CN105246912B - 嵌合抗原受体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供的是治疗性多肽，例如嵌合抗原受体，其能够引导免疫细胞(例如T淋巴细胞)至靶抗原，并且当抗原与多肽结合时能够引起T细胞增殖或将展示该抗原的细胞杀死，其中该多肽包含来自T细胞共抑制蛋白(诸如CTLA4或PD‑1)的跨膜域。本发明还提供的是表达该多肽的T淋巴细胞及这样的T淋巴细胞治疗疾病(诸如癌症)的用途。

Description

嵌合抗原受体
本申请要求2012年12月20日申请的美国临时专利申请第61/740,113号和2013年3月13日申请的美国临时专利申请第61/779,925号的优先权，所述各临时专利申请通过引用其全部结合到本文中。
1.领域
本文中的公开内容涉及免疫学领域，更准确地说涉及T淋巴细胞或其它免疫细胞的修饰。
2.背景
免疫系统的细胞(例如T淋巴细胞(也称为T细胞))通过受体或受体复合物识别特定抗原并与其相互作用，在识别此类抗原并与其相互作用时，引起该类细胞的活化。此类受体的一个实例是抗原特异性T淋巴细胞受体复合物(TCR/CD3)，一种八个蛋白质的复合物。T细胞受体(TCR)在T淋巴细胞的表面上表达。具有不变结构的一种组分CD3在TCR被配体占据之后负责细胞内信号传递。对抗原-CD3复合物(TCR/CD3)的T淋巴细胞受体识别由主要组织相容性复合体(MHC)的蛋白质呈递给它的抗原性肽。MHC和肽的复合物在抗原呈递细胞和其它T淋巴细胞靶标的表面上表达。TCR/CD3复合物的刺激导致T淋巴细胞的活化并随之发生抗原特异性免疫应答。TCR/CD3复合物在效应功能和免疫系统调节中起重要的作用。
T淋巴细胞需要第二信号—共刺激信号(co-stimulatory signal)才能变成完全活性的。若没有这样的信号，T淋巴细胞对结合于TCR的抗原无应答，或者变成无能的(anergic)。这样的共刺激信号例如由CD28(一种T淋巴细胞蛋白)提供，CD28与产生抗原的细胞(antigen-producing cells)上的CD80和CD86相互作用。ICOS(可诱导共刺激分子(Inducible COStimulator))(另一种T淋巴细胞蛋白)当结合于ICOS配体时提供共刺激信号。CTLA4(细胞毒性T-淋巴细胞抗原4)，也称为CD152，是在辅助T细胞和CD4+T细胞的表面上表达的一种受体，其下调T细胞活性。CTLA4与其关联配体CD80和CD86的结合导致T细胞活化和增殖降低。PD-1(编程性细胞死亡-1)，也称为CD279，目前理解为负调节T细胞受体(TCR)信号并且广泛地负调节免疫应答。
已经通过对单多肽链(一般称为嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor,CAR))的遗传重组方法降低TCR复合物的必需抗原-结合、信号传递和刺激功能。参见例如，Eshhar，美国专利第7,741,465号；Eshhar，美国专利申请公布第2012/0093842号。携带此类CAR的T淋巴细胞一般被称为CAR-T淋巴细胞。CAR经特异性构建以在对CAR所结合的特定抗原应答时刺激T细胞活化和增殖。
3.概述
在一个方面，本文提供的是多肽，例如嵌合抗原受体(参见例如，Eshhar，美国专利第7,741,465号)，其可由免疫系统细胞(例如，T淋巴细胞(T细胞))表达，在这样的免疫系统细胞中是膜结合的，并且其包含来自在正常情况下将抑制信号传递至这样的免疫系统细胞的免疫系统蛋白质的跨膜域(transmembrane domain)，例如来自CTLA4(细胞毒性T-淋巴细胞抗原4或细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4)或PD-1(编程性细胞死亡-1)的跨膜域。
在一个实施方式中，本文提供的是多肽，其包含：(i)跨膜域，包含来自CTLA4(例如，GenBank登记号NM_005214.4(CTLA4细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(智人(Homosapiens))；Gene ID:1493))或PD-1(例如，GenBank登记号NM_005018.2(编程性细胞死亡1(智人)；Gene ID:5133))的跨膜域或其部分，(ii)表达于淋巴细胞的表面上并且触发所述淋巴细胞的活化和/或增殖的内源蛋白质的胞内域(例如，细胞质域)，和(iii)结合于目标抗原的胞外域，其中，如果该跨膜域是来自CTLA4，则所述多肽的胞内域和胞外域不是来自CTLA4；和如果该跨膜域是来自PD-1，则所述多肽的胞内域和胞外域不是来自PD-1。在一个具体的实施方式中，该多肽是嵌合抗原受体(CAR)。在一个具体的实施方式中，表达本文描述的所述多肽或此类多肽的任何一种的T淋巴细胞当所述多肽结合于所述抗原时经活化或刺激得以增殖。在一个具体的实施方式中，该多肽当表达于T淋巴细胞的表面上时引导该T淋巴细胞将表达所述抗原的细胞杀死。
在一个具体的实施方式中，本文提供的是多肽，其包含来自CTLA4的跨膜域，其中该CTLA4跨膜域是由人ctla4基因(例如，GenBank登记号NM_005214.4(CTLA4细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(智人)；Gene ID:1493))的外显子3编码的多肽序列。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的CTLA4跨膜域是或包含氨基酸序列PEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKM(以三字母密码，Pro-Glu-Pro-Cys-Pro-Asp-Ser-Asp-Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val-Ser-Leu-Ser-Lys-Met)(SEQ ID NO:1)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的CTLA4跨膜域是或包含由GenBank登记号NM_005214.4(CTLA4细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(智人)；Gene ID:1493)的核苷酸610-722编码的多肽序列。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的CTLA4跨膜域是或包含氨基酸序列PDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSL(以三字母密码，Pro-Asp-Ser-Asp-Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val-Ser-Leu)(SEQ ID NO:2)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的CTLA4跨膜域是或包含由GenBank登记号NM_005214.4(CTLA4细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(智人)；Gene ID:1493)的核苷酸636-699编码的多肽序列。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的CTLA4跨膜域是或包含氨基酸序列FLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAV(以三字母密码，Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val)(SEQ ID NO:3)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的CTLA4跨膜域是或包含多肽序列FLLWILAAVSSGLFFYSFLLT(以三字母密码，Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr)(SEQ ID NO:4)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的CTLA4跨膜域是或包含多肽序列FLLWILVAVSLGLFFYSFLVSAVSLS(以三字母密码，Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Val-Ala-Val-Ser-Leu-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Val-Ser-Ala-Val-Ser-Leu-Ser)(SEQ IDNO:5)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的CTLA4跨膜域是或包含多肽序列LGIGNGTQIYVIDPEPSPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLT AVSLSKM(以三字母密码，Leu Gly IleGly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Ser Pro Asp Ser Asp PheLeu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu LeuThr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met)(SEQ ID NO:9)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的CTLA4跨膜域是或包含多肽序列FLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKM(以三字母密码，Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala ValSer Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met)(SEQ ID NO:10)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的PD-1跨膜域是或包含氨基酸序列TLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAA(以三字母密码，Thr-Leu-Val-Val-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Gly-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Trp-Val-Leu-Ala-Val-Ile-Cys-Ser-Arg-Ala-Ala)(SEQ ID NO:6)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的PD-1跨膜域是或包含氨基酸序列VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI(以三字母密码，Val-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Gly-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Trp-Val-Leu-Ala-Val-Ile)(SEQ ID NO:7)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的PD-1跨膜域是或包含氨基酸序列FQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI(以三字母密码，Phe-Glu-Thr-Leu-Val-Val-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Gly-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Trp-Val-Leu-Ala-Val-Ile)(SEQ IDNO:8)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的PD-1跨膜域是或包含氨基酸序列FQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAA(以三字母密码，Phe Gln Thr Leu Val Val Gly ValVal Gly Gly Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile CysSer Arg Ala Ala)(SEQ ID NO:11)。
以本文描述的CTLA-4和PD-1跨膜域序列(即，SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ IDNO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11)为范例举例说明，本文描述的跨膜域在某些实施方式中包含来自它们所衍生的蛋白质(即，CTLA-4或PD-1)的胞外域的一个或多个氨基酸和/或来自它们所衍生的蛋白质(即，CTLA-4或PD-1)的胞内域的一个或多个氨基酸。在某些实施方式中，本文描述的跨膜域包含来自它们所衍生的蛋白质(即，CTLA-4或PD-1)的胞外域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在某些实施方式中，本文描述的跨膜域包含来自它们所衍生的蛋白质(即，CTLA-4或PD-1)的胞内域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在某些实施方式中，本文描述的跨膜域包含(i)来自它们所衍生的蛋白质(即，CTLA-4或PD-1)的胞外域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸和(ii)来自它们所衍生的蛋白质(即，CTLA-4或PD-1)的胞内域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的是多肽，其包含跨膜域，其中该跨膜域是或包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11中所公开的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个连续氨基酸。在另一个具体的实施方式中，本文提供的是多肽，其包含跨膜域，其中该跨膜域与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性。在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽在多肽的跨膜域中包含1、2、3、4或5个氨基突变(amino mutations)，例如保守氨基酸突变(例如，疏水氨基酸突变成不同的疏水氨基酸)。
在某些实施方式中，本文提供的是核苷酸序列，其编码本文公开的多肽中的一种。在一个具体的实施方式中，本文提供的是核苷酸序列，其包含编码SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11中所公开的氨基酸序列中的任一种的核苷酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供的是核酸，其编码本文描述的多肽，其中该核酸包含编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11中所公开的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个连续氨基酸的核苷酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供的是核酸序列，其编码与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10或SEQ ID NO:11有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的多肽。
在某些实施方式中，任何本文描述的多肽的胞外域包含结合于抗原的受体或受体部分。该胞外域可以是例如结合于所述抗原的受体或受体部分。在某些实施方式中，该胞外域包含或是抗体或其抗原-结合部分。在一个具体的实施方式中，该胞外域包含或是单链Fv域。该单链Fv域可包含例如通过柔性接头(flexible linker)与VH连接的VL，其中所述VL和VH是来自结合所述抗原的抗体。
该多肽的胞外域所结合的抗原可以是任何目标抗原，例如肿瘤细胞上的抗原。该肿瘤细胞可以是例如实体肿瘤中的细胞或非实体肿瘤的细胞，例如血液癌症的细胞。在某些实施方式中，该抗原是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。在一个具体的实施方式中，该肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原是(但不限于)Her2、前列腺干细胞抗原(PSCA)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原-125(CA-125)、CA19-9、钙视网膜蛋白(calretinin)、MUC-1、上皮膜蛋白(EMA)、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、CD34、CD45、CD99、CD117、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、桥粒蛋白(desmin)、胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)、巨囊性疾病液体蛋白(gross cystic disease fluid protein,GCDFP-15)、HMB-45抗原、蛋白melan-A(由T淋巴细胞识别的黑色素瘤抗原；MART-1)、myo-D1、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)、神经丝、神经元特异性烯醇酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶、突触小泡蛋白、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、二聚体形式的丙酮酸激酶同工酶M2型(肿瘤M2-PK)、CD19、CD22、CD27、CD30、CD70、GD2(神经节苷脂G2)、EGFRvIII(表皮生长因子变异体III)、精子蛋白17(Sp17)、间皮蛋白、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、prostein、TARP(T细胞受体γ可变阅读框架蛋白(T cell receptor gamma alternate reading frame protein))、Trp-p8、STEAP1(前列腺六次跨膜上皮1抗原(six-transmembrane epithelial antigen of the prostate 1))、异常ras蛋白或异常p53蛋白。在另一个具体的实施方式中，所述肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原是整联蛋白αvβ3(CD61)、催乳激素(galactin)、K-Ras(V-Ki-ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因)或Ral-B。
在某些实施方式中，本文描述的多肽的胞外域通过接头(linker)、间隔区(spacer)或铰链区(hinge)多肽/肽序列(例如，CH2CH3铰链区序列或来自CD8、CD28、CTLA4或PD-1的序列)与该多肽的跨膜域相连接。
在某些实施方式中，本文描述的多肽的胞内域是或包含表达于T细胞的表面上并且触发所述T细胞的活化和/或增殖的蛋白质的胞内域。在一个具体的实施方式中，该胞内域是CD3ζ细胞内信号传导域(intracellular signaling domain)。在另一个具体的实施方式中，该胞内域是来自淋巴细胞受体链、TCR/CD3复合物蛋白、Fc受体亚基(subunit)或IL-2受体亚基。
在某些实施方式中，本文提供的多肽另外包含一个或多个共刺激域，例如，作为该多肽的胞内域的一部分。该一个或多个共刺激域可以是或可以包含(但不限于)共刺激CD27多肽序列、共刺激CD28多肽序列、共刺激OX40(CD134)多肽序列、共刺激4-1BB(CD137)多肽序列或共刺激可诱导T-细胞共刺激(ICOS)多肽序列中的一种或多种。
在一个具体的实施方式中，本文提供的多肽从N-端到C-端按顺序包含：(i)抗原-结合域(例如，结合肿瘤细胞上的抗原(例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗原结合域)；(ii)CD28或CTLA4铰链区多肽序列；(iii)CTLA4或PD-1跨膜域；(iv)共刺激域；和(v)细胞内信号传导域。在一个具体的实施方式中，该多肽的抗原-结合域结合于CD19。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽从N-端到C-端按顺序包含：(i)抗原-结合域(例如，结合肿瘤细胞上的抗原(例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗原结合域)；(ii)CH2CH3铰链区多肽序列；(iii)CTLA4或PD-1跨膜域；(iv)CD28共刺激域；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽从N-端到C-端按顺序包含：(i)抗原-结合域(例如，结合肿瘤细胞上的抗原(例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗原结合域)；(ii)CD28铰链区多肽序列；(iii)CTLA4或PD-1跨膜域；(iv)4-1BB共刺激域；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽从N-端到C-端按顺序包含：(i)单链Fv域，其包含通过接头与VH连接的VL，其中所述VL和VH是来自结合目标抗原(例如，肿瘤细胞上的抗原，例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗体；(ii)CD28铰链区多肽序列；(iii)CTLA4跨膜域；(iv)CD28共刺激域；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽从N-端到C-端按顺序包含：(i)单链Fv域，其包含通过接头与VH连接的VL，其中所述VL和VH是来自结合目标抗原(例如，肿瘤细胞上的抗原，例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗体；(ii)CTLA4铰链区多肽序列；(iii)CTLA4跨膜域；(iv)CD28共刺激域；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽从N-端到C-端按顺序包含：(i)单链Fv域，其包含通过接头与VH连接的VL，其中所述VL和VH是来自结合目标抗原(例如，肿瘤细胞上的抗原，例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗体；(ii)CD28铰链区多肽序列；(iii)PD-1跨膜域；(iv)CD28共刺激域；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽从N-端到C-端按顺序包含：(i)单链Fv域，其包含通过接头与VH连接的VL，其中所述VL和VH是来自结合目标抗原(例如，肿瘤细胞上的抗原，例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗体；(ii)CTLA4铰链区多肽序列；(iii)PD-1跨膜域；(iv)CD28共刺激域；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽从N-端到C-端按顺序包含：(i)抗原-结合域(例如，结合肿瘤细胞上的抗原(例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗原结合域)；(ii)PD-1铰链区多肽序列；(iii)CTLA4或PD-1跨膜域；(iv)共刺激域；和(v)细胞内信号传导域。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽从N-端到C-端按顺序包含：(i)单链Fv域，其包含通过接头与VH连接的VL，其中所述VL和VH是来自结合目标抗原(例如，肿瘤细胞上的抗原，例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗体；(ii)PD-1铰链区多肽序列；(iii)CTLA4跨膜域；(iv)CD28共刺激域；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽从N-端到C-端按顺序包含：(i)单链Fv域，其包含通过接头与VH连接的VL，其中所述VL和VH是来自结合目标抗原(例如，肿瘤细胞上的抗原，例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗体；(ii)PD-1铰链区多肽序列；(iii)PD-1跨膜域；(iv)CD28共刺激域；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
在另一个方面，本文提供的是T淋巴细胞，例如T细胞，其包含(例如，在其细胞表面上表达)膜结合的多肽，其中所述多肽包含：(i)跨膜域，其包含来自CTLA4或PD-1的跨膜域或其部分；(ii)表达于淋巴细胞的表面上并且触发所述淋巴细胞的活化和/或增殖的内源蛋白质的胞内域；和(iii)结合于目标抗原的胞外域，其中如果该跨膜域是来自CTLA4，则所述多肽的胞内域和胞外域(任选地不包括CTLA4接头)不是来自CTLA4；和如果该跨膜域是来自PD-1，则所述多肽的胞内域和胞外域不是来自PD-1。在一个具体的实施方式中，该多肽是嵌合抗原受体(CAR)。
在一个具体的实施方式中，本文提供的是T淋巴细胞，其包含包含来自CTLA4的跨膜域的多肽，其中该CTLA4跨膜域是由人CTLA4基因(例如，GenBank登记号NM_005214.4(CTLA4细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(智人)；Gene ID:1493))的外显子3编码的多肽序列。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的是T淋巴细胞，其包含包含来自CTLA4的跨膜域的多肽，其中该CTLA4跨膜域是或包含氨基酸序列PEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKM(以三字母密码，Pro-Glu-Pro-Cys-Pro-Asp-Ser-Asp-Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val-Ser-Leu-Ser-Lys-Met)(SEQ ID NO:1)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的是T淋巴细胞，其包含包含来自CTLA4的跨膜域的多肽，其中该CTLA4跨膜域是或包含由GenBank登记号NM_005214.4(CTLA4细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(智人)；Gene ID:1493)的核苷酸610-722编码的多肽序列。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的是T淋巴细胞，其包含包含来自CTLA4的跨膜域的多肽，其中该CTLA4跨膜域是或包含氨基酸序列PDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSL(以三字母密码，Pro-Asp-Ser-Asp-Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val-Ser-Leu)(SEQ ID NO:2)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的是T淋巴细胞，其包含包含来自CTLA4的跨膜域的多肽，其中该CTLA4跨膜域是或包含由GenBank登记号NM_005214.4(CTLA4细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(智人)；Gene ID:1493)的核苷酸636-699编码的多肽序列。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的是T淋巴细胞，其包含包含来自CTLA4的跨膜域的多肽，其中该CTLA4跨膜域是或包含氨基酸序列FLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAV(以三字母密码，Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val)(SEQ ID NO:3)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的是T淋巴细胞，其包含包含来自CTLA4的跨膜域的多肽，其中该CTLA4跨膜域是或包含多肽序列FLLWILAAVSSGLFFYSFLLT(以三字母密码，Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr)(SEQ ID NO:4)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的是T淋巴细胞，其包含包含来自CTLA4的跨膜域的多肽，其中该CTLA4跨膜域是或包含多肽序列FLLWILVAVSLGLFFYSFLVSAVSLS(以三字母密码，Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Val-Ala-Val-Ser-Leu-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Val-Ser-Ala-Val-Ser-Leu-Ser)(SEQ ID NO:5)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的是T淋巴细胞，其包含包含来自CTLA4的跨膜域的多肽，其中该CTLA4跨膜域是或包含多肽序列LGIGNGTQIYVIDPEPSPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKM(以三字母密码，Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr ValIle Asp Pro Glu Pro Ser Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala ValSer Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met)(SEQ ID NO:9)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的是T淋巴细胞，其包含包含来自CTLA4的跨膜域的多肽，其中该CTLA4跨膜域是或包含多肽序列FLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKM(以三字母密码，Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe TyrSer Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met)(SEQ ID NO:10)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的是T淋巴细胞，其包含包含来自PD-1的跨膜域的多肽，其中该PD-1跨膜域是或包含氨基酸序列TLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAA(以三字母密码，Thr-Leu-Val-Val-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Gly-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Trp-Val-Leu-Ala-Val-Ile-Cys-Ser-Arg-Ala-Ala)(SEQ ID NO:6)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的是T淋巴细胞，其包含包含来自PD-1的跨膜域的多肽，其中该PD-1跨膜域是或包含氨基酸序列VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI(以三字母密码，Val-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Gly-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Trp-Val-Leu-Ala-Val-Ile)(SEQ ID NO:7)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的是T淋巴细胞，其包含包含来自PD-1的跨膜域的多肽，其中该PD-1跨膜域是或包含氨基酸序列FQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI(以三字母密码，Phe-Glu-Thr-Leu-Val-Val-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Gly-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Trp-Val-Leu-Ala-Val-Ile)(SEQ ID NO:8)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的是T淋巴细胞，其包含包含来自PD-1的跨膜域的多肽，其中该PD-1跨膜域是或包含氨基酸序列FQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAA(以三字母密码，Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly Leu Leu Gly Ser LeuVal Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys Ser Arg Ala Ala)(SEQ ID NO:11)。
在某些实施方式中，由本文提供的T淋巴细胞(即，包含本文描述的多肽的T淋巴细胞)表达或编码的核苷酸序列包含编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11中所公开的氨基酸序列中的任一种的核苷酸序列。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的是T淋巴细胞，其包含包含跨膜域的多肽，其中该跨膜域是或包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11中所公开的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个连续氨基酸。在某些实施方式中，本文提供的是T淋巴细胞，其包含编码本文描述的多肽的核酸，其中该核酸包含编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11中所公开的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个连续氨基酸的核苷酸序列。
在某些实施方式中，由本文提供的T淋巴细胞表达的多肽的胞外域包含结合于目标抗原的受体或受体部分。该胞外域可以是例如结合于所述抗原的受体或受体部分。在某些实施方式中，该胞外域包含或是抗体或其抗原-结合部分。在具体的实施方式中，该胞外域包含或是单链Fv域。该单链Fv域可包含例如通过柔性接头与VH连接的VL，其中所述VL和VH是来自结合所述抗原的抗体。
由本文提供的T淋巴细胞表达的多肽的胞外域所结合并因此该T细胞由该多肽所引导的抗原可以是任何目标抗原，例如肿瘤细胞上的抗原。该肿瘤细胞可以是例如实体肿瘤中的细胞或非实体肿瘤的细胞，例如血液癌症的细胞。在某些实施方式中，该抗原是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。在某些实施方式中，该抗原是κ(Kappa)、λ(Lambda)、CD19、CD22、CD27、CD30、CD70、GD2、HER2、CEA、EGFRvIII、精子蛋白17、PSCA、间皮蛋白、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、prostein、TARP(T细胞受体γ可变阅读框架蛋白)、Trp-p8、STEAP1(前列腺六次跨膜上皮1抗原)和/或MUC-1中的一种或多种。在各种具体的实施方式中，该肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原是(但不限于)Her2、前列腺干细胞抗原(PSCA)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原-125(CA-125)、CA19-9、钙视网膜蛋白、MUC-1、上皮膜蛋白(EMA)、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、CD34、CD45、CD99、CD117、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、桥粒蛋白、胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)、巨囊性疾病液体蛋白(GCDFP-15)、HMB-45抗原、蛋白melan-A(由T淋巴细胞识别的黑色素瘤抗原；MART-1)、myo-D1、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)、神经丝、神经元特异性烯醇酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶、突触小泡蛋白、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、二聚体形式的丙酮酸激酶同工酶M2型(肿瘤M2-PK)、异常ras蛋白或异常p53蛋白。在另一个具体的实施方式中，所述肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原是整联蛋白αvβ3(CD61)、催乳激素、K-Ras(V-Ki-ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因)或Ral-B。
在某些实施方式中，由本文描述的T淋巴细胞表达的多肽的胞外域通过接头、间隔区或铰链区多肽序列(例如，来自CD8、CD28、CTLA4或PD-1的序列)与该多肽的所述跨膜域相连接。
在某些实施方式中，由本文描述的T淋巴细胞表达的多肽的胞内域是或包含在正常情况下表达于T细胞的表面上并且触发所述T细胞的活化和/或增殖的蛋白质的胞内域。在一个具体的实施方式中，该胞内域是CD3ζ细胞内信号传导域。在另一个实施方式中，该胞内域是来自淋巴细胞受体链、TCR/CD3复合物蛋白、Fc受体亚基或IL-2受体亚基。
在某些实施方式中，由本文描述的T淋巴细胞表达的多肽另外包含一个或多个共刺激域，例如，作为该多肽的胞内域的一部分。该一个或多个共刺激域可以是或包含共刺激CD27多肽序列、共刺激CD28多肽序列、共刺激OX40(CD134)多肽序列、共刺激4-1BB(CD137)多肽序列或共刺激可诱导T-细胞共刺激(ICOS)多肽序列中的一种或多种。
在一个具体的实施方式中，本文提供的T淋巴细胞表达或包含多肽，其从N-端到C-端按顺序包含：(i)抗原-结合域(例如，结合肿瘤细胞上的抗原(例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗原结合域)；(ii)CD28或CTLA4铰链区多肽序列；(iii)CTLA4或PD-1跨膜域；(iv)共刺激域；和(v)细胞内信号传导域。在一个具体的实施方式中，该多肽的抗原-结合域结合于CD19。
在一个具体的实施方式中，本文提供的T淋巴细胞表达或包含多肽，其从N-端到C-端按顺序包含：(i)抗原-结合域(例如，结合肿瘤细胞上的抗原(例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗原结合域)；(ii)CH2CH3铰链区多肽序列；(iii)CTLA4或PD-1跨膜域；(iv)CD28共刺激域；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。在一个具体的实施方式中，该多肽的抗原-结合域结合于HER2。
在一个具体的实施方式中，本文提供的T淋巴细胞表达或包含多肽，其从N-端到C-端按顺序包含：(i)抗原-结合域(例如，结合肿瘤细胞上的抗原(例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗原结合域)；(ii)CH2CH3铰链区多肽序列；(iii)CTLA4或PD-1跨膜域；(iv)CD28共刺激域；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。在一个具体的实施方式中，该多肽的抗原-结合域结合于HER2。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的T淋巴细胞表达或包含多肽，其从N-端到C-端按顺序包含：(i)单链Fv域，其包含通过接头与VH连接的VL，其中所述VL和VH是来自结合目标抗原(例如，肿瘤细胞上的抗原，例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗体；(ii)CD28铰链区多肽序列；(iii)CTLA4跨膜域；(iv)CD28共刺激域；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的T淋巴细胞表达或包含多肽，其从N-端到C-端按顺序包含：(i)单链Fv域，其包含通过接头与VH连接的VL，其中所述VL和VH是来自结合目标抗原(例如，肿瘤细胞上的抗原，例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗体；(ii)CTLA4铰链区多肽序列；(iii)CTLA4跨膜域；(iv)CD28共刺激域；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的T淋巴细胞表达或包含多肽，其从N-端到C-端按顺序包含：(i)单链Fv域，其包含通过接头与VH连接的VL，其中所述VL和VH是来自结合目标抗原(例如，肿瘤细胞上的抗原，例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗体；(ii)CD28铰链区多肽序列；(iii)PD-1跨膜域；(iv)CD28共刺激域；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的T淋巴细胞表达或包含多肽，其从N-端到C-端按顺序包含：(i)单链Fv域，其包含通过接头与VH连接的VL，其中所述VL和VH是来自结合目标抗原(例如，肿瘤细胞上的抗原，例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗体；(ii)CTLA4铰链区多肽序列；(iii)PD-1跨膜域；(iv)CD28共刺激域；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的T淋巴细胞表达或包含多肽，其从N-端到C-端按顺序包含：(i)抗原-结合域(例如，结合肿瘤细胞上的抗原(例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗原结合域)；(ii)PD-1铰链区多肽序列；(iii)CTLA4或PD-1跨膜域；(iv)共刺激域；和(v)细胞内信号传导域。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的T淋巴细胞表达或包含多肽，其从N-端到C-端按顺序包含：(i)单链Fv域，其包含通过接头与VH连接的VL，其中所述VL和VH是来自结合目标抗原(例如，肿瘤细胞上的抗原，例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗体；(ii)PD-1铰链区多肽序列；(iii)CTLA4跨膜域；(iv)CD28共刺激域；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的T淋巴细胞表达或包含多肽，其从N-端到C-端按顺序包含：(i)单链Fv域，其包含通过接头与VH连接的VL，其中所述VL和VH是来自结合目标抗原(例如，肿瘤细胞上的抗原，例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗体；(ii)PD-1铰链区多肽序列；(iii)PD-1跨膜域；(iv)CD28共刺激域；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
在一个具体的实施方式中，表达或包含本文提供的多肽中的一种或多种的本文提供的T淋巴细胞当所述多肽结合于该多肽的抗原结合域或单链Fv域是特异性的抗原时变成活化的或刺激的得以增殖。在另一个具体的实施方式中，表达或包含本文提供的多肽中的一种或多种的本文提供的T淋巴细胞当该T淋巴细胞开始与所述抗原-表达细胞接触时就将表达或包含该多肽的抗原结合域或单链Fv域是特异性的抗原的细胞杀死。
在另一个方面，本文提供的是治疗患有疾病或紊乱的个体的方法，其中该疾病或紊乱以表达抗原的细胞为特征或是通过表达抗原的细胞可表征的，该方法包括向该个体给予本文提供的T淋巴细胞(即，包含或表达本文描述的多肽的T淋巴细胞)中的一种或多种。
4.附图简述
图1描绘用表达CAR的慢病毒载体转导T细胞后三天，CAR由T细胞表达。
图2描绘白介素-2(IL-2)由CAR T细胞产生：(i)在静息状态下(第一个柱子(firstbar))，(ii)在暴露于抗CD28之后(第二个柱子(second bar))；(iii)在暴露于0.25μg/mlHER2-Fc之后；(iv)在暴露于0.5μg/ml HER2-Fc之后；和(v)在暴露于1.0μg/ml HER2-Fc之后。
图3描绘GM-CSF由CAR T细胞产生：(i)在静息状态下(第一个柱子)，(ii)在暴露于aCD28之后(第二个柱子)；(iii)在暴露于0.25μg/ml HER2-Fc之后；(iv)在暴露于0.5μg/mlHER2-Fc之后；和(v)在暴露于1.0μg/ml HER2-Fc之后。
图4描绘干扰素-γ(IFN-γ)由CAR T细胞产生：(i)在静息状态下(第一个柱子)，(ii)在暴露于aCD28之后(第二个柱子)；(iii)在暴露于0.25μg/ml HER2-Fc之后；(iv)在暴露于0.5μg/ml HER2-Fc之后；和(v)在暴露于1.0μg/ml HER2-Fc之后。
图5描绘在多轮暴露于1.0μg/ml HER2-Fc之后，细胞内肿瘤坏死因子α(TNF-α)由CAR T细胞产生。
图6描绘在不存在(顶上图)和存在(底下图)用HER2-Fc刺激的情况下，表达某些抗HER2CAR或模拟对照的CAR T细胞的百分比。A)表达模拟物、HER2-28TMζ或HER2-28TM28ζ的抗HER2CAR T细胞的百分比。B)表达HER2-CTLA4TM28ζ或HER2-4-1BBTM28ζ的抗HER2CAR T细胞的百分比。
图7描绘在用表达CAR的慢病毒载体转导T细胞之后十一天，CAR由T细胞表达。
图8描绘IL-2、TNF-α和IFN-γ由CAR T细胞产生：(i)在静息状态下，(ii)在暴露于0.25、0.5或1.0μg/ml HER2-Fc之后；或(iii)在CD3/CD28连接之后。各组中的第一个(最左边)柱子：模拟物转导的细胞(无CAR表达)；各组中的第二个柱子：用命名为HER-PD1TM-CD28-CD3的CAR转导的细胞；各组中的第三个柱子：用命名为HER-CTLA4(189)TM-41BB-CD3的CAR转导的细胞；各组中的第四个柱子：用命名为HER-PD1TM-41BB-CD3的CAR转导的细胞；各组中的第五个(最右边)柱子：用命名为HER2-CD28TM-CD28-CD3的CAR转导的细胞。
图9描绘GM-CSF、粒酶B(Granzyme B)和IL-13由CAR T细胞产生：(i)在静息状态下，(ii)在暴露于0.25、0.5或1.0μg/ml HER2-Fc之后；或(iii)在CD3/CD28连接之后。各组中的第一个(最左边)柱子：模拟物转导的细胞(无CAR表达)；各组中的第二个柱子：用命名为HER-PD1TM-CD28-CD3的CAR转导的细胞；各组中的第三个柱子：用命名为HER-CTLA4(189)TM-41BB-CD3的CAR转导的细胞；各组中的第四个柱子：用命名为HER-PD1TM-41BB-CD3的CAR转导的细胞；各组中的第五个(最右边)柱子：用命名为HER2-CD28TM-CD28-CD3的CAR转导的细胞。
图10描绘在用HER2-Fc刺激后的活T细胞计数。第一个(最左边)柱子：用命名为HER2-CD28TM-CD28-CD3的CAR转导的细胞；第二个柱子：用命名为HER-PD1TM-CD28-CD3的CAR转导的细胞；第三个柱子：用命名为HER-CTLA4(189)TM-41BB-CD3的CAR转导的细胞；第四个柱子：用命名为HER-PD1TM-41BB-CD3的CAR转导的细胞；第五个(最右边)柱子：模拟物转导的细胞(无CAR表达)。
5.详述
在一个方面，本文提供的是多肽，例如嵌合抗原受体(参见例如，Eshhar，美国专利第7,741,465号)，其可由免疫系统细胞(例如，T淋巴细胞(T细胞))表达，在这样的免疫系统细胞中是膜结合的，并且其包含来自在正常情况下将抑制信号传递至这样的免疫系统细胞的免疫系统蛋白质的跨膜域，例如，来自CTLA4(细胞毒性T-淋巴细胞抗原4或细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4)或PD-1(编程性细胞死亡-1)的跨膜域。本文进一步提供的是编码本文描述的多肽的核酸序列。本文还提供的是表达此类多肽的免疫系统细胞，例如T淋巴细胞(例如T细胞)。
本文提供的多肽包含结合于抗原(例如，细胞上的抗原)的胞外域、跨膜域和将初级活化信号传递至免疫细胞的细胞内(细胞质)信号传导域。当本文提供的多肽表达于例如T淋巴细胞的表面上时并且当CAR的胞外域结合于抗原时，细胞内信号传导域将信号传递至T淋巴细胞以活化和/或增殖，而且，如果抗原被呈递在细胞表面，则将表达该抗原的细胞杀死。因为T淋巴细胞需要双信号以便完全活化，即初级活化信号和共刺激信号，在某些实施方式中，本文描述的多肽可包含共刺激域使得抗原与胞外域的结合导致初级活化信号和共刺激信号二者的传递。
本文提供的多肽(例如，CAR)是功能性免疫刺激多肽，其包含来自T细胞共抑制蛋白(例如，CTLA4或PD-1)的跨膜域。在一个方面，本文提供的是多肽，其包含(i)来自CTLA4或PD-1的跨膜域，(ii)表达于淋巴细胞的表面上并且触发所述淋巴细胞的活化和/或增殖的内源蛋白质的胞内域(例如，细胞质域)，和(iii)结合于抗原的胞外域，其中如果该跨膜域是来自CTLA4，则所述多肽的胞内域和胞外域不是来自CTLA4；和如果该跨膜域是来自PD-1，则所述多肽的胞内域和胞外域不是来自PD-1。在一个具体的实施方式中，表达本文描述的多肽的T淋巴细胞当所述多肽结合于对该多肽是特异性的抗原(即，该多肽的胞外域所结合的抗原)时经活化或刺激得以增殖。在一个具体的实施方式中，该多肽当表达于T淋巴细胞的表面上时引导该T淋巴细胞将表达所述抗原的细胞杀死。
在某些实施方式中，本文提供的多肽包含来自CTLA4或PD-1的跨膜域或其部分，其中该CTLA4或PD-1跨膜域是来自哺乳动物CTLA4或PD-1，例如人、灵长类动物或啮齿动物，例如鼠CTLA4或PD-1。在一个具体的实施方式中，该跨膜域不包含来自CTLA4或PD-1的胞内域、胞外域或胞内或胞外域任一个的氨基酸。CTLA4或PD-1跨膜域序列的具体的非限制性实例在下文提供。
在一个具体的实施方式中，本文提供的是多肽，其包含来自CTLA4的跨膜域，其中该CTLA4跨膜域是由人ctla4基因(例如，GenBank登记号NM_005214.4(CTLA4细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(智人)；Gene ID:1493))的外显子3编码的多肽序列。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的CTLA4跨膜域是或包含氨基酸序列PEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKM(以三字母密码，Pro-Glu-Pro-Cys-Pro-Asp-Ser-Asp-Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val-Ser-Leu-Ser-Lys-Met)(SEQ ID NO:1)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的CTLA4跨膜域是或包含由GenBank登记号NM_005214.4(CTLA4细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(智人)；Gene ID:1493)的核苷酸610-722编码的多肽序列。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的CTLA4跨膜域是或包含氨基酸序列PDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSL(以三字母密码，Pro-Asp-Ser-Asp-Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val-Ser-Leu)(SEQ ID NO:2)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的CTLA4跨膜域是或包含由GenBank登记号NM_005214.4(CTLA4细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(智人)；Gene ID:1493)的核苷酸636-699编码的多肽序列。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的CTLA4跨膜域是或包含氨基酸序列FLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAV(以三字母密码，Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val)(SEQ ID NO:3)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的CTLA4跨膜域是或包含多肽序列FLLWILAAVSSGLFFYSFLLT(以三字母密码，Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr)(SEQ ID NO:4)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的CTLA4跨膜域是或包含多肽序列FLLWILVAVSLGLFFYSFLVSAVSLS(以三字母密码，Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Val-Ala-Val-Ser-Leu-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Val-Ser-Ala-Val-Ser-Leu-Ser)(SEQ IDNO:5)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的CTLA4跨膜域是或包含多肽序列LGIGNGTQIYVIDPEPSPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTA VSLSKM(以三字母密码，Leu Gly IleGly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Ser Pro Asp Ser Asp PheLeu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu LeuThr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met)(SEQ ID NO:9)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的CTLA4跨膜域是或包含多肽序列FLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKM(以三字母密码，Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala ValSer Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met)(SEQ ID NO:10)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的PD-1跨膜域是或包含氨基酸序列TLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAA(以三字母密码，Thr-Leu-Val-Val-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Gly-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Trp-Val-Leu-Ala-Val-Ile-Cys-Ser-Arg-Ala-Ala)(SEQ ID NO:6)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的PD-1跨膜域是或包含氨基酸序列VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI(以三字母密码，Val-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Gly-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Trp-Val-Leu-Ala-Val-Ile)(SEQ ID NO:7)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的PD-1跨膜域是或包含氨基酸序列FQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI(以三字母密码，Phe-Glu-Thr-Leu-Val-Val-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Gly-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Trp-Val-Leu-Ala-Val-Ile)(SEQ IDNO:8)。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的PD-1跨膜域是或包含氨基酸序列FQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAA(以三字母密码，Phe Gln Thr Leu Val Val Gly ValVal Gly Gly Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile CysSer Arg Ala Ala)(SEQ ID NO:11)。
以本文描述的CTLA-4和PD-1跨膜域序列(即，SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ IDNO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11)为范例举例说明，在某些实施方式中，本文描述的跨膜域包含来自它们所衍生的蛋白质(即，CTLA-4或PD-1)的胞外域的一个或多个氨基酸和/或来自它们所衍生的蛋白质(即，CTLA-4或PD-1)的胞内域的一个或多个氨基酸。在某些实施方式中，本文描述的跨膜域包含来自它们所衍生的蛋白质(即，CTLA-4或PD-1)的胞外域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在某些实施方式中，本文描述的跨膜域包含来自它们所衍生的蛋白质(即，CTLA-4或PD-1)的胞内域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在某些实施方式中，本文描述的跨膜域包含(i)来自它们所衍生的蛋白质(即，CTLA-4或PD-1)的胞外域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸和(ii)来自它们所衍生的蛋白质(即，CTLA-4或PD-1)的胞内域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的是多肽，其包含跨膜域，其中该跨膜域是或包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11中所公开的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个连续氨基酸。在另一个具体的实施方式中，本文提供的是多肽，其包含跨膜域，其中该跨膜域与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％有同一性。
在某些实施方式中，本文提供的是核苷酸序列，其编码本文公开的多肽中的一种。在一个具体的实施方式中，本文提供的是核苷酸序列，其包含编码SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11中所公开的氨基酸序列中任一种的核苷酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供的是核酸，其编码本文描述的多肽，其中该核酸包含编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11中所公开的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个连续氨基酸的核苷酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供的是核酸序列，其编码与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10或SEQ ID NO:11有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的多肽。
在构建本文提供的多肽时，在某些实施方式中，可将人序列与非人序列组合在一起。例如，包含人胞外域和胞内域氨基酸序列的多肽可包含来自非人物种的跨膜域；例如，可包含鼠CTLA4跨膜域或鼠PD-1跨膜域。在一个更具体的实施方式中，该多肽包含胞外域和胞内域的人氨基酸序列，并且包含具有SEQ ID NO:5氨基酸序列或由SEQ ID NO:5氨基酸序列组成的跨膜域。
本文提供的多肽的胞外域结合于目标抗原。在某些实施方式中，本文提供的多肽的胞外域包含结合于所述抗原的受体或受体部分。该胞外域可以是例如结合于所述抗原的受体或受体部分。在某些实施方式中，该胞外域包含或是抗体或其抗原-结合部分。在具体的实施方式中，该胞外域包含或是单链Fv域。该单链Fv域可包含例如通过柔性接头与VH连接的VL，其中所述VL和VH是来自结合所述抗原的抗体。
本文提供的多肽的胞外域所结合/识别的抗原可以是任何目标抗原，例如，可以是肿瘤细胞上的抗原。该肿瘤细胞可以是例如实体肿瘤中的细胞或非实体肿瘤的细胞，例如血液癌症的细胞。该抗原可以是表达于任何肿瘤或癌症类型的细胞上的任何抗原，所述细胞例如淋巴瘤、肺癌、乳癌、前列腺癌、肾上腺皮质癌、甲状腺癌、鼻咽癌、黑色素瘤(例如，恶性黑色素瘤)、皮肤癌、结肠直肠癌、硬纤维瘤、促结缔组织增生小圆细胞肿瘤、内分泌肿瘤、尤因肉瘤(Ewing sarcoma)、外周原始神经外胚叶肿瘤、实体生殖细胞肿瘤、肝母细胞瘤、神经母细胞瘤、非横纹肌肉瘤软组织肉瘤、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、韦尔姆斯氏肿瘤(Wilms tumor)、成胶质细胞瘤、黏液瘤、纤维瘤、脂肪瘤等的细胞。在更具体的实施方式中，所述淋巴瘤可以是慢性淋巴细胞性白血病(小淋巴细胞性淋巴瘤)、B-细胞前淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(macroglobulinemia)、脾边缘带淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、结节外边缘带B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、结节边缘带B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤(primaryeffusion lymphoma)、伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、T淋巴细胞前淋巴细胞性白血病、T淋巴细胞大颗粒状淋巴细胞性白血病、侵袭性NK细胞白血病、成体T淋巴细胞白血病/淋巴瘤、结节外NK/T淋巴细胞淋巴瘤、鼻型、肠病变型T淋巴细胞淋巴瘤、肝脾T淋巴细胞淋巴瘤、母细胞性NK细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿病、塞扎里综合征(Sezary syndrome)、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、类淋巴瘤样丘疹病、血管免疫母细胞性T淋巴细胞淋巴瘤、外周T淋巴细胞淋巴瘤(未分类的)、间变性大细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)或非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)。对某些癌症有特异性的抗原以及鉴别此类抗原的方法是本领域已知的。
在其中所述癌症是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的一个具体的实施方式中，该CLL的B细胞具有正常核型。在其中所述癌症是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的其它具体的实施方式中，该CLL的B细胞携带17p缺失、11q缺失、12q三体、13q缺失或p53缺失。
在某些实施方式中，被本文描述的多肽的胞外域识别的抗原是肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)。在各种具体的实施方式中，该肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原是(但不限于)Her2、前列腺干细胞抗原(PSCA)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原-125(CA-125)、CA19-9、钙视网膜蛋白、MUC-1、上皮膜蛋白(EMA)、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、CD19、CD22、CD27、CD30、CD34、CD45、CD70、CD99、CD117、EGFRvIII(表皮生长因子变异体III)、间皮蛋白、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、prostein、TARP(T细胞受体γ可变阅读框架蛋白)、Trp-p8、STEAP1(前列腺六次跨膜上皮1抗原)、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、桥粒蛋白、胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)、巨囊性疾病液体蛋白(GCDFP-15)、HMB-45抗原、蛋白melan-A(由T淋巴细胞识别的黑色素瘤抗原；MART-1)、myo-D1、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)、神经丝、神经元特异性烯醇酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶、突触小泡蛋白、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、二聚体形式的丙酮酸激酶同工酶M2型(肿瘤M2-PK)、异常ras蛋白或异常p53蛋白。
在某些实施方式中，被本文描述的多肽的胞外域识别的TAA或TSA是整联蛋白αvβ3(CD61)、催乳激素或Ral-B。
在某些实施方式中，被本文描述的多肽的胞外域识别的TAA或TSA是癌症/睾丸(CT)抗原，例如，BAGE、CAGE、CTAGE、FATE、GAGE、HCA661、HOM-TES-85、MAGEA、MAGEB、MAGEC、NA88、NY-ESO-1、NY-SAR-35、OY-TES-1、SPANXB1、SPA17、SSX、SYCP1或TPTE。
在某些其它实施方式中，被本文描述的多肽的胞外域识别的TAA或TSA是碳水化合物或神经节苷脂，例如，fuc-GM1、GM2(癌胚抗原-免疫原性-1；OFA-I-1)；GD2(OFA-I-2)、GM3、GD3等。
在某些其它实施方式中，被本文描述的多肽的胞外域识别的TAA或TSA是α-辅肌动蛋白-4、Bage-1、BCR-ABL、Bcr-Abl融合蛋白、β-联蛋白(beta-catenin)、CA 125、CA 15-3(CA 27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、Casp-8、cdc27、cdk4、cdkn2a、CEA、coa-1、dek-can融合蛋白、EBNA、EF2、Epstein Barr病毒抗原、ETV6-AML1融合蛋白、HLA-A2、HLA-A11、hsp70-2、KIAAO205、Mart2、Mum-1、2和3、neo-PAP、肌球蛋白I类、OS-9、pml-RARα融合蛋白、PTPRK、K-ras、N-ras、磷酸丙糖异构酶、Gage 3,4,5,6,7、GnTV、Herv-K-mel、Lage-1、NA-88、NY-Eso-1/Lage-2、SP17、SSX-2、TRP2-Int2、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、RAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15(58)、RAGE、SCP-1、Hom/Mel-40、PRAME、p53、H-Ras、HER-2/neu、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72-4、CA19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、13-联蛋白(13-Catenin)、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、CT7、端粒酶、43-9F、5T4、791Tgp72、13HCG、BCA225、BTAA、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB\70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TAG72、TLP或TPS。其它肿瘤相关和肿瘤特异性抗原是本领域技术人员已知的。
结合于TSA和TAA的抗体和scFv是本领域已知的，如同编码它们的核苷酸序列一样。
在某些具体的实施方式中，被本文描述的多肽的胞外域识别的抗原是这样的抗原：不认为是TSA或TAA，但是尽管如此其与肿瘤细胞或由肿瘤引起的损害相关。在某些实施方式中，例如，该抗原是例如生长因子、细胞因子或白介素，例如与血管生成或血管发生相关的生长因子、细胞因子或白介素。这样的生长因子、细胞因子或白介素可包括例如血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)或白介素-8(IL-8)。肿瘤也可以产生局限于肿瘤的低氧环境。因此，在其它具体的实施方式中，该抗原是低氧相关因子，例如，HIF-1α、HIF-1β、HIF-2α、HIF-2β、HIF-3α或HIF-3β。肿瘤也可以引起对正常组织的局部化损害，引起称为损害相关分子模式分子(DAMPs；也称为警报素(alarmins))的分子的释放。因此，在某些其它具体的实施方式中，该抗原是DAMP，例如，热休克蛋白、染色质相关蛋白高速泳动族框1(HMGB1)、S100A8(MRP8,钙粒蛋白A)、S100A9(MRP14,钙粒蛋白B)、血清淀粉状蛋白A(SAA)，或者可以是脱氧核糖核酸、腺苷三磷酸、尿酸或硫酸肝素。
在某些实施方式中，本文描述的多肽的胞外域通过接头、间隔区或铰链区多肽序列(例如，来自CD28的序列或来自CTLA4的序列)与该多肽的跨膜域相连接。
在某些实施方式中，本文描述的多肽的胞内域是或包含表达于T细胞的表面上并且触发所述T细胞的活化和/或增殖的蛋白质的胞内域或基序(motif)。这样的域或基序能够传递对响应该抗原与CAR的胞外部分结合时T淋巴细胞活化必需的初级抗原-结合信号。典型地，该域或基序包含或是ITAM(基于免疫受体酪氨酸的活化基序)。适合于CAR的含有ITAM的多肽包括例如ζ(zeta)CD3链(CD3ζ)或其含有ITAM的部分。在一个具体的实施方式中，该胞内域是CD3ζ细胞内信号传导域。在其它具体的实施方式中，该胞内域是来自淋巴细胞受体链、TCR/CD3复合物蛋白、Fc受体亚基或IL-2受体亚基。
在某些实施方式中，本文提供的多肽另外包含一个或多个共刺激域或基序，例如，作为该多肽的胞内域的一部分。该一个或多个共刺激域或基序可以是或包含共刺激CD27多肽序列、共刺激CD28多肽序列、共刺激OX40(CD134)多肽序列、共刺激4-1BB(CD137)多肽序列或共刺激可诱导T-细胞共刺激(ICOS)多肽序列或其它共刺激域或基序中的一种或多种。
在一个具体的实施方式中，本文提供的多肽从N-端到C-端按顺序包含：(i)抗原-结合域(例如，结合肿瘤细胞上的抗原(例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗原结合域)；(ii)CD28或CTLA4铰链区多肽序列；(iii)CTLA4或PD-1跨膜域；(iv)共刺激域；和(v)细胞内信号传导域。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽从N-端到C-端按顺序包含：(i)抗原-结合域(例如，结合肿瘤细胞上的抗原(例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗原结合域)；(ii)CH2CH3铰链区多肽序列；(iii)CTLA4或PD-1跨膜域；(iv)CD28共刺激域；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽从N-端到C-端按顺序包含：(i)抗原-结合域(例如，结合肿瘤细胞上的抗原(例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗原结合域)；(ii)CD28铰链区多肽序列；(iii)CTLA4或PD-1跨膜域；(iv)4-1BB共刺激域；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽从N-端到C-端按顺序包含：(i)抗原-结合域(例如，结合肿瘤细胞上的抗原(例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗原结合域)；(ii)PD-1铰链区多肽序列；(iii)CTLA4或PD-1跨膜域；(iv)共刺激域；和(v)细胞内信号传导域。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽从N-端到C-端按顺序包含：(i)单链Fv域，其包含通过接头与VH连接的VL，其中所述VL和VH是来自结合目标抗原(例如，肿瘤细胞上的抗原，例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗体；(ii)CD28铰链区多肽序列；(iii)CTLA4跨膜域；(iv)CD28共刺激域；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽从N-端到C-端按顺序包含：(i)单链Fv域，其包含通过接头与VH连接的VL，其中所述VL和VH是来自结合目标抗原(例如，肿瘤细胞上的抗原，例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗体；(ii)CTLA4铰链区多肽序列；(iii)CTLA4跨膜域；(iv)CD28共刺激域；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽从N-端到C-端按顺序包含：(i)单链Fv域，其包含通过接头与VH连接的VL，其中所述VL和VH是来自结合目标抗原(例如，肿瘤细胞上的抗原，例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗体；(ii)CD28铰链区多肽序列；(iii)PD-1跨膜域；(iv)CD28共刺激域；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽从N-端到C-端按顺序包含：(i)单链Fv域，其包含通过接头与VH连接的VL，其中所述VL和VH是来自结合目标抗原(例如，肿瘤细胞上的抗原，例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗体；(ii)CTLA4铰链区多肽序列；(iii)PD-1跨膜域；(iv)CD28共刺激域；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽从N-端到C-端按顺序包含：(i)单链Fv域，其包含通过接头与VH连接的VL，其中所述VL和VH是来自结合目标抗原(例如，肿瘤细胞上的抗原，例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗体；(ii)CTLA4铰链区多肽序列；(iii)PD-1跨膜域；(iv)CD28共刺激域；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽从N-端到C-端按顺序包含：(i)抗原-结合域(例如，结合肿瘤细胞上的抗原(例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗原结合域)；(ii)PD-1铰链区多肽序列；(iii)CTLA4或PD-1跨膜域；(iv)共刺激域；和(v)细胞内信号传导域。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽从N-端到C-端按顺序包含：(i)单链Fv域，其包含通过接头与VH连接的VL，其中所述VL和VH是来自结合目标抗原(例如，肿瘤细胞上的抗原，例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗体；(ii)PD-1铰链区多肽序列；(iii)CTLA4跨膜域；(iv)CD28共刺激域；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽从N-端到C-端按顺序包含：(i)单链Fv域，其包含通过接头与VH连接的VL，其中所述VL和VH是来自结合目标抗原(例如，肿瘤细胞上的抗原，例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗体；(ii)PD-1铰链区多肽序列；(iii)PD-1跨膜域；(iv)CD28共刺激域；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽从N-端到C-端按顺序包含：(i)单链Fv域，其包含通过接头与VH连接的VL，其中所述VL和VH是来自结合目标抗原(例如，肿瘤细胞上的抗原，例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗体；(ii)CTLA4铰链区多肽序列；(iii)CTLA4跨膜域；(iv)4-1BB共刺激域；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
在另一个具体的实施方式中，该多肽从N-端到C-端按顺序包含：(i)单链Fv域，其包含通过接头与VH连接的VL，其中所述VL和VH是来自结合目标抗原(例如，肿瘤细胞上的抗原，例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗体；(ii)CD28铰链区多肽序列；(iii)PD-1跨膜域；(iv)4-1BB共刺激域；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
在另一个具体的实施方式中，该多肽从N-端到C-端按顺序包含：(i)单链Fv域，其包含通过接头与VH连接的VL，其中所述VL和VH是来自结合目标抗原(例如，肿瘤细胞上的抗原，例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗体；(ii)CTLA4铰链区多肽序列；(iii)PD-1跨膜域；(iv)4-1BB共刺激域；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
在另一个具体的实施方式中，该多肽从N-端到C-端按顺序包含：(i)单链Fv域，其包含通过接头与VH连接的VL，其中所述VL和VH是来自结合目标抗原(例如，肿瘤细胞上的抗原，例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原)的抗体；(ii)PD-1铰链区多肽序列；(iii)CTLA4跨膜域；(iv)4-1BB共刺激域；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
5.1.分离的多肽(嵌合抗原受体)
本文提供的包含CTLA4或PD-1跨膜域的T淋巴细胞-刺激多肽可以通过例如酰化、酰胺化、糖基化、甲基化、磷酸化、硫酸化、苏素化(sumoylation)、遍在蛋白化(ubiquitylation)等进行修饰。该多肽可以用能够提供可检测信号的标记(例如，用放射性同位素和荧光化合物)进行标记。第一或第二多肽的一个或多个侧链可以衍生化，例如，赖氨酰基和氨基末端残基用琥珀酸酐或其它羧酸酐衍生化，或者用例如亚氨酸酯(如甲基吡啶亚氨酸甲酯)衍生化；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氢化物；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2,4-戊二酮；和与乙醛酸进行的转氨酶催化的反应。羧基一侧基团天冬氨酰基或谷氨酰基可以通过与碳二亚胺(R—N＝C＝N—R')(如1-环己基-3-(2-吗啉基-(4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳二亚胺)反应而被选择性修饰。
5.2.分离的核酸
本文提供的是核酸序列(多核苷酸)，其编码本文提供的多肽中的一种或多种。该多核苷酸可以含在适合于转化免疫细胞(例如，T淋巴细胞)的任何多核苷酸载体里面。例如，T淋巴细胞可以使用含有编码第一和第二多肽(例如，嵌合受体)的多核苷酸的合成载体、慢病毒或逆转录病毒载体、自主复制质粒、病毒(例如，逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或疱疹病毒)等来转化。适合于转化T淋巴细胞的慢病毒载体包括但不限于例如在美国专利号5,994,136、6,165,782、6,428,953、7,083,981和7,250,299中描述的慢病毒载体，所述专利的公开内容通过引用其全部结合到本文中。适合于转化T淋巴细胞的HIV载体包括但不限于例如在美国专利号5,665,577中描述的载体，所述专利的公开内容通过引用其全部结合到本文中。
可用于产生第一和第二多肽的核酸(例如，在修饰的T淋巴细胞中)包括DNA、RNA或核酸类似物。核酸类似物可以在碱基部分、糖部分或磷酸酯骨架被修饰，并且可包括脱氧尿苷取代脱氧胸苷、5-甲基-2'-脱氧胞苷或5-溴-2'-脱氧胞苷取代脱氧胞苷。糖部分的修饰可包括修饰核糖糖的2'羟基以形成2'-O-甲基或2'-O-烯丙基糖。脱氧核糖磷酸酯骨架可以经修饰以产生吗啉代核酸，其中各碱基部分与六元吗啉代环或肽核酸相连接，其中该脱氧磷酸酯骨架被假肽骨架置换但四个碱基仍被保留下来。参见例如，Summerton和Weller(1997)Antisense Nucleic Acid Drug Dev.7:187-195；和Hyrup等(1996)Bioorgan.Med.Chain.4:5-23。另外，脱氧磷酸酯骨架可以用例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯骨架、亚磷酰胺(phosphoroamidite)或烷基磷酸三酯骨架置换。
5.3.T淋巴细胞
本文提供的是免疫细胞，例如T淋巴细胞，其包含本文提供的多肽。本文提供的T淋巴细胞可以是幼稚T淋巴细胞或MHC-限制性T淋巴细胞。在某些实施方式中，本文提供的T淋巴细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)。在某些实施方式中，本文提供的T淋巴细胞已经从肿瘤生物活检样品(biopsy)分离出来或者已经从分离自肿瘤生物活检样品的T淋巴细胞扩增而来。在某些其它实施方式中，本文提供的T淋巴细胞已经分离自或扩增自由外周血、脐带血或淋巴液扩增的T淋巴细胞。
在某些实施方式中，包含本文提供的多肽的本文提供的免疫细胞(例如，修饰的T淋巴细胞)对将要给予修饰的T淋巴细胞的个体而言是自体的。在某些实施方式中，本文提供的修饰的T淋巴细胞对将要给予修饰的T淋巴细胞的个体而言是同种异体的。在使用同种异体的T淋巴细胞制备修饰的T淋巴细胞的情况下，可以选择出将降低个体的移植物抗宿主病(GVHD)的可能性的T淋巴细胞。例如，在某些实施方式中，可以选择病毒特异性T淋巴细胞用于制备修饰的T淋巴细胞；预期这样的淋巴细胞将具有大大地降低结合于任何接受者抗原并因此变得由任何接受者抗原活化的天然能力。在某些实施方式中，同种异体T淋巴细胞的接受者介导的排斥可以通过向宿主共同给予一种或多种免疫抑制剂(例如，环孢菌素、他克莫司、西罗莫司、环磷酰胺等)来降低。
在一个实施方式中，从个体获取T淋巴细胞，任选进行扩增，然后用编码本文描述的含有CTLA4或PD-1跨膜域的多肽的多核苷酸转化，并且任选进行扩增。在另一个实施方式中，从个体获取T淋巴细胞，然后任选进行扩增，和然后用编码本文描述的含有CTLA4或PD-1跨膜域的多肽的多核苷酸转化，和然后任选扩增至少一次或多次。可使用选择标记选择出含有该多核苷酸的细胞。
在某些实施方式中，本文描述的修饰的T淋巴细胞表达或包含能够形成天然TCR复合物的天然TCR蛋白，例如TCR-α和TCR-β，除了含有CTLA4或PD-1跨膜域的多肽以外。在某些其它实施方式中，将任一个或两个在修饰的T淋巴细胞中编码TCR-α和TCR-β的天然基因修饰成非功能性的，例如，部分或全部缺失，插入突变，等等。
在某些实施方式中，本文描述的T淋巴细胞分离自肿瘤病灶，例如，是肿瘤-浸润性淋巴细胞；预期这样的T淋巴细胞对TSA或TAA是特异性的。
在某些实施方式中，含有CTLA4或PD-1跨膜域的多肽(例如，CAR)的信号传导基序可用于促进本文描述的修饰的T淋巴细胞的增殖和扩增。例如，未修饰的T淋巴细胞和包含包含CD3ζ信号传导域和CD28共刺激域的多肽的T淋巴细胞可使用抗CD3和CD28的抗体(例如，连接至微珠或至细胞培养板的表面的抗体)进行扩增；参见例如，美国专利号5,948,893、6,534,055、6,352,694、6,692,964、6,887,466和6,905,681。在某些实施方式中，含有CTLA4或PD-1跨膜域的多肽的胞外域所结合的抗原可用于促进表达该多肽的T淋巴细胞的选择性扩增。例如，在其中该抗原是TSA的一个实施方式中，将包含该多肽的T淋巴细胞在存在TSA(例如，可溶形式的TSA)情况下进行培养，从而导致与在不存在TSA情况下培养相比，增殖增加。
在某些实施方式中，本文描述的包含含有CTLA4或PD-1跨膜域的多肽的T淋巴细胞使用结合于与该多肽的胞外抗原-结合域可结合的抗原偶联的多肽上的信号传导域的抗体刺激得以增殖。例如，在其中该多肽的信号传导域是CD3ζ且结合于该多肽的抗原是TSA的实施方式中，包含该多肽的T淋巴细胞经刺激得以增殖，即在存在TSA(例如，可溶形式的TSA)与结合于CD3ζ的抗体组合的情况下培养该细胞。
在以上实施方式的任一个中，该抗原和/或抗体可以在其中T淋巴细胞是培养物的培养基中游离存在，或者任何一个或两个可以与固体支持物(例如，组织培养塑料表面、微珠等)相连接。
本文描述的包含含有CTLA4或PD-1跨膜域的多肽的T淋巴细胞当需要时可任选包含能够杀死所有或基本上所有的T淋巴细胞的“自杀基因(suicide gene)”或“安全性开关(safety switch)”。例如，在某些实施方式中，本文描述的修饰的T淋巴细胞可包含HSV胸苷激酶基因(HSV-TK)，当与更昔洛韦(gancyclovir)接触时其引起修饰的T淋巴细胞死亡。在另一个实施方式中，该修饰的T淋巴细胞表达或包含可诱导胱天蛋白酶(induciblecaspase)，例如，可诱导胱天蛋白酶9(icaspase9)，例如，一种在胱天蛋白酶9和人FK506结合蛋白之间的融合蛋白，允许使用特异性小分子药物二聚化。参见Straathof等人,Blood105(11):4247-4254(2005)。
5.4.使用修饰的T淋巴细胞的方法
本文提供的包含含有CTLA4或PD-1跨膜域的多肽(例如，CAR)的修饰的免疫细胞(例如，修饰的T淋巴细胞)，可以用于治疗具有需要由T淋巴细胞所靶向的一种或多种细胞类型(例如，要杀死的一种或多种细胞类型)的个体。在某些实施方式中，要杀死的细胞是癌症细胞，例如肿瘤细胞。在某些实施方式中，该癌症细胞是实体肿瘤的细胞。在某些实施方式中，该细胞是以下癌或肿瘤的细胞：淋巴瘤、肺癌、乳癌、前列腺癌、肾上腺皮质癌、甲状腺癌、鼻咽癌、黑色素瘤(例如，恶性黑色素瘤)、皮肤癌、结肠直肠癌、硬纤维瘤、促结缔组织增生小圆细胞肿瘤、内分泌肿瘤、尤因肉瘤、外周原始神经外胚叶肿瘤、实体生殖细胞肿瘤、肝母细胞瘤、神经母细胞瘤、非横纹肌肉瘤软组织肉瘤、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、韦尔姆斯氏肿瘤、成胶质细胞瘤、黏液瘤、纤维瘤、脂肪瘤等。在更具体的实施方式中，所述淋巴瘤可以是慢性淋巴细胞性白血病(小淋巴细胞性淋巴瘤)、B-细胞前淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、脾边缘带淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、结节外边缘带B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、结节边缘带B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、T淋巴细胞前淋巴细胞性白血病、T淋巴细胞大颗粒状淋巴细胞性白血病、侵袭性NK细胞白血病、成体T淋巴细胞白血病/淋巴瘤、结节外NK/T淋巴细胞淋巴瘤、鼻型、肠病变型T淋巴细胞淋巴瘤、肝脾T淋巴细胞淋巴瘤、母细胞性NK细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿病、塞扎里综合征、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、类淋巴瘤样丘疹病、血管免疫母细胞性T淋巴细胞淋巴瘤、外周T淋巴细胞淋巴瘤(未分类的)、间变性大细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。
在向患有由T淋巴细胞可医治的疾病或紊乱的个体(例如，患有癌症的个体)给药之后，本文描述的修饰的T淋巴细胞的疗效可以通过本领域普通技术人员已知的对特定疾病或紊乱有特异性的一个或多个标准进行评估，从而指示疾病或紊乱的进展。一般而言，当所述标准中的一个或多个可检测地(例如，显著地)从疾病状态值或范围移动到正常值或范围或朝向正常值或范围移动时，将本文描述的修饰的T淋巴细胞给予这样的个体是有效的。
本文描述的修饰的T淋巴细胞可以配制在任何药学上可接受的溶液，优选适合于递送活细胞的溶液，例如盐水溶液(诸如林格氏溶液(Ringer's solution))、明胶、碳水化合物(例如，乳糖、直链淀粉、淀粉等)、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷(polyvinylpyrolidine)等中。这样的制剂优选在添加修饰的T淋巴细胞之前进行灭菌，并且可以与助剂例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂和着色剂进行混合。适合用于配制修饰的T淋巴细胞的药用载体是本领域已知的并且描述于例如WO 96/05309中。
在某些实施方式中，将本文描述的修饰的T淋巴细胞配制成为个体剂量，其中所述个体剂量包含至少、至多或约1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010或1×1011个修饰的T淋巴细胞。在某些实施方式中，将该修饰的T淋巴细胞配制成用于静脉内、动脉内、胃肠外、肌内、皮下、鞘内或眼内给药或者在特定器官或组织内给药。
6.实施例
6.1.实施例1：B细胞淋巴瘤的治疗
个体呈现出B-细胞慢性淋巴细胞性白血病，一种B细胞淋巴瘤。测试来自该个体的B细胞确定该B细胞携带17p缺失。从该个体获得T淋巴细胞，用包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列的慢病毒载体转染，且使用CD3+CD28包被的微珠扩增至足够数目用于给药。该嵌合受体包含结合于CD19的胞外抗原-结合区；来自CTLA4的跨膜域；来自CD28的细胞内共刺激域；和胞内CD3ζ域。该个体在30分钟内通过静脉内输注给予在200ml盐水溶液中的介于109和1010之间的T淋巴细胞。此后监测该个体两周以建立在该个体的血液中CD19+B细胞至少90％降低。
6.2.实施例2：B细胞淋巴瘤的治疗
个体呈现出B-细胞慢性淋巴细胞性白血病，一种B细胞淋巴瘤。测试来自该个体的B细胞确定该B细胞携带17p缺失。从该个体获得约106个T淋巴细胞，用包含编码CAR的核苷酸序列的慢病毒载体转染。该CAR包含结合于CD19的胞外抗原-结合区；来自PD-1的跨膜域；来自CD28的细胞内共刺激域；和胞内CD3ζ域。将表达CAR的T细胞给予该个体而无需T细胞的之前扩增。该个体在30分钟内通过静脉内输注给予在200ml盐水溶液中的介于105和106之间的T淋巴细胞。此后监测该个体两周以建立在该个体的血液中CD19+B细胞至少90％降低。
6.3.实施例3：B细胞淋巴瘤的治疗
个体呈现出B-细胞慢性淋巴细胞性白血病，一种B细胞淋巴瘤。测试来自该个体的B细胞确定该B细胞携带p53缺失。从该个体获得T淋巴细胞，用包含编码CAR的核苷酸序列的慢病毒载体转染，且使用CD3+CD28包被的微珠扩增至足够数目用于给药。该CAR包含结合于CD19的胞外抗原-结合区；来自CTLA4的跨膜域；分别来自CD28、4-1BB和OX40的细胞内共刺激域；和胞内CD3ζ域。该个体在30分钟内通过静脉内输注给予在200ml盐水溶液中的介于109和1010之间的T淋巴细胞。此后监测该个体两周以建立在该个体的血液中CD19+B细胞至少90％降低。
6.4.实施例4：B细胞淋巴瘤的治疗
个体呈现出B-细胞慢性淋巴细胞性白血病，一种B细胞淋巴瘤。测试来自该个体的B细胞确定该B细胞携带p53缺失。从该个体获得约106个T淋巴细胞，用包含编码CAR的核苷酸序列的慢病毒载体转染。该CAR包含结合于CD19的胞外抗原-结合区；来自PD-1的跨膜域；分别来自CD28、4-1BB和OX40的细胞内共刺激域；和胞内CD3ζ域。将表达CAR的T细胞给予该个体而无需T细胞的之前扩增。该个体在30分钟内通过静脉内输注给予在200ml盐水溶液中的介于105和106之间的T淋巴细胞。此后监测该个体两周以建立在该个体的血液中CD19+B细胞至少90％降低。
6.5.实施例5：前列腺癌的治疗
个体呈现出T2期前列腺癌，没有扩散到局部或其它淋巴结(N0,M0)。组织学等级经测定为G2。总体上，该个体经测定患有I1期前列腺癌。该个体在30分钟内通过静脉内输注给予在200ml盐水溶液中的介于109和1010之间的包含CAR的修饰的T淋巴细胞。该CAR包含结合于PSCA的胞外抗原-结合区、来自CTLA4的跨膜域、来自CD28的细胞内共刺激域和胞内CD3ζ域。在给药后30天、60天和90天，对该个体的前列腺癌分期和扩散到淋巴结进行再次评估，并且进行生物活检的前列腺组织的组织学分析。
6.6.实施例6：前列腺癌的治疗
个体呈现出T2期前列腺癌，没有扩散到局部或其它淋巴结(N0,M0)。组织学等级经测定为G2。总体上，该个体经测定患有I1期前列腺癌。该个体在30分钟内通过静脉内输注给予在200ml盐水溶液中的介于109和1010之间的包含CAR的修饰的T淋巴细胞。该CAR包含结合于PSCA的胞外抗原-结合区、来自PD-1的跨膜域、来自CD28的细胞内共刺激域和胞内CD3ζ域。在给药后30天、60天和90天，对该个体的前列腺癌分期和扩散到淋巴结进行再次评估，并且进行生物活检的前列腺组织的组织学分析。
6.7.实施例7：前列腺癌的治疗
个体呈现出T2期前列腺癌，没有扩散到局部或其它淋巴结(N0,M0)。组织学等级经测定为G2。总体上，该个体经测定患有I1期前列腺癌。该个体在30分钟内通过静脉内输注给予在200ml盐水溶液中的介于109和1010之间的包含CAR的修饰的T淋巴细胞。该CAR包含结合于PSCA的胞外抗原-结合区；来自CTLA-4的跨膜域；分别来自CD28、4-1BB和OX40的细胞内共刺激域；和胞内CD3ζ域。在给药后30天、60天和90天，对该个体的前列腺癌分期和扩散到淋巴结进行再次评估，并且进行生物活检的前列腺组织的组织学分析。
6.8.实施例8：前列腺癌的治疗
个体呈现出T2期前列腺癌，没有扩散到局部或其它淋巴结(N0,M0)。组织学等级经测定为G2。总体上，该个体经测定患有I1期前列腺癌。该个体在30分钟内通过静脉内输注给予在200ml盐水溶液中的介于109和1010之间的包含CAR的修饰的T淋巴细胞。该CAR包含结合于PSCA的胞外抗原-结合区；来自PD-1的跨膜域；分别来自CD28、4-1BB和OX40的细胞内共刺激域；和胞内CD3ζ域。在给药后30天、60天和90天，对该个体的前列腺癌分期和扩散到淋巴结进行再次评估，并且进行生物活检的前列腺组织的组织学分析。
6.9.实施例9：包含CTLA-4或PD-1跨膜域的CAR
本实施例证明包含CTLA-4或PD-1跨膜域的嵌合抗原受体在T细胞中是功能性的和活性的。
6.9.1包含CTLA-4跨膜域的CAR
产生了包含结合抗原HER2的胞外域(抗HER2scFV)的CAR。具体地说，产生了以下CAR：(i)HER-28TMζ，包含抗HER2scFV、CD28跨膜域和CD3ζ胞内域；(ii)HER-28TM28ζ，包含抗HER2scFV、CD28跨膜域和CD28-CD3ζ胞内域；(iii)HER2-CTLA4TM28ζ，包含抗HER2scFV、CH2CH3铰链区、CTLA-4跨膜域(SEQ ID NO:10)和CD28-CD3ζ胞内域；和(iv)HER2-41BBTM28ζ，包含抗HER2scFV、CD8铰链区、4-1BB跨膜域和CD28-CD3ζ胞内域。
评估了人T细胞表达以上描述的CAR的能力。分别使用人全T分离试剂盒II和人幼稚全(Pan)T分离试剂盒(Miltenyi,Cambridge,MA)，通过负选择从供体样品血的血沉棕黄层中分离出全T细胞和幼稚全T细胞(Pan T cells)。将分离的T细胞在RPMI完全培养基中在10ng/ml IL-7存在下培养11天，然后用表达CAR构建体的慢病毒以MOI为5进行转导。
在转导后三天，对CAR T细胞表型进行了表征：细胞用HER2-Fc融合蛋白(R&DSystems,Minneapolis,MN)染色，然后用与FITC或APC缀合的多克隆山羊抗人IgG-Fc抗体(Jackson ImmunoRessearch,West Grove,PA)染色。在同一天，T细胞用HER2-Fc融合蛋白在范围为的0.25μg/ml至1μg/ml的浓度梯度下刺激。刺激后48小时收集上清液进行细胞计数微珠阵列(cytometric beads array,CBA)分析，以使用客户指定的CBA flex set(BDBiosciences,San Jose,CA)评估细胞因子由T细胞产生。对来自上清液去除后的培养物的细胞进行染色，以使用具有荧光染料缀合物的抗人单克隆抗体(BD Biosciences)测量T细胞活化表面标志物CD69、4-1BB、CD71、HLA-DR和CD25。在FACS Canto II机器上进行CBA和表面标志物二者的流式细胞术分析，并且用FACSDiva软件(BD Biosciences)获取数据。用FCAP Assay软件(Soft Flow Ltd.,Pecs,Hungary)分析CBA数据。使用FlowJo流式细胞术软件(Tree Star,Ashland,OR)分析表面标志物流动数据。
如图1所示，所产生的CAR中的三个(包括具有CTLA-4跨膜域的CAR)由T细胞高度表达。在CAR连接后，即当CAR T细胞用HER2-Fc融合蛋白刺激时，T细胞活化表面标志物CD69、4-1BB和HLA-DR各自被上调。在每一种情况下，在表达构建体HER2-CTLA4TM28ζ的CAR T细胞中观察到最高水平。
如图2-4所示，四组CAR T细胞中有两组证明在对HER2刺激应答时有细胞因子产生。具体地说，表达命名为HER2-28TM28ζ的CAR的T细胞和表达命名为HER2-CTLA4TM28ζ的CAR的T细胞在对HER2刺激应答时以剂量依赖性方式产生细胞因子白介素-2(IL-2)(图2)、GM-CSF(图3)和干扰素-γ(IFN-γ)(图4)。出乎意料的是，表达包含来自在正常情况下将抑制信号传递至免疫系统细胞的蛋白质的跨膜域(即，CTLA-4跨膜域)的CAR的T细胞与分别表达其它CAR的T细胞(包括表达命名为HER2-28TM28ζ的CAR的T细胞)相比，前者产生的各细胞因子水平高得多。参见图2-4。
进一步检查用HER2刺激表达以上描述的CAR的T细胞是否诱导细胞内肿瘤坏死因子-α(TNF-α)由T细胞产生。CAR T细胞用HER2-Fc(1μg/ml)在含有IL-2(50IU/ml)的培养基中刺激2天。HER2刺激多进行两次，每次间隔七天。第三次刺激后，通过流式细胞术检查细胞内TNF-α。如图5所示，表达命名为HER2-28TM28ζ的CAR的T细胞、表达命名为HER2-CTLA4TM28ζ的CAR的T细胞和表达命名为HER2-28TMζ的CAR的T细胞产生了TNF-α，其中最高数量的TNF-α由表达包含来自在正常情况下将抑制信号传递至免疫系统细胞的蛋白质的跨膜域(即，CTLA-4跨膜域)的CAR的T细胞产生。
最后，测定用HER2刺激表达以上描述的CAR的T细胞是否导致CAR T细胞群体的富集。用HER2-Fc融合蛋白刺激表达以上描述的CAR的CAR T细胞。用HER2刺激后十三天，通过流式细胞术分析CAR T细胞，如上所述。出乎意料的是，如图6所示，在HER2刺激后，仅富集表达命名为HER2-CTLA4TM28ζ的CAR的CAR T细胞。
6.9.2包含PD-1或CTLA-4跨膜域的CAR
本实施例证明包含CTLA-4跨膜域或PD-1跨膜域的嵌合抗原受体在T细胞中是功能性的和活性的。
产生了包含结合抗原HER2的胞外域(抗HER2scFV)的CAR。具体地说，产生了以下CAR：(i)HER-PD1TM-CD28-CD3，包含抗HER2scFV、CH2CH3铰链区、PD-1跨膜域(SEQ ID NO:11)和CD28-CD3胞内域；(ii)HER-CTLA4(189)TM-41BB-CD3，包含抗HER2scFV、CD28铰链区、CTLA-4跨膜域(SEQ ID NO:10)和4-1BB-CD3胞内域；(iii)HER-PD1TM-41BB-CD3，包含抗HER2scFV、CD28铰链区、PD-1跨膜域(SEQ ID NO:11)和4-1BB-CD3胞内域；和(iv)HER2-CD28TM-CD28-CD3，包含抗HER2scFV、CD28铰链区、CD28跨膜域和CD28-CD3胞内域。
分别使用人全T分离试剂盒II和人幼稚全T分离试剂盒(Miltenyi,Cambridge,MA)，通过负选择从供体样品血的血沉棕黄层中分离出全T细胞和幼稚全T细胞。将分离的T细胞在RPMI完全培养基中在10ng/ml IL-7存在下培养11天，然后用表达CAR构建体的慢病毒以MOI为7进行转导。
在转导后三天，对CAR T细胞表型进行了表征：细胞用HER2-Fc融合蛋白(R&DSystems,Minneapolis,MN)染色，然后用与FITC或APC缀合的多克隆山羊抗人IgG-Fc抗体(Jackson ImmunoRessearch,West Grove,PA)染色。在同一天，T细胞用HER2-Fc融合蛋白在范围为的0.25μg/ml至1μg/ml的浓度梯度下刺激。刺激后48小时收集上清液进行细胞计数微珠阵列(cytometric beads array,CBA)分析，以使用客户指定的CBA flex set(BDBiosciences,San Jose,CA)评估细胞因子由T细胞产生。对来自上清液去除后的培养物的细胞进行染色，以使用具有荧光染料缀合物的抗人单克隆抗体(BD Biosciences)测量T细胞活化表面标志物CD69、4-1BB、CD71、HLA-DR和CD25。在FACS Canto II机器上进行CBA和表面标志物二者的流式细胞术分析，并且用FACSDiva软件(BD Biosciences)获取数据。用FCAP Assay软件(Soft Flow Ltd.,Pecs,Hungary)分析CBA数据。使用FlowJo流式细胞术软件(Tree Star,Ashland,OR)分析表面标志物流动数据。
如图7所示，所产生的CAR各自由T细胞高度表达。在用HER2刺激以上描述的CAR T细胞后，T细胞活化表面标志物CD69、CD71和HLA-DR各自被上调。在每一种情况下，所观察的上调水平在表达具有PD-1或CTLA-4跨膜域的CAR的CAR T细胞中最高。
如图8-9所示，CAR T细胞证明在对HER2刺激应答时有细胞因子产生。具体地说，表达以上描述的CAR的T细胞在对HER2刺激应答时以剂量依赖性方式产生细胞因子IL-2(图8)、TNF-α(图8)和IFN-γ(图8)、GM-CSF(图9)、粒酶B(图9)和IL-13(图9)。在每一种情况下，表达包含PD-1或CTLA-4跨膜域的CAR的T细胞表现出最高水平的细胞因子产生，其中表达命名为HER-PD1TM-CD28-CD3的CAR的T细胞一致地产生最高水平的各细胞因子(参见图8和图9)。
最后，测定了用HER2刺激表达以上描述的CAR的T细胞是否导致CAR T细胞群体的富集。用HER2-Fc融合蛋白刺激表达以上描述的CAR的CAR T细胞。用HER2刺激后十一天，通过流式细胞术分析CAR T细胞，如上所述。如图10所示，表达命名为HER-PD1TM-CD28-CD3的CAR的CAR T细胞在HER2刺激后富集，其中表达所描述的其它CAR的T细胞显示在活细胞中相对于初始细胞数有最适度水平的增加。
6.9.3结论
综上所述，已经证明表达包含来自在正常情况下将抑制信号传递至免疫系统细胞的蛋白质的跨膜域的CAR的T细胞的产生。此外，已经显示这样的CAR T细胞具备预料不到的特征。具体地说，这样的T细胞(i)证明与表达包含来自在正常情况下将刺激信号传递至免疫系统细胞的蛋白质的跨膜域的CAR的T细胞相比，在用所针对它们表达的CAR的胞外域的抗原刺激应答时细胞因子产生的水平升高；和(ii)在所针对它们表达的CAR的胞外域的抗原存在下培养时富集，而表达包含来自在正常情况下将刺激信号传递至免疫系统细胞的蛋白质的跨膜域的CAR的T细胞当用该抗原刺激时不富集至相同的程度。
等同实施方式
本公开并不局限于由本文描述的具体实施方式所涵盖的范围。实际上，根据以上描述，对本文提供的主题的各种修改，除了所述的那些以外，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。这样的修改计划落入附上的权利要求书的范围内。
本文中引用了各种出版物、专利和专利申请，其公开内容通过引用其全部结合到本文中。

Claims (14)

1.多肽，其包含(i)来自PD-1的跨膜域，(ii)CD3ζ胞内域，(iii)共刺激CD28多肽序列，和(iv)结合于肿瘤细胞上的抗原的胞外域，其中所述多肽的胞外域不是来自PD-1。
2.权利要求1的多肽，其中所述多肽是嵌合抗原受体(CAR)。
3.权利要求1的多肽，其中表达所述多肽的T淋巴细胞当所述多肽结合于所述抗原时经活化或刺激得以增殖。
4.权利要求1的多肽，其中所述多肽当表达于T淋巴细胞的表面上时引导该T淋巴细胞将表达所述抗原的细胞杀死。
5.权利要求1的多肽，其中所述PD-1的跨膜域是或包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
6.权利要求1的多肽，其中所述胞外域是抗体或其抗原-结合部分。
7.权利要求1的多肽，其中所述抗原是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。
8.权利要求7的多肽，其中所述肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原是Her2、前列腺干细胞抗原(PSCA)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原-125(CA-125)、CA19-9、钙视网膜蛋白、MUC-1、上皮膜蛋白(EMA)、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、CD34、CD45、CD99、CD117、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、桥粒蛋白、胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)、巨囊性疾病液体蛋白(GCDFP-15)、HMB-45抗原、蛋白melan-A(由T淋巴细胞识别的黑色素瘤抗原；MART-1)、myo-D1、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)、神经丝、神经元特异性烯醇酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶、突触小泡蛋白、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、二聚体形式的丙酮酸激酶同工酶M2型(肿瘤M2-PK)、CD19、CD22、CD27、CD30、CD70、GD2(神经节苷脂G2)、EGFRvIII(表皮生长因子变异体III)、精子蛋白17(Sp17)、间皮蛋白、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、prostein、TARP(T细胞受体γ可变阅读框架蛋白)、Trp-p8、STEAP1(前列腺六次跨膜上皮1抗原)、异常ras蛋白、异常p53蛋白、整联蛋白αvβ3(CD61)、催乳激素、K-Ras(V-Ki-ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因)或Ral-B。
9.权利要求8的多肽，其中所述肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原是Her2。
10.权利要求1的多肽，其中所述多肽从N-端到C-端按顺序包含：(i)结合肿瘤细胞上的抗原的胞外域；(ii)CD28或CTLA4铰链区多肽序列；(iii)来自PD-1的跨膜域；(iv)共刺激CD28多肽序列；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
11.权利要求10的多肽，其中所述多肽从N-端到C-端按顺序包含：(i)包含单链Fv域的胞外域，该单链Fv域包含通过柔性接头与VH连接的VL，其中所述VL和VH是来自结合所述抗原的抗体；(ii)CD28铰链区多肽序列；(iii)来自PD-1的跨膜域；(iv)共刺激CD28多肽序列；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
12.权利要求10的多肽，其中所述多肽从N-端到C-端按顺序包含：(i)包含单链Fv域的胞外域，该单链Fv域包含通过柔性接头与VH连接的VL，其中所述VL和VH是来自结合所述抗原的抗体；(ii)CTLA4铰链区多肽序列；(iii)来自PD-1的跨膜域；(iv)共刺激CD28多肽序列；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
13.权利要求10的多肽，其中所述多肽从N-端到C-端按顺序包含：(i)包含单链Fv域的胞外域，该单链Fv域包含通过柔性接头与VH连接的VL，其中所述VL和VH是来自结合所述抗原的抗体；(ii)PD-1铰链区多肽序列；(iii)来自PD-1的跨膜域；(iv)CD28共刺激域序列；和(v)CD3ζ细胞内信号传导域。
14.T淋巴细胞，其包含权利要求1-13任一项的多肽。
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