하게, 예를 들면, 유의하게 이동시킬 때 효과적이다.
본원에 기재된 변경된 T 림프구는 임의의 약학적으로 허용가능한 용액, 바람직하게는 생존 세포의 전달에 적합한 용액, 예를 들면, 식염수 용액(예컨대, 링거 용액), 젤라틴, 탄수화물(예를 들면, 락토스, 아밀로스, 전분 등), 지방산 에스터, 하이드록시메틸셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈 등에 의해 제제화될 수 있다. 이러한 제제는 바람직하게는 변경된 T 림프구의 첨가 전에 멸균되고, 보조제, 예컨대, 윤활제, 방부제, 안정화제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치기 위한 염, 완충제 및 착색제와 혼합될 수 있다. 변경된 T 림프구의 제제화에 사용되기에 적합한 약학 담체는 당분야에서 공지되어 있고, 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO 96/05309호에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변경된 T 림프구는 개별 용량으로 제제화되고, 이때 상기 개별 용량은 적어도, 많아야 또는 약 1x104개, 5x104개, 1x105개, 5x105개, 1x106개, 5x106개, 1x107개, 5x107개, 1x108개, 5x108개, 1x109개, 5x109개, 1x1010개, 5x1010개 또는 1x1011개의 변경된 T 림프구를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변경된 T 림프구는 정맥내, 동맥내, 비경구, 근육내, 피하, 경막내 또는 안내 투여, 또는 특정 장기 또는 조직 내로의 투여를 위해 제제화된다.
실시예
1. 실시예 1: B 세포 림프종의 치료
개체는 B 세포 만성 림프구성 백혈병인 B 세포 림프종을 나타낸다. 상기 개체의 B 세포의 시험은 상기 B 세포가 17p 결실을 보유한다는 것을 확인시켜준다. 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터로 형질감염된 개체로부터 T 림프구를 수득하고 CD3+CD28-코팅된 비드를 사용하여 투여에 충분한 수까지 증폭한다. 상기 키메라 수용체는 CD19에 결합하는 세포외 항원-결합 영역; CTLA4로부터의 경막 도메인; CD28의 세포내 보조자극 도메인; 및 세포내 CD3ζ 도메인을 포함한다. 200 ㎖ 식염수 용액 중의 109개 내지 1010개 T 림프구를 30분에 걸친 정맥내 주입으로 상기 개체에게 투여한다. 그 후, 개체의 혈액에서 90% 이상의 CD19+ B 세포의 감소를 확립하기 위해 2주 동안 상기 개체를 모니터링한다.
2. 실시예 2: B 세포 림프종의 치료
개체는 B 세포 만성 림프구성 백혈병인 B 세포 림프종을 나타낸다. 상기 개체의 B 세포의 시험은 상기 B 세포가 17p 결실을 보유한다는 것을 확인시켜준다. CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터로 형질감염된 개체로부터 약 106개의 T 림프구를 수득한다. CAR은 CD19에 결합하는 세포외 항원-결합 영역; PD-1로부터의 경막 도메인; CD28의 세포내 보조자극 도메인; 및 세포내 CD3ζ 도메인을 포함한다. T 세포의 사전 증폭 없이 CAR 발현 T 세포를 개체에게 투여한다. 200 ㎖ 식염수 용액 중의 105개 내지 106개 T 림프구를 30분에 걸친 정맥내 주입으로 상기 개체에게 투여한다. 그 후, 개체의 혈액에서 90% 이상의 CD19+ B 세포의 감소를 확립하기 위해 2주 동안 상기 개체를 모니터링한다.
3. 실시예 3: B 세포 림프종의 치료
개체는 B 세포 만성 림프구성 백혈병인 B 세포 림프종을 나타낸다. 상기 개체의 B 세포의 시험은 상기 B 세포가 p53 결실을 보유한다는 것을 확인시켜준다. CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터로 형질감염된 개체로부터 T 림프구를 수득하고 CD3+CD28-코팅된 비드를 사용하여 투여에 충분한 수까지 증폭한다. CAR은 CD19에 결합하는 세포외 항원-결합 영역; CTLA4로부터의 경막 도메인; CD28, 4-1BB 및 OX40 각각의 세포내 보조자극 도메인; 및 세포내 CD3ζ 도메인을 포함한다. 200 ㎖ 식염수 용액 중의 109개 내지 1010개 T 림프구를 30분에 걸친 정맥내 주입으로 상기 개체에게 투여한다. 그 후, 개체의 혈액에서 90% 이상의 CD19+ B 세포의 감소를 확립하기 위해 2주 동안 상기 개체를 모니터링한다.
4. 실시예 4: B 세포 림프종의 치료
개체는 B 세포 만성 림프구성 백혈병인 B 세포 림프종을 나타낸다. 상기 개체의 B 세포의 시험은 상기 B 세포가 p53 결실을 보유한다는 것을 확인시켜준다. CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터로 형질감염된 개체로부터 약 106개의 T 림프구를 수득한다. CAR은 CD19에 결합하는 세포외 항원-결합 영역; PD-1로부터의 경막 도메인; CD28, 4-1BB 및 OX40 각각의 세포내 보조자극 도메인; 및 세포내 CD3ζ 도메인을 포함한다. T 세포의 사전 증폭 없이 CAR 발현 T 세포를 개체에게 투여한다. 200 ㎖ 식염수 용액 중의 105개 내지 106개 T 림프구를 30분에 걸친 정맥내 주입으로 상기 개체에게 투여한다. 그 후, 개체의 혈액에서 90% 이상의 CD19+ B 세포의 감소를 확립하기 위해 2주 동안 상기 개체를 모니터링한다.
5. 실시예 5: 전립선암의 치료
개체는 국소적 또는 다른 림프절로 퍼지지 않은(NO, MO) T2 기의 전립선암을 나타낸다. 조직학적 등급은 G2인 것으로 확인된다. 종합하건대, 개체는 I1 기 전립선암을 갖는 것으로 확인된다. 200 ㎖ 식염수 용액 중의 109개 내지 1010개 변경된 T 림프구(CAR을 포함함)를 30분에 걸친 정맥내 주입으로 상기 개체에게 투여한다. CAR은 PSCA에 결합하는 세포외 항원-결합 영역; CTLA4로부터의 경막 도메인; CD28의 세포내 보조자극 도메인; 및 세포내 CD3ζ 도메인을 포함한다. 전립선암 병기 및 림프절로의 퍼짐에 대해 개체를 재평가하고, 생검된 전립선 조직의 조직학적 분석을 투여 후 30일, 60일 및 90일에서 수행한다.
6. 실시예 6: 전립선암의 치료
개체는 국소적 또는 다른 림프절로 퍼지지 않은(NO, MO) T2 기의 전립선암을 나타낸다. 조직학적 등급은 G2인 것으로 확인된다. 종합하건대, 개체는 I1 기 전립선암을 갖는 것으로 확인된다. 200 ㎖ 식염수 용액 중의 109개 내지 1010개 변경된 T 림프구(CAR을 포함함)를 30분에 걸친 정맥내 주입으로 상기 개체에게 투여한다. CAR은 PSCA에 결합하는 세포외 항원-결합 영역; PD-1로부터의 경막 도메인; CD28의 세포내 보조자극 도메인; 및 세포내 CD3ζ 도메인을 포함한다. 전립선암 병기 및 림프절로의 퍼짐에 대해 개체를 재평가하고, 생검된 전립선 조직의 조직학적 분석을 투여 후 30일, 60일 및 90일에서 수행한다.
7. 실시예 7: 전립선암의 치료
개체는 국소적 또는 다른 림프절로 퍼지지 않은(NO, MO) T2 기의 전립선암을 나타낸다. 조직학적 등급은 G2인 것으로 확인된다. 종합하건대, 개체는 I1 기 전립선암을 갖는 것으로 확인된다. 200 ㎖ 식염수 용액 중의 109개 내지 1010개 변경된 T 림프구(CAR을 포함함)를 30분에 걸친 정맥내 주입으로 상기 개체에게 투여한다. CAR은 PSCA에 결합하는 세포외 항원-결합 영역; CTLA4로부터의 경막 도메인; CD28, 4-1BB 및 OX40 각각의 세포내 보조자극 도메인; 및 세포내 CD3ζ 도메인을 포함한다. 전립선암 병기 및 림프절로의 퍼짐에 대해 개체를 재평가하고, 생검된 전립선 조직의 조직학적 분석을 투여 후 30일, 60일 및 90일에서 수행한다.
8. 실시예 8: 전립선암의 치료
개체는 국소적 또는 다른 림프절로 퍼지지 않은(NO, MO) T2 기의 전립선암을 나타낸다. 조직학적 등급은 G2인 것으로 확인된다. 종합하건대, 개체는 I1 기 전립선암을 갖는 것으로 확인된다. 200 ㎖ 식염수 용액 중의 109개 내지 1010개 변경된 T 림프구(CAR을 포함함)를 30분에 걸친 정맥내 주입으로 상기 개체에게 투여한다. CAR은 PSCA에 결합하는 세포외 항원-결합 영역; PD-1로부터의 경막 도메인; CD28, 4-1BB 및 OX40 각각의 세포내 보조자극 도메인; 및 세포내 CD3ζ 도메인을 포함한다. 전립선암 병기 및 림프절로의 퍼짐에 대해 개체를 재평가하고, 생검된 전립선 조직의 조직학적 분석을 투여 후 30일, 60일 및 90일에서 수행한다.
9. 실시예 9: CTLA -4 또는 PD -1 경막 도메인을 포함하는 CAR
본 실시예는 TLA-4 또는 PD-1 경막 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체가 T 세포에서 기능성 및 활성을 갖는다는 것을 입증한다.
9.1 CTLA -4 경막 도메인을 포함하는 CAR
항원 HER2에 결합하는 세포외 도메인(항-HER2 scFV)을 포함하는 CAR들을 생성하였다. 구체적으로, 하기 CAR들을 생성하였다: (i) 항-HER2 scFV, CD28 경막 도메인 및 CD3ζ 세포내 도메인을 포함하는 HER-28TMζ; (ii) 항-HER2 scFV, CD28 경막 도메인 및 CD28-CD3ζ 세포내 도메인을 포함하는 HER-28TM28ζ; (iii) 항-HER2 scFV, CH2CH3 힌지, CTLA-4 경막 도메인(서열번호 10) 및 CD28-CD3ζ 세포내 도메인을 포함하는 HER2-CTLA4TM28ζ; 및 (iv) 항-HER2 scFV, CD8 힌지, 4-1BB 경막 도메인 및 CD28-CD3ζ 세포내 도메인을 포함하는 HER2-41BBTM28ζ.
전술된 CAR들을 발현하는 인간 T 세포의 능력을 평가하였다. 인간 범 T 단리 키트 II 및 인간 천연 범 T 단리 키트(밀테니이(Miltenyi), 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재)를 사용하여 음성 선별로 공여자 샘플 혈액의 버피 코트로부터 각각 범 T 세포 및 천연 범 T 세포를 단리하였다. 단리된 T 세포를 10 ng/㎖ IL-7의 존재 하에서 11일 동안 RPMI 완전 배지에서 배양한 후, CAR 구축물을 발현하는 렌티바이러스를 사용하여 5의 MOI로 형질도입하였다.
형질도입으로부터 3일 후, HER2-Fc 융합 단백질(알앤디 시스템스(R&D Systems), 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)을 사용하여 세포를 염색한 후 FITC 또는 APC와 접합된 다중클론 염소 항-인간 IgG-Fc 항체(잭슨 이뮤노리서치(ImmunoResearch), 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브 소재)로 염색하여 CAR T 세포 표현형을 특징규명하였다. 동일한 날에 T 세포를 0.25 내지 1 ㎍/㎖의 농도 구배에서 HER2-Fc 융합 단백질로 자극하였다. 주문제작된 CBA 플렉스 세트(비디 바이오사이언시스(BD Biosciences), 미국 캘리포니아주 산 호세 소재)를 사용하여 세포측정 비드 어레이(CBA) 분석을 수행하기 위해 자극으로부터 48시간 후 상청액을 수집하여 T 세포에 의한 사이토카인 생성을 평가하였다. 상청액 제거 후, 형광색소 접합체(비디 바이오사이언시스)를 갖는 항-인간 단일클론 항체를 사용하여 배양물의 세포를 염색하여 T 세포 활성화 표면 마커 CD69, 4-1BB, CD71, HLA-DR 및 CD25를 측정하였다. CBA 및 표면 마커 둘다에 대한 유동 세포측정 분석을 FACS 캔토(Canto) II 기계 상에서 수행하고, 데이터를 FACSDiva 소프트웨어(비디 바이오사이언시스)로 획득하였다. CBA 데이터를 FCAP 분석 소프트웨어(소프트 플로우 리미티드(Soft Flow Ltd.), 헝가리 펙스 소재)로 분석하였다. 플로우조(FlowJo) 유동 세포측정 소프트웨어(트리 스타(Tree Star), 미국 오레곤주 애쉬랜드 소재)를 이용하여 표면 마커 유동 데이터를 분석하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, CTLA-4 경막 도메인을 갖는 CAR을 포함하는, 생성된 CAR들 중 3개의 CAR들이 T 세포에 의해 고도로 발현되었다. T 세포 활성화 표면 마커 CD69, 4-1BB 및 HLA-DR 각각은 CAR 연결 시, 즉 CAR T 세포가 HER2-Fc 융합 단백질로 자극되었을 때 상향조절되었다. 각각의 경우, 구축물 HER2-CTLA4TM28ζ를 발현하는 CAR T 세포에서 가장 높은 수준이 관찰되었다.
도 2 내지 4에 나타낸 바와 같이, 4개의 CAR T 세포 세트들 중 2개의 CAR T 세포 세트들이 HER2 자극에 반응하여 사이토카인 생성을 나타내었다. 구체적으로, HER2-28TM28ζ로 표기된 CAR을 발현하는 T 세포 및 HER2-CTLA4TM28ζ로 표기된 CAR을 발현하는 T 세포는 HER2 자극에 반응하여 용량 의존적 방식으로 사이토카인 인터류킨-2(IL-2)(도 2), GM-CSF(도 3) 및 인터페론-감마(IFN-γ)(도 4)를 생성하였다. 놀랍게도, 억제 신호를 면역 시스템 세포에게 정상적으로 전달하는 단백질의 경막 도메인(즉, CTLA-4 경막 도메인)을 포함하는 CAR을 발현하는 T 세포는 HER2-28TM28ζ로 표기된 CAR을 발현하는 T 세포를 포함하는, 다른 CAR들 각각을 발현하는 T 세포들에 비해 훨씬 더 높은 수준의 각각의 사이토카인을 생성하였다. 도 2 내지 4를 참조한다.
HER2를 사용한 전술된 CAR들을 발현하는 T 세포의 자극이 T 세포에 의한 세포내 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 생성을 유도하는지도 조사하였다. CAR T 세포를 IL-2(50 IU/㎖)-함유 배지에서 2일 동안 HER2-Fc(1 ㎍/㎖)로 자극하였다. HER2 자극을 매회 7일 간격으로 2회 이상 수행하였다. 세 번째 자극 후, 세포내 TNF-α를 유동 세포측정으로 조사하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, HER2-28TM28ζ로 표기된 CAR을 발현하는 T 세포, HER2-CTLA4TM28ζ로 표기된 CAR을 발현하는 T 세포, 및 HER2-28TMζ로 표기된 CAR을 발현하는 T 세포는 TNF-α를 생성하였는데, 이때 가장 높은 양의 TNF-α는 억제 신호를 면역 시스템 세포에게 정상적으로 전달하는 단백질의 경막 도메인(즉, CTLA4 경막 도메인)을 포함하는 CAR을 발현하는 T 세포에 의해 생성되었다.
마지막으로, HER2를 사용한 전술된 CAR들을 발현하는 T 세포의 자극이 CAR T 세포 집단을 풍부하게 하는지를 확인하였다. 전술된 CAR들을 발현하는 CAR T 세포들을 HER2-Fc 융합 단백질로 자극하였다. HER2를 사용한 자극으로부터 13일 후, CAR T 세포를 전술된 바와 같이 유동 세포측정으로 분석하였다. 놀랍게도, 도 6에 나타낸 바와 같이, HER2 자극 후 HER2-CTLA4TM28ζ로 표기된 CAR을 발현하는 CAR T 세포만이 풍부하게 존재하였다.
9.2 PD -1 또는 CTLA -4 경막 도메인을 포함하는 CAR
본 실시예는 CTLA-4 경막 도메인 또는 PD-1 경막 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체가 T 세포에서 기능성 및 활성을 갖는다는 것을 입증한다.
항원 HER2에 결합하는 세포외 도메인(항-HER2 scFV)을 포함하는 CAR들을 생성하였다. 구체적으로, 하기 CAR들을 생성하였다: (i) 항-HER2 scFV, CH2CH3 힌지, PD-1 경막 도메인(서열번호 11) 및 CD28-CD3 세포내 도메인을 포함하는 HER-PD1TM-CD28-CD3; (ii) 항-HER2 scFV, CD28 힌지, CTLA-4 경막 도메인(서열번호 10) 및 4-1BB-CD3 세포내 도메인을 포함하는 HER-CTLA4(189)TM-41BB-CD3; (iii) 항-HER2 scFV, CD28 힌지, PD-1 경막 도메인(서열번호 11) 및 4-1BB-CD3 세포내 도메인을 포함하는 HER-PD1TM-41BB-CD3; 및 (iv) 항-HER2 scFV, CD28 힌지, CD28 경막 도메인 및 CD28-CD3 세포내 도메인을 포함하는 HER2-CD28TM-CD28-CD3.
인간 범 T 단리 키트 II 및 인간 천연 범 T 단리 키트(밀테니이, 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재)를 사용하여 음성 선별로 공여자 샘플 혈액의 버피 코트로부터 각각 범 T 세포 및 천연 범 T 세포를 단리하였다. 단리된 T 세포를 10 ng/㎖ IL-7의 존재 하에서 11일 동안 RPMI 완전 배지에서 배양한 후, CAR 구축물을 발현하는 렌티바이러스를 사용하여 7의 MOI로 형질도입하였다.
형질도입으로부터 3일 후, HER2-Fc 융합 단백질(알앤디 시스템스, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)을 사용하여 세포를 염색한 후 FITC 또는 APC와 접합된 다중클론 염소 항-인간 IgG-Fc 항체(잭슨 이뮤노리서치, 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브 소재)로 염색하여 CAR T 세포 표현형을 특징규명하였다. 동일한 날에 T 세포를 0.25 내지 1 ㎍/㎖의 농도 구배에서 HER2-Fc 융합 단백질로 자극하였다. 주문제작된 CBA 플렉스 세트(비디 바이오사이언시스, 미국 캘리포니아주 산 호세 소재)를 사용하여 세포측정 비드 어레이(CBA) 분석을 수행하기 위해 자극으로부터 48시간 후 상청액을 수집하여 T 세포에 의한 사이토카인 생성을 평가하였다. 상청액 제거 후, 형광색소 접합체(비디 바이오사이언시스)를 갖는 항-인간 단일클론 항체를 사용하여 배양물의 세포를 염색하여 T 세포 활성화 표면 마커 CD69, 4-1BB, CD71, HLA-DR 및 CD25를 측정하였다. CBA 및 표면 마커 둘다에 대한 유동 세포측정 분석을 FACS 캔토 II 기계 상에서 수행하고, 데이터를 FACSDiva 소프트웨어(비디 바이오사이언시스)로 획득하였다. CBA 데이터를 FCAP 분석 소프트웨어(소프트 플로우 리미티드, 헝가리 펙스 소재)로 분석하였다. 플로우조 유동 세포측정 소프트웨어(트리 스타, 미국 오레곤주 애쉬랜드 소재)를 이용하여 표면 마커 유동 데이터를 분석하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 생성된 CAR들 각각이 T 세포에 의해 고도로 발현되었다. T 세포 활성화 표면 마커 CD69, CD71 및 HLA-DR 각각이 HER2를 사용한 전술된 CAR T 세포들의 자극 시 상향조절되었다. 각각의 경우, 관찰된 상향조절 수준은 PD-1 또는 CTLA-4 경막 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 CAR T 세포에서 가장 높았다.
도 8 또는 9에 나타낸 바와 같이, 상기 CAR T 세포들은 HER2 자극에 반응하여 사이토카인 생성을 나타내었다. 구체적으로, 전술된 CAR들을 발현하는 T 세포들은 HER2 자극에 반응하여 용량 의존적 방식으로 사이토카인 IL-2(도 8), TNF-α(도 8), IFN-γ(도 8), GM-CSF(도 9), 그랜자임 B(도 9) 및 IL-13(도 9)을 생성하였다. 각각의 경우, PD-1 또는 CTLA-4 경막 도메인을 포함하는 CAR들을 발현하는 T 세포들은 가장 높은 수준의 사이토카인 생성을 나타내었는데, 이때 HER-PD1TM-CD28-CD3으로 표기된 CAR을 발현하는 T 세포들은 가장 높은 수준의 각각의 사이토카인을 일관되게 생성하였다(도 8 및 9 참조).
마지막으로, HER2를 사용한 전술된 CAR들을 발현하는 T 세포의 자극이 CAR T 세포 집단의 풍부화를 야기하는지를 확인하였다. 전술된 CAR들을 발현하는 CAR T 세포들을 HER2-Fc 융합 단백질로 자극하였다. HER2를 사용한 자극으로부터 11일 후, CAR T 세포를 전술된 바와 같이 유동 세포측정으로 분석하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, HER-PD1TM-CD28-CD3으로 표기된 CAR을 발현하는 CAR T 세포는 HER2 자극 후 풍부하게 존재하였는데, 이때 기재된 다른 CAR들을 발현하는 T 세포들은 초기 세포 수에 비해 생존 세포의 적당한 수준의 증가를 보였다.
9.3 결론
결론적으로, 억제 신호를 면역 시스템 세포에게 정상적으로 전달하는 단백질의 경막 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 T 세포의 생성이 입증되었다. 추가로, 이러한 CAR T 세포가 놀라운 특징을 보유한다는 것이 밝혀졌다. 구체적으로, 이러한 T 세포는 (i) 자극 신호를 면역 시스템 세포에게 정상적으로 전달하는 단백질의 경막 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 T 세포에 비해 그 자신이 발현하는 CAR의 세포외 도메인이 향하는 항원을 사용한 자극에 반응하여 향상된 수준의 사이토카인 생성을 나타내고; (ii) 그 자신이 발현하는 CAR의 세포외 도메인이 향하는 항원의 존재 하에서 배양될 때 풍부해지는 반면, 자극 신호를 면역 시스템 세포에게 정상적으로 전달하는 단백질의 경막 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 T 세포는 상기 항원으로 자극될 때 동일한 정도까지 풍부해지지 않는다.
균등론
본 개시내용은 본원에 기재된 구체적인 실시양태들에 의해 범위 면에서 한정되지 않아야 한다. 실제로, 기재된 변경 이외에 본원에서 제공된 보호대상의 다양한 변경이 상기 설명으로부터 당업자에게 명확해질 것이다. 이러한 변경은 첨부된 특허청구범위 내에 있다.
다양한 공개문헌들, 특허들 및 특허출원들이 본원에서 인용되어 있고, 이들의 개시내용은 전체로서 참고로 도입된다.
SEQUENCE LISTING <110> Anthrogenesis Corporation <120> CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS <130> 12827-401-228 <140> PCT/US2013/076486 <141> 2013-12-19 <150> US 61/740,113 <151> 2012-12-20 <150> US 61/779,925 <151> 2013-03-13 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide - CTLA4 transmembrane domain <400> 1 Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala 1 5 10 15 Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser 20 25 30 Leu Ser Lys Met 35 <210> 2 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide - CTLA4 transmembrane domain <400> 2 Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly 1 5 10 15 Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu 20 25 <210> 3 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide - CTLA4 transmembrane domain <400> 3 Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr 1 5 10 15 Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val 20 <210> 4 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide - CTLA4 transmembrane domain <400> 4 Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr 1 5 10 15 Ser Phe Leu Leu Thr 20 <210> 5 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide - CTLA4 transmembrane domain <400> 5 Phe Leu Leu Trp Ile Leu Val Ala Val Ser Leu Gly Leu Phe Phe Tyr 1 5 10 15 Ser Phe Leu Val Ser Ala Val Ser Leu Ser 20 25 <210> 6 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide - PD-1 transmembrane domain <400> 6 Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu 1 5 10 15 Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys Ser Arg Ala Ala 20 25 <210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide - PD-1 transmembrane domain <400> 7 Val Gly Val Val Gly Gly Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp 1 5 10 15 Val Leu Ala Val Ile 20 <210> 8 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide - PD-1 transmembrane domain <400> 8 Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly Leu Leu Gly Ser Leu 1 5 10 15 Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile 20 25 <210> 9 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide - CTLA4 transmembrane domain <400> 9 Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro 1 5 10 15 Ser Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser 20 25 30 Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys 35 40 45 Met <210> 10 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide - CTLA4 transmembrane domain <400> 10 Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr 1 5 10 15 Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met 20 25 <210> 11 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide - PD-1 transmembrane domain <400> 11 Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly Leu Leu Gly Ser Leu 1 5 10 15 Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys Ser Arg Ala Ala 20 25 30

Claims (80)

  1. (i) 세포독성 T 림프구 항원 4(CTLA4) 또는 프로그래밍된 세포 사멸 1(PD-1)로부터 유래되는 경막 도메인, (ii) 림프구의 활성화 및/또는 증식을 유발하는, 상기 림프구의 표면 상에서 발현되는 내생성 단백질의 세포내 도메인, 및 (iii) 항원에 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 경막 도메인이 CTLA4로부터 유래될 때, 상기 폴리펩티드의 세포내 도메인 및 세포외 도메인이 CTLA4로부터 유래되지 않고; 상기 경막 도메인이 PD-1로부터 유래될 때, 상기 폴리펩티드의 세포내 도메인 및 세포외 도메인이 PD-1로부터 유래되지 않는, 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서,
    키메라 항원 수용체(CAR)인 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    폴리펩티드를 발현하는 T 림프구가, 상기 폴리펩티드가 항원에 결합할 때 증식하도록 활성화되거나 자극되는, 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    T 림프구의 표면 상에서 발현될 때 상기 T 림프구로 하여금 항원을 발현하는 세포를 사멸시키도록 유도하는 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    CTLA4 경막 도메인이 인간 CTLA4 유전자의 엑손 3에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열인, 폴리펩티드.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    CTLA4 경막 도메인이 서열번호 1의 아미노산 서열이거나 이러한 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    CTLA4 경막 도메인이 서열번호 2의 아미노산 서열이거나 이러한 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    CTLA4 경막 도메인이 서열번호 3의 아미노산 서열이거나 이러한 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    CTLA4 경막 도메인이 서열번호 4의 아미노산 서열이거나 이러한 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    CTLA4 경막 도메인이 서열번호 5의 아미노산 서열이거나 이러한 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    PD-1 경막 도메인이 서열번호 6의 폴리펩티드 서열이거나 이러한 폴리펩티드 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    PD-1 경막 도메인이 서열번호 7의 폴리펩티드 서열이거나 이러한 폴리펩티드 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    PD-1 경막 도메인이 서열번호 8의 폴리펩티드 서열이거나 이러한 폴리펩티드 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포외 도메인이 항원에 결합하는 수용체, 또는 수용체의 부분을 포함하는, 폴리펩티드.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포외 도메인이 항원에 결합하는 수용체, 또는 수용체의 부분인, 폴리펩티드.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포외 도메인이 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는, 폴리펩티드.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포외 도메인이 항체 또는 이의 항원-결합 부분인, 폴리펩티드.
  18. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포외 도메인이 단일-쇄 Fv 도메인을 포함하는, 폴리펩티드.
  19. 제18항에 있어서,
    단일-쇄 Fv 도메인이 유연성 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하고, 이때 상기 V L 및 V H 가 항원에 결합하는 항체로부터 유래되는, 폴리펩티드.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원이 종양 세포 상의 항원인, 폴리펩티드.
  21. 제20항에 있어서,
    종양 세포가 고형 종양의 세포인, 폴리펩티드.
  22. 제20항에 있어서,
    종양 세포가 혈액암의 세포인, 폴리펩티드.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원이 종양-관련 항원 또는 종양-특이적 항원인, 폴리펩티드.
  24. 제23항에 있어서,
    종양-관련 항원 또는 종양-특이적 항원이 Her2, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 알파-태아단백질(AFP), 암배아 항원(CEA), 암 항원-125(CA-125), CA19-9, 칼레티닌, MUC-1, 상피 막 단백질(EMA), 상피 종양 항원(ETA), 티로시나제, 흑색종-관련 항원(MAGE), CD34, CD45, CD99, CD117, 크로모그라닌, 사이토케라틴, 데스민, 신경아교 원섬유 산성 단백질(GFAP), 육안적 낭포증 유체 단백질(GCDFP-15), HMB-45 항원, 단백질 멜란-A(T 림프구에 의해 인식되는 흑색종 항원; MART-1), myo-D1, 근육-특이적 액틴(MSA), 신경필라멘트, 신경-특이적 에놀라제(NSE), 태반 알칼리성 포스파타제, 시냅토파이시스, 티로글로불린, 갑상선 전사 인자-1, 피루베이트 키나제 동종효소 유형 M2의 이량체 형태(종양 M2-PK), CD19, CD22, CD27, CD30, CD70, 강글리오사이드 G2(GD2), 표피 성장 인자 변이체 III(EGFRvIII), 정자 단백질 17(Sp17), 메소텔린, 전립선 산 포스파타제(PAP), 프로스테인, T 세포 수용체 감마 대안적 판독 프레임 단백질(TARP), Trp-p8, 전립선의 6-경막 상피 항원 1(STEAP1), 비정상적 ras 단백질, 비정상적 p53 단백질, 인테그린 αvβ3(CD61), 갈락틴(galactin), V-Ki-ras2 키르스텐(Kirsten) 래트 육종 바이러스 발암유전자(K-Ras) 또는 Ral-B인, 폴리펩티드.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포외 도메인이 연결제, 스페이서 또는 힌지 폴리펩티드 서열에 의해 경막 도메인에 연결되는, 폴리펩티드.
  26. 제25항에 있어서,
    연결제, 스페이서 또는 힌지 폴리펩티드 서열이 CD28로부터 유래되는, 폴리펩티드.
  27. 제25항에 있어서,
    연결제, 스페이서 또는 힌지 폴리펩티드 서열이 CTLA4로부터 유래되는, 폴리펩티드.
  28. 제25항에 있어서,
    연결제, 스페이서 또는 힌지 폴리펩티드가 PD-1로부터 유래되는, 폴리펩티드.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포내 도메인이 T 세포의 표면 상에서 발현되고 상기 T 세포의 활성화 및/또는 증식을 유발하는 단백질의 세포내 도메인인, 폴리펩티드.
  30. 제29항에 있어서,
    세포내 도메인이 CD3ζ 세포내 신호전달 도메인인, 폴리펩티드.
  31. 제29항에 있어서,
    세포내 도메인이 림프구 수용체 쇄, TCR/CD3 복합체 단백질, Fc 수용체 서브유닛 또는 IL-2 수용체 서브유닛으로부터 유래되는, 폴리펩티드.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 보조자극 도메인을 추가로 포함하는 폴리펩티드.
  33. 제32항에 있어서,
    하나 이상의 보조자극 도메인이 보조자극 CD27 폴리펩티드 서열, 보조자극 CD28 폴리펩티드 서열, 보조자극 OX40(CD134) 폴리펩티드 서열, 보조자극 4-1BB(CD137) 폴리펩티드 서열 및 보조자극 유도성 T 세포 보조자극(ICOS) 폴리펩티드 서열 중 하나 이상의 폴리펩티드 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 항원-결합 도메인; (ii) CD28 또는 CTLA4 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 또는 PD-1 경막 도메인; (iv) 보조자극 도메인; 및 (v) 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함하는 폴리펩티드.
  35. 제34항에 있어서,
    (i) 유연성 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 항원에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) CD28 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함하는 폴리펩티드.
  36. 제34항에 있어서,
    (i) 유연성 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 항원에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) CTLA4 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함하는 폴리펩티드.
  37. 제34항에 있어서,
    (i) 유연성 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 항원에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) CD28 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) PD-1 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함하는 폴리펩티드.
  38. 제34항에 있어서,
    (i) 유연성 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 항원에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) CTLA4 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) PD-1 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함하는 폴리펩티드.
  39. 제34항에 있어서,
    (i) 유연성 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 항원에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) PD-1 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함하는 폴리펩티드.
  40. 제34항에 있어서,
    (i) 유연성 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 항원에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) PD-1 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) PD-1 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함하는 폴리펩티드.
  41. (i) 세포독성 T 림프구 항원 4(CTLA4) 또는 프로그래밍된 세포 사멸 1(PD-1)로부터 유래되는 경막 도메인, (ii) 림프구의 표면 상에서 발현되고 상기 림프구의 활성화 및/또는 증식을 유발하는 내생성 단백질의 세포내 도메인, 및 (iii) 항원에 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 막-결합된 폴리펩티드를 포함하는 T 림프구로서, 상기 경막 도메인이 CTLA4로부터 유래될 때, 상기 폴리펩티드의 세포내 도메인 및 세포외 도메인이 CTLA4로부터 유래되지 않고; 상기 경막 도메인이 PD-1로부터 유래될 때, 상기 폴리펩티드의 세포내 도메인 및 세포외 도메인이 PD-1로부터 유래되지 않는, T 림프구.
  42. 제41항에 있어서,
    폴리펩티드가 키메라 항원 수용체(CAR)인, T 림프구.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서,
    폴리펩티드를 발현하는 T 림프구가, 상기 폴리펩티드가 항원에 결합할 때 증식하도록 활성화되거나 자극되는, T 림프구.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리펩티드가 T 림프구의 표면 상에서 발현될 때 상기 T 림프구로 하여금 항원을 발현하는 세포를 사멸시키도록 유도하는, T 림프구.
  45. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    CTLA4 경막 도메인이 인간 CTLA4 유전자의 엑손 3에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열인, T 림프구.
  46. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    CTLA4 경막 도메인이 서열번호 1의 아미노산 서열이거나 이러한 아미노산 서열을 포함하는, T 림프구.
  47. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    CTLA4 경막 도메인이 서열번호 2의 아미노산 서열이거나 이러한 아미노산 서열을 포함하는, T 림프구.
  48. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    CTLA4 경막 도메인이 서열번호 3의 아미노산 서열이거나 이러한 아미노산 서열을 포함하는, T 림프구.
  49. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    CTLA4 경막 도메인이 서열번호 4의 아미노산 서열이거나 이러한 아미노산 서열을 포함하는, T 림프구.
  50. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    CTLA4 경막 도메인이 서열번호 5의 아미노산 서열이거나 이러한 아미노산 서열을 포함하는, T 림프구.
  51. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    PD-1 경막 도메인이 서열번호 6의 폴리펩티드 서열이거나 이러한 폴리펩티드 서열을 포함하는, T 림프구.
  52. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    PD-1 경막 도메인이 서열번호 7의 폴리펩티드 서열이거나 이러한 폴리펩티드 서열을 포함하는, T 림프구.
  53. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    PD-1 경막 도메인이 서열번호 8의 폴리펩티드 서열이거나 이러한 폴리펩티드 서열을 포함하는, T 림프구.
  54. 제41항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포외 도메인이 항원에 결합하는 수용체, 또는 수용체의 부분을 포함하는, T 림프구.
  55. 제41항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포외 도메인이 항원에 결합하는 수용체, 또는 수용체의 부분인, T 림프구.
  56. 제41항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포외 도메인이 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는, T 림프구.
  57. 제41항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포외 도메인이 항체 또는 이의 항원-결합 부분인, T 림프구.
  58. 제41항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포외 도메인이 단일-쇄 Fv 도메인을 포함하는, T 림프구.
  59. 제58항에 있어서,
    단일-쇄 Fv 도메인이 유연성 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하고, 이때 상기 V L 및 V H 가 항원에 결합하는 항체로부터 유래되는, T 림프구.
  60. 제41항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원이 종양 세포 상의 항원인, T 림프구.
  61. 제60항에 있어서,
    종양 세포가 고형 종양의 세포인, T 림프구.
  62. 제60항에 있어서,
    종양 세포가 혈액암의 세포인, T 림프구.
  63. 제41항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원이 종양-관련 항원 또는 종양-특이적 항원인, T 림프구.
  64. 제63항에 있어서,
    종양-관련 항원 또는 종양-특이적 항원이 Her2, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 알파-태아단백질(AFP), 암배아 항원(CEA), 암 항원-125(CA-125), CA19-9, 칼레티닌, MUC-1, 상피 막 단백질(EMA), 상피 종양 항원(ETA), 티로시나제, 흑색종-관련 항원(MAGE), CD34, CD45, CD99, CD117, 크로모그라닌, 사이토케라틴, 데스민, 신경아교 원섬유 산성 단백질(GFAP), 육안적 낭포증 유체 단백질(GCDFP-15), HMB-45 항원, 단백질 멜란-A(T 림프구에 의해 인식되는 흑색종 항원; MART-1), myo-D1, 근육-특이적 액틴(MSA), 신경필라멘트, 신경-특이적 에놀라제(NSE), 태반 알칼리성 포스파타제, 시냅토파이시스, 티로글로불린, 갑상선 전사 인자-1, 피루베이트 키나제 동종효소 유형 M2의 이량체 형태(종양 M2-PK), CD19, CD22, CD27, CD30, CD70, 강글리오사이드 G2(GD2), 표피 성장 인자 변이체 III(EGFRvIII), 정자 단백질 17(Sp17), 메소텔린, 전립선 산 포스파타제(PAP), 프로스테인, T 세포 수용체 감마 대안적 판독 프레임 단백질(TARP), Trp-p8, 전립선의 6-경막 상피 항원 1(STEAP1), 비정상적 ras 단백질, 비정상적 p53 단백질, 인테그린 αvβ3(CD61), 갈락틴, V-Ki-ras2 키르스텐 래트 육종 바이러스 발암유전자(K-Ras) 또는 Ral-B인, T 림프구.
  65. 제41항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포외 도메인이 연결제, 스페이서 또는 힌지 폴리펩티드 서열에 의해 경막 도메인에 연결되는, T 림프구.
  66. 제65항에 있어서,
    연결제, 스페이서 또는 힌지 폴리펩티드 서열이 CD28로부터 유래되는, T 림프구.
  67. 제65항에 있어서,
    연결제, 스페이서 또는 힌지 폴리펩티드 서열이 CTLA4로부터 유래되는, T 림프구.
  68. 제65항에 있어서,
    연결제, 스페이서 또는 힌지 폴리펩티드 서열이 PD-1로부터 유래되는, T 림프구.
  69. 제41항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포내 도메인이 T 세포의 표면 상에서 발현되고 상기 T 세포의 활성화 및/또는 증식을 유발하는 단백질의 세포내 도메인인, T 림프구.
  70. 제69항에 있어서,
    세포내 도메인이 CD3ζ 세포내 신호전달 도메인인, T 림프구.
  71. 제69항에 있어서,
    세포내 도메인이 림프구 수용체 쇄, TCR/CD3 복합체 단백질, Fc 수용체 서브유닛 또는 IL-2 수용체 서브유닛으로부터 유래되는, T 림프구.
  72. 제41항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리펩티드가 하나 이상의 보조자극 도메인을 추가로 포함하는, T 림프구.
  73. 제72항에 있어서,
    하나 이상의 보조자극 도메인이 보조자극 CD27 폴리펩티드 서열, 보조자극 CD28 폴리펩티드 서열, 보조자극 OX40(CD134) 폴리펩티드 서열, 보조자극 4-1BB(CD137) 폴리펩티드 서열 및 보조자극 유도성 T 세포 보조자극(ICOS) 폴리펩티드 서열 중 하나 이상의 폴리펩티드 서열을 포함하는, T 림프구.
  74. 제41항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리펩티드가 (i) 항원-결합 도메인; (ii) CD28 또는 CTLA4 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 또는 PD-1 경막 도메인; (iv) 보조자극 도메인; 및 (v) 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함하는, T 림프구.
  75. 제74항에 있어서,
    폴리펩티드가 (i) 유연성 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 항원에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) CD28 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함하는, T 림프구.
  76. 제74항에 있어서,
    폴리펩티드가 (i) 유연성 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 항원에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) CTLA4 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함하는, T 림프구.
  77. 제74항에 있어서,
    폴리펩티드가 (i) 유연성 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 항원에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) CD28 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) PD-1 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함하는, T 림프구.
  78. 제74항에 있어서,
    폴리펩티드가 (i) 유연성 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 항원에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) CTLA4 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) PD-1 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함하는, T 림프구.
  79. 제74항에 있어서,
    폴리펩티드가 (i) 유연성 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 항원에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) PD-1 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) CTLA4 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함하는, T 림프구.
  80. 제74항에 있어서,
    폴리펩티드가 (i) 유연성 연결제에 의해 V H 에 연결된 V L 을 포함하는 단일-쇄 Fv 도메인으로서, 상기 V L 및 V H 가 항원에 결합하는 항체로부터 유래되는, 단일-쇄 Fv 도메인; (ii) PD-1 힌지 폴리펩티드 서열; (iii) PD-1 경막 도메인; (iv) CD28 보조자극 도메인; 및 (v) CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 N-말단부터 C-말단까지 순서대로 포함하는, T 림프구.
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