KR20100097721A - 항ｎｒ１０ 항체 및 그의 이용 - Google Patents

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Abstract

본 발명자들은, NR10에 대해 유효한 중화활성을 갖는 항NR10 항체를 취득하는 것에 성공하였다. 본 발명에 의해 제공되는 항NR10 항체는, 예를 들면, 염증성 질환의 치료 또는 예방을 위한 의약품으로서 유용하다.

Description

항ＮＲ１０ 항체 및 그의 이용{Anti-NR10 antibody and use thereof}
본 발명은 항NR10 항체, 및 항NR10 항체를 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다.
각종 세포의 증식 분화, 또는 분화 성숙한 세포의 기능의 부활화에 관여하는 액성 인자로서, 수많은 사이토카인의 존재가 알려져 있다. 생체에서는, 사이토카인 자극을 받은 세포가 별도의 사이토카인을 생산하여, 복수의 사이토카인에 의한 네트워크가 형성되어 있다. 생체의 항상성은, 이 네트워크가 상호 서로 조절함으로써, 미묘한 균형 위에 유지되어 있다. 많은 면역 염증성의 질환은, 이들 사이토카인·네트워크의 파탄에 의해 발생한다고 생각되어, 단일클론항체에 의한 항사이토카인요법이 주목되고 있다. 예를 들면, 항TNF 항체나 항IL-6 수용체 항체는, 임상에서 높은 효과를 나타내고 있다. 그러나 한편으로, 실제의 병태에서는 대상경로가 작용하여, IL-4 등 하나의 사이토카인을 차단한 것만으로는 치료효과가 얻어지지 않아, 실패한 예도 많다.
본 발명자들은, IL-6의 시그날 전달수용체 gp130에 상동성이 높은, 신규 사이토카인 수용체 NR10의 단리에 성공하였다(특허문헌 1). NR10은, 온코스타틴 M 수용체(OSMR)와 헤테로다이머를 형성하고, IL-31의 수용체로서 기능한다(비특허문헌 1). IL-31에 대해서는, IL-31을 과잉 발현시킨 형질전환 마우스가 소양성 피부염을 자연 발증하는 것이 보고되어 있다(특허문헌 2).
NR10에 결합하여, IL-31과 NR10의 결합을 저해하는 항체는 염증성 질환의 치료에 유효하다고 생각되나, 항NR10 항체를 임상에서 사용하기 위해서는, 면역원성이 낮은 항체가 필요로 해진다. 또한, 높은 치료효과를 발휘하기 위해, NR10으로의 결합활성 또는 중화활성이 높은 항체가 요망된다.
또한, 본 발명의 선행기술문헌을 이하에 나타낸다.
특허문헌 1: WO00/75314
특허문헌 2: WO03/060090
비특허문헌 1: IL-31 is associated with cutaneous lymphocyte antigen-positive skin homing T cells in patients with atopic dermatitis., J Allergy Clin Immunol. 2006 Feb;117(2):418-25.
본 발명은 전술한 배경에 비추어 이루어진 것으로, 본 발명은 항NR10 항체, 및 항NR10 항체를 포함하는 의약 조성물의 제공을 과제로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하고자, 예의 연구를 행하였다. 본 발명자들은, NR10에 대해 유효한 중화활성을 갖는 항NR10 항체를 취득하는 것에 성공하였다. 또한 본 발명자들은, 항체의 활성을 유지한 상태로 항체를 인간화하는 것에 성공하였다. 또한 본 발명자들은 약물동태가 향상된, 항원으로의 결합활성이 증강된, 안정성이 향상된, 및/또는 면역원성의 리스크가 저감된 항체를 제작하는 것에 성공하였다. 그 항체는 염증성 질환 치료제로서 유용하다.
본 발명은 항NR10 항체, 및 항NR10 항체를 포함하는 의약 조성물에 관한 것이고, 보다 구체적으로는, 이하의 [1]~[15]의 발명을 포함한다.
[1] NR10의 도메인 1을 인식하는 항체.
[2] 중화활성을 갖는 것을 특징으로 하는 [1]에 기재된 항체.
[3] 인간화 항체인 [1] 또는 [2]에 기재된 항체.
[4] 이하의 (1)~(8) 중 어느 하나에 기재된 항NR10 항체;
(1) 서열번호:1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 갖는 항체,
(2) 서열번호:4에 기재된 중쇄 가변영역을 갖는 항체,
(3) 서열번호:5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:7에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
(4) 서열번호:8에 기재된 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
(5) (1)의 중쇄 가변영역 및 (3)의 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
(6) (2)의 중쇄 가변영역 및 (4)의 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
(7) (1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 항체에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로서, (1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체,
(8) (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
[5] 이하의 (1)~(8) 중 어느 하나에 기재된 항NR10 항체;
(1) 서열번호:9에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:10에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:11에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 갖는 항체,
(2) 서열번호:12에 기재된 중쇄 가변영역을 갖는 항체,
(3) 서열번호:13에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:14에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:15에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
(4) 서열번호:16에 기재된 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
(5) (1)의 중쇄 가변영역 및 (3)의 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
(6) (2)의 중쇄 가변영역 및 (4)의 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
(7) (1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 항체에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로서, (1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체,
(8) (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
[6] 이하의 (1)~(8) 중 어느 하나에 기재된 항NR10 항체;
(1) 서열번호:17에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:18에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 갖는 항체,
(2) 서열번호:20에 기재된 중쇄 가변영역을 갖는 항체,
(3) 서열번호:21에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:22에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:23에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
(4) 서열번호:24에 기재된 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
(5) (1)의 중쇄 가변영역 및 (3)의 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
(6) (2)의 중쇄 가변영역 및 (4)의 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
(7) (1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 항체에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로서, (1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체,
(8) (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
[7] 이하의 (1)~(8) 중 어느 하나에 기재된 항NR10 항체;
(1) 서열번호:25에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:26에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:27에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 갖는 항체,
(2) 서열번호:28에 기재된 중쇄 가변영역을 갖는 항체,
(3) 서열번호:29에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:30에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:31에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
(4) 서열번호:32에 기재된 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
(5) (1)의 중쇄 가변영역 및 (3)의 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
(6) (2)의 중쇄 가변영역 및 (4)의 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
(7) (1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 항체에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로서, (1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체,
(8) (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
[8] 이하의 (1)~(20) 중 어느 하나에 기재된 항체 가변영역, 또는 항체;
(1) 서열번호:196에 기재된 CDR1, 서열번호:197에 기재된 CDR2, 서열번호:11에 기재된 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역(H17),
(2) 서열번호:176에 기재된 CDR1, 서열번호:197에 기재된 CDR2, 서열번호:11에 기재된 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역(H19),
(3) 서열번호:196에 기재된 CDR1, 서열번호:197에 기재된 CDR2, 서열번호:184에 기재된 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역(H28, H42),
(4) 서열번호:9에 기재된 CDR1, 서열번호:197에 기재된 CDR2, 서열번호:184에 기재된 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역(H30, H44),
(5) 서열번호:176에 기재된 CDR1, 서열번호:197에 기재된 CDR2, 서열번호:184에 기재된 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역(H34, H46),
(6) 서열번호:9에 기재된 CDR1, 서열번호:198에 기재된 CDR2, 서열번호:184에 기재된 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역(H57, H78),
(7) 서열번호:176에 기재된 CDR1, 서열번호:198에 기재된 CDR2, 서열번호:184에 기재된 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역(H71, H92),
(8) 서열번호:9에 기재된 CDR1, 서열번호:199에 기재된 CDR2, 서열번호:184에 기재된 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역(H97, H98),
(9) 서열번호:200에 기재된 CDR1, 서열번호:170에 기재된 CDR2, 서열번호:193에 기재된 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역(L11),
(10) 서열번호:201에 기재된 CDR1, 서열번호:170에 기재된 CDR2, 서열번호:193에 기재된 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역(L12),
(11) 서열번호:202에 기재된 CDR1, 서열번호:170에 기재된 CDR2, 서열번호:193에 기재된 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역(L17),
(12) 서열번호:203에 기재된 CDR1, 서열번호:170에 기재된 CDR2, 서열번호:193에 기재된 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역(L50),
(13) (3)의 중쇄 가변영역과 (11)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체,
(14) (4)의 중쇄 가변영역과 (11)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체,
(15) (5)의 중쇄 가변영역과 (11)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체,
(16) (6)의 중쇄 가변영역과 (11)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체,
(17) (7)의 중쇄 가변영역과 (11)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체,
(18) (8)의 중쇄 가변영역과 (12)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체,
(19) (13)~(18) 중 어느 하나에 기재된 항체에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로서, (13)~(18) 중 어느 하나에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체,
(20) (13)~(18) 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
[9] 이하의 (1)~(32) 중 어느 하나에 기재된 항체 가변영역 또는 항체;
(1) 서열번호:204에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H17),
(2) 서열번호:205에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H19),
(3) 서열번호:206에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H28),
(4) 서열번호:207에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H30),
(5) 서열번호:208에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H34),
(6) 서열번호:209에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H42),
(7) 서열번호:210에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H44),
(8) 서열번호:211에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H46),
(9) 서열번호:212에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H57),
(10) 서열번호:213에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H71),
(11) 서열번호:214에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H78),
(12) 서열번호:215에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H92),
(13) 서열번호:216에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H97),
(14) 서열번호:217에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H98),
(15) 서열번호:218에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역(L11),
(16) 서열번호:219에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역(L12),
(17) 서열번호:220에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역(L17),
(18) 서열번호:221에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역(L50),
(19) (3)의 중쇄 가변영역과 (17)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H28L17),
(20) (4)의 중쇄 가변영역과 (17)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H30L17),
(21) (5)의 중쇄 가변영역과 (17)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H34L17),
(22) (6)의 중쇄 가변영역과 (17)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H42L17),
(23) (7)의 중쇄 가변영역과 (17)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H44L17),
(24) (8)의 중쇄 가변영역과 (17)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H46L17),
(25) (9)의 중쇄 가변영역과 (17)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H57L17),
(26) (10)의 중쇄 가변영역과 (17)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H71L17),
(27) (11)의 중쇄 가변영역과 (17)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H78L17),
(28) (12)의 중쇄 가변영역과 (17)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H92L17),
(29) (13)의 중쇄 가변영역과 (18)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H97L50),
(30) (14)의 중쇄 가변영역과 (18)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H98L50),
(31) (19)~(30) 중 어느 하나에 기재된 항체에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로서, (19)~(30) 중 어느 하나에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체,
(32) (19)~(30) 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
[10] 인간화 항체인, [4] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 항NR10 항체.
[11] 이하의 (1)~(32) 중 어느 하나의 항체 중쇄, 항체 경쇄, 또는 항체;
(1) 서열번호:222에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H17),
(2) 서열번호:223에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H19),
(3) 서열번호:224에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H28),
(4) 서열번호:225에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H30),
(5) 서열번호:226에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H34),
(6) 서열번호:227에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H42),
(7) 서열번호:228에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H44),
(8) 서열번호:229에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H46),
(9) 서열번호:230에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H57),
(10) 서열번호:231에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H71),
(11) 서열번호:232에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H78),
(12) 서열번호:233에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H92),
(13) 서열번호:234에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H97),
(14) 서열번호:235에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H98),
(15) 서열번호:236에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄(L11),
(16) 서열번호:237에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄(L12),
(17) 서열번호:238에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄(L17),
(18) 서열번호:239에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄(L50),
(19) (3)의 중쇄와 (17)의 경쇄를 포함하는 항체(H28L17),
(20) (4)의 중쇄와 (17)의 경쇄를 포함하는 항체(H30L17),
(21) (5)의 중쇄와 (17)의 경쇄를 포함하는 항체(H34L17),
(22) (6)의 중쇄와 (17)의 경쇄를 포함하는 항체(H42L17),
(23) (7)의 중쇄와 (17)의 경쇄를 포함하는 항체(H44L17),
(24) (8)의 중쇄와 (17)의 경쇄를 포함하는 항체(H46L17),
(25) (9)의 중쇄와 (17)의 경쇄를 포함하는 항체(H57L17),
(26) (10)의 중쇄와 (17)의 경쇄를 포함하는 항체(H71L17),
(27) (11)의 중쇄와 (17)의 경쇄를 포함하는 항체(H78L17),
(28) (12)의 중쇄와 (17)의 경쇄를 포함하는 항체(H92L17),
(29) (13)의 중쇄와 (18)의 경쇄를 포함하는 항체(H97L50),
(30) (14)의 중쇄와 (18)의 경쇄를 포함하는 항체(H98L50),
(31) (19)~(30) 중 어느 하나에 기재된 항체에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로서, (19)~(30) 중 어느 하나에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체,
(32) (19)~(30) 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
[12] [1]~[11] 중 어느 하나에 기재된 항체를 포함하는 의약 조성물.
[13] 염증성 질환 치료제인 [12]에 기재된 의약 조성물.
[14] [1]~[11] 중 어느 하나에 기재된 항체를 투여하는 공정을 포함하는, 염증성 질환의 치료 또는 예방방법.
[15] [1]~[11] 중 어느 하나에 기재된 항체의 염증성 질환 치료제의 제조에 있어서의 사용.
도 1은 마우스 항체 NS18, NS22, NS23, NS33의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열을 나타내는 도면이다.
도 2는 마우스 항체 NS18, NS22, NS23, NS33의 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 나타내는 도면이다.
도 3은 hNR10/hOSMR/BaF3 세포 증식에 대한 하이브리도마 배양상청의 저해에 대해 나타내는 그래프이다.
도 4는 cynNR10/cynOSMR/BaF3 세포 증식에 대한 하이브리도마 배양상청의 저해에 대해 나타내는 그래프이다.
도 5는 키메라 NS22의 활성평가(BaF)에 대해 나타내는 그래프이다.
도 6은 키메라 NS22의 활성평가(DU-145)에 대해 나타내는 그래프이다.
도 7은 키메라 NS22의 IL-31 경합활성평가에 대해 나타내는 그래프이다.
도 8은 항NR10 항체의 NR10 결합 경합활성에 대해 나타내는 그래프이다.
도 9는 인간화 NS22(H0L0)의 IL-31 경합활성에 대해 나타내는 그래프이다.
도 10은 인간화 항NR10 항체 H0L0의 정상영역(constant region)이 미치는 이질성(heterogeneity)으로의 영향을 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 평가한 도면이다.
도 11은 인간화 항NR10 항체의 NR10으로의 결합을 크게 저하시키지 않고, 가변영역의 등전점을 저하시킬 수 있는 변이체의 IL-31 경합활성평가를 나타내는 그래프이다.
도 12는 항IL-6 수용체 항체의 정상영역이 미치는 이질성으로의 영향을 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 평가한 도면이다.
도 13은 항IL-6 수용체 항체의 정상영역이 미치는 변성 피크로의 영향을 DSC에 의해 평가한 도면이다.
도 14는 항IL-6 수용체 항체에 있어서, 신규 정상영역 M14가 미치는 이질성으로의 영향을 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 평가한 도면이다.
도 15는 항IL-6 수용체 항체에 있어서, 신규 정상영역 M58이 미치는 이질성으로의 영향을 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 평가한 도면이다.
도 16은 항IL-6 수용체 항체에 있어서, 신규 정상영역 M58이 미치는 변성 피크로의 영향을 DSC에 의해 평가한 도면이다.
도 17은 huPM1-IgG1 및 huPM1-M58의 인간 FcRn 형질전환 마우스에 있어서의 혈장 중 체류성의 평가결과를 나타내는 도면이다.
도 18은 각 항체에 대해서, BaF/NR10을 사용한 생물활성을 나타내는 그래프이다.
도 19는 얻어진 각 개변 항체의 열 가속품(점선) 및 미 가속품(실선)을 양이온 교환 크로마토그래피로 분석하고, 열 가속 전후에서의 분해물 생성을 비교한 도면이다. 화살표는 변화가 확인된 염기성 성분 피크 위치를 나타낸다.
도 20은 각 개변체의 활성평가(BaF)에 대해 나타내는 그래프이다.
도 21은 Ha401La402, H0L0의 활성평가(BaF)에 대해 나타내는 그래프이다.
도 22는 H17L11, H0L0의 활성평가(BaF)에 대해 나타내는 그래프이다.
도 23은 H19L12, H0L0의 활성평가(BaF)에 대해 나타내는 그래프이다.
도 24는 H0L12 및 H0L17에 대해, BaF/NR10을 사용한 생물활성을 나타내는 그래프이다.
도 25a는 각 개변체의 활성평가(BaF)에 대해 나타내는 그래프이다.
도 25b는 도 25a의 계속되는 도면이다.
도 26은 인간·마우스 야생형 및 키메라 NR10-ECD의 모식도이다.
도 27은 결합 도메인을 웨스턴 블롯을 사용하여 검출한 사진이다. A는 인간화 항인간 NR10 항체에 의해 검출한 결과를 나타내는 사진이고, B는 마우스 항인간 NR10 항체에 의해 검출한 결과를 나타내는 사진이며, C는 항Myc 항체에 의해 검출한 결과를 나타내는 사진이다. 항인간 NR10 항체에 따라서는, hhh, hhm, hmm에만 결합 항원이 검출되고, mmm, mmh, mhm은 결합을 확인할 수 없었다.
도 28a는 H0(서열번호:50)의 각 개변체의 아미노산 서열을 나타내는 도면이다.
도 28b는 도 28a의 계속되는 도면이다.
도 28c는 도 28b의 계속되는 도면이다.
도 29a는 L0(서열번호:52)의 각 개변체의 아미노산 서열을 나타내는 도면이다.
도 29b는 도 29a의 계속되는 도면이다.
NR10
NR10은, 온코스타틴 M 수용체(OSMR)와 헤테로다이머를 형성하고, IL-31의 수용체로서 기능하는 단백질이다. glm-r(J Biol Chem 277, 16831-6, 2002), GPL(J Biol Chem 278, 49850-9, 2003), IL31RA(Nat Immunol 5, 752-60, 2004) 등의 명칭으로도 알려져 있으며, 본 발명의 NR10에는, 이와 같은 명칭으로 불리는 단백질도 포함된다.
본 발명의 NR10(IL31RA, GPL 또는 glm-r로도 불림)의 유래는 특별히 한정되지 않고, 인간, 마우스, 원숭이, 기타 포유동물에 유래하는 NR10이 포함되나, 바람직하게는 인간, 마우스 또는 원숭이 유래의 NR10이고, 특히 바람직하게는 인간 유래의 NR10이다.
인간 유래의 NR10으로서, 복수의 스플라이싱 배리언트가 알려져 있다(WO00/075314). 상기 스플라이싱 배리언트 중, NR10.1은 662 아미노산으로 되고, 세포막 관통영역을 갖는 것을 특징으로 한다. 또한, NR10.2는 252 아미노산 서열로 되는 막 관통영역을 갖지 않는 가용성 수용체 유사 단백질이다. 한편, 세포막 관통형 수용체 단백질로서 기능하는 NR10 스플라이싱 배리언트로서, NR10.3 및 IL31RAv3가 알려져 있다. 본 발명에 있어서의 인간 NR10은, 온코스타틴 M 수용체(OSMR)와 헤테로다이머를 형성하고, IL-31의 수용체로서 기능하는 것이면 특별히 제한되지 않으나, 바람직한 NR10으로서는 NR10.3(ILRAv4로도 불림(Nat Immunol 5, 752-60, 2004)) 및 IL31RAv3를 들 수 있다. NR10.3(IL31RAv4)는 662 아미노산으로 되고(WO00/075314, Nat Immunol 5, 752-60, 2004), IL31RAv3는 732 아미노산으로 된다(GenBank ACCESSION No: NM_139017). IL31RAv4의 아미노산 서열을 서열번호:79에, IL31RAv3의 아미노산 서열을 서열번호:80에 나타낸다. 한편, 마우스 유래의 NR10으로서는, 예를 들면, 서열번호:81에 기재된 아미노산 서열로 되는 단백질을 들 수 있다. 또한, 게잡이원숭이 유래의 NR10으로서는, 예를 들면 서열번호:66에 기재된 아미노산 서열로 되는 단백질을 들 수 있다.
항체(서열)
본 발명의 항NR10 항체의 바람직한 태양으로서, 하기의 (A)~(D)에 있어서의 (1)~(8) 중 어느 하나에 기재된 항NR10 항체를 들 수 있다.
(A) NS18
(1) 서열번호:1(HCDR1)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:2(HCDR2)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:3(HCDR3)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 갖는 항체
(2) 서열번호:4(VH)에 기재된 중쇄 가변영역을 갖는 항체
(3) 서열번호:5(LCDR1)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:6(LCDR2)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:7(LCDR3)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 갖는 항체
(4) 서열번호:8(VL)에 기재된 경쇄 가변영역을 갖는 항체
(5) (1)의 중쇄 가변영역 및 (3)의 경쇄 가변영역을 갖는 항체
(6) (2)의 중쇄 가변영역 및 (4)의 경쇄 가변영역을 갖는 항체
(7) (1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 항체에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로서, (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체
(8) (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체
(B) NS22
(1) 서열번호:9(HCDR1)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:10(HCDR2)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:11(HCDR3)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 갖는 항체
(2) 서열번호:12(VH)에 기재된 중쇄 가변영역을 갖는 항체
(3) 서열번호:13(LCDR1)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:14(LCDR2)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:15(LCDR3)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 갖는 항체
(4) 서열번호:16(VL)에 기재된 경쇄 가변영역을 갖는 항체
(5) (1)의 중쇄 가변영역 및 (3)의 경쇄 가변영역을 갖는 항체
(6) (2)의 중쇄 가변영역 및 (4)의 경쇄 가변영역을 갖는 항체
(7) (1)~(6)중 어느 하나에 기재된 항체에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로서, (1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체
(8) (1)~(7)중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체
전술한 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입의 구체적인 예로서는, 특별히 한정되지 않으나, 이하의 개변을 들 수 있다.
서열번호:9의 중쇄 CDR1에 있어서 3번째의 Ile의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 Val을 들 수 있다.
서열번호:9의 중쇄 CDR1에 있어서 4번째의 Met의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 Ile를 들 수 있다.
서열번호:9의 중쇄 CDR1에 있어서 4번째의 Met의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 Leu를 들 수 있다.
서열번호:9의 중쇄 CDR1에 있어서 3번째의 Ile의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 Ala를 들 수 있다.
서열번호:10의 중쇄 CDR2에 있어서 1번째의 Leu의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 Glu를 들 수 있다.
서열번호:10의 중쇄 CDR2에 있어서 3번째의 Asn의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 Asp를 들 수 있다.
서열번호:10의 중쇄 CDR2에 있어서 13번째의 Gln의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 Asp를 들 수 있다.
서열번호:10의 중쇄 CDR2에 있어서 14번째의 Lys의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 Gln을 들 수 있다.
서열번호:10의 중쇄 CDR2에 있어서 16번째의 Lys의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 Gln을 들 수 있다.
서열번호:10의 중쇄 CDR2에 있어서 17번째의 Gly의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 Asp를 들 수 있다.
서열번호:10의 중쇄 CDR2에 있어서 16번째의 Lys 및 17번째의 Gly의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 16번째의 Lys의 Gln, 17번째의 Gly의 Asp로의 치환을 들 수 있다.
서열번호:10의 중쇄 CDR2에 있어서 14번째의 Lys, 16번째의 Lys 및 17번째의 Gly의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 14번째의 Lys의 Gln, 16번째의 Lys의 Gln, 17번째의 Gly의 Asp로의 치환을 들 수 있다.
서열번호:10의 중쇄 CDR2에 있어서 13번째의 Gln, 14번째의 Lys, 16번째의 Lys 및 17번째의 Gly의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 13번째의 Gln의 Asp, 14번째의 Lys의 Gln, 16번째의 Lys의 Gln, 17번째의 Gly의 Asp로의 치환을 들 수 있다.
서열번호:10의 중쇄 CDR2에 있어서 10번째의 Ser의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 Asp를 들 수 있다.
서열번호:10의 중쇄 CDR2에 있어서 13번째의 Gln의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 Pro를 들 수 있다.
서열번호:11의 중쇄 CDR3에 있어서 3번째의 Tyr의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 Leu를 들 수 있다.
서열번호:11의 중쇄 CDR3에 있어서 10번째의 Met의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 Leu를 들 수 있다.
서열번호:11의 중쇄 CDR3에 있어서 11번째의 Asp의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 Glu를 들 수 있다.
서열번호:11의 중쇄 CDR3에 있어서 12번째의 Tyr의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 Thr 또는 Ser을 들 수 있다.
서열번호:11의 중쇄 CDR3에 있어서, 10번째의 Met, 11번째의 Asp 및 12번째의 Tyr의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나, 바람직한 예로서, 10번째의 Met의 Leu, 11번째의 Asp의 Glu, 및 12번째의 Tyr의 Thr로의 치환을 들 수 있다.
서열번호:11의 중쇄 CDR3에 있어서, 11번째의 Asp 및 12번째의 Tyr의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나, 바람직한 예로서, 11번째의 Asp의 Glu, 및 12번째의 Tyr의 Thr로의 치환을 들 수 있다.
서열번호:11의 중쇄 CDR3에 있어서, 3번째의 Tyr, 11번째의 Asp 및 12번째의 Tyr의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나, 바람직한 예로서, 3번째의 Tyr의 Leu, 11번째의 Asp의 Glu, 및 12번째의 Tyr의 Thr 또는 Ser로의 치환을 들 수 있다.
서열번호:13의 경쇄 CDR1에 있어서 1번째의 Arg의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 Gln을 들 수 있다.
서열번호:13의 경쇄 CDR1에 있어서 5번째의 Asn의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 Asp를 들 수 있다.
서열번호:13의 경쇄 CDR1에 있어서 1번째의 Arg 및 5번째의 Asn의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 1번째의 Arg의 Gln, 5번째의 Asn의 Asp로의 치환을 들 수 있다.
서열번호:13의 경쇄 CDR1에 있어서 8번째의 Ser의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 Arg를 들 수 있다.
서열번호:13의 경쇄 CDR1에 있어서 10번째의 Leu의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 Val을 들 수 있다.
서열번호:13의 경쇄 CDR1에 있어서 8번째의 Ser 및 10번째의 Leu의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 8번째의 Ser의 Arg, 10번째의 Leu의 Val로의 치환을 들 수 있다.
서열번호:13의 경쇄 CDR1에 있어서 2번째의 Thr의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 Ala 또는 Ser을 들 수 있다.
서열번호:14의 경쇄 CDR2에 있어서 1번째의 Asn의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 Asp를 들 수 있다.
서열번호:14의 경쇄 CDR2에 있어서 3번째의 Lys의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 Gln을 들 수 있다.
서열번호:14의 경쇄 CDR2에 있어서 5번째의 Leu의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 Glu를 들 수 있다.
서열번호:14의 경쇄 CDR2에 있어서 7번째의 Lys의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 Gln 또는 Asp를 들 수 있다.
서열번호:14의 경쇄 CDR2에 있어서 3번째의 Lys, 5번째의 Leu 및 7번째의 Lys의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 3번째의 Lys의 Gln, 5번째의 Leu의 Glu, 7번째의 Lys의 Gln으로의 치환을 들 수 있다.
서열번호:15의 경쇄 CDR3에 있어서 5번째의 Glu의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 Asp를 들 수 있다.
서열번호:15의 경쇄 CDR3에 있어서 6번째의 Ser의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 Asp를 들 수 있다.
서열번호:15의 경쇄 CDR3에 있어서 9번째의 Thr의 다른 아미노산으로의 치환. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나 바람직한 예로서 Phe를 들 수 있다.
전술한 치환은 단독으로 행해도 되고, 복수의 치환을 조합해도 된다. 또한, 전술한 치환과 전술한 것 이외의 치환을 조합해도 된다. 이들의 치환에 의해 항체의 약물동태(혈장 중 체류성)의 향상, 항원으로의 결합활성의 증강, 안정성의 향상, 및/또는 면역원성의 리스크의 저감이 가능하다.
본 발명에 있어서 전술한 치환을 조합한 가변영역의 구체예로서는, 서열번호:167의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역 또는 서열번호:168의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 들 수 있다. 또한, 전술한 치환을 조합한 항체의 예로서, 서열번호:167의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호:168의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체를 들 수 있다.
또한, 전술한 치환을 조합한 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 구체예로서, 이하의 가변영역을 들 수 있다.
(a) 서열번호:196에 기재된 CDR1, 서열번호:197에 기재된 CDR2, 서열번호:11에 기재된 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역.(H17)
(b) 서열번호:176에 기재된 CDR1, 서열번호:197에 기재된 CDR2, 서열번호:11에 기재된 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역.(H19)
(c) 서열번호:196에 기재된 CDR1, 서열번호:197에 기재된 CDR2, 서열번호:184에 기재된 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역.(H28, H42)
(d) 서열번호:9에 기재된 CDR1, 서열번호:197에 기재된 CDR2, 서열번호:184에 기재된 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역.(H30, H44)
(e) 서열번호:176에 기재된 CDR1, 서열번호:197에 기재된 CDR2, 서열번호:184에 기재된 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역.(H34, H46)
(f) 서열번호:9에 기재된 CDR1, 서열번호:198에 기재된 CDR2, 서열번호:184에 기재된 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역.(H57, H78)
(g) 서열번호:176에 기재된 CDR1, 서열번호:198에 기재된 CDR2, 서열번호:184에 기재된 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역.(H71, H92)
(h) 서열번호:9에 기재된 CDR1, 서열번호:199에 기재된 CDR2, 서열번호:184에 기재된 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역.(H97, H98)
(i) 서열번호:200에 기재된 CDR1, 서열번호:170에 기재된 CDR2, 서열번호:193에 기재된 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역.(L11)
(j) 서열번호:201에 기재된 CDR1, 서열번호:170에 기재된 CDR2, 서열번호:193에 기재된 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역.(L12)
(k) 서열번호:202에 기재된 CDR1, 서열번호:170에 기재된 CDR2, 서열번호:193에 기재된 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역.(L17)
(l) 서열번호:203에 기재된 CDR1, 서열번호:170에 기재된 CDR2, 서열번호:193에 기재된 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역.(L50)
또한, 전술한 치환을 조합한 항체의 구체예로서, 이하의 항체를 들 수 있다.
(i) (c)의 중쇄 가변영역과 (k)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체
(ii) (d)의 중쇄 가변영역과 (k)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체
(iii) (e)의 중쇄 가변영역과 (k)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체
(iv) (f)의 중쇄 가변영역과 (k)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체
(v) (g)의 중쇄 가변영역과 (k)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체
(vi) (h)의 중쇄 가변영역과 (l)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체
(C) NS23
(1) 서열번호:17(HCDR1)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:18(HCDR2)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:19(HCDR3)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 갖는 항체
(2) 서열번호:20(VH)에 기재된 중쇄 가변영역을 갖는 항체
(3) 서열번호:21(LCDR1)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:22(LCDR2)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:23(LCDR3)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 갖는 항체
(4) 서열번호:24(VL)에 기재된 경쇄 가변영역을 갖는 항체
(5) (1)의 중쇄 가변영역 및 (3)의 경쇄 가변영역을 갖는 항체
(6) (2)의 중쇄 가변영역 및 (4)의 경쇄 가변영역을 갖는 항체
(7) (1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 항체에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로서, (1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체
(8) (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체
(D) NS33
(1) 서열번호:25(HCDR1)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:26(HCDR2)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:27(HCDR3)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 갖는 항체
(2) 서열번호:28(VH)에 기재된 중쇄 가변영역을 갖는 항체
(3) 서열번호:29(LCDR1)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:30(LCDR2)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:31(LCDR3)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 갖는 항체
(4) 서열번호:32(VL)에 기재된 경쇄 가변영역을 갖는 항체
(5) (1)의 중쇄 가변영역 및 (3)의 경쇄 가변영역을 갖는 항체
(6) (2)의 중쇄 가변영역 및 (4)의 경쇄 가변영역을 갖는 항체
(7) (1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 항체에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로서, (1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체
(8) (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체
전술한 (1) 또는 (3)에 기재된 항체에 있어서는 어떠한 프레임워크영역(FR)이 사용되어도 되나, 인간 유래의 FR이 사용되는 것이 바람직하다. 또한, 전술한 (1)~(8)에 기재된 항체에 있어서, 정상영역은 어떠한 정상영역이 사용되어도 되나, 인간 유래의 정상영역이 사용되는 것이 바람직하다. 본 발명의 항체에 사용되는 FR 또는 정상영역의 아미노산 서열은, 유래가 되는 원래의 FR 또는 정상영역의 아미노산 서열을 그대로 사용해도 되고, 1 또는 복수의 아미노산을 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입하는 등 상이한 아미노산 서열로 해서 사용해도 된다.
전술한 NS18의 중쇄의 아미노산 서열을 서열번호:34에, 당해 아미노산 서열을 코드하는 염기서열을 서열번호:33에 나타낸다. 또한 경쇄의 아미노산 서열을 서열번호:36, 당해 아미노산 서열을 코드하는 염기서열을 서열번호:35에 나타낸다.
NS22의 중쇄의 아미노산 서열을 서열번호:38에, 당해 아미노산 서열을 코드하는 염기서열을 서열번호:37에 나타낸다. 또한 경쇄의 아미노산 서열을 서열번호:40, 당해 아미노산 서열을 코드하는 염기서열을 서열번호:39에 나타낸다.
NS23의 중쇄의 아미노산 서열을 서열번호:42에, 당해 아미노산 서열을 코드하는 염기서열을 서열번호:41에 나타낸다. 또한 경쇄의 아미노산 서열을 서열번호:44, 당해 아미노산 서열을 코드하는 염기서열을 서열번호:43에 나타낸다.
NS33의 중쇄의 아미노산 서열을 서열번호:46에, 당해 아미노산 서열을 코드하는 염기서열을 서열번호:45에 나타낸다. 또한 경쇄의 아미노산 서열을 서열번호:48, 당해 아미노산 서열을 코드하는 염기서열을 서열번호:47에 나타낸다.
본 발명에 있어서, 「(1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 항체와 동등한 활성」이란, NR10(예를 들면 인간 NR10)으로의 결합활성 및/또는 중화활성이 동등한 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 「동등」이란, 반드시 동일 정도의 활성일 필요는 없고, 활성이 증강되어 있어도 되고, 또한, 활성을 갖는 한 활성이 감소되어 있어도 된다. 활성이 감소되어 있는 항체로서는, 예를 들면, 원래의 항체와 비교하여 30% 이상의 활성, 바람직하게는 50% 이상의 활성, 보다 바람직하게는 80% 이상의 활성을 갖는 항체를 들 수 있다.
전술한 (1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 항체는, NR10에 대한 결합활성 및/또는 중화활성을 갖는 한, 가변영역(CDR 서열 및/또는 FR 서열)의 아미노산 서열에 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되어 있어도 된다. 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되어 있고, NR10에 대한 결합활성 및/또는 중화활성을 갖는 항체의 아미노산 서열을 조제하기 위한, 당업자에게 잘 알려진 방법으로서는, 단백질에 변이를 도입하는 방법이 알려져 있다. 예를 들면, 당업자라면, 부위 특이적 변이유발법(Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer,W, Drutsa,V, Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz,HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel,TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492) 등을 사용하여, NR10에 대한 결합활성 및/또는 중화활성을 갖는 항체의 아미노산 서열에 적절히 변이를 도입함으로써, NR10에 대한 결합활성 및/또는 중화활성을 갖는 항체와 기능적으로 동등한 변이체를 조제할 수 있다. 이와 같이, 가변영역에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산이 변이되어 있어, NR10에 대한 결합활성 및/또는 중화활성을 갖는 항체도 또한 본 발명의 항체에 포함된다.
아미노산 잔기를 개변하는 경우에는, 아미노산 측쇄의 성질이 보존되어 있는 별도의 아미노산으로 변이되는 것이 바람직하다. 예를 들면 아미노산 측쇄의 성질로서는, 소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 지방족 측쇄를 갖는 아미노산(G, A, V, L, I, P), 수산기 함유 측쇄를 갖는 아미노산(S, T, Y), 황원자 함유 측쇄를 갖는 아미노산(C, M), 카르복실산 및 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산(D, N, E, Q), 염기 함유 측쇄를 갖는 아미노산(R, K, H), 및 방향족 함유 측쇄를 갖는 아미노산(H, F, Y, W)을 들 수 있다(괄호 안은 모두 아미노산의 1문자 표기를 나타냄). 이들의 각 그룹 내의 아미노산의 치환을 보존적 치환이라 부른다. 어느 한 아미노산 서열에 대한 1 또는 복수개의 아미노산 잔기의 결실, 부가 및/또는 다른 아미노산에 의한 치환에 의해 수식된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 그 생물학적 활성을 유지하는 것은 이미 알려져 있다(Mark, D. F. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81:5662-6; Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic Acids Res.(1982)10:6487-500; Wang, A. et al., Science(1984)224:1431-3; Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79:6409-13). 이와 같은 변이체는, 본 발명의 가변영역(예를 들면 CDR 서열, FR 서열, 가변영역 전체)의 아미노산 서열과 70% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 보다 바람직하게는 90% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열의 동일성을 갖는다. 본 명세서에 있어서 서열의 동일성은, 서열 동일성이 최대가 되도록 필요에 따라 서열을 정렬화하고, 적절히 갭 도입한 후, 토대가 된 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열의 잔기와 동일한 잔기의 비율로서 정의된다. 아미노산 서열의 동일성은, 후술하는 방법에 의해 결정할 수 있다.
또한, 가변영역(CDR 서열 및/또는 FR 서열)의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되어 있어, NR10에 대한 결합활성 및/또는 중화활성을 갖는 가변영역의 아미노산 서열은, 그 가변영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기서열로 되는 핵산에 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산으로부터 얻는 것도 가능하다. 가변영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기서열로 되는 핵산에 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산을 단리하기 위한, 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건으로서는, 6M 요소, 0.4% SDS, 0.5×SSC, 37℃의 조건 또는 이것과 동등한 스트린젠시의 하이브리다이제이션 조건을 예시할 수 있다. 보다 스트린젠시가 높은 조건, 예를 들면, 6M 요소, 0.4% SDS, 0.1×SSC의 조건, 42℃를 사용하면, 보다 상동성이 높은 핵산의 단리를 기대할 수 있다. 단리한 핵산의 서열의 결정은, 후술하는 공지의 방법에 의해 행하는 것이 가능하다. 단리된 핵산의 상동성은, 염기서열 전체에서, 적어도 50% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상(예를 들면, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)의 서열의 동일성을 갖는다.
상기 하이브리다이제이션 기술을 이용하는 방법 대신에, 가변영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기서열정보를 토대로 하여 합성한 프라이머를 사용하는 유전자 증폭법, 예를 들면, 폴리머라아제 연쇄반응(PCR)법을 이용하여, 가변영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기서열로 되는 핵산과 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산을 단리하는 것도 가능하다.
염기서열 및 아미노산 서열의 동일성은, Karlin and Altschul에 의한 알고리즘 BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:5873-7)에 의해 결정할 수 있다. 이 알고리즘을 토대로 하여, BLASTN이나 BLASTX로 불리는 프로그램이 개발되어 있다(Altschul et al., J.Mol.Biol.(1990)215:403-10). BLAST를 토대로 하여 BLASTN에 의해 염기서열을 해석하는 경우에는, 파라미터는 예를 들면 score=100, wordlength=12로 한다. 또한, BLAST를 토대로 하여 BLASTX에 의해 아미노산 서열을 해석하는 경우에는, 파라미터는 예를 들면 score=50, wordlength=3으로 한다. BLAST와 Gapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우에는, 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 사용한다. 이들의 해석방법의 구체적인 수법은 공지이다(NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)의 웹사이트를 참조; http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
또한 본 발명은, (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체도 제공한다.
어느 한 항체가 다른 항체와 동일한 에피토프를 인식하는지 여부는, 양자의 에피토프에 대한 경합에 의해 확인할 수 있다. 항체간의 경합은, 경합 결합 어세이에 의해 평가할 수 있고, 그 수단으로서 ELISA, 형광에너지 전이측정법(FRET)이나 형광 미량 측정기술(FMAT(등록상표)) 등을 들 수 있다. 항원에 결합한 이 항체의 양은, 동일한 에피토프로의 결합에 대해 경합하는 후보 경합항체(피검 항체)의 결합능에 간접적으로 상관하고 있다. 즉, 동일한 에피토프에 대한 피검 항체의 양이나 친화성이 클수록, 그 항체의 항원으로의 결합량은 저하되고, 항원으로의 피검 항체의 결합량은 증가한다. 구체적으로는, 항원에 대해, 적당한 표지를 한 그 항체와 평가해야 하는 항체를 동시에 첨가하고, 표지를 이용하여 결합하고 있는 그 항체를 검출한다. 항원에 결합한 그 항체량은, 그 항체를 사전에 표지해 둠으로써, 용이하게 측정할 수 있다. 이 표지는 특별히 제한되지는 않으나, 수법에 따른 표지방법을 선택한다. 표지방법은, 구체적으로는 형광표지, 방사표지, 효소표지 등을 들 수 있다.
예를 들면, NR10을 발현시킨 동물세포에 형광표지한 그 항체와, 비표지의 그 항체 또는 피검 항체를 동시에 첨가하고, 표지된 그 항체를 형광 미량 측정기술에 의해 검출한다.
여기서 말하는 「동일한 에피토프를 인식하는 항체」란, 표지 항체에 대해, 비표지의 그 항체의 결합에 의해 결합량을 50% 저하시키는 농도(IC50)에 대해, 피검 항체가 비표지의 그 항체의 IC50의 통상 100배, 바람직하게는 80배, 더욱 바람직하게는 50배, 더욱 바람직하게는 30배, 보다 바람직하게는 10배 높은 농도에서 적어도 50%, 표지의 그 항체의 결합량을 저하시킬 수 있는 항체이다.
전술한 (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피토프에 결합하는 항체는, 특히 높은 중화활성을 갖는 점에서 유용하다.
전술한 (1)~(8) 중 어느 하나에 기재된 항체는 특별히 한정되지 않으나, 인간화 항체인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 전술한 (A)~(D)에 있어서의 (1)~(8) 중 어느 하나에 기재된 항NR10 항체를 코드하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 어떠한 유전자여도 되고, 예를 들면 DNA여도 되며, RNA여도 된다.
항체(인간화)
본 발명에 있어서의 항체의 바람직한 태양의 하나로서, NR10에 결합하는 인간화 항체를 들 수 있다. 인간화 항체는 당업자에게 기지의 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
항체의 가변영역은, 통상, 4개의 프레임(FR) 사이에 끼인 3개의 상보성 결정영역(complementarity determining region; CDR)으로 구성되어 있다. CDR은, 실질적으로, 항체의 결합 특이성을 결정하고 있는 영역이다. CDR의 아미노산 서열은 다양성이 풍부하다. 한편 FR을 구성하는 아미노산 서열은, 상이한 결합 특이성을 갖는 항체 사이에서도, 높은 상동성을 나타내는 경우가 많다. 그 때문에, 일반적으로, CDR의 이식에 의해, 어느 한 항체의 결합 특이성을, 다른 항체에 이식할 수 있다고 일컬어지고 있다.
인간화 항체는, 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 불리며, 이것은, 인간 이외의 포유동물, 예를 들면 마우스 항체의 CDR을 인간 항체의 상보성 결정영역으로 이식한 것으로, 그 일반적인 유전자 재조합수법도 알려져 있다(유럽 특허출원 공개번호 EP 125023호 공보, WO 96/02576호 공보 참조).
구체적으로는, 예를 들면 CDR이 마우스 항체 유래인 경우에는, 마우스 항체의 CDR과 인간 항체의 프레임워크영역(framework region; FR)을 연결하도록 설계한 DNA 서열을, CDR 및 FR 양쪽의 말단영역에 오버랩되는 부분을 갖도록 제작한 수 개의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하여 PCR법에 의해 합성한다(WO 98/13388호 공보에 기재된 방법을 참조). 얻어진 DNA를 인간 항체 정상영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이어서 발현 벡터에 삽입하여, 이것을 숙주에 도입하고 생산시킴으로써 얻어진다(유럽 특허출원 공개번호 EP 239400, 국제특허출원 공개번호 WO 96/02576 참조).
CDR과 연결되는 인간 항체의 프레임워크영역은, 상보성 결정영역이 양호한 항원 결합부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라, 재구성 인간 항체의 상보성 결정영역이 적절한 항원 결합부위를 형성하도록, 항체의 가변영역에 있어서의 프레임워크영역의 아미노산을 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입해도 된다. 예를 들면, 마우스 CDR의 인간 FR로의 이식에 사용한 PCR법을 응용하여, FR에 아미노산 서열의 변이를 도입할 수 있다. 구체적으로는, FR에 어닐링하는 프라이머에 부분적인 염기서열의 변이를 도입할 수 있다. 이와 같은 프라이머에 의해 합성된 FR에는, 염기서열의 변이가 도입된다. 아미노산을 치환한 변이형 항체의 항원으로의 결합활성을 상기 방법으로 측정하여 평가함으로써 목적하는 성질을 갖는 변이 FR 서열을 선택할 수 있다(Sato, K.etal., CancerRes.(1993)53, 851-856).
인간화 항체의 C영역에는, 인간 항체의 것이 사용되고, 예를 들면 H쇄에서는, Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cμ, Cδ, Cα1, Cα2, Cε를, L쇄에서는 Cκ, Cλ를 사용할 수 있다. Cκ의 아미노산 서열을 서열번호:58에, 당해 아미노산 서열을 코드하는 염기서열을 서열번호:57에 나타낸다. Cγ1의 아미노산 서열을 서열번호:60에, 당해 아미노산 서열을 코드하는 염기서열을 서열번호:59에 나타낸다. Cγ2의 아미노산 서열을 서열번호:62에, 당해 아미노산 서열을 코드하는 염기서열을 서열번호:61에 나타낸다. Cγ4의 아미노산 서열을 서열번호:64에, 당해 아미노산 서열을 코드하는 염기서열을 서열번호:63에 나타낸다. 또한, 항체 또는 그의 생산의 안정성을 개선하기 위해, 인간 항체 C영역을 수식해도 된다. 수식된 인간 항체 C영역의 예로서 후술하는 C영역을 들 수 있다. 인간화시에 사용되는 인간 항체는, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD 등 어떠한 아이소타입의 인간 항체여도 되나, 본 발명에 있어서는 IgG를 사용하는 것이 바람직하다. IgG로서는, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등을 사용하는 것이 가능하다.
또한, 인간화 항체를 제작한 후에, 가변영역(예를 들면, CDR, FR)이나 정상영역 중의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 등 해도 되고, 본 발명의 인간화 항체에는, 그와 같은 아미노산 치환 등 된 인간화 항체도 포함된다.
인간화 항체에 있어서의 CDR의 유래는 특별히 한정되지 않고, 어떤 동물 유래여도 된다. 예를 들면, 마우스 항체, 랫트 항체, 토끼 항체, 낙타 항체 등의 서열을 사용하는 것이 가능하나, 바람직하게는 마우스 항체의 CDR 서열이다.
항체의 인간화에 있어서, 통상, 유래가 된 항체의 결합활성이나 중화활성을 유지한 채로 인간화를 행하는 것은 곤란하나, 본 발명에 있어서는, 유래가 된 마우스 항체와 동등한 결합활성 및/또는 중화활성을 갖는 인간화 항체의 취득에 성공하였다. 인간화 항체는 인간 체내에 있어서의 면역원성이 저하되어 있기 때문에, 치료목적 등으로 인간에 투여하는 경우에 유용하다.
본 발명에 있어서 인간화 항NR10 항체의 바람직한 예로서는, 예를 들면, 이하의 (a)~(e) 중 어느 하나에 기재된 항체를 들 수 있다.
(a) 서열번호:50(H0-VH)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 인간화 항체
(b) 서열번호:112(H1-VH)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 인간화 항체
(c) 서열번호:52(L0-VL)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 인간화 항체
(d) 서열번호:50(H0-VH)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호:52(L0-VL)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 인간화 항체
(e) 서열번호:112의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호:52의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 인간 항체
또한, 서열번호:50(H0-VH)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역, 서열번호:112에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호:52(L0-VL)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역은, 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되어 있어도 된다. 아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입은 CDR 또는 FR에 있어서 행해져도 되고, 또한, CDR과 FR의 양쪽에 있어서 행해져도 된다.
따라서, 본 발명에 있어서 인간화 항NR10 항체의 바람직한 다른 태양으로서, 예를 들면, 이하의 (f)~(j) 중 어느 하나에 기재된 항체를 들 수 있다.
(f) 서열번호:50(H0-VH)의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체
(g) 서열번호:112(H1-VH)의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체
(h) 서열번호:52(L0-VL)의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체
(i) 서열번호:50(H0-VH)의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역, 및 서열번호:52(L0-VL)의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체
(j) 서열번호:112(H1-VH)의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역, 및 서열번호:52(L0-VL)의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체
특별히 한정되지 않으나 (f)~(j) 중 어느 하나에 기재된 항체는, (a)~(e) 중 어느 하나에 기재된 항체와 동일한 활성을 가지고 있는 것이 바람직하다.
아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입은 특별히 한정되지 않으나, 구체적인 예로서, 예를 들면 전술한 아미노산 치환을 행하는 것이 가능하다.
보다 구체적으로는, 예를 들면 이하의 아미노산 치환을 들 수 있다.
서열번호:50 또는 서열번호:112의 중쇄 가변영역에 있어서, CDR1(서열번호:9)의 3번째의 Ile의 Val로의 치환(서열번호:173). 따라서, 본 발명은 서열번호:50 또는 서열번호:112의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:9의 아미노산 서열을 갖는 CDR1이 서열번호:173의 아미노산 서열을 갖는 CDR1으로 치환된 중쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:50 또는 서열번호:112의 중쇄 가변영역에 있어서, CDR1(서열번호:9)의 4번째의 Met의 Ile로의 치환(서열번호:174). 따라서, 본 발명은 서열번호:50 또는 서열번호:112의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:9의 아미노산 서열을 갖는 CDR1이 서열번호:174의 아미노산 서열을 갖는 CDR1으로 치환된 중쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:50 또는 서열번호:112의 중쇄 가변영역에 있어서, CDR1(서열번호:9)의 4번째의 Met의 Leu로의 치환(서열번호:175). 따라서, 본 발명은 서열번호:50 또는 서열번호:112의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:9의 아미노산 서열을 갖는 CDR1이 서열번호:175의 아미노산 서열을 갖는 CDR1으로 치환된 중쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:50 또는 서열번호:112의 중쇄 가변영역에 있어서, CDR1(서열번호:9)의 3번째의 Ile의 Ala로의 치환(서열번호:176). 따라서, 본 발명은 서열번호:50 또는 서열번호:112의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:9의 아미노산 서열을 갖는 CDR1이 서열번호:176의 아미노산 서열을 갖는 CDR1으로 치환된 중쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:50 또는 서열번호:112의 중쇄 가변영역에 있어서, CDR2(서열번호:10)의 1번째의 Leu의 Glu로의 치환(서열번호:113). 따라서, 본 발명은 서열번호:50 또는 서열번호:112의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:10의 아미노산 서열을 갖는 CDR2가 서열번호:113의 아미노산 서열을 갖는 CDR2로 치환된 중쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:50 또는 서열번호:112의 중쇄 가변영역에 있어서, CDR2(서열번호:10)의 3번째의 Asn의 Asp로의 치환(서열번호:114). 따라서, 본 발명은 서열번호:50 또는 서열번호:112의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:10의 아미노산 서열을 갖는 CDR2가 서열번호:114의 아미노산 서열을 갖는 CDR2로 치환된 중쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:50 또는 서열번호:112의 중쇄 가변영역에 있어서, CDR2(서열번호:10)의 13번째의 Gln의 Asp로의 치환(서열번호:115). 따라서, 본 발명은 서열번호:50 또는 서열번호:112의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:10의 아미노산 서열을 갖는 CDR2가 서열번호:115의 아미노산 서열을 갖는 CDR2로 치환된 중쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:50 또는 서열번호:112의 중쇄 가변영역에 있어서, CDR2(서열번호:10)의 14번째의 Lys의 Gln으로의 치환(서열번호:116). 따라서, 본 발명은 서열번호:50 또는 서열번호:112의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:10의 아미노산 서열을 갖는 CDR2가 서열번호:116의 아미노산 서열을 갖는 CDR2로 치환된 중쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:50 또는 서열번호:112의 중쇄 가변영역에 있어서, CDR2(서열번호:10)의 16번째의 Lys의 Gln으로의 치환(서열번호:117). 따라서, 본 발명은 서열번호:50 또는 서열번호:112의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:10의 아미노산 서열을 갖는 CDR2가 서열번호:117의 아미노산 서열을 갖는 CDR2로 치환된 중쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:50 또는 서열번호:112의 중쇄 가변영역에 있어서, CDR2(서열번호:10)의 17번째의 Gly의 Asp로의 치환(서열번호:118). 따라서, 본 발명은 서열번호:50 또는 서열번호:112의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:10의 아미노산 서열을 갖는 CDR2가 서열번호:118의 아미노산 서열을 갖는 CDR2로 치환된 중쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:50 또는 서열번호:112의 중쇄 가변영역에 있어서, CDR2(서열번호:10)의 16번째의 Lys의 Gln으로의 치환 및 17번째의 Gly의 Asp로의 치환(서열번호:119). 따라서, 본 발명은 서열번호:50 또는 서열번호:112의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:10의 아미노산 서열을 갖는 CDR2가 서열번호:119의 아미노산 서열을 갖는 CDR2로 치환된 중쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:50 또는 서열번호:112의 중쇄 가변영역에 있어서, CDR2(서열번호:10)의 14번째의 Lys의 Gln으로의 치환, 16번째의 Lys의 Gln으로의 치환 및 17번째의 Gly의 Asp로의 치환(서열번호:167). 따라서, 본 발명은 서열번호:50 또는 서열번호:112의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:10의 아미노산 서열을 갖는 CDR2가 서열번호:171의 아미노산 서열을 갖는 CDR2로 치환된 중쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:50 또는 서열번호:112의 중쇄 가변영역에 있어서, CDR2(서열번호:10)의 13번째의 Gln의 Asp로의 치환, 14번째의 Lys의 Gln으로의 치환, 16번째의 Lys의 Gln으로의 치환 및 17번째의 Gly의 Asp로의 치환(서열번호:172). 따라서, 본 발명은 서열번호:50 또는 서열번호:112의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:10의 아미노산 서열을 갖는 CDR2가 서열번호:172의 아미노산 서열을 갖는 CDR2로 치환된 중쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:50 또는 서열번호:112의 중쇄 가변영역에 있어서, CDR2(서열번호:10)의 10번째의 Ser의 Asp로의 치환(서열번호:177). 따라서, 본 발명은 서열번호:50 또는 서열번호:112의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:10의 아미노산 서열을 갖는 CDR2가 서열번호:177의 아미노산 서열을 갖는 CDR2로 치환된 중쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:50 또는 서열번호:112의 중쇄 가변영역에 있어서, CDR2(서열번호:10)의 13번째의 Gln의 Pro로의 치환(서열번호:178). 따라서, 본 발명은 서열번호:50 또는 서열번호:112의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:10의 아미노산 서열을 갖는 CDR2가 서열번호:178의 아미노산 서열을 갖는 CDR2로 치환된 중쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:50 또는 서열번호:112의 중쇄 가변영역에 있어서, CDR3(서열번호:11)의 3번째의 Tyr의 Leu로의 치환(서열번호:179). 따라서, 본 발명은 서열번호:50 또는 서열번호:112의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:11의 아미노산 서열을 갖는 CDR3가 서열번호:179의 아미노산 서열을 갖는 CDR3로 치환된 중쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:50 또는 서열번호:112의 중쇄 가변영역에 있어서, CDR3(서열번호:11)의 10번째의 Met의 Leu로의 치환(서열번호:180). 따라서, 본 발명은 서열번호:50 또는 서열번호:112의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:11의 아미노산 서열을 갖는 CDR3가 서열번호:180의 아미노산 서열을 갖는 CDR3로 치환된 중쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:50 또는 서열번호:112의 중쇄 가변영역에 있어서, CDR3(서열번호:11)의 11번째의 Asp의 Glu로의 치환(서열번호:181). 따라서, 본 발명은 서열번호:50 또는 서열번호:112의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:11의 아미노산 서열을 갖는 CDR3가 서열번호:181의 아미노산 서열을 갖는 CDR3로 치환된 중쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:50 또는 서열번호:112의 중쇄 가변영역에 있어서, CDR3(서열번호:11)의 12번째의 Tyr의 Thr로의 치환(서열번호:182). 따라서, 본 발명은 서열번호:50 또는 서열번호:112의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:11의 아미노산 서열을 갖는 CDR3가 서열번호:182의 아미노산 서열을 갖는 CDR3로 치환된 중쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:50 또는 서열번호:112의 중쇄 가변영역에 있어서, CDR3(서열번호:11)의 12번째의 Tyr의 Ser로의 치환(서열번호:183). 따라서, 본 발명은 서열번호:50 또는 서열번호:112의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:11의 아미노산 서열을 갖는 CDR3가 서열번호:183의 아미노산 서열을 갖는 CDR3로 치환된 중쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:50 또는 서열번호:112의 중쇄 가변영역에 있어서, CDR3(서열번호:11)의 10번째의 Met의 Leu로의 치환, 11번째의 Asp의 Glu로의 치환 및 12번째의 Tyr의 Thr로의 치환(서열번호:184). 따라서, 본 발명은 서열번호:50 또는 서열번호:112의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:11의 아미노산 서열을 갖는 CDR3가 서열번호:184의 아미노산 서열을 갖는 CDR3로 치환된 중쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:50 또는 서열번호:112의 중쇄 가변영역에 있어서, CDR3(서열번호:11)의 11번째의 Asp의 Glu로의 치환 및 12번째의 Tyr의 Thr로의 치환(서열번호:185). 따라서, 본 발명은 서열번호:50 또는 서열번호:112의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:11의 아미노산 서열을 갖는 CDR3가 서열번호:185의 아미노산 서열을 갖는 CDR3로 치환된 중쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:50 또는 서열번호:112의 중쇄 가변영역에 있어서, CDR3(서열번호:11)의 3번째의 Tyr의 Leu로의 치환, 11번째의 Asp의 Glu로의 치환 및 12번째의 Tyr의 Thr로의 치환(서열번호:186). 따라서, 본 발명은 서열번호:50 또는 서열번호:112의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:11의 아미노산 서열을 갖는 CDR3가 서열번호:186의 아미노산 서열을 갖는 CDR3로 치환된 중쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:50 또는 서열번호:112의 중쇄 가변영역에 있어서, CDR3(서열번호:11)의 3번째의 Tyr의 Leu로의 치환, 11번째의 Asp의 Glu로의 치환 및 12번째의 Tyr의 Ser로의 치환(서열번호:187). 따라서, 본 발명은 서열번호:50 또는 서열번호:112의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:11의 아미노산 서열을 갖는 CDR3가 서열번호:187의 아미노산 서열을 갖는 CDR3로 치환된 중쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:52의 경쇄 가변영역에 있어서, CDR1(서열번호:13)의 1번째의 Arg의 Gln으로의 치환(서열번호:121). 따라서, 본 발명은 서열번호:52의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:13의 아미노산 서열을 갖는 CDR1이 서열번호:121의 아미노산 서열을 갖는 CDR1으로 치환된 경쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:52의 경쇄 가변영역에 있어서, CDR1(서열번호:13)의 5번째의 Asn의 Asp로의 치환(서열번호:122). 따라서, 본 발명은 서열번호:52의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:13의 아미노산 서열을 갖는 CDR1이 서열번호:122의 아미노산 서열을 갖는 CDR1으로 치환된 경쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:52의 경쇄 가변영역에 있어서, CDR1(서열번호:13)의 8번째의 Ser의 Arg로의 치환(서열번호:188). 따라서, 본 발명은 서열번호:52의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:13의 아미노산 서열을 갖는 CDR1이 서열번호:188의 아미노산 서열을 갖는 CDR1으로 치환된 경쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:52의 경쇄 가변영역에 있어서, CDR1(서열번호:13)의 10번째의 Leu의 Val로의 치환(서열번호:189). 따라서, 본 발명은 서열번호:52의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:13의 아미노산 서열을 갖는 CDR1이 서열번호:189의 아미노산 서열을 갖는 CDR1으로 치환된 경쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:52의 경쇄 가변영역에 있어서, CDR1(서열번호:13)의 8번째의 Ser의 Arg로의 치환 및 10번째의 Leu의 Val로의 치환(서열번호:190). 따라서, 본 발명은 서열번호:52의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:13의 아미노산 서열을 갖는 CDR1이 서열번호:190의 아미노산 서열을 갖는 CDR1으로 치환된 경쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:52의 경쇄 가변영역에 있어서, CDR1(서열번호:13)의 2번째의 Thr의 Ala로의 치환(서열번호:191). 따라서, 본 발명은 서열번호:52의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:13의 아미노산 서열을 갖는 CDR1이 서열번호:191의 아미노산 서열을 갖는 CDR1으로 치환된 경쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:52의 경쇄 가변영역에 있어서, CDR1(서열번호:13)의 2번째의 Thr의 Ser로의 치환(서열번호:192). 따라서, 본 발명은 서열번호:52의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:13의 아미노산 서열을 갖는 CDR1이 서열번호:192의 아미노산 서열을 갖는 CDR1으로 치환된 경쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:52의 경쇄 가변영역에 있어서, CDR2(서열번호:14)의 1번째의 Asn의 Asp로의 치환(서열번호:123). 따라서, 본 발명은 서열번호:52의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:14의 아미노산 서열을 갖는 CDR2가 서열번호:123의 아미노산 서열을 갖는 CDR2로 치환된 경쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:52의 경쇄 가변영역에 있어서, CDR2(서열번호:14)의 3번째의 Lys의 Gln으로의 치환(서열번호:124). 따라서, 본 발명은 서열번호:52의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:14의 아미노산 서열을 갖는 CDR2가 서열번호:124의 아미노산 서열을 갖는 CDR2로 치환된 경쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:52의 경쇄 가변영역에 있어서, CDR2(서열번호:14)의 5번째의 Leu의 Glu로의 치환(서열번호:125). 따라서, 본 발명은 서열번호:52의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:14의 아미노산 서열을 갖는 CDR2가 서열번호:125의 아미노산 서열을 갖는 CDR2로 치환된 경쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:52의 경쇄 가변영역에 있어서, CDR2(서열번호:14)의 7번째의 Lys의 Gln으로의 치환(서열번호:126). 따라서, 본 발명은 서열번호:52의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:14의 아미노산 서열을 갖는 CDR2가 서열번호:126의 아미노산 서열을 갖는 CDR2로 치환된 경쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:52의 경쇄 가변영역에 있어서, CDR2(서열번호:14)의 7번째의 Lys의 Asp로의 치환(서열번호:127). 따라서, 본 발명은 서열번호:52의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:14의 아미노산 서열을 갖는 CDR2가 서열번호:127의 아미노산 서열을 갖는 CDR2로 치환된 경쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:52의 경쇄 가변영역에 있어서, CDR1(서열번호:13)의 1번째의 Arg의 Gln으로의 치환 및 5번째의 Asn의 Asp로의 치환(서열번호:169). 따라서, 본 발명은 서열번호:52의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:13의 아미노산 서열을 갖는 CDR1이 서열번호:169의 아미노산 서열을 갖는 CDR1으로 치환된 경쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:52의 경쇄 가변영역에 있어서, CDR2(서열번호:14)의 3번째의 Lys의 Gln으로의 치환, 5번째의 Leu의 Glu로의 치환 및 7번째의 Lys의 Gln으로의 치환(서열번호:170). 따라서, 본 발명은 서열번호:52의 경쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:14의 아미노산 서열을 갖는 CDR2가 서열번호:170의 아미노산 서열을 갖는 CDR2로 치환된 경쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:52의 경쇄 가변영역에 있어서, CDR3(서열번호:15)의 5번째의 Glu의 Asp로의 치환(서열번호:193). 따라서, 본 발명은 서열번호:52의 경쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:15의 아미노산 서열을 갖는 CDR3가 서열번호:193의 아미노산 서열을 갖는 CDR3로 치환된 경쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:52의 경쇄 가변영역에 있어서, CDR3(서열번호:15)의 6번째의 Ser의 Asp로의 치환(서열번호:194). 따라서, 본 발명은 서열번호:52의 경쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:15의 아미노산 서열을 갖는 CDR3가 서열번호:194의 아미노산 서열을 갖는 CDR3로 치환된 경쇄 가변영역을 제공한다.
서열번호:52의 경쇄 가변영역에 있어서, CDR3(서열번호:15)의 9번째의 Thr의 Phe로의 치환(서열번호:195). 따라서, 본 발명은 서열번호:52의 경쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:15의 아미노산 서열을 갖는 CDR3가 서열번호:195의 아미노산 서열을 갖는 CDR3로 치환된 경쇄 가변영역을 제공한다.
또한, 전술한 아미노산 이외의 치환으로서, 서열번호:97의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 FR2에 있어서 3번째의 Arg의 다른 아미노산으로의 치환을 들 수 있다. 치환 후의 아미노산은 특별히 한정되지 않으나, 바람직한 예로서 Gln을 들 수 있다. 또한, 서열번호:97의 3번째의 Arg를 Gln으로 치환한 경우, 5번째의 Ala를 Ser로 치환하고, FR2를 인간 서열로 하는 것도 가능하다. 서열번호:97의 아미노산 서열에 있어서, 3번째의 Arg를 Gln으로, 5번째의 Ala를 Ser로 치환한 아미노산 서열을 서열번호:120에 나타낸다. 따라서, 본 발명은 서열번호:50 또는 서열번호:112의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역에 있어서, 서열번호:97의 아미노산 서열을 갖는 FR2가 서열번호:120의 아미노산 서열을 갖는 FR2로 치환된 중쇄 가변영역을 제공한다.
전술한 아미노산 치환은 단독으로 사용해도 되고, 전술한 다른 아미노산 치환과 조합해도 된다. 또한, 전술한 것 이외의 아미노산 치환과 조합해도 된다.
전술한 치환이 행해진 항체의 구체적인 예로서, 서열번호:167의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체, 서열번호:168의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체, 서열번호:167의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호:168의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 등을 들 수 있다.
또한, 전술한 치환이 행해진 중쇄 가변영역의 구체예로서, 이하의 중쇄 가변영역을 들 수 있다.
(1) 서열번호:204에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H17)
(2) 서열번호:205에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H19)
(3) 서열번호:206에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H28)
(4) 서열번호:207에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H30)
(5) 서열번호:208에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H34)
(6) 서열번호:209에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H42)
(7) 서열번호:210에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H44)
(8) 서열번호:211에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H46)
(9) 서열번호:212에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H57)
(10) 서열번호:213에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H71)
(11) 서열번호:214에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H78)
(12) 서열번호:215에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H92)
(13) 서열번호:216에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H97)
(14) 서열번호:217에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H98)
또한, 전술한 치환이 행해진 경쇄 가변영역의 구체예로서, 이하의 경쇄 가변영역을 들 수 있다.
(15) 서열번호:218에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역(L11)
(16) 서열번호:219에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역(L12)
(17) 서열번호:220에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역(L17)
(18) 서열번호:221에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역(L50)
추가적으로, 전술한 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 항체의 구체예로서, 이하의 항체를 들 수 있다.
(19) (3)의 중쇄 가변영역과 (17)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H28L17)
(20) (4)의 중쇄 가변영역과 (17)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H30L17)
(21) (5)의 중쇄 가변영역과 (17)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H34L17)
(22) (6)의 중쇄 가변영역과 (17)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H42L17)
(23) (7)의 중쇄 가변영역과 (17)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H44L17)
(24) (8)의 중쇄 가변영역과 (17)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H46L17)
(25) (9)의 중쇄 가변영역과 (17)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H57L17)
(26) (10)의 중쇄 가변영역과 (17)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H71L17)
(27) (11)의 중쇄 가변영역과 (17)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H78L17)
(28) (12)의 중쇄 가변영역과 (17)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H92L17)
(29) (13)의 중쇄 가변영역과 (18)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H97L50)
(30) (14)의 중쇄 가변영역과 (18)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H98L50)
본 발명의 인간화 항체에 사용되는 정상영역은, 인간 항체 유래의 어떠한 정상영역이어도 된다. 인간 항체 유래의 정상영역의 바람직한 예로서는, IgG1 또는 IgG2 유래의 정상영역을 들 수 있다. 또한, 인간 항체 유래의 정상영역에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 정상영역을 사용해도 된다.
인간 항체 유래의 정상영역에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 정상영역은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면, 이하의 정상영역을 들 수 있다.
서열번호:128에 기재된 아미노산 서열을 갖는 정상영역(M58)
서열번호:129에 기재된 아미노산 서열을 갖는 정상영역(M14)
서열번호:62에 기재된 아미노산 서열을 갖는 정상영역(SKSC)
전술한 정상영역을 사용한 중쇄 또는 항체의 구체적인 예로서는, 예를 들면 이하의 중쇄 또는 항체를 들 수 있다.
(1) 서열번호:167의 아미노산 서열을 갖는 가변영역 및 서열번호:128의 아미노산 서열을 갖는 정상영역을 포함하는 중쇄
(2) (1)의 중쇄에 있어서, 서열번호:171의 아미노산 서열을 갖는 CDR2가 서열번호:172의 아미노산 서열을 갖는 CDR2로 치환된 중쇄
(3) (1)의 중쇄와 서열번호:152의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체
(4) (2)의 중쇄와 서열번호:152의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체
본 발명의 인간화 항NR10 항체의 보다 구체적인 예로서, 예를 들면, 이하의 (k)~(o) 중 어느 하나에 기재된 항체를 들 수 있다.
(k) 서열번호:54(H0－VH＋정상영역)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체
(l) 서열번호:130(H1－VH＋정상영역)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체
(m) 서열번호:56(L0－VL＋정상영역)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체
(n) 서열번호:54(H0－VH＋정상영역)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 서열번호:56(L0－VL＋정상영역)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체
(o) 서열번호:130(H1－VH＋정상영역)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 서열번호:56(L0－VL＋정상영역)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체
또한, 서열번호:54(H0－VH＋정상영역)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호:56(L0－VL＋정상영역)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄는, 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되어 있어도 된다. 아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입은 가변영역 또는 정상영역에 있어서 행해져도 되고, 가변영역과 정상영역의 양쪽에서 행해져도 된다.
따라서, 본 발명은 이하의 (p)~(t) 중 어느 하나에 기재된 항체를 제공한다.
(p) 서열번호:54(H0－VH＋정상영역)의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체
(q) 서열번호:130(H1－VH＋정상영역)의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체
(r) 서열번호:56(L0－VL＋정상영역)의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체
(s) 서열번호:54(H0－VH＋정상영역)의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 서열번호:56(L0－VL＋정상영역)의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체
(t) 서열번호:130(H1－VH＋정상영역)의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 서열번호:56(L0－VL＋정상영역)의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체
특별히 한정되지 않으나 (p)~(t) 중 어느 하나에 기재된 항체는, (k)~(o) 중 어느 하나에 기재된 항체와 동일한 활성을 가지고 있는 것이 바람직하다.
아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입은 특별히 한정되지 않으나, 구체적인 예로서, 예를 들면 전술한 아미노산 치환을 행하는 것이 가능하다.
또한 전술한 인간화 중쇄 가변영역의 아미노산 서열(서열번호:50)을 코드하는 염기서열을 서열번호:49에, 인간화 경쇄 가변영역의 아미노산 서열(서열번호:52)을 코드하는 염기서열을 서열번호:51에, 인간화 중쇄의 아미노산 서열(서열번호:54)을 코드하는 염기서열을 서열번호:53에, 인간화 경쇄의 아미노산 서열(서열번호:56)을 코드하는 염기서열을 서열번호:55에 나타낸다.
추가적으로, 본 발명은 전술한 (a)~(t) 중 어느 하나에 기재된 항체가 인식하는 에피토프와 동일한 에피토프를 인식하는 항체를 제공한다. 동일한 에피토프로의 결합에 대해서는 앞서 기재한 바와 같다.
또한, 본 발명은 이하의 (u)~(w) 중 어느 하나에 기재된 항체를 제공한다.
(u) 서열번호:151에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체
(v) 서열번호:152에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체
(w) (u)의 중쇄와 (v)의 경쇄를 포함하는 항체
추가적으로 본 발명은 이하 중 어느 하나에 기재된 중쇄, 경쇄, 또는 항체를 제공한다.
(1) 서열번호:222에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H17)
(2) 서열번호:223에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H19)
(3) 서열번호:224에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H28)
(4) 서열번호:225에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H30)
(5) 서열번호:226에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H34)
(6) 서열번호:227에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H42)
(7) 서열번호:228에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H44)
(8) 서열번호:229에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H46)
(9) 서열번호:230에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H57)
(10) 서열번호:231에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H71)
(11) 서열번호:232에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H78)
(12) 서열번호:233에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H92)
(13) 서열번호:234에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H97)
(14) 서열번호:235에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H98)
(15) 서열번호:236에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄(L11)
(16) 서열번호:237에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄(L12)
(17) 서열번호:238에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄(L17)
(18) 서열번호:239에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄(L50)
(19) (3)의 중쇄와 (17)의 경쇄를 포함하는 항체(H28L17)
(20) (4)의 중쇄와 (17)의 경쇄를 포함하는 항체(H30L17)
(21) (5)의 중쇄와 (17)의 경쇄를 포함하는 항체(H34L17)
(22) (6)의 중쇄와 (17)의 경쇄를 포함하는 항체(H42L17)
(23) (7)의 중쇄와 (17)의 경쇄를 포함하는 항체(H44L17)
(24) (8)의 중쇄와 (17)의 경쇄를 포함하는 항체(H46L17)
(25) (9)의 중쇄와 (17)의 경쇄를 포함하는 항체(H57L17)
(26) (10)의 중쇄와 (17)의 경쇄를 포함하는 항체(H71L17)
(27) (11)의 중쇄와 (17)의 경쇄를 포함하는 항체(H78L17)
(28) (12)의 중쇄와 (17)의 경쇄를 포함하는 항체(H92L17)
(29) (13)의 중쇄와 (18)의 경쇄를 포함하는 항체(H97L50)
(30) (14)의 중쇄와 (18)의 경쇄를 포함하는 항체(H98L50)
(31) (1)~(14) 중 어느 하나에 기재된 중쇄에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 갖는 중쇄
(32) (15)~(18) 중 어느 하나에 기재된 경쇄에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 갖는 경쇄
(33) (19)~(30) 중 어느 하나에 기재된 항체에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 갖는 항체
(34) (19)~(33) 중 어느 하나에 기재된 항체가 인식하는 에피토프와 동일한 에피토프를 인식하는 항체.
아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입에 대해서는 전술한 바와 같다. 또한, 어느 한 항체가 인식하는 에피토프와 동일한 에피토프를 인식하는 항체는 전술한 바와 같다.
또한 본 발명은, 본 발명의 가변영역, 본 발명의 중쇄, 본 발명의 경쇄 또는 본 발명의 항체를 코드하는 유전자를 제공한다.
또한 본 발명은, 전술한 유전자를 포함하는 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은, 전술한 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
또한 본 발명은, 전술한 숙주세포를 배양하는 공정을 포함하는, 본 발명의 가변영역, 본 발명의 중쇄, 본 발명의 경쇄 또는 본 발명의 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
벡터, 숙주세포, 숙주세포의 배양에 대해서는 후술하는 바와 같다.
도메인 인식 항체
본 발명에 있어서의 항NR10 항체의 바람직한 태양의 하나로서 도메인 1을 인식하는 항체, 또는 도메인 2를 인식하는 항체를 들 수 있다. 본 발명에 있어서 도메인 1이란 서열번호:76에 기재된 인간 NR10의 아미노산 서열에 있어서 시그날 펩티드를 포함하고 있는 상태에서의 번호로 21번째의 아미노산에서 120번째의 아미노산까지의 영역(LPAKP~LENIA)을 말한다. 또한, 본 발명에 있어서 도메인 2란 서열번호:76에 기재된 인간 NR10의 아미노산 서열에 있어서 시그날 펩티드를 포함하고 있는 상태에서의 번호로 121번째의 아미노산에서 227번째의 아미노산까지의 영역(KTEPP~EEEAP)을 말한다.
이와 같은 항체는 특별히 한정되지 않으나, 통상, 중화활성을 가지고 있는 항체로, 바람직하게는 인간화 항체이다.
본 발명에 있어서 바람직한 항체의 예로서, 도메인 1을 인식하는 항체를 들 수 있다. 도메인 1을 인식하는 항체는 높은 중화활성을 가지고 있어, 의약품으로서 특히 유용하다.
항체(중화활성)
본 발명은 추가적으로 중화활성을 갖는 항NR10 항체를 제공한다.
본 발명에 있어서 NR10에 대한 중화활성이란, NR10과 그의 리간드인 IL-31의 결합을 저해하는 활성으로, 바람직하게는 NR10에 기인하는 생리활성을 억제하는 활성이다.
NR10 중화활성을 갖는 항체의 선별은, 예를 들면, IL-31 의존성 세포주에 후보의 항체를 첨가했을 때의, 그 IL-31 의존성 세포주의 증식억제효과를 관찰하는 방법에 의해 행하는 것이 가능하다. 상기 방법에 있어서 IL-31 의존성 세포주의 증식을 억제하는 항체는, NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체라고 판단된다.
항체(일반)
본 발명의 항체는, 그 유래에 한정되지 않고, 인간 항체, 마우스 항체, 랫트 항체 등, 어떠한 동물 유래의 항체여도 된다. 또한, 키메라(chimeric) 항체나 인간화(humanized) 항체 등의 재조합 항체여도 된다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 항체로서 인간화 항체를 들 수 있다.
키메라 항체는, 인간 이외의 포유동물, 예를 들면, 마우스 항체의 중쇄, 경쇄의 가변영역과 인간 항체의 중쇄, 경쇄의 정상영역으로 되는 항체이다. 키메라 항체는, 기지의 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 항체 유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하여, 적당한 벡터에 삽입하고, 이것을 숙주에 도입함으로써 행하는 것이 가능하다(예를 들면, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 참조). 구체적으로는, 하이브리도마의 mRNA로부터 역전사효소를 사용하여 항체의 가변영역(V영역)의 cDNA를 합성한다. 목적으로 하는 항체의 V영역을 코드하는 DNA가 얻어지면, 이것을 목적하는 인간 항체 정상영역(C영역)을 코드하는 DNA와 연결하고, 이것을 발현 벡터에 삽입한다. 또는, 항체의 V영역을 코드하는 DNA를, 인간 항체 C영역의 DNA를 포함하는 발현 벡터에 삽입해도 된다. 발현제어영역, 예를 들면, 인핸서, 프로모터의 제어하에서 발현하도록 발현 벡터에 삽입한다. 다음으로, 이 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환하여, 키메라 항체를 발현시킬 수 있다.
또한, 인간 항체의 취득방법도 알려져 있다. 예를 들면, 인간 림프구를 인 비트로에서 목적하는 항원 또는 목적하는 항원을 발현하는 세포로 감작하고, 감작 림프구를 인간 골수종 세포, 예를 들면 U266과 융합시켜, 항원으로의 결합활성을 갖는 목적하는 인간 항체를 얻는 것도 가능하다(일본국 특허공고 평1-59878 참조). 또한, 인간 항체 유전자의 모든 레퍼토리를 갖는 형질전환 동물을 목적하는 항원으로 면역함으로써 목적하는 인간 항체를 취득할 수 있다(국제특허출원 공개번호 WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735 참조).
또한, 인간 항체 파지 라이브러리를 사용하여, 패닝법에 의해 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들면, 인간 항체의 가변영역을 단일쇄 항체(scFv)로서 파지 디스플레이법에 의해 파지의 표면에 발현시키고, 항원에 결합하는 파지를 선택할 수 있다. 선택된 파지의 유전자를 해석하면, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변영역을 코드하는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열이 명확해지면, 당해 서열을 갖는 적당한 발현 벡터를 제작하여, 인간 항체를 취득할 수 있다. 이들의 방법은 주지로, WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388 등을 참고로 할 수 있다.
본 발명의 항체에는, NR10으로의 결합활성 및/또는 중화활성을 갖는 한, IgG로 대표되는 2가 항체뿐 아니라, 1가 항체, 또는 IgM으로 대표되는 다가 항체, 또는 상이한 항원에 결합할 수 있는 Bispecific 항체도 포함된다. 본 발명의 다가 항체에는, 전부 동일한 항원 결합부위를 갖는 다가 항체, 또는, 일부 또는 전부 상이한 항원 결합부위를 갖는 다가 항체가 포함된다. 본 발명의 항체는, 항체의 전장 분자에 한정되지 않고, NR10 단백질에 결합하는 한, 저분자화 항체 또는 그의 수식물이어도 된다.
또한 본 발명에 있어서의 항체는, 저분자화 항체여도 된다. 저분자화 항체는, 전장 항체(whole antibody, 예를 들면 whole IgG 등)의 일부분이 결손되어 있는 항체 단편을 포함하는 항체로, NR10으로의 결합활성 및/또는 중화활성을 갖는 한 특별히 한정되지 않는다. 본 발명에 있어서 저분자화 항체는, 전장 항체의 일부분을 포함하는 한 특별히 한정되지 않으나, 중쇄 가변영역(VH) 또는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하고 있는 것이 바람직하고, 특히 바람직하게는 VH와 VL의 양쪽을 포함하는 저분자화 항체이다. 또한, 본 발명의 저분자화 항체의 다른 바람직한 예로서, 항체의 CDR을 포함하는 저분자화 항체를 들 수 있다. 저분자화 항체에 포함되는 CDR은 항체의 6개의 CDR 전부가 포함되어 있어도 되고, 일부의 CDR이 포함되어 있어도 된다.
본 발명에 있어서의 저분자화 항체는, 전장 항체보다도 분자량이 작아지는 것이 바람직하나, 예를 들면, 다이머, 트리머, 테트라머 등의 다량체를 형성하는 경우 등도 있어, 전장 항체보다도 분자량이 커지는 경우도 있다.
항체 단편의 구체예로서는, 예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 등을 들 수 있다. 또한, 저분자화 항체의 구체예로서는, 예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv(single chain Fv), Diabody, sc(Fv)2(single chain(Fv)2) 등을 들 수 있다. 이들 항체의 다량체(예를 들면, 다이머, 트리머, 테트라머, 폴리머)도, 본 발명의 저분자화 항체에 포함된다.
항체 단편은, 예를 들면, 항체를 효소로 처리하여 항체 단편을 생성시킴으로써 얻을 수 있다. 항체 단편을 생성하는 효소로서, 예를 들면 파파인, 펩신, 또는 플라스민 등이 공지이다. 또는, 이들 항체 단편을 코드하는 유전자를 구축하고, 이것을 발현 벡터에 도입한 후, 적당한 숙주세포에서 발현시킬 수 있다(예를 들면, Co, M.S. et al., J. Immunol.(1994)152, 2968-2976, Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology(1989)178, 476-496, Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology(1989)178, 476-496, Lamoyi, E., Methods in Enzymology(1989)121, 652-663, Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology(1989)121, 663-669, Bird, R. E. et al., TIBTECH(1991)9, 132-137 참조).
소화 효소는, 항체 단편의 특정 위치를 절단하고, 다음과 같은 특정 구조의 항체 단편을 부여한다. 이와 같은 효소적으로 얻어진 항체 단편에 대해, 유전자 공학적 수법을 이용하면, 항체의 임의의 부분을 결실시킬 수 있다.
전술한 소화 효소를 사용한 경우에 얻어지는 항체 단편은 이하와 같다.
파파인 소화: F(ab)2 또는 Fab
펩신 소화: F(ab')2 또는 Fab'
플라스민 소화: Facb
본 발명에 있어서의 저분자화 항체는, NR10으로의 결합활성 및/또는 중화활성을 갖는 한, 임의의 영역을 결실한 항체 단편을 포함할 수 있다.
디아바디(Diabody)는, 유전자 융합에 의해 구축된 2가(bivalent)의 항체 단편을 가리킨다(Holliger P et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448(1993), EP404,097호, WO93/11161호 등). 디아바디는, 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성되는 다이머이다. 통상, 다이머를 구성하는 폴리펩티드 사슬은, 각각, 동일한 사슬 중에서 VL 및 VH가 링커에 의해 결합되어 있다. 디아바디에 있어서의 링커는, 일반적으로, VL과 VH가 서로 결합할 수 없을 만큼 짧다. 구체적으로는, 링커를 구성하는 아미노산 잔기는, 예를 들면, 5잔기 정도이다. 그 때문에, 동일 폴리펩티드 사슬 상에 코드되는 VL과 VH는, 단쇄 가변영역 프래그먼트를 형성할 수 없어, 별도의 단쇄 가변영역 프래그먼트와 이량체를 형성한다. 그 결과, 디아바디는 2개의 항원 결합부위를 갖게 된다.
scFv 항체는, 중쇄 가변영역([VH]) 및 경쇄 가변영역([VL])을 링커 등으로 결합하여 단일쇄 폴리펩티드로 한 항체이다(Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1988) 85, 5879-5883, Plickthun「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies」Vol.113, Resenburg 및 Moore편, Springer Verlag, New York, pp.269-315,(1994)). scFv에 있어서의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역은, 본 명세서에 기재된 어느 항체 유래여도 된다. V영역을 연결하는 펩티드 링커에는, 특별히 제한은 없다. 예를 들면 3~25 잔기 정도로 되는 임의의 단일쇄 펩티드를 링커로서 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 후술하는 펩티드 링커 등을 사용할 수 있다.
양쇄의 V영역은, 예를 들면 상기와 같은 PCR법에 의해 연결할 수 있다. PCR법에 의한 V영역의 연결을 위해, 먼저 다음 DNA 중, 전부 또는 목적하는 부분 아미노산 서열을 코드하는 DNA가 주형으로서 이용된다.
항체의 H쇄 및 H쇄 V영역을 코드하는 DNA 서열, 및
항체의 L쇄 및 L쇄 V영역을 코드하는 DNA 서열
증폭해야 하는 DNA의 양단의 서열에 대응하는 서열을 갖는 프라이머의 한 쌍을 사용한 PCR법에 의해, H쇄와 L쇄의 V영역을 코드하는 DNA가 각각 증폭된다. 이어서, 펩티드 링커부분을 코드하는 DNA를 준비한다. 펩티드 링커를 코드하는 DNA도 PCR을 이용하여 합성할 수 있다. 이때 이용하는 프라이머의 5'측에, 별도로 합성된 각 V영역의 증폭산물과 연결할 수 있는 염기서열을 부가해 둔다. 이어서, [H쇄 V영역 DNA]－[펩티드 링커 DNA]－[L쇄 V영역 DNA]의 각 DNA와, 어셈블리 PCR용 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 행한다.
어셈블리 PCR용 프라이머는, [H쇄 V영역 DNA]의 5'측에 어닐링하는 프라이머와, [L쇄 V영역 DNA]의 3'측에 어닐링하는 프라이머의 조합으로 된다. 즉 어셈블리 PCR용 프라이머란, 합성해야 하는 scFv의 전장 서열을 코드하는 DNA를 증폭할 수 있는 프라이머 세트이다. 한편 [펩티드 링커 DNA]에는 각 V영역 DNA와 연결할 수 있는 염기서열이 부가되어 있다. 그 결과, 이들 DNA가 연결되고, 추가적으로 어셈블리 PCR용 프라이머에 의해, 최종적으로 scFv의 전장이 증폭산물로서 생성된다. 일단 scFv를 코드하는 DNA가 제작되면, 그들을 함유하는 발현 벡터, 및 그 발현 벡터에 의해 형질전환된 재조합 세포를 통상의 방법에 따라 취득할 수 있다. 또한, 그 결과 얻어지는 재조합 세포를 배양하여 그 scFv를 코드하는 DNA를 발현시킴으로써, 그 scFv를 취득할 수 있다.
결합되는 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 순서는 특별히 한정되지 않고, 어떤 순서로 나열되어 있어도 되며, 예를 들면, 이하와 같은 배치를 들 수 있다.
[VH]링커[VL]
[VL]링커[VH]
sc(Fv)2는, 2개의 VH 및 2개의 VL을 링커 등으로 결합하여 단일쇄로 한 저분자화 항체이다(Hudson et al, J Immunol. Methods 1999;231:177-189). sc(Fv)2는, 예를 들면, scFv를 링커로 연결함으로써 제작할 수 있다.
또한 2개의 VH 및 2개의 VL이, 단일쇄 폴리펩티드의 N 말단측을 기점으로 하여 VH, VL, VH, VL([VH]링커[VL]링커[VH]링커[VL])의 순서로 나열되어 있는 것을 특징으로 하는 항체가 바람직하나, 2개의 VH와 2개의 VL의 순서는 특별히 상기 배치에 한정되지 않고, 어떠한 순서로 나열되어 있어도 된다. 예를 들면 이하와 같은 배치도 들 수 있다.
[VL]링커[VH]링커[VH]링커[VL]
[VH]링커[VL]링커[VL]링커[VH]
[VH]링커[VH]링커[VL]링커[VL]
[VL]링커[VL]링커[VH]링커[VH]
[VL]링커[VH]링커[VL]링커[VH]
저분자 항체 중의 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은, 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되어 있어도 된다. 또한, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 회합시킨 경우에, 항원 결합활성을 갖는 한, 일부를 결손시켜도 되고, 다른 폴리펩티드를 부가해도 된다. 또한, 가변영역은 키메라화나 인간화되어 있어도 된다.
본 발명에 있어서, 항체의 가변영역을 결합하는 링커는, 유전자 공학에 의해 도입할 수 있는 임의의 펩티드 링커, 또는 합성 화합물 링커, 예를 들면, Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996에 개시되는 링커를 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서 바람직한 링커는 펩티드 링커이다. 펩티드 링커의 길이는 특별히 한정되지 않고, 목적에 따라 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하나, 통상, 1~100 아미노산, 바람직하게는 3~50 아미노산, 더욱 바람직하게는 5~30 아미노산, 특히 바람직하게는 12~18 아미노산(예를 들면, 15 아미노산)이다.
펩티드 링커의 아미노산 서열로서는, 예를 들면, 이하와 같은 서열을 들 수 있다.
Ser
Gly·Ser
Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호:82)
Ser·Gly·Gly·Gly(서열번호:83)
Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호:84)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호:85)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호:86)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호:87)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호:88)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호:89)
(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호:84))n
(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호:85))n
[n은 1 이상의 정수이다] 등을 들 수 있다.
펩티드 링커의 아미노산 서열은, 목적에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 예를 들면 상기의 펩티드 링커의 길이를 결정하는 n은, 통상 1~5, 바람직하게는 1~3, 보다 바람직하게는 1 또는 2이다.
합성 화합물 링커(화학가교제)는, 펩티드의 가교에 통상 사용되고 있는 가교제, 예를 들면, N-히드록시숙신이미드(NHS), 디숙신이미딜스베레이트(DSS), 비스(설포숙신이미딜)스베레이트(BS3), 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)(DSP), 디티오비스(설포숙신이미딜프로피오네이트)(DTSSP), 에틸렌글리콜 비스(숙신이미딜숙시네이트)(EGS), 에틸렌글리콜 비스(설포숙신이미딜숙시네이트)(설포-EGS), 디숙신이미딜 타르타르산염(DST), 디설포숙신이미딜 타르타르산염(설포-DST), 비스[2-(숙신이미드옥시카르보닐옥시)에틸]설폰(BSOCOES), 비스[2-(설포숙신이미드옥시카르보닐옥시)에틸]설폰(설포-BSOCOES) 등이고, 이들의 가교제는 시판되고 있다.
4개의 항체 가변영역을 결합하는 경우에는, 통상, 3개의 링커가 필요해진다. 복수의 링커는, 동일해도 되고, 상이한 링커를 사용하는 것도 가능하다.
본 발명의 항체에는, 본 발명의 항체의 아미노산 서열에 1 또는 복수개의 아미노산 잔기가 부가된 항체도 포함된다. 또한, 이들 항체와 다른 펩티드 또는 단백질이 융합된 융합 단백질도 포함된다. 융합 단백질을 제작하는 방법은, 본 발명의 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드와 다른 펩티드 또는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 프레임이 일치하도록 연결하여 이것을 발현 벡터에 도입하고, 숙주에서 발현시키면 되기에, 당업자에게 공지의 방법을 사용할 수 있다. 본 발명의 항체와의 융합에 부여되는 다른 펩티드 또는 폴리펩티드로서는, 예를 들면, FLAG(Hopp, T. P. et al., BioTechnology(1988) 6, 1204-1210), 6개의 His(히스티딘) 잔기로 되는 6×His, 10×His, 인플루엔자 응집소(HA), 인간 c-myc의 단편, VSV-GP의 단편, p18HIV의 단편, T7-tag, HSV-tag, E-tag, SV40T 항원의 단편, lck tag, α-tubulin의 단편, B-tag, Protein C의 단편 등의 공지의 펩티드를 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체와의 융합에 부여되는 다른 폴리펩티드로서는, 예를 들면, GST(글루타티온-S-트랜스페라아제), HA(인플루엔자 응집소), 면역글로블린 정상영역, β-갈락토시다아제, MBP(말토오스 결합 단백질) 등을 들 수 있다. 시판되고 있는 이들 펩티드 또는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를, 본 발명의 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드와 융합시키고, 이것에 의해 조제된 융합 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써, 융합 폴리펩티드를 조제할 수 있다.
또한 본 발명의 항체는, 폴리에틸렌글리콜(PEG)이나 히알루론산 등의 고분자물질, 방사성물질, 형광물질, 발광물질, 효소, 톡신 등의 각종 분자와 결합한 콘쥬게이트 항체여도 된다. 이와 같은 콘쥬게이트 항체는, 얻어진 항체에 화학적인 수식을 행함으로써 얻을 수 있다. 또한, 항체의 수식방법은 이 분야에 있어서 이미 확립되어 있다(예를 들면, US 5057313, US 5156840). 본 발명에 있어서의 「항체」에는 이들의 콘쥬게이트 항체도 포함된다.
또한, 본 발명에서 사용되는 항체는 이중 특이성 항체(bispecific antibody)여도 된다. 이중 특이성 항체란, 상이한 에피토프를 인식하는 가변영역을 동일 항체 분자 내에 갖는 항체를 말한다. 본 발명에 있어서, 이중 특이성 항체는 NR10 분자 상의 상이한 에피토프를 인식하는 이중 특이성 항체여도 되고, 한쪽의 항원 결합부위가 NR10을 인식하고, 다른 쪽의 항원 결합부위가 다른 물질을 인식하는 이중 특이성 항체로 하는 것도 가능하다.
이중 특이성 항체를 제조하기 위한 방법은 공지이다. 예를 들면, 인식 항원이 상이한 2종류의 항체를 결합시켜서, 이중 특이성 항체를 제작할 수 있다. 결합시키는 항체는, 각각이 H쇄와 L쇄를 갖는 1/2 분자여도 되고, H쇄만으로 되는 1/4 분자여도 된다. 또는, 상이한 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마를 융합시켜서, 이중 특이성 항체 생산 융합세포를 제작하는 것도 가능하다. 또한, 유전자 공학적 수법에 의해 이중 특이성 항체를 제작할 수 있다.
본 발명의 항체는, 후술하는 항체를 생산하는 세포나 숙주 또는 정제방법에 의해, 아미노산 서열, 분자량, 등전점 또는 당쇄의 유무나 형태 등이 상이할 수 있다. 그러나, 얻어진 항체가, 본 발명의 항체와 동등한 기능을 갖고 있는 한, 본 발명에 포함된다. 예를 들면, 본 발명의 항체를 원핵세포, 예를 들면 대장균에서 발현시킨 경우, 본래의 항체의 아미노산 서열의 N 말단에 메티오닌 잔기가 부가된다. 본 발명의 항체는 이와 같은 항체도 포함한다.
항체의 제조
본 발명의 항체는, 다중클론항체여도 되고 단일클론항체여도 된다. NR10에 대한 결합활성 및/또는 중화활성을 갖는 단일클론항체는, 예를 들면, 인간이나 마우스 등의 포유동물에 유래하는 NR10 또는 그의 단편 펩티드를 면역원으로 하여, 공지 방법에 의해 항NR10 단일클론항체를 조제한 후, 얻어진 항NR10 단일클론항체 중에서 NR10 결합활성 및/또는 중화활성을 갖는 항체를 선별함으로써, 얻을 수 있다. 즉, 목적하는 항원이나 목적하는 항원을 발현하는 세포를 감작항원으로서 사용하고, 이것을 통상의 면역방법에 따라 면역한다. 얻어지는 면역세포를 통상의 세포융합법에 의해 공지의 친세포와 융합시키고, 통상의 스트리닝법에 의해, 단일클론항체 생산세포(하이브리도마)를 스크리닝함으로써, 항NR10 단일클론항체를 제작하는 것이 가능하다. 면역되는 동물로서는, 예를 들면, 마우스, 랫트, 토끼, 양, 원숭이, 염소, 당나귀, 소, 말, 돼지 등의 포유동물을 사용할 수 있다. 항원의 조제는, 공지 NR10 유전자 서열을 사용하여, 공지의 방법, 예를 들면 바큘로바이러스를 사용한 방법(WO98/46777 등) 등에 준하여 행할 수 있다.
하이브리도마의 제작은, 예를 들면, 밀스테인 등의 방법(Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol.(1981) 73: 3-46) 등에 준하여 행할 수 있다. 항원의 면역원성이 낮은 경우에는, 알부민 등의 면역원성을 갖는 거대분자와 결합시켜, 면역을 행해도 된다.
본 발명의 NR10에 대한 결합활성 및/또는 중화활성을 갖는 항체의 일태양으로서, 인간 NR10에 대한 결합활성 및/또는 중화활성을 갖는 단일클론항체를 들 수 있다. 인간 NR10에 대한 결합활성 및/또는 중화활성을 갖는 단일클론항체를 제작하기 위한 면역원으로서는, 인간 NR10에 대한 결합활성 및/또는 중화활성을 갖는 항체를 제작할 수 있는 한, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면 인간 NR10에는 복수의 배리언트의 존재가 알려지나, 인간 NR10에 대한 결합활성 및/또는 중화활성을 갖는 항체를 제작할 수 있는 한, 어떤 배리언트를 면역원으로 해도 된다. 또는 동일한 조건하에, NR10의 단편 펩티드나, 천연 NR10 서열에 인위적인 변이를 가한 것을 면역원으로 해도 된다. 인간 NR10.3는, 본 발명의 NR10에 대한 결합활성 및/또는 중화활성을 갖는 항체를 제작할 수 있는 측면에서, 바람직한 면역원의 하나이다.
또한, 항체의 NR10에 대한 결합활성 및/또는 중화활성의 측정은, 예를 들면, 실시예에 기재된, 그 IL-31 의존성 세포주의 증식 억제효과를 관찰하는 방법에 의해 행할 수 있다.
한편, 단일클론항체는, DNA 면역(DNA Immunization)에 의해서도 얻을 수 있다. DNA 면역이란, 면역동물 중에서 항원 단백질을 코드하는 유전자가 발현할 수 있는 태양으로 구축된 벡터 DNA를 당해 면역동물에 투여하고, 면역 항원을 면역동물의 생체 내에서 발현시킴으로써, 면역 자극을 부여하는 방법이다. 단백질 항원을 투여하는 일반적인 면역방법과 비교하여, DNA 면역에는, 다음과 같은 우위성을 기대할 수 있다.
－막단백질의 구조를 유지하여 면역 자극을 부여할 수 있다
－면역 항원을 정제할 필요가 없다
그러나 한편으로, DNA 면역에 있어서는, 애쥬번트 등의 면역 자극수단과 조합하는 것이 곤란하다.
DNA 면역에 의해 단일클론항체를 얻는 데는, 먼저, NR10을 코드하는 DNA를 면역동물에 투여한다. NR10을 코드하는 DNA는, PCR 등의 공지의 방법에 의해 합성할 수 있다. 얻어진 DNA를 적당한 발현 벡터에 삽입하고, 면역동물에 투여한다. 발현 벡터로서는, 예를 들면 pcDNA3.1 등의 시판의 발현 벡터를 이용할 수 있다. 벡터를 생체에 투여하는 방법도, 일반적으로 사용되고 있는 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터를 흡착시킨 금입자를, 유전자총(gene gun)으로 세포내에 넣음으로써 DNA 면역을 행할 수 있다. DNA 면역 후에, NR10 발현세포에 의한 추가 면역(boost)을 행하는 것은, 단일클론항체를 얻는 바람직한 방법이다.
이와 같이 포유동물이 면역되고, 혈청 중에 있어서의 목적하는 항체량의 상승이 확인된 후에, 포유동물로부터 면역세포가 채취되어, 세포융합에 부여된다. 바람직한 면역세포로서는, 특히 비장세포를 사용할 수 있다.
상기의 면역세포와 융합되는 세포로서, 포유동물의 골수종 세포가 사용된다. 골수종 세포는, 스크리닝을 위한 적당한 선택 마커를 구비하고 있는 것이 바람직하다. 선택 마커란, 특정 배양조건하에서 생존할 수 있는(또는 할 수 없는) 형질을 가리킨다. 선택 마커에는, 히포크산틴-구아닌-포스포리보실트랜스페라아제 결손(이하 HGPRT 결손으로 생략한다), 또는 티미딘 키나아제 결손(이하 TK 결손으로 생략한다) 등이 공지이다. HGPRT나 TK의 결손을 갖는 세포는, 히포크산틴-아미노프테린-티미딘 감수성(이하 HAT 감수성으로 생략한다)을 갖는다. HAT 감수성의 세포는 HAT 선택배지 중에서 DNA 합성을 행할 수 없어 사멸되나, 정상세포와 융합하면 정상세포의 샐비지 회로를 이용하여 DNA의 합성을 계속할 수 있기 때문에 HAT 선택배지 중에서도 증식하게 된다.
HGPRT 결손이나 TK 결손의 세포는, 각각 6 티오구아닌, 8 아자구아닌(이하 8AG로 생략한다), 또는 5'브로모데옥시우리딘을 포함하는 배지에서 선택할 수 있다. 정상세포는 이들 피리미딘 아날로그를 DNA 중에 삽입해 버리기 때문에 사멸되나, 이들 효소를 결손한 세포는, 이들 피리미딘 아날로그를 삽입할 수 없기 때문에 선택배지 중에서 생존할 수 있다. 이 밖에 G418 내성으로 불리는 선택 마커는, 네오마이신 내성 유전자에 의해 2-데옥시스트렙타민계 항생물질(겐타마이신 유사체)에 대한 내성을 부여한다. 세포융합에 적합한 각종 골수종 세포가 공지이다.
기본적으로는 공지의 방법, 예를 들면, 쾰러와 밀스테인 등의 방법(Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol.(1981)73, 3-46) 등에 준하여, 면역세포와 골수종 세포의 세포융합이 행해진다.
보다 구체적으로는, 예를 들면 세포융합 촉진제의 존재하에서 통상의 영양 배양액 중에서, 세포융합을 실시할 수 있다. 융합 촉진제로서는, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 센다이 바이러스(HVJ) 등을 사용할 수 있다. 추가적으로 융합효율을 높이기 위해 목적하는 바에 따라 디메틸설폭시드 등의 보조제를 첨가하는 것도 가능하다.
면역세포와 골수종 세포의 사용 비율은 임의로 설정할 수 있다. 예를 들면, 골수종 세포에 대해 면역세포를 1~10배로 하는 것이 바람직하다. 세포융합에 사용하는 배양액으로서는, 예를 들면, 골수종 세포주의 증식에 적합한 RPMI1640 배양액, MEM 배양액, 기타, 이 종의 세포 배양에 사용되는 통상의 배양액을 이용할 수 있다. 또한, 소태아혈청(FCS) 등의 혈청 보액을 배양액에 첨가할 수 있다.
세포융합은, 면역세포와 골수종 세포의 소정량을 배양액 중에서 잘 혼합하고, 사전에 37℃ 정도로 가온한 PEG 용액을 혼합함으로써 목적으로 하는 융합세포(하이브리도마)가 형성된다. 세포융합법에 있어서는, 예를 들면 평균 분자량 1000~6000 정도의 PEG를, 통상 30~60%(w/v)의 농도로 첨가할 수 있다. 계속해서, 상기에 예로 든 적당한 배양액을 축차 첨가하고, 원심하여 상청을 제거하는 조작을 반복함으로써, 하이브리도마의 생육에 바람직하지 않은 세포융합제 등이 제거된다.
이와 같이 하여 얻어진 하이브리도마는, 세포융합에 사용된 골수종이 갖는 선택 마커에 따른 선택 배양액을 이용함으로써 선택할 수 있다. 예를 들면 HGPRT나 TK의 결손을 갖는 세포는, HAT 배양액(히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양액)으로 배양함으로써 선택할 수 있다. 즉, HAT 감수성의 골수종 세포를 세포융합에 사용한 경우, HAT 배양액 중에서, 정상세포와의 세포융합에 성공한 세포를 선택적으로 증식시킬 수 있다. 목적으로 하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸되기에 충분한 시간, 상기 HAT 배양액을 사용한 배양이 계속된다. 구체적으로는, 일반적으로, 수일에서 수 주간의 배양에 의해, 목적으로 하는 하이브리도마를 선택할 수 있다. 이어서, 통상의 한계 희석법을 실시함으로써, 목적으로 하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝을 실시할 수 있다. 또는, NR10을 인식하는 항체를 국제공개 WO03/104453에 기재된 방법에 의해 제작하는 것도 가능하다.
목적으로 하는 항체의 스크리닝 및 단일 클로닝은, 공지의 항원 항체반응을 토대로 하는 스크리닝방법에 의해 적합하게 실시할 수 있다. 예를 들면, 폴리스티렌 등으로 된 비즈나 시판의 96웰의 마이크로타이터 플레이트 등의 담체에 항원을 결합시키고, 하이브리도마의 배양상청과 반응시킨다. 이어서 담체를 세정한 후에 효소로 표지한 2차 항체 등을 반응시킨다. 만일 배양상청 중에 감작 항원과 반응하는 목적으로 하는 항체가 포함되는 경우, 2차 항체는 이 항체를 매개로 담체에 결합한다. 최종적으로 담체에 결합하는 2차 항체를 검출함으로써, 목적으로 하는 항체가 배양상청 중에 존재하고 있는지 여부를 결정할 수 있다. 항원에 대한 결합능을 갖는 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 한계 희석법 등에 의해 클로닝하는 것이 가능해진다. 이때, 항원으로서는 면역에 사용한 것을 비롯하여, 실질적으로 동질의 NR10 단백질을 적합하게 사용할 수 있다. 예를 들면 NR10을 발현하는 세포주, NR10의 세포외 도메인, 또는 당해 영역을 구성하는 부분 아미노산 서열로 되는 올리고펩티드를, 항원으로서 이용할 수 있다.
또한, 인간 이외의 동물의 항원을 면역함으로써 상기 하이브리도마를 얻는 방법 이외에, 인간 림프구를 항원 감작하여 목적으로 하는 항체를 얻는 것도 가능하다. 구체적으로는, 먼저 인 비트로에 있어서 인간 림프구를 NR10 단백질로 감작한다. 이어서 면역 감작된 림프구를 적당한 융합 파트너와 융합시킨다. 융합 파트너로는, 예를 들면 인간 유래로서 영구 분열능을 갖는 골수종 세포를 이용할 수 있다(일본국 특허공고 평1-59878호 공보 참조). 이 방법에 의해 얻어지는 항체는, NR10 단백질로의 결합활성을 갖는 인간 항체이다.
전술한 방법 등에 의해 취득된 항NR10 항체를 코드하는 염기서열, 아미노산 서열은 당업자에게 공지의 방법에 의해 얻는 것이 가능하다.
얻어진 항NR10 항체의 서열을 토대로, 당업자에게 공지의 유전자 재조합기술을 사용하여 항NR10 항체를 제작하는 것이 가능하다. 구체적으로는, NR10을 인식하는 항체의 서열을 토대로 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 구축하고, 이것을 발현 벡터에 도입한 후, 적당한 숙주세포에서 발현시키면 된다(예를 들면, Co, M. S. et al., J. Immunol.(1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol.(1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol.(1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol.(1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol.(1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol.(1991) 9, 132-137 참조).
벡터의 예로서는, M13계 벡터, pUC계 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script 등을 들 수 있다. 또한, cDNA의 서브 클로닝, 잘라내기를 목적으로 한 경우, 상기 벡터 외에, 예를 들면, pGEM-T, pDIRECT, pT7 등을 들 수 있다. 본 발명의 항체를 생산하는 목적에 있어서 벡터를 사용하는 경우에는, 특히, 발현 벡터가 유용하다. 발현 벡터로서는, 예를 들면, 대장균에서의 발현을 목적으로 한 경우는, 벡터가 대장균에서 증폭되는 상기 특징을 갖는 것 외에, 숙주를 JM109, DH5α, HB101, XL1-Blue 등의 대장균으로 한 경우에 있어서는, 대장균에서 효율적으로 발현할 수 있는 프로모터, 예를 들면 lacZ 프로모터(Ward 등, Nature(1989) 341, 544-546;FASEB J.(1992) 6, 2422-2427), araB 프로모터(Better 등, Science(1988) 240, 1041-1043), 또는 T7 프로모터 등을 갖고 있는 것이 불가결하다. 이와 같은 벡터로서는, 상기 벡터 외에 pGEX-5X-1(파마시아제), 「QIAexpress system」(퀴아겐제), pEGFP, 또는 pET(이 경우, 숙주는 T7 RNA 폴리머라아제를 발현하고 있는 BL21이 바람직하다) 등을 들 수 있다.
또한, 벡터에는, 항체 분비를 위한 시그날 서열이 포함되어 있어도 된다. 항체 분비를 위한 시그날 서열로서는, 대장균의 페리플라즘으로 생산시키는 경우, pelB 시그날 서열(Lei, S. P. et al., J. Bacteriol.(1987)169, 4379)을 사용하면 된다. 숙주세포로의 벡터의 도입은, 예를 들면 염화칼슘법, 전기천공법(electroporation method)을 사용해서 행할 수 있다.
대장균 이외에도, 예를 들면, 본 발명의 항체를 제조하기 위한 벡터로서는, 포유동물 유래의 발현 벡터(예를 들면, pcDNA3(인비트로겐사제)나, pEF-BOS(Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322), pEF, pCDM8), 곤충세포 유래의 발현 벡터(예를 들면 「Bac-to-BAC baculovairus expression system」(기브코 BRL제), pBacPAK8), 식물 유래의 발현 벡터(예를 들면 pMH1, pMH2), 동물 바이러스 유래의 발현 벡터(예를 들면, pHSV, pMV, pAdexLcw), 레트로 바이러스 유래의 발현 벡터(예를 들면, pZIPneo), 효모 유래의 발현 벡터(예를 들면, 「Pichia Expression Kit」(인비트로겐제), pNV11, SP-Q01), 고초균 유래의 발현 벡터(예를 들면, pPL608, pKTH50)를 들 수 있다.
CHO 세포, COS 세포, NIH3T3 세포 등의 동물세포에서의 발현을 목적으로 한 경우에는, 세포내에서 발현시키기 위해 필요한 프로모터, 예를 들면 SV40 프로모터(Mulligan 등, Nature(1979) 277, 108), MMLV-LTR 프로모터, EF1α 프로모터(Mizushima 등, Nucleic Acids Res.(1990) 18, 5322), CMV 프로모터 등을 갖고 있는 것이 불가결하고, 세포로의 형질전환을 선발하기 위한 유전자(예를 들면, 약제(네오마이신, G418 등)에 의해 판별할 수 있는 약제 내성 유전자)를 가지면 더욱 바람직하다. 이와 같은 특성을 갖는 벡터로서는, 예를 들면, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, pOP13 등을 들 수 있다.
또한, 유전자를 안정적으로 발현시키고, 또한, 세포내에서의 유전자의 카피 수의 증폭을 목적으로 하는 경우에는, 핵산 합성경로를 결손한 CHO 세포에 그것을 상보하는 DHFR 유전자를 갖는 벡터(예를 들면, pSV2-dhfr(「Molecular Cloning 2nd edition」 Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989)) 등)를 도입하고, 메토트렉세이트(MTX)에 의해 증폭시키는 방법을 들 수 있으며, 또한, 유전자의 일과성 발현을 목적으로 하는 경우에는, SV40 T항원을 발현하는 유전자를 염색체 상에 갖는 COS 세포를 사용하여 SV40의 복제 기점을 갖는 벡터(pcD 등)로 형질전환하는 방법을 들 수 있다. 복제 개시점으로서는, 또한, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 소유두종 바이러스(BPV) 등의 유래의 것을 사용하는 것도 가능하다. 또한, 숙주세포계에서 유전자 카피 수의 증폭을 위해, 발현 벡터는 선택 마커로서, 아미노글리코시드 트랜스페라아제(APH) 유전자, 티미딘 키나아제(TK) 유전자, 대장균 크산틴구아닌 포스포리보실트랜스페라아제(Ecogpt) 유전자, 디히드로엽산 환원효소(dhfr) 유전자 등을 포함할 수 있다.
이것에 의해 얻어진 본 발명의 항체는, 숙주세포내 또는 세포외(배지 등)로부터 단리하여, 실질적으로 순수하고 균일한 항체로서 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는, 통상의 항체의 정제에서 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용하면 되고, 전혀 한정되지 않는다. 예를 들면, 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외여과, 염석, 용매침전, 용매추출, 증류, 면역침강, SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동, 등전점 전기영동법, 투석, 재결정 등을 적절히 선택, 조합하면 항체를 분리, 정제할 수 있다.
크로마토그래피로서는, 예를 들면 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography), 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). 이들 크로마토그래피는, 액상 크로마토그래피, 예를 들면 HPLC, FPLC 등의 액상 크로마토그래피를 사용해서 행할 수 있다. 친화성 크로마토그래피에 사용하는 칼럼으로서는, 프로테인 A 칼럼, 프로테인 G 칼럼을 들 수 있다. 예를 들면, 프로테인 A를 사용한 칼럼으로서, Hyper D, POROS, Sepharose FF(GE Amersham Biosciences) 등을 들 수 있다. 본 발명은 이들 정제방법을 사용하여 고도로 정제된 항체도 포함한다.
얻어진 항체의 NR10에 대한 결합활성의 측정은, 당업자에 공지의 방법에 의해 행하는 것이 가능하다. 예를 들면, 항체의 항원 결합활성을 측정하는 방법으로서, ELISA(효소결합 면역흡착 검정법), EIA(효소 면역 측정법), RIA(방사 면역 측정법) 또는 형광 항체법 등을 사용할 수 있다. 예를 들면, 효소 면역 측정법을 사용하는 경우, 항원을 코팅한 플레이트에, 항체를 포함하는 시료, 예를 들면, 항체 생산세포의 배양상청이나 정제 항체를 첨가한다. 알칼리포스파타아제 등의 효소로 표지한 이차 항체를 첨가하고, 플레이트를 인큐베이트하여, 세정한 후, p-니트로페닐인산 등의 효소 기질을 첨가하여 흡광도를 측정함으로써 항원 결합활성을 평가할 수 있다.
의약 조성물
또한 본 발명은, 전술한 항체를 유효성분으로서 함유하는 의약 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 전술한 항체를 유효성분으로 하는 염증성 질환의 치료제를 제공한다.
본 발명에 있어서 염증성 질환이란, 물리적, 화학적, 또는 생물학적 작용 물질에 의한 손상이나 이상 자극에 의해, 이환(罹患) 혈관 및 인접한 조직에 일어나는 세포학적·조직학적 반응에 관한 병리학상의 소견을 수반하는 질환(스테드먼 의학대사전 제5판, 주식회사 메디컬리뷰사, 2005년)을 말한다. 일반적으로 염증성 질환은 피부염(아토피성 피부염, 만성 피부염 등), 염증성 장 질환(대장염 등), 천식, 관절염(관절 류머티즘, 변형성 관절증 등), 기관지염, Th-2형 자기면역질환, 전신성 에리테마토데스, 중증 근무력증, 만성 GVHD, 클론병, 변형성 척추염, 요통, 통풍, 수술 외상 후의 염증, 종창의 완해, 신경통, 인후두염, 방광염, 간염(비알코올성 지방성 간염, 알코올성 간염 등), B형 간염, C형 간염, 동맥경화, 소양 등을 들 수 있다.
본 발명의 대상이 되는 염증성 질환의 바람직한 예로서, 아토피성 피부염, 만성 피부염, 류머티즘, 변형성 관절증, 만성 천식, 소양을 들 수 있다.
항NR10 항체를 「유효성분으로서 함유하는」이란, 항NR10 항체를 활성성분의 하나 이상으로서 포함한다는 의미이고, 그 함유율을 제한하는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 염증성 질환의 치료제는, 전술한 항NR10 항체와 함께 다른 염증성 질환의 치료를 촉진하는 성분을 함유해도 된다.
또한, 본 발명의 치료제는 예방 목적으로 사용해도 된다.
본 발명의 항NR10 항체는, 통상의 방법에 따라 제제화할 수 있다(예를 들면, Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A). 또한, 필요에 따라, 의약적으로 허용되는 담체 및/또는 첨가물을 함께 포함해도 된다. 예를 들면, 계면활성제(PEG, Tween 등), 부형제, 산화방지제(아스코르브산 등), 착색료, 착향료, 보존료, 안정제, 완충제(인산, 구연산, 다른 유기산 등), 킬레이트제(EDTA 등), 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 유동성 촉진제, 교미제 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명의 염증성 질환의 예방 또는 치료제는, 이들에 제한되지 않고, 기타 상용의 담체를 적절히 포함하고 있어도 된다. 구체적으로는, 연질 무수규산, 젖당, 결정 셀룰로오스, 만니톨, 전분, 카르멜로오스칼슘, 카르멜로오스나트륨, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 중쇄 지방산 트리글리세라이드, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60, 백당, 카르복시메틸셀룰로오스, 콘스타치, 무기염류 등을 들 수 있다. 또한, 기타 저분자량의 폴리펩티드, 혈청 알부민, 젤라틴 및 면역글로불린 등의 단백질, 및 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 및 리신 등의 아미노산을 포함하고 있어도 된다. 주사용의 수용액으로 하는 경우에는, 항NR10 항체를, 예를 들면, 생리식염수, 포도당 또는 기타 보조약을 포함하는 등장액에 용해한다. 보조약으로서는, 예를 들면, D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화나트륨을 들 수 있고, 또한, 적당한 용해보조제, 예를 들면 알코올(에탄올 등), 폴리알코올(프로필렌글리콜, PEG 등), 비이온성 계면활성제(폴리소르베이트 80, HCO-50) 등과 병용해도 된다.
또한, 필요에 따라 항NR10 항체를 마이크로 캡슐(히드록시메틸셀룰로오스, 젤라틴, 폴리[메틸메타크릴산] 등의 마이크로 캡슐)에 봉입하거나, 콜로이드 드러그 딜리버리 시스템(리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐 등)으로 하는 것도 가능하다(Remington's Pharmaceutical Science 16th edition &, Oslo Ed.(1980) 등 참조). 또한, 약제를 서방성의 약제로 하는 방법도 공지로, 항NR10 항체에 적용할 수 있다(Langer et al., J.Biomed.Mater.Res.(1981) 15: 167-277; Langer, Chem. Tech.(1982)12: 98-105; 미국 특허 제3,773,919호; 유럽 특허출원 공개(EP) 제58,481호; Sidman et al., Biopolymers(1983)22:547-56; EP 제133,988호).
본 발명의 의약 조성물은, 경구 또는 비경구 중 어느 것으로도 투여 가능하나, 바람직하게는 비경구 투여된다. 구체적으로는, 주사 및 경피 투여에 의해 환자에게 투여된다. 주사제형의 예로서는, 예를 들면, 정맥 내 주사, 근육 내 주사 또는 피하 주사 등에 의해 전신 또는 국소적으로 투여할 수 있다. 염증을 억제하고자 하는 부위 또는 그 주변에 국소 주입, 특히 근육 내 주사해도 된다. 또한, 환자의 연령, 증상에 따라 적절히 투여방법을 선택할 수 있다. 투여량으로서는, 예를 들면, 1회에 체중 1 ㎏당 활성성분을 0.0001 ㎎~100 ㎎의 범위에서 선택하는 것이 가능하다. 또한, 예를 들면, 인간 환자에게 투여하는 경우, 환자당 활성성분이 0.001~1000 ㎎/㎏·body·weight의 범위에서 선택할 수 있고, 1회당 투여량으로서는, 예를 들면, 본 발명의 항체가 0.01~50 ㎎/㎏·body·weight 정도의 양이 포함되는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명의 염증성 질환의 예방 또는 치료제는, 이들 투여량에 제한되지 않는다.
또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은, 참조로써 본 명세서에 포함된다.
실시예
이하 본 발명을 실시예를 사용하여 구체적으로 설명하나, 본 발명은 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1] 하이브리도마 제작
1.1. DNA 면역용 인간 NR10 플라스미드, 게잡이원숭이 NR10 플라스미드의 조제
1.1.1. hNR10 , cynNR10 발현 벡터의 조제
마우스 β-액틴의 프로모터 제어하에 단백을 발현하는 벡터 pMacII(WO2005/054467)에, 인간 NR10(염기서열 서열번호:75, 아미노산서열 서열번호:76)을 삽입하여 hNR10 발현 벡터로 하였다. 마찬가지로, 게잡이원숭이 NR10(염기서열 서열번호:65, 아미노산 서열 서열번호:66)으로부터 cynNR10 발현 벡터를 구축하였다.
1.1.2. DNA 카트리지의 제작
1.1.1에서 제작한 hNR10 또는 cynNR10 발현 벡터를 마우스로의 DNA 면역에 사용하기 위해 Herios Gene Gun용 카트리지 키트(BIO-RAD사제)를 사용하여, 각각의 DNA에 대해서 1회당 1 ㎍의 DNA를 면역할 수 있는 DNA 카트리지를 제작하였다.
1.2. 항인간 NR10 항체 생산 하이브리도마의 제작
1.2.1. 인간 NR10 및 게잡이원숭이 NR10 면역마우스를 사용한 하이브리도 마의 제작
Balb/c 마우스(자성, 면역 개시시 6주령, 닛폰 찰스·리버) 10마리에, 인간 NR10 또는 게잡이원숭이 NR10을 이하와 같이 면역하였다. 초회 면역으로서 hNR10 발현 벡터로 제작한 DNA 카트리지를 Herios Gene Gun 시스템(BIO-RAD)을 사용하여 면역하였다. 2회째 면역은 1주간 후에 cynNR10 발현 벡터로 제작한 DNA 카트리지를 Herios Gene Gun 시스템으로 면역하여 행하였다. 3회째 이후부터는 1주 간격으로 hNR10과 cynNR10 발현 벡터를 번갈아 면역하였다. 인간 NR10에 대한 혈청 항체가의 상승을 확인 후, 최종 면역으로서 PBS(-)에 희석한 인간 NR10 단백(세포외영역)(참고예 4)을 10 ㎍/head 정맥 내 투여하였다. 최종 면역의 4일 후, 마우스의 비장세포와 마우스 골수종 세포 P3X63Ag8U.1(P3U1이라 부른다, ATCC CRL-1597)을, PEG1500(Roche Diagnostics)을 사용한 통상의 방법에 따라 세포융합하였다. 융합세포, 즉 하이브리도마는, 10% FBS를 포함하는 RPMI1640 배지(이하, 10% FBS/RPMI1640이라 부른다)에서 배양하였다.
1.2.2. 하이브리도마의 선발
융합 다음날, (1) 융합 세포를 반유동배지(StemCells)에 현탁하고, 하이브리도마의 선택 배양을 행하는 동시에, 하이브리도마의 콜로니화를 실시하였다.
융합 후 9일째 또는 10일째에 하이브리도마의 콜로니를 픽업하고, HAT 선택 배지(10% FBS/RPMI1640, 2 vol% HAT 50x concentrate(다이닛폰제약), 5 vol% BM-Condimed H1(Roche Diagnostics))이 든 96-웰 플레이트에, 1 웰당 1 콜로니를 파종하였다. 3~4일 배양 후, 각 웰의 배양상청을 회수하고, 배양상청 중의 마우스 IgG 농도를 측정하였다. 마우스 IgG를 확인할 수 있었던 배양상청에 대해, 인간 IL-31 의존성 세포주(hNR10/hOSMR/BaF3 세포; 참고예 2)를 사용한 중화활성으로 평가하여, 높은 NR10 중화활성을 갖는 몇 개의 클론을 얻었다(도 3). 인간 IL-31 자극에 의한 세포 증식을 농도 의존적으로 억제하는 클론으로, 또한, 게잡이원숭이 IL-31 자극에 의한 세포(cynNR10/cynOSMR/BaF3 세포; 참고예 2) 증식을 농도 의존적으로 억제하는 클론을 얻었다(도 4).
[실시예 2] 키메라 항체의 제작
키메라 항체 발현 벡터의 제작
하이브리도마 세포로부터, RNeasy Mini Kits(QIAGEN)를 사용하여 토탈 RNA를 추출하고, SMART RACE cDNA Amplification Kit(BD Biosciences)에 의해 cDNA를 합성하였다. SMART RACE cDNA Amplification Kit(BD Biosciences)에 첨부된 10X Universal Primer A Mix와 항체의 각각의 정상영역에 설정한 프라이머(H쇄: mIgG1-rnot, L쇄: mIgK-rnot)를 사용하고, PrimeSTAR HS DNA polymerase(TaKaRa)에 의해 PCR을 행하여, 항체의 가변영역 유전자를 단리하였다. 단리한 각 DNA 단편의 염기서열은, BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)를 사용하고, DNA 시퀀서 ABI PRISM 3730xL DNA Sequencer 또는 ABI PRISM 3700 DNA Sequencer(Applied Biosystems)로, 첨부 설명서 기재의 방법에 따라 결정하였다. 얻어진 NS18, NS22, NS23 및 NS33의 마우스 항체의 아미노산 서열의, H쇄 가변영역을 도 1, L쇄 가변영역을 도 2에 나타낸다.
얻어진 H쇄, L쇄 각 단편에 대해, 표 1에 기재된 조합의 Primer를 사용하여 PrimeSTAR HS DNA Polymerase(TaKaRa)에 의해 PCR을 행하고, 얻어진 증폭 단편을 정상영역(각각, 인간 γ1 또는 γ2, 인간 κ)과 결합하여, 동물세포 발현 벡터에 삽입하였다. 각 DNA 단편의 염기서열은, BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)를 사용하고, DNA 시퀀서 ABI PRISM 3730xL DNA Sequencer 또는 ABI PRISM 3700 DNA Sequencer(Applied Biosystems)로, 첨부 설명서 기재의 방법에 따라 결정하였다.
Figure pct00001
키메라 항체의 제작
인간 태아 신장암세포 유래 HEK293H주(Invitrogen)를 10% Fetal Bovine Serum(Invitrogen)을 포함하는 DMEM 배지(Invitrogen)로 현탁하고, 6×105개/mL의 세포밀도로 접착세포용 디쉬(직경 10 ㎝, CORNING)의 각 디쉬에 10 mL씩 파종하여 CO2 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 내에서 하루 배양한 후에, 배지를 흡인 제거하고, CHO-S-SFMII(Invitrogen) 배지 6.9 mL를 첨가하였다. 조제한 플라스미드 DNA 혼합액(합계 13.8 ㎍)에 CHO-S-SFMII 배지를 첨가하여 700 μL로 하고, 1 ㎍/mL Polyethylenimine(Polysciences Inc.) 20.7 μL를 첨가하고 혼합하여 실온에서 10분간 정치한 것을 각 디쉬의 세포로 투입하여, 4~5시간, CO2 인큐베이터(37℃에서 5% CO2) 내에서 인큐베이트하였다. 그 후, CHO-S-SFMII(Invitrogen) 배지 6.9 mL를 첨가하여, 3~4일간 CO2 인큐베이터 내에서 배양하였다. 배양상청을 회수한 후, 원심분리(약 2000 g, 5분간, 실온)하여 세포를 제거하고, 추가적으로 0.22 ㎛ 필터 MILLEX(등록상표)-GV(Millipore)를 통과시켰다. 각 샘플은 사용할 때까지 4℃에서 보존하였다. 이 상청으로부터 Protein G Sepharose(Amersham Biosciences)를 사용하여 항체를 정제하였다. 정제한 항체는, Amicon Ultra 15(Millipore)를 사용해서 농축하고, 추가적으로 PD-10 Desalting columns(Amersham Biosciences)를 사용해서 0.05%의 NaN3를 포함하는 PBS(-)로 용매를 치환하였다. 280 ㎚의 흡광도를 ND-1000 Spectrophotometer(NanoDrop)로 측정하고, Pace 등의 방법(Protein Science(1995) 4: 2411-2423)으로 농도를 산출하였다.
키메라 NS22 의 활성평가
hIL-31 용량 의존적으로 증식하는 hNR10/hOSMR/BaF3 세포주를 사용하여, 이하에 나타내는 바와 같이 hIL-31 중화활성을 평가하였다.
hNR10/hOSMR/BaF3 세포를 10% FBS(MOREGATE), 1% Penicillin-Streptomycin(Invitrogen)을 포함하는 RPMI1640 배지(GIBCO)에서 1.5×105 cells/mL가 되도록 조제하였다. 그 일부를 취하여, hIL-31(R&D Systems)을 4 ng/mL가 되도록 첨가하였다(IL-31(+), final conc.; 2 ng/mL). 나머지 세포 현탁액을 IL-31(-)로 하였다. 정제한 NS22를 배지에서 2 ㎍/mL로 조정하고, 추가적으로 희석 공비 3, 합계 8 계열의 희석액을 조제하였다(final conc.;≤1 ㎍/mL). 96 well flat bottom plate(CORNING)의 각 well에 세포 현탁액과 키메라 NS22(인간 γ1, κ) 희석용액 각각 50 μL를 파종하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 2일간 배양하였다. 배양 종료 후, 각 well에 Cell Counting Kit-8(Dojindo)와 PBS를 등량 혼합한 용액을 20 μL 첨가하고, 흡광도(450 ㎚/620 ㎚)를 측정하였다(TECAN, SUNRISE CLASSIC). 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 2시간 반응시킨 후, 다시 흡광도를 측정하였다. NS22의 중화활성은 2시간 값에서 0시간 값을 뺀 값을 사용하여, 저해율로 나타내었다. 그 결과, NS22는 hNR10/hOSMR/BaF3 세포주에 있어서, 농도 의존적으로 IL-31 자극에 의한 세포 증식을 억제하는 것이 명백해져, 인간 IL-31 시그날링에 대해 중화활성을 갖는 것이 증명되었다(도 5).
IL-31 자극에 의해 IL-6 생산 유도를 나타내는 DU145 세포주(인간 전립선암 세포주)를 사용하여, 이하에 나타내는 바와 같이, IL-31 중화활성을 평가하였다.
DU145를 10% FBS(MOREGATE), 2 m㏖/L L-glutamine(Invitrogen), 1 m㏖/L sodium pyruvate(SIGMA)를 포함하는 MEM 배지(Invitrogen)에서 2.5×105 cells/mL가 되도록 조제하고, 48 well-plate(CORNING)의 각 well에 200 μL씩 분주하여, 37℃, 5% CO2 조건하, 하룻밤 배양하였다. 정제한 키메라 NS22(인간 γ1, κ)를 100 ㎍/mL가 되도록 10% FBS, 2 m㏖/L L-glutamine, sodium pyruvate를 포함하는 MEM 배지에 희석하고, 이 용액을 사용하여 희석 공비 5, 합계 6 계열의 희석액을 조제하여, 각각을 100 ng/mL의 human interleukin-31(R&D systems)과 1:1로 혼합하여, 각 well에 50 μL씩 첨가하였다. 37℃, 5% CO2 조건하에서 2일간 배양한 후의 배양상청 중 IL-6 농도를 DuoSet ELISA Development kit(R&D systems)를 사용하여 측정하였다. NS22의 중화활성은 저해율(%)로서 평가하였다. 즉, IL-31 비존재하에서의 IL-6 농도(A)를 최대 저해활성(100% 저해), IL-31 첨가하 및 NS22 비첨가하에서의 IL-6 농도(B)를 저해활성 없음(0% 저해)으로 하여, IL-31 첨가하 및 NS22 첨가하의 IL-6 농도(C)를, 다음 식에 의해 산출하였다.
저해율(％)＝(B－C)/(B－A)×100
그 결과, NS22는 DU145 세포주에 있어서, 농도 의존적으로 IL-31 자극에 의한 IL-6 생산을 억제하는 것이 명확해져, 인간 IL-31 시그날링에 대해 중화활성을 갖는 것이 증명되었다(도 6).
키메라 항 NR10 항체의 IL -31 경합활성평가
Human IL-31(R&D Systems)에 대해 FMAT Blue Monofunctional Reactive Dye(Applied Biosystems)에 의한 표지를 행하였다. 50 mM 인산나트륨 완충액(pH 8.0)으로 0.5 ㎎/mL로 조제한 hIL-31 100 μL에 대해, DMSO(Junsei)에 용해한 25 nmoles FMAT Blue 5.25 μL를 첨가하고, Vortex를 행한 후, 상온에서 15분간 정치하였다. 1 M Tris-HCl(pH 7.4) 5 μL 및 10% Tween20 1.1 μL를 첨가함으로써, hIL-31으로의 FMAT Blue의 도입반응을 정지한 후, Superdex 75(GE Healthcare, 17-0771-01)를 Column으로서 사용한 겔 여과에 의해, 0.1% Tween20/PBS 전개액 상에서 FMAT Blue-labeled hIL-31 및 미반응의 FMAT Blue를 분리하였다.
hNR10 발현 CHO 세포를 사용하여, 이하에 나타내는 바와 같이 항체의 IL-31/NR10 결합 저해활성을 평가하였다.
NS22 및 NA633(각각 정상영역은 γ1, κ)를 Assay buffer(10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, 3 mM MgCl2, 2% FBS, 0.01% NaN3)를 사용하여 적당한 농도로 희석하고, 추가적으로 희석 공비 2, 합계 7 계열의 희석액을 조제하여, 40 μL/well로 플레이트(96-Well FMAT Plates, Applied Biosystems)에 첨가하였다. 계속해서, FMAT Blue-labeled hIL-31을 Assay buffer로 400배 희석하고, 20 μL/well로 첨가하였다. 마지막으로, Assay buffer로 2.5×105 /mL로 조정한 세포 현탁액을 40 μL/well로 첨가하였다(final 1×104 /well). 세포를 첨가하고 나서 2시간 후에 8200 Cellular Detection System(Applied Biosystems)으로 형광(FL1)을 측정하였다. 그 결과, NS22는 hIL-31/hNR10의 결합을 용량 의존적으로 저해하는 것이 나타나, 그 활성은 NA633보다도 우수한 것이 증명되었다(도 7).
[실시예 3] 항NR10 항체의 NR10에 대한 경합
Hybridoma 배양상청으로부터 정제한 NS22 항체에 대해 FMAT Blue(Applied Biosystems, 4328853)에 의한 표지를 행하였다. 1 ㎎/㎖-PBS로 조제한 NS22 170 μL에 대해, 17 μL 1 M NaHCO3 용액 및 DMSO에 용해한 17 nmoles FMAT Blue 3.4 μL를 첨가하고, Vortex를 행한 후, 상온에서 30분간 정치하였다. 8 μL 1 M Tris-HCl(pH 7.4) 및 1.9 μL 1% Tween20를 첨가함으로써, NS22로의 FMAT Blue의 도입반응을 정지한 후, Superdex 75(GE Healthcare, 17-0771-01)를 Column으로서 사용한 겔 여과에 의해, 0.01% Tween20/PBS 전개액 상에서 FMAT Blue 표지 NS22(FMAT Blue-NS22) 및 미반응의 FMAT Blue를 분리하였다.
얻어진 FMAT Blue-NS22의 hNR10 발현 CHO 세포(참고예 3)의 결합에 대한 각종 항체에 의한 저해를 8200 Cellular Detection System(Applied Biosystems, 4342920)을 사용하여 검토하였다. 8.8×10-2 ㎍/mL FMAT Blue-NS22, 7500 cells/well에 대해, 각종 농도의 키메라 항NR10 항체(각각 정상영역은 γ1, κ)를 첨가하고, 암소, 4시간 정치 후의 세포에 결합한 FMAT Blue 유래의 형광 시그날을 측정하였다. 반응은, 2.5 mM CaCl2, 3 mM MgCl2, 140 mM NaCl, 2% FBS, 0.01% NaNO3를 포함하는 10 mM Hepes-KOH 중에서 행하였다. 결과를 도 8에 나타낸다. NS22와 NS23 항체의 농도가 상승함에 따라, FMAT Blue-NS22의 NR10 발현 세포에 대한 결합을 나타내는 형광값 FL1이 감소하였다. 한편, NA633 항체(참고예 6)의 농도의 상승에 수반하는 FL1의 저하는 거의 확인되지 않았다(도 8).
[실시예 4] NS22 항체의 인간화
각 프레임워크 서열의 선정
마우스 NS22 항체의 가변영역과 인간의 germline 서열을 비교하였다. 그 중에서, 인간화시에 사용하는 FR 서열을 표 2에 정리하였다. CDR, FR의 결정은 Kabat numbering에 따라 행해졌다. 인간화한 가변영역으로서, H쇄는 표 2에 기재되어 있는 FR1, FR2, FR3_1, FR4로 되는 서열을 H0-VH(서열번호:50), FR1, FR2, FR3_2, FR4로 되는 서열을 H1-VH(서열번호:112)로 하였다. 또한, L쇄는 FR1, FR2, FR3, FR4로 되는 서열을 L0(서열번호:52)로 하였다.
인간화 NS22 H0L0 의 가변영역의 제작
인간화시에 사용한 FR영역에 NS22의 CDR영역을 이식한 인간화 NS22의 가변영역을 제작하기 위해, 합성 올리고 DNA를 H쇄, L쇄 각각 설계하였다. 각 합성 올리고 DNA를 혼화하고, 어셈블리 PCR에 의해 인간화 NS22의 가변영역을 코드하는 유전자를 제작하였다. 어셈블리 PCR은 KOD-Plus(TOYOBO)를 사용해서 행하고, 이하의 조건에 따라 PCR법에 의해 실시하였다. 첨부의 PCR Buffer, dNTPs, MgSO4, KOD-Plus 및 10 p㏖의 합성 올리고 DNA로 되는 반응 혼합물을, 94℃에서 5분간 가열한 후, 94℃에서 2분, 55℃에서 2분, 68℃에서 2분으로 구성되는 PCR 반응 사이클을 2회 실시한 후, 가변영역의 5' 말단에 제한효소 사이트와 코작 서열을 부가한 프라이머, 및 3' 말단에 제한효소 사이트를 부가한 프라이머를 각각 10 p㏖ 첨가하고, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 1분으로 구성되는 PCR 반응 사이클을 35회 실시하여 증폭 단편을 얻었다. 얻어진 증폭 단편을 TOPO TA Cloning 벡터(TOYOBO)로 클로닝하고, 시퀀스에 의해 염기서열을 확인하였다. 제작한 가변영역과 정상영역을 조합하고, H0-SKSC(서열번호:54), L0(서열번호:56)를 제작하여, 동물 세포에 있어서 삽입 유전자를 발현 가능하게 하는 발현 벡터에 삽입하였다. 각 DNA 단편의 염기서열은, BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)를 사용하고, DNA 시퀀서 ABI PRISM 3730xL DNA Sequencer 또는 ABI PRISM 3700 DNA Sequencer(Applied Biosystems)로, 첨부 설명서 기재의 방법에 따라 결정하였다.
인간화 NS22 H1 의 가변영역의 제작
H1-SKSC(서열번호:130)의 제작은 H0-SKSC(서열번호:54)의 FR3에 존재하는 kabat numbering의 73번째의 글루타민(E)을 리신(K)으로 치환함으로써 행하였다. 변이체의 제작은 시판의 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)를 사용해서 행하고, 첨부 설명서의 방법에 따라 변이체를 제작하였다.
IgG 화한 항체의 발현
항체의 발현은 이하의 방법을 사용해서 행하였다. 인간 태아 신장암세포 유래 K293H주(Invitrogen)를 10% Fetal Bovine Serum(Invitrogen)을 포함하는 DMEM 배지(Invitrogen)로 현탁하고, 5~6×105개/mL의 세포밀도로 접착세포용 디쉬(직경 10 ㎝, CORNING)의 각 디쉬에 10 mL씩 뿌려 CO2 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 내에서 하루 배양한 후에, 배지를 흡인 제거하고, CHO-S-SFMII(Invitrogen) 배지 6.9 mL를 첨가하였다. 조제한 플라스미드 DNA 혼합액(합계 13.8 ㎍)을 1 ㎍/mL Polyethylenimine(Polysciences Inc.) 20.7 μL와 CHO-S-SFMII 배지 690 μL와 혼합하여 실온에서 10분간 정치한 것을 각 디쉬의 세포로 투입하고, 4~5시간, CO2 인큐베이터(37℃에서 5% CO2) 내에서 인큐베이트하였다. 그 후, CHO-S-SFMII(Invitrogen) 배지 6.9 mL를 첨가하고, 3일간 CO2 인큐베이터 내에서 배양하였다. 배양상청을 회수한 후, 원심분리(약 2000 g, 5분간, 실온)하여 세포를 제거하고, 추가적으로 0.22 ㎛ 필터 MILLEX(R)-GV(Millipore)를 통과시켜 멸균하였다. 각 샘플은 사용할 때까지 4℃에서 보존하였다.
IgG 화한 항체의 정제
얻어진 배양상청에 TBS 중에 현탁시킨 50 μL의 rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 첨가하고, 4℃에서 4시간 이상 전도 혼화하였다. 그 용액을 0.22 ㎛의 필터 컵 Ultrafree(등록상표)-MC(Millipore)로 옮기고, TBS 500 μL로 3회 세정 후, rProtein A SepharoseTM 수지에 100 μL의 50 mM 초산나트륨수용액, pH 3.3에 현탁하여 3분간 정치한 후, 항체를 용출시켰다. 바로, 6.7 μL의 1.5 M Tris-HCl, pH 7.8을 첨가하여 중화하였다. 용출은 2회 행하여, 200 μL의 정제 항체를 얻었다. 항체를 포함하는 용액 2 μL를 ND-1000 Spectrophotometer(NanoDrop사)(Thermo Scientific NanoDropTM 1000 Spectrophotometer(Thermo Scientific사)), 또는 50 μL를 분광 광도계 DU-600(BECKMAN)에 제공하여, 280 ㎚에서의 흡광도를 측정하고 Pace 등의 방법(Protein Science(1995) 4: 2411-2423)에 의해 항체 농도를 산출하였다.
FMAT 를 사용한 IL-31 경합활성의 측정
hNR10 발현 CHO 세포를 사용하여, 이하에 나타내는 바와 같이 항체의 IL-31/NR10 결합 저해활성을 평가하였다. NS22 키메라 항체 및 NS22_H0L0(H쇄 H0-SKSC/서열번호:54, L쇄 L0/서열번호:56)를 Assay buffer(10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, 3 mM MgCl2, 2% FBS, 0.01% NaN3, pH 7.4)를 사용하여 적당한 농도로 희석하고, 추가적으로 희석 공비 2, 합계 8 계열의 희석액을 조제하여, 40 μL/well로 플레이트(96-Well FMAT Plates, Applied Biosystems)에 첨가하였다. 계속해서, FMAT Blue-labeled hIL-31을 Assay buffer로 400배 희석하고, 20 μL/well로 첨가하였다. 마지막으로, Assay buffer로 2.5×105 /mL로 조정한 세포 현탁액을 40 μL/well에 첨가하였다(final 1×104 /well). 세포를 첨가하고 나서 2시간 후에 8200 Cellular Detection System(Applied Biosystems)으로 형광(FL1)을 측정하였다.
그 결과, 인간화 NS22 항체, H0L0(H쇄 H0-SKSC/서열번호:54, L쇄 L0/서열번호:56), H1L0(H쇄 H1-SKSC/서열번호:130, L쇄 L0/서열번호:56)는 도 9에 나타내는 바와 같이 키메라 항체와 거의 동등한 경합활성을 나타낸 것으로부터, H0L0, H1L0 인간화 항IL-31 수용체 항체라고 할 수 있다. 또한, H0L0, H1L0에 사용한 FR은, 모두 인간화시에 FR로서 사용할 수 있는 것으로 생각된다.
그 때문에, 이하의 실시예에서 나타내는 CDR에 대한 변이 개소는 H0, H1 어느 것에도 도입할 수 있는 것으로 생각된다.
Figure pct00002
[실시예 5] 인간화 항IL31 수용체 항체에 있어서의 신규 정상영역 M14 및 M58에 의한 이질성(heterogeneity) 저감효과
참고예 7~9에 나타내는 바와 같이, 인간화 항IL-6 수용체 항체인 huPM1 항체에 있어서, 정상영역을 IgG2로부터 M14 또는 M58로 변환함으로써, 안정성을 저감시키지 않고, IgG2의 힌지영역에 유래하는 이질성을 저감할 수 있는 것이 확인되었다. 이에, 인간화 항IL-31 수용체 항체에 있어서도, 정상영역을 야생형 IgG2로부터 M14 또는 M58로 변환함으로써 이질성을 저감할 수 있는지 여부를 검토하였다.
H쇄로서, 참고예 8 및 9에서 제작한 M14(서열번호:129), M58(서열번호:128)을 포함하는, IgG1(서열번호:60), 및 IgG2(서열번호:132)와 실시예 4에서 제작한 인간화 항IL-31 수용체 항체의 H쇄 가변영역 H0(H0-VH/서열번호:50)를 조합한 H0-M14, H0-M58, H0-IgG1 및 H0-IgG2, L쇄로서 실시예 4에서 제작한 L0(L0/서열번호:56)를 사용하여, H0L0-IgG1(H쇄 H0-IgG1/서열번호:133, L쇄 L0/서열번호:56), H0L0-IgG2(H쇄 H0-IgG2/서열번호:134, L쇄 L0/서열번호:56), H0L0-M14(H쇄 H0-M14/서열번호:135, L쇄 L0/서열번호:56) 및 H0L0-M58(H쇄 H0-M58/서열번호:136, L쇄 L0/서열번호:56)을 제작하였다. 각 항체의 발현·정제는 실시예 4에 기재한 방법으로 행하였다.
이질성의 평가방법으로서, 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 평가를 행하였다. 제작한 항체의 이질성의 평가는, 칼럼으로서 ProPac WCX-10(Dionex)을 사용하고, 이동상 A로서 20 mM Sodium Acetate, pH 5.0, 이동상 B로서 20 mM Sodium Acetate, 1 M NaCl, pH 5.0을 사용하고, 적절한 유속 및 그라디언트를 사용해서 실시하였다. 양이온 교환 크로마토그래피(IEC)에 의한 평가를 행한 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 항IL-31 수용체 항체에 있어서도, 정상영역을 IgG1으로부터 IgG2로 변환함으로써 이질성이 증대하고, 정상영역을 M14 또는 M58로 변환함으로써, 어느 한 항체에 있어서도 이질성을 저감할 수 있는 것이 확인되었다.
[실시예 6] 항IL-31 수용체 항체에 있어서의 신규 정상영역 M58에 의한 약물동태 개선효과
참고예 9에 나타낸 바와 같이, 항IL-6 수용체 항체인 huPM1 항체에 있어서, 정상영역을 IgG1으로부터 M58로 변환함으로써, 인간 FcRn으로의 결합성이 향상되어, 인간 FcRn 형질전환 마우스에 있어서 약물동태가 향상되는 것이 발견되었다. 이에, 항IL-31 수용체 항체에 대해서도, 정상영역을 M58로 변환함으로써 약물동태를 향상시킬 수 있는지 여부를 검토하였다.
실시예 4 및 실시예 5에서 제작한 H0L0-IgG1(H쇄 H0-IgG1/서열번호:133, L쇄 L0/서열번호:56), H0L0-M58(H쇄 H0-M58/서열번호:136, L쇄 L0/서열번호:56)을 참고예 9에 나타낸 방법으로 인간 FcRn으로의 결합성을 평가하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.
Figure pct00003
표 3에 나타낸 바와 같이, 항IL-31 수용체 항체인 H0L0에 있어서도, 정상영역을 IgG1으로부터 M58로 변환함으로써, 항IL-6 수용체 항체인 hPM1과 마찬가지로, 인간 FcRn으로의 결합성이 향상하는 것이 확인되었다. 이것으로부터, 정상영역을 IgG1으로부터 M58로 변환함으로써, 항IL-31 수용체에 있어서도 인간에서 약물동태가 향상될 가능성이 나타내어졌다.
[실시예 7] 등전점을 저하시키는 변이 개소의 동정
변이체의 제작
각 변이체의 제작은 실시예 4에 준하는 방법, 또는 PCR을 사용한 어셈블리 PCR을 사용함으로써 행해졌다. 어셈블리 PCR을 사용해서 행하는 방법은, 개변부위를 포함하는 순쇄(順鎖) 및 역쇄(逆鎖)의 서열을 토대로 설계한 올리고 DNA의 합성을 행한다. 개변부위를 포함하는 순쇄의 올리고 DNA와 개변을 행하는 유전자가 삽입되어 있는 벡터에 결합하는 역쇄의 올리고 DNA, 개변부위를 포함하는 역쇄의 올리고 DNA와 개변을 행하는 유전자가 삽입되어 있는 벡터에 결합하는 순쇄의 올리고 DNA를 각각 조합하고, PrimeSTAR(TAKARA)를 사용하여 PCR을 행함으로써, 개변부위를 포함하는 단편을 5' 말단측과 3' 말단측의 2개를 제작하였다. 그 2개의 단편을 어셈블리 PCR에 의해 서로 연결함으로써, 각 변이체를 제작하였다. 제작된 변이체를 동물세포에 있어서 삽입 유전자를 발현 가능하게 하는 발현 벡터에 삽입하고, 얻어진 발현 벡터의 염기서열은 당업자 공지의 방법으로 결정하였다. 항체의 제작 및 정제는 실시예 4의 방법에 따라 행하였다.
변이 개소의 동정
H0L0(H쇄 H0-SKSC/서열번호:54, L쇄 L0/서열번호:56)의 약물동태를 향상시키기 위해, 가변영역의 등전점을 저하시킬 수 있는 개변 개소의 검토를 행하였다. 입체구조 모델로부터 추찰된 가변영역 변이 개소를 스크리닝한 결과, NR10으로의 결합을 크게 저하시키지 않고 가변영역의 등전점을 저하시키는 개소를 발견하고, 그들을 표 4에 정리하였다(Hp5-VH/서열번호:137, Hp7-VH/서열번호:138, Hp8-VH/서열번호:139, Hp6-VH/서열번호:140, Hp9-VH/서열번호:141, Hp1-VH/서열번호:142, Hp13-VH/서열번호:143, Lp1-VL/서열번호:144, Lp2-VL/서열번호:145, Lp3-VL/서열번호:146, Lp4-VL/서열번호:147, Lp7-VL/서열번호:148, Lp5-VL/서열번호:149, Lp6-VL/서열번호:150). 각 개변체의 제작, 정제는 실시예 4에 기재한 방법으로 행하였다.
각 개변체의 hIL-31/hNR10 결합 저해활성을 FMAT를 사용해서 평가하였다. 방법은 실시예 4의 방법에 따라 행하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 각 개변체의 경합활성은 H0L0의 그것과 비교하여 커다란 저하는 나타나지 않았다.
Figure pct00004
상기 표 4 중에 있어서의 ※는, 인간 서열로 하기 위해 등전점에는 관계 없으나 개변한 개소이다.
이들의 개변을 조합한 등전점을 저하시킨 인간화 NS22 항체의 예로서, Hp3Lp15(H쇄 Hp3-SKSC/서열번호:151, L쇄 Lp15/서열번호:152)를 들 수 있다. Hp3Lp15의 NR10에 대한 친화성, 등전점, 및 마우스에 있어서의 혈장 중 체류성을 H0L0와 비교하였다.
친화성의 측정
각 항체의 NR10에 대한 친화성을 참고예 10의 방법에 따라 행하였다.
측정한 친화성의 결과를 표 5에 나타내었다. Hp3Lp15의 친화성은 H0L0의 그것과 거의 동등한 것이 나타내어졌다.
Figure pct00005
등전점의 측정
가변영역의 아미노산 개변에 의한 전장 항체의 등전점의 변화에 대해 평가하기 위해, 각 항체의 등전점 전기영동에 의한 분석을 실시하였다. 등전점 전기영동의 방법은 이하에 준하였다.
Phastsystem Cassette(Amersham Biosciences사제)를 사용하여 이하의 팽윤액으로 30분 정도 Phast-Gel Dry IEF(Amersham Biosciences사제) 겔을 팽윤시켰다.
밀리Q워터 1.5 mL
Pharmalyte 5-8 for IEF(Amersham Biosciences사제) 100 μL
팽윤한 겔을 사용하여 PhastSystem(Amersham Biosciences사제)에 의해 이하의 프로그램으로 전기영동을 행하였다. 샘플은 Step 2에서 겔에 첨가하였다. pI 마커로서, Calibration Kit for pI(Amersham Biosciences사제)를 사용하였다.
Step 1: 2000 V 2.5 mA 3.5 W 15℃ 75 Vh
Step 2: 200 V 2.5 mA 3.5 W 15℃ 15 Vh
Step 3: 2000 V 2.5 mA 3.5 W 15℃ 410 Vh
영동 후의 겔은 20% TCA로 고정한 후, Silver staining Kit, protein(Amersham Biosciences사제)을 사용하여, 키트에 첨부되어 있는 프로토콜에 따라 은 염색을 행하였다. 염색 후, pI 마커의 기지 등전점으로부터 샘플(전장 항체)의 등전점을 산출하였다.
등전점 전기영동에 의해 등전점을 측정한 결과, H0L0의 등전점은 약 7.8이고, Hp3Lp15의 등전점은 약 5.5인 것으로부터, Hp3Lp15의 등전점은 H0L0의 등전점과 비교하여 약 2.3 저하되었다. 또한, 가변영역 VH/VL의 이론 등전점을 GENETYX(GENETYX CORPORATION)에 의해 계산한 바, H0L0의 가변영역의 이론 등전점은 7.76이고, Hp3Lp15의 가변영역의 이론 등전점은 4.63으로, Hp3Lp15는 H0L0과 비교하여 이론 등전점이 3.13 저하되었다.
마우스를 사용한 등전점을 저하시킨 항체의 약물동태의 평가
등전점을 저하시킨 개변 항체, Hp3Lp15의 혈장 중 체류성을 평가하기 위해, H0L0와 Hp3Lp15의 정상 마우스에 있어서의 혈장 중 체류성의 비교를 행하였다. H0L0 및 Hp3Lp15를 마우스(C57BL/6J, 닛폰 찰스·리버)에 1 ㎎/㎏으로 정맥 내에 단회 투여하고 혈장 중 농도 추이를 비교하였다. 혈장 중 농도 측정은 ELISA법으로 측정하였다. 적당한 농도의 검량선 시료 및 혈장 측정시료를 Anti-human IgG(Fc-specific) antibody(Sigma사제)로 고상화한 이뮤노플레이트(Nunc-Immuno Plate, MaxiSorp(Nalge nunc International사제))에 분주하고, 실온에서 1시간 정치 후에 하였다. Goat Anti-Human IgG-ALP(Sigma사제)를 실온에서 1시간 반응시킨 후, BluePhos Microwell Phosphatase Substrates System(Kirkegaard & Perry Laboratories사제)을 기질로서 사용하여 발색반응을 행하고, 마이크로플레이트 리더로 650 ㎚의 흡광도를 측정하였다. 혈장 중 농도는 검량선의 흡광도로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices사제)를 사용하여 산출하였다.
얻어진 혈장 중 농도 추이의 데이터를 약물동태 해석 소프트 WinNonlin(Pharsight사제)을 사용해서 약물동태학적 파라미터(AUC, 전신 클리어런스(CL))를 산출하여 표 6에 나타내었다. H0L0에 대해, Hp3Lp15의 정맥 내 투여 후의 AUC는 약 14%, 클리어런스가 약 12% 저하되었다. 이와 같이, H0L0의 등전점을 저하시킨 Hp3Lp15는, 그 약물동태가 상승되는 것이 발견되었다.
Figure pct00006
[실시예 8] 가변영역과 정상영역의 조합에 의한 생물활성으로의 영향
상이한 정상영역을 사용하는 것에 의한 생물활성으로의 영향을 평가하기 위해 이하의 개변체를 제작하였다.
H쇄로서, 정상영역을 참고예 7 및 9에서 제작한 SKSC(서열번호:62), M58(서열번호:128) 가변영역을 실시예 7에서 제작한 가변영역 Hp3(Hp3-VH/서열번호:167)를 조합하여 Hp3-M58(서열번호:240), Hp3-SKSC(서열번호:151)를 제작하였다. 제작한 H쇄와 실시예 7에서 제작한 L쇄 Lp15(Lp15/서열번호:152)를 조합하여 Hp3Lp15-SKSC(H쇄 Hp3-SKSC/서열번호:151, L쇄 Lp15/서열번호:152) 및 Hp3Lp15-M58(H쇄 Hp3-M58/서열번호:240, L쇄 Lp15/서열번호:152)을 제작하였다. 각 항체의 발현·정제는 실시예 4에 기재한 방법으로 행하였다.
상기에서 제작한 각 항체와, 참고예 7에 기재한 정상영역 SKSC(서열번호:62)을 사용한 H0L0-SKSC(H쇄 H0-SKSC/서열번호:54, L쇄 L0/서열번호:56), 실시예 5에서 제작한 H0L0-M58(H쇄 H0-M58/서열번호:136, L쇄 L0/서열번호:56) 및 H0L0-IgG2(H쇄 H0-IgG2/서열번호:134, L쇄 L0/서열번호:56)에 대해서, BaF/NR10을 사용한 생물활성을 실시예 2에 기재한 방법으로 행하여, 그 결과를 도 18에 정리하였다.
도 18에 나타내는 바와 같이, 정상영역 사이에서 큰 생물활성의 차는 검출되지 않았다. 2개의 가변영역 H0, Hp3와 각 정상영역을 조합해도 생물활성에 영향을 주지 않은 것으로부터, 향후 제작하는 가변영역에 있어서, 어떤 정상영역과 조합해도 생물활성은 변화하지 않을 것으로 생각된다.
[실시예 9] 열 가속시험에 의한 분해를 억제하는 변이개소의 동정
의약품에 사용하는 항체는, 단일 항체 생산세포에 유래하는 클론으로부터 얻어지는 단일클론항체임에도 불구하고, 이질성이 존재한다. 그와 같은 항체의 이질성은 산화, 탈아미드화 등의 수식에 의해 일어나고, 장기간의 보존 중이나 열 스트레스, 빛 스트레스라는 스트레스 조건하에 노출됨으로써 증가하는 것이 알려져 있다(참고문헌: Heterogeneity of Monoclonal Antibodies:Journal of pharmaceutical sciences, vol.97,No.7,2426-2447). 그러나, 항체를 의약품으로서 개발하는 데 있어서, 그 단백질의 물성, 중에서도 균일성과 안정성은 매우 중요하여, 목적물질/관련물질의 이질성을 저감하고, 가능한 한 단일 물질인 것이 요망된다. 이에, 스트레스 조건하에 있어서의 항체의 이질성을 평가하고, 그 이질성을 저감하기 위해 이하의 실험을 행하였다.
분해물을 평가하기 위해, H0L0(H쇄 H0-SKSC/서열번호:54, L쇄 L0/서열번호:56)의 열 가속품을 이하의 방법으로 조제하였다. 조제한 열 가속품 및 미 가속품(initial)에 대해, 이하의 방법으로 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 분석을 행하였다.
·열 가속 품의 조제방법
완충액: PBS
항체 농도: 0.2-1.0 ㎎/mL
가속온도: 60℃
가속기간: 1일간
·양이온 교환 크로마토그래피의 분석방법
칼럼: ProPac WCX-10, 4×250 ㎜(Dionex)
이동상: (A) 25 m㏖/L MES/NaOH, pH 6.1
(B) 25 m㏖/L MES/NaOH, 250 m㏖/L NaCl, pH 6.1
유속: 0.5 mL/min
칼럼 온도: 40℃
그라디언트: %B 0 to 0(o-5 min)→0 to 30(5-80 min)
검출: 280 ㎚
H0L0의 열 가속 전, 후의 샘플의 크로마토그램의 결과를 도 19에 나타내었다. H0L0의 열 가속 후의 샘플에 있어서, 염기성의 피크가 증가하는 경향이 얻어졌다.
이에, 이 피크를 저감시키기 위해, 스크리닝을 행한 결과 Ha355, Ha356, Ha360, Ha362를 발견하고, 그들 H쇄 개변체와 L0를 조합한 Ha355L0(H쇄 Ha355-SKSC/서열번호:242 L쇄 L0/서열번호:56), Ha356L0(H쇄 Ha356-SKSC/서열번호:243 L쇄 L0/서열번호:56), Ha360L0(H쇄 Ha360-SKSC/서열번호:244 L쇄 L0/서열번호:56), Ha362L0(H쇄 Ha362-SKSC/서열번호:245 L쇄 L0/서열번호:56)를 제작하였다. 각 개변체의 서열을 표 7에 정리하였다.
Figure pct00007
발견한 각 항체의 발현·정제는 실시예 4에 기재한 방법으로 행하였다. 제작한 각 항체를 H0L0과 마찬가지로, 열 가속품을 조제하고, 양이온 교환 크로마토그래피로 분석하여, 그 결과를 도 19에 나타내었다.
그 결과, H쇄 101번째의 아스파라긴산이 글루타민산으로 치환된 개변을 포함하는 개변 항체에서는, 열 가속 후에 증가하는 염기성 피크의 생성이 H0L0에 비해 적었다. 이들 개변 항체를 BaF/NR10을 사용한 생물활성을 실시예 2에 기재한 방법으로 행하고, 그 결과를 도 20에 나타낸다. 도 20에 나타내는 바와 같이, 이들의 개변의 생물활성은 H0L0의 그것과 비교하여 거의 동등, 또는 그 이상을 나타내었다. 이상의 사실로부터, Ha355, Ha356, Ha360, Ha362의 개변이 열 가속에 의해 생성하는 분해물을 억제하여, 항체의 안정성을 높이는 측면에서 효과적인 것을 발견하였다.
[실시예 10] 친화성을 증가시키는 변이 개소의 동정
H0L0의 NR10으로의 친화성을 향상시키기 위해, CDR 서열에 변이를 도입한 라이브러리를 제작하여 검토하였다. CDR에 변이를 도입한 라이브러리를 스크리닝한 결과, NR10으로의 친화성을 향상하는 변이를 발견하고, 그들을 표 8에 정리하였다. 각각의 H쇄 개변체 Ha101-SKSC(서열번호:246), Ha103-SKSC(서열번호:247), Ha111-SKSC(서열번호:248), Ha204-SKSC(서열번호:249), Ha219-SKSC(서열번호:250)와 L0(L0/서열번호:56), 각각의 L쇄 개변체 La134(서열번호:251), La130(서열번호:252), La303(서열번호:253), La328(서열번호:254)과 H0(H0-SKSC/서열번호:54)를 각각 조합하여, 각 항체를 제작하였다. 각 개변체의 제작, 정제는 실시예 4에 기재한 방법으로 행하였다.
각 개변체의 NR10에 대한 친화성을 Biacore를 사용해서 평가하고, 표 9에 나타내었다. 방법은 참고예 10에 기재한 방법으로 행하였다. 표 9에 나타낸 바와 같이, 각 개변체의 KD값은 H0L0(H쇄 H0-SKSC/서열번호:54, L쇄 L0/서열번호:56)의 그것과 비교하여 향상되어 있는 것을 발견하였다.
Figure pct00008
Figure pct00009
이들 친화성을 향상시킨 변이와 실시예 7에서 제작한 등전점을 저하시키는 변이를 조합한 예로서, Ha401La402(H쇄 Ha401-SKSC/서열번호:255, L쇄 La402/서열번호:256), 또는 H17L11(H쇄 H17-M58/서열번호:222, L쇄 L11/서열번호:236)을 들 수 있다. 각 개변체의 제작, 정제는 실시예 4에 기재한 방법으로 행하였다.
Ha401La402(H쇄 Ha401-SKSC/서열번호:255, L쇄 La402/서열번호:256)의 NR10에 대한 친화성 및 BaF/NR10을 사용한 생물활성을 참고예 10 및 실시예 2에 기재한 방법으로 행하고, H0L0(H쇄 H0-SKSC/서열번호:54, L쇄 L0/서열번호:56)와 비교하였다. 측정한 친화성의 결과를 표 10, BaF/NR10을 사용한 생물활성을 도 21에 나타내었다. 친화성, 생물활성 모두 H0L0(H쇄 H0-SKSC/서열번호:54, L쇄 L0/서열번호:56)의 그것보다 향상되어 있는 것을 발견하였다.
Figure pct00010
또한, H17L11((H쇄 H17-M58/서열번호:222, L쇄 L11/서열번호:236)의 NR10에 대한 친화성 및 BaF/NR10을 사용한 생물활성을 실시예 7 및 실시예 2에 기재한 방법으로 행하고, H0L0(H쇄 H0-M58/서열번호: 136, L쇄 L0/서열번호:56)와 비교하였다. 측정한 친화성의 결과를 표 11, BaF/NR10을 사용한 생물활성을 도 22에 나타내었다. 친화성, 생물활성 모두 H0L0(H쇄 H0-M58/서열번호:136, L쇄 L0/서열번호:56)의 그것보다 향상되어 있는 것을 발견하였다.
Figure pct00011
[실시예 11] 면역원성의 리스크를 저하시키기 위한 변이 개소의 동정
H쇄 CDR1 의 면역원성의 리스크의 저감
H0L0의 가변영역 서열에 존재하는 T-cell 에피토프를 TEPITOPE(Methods. 2004 Dec;34(4):468-75)를 사용하여 해석을 행하였다. 그 결과, H쇄 CDR1에 많은 HLA에 결합하는 T-cell 에피토프가 존재하는(면역원성의 리스크가 높은 서열이 존재하는) 것이 예측되었다. 이에, TEPITOPE 해석에 있어서 H쇄 CDR1의 면역원성의 리스크를 저감시키는 개변을 검토한 바, kabat numbering 33번째의 이소류신(I)을 알라닌(A)으로 치환함으로써, 면역원성의 리스크가 크게 감소하는 것이 개변을 발견하였다(표 12). 이 개변을 실시예 10에서 제작한 H17에 대해 첨가한 H19(H19-M58/서열번호:223)를 제작하였다. 제작한 H19을 L12와 조합하여 H19L12(H쇄 H19-M58/서열번호:223, L쇄 L12/서열번호:237)를 제작하였다. 각 개변체의 제작, 정제는 실시예 4에 기재한 방법으로 행하였다.
NR10에 대한 친화성 및 BaF/NR10을 사용한 생물활성을 참고예 10 및 실시예 2에 기재한 방법으로 행하여, H0L0(H쇄 H0-M58/서열번호:136, L쇄 L0/서열번호:56)와 비교하였다. 측정한 친화성의 결과를 표 13, BaF/NR10을 사용한 생물활성을 도 23에 나타내었다. 친화성, 생물활성 모두 H0L0의 그것과 거의 동등한 활성을 나타내는 것이 나타내어졌다.
Figure pct00012
Figure pct00013
L쇄 CDR1 의 면역원성의 리스크의 저감
L쇄의 CDR1에 존재하는 kabat numbering 25번째의 트레오닌(T)은 생식세포계열 서열에서는 알라닌(A) 또는 세린(S)이다. 이에, 25번째의 트레오닌(T)을 알라닌(A), 또는 세린(S)으로 개변하는 쪽이 면역원성의 리스크가 낮은 것이 예상된다(표 14). 이에, L12에 대해 상기의 개변을 더한 L17(서열번호:238)을 제작하였다. 제작한 L17과 H0를 조합하여 H0L17(H쇄 H0-M58/서열번호:136, L쇄 L17/서열번호:238)을 제작하였다. 개변체의 제작, 정제는 실시예 4에 기재한 방법으로 행하였다.
각 개변체의 NR10에 대한 친화성 및 BaF/NR10을 사용한 생물활성을 참조예 10 및 실시예 2에 기재한 방법으로 행하고, H0L0(H쇄 H0-M58/서열번호:136, L쇄 L0/서열번호:56), 및 H0L12(H쇄 H0-M58/서열번호:136, L쇄 L12/서열번호:237)와 비교하였다. L12는 친화성이 향상되는 서열을 포함하기 때문에, H0L0와 비교하여 약 2배 높은 친화성을 나타내고 있다. 측정한 친화성의 결과를 표 15, BaF/NR10을 사용한 생물활성을 도 24에 나타내었다. 친화성, 생물활성 모두 H0L12의 그것과 거의 동등한 친화성 및 생물활성을 나타내는 것이 나타내어졌다.
Figure pct00014
Figure pct00015
[실시예 12] 완전 인간화 NS22 항체의 제작
상기 실시예에서 발견된 pI를 저하시키는 개변, 친화성을 상승시키는 개변, H쇄의 분해를 억제하는 개변, 면역원성의 리스크를 저하시키는 개변을 H0(H0-M58/서열번호:136), H1(H1-M58/서열번호:257), 또는 L0(L0/서열번호:56)에 대해 복수 조합하여 NS22 개변체의 가변영역을 제작하고, 각종 스크리닝을 실시한 결과, H28L17(H쇄 H28-M58/서열번호:224, L쇄 L17/서열번호:238), H30L17(H쇄 H30-M58/서열번호:225, L쇄 L17/서열번호:238), H34L17(H쇄 H34-M58/서열번호:226, L쇄 L17/서열번호:238), H42L17(H쇄 H42-M58/서열번호:227, L쇄 L17/서열번호:238), H44L17(H쇄 H44-M58/서열번호:228, L쇄 L17/서열번호:238), H46L17(H쇄 H46-M58/서열번호:229, L쇄 L17/서열번호:238), H57L17(H쇄 H57-M58/서열번호:230, L쇄 L17/서열번호:238), H71L17(H쇄 H71-M58/서열번호:231, L쇄 L17/서열번호:238), H78L17(H쇄 H78-M58/서열번호:232, L쇄 L17/서열번호:238), H92L17(H쇄 H92-M58/서열번호:233, L쇄 L17/서열번호:238), H97L50(H쇄 H97-M58/서열번호:234, L쇄 L50/서열번호:239), H98L50(H쇄 H98-M58/서열번호:235, L쇄 L50/서열번호:239)를 발견하였다. 개변체의 제작, 정제는 실시예 4에 기재한 방법으로 행하였다.
각 개변체의 NR10에 대한 친화성 및 BaF/NR10을 사용한 생물활성을 참고예 10 및 실시예 2에 기재한 방법으로 행하고, H0L0(H쇄 H0-M58/서열번호:136, L쇄 L0/서열번호:56)와 비교하였다. 측정한 친화성의 결과를 표 16, BaF/NR10을 사용한 생물활성을 도 25-1 및 도 25-2에 나타내었다. 어느 항체의 친화성, 생물활성 모두 H0L0의 그것과 거의 동등 또는 그 이상을 나타내는 것이 나타내어졌다.
Figure pct00016
[실시예 13] 항NR10 중화항체의 결합 도메인의 해석
(1) 인간·마우스 야생형 및 키메라 항원의 조제
인간과 마우스의 야생형 및 키메라 NR10 세포외영역(hhh(서열번호:258), mmm(서열번호:259), hhm(서열번호:260), mmh(서열번호:261), hmm(서열번호:262), mhm(서열번호:263), mhh(서열번호:264))을 코드하는 유전자를, C 말단에 His 태그와 Myc 태그(HHHHHHEQKLISEEDL/서열번호:287)를 부여하여 동물세포 발현 벡터에 삽입하고, FreeStyle 293 Expression System(invitrogenTM)으로 일과성 발현시켰다. 이들 인간·마우스 야생형 및 키메라 NR10-ECD의 모식도를 도 26에 나타낸다.
배양상청으로부터의 인간·마우스 야생형 및 키메라 항원(hhh, mmm, hhm, mmh, hmm, mhm, mhh)의 정제는, Ni-NTA Superflow 칼럼 크로마토그래피로 행하였다. 즉, Ni-NTA Superflow(QIAGEN) 1 mL를 폴리프레프 엠프티 칼럼(Poly-Prep Empty Column)(BioRad)에 충전하고, 각 30 mL의 배양상청을 첨가하여, 150 mM 염화나트륨과 20 mM 이미다졸을 포함하는 D-PBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Salines)로 세정한 후, 150 mM 염화나트륨과 250 mM 이미다졸을 포함하는 D-PBS로 용출하였다. 용출 획분은 분획 분자량 10 K의 Amicon-Ultra(Millipore)에서 D-PBS로 치환한 후, 농축하였다.
(2) Western Blot에 의한 결합 항원의 검출
조제한 인간·마우스 야생형 및 키메라 항원을 각 0.5 ㎍/lane 상당, 4-20% 폴리아크릴아미드 겔(다이이치화학) 3장에서 전기영동하였다. 세미드라이형 블로팅장치에서 PVDF막(Millipore)에 전기적으로 전사하고, 5% SkimMilk를 포함하는 TBS로 블로킹하였다. 1장(인간화 항인간 NR10 항체 검출계)은 5 ㎍/mL의 H44M58L17에서, 1장(마우스 항인간 NR10 항체 검출계)은 5 ㎍/mL의 ND41에서, 1장(Myc 태그 검출계)은 5% SkimMilk를 포함하는 TBS로 500배로 희석한 항Myc 항체(SantaCruz, Cat.#sc-789)에서 실온에서 1시간 반응시켰다.
0.05% TweenTM 20를 포함하는 TBS로 3분간 3회 세정한 후, 2차 항체를 반응시켰다. 인간화 항인간 NR10 항체 검출계에는 알칼리 포스파타아제 표지 염소 항인간 IgGγ(BIOSOURCE, Cat.#AHI0305)를, 마우스 항인간 NR10 항체 검출계에는 알칼리 포스파타아제 표지 염소 항마우스 IgG(SantaCruz, Cat.#sc-2008)를, Myc 태그 검출계에는 알칼리 포스파타아제 표지 염소 항토끼 IgG(SantaCruz, Cat.#sc-2057)를 사용하여, 실온에서 1시간 반응시켰다. 0.05% TweenTM 20를 포함하는 TBS로 3분간 4회 세정한 후, BCIP/NBT Phosphatase substrate, 1-Component System(KPL)에 의해 발색시켰다. 여기서 사용한 TBS(Tris-Buffered Saline)는, TBS(Tris-Buffered-Saline)powder(TaKaRa) 1포를 증류수 1 L에 용해하여 조제하였다. 결과를 도 27에 나타낸다.
인간화 항체, 마우스 항체를 사용한 경우는, NR10의 세포외영역인 hhh, hhm, hmm에만 결합이 검출되었다.
[참고예 1] 게잡이원숭이 NR10, OSMR, IL-31 유전자의 단리
전임상단계에서의 안전성 평가를 위해, 게잡이원숭이로의 교차성·중화활성은 중요하다고 생각하여, 게잡이원숭이 NR10 유전자, OSMR 유전자의 단리를 시도하였다. 공개되어 있는 붉은털원숭이 정보 등으로부터 프라이머를 설계하고, PCR법에 의해 게잡이원숭이 비장 cDNA로부터 NR10 유전자, OSMR 유전자의 증폭에 성공하였다. 단리한 게잡이원숭이 NR10, OSMR, IL-31의 유전자 서열을 서열번호: 65, 69, 67에 나타낸다. 또한 게잡이원숭이 NR10, OSMR, IL-31의 아미노산 서열을 서열번호: 66, 70, 68에 나타낸다.
[참고예 2] NR10 및 OSMR 발현 Ba/F3 세포주의 수립
인간 전장 NR10 cDNA(서열번호:75)를 발현 벡터 pCOS1(Biochem Biophys Res Commun. 228, p838-45, 1996)에 삽입하여, pCosNR10.3로 하였다. 온코스타틴 M 수용체 cDNA(OSMR, GenBank accession No. NM003999)를 인간 태반 라이브러리로부터 PCR법에 의해 단리하여, 마찬가지로, 발현 벡터 pCos1-hOSMR을 구축하였다. 마우스 IL-3 의존성 pro-B 세포 유래 세포주 Ba/F3에, 각각의 벡터 10 ㎍씩을 동시에 전기천공법으로 도입하였다(BioRad Gene Pulser, 960 μF, 0.33 kV). 도입 후는, 인간 IL-31(R&D Systems)을 첨가·배양하여, IL-31 의존성에 증식을 나타내는 세포주(hNR10/hOSMR/BaF3 세포)를 얻었다. 또한, 게잡이원숭이 IL-31 유전자(서열번호:67)를 포유동물 세포용 발현 벡터에 삽입하고, CHO 세포주 DG44에 도입하여, 그 배양상청으로서 게잡이원숭이 IL-31을 얻었다. 이 배양상청을 사용하여, hNR10/hOSMR/BaF3와 마찬가지로, 게잡이원숭이 전장 NR10 및 게잡이원숭이 OSMR 유전자를 발현 벡터 pCOS1에 각각 삽입하고, Ba/F3 세포에 발현시켜서 게잡이원숭이 IL-31 의존성 세포주(cynNR10/cynOSMR/BaF3 세포)를 수립하였다.
[참고예 3] NR10 발현 CHO 세포주의 수립
세포내영역 결실형 인간 NR10 유전자(서열번호:73) 및 세포내영역 결실형 게잡이원숭이 NR10 유전자(서열번호:71)를 각각 포유동물 세포용 발현 벡터에 삽입하고, 이 벡터를 제한효소로 직쇄상으로 한 후, CHO 세포주 DG44에 전기천공법으로 도입하였다(BioRad Gene Pulser, 25 μF, 1.5 kV). 약제로 선발하고, 항인간 NR10 항체를 사용하여 FCM 해석에 의해 NR10 발현 세포를 선택하여, 수립하였다. 또한 세포내영역 결실형 인간 NR10 유전자의 염기서열(서열번호:73)에 의해 코드되는 아미노산 서열을 서열번호:74, 세포내영역 결실형 게잡이원숭이 NR10 유전자의 염기서열(서열번호:71)에 의해 코드되는 아미노산 서열을 서열번호:72에 나타낸다.
[참고예 4] NR10 단백(세포외영역)의 조제
인간 NR10 cDNA를 주형으로, PCR법에 의해 세포외영역만을 증폭하고, 또한 C 말단에 FLAG 태그 서열을 부가하여, 포유동물 세포용 발현 벡터에 삽입하였다. 직쇄상으로 한 이 벡터 10 ㎍을 차이니즈 햄스터 난소 세포주 DG44로 전기천공법에 의해 도입하여(BioRad Gene PulserII, 25 μF, 1.5 kV), 고발현을 나타내는 세포주를 얻었다. 이 세포주를 대량 배양한 배양상청으로부터 항FLAG 항체 칼럼(SIGMA제), 겔 여과법에 의해 정제하여 가용형 NR10을 얻었다. 가용형 NR10의 염기서열을 서열번호:77에, 아미노산 서열을 서열번호:78에 나타낸다.
[참고예 5] 항인간 NR10 항체의 제작
인간 NR10 단백(세포외영역)[참고예 4에 기재]을 마우스에 면역하고, 통상의 방법에 의해 하이브리도마를 제작하였다. 이들 하이브리도마의 배양상청을, 참고예 2에서 나타낸 인간 IL-31 의존성 세포주(hNR10/hOSMR/BaF3 세포)를 사용한 중화활성으로 평가하여, NR10 중화활성을 갖는 NA633을 얻었다.
또한, 인간 NR10 전장 유전자(서열번호:75)를 삽입한 포유동물용 발현 벡터를 사용하고, He 가스 사출 유전자총을 사용해 DNA 면역을 행하여, 통상의 방법에 의해 하이브리도마를 제작하였다. 이들 하이브리도마의 배양상청을, 참고예 2에서 나타낸 인간 IL-31 의존성 세포주(hNR10/hOSMR/BaF3 세포)를 사용한 중화활성으로 평가하여, NR10 중화활성을 갖는 ND41을 얻었다.
[참고예 6] 인간·키메라 항체의 제작
NA633의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열을 서열번호:104에, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 서열번호:108에 나타낸다. 또한, NA633의 중쇄 가변영역의 CDR1의 아미노산 서열을 서열번호:105에, CDR2의 아미노산 서열을 서열번호:106에, CDR3의 아미노산 서열을 서열번호:107에, 경쇄 가변영역의 CDR1의 아미노산 서열을 서열번호:109에, CDR2의 아미노산 서열을 서열번호:110에, CDR3의 아미노산 서열을 서열번호:111에 나타낸다. 또한, 통상의 방법에 따라, 이들 마우스 가변영역과, 인간 정상영역(H쇄는 γ1, L쇄는 κ)과의 키메라 항체를 제작하였다.
[참고예 7] 안정성을 저하시키지 않고 야생형 IgG2의 이질성을 저감한 huPM1-SKSC의 제작
NS22 항체는 NR10 중화항체인 것으로부터, 면역원성과 부작용을 고려한 경우, Fcγ 수용체로의 결합은 바람직하지 않을 가능성이 생각된다. Fcγ 수용체로의 결합을 줄이기 위해, 정상영역의 아이소타입을 IgG1이 아닌, IgG2 또는 IgG4를 선택하는 방법이 생각되고(Ann Hematol. 1998 Jun;76(6):231-48.), Fcγ 수용체 I 및 혈장 중 체류성의 관점에서는 IgG4보다는 IgG2가 바람직하다고 생각되었다(Nat Biotechnol. 2007 Dec;25(12):1369-72). 한편, 항체를 의약품으로서 개발하는 데 있어서, 그 단백질의 물성, 그 중에서도 균일성과 안정성은 매우 중요하여, IgG2 아이소타입은, 힌지영역의 디설피드 결합에 유래하는 이질성이 매우 많은 것이 보고되어 있다(J Biol Chem. 2008 Jun 6;283(23):16206-15.). 이것에 유래하는 목적물질/관련물질의 이질성의 제조간 차를 유지하면서 의약품으로서 대량으로 제조하는 것은 용이하지 않아 비용 증가로 이어져, 가능한 한 단일 물질인 것이 요망된다. 따라서 IgG2 아이소타입의 항체를 의약품으로서 개발하는 데는 안정성을 저하시키지 않고 디설피드 결합 유래의 이질성이 저감되어 있는 것이 바람직하다.
야생형 IgG2의 이질성을 저감하는 것을 목적으로 IgG2의 힌지부분의 시스테인 및 CH1 도메인에 존재하는 시스테인의 개변을 행하였다. 각종 개변체의 검토 결과, 야생형 IgG2 정상영역 서열 중, H쇄의 CH1 도메인에 존재하는 EU 넘버링(Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242) 131번째의 시스테인과 133번째의 아르기닌을 각각 세린과 리신으로 개변하고, H쇄의 upper hinge에 존재하는 EU 넘버링 219번째의 시스테인을 세린으로 개변한 정상영역인 SKSC(서열번호:62)에 의해, 안정성을 저하시키지 않고 이질성을 저감하는 것이 가능하다고 생각된다. 한편, 이질성을 저감하는 방법으로서, H쇄의 upper hinge에 존재하는 EU 넘버링 219번째의 시스테인만을 세린으로 개변하는 방법, 및 220번째의 시스테인만을 세린으로 개변하는 방법이 생각된다. 이에, IgG2의 EU 넘버링 219번째의 시스테인을 세린으로 개변한 정상영역인 SC(서열번호:153), 및 IgG2의 EU 넘버링 220번째의 시스테인을 세린으로 개변한 정상영역인 CS(서열번호:154)를 제작하였다.
H쇄로서, 상기에서 제작한 각 정상영역과 IgG1(서열번호:60), 및 IgG2(서열번호:132)과 인간화 항 IL-6 수용체 항체의 가변영역(H쇄 가변영역 huPM1-VH/서열번호:155, L쇄 가변영역 huPM1-VL/서열번호:156)(Cancer Res. 1993 Feb 15;53(4):851-6.)을 조합한 huPM1-SC(서열번호:157), huPM1-CS(서열번호:158), huPM1-IgG1(서열번호:159), huPM1-IgG2(서열번호:160) 및 huPM1-SKSC(서열번호:161)를 사용하고, L쇄로서 huPM1-L(서열번호:162)을 사용하여 각 항체를 제작하였다. 각 항체의 발현·정제는 실시예 4에 기재한 방법으로 행하였다.
각각의 항체의 이질성의 비교를 행하였다. huPM1-IgG1, huPM1-IgG2, huPM1-SC, huPM1-CS, huPM1-SKSC의 이질성의 평가방법으로서, 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 평가를 행하였다. 칼럼으로서 ProPac WCX-10(Dionex)을 사용하고, 이동상 A로서 20 mM Sodium Acetate, pH 5.0, 이동상 B로서 20 mM Sodium Acetate, 1 M NaCl, pH 5.0을 사용하고, 적절한 유량 및 그라디언트를 사용해서 실시하였다. 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 평가를 행한 결과를 도 12에 나타내었다.
그 결과, 도 12에 나타내는 바와 같이, 정상영역을 IgG1에서 IgG2로 변환함으로써 이질성이 증대하였으나, 정상영역을 SKSC로 변환함으로써 이질성이 대폭 저감되었다. 한편, 정상영역을 SC로 한 경우는 정상영역을 SKSC로 한 경우와 마찬가지로 이질성이 대폭 저감되었으나, 정상영역을 CS로 한 경우는 충분히 이질성이 개선되지 않았다.
일반적으로 항체를 의약품으로서 개발하기 위해서는 이질성이 적을 뿐 아니라, 안정한 제제를 조제하기 위해 높은 안정성을 갖는 것이 바람직하다. 이에 안정성의 평가방법으로서, 시차주사형 열량 측정(DSC)에 의한 열변성 중간온도(Tm값)의 평가를 행하였다(VP-DSC, Microcal사제). 열변성 중간온도(Tm값)는 안정성의 지표로, 의약품으로서 안정한 제제를 제작하기 위해서는, 열변성 중간온도(Tm값)가 높은 것이 바람직하다(J Pharm Sci. 2008 Apr;97(4):1414-26). 이에, huPM1-IgG1, huPM1-IgG2, huPM1-SC, huPM1-CS, huPM1-SKSC를 20 mM sodium acetate, 150 mM NaCl, pH 6.0의 용액에 대해 투석(EasySEP, TOMY)을 행하고, 약 0.1 ㎎/mL의 단백질 농도로, 40℃에서 100℃까지 1℃/min의 승온속도로 DSC 측정을 행하였다. 얻어진 DSC의 변겅 곡선을 도 13에, Fab부분의 Tm값을 이하의 표 17에 나타내었다.
Figure pct00017
huPM1-IgG1 및 huPM1-IgG2의 Tm값은 거의 동등하여 약 94℃ 정도(IgG2가 약 1℃낮음)였던 것에 대해, huPM1-SC 및 huPM1-CS의 Tm값은 약 86℃로, huPM1-IgG1 및 huPM1-IgG2와 비교해서 현저히 Tm값이 저하되어 있었다. 한편, huPM1-SKSC의 Tm값은 약 94℃로, 거의 huPM1-IgG1 및 huPM1-IgG2와 동등하였다. huPM1-SC 및 huPM1-CS는 안정성이 IgG2와 비교해서 현저히 낮은 것으로부터, 의약품으로서 개발하기 위해서는, CH1 도메인의 시스테인도 세린으로 개변한 huPM1-SKSC가 바람직하다고 생각되었다. huPM1-SC 및 huPM1-CS의 Tm값이 IgG2와 비교해서 대폭 저하된 이유로서, huPM1-SC 및 huPM1-CS는 IgG2의 디설피드 결합 패턴과는 상이한 양식을 취하고 있기 때문이라고 생각되었다.
또한, DSC 변성곡선을 비교한 경우, huPM1-IgG1 및 huPM1-SKSC의 Fab부분의 변성 피크는 샤프했던 것에 대해, huPM1-SC 및 huPM1-CS는 이들과 비교해서, Fab부분의 변성 피크가 브로드하여, huPM1-IgG2는 Fab부분의 변성 피크의 저온측에 숄더 피크가 확인되었다. DSC의 변성 피크는 단일 성분의 경우는 통상 샤프한 변성 피크를 나타내나, Tm이 상이한 복수 성분(즉 이질성)이 존재하는 경우, 변성 피크는 브로드해지는 것으로 생각된다. 즉, huPM1-IgG2, huPM1-SC 및 huPM1-CS에는 복수 성분 존재하고, huPM1-SC 및 huPM1-CS는, 천연형 IgG2의 이질성이 충분히 저감되어 있지 않을 가능성이 시사되었다. 이 사실로부터, 천연형 IgG2의 이질성은 힌지부분의 시스테인뿐 아니라, CH1 도메인에 존재하는 시스테인의 양쪽이 관여하고 있다고 생각되어, DSC 상의 이질성을 저감하기 위해서는 힌지부분의 시스테인뿐 아니라, CH1 도메인의 시스테인도 개변할 필요가 있다고 생각되었다. 또한, 전술한 바와 같이, 힌지부분의 시스테인뿐 아니라, CH1 도메인의 시스테인을 개변함으로써 비로소 천연형 IgG2와 동등한 안정성을 갖는 것이 가능하다.
이상으로부터, IgG2의 힌지영역에 유래하는 이질성을 저감한 정상영역으로서, 힌지부분의 시스테인만을 세린으로 치환한 정상영역인 SC와 CS는 이질성 및 안정성의 관점에서 불충분하다고 생각되어, CH1 도메인에 존재하는 EU 넘버링 131번째의 시스테인도 세린으로 치환함으로써 비로소 IgG2와 동등한 안정성을 유지하면서 이질성을 대폭 저감하는 것이 가능한 것이 발견되었다. 그러한 정상영역으로서는, SKSC를 들 수 있다.
[참고예 8] Fc γ 수용체 비결합의 최적화 정상영역 M14 의 제작과 평가
IgG2의 정상영역은 Fcγ 수용체 결합부위 중 EU 넘버링: 233, 234, 235, 236이 비결합형이나, Fcγ 수용체 결합부위 중 EU 넘버링:327, 330, 331번째는 비결합형의 IgG4와는 상이한 서열이기 때문에, EU 넘버링:327, 330, 331번째의 아미노산을 IgG4의 서열로 개변할 필요가 있다(Eur J Immunol. 1999 Aug;29(8):2613-24에 있어서의 G2Δa). 그러나, IgG4는 EU 넘버링:339번째의 아미노산이 알라닌인 것에 대해, IgG2는 트레오닌이기 때문에, EU 넘버링:327, 330, 331번째의 아미노산을 IgG4의 서열로 개변한 것만으로는 천연에는 존재하지 않는 T-cell 에피토프 펩티드가 될 수 있는 9 아미노산의 새로운 펩티드 서열이 출현해 버려, 면역원성의 리스크가 발생한다. 이에, 전술한 개변에 더하여 새롭게 IgG2의 EU 넘버링:339번째의 트레오닌을 알라닌으로 개변함으로써, 새로운 펩티드 서열의 출현을 방지하는 것이 가능한 것을 발견하였다. 이들의 변이에 더하여, IgG2의 산성조건하에서의 안정성을 향상시키는 IgG2의 EU 넘버링의 397번째의 메티오닌으로부터 발린으로의 변이를 도입하였다. 또한, 참고예 7에서 제작한 힌지영역의 디설피드 결합에 유래하는 이질성을 개선시키는 SKSC(서열번호:62)는 131번째와 133번째의 변이 도입에 수반하여 천연에는 존재하지 않는 T-cell 에피토프 펩티드가 될 수 있는 9 아미노산의 새로운 펩티드 서열이 출현해 버려 면역원성 리스크가 발생하는 것으로부터, EU 넘버링의 137번째의 글루타민산으로부터 글리신으로의 변이, 138번째의 세린으로부터 글리신으로의 변이를 도입함으로써, 131번째부터 139번째 부근의 펩티드 서열을 IgG1과 동일한 것으로 하였다. 이들의 변이를 모두 도입한 정상영역 서열 M14(서열번호:129)를 제작하였다.
H쇄로서 huPM1-M14, L쇄로서 huPM1-L(서열번호:162)을 사용한 huPM1-M14의 발현·정제는 참고예 7에 기재한 방법으로 행하였다. 제작한 huPM1-M14(서열번호:163) 및 huPM1-IgG1, huPM1-IgG2의 이질성의 평가를 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여, 참고예 7에 기재한 방법으로 실시하였다.
도 14에 나타내는 바와 같이, huPM1-M14에 있어서도 huPM1-SKSC와 동일하게 이질성이 저감되었다.
[참고예 9] H쇄 C 말단측의 이질성을 저감시키고, 약물동태를 향상시킨 huPM1-M58의 제작
huPM1 - M58 분자의 제작
huPM1은 IgG1 항체이다. IgG 항체의 H쇄 C 말단 서열의 이질성으로서, C 말단 아미노산의 리신 잔기의 결손, 및 C 말단의 2 아미노산인 글리신, 리신 양쪽의 결손에 의한 C 말단 아미노기의 아미드화가 보고되어 있다(Anal Biochem. 2007 Jan 1;360(1):75-83.). huPM1에 있어서도, 그 주성분은 염기서열 상 존재하는 C 말단 아미노산의 리신이 번역 후 수식에 의해 결손된 서열이지만, 리신이 잔존하고 있는 부성분 및 글리신, 리진 양쪽의 결손에 의한 C 말단 아미노기의 아미드화된 부성분도 이질성으로서 존재한다. 목적물질/관련물질의 이질성의 제조간 차를 유지하면서 의약품으로서 대량으로 제조하는 것은 용이하지 않고 비용 증가로 이어져, 가능한 한 단일 물질인 것이 요망되고, 항체를 의약품으로서 개발하는 데 있어서는 이들 이질성이 저감되어 있는 것이 바람직하다. 따라서 의약품으로서 개발하는 데 있어서는 H쇄 C 말단의 이질성은 존재하지 않는 것이 바람직하다. 또한, 항체의 투여량을 줄이기 위해서는, 항체의 혈장 중 반감기를 길게 하는 것이 바람직하다.
이에, H쇄 C 말단측의 이질성을 저감시키고, huPM1-IgG1보다 약물동태가 개선되며, 또한, 야생형 IgG2에 유래하는 이질성을 안정성을 저하시키지 않고 저감시킨 신규 정상영역을 제작하는 것을 목적으로 이하의 개변을 도입하였다.
구체적으로는, 높은 안정성을 가지고 IgG2 아이소타입의 정상영역의 항체에 관한 전술한 이질성이 저감된 huPM1-SKSC에 대해, EU 넘버링 137번째의 글루타민산을 글리신으로 138번째의 세린을 글리신으로, 268번째의 히스티딘을 글루타민으로, 355번째의 아르기닌을 글루타민으로, 419번째의 글루타민을 글루타민산으로 치환하고, 이것에 더하여 H쇄 C 말단의 이질성을 저감하기 위해 446번째의 글리신 및 447번째의 리신을 결손시킨 huPM1-M58(서열번호:164)을 발견하였다. H쇄로서 huPM1-M58, L쇄로서 huPM1-L(서열번호:162)을 사용한 huPM1-M58의 발현·정제는 실시예 4에 기재한 방법으로 행하였다.
제작한 huPM1-M58 및 huPM1-IgG1, huPM1-IgG2의 이질성의 평가를 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여, 안정성의 평가를 DSC를 사용하여, 각각 실시예 5에 기재한 방법으로 실시하였다.
DSC의 결과를 표 18에 나타낸다. 또한 도 13 및 16에 나타내는 바와 같이, huPM1-M58에 있어서도 huPM1-SKSC와 마찬가지로, 안정성을 손상시키지 않고 이질성이 저감되어 있다.
Figure pct00018
huPM1 - M58 의 혈장 중 체류성 평가
IgG 분자의 혈장 중 체류성이 긴(소실이 느린) 것은, IgG 분자의 샐비지 수용체로서 알려져 있는 FcRn이 기능하고 있기 때문이다(Nat Rev Immunol. 2007 Sep;7(9):715-25). 음세포작용(pinocytosis)에 의해 엔도솜에 삽입된 IgG 분자는, 엔도솜 내의 산성조건하(pH 6.0 부근)에 있어서 엔도솜 내에 발현하고 있는 FcRn에 결합한다, FcRn에 결합할 수 없었던 IgG 분자는 리소좀으로 진행하고 리소좀에 분해되나, FcRn으로 결합한 IgG 분자는 세포 표면으로 이행하여 혈장 중의 중성조건하(pH 7.4 부근)에 있어서 FcRn으로부터 해리함으로써 다시 혈장 중으로 돌아간다.
IgG 타입의 항체로서, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 아이소타입이 알려져 있으나, 이들의 인간에서의 혈장 중 반감기는, IgG1, IgG2가 약 36일, IgG3가 약 29일, IgG4가 16일인 것이 보고되어 있어(Nat Biotechnol. 2007 Dec;25(12):1369-72.), IgG1 및 IgG2의 혈장 중 체류성이 가장 길다고 생각되고 있다. 일반적으로 항체의약의 아이소타입은 IgG1, IgG2, IgG4이나, 이들의 IgG 항체의 약물동태를 추가적으로 향상하는 방법으로서, IgG의 정상영역의 서열을 개변함으로써 전술한 인간 FcRn으로의 결합성을 향상시키는 방법이 보고되어 있다(J Biol Chem. 2007 Jan 19;282(3):1709-17, J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56).
마우스 FcRn과 인간 FcRn에서는 종차가 존재하는 것으로부터(Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Dec 5;103(49):18709-14), 정상영역의 서열을 개변한 IgG 항체의 인간에 있어서의 혈장 중 체류성을 예측하기 위해서는, 인간 FcRn으로의 결합평가 및 FcRn 형질전환 마우스에 있어서 혈장 중 체류성을 평가하는 것이 바람직하다고 생각되었다(Int Immunol. 2006 Dec;18(12):1759-69).
인간 FcRn 으로의 결합평가
FcRn은 FcRn과 β2-microglobulin의 복합체이다. 공개되어 있는 인간 FcRn 유전자 서열(J. Exp. Med. 180(6), 2377-2381(1994))을 토대로, 올리고 DNA 프라이머를 제작하였다. 인간 cDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech)를 주형으로 하고, 제작한 프라이머를 사용해서 PCR법에 의해 유전자 전장을 코드하는 DNA 단편을 조정하였다. 얻어진 DNA 단편을 주형으로, PCR법에 의해 시그날영역을 포함하는 세포외영역(Met1-Leu290)을 코드하는 DNA 단편을 증폭하고, 동물세포 발현 벡터에 삽입하였다(인간 FcRn 아미노산 서열/서열번호:165). 마찬가지로, 공개되어 있는 인간 β2-microglobulin 유전자 서열(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99(26), 16899-16903(2002))을 토대로, 올리고 DNA 프라이머를 제작하였다. 인간 cDNA(Hu-Placenta Marathon-Ready cDNA, CLONTECH)를 주형으로 하고, 제작한 프라이머를 사용하여 PCR법에 의해 유전자 전장을 코드하는 DNA 단편을 조제하였다. 얻어진 DNA 단편을 주형으로, PCR법에 의해 시그날영역을 포함하는 β2-microglobulin 전장(Met1-Met119)을 코드하는 DNA 단편을 증폭하고, 동물세포 발현 벡터에 삽입하였다(인간 β2-microglobulin 아미노산 서열/서열번호:166).
가용형 인간 FcRn의 발현은 인간 태아 신장암세포 유래 HEK293H주(Invitrogen)를 10% Fetal Bovine Serum(Invitrogen)을 사용해서, 조제한 인간 FcRn 및 인간 β2-microglobulin의 플라스미드를 lipofection법에 의해 세포로 도입하였다. 얻어진 배양상청을 회수한 후, IgG Sepharose 6 Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용해서, (J Immunol. 2002 Nov 1;169(9):5171-80.)의 방법에 따라 정제를 행하였다. 그 후, HiTrap Q HP(GE Healthcare)에 의해 정제를 행하였다.
인간 FcRn으로의 결합평가에는 Biacore 3000을 사용하고, 센서칩에 고정화한 Protein L 또는 토끼 항인간 IgG Kappa chain 항체로 결합시킨 항체에, 애널라이트로서 인간 FcRn을 상호작용시켰을 때의 인간 FcRn의 결합량으로부터 친화성(affinity)(KD)을 산출하였다. 구체적으로는, 러닝 버퍼로서 150 mM NaCl을 포함하는 50 mM Na-phosphate buffer, pH 6.0을 사용하고, 아민 커플링법에 의해 센서칩 CM5(BIACORE)에 Protein L을 고정화하였다. 그 후, 항체를 0.02% Tween20을 포함하는 러닝 버퍼로 희석하고 인젝트하여 칩에 항체를 결합시킨 후, 인간 FcRn을 인젝트하여, 항체의 인간 FcRn으로의 결합성을 평가하였다.
친화성의 산출에는 소프트웨어, BIAevaluation을 사용하였다. 얻어진 센서그램으로부터, 인간 FcRn 인젝션 종료 직전의 항체로의 hFcRn 결합량을 구하고, 이것을 steady state affinity법으로 피팅하여 항체로의 인간 FcRn의 친화성을 산출하였다.
huPM1 - IgG1 , huPM1 - M58 의 인간 FcRn 을 사용한 인간에 있어서의 혈장 중 체류성의 예측평가
huPM1-IgG1 및 huPM1-M58의 인간 FcRn으로의 결합성의 평가를 BIAcore에 의해 행하였다. 표 19에 나타내는 바와 같이, huPM1-M58의 결합성은 huPM1-IgG1보다도 약 1.4배 정도 우수하였다.
Figure pct00019
인간 FcRn 형질전환 마우스에 있어서의 혈장 중 체류성의 평가
인간 FcRn 형질전환 마우스(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 276 +/+ 마우스, Jackson Laboratories)에 있어서의 약물동태의 평가는 이하와 같이 행하였다. 항체를 마우스에 1 ㎎/㎏의 투여량으로 정맥 내에 단회 투여하고 적시 채혈을 행하였다. 채혈한 혈액은 바로 4℃, 15,000 rpm으로 15분간 원심분리하여, 혈장을 얻었다. 분리한 혈장은, 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존하였다. 혈장 중 농도는 ELISA법을 사용하여 측정하였다.
huPM1 - IgG1 , huPM1 - M58 의 인간 FcRn 형질전환 을 사용한 인간에 있어서의 혈장 중 체류성의 예측평가
huPM1-IgG1 및 huPM1-M58의 인간 FcRn 형질전환 마우스에 있어서의 혈장 중 체류성의 평가를 행하였다. 그 결과, 도 17에 나타내는 바와 같이, huPM1-M58은 huPM1-IgG1과 비교하여 약물동태의 개선이 확인되었다. 인간 FcRn으로의 결합성과 인간 FcRn 형질전환 마우스에 있어서의 혈장 중 체류성은 상관하는 것이 시사되었다.
[참고예 10] Biacore를 사용한 항원 항체반응의 친화성 측정
Biacore T100(GE 헬스케어 바이오사이언스)을 사용해서, 항원 항체반응의 속도론적 해석을 행하였다. 센서칩 상에 rec-Protein A(ZYMED)(이하, Protein A)를 고정화하고, 이 고정화 Protein A에 항체를 포착하여, 추가적으로 항원을 애널라이트로서 반응시켜서, 항체와 항원의 상호작용을 측정하였다. 항원에는 각종 농도로 조제한 rhNR10을 사용하였다. 측정으로 얻어진 센서그램으로부터, 키네틱 파라미터(kinetic parameter)인 결합속도상수 ka(1/Ms), 및 해리속도상수 kd(1/s)를 산출하고, 그 값을 토대로 KD(M)를 산출하였다. 각 파라미터의 산출에는 Biacore T100 Evaluation Software version 1.1(GE 헬스케어 바이오사이언스)을 사용하였다.
센서칩으로의 Protein A의 고정화
아민 커플링법에 의해 센서칩 CM5(GE 헬스케어 바이오사이언스)의 모든 플로우셀에 Protein A를 고정화하였다. 러닝 버퍼에는 HBS-EP+(10 mM HEPES, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% v/v Surfactant P20)를 사용하고, 유속 μL/min로 실험을 행하였다. 센서칩 상의 카르복시메틸덱스트란의 카르복실기를 75 ㎎/mL EDC(N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)와 11.5 ㎎/mL NHS(N-hydroxysuccinimide)의 1:1 혼합액 100 μL에 의해 활성화하고, 거기에 10 mM 초산 버퍼(pH 4.5)로 50 ㎍/mL로 조제한 Protein A를 흘려, 반응시켰다. 그 후, 1 M ethanolamine hydrochloride(pH 8.5)를 100 μL 흘려, 미반응의 활성기를 불활성화하였다. 최종적으로 약 4000-5000 RU 고정화하였다. 실험은 모두 25℃에서 행하였다.
Protein A에 포착시킨 항체와 rhNR10 의 항원 항체반응의 친화성 측정
러닝 버퍼에는 HBS-EP+를 사용하였다. 각 항체는 0.25 ㎍/mL, 또는 Protein A에 약 100 RU 결합하도록 조제하였다. 애널라이트로서 사용한 rhNR10은 HBS-EP+를 사용하여 0, 38.5, 77.0, 154 nM, 또는, 0, 19.25, 77.01 nM으로 조제하였다. 측정은 먼저 항체 용액을 Protein A에 포착시키고, 추가적으로 유속 20 μL/min로, 애널라이트 용액을 3 min 반응시키고, 그 후 HBS-EP+로 전환하여 5 min 해리상을 측정하였다. 해리상의 측정 종료 후, 10 mM glycine-HCl(pH 1.5)로 세정하여, 센서칩을 재생하였다. 얻어진 센서그램으로부터, Biacore 전용의 데이터 해석 소프트웨어인 Biacore T100 Evaluation Software Version 1.1을 사용해서 속도론적인 해석을 행하였다.
본 발명자에 의해 취득된 항NR10 항체는, NR10에 대해 유효한 중화활성을 나타내, 예를 들면 염증성 질환 치료제로서 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> Anti-NR10 antibodies, and their use <130> C1-A0712Y1P <150> JP 2007-315143 <151> 2007-12-05 <150> JP 2008-247425 <151> 2008-09-26 <160> 287 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Gly Tyr Ile Met Asn 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Asp Gly Tyr Asp Asp Gly Pro Tyr Thr Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Ile Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr 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acccacccct tcagggctga ctgtcccctg gggaaaagtt ttgaggagct cccagtttca 1980 cctgagattc ctcccagaaa atcccaatac ctacgttcga ggatgccaga agggacctgc 2040 ctagaagccg aagagcagct tctcgtttct ggtcaaagtc tagaaagtct agcaccagac 2100 catgtgcggg aggcagcggc cccaaatccg tatttgaaaa attcagtgac aaccagggaa 2160 tttcttgtgt ctcaaaaact tccagagcac accaaaggag aagtctaa 2208 <210> 66 <211> 735 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 66 Met Met Trp Thr Trp Ala Leu Trp Met Phe Pro Leu Leu Cys Lys Phe 1 5 10 15 Gly Leu Ala Ala Leu Pro Ala Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Val Tyr 20 25 30 Tyr Tyr Arg Lys Asn Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr 35 40 45 Ser Tyr Thr Gln Tyr Thr Ala Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Lys Lys 50 55 60 His Asp Asn Cys Thr Thr Ser Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala Ser 65 70 75 80 Cys Ser Phe Phe Leu Pro Arg Ile Thr Ile Pro Asp Asn Tyr Thr Ile 85 90 95 Glu Val Glu Ala Glu Asn Gly Asp Gly Val Ile Lys Ser Asp Met Thr 100 105 110 Cys Trp Arg Leu Glu Asp Ile Ala Lys Thr Glu Pro Pro Glu Ile Phe 115 120 125 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actcagcagg ccccgcgacg tccgtgctgt ttctgctctg ctgcctggga 60 ggctggctga cctcccacac gttgcccgtc catttcctac aaccaagtga tatacagaaa 120 atagtcgagg aattacagtc cctctcgaag atgcttttga aagatgtgaa ggaagacaag 180 ggggtgctcg tgtcccagaa ttacacgctg ccgtgtctca cccctgacgc ccagccgcca 240 aacatcatcc acagcccagc catccgggca tatctcaaga caatcagaca gttagacaac 300 aaatctgtta ttgatgagat catagagcac ctcgacaaac tcatatttca agatgcacca 360 gaaacaaaca tttctgtgcc aacagacacc catgaatgta aacgcttcat cctgactatt 420 tctcaacagt tttcagagtg catggacctt gcattaaaat cgttgacttc tggagcccag 480 caggccacca cttaa 495 <210> 68 <211> 164 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 68 Met Ala Ser His Ser Ala Gly Pro Ala Thr Ser Val Leu Phe Leu Leu 1 5 10 15 Cys Cys Leu Gly Gly Trp Leu Thr Ser His Thr Leu Pro Val His Phe 20 25 30 Leu Gln Pro Ser Asp Ile Gln Lys Ile Val Glu Glu Leu Gln Ser Leu 35 40 45 Ser Lys Met Leu Leu Lys Asp Val Lys Glu Asp Lys Gly Val Leu Val 50 55 60 Ser Gln Asn Tyr Thr Leu Pro Cys Leu Thr Pro Asp Ala Gln Pro Pro 65 70 75 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gagaagtgtg 1320 aactcagagc caggaaatca tactgtgacc ttattctgga agccattatc aaaactgcat 1380 gccaatggaa agatcctgtt ctataatgta gttgtagaaa acctagacaa accgtccagg 1440 tcagagctcc gttccattcc ggcaccagcc aacagcacaa aactaatcct cgacaggtgt 1500 tcctaccaaa tctgcgtcac agctaacaac agtgtgggcg cttctcctgc ttctataata 1560 gtcatctctg cggaccctga aaacaaagag gttgaggaag aaagaattgc aggcacagag 1620 ggtggattct ctctgtcttg gaaaccccag cctggagatg ttataggcta tgttgtggac 1680 tggtgtgacc atccccagga tgtgctccag tggaagaatg taggtcccaa taccacaagc 1740 acagtcatta gcacagatgc ttttaggcca ggagttcgat acgacttcag aatctatggg 1800 ttatctacaa aaaggattgc ttgtttatta gagaaaaaaa caggatactc tcaggaactg 1860 gctccttcag acaaccctca cgtgctggta gatatgttga catcccactc cttcactctg 1920 agttggaaag attactctac tgaatctcaa cctggtttta tacaagggta ccatgtctat 1980 ctgaaatcca aggcgaggca gtgccaccca cgatttcaaa aggcagttct ttcagatggt 2040 tcagaatgtt gcaaatacaa aattgacaac ccagaagaaa aggcattgat tgtggacaac 2100 ctaaagccag aatccttcta tgagtttttc gttactccat tcactagtgc tggcgagggc 2160 cccaatgcta cgttcacgaa ggtcacgact ccggatgaac actcctccat gttgattcgt 2220 atcctactgc ccatggtttt ctgcgtcttg ctcatcatga tcgtgtgcta cttgaaaagt 2280 cagtggatca aggagacgtg ttatcctgac atccctgacc cttacaagag cagcatcctg 2340 tcgttaataa aattcaagga gaaccctcac ctaacaataa tgaatgtcag tgactgtatc 2400 ccagatgcta ttgaagttgt cagcaagcca gaagggacaa agatacagct cctaggcact 2460 aggaagtcac tcacagaaac tgagttaact aagcctaact acctttatct ccttccaaca 2520 gaaaagaatc actctggccc tggcccctgc atctgttttg agaactttac ctacaaccag 2580 gcagcttctg acgctggctc ttgtggccat gttccagtac cccccaaagc cccaccaagt 2640 atgctaggac taatgacctc acctgaaaat gtactaaagg cgctagaaaa aaactacatg 2700 aactccctgg gagaagtccc agctggagaa acaagtttga attatgtgtc ccagttggct 2760 tcacccatgt ctggagacaa ggacagtctc ccaacaaacc cagtggagcc accacactgt 2820 tcagagtata aaatgcaaat ggcagtcccc ctgcgtcttg ccctgcctcc cccgaccgag 2880 aatagcagcc tttcctcaat taccctttta gatccaggtg aacactaccg ctaa 2934 <210> 70 <211> 977 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 70 Met Ala Leu Phe Val Val Phe Gln Thr Thr Phe Phe Leu Thr Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Thr Tyr Gln Ser Glu Val Leu Ala Glu Arg Leu Pro Leu 20 25 30 Thr Pro Val Ser Leu Lys Val Ser Thr Asn Ser Ile His Gln Ser Leu 35 40 45 His Leu Gln Trp Thr Val His Asn Leu Pro Tyr His Gln Glu Leu Lys 50 55 60 Met Val Phe Gln Ile Gln Ile Ser Arg Ile Glu Thr Ser Asn Val Val 65 70 75 80 Trp Val Gly Asn Tyr Ser Thr Thr Val Lys Trp Asn Gln Val Leu His 85 90 95 Trp Ser Trp Glu Ser Glu Leu Pro Leu Glu Cys Ala Thr His Phe Val 100 105 110 Arg Ile Lys Ser Val Ile Asp Asp Ala Ser Phe Pro Glu Pro Asn Phe 115 120 125 Trp Ser Asn Trp Ser Ser Trp Glu Glu Val Ser Val Gln Asp Tyr Leu 130 135 140 Gly Arg Gly Thr Leu Phe Val Phe Pro Lys Asp Lys Leu Val Glu Glu 145 150 155 160 Gly Ser Asn Val Thr Ile Cys Tyr Val Ser Arg Asn Ile Gln Asn Asn 165 170 175 Val Ser Cys Tyr Leu Glu Gly Lys Gln Ile His Gly Glu Gln Leu Asp 180 185 190 Pro His Val Thr Ala Phe Asn Leu Asn Ser Val Pro Phe Ile Arg Asn 195 200 205 Arg Gly Thr Asn Ile Tyr 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tcgtgcttcg 240 tgctcttttt tccttccaag aataacgatc ccagataatt ataccattga ggtggaagct 300 gaaaatggag atggtgtaat taaatctgat atgacatgtt ggagattaga ggacatagcg 360 aaaactgaac cacctgagat tttcagtgtg aaaccagttt tgggcatcaa acgaatgatt 420 cggattgaat ggataaagcc tgagttggca cctgtttcat ctgatttaaa atatgcactt 480 cgattcagga cagtcaatag taccagctgg atggaagtca acttcgctaa gaaccgtaaa 540 gatacaaacc aaacctacaa ccttatgggg ctgcaggctt ttacagagta tgtcgtagct 600 ctgcgatgtg cggtcaagga gtcaaagttc tggagtgact ggagccaaga aaaaatggga 660 atgactgagg aagaagctcc atgtggcctg gaactgtgga gagtcctgaa accaactgag 720 gtggatggaa gaaggccagt gcggttgtta tggaagaagg caagaggagc cccagtccta 780 gagaaaacac ttggctacaa catatggtac tttccagaaa acaacactaa cctcacagag 840 acagtgaaca ccactaacca gcagcttgaa ctgcatctgg gaggcgagag ctattgggtg 900 tctatgattt cttataattc tcttgggaag tctccagtga ccaccctgag gattccagcc 960 attcaggaaa agtcatttcg gtgcattgag gtcatgcagg cctgccttgc tgaggaccag 1020 ctagtggtga agtggcaaag ctctgctcta gacgtgaaca cttggatgat tgaatggttt 1080 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artificially synthesized peptide sequence <400> 89 Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 90 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 90 taatagcggc cgctcattat ttaccaggag agtgggagag 40 <210> 91 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 91 taatagcggc cgctcattaa cactcattcc tgttgaagct 40 <210> 92 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 92 gacgaattcc accatgggat ggagctggat ctt 33 <210> 93 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 93 gacgaattcc accatgagtg tgcccactca ggt 33 <210> 94 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 94 gacgaattcc accatggaat gtaactggat act 33 <210> 95 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 95 gacgaattcc accatggatt ttctggtgca gat 33 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artificially synthesized peptide sequence <400> 163 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn 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artificially synthesized peptide sequence <400> 171 Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Gln Phe Gln 1 5 10 15 Asp <210> 172 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 172 Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Asp Gln Phe Gln 1 5 10 15 Asp <210> 173 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 173 Gly Tyr Val Met Asn 1 5 <210> 174 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 174 Gly Tyr Ile Ile Asn 1 5 <210> 175 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 175 Gly Tyr Ile Leu Asn 1 5 <210> 176 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 176 Gly Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 177 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 177 Leu Ile Asn Pro Tyr 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synthesized peptide sequence <400> 183 Asp Gly Tyr Asp Asp Gly Pro Tyr Thr Met Asp Ser 1 5 10 <210> 184 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 184 Asp Gly Tyr Asp Asp Gly Pro Tyr Thr Leu Glu Thr 1 5 10 <210> 185 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 185 Asp Gly Tyr Asp Asp Gly Pro Tyr Thr Met Glu Thr 1 5 10 <210> 186 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 186 Asp Gly Leu Asp Asp Gly Pro Tyr Thr Met Glu Thr 1 5 10 <210> 187 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 187 Asp Gly Leu Asp Asp Gly Pro Tyr Thr Met Glu Ser 1 5 10 <210> 188 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 188 Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Arg Phe Leu Ala 1 5 10 <210> 189 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 189 Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe Val Ala 1 5 10 <210> 190 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 190 Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Arg Phe Val Ala 1 5 10 <210> 191 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 191 Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe Leu Ala 1 5 10 <210> 192 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 192 Arg Ser Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe Leu Ala 1 5 10 <210> 193 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 193 Gln His His Tyr Asp Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 194 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 194 Gln His His Tyr Glu Asp Pro Leu Thr 1 5 <210> 195 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 195 Gln His His Tyr Glu Ser Pro Leu Phe 1 5 <210> 196 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 196 Gly Tyr Val Leu Asn 1 5 <210> 197 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 197 Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Pro Gln Phe Gln 1 5 10 15 Asp <210> 198 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 198 Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Pro Gln Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 199 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 199 Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Gln Phe Gln 1 5 10 15 Asp <210> 200 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 200 Gln Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Arg Phe Val Ala 1 5 10 <210> 201 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 201 Gln Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Phe Val Ala 1 5 10 <210> 202 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 202 Gln Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Phe Val Ala 1 5 10 <210> 203 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 203 Gln Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Phe Leu Ala 1 5 10 <210> 204 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 204 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Val Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Pro Gln Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Tyr Asp 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Gln Asp Lys Leu Lys Pro 370 375 380 Phe Thr Cys Tyr Asn Ile Ser Val Tyr Pro Val Leu Gly His Arg Val 385 390 395 400 Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gln Ala Tyr Ala Lys Glu Gly Thr Pro Leu 405 410 415 Lys Gly Pro Glu Thr Arg Val Glu Asn Ile Gly Leu Arg Thr Ala Thr 420 425 430 Ile Thr Trp Lys Glu Ile Pro Lys Ser Ala Arg Asn Gly Phe Ile Asn 435 440 445 Asn Tyr Thr Val Phe Tyr Gln Ala Glu Gly Gly Lys Glu Leu Ser Lys 450 455 460 Thr Val Asn Ser His Ala Leu Gln Cys Asp Leu Glu Ser Leu Thr Arg 465 470 475 480 Arg Thr Ser Tyr Thr Val Trp Val Met Ala Ser Thr Arg Ala Gly Gly 485 490 495 Thr Asn Gly Val Arg Ile Asn Phe Lys Thr Leu Ser His His His His 500 505 510 His His Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 515 520 <210> 263 <211> 524 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 263 Met Trp Thr Leu Ala Leu Trp Ala Phe Ser Phe Leu Cys Lys Phe Ser 1 5 10 15 Leu Ala Val Leu Pro Thr Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Val Phe Tyr 20 25 30 Phe Asp Arg Asn Leu Thr Cys Thr Trp Arg Pro Glu Lys Glu Thr Asn 35 40 45 Asp Thr Ser Tyr Ile Val Thr Leu Thr Tyr Ser Tyr Gly Lys Ser Asn 50 55 60 Tyr Ser Asp Asn Ala Thr Glu Ala Ser Tyr Ser Phe Pro Arg Ser Cys 65 70 75 80 Ala Met Pro Pro Asp Ile Cys Ser Val Glu Val Gln Ala Gln Asn Gly 85 90 95 Asp Gly Lys Val Lys Ser Asp Ile Thr Tyr Trp His Leu Ile Ser Ile 100 105 110 Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys Ile Phe Arg Val Lys Pro Val Leu Gly 115 120 125 Ile Lys Arg Met Ile Gln Ile Glu Trp Ile Lys Pro Glu Leu Ala Pro 130 135 140 Val Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr Leu Arg Phe Arg Thr Val Asn Ser 145 150 155 160 Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe Ala Lys Asn Arg Lys Asp Lys Asn 165 170 175 Gln Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gln Pro Phe Thr Glu Tyr Val Ile 180 185 190 Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser Lys Phe Trp Ser Asp Trp Ser 195 200 205 Gln Glu Lys Met Gly Met Thr Glu Glu Glu Ala Pro His Val Leu Asp 210 215 220 Leu Trp Arg Ile Leu Glu Pro Ala Asp Met Asn Gly Asp Arg Lys Val 225 230 235 240 Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro Val Leu Glu Lys Thr 245 250 255 Phe Gly Tyr His Ile Gln Tyr Phe Ala Glu Asn Ser Thr Asn Leu Thr 260 265 270 Glu Ile Asn Asn Ile Thr Thr Gln Gln Tyr Glu Leu Leu Leu Met Ser 275 280 285 Gln Ala His Ser Val Ser Val Thr Ser Phe Asn Ser Leu Gly Lys Ser 290 295 300 Gln Glu Thr Ile Leu Arg Ile Pro Asp Val His Glu Lys Thr Phe Gln 305 310 315 320 Tyr Ile Lys Ser Met Gln Ala Tyr Ile Ala Glu Pro Leu Leu Val Val 325 330 335 Asn Trp Gln Ser Ser Ile Pro Ala Val Asp Thr Trp Ile Val Glu Trp 340 345 350 Leu Pro Glu Ala Ala Met Ser Lys Phe Pro Ala Leu Ser Trp Glu Ser 355 360 365 Val Ser Gln Val Thr Asn Trp Thr Ile Glu Gln Asp Lys Leu Lys Pro 370 375 380 Phe Thr Cys Tyr Asn Ile Ser Val Tyr Pro Val Leu Gly His Arg Val 385 390 395 400 Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gln Ala Tyr Ala Lys Glu Gly Thr Pro Leu 405 410 415 Lys Gly Pro Glu Thr Arg Val Glu Asn Ile Gly Leu Arg Thr Ala Thr 420 425 430 Ile Thr Trp Lys Glu Ile Pro Lys Ser Ala Arg Asn Gly Phe Ile Asn 435 440 445 Asn Tyr Thr Val Phe Tyr Gln Ala Glu Gly Gly Lys Glu Leu Ser Lys 450 455 460 Thr Val Asn Ser His Ala Leu Gln Cys Asp Leu Glu Ser Leu Thr Arg 465 470 475 480 Arg Thr Ser Tyr Thr Val Trp Val Met Ala Ser Thr Arg Ala Gly Gly 485 490 495 Thr Asn Gly Val Arg Ile Asn Phe Lys Thr Leu Ser His His His His 500 505 510 His His Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 515 520 <210> 264 <211> 523 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 264 Met Trp Thr Leu Ala Leu Trp Ala Phe Ser Phe Leu Cys Lys Phe Ser 1 5 10 15 Leu Ala Val Leu Pro Thr Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Val Phe Tyr 20 25 30 Phe Asp Arg Asn Leu Thr Cys Thr Trp Arg Pro Glu Lys Glu Thr Asn 35 40 45 Asp Thr Ser Tyr Ile Val Thr Leu Thr Tyr Ser Tyr Gly Lys Ser Asn 50 55 60 Tyr Ser Asp Asn Ala Thr Glu Ala Ser Tyr Ser Phe Pro Arg Ser Cys 65 70 75 80 Ala Met Pro Pro Asp Ile Cys Ser Val Glu Val Gln Ala Gln Asn Gly 85 90 95 Asp Gly Lys Val Lys Ser Asp Ile Thr Tyr Trp His Leu Ile Ser Ile 100 105 110 Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys Ile Phe Arg Val Lys Pro Val Leu Gly 115 120 125 Ile Lys Arg Met Ile Gln Ile Glu Trp Ile Lys Pro Glu Leu Ala Pro 130 135 140 Val Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr Leu Arg Phe Arg Thr Val Asn Ser 145 150 155 160 Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe Ala Lys Asn Arg Lys Asp Lys Asn 165 170 175 Gln Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gln Pro Phe Thr Glu Tyr Val Ile 180 185 190 Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser Lys Phe Trp Ser Asp Trp Ser 195 200 205 Gln Glu Lys Met Gly Met Thr Glu Glu Glu Ala Pro Cys Gly Leu Glu 210 215 220 Leu Trp Arg Val Leu Lys Pro Ala Glu Ala Asp Gly Arg Arg Pro Val 225 230 235 240 Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro Val Leu Glu Lys Thr 245 250 255 Leu Gly Tyr Asn Ile Trp Tyr Tyr Pro Glu Ser Asn Thr Asn Leu Thr 260 265 270 Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gln Gln Leu Glu Leu His Leu Gly Gly 275 280 285 Glu Ser Phe Trp Val Ser Met Ile Ser Tyr Asn Ser Leu Gly Lys Ser 290 295 300 Pro Val Ala Thr Leu Arg Ile Pro Ala Ile Gln Glu Lys Ser Phe Gln 305 310 315 320 Cys Ile Glu Val Met Gln Ala Cys Val Ala Glu Asp Gln Leu Val Val 325 330 335 Lys Trp Gln Ser Ser Ala Leu Asp Val Asn Thr Trp Met Ile Glu Trp 340 345 350 Phe Pro Asp Val Asp Ser Glu Pro Thr Thr Leu Ser Trp Glu Ser Val 355 360 365 Ser Gln Ala Thr Asn Trp Thr Ile Gln Gln Asp Lys Leu Lys Pro Phe 370 375 380 Trp Cys Tyr Asn Ile Ser Val Tyr Pro Met Leu His Asp Lys Val Gly 385 390 395 400 Glu Pro Tyr Ser Ile Gln Ala Tyr Ala Lys Glu Gly Val Pro Ser Glu 405 410 415 Gly Pro Glu Thr Lys Val Glu Asn Ile Gly Val Lys Thr Val Thr Ile 420 425 430 Thr Trp Lys Glu Ile Pro Lys Ser Glu Arg Lys Gly Ile Ile Cys Asn 435 440 445 Tyr Thr Ile Phe Tyr Gln Ala Glu Gly Gly Lys Gly Phe Ser Lys Thr 450 455 460 Val Asn Ser Ser Ile Leu Gln Tyr Gly Leu Glu Ser Leu Lys Arg Lys 465 470 475 480 Thr Ser Tyr Ile Val Gln Val Met Ala Ser Thr Ser Ala Gly Gly Thr 485 490 495 Asn Gly Thr Ser Ile Asn Phe Lys Thr Leu Ser His His His His His 500 505 510 His Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 515 520 <210> 265 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 265 Asp Gly Tyr Asp Asp Gly Pro Tyr Thr Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 266 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 266 Asp Gly Tyr Asp Asp Gly Pro Tyr Thr Leu Glu Thr 1 5 10 <210> 267 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 267 Asp Gly Tyr Asp Asp Gly Pro Tyr Thr Met Glu Thr 1 5 10 <210> 268 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 268 Asp Gly Leu Asp Asp Gly Pro Tyr Thr Met Glu Thr 1 5 10 <210> 269 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 269 Asp Gly Leu Asp Asp Gly Pro Tyr Thr Met Glu Ser 1 5 10 <210> 270 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 270 Gly Tyr Ile Met Asn 1 5 <210> 271 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 271 Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 272 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 272 Gly Tyr Val Met Asn 1 5 <210> 273 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 273 Gly Tyr Ile Ile Asn 1 5 <210> 274 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 274 Gly Tyr Ile Leu Asn 1 5 <210> 275 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 275 Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 276 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 276 Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Pro Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 277 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 277 Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe Leu Ala 1 5 10 <210> 278 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 278 Gln His His Tyr Glu Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 279 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 279 Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Arg Phe Leu Ala 1 5 10 <210> 280 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 280 Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Arg Phe Val Ala 1 5 10 <210> 281 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 281 Gln His His Tyr Asp Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 282 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 282 Gln His His Tyr Glu Asp Pro Leu Thr 1 5 <210> 283 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 283 Gln His His Thr Glu Ser Pro Leu Phe 1 5 <210> 284 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 284 Gly Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 285 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 285 Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe Leu Ala 1 5 10 <210> 286 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 286 Arg Ser Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe Leu Ala 1 5 10 <210> 287 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 287 His His His His His His Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 15

Claims (13)

  1. NR10의 도메인 1을 인식하는 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    중화활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    인간화 항체인 항체.
  4. 이하의 (1)~(8) 중 어느 하나에 기재된 항NR10 항체;
    (1) 서열번호:1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 갖는 항체,
    (2) 서열번호:4에 기재된 중쇄 가변영역을 갖는 항체,
    (3) 서열번호:5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:7에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
    (4) 서열번호:8에 기재된 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
    (5) (1)의 중쇄 가변영역 및 (3)의 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
    (6) (2)의 중쇄 가변영역 및 (4)의 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
    (7) (1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 항체에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로서, (1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체,
    (8) (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
  5. 이하의 (1)~(8) 중 어느 하나에 기재된 항NR10 항체;
    (1) 서열번호:9에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:10에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:11에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 갖는 항체,
    (2) 서열번호:12에 기재된 중쇄 가변영역을 갖는 항체,
    (3) 서열번호:13에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:14에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:15에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
    (4) 서열번호:16에 기재된 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
    (5) (1)의 중쇄 가변영역 및 (3)의 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
    (6) (2)의 중쇄 가변영역 및 (4)의 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
    (7) (1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 항체에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로서, (1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체,
    (8) (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
  6. 이하의 (1)~(8) 중 어느 하나에 기재된 항NR10 항체;
    (1) 서열번호:17에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:18에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 갖는 항체,
    (2) 서열번호:20에 기재된 중쇄 가변영역을 갖는 항체,
    (3) 서열번호:21에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:22에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:23에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
    (4) 서열번호:24에 기재된 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
    (5) (1)의 중쇄 가변영역 및 (3)의 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
    (6) (2)의 중쇄 가변영역 및 (4)의 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
    (7) (1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 항체에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로서, (1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체,
    (8) (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
  7. 이하의 (1)~(8) 중 어느 하나에 기재된 항NR10 항체;
    (1) 서열번호:25에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:26에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:27에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 갖는 항체,
    (2) 서열번호:28에 기재된 중쇄 가변영역을 갖는 항체,
    (3) 서열번호:29에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:30에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:31에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
    (4) 서열번호:32에 기재된 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
    (5) (1)의 중쇄 가변영역 및 (3)의 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
    (6) (2)의 중쇄 가변영역 및 (4)의 경쇄 가변영역을 갖는 항체,
    (7) (1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 항체에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로서, (1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체,
    (8) (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
  8. 이하의 (1)~(20) 중 어느 하나에 기재된 항체 가변영역, 또는 항체;
    (1) 서열번호:196에 기재된 CDR1, 서열번호:197에 기재된 CDR2, 서열번호:11에 기재된 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역(H17),
    (2) 서열번호:176에 기재된 CDR1, 서열번호:197에 기재된 CDR2, 서열번호:11에 기재된 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역(H19),
    (3) 서열번호:196에 기재된 CDR1, 서열번호:197에 기재된 CDR2, 서열번호:184에 기재된 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역(H28, H42),
    (4) 서열번호:9에 기재된 CDR1, 서열번호:197에 기재된 CDR2, 서열번호:184에 기재된 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역(H30, H44),
    (5) 서열번호:176에 기재된 CDR1, 서열번호:197에 기재된 CDR2, 서열번호:184에 기재된 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역(H34, H46),
    (6) 서열번호:9에 기재된 CDR1, 서열번호:198에 기재된 CDR2, 서열번호:184에 기재된 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역(H57, H78),
    (7) 서열번호:176에 기재된 CDR1, 서열번호:198에 기재된 CDR2, 서열번호:184에 기재된 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역(H71, H92),
    (8) 서열번호:9에 기재된 CDR1, 서열번호:199에 기재된 CDR2, 서열번호:184에 기재된 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역(H97, H98),
    (9) 서열번호:200에 기재된 CDR1, 서열번호:170에 기재된 CDR2, 서열번호:193에 기재된 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역(L11),
    (10) 서열번호:201에 기재된 CDR1, 서열번호:170에 기재된 CDR2, 서열번호:193에 기재된 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역(L12),
    (11) 서열번호:202에 기재된 CDR1, 서열번호:170에 기재된 CDR2, 서열번호:193에 기재된 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역(L17),
    (12) 서열번호:203에 기재된 CDR1, 서열번호:170에 기재된 CDR2, 서열번호:193에 기재된 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역(L50),
    (13) (3)의 중쇄 가변영역과 (11)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체,
    (14) (4)의 중쇄 가변영역과 (11)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체,
    (15) (5)의 중쇄 가변영역과 (11)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체,
    (16) (6)의 중쇄 가변영역과 (11)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체,
    (17) (7)의 중쇄 가변영역과 (11)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체,
    (18) (8)의 중쇄 가변영역과 (12)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체,
    (19) (13)~(18) 중 어느 하나에 기재된 항체에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로서, (13)~(18) 중 어느 하나에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체,
    (20) (13)~(18) 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
  9. 이하의 (1)~(32) 중 어느 하나에 기재된 항체 가변영역 또는 항체;
    (1) 서열번호:204에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H17),
    (2) 서열번호:205에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H19),
    (3) 서열번호:206에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H28),
    (4) 서열번호:207에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H30),
    (5) 서열번호:208에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H34),
    (6) 서열번호:209에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H42),
    (7) 서열번호:210에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H44),
    (8) 서열번호:211에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H46),
    (9) 서열번호:212에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H57),
    (10) 서열번호:213에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H71),
    (11) 서열번호:214에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H78),
    (12) 서열번호:215에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H92),
    (13) 서열번호:216에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H97),
    (14) 서열번호:217에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(H98),
    (15) 서열번호:218에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역(L11),
    (16) 서열번호:219에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역(L12),
    (17) 서열번호:220에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역(L17),
    (18) 서열번호:221에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역(L50),
    (19) (3)의 중쇄 가변영역과 (17)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H28L17),
    (20) (4)의 중쇄 가변영역과 (17)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H30L17),
    (21) (5)의 중쇄 가변영역과 (17)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H34L17),
    (22) (6)의 중쇄 가변영역과 (17)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H42L17),
    (23) (7)의 중쇄 가변영역과 (17)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H44L17),
    (24) (8)의 중쇄 가변영역과 (17)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H46L17),
    (25) (9)의 중쇄 가변영역과 (17)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H57L17),
    (26) (10)의 중쇄 가변영역과 (17)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H71L17),
    (27) (11)의 중쇄 가변영역과 (17)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H78L17),
    (28) (12)의 중쇄 가변영역과 (17)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H92L17),
    (29) (13)의 중쇄 가변영역과 (18)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H97L50),
    (30) (14)의 중쇄 가변영역과 (18)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(H98L50),
    (31) (19)~(30) 중 어느 하나에 기재된 항체에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로서, (19)~(30) 중 어느 하나에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체,
    (32) (19)~(30) 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
  10. 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간화 항체인 항NR10 항체.
  11. 이하의 (1)~(32) 중 어느 하나의 항체 중쇄, 항체 경쇄, 또는 항체;
    (1) 서열번호:222에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H17),
    (2) 서열번호:223에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H19),
    (3) 서열번호:224에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H28),
    (4) 서열번호:225에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H30),
    (5) 서열번호:226에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H34),
    (6) 서열번호:227에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H42),
    (7) 서열번호:228에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H44),
    (8) 서열번호:229에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H46),
    (9) 서열번호:230에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H57),
    (10) 서열번호:231에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H71),
    (11) 서열번호:232에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H78),
    (12) 서열번호:233에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H92),
    (13) 서열번호:234에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H97),
    (14) 서열번호:235에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄(H98),
    (15) 서열번호:236에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄(L11),
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    (17) 서열번호:238에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄(L17),
    (18) 서열번호:239에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄(L50),
    (19) (3)의 중쇄와 (17)의 경쇄를 포함하는 항체(H28L17),
    (20) (4)의 중쇄와 (17)의 경쇄를 포함하는 항체(H30L17),
    (21) (5)의 중쇄와 (17)의 경쇄를 포함하는 항체(H34L17),
    (22) (6)의 중쇄와 (17)의 경쇄를 포함하는 항체(H42L17),
    (23) (7)의 중쇄와 (17)의 경쇄를 포함하는 항체(H44L17),
    (24) (8)의 중쇄와 (17)의 경쇄를 포함하는 항체(H46L17),
    (25) (9)의 중쇄와 (17)의 경쇄를 포함하는 항체(H57L17),
    (26) (10)의 중쇄와 (17)의 경쇄를 포함하는 항체(H71L17),
    (27) (11)의 중쇄와 (17)의 경쇄를 포함하는 항체(H78L17),
    (28) (12)의 중쇄와 (17)의 경쇄를 포함하는 항체(H92L17),
    (29) (13)의 중쇄와 (18)의 경쇄를 포함하는 항체(H97L50),
    (30) (14)의 중쇄와 (18)의 경쇄를 포함하는 항체(H98L50),
    (31) (19)~(30) 중 어느 하나에 기재된 항체에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로서, (19)~(30) 중 어느 하나에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체,
    (32) (19)~(30) 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 의약 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    염증성 질환 치료제인 의약 조성물.
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