KR20150082619A - 히알루론산의 광반응성 유도체, 이의 제조 방법, 히알루론산의 3ｄ-가교된 유도체, 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

히알루론산의 광반응성 유도체, 이의 제조 방법, 히알루론산의 3ｄ-가교된 유도체, 이의 제조 방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 히알루론산의 광반응성 유도체 (화학식 I) 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 히알루론산의 알데하이드 유도체를 제조한 다음, 이를 글루코사민 사이클의 6번 위치에서 산화시키고, 이후 산화된 유도체를 환원제의 존재 하에, 광반응성 화학종을 가진 아민, 예를 들어 1-(2-아미노에틸)피리딘-2(1H)-온과 반응시켜, 광반응성 유도체를 제조한다. 제조된 광반응성 유도체는 이후 광화학적 가교될 수 있으며, 이때 반응은 [4+4] 광화학적 고리화 첨가 반응을 기본으로 한다. 아울러, 본 발명은, 증가된 가수분해 안정성과 향상된 수착성을 나타내며, 최종 용도의 요건에 따라 이의 물성을 추가적으로 설계할 수 있는, 히알루론산의 3D-가교된 유도체 (화학식 II), 및 이의 조직 공학, 재생 의학, 의약제 또는 의약 제형 또는 미용 분야에서의 용도에 관한 것이다.

Description

히알루론산의 광반응성 유도체, 이의 제조 방법, 히알루론산의 3Ｄ-가교된 유도체, 이의 제조 방법 및 용도{PHOTOREACTIVE DERIVATIVE OF HYALURONIC ACID, METHOD OF PREPARATION THEREOF, 3D-CROSSLINKED DERIVATIVE OF HYALURONIC ACID, METHOD OF PREPARATION AND USE THEREOF}
본 발명은 광화학적 가교에 의해 제조되는 3-D 구조의 히알루론산의 제조 방법에 관한 것이다. 본 방법은　히알루론산의 폴리머 사슬에 병합된 적절한 발색단의 분자간(intermolecular) 광화학적 고리화 첨가 반응(photocycloaddition) 또는 광이량화 반응(photodimerization reaction)을 토대로 한다. 광반응은 불활성 분위기 없이 수행되고, 공기 중 실온에서 진행되며, 유기 용매가 필요하지 않으며, 원하는 산물에 대한 임의의 분리 공정 또는 부산물의 임의의 폐기도 요구되지 않는다. 광화학적 반응의 생성물은 히알루론산의 폴리머 사슬에 저분자량의 발색단이 결합된 다이머 구조 (소위 가교물)이다. 이는, 초기 물질보다 수성 매질에 대한 용해도가 상당히 낮고, 보다 높은 안정성을 나타내는 3-D 가교된 구조의 히알루론산이 형성된다는 것을 의미한다:
Figure pct00001
도식 1: 히알루론산 분자에 병합된 발색단 및　2-탄소 링커 1-(2-아미노에틸)피리딘-2(1H)-온 (AEP).
히알루론산은, D-글루쿠론산 서브유닛 및 N-아세틸-D-글루코사민 서브유닛이 β(1→3) 및　β(1→4) O-글리코시드 결합에 의해 서로 결합된, 글리코사미노 글리칸으로 된 천연 이종다당류이다. 히알루론산은 다수의 결합 조직, 활액, 피부 및 연골에서 천연적으로 형성된다 (Smeds K. A., Grinstaff M. W. 2001. J Biomed Mater Res 54: 115). 히알루론산은 효소적 분해되기 쉬우며 (Burdick J. A., Chung C., Jia X., Randolph M. A. and Langer R. 2005. Biomacromolecules 6: 386), 조직의 수화(hydration), 세포 분화 (Park Y.D., Tirelli N., Hubbell J. A. 2003. Biomaterials 24: 893), 피부 상처의 치료 (Leach J.B. and Schmidt C. E. 2003. Biotechnol Bioeng . 82: 578), 혈관신생 (Leach J.B. and Schmidt C. E. 2005. Biomaterials 26: 125) 및 만성 질환의 치료 (Jia X.Q., Burdick J. A., Kobler J., Clifton R.J., Rosowski J.J., Zeitels S.M., Langer R. 2004. Macromolecules 37: 3239)에 중요한 역할을 한다.
히알루론산은 특히 조직 공학 분야의 생체물질의 용도 면에서 흥미로운 물질이다. 폴리머 구조에 함유된 관능기 (OH, COOH)는 화학적 유도체화(chemical derivatization)를 발생시켜 (예를 들어, 선택적 산화 Buffa R., Kettou S. and　Velebny V., PV 2009-835, 2009-836), 화학적 가교 (Burdick J.A. and　Prestwich D.G. 2011. Adv Mater 23, H41) 또는 광화학적 가교를 유도함으로써, 가수분해에 안정한 공유 결합을 형성한다 (Seidlits S. K., Khaing Z. Z., Petersen R. R.,Nickels J. D., Vanscoy J. E., Shear J. B., Christine E. Schmidt Ch. E. 2010. Biomaterials 31: 3930),
HA의 광화학적 고리화 첨가 반응
마크로머(macromeric) HA 사슬의 가교를 유도하는 가장 자주 사용되는 광화학적 반응들 중 하나는 소위 [2+2] 광화학적 고리화 첨가 반응, 또는 [2+2] 광이량화 반응이다. 이들 2가지 분자간 반응이 수행되는 동안에, 2개의 불포화된 π-결합이 포화된 σ-결합으로 변환되어, 바이오폴리머 구조에 측쇄가 결합된 4-원성 사이클로부탄 고리 (가교)가 형성된다 (도식 2).
Figure pct00002
도식 2: 2종의 올레핀의 [2+2] 광화학적 고리화 첨가 반응에 의한 사이클로부탄 고리의 형성에 대한 일반적인 도식
다당류의 경우, UV 광에 의한 여기 시, [2+2] 광화학적 고리화 첨가 반응을 이행하는 공액된 이중 결합을 포함하는 발색단들이 다수 존재하고 있다. 이들 광반응성 화합물로는, 아크릴산, 메타크릴산, 푸릴아크릴산, 티에닐아크릴산, 푸마르산, 말레산, 소르브산, p-아미노산 유도체를 비롯한 신남산, 말레인이미드와 이의 알킬 및　아릴 유도체, 피리미딘 염기 (우라실, 티민 및　시토신), 피란-2-온, 쿠마린, 소랄렌(psoralen), trans-칼콘(chalcon), trans-스틸벤 및　이의 메톡실 유도체 및 4차 피리디늄 염 (trans-4-스티리릴피리디늄 할라이드)을 포함한다.
[2+2] 광화학적 고리화 첨가 반응의 응용
일본 Seikagaku Corporation사의 복합 특허 (Matsuda T., Moghaddam M.J, Sakurai K. 1993, EP0554898B1)가 1993년에 공개되었다. 저자들은, 광반응성 이종다당류, 특히 히알루론산을 비롯한 GAG (영문명 글루코사미노글리칸의 약어)의 제조 방법을 기술하였다. 이들은 신남산을 기재로 한 광화학적으로 가교된 히알루론산을 심장형태형성(cardiomorphogenesis)에 사용하고자 하였다.
특허 (Motani Y., Seikagaku Corporation, JP, 1997, EP0763754A2)에서, 저자들은 trans-신남산으로 치환된 히알루론산의 유도체를 제시하였다. 3-D 가교된 생성물은 콘택트 렌즈에 사용되었다. 가교된 유도체는 안구 표면에 적용가능한 투명하고 콤팩트한 하이드로겔이었다. 저자들은, 사용한 물질의 형태 안정성, 항접착 특성, 잘-규정된 기계적 및 흡수 특성 (겔 부피의 20-99%가 수계임)을 주장하였다.
특허 문서 (Waki M. and　Motani Y., Seikagaku Corporation, JP, 2000, US006025444)는 trans-신남산의 용도를 개발 및 최적화하였다. 저자들은, 히알루론산의 구조에서 이의 반응성이 낮은 이유를 설명하는 데 성공하였다. 이들은 그 원인을 경쟁적인 광화학적 반응 - 광이성질화라로 하였다. 저자들에 따르면, 히알루론산의 선택된 광반응성 유도체의 농도가, 생성되는 광 고리화 부가물(photocycloadduct)과, 신남산의 광화학적 불활성 cis-이성질체 형태로 존재하는 이의 경쟁물질 간의 비율에 중요한 영향을 미친다.
복합 특허 출원 (Sato T., 2003, Seikagaku Corporation, JP, EP1607405B1)은 2종의 광반응성 기, 즉 trans-신남산과 피리미딘 염기 - 티민-을 청구하였다. 저자들은, 바이오폴리머의 동결된 광반응성 유도체의 조사, 또는 킬레이트화제, 디터전트를 조사된 용액에 첨가하여 줄기 세포를 증식시키는데 적합한 스캐폴드(scaffold)를 형성하는 것에 대해 진보성을 주장하였다.
2006년도에, 광화학 분야에서 히알루론산에 부착된 trans-신남산에 대한 특허 (Miyamoto K., Kurahashi Y., Seikagaku Corporation, JP, 2006, EP1217008B1)가 허여되었다. 저자들은, 광화학적 반응 시 알칼리 조건을 적용하는 것이 이들 실험의 진보적인 측면이라고 보았다. 반응에서 변형된 pH (7.2-11.0), 이상적으로는 (7.5-10.0)는 히알루론산의 용해도 (친수성) 뿐만 아니라 이의 2차 및 3차 구조의 특징에도 근본적인 영향을 발휘하였다. 이로써, 광반응성 기의 훨씬 더 효율적인 자가-조립이 이루어졌으며, 후속적으로 보다 높은 양자 수율이 달성되었다.
특허 문헌 (Miyamoto K., Yasuda Y., Seikagaku Corporation, JP, 2008. EP1905456A1, 국제 출원 2007, WO2007/004675)은 공유 결합된 의약 성분 (바람직하게는 소염제)을 포함하는, trans-신남산으로부터 유래된 HA의 광반응성 유도체를 제시하였다. 히알루론산 유도체의 졸-겔 전환 및 수득된 하이드로겔의 파라미터는, 압력 (0.5 - 5 kg/cm2)을 가하여 유기체에 피하 투여 (바늘 20 내지 25)하여, 투여 부위에서 의약 성분이 시간-계획된 방식으로(time-designed) 방출되는 것을 반영하였다. 의약 성분은 특히, 나프록센(naproxen), 이부프로펜(ibuprofen), 플루비프로펜(flubiprofen), 펠비낙(felbinac), 에토돌락(etodolac) 또는 악타리트(actarit)와 같은 비-스테로이드계 염증제이었다.
국제 특허 출원 (Francotte E., CIBA-Geigy, CH, 1996. WO96/27615 특허 패밀리: 2000, US6011149, 2002, EP08137546B1)은, 아노머 혼합물을 효율적으로 분리하기 위해, 컬럼 크로마토그래피의 새로운 정지상을 설계하는 분야에서, 흥미롭고 유용한 [2+2] 광화학적 고리화 첨가 반응의 사용을 제시한다. 저자는, 필요한 키랄 정보를 가진 다당류 사슬에 카르바메이트 결합에 의해 부착된 치환된 말레인이미드의 다이머화 반응을 소개하였다. 이 특허는 셀룰로스, 아밀로스, 키토산, 덱스트란, 크실란(xylan) 또는 이뉼린(inulin)과 같은 여러 가지 유형의 다당류들을 청구하였다.
1989년의 포괄적인 공개문헌 (Katritzky A.R., Dennis N., 1989. Chem Rev 89: 827)은, 6-원성 헤테로사이클릭 화합물의 고리첨가 반응의 (광)화학성을 상세히 다루었다. 저자들은, 원문에 인용된 참조문헌을 통해, 질소 염기와, 키놀린-1-옥사이드, 피란-2-온, 쿠마린, 치환된 크로몬(chromone), 다이하이드로피리딘 및 다이하이드로피란-2,4-온으로부터 유래되는 기타 발색단의 [2+2] 광화학적 고리화 첨가 반응들을 기술하였다.
광이량화 반응 분야에서 피리미딘 염기 (시토신, 티민, 우라실)를 이용하는 것에 대해 많은 노력들이 이루어졌으며, 다수의 특허들 (Grasshoff J.M, Taylor D.L., Warner N., Polaroid corporation, UK, 1995. US5455349); (Matsuda T., Nakao H., Seikagaku Kogyo, JP, 2000. US6075066); (Sato T., Seikagaku Corporation, JP, 2003. EP1369441A1); (Warner J.C., Morelli A., Ku M.Ch., University of Massachusetts, 2005. US20050266546A1); (Warner J.C., Cannon A.S., Raudys J., Undurti A., University of Massachusetts, 2009. US7550136)이 출원되었다. 이들의 출원은 미용 산업, 광학, 조직 공학 및 재생 의학 분야에 관한 것이었다.
[2+2] 광화학적 고리화 첨가 반응은, 추가적인 화학적 변형이 불가능하여, 구조가 어떠한 생물학적 동기가 되지 못하는, 포화된 사이클로부탄 고리 (이중 결합이 없는 4-원성 고리)를 생성물로서 만들어낸다. 이와는 대조적으로, [4+4] 광화학적 고리화 첨가 반응을 포함하는 본 발명이 오리지널이며, 몇 가지 이점들을 제공한다. [4+4] 광화학적 고리화 첨가 반응은 불포화된 β-락탐 사이클 (2개의 이중 결합을 가진 8-원성 사이클)을 생성물로서 제공하며, 이는 추가적인 화학적 변형이 가능할 수 있다. 더욱이, 사이클로옥타다이엔 가교는, 가교 구조에 부여되는 흥미로운 생물학적 동기인 것으로 여겨지고 있다 (Holten K.B., Onosuko E.M. 2000., American Family Physician 62: 611; Elander R.P., 2003. Applied Microbiology and Biotechnology 61: 385).
광이량화 전략을 토대로 하는 다른 방법들과 비교해, [4+4] 광화학적 고리화 첨가 반응의 또 다른 이점은 형성된 가교의 독특한 구조이다. 4-원성의 포화된 사이클로부탄 고리만 형성되는 [2+2] 광화학적 고리화 첨가 반응과는 대조적으로, 언급된 특징들로 인해, 2개의 다중 결합을 포함하는 8-원성 사이클을 형성시킬 수 있다. 가교에서 고립된 이중 결합은 부가적인 화학적 변형 (산화, 환원 또는 첨가)에 쉽게 노출된다. 현재까지는 [4+4] 광화학적 고리화 첨가 반응이 히알루론산의 광화학적 가교에 사용된 적은 없다. 언급된 [4+4] 광화학적 고리화 첨가 반응은 고체 상에서 진행되며, 따라서, 임의의 용매, 반응 혼합물의 임의의 탈기(degassing), 샘플의 임의의 복잡한 제조 과정이 필요하지 않으며, 농도 또는 점도와 같은 용액 파라미터에 의존하지 않는다. 본 전략의 큰 이점은, 반응에 임의의 독성 용매가 수반되지 않으며, 반응이 고 선택적이며, 불활성 분위기 및 최종 생성물의 분리 둘 다 불필요하다는 것으로서, 따라서 비용이 상당히 절감되며 실험 자체가 쉬워진다. 더욱이, 공정의 효율이 상당히 증가된다 (단리(isolation), 분리(separation), 정제, 폐기물의 양). 이들 요소는 산업적인 측면에서 매우 바람직하다.
이 외에도, 본 발명에 따른 중요한 혁신적인 단계 역시, 2-피리돈을 토대로 하는 광반응성 화학종의 특징에 있다. 다수의 발색단들이 산소에 증가된 민감성을 나타내어, 부적절한 오존 분해에 의해 쉽게 분해되거나, 또는 고 반응성의 라디칼이 형성되어 바이오폴리머의 광분해를 유발한다. 따라서, 이러한 경우, 광화학적 반응은 공기 분위기에 자유롭게 개방된 상태에서는 수행될 수 없다. 우선, 반응 혼합물의 탈기 (탈산소화)가 이루어져야 하며, 이후 불활성 분위기의 흐름이 확보되어야 하며, 그 이후에만 광화학적 반응 자체를 진행시킬 수 있다. 본 발명의 광반응성 기는 산소에 민감하지 않기 때문에 이러한 선행되는 준비 과정이 필요 없다 (Sieburth S.M, Cunard T.N., 1996. Tetrahedron 52: 6251; Dilling W.L., Mitchell A.B., 1973. Mol . Photochem . 5:, 371; Matsushima R., Terada K. 1985. J. Chem . Soc . Perkin Trans. 2, 1445). 이의 안정성은 이의 공액에 반영되어, 이중 결합의 분해 취약성이 실질적으로 감소된다. 즉, 본 발명에 따른 해법이 다당류의 광화학적 가교 분야의 당해 기술과 비교해, 상당히 단순하며 경제적으로 보다 유리하다는 것을 의미한다.
본 발명의 내용은 [4+4] 광화학적 고리화 첨가 반응을 토대로 히알루론산의 광반응성 유도체를 광화학적으로 가교하는 방법에 관한 것이다. 이 반응은 횡단 결합 (가교)을 형성함으로써 가교된 구조의 히알루론산을 형성할 수 있다. 광이량화 방법을 토대로 하는 다른 해법들과 비교해, [4+4] 광화학적 고리화 첨가 반응의 또 다른 이점은 형성된 가교의 구조 특징에 있다. 4-원성의 포화된 사이클로부탄 고리만 형성되는 [2+2] 광화학적 고리화 첨가 반응과는 대조적으로, 이러한 특징으로 인해 다중 결합을 2개 포함하는 8-원성 사이클을 형성할 수 있다. 이러한 구조에서 고립된 이중 결합은 부가적인 화학적 변형 (산화, 환원 또는 부가)에 쉽게 노출된다.
더욱이, 광반응성 기로서의 2-피리돈의 사용은 대기 산소에 그렇게 민감하지 않아, 다른 발색단과 비교해 실험적인 구현이 매우 간단해진다. 그 이유는, 공액된 다중 결합의 π-전자가 헤테로사이클의 공명으로 인해 부분적으로 비편재화(delocalization)되기 때문이다. 물론, 본 발명은 2-피리돈 및 이의 유도체로만 제한되지 않는다. 잠재적으로 유용한 발색단으로는, 예를 들어, 아크리디지늄 염, 안트라센, 2-피론(pyrone), 벤조푸란 등이 포함된다.
히알루론산의 광화학적으로 가교된 유도체는, 가수분해에 대한 안정성 증가와 수성 매질에 대한 제한된 용해성으로 표시되는, 이의 물성 변형이 특징적이다. 나아가, 수성 매질에서, 이 유도체는 팽윤하여, 하이드로겔, 불용성 입자를 형성하며, 수착성을 나타내고, 액체, 염료, 선택적으로 생물학적 활성 성분을 보유하는 것을 특징으로 한다.
히알루론산의 3-D 가교된 생성물의 형성에 대해 제시된 방법은 3가지 단계로 구성된다 (도식 1). 히알루론산의 광반응성 유도체의 제조는 이의 산화된 형태 (단계 1, 도식 1), 및 표적 발색단을 가진 아민으로부터 시작된다. 가수분해적으로 불안정한 이민은 반응 혼합물로부터 형성되며, 인 시추(in situ)에서 하이드라이드(hydride)에 의해, 가수분해적으로 안정한 2차 아민으로 직접 환원된다 (단계 2, 도식 1). 이를 위해, 2-피리돈의 N-알킬화된 유도체 (1-(2-아미노에틸)피리딘-2(1H)-온) (이하, 단순히 AEP)가 2-(Boc-아미노)에틸브로마이드를 이용한 피리딘-2(1H)-온의 선택적인 N-알킬화에 의해 합성되었다. 마지막 단계는 제조된 HA 유도체의 광화학적 가교 반응 (단계 3, 도식 1)으로, 그 결과 3-D 가교된 생성물이 형성된다. 광화학적 가교는 UVB 광에 의해 개시되며, 고체 상에서 발생하는데, 즉, 임의의 용매, 화학적 촉매작용 또는 불활성 분위기의 부재 하에 발생한다. 이러한 유형의 광화학적 반응은 [4+4] 광화학적 고리화 첨가 반응 또는 [4+4] 광이량화 반응으로 분류된다.
Figure pct00003
도식 3: 본 발명의 합성 방법.
특히, 본 발명은 화학식 (I)로 표시되는 히알루론산의 광반응성 유도체에 관한 것이다:
Figure pct00004
상기 식에서, R은 수소 또는 알칼리 금속 양이온이다.
히알루론산 또는 이의 무기 염은 분자량이 1.104 g.mol-1 내지 5.106 g.mol-1 범위이다.
나아가, 본 발명은 화학식 (I)로 표시되는 유도체의 제조 방법에 관한 것으로서, 글루코사민 사이클의 6번 위치에서 형성된 히알루론산의 알데하이드를 먼저 제조한 다음, 산화된 유도체를 환원제의 존재 하에 광반응성 화학종을 가진 아민과 반응시켜, 광반응성 유도체를 형성한다. 글루코사민 사이클의 6번 위치에서 선택적으로 산화된 히알루론산의 알데하이드 유도체의 제조는, 비양성자성 매질 중의 산화제 Dess-Martin 페리오디난, 또는 수성 매질 중의 TEMPO 라디칼 + NaClO에 의해 수행될 수 있다. 이어서, 히알루론산의 알데하이드는 광반응성 화학종 (즉, 2-탄소 링커가 결합된 발색단)을 가진 아민의 아미노기와 반응하여, 이민을 형성하며, 이는 수성 매질 또는 물-유기 용매 시스템 중의 환원제 NaBH3CN의 존재 하에 2차 아민으로 한단계로 직접 환원된다. 광반응성 기를 가진 아민은 예를 들어, 1-(2-아미노에틸)피리딘-2(1H)-온일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 히알루론산의 3D 가교된 유도체의 제조 방법에 관한 것으로서, 화학식 (I)로 표시되는 광반응성 유도체를 280-315 nm의 파장에서 전자기 방사선으로 처리한다. 광반응성 유도체는 분말, 동결건조물, 박막, 나노섬유 또는 미세섬유 구조 형태일 수 있다.
더욱이, 본 발명은 화학식 (II)로 표시되는 히알루론산의 3D 가교된 유도체 뿐만 아니라, 조직 공학, 재생 의학, 의료 기기 또는 미용 분야에 있어서의 이의 용도에 관한 것이다:
Figure pct00005
.
따라서, 제조되는 히알루론산의 3D 가교된 구조는 증가된 가수분해 안정성, 양호한 수착성을 나타내며, 공동작용하는 과학적 원리의 요구를 토대로 물성을 보다 설계할 수 있는 여지를 제공한다. 이는 조직 공학 (스캐폴드, 충전물, 약물 담체); 재생 의학 (세포 - 줄기 세포 또는 분화된 세포, 예컨대: 연골 세포, 섬유모세포, 신경 세포 등의 성장을 위한 지지용 나노-구조체 또는 마이크로-구조체); 상처 치유 용도 (나노-구조체, 마이크로-구조체, 부직포, 편물(knitted fabric)은 표면 상처에 대해 생물학적 활성 성분을 조절 방출하는 생분해성 붕대의 제조에 사용될 수 있음); 및 미용분야에서의 광범위한 용도 (예컨대, 얼굴 마스크 제조, 예방 또는 재생 효과를 가진 선 로션의 첨가제)와 같은 개별적인 용도를 수반한다.
도 1은 자외선 조사 전, 한가지 유형의 히알루론산의 광반응성 유도체 (Mw = 25 kDa, DS = 18%)를 3가지 다른 형태로 비교한 것이다. 20℃에서 PBS (pH = 7.4)에서 48시간 동안 팽윤시킨, 광화학적으로 가교된 유도체 (t = 1 h, E = 23400 mJ.cm-2)의 SEM 현미경 분석 사진이다. 상부 - 박막 (T): 범위 2 mm, 500 ㎛, 2 ㎛. 중앙부 - 동결건조물 (L): 범위 (500, 50, 10) ㎛. 하부 - 나노섬유 층 (N): 범위: (500, 50, 10) ㎛.
도 2는 나노섬유 층, 범위 10 ㎛, 배율 3.22 kx (k = 1000), 섬유 직경 189 ± 50 nm 형태의 히알루론산의 광반응성 유도체 (25 kDa, DS = 18%)의 SEM 분석의 현미경 사진이다.
도 3은 물에서 (1h) 동안 팽윤시킨 나노섬유 층, 스케일 20 ㎛, 배율 2.02 kx, (좌측) 형태의 히알루론산의 동결된 광화학적으로 가교된 유도체 (25 kDa, DS = 18%, texp = 1 h, E = 23400 mJ.cm- 2)의 SEM 현미경 분석 사진이다. 자세한 도면은 스캐일 5 ㎛, 배율 5.54 kx, 섬유 직경 314±202 nm (우측)이다.
도 4는 히알루론산의 광반응성 유도체 (Mw = 34 kDa, DS = 20%)의 환경에서 3T3 섬유모세포의 세포 생존율 테스트 결과를 나타낸 것이다. T = 0 h에서의 대조군 (100%)에 대해 백분율로 나타낸 증식 곡선이다. 평가는 n = 6으로 하여 MTT 방법을 5회 반복하여 수행한다.
도 5는 3T3 섬유모세포의 세포 생존율에 대한 UVA (315-380 nm)의 영향을 테스트한 결과이다. 양성 (안트라센) 및 음성 (SDS) 대조군이 존재한다. 평가는 n = 3으로 하여 MTT 방법을 3회 반복하여 수행한다. 성분의 농도는 안트라센 (1-30 ㎍/ml), SDS (1-15 ㎍/ml)이다. 첨가제를 포함하지 않는 대조군 (100%).
도 6은 3T3 섬유모세포의 세포 생존율에 대한 UVA (315-380 nm)의 영향을 테스트한 결과이다. 평가는 n = 5로 하여 MTT 방법을 5회 반복하여 수행한다. 광반응성 유도체 (Mw = 34 kDa, DS = 20%)의 농도는 1, 3, 30, 100, 500, 1000, 5000 ㎍/ml이다. 유도체를 포함하지 않는 대조군 (100%).
도 7은 샘플 1 mg에 대한 히알루론산의 광화학적으로 가교된 유도체 (Mw = 34 kDa, DS = 20%)의 효소적 분해를 나타낸 것으로, 글루코스 헤미아세탈 당량으로 표현한다.
실시예
DS는　NMR (핵 자기 공명)에 의해 측정하고, 하기 등식에 따라 계산하였다: DS = 치환율 = 100% * 결합된 치환기의 몰 양 / 모든 다당류 다이머의 몰 양. 계산은, N-아세틸기의 적분과는 대조적으로 주어진 변형을 특징으로 하는, 글루코사민 서브유닛의 6번 위치에서 2개의 부분입체이성질체성 수소의 적분 값의 상대 비(relative ratio)에 기인한다.
TEMPO 라디칼은 2,2,6,6-테트라메틸피페리디닐옥실 라디칼이다.
샘플의 NMR 스펙트럼은 BRUKER AVANCE 500MHz에서 D2O 또는 CDCl3에서 측정하였다. 화학적 이동은 3-트리메틸실릴프로파노익산 (TSPA)의 중수소화된 나트륨 염의 내부 표준(inner standard)에 대해 보정하였다. 데이터는 소프트웨어 Bruker TOPSPIN 1.2 또는 소프트웨어 Spinworks 3.1.7에 의해 처리하였다.
본원에 사용되는 용어 당량(eq)은 다르게 언급되지 않는 한, 히알루론산의 다이머에 관한 것이다. 백분율은 다르게 언급되지 않는 한, 중량 백분율로서 사용된다.
초기 히알루로난 (소스: Contipro Biotech s.r.o, Dolni Dobrouc, CZ)의 분자량은 SEC-MALLS 방법으로 측정하였다.
FT-IR 스펙트럼은 Nicolet 6700 FTIR 분광계에서 박막 형태 또는 KBr 정제로서 4000 - 400 cm-1 범위에서 측정하였다.
UV-VIS 스펙트럼은 Shimadzu UV-2401PC 장비에서 200-800 nm 범위에서 측정하고, UV Probe 소프트웨어, 버전 2.00에 의해 처리하였다.
동결건조된 샘플의 표면 형태는 주사 전자 현미경 Tescan VEGA II LSU에 의해 검사하였다. 샘플을 20℃에서 측정하고, VegaTC 3.5.2.1 소프트웨어 (10 kV, 작동 거리(working distance) 3.4 mm, 배율 1000-20 kx)에 의해 평가하였다.
광화학적 가교는 방법 A-C에 따라 UV Crosslinker CL-1000M (302 nm, 6.75 mW/cm2)에서 수행하였다.
실시예 1. DMP를 이용한 히알루론산의 산화
건조 DMSO 중의 히알루론산 (2.0 g, 5.29 mmol, Mw = 270 kDa)의 산 형태의 2% 용액을 제조한다. 제조된 용액에 DMP (1.91 g, 4.49 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 5시간 동안 교반한다. 이후, EtOH (3 ml)를 첨가한다. 생성물을 초여과하고 동결건조한다.
Figure pct00006
도식 4: Dess-Martin 페리오디난에 의한 히알루론산의 산화.
DS = 20%, Mw = 34 kDa, 분리된 수율 91%
1H NMR (D2O) δ 5.26 (s, 1H, 폴리머-CH(OH)2) ppm - 저미날 다이올(geminal diol) (수화된 알데하이드)
HSQC (D2O) 가교피크 δ 5.26 ppm (1H) - 90 ppm (13C) 폴리머-CH(OH)2
FT-IR (KBr) 1740 cm-1 -CH=O
실시예 2. Tempo/ NaOCl에 의한 히알루론산의 산화
히알루론산 (5.0 g, 12.50 mmol, Mw = 950 kDa)의 2% (수성) 용액을 제조한다. NaBr (642.5 mg, 6.25 mmol) 및 Na2HPO4.12H2O (9.71 g, 27.12 mmol)를 첨가한다. 반응 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반한다. 반응 혼합물을 5℃로 냉각시킨다. 이어서, 4-아세타미도-TEMPO (26.7 mg, 0.13 mmol) 및 NaClO 용액 (1.47 ml, 6.25 mmol)을 첨가한다. 반응 혼합물을 5℃에서 2시간 동안 교반한다. 그런 다음, EtOH (7.29 ml, 125.0 mmol)를 첨가한다. 생성물을 초여과하고 동결건조한다.
Figure pct00007
도식 5: NaClO의 존재 하에 Tempo 라디칼을 이용한 히알루론산의 산화.
DS = 8%, Mw = 288 kDa, 분리된 수율 82%
1H NMR (D2O) δ 5.26 (s, 1H, 폴리머-CH(OH)2) ppm
HSQC (D2O) 가교피크 δ 5.26 ppm (1H) - 90 ppm (13C) 폴리머-CH(OH)2
FT-IR (KBr) 1740 cm-1 -CH=O
실시예 3. 1 -(2- 아미노에틸 )피리딘-2(1H)-온 ( AEP )의 합성. 2 -( Boc -아미노)에틸브로마이드를 사용한 피리딘-2(1H)-온의 N-알킬화.
피리딘-2(1H)-온 (100.0 mg, 1.051 mmol)을, 교반기, 냉각기 및 불활성 가스가 채워진 벌룬(ballon)이 장착된 3-목 플라스크에서 EtOH (건조) 2 ml에 용해시킨다. KOH (66.1 mg, 1.182 mmol)를 상기 용액에 첨가하고, 반응 혼합물을 30분 동안 교반한다. 그런 다음, 2-(boc-아미노)에틸브로마이드 (313.3 mg, 1.398 mmol)를 첨가한다. 반응 혼합물을 5시간 동안 환류시킨다. 용매를 진공 회전 증발기에서 증발시킨다. 증발 잔류물을 CHCl3 10 ml에 용해시킨다. 25% NH4OH 용액 10 ml을 상기 용액에 첨가한다. 그런 다음, 유기 상을 (2x5ml) H2O 및 (1x5ml) 염수 (통상적으로 사용됨)로 세정한다. 이를 MgSO4로 건조하고, 여과한 다음, 용매를 진공 회전 증발기에서 증발시킨다. 생성물을 농도 구배 (MeOH, CHCl3)를 이용해 Si-겔 상에서 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리한다.
Figure pct00008
도식 6: 피리딘-2(1H)-온의 알킬화.
N-알킬 생성물: terc-부틸 2-(2-옥소피리딘-1(2H)-일)에틸카르바메이트, C12H18N2O3, Mw = 238.283 g/mol, 무색 결정, R F (TB-16-F2) = 0.70 (CHCl3 :　MeOH/ 9 : 1), 분리된 수율 = 41%. 1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 7.31 (ddd, J = 9.0; 6.6; 2.1 Hz, 1H), 7.24-7.26 (m; 1H); 6.54 (d; J = 9.0 Hz; 1H); 6.16 (t; J = 6.6 Hz; 1H); 5.13 (bs; 1H); 4.07 (t; J = 6.0 Hz; 2H); 3.42 (q; J = 6.0 Hz; 2H); 1.39 (s; 9H) ppm
13C NMR (125 MHz; CDCl3): δ = 162.9; 156.1; 139.8; 138.2; 120.8; 106.2; 79.5; 49.3; 39.8; 28.3 (3C) ppm
O-알킬 생성물: terc-부틸 2-(피리딘-2-일옥시)에틸카르바메이트; C12H18N2O3; Mw = 238.283 g/mol; 무색 점성 오일; R F = 0.80 (CHCl3 :　MeOH/ 9 : 1); 분리된 수율 = 5%;
1H NMR (500 MHz; CDCl3):δ = 8.12 (dd; J = 4.9; 1.5 Hz; 1H); 7.55-7.58 (m; 1H); 6.85 (ddd; J = 5.9; 5.1; 0.7 Hz; 1H); 6.72 (t; J = 8.4 Hz; 1H); 4.95 (bs; 1H); 4.36 (t; J = 5.2 Hz; 2H); 3.45 (q; J = 5.2 Hz; 2H); 1.44 (s; 9H) ppm
13C NMR (125 MHz; CDCl3): δ = 163.5; 155.6; 146.9; 138.7; 116.9; 110.9; 81.1; 65.0; 40.2; 27.8 (3C) ppm
실시예 4. terc -부틸 2-(2- 옥소피리딘 -1(2H)-일) 에틸카르바메이트의 탈보호
Boc-아민 (43.0 mg, 0.180 mmol)을 불활성 분위기 N2　하에 다이클로로메탄 (300 ㎕)에 용해시킨다. TFA (275 ㎕, 3.6 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한다. 과량의 트리플루오로아세트산 (b.p. = 72.4℃) 및 다이클로로메탄을 진공 회전 증발기에서 증발시키고, 증발 잔류물을 포화된 NaHCO3 용액으로 중화시킨다. 수용액에, CHCl3 2 ml을 첨가한다. 추출물을 (1x2ml) H2O, (1x2ml) 포화된 NaCl 용액으로 세정하고, MgSO4로 건조시킨다. 반응 혼합물을 여과하고, 진공 회전 증발기에서 증발시킨다.
Figure pct00009
도식 7: terc-부틸 2-(2-옥소피리딘-1(2H)-일)에틸카르바메이트의 탈보호.
1-(2-아미노에틸)피리딘-2(1H)-온, C7H10N2O, Mw = 138.167 g/mol, 황색 액체; R F = 0.18 (CHCl3 :　MeOH/ 1 : 1); 분리된 수율 = 80%,
1H NMR (500 MHz; D2O):δ = 7.65-7.68 (m; 2H); 6.66 (d; J = 9.5 Hz; 1H); 6.72 (dt; J = 6.8; 1.2 Hz; 1H); 4.09 (t; J = 6.1 Hz; 2H); 2.99 (t; J = 6.1 Hz; 2H) ppm
13C NMR (125 MHz; D2O): δ = 167.1; 145.2; 142.2; 122.0; 112.2; 55.1; 42.4 ppm
실시예 5. AEP 2 당량을 사용한 환원적 아민화. 발색단의 바이오폴리머로 의 도입.
산화된 형태의 히알루로난 (100.0 mg, 0.265 mmol, DS = 20%, Mw = 34.4 kDa)을 증류수 10 ml (1% 용액)에 용해시킨다. 상기 용액에, AEP (14.6 mg, 0.106 mmol, 2 eq.)를 첨가한다. 반응 혼합물을 2시간 동안 교반한다. 그런 다음, NaBH3CN (26.5 mg, 0.425 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 12시간 더 교반한다. 최종 용액을 투석한 다음 동결건조한다.
Figure pct00010
도식 8: 환원적 아민화 - 히알루론산의 구조에서 발색단의 결합.
DS = 16%; Mw = 34 kDa; 분리된 수율 65%
1H NMR (D2O+NaOD) δ 2.78 (bs; 1H;폴리머-H6a);2.99 (bs; 1H;폴리머-H6b); 2.94 -3.00 (m; 2H;-NHCH2-); 4.13 - 4.17 (m; 2H;-NCH2-); 6.58 (bs; 1H; Hhetar); 6.66 (bs; 1H; Hhetar); 7.64 - 7.70 (m; 2H; Hhetar) ppm,
H-H COSY (D2O+NaOD) 가교피크 δ 2.78 - 2.99; 3.00 - 4.16; 6.58 - 7.65; 6.66 - 7.69 ppm
HSQC (D2O+NaOD) 가교피크 δ 2.78 (1H) - 49.0 (13C); 2.99 (1H) - 49.0 (13C); 3.00 (1H) - 47.4 (13C); 4.16 (1H) - 50.0 (13C); 6.58 (1H) - 110.2 (13C); 6.66 (1H) - 118.1 (13C); 7.69 (1H) - 136.4 (13C); 7.65 (1H) - 145.0 (13C) ppm
DOSY NMR (D2O+NaOD) log D (2.03 ppm; Me-CO-NH-폴리머) ~ -10.45 m2/s
log D (2.78 ppm; 폴리머-H6a) ~ -10.45 m2/s
log D (2.99 ppm; 폴리머-H6b) ~ -10.45 m2/s
log D (3.00 ppm; -NHCH2-) ~ -10.45 m2/s
log D (4.16 ppm; -NCH2-) ~ -10.45 m2/s
log D (6.58 ppm; Hhetar) ~ -10.45 m2/s
log D (7.65 ppm; Hhetar) ~ -10.45 m2/s
log D (7.65 δ 7.69 ppm; Hhetar) ~ -10.45 m2/s
log D (4.72 ppm; H2O) ~ -8.6 m2/s
FT-IR (KBr) 1654 cm-1 Nhetar-C=O
UV/vis (0.005%; H2O) λmax = 299 nm; n→π* Nhetar-C=O
실시예 6. AEP 1 당량을 사용한 환원적 아민화 .
산화된 형태의 히알루로난 (100.0 mg, 0.265 mmol, DS = 8%, Mw = 288 kDa)을 증류수 (1% 용액) 10 ml에 용해시킨다. 상기 용액에, AEP (3.1 mg, 0.022 mmol, 1 eq.)를 첨가한다. 반응 혼합물을 2시간 동안 교반한다. 그런 다음, NaBH3CN (26.5 mg, 0.425 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 12시간 더 교반한다. 최종 용액을 투석한 다음 동결건조한다.
DS = 3%, Mw = 229 kDa, 분리된 수율 95% (NMR로 측정, 보다 상세히는 실시예 6 참조)
실시예 7. AEP 2 당량 및　2% (aq) 용액을 사용한 환원적 아민화 .
산화된 형태의 히알루로난 (100.0 mg, 0.265 mmol, DS = 20%, Mw = 34.4 kDa)을 증류수 (2% 용액) 5 ml에 용해시킨다. 상기 용액에, AEP를 첨가한다 (14.6 mg, 0.106 mmol, 2 eq.). 반응 혼합물을 2시간 동안 교반한다. 그런 다음, NaBH3CN (26.5 mg, 0.425 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 12시간 더 교반한다. 최종 용액을 투석하고 동결건조한다.
DS = 20%, Mw = 34 kDa, 분리된 수율 74% (NMR로 측정, 보다 상세히는 실시예 6 참조)
실시예 8. AEP 1.5 당량을 사용한 환원적 아민화 ,　 NaHCO 3 1 당량 및 2% (aq) 용액의 첨가.
산화된 형태의 히알루로난 (100.0 mg, 0.265 mmol, DS = 20%, Mw = 34.4 kDa)을 증류수 (2% 용액) 5 ml에 용해시킨다. 상기 용액에, AEP (11.0 mg, 0.080 mmol, 1.5 eq) 및 NaHCO3 (22.2 mg, 0.265 mmol)를 첨가한다. 반응 혼합물을 2시간 동안 교반한다. 그런 다음, NaBH3CN (26.5 mg, 0.425 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 12시간 더 교반한다. 최종 용액을 투석하고 동결건조한다.
DS = 17%, Mw = 31 kDa, 분리된 수율 79% (NMR로 측정, 보다 상세히는 실시예 6 참조)
실시예 9. 히알루론산의 광반응성 유도체의 광화학적 가교 - 방법 A
방사선 조사된 물질은, 히알루론산 (DS = 18%, Mw = 25　kDa)의 광반응성 유도체의 5% (aq) 용액의 증발에 의해 제조한, 박막 형태이다. 상기 용액을 페트리 접시에 파이페팅하고, 40℃에서 열기 드라이어에서 12시간 동안 증발시켰다. 제조된 박막을 페트리 접시에서 알루미늄 호일에 둔 다음, 1시간 동안 방사선 조사하였다 (E = 24300 mJ/cm2). 물질의 노출 후, 이의 물성 (용해도 및 안정성)의 변화를 비-조사된 샘플과 비교해 테스트하였다. 분석은 25℃에서 증류수 및 PBS (pH = 7)에서 수행하였다. 비-용해된 물질을 여과하고, SEM 현미경 분석을 위해 동결건조하였다. 여과물을 증발시키고, NMR에 의해 분석하였다. 노출된 물질의 추출물의 테스트 결과 및 NMR 분석 결과를 표 1에 제시한다. 이미지 분석은 도 1에 제시한다.
샘플
DS		 Mw E 용해도/안정성 젤화/팽윤 NMR 추출물
HA/PEO
시간 [h]
[%] [kDa] [mJ.cm-2] 12 24 36 48
TB-40-L 18 25 24300 -/+ -/+ -/+ -/+ +/+ -/-
TB-40-N 18 25 24300 -/+ -/+ -/+ -/- +/+ -/+
TB-40-T 18 25 24300 -/+ -/+ -/+ -/+ +/+ -/-
TB-39-L 20 15 24300 -/+ -/+ -/+ -/+ +/+ -/-
TB-31-N 20 34 24300 -/+ -/+ -/- -/- +/+ -/+
TB-23-L 3 229 24300 -/+ -/+ -/+ -/+ +/+ -/-
H2O 및 PBS (pH = 7.4)에서 히알루론산의 광화학적으로 가교된 유도체의 분석 결과. L - 동결건조된 형태, N - 나노섬유층, T - 박막. +는 양성 결과를 나타내며, -는 음성 결과를 나타낸다.
실시예 10. 히알루론산의 광반응성 유도체의 광화학적 가 교 - 방법 B
방사선 조사된 물질은, 히알루론산 (DS = 18%, Mw = 25　kDa)의 광반응성 유도체의 5% (aq) 용액의 동결건조에 의해 제조한, 동결건조물 형태였다. 얇은 층 (두께가 약 0.5-1.0 mm) 및 치수 (2 x 2 cm)의 동결건조물을 페트리 접시에서 알루미늄 호일에 두었다. 동결건조물을 1시간 동안 방사선 조사하였다 (E = 24300 mJ/cm2). 물질의 노출 후, 이의 물성 (용해도 및 안정성)의 변화를 비-조사된 샘플과 비교해 테스트하였다. 분석은 25℃에서 증류수 및 인산염 완충액 (PBS - 인산염 완충 식염수, pH = 7)에서 수행하였다. 비-용해된 물질을 여과하고, SEM (주사 전자 현미경) 분석을 위해 동결건조하였다. 여과물을 증발시키고, NMR에 의해 분석하였다. 노출된 물질의 추출물의 테스트 결과 및 NMR 분석 결과를 표 1에 제시한다. 이미지 분석은 도 1에 제시한다.
실시예 11. 히알루론산의 광반응성 유도체의 광화학적 가교 - 방법 C
방사선 조사된 물질은, 평균 기본 중량이 0.3 mg/cm2인 나노섬유 층 형태이다. 나노섬유 층은 Contipro Biotech s.r.o.사에서 제조한 장비 4Spin을 사용해 정전기 스피닝(electrostatic spinning)(전기스피닝)에 의해 제조하였다. 스피닝된 수용액의 농도는 10 중량%였다. 히알루론산의 광반응성 폴리머 (DS = 18%, Mw = 25 kDa)와 지지형(supportive) 폴리머 폴리에틸렌옥사이드 (Mw = 600 kDa)의 상대적인 중량 비는 (80/20)이었다. 크기가 (2 x 2 cm)인 폴리프로필렌 베이스먼트(basement) 텍스타일에 코팅된 나노층을 페트리 접시에서 알루미늄 호일에 두었다. 물질을 1시간 동안 방사선 조사하였다 (E = 24300 mJ/cm2). 물질의 노출 후, 이의 물성 (용해도 및 안정성)의 변화를 비-조사된 샘플과 비교해 테스트하였다. 분석은 25℃에서 증류수 및 PBS (pH = 7)에서 수행하였다. 비-용해된 물질을 여과하고, SEM 현미경 분석을 위해 동결건조하였다. 여과물을 증발시키고, NMR에 의해 분석하였다. 노출된 물질의 추출물의 테스트 결과 및 NMR 분석 결과를 표 1에 제시한다. 사진 분석을 첨부한다 (도 1, 2, 3).
실시예 12. 광반응성 유도체의 세포 생존율 테스트
테스트할 성분 (DS = 18%, Mw = 25 kDa)을 완전 3T3 매질에 용해시켰다. 용액을 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. 용액의 최종 테스트 농도는 100, 500, 1000 ㎍/ml이었다. 밀도가 웰 당 3000개 세포인 3T3 세포를 96-웰 패널에 접종하였다. 테스트 전에, 세포를 완전 세포 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 세포 생존율은 0, 24, 48 및 72시간 간격으로 3-[4,5-다이메틸티아졸-2-일]-2,5-다이페닐 테트라졸륨 브로마이드 (MTT) 방법에 의해 측정하였다. 상기 분석에서, MTT는 살아 있는 세포에 의해 보라색의 수-불용성 포르마잔으로 환원되며, 이는 이후에 분광광도법에 의해 측정된다.
MTT 스탁 용액 (5 mg/ml) 20 ㎕를 각각의 웰에 있는 세포 배양 배지 200 ㎕에 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 열 조절기에서 2.5 시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 세포 위의 부유 용액을 흡인하고, 부피가 220 ㎕인 용해성 용액을 첨가하였다. 용액의 광학 밀도를 Microplate 판독기 VERSAmax에 의해 570 nm (690 nm 배경)에서 측정하였다. 전체 실험에는 다수의 비-처리 대조군과 블랭크 샘플이 보조되었다. 광학 밀도의 측정 데이터를 토대로, T0 시간에서의 대조군과 관련된 백분율 대표값 (처리 샘플의 광학 밀도 / T0에서의 비-처리 대조군의 광학 밀도 x 100) 및 평균의 표준 편차 (SEM)을 계산하였다. 생존율 테스트의 결과를 그래프로 처리하여 첨부한다 (도 4).
실시예 13. 광반응성 유도체의 광독성 테스트
3T3 세포를 웰 당 10000개 세포의 밀도로 96-웰 패널에 접종하였다. 테스트 전에, 세포를 완전 세포 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 세포를 PBS (pH = 7.00)로 세정하고, PBS에 용해시킨 테스트 성분 (테스트 성분 TB-13: DS = 20%, Mw = 34kDa, 1, 3, 30, 100, 500, 1000, 5000 ㎍/ml; 광독성 안트라센-1, 3, 30 ㎍/ml; 비-광독성 SDS-1, 3, 15 ㎍/ml)과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 램프 (Oriel Instruments)를 사용해 0.1 J/cm2 UVA (315-400 nm)의 선량으로 방사선 조사하고, 그 결과를 광도계 PMA 2100 (Solar light Co.)에 의해 측정하였다. 노출 후 10분째에, 상층액을 세포로부터 제거하고, 완전 세포 배지를 첨가하였다. 방사선 조사 후 24시간째에 세포 생존율을 MTT 방법에 의해 분광광도법으로 평가하였다. 테스트 결과를 그래프로 처리하여 첨부한다 (도 5 및 6).
실시예 14. 광화학적으로 가교된 유도체의 생분해성 테스트
히알루론산의 광화학적으로 가교된 유도체: 동결건조물 (L) = 16.3 mg 및 나노층 형태: m (N) = 9.0 mg을 멸균 조건에서 제조한 다음, PBS (pH = 7.38) 2 ml로 오버레이드(overlaid)하고, 24시간 동안 팽윤시켰다. 각 샘플에, BTH (BTH = 소 고환 히알루로니다제, EC 3.2.1.35) 200 U를 첨가하고, 샘플을 37℃에서 43시간 동안 인큐베이션하였다. 0, 4, 8, 19 및 43시간의 시간 간격으로, 각각의 샘플 100 ㎕를 취하고, 최종 분석 때까지 -20℃에 보관하였다. 동시에, 대조군 (PBS + BTH, 및 PBS 중의 순수한 유도체)을 인큐베이션하였다. 대조군 PBS+BTH의 흡광도를 배경 1로서 배제하였다. 팽윤 후 (시간 T = 0) 유도체를 포함하는 완충액의 흡광도는 배경 2로서 배제하였다. 동시에, 순수한 PBS 중의 임의의 효소를 포함하지 않는 순수한 유도체를 포함하는 대조군을 인큐베이션하여, 샘플이 자발적 분해를 수행하는 지 알아보았다. 자유 환원 말단은 하기의 절차에 따라 Somogyi 및　Nelson 테스트에 의해 측정하였다: 샘플 50 ㎕를 동일 부피의 방금 제조한 Somogyi 제제와 혼합하였다. 혼합 후, 혼합물을 100℃에서 15분 동안 서모블록(thermoblock)에서 인큐베이션하였다. 냉각 후, Nelson 제제 100 ㎕를 첨가하고, 샘플을 혼합한 다음, 원심분리하고, 540 nm에서의 이들의 흡광도를 측정하였다. 배경을 배제한 후, 글루코스 당량 값 (자유 환원 말단의 유사체)을 보정 곡선으로부터 측정하였다. 테스트 결과를 그래프로 처리하여 첨부한다 (도 7).

Claims (13)

  1. 화학식 (I)로 표시되는 히알루론산의 광반응성 유도체:
    Figure pct00011

    상기 식에서, R은 수소 또는 알칼리 금속 양이온임.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산 또는 이의 무기 염은 분자량이 1.104 g.mol-1 내지 5.106 g.mol-1 범위인 것을 특징으로 하는, 히알루론산의 광반응성 유도체.
  3. 제1항 또는 제2항에 따른 광반응성 유도체의 제조 방법으로서,
    글루코사민 사이클의 6번 위치에서 산화된 히알루론산의 알데하이드 유도체를 제조하는 단계, 및
    상기 산화된 유도체를 환원제의 존재 하에, 광반응성 화학종을 가진 아민과 반응시켜, 광반응성 유도체를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 광반응성 유도체의 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 히알루론산의 글루코사민 파트의 6번 위치에서 알데하이드의 선택적인 제조를 위해, 비양성자성 매질 중의 Dess-Martin 페리오디난(periodinane) 산화제를 사용하거나 또는 수성 매질 중의 TEMPO 라디칼 + NaClO를 사용하는 것을 특징으로 하는, 광반응성 유도체의 제조 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 히알루론산의 알데하이드 유도체가 광반응성 화학종을 가진 아민의 아미노기와 반응하여, 이민을 형성하며, 형성된 이민은 수성 매질 또는 물-유기 용매 시스템 중의 환원제 NaBH3CN의 존재 하에, 2차 아민으로 한단계로 직접 환원되는 것을 특징으로 하는, 광반응성 유도체의 제조 방법.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 광반응성 화학종을 가진 아민이 1-(2-아미노에틸)피리딘-2(1H)-온인 것을 특징으로 하는, 광반응성 유도체의 제조 방법.
  7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 산화된 히알루론산의 DS가 1% 내지 40% 범위이며,
    제6항에 따른 상기 광반응성 화학종을 가진 2차 아민의 DS가 1% 내지 40%, 바람직하게는 15% 내지 20% 범위인 것을 특징으로 하는, 광반응성 유도체의 제조 방법.
  8. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 히알루론산의 알데하이드 유도체의 1 중량% 내지 2 중량% 수용액을 제조하고, 상기 광반응성 화학종을 가진 아민 1 당량 내지 2 당량을 첨가한 후, 상기 환원제 NaBH3CN 1 당량 내지 3.5 당량을 첨가하여, 화학식 (I)로 표시되는 광반응성 유도체를 제조하는 것을 특징으로 하는, 광반응성 유도체의 제조 방법.
  9. 히알루론산의 3D-가교된 유도체의 제조 방법으로서,
    제1항 또는 제2항에 따른 상기 광반응성 유도체를 280 nm 내지 315 nm의 파장에서 전자기 조사에 노출시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 히알루론산의 3D-가교된 유도체의 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 광반응성 유도체가 분말, 동결건조물, 박막, 나노섬유 구조 또는 미세섬유 구조 형태인 것을 특징으로 하는, 히알루론산의 3D-가교된 유도체의 제조 방법.
  11. 화학식 (II)로 표시되는 히알루론산의 3D-가교된 유도체:
    Figure pct00012
  12. 조직 공학, 재생 의학, 의료 기기 또는 미용 분야에 있어서의, 제11항에 따른 3D-가교된 유도체의 용도.
  13. 세포, 특히 줄기 세포, 또는 연골 세포, 섬유모세포, 신경 세포 및 기타 세포 타입의 분화된 세포의 생장을 위한, 스캐폴드(scaffold), 충전물(filling), 약물 담체, 지지용 나노-구조체 또는 마이크로-구조체로서의; 표면 상처에 대해 생물학적 활성 성분을 조절 방출하는 생분해성 붕대 제조용 나노-구조체, 미세-구조체, 부직포, 편물(knitted fabric)을 제조하기 위한; 얼굴 마스크의 제조에 있어, 또는 예방 또는 재생 효과를 가진 선 로션의 첨가제로서의, 제11항에 따른 3D-가교된 유도체의 용도.
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