SK288124B6 - Anti-VLA-1 antibody, composition comprising such antibodies, isolated nucleic acids sequence, use of composition, in vitro method of determining level of VLA-1 in tissue, cell of cell line hAQC2, haAQC2, hsAQC2 or hybridoma mAQC2 and method for identifying inhibitor of I domain of integrin - Google Patents

Anti-VLA-1 antibody, composition comprising such antibodies, isolated nucleic acids sequence, use of composition, in vitro method of determining level of VLA-1 in tissue, cell of cell line hAQC2, haAQC2, hsAQC2 or hybridoma mAQC2 and method for identifying inhibitor of I domain of integrin Download PDF

Info

Publication number
SK288124B6
SK288124B6 SK1374-2003A SK13742003A SK288124B6 SK 288124 B6 SK288124 B6 SK 288124B6 SK 13742003 A SK13742003 A SK 13742003A SK 288124 B6 SK288124 B6 SK 288124B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
antibody
domain
light chain
seq
heavy chain
Prior art date
Application number
SK1374-2003A
Other languages
English (en)
Other versions
SK13742003A3 (sk
Inventor
Paul D. Lyne
Ellen A. Garber
Jose W. Saldanha
Michael Karpusas
Original Assignee
Biogen Idec Ma Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen Idec Ma Inc. filed Critical Biogen Idec Ma Inc.
Publication of SK13742003A3 publication Critical patent/SK13742003A3/sk
Publication of SK288124B6 publication Critical patent/SK288124B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C07K16/2842—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta1-subunit-containing molecules, e.g. CD29, CD49
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/06—Antimigraine agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)

Abstract

Subject of invention are antibodies that specifically bind to VLA-1 integrin and that are useful to treat immunological disorders. Also included are crystal structures of complexes formed by VLA-1 antibodies and their ligands, and VLA-1 antagonists and agonists identified by using the structure coordinates of these structures.

Description

Oblasť techniky
Predkladaný vynález sa týka protilátok k integrálu VLA-1 a týchto protilátok na liečenie zápalových ochorení a ďalších imunologických porúch. Vynález tiež opisuje kryštálovú štruktúru komplexu vytvoreného jednou takouto protilátkou a al-I doménou VLA-1, a použitie týchto štruktúrnych informácií na počítačové navrhovanie liečiv.
Doterajší stav techniky
Integrály tvoria superrodinu receptorov bunkového povrchu, ktoré sprostredkovávajú adhéziu bunka-bunka a bunka-matrix. Tieto proteíny sú známe tým, že poskytujú ukotvenie a tiež signály pre bunkový rast, migráciu a diferenciáciu počas vývoja a regenerácie tkanív. Predpokladá sa, že sa tiež podieľajú na imunitných a zápalových procesoch. Integríny sú heterodiméme proteíny zložené z dvoch nekovalentne spojených polypeptidových reťazcov, a a β. Aminokoniec každého reťazca vytvára guľovitú „hlavu“, ktorá prispieva k medzireťazcovej väzbe a k väzbe ligandu. Tieto guľovité hlavy sú pripojené k transmembránovým segmentom tzv. „stonky“. Cytoplazmatické „chvostíky“ sú dlhé zvyčajne menej ako 50 aminokyselinových zvyškov. Integrínové subrodiny boli pôvodne definované na základe toho, že β podjednotka sa použila na vznik heterodimérov. Integríny obsahujúce βΐ sa tiež nazývajú VLA molekuly, čo súvisí so vzťahom k antigénom „veľmi neskorej aktivácie“ („very late activation“). Označenia VLA-1 až VLA-6 sa týkajú subrodiny obsahujúcej al až a6 (t. j. CD49a až CD49f), v danom poradí. (Pre všeobecný prehľad pozri napr. Cellular and Molecular Imnmnology, eds. Abul K. Rbbas et al., W. B. Saunders Company, Philadelphia, PA, 2000.)
Kolagén (tak typ I ako aj typ IV) a laminín sú známe Ugandy αϊβΐ integrálu (t. j. VLA-1). Predpokladá sa, že VLA-1 sa podieľa na bunkovej adhézii a migrácii na kolagéne (Keely et al., 1995, J. Celí Sci. 108: 595 až 607, Gotwals et al., 1996, J. Clin. Invest. 97: 469 - 2477), podporuje kontrakcie a reorganizáciu kolagénovej matrice, je rozhodujúcim komponentom pri hojení rán (Gotwals et al., vyššie a Chiro, 1991,Celí 67: 403 až 410) a zúčastňuje sa riadenia expresie génov zapojených do reorganizácie extracelulámeho matrixu (Riikonen et al., 1995, J. Biol. Chem. 270: 1 - 5, and Langholz et al., 1995, j. Celí Biol. 131: 1903 - 1915). Takže nesprávna regulácia VLA-1 môže spôsobiť určité patologické stavy, ako je napríklad fibróza.
Navyše sa tiež navrhlo, že VLA-1 by mohol mať úlohu v ochoreniach, ktoré sú spôsobené T lymfocytmi/monocytmi. Anti-VLA-1 protilátky blokujú expresiu cytokínu závislú od T lymfocytov (Miyake et al., 1993, J. Exp. Med. 177: 863 - 868). Expresia VLA-1 je zvýšená pri perzistentne aktivovaných, 2 až 4 týždne starých, kultivovaných T lymfocytoch (Hemler et al., 1985, Eur. J. Immunol. 15: 502 - 508). VLA-1 sa tiež exprimuje na vysokom percente T lymfocytov izolovaných zo synovia pacientov s reumatoidnou artritídou (Hemler et al., 1986, J. Clin. Invest. 78: 692 - 702).
Určilo sa niekoľko kryštálových štruktúr integrínovej podjednotky a, vrátane Štruktúry domény a2-I z α2β1 (PDB prístupový kód laox, Emsley et al. , 1997, J. Biol. Chem. 272: 28512 - 28517), al-I domény z potkanieho αϊβΐ (PDB prístupový kód lck4, Nolte et al., 1999, FEBS Lett. 452: 379 - 385, W000/20459), al podjednotky ľudského αϊβΐ (PDB prístupový kód lqc5, Rich et al., 1999,J. Biol. Chem. 274: 24 906 - 24 913), aL-I a aM-I domén a vWF-A3 (Lee et al., 1995, Celí 80: 631 - 635, Lee et al., 1995, Structure 3: 1333 až 1340, Qu et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 10277 - 10281, Qu et al., 1996, Structure 4: 931 až 942). Zistilo sa, že štruktúra α2β1 je závitnica (helix) (t. j. C-helix), ktorá tvorí zárez alebo ryhu na jednej strane proteínu vo väzbovom mieste pre ión kovu (Emsley et al., supra).
Kryštálová štruktúra a2-I domény v komplexe s krátkym trojzávitnicovým peptidom na báze kolagénu odhalila, že peptid na báze kolagénu sa viazal k zárezu, kde aminokyseliny a2-I, ktoré vytvárali intermolekulové kontakty alebo kontakty s kovom, boli Aspl51, Asnl54, Tyrl57, Gln215, Asp219, Leu220, Thr221, Asp254, Glu256, His258, Tyr285, Leu286, Asn289, Leu291, Asn295 a Lys298 (PDB prístupový kód ldzi, Emsley et al., 2000, Celí 101: 47 - 56, WOOl/73444). Bezprostredne uvedené číslovanie aminokyselín je založené na sekvencii s PDB prístupovým kódom ldzi, a v tomto texte sa naň ďalej odkazuje ako na „kryštálové číslovanie.“ Kryštálové štruktúry al-I domén laboratórneho potkana a človeka mali podobné zárezy.
Množstvo výskumníkov opisuje protilátky anti-VLA-1. De Fougerolles et al. (J. Clin. Invest., 2000, 205: 721 - 729) opisuje dôležitosť kolagén viažucich integrínov pri zápalovom ochorení a uvádza jednu monoklonálnu protilátku pri škrečkovi vytvorenú proti myším integrínovým reťazcom. Mendrick et al. (Lab. Invest., 1995, 72: 367 - 375) opisuje niekoľko anti-VLA-1 protilátok, ktoré rozpoznávajú ľudský a potkaní VLA-1. US-A 5 788 966 opisuje dve anti-VLA-1 protilátky, jedna z nich rozpoznáva ľudský a potkaní VLA-1. Druhá anti-VLA-1 protilátka neovplyvňuje viazanie aktivovavných lymfocytov na kolagénom IV ošetrených doštičkách, ako opisuje Fabbri et al. (Tissue Antigens, 1996,48: 47-51). JP-A 08-13118 opisuje monoklonálnu protilátku schopnú reagovať s myším VLA-1. Fabbri et al (loc. cit.) opisuje anti-VLA-1 monoklonálnu protilátku označenú FB12. FBI2 inhibuje viazanie aktivovaných lymfocytov na kolagénom ošetrených doštičkách. Inhibičný účinok protilátok dosiahol asi 10 pg/mL FB12.
SK 288124 Β6
Podstata vynálezu
Predkladaný vynález sa týka nasledujúcich aspektov:
1. Protilátka anti-VLA-1 alebo jej fragment viažuci antigén, ktorých úseky určujúce komplementaritu ľahkého reťazca sú definované aminokyselinovými zvyškami 24 až 33, 49 až 55 a 88 až 96 zo SEQ ID NO: 1, a ktorých úseky určujúce komplementaritu ťažkého reťazca sú definované aminokyselinovými zvyškami 31 až 35, 50 až 65 a 98 až 107 zo SEQ ID NO: 2.
2. Protilátka podľa bodu 1, ktorá obsahuje vo svojom ťažkom reťazci aspoň jeden z nasledujúcich zvyškov: V12, F29, A49, T93 a R94.
3. Protilátka podľa bodu 1, ktorá obsahuje vo svojom ľahkom reťazci aspoň jeden z nasledujúcich zvyškov: Ql, L4 a Y71.
4. Protilátka alebo jej fragment viažuci antigén podľa bodu 1, ktorá obsahuje:
a) variabilnú doménu ľahkého reťazca so sekvenciou SEQ ID NO: 1, a variabilnú doménu ťažkého reťazca so sekvenciou SEQ ID NO: 2; alebo
b) rovnaké polypeptidové sekvencie ťažkého a ľahkého reťazca ako protilátka produkovaná hybridómom mAQC2 s ATCC prístupovým číslom PTA3273.
5. Protilátka alebo jej fragment viažuci antigén podľa bodu 1, pričom protilátkou alebo fragmentom je humanizovaná protilátka.
6. Protilátka alebo jej fragment viažuci antigén podľa bodu 5, pričom protilátka alebo fragment obsahuje:
a) vo svojom ľahkom reťazci aspoň jeden z nasledujúcich zvyškov: Ql, L4, P46, W47 a Y71; alebo vo svojom ťažkom reťazci aspoň jeden z nasledujúcich zvyškov: Dl, V12, S28, F29, A49, T93, R94 s číslovaním podľa Kabata; alebo
b) sekvenciu variabilnej domény ľahkého reťazca definovanú aminokyselinovými zvyškami 1 až 106 zo sekvencie SEQ ID NO: 3 a sekvenciu variabilnej domény ťažkého reťazca definovanú aminokyselinovými zvyškami 1 až 118 zo sekvencie SEQ ID NO: 4; alebo
c) rovnaké polypeptidové sekvencie ťažkého a ľahkého reťazca ako protilátka produkovaná bunkovou líniou hAQC2 s ATCC prístupovým číslom PTA3275; alebo
d) rovnaké polypeptidové sekvencie ťažkého a ľahkého reťazca ako protilátka produkovaná bunkovou líniou hsAQC2 s ATCC prístupovým číslom PTA3356; alebo
e) rovnaké polypeptidové sekvencie ťažkého a ľahkého reťazca ako protilátka produkovaná bunkovou líniou haAQC2 s ATCC prístupovým číslom PTA3274.
7. Protilátka alebo jej fragment viažuci antigén podľa bodu 5, kde ťažký reťazec je mutovaný v jednom alebo vo viacerých aminokyselinových zvyškoch vybraných zo skupiny, ktorú tvoria zvyšky 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 a 322 podľa systému číslovanie EU, čím je spôsobená zmena efektorovej funkcie, zatiaľ čo je zachovaná väzba k VLA-1, v porovnaní s nemodifikovaňou protilátkou.
8. Protilátka alebo jej fragment viažuci antigén podľa bodu 7, pričom protilátka alebo fragment obsahuje mutácie L234A a L235A podľa systému číslovania EU vo svojom ťažkom reťazci, v porovnaní s nemodifikovanou protilátkou.
9. Protilátka alebo jej fragment viažuci antigén podľa bodu 5, pričom protilátka alebo fragment sú mutované v aminokyselinovom zvyšku, ktorý je glykozylačným miestom, čím je glykozylačné miesto eliminované.
10. Protilátka alebo jej fragment viažuci protilátku podľa bodu 9, ktorá obsahuje vo svojom ťažkom reťazci mutáciu N297Q podľa systému číslovania EU.
11. Kompozícia obsahujúca protilátku alebo jej fragment viažuci antigén podľa ktoréhokoľvek z bodov 1 až 10 a farmaceutický prijateľný nosič.
12. Sekvencia izolovanej nukleovej kyseliny obsahujúca DNA, ktorá je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z:
a) kódujúcej sekvencie pre SEQ ID NO: 1 a kódujúcej sekvencie pre SEQ ID NO: 2;
b) kódujúcej sekvencie pre ľahký reťazec protilátky produkovanej hybridómom mAQC2 s ATCC prístupovým číslom PTA3273 a kódujúcej sekvencie pre ťažký reťazec protilátky produkovanej hybridómom mAQC2 s ATCC prístupovým číslom PTA327;
c) kódujúcej sekvencie pre ľahký reťazec protilátky produkovanej bunkovou líniou hAQC2 s ATCC prístupovým číslom PTA3275 a kódujúcej sekvencie pre ťažký reťazec protilátky produkovanej bunkovou líniou hAQC2 s ATCC prístupovým číslom PTA3275;
d) kódujúcej sekvencie pre ťažký reťazec protilátky produkovanej bunkovou líniou haAQC2 s ATCC prístupovým číslom PTA3274;
e) kódujúcej sekvencie pre ťažký reťazec protilátky produkovanej bunkovou líniou hsAQC2 s ATCC prístupovým číslom PTA3356;
f) kódujúcej sekvencie pre zvyšky 1 až 106 zo SEQ ID NO: 3 a kódujúcej sekvencie pre zvyšky I až 118 zo SEQ ID NO: 4; a
g) kódujúcej sekvencie pre protilátku anti-VLA-1 alebo jej fragment viažuci antigén, ktorých úseky určujúce komplementaritu ľahkého reťazca sú definované aminokyselinovými zvyškami 24 až 33, 49 až 55 a 88 až 96 zo SEQ ID NO: 1, a ktorých úseky určujúce komplementaritu ťažkého reťazca sú definované aminokyselinovými zvyškami 31 až 35, 50 až 65 a 98 až 107 zo SEQ ID NO: 2.
13. Použitie kompozície podľa bodu 11 na prípravu farmaceutickej kompozície na liečenie imunologických porúch.
14. Spôsob určovania hladiny VLA-1 in vitro v tkanive zahrnujúci kroky, keď sa tkanivo privedie do kontaktu s protilátkou podľa nároku 1 a deteguje sa väzba protilátky ku tkanivu, čím sa určí hladina VLA-1 v tkanive.
15. Použitie kompozície podľa bodu 11 na prípravu kompozície na určovanie hladiny VLA-1 v tkanive na použitie v diagnostike imunologických porúch.
16. Bunka z bunkovej línie hAQC2 s ATCC prístupovým číslom PTA3275, haAQC2 s ATCC prístupovým číslom PTA3274, hsAQC2 s ATCC prístupovým číslom PTA3356 alebo z hybridómu mAQC2 s ATCC prístupovým číslom PTA3273.
17. Spôsob identifikácie inhibítora I domény integrínu zahrnujúci kroky, keď sa
a) použijú štruktúrne koordináty aminokyselín hAQC2 obsahujúce zvyšky ľahkého reťazca Asn30, Tyr48, Trp90, Asn93 a Trp95 a zvyšky ťažkého reťazca Arg31, His56, Tyr58, GlylOO a AsplOl, alebo hodnota odmocniny priemerného štvorca odchýlok atómov hlavného reťazca aminokyselín hAQC2 najviac ± 1,10 Á, na vytvorenie trojrozmernej štruktúry väzbového miesta,
b) trojrozmerná štruktúra použije na navrhnutie alebo výber potenciálneho antagonistu,
c) syntetizuje sa potenciálny antagonista a
d) potenciálny antagonista privedie do kontaktu s hAQC2, aby sa určila schopnosť potenciálneho antagonistu interagovať s hAQC2, pričom schopnosť potenciálneho antagonistu interagovať s hAQC2 ukazuje, že potenciálny antagonista je inhibítor I domény.
18. Použitie podľa bodov 13 alebo 15, pričom imunologická porucha je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z gastrointestinálnych porúch, autoimunitných ochorení, fibrózy, kožných porúch, vaskulámych ochorení, alergickej rinitídy, syndrómu respiračného distresu, astmy, bronchitídy, tendinitídy, burzitídy, migrény, nodóznej periarteritídy, tyroiditídy, aplastickej anémie, Hodgkinovej choroby, reumatickej horúčky, osteoartritídy, sarkoidózy, nefrotického syndrómu, renálneho zlyhania, Bechetovho syndrómu, polymyozitídy, gingivitídy, hypersenzitivity, rejekcie štepu a transplantátu, ochorenie spôsobené reakciou štepu proti hostiteľovi (graft versus host disease), konjunktivitídy, opuchov po poranení, ischémie myokardu a syndrómu endotoxínového šoku.
19. Protilátka alebo jej fragment viažuci antigén podľa niektorého z bodov 1 až 10, pričom fragment viažuci antigén je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z Fab, F(ab')2 a jednoduchého reťazca Fv.
Tento vynález opisuje protilátky anti-VLA-1 a tieto protilátky na liečenie množstva zápalových a imunologických ochorení.
Konkrétne vynález opisuje protilátku, ktorá sa špecificky viaže k VLA-1 (napr. ľudskému VLA-1). V kontexte tohto vynálezu sa taktiež opisuje, že táto protilátka obsahuje úseky určujúce komplementaritu („CDR“) ľahkého reťazca definované aminokyselinovými zvyškami 24 až 33, 49 až 55 a 88 až 96 zo sekvencie uvedenej v zozname sekvencii ako SEQ ID NO: 1, a/alebo úseky určujúce komplementaritu ťažkého reťazca definované aminokyselinovými zvyškami 31 až 35, 50 až 65 a 98 až 107 zo sekvencie uvedenej tu v zozname sekvencii ako SEQ ID NO: 2. Opisuje sa tu, že tieto úseky CDR môžu obsahovať mutácie (napr. delécie, inzercie a/alebo substitúcie) v častiach, ktoré nie sú v kontakte s antigénom, ako sa určilo z kryštálovej štruktúry opísanej v tomto texte, pričom by to neovplyvnilo VLA-1-väzbovú aktivitu protilátky. Príklady takýchto mutácií sú S24N, G92S a D101A v CDR ľahkého reťazca a G55S v CDR2 ťažkého reťazca. Protilátka, ako sa opisuje v kontexte vynálezu, môže obsahovať sekvenciu SEQ ID NO: 1 variabilnej domény ľahkého reťazca a/alebo sekvenciu SEQ ID NO: 2 variabilnej domény ťažkého reťazca.
Protilátka, ako sa opisuje v kontexte tohto vynálezu, môže taktiež obsahovať rovnaké polypeptidové sekvencie ťažkého a ľahkého reťazca ako protilátka produkovaná hybridómom mAQC2, ktorý sa uložil 18. apríla 2001 v Americkej zbierke mikroorganizmov (American Type Culture Collection, „ATCC“, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110 - 2209) a má ATCC prístupové číslo PTA3273. (Všetky uloženia v ATCC opísané v tomto texte sa uskutočnili v zmysle Budapeštianskej zmluvy). Táto protilátka sa môže teda produkovať napríklad hybridómom mAQC2 alebo bunkami, ktoré obsahujú sekvenciu nukleovej kyseliny izolovanú z uvedeného hybridómu, ktorá kóduje ťažký a ľahký reťazec monoklonálnej protilátky mAQC2.
Protilátkou, ako sa tu opisuje, môže taktiež byť humanizovaná protilátka obsahujúca aspoň jeden (napr. 2, 3, 4 alebo 5) z nasledujúcich zvyškov v svojom ľahkom reťazci: Ql, L4, P46, W47 a Y71, alebo aspoň jeden (napr. 2, 3, 4, 5, 6 alebo 7) z nasledujúcich zvyškov v svojom ťažkom reťazci: Dl, V12, S28, F29, A49, T93, R94 (číslovanie zodpovedá konvencii podľa Kabata). Napríklad opísaná protilátka obsahuje Ql, L4 a Y71 v ľahkom reťazci a/alebo (i) F29, A49, T93 a R94 alebo (ii) A49 a T93 v ťažkom reťazci.
Humanizovaná protilátka, ako sa opisuje v kontexte tohto vynálezu, môže obsahovať sekvenciu variabil4
SK 288124 Β6 nej domény ľahkého reťazca definovanú aminokyselinovými zvyškami 1 až 106 zo SEQ ID NO: 3 a/alebo sekvenciu variabilnej domény ťažkého reťazca definovanú aminokyselinovými zvyškami 1 až 118 zo SEQ ID NO: 4. Opisovaná humanizovaná protilátka môže obsahovať rovnaké polypeptidové sekvencie ťažkého a/alebo ľahkého reťazca ako protilátka produkovaná bunkovou líniou hAQC2 (ATCC prístupové číslo PTA3275, vzorka uložená 18. apríla 2001).
Humanizovaná protilátka, ako sa opisuje v kontexte tohto vynálezu, môže obsahovať mutáciu (napr. deléciu, substitúciu alebo adíciu) v jednej alebo viacerých (napr. 2, 3, 4, 5, 6, 7 alebo 8) určitých polohách ťažkého reťazca, takže efektorová funkcia protilátky (napr. schopnosť protilátky viazať sa k Fc receptoru alebo faktoru komplementu) je zmenená, pričom sa neovplyvní schopnosť protilátky viazať sa k VLA-1 (U. S. Patent 5 648 260). Tieto polohy v ťažkom reťazci zahrnujú, pričom ich zoznam nie je limitujúci, zvyškami 234, 235, 236,237, 297, 318, 320 a 322 (systém číslovania EU). Opísaná humanizovaná protilátka môže napríklad obsahovať mutácie L234A (t. j. leucín v polohe 234 nemodifikovanej protilátky je nahradený alanínom) a L235A (systém číslovania EU) v ťažkom reťazci. Opísaná protilátka môže obsahovať taktiež rovnakú polypeptidovú sekvenciu ťažkého reťazca ako protilátka produkovaná bunkovou líniou hsAQC2 (ATCC prístupové číslo PTA3356, vzorka uložená 4. mája 2001).
Ďalej humanizovaná protilátka, ako sa opisuje v kontexte tohto vynálezu, môže obsahovať mutáciu (napr. deléciu alebo substitúciu) v aminokyselinovom zvyšku, ktorý je miestom pre glykozyláciu, takže glykozylačné miesto sa odstráni. Takáto protilátka môže byť klinicky výhodná tým, že má redukovanú efektorovú funkciu alebo ďalšie nežiaduce funkcie, pričom si udržiava svoju väzbovú afinitu pre VLA-1. Mutácie glykozylačného miesta môžu byť tiež výhodné pre vývoj postupov spracovania (napr. expresie proteínu a jeho purifikácie). Napríklad ťažký reťazec opísanej protilátky môže obsahovať mutáciu N297Q (systém číslovania EU), takže takýto ťažký reťazec sa nemôže glykozylovať v tomto mieste. Humanizovaná protilátka tu opísaná môže taktiež obsahovať rovnakú polypeptidovú sekvenciu ťažkého reťazca ako protilátka produkovaná bunkovou líniou haAQC2 (ATCC prístupové číslo PTA3274, vzorka uložená 18. apríla 2001).
Ďalej ťažký a/alebo ľahký reťazec protilátky, ako sa opisuje v kontexte tohto vynálezu, obsahuje mutácie, ktoré zvyšujú afinitu väzby k VLA1, a preto zvyšujú účinnosť na liečenie VLA-1-sprostredkovaných chorobných stavov.
V kontexte tohto vynálezu je ďalej kompozícia obsahujúca protilátku podľa vynálezu a farmaceutický prijateľný nosič, izolovanú nukleovú kyselinu obsahujúcu kódujúcu sekvenciu pre SEQ ID NO: 1, izolovanú nukleovú kyselinu obsahujúcu kódujúcu sekvenciu pre SEQ ID NO: 2, izolovanú nukleovú kyselinu obsahujúcu kódujúcu sekvenciu pre ľahký reťazec protilátky produkovaný hybridómom mAQC2, izolovanú nukleovú kyselinu obsahujúcu kódujúcu sekvenciu pre ťažký reťazec protilátky produkovaný hybridómom mAQC2, izolovanú nukleovú kyselinu obsahujúcu kódujúcu sekvenciu pre ľahký reťazec protilátky produkovaný bunkovou líniou hAQC2, izolovanú nukleovú kyselinu obsahujúcu kódujúcu sekvenciu pre ťažký reťazec protilátky produkovaný bunkovou líniou hAQC2, izolovanú nukleovú kyselinu obsahujúcu kódujúcu sekvenciu pre ťažký reťazec protilátky produkovaný bunkovou líniou haAQC2, izolovanú nukleovú kyselinu obsahujúcu kódujúcu sekvenciu pre ťažký reťazec protilátky produkovaný bunkovou líniou hsAQC2, izolovanú nukleovú kyselinu obsahujúcu kódujúcu sekvenciu pre zvyšky 1 až 106 zo sekvencie SEQ ID NO: 3, izolovanú nukleovú kyselinu obsahujúcu kódujúcu sekvenciu pre zvyšky 1 až 118 zo sekvencie SEQ ID NO: 4, bunky hybridómu mAQC2, bunky z bunkovej línie hAQC2, bunky z bunkovej línie haAQC2 a bunky z bunkovej línie hsAQC2.
Tento vynález taktiež opisuje protilátku podľa tohto vynálezu na liečenie pacienta s imunologickým ochorením sprostredkovaným VLA-1, pričom uvedená protilátka je pripravená na podanie subjektu v účinnom množstve protilátky opísanej v kontexte tohto vynálezu. Napríklad je táto protilátka na liečenie ľudských subjektov na zmiernenie, zlepšenie, stabilizovanie, reverziu, zabránenie, spomalenie alebo zdržanie priebehu ochorení. Alternatívne sa táto protilátka používa na profylaktické liečenie ľudských subjektov, u ktorých je riziko, že sa u nich vyvinie toto imunologické ochorenie, a to buď na prevenciu alebo na oneskorenie nástupu ochorenia. „Účinné množstvo“ prípravku sa môže podať v jednej alebo vo viacerých dávkach.
K imunologickým ochoreniam sprostredkovaným VLA-1 patria, pričom však tento zoznam nie je obmedzený, chorobné stavy, pri ktorých je hladina VLA-1 aktivity zvýšená v jednej alebo vo viacerých tkanivách v porovnaní s normálnym zdravým jedincom. Príklady takýchto chorobných stavov sú stavy príbuzné kožným chorobám (napr. psoriáza, ekzém, popáleniny, dermatitída a abnormálna proliferácia buniek vlasových vačkov), fibróza (napr. obličiek alebo pľúcna fibróza), alergická rinitída, syndróm respiračnej tiesne (ťažkosti s dýchaním), astma, bronchitída, tendinitída, burzitída, horúčka, migrény, gastrointestinálne ochorenia (napr. zápalové ochorenie čriev, Crohnova choroba, gastritída, syndróm dráždivého kolónu, kolitída a kolorektálny karcinóm), vaskuláme ochorenia (napr. ateroskleróza), nodózna periarteritída, tyroiditída, aplastická anémia, Hodgkinova choroba, reumatická horúčka, osteoartritída, autoimúnne choroby (napr. diabetes typu I, ťažká myasténia, reumatoidná artritída, systémový lupus erythematosus a skleróza multiplex), sarkoidóza, nefrotický syndróm, renálne zlyhanie, Bechetov syndróm, polymyozitída, gingivitída, precitlivelosť (napr. oneskore5
SK 288124 Β6 ný typ hypersenzitivity alebo okamžitá hypersenzitivita), odmietnutie štepu a transplantátu, ochorenie spôsobené reakciou štepu proti hostiteľovi (GVHD), konjunktivitída, opuchy nastávajúce po poranení, ischémia myokardu a syndróm endotoxínového šoku.
Predkladaný vynález tiež opisuje spôsob na in vitro určenie hladiny VLA-1 v tkanive (napr. vzorke tkaniva a telovej tekutiny), ktorý zahrnuje krok, keď sa tkanivo privedie do kontaktu s protilátkou, ako sa opisuje v kontexte tohto vynálezu, a potom sa deteguje väzba protilátky k tkanivu, čím sa určí hladina VLA-1 v tkanive.
Ako sa v tomto texte používa termín protilátka, ako sa opisuje v kontexte tohto vynálezu, môže to byť napríklad myšacia protilátka, humanizovaná protilátka alebo chiméma protilátka. Môže to byť celá protilátka (t. j. s dvoma kompletnými ľahkými reťazcami a dvoma kompletnými ťažkými reťazcami) ktoréhokoľvek izotypu a podtypu (napr. IgM, IgD, IgG, IgG2, lgG3, IgG4, IgE, IgA a IgA2, s ľahkým reťazcom buď typu kappa, alebo lambda). Alternatívne sa termín protilátka, ako sa opisuje v kontexte tohto vynálezu, tiež týka antigén-väzbového fragmentu (napr. Fab, F(ab’)2 a jednoduchého reťazca Fv) z celej protilátky.
Tento vynález ďalej opisuje kryštalizovateľné kompozície a kryštály komplexov vytvorených chimémou potkaňou/ľudskou al-I doménou (mutant RAH) a Fab fragmentom hAQC2, a ďalej sa vynález týka použitia týchto kompozícií a kryštálov. Vynález tiež opisuje štruktúrne koordináty (súradnice) a väzbové miesta chimémej domény a hAQC2 Fab fragmentu. Atómové koordináty pochádzajúce z kryštálovej štruktúry opísané v tomto texte poskytujú štruktúrne východisko pre biologické aktivity hAQC2, a tiež základ pre racionálne navrhovanie („rational design“) VLA-1 agonistov alebo antagonistov s predikovanými biologickými aktivitami (napr. zlúčenín patriacich medzi tzv. malé molekuly alebo protilátok ako napríklad hAQC2 variant).
Kryštálová štruktúra opísaná v tomto texte je prvou kryštálovou štruktúrou al-I domény z komplexu αϊβΐ integrín/Fab. Táto štruktúra ukazuje zvyšky kritické pre väzbu Fab doménou all. Okrem toho, Fab sa viaže v predpokladanom väzbovom mieste pre kolagén a inhibuje väzbu kolagénu. Aminokyselinové zvyšky zistené vo väzbovom mieste al-I domény zahrnujú Aspl54, Serl56, Asnl57, Serl58, TyrlóO, Glul92, Glu218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 a Leu294 (kryštálové číslovanie). Zvyšky na Fab fragmente, o ktorých sa zistilo, že viažu al-I doménu, zahrnujú zvyšky ľahkého reťazca Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 a Trp95 a zvyšky ťažkého reťazca Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO a AsplOl (kryštálové číslovanie).
Tento vynález tiež opisuje počítač na prípravu trojrozmernej reprezentácie molekulového komplexu, kde molekulový komplex je definovaný súborom štruktúrnych koordinát komplexu chimémej domény I z αϊβΐ integrínu RAH a humanizovanej protilátky hAQC2, podľa obr. 19, alebo homologického molekulového komplexu, kde homológ nemá hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlky od atómov hlavného reťazca aminokyseliny vyššiu ako 0,65 Á. Počítač tu opísaný obsahuje strojom čitateľné médium na ukladanie údajov (pamäťové médium) vrátane údajov kódovaných so strojom čitateľnými údajmi, kde údaje obsahujú aspoň časť štruktúrnych koordinát komplexu podľa obr. 19, pracovnú pamäť na uloženie inštrukcií na spracovanie strojom čitateľných údajov, centrálnu procesorovú jednotku spojenú s pracovnou pamäťou a s pamäťovým médiom na ukladanie strojom čitateľných údajov na spracovanie strojom čitateľných údajov do trojrozmerných reprezentácií, a displej spojený s centrálnou procesorovou jednotkou na zobrazovanie trojrozmerných reprezentácií.
Predkladaný vynález ďalej opisuje počítač na prípravu trojrozmernej reprezentácie molekuly alebo molekulového komplexu vrátane väzbových miest definovaných štruktúrnymi koordinátami aminokyselín hAQC2 vrátane aspoň siedmich (napr. 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 alebo 16) zvyškov ľahkého reťazca Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 a Trp95 a zvyškov ťažkého reťazca Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO a Asp 101 (kryštálové číslovanie), podľa obr. 19, alebo homológ molekuly alebo molekulového komplexu, kde homológ obsahuje väzbové miesto, ktoré má hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlky od atómov hlavného reťazca aminokyselín hAQC2 nie vyššiu ako 1,10 Á. Tento vynález tiež opisuje počítač na prípravu trojrozmernej reprezentácie väzbového miesta definovaného štruktúrnymi koordinátami hAQC2 aminokyselín vrátane aspoň siedmich (napr. 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 alebo 16) zvyškov ľahkého reťazca Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 a Trp95 a zvyškov ťažkého reťazca Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO a AsplOl (kryštálové číslovanie), podľa obr. 19, väzbového miesta homológa, ktoré má hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlky od atómov hlavného reťazca aminokyselín hAQC2 nie vyššiu ako 1,10 Á.
Tento vynález tiež opisuje spôsob identifikácie inhibítorov domény I integrínu, ktorý zahrnuje kroky použitia štruktúrnych koordinát hAQC2 aminokyselín vrátane aspoň siedmich (napr. 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 alebo 16) zvyškov ľahkého reťazca Asn30, Tyr4 8, Trp90, Ser91, Asn93 a Trp95 a zvyškov ťažkého reťazca Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO a AsplOl (kryštálové číslovanie), podľa obr. 19, alebo ± hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlky od atómov hlavného reťazca aminokyselín hAQC2 nie vyššiu ako 1,10 Á, vytvorenie trojrozmernej štruktúry väzbového miesta, využitie trojrozmernej štruktúry pre návrh alebo selekciu potenciálneho antagonistu, syntézu potenciálneho antagonistu a kontaktovanie potenciálneho antagonistu s hAQC2 na určenie schopnosti potenciálneho antagonistu intera6
SK 288124 Β6 govať s hAQC2, pričom schopnosť potenciálneho antagonistu interagovať s hAQC2 ukazuje, že potenciálny antagonista je inhibítor domény I. Tento vynález ďalej opisuje inhibítor domény I integrínu identifikovaný opísaným spôsobom.
Tento vynález tiež opisuje počítač na prípravu trojrozmernej reprezentácie molekuly alebo molekulového komplexu obsahujúceho: väzbové miesto definované štruktúrnymi koordinátami aminokyselinových zvyškov domény I Asp 154, Serl56, Asnl57, Serl58, TyrlóO, Glul92, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 a Leu294 (kryštálové číslovanie), podľa obr. 19, alebo homológa molekuly alebo molekulového komplexu, kde homológ zahrnuje druhé väzbové miesto, ktoré má hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlky od atómov hlavného reťazca aminokyselín domény najviac 0,65 Á. Tento vynález tiež opisuje počítač na prípravu trojrozmernej reprezentácie: prvého väzbového miesta definovaného štruktúrnymi koordinátami aminokyselinových zvyškov I domény Asp 154, Ser 156, Asnl57, Serl58, TyrlóO, Glul92, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 a Leu294 (kryštálové číslovanie), podľa obr. 19, alebo väzbového miesta homológa, ktorý má hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlky od atómov hlavného reťazca aminokyselín domény najviac 0,65 Á.
Tento vynález tiež opisuje počítač na prípravu trojrozmernej reprezentácie molekuly alebo molekulového komplexu obsahujúceho: väzbové miesto definované štruktúrnymi koordinátami aminokyselín domény I vrátane aspoň tri zvyškov Glu 192, Gln218, Arg219, Gly220 a Gly221 (kryštálové číslovanie), podľa obr. 19, alebo homológa molekuly alebo molekulového komplexu, kde homológ zahrnuje druhé väzbové miesto, ktoré má hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlky od atómov hlavného reťazca aminokyselín I domény najviac 1,0 Á. Vynález ďalej opisuje počítač na prípravu trojrozmernej reprezentácie väzbového miesta definovaného štruktúrnymi koordinátami aminokyseliny I domény vrátane aspoň troch zvyškov z Glu 192, Gln218, Arg219, Gly220 a Gly221 (kryštálové číslovanie), podľa obr. 19, alebo väzbové miesto homológa, ktoré má hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlky od atómov hlavného reťazca aminokyselín domény I najviac 1,0 Á.
Tento vynález ďalej opisuje spôsoby použitia trojrozmernej reprezentácie pre návrh chemických entít, ktoré asociujú s chimérnou doménou alebo Fab fragmentom hAQC2, alebo jeho časťou a pôsobia ako potenciálne inhibítory chimémej domény alebo Fab fragmentu hAQC2, alebo jeho časti.
Tento vynález tiež opisuje kompozície obsahujúce chemické entity, ako napríklad inhibítory a varianty chimémej domény alebo varianty Fab fragmentu hAQC2, kde takéto chemické entity a varianty sú racionálne navrhnuté prostredníctvom štruktúrnych koordinát chimémej domény alebo Fab fragmentu hAQC2, alebo väzbových miest. Vynález ďalej opisuje použitie identifikovaných chemických zlúčenín na liečenie alebo prevenciu ochorení združených s nevhodnou alebo abnormálnou aktivitou αϊβΐ u pacienta.
Tento vynález ďalej opisuje spôsob identifikácie inhibítora domény I integrínu, ktorý zahrnuje kroky, keď sa použijú štruktúrne koordináty aminokyselinových zvyškov I domény Aspl54, Serl56, Asnl57, Serl58, TyrlóO, Glul92, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 a Leu294 (kryštálové číslovanie), podľa obr. 19, na vytvorenie trojrozmernej štruktúry väzbového miesta, využije trojrozmerné štruktúry pre návrh alebo selekciu potenciálneho antagonistu, syntézu potenciálneho antagonistu a kontaktuje potenciálneho antagonistu s doménou I, aby sa určila schopnosť potenciálneho antagonistu interagovať s doménou I, pričom schopnosť potenciálneho antagonistu interagovať s doménou I ukazuje, že potenciálny antagonista je inhibítor domény I.
Predkladaný vynález tiež opisuje spôsob identifikácie inhibítora domény 1 integrínu, zahrnujúci kroky použitia štruktúrnych koordinát aspoň troch aminokyselinových zvyškov z Glu 192, Gln218, Arg219, Gly220 a Gly221 (kryštálové číslovanie) domény I podľa obr. 19, alebo ± hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlky od atómov aminokyselín domény I najviac 0,65 Á, vytvorenie trojrozmernej štruktúry väzbového miesta, použitie trojrozmernej štruktúry pre návrh alebo selekciu potenciálneho antagonistu, syntézu potenciálneho antagonistu a kontaktovanie potenciálneho antagonistu s doménou I, aby sa určila schopnosť potenciálneho antagonistu interagovať s doménou I integrínu, pričom schopnosť potenciálneho antagonistu interagovať s doménou I ukazuje, že potenciálny antagonista je inhibítor domény I. Tento vynález tiež opisuje inhibítor domény I integrínu identifikovaný týmto spôsobom.
Ďalšie vlastnosti a výhody vynálezu budú zjavné z nasledujúceho podrobného opisu, príkladov, obrázkov a nárokov.
Podrobný opis vynálezu
Zistením, na ktorom je založený predkladaný vynález, je to, že protilátka k integrínu (napr. VLA-1) a jeho fragmentu, konkrétne podjednotke α 1-integrínu, môže blokovať interakciu prozápalových leukocytov so zložkami extracelulámeho matrixu, vrátane kolagénov, laminínu a fibronektínu, bez toho, aby tento zoznam zložiek bol obmedzujúci. Tento objav ukazuje dôležitosť adhéznych molekúl z rodiny integrínov, konkrétne αϊβΐ, v prostredí periférnych tkanív v priebehu stavov príbuzných zápalu.
To tiež rozširuje úlohu členov rodiny integrínov a ich fragmentov pri zápale nad jednoduché naviazanie
SK 288124 Β6 leukocytov a extravasáciu na hranici endotelu tým, že zdôrazňuje dôležitosť na matrix bohatého prostredia periférneho tkaniva pre imunitné reakcie a odhaľuje tak periférne tkanivá ako nový cieľový bod intervencie pri terapii založenej na adhézii.
I. Anti-integrínové protilátky
Spôsoby opísané v kontexte tohto vynálezu uvažujú s použitím protilátok k integrínom, kde integríny zahrnujú molekuly, ktoré obsahujú reťazec β, vrátane, ale bez obmedzenia βΐ, β2, β3, β4, β5, β6, β7, β8, nekovalentne viazaný k reťazcu a, vrátane, ale bez obmedzenia, al, a2, a3, a4, a5, a6, a7, a8, a9, alO, aV, aL, aM, aX, aD, aE, allb. Príklady rôznych integrínov, prichádzajúcich do úvahy na použitie podľa vynálezu, zahrnujú, ale bez obmedzenia, nasledujúce integríny:
α 1 β 1, α2β1, α3β1, α4β1, α5β1, α6β1, α7β1, α8β1, α9β1, αΙΟβΙ, ανβΐ, αΕβΙ, αΜβΙ, αΧβΙ, αϋβΐ, αΐΐύβΐ, αΕβΙ;
α1β2, α2β2, α3β2, α4β2, α5β2, α6β2, α7β2, α8β2, α9β2, α10β2, ανβ2, αίβ2, αΜβ2, αΧβ2, αϋβ2, αΙΙύβ2, αΕβ2;;
α1β3, α2β3, α3β3, α4β3, α5β3, α6β3, α7β3, α8β3, α9β3, α10β3, ανβ3, αΐίβ3, αΜβ3, αΧβ3, αϋβ3, αΙΙύβ3, αΕβ3;
α1β4, α2β4, α3β4, α4β4, α5β4, α6β4, α7β4, α8β4, α9β4, α10β4, ανβ4, αίβ4, αΜβ4, αΧβ4, αϋβ4, αΙΙδβ4, αΕβ4;
α1β5, α2β5, α3β5, α4β5, α5β5, α6β5, α7β5, α8β5, α9β5, α10β5, ανβ5, αΕβ5, αΜβ5, αΧβ5, αϋβ5, αΙΙύβ5, αΕβ5;
α1β6, α2β6, α3β6, α4β6, α5β6, α6β6, α7β6, α8β6, α9β6, α10β6, ανβ6, αίβ6, αΜβ6, αΧβ6, αϋβ6, αΙΙύβ6, αΕβ6;
α1β7, α2β7, α3β7, α4β7, α5β7, α6β7, α7β7, α8β7, α9β7, α10β7, ανβ7, αίβ7, αΜβ7, αΧβ7, αϋβ7, αΙΙΙ>β7, αΕβ7;
a 1 β8, α2β8, α3β8, α4β8, α5β8, α6β8, α7β8, α8β8, α9β8, αΙΟβδ, ανβ8, αϋβ8, αΜβ8, αΧβ8, αϋβ8, α!Ιύβ8, αΕβ8;
Spôsoby, ako sú opísané v kontexte tohto vynálezu, tiež zahrnujú použitie protilátok k fragmentom integrínu, vrátane napríklad protilátok proti samotnému reťazcu β, vrátane, ale bez obmedzenia, βΐ, β2, β3, β4, β5, β6, β7, β8, rovnako ako samotnému reťazcu a, vrátane, ale bez obmedzenia, al, a2, a3, a4, a5, a6, a7, a8, a9, alO, aV, aL, aM, aX, aD, aE, allb. Navyše spôsoby, ako sú opísané v kontexte tohto vynálezu, uvažujú aj použitie protilátok k fragmentom integrínu vrátane napríklad protilátok k doméne I reťazca a, vrátane, ale bez obmedzenia, domény I z αϊβΐ (Briesewitz et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 2989), α2β1 (Takada and Hemler, 1989, I Celí Biol 109: 397), αίβ2 (Larson et al., 1989, J Celí Biol 108: 703), αΜβ2 (Corbi et al., 1988,JBiol Cheer 263: 12403), αΧβ2 (Corbi et al., 1987, EMBO J 6: 4023), αϋβ2 (Grayson et al., 1988, JExp Med 188: 2187), αΕβ7 (Shaw et al., 1994, J. Biol. Chem. 269: 6016). V jednom uskutočnení antigénny determinant al-I domény zahrnuje aminokyselinovú sekvenciu najmenej 6 po sebe idúcich aminokyselín, pričom táto súvislá sekvencia sa vyskytuje v sekvencii uvedenej na obr. 12. V príbuznom uskutočnení ja táto súvislá sekvencia Val-Gln-Arg-Gly-Gly-Arg (aminokyselinové zvyšky 91 až 97 zo SEQ ID NO: 64).
Spôsoby produkcie integrínov na použitie podľa predkladaného vynálezu sú odborníkom známe (pozri napr. Springer et al., 1990, Náture 346: 425 - 434).
Uskutočnenie vynálezu ďalej zahrnuje anti-integrínové polyklonálne a monoklonálne protilátky. Uskutočnenia vynálezu zahrnujú monoklonálne protilátky, ako je napr. anti-αΐ monoklonálna protilátka. Protilátky na liečenie, konkrétne na liečbu ľudí, zahrnujú ľudské protilátky, humanizované protilátky, chiméme protilátky a antigén-väzbové fragmenty celých protilátok, ako sú napríklad Fab, Fab', F(ab')2 a F(v) protilátkové fragmenty. Niektoré protilátky, ako sú opísané v kontexte tohto vynálezu, môžu tiež zahrnovať proteíny obsahujúce jeden alebo viac imunoglobulínových ľahkých reťazcov a/alebo ťažkých reťazcov, ako napríklad monoméry a homo- alebo heteromultiméry (napr. diméry alebo triméry) týchto reťazcov, kde sú tieto reťazce prípadne viazané disulfidickou väzbou alebo sú zosietené iným spôsobom. Protilátky sú schopné viazať sa k jednému alebo viacerým antigénom (napr. al, a2, a6 alebo podjednotkám integrínu obsahujúcom α-I doménu).
Označenie protilátka blokujúca fúnkciu αϊβΐ, ako sa v tomto texte opisuje, sa týka protilátky, ktorá sa viaže na al-I doménu, napríklad zvyšky 92 až 97 sekvencie na obr. 12, a blokuje tým αϊβΐ fúnkciu, ktorá je testovaná napríklad podľa schopnosti inhibovať K562-al závislú adhéziu ku kolagénu IV (pozri príklad 15).
V nasledujúcej časti sú opísané rôzne spôsoby prípravy protilátok, ako sú opísané v kontexte tohto vynálezu. Spôsoby, ktoré sú v odbore známe, ale nie sú špecificky opisované v tomto texte, patria tiež do rozsahu predkladaného vynálezu. Napríklad protilátky, ako sú opísané v kontexte tohto vynálezu, sa môžu tiež identifikovať s použitím fágovej displejovej protilátkovej knižnice, ako je napr. opísané v Smith, 1985, Science 228: 1315 - 7, alebo v U. S. patentoch č. 5 565 332, 5 733 743, 6 291 650 a 6 303 313. Ďalšie protilátky, ako sú opísané v kontexte tohto vynálezu, sa môžu pripraviť kondenzáciou ťažkých reťazcov identifikovaných podľa vynálezu s nepríbuzným ľahkým reťazcom, napr. ľahkým reťazcom, ktorý bol identifikovaný metódou displeja na fágu („phage display“).
II. Protilátky z hybridómov iných ako ľudských
Monoklonálne protilátky, ako sú opísané v kontexte tohto vynálezu, sa môžu tvoriť známou hybridómovou technológiou. Napríklad zvieratá β 1-/- (napr. myši, laboratórne potkany alebo králiky) sa môžu imunizovať purifikovaným alebo surovým preparátom αϊβΐ, bunky sa môžu transfekovať s cDNA konštruktom kódujúcim al, βΐ alebo obidvoma antigénmi, bunky môžu konštitutívne exprimovať αϊβΐ a pod., antigén sa môže podať ako purifikovaný proteín, proteín exprimovaný na bunkách, proteínový fragment alebo jeho peptid, ako nahá DNA alebo vírusový vektor kódujúci proteín, proteínový fragment alebo peptid. Séra imunizovaných zvierat sa potom testujú na prítomnosť anti-αΐβΐ protilátky. B lymfocyty sa izolujú zo zvierat, ktoré sú v teste pozitívne a s B lymfocytmi sú vytvorené hybridómy.
Protilátky sekrétované hybridómami sú podrobené skríningu na ich schopnosť viazať sa špecificky k VLA-1 (napr. viazať sa na bunky transfekované al, ale nie na parentálne netransfekované bunky) a na akékoľvek ďalšie požadované vlastnosti, napr. či majú požadované CDR kanonické sekvencie, či inhibujú (alebo neinhibujú, v prípade hľadania neblokujúcich agens) väzbu medzi kolagénom a VLA-1.
Hybridómové bunky, ktoré sú pozitívne v skríningovom teste, sa kultivujú v živnom médiu za podmienok, ktoré dovoľujú bunkám sekrétovať monoklonálne protilátky do kultivačného média. Kondicionovaný supematant hybridómovej kultúry sa potom odoberie a purifikujú sa protilátky nachádzajúce sa v supematante. Inak sa môžu požadované protilátky vytvoriť tak, že sa injikujú hybridómové bunky do pobrušnicovej dutiny neimunizovaného zvieraťa (napr. myši). Hybridómové bunky sa potom množia v pobrušnicovej dutine a sekrétujú protilátku, ktorá sa hromadí ako tekutý ascites. Protilátka sa potom môže zozbierať tak, že sa odoberie ascitická tekutina z pobrušnicovej dutiny pomocou injekčnej striekačky.
Monoklonálne protilátky sa môžu tiež pripraviť tak, že sa izoluje cDNA kódujúca protilátku z požadovaného hybridómu, touto cDNA sa transfekujú cicavčie hostiteľské bunky (napr. bunky CHO alebo NSO), transfekované hostiteľské bunky sa kultivujú a protilátka sa získa z kultivačného média,
III. Chiméme protilátky
Monoklonálne protilátky, ako sú opísané v kontexte tohto vynálezu, sa môžu tiež pripraviť tak, že sa pripraví príbuzná protilátka z hybridómu (napr. myši, laboratórneho potkana alebo králika). Napríklad príbuzná protilátka sa môže potom zmeniť technikou rekombinantnej DNA tak, že časť alebo celá kĺbová oblasť a/alebo konštantné úseky ťažkého a/alebo ľahkého reťazca sa nahradia zodpovedajúcimi zložkami protilátky iného biologického druhu (napr. ľudskej protilátky).
Všeobecne, variabilné domény geneticky pripravenej protilátky zostanú totožné alebo v podstate totožné s variabilnými doménami príbuznej protilátky. Takáto geneticky upravená protilátka sa nazýva chiméma protilátka a je menej antigénna ako príbuzná protilátka, keď je podávaná príjemcovi, ktorý je biologickým druhom, z ktorého pochádzajú celá kĺbová oblasť a/alebo konštantné úseky ťažkého a/alebo ľahkého reťazca (napr. človek). Spôsoby prípravy chimémych protilátok sú v odbore dobre známe. Ľudské konštantné úseky zahrnujú tie, ktoré pochádzajú z IgGl a IgG4.
IV. Plne ľudské protilátky
Monoklonálne protilátky, ako sú opísané v kontexte tohto vynálezu, tiež zahrnujú plne ľudské protilátky. Tie sa môžu pripraviť s použitím in vitro iniciovaných („primed“) ľudských splenocytov, ako bolo opísané v Boemer et al., 1991, J. Immunol. 147: 86 - 95, alebo s využitím fágovej displejovej knižnice protilátok, ako bolo opísané napr. v U. S. patente č. 6 300 064.
Alternatívne, plne ľudské protilátky sa môžu tiež pripraviť pomocou tzv. repertoárového klonovania, ako bolo opísané v Persson et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 188: 24322436, and Huang and Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141: 227 - 236. Okrem toho, U. S. patent č. 5 798 230 (25. august 1998) opisuje prípravu ľudskej monoklonálnej protilátky z ľudských B lymfocytov, kde ľudské B lymfocyty produkujúce protilátky sú imortalizované infekciou Epstein-Barrovej vírusom alebo jeho derivátom, ktorý exprimuje nukleárny antigén 2 (EBNA2) Epstein-Barrovej vírusu, čo je proteín požadovaný pre imortalizáciu. EBNA2 funkcia je následne vyradená, čo potom spôsobí zvýšenie produkcie protilátky.
Niektoré ďalšie produkcie plne ľudských protilátok zahrnujú použitie zvierat iného ako ľudského pôvodu,
SK 288124 Β6 ktoré majú deaktivované endogénne Ig lokusy a sú transgénne pre gény ťažkého reťazca a ľahkého reťazca ľudských protilátok, ktoré nie sú preskupené. Takéto transgénne zvieratá sa môžu imunizovať al β 1 a z ich B lymfocytov sa potom pripravia hybridómy. Tieto metódy sú opísané napr. v rôznych publikáciách GenPharm/Medarex (Palo Alto, CA) a patentoch týkajúcich sa transgénnych myší obsahujúcich ľudské Ig minilokusy (napr. Lonberg, U. S. patent 5 789 650), rôznych publikáciách/patentoch firmy Abgenix (Fremont, CA) týkajúcich sa XENOMICE (napr. Kucherlapati U. S. patenty 6 075 181, 6 150 584 a 6 162 963, Green et al., 1994, Náture Genetics 7: 13 - 21 a Mendez et al., 1997, Náture Genetics 15 (2): 146 - 56) a rôznych publikáciách/patentoch firmy Kirin (Japonsko) týkajúcich sa „transomickej“ myši (napr., EP 843961 a Tomizuka et al., 1997, Náture Genetics 16: 133 - 1443).
V. Humanizované protilátky
Monoklonálne protilátky, ako sú opísané v kontexte tohto vynálezu, tiež zahrnujú humanizované verzie príbuzných anti-αΐβΐ protilátok pochádzajúcich z iných biologických druhov. Humanizovaná protilátka je protilátka pripravená metódami rekombinantnej DNA, v ktorej sú niektoré alebo všetky aminokyseliny ľudského imunoglobulínového ľahkého alebo ťažkého reťazca, ktoré nie sú vyžadované pre väzbu antigénu (napr. konštantné úseky a rámcové úseky variabilných domén) použité na nahradenie zodpovedajúcich aminokyselín ľahkého alebo ťažkého reťazca v príbuznej protilátke iného ako ľudského pôvodu. Tak napríklad humanizovaná verzia myšacej protilátky k určitému antigénu má tak v ťažkom ako aj v ľahkom reťazci (1) konštantné úseky ľudskej protilátky, (2) rámcové úseky z variabilnej domény ľudskej protilátky a (3) úseky CDR z myšacej protilátky. Keď je to nutné, jeden alebo viac zvyškov v ľudskom rámcovom úseku sa môže zmeniť na zvyšky zodpovedajúce polohám v myšacej protilátke, aby sa zachovala väzbová afinita humanizovanej protilátky k antigénu. Táto zmena sa niekedy nazýva „spätnou mutáciou“ („back mutation“). Humanizované protilátky všeobecne vyvolávajú imunitné reakcie u ľudí s menšou pravdepodobnosťou v porovnaní s chimémymi ľudskými protilátkami, pretože humanizované protilátky obsahujú podstatne menej zložiek iného ako ľudského pôvodu.
Spôsoby prípravy humanizovaných protilátok sú známe a boli opísané napr. vo Winter, EP 239 400, Jones et al., 1986, Náture 321: 522 - 525, Riechmann et al., 1988, Náture 332: 323 - 327, 1988, Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534 - 1536, Queen et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 10029, U. S. patent 6 180 370, a Orlandi et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833. Všeobecne, transplantácia myšacích (alebo všeobecne iného ako ľudského pôvodu) úsekov CDR na ľudskú protilátku sa uskutočňuje nasledovným spôsobom.
Z hybridómu sa izolujú cDNA kódujúce variabilné domény ťažkého a ľahkého reťazca. DNA sekvencie variabilných domén, zahrnujúce úseky CDR, sa určia sekvenovaním. DNA kódujúce CDR sa potom prenesú do zodpovedajúcich úsekov sekvencie kódujúcej variabilné domény ťažkého alebo ľahkého reťazca ľudskej protilátky metódou miestne cielenej mutagenézy. Potom sa pridajú génové segmenty ľudských konštantných úsekov požadovaného izotypu (napr. γΐ pre CH a k pre CL). Gény humanizovaného ťažkého a ľahkého reťazca sa potom koexprimujú (súčasne exprimujú) v cicavčích hostiteľských bunkách (napr. CHO alebo NSO), čím sa produkuje rozpustná humanizovaná protilátka. Aby bolo možné produkovať protilátky v priemyselnom meradle, je často nutné produkovať takéto humanizované protilátky v bioreaktoroch obsahujúcich bunky exprimujúce protilátky alebo pomocou transgénnych cicavcov (ako sú napr. kozy, kravy alebo ovce), ktoré exprimujú protilátku v mlieku (pozri napr. U. S. patent č. 5 827 690).
Niekedy priamy prenos úsekov CDR do ľudského rámca spôsobuje stratu antigén-väzbovej afinity pre antigén pri takto vzniknutej protilátke. Je to tým, že v niektorých príbuzných protilátkach určité aminokyseliny v rámcovom úseku interagujú s CDR a tak ovplyvňujú celkovú väzbovú afinitu protilátky k antigénu. V takomto prípade by bolo rozhodujúce vniesť „spätné mutácie“ (pozri skôr) do rámcového úseku akceptorovej protilátky, aby sa udržala antigén-väzbová aktivita príbuznej protilátky.
Všeobecný postup vnášania spätných mutácií je v odbore známy. Napríklad Queen et al. (pozri skôr), Co et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88: 2869 - 2873 a W090/07861(Protein Design Labs Inc.) opisujú spôsob, ktorý zahrnuje dva kľúčové kroky. V prvom kroku ľudské úseky V rámca sú vybrané pomocou počítačovej analýzy podľa optimálnej sekvenčnej proteínovej homológie s V rámcovými úsekmi príbuznej myšacej protilátky. Potom je terciáma štruktúra myšacieho V úseku modelovaná počítačom, aby bolo možné vizualizovať aminokyselinové zvyšky rámcového úseku, ktoré by mohli pravdepodobne interagovať s myšacími úsekmi CDR, a tieto myšacie aminokyselinové zvyšky sú potom superponované na homologický ľudský rámcový úsek.
Pri tomto dvojfázovom postupe je niekoľko kritérií na navrhovanie humanizovaných protilátok. Prvým kritériom je použitie ako ľudského akceptora rámcového úseku z určitého ľudského imunoglobulínu, ktorý je zvyčajne homologický s donorovým imunoglobulínom iného ako ľudského pôvodu, a/alebo použitie kanonickej sekvencie rámca z mnohých ľudských protilátok. Druhým kritériom je použitie aminokyseliny donora skôr ako akceptora, ak ľudský akceptorový zvyšok je nezvyčajný a aminokyselinový zvyšok donora je typický pre ľudské sekvencie v špecifickom zvyšku rámcového úseku. Tretím kritériom je použitie aminokyseli10
SK 288124 Β6 nového zvyšku rámcového úseku donora skôr ako akceptora v polohách bezprostredne susediacich s úsekmi CDR.
Môže sa ale použiť tiež úplne iný prístup, ako bol opísaný napr. v Tempest, 1991, Biotechnology 9: 266 až 271. Podľa tohto postupu úseky V rámcov pochádzajúce z ťažkého a ľahkého reťazca NEWM a REI, v danom poradí, sa použili na CDR-štepenie, bez toho, aby sa vniesli radikálne myšacie zvyšky. Výhodou pri použití tohto prístupu je to, že trojrozmerné štruktúry variabilných úsekov NEWM a REI sú známe z rôntgenovej kryštalografie, takže špecifické interakcie medzi CDR úsekmi a zvyškami úseku V rámca sa môžu ľahko modelovať.
VI. Ďalšie skupiny
Monoklonálne protilátky, ako sú opísané v kontexte tohto vynálezu, môžu ďalej zahrnovať ďalšie skupiny na vykonávanie požadovaných funkcií. Napríklad protilátky môžu obsahovať toxínovú skupinu (napr. tetanový toxoid alebo ricín) alebo rádionuklid (napr. H1In alebo 90Y) na usmrtenie buniek cielených protilátkami (pozri napr. U. S. patent 6 307 026). Protilátky môžu obsahovať skupinu umožňujúcu detekciu alebo ľahkú izoláciu (napr. biotín, fluorescenčné skupiny, rádioaktívne skupiny, histidínový „prívesok“ - tag, alebo ďalšie peptidové tagy). Protilátky môžu tiež obsahovať skupiny, ktoré môžu predĺžiť ich sérový polčas, napríklad polyetylénglykolovú (PEG) skupinu, a člena superrodiny imunoglobulínov alebo jeho fragment (napr. časť konštantného úseku ťažkého reťazca ľudského IgGl, napríklad kĺbový úsek, CH2 a CH3 úseky).
VII. Kryštalizovatelné kompozície a kryštály
Predkladaný vynález tiež opisuje kryštalizovateľnú kompozíciu obsahujúcu komplex: (1) potkanie-ľudské chiméme al-I domény (napr. mutant RAH) alebo jej časť (napr. polypeptid zahrnujúci aminokyseliny 135 až 336 z potkanej-ľudskej chimémej al-I domény) a (2) Fab fragment z hAQC2 alebo jeho časť (napr. polypeptid zahrnujúci aminokyseliny 3 až 213 ľahkého reťazca a/alebo polypeptid zahrnujúci aminokyseliny 3 až 219 ťažkého reťazca). Príklad takéhoto komplexu je uvedený na obr. 20. RAH al-I doména môže obsahovať napr. aminokyselinové zvyšky 145 až 336 (kryštálové číslovanie) (SEQ ID NO: 59, pozri vyššie) al podjednotky laboratórneho potkana. hAQC2 Fab fragmenty môžu obsahovať aminokyselinové zvyšky 1 až 106 (napr. 1 až 213) ľahkého reťazca, ktorý má SEQ ID NO: 3, a aminokyselinové zvyšky 1 až 118 (napr. 1 až 219) ťažkého reťazca, ktorý má SEQ ID NO: 4. Fragmenty hAQC2 Fab sa môžu získať papaínovým štiepením celej protilátky alebo môžu sa pripraviť metódami rekombinantnej DNA. Fab fragmenty obsahujú aspoň antigén-väzbovú časť variabilnej domény ľahkého reťazca a/alebo ťažkého reťazca z hAQC2.
145 TQLDIV
151 IVLDGSNSIY PWESVIAFLN DLLKRMDIGP KQTQVGIVQY
191 GENVTHEFNL NKYSSTEEVL VAANKIVQRG GRQTMTALGI
231 DTARKEAFTE ARGARRGVKK VMVIVTDGES HDNYRLKQVI
271 QDCEDENIQR FSIAILGHYN RGNLSTEKFV EEIKSIASEP
311 TEKHFFNVSD ELALVTIVKA LGERIF (SEQ ID NO: 59)
Niektoré kryštalizovateľné kompozície a kryštály, ako sú opísané v kontexte tohto vynálezu, môžu obsahovať molekulu alebo molekulárny komplex, ktorý je homologický s al-I doménou a/alebo hAQC2 Fab fragmentom podľa aminokyselinovej sekvencie alebo trojrozmernej štruktúry. Príklady homológov zahrnujú, ale bez obmedzenia: al-I doménu a/alebo hAQC2 Fab fragment s mutáciami, ako sú napríklad konzervatívne substitúcie, adície, delécie alebo ich kombinácie. Termín „konzervatívna substitúcia“ označuje nahradenie zvyšku iným zvyškom, ktorý je fyzicky podobný veľkosťou, tvarom, hydrofobicitou, nábojom a/alebo chemickými vlastnosťami zodpovedajúcemu referenčnému zvyšku. Spôsoby identifikácie „zodpovedajúcej“ aminokyseliny sú v odbore známe a sú založené na sekvenčnom porovnaní, štruktúrnom porovnaní, funkčnej polohe alebo ich kombináciou v porovnaní s kryštálovou štruktúrou riešenou podľa predkladaného vynálezu. Napríklad zodpovedajúce aminokyseliny môžu byť identifikované tým, že sa superponujú atómy aminokyselín hlavného reťazca komplexu al-I doména/hAQC2 a homológa al-I domény a/alebo hAQC2 s použitím odborníkovi dobre známych programov (softvérových aplikácií), ako je napríklad QUANTA (Molecular Simulation, Inc., San Diego, CA, ©1998, 2000). Zodpovedajúce aminokyseliny sa môžu tiež identifikovať s použitím počítačových programov pre porovnávanie sekvencií, ako je napríklad program „Bestfit“ dostupný od Genetics Computer Group, ktorý používa algoritmus lokálnej homológie opísaný v publikácii Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981.
Kryštalizovateľné kompozície, ako sú opísané v kontexte tohto vynálezu, môžu ďalej obsahovať jednu alebo viac súčastí, ktoré podporujú kryštalizáciu a/alebo sú kompatibilné s podmienkou kryštalizácie. K takýmto zložkám patria, ale bez obmedzenia, pufer, soli, precipitačné činidlá a ďalšie činidlá. Jedna zložka môže byť 30 % (hmotnosť/objem) polyetylénglykolu 1500 (PEG 1500).
SK 288124 Β6
Predkladaný vynález tiež opisuje spôsoby prípravy kryštálov z kryštalizovateľnej kompozície obsahujúce komplex al-I domény a antigén-väzbové časti hAQC2 (napr. Fab, Fab' alebo iného fragmentu, pozri skôr). Rôzne techniky kryštalizácie sa môžu použiť vo vynáleze, vrátane difúzie pary, dialýzy, mikrodávkovej a dávkovej difúzie, a difúzie kvapalina-kvapalina.
Metódy difúzie pary zahrnujú, ale bez obmedzenia, metódy prisadnutej kvapky („sitting-drop“), zavesenej kvapky („hanging-drop“) a sendvičovej kvapky („sandwich-drop“). Metódy difúzie pary môžu využívať postupy na kontrolu rýchlosti kryštalizácie, ako je napríklad pridanie olejov na kvapky alebo roztoku v zásobníku. Kryštalizačné metódy môžu zahrnovať miešanie roztoku v zásobníku obsahujúceho zrážadlo s vodným roztokom komplexu al-I domény a antigén-väzbové časti hAQC2 za vzniku kryštalizovateľnej kompozície. Zmes alebo kryštalizovateľné kompozície sa môžu potom kryštalizovať s použitím rôznych zmienených postupov. Kryštalizovateľná kompozícia podľa tohto vynálezu môže byť vodný roztok komplexu a 1-1 domény a antigén-väzbové časti hAQC2, ktorý obsahuje komplex s koncentráciou približne 1 až 50 mg na 1 ml, ako napríklad s koncentráciou približne 5 až 15 mg na 1 ml (napr. 11 mg na 1 ml).
VIII. Kryštálové štruktúry a štruktúrne koordináty
Predkladaný vynález opisuje trojrozmernú štruktúru kryštálu vrátane komplexu mutanta RAH a hAQC2 Fab fragmentu pri rozlíšení 2,8 Á (pozri príklad 24). Trojrozmerné štruktúry ďalších príbuzných kryštálov sa môžu tiež určiť s použitím spôsobov opísaných v tomto texte a postupov známych v odbore. Trojrozmerná štruktúra tohto komplexu je definovaná súborom štruktúrnych koordinát (súradníc) uvedených na obr. 19. Tieto štruktúrne koordináty sú kartézske koordináty atómov odvodené z matematických rovníc týkajúcich sa vzorcov získaných difrakciou monochromatického lúča rôntgenového žiarenia na atómoch alebo rozptylových centrách kryštalického komplexu al-I domény a hAQC2 Fab fragmentu. Difrakčné (rozptylové) dáta sú najskôr použité na výpočet mapy elektrónovej hustoty (denzity) opakujúcej sa kryštálovej jednotky. Mapa elektrónovej hustoty sa potom použije na stanovenie polohy jednotlivých atómov komplexu.
Predkladaný vynález opisuje molekulu alebo molekulárny komplex definovaný všetkými alebo niektorými štruktúrnymi koordinátami všetkých aminokyselín uvedených na obr. 19, a tiež homologickú molekulu alebo molekulárny komplex, kde homológ má odmocninu priemerného štvorca odchýlky od atómov hlavného reťazca týchto aminokyselín medzi 0,00 Á a 0,65 Ä, napríklad medzi 0,00 Á a 0,60 Ä (napr. medzi 0,00 Á a 0,50 Á).
Termín „odmocnina priemerného štvorca odchýlky“ alebo „r. m. s. odchýlky“ znamená druhú odmocninu aritmetického priemeru štvorcov odchýlok od priemeru. To je spôsob, ako vyjadriť odchýlku alebo variáciu od trendu alebo predmetu. Pre tento vynález termíny „odmocnina priemerného štvorca odchýlky“ alebo „r. m. s. pozičnej odchýlky“ definujú odchýlku hlavného reťazca proteínu od relevantnej časti hlavného reťazca polypeptidu, ako bol definovaný štruktúrnymi koordinátami opísanými v tomto texte.
Molekula alebo molekulárny komplex, ako sú opísané v kontexte tohto vynálezu, môžu tiež zahrnovať väzbové miesto definované Štruktúrnymi koordinátami aspoň siedmich aminokyselín z hAQC2 Fab fragmentu vybraných zo skupiny obsahujúcej zvyšky ľahkého reťazca Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 a Trp95 a zvyšky ťažkého reťazca Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO a AsplOl (kryštálové číslovanie) podľa obr. 19, alebo homológ molekuly, alebo molekulového komplexu, kde homológ zahrnuje väzbové miesto, ktoré má odmocninu priemerného štvorca odchýlky od atómov hlavného reťazca jednej alebo viac z týchto aminokyselín medzi 0,00 Á a 1,10 Á, napríklad medzi 0,00 Á a 1,00 Á (napr. medzi 0,00 Á a 0,50 Á). Termín „väzbové miesto“, ako sa v tomto texte používa, sa týka úseku molekuly alebo molekulového komplexu, ktorý sa, v dôsledku svojho tvaru a náboja, priaznivo asociuje s ďalšou chemickou entitou. Termín „miesto“ zahrnuje, ale nie je tým obmedzený, prehĺbeninu, ryhu, kanál alebo vrecko. Napríklad väzbové miesta na al doméne môžu zahrnovať väzbové miesto pre kolagén (Emsley et al., 1997, pozri vyššie), väzbové miesto pre antigén a alosterické (alebo MIDAS) väzbové miesto (Huth et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97: 5231 - 5236). Termín „chemická entita“ zahrnuje, ale nie je tým obmedzený, akúkoľvek molekulu, molekulárny komplex, zlúčeninu alebo jej fragment. Termín „asociovať sa“, sa týka asociácie alebo väzby v podmienkach blízkosti chemickej entity alebo jej časti a väzbového vrecka alebo väzbového miesta proteínu. Asociácia môže byť nekovalentná - kde vzájomné postavenie vedľa seba je energeticky zvýhodnené vodíkovými väzbami alebo van der Waalsovými, alebo elektrostatickými interakciami - alebo môže byť kovalentné.
Molekula alebo molekulárny komplex, ako sú opísané v kontexte tohto vynálezu, môže tiež obsahovať väzbové miesto definované štruktúrnymi koordinátami aminokyselinových zvyškov al-I domény vybraných zo skupiny obsahujúcej Asp 154, Serl56, Asnl57, Serl58, Tyrl60, Glul92, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, GIn223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 a Leu294 (kryštálové číslovanie), podľa obr. 19, alebo homológ molekuly, alebo molekulového komplexu, kde homológ zahrnuje väzbové miesto, ktoré má hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlky od atómov hlavného reťazca aminokyselín al-I domény medzi 0,00 a 0,92 Á.
Molekula alebo molekulárny komplex, ako sú opísané v kontexte tohto vynálezu, môžu tiež obsahovať
SK 288124 Β6 väzbové miesto definované štruktúrnymi koordinátami aminokyselinových zvyškov al-I domény vybraných zo skupiny obsahujúcej Glul92, Gln218, Arg219, Gly220 a Gly221 (kryštálové číslovanie), podľa obr. 19, alebo homológ molekúl, alebo komplex, ktorý obsahuje väzbové miesto, ktoré má hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlky od atómov hlavného reťazca aminokyselín al-I domény medzi 0,00 a 0,30 Á.
Odborníci chápu, že súbor štruktúrnych koordinát pre polypeptid je relatívny súbor bodov, ktoré definujú tvar v troch rozmeroch (v priestore). Takže je možné, že úplne odlišný súbor koordinát, ktorý definuje podobný alebo totožný tvar, sa môže vytvoriť pomocou matematických úprav štruktúrnych koordinát na obr. 19. Napríklad štruktúrne koordináty by sa mohli upravovať kryštalografickými permutáciami štruktúrnych koordinát, frakcionalizáciou štruktúrnych koordinát, prirátaním alebo odrátaním celého čísla od súboru štruktúrnych koordinát, inverziou štruktúrnych koordinát alebo akoukoľvek ich kombináciou. Navyše malé zmeny v jednotlivých koordinátach majú iba malý účinok na celkový tvar.
Inak modifikácia v kryštálovej štruktúre spôsobená mutáciou, ako je napríklad adícia, substitúcia, a/alebo delécia aminokyseliny, alebo ďalšie zmeny v ktorejkoľvek zložke polypeptidu (napr. hAQC2 Fab fragmentu alebo al-I doméne), ktorá tvorí kryštál, môže tiež zodpovedať za zmeny štruktúrnych koordinát. Ak sú takéto variácie v prijateľnom rozsahu strednej chyby v porovnaní s pôvodnými koordinátami, výsledný trojrozmerný tvar je považovaný za zhodný s nemodifikovaným kryštálom.
Je preto nutné určiť, či entita je dostatočne podobná celej alebo iba časti štruktúry opísanej v tomto texte, pokiaľ ide o to, či môže byť považovaná za rovnakú.
Takéto analýzy sa môžu uskutočňovať s použitím moderných softvérových aplikácií, ako je napríklad program QUANTA (Accelrys, Inc. and Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA © 1998, 2000) a program O (Jones et al., 1991, ActaGast. A47: 110 - 119), pozri príslušné užívateľské príručky. Aplikácia Molecular Similarity z programu QUANTA a aplikácia LSQ z programu O umožňujú porovnanie medzi rôznymi štruktúrami, rôznymi konformáciami rovnakej štruktúry a rôznymi časťami rovnakej štruktúry. Všeobecný postup použitý v obidvoch aplikáciách je vloženie štruktúr, ktoré sa majú porovnávať, definovanie ekvivalentných atómových polôh v týchto štruktúrach, uskutočnenie priraďovacích operácií a analyzovanie výsledkov.
Po vložení každej štruktúry do aplikácie sa jej pridelí meno a štruktúra sa identifikuje ako fixovaná štruktúra alebo pohyblivá štruktúra. Atómová ekvivalencia je zvyčajne definovaná ekvivalentnými atómami ako napríklad atómami proteínového reťazca (N, Ca, CaO) pre všetky konzervatívne zvyšky medzi dvoma štruktúrami, ktoré sú porovnávané. Pohyblivá štruktúra sa translatuje a otáča, aby sa dosiahla optimálna zhoda alebo zhoda s najmenším štvorcom odchýlok s fixovanou štruktúrou. Odmocnina priemerného štvorca odchýlok pre všetky špecifikované páry ekvivalentných atómov je uvádzaná obidvoma programami v ángstrômoch (Á).
Pre tento vynález, ktorýkoľvek molekulárny komplex, ktorý má odmocninu priemerného štvorca odchýlok atómov hlavného reťazca konzervatívnych zvyškov (N, Ca, C, O) medzi 0,00 Á a 1,50 Á, ako napríklad medzi 0,00 a 1,00 Á (napr. medzi 0,00 a 0,50 Á), keď je superponovaný na relevantné atómy hlavného reťazca opísané štruktúrnymi koordinátami uvedenými na obr. 19, považuje sa za totožný.
IX: Určovanie ďalších kryštálových štruktúr
Štruktúrne koordináty uvedené na obr. 19 sa môžu tiež použiť ako pomôcka na získanie štruktúrnych informácií o iných kryštalizovaných molekulárnych entitách, napríklad iné hAQC2 obsahujúce substitúcie aminokyselín v jednom z úsekov CDR. To sa môže dosiahnuť ktoroukoľvek zo známych techník, zahrnujúcich molekulárnu substitúciu, čo je osobitne užitočný spôsob na určovanie štruktúry mutantov a homológov al-I domény/Fab.
Štruktúrne koordináty uvedené na obr. 19 sa môžu tiež použiť na určenie aspoň časti trojrozmernej štruktúry molekulárnych entít, ktoré obsahujú aspoň niektoré štruktúrne rysy podobné aspoň časti al-I domény alebo hAQC2 Fab. Preto ďalšie uskutočnenie tohto vynálezu poskytuje spôsob využitia molekulárnej substitúcie na získanie štruktúrnej informácie o kryštalizovanej molekule alebo molekulárnom komplexe s neznámou štruktúrou zahrnujúci kroky: (a) vytvorenie rôntgenového difrakčného vzorca pre kryštalizovanú molekulu alebo molekulárny komplex a (b) aplikácia aspoň časti štruktúrnych koordinát uvedených na obr. 19 na rôntgenový difrakčný vzorec, aby sa vytvorila trojrozmerná mapa elektrónovej denzity molekuly alebo molekulového komplexu s neznámou štruktúrou.
Aplikáciou molekulárnej substitúcie môžu byť všetky alebo časť štruktúrnych koordinát uvedených na obr. 19 použité na rýchlejšie a účinnejšie určenie neznámej štruktúry kryštalizovanej molekuly, ako keby sa takéto informácie získavali znova od samého začiatku {ab initio). Molekulárna substitúcia poskytuje presné určenie fáz pre neznámu štruktúru. Fázy sú faktory v rovniciach určených na riešenie kryštálových štruktúr, ktoré sa nemôžu určiť priamo. Získanie presných hodnôt pre fázy, metódami inými ako je molekulárna substitúcia, môže byť často časovo veľmi náročný postup, ktorý zahrnuje iteračné cykly aproximácie a ďalšieho spresňovania, a výrazne sťažuje vyriešenie kryštálovej štruktúry. Ale keď je vyriešená kryštálová štruktúra proteínu obsahujúceho aspoň homologickú časť, fázy zo známej štruktúry môžu často poskytnúť uspokojivý odhad fáz pre neznámu štruktúru.
Takže molekulárna substitúcia zahrnuje vytvorenie predbežného modelu molekuly alebo molekulového komplexu, ktorého štruktúrne koordináty sú neznáme, tým, že sa orientuje a polohuje relevantná časť komplexu podľa obr. 19 v rámci jednotkovej bunky kryštálu neznámej molekuly alebo molekulového komplexu tak, aby najlepšie zodpovedala pozorovanému vzorcu rôntgenovej difrakcie kryštálu molekuly alebo molekulového komplexu, ktorého štruktúra je neznáma. Fázy sa môžu potom vyrátať z tohto modelu a v kombinácii s amplitúdami pozorovaného vzorca rôntgenovej difrakcie poskytnú mapu elektrónovej denzity štruktúry, ktorej koordináty sú neznáme. Tá sa potom môže ďalej podrobiť akejkoľvek známej metóde výstavby modelu a upresňovania štruktúry, aby sa získala presná štruktúra neznámej kryštalizovanej molekuly alebo molekulového komplexu (Lattman, 1985, Meth. Enzymol. 115: 55 - 77, Rossmann, ed., „The Molecular Replacement Method“, Int. Sci. Rev. Ser., No. 13, Gordon & Breach, New York, 1972). Štruktúra ktorejkoľvek časti ktorejkoľvek kryštalizovanej molekuly alebo molekulového komplexu, ktoré sú dostatočne homologické s ktoroukoľvek časťou al-I domény a/alebo hAQC2 Fab fragmentu (podľa obr. 19), môže sa vyriešiť týmto spôsobom.
X. Počítač a pamäťové médium
Aby sa dali použiť štruktúrne koordináty, ako sú opísané v kontexte tohto vynálezu, napr. koordináty uvedené na obr. 19, je zvyčajne nutné konvertovať tieto koordináty na trojrozmernú (t. j. priestorovú) reprezentáciu alebo tvar. Komerčne dostupné grafické programy (softvér) vrátane, ale bez obmedzenia, programu O (Jones et al., 1991, Acta Cryst. A47: 110 - 119) a 1NSIGHTII (©Accelrys, Inc. a Molecular Simulation, Inc., San Diego, CA), sú schopné zo súboru štruktúrnych koordinát vytvoriť trojrozmernú reprezentáciu molekuly alebo molekulového komplexu, alebo ich častí.
Podľa opisu tohto vynálezu štruktúrne koordináty molekulárnych entít podľa vynálezu sú uložené na pamäťovom médiu, ktoré je čitateľné strojovo (napr. počítačom). S použitím počítača a vhodného programového vybavenia (softvéru) sa môžu takéto dáta použiť na celý rad účelov, ako napríklad objavovanie liečiv a rôntgenokryštalografickú analýzu kryštálov ďalších proteínov.
V súlade s tým, strojovo čitateľné médium na uchovanie dát (pamäťové médium) môže zahrnovať dátový materiál kódovaný do strojovo čitateľných dát zahrnujúci aspoň časť štruktúrnych koordinát uvedených na obr. 19. Počítač môže ďalej zahrnovať inštrukcie na vytvorenie trojrozmernej reprezentácie molekulárnych komplexov al-I domény a hAQC2 Fab fragmentu spracovaním strojovo čitateľných dát podľa tohto vynálezu. Počítač podľa vynálezu môže tiež zahrnovať displej, grafické rozhranie na zobrazenie alebo vstupné zariadenie na pohybovanie a manipulácie s trojrozmernou grafickou reprezentáciou štruktúrnych koordinát.
Tento vynález tiež opisuje počítač na určenie aspoň časti štruktúrnych koordinát zodpovedajúcich dátam rôntgenovej difrakcie získaným pre molekulárny komplex αϊβΐ integrínu a Fab fragmentu z hAQC2 protilátky, kde počítač zahrnuje strojovo čitateľné médium obsahujúce dátový materiál kódovaný so strojovo čitateľnými dátami, kde dáta zahrnujú aspoň časť štruktúrnych koordinát molekulového komplexu z al-I domény a hAQC2 Fab fragmentu podľa obr. 19 alebo dáta rôntgenovej difrakcie získané z kryštalického molekulového komplexu. Počítač ďalej zahrnuje inštrukcie na uskutočňovanie Fourierovej transformácie strojovo, čitateľných koordinátových dát a inštrukcie na spracovanie týchto strojovo čitateľných difrakčných dát do štruktúrnych koordinát. Tento počítač môže ďalej zahrnovať: pracovnú pamäť na ukladanie inštrukcií na spracovanie strojovo čitateľných dát, centrálnu procesorovú jednotku spojenú s pracovnou pamäťou a so strojovo čitateľnými dátami, a voliteľné grafické rozhranie alebo displej spojený s centrálnou procesorovou jednotkou na zobrazenie trojrozmernej grafickej reprezentácie štruktúrnych koordinát molekuly alebo molekulového komplexu.
Vynález ďalej opisuje počítač na vytvorenie trojrozmernej reprezentácie: molekuly alebo molekulového komplexu definovaného tým, že aspoň časť alebo všetky štruktúrne koordináty všetkých aminokyselín al-I domény a hAQC2 Fab fragmentu, uvedených na obr. 19, alebo homológa molekuly alebo molekulového komplexu, kde homológ má odmocninu štvorca priemernej odchýlky od atómov aminokyselín hlavného reťazca medzi 0,00 Á a 1,50 Á, napríklad medzi 0,00 a 1,00 Á (napr. medzi 0,00 a 0,50 Á). Ďalej v tomto vynáleze počítač zahrnuje: strojovo čitateľné pamäťové médium na uloženie dát obsahujúce uložený dátový materiál kódovaný so strojovo čitateľnými dátami, kde dáta zahrnujú aspoň časť alebo všetky štruktúrne koordináty všetkých aminokyselín al-I domény a Fab hAQC2 fragmentu, ako sú uvedené na obr. 19.
Počítač, ako je opísaný v kontexte tohto vynálezu, môže vytvoriť trojrozmernú reprezentáciu molekuly alebo molekulového komplexu vrátane väzbových miest. Väzbové miesto sa môže definovať štruktúrnymi koordinátami aspoň siedmich aminokyselín z hAQC2 Fab fragmentu vybraných zo skupiny obsahujúcej zvyšky ľahkého reťazca Asn30,Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 a Trp95 a zvyšky ťažkého reťazca Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO a AsplOl (kryštálové číslovanie) podľa obr. 19, alebo homológa molekuly, alebo molekulového komplexu, kde homológ zahrnuje väzbové miesto, ktoré má hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlok atómov hlavného reťazca aspoň jednej aminokyseliny z hAQC2 Fab fragmentu medzi 0,00 Á a 1,10 Á, ako napríklad medzi 0,00 Á a 1,00 Ä (napr. medzi 0,00 Á a
SK 288124 Β6
0,50 Á). Ďalej počítač podľa tohto vynálezu zahrnuje: strojovo čitateľné pamäťové médium na ukladané dáta vrátane uloženého dátového materiálu kódovaného so strojovo čitateľnými dátami, kde dáta zahrnujú štruktúrne koordináty aspoň siedmich aminokyselín z hAQC2 Fab fragmentu vybraných zo skupiny obsahujúcej zvyšky ľahkého reťazca Asn30,Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 a Trp95 a zvyšky ťažkého reťazca Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO a AsplOl (kiyštálové číslovanie) podľa obr. 19.
Tento vynález tiež opisuje počítač na vytvorenie trojrozmernej reprezentácie molekuly alebo molekulového komplexu vrátane väzbového miesta definovaného štruktúrnymi koordinátami aminokyselín domény I vybraných zo skupiny, ktorú tvoria zvyšky Aspl54, Serl56, Asnl57, Serl58, Tyrl60, Glul92, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 a Leu294 (kryštálové číslovanie), podľa obr. 19, alebo homológa molekuly, alebo molekulového komplexu, kde homológ zahrnuje väzbové miesto, ktoré má hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlok atómov aminokyselín domény I medzi 0,00 Á a 0,92 Á. Ďalej v tomto vynáleze počítač zahrnuje: strojovo čitateľné pamäťové médium na ukladanie dát vrátane uloženého dátového materiálu kódovaného so strojovo čitateľnými dátami, kde dáta zahrnujú štruktúrne koordináty aminokyselín domény I vybraných zo skupiny, ktorú tvoria zvyšky Asp 154, Serl56, Asnl57, Serl58, Tyrl60, Glul92, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 a Leu294 (kryštálové číslovanie) podľa obr. 19.
Tento vynález tiež opisuje počítač na vytvorenie trojrozmernej reprezentácie molekuly alebo molekulového komplexu vrátane väzbového miesta definovaného štruktúrnymi koordinátami aminokyselín domény I vybraných zo skupiny, ktorú tvoria zvyšky Glu 192, Gln218, Arg219, Gly220 a Gly221 (kryštálové číslovanie), podľa obr. 19, alebo homológa molekuly, alebo molekulového komplexu, kde homológ zahrnuje väzbové miesto, ktoré má hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlky od atómov aminokyselín hlavného reťazca domény medzi 0,00 Á a 0,30 Á. Ďalej v kontexte tohto vynálezu počítač zahrnuje: strojovo čitateľné pamäťové médium na ukladanie dát vrátane uloženého dátového materiálu kódovaného so strojovo čitateľnými dátami, kde dáta zahrnujú štruktúrne koordináty aminokyselín domény I vybraných zo skupiny, ktorú tvoria zvyšky Glu 192, Gln218, Arg219, Gly220 a Gly221 (kryštálové číslovanie), podľa obr. 19.
Obr. 21 demonštruje jedno takéto zverejnenie. Systém JO zahrnuje počítač J_1 vrátane centrálnej procesorovej jednotky („CPU“) 20, pracovnú pamäť 22, ktorá môže byť napr. RAM (pamäť typu „random-access“) alebo „feritová“ pamäť, pamäť 24 na hromadné ukladanie (ako napríklad jedna alebo viac jednotiek - driverov - pre disk alebo pásku, alebo CD-ROM, alebo DVD-ROM), jeden alebo viac obrazovkových („CRT“) terminálov 26, jednu alebo viac klávesníc 28, jedno alebo viac vstupných vedení 30 a jedno alebo viac výstupných vedení 40, každé z nich je prepojené zvyčajnou obojstrannou systémovou zbernicou 50.
Vstupný hardvér 36, spojený s počítačom JJ. vstupným vedením 30. sa môže realizovať celým radom spôsobov. Strojovo čitateľné dáta podľa tohto vynálezu sa môžu vkladať prostredníctvom modemu alebo modemov 32 pripojených telefónnou linkou alebo zvláštnou linkou 34 na prenos dát. Alternatívne alebo aj navyše, vstupný hardvér 36 môže zahrnovať CD-ROM alebo DVD-ROM jednotky alebo páskové alebo diskové jednotky 24. V spojení s displejovým terminálom 26 môže byť tiež klávesnica 28 použitá ako vstupné zariadenie.
Výstupný hardvér 46, spojený s počítačom JJ. výstupným vedením 40, sa môže podobne realizovať zvyčajnými zariadeniami. Napríklad výstupný hardvér 46 môže zahrnovať obrazovkový CRT terminál 26 na zobrazenie grafickej reprezentácie väzbového miesta podľa tohto vynálezu s použitím programu, ako je napríklad program QUANTA, ako bolo opísané v tomto texte. Výstupný hardvér by mohol tiež zahrnovať tlačiareň 42, takže by sa dali vytvárať vytlačené výstupy, alebo diskovú jednotku 24 na uloženie celého systémového výstupu na neskoršie použitie.
Pri prevádzke CPU 20 koordinuje použitie rôznych vstupných a výstupných zariadení 36, 46, koordinuje sprístupnenie dátového materiálu z hromadnej pamäte 24 a umožňuje vstup a výstup z pracovnej pamäte 22, a tiež určuje sled jednotlivých krokov spracovania dát.
Na spracovanie strojovo čitateľných dát podľa tohto vynálezu sa môže použiť celý rad programov. Tieto programy sú diskutované vo vzťahu k výpočtovým metódam na navrhovanie liečiv opísanom v tomto texte. Špecifické odkazy na jednotlivé komponenty hardvérového systému J0 sú zahrnuté tam, kde je to vhodné, v nasledujúcom opise média na uchovávanie dát.
Obr. 22 ukazuje prierez magnetickým pamäťovým médiom 100, ktoré môže byť kódované strojovo čitateľnými dátami, čo sa môže uskutočniť systémom, ako je napríklad systém 10 na obr. 21. Médium 100 môže byť zvyčajná pružná disketa alebo pevný disk, s vhodným substrátom 101, a vhodnou obalovou vrstvou 102, ktorá môže zvyčajne obsahovať, na jednej alebo na obidvoch stranách, magnetické domény (neviditeľné), ktorých polarita alebo orientácia sa môžu zmeniť magneticky.
Médium 100 môže tiež mať otvor (nie je ukázaný) na vsunutie hriadeľa diskovej jednotky alebo iného zariadenia na uchovávanie dát 24.
Magnetické domény vo vrstve 102 na médiu 100 sú polarizované alebo orientované tak, aby kódovali spôsobom, ktorý je zvyčajný, strojovo čitateľné dáta ako napríklad dáta opísané v tomto texte, na spracovanie systémom, ako je napríklad systém 10 na obr. 21.
SK 288124 Β6
Obr. 23 ukazuje prierez opticky-čitateľným pamäťovým médiom 110 na uchovávanie dát, ktoré tiež môžu byť kódované so strojovo čitateľnými dátami alebo súborom inštrukcií, ktoré sa môžu uskutočňovať systémom, ako je napríklad systém 10 na obr. 21.
Médium 110 môže byť obyčajný kompaktný disk alebo DVD disk typu ROM („Read Only Memory“), t. j. CD-ROM alebo DVD-ROM, alebo prepisovateľné médium, ako napríklad magneto-optický disk, ktorý je opticky čitateľný a magneto-opticky zapisovateľný. Médium 100 má vhodný substrát 111, ktorý môže byť obyčajný, a vhodný povrch 112, ktorý môže byť obyčajný, a to zvyčajne na jednej strane substrátu 111.
V prípade CD-ROM, ako je dobre známe, povrchová vrstva 112 je reflexívna a je pokrytá veľkým množstvom jamiek 113, ktoré kódujú strojovo čitateľné dáta. Usporiadanie jamiek je čítané laserovým svetlom odrazeným z povrchu vrstvy 112. Ochranná vrstva 114, ktorá je v podstate priehľadná, je nanesená na povrchu vrstvy 112.
V prípade magneto-optického disku, ako je dobre známe, vrstva 112 nemá žiadne jamky 113, ale obsahuje veľké množstvo magnetických domén, ktorých polarita alebo orientácia sa môžu zmeniť magneticky, keď sa zahrejú nad určitú teplotu, napr. laserom (nie je uvedené). Orientácia domén je čítaná meraním polarizácie laserového svetla odrážaného od vrstvy 112. Usporiadanie domén kódujúcich dáta je také, ako bolo opísané skôr.
XI. Racionálny návrh liečiv
Predkladaný vynález dovoľuje použiť postupy návrhu liečiv založené na štruktúrnych údajoch a postupy tzv. racionálneho navrhovania liečiv („Rational Drug Design“) pre návrh, selekciu, syntézu alebo izoláciu chemických entít, ako sú napríklad inhibítory αί-I domény, a tiež na zlepšenie známych inhibítorov tejto domény.
Tieto inhibítory môžu byť schopné blokovať väzbové miesto VLA-I pre kolagén. Tento vynález tiež dovoľuje použiť postupy založené na štruktúrnych údajoch a postupy tzv. racionálneho navrhovania liečiv pre návrhy variantov, ktoré môžu pôsobiť ako inhibítory väzby kolagénu.
Trojrozmerné reprezentácie, ako sú opísané v kontexte tohto vynálezu, sa môžu použiť experimentálne alebo v počítačovej forme na navrhovanie potenciálnych inhibítorov, ďalších chemických entít, variantov Fab fragmentov alebo kombinácie chemických entít, ktoré sa môžu viazať na biologickú funkciu hAQC2 Fab fragmentu alebo chimémej αί-I domény podľa vynálezu a ovplyvňovať ju.
Odborník môže použiť jednu alebo niekoľko metód skríningu chemických entít na ich schopnosť asociovať sa s komplexom hAQC2 Fab fragmentu alebo chimémej αί-I domény podľa predkladaného vynálezu a konkrétne s väzbovým miestom buď domény I, alebo Fab fragmentu. Tento postup môže začať vizuálnym vyhľadávaním, napríklad väzbového miesta buď pre doménu I, alebo Fab fragment, na počítačovej obrazovke, na základe koordinát komplexu uvedených na obr. 19.
Vybrané chemické entity sa potom umiestnia v celom rade orientácií alebo sa usadia v individuálnych väzbových miestach buď domény I, alebo Fab fragmentu. Toto usadzovanie sa môže uskutočniť s použitím softvéru ako je napríklad program QUANTA, po ktorom nasleduje minimalizácia energií a molekulárna dynamika s využitím štandardných silových polí molekulárnej mechaniky, ako sú napríklad programy CHARMM (Molecular Simulations, Inc., Burlington, MA ©1994) a AMBER (P. A. Kollman, University of Califomia at San Francisco, (©1994).
Špecializované počítačové programy môžu tiež pomôcť v postupe selekcie chemických entít. Okrem ďalších k takýmto programom patria nasledujúce:
1. GR1D (Goodford, P. J., 1985, J. Med. Cliem. 28: 849 - 857). Program GRID sa dá získať z Oxford University, Oxford, UK
2. MCSS (Miranker, AAA. and M. Karplus, 1991, Proteins. Structure, Function and Genetics 11: 29 až 34). MCSS je dostupný od Molecular Simulations, Burlington, MA.
3. AUTODOCK (Goodsell, D. S. and AAA. J. Olsen, 1990, Proteins: Structure, Function, and Genetics 8: 195 - 202). AUTODOCK je dostupný zo Scripps Research Inštitúte, La Jolla, CA.
4. DOCK (Kuntz, I. D. et al., 1982, J. Mol. Biol. 161: 269 - 288). DOCK sa dá získať z University of Califomia, San Francisco, CA.
Keď sa vhodné chemické entity vybrali, môžu sa zostaviť do jednotlivých zlúčenín. Zostavovanie môže pokračovať vizuálnou prehliadkou vzťahu entít k sebe navzájom v trojrozmernom zobrazení na počítačovej obrazovke vo vzťahu k štruktúrnym koordinátam komplexu hAQC2 Fab fragmentu a chimémej αί-I domény. Potom nasleduje ručné zostavenie modelu s použitím softvéru, ako je napríklad program „Quanta“ alebo „Sybyl“.
Opísané postupy vyhodnocovania chemických entít sa môžu uskutočňovať podobným spôsobom pre zlúčeniny alebo pre varianty, ktoré môžu viazať αί-I doménu.
K užitočným programom, ktoré odborníkovi pomôžu v spájaní individuálnych chemických entít, patria napr. nasledujúce:
1. CAVEAT (Bartlett, P. AAA. et al, „CAVEAT: A Program to Facilitate the Structure-Derived Design
SK 288124 Β6 of Biologically Active Molecules“. In „Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems“, Spadal Pub., 1989, Royal Chem. Soc., 78: 182 - 196). CAVEAT sa dá získať z University of Califomia, Berkeley, CA.
2. 3D databázové systémy ako je napríklad MACCS-3D (MDL Information Systems, San Leandro, CA). Táto oblasť je v prehľade zhodnotená v publikácii Martin, Y. C., 1992, J. Med. Chem. 35: 2145 - 2154.
3. HOOK (dostupný od firmy Molecular Simulations, Burlington, MA).
Namiesto toho, aby pokračovalo zostavovanie inhibítora alebo väzbovej zlúčeniny postupným spôsobom vždy po jednej chemickej entite, ako bolo opísané, väzbové zlúčeniny sa môžu tiež navrhnúť naraz v celku alebo „de novo“ s použitím buď prázdneho väzbového miesta (ako je napríklad väzbové miesto al-I domény alebo hAQC2 Fab fragmentu), alebo ľubovoľne zahrnujúcu nejakú časť alebo časti známej väzbovej zlúčeniny al-I domény alebo hAQC2 Fab fragmentu. K takýmto postupom patria napr. nasledujúce:
1. LUDI (Bohm, H. - J., 1992, J. Comp. Aid. Molec. Design 6: 61 - 78). LUDI je dostupný od firmy Biosym Technologies, San Diego, CA.
2. LEGEND (Nishibata, Y. and AAA. Itai, 1991, Tetrahedron 47: 8985). LEGEND je dostupný od Molecular Simulations, Burlington, MA.
3. LeapFrog (dostupný od Tripos Associates, St. Louis, MO).
V súlade s tým, čo sa uvádza v predkladanom vynáleze, sa môžu použiť aj ďalšie techniky molekulového modelovania, pozri napr. Cohen, N. C. et al., 1990, J Med. Chem. 33: 883 - 894. Pozri tiež Navia, M. A. a M.
A. Murcko, 1992, Curr. Opin. Struct. Biol. 2: 202 - 210.
Keď sa raz entita navrhne alebo vyberie už opísanými metódami, účinnosť, s ktorou sa takáto entita môže viazať k al-I doméne alebo hAQC2 Fab fragmentu, sa môže testovať a optimalizovať pomocou vyhodnocovania výpočtov. Napríklad zlúčenina, ktorá bola navrhnutá alebo vybraná, aby fungovala ako väzbová zlúčenina al-I domény, sa môže rozprestierať v objeme, ktorý sa neprekrýva s objemom, ktorý zaberá väzbové miesto, keď je viazané k chimémej al-I doméne. Účinná väzbová zlúčenina al-I domény môže mať relatívne malý rozdiel v energii medzi svojím viazaným a voľným stavom (t. j. malá deformačná energia väzby). Takže najúčinnejšia väzbová zlúčenina al-I domény by sa mala navrhnúť tak, aby deformačná energia väzby nebola väčšia ako približne 41,868 kJ/mol (10 kcal/mol), napr. nie väčšia ako 29,308 kJ/mol (7 kcal/mol). Väzbové zlúčeniny al-I domény môžu interagovať s al-I doménou vo viac ako jednej konformácii, ktoré sú podobné v celkovej energii väzby. V takýchto prípadoch je deformačná energia väzby rozdielom medzi energiou voľnej zlúčeniny a priemernou energiou konformácie, ktorá sa môže pozorovať, keď sa zlúčenina viaže na proteín.
Zlúčenina navrhnutá alebo vybraná ako väzbová zlúčenina al-I domény môže byť ďalej počítačovo optimalizovaná tak, aby v svojom viazanom stave nemala odpudivé elektrostatické interakcie s cieľovým proteínom. Takéto nekomplementáme (napr. elektrostatické) interakcie zahrnujú odpudivé interakcie typu náboj-náboj, dipól-dipól a náboj-dipól. Špecificky, suma všetkých elektrostatických interakcií medzi zlúčeninou a proteínom, keď je zlúčenina viazaná k al-I doméne, by mala byť neutrálnym alebo prospešným príspevkom k entalpii väzby.
Na výpočty deformačnej energie zlúčenín a elektrostatických interakcií je odborníkom k dispozícii špecifický počítačový softvér. Príklady programov určených na takéto použitie zahrnujú: Gaussian 92, revízia C (M. J. Frisch, Gaussian, Inc., Pittsburgh, PA, ©1992), AMBER, verzia 4.0 (P. A. Kollman, University of Califomia at San Francisco, (©1994), QUANTA/CHARMM (Molecular Simulations, Inc., Burlington, MA, ©1994) a Insight II/Discover (Biosysm Technologies Inc., San Diego, CA (©1994). Tieto programy môžu byť implementované napríklad na počítačoch (workstation) Sillicon Graphics. Ďalšie hardvérové systémy a softvérové balíky sú odborníkom tiež známe.
Jednou z ďalších techník použiteľnou na navrhovanie liečiv, ktorú umožňuje predkladaný vynález, je iteračné navrhovanie liečiv. Iteračné navrhovanie liečiv je spôsob, ako optimalizovať vzťahy medzi proteínom a zlúčeninou (vrátane zlúčeniny, ktorou je protilátka) tým, že sa určujú a vyhodnocujú trojrozmerné štruktúry postupných súborov komplexov proteín/zlúčenina. Pri iteračnom navrhovaní liečiv sú získané série proteínových kryštálov v komplexe s entitami, ktoré sa viažu na proteín, a potom sa riešia trojrozmerné štruktúry každého molekulového komplexu. Takýto prístup poskytuje možnosť nahliadnuť do spojenia medzi proteínmi a ďalšími entitami každého komplexu. To sa uskutoční tak, že sa selektujú chemické entity s inhibičnou aktivitou, získajú sa kryštály nových komplexov, vyriešia sa trojrozmerné štruktúry komplexov a porovnajú sa spojenia (asociácie) medzi novými komplexmi a skôr riešenými komplexmi. Spojenia v komplexe sa môžu optimalizovať tým, že sa pozoruje, ako zmeny v zložkách komplexu ovplyvňujú spojenie.
V niektorých prípadoch iteratívny návrh liečiv sa uskutočňuje tak, že sa vytvoria postupné komplexy a potom sa kryštalizuje každý nový komplex. Alternatívne sú preformované proteínové kryštály navlhčené v prítomnosti ďalšej chemickej entity, čím sa vytvorí komplex, a tak sa odstráni nutnosť kryštalizovať každý individuálny komplex.
SK 288124 Β6
XII. Farmaceutické kompozície
Farmaceutické kompozície, ako sú opísané v kontexte tohto vynálezu, obsahujú jeden alebo viac VLA-1 antagonistov podľa predkladaného vynálezu (napr. anti-VLA-1 protilátky a VLA-1 antagonisty typu malej molekuly, ktoré boli identifikované opísaným spôsobom racionálneho návrhu liečiv) alebo ich farmaceutický prijateľné deriváty. Kompozície môžu ďalej obsahovať farmaceutický prijateľný nosič, ako napríklad adjuvans, vehikulum, pufer a stabilizátor.
Farmaceutické kompozície, ako sú opísané v kontexte tohto vynálezu, môžu byť podávané perorálnou, topickou, intravenóznou, subkutánnou, intraperitoneálnou, intramuskulámou, intramedulámou, intraarteriálnou, intraartikulámou, intrasynoviálnou, intrastemálnou, intratekálnou, intrahepatickou, intraspinálnou alebo intrakraniálnou cestou podľa požiadaviek, alebo priamo lokálne do miesta zápalu alebo rastu nádoru. Farmaceutické kompozície, ako sú opísané v kontexte tohto vynálezu, sa môžu tiež podávať inhaláciou, napr. pomocou nebulizéra, inhalátora na suchý prášok alebo inhalátora s odmeranými dávkami, a/alebo implantáciou infúznej pumpy, alebo biologicky kompatibilného implantátu s predĺženým uvoľňovaním priamo do tela pacienta.
Farmaceutické kompozície môžu byť tiež vo forme sterilného prípravku pre injekciu, napríklad sterilné vodné alebo olejové suspenzie pre injekciu. Takéto suspenzie sa môžu formulovať postupmi, ktoré sú v odbore známe, s použitím vhodných dispergačných, zmáčacích a suspendujúcich činidiel. Ak je prípravok podávaný perorálne, potom farmaceutická kompozícia sa môže podávať vo forme tobolky, tablety, vodnej suspenzie alebo roztoku. Na topické aplikácie farmaceutické kompozície sa môžu formulovať ako vhodné masti.
Dávka a dávkovací režim VLA-1 antagonistov, ako sú opísané v kontexte tohto vynálezu, ktoré sú účinné na dosiahnutie požadovaného účinku, závisia od celého radu faktorov, ako napríklad povaha ochorenia, ktoré sa lieči, veľkosť pacienta, požadovaný cieľ liečby, použitá špecifická farmaceutická kompozícia a názor ošetrujúceho lekára.
Použiteľné sú napr. dávkové hladiny účinnej zložky medzi približne 0,001 a približne 100 mg/kg telesnej hmotnosti za deň, napríklad medzi približne 0,1 a približne 50 mg/kg telesnej hmotnosti za deň. Napríklad protilátka, ako je opísaná v kontexte tohto vynálezu, sa bude podávať v dávkach v rozsahu od približne 0,01 mg/kg telesnej hmotnosti za deň a približne 20 mg/kg telesnej hmotnosti za deň, napr. v rozsahu od približne 0,1 mg/kg telesnej hmotnosti za deň a približne 10 mg/kg telesnej hmotnosti za deň, a to v intervaloch raz denne až raz za štrnásť dní.
V inom uskutočnení je protilátka podávaná v dávke približne 0,3 až 1 mg/kg telesnej hmotnosti, pokiaľ je podávaná intraperitoneálne. V ešte ďalšom uskutočnení je protilátka podávaná v dávke približne 5 až 12,5 mg/kg telesnej hmotnosti, keď je podávaná intravenózne. V ďalšom uskutočnení je protilátková kompozícia podávaná v množstve, ktoré je dostatočne účinné na to, aby poskytlo plazmatickú hladinu protilátky aspoň 1 mg/ml.
XIII. Ochorenia a modely na zvieratách
VLA-1 antagonisty, ako sú opísané v kontexte tohto vynálezu, sú užitoční pri liečení, vrátane prevencie, αϊβΐ-sprostredkovaných ochorení, ako sú napríklad ochorenia už vymenované skôr. Liečenie s použitím prípravkov podľa tohto vynálezu je účinné tak u ľudí ako aj pri zvieratách, postihnutých uvedenými ochoreniami. Zvieratá, pri ktorých je vynález použiteľný, zahrnujú tak domáce ako aj hospodárske zvieratá, chované buď ako domáce maznáčiky, alebo na komerčné účely. Príkladom sú psy, mačky, dobytok, kone, ovce, prasce a kozy.
Účinnosť VLA-1 antagonistov, ako sú opísané v kontexte tohto vynálezu, sa môže testovať na rôznych zvieracích modeloch. Napríklad k užitočným modelom psoriázy a artritídy patria modely opísané v WOOO/72881. K modelom fibrózy obličiek patria modely opísané vo WO 99/61040, model Alportovho syndrómu obličiek je opísaný v Cosgrove et al., 2000, Am. J. Path. 157: 1649 - 1659 a model lupus nephritis na SNF1 myšiach je opísaný v Kalled et al., 2001, Lupus 10: 9 - 22. Model vaskulámej fibrózy pre restenózu zahrnuje model poškodenia karotídy balónikom pri laboratórnom potkanovi opísaný v Smith et al., 1999, Circ. Res. 84: 1212 - 1222. Model fibrózy pľúc modelujúci idiopatickú pľúcnu fibrózu a pľúcnu fibrózu asociovanú so sklerodermou zahrnuje model bleomycínom indukovanej pľúcnej fibrózy opísaný vo Wang et al., 1999, Thorax 54: 805 - 812. Modely cirhózy pečene pre hepatitídu C alebo pre alkoholom indukovanú cirhózu zahrnuje model s ligáciou žlčovodu opísaný v George et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 12719 - 12724 a model CCLA-indukovanej fibrózy pečene opísaný v Shi et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 10663 - 10668.
Účinnosť liečenia, ako je opísané v kontexte tohto vynálezu, sa môže hodnotiť radom dostupných diagnostických prostriedkov, vrátane fyzikálneho vyšetrenia, krvných testov, merania proteínurie, hladiny kreatinínu a clearance kreatinínu, fúnkčného pľúcneho testu, rôntgenu hrudníka, bronchoskopie, bronchoalveolámej laváže, biopsie pľúc, hladín dusíka v plazme, krvi a moči (BUN), pozorovanie a skórovanie jazvenia alebo fibrotických lézií, depozitu extracelulámeho matrixu, napríklad kolagénu, aktínu hladkého svalstva a fibronektínu, funkčných testov obličiek, a vyšetrenia pomocou ultrazvuku, zobrazovania pomocou magnetic18
SK 288124 Β6 kej rezonancie (MRI) a vyšetrenia počítačovou tomografiou (CT).
XIV. Diagnostické postupy
Protilátky, ako sú opísané v kontexte tohto vynálezu, sa môžu použiť na diagnostické stanovenie ochorení spojených so zmenami expresnej hladiny αϊβΐ. Tkanivová vzorka pacienta, ako napríklad tkanivová biopsia, vzorka telesnej tekutiny alebo laváž (napr. alveolárna laváž), sa môže testovať v teste založenom na zachytení antigénu, ELISA teste, imunohistochemickom teste a pod., s použitím protilátky. Tkanivová vzorka z normálneho zdravého jedinca sa použije ako kontrola.
Pri uskutočnení predkladaného vynálezu sa využijú, pokiaľ nie je špecificky uvedené inak, zvyčajné techniky bunkovej biológie, tkanivových kultúr, molekulárnej biológie, mikrobiológie, rekombinantnej DNA, proteínovej chémie a imunológie, ktoré sú odborníkom známe a patria k ich rutinným schopnostiam. Takéto techniky sú opísané v odbornej literatúre, napríklad Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (Sambrook et al., Eds.), 1989, Oligonucleotide Synthesis, (M. J. Gait, Ed.), 1984, U. S. Patent 4 683 195, Mullis et al., Nucleic Acid Hybridization, (B. D. Hames and S. J. Higgins), 1984, Transcription and Translation, (B. D. Hames and S. J. Higgins), 1984, Culture of Animal Cells (R. I. Freshney, Ed.), 1987, Immobilized cells and Enzymes, IRL Press, 1986, A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984, Methods in Enzymology, Volumes 154 and 155 (Wu et al., Eds.), Academic Press, New York, Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos, Eds.), 1987, Immunochemical Methods in Celí and Molecular Biology (Mayer and Walker, Eds.), 1987, Handbook of Experiment Immunology, Volumes I-1V (D. M. Weir and C. C. Blackwell, Eds.), 1986, Manipulating the Mouse Embryo, 1986.
Ak nie je uvedené inak, všetky technické a vedecké termíny použité v tomto texte majú rovnaký význam, ako mu zvyčajne rozumie odborník v príslušnom odbore techniky, do ktorého patrí tento vynález. Príklady metód a materiálov sú opísané neskôr, aj keď v praxi alebo testoch podľa predkladaného vynálezu sa môžu tiež použiť metódy a materiály podobné alebo ekvivalentné s tými, ktoré sú opísané v tomto texte. V prípade konfliktu je rozhodujúci predkladaný opis, vrátane uvedených definícií. Materiály a metódy, a tiež uvedené príklady, sú iba ilustratívne a nijako predkladaný vynález neobmedzujú.
V tomto opise a nárokoch termín „obsahovať“ alebo jeho tvary („obsahuje“ alebo „obsahujúce“) je treba rozumieť tak, že znamená zahrnutie daného celého čísla alebo skupiny celých čísel, ale pritom nevylučuje akékoľvek ďalšie celé čísla alebo skupiny celých čísel.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1. Integríny αϊβΐ a α2β1 viažuce kolagén na aktivovaných leukocytoch. (A). Analýza expresie al a α2β1 integrínov na IL-2 aktivovaných splenocytoch (dl 1) s použitím prietokovej cytometrie. Bunky sa označili buď anti-αΐ mAb (monoklonálnou protilátkou), anti-a2 mAb alebo neviažucou sa kontrolnou mAb (sivá čiara) a potom FITC-anti-škrečací imunoglobulín. (B) Účinok anti-α a anti-a2 mAb na adhéziu leukocytov ku kolagénu. Na 105 IL-2 aktivovaných splenocytov sa nechalo pôsobiť uvedených mAb 15 minút pred vysiatím na doštičky s jamkami potiahnutými kolagénom buď typu IV, alebo typu I na 1 hodinu pri 37 °C. Adhézia sa vyrátala, ako je uvedené v príklade 1 a vyjadrila ako % adhézie vzhľadom na kontrolné bunky opracované mAb. Testy adhézie sa uskutočnili v troch opakovaniach a uskutočnili na najmenej tri nezávislé experimenty. Uvedený je jeden reprezentatívny experiment.
Obrázok 2. Účinok anti-integrínových mAb na efektorovú fázu hypersenzitivity oneskoreného typu. SRBC-senzitizované myši sa injikovali i. p. uvedenými mAb, a to 1 hodinu pred SRBC výzvou („challenge“). Hrúbka vankúšikov labky (ďalej skrátene iba labky) sa merala 20 hodín po expozícii antigénu a výsledky sú uvedené ako % zvýšenie hrúbky ± stredná chyba priemeru (SEM), ako je uvedené v príklade 2. Dáta predstavujú súhrn z ôsmich experimentov s n = 79 (PBS), 68 (kontrolný Ig škrečka), 68 (anti-al), 29 (anti-a2), 18 (anti-al +anti-a2), 45 (anti-a4), 18 (anti-a5), 20 (anti-a6) a 10 (anti-βΐ). Použili sa mAb Ha4/8 (kontrolné škrečky Ig skupiny 2), Ha31/8 (anti-al), Hal/29 (anti-a2), PS/2 (anti-a4), 5H10-27 (anti-a5), GoH3 (anti-a6) a HMPL-1 (anti-βΐ).
Obrázok 3. Účinok anti-integrínových mAb na efektorovú fázu kontaktnej hypersenzitivity. FITC-senzitizované myši boli injikované i. p. uvedenými mAb, a to 4 hodiny pred FITC výzvou. Hrúbka ušnice sa zmerala na začiatku (východisková hodnota) a po 24 hodinách, a výsledky boli uvedené ako % zvýšenie hrúbky ucha ± stredná chyba priemeru (SEM), ako je ilustrované v príklade 3. Tieto dáta predstavujú zhrnutie deviatich experimentov s n = 74 (PBS), 60 (kontrolná Ig škrečka), 26 (anti-ICAM-1), 44 (anti-al), 44 (anti-a2), 38 (anti-al + anti-a2), 36 (anti-a4), 16 (anti-a5), 26 (anti-a4 + anti-a5), 24 (anti-a6) a 22 (anti-βΐ). Použili sa škrečacia mAb: Ha4/8 (kontrolný škrečací Ig skupiny 2), Ha31/8 (anti-al), Hal/ (anti-a2), HMSS1-1 (anti-βΐ), 3E2 (anti-ICAM-1), a použili sa mAb laboratórneho potkana: R35-95 a R35-38 (kontrolná IgG2a laboratórneho potkana, a IgG2b laboratórneho potkana, v danom poradí), PS/2 (anti-a4), 5H10-27 (anti-a5), GoH3 (anti-a6).
SK 288124 Β6
Obrázok 4. Reakcia kontaktnej hypersenzitivity pri al-defícientnej myši v porovnaní s myšou divého typu. FITC-senzitizované myši boli injikované i. p. uvedenými mAb, a to 4 hodiny pred FITC výzvou. Hrúbka ušnice sa zmerala na počiatku (východisková hodnota) a po 24 hodinách, a výsledky boli uvedené ako % zvýšenie hrúbky ucha ± stredná chyba priemeru (SEM), ako je ilustrované v príklade 4. Skupiny štyroch až piatich myší sa použili pre jednotlivé typy ošetrenia a všetky experimenty sa uskutočnili najmenej trikrát. Jeden reprezentatívny experiment je ukázaný.
Obrázok 5. Účinok anti-αΐ a anti-a2 mAb na nešpecifický zápal indukovaný krotonovým olejom. Myši boli injikované i. p. uvedenými mAb 4 h pred potrením uší krotonovým olejom. Hrúbka ucha sa zmerala na počiatku (bazálna hodnota) a o 24 hodín neskôr, a výsledky boli ukázané ako % zvýšenie hrúbky ± stredná chyba priemeru, ako je znázornené v príklade 5. Skupiny štyroch až piatich myší sa použili pre jednotlivé typy ošetrenia a všetky experimenty boli uskutočnené najmenej trikrát. Jeden reprezentatívny experiment je ukázaný.
Obrázok 6. Účinok anti-αΐ a a2 mAb na artritídu indukovanú mAb proti kolagénu. Myši boli injikované i. p. anti-kolagén mAb v deň 0, potom nasledované LPS v deň 3. Myši boli injikované i. p. uvedenými mAb každý 3. deň začínajúc dňom 0. Klinická artritída bola zjavná 2 - 3 dni po LPS injekcii a trvala niekoľko týždňov. Každá končatina sa ohodnotila podľa škály 0 až 4 každý 3. deň, ako je znázornené v príklade 6, a výsledky boli vyjadrené ako priemerné artritické skóre medzi dňom 9 a dňom 15 (±SEM) z údajov pre všetky štyri končatiny. Dáta predstavujú zhrnutie zo štyroch experimentov, keď sa každý experiment uskutočnil na skupine troch až štyroch myší.
Obrázok 7. Účinok anti-αΐ a a2 mAb na artritídu indukovanú mAb proti kolagénu.
A. Preventívna liečba myšacou buď anti-αΐ, alebo anti-a2 mAb znížila artritické skóre. Na myši sa nechal pôsobiť anti-kolagén mAb v deň 0, potom nasledoval LPS v deň 3. Artritída bola v deň 6 a pokračovala niekoľko týždňov. Na myši sa nechali pôsobiť uvedené mAb každý 3. deň začínajúc dňom 0. Každá končatina sa ohodnotila podľa škály 0 až 4 každý 3. deň, ako je znázornené v príklade 6, a výsledky sa vyjadrili ako priemerné artritické skóre medzi dňom 9 a dňom 15 (±SEM) pre všetky štyri končatiny (maximálne skóre 16). Skupina štyroch myší sa použila pre každý druh experimentálneho ošetrenia, uvedené dáta sú priemerom z 12 experimentov.
B. al deficitné myši mali redukované artritické skóre porovnateľné so skupinou myší divého typu ošetrených anti-αΐ mAb. Pre každý experiment sa použili skupiny štyroch myší, uvedená je priemerná hodnota z dvoch experimentov.
Obrázok 8. Rozvoj artritídy je oneskorený za absencie lymfocytov a inhibícia artritídy anti-αΐ mAb nastáva za absencie lymfocytov. Myši divého typu B6,129 alebo RAG-1 deficientné myši B6,129 boli podrobené pôsobeniu anti-kolagén mAb v deň 0, nasledoval LPS v deň 3. Artritída bola zjavná v deň 6 a trvala niekoľko týždňov. Myši sa podrobili pôsobeniu uvedených mAb každý 3. deň začínajúc dňom 0. Každá končatina sa hodnotila a vyhodnotila na skóre 0 až 4 každý 3. deň. Výsledky boli vyjadrené ako priemerné artritické skóre pre končatinu (maximálne skóre 4). Pre každé ošetrenie sa použili skupiny 4 myší.
Obrázok 9. Reakcia na dávku pri anti-αΐ mAb inhibícii artritídy. Myši divého typu Balb/c sa podrobili pôsobeniu anti-kolagén mAb v deň 0, nasledoval LPS v deň 3. Artritída bola zjavná v deň 6 a trvala niekoľko týždňov. Myši sa podrobili pôsobeniu i. p. uvedených dávok buď Ha4/8 (izotypová kontrola), alebo Ha31/8 (anti-αΐ) mAb každý 3. deň začínajúc dňom 0. Každá končatina sa hodnotila a bola ohodnotená v rozsahu škály 0 až 4 každý 3. deň. Výsledky boli vyjadrené ako priemerné artritické skóre na končatinu (maximálne skóre 4). Pre každé ošetrenie sa použili skupiny 4 myší.
Obrázok 10. Terapeutické ošetrenie s anti-αΐ mAb môže znížiť artritické skóre. Myši Balb/c divého typu sa podrobili pôsobeniu anti-kolagén mAb v deň 0, nasledoval LPS v deň 3. Artritída bola zjavná v deň 6 a trvala niekoľko týždňov. Myši sa podrobili pôsobeniu i. p. mAb (250 pg) alebo lg fúzneho proteínu (200 pg) každý 3. deň začínajúc dňom 4. Myši dostali buď mAb (Ha4/8 izotypová kontrola alebo Ha31/8 anti-αΐ), lg fúzny proteín (lg izotypová kontrola alebo TNF-R55-Ig), alebo kombináciu obidvoch (250 pg Ha31/8 a 200 pg TNF-R55-Ig). Každá končatina bola hodnotená a bola skórovaná v rozsahu škály 0 až 4 každý 3. deň. Výsledky boli vyjadrené ako priemerné artritické skóre na končatinu (maximálne skóre 4). Na každé ošetrenie sa použili skupiny 4 myší.
Obrázok 11. Lokalizácia epitopu pre anti-αΐ mAb blokujúcu doménu I.
A. Aminokyselinová sekvencia al-I domény laboratórneho potkana (hore, SEQ ID NO: 63) a človeka (dole, zvyšky 91-96 zo SEQ ID NO: 64). Zvyšky zahrnujúce motív MIDAS (adhézne miesto závislé od kovového iónu) sú uvedené tučné. Ľudské aminokyseliny, ktoré nahradili zodpovedajúce zvyšky laboratórneho potkana (RAH), sú ukázané pod sekvenciou laboratórneho potkana v rámčeku. Pre jasnosť, číslovanie zvyškov v textu sa vzťahuje práve na tento obrázok, ak nie je uvedené iné číslovanie, napr. kryštálové číslovanie.
B. Zvyšujúca sa koncentrácia mAb AJH10 (ATCC č. PTA-3580, uložená podľa Budapeštianskej zmluvy v zbierke ATCC, Manassas, VA, USA, 2. augusta 2001) bola naviazaná na doštičky potiahnuté 30pg/ml ľudskou (krúžky), potkaňou (trojuholníky) alebo RAH (štvorčeky) al-I doménou. Uvedené dáta reprezentujú tri experimenty.
SK 288124 Β6
Obrázok 12. Aminokyselinová sekvencia ľudskej al-I domény (SEQ ID NO: 64).
Obrázok 13. Identifikácia blokujúcej mAb al-I domény
A. Zvyšujúca sa koncentrácia mAb AEF3 (trojuholníky) alebo AJH10 (kruhy) boli naviazané na doštičky potiahnuté 30 pg/ml al-I domény.
B. al-I doména sa podrobila pôsobeniu zvyšujúcej sa koncentrácie mAb AJH10 (kosoštvorce) alebo mAb BGC5 (štvorce) a naviazaná na doštičky potiahnuté kolagénom IV (2 pg/ml).
C. K562-al bunky sa podrobili pôsobeniu zvyšujúcej sa koncentrácie mAb AEF3 (trojuholníky) alebo AJH10 (kruhy) a naviazali sa na doštičky potiahnuté kolagénom IV 5 pg/ml). 45 - 50 % buniek pridaných ku každej jamke adherovalo ku kolagénu IV. Uvedené dáta reprezentujú tri nezávislé experimenty.
Obrázok 14. Druhovo skrížená reaktivita blokujúcich mAb analyzovaná FACS (fluorescenciou aktivované triedenie buniek). Králičie bunky hladkého svalstva ciev sa inkubovali buď s mAb AJH10 (dole) časťou, alebo myšacou IgG kontrolou (hore) a analyzovali s FACS (fluorescenciou aktivované triedenie buniek).
Obrázok 15. al-1 doména viaže kolagén.
A. Zvyšujúca sa koncentrácia ľudskej al-I domény bola naviazaná na doštičky predtým potiahnuté 1 pg/ml kolagénu I (štvorčeky) alebo kolagénu IV (krúžky). Uvedené hodnoty sa korigovali na pozadí väzby k BSA.
B. 2 pg/ml ľudskej al-I domény sa zmiešalo so zvyšujúcou sa koncentráciou protilátky 5E8D9 proti ľudskému α 1-integrínu (štvorčeky) alebo protilátky A2IIE10 proti ľudskému a2-integrínu (krúžky) a potom sa naviazalo na doštičky predtým potiahnuté s 1 pg/ml kolagénu IV.
C. Doštičky sa potiahli s 1 pg/ml kolagénu IV alebo 3 % BSA. al-I doména (2 pg/ml) sa nasledovne naviazala na doštičky potiahnuté v prítomnosti 1 mM Mn2+, 1 mM Mg2+ alebo 5 mM EDTA. Uvedené dáta reprezentujú tri nezávislé experimenty.
Obrázok 16. Charakterizácia humanizovaných foriem AQC2. Hodnotili sa mAQC2 (trojuholníky), chAQC2 (kruhy), hAQC2 (obrátené trojuholníky) a hAQC2' (štvorce).
A. Inhibícia VLA-1 väzby ku kolagénu typu IV.
B. Inhibícia väzby al-I domény ku kolagénu typu IV.
C. Väzba k imobilizovanej doméne al-I.
D. Kompetícia s biotinylovanou mAQC2 o väzbu k imobilizovanej doméne al-I.
Obrázok 17. Charakterizácia humanizovaných foriem AQC2 pomocou FACS. Znenie nadpisu z obrázka: Humanizované protilátka AQ.C2 testované DACS na bunkách J562al.
Obrázok 18. Charakterizácia humanizovaných foriem AQC2 pomocou FACS. Znenie nadpisu z obrázka: ANC 11/3100; FACS purifikované AQ.C2 mAb s bunkami K562al.
Obrázok 19. Koordináty atómovej štruktúry komplexu „al-I doména/Fab“, ako boli určené rôntgenovou kryštalografíou kryštálov komplexu vo formáte proteínovej databanky (PDB). Koordináty dvoch komplexov v asymetrickej jednotke sú uvedené nasledovne:
Komplex 1: molekula A = I doména integrínu molekula H = ťažký reťazec hAQC2 Fab molekula L = ľahký reťazec hAQC2 Fab molekula M = Mn+2
Komplex 2: molekula B= I doména integrínu molekula X = ťažký reťazec hAQC2 Fab molekula Y = ľahký reťazec hAQC2 Fab molekula M = Mn+2
Obrázok 20. Komplex „I doména/Fab“.
A. Pásový diagram komplexu doména I/Fab. Doména I a ťažký a ľahký reťazec protilátky sú označené.
Mn+2 = ión je označený ako guľa.
B. Zväčšenie miesta MIDAS (adhézne miesto závislé od kovového iónu) ukazujúce koordináciu kovového iónu (guľa) zvyškom AsplOl (kryštálové číslovanie). Proteínové hlavné reťazce sú uvedené ako stuhy a bočné reťazce sú znázornené formou guľôčok a tyčiniek. Valce predstavujú interakcie medzi kovovým iónom a atómami proteinu. Tenké čiary predstavujú H-väzby. Obr. 20 sa vytvoril pomocou softvéru RIBBONS (Carson, 1991, J. Appl. Cryst. 24: 958 - 961).
Obrázok 21. Diagram systému použitého na realizáciu inštrukcie kódované pamäťovým médiom na obr. 22 a 23.
Obrázok 22. Prierez magnetickým pamäťovým médiom.
Obrázok 23. Prierez opticky čitateľným pamäťovým médiom.
Nasledujúce príklady, ktoré sú poskytnuté s cieľom podrobnejšie objasniť predkladaný vynález, nijako neobmedzujú rozsah vynálezu.
SK 288124 Β6
Príklady uskutočnenia vynálezu
Chemické činidlá
Izotiokyanát fluoresceín (FITC) sa kúpil od firmy Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Krotónový olej sa kúpil od ICN Biochemicals (Aurora, OH). Plná ovčia krv v Alseverovom roztoku bola získaná od East Acres Biologicals (Southbridge, MA). Kolagén typu I z chvosta laboratórneho potkana a myšací kolagén typu IV boli kúpené od Collaborative Research Inc. (Bedford, MA) a Gibco (Gaithersburg, MD), v danom poradí.
Samice myší Balb/c vo veku 6 až 8 týždňov boli kúpené od firmy Taconic (Germantown, NY) a myši αΐβΐ-deficientné s Balb/c základom boli získané, ako bolo opísané skôr (3).
Príklad 1
Monoklonálne protilátky
Funkciu-blokujúce monoklonálne protilátky (mAb) proti myšacím antigénom boli pripravené vo forme bez azidu a s nízkym obsahom endotoxínu: Ha31/8 (škrečia anti-CD49a, integrín al) (Mendrick et al. 1995. Lab. Invest. 72: 367 - 375), Hal/29 (škrečia anti-CD49b, integrín α2) (βΐ) (Mendrick et al. 1995. Lab. Invest. 72: 367 - 375, Mendrick, D. L. and D. M. Kelly 1993 Lab. Invest. 69: 690 - 702), škrečia kontrolná mAb Ha4/8 skupiny II (škrečia anti-KLH) (Mendrick, D. L. and D. M. Kelly 1993 Lab. Invest. 69: 690 - 702) a PS/2 (potkaní anti-CD49d, reťazec integrín a4(31) (Miyake et al. 1991 J Exp. Med. 173: 599 - 607). Okrem toho, nasledujúce funkciu-blokujúce monoklonálne protilátky proti myšacím antigénom boli kúpené ako preparáty bez azidu/s nízkym obsahom endotoxínu od firmy Pharmingen (San Diego, CA): ΗΜβΙ-1 (škrečia anti-CD29, reťazec integrín β 1) (Noto et al. 1995 Int. Immunol. 7: 835 - 842), Ha2/5 (škrečí anti-CD29, reťazec integrín βΐ) (Mendrick, D. L. and D. M. Kelly 1993 Lab. Invest. 69: 690 - 702), 3E2 (škrečí anti-CD54, ICAM-1) (Scheynius et al. 1993 J. Immunol. 150: 655 - 663), 5H10-27 (potkania anti-CD49e, integrín a5) (Kinashi, T., and T. A. Springer. 1994. Blood Cells. 20: 25 - 44), GoH3 (potkania anti-CD49f, integrín a6) (Sonnenberg et al. 1987J, Biol. Chem. 262: 10376 - 10383) a potkania izotypová kontrolná monoklonálna protilátka R35-95 (potkania IgG2a) a R35-38 (potkania IgG2b).
Testy adhézie
Splenocyty z Balb/c myší sa kultivovali 7 až 12 dní s 20 ng/ml IL-2. Adhézia buniek ku kolagénu typu I a typu IV bola taká, ako už bolo skôr opísané (Gotwals et al. 1996J. Clin. Invest. 97: 2469 - 2477). Stručne, 96 jamkové doštičky Maxisorp (Nunc, Napierville, IL) boli potiahnuté buď 10 pg/ml kolagénu typu IV, alebo 5 pg/ml kolagénu typu I a nešpecifické miesta sa blokovali s 1 % BSA. IL-2 aktivované splenocyty sa označili s 2 pM BCECF [pentaacetoxymetylester 2',7'-bis(karboxyetyl)-5(6)karboxylfluoresceínu] (Molecular Probes, Eugene, OR) a inkubovali 15 minút s 10 pg/ml uvedenej protilátky. 105 buniek v 0,25 % BSA v RPMI sa potom pridalo k potiahnutým jamkám a inkubovalo 60 minút pri 37 °C. Nenaviazané bunky sa odstránili premytím trikrát s 0,25 % BSA v RPMI. Adhézia sa kvantifikovala s použitím Čítacieho zariadenia Cytofluor 2350 pre fluorescenciu na doštičkách (Millipore, Bedford, MA).
Zmeral sa pomer naviazaných buniek k celkovému počtu vstupujúcich buniek a vyrátalo sa percento adhézie vzhľadom na bunky ošetrené kontrolnou protilátkou (normalizované k 100 %). Odrátali sa hodnoty pozadia spôsobené bunkovou adhéziou na jamky potiahnuté samotným BSA.
Expresná a funkčná blokáda αϊβΐ a α1β2 aktivovaných leukocytov
Vzhľadom na kľúčovú úlohu leukocytov pri zápale, pôvodcovia sa rozhodli testovať, či anti-αΐ a anti-a2 monoklonálne protilátky boli schopné blokovať adhéziu leukocytov ku kolagénu. Aby sa získali leukocyty exprimujúce vysoké hladiny tak al ako aj a2, myšacie T lymfocyty sa stimulovali 7 až 12 dní in vitro s IL-2. Tieto bunky exprimovali vysoké hladiny tak al ako aj a2 (obr. IA) a viazali sa dobre k obidvom povrchom potiahnutým kolagénom typu IV a typu I (obr. IB). Adhézia ku kolagénu typu IV bola čiastočne inhibovaná samotnou anti-αΐ mAb a inhibovaná nebola samotnou anti-a2 mAb. Na rozdiel od toho adhézia ku kolagénu typu I bola kompletne inhibovaná anti-a2 mAb a anti-αΐ mAb samotná prejavovala iba parciálnu inhibíciu. Tak anti-βΐ mAb ako aj kombinácia anti-αΐ a anti-a2 mAb úplne inhibovali adhéziu ku kolagénu typu 1 a IV. Potom, čo sa ukázalo, že integríny al β 1 a α1β21 sú exprimované na aktivovaných T lymfocytoch a že anti-al a a2 monoklonálne protilátky sú schopné funkčne blokovať adhéziu leukocytov ku kolagénu, tieto monoklonálne protilátky sa použili na in vivo skúmanie úlohy uvedených integrálov na zvieracích modeloch zápalových ochorení.
Príklad 2
Inhibícia DTH reakcie anti-integrínovými monoklonálnymi protilátkami
SRBC-indukovaná hypersenzitívna reakcia oneskoreného typu (DTH) sa adaptovala z už skôr publikovaného protokolu (Hurtrel et al., 1992, Celí. Immunol. 142: 252 - 263). Krátko, myši sa imunizovali na chrbte s. c. injekciou dávkou 2 x 107 SRBC v 100 pl PBS v deň 0. Myši sa druhýkrát s. c. injikovali (uskutočnila sa tzv. antigénna výzva, „challenge“) v deň 5 dávkou 1 x 108 SRBC v 25 μΐ PBS do pravej labky. Hrúbka labky sa merala inžinierskym posuvným meradlom (kaliperom) firmy Mitutoyo/MTI, Paramus, NJ, 20 hodín po expozícii antigénu a vyrátala sa miera opuchu labky. Výsledky sú uvedené ako priemerná hodnota percentuálneho nárastu hrúbky labky ± stredná chyba priemeru (SEM) a vyrátali sa ako % zvýšenie = [1 - (hrúbka pravej labky 20 hodín po expozícii antigénu/hrúbka neinjikovanej ľavej labky 20 hodín po expozícii antigénu)] x 100. Na zablokovanie efektorovej fázy SRBC-indukovanej DTH reakcie sa terapeutické alebo kontrolné mAb (100 pg), ktoré boli pripravené postupmi opísanými v príklade 1, podávali i. p. 1 hodinu pred antigénnou výzvou v deň 5.
SRBC-indukovaná DTH je dobre charakterizovaný in vivo model zápalu, konkrétne psoriázy, ktorý sa použil na demonštráciu významu celého radu cytokínov a adhéznych molekúl pri zápale (Tedder et al., 1995, J. Exp. Med. 181: 2259 - 2264, Terashita at al., 1996, J. Immunol. 156: 4638 - 4643). SRBC-senzibilizované myši dostali anti-integrínovú mAb 1 hodinu pred antigénnou výzvou uskutočnenou na chodidle a zápal sa vyhodnotil po 20 hodinách ako miera zväčšenia hrúbky labky. Kontrolné myši ošetrené PBS a kontrolné myši ošetrené škrečou Ig ukázali 60 až 70 % zvýšenie hrúbky labky 20 hodín po antigénnej výzve (obr. 2). V porovnaní s kontrolou ošetrenou škrečím Ig, anti-αΐ alebo anti-a2 mAb spôsobili 68 % a 60 % inhibíciu v hrúbke labky, v danom poradí. Kombinácia z anti-αΐ a anti-a2 mAb spôsobila 71 % inhibíciu, čo ukázalo na veľmi malý aditívny účinok proti samotným anti-αΐ alebo anti-a2 mAb. Ošetrenie ďalšou anti-integrínovou mAb bolo tiež účinné pri inhibícii efektorovej reakcie DTH. Miera inhibície pozorovaná pre rôzne mAb bola 49 % (anti-a4), 23 % (anti-a5) a 57 % (anti-a6). A nakoniec mAb blokáda všeobecnej integrínovej podjednotky βΐ (mAb HMBI-1) spôsobila inhibíciu efektorovej DTH reakcie o 67 %.
Príklad 3
Inhibícia CHS efektorovej reakcie anti-integrínovými monoklonálnymi protilátkami
Kontaktná hypersenzitivita (CHS) na FITC sa testovala, ako bolo opísané skôr (Gašpari et al., 1991, Current Protocols in Immunology. J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, and W. Strober, editors. John Wiley & Sons, New York. Sekcia 4. 2: 1). Krátko, myši boli senzibilizované nanesením 100 μΐ 0,5 % FITC v zmesi 1 : 1 acetón/dibutylftalát na oholený chrbát v deň 0, po 10 dňoch sa uskutočnila antigénna výzva („challenge“) nanesením 5 μΐ 0,5 % FITC na obidve strany každého ucha. Reakcia opuchu ucha sa hodnotila hrúbkou ucha meranou inžinierskym posuvným meradlom (Mitutoyo/MTI, Paramus, NJ) v čase antigénnej výzvy (deň 10) a o 24 hodín neskôr a výsledky boli uvedené ako priemerné percentuálne zvýšenie bazálnej hodnoty hrúbky ušnice ± SEM (stredná chyba priemeru).
Zvýšenie hrúbky ucha sa vyrátalo ako % zvýšenie = [1 - (hrúbka ucha 24 h po antigénnej výzve/hrúbka ucha v okamihu antigénnej výzvy)] x 100. Na zablokovanie efektorovej fázy CHS reakcie, terapeutické alebo kontrolné mAb (250 pg) sa podávali i. p. 4 hodiny pred antigénnou výzvou v deň 10. Myši, ktoré boli antigénne-senzibilizované iba vehikulom a tiež do ucha sa injikovalo samotné vehikulum (vehikulová kontrola) alebo myši, pri ktorých sa uskutočnila antigénna výzva ucha bez predchádzajúcej senzibilizácie (kontrola iritujúcim činidlom), slúžili ako negatívne kontroly (nikdy neprekročili 2 % zvýšenie hrúbky ucha).
Vzhľadom na to, že CHS je podľa mechanizmu zreteľne odlišný od DTH a podieľajú sa na ňom tiež odlišné efektorové bunky, pôvodcovia skúmali, aké účinky majú anti-integrínové mAb na efektorovú fázu CHS reakcie. Myši boli hapténovo senzibilizované s použitím FITC naneseným na vyholený chrbát, potom nasledovala o 10 dní neskôr FITC výzva aplikáciou na uši, ktorá spôsobila zápalovú reakciu nasledujúci deň. FITC-senzibilizované myši mali 60 - 70 % zvýšenie hrúbky (ucha) 24 hodín po antigénnej výzve (obr. 3). V súlade s publikovanými výsledkami (Scheynius et al., J. Immunol. 150: 655 - 663) liečenie podávaním antiICAM-1 mAb spôsobilo 51 % inhibíciu opuchu ucha. V porovnaní s kontrolnou škrečou mAb, liečba myší podávaním anti-αΐ alebo anti-a2 mAb 4 hodiny pred antigénnou výzvou spôsobila 37 % a 57 % inhibíciu opuchu ucha, v danom poradí (obr. 3). Kombinácia anti-αΐ a anti-a2 mAb spôsobila mierne vyššiu inhibíciu opuchu ucha (65 %).
Liečenie ďalšou mAb proti βΐ integrínu odhalilo, že zatiaľ čo mAb anti-a4 a anti-a5 nespôsobili žiadnu inhibíciu FITC-indukovanej CHS efektorovej reakcie v porovnaní s kontrolnou mAb laboratórneho potkana, liečenie anti-a6 mAb spôsobilo 86 % inhibíciu efektorovej reakcie. A nakoniec mAb blokáda spoločnej βΐ integrínovej podjednotky inhibovala CHS efektorovú reakciu o 74 %. Podobné CHS výsledky sa získali s použitím rôznych kmeňov myší (C57/BL6,129/Sv) a rôznych senzibilizujúcich činidiel (oxazolon) (dáta nie sú ukázané). Podobne ako výsledky pozorované pri SRBC-indukovanom modeli DTH, histologické analýzy uší so zápalom odhalili, že tak vytváranie edému ako aj infiltrácia leukocytov boli inhibované podávaním anti-αΐ a anti-a2 mAb.
V súlade so zisteniami, že αϊβΐ a α2β1 sa môžu exprimovať na IL-2-aktivovaných splenocytoch, analýza lymfatických uzlín s antigénom senzibilizovaných myší (FITC alebo oxazolon) ukázala, že αϊβΐ a α2β1 sú exprimované výhradne na CD44*“ LFA-l1“ aktivovaných CD4+ a CD8+ T lymfocytoch (dáta nie sú uvedené). Liečenie myší podávaním anti-αΐ a anti-a2 mAb nespôsobilo odstránenie týchto buniek, keď množstvo aktivovaných T lymfocytov tak v slezine ako aj lymfatických uzlinách zostalo neovplyvnené v reakcii na senzi23 bilizáciu antigénom v CHS modeli. Okrem toho, efektorové bunky sa funkčne neodstránili, keď dlhodobé liečenie antigénom senzibilizovaných myší anti-αΐ a anti-a2 mAb (deň 10 až 16) neovplyvnilo zápalové reakcie myší, pri ktorých sa aplikovala antigénna výzva v deň 20 (dáta nie sú uvedené).
Príklad 4
CHS efektorové reakcie sú znížené pri αΐβΐ-deficientných myšiach
Aby sa vylúčila možnosť, že inhibičná úloha αϊβΐ v efektorovej reakcii FITC-sprostredkovanej CHS sa sprostredkovala monoklonálnou protilátkou, experimenty sa uskutočňovali pri myšiach divého typu a myšiach deficientných na αϊβΐ (obr. 4). Inhibícia mAb efektorovej fázy pri myšiach divého typu bola zhodná s predchádzajúcimi výsledkami, keď 56 % inhibícia v hrúbke ucha sa pozorovala s anti-al, 56 % s anti-a2 a 62 % s kombináciou anti-al a anti-a2. Efektorová fáza CHS bola významne redukovaná pri neošetrených αϊβΐ-deficientných myšiach v porovnaní s neošetrenými myšami divého typu (30 % vs. 71 % zvýšenie v hrúbke ucha, v danom poradí). Ako sa dalo očakávať, miera opuchu ucha pri neošetrených αϊβΐ-deficientných myšiach bola ekvivalentná s mierou opuchu ucha pozorovanou pri myšiach divého typu podrobených pôsobeniu anti-al mAb. A nakoniec, mAb blokáda α2β1 a αΐβΐ-deficientných myší spôsobila iba mierne zvýšenú inhibíciu opuchu ucha, čo bolo v súlade s pozorovaním pri myšiach divého typu podrobených pôsobeniu kombinácie anti-al a anti-a2 mAb.
Príklad 5
Aby sa ďalej vylúčila možnosť, že inhibičný účinok anti-integrínových mAb, pozorovaný tak pri DTH ako aj CHS modelov zápalu, je spôsobený všeobecným protizápalovým účinkom sprostredkovaným anti-al a anti-a2 mAb, skúmal sa účinok mAb na dermatitídu vyvolanú dráždivým činidlom (iritantom).
Na hodnotenie dermatitídy vyvolanej iritantom sa myšiam nanieslo 5 μΐ 0,8 % krotónového oleja v acetóne na obidve strany každého ucha. Terapeutické alebo kontrolné protilátky sa podávali 4 hodiny pred použitím iritantu. Opuch ucha sa meral o 24 hodín neskôr, ako bolo opísané, a porovnal sa s hrúbkou ucha pred aplikáciou krotónového oleja. Výsledky sú uvádzané ako priemer percentuálneho zvýšenia bazálnej hodnoty hrúbky ucha ± SEM, ako bolo opísané. Myši, ktorým sa aplikoval samotný acetón (kontrola vehikulom) slúžili ako negatívna kontrola.
Za 24 hodín uši myší podrobené pôsobeniu krotónového oleja mali významné zvýšenie hrúbky ucha (48 %) v porovnaní s myšami, ktoré dostávali samotné vehikulum (acetón). Toxické opuchy ucha spôsobené krotónovým olejom neboli významne ovplyvnené pri myšiach dopredu ošetrených anti-al alebo anti-a2 mAb v porovnaní s kontrolnými zvieratami ošetrenými buď PBS, alebo kontrolnou mAb (obr. 5). Histologické vyšetrenie uší ošetrených krotónovým olejom neodhalilo žiadne rozdiely v počte alebo type infiltrujúcich buniek alebo tvorbe edému pri myšiach podrobených pôsobeniu anti-al alebo anti-a2 mAb v porovnaní s myšami ošetrenými kontrolnou mAb alebo PBS (dáta nie sú uvedené).
Príklad 6
Inhibícia artritídy podávaním al β 1 a α1β2
Keďže αϊβΐ je dobre exprimovaný na infiltrujúcich bunkách v synoviu pacientov s artritídou, pôvodcovia sa rozhodli skúmať, či anti-al alebo anti-a2 mAb by pôsobili ako inhibičné v skôr opísanom zrýchlenom modeli artritídy (Terato et al., 1992, J Immunol. 148: 2103 - 2108, Terato et al., 1995, Autoimmunity 22: 137 až 147).
Súpravy artrogén-CIA protilátok boli kúpené od Stratagene (La Jolla, CA) a artritída sa indukovala s použitím zavedeného protokolu (Terato et al., 1992, J. Immunol. 148: 2103 - 2108, Teratoet al., 1995, Autoimmunity 22: 137 - 147). Krátko, artritída sa indukovala podávaním i. p. injekcie kokteilu zo 4 mAb antikolagén typu II (1 mg každej) v deň 0, potom nasledovala i. p. injekcia 50 μΐ LPS v deň 3. V priebehu ďalších 3 - 4 dní sa pri myšiach vyvinuli opuchy zápästí, členkov a prstov. Terapeutické alebo kontrolné mAb (250 pg) sa podávali i. p. 4 hodiny pred injekciou anti-kolagénových mAb v deň 0 a znova 4 hodiny pred podaním LPS v deň 3 a potom podávanie pokračovalo každý 3. deň po celú dĺžku trvania experimentu. Počínajúc dňom 3 sa myši vyhodnocovali na rozvoj artritídy. Závažnosť artritídy v každej končatine sa zaznamenávala s použitím štvorbodového systému: 0 = normálne, 1 = mierne sčervenanie, nepatrný opuch členka alebo zápästia, 2 = mierny opuch členka alebo zápästia, 3 = závažný opuch vrátane niektorých prstov, členka a labky, 4 = maximálny zápal.
Závažná artritída sa pri Balb/c myšiach vyvinula za 72 hodín po LPS injekcii a pretrvávala viac ako 3 týždne. Ani injekcia anti-kolagénových mAb samotných, ani LPS samotného neindukovala artritídu. Myši dostávajúce kontrolnú mAb mali rovnako závažnú artritídu ako sa pozorovala pri myšiach, ktorým sa podával PBS (obr. 6). Na rozdiel od toho, liečba anti-al mAb samotnou spôsobila výrazné potlačenie (78 %) artritídy, ktoré trvalo po celý čas experimentu. Liečba anti-a2 mAb samotnou mala tiež priaznivý účinok, spôsobila 32 % zníženie artritického skóre v porovnaní s myšami liečenými kontrolnými mAb. Kombinácia anti-al a anti-a2 mAb spôsobila podobnú mieru inhibície, aká bola pozorovaná pre anti-al mAb samotnú.
SK 288124 Β6
Príklad 7
Histologická analýza účinku liečenia anti-αΐ a anti-a2 mAb na zápalový bunkový infiltrát
Ďalšie histologické analýzy SRBC-indukovanej DTH reakcie potvrdili schopnosť anti-αΐ a anti-a2 mAb liečby modulovať vyvolanú zápalovú reakciu. Vankúšiky labky (ďalej skrátene labky) bez aplikácie antigénnej výzvy pri SRBC-senzibilizovaných myšiach skutočne nemali žiadny zápalový bunkový infiltrát, v porovnaní s chodidlami po SRBC-výzve pri rovnakých myšiach. Liečenie SRBC-senzibilizovaných anti-αΐ a antia2 mAb, buď samotnými, alebo v kombinácii, spôsobilo redukciu počtu infiltrujúcich buniek zistených v labkách po SRBC-výzve, v porovnaní s myšami liečenými kontrolnou mAb. Podrobnejšie vyšetrenie infiltrujúcich buniek odhalilo, že väčšinu buniek predstavovali neutrofily, s výskytom niekoľkých monocytov a lymfocytov, a potvrdili tak, že liečba anti-αΐ a anti-a2 mAb spôsobuje veľké zníženie počtu týchto buniek.
Príklad 8
Imunohistochemická demonštrácia buniek exprimujúcich αϊβΐ v zápalovom infiltráte
Imunohistochemické vyšetrenie sa uskutočnilo podrobnejšie kvôli presnejšiemu určeniu povahy infiltrujúcich buniek a na zistenie toho, či exprimujú integríny viažuce kolagén. Infiltrujúce bunky zo zapálených chodidiel neošetrených myší sa vyšetrili na expresiu al β 1 integrínu a výskyt markerov bunkových línií. Expresia αϊβΐ integrínu sa zistila na mnohých infiltrujúcich leukocytoch. Dvojaké imunohistochemické označenie sa použilo na rozpoznanie povahy infiltrujúcich buniek a distribúciu αϊβΐ expresie. S použitím markerov bunkových línií sa zistilo, že infiltrát je zložený prevažne z granulocytov/monocytov (Mac-1+), pričom mnohé z týchto buniek sú neutrofily (Grl+), spolu s menším počtom T lymfocytov (CD3+). Expresia αϊβΐ integrínu sa zistila pri všetkých troch podmnožinách buniek, s al exprimovanou na podmnožine Mac-1+ granulocytov/monocytov, podmnožine Grl+ neutrofilov a na väčšine infiltrujúcich CD3+ T lymfocytov. Detailná imunohistochemická analýza odhalila, že aj keď liečenie anti-αΐ a anti-a2 mAb redukovalo množstvo infiltrujúcich buniek, nepozorovala sa žiadna zmena v zložení infiltrátu (dáta nie sú uvedené). Imunohistochemické vyšetrenie s farbením pomocou FITC anti-škrečou mAb potvrdilo schopnosť anti-αΐ a anti-a2 mAb lokalizovať sa do zapálenej labky (dáta nie sú uvedené).
Príklad 9
Inhibícia artritídy mAb proti al β 1 a α1β2 pri αΐβΐ-deficientných myšiach
Keďže αϊβΐ je dobre exprimovaný na infiltrujúcich bunkách v synoviu pacientov s artritídou, pôvodcovia sa rozhodli skúmať, či anti-αΐ alebo anti-a2 mAb by pôsobili ako inhibičné v skôr opísanom zrýchlenom modeli artritídy (Terato et al., 1992, J Immunol. 148: 2103 - 2108, Terato et al., 1995, Autoimmunity 22: 137 až 147).
Tento model zahrnuje injekciu koktejlu z 4 mAb anti-kolagén typu II (1 mg každej) v deň 0 do myší, nasledovanou podaním LPS, čo spôsobí v priebehu ďalších 3 - 7 dní vývoj artritídy.
Myši dostávali mAb každý 3. deň počínajúc dňom 0 a vyhodnocovali sa na rozvoj artritídy tiež každý 3. deň. Závažná artritída sa vyvinula pri všetkých myšiach za 72 hodín po LPS injekcii a pretrvávala viac ako 3 týždne. Ani injekcia anti-kolagénových mAb samotných ani LPS samotného neindukovala artritídu. Myši dostávajúce kontrolnú mAb mali rovnako závažnú artritídu ako sa pozorovala pri myšiach, ktorým sa podával PBS (obr. 7). Na rozdiel od toho, liečenie samotnou anti-αΐ mAb spôsobilo výrazné potlačenie (79 % a vyššie) artritídy, ktoré trvalo po celý čas experimentu. Liečenie samotnou anti-a2 mAb malo tiež priaznivý účinok, spôsobilo 37 % zníženie artritického skóre v porovnaní s myšami liečenými kontrolnými mAb. Kombinácia anti-αΐ a anti-a2 mAb spôsobila podobnú mieru inhibície, aká sa pozorovala pre anti-αΐ mAb samotnú.
Redukcia artritického skóre podávaním anti-αΐ mAb sa pozorovala pri všetkých myšiach a porovnanie vyznelo priaznivo oproti iným mAb na liečenie artritídy, ako je napríklad fúzny proteín rozpustného TNF receptora a Ig (Mori et al., 1996, J. Immunol. 157: 31783182), anti-Mac-1 (Taylor et al., 1996, Immunology. 88: 315 až 321), anti-a4 (Seiffge, 1996, J. Rheumatol. 23: 2086 - 2091) a anti-lCAM-1 (Kakimoto et al., 1992, Celí Immunol. 142: 326 - 337).
V zhode s údajmi založenými na mAb ukazujúcimi dôležitú úlohu αϊβΐ pri artritíde, neošetrené al-deficientné myši mali významné zníženie artritického skóre v porovnaní s divým typom myši.
Príklad 10
Účinky liečenia anti-αΐ mAb na imunopatológiu artritických kĺbov
Kĺby z divého typu artritickej myši (deň 8) dostávajúcej buď kontrolnú mAb, alebo anti-αΐ mAb sa porovnávali vizuálne a histologický s kĺbmi z normálnych neošetrených myší. Vizuálne kĺby z kontrolnej mAb-ošetrenej myši demonštrovali sčervenanie a opuch celej nohy vrátane prstov, zatiaľ čo myši liečené anti-al mAb mali malé, pokiaľ vôbec, známky zápalu buď v kĺboch, alebo prstoch.
Histologické vyšetrenie ukázalo závažné zmeny na artritických kĺboch po ošetrení s kontrolnou mAb, s rozsiahlou infiltráciou subsynoviálnych tkanív bunkami zápalovej reakcie, adhéziu buniek na povrch kĺbu a
SK 288124 Β6 značnú deštrukciu chrupavky, čo dokazuje stratu proteoglykánov. V súlade s predchádzajúcimi publikáciami (Terato et al., 1992, J. Immunol 148: 2103 - 2108, Terato et al., 1995, Autoimmunity 22: 137 - 147), bola väčšina infiltrujúcich buniek v tomto modeli neutrofily. Liečba myší s anti-αΐ mAb dramaticky redukovala množstvo zápalového infiltrátu a mieru deštrukcie chrupavky.
Príklad 11
Rozvoj artritídy je oneskorený v prítomnosti lymfocytov a inhibícia artritídy anti-αΐ mAb nastáva pri absencii lymfocytov
Aby sa určilo to, aké bunkové typy by mohli byť dôležité v modeli kolagén mAb-indukovanej artritídy, pôvodcovia porovnali schopnosť myší B6-129 divého typu a B6-129 RAG-l-deficientných myší rozvinúť artritídu (obr. 8). Genetická delécia génov RAG-1 (rekombinácia aktivujúca gén 1) spôsobila úplnú stratu zrelých T a B lymfocytov (Mombaerts et al., 1992, Celí 68: 869 - 877). Tak pri myšiach divého typu ako aj pri RAG-l-deficientných myšiach sa vyvinula artritída, aj keď kinetika indukcie pri RAG-l-deficientných myšiach bola významne pomalšia (obr. 8). Výsledky ukazujú na to, že zatiaľ čo lymfocyty sú zapojené do tohto modelu artritídy, nie sú vyžadované na rozvoj a priebeh ochorenia. Iné publikácie skúmajúce účinok RAG-1 deficientných myší v ďalších modeloch artritídy tiež zistili, že strata T a B lymfocytov oneskoruje nástup artritídy (Plows et al., 1999, J. Immunol. 162: 1018 - 1023).
Liečenie tak myší divého typu ako aj RAG-l-deficientných myší anti-αΐ mAb kompletne inhibovalo artritídu (obr. 8). Výsledky demonštrujú, že účinnosť anti-αΐ mAb v tomto modeli nie je závislá od prítomnosti lymfocytov, a že účinnosť anti-αΐ mAb v prevencii ochorenia môže byť prostredníctvom jej pôsobenia na ďalšie al-exprimujúce bunky, ako napríklad makrofágy a neutrofily, ako sa už navrhlo v predchádzajúcich experimentoch (obr. 7).
Príklad 12
Reakcia na dávku pri inhibícii artritídy podávaním anti-αΐ mAb
Vzhľadom na prekvapujúce účinky podávania anti-αΐ mAb na prevenciu artritídy pôvodcovia vynálezu rozšírili tieto štúdie tak, aby bola zahrnutá aj analýza reakcie na dávku (pozri obr. 9). Rôzne dávky mAb sa podávali i. p. každý 3. deň počínajúc v deň 0. V zhode so skoršími dátami, 250 pg dávka anti-αΐ mAb spôsobila takmer kompletnú prevenciu artritídy. Nižšia dávka 100 pg anti-αΐ mAb bola čiastočne účinná v prevencii artritídy v tomto modeli, zatiaľ čo nižšie dávky nemali žiadny preukázateľný účinok na artritické skóre (obr. 9).
Príklad 13
Terapeutické podávanie anti-αΐ mAb môže znížiť artritické skóre
Vzhľadom na účinnosť anti-αΐ mAb pri prevencii artritídy sa pôvodcovia pokúsili o liečenie myší, ktoré sú na ceste k tomu, aby sa pri nich vyvinulo toto ochorenie. Artritída sa indukovala pri myšiach injekciou koktejlu mAb anti-kolagén typu II v deň 0, nasledovanou podaním LPS v deň 3. Myši sa potom podrobili pôsobeniu buď anti-αΐ mAb, alebo fuzneho proteínu rozpustného TNF receptora s Ig počínajúc dňom 4. Progresia artritídy sa úplne zablokovala pri myšiach dostávajúcich anti-αΐ mAb počínajúc dňom 4 v porovnaní s myšami dostávajúcimi kontrolnú škrečiu mAb počínajúc dňom 4 (obr. 10). Miera inhibície pozorovaná pri terapeutickom podávaní anti-αΐ mAb bola kompletná a bola rovnaká ako tá, ktorá sa pozorovala pri preventívnom podávaní anti-αΐ mAb (začatom v deň 0) (obr. 10). Na porovnanie, liečba fúznym proteínom TNF receptora s Ig od dňa 4 spôsobila iba 60 - 70 % inhibíciu artritického skóre v porovnaní s kontrolným Ig fúznym proteínom (obr. 10). Kombinovaná liečba anti-αΐ mAb a fúziou TNF receptora s Ig spôsobila účinne kompletnú inhibíciu artritického skóre, čo nie je prekvapujúce, vzhľadom na plnú účinnosť podávania samotnej anti-αΐ mAb na potlačenie artritídy. Môžu sa teda zhrnúť výsledky, ktoré ukázali, že terapeutické podávanie anti-αΐ mAb je účinné pri inhibícii artritického skóre a môže sa priaznivo porovnať s terapeutickým podávaním TNF antagonistu.
Príklad 14
Klonovanie a mutagenéza al-I domény
Sekvencia ľudskej a potkanej domény I integrínu αϊβΐ sa amplifikovali z kompletných cDNA (Kem, et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 22811 - 22816, Ignatius et al., 1990, J. Celí Biol. 111, 709 - 720) polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) (s použitím súpravy PCR CORE Kit, Boehringer Mannheim, GmbH, Nemecko), s využitím buď špecifických ľudských primérov:
5'-CAGGATCCGTCAGCCCCACATTTCAA-3' [priamy] (SEQ ID NO: 7) a
5-TCCTCGAGGGCTTGCAGGGCAAATAT-3' [reverzný] (SEQ IDNO: 8), alebo primérov špecifických pre laboratórneho potkana:
5-CAGGATCCGTCAGTCCTACATTTCAA-3' [priamy] (SEQ ID NO: 9) a
5-TCCTCGAGCGCTTCCAAAGCGAATAT-3' [reverzný] (SEQ IDNO: 10).
SK 288124 Β6
Výsledné PCR amplifikované produkty sa purifikovali, ligovali do plazmidu pGEX4t-i (Pharmacia) a použili na transformáciu kompetentných buniek DH5a (Life Technologies). Ampicilín rezistentné kolónie sa podrobili skríningu na expresiu fúzneho proteínu „glutatión-S-transferáza - doména I“ s veľkosťou približne 45 kDa. Sekvencia z inzertov plazmidovej DNA klonov, ktoré sa selektovali pre ďalšiu charakterizáciu, sa potvrdili sekvenovaním DNA.
Chiméma ľudská/potkania doména al-I (RAH) sa pripravila (súprava pre mutagenézu MORPH Mutagenesis kit, od firmy „5 prime-3 prime”), pričom zvyšky G91, R92, Q93 a L96 laboratórneho potkana (obr. 11) nahradili zodpovedajúce ľudské zvyšky V, Q, R a R, v uvedenom poradí. Klony s RAH I doménou sa identifikovali podľa toho, že stratili diagnostické miesto pre reštrikčný enzým Stul a inzerty sa potom potvrdili DNA sekvenovaním. Aminokyselinová sekvencia ľudskej al-I domény je uvedená na obr. 12.
Príklad 15
Príprava mAb špecifických pre al-I doménu
Dokázalo sa, že monoklonálne protilátky sú veľmi užitočné ako sondy pri skúmaní vzťahu medzi štruktúrou a funkciou integrínových podjednotiek. Napríklad mAb sa využili veľmi extenzívne pri štúdiu úsekov βΐ podjednotky spojenej s aktivovanou konformáciou (Qu, A., and Leahy, D. J., 1996, Structure 4, 931 - 942). Takže pre identifikáciu potenciálnej sondy vhodnej pre konformačné zmeny al-I domény pôvodcovia vytvorili panel mAb k ľudskej al-I doméne.
Príprava monoklonálnych protilátok k al-I doméne („anti-al-I doména“ mAb)
Samice Robertsonových myší (Jackson Labs) sa imunizovali intraperitoneálne (i. p.) s 25 pg purifikovaného ľudského αϊβΐ (Edwards et al., 1995, J. Biol. Chem. 270, 12635 - 12640, Gotwals et al., 1999, Biochemistry 38: 8280 - 8) emulgovaného s kompletným Freundovým adjuvans (LifeTechnologies). Trikrát sa stimulovali zosilňovacou dávkou („boost“) i. p. 25 pg αϊβΐ emulgovaného s neúplným Freundovým adjuvans (LifeTechnologies). Myš s najvyšším titrom protilátky anti-al-I doména sa znova stimulovala i. p. so 100 pg al β 1 tri dni pred fúziou a potom intravenózne 50 pg αϊβΐ i. p. jeden deň pred fúziou. Bunky sleziny sa fúzovali s bunkami myelómu FL653 v pomere 1:6a potom sa vysiali v množstve 100,000 a 33,000 na jamku do 96 jamkových doštičiek pre tkanivové kultivácie.
Supematanty sa potom hodnotili na väzbu αϊβΐ integrínu pomocou FACS s jednoduchých farbením. Pred FACS analýzou sa supematanty inkubovali s netransfekovanými bunkami K562, aby sa vylúčil IgG, ktorý sa viaže iba k βΐ podjednotke. Následne sa 3 - 5 x 104 buniek K562 transfekovaných podjednotkou al integrínu (K562-al) a suspendovaných vo FACS pufri (1 % fetálne teľacie sérum (FCS) v PBS obsahujúcom 0,5 % NaN3) inkubovalo so supematantom 45 minút pri 4 °C, premylo a inkubovalo s anti-myšacím IgG konjugovaným s fykoerytrínom. Po premytí dvakrát FACS pufrom sa bunky analyzovali prietokovým cytometrom Becton Dickinson.
Supematanty zo vzniknutých hybridómov sa podrobili skríningu na väzbu k al-I doméne. Krátko, 50 pl fúzie „ľudská al-I doména - GST“ v PBS (30 pg/ml bol) sa použila na potiahnutie jamiek 96 jamkových doštičiek (Nunc) cez noc pri 4 °C. Doštičky sa premyli s PBS, blokovali s 1 % BSA v PBS a hybridómový supematant sa inkuboval s doménou I pri teplote miestnosti 1 hodinu. Po dôkladnom premytí v PBS obsahujúcom 0,03 % Tween 20 sa pridal na ďalšiu hodinu anti-myšací IgG s naviazanou alkalickou fosfatázou (Jackson ImmunoResearch). Po konečnom premytí sa pridalo 1 mg/ml p-nitrofenylfosfátu (pNPP) v 0,1 M glycíne, 1 mM ZnCl2 a 1 mM MgCl2 30 minút pri teplote miestnosti a doštičky sa potom čítali pri O. D. 405.
Vybrané supematanty sa testovali na ich schopnosť inhibovať K562-al závislú adhéziu ku kolagénu typu IV. Bunky K562-al sa označili s 2 mM pentaacetoxymetylesterom 2',7'(bis-2-karboxyetyl-5 a 6)karboxyfluoresceínu (BCECF, Molecular Probes) v DMEM obsahujúcom 0,25 % BSA pri 37 °C 30 minút.
Označené bunky sa premyli väzbovým pufrom (10 mM Hepes, pH 7,4, 0,9 % NaCl a 2 % glukóza) a resuspendovali vo väzbovom pufri s 5 mM MgCl2 na konečnú koncentráciu 1 x 106 buniek/ml. 50 pl supematantu sa inkubovalo s rovnakým objemom 2 x 105 buniek K562-al v jamkách 96 jamkovej doštičky. Doštička sa potom stočila a supematanty sa odstránili. Bunky sa resuspendovali vo väzbovom pufri a preniesli do jamiek kolagénom potiahnutej doštičky a inkubovali 1 hodinu pri 37 °C. Po inkubácii sa odstránili neadherujúce bunky premytím trikrát s väzbovým pufrom. Prisadnuté bunky sa analyzovali na zariadení Cytofluor (Millipore).
Pôvodcovia spočiatku identifikovali 19 hybridómov, ktorých supematanty sa viazali k ľudským leukemickým bunkám K562 exprimujúcim αϊβΐ integrín (K562-al) a k al-I doméne. Purifikovali sa imunoglobulíny z každého z hybridómov a testovali sa na schopnosť blokovať väzbu buď K562-al, alebo al-I domény ku kolagénu IV. Mab patrili do dvoch kategórií: tie, ktoré blokovali, a tie, ktoré neblokovali αϊβ 1 funkcie. Napríklad zatiaľ čo mAb produkované klony AEF3, BGC5, AQC2 a AJH10 viažu al-I doménu (pozri obr. 13 A, dáta nie sú ukázané pre BGC5), iba mAb AJH10 a AQC2 inhibujú adhéziu ku kolagénu IV v závislosti od al-I domény (obr. 13B, obr. 16B) alebo K562-al (obr. 13C, obr. 16C).
Sekvenovanie úsekov určujúcich komplementaritu (CDR)
Aby sa určil klonálny pôvod tohto panelu mAb, pôvodcovia amplifikovali pomocou PCR a sekvenovali úseky CDR pri 12 z 19 pripravených protilátok (dáta nie sú uvedené).
pg mRNA, izolovanej z 107 hybridómov (s použitím súpravy na izoláciu mRNA FastTrackmRNA, Invitrogen), sa reverzne transkribovalo (s použitím súpravy Ready-To-Go You Prime First Strand Kit, Pharmacia Biotech) s využitím 25 pM každého z nasledujúcich primérov: ťažký reťazec VH1F0R-2 (Michishita et al., 1993, Celí 72: 857 - 867), ľahký reťazec, VK4FOR, ktorý definuje štyri samostatné oligonukleotidy (Kem et al., 1994, J. Biol. Chem. 269: 22811 - 22816). Pre každý hybridom, ťažké a ľahké reťazce sa amplifikovali v štyroch oddelených PCR reakciách s použitím rôznych kombinácií nasledujúcich oligonukleotidov: (1) Ťažký reťazec: VH1FR1K (Kamata et al., 1995, J. Biol. Chem. 270: 12531 - 12535), VH1BACK, VH1BACK (Baldwin et al. 1998, Structure 6, 923 - 935), VHfrla, VHfrlb, VHfrle, VHfrlf, VHfrlg (Ignatius et al., 1990, J. Celí Biol. 111, 709 - 720) alebo VH1FOR-2 (Michishita, M., Videm, V., and Amaout, M. AAA., 1993, Celí 72, 857 - 867), a (2) ľahký reťazec: VK1BACK (Baldwin et al., 1998, Structure 6, 923 až 935), VK4FOR, VK2BACK oligonukleotidy (Kem et al., 1994, J, Biol. Chem. 269, 22811 - 22816) alebo VKfrla, VHfŕlc, VHfrle, VHfrl f,(Ignatius et al., 1990, J. Celí Biol. 111, 709 - 720). Produkty sa amplifikovali (5 minút pri 95 °C, 50 cyklov 1 minúta/94 °C, 2 minúty 55 °C, 2 minúty 72 °C a na koniec cyklu 10 minút pri 72 °C), purifikovali z gélu (QIAQUICK, Qiagen) a priamo sekvenovali s použitím rôznych uvedených oligonukleotidov s použitím sekvenátora ABI 377.
Sekvencie z klonov produkujúcich funkciu blokujúcu mAb boli takmer totožné vo všetkých úsekoch určujúcich komplementaritu (CDRS) a vložené úseky rámcovej sekvencie naznačujú, že hybridómy sú klonálne príbuzné.
Príklad 16
Imunoprenos a FACS analýza
Sekvencie variabilných úsekov neblokujúcej protilátky boli významne odlišné od klonálne príbuznej rodiny sekvencií zistených pre blokujúce protilátky. Keďže sa zdá, že blokujúce protilátky pochádzajú z jediného klonu, pôvodcovia vybrali dve protilátky (AJH10 a AQC2) na ďalšiu charakterizáciu.
Imunoprenos („immunoblotting“)
Vrstva buniek hladkého svalstva odobratá z ovčej aorty a K562-al bunky sa extrahovali s použitím 1 % Triton X-100 v 50 mM Hepes, pH 7,5,150 mM NaCl, 10 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 20 pg/ml aprotinín, 10 pg/ml leupeptín, 10 mM kyselina etyléndiamintetraoctová (EDTA). Vzorky sa naniesli na 4 až 20 % gradient SDS-PAGE a preniesli elektroforeticky (blotovali sa) na nitrocelulózovú membránu. Bloty sa blokovali 5 % sušeným mliekom v TBS, premyli TBS obsahujúcim 0,03 % Tween-20 a inkubovali s protilátkami v blokovacom pufri obsahujúcom 0,05 % NaN3 2 hodiny. Bloty sa potom premyli ako predtým, inkubovali 1 hodinu s anti-myšacím IgG konjugovaným s chrenovou peroxidázou, znova premyli, a potom podrobili pôsobeniu ECL činidla (Amersham). Bloty sa potom exponovali na film (Kodak) 30 až 60 sekúnd a vyvolali.
Imunoblot a FACS analýza (pozri obr. 14) ukázali, že AJH10 reaguje s ľudský, králičím a ovčím α 1 βΐ integrínom, ale vôbec nie s potkaním α 1 βΐ integrínom, čo vedie k názoru, že blokujúce mAb sa viažu na evolučné konzervatívny lineárny epitop. Neblokujúce mAb neboli účinné ani v imunoblote, ani nereagovali s iným biologickým druhom, ako je človek.
Príklad 17
Väzba al-I domény ku kolagénu je závislá od dvojmocného katiónu
A. Purifikácia al-I domén al-I domény sa exprimovali v E. coli ako fúzne proteíny s GST (glutatión-S-transferázou) obsahujúce miesto na štiepenie s trombínom v spojení sekvencií. Vyčistený supernatant z buniek lyzovaných v PBS sa naniesol na kolónu glutatión-Sepharose 4B (Pharmacia), ktorá sa dôkladne premyla s PBS. Fúzny proteín „al-I doména - GST“ sa eluoval pufrom obsahujúcim 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM glutatión (redukovaný). Pre denaturačné štúdie I doména sa odštiepila trombínom v 50 mM Tris, pH 7,5 pufri a purifikovala sa od GST fúzneho partnera. K vzorke sa pridal 2 mM DTT a vzorka sa naniesla na kolónu glutatión Sepharose 4B.
Pretečený pufer a premývané frakcie sa spojili a naniesli na kolónu Q Sepharose FF (Pharmacia). al-I doména sa eluovala pufrom obsahujúcim 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM 2-merkaptoetanol, 75 mM NaCl. Purifikovaná I doména mala predpovedanú hmotnosť (Leea et al., 1995, Structure 3, 1333 - 1340: 871 Da) podľa elektrosprejovej ionizačnej hmotnostnej spektrometrie (ESI-MS), na SDS-PAGE sa pohybovala ako jednoduchý pás a proteín sa eluoval ako jednoduchý vrchol zodpovedajúci veľkosti pri vylučovacej chromatografii na kolóne Superose 6 FPLC (Pharmacia).
SK 288124 Β6
B. Funkčná analýza jamkové doštičky sa potiahli cez noc pri 4 °C s 1 pg/ml kolagénu typu IV (Sigma) alebo kolagénu typu I (Collaborative Biomedical), premyli s tritónovým pufrom (0,1 % Triton X-100, 1 mM MnCl2, 25 mM TrisHC1,15O mM NaCl) a blokovali s použitím 3 % hovädzieho sérového albumínu (BSA) v pufri obsahujúcom 25mM Tris-HCl, 150mM NaCl (TBS).
Sériové riedenie fúzneho proteínu „αί-I doména-GST“ v TBS obsahujúcom 1 mM MnCl2 a 3 % BSA sa inkubovalo na potiahnutých doštičkách pri teplote miestnosti 1 hodinu a premylo tritónovým pufrom. Naviazaná αί-I doména sa detegovala sériovým pridaním 10 pg/ml biotinylovanej anti-GST polyklonálnej protilátky (Pharmacia), ExtrAvidin-chrenovej peroxidázy (Sigma) nariedenej 1 : 3000 v TBS obsahujúcom 1 mM MnCl2 a 3 % BSA, a 1-Step ABTS (2,2'-azin-di[3-etylbenztiazolinsulfonát], od firmy Pierce). Doštičky sa vyhodnotili na O. D. 405 na čítacom zariadení pre mikrotitračné doštičky (Molecular Devices).
Výsledky αί-I domény človeka a laboratórneho potkana (95 % identita s ľudskou sekvenciou) sa exprimovali v E. coli ako GST-fuzne proteíny a purifikovali pomocou glutatión-Sepharose. Obidva proteíny sa vyšetrili na väzbu ku kolagénu I a IV s použitím obmeneného testu založeného na ELISA, ktorý bol už skôr opísaný (Qu, A. a Leahy, D. J., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10277 - 10281). Ľudská αί-l doména viaže kolagén IV s lepšou účinnosťou ako kolagén I (pozri obr. 15A). Protilátka špecifická k αί-I doméne, ale nie protilátka špecifická k a2-I doméne (obr. 15B) ruší väzbu k obom ligandom (dáta pre kolagén I nie sú uvedené). Tak Mn2+ ako aj Mg2+ stimuluje väzbu, EDTA redukuje väzbu na hladinu šumu (pozadie) (obr. 15C). Žiadne merateľné rozdiely vo väzbe ligandu sa nedetegovali medzi ľudskou doménou αί-I a rovnakou doménou potkana, čo vedie k predpokladu, že sekvenčné rozdiely medzi biologickými druhy nie sú funkčne relevantné (dáta nie sú uvedené). Takže αί-I doména pre účinnú väzbu ligandu špecificky vyžaduje prítomnosť katiónu.
Príklad 18
Epitop závislý od katiónu je umiestnený v blízkosti MIDAS motívu
Pôvodcovia využili pozorovanie, že AJH10 rozpoznáva ľudské αί-I doménové sekvencie, ale nie potkanie, na mapovanie epitopu pre αΐβΐ-funkciu blokujúcej mAb. Ľudské sekvencie a sekvencie laboratórneho potkana sa líšia iba v 12 aminokyselinách, z ktorých 4 ležia v úseku 6 aminokyseliny (aa 91 - 96, obr. 11A) susediacej s kritickým treonínom (obr. 11A, aa 98) v motíve MIDAS. Na otestovanie hypotézy, že 6 aminokyselinových zvyškov, Val-Gln-Arg-Gly-Gly-Arg (zvyšky 91 - 96 z obr. 12), zahrnuje epitop pre blokujúcu mAb, pôvodcovia skonštruovali chimému I doménu (RAH), kde zvyšky G91, R92, Q93 a L96 laboratórneho potkana sa vymenili za zodpovedajúce ľudské zvyšky V, Q, R a R, v danom poradí. AJH10, spolu so všetkými funkciu blokujúcimi mAb, rozpoznáva chimému I doménu (RAH, obr. 11 B). Pre orientáciu týchto zvyškov vzhľadom na doménu MIDAS v terciámej štruktúre αί-I domény, pôvodcovia modelovali αί-I doménu s použitím koordinát kryštálovej štruktúry α2 I domény.
Homologický model ľudskej αί I domény sa postavil s použitím rôntgenovo zistenej kryštálovej štruktúry ľudskej α2 I domény (Ward et al., 1989, Náture 341, 544 - 546). Model sa postavil s použitím modulu pre homologické modelovanie Insightll (verzia 2.3.5, Biosym Technologies). Použil sa program CHARMM (Clackson et al., 1991, Náture 352, 624 - 628) so súborom všetkých vodíkových parametrov 22 so vzdialene závislou dielektrickou konštantou dvojnásobku vzdialenosti oddeľujúcej atómy. Najskôr sa uskutočnilo prvých 1000 krokov najstrmšej zostupnej minimalizácie s hmotnostne-váženou harmonickou polohovou zábranou 4,19 kJ/(mol Á2) (1 kcal/ (mol Á2)) na všetkých atómoch a 1-1 domény. Po tejto minimalizácii nasledovalo ďalších 1000 krokov najstrmšieho zostupu a 5000 krokov z Adopted-Basis Newton Raphson so zábranami 0,419 kJ/(mol Á2) (0,1 kcal/ (mol Á2)) C-α atómoch αί-I domény, aby sa zabránilo významným odchýlkam od rôntgenografickej kryštálovej štruktúry a2-I domény.
Sekvencie integrínov αί β 1 a α1β2 prejavujú 51 % identitu bez akýchkoľvek inzercií alebo deiécií, čo vedie k predpokladu, že celková štruktúra obidvoch I domén bude podobná. Koordinačné miesto kovu je podľa predikcie rovnaké v αί-I doméne ako v a2-I doméne, a rezíduá, ktoré obsahujú epitop pre blokujúcu mAb, ležia na kľučke medzi helixom a3 a helixom a4, ktorý obsahuje treonín v MIDAS motíve, ktorý je kritický pre väzbu katiónu. Model αί-I domény predikuje, že amidový dusík zvyšku Q92 (obr. 11A) vytvára vodíkovú väzbu s karbonylovou skupinou zvyšku 133, čo je zvyšok susediaci so zvyškom S32. Takže slučka, ktorá obsahuje epitop, môže mať funkčnú úlohu v stabilizácii úseku MIDAS.
Príklad 19
Monoklonálna protilátka AQC2 (t. j. mAQC2, kde „m“ označuje, že ide o myšaciu protilátku, pozri príklad 15 je protilátka typu IgGb kappa. Na identifikáciu nukleotidovej sekvencie kódujúcej ťažký a ľahký reťazec tejto protilátky sa pripravila celková bunková RNA z myšacích hybridómových buniek AQC2 s použitím súpravy QIAGEN RNEASY midi kit podľa inštrukcie výrobcu. Potom sa cDNA kódujúce variabilné úseky ťažkého a ľahkého reťazca klonovali metódou RT-PCR z celkovej bunkovej RNA s použitím súpravy
SK 288124 Β6 „GIBCO BRL SUPERSCRIPT Preamplification System for the First Strand cDNA Synthesis“ podľa protokolu odporučeného výrobcom. Náhodné hexaméry sa použili ako reakčné priméry.
Variabilná doména ťažkého reťazca mAQC2 sa amplifikovala pomocou PCR z prvého vlákna cDNA s primármi:
5' TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGC CCT TGG CCC C 3' (SEQ ID NO: 11) a
5' AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G 3' (S=C/G, M=A/C, R=A/G a W=A/T) (SEQ ID NO: 12).
PCR sa uskutočnila v 30 cykloch s použitím Clontech's Advantage Taq polymerázy: denaturácia 30 sekúnd pri 94 °C, nasadnutie 1 minúta v 50 °C a predlžovanie 1,5 minúty pri 68 °C. Ľahký reťazec mAQC2 a jeho signálna sekvencia sa amplifikovali pomocou PCR s použitím primérov:
5' ACT AGT CGA CAT GGA TTT WCA GGT GCA GAT TWT CAG CTT C 3' (W=A/T) (SEQ ID NO: 13) a 5' ACT GGA TGG TGG GAA GAT GGA 3' (SEQ ID NO: 14).
PCR sa uskutočnila v 30 cykloch s použitím klonovanej Pfú polymerázy Stratagene: denaturácia 1 minúta pri 94 °C, nasadnutie 1 minúta pri 50 °C a predlžovanie 2 minúty pri 70 °C. PCR produkty pre ťažký a ľahký reťazec sa purifikovali z gélu s použitím súpravy QIAGEN QIAQUICK pre gélovú extrakciu podľa výrobcom odporučeného protokolu.
Purifikovaný produkt - ťažký reťazec sa subklonoval do vektora pCR2,l-TOPO TA firmy Invitrogen s použitím klonovacej súpravy TOPO TA, Invitrogen. Purifikovaný ľahký reťazec sa subklonoval do vektora pCRbluntlITOPO od Invitrogen s použitím klonovacej súpravy Zero Blunt TOPO, Invitrogen, podľa protokolu odporučeného výrobcom. Inzerty z mnohých nezávislých subklonov sa sekvenovali. S výnimkou degenerovaných polôh v PCR priméroch boli sekvencie inzertov nezávislých subklonov totožné.
Polypeptidové sekvencie mAQC2 sa odvodili z ich kódujúcich sekvencií. N-koncová aminokyselinová sekvencia pre zrelý ľahký reťazec predikovaná z cDNA sekvencie PCR produktu amplifikovaného so signálnou sekvenciou presne zodpovedala N-koncovej sekvencii purifikovaného ľahkého reťazca mAQC2 získaného Edmanovou degradáciou (DVKVVESGG, SEQ ID NO: 15). BLAST analýzy sekvencií variabilných domén potvrdili ich imunoglobulinovú identitu.
Polypeptidová sekvencia variabilnej domény ľahkého reťazca mACQ2 je uvedená ďalej:
QIVLTQFPAL MSASPGEKVT MTCSASSSVN HMFWYQQKPK
SSPKPWIYLT SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISSMEAE
DAATYYCQQW SGNPWTFGGG TKLEIK 106 (SEQ ID NO: 1)
CDR úseky sú znázornené tučné. CDR úseky sú definované podľa Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, the United States Department of Health and Human Services, the United States Government Printing Office, 1991. S použitím systému číslovania podľa Kabata, SEQ ID NO: 1 je reprezentovaná nasledovne, pričom pomlčka označuje neprítomnosť aminokyseliny:
QIVLTQFPAL MSASPGEKVT MTCSASS-SV NHMFWYQQKP
KSSPKPWIYL TSNLASGVPA RFSGSGSGTS YSLTISSMEA
EDAATYYCQQ WSGNPWTFGG GTKLEIK 107
Polypeptidová sekvencia variabilnej domény ťažkého reťazca mAQC2 je nasledujúca:
DVKWESGGG LVKPGGSLKL ACAASGFSFS RYTMSWVRQI
PEKRLEWVAT ISGGGHTYYL DSVKGRFTIS RDNAKNTLYL
QMSSLRSEDT AMYYCTRGFG DGGYFDVWGQ GTTVTVSS (SEQ ID NO: 2)
CDR úseky sú znázornené tučné. S použitím systému číslovanie podľa Kabata, SEQ ID NO: 1 je reprezentovaná nasledovne, pričom čísla polôh sú po sebe nasledujúce čísla, pokiaľ nie je uvedené inak:
DVKWESGGG LVKPGGSLKL ACAASGFSFS RYTMSWVRQI
PEKRLEWVAT ISGGGHTYYL DSVKGRFTIS RDNAKNTLYL
QM
82a-c SSL
RSEDTAMY YCTRGFGDGG lOOa-b YF
101 DVWGQGTTVT VSS 113
Ako sa v tomto texte používa, čísla polôh aminokyselinových zvyškov variabilných domén sú v zhode so systémom číslovania podľa Kabata, ak nie je uvedené inak.
SK 288124 Β6
Príklad 20
Tento príklad opisuje prípravu chimémej myšacej-ľudskej protilátky chAQC2.
cDNA kódujúce variabilné úseky ťažkého a ľahkého reťazca mAQC2 sa použili na konštrukciu expresných vektorov chAQC2, v ktorých variabilné úseky mAQC2 boli spojené s ľudským IgG] a konštantnými úsekmi kappa.
Chiméra ťažkého reťazca sa konštruovala nasledujúcim postupom: Fragment KbPstl-BstEII veľký 0,33 kb z plazmidu pAND083 ťažkého reťazca mAQC2 sa subklonoval do fosfatázou opracovaného Pstl-BstEII vektorového fragmentu veľkosti 2,82 kb z plazmidu 5a8 ťažkého reťazca pLCB7, aby sa pridali signálkódujúce sekvencie myšacieho ťažkého reťazca a myšacie donorové zostrihové miesto k cDNA variabilného úseku ťažkého reťazca mAQC2. 5a8 je molekulárne klonovaná CD4-špecifická mAb (pozri napr., Boon et al., 2002, Toxicology 172: 191 - 203). V zrelom ťažkom reťazci kódovanom vzniknutým plazmidom (pAND092) sa N-koniec líši v piatich aminokyselinových zvyškoch od N-konca (DVKVVE, SEQ ID NO:
16) príbuzného ťažkého reťazca mAQC2.
Na opravu N-konca ťažkého reťazca sa pAND092 mutagenézou eliminovali jedinečné miesta (USE) s použitím súpravy pre USE mutagenézu (Amersham Pharmacia Biotech) podľa protokolu odporučeného výrobcom. Substitúcie Q1D, Q3K, L4V, Q5V a Q6E boli kódované mutagénnym primérom: 5' GCA CCA GGT GCC CAC TCC GAC GTC AAG GTG GTG GAG TCA GGG GGA GGC TTA GTG 3' (SEQ ID NO:
17) . Mutované plazmidové klony sa identifikovali podľa ich nových AatlI a Hinfl miest a straty PstI miesta. Kódujúce sekvencie ťažkého reťazca sa potom potvrdili DNA sekvenovaním. Správne mutovaný plazmid sa pomenoval pAND094. Notl-HindlII fragment s veľkosťou 0,43 kb z pAND094 a HindlII-NotI fragment s veľkosťou 1,21 kb z plazmidu pEAG964 (obsahujúce kódujúce sekvencie pre konštantný úsek ľudského IgGi) sa subklonovali do Nôti miesta v pCH269, plazmidu pochádzajúcom z pCEP4 EBV expresného vektora (Invitrogén). Výsledný plazmid sa nazval pAND099.
Chiméra ľahkého reťazca sa pripravila nasledujúcim spôsobom: EcoRI fragment s veľkosťou 0,46 kb z plazmidu dpAND081 variabilnej domény ľahkého reťazca mAQC2 sa subklonoval do fosfatázou ošetreného fragmentu s veľkosťou 2,7 kb z vektora pNN09 odvodeného z klonovacieho vektora pUC, aby sa pridalo 5' Nôti miesto. Vzniknutý plazmid, pAND091, sa mutagenizoval s použitím súpravy pre USE mutagenézu (Amersham), pozri skôr)), aby sa vnieslo BglII miesto na 3' koniec kódujúcej sekvencie. Mutagénny primér mal sekvenciu: 5’ GGA GGC ACC AAG CTG GAG ATC TAA CGG GCT GAT GCT GC 3 ' (SEQ ID NO:
18) .
Správne mutovaný plazmid sa identifikoval podľa zmien polohy miest BglII a BstYI. Sekvencia kódujúca ľahký reťazec vo výslednom plazmide pAND093 sa potvrdila DNA sekvenovaním. Potom sa Notl-BglII fragment variabilnej domény ľahkého reťazca s veľkosťou 0,44 kb z pAND093 a BclI-NotI fragment z plazmidu pEAG963 s veľkosťou 0,68 kb (obsahujúce kódujúce sekvencie konštantnej domény ľudského ľahkého reťazca kappa) subklonovali do Nôti miesta pCH269 (pozri skôr), čím sa vytvoril plazmid pAND102. Na vytvorenie neblokovaného ľahkého reťazca kappa (Q1E), pAND093 sa USE mutagenizoval s mutagénnym primérom: 5'CAT AAT GTC CAG GGG AGA AAT TGT TCT CAC CCA G 3 ’ (SEQ ID NO: 19), na vnesenie XmnI miesta. Mutovaný plazmid sa identifikoval skríningom na zmenu polohy XmnI. Sekvencia ľahkého reťazca vo vzniknutom plazmide pAND097 sa potvrdila DNA sekvenovaním. Fragment Notl-BglII variabilnej domény ľahkého reťazca z pAND097 s veľkosťou 0,44 kb a BclI-NotI fragment z plazmidu pEAG963 s veľkosťou 0,68 kb (obsahujúce konštantnú doménu ľudského ľahkého reťazca kappa) sa subklonovali do Nôti miesta pCH269, čím sa vytvoril plazmid pAND098.
Na tvorbu protilátky chAQC2 sa expresnými vektormi (vektor pAND099 pre ťažký reťazec chAQC2 + + vektor pAND102 pre ľahký reťazec chAQC2 a vektor pAND099 pre ťažký reťazec chAQC2 + vektor pAND098 pre neblokovaný ľahký reťazec chAQC2) kotransfekovali bunky 293-EBNA. Transfektanty sa testovali na sekréciu protilátky a jej špecificitu. Kontrolu tvorili bunky transfekované zodpovedajúcimi vektormi bez inzertu alebo s DNA konštruktmi kódujúcimi ch5c8 (molekulárne klonovaná CD154-špecifická mAb opísaná napr. v Elster et al., 2001, Transplantation 72: 1473 - 1478) alebo chCBEl 1 (molekulárne klonovaná LTR-špecifická mAb opísaná napr. v Browning et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 24 934 - 24938).
Potom sa transfektanty, ktoré sekrétovali požadovanú protilátku, lyžovali a s lyzátmi a kondicionovaným médiom sa urobila imunoprecipitácia proteínom A. Westem blot analýza precipitátov uskutočnená s protilátkami proti ľudskému ťažkému a ľahkému reťazcu ukázala, že chAQC2-transfekované bunky syntetizovali a účinne sekrétovali ťažký a ľahký reťazec v hladine podobnej ch5c8-transfekovaným a chCBEll-transfekovaným bunkám. Ďalej huVLA-1-exprimujúce bunky K562al sa označili (zafarbili) pomocou kondicionovaného média z transfekovaných buniek a na takto označených bunkách sa uskutočnila FACS analýza. Výsledky ukázali, že protilátka chAQC2 vytvorila zafarbené profily podobné profilom mAQC2, zatiaľ čo kondicionované médiá zo slepo transfekovaných a ch5c8-transfekovaných buniek nezafarbili bunky K562al. Chiméma AQC2 produkovaná po prechodnej transfekcii vo väčšom meradle sa purifikovala a pomocou FACS titrácie sa ukázalo, že sa viaže k VLA-1. Chiméma AQC2 buď divého typu, alebo s geneticky odblokovaným ľahkým reťazcom sa viaže k VLA-1. Pozri tiež obrázky 16 A - D (diskutované neskôr).
SK 288124 Β6
Príklad 21
Tento príklad opisuje spôsob humanizácie monoklonálnej protilátky mAQC2.
Analýza variabilnej domény mAQC2
Variabilné domény ľahkého a ťažkého reťazca mAQC2 sa porovnali s kanonickými sekvenciami pre myšacie a ľudské podskupiny (Kabat et al., pozri skôr) s použitím počítačového programu FASTA. Zistilo sa, že variabilná doména ľahkého reťazca je členom myšacej podskupiny VI s 89 % identitou v prekrývajúcom sa úseku 109 aminokyselín. Táto doména tiež zodpovedala ľudskej podskupine I so 72 % identitou v prekrývajúcom sa úseku 113 aminokyselín. A ďalej sa zistilo, že variabilná doména ťažkého reťazca je členom myšacej podskupiny Illd s 86 % identitou v prekrývajúcom sa úseku 129 aminokyselín. Táto variabilná doména ťažkého reťazca tiež zodpovedala ľudskej podskupine 111 so 79 % identitou v prekrývajúcom sa úseku 130 aminokyselín.
CDR úseky sa kategorizovali a roztriedili do kanonických tried podľa Chothia et al., Náture 342, pp. 877 až 883, 1989. Kľúčové zvyšky definujúce každú z kanonických tried rozhodujú do značnej miery o štruktúrnej konformácii CDR slučky, takže by mali byť zachované v reorganizovanej (prestavanej) protilátke. Ukázalo sa, že Ll slučka mAQC2 patrí do kanonickej triedy 1 (slučka z 10 zvyškov), L2 do triedy 1 (slučka zo 7 zvyškov) a L3 tiež do triedy 1 (slučka z 9 zvyškov). Hl slučka patrí do triedy 1 (slučka 5 zvyškov) a H2 slučka tiež do triedy 1 (slučka zo 16 zvyškov). Zdá sa, že H3 slučka nepatrí do žiadnej kanonickej triedy. Kanonické zvyšky dôležité pre tieto triedy boli všetky zahrnuté v humanizovaných protilátkach.
Nezvyčajné zvyšky rámca mAQC2 sa určili pomocou analýzy všetkých myšacích a ľudských sekvencií variabilných reťazcov podľa 1999 verzie databázy Kabata. Predpokladalo sa, že mAQC2-špecifické rozdiely by mohli ukazovať na somatické mutácie, ktoré zosilňujú väzbovú afinitu, ak sa rozdiely vyskytujú blízko väzbového miesta. Nezvyčajné mAQC2 zvyšky vo väčšej vzdialenosti od väzbového miesta a nezvyčajné zvyšky ľudského rámca odstránili v prípade, že by vytvárali imunogénne epitopy v humanizovanej protilátke. Nezvyčajné zvyšky rámca zistené v mAQC2 boli 7 (F), 10 (L) a 41 (K) v ľahkom reťazci a 4 (V), 21 (A) a 40 (I) v ťažkom reťazci. Žiadny z nezvyčajných zvyškov myšacieho rámca sa neponechal v humanizovaných protilátkach.
Modelovanie štruktúry variabilných úsekov
Ľahký a ťažký reťazec mAQC2 sa porovnali oproti nonredundantnej databáze, aby sa stanovilo to, ktoré štruktúrne rámce by sa mali použiť na konštrukciu trojrozmerných modelov ľahkého a ťažkého reťazca mAQC2. S použitím programu FASTA sa zistilo, že ľahký reťazec má 82 % sekvenčnú identitu s myšacou monoklonálnou protilátkou ab57 (1CLOL), zatiaľ čo ťažký reťazec má 76 % sekvenčnú identitu s myšacím 6d9 Fab fragmentom (1HYY). S použitím programového balíka na molekulárne modelovanie SYBYL (Tripos Inc.) sa zostavila približná trojrozmerná štruktúra ľahkého a ťažkého reťazca mAQC2 s využitím ľahkého reťazca z ab57 a ťažkého reťazca z 6d9, v danom poradí. Štruktúrna integrita modelov sa vyhodnotila priamo pri počítači a vyhodnotila sa ako rozumná.
Návrh reorganizovaných variabilných úsekov
Použili sa dva prístupy na výber ľudského akceptorového rámca, aby prijal CDR úseky z mAQC2c. Prvý prístup bola metóda homologickej zhody („homológy matching) a druhým prístupom bolo využitie kanonických ľudských Ig sekvencií. Pri homologickej metóde sa databáza Kabata, nonredundantná databáza NCBI, ENTREZ (The National Institutes of Health) a databáza Incyte prehľadávala s použitím programov FASTA a BLAST. Voľba ľudského akceptorového miesta sa urobila na základe sekvenčnej identity medzi rámcom mAQC2 a ľudským rámcom (s vylúčením rámcov už skôr humanizovaných protilátok) a zdrojom protilátky.
Rámce z génov variabilných úsekov imunoglobulínu s prístupovým číslom v GENBANK gi:587330 (ľudská kappa podskupina I VK-lcl47) sa nakoniec zvolili pre ľahký reťazec humanizovanej protilátky (Welschof et al., J. Immunol. Meth. 179: 203 - 14, 1995). Rámce z Amulcll (Kabat ID 044469, ľudská podskupina III) sa zvolili pre ťažký reťazec humanizovanej protilátky (Huang et al., J. Immunol. 151: 5290 - 300, 1993). Spätné mutácie ľudského rámca
Stratégia na určenie toho, ktoré spätné mutácie urobiť, sú dostupné na webových stránkach Humanization bY Design na url adresách http://mathbio.nimr.mrc.ac.uk/isaldan a http://www.crvst.bbk.ac.uk/~-ubcg07s. Predchádzajúce experimenty dokázali, že je dôležité zachovať kanonické zvyšky, zvyšky „zbaľovania rozhrania“ a nezvyčajné myšacie zvyšky, ktoré sú blízko väzbového miesta. Okrem toho by sa mali zvážiť zvyšky vo „Vemier zóne“, ktorá tvorí platformu, na ktorej ležia úseky CDR (Foote et al., J. Mol. Biol. 224, p. 487, 1992), a malo by sa uvažovať o zvyškoch v blízkosti CDR H3.
Štyri reorganizované verzie navrhli pre každý variabilný ľahký a ťažký reťazec, ako je uvedené v tabuľke
1. Dve zo štyroch verzií pre každý reťazec sa navrhli metódou zhody podľa homológie (označené huAQC2-hl a -h2) a ďalšie dve verzie metódou kanonickej zhody (huAQC2-cl a -c2). Je nutné poznamenať, že sek32 vencie pre ťažký reťazec huAQC-hl a ťažký reťazec huAQC-cl sú identické.
Tabuľka 1
Sekvencia mAQC2, huAQC2 a ľudské rámce
ĽAHKÝ REŤAZEC
FRI
Vk-lcl47 D--M—S-SSL—-V-DR—I—· huAQC2-h2 ......S-SSL—V-DR—I— huAQC2-hl ------S-SSL---V-DR--I-mAQC2 QIVLTQFPALMSASPGEKVTMTC huAQC2-Cl --Q---S-SSL---V-DR--I— huAQC2-c2 --Q---S-SSL---V-DR--I-CDR1 FR2
Vk-lcl47 R—Q-ISYLN ------GKA--LL-huAQC2-h2 .........- .....-GKA--LL-huAQC2-hl ---------- ------GKA.....mAQC2 SASSSVNHMF HYQQKPKSSPKPWIY huAQC2-cl .........- ------GKA-----huAQC2-c2 ---------- ------GKA—LL—
CPR2 FR3
Vk-lcl47 AA-S-Q- ---S---------DPT-----LQP--F----huAQC2-h2 S---------D-T-----LQP--F----huAQC2-hl S---------D-T-----LQP--F----mAQC2 LTSNLAS GVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYC huAQC2-cl ---S---------D-T-----LQP--F----huAQC2-c2 S---------D-T-----LQP--F----Frantework
CDR3 FR4 chanaea
Vk-lcl47 --SYST-L- ......V--- 25 huAQC2-h2 --------- ------V 21 huAQC2-hl ......... ......V 19 mAQC2 QQWSGNPWT FGGGTKLEIK** 0 huAQC2-Cl —........Q..-v--- 21 huAQC2-c2 --------- --Q---V--- 23
AMU1C11 huAQC2-h2 huAQC2-hl mAQC2 huAQC2-d huAQC2-c2
AMU1C11 huAQC2-h2 buAQC2-hl mAQC2 huAQC2-d huAQC2-c2
ŤAŽKÝ REŤAZEC
ESI CDRl
E-QL-......IQ-----R-S------TV- SNY—
E-QL-------IQ-- —-R-S------T.......
—QL-.......Q-- —-R-S—....... .....
DVKWESGGGLVKPGGSLKLACAASGFSFS RYTMS
--QL—-.....Q-----R-S—............
E-QL--------Q-----R-S------T-- ----FR2 CDR2
----A-G-G----S V-YS--S-—A--------A-G-G----- -------------------A-G-G----- ---------------WVRQIPEKRLEHVA TISGGGHTYYLDSVKG
----A-G-G----- -------------------A-G-G----- ---------------FH3 CDR3
AMU1C11 huAQC2-h2 huAQC2-hl mAQC2 huAQC2-d huAQC2-c2
--------s.--- ..-..-.,5.... ----N---A—--V---AS _ ..fj. .-A.-- *-V- -- IRFLEWS—Y
0
RFTISRDNAXMTLYLQMSSLRSEDTAMYYCTR GFGDGGYFDV
S------—N---A----V·
S--------N—-A----V·
AMU1C11 huAQC2-h2 huAQC2-hl mAQC2 hUAQC2-Cl buAQC2-c2
FBI
-----L---------L.....
-----L----WGQGTTVTVSS* .....L.....
-----L----Zunv ráme: 20 16 13 0 * Pomlčky označujú totožnosť s mAQC aminokyselinovou sekvenciou ·· Časť SEQ ID NO:1.
•••Časť SEO ID N0:2.
SK 288124 Β6
Niektoré spätné mutácie sú diskutované ešte ďalej.
(1) Ľahký reťazec:
D —» Q Táto mutácia sa vytvorila vo všetkých verziách, pretože predchádzajúce reorganizačné experimenty (napr. Kolbinger et al., Protein Eng. 6, p. 971, 1993) predpokladajú jej dôležitosť pre väzbu antigénu.
M —♦ L Toto je „vemier“ zvyšok a zachoval sa vo všetkých verziách.
L —> P Tento zvyšok je tak zvyšok rozhrania ako aj „vemier“ zvyšok a zachoval sa iba v hl a cl.
L —» W Toto je „vemier“ zvyšok a zachoval sa iba v hl a cl.
F —> Y Tento zvyšok je v dôležitej kanonickej polohe a zachoval sa vo všetkých verziách.
(2) Ťažký reťazec:
E —> D Táto spätná mutácia sa vytvorila v iba hl (t. j. cl)
I —> V Zvyšok I je nezvyčajný v ľudskej sekvencii a zachoval sa iba v h2.
28T—>STotoje „vemier“ zvyšok a zachoval sa iba v hl.
V —»F Toto je kanonický zvyšok a zachoval sa vo všetkých verziách.
S —>_ A Toto je „vemier“ zvyšok a zachoval sa vo všetkých verziách.
A —♦ T Tento zvyšok je tak zvyšok rozhrania ako aj „vemier“ zvyšok a zachoval sa vo všetkých verziách.
S —> R Toto je kanonický zvyšok a zachoval sa v obidvoch verziách.
Variabilné úseky huAQC2 sa pripravili pomocou USE mutagenézy, ako bolo opísané, s využitím plazmidov variabilnej domény chAQC2 ako východiskových templátov. cDNA sekvencie ľudského akceptorového rámca („FR“) boli Kabat # Z37334 pre ľahký reťazec a Kabat #U00490 pre ťažký reťazec. Pre ľahšiu identifikáciu mutovaných plazmidov sa vniesli umlčané mutácie, aby sa zmenili reštrikčné miesta. Mutované plazmidy sa identifikovali podľa zmeny reštrikčných miest. cDNA sekvencie variabilných úsekov vo výsledných plazmidoch sa overili DNA sekvenovaním.
Verzie ťažkých reťazcov hl a cl (ktoré boli totožné) sa vytvorili s použitím plazmidu pAND094 ako templátu. Mutagénne priméry boli nasledujúce:
FR1 primér 5' GGT GCC CAC TCC GAC GTC CAG CTG GTC GAG TCA GGG GGA GGC TTA GTC CAG CCT GGA GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC 3' (SEQ ID NO: 20), ktorý vniesol miesta Taql a PvuII a eliminoval miesto Ddel,
FR2 primér 5' ATG TCT TGG GTT CGC CAG GCT CCG GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC GCA ACC 3' (SEQ ID NO: 21), ktorý vniesol miesto Ncil a eliminoval miesta BspEI a EarI,
FR3 primér 5' TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACC CTG TAC CTG CAG ATG AAC AGT CTG AGG GCC GAG GAC ACA GCC GTG TAT TAC TGT ACA AGA 3' (SEQ ID NO: 22), ktorý vniesol miesta PstI a Ddel, a
FR4 primér 5 ' TGG GGC CAA GGT ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GAG 3' (SEQ ID NO: 23), ktorý vniesol miesta KpnI a Eco0109I. Výsledný plazmid ťažkého reťazca hl (t. j. cl) sa nazval pANDl 04.
Verzia c2 ťažkého reťazca sa vytvorila s použitím pAND104 ako templátu s nasledujúcimi mutagénnymi primérmi:
FR1 primér 5 ' TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGG TAT ACT ATG TCT TGG GTT 3' (SEQ ID NO: 24), ktorý zaviedol Accl miesto, a
FR1 primér 5' GCA CCA GGT GCG CAC TCC GAG GTC CAG CTG GTC GAG TCA 3' (SEQ ID NO:
25) , ktorý zaviedol FspI miesto a eliminoval AatlI miesto. Výsledný plazmid ťažkého reťazca c2 sa nazval pANDl 15.
Verzia h2 ťažkého reťazca sa vytvorila s použitím pANDl 15 ako templátu s nasledujúcim primérom:
FR1 primér 5'GAG TCA GGG GGA GGC TTA ATC CAG CCT GGA GGG TCC CTG 3' (SEQ ID NO:
26) , ktorý eliminoval Ddel miesto, výsledný plazmid ťažkého reťazca h2 sa nazval pANDl 13.
Na vytvorenie expresných vektorov pre ťažký reťazec huAQC2, Notl-HindlII fragment variabilnej domény ťažkého reťazca s veľkosťou 0,43 kb z pAND104, pANDl 15 alebo pANDl 13 a HindlII-NotI fragment s veľkosťou 1,21 kb z pEAG964 (pozri skôr) sa subklonovali do Nôti miesta v pCH269 (pozri skôr). Vzniknuté expresné plazmidy pre ťažké reťazce sa nazvali pANDl 14 (hl), pAND121 (c2) a p AND 124 (h2), v danom poradí.
Verzia hl ľahkého reťazca sa vytvorila s použitím plazmidu pAND093 ako templátu. Mutagénne priméry boli nasledujúce:
SK 288124 Β6
FR1 primér 5 ' CAA ATT GTT CTC ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCG TCT GTA GGG GAC AGA GTC ACC ATC ACA TGC AGT GCC AGC TCA 3' (SEQ ID NO: 7), ktorý odstránil StEII a PstI miesta,
FR2 primér 5 ' TTC TGG TAT CAG CAG AAG CCC GGG A GCC CCC A CCC TGG ATT 3' (SEQ ID NO: 28), ktorý zaviedol Ncil miesto,
FR3 primér 5 ' GCT TCT GGA GTC CCT TCA CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAT TAC ACT CTC ACA ATC AGC AGC CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCC ACT TAT TAC TGC CAG 3' (SEQ ID NO: 29), ktorý zaviedol Ddel miesto a odstránil Eco01091 a Aval miesta, a
FR4 primér 5 ' GGT GGA GGC ACT AAG GTG GAG ATC TAA CGG GCT 3' (SEQ ID NO: 30), ktorý zaviedol Ddel a Styl miesta. Vzniknutý plazmid ľahkého reťazca hl sa nazval pAND103.
Verzia h2 ľahkého reťazca sa vytvorila s použitím pAND103 ako templátu s nasledujúcimi primérmi:
FR2 primér 5' CCC GGG A GCG CCC A CTC CTG ATT TAT CTC ACA TCC 3' (SEQ ID NO: 31), ktorý vniesol Hhal a HaelI miesta. Vzniknutý plazmid ľahkého reťazca h2 sa nazval pANDl 16.
Pre verziu cl ľahkého reťazca sa použil plazmid pANDl03 ako templát s nasledujúcimi primérmi:
FR1 primér 5' GCC TCA GTC ATA ATG TCC CGG GGA CAA ATT CAG CTC ACC CAG TCT CCA TCC 3' (SEQ ID NO: 32), ktorý vniesol miesta Smal, Ncil a Hpall,
FR4 primér 5' GGT AAC CCG TGG ACG TTC GGT CAG GGC ACT AAG GTG GAG ATC TAA CGG GCT 3' (SEQ ID NO: 33), ktorý vniesol Bsp 12861 miesto. Výsledný plazmid ľahkého reťazca sa nazval pANDl 18.
Verzia c2 ľahkého reťazca sa vytvorila s použitím plazmidu pAND 116 ako templátu s nasledujúcimi primérmi:
FR1 primér 5' GCC TCA GTC ATA ATG TCC CGG GGA CAA ATT CAG CTC ACC CAG TCT CCA TCC 3' (SEQ ID NO: 34), ktorý zaviedol miesta Smal, Ncil a Hpall,
FR4 primér 5' GGT AAC CCG TGG ACG TTC GGT CAG GGC ACT AAG GTG GAG ATC TAA CGG GCT 3' (SEQ ID NO: 35), ktorý zaviedol Bspl286I miesto. Výsledný plazmid ľahkého reťazca c2 sa nazval pANDl 19.
Na vytvorenie expresných vektorov pre ľahké reťazce huAQC2, Notl-BglII fragmenty variabilnej domény ľahkého reťazca s veľkosťou 0,44 kb z pAND103, pANDl 16, pANDl 18 alebo pANDl 19 a BclI-NotI fragment s veľkosťou 0,68 kb z pEAG963 (pozri skôr) sa subklonovali do Nôti miesta v pCH269 (pozri skôr). Výsledné expresné vektory ľahkého reťazca sa nazvali pANDl 17 (hl), pAND120 (h2), pAND122 (cl) a pANDl23 (c2), v danom poradí.
Expresné vektory sa použili na kotransfekciu buniek 293-EBNA a transfekované bunky sa potom testovali na sekréciu protilátky a jej špecificitu. Bunky transfekované prázdnym vektorom slúžili ako negatívna kontrola. Lyzáty z celých buniek a kondicionované médiá sa imunoprecipitovali s proteínom A. Western blot analýza precipitátov (vyvolaná s protilátkami proti ľudskému ťažkému a ľahkému reťazcu) ukázala, že huAQC2-transfekované bunky syntetizovali a účinne sekrétovali ťažký a ľahký reťazec protilátky v hladinách podobných chAQC2-transfekovaným bunkám.
Potom sa uskutočnila FACS analýza VLA-1-exprimujúcich buniek K562a zafarbených kondicionovaným médiom z kultivácie transfekovaných buniek. Bunky K562a sa preto inkubovali s kondicionovaným médiom na ľade 120 minút. Potom sa bunky premyli trikrát s FACS pufrom (PBS s 5 % FBS a 0,05 % azidom sodným). Premyté bunky sa resuspendovali v pufri a inkubovali 30 minút s PE-konjugovaným anti-ľudským IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) na ľade. Po inkubácii sa bunky premyli trikrát s FACS pufrom a resuspendovali vo FACS pufri na analýzu. Dáta sú uvedené v tabuľke 2, kde HuAQC2-hl označuje mAb, pozostávajúca z hl verzie ťažkého reťazca (HC) huAQC2 a hl verzie ľahkého reťazca (LC) z huAQC2 (pozri tabuľka 1). Podobne, huAQC-h2 je mAb, ktorú tvoria h2 verzia ťažkého a ľahkého reťazca, pri huAQC2-cl je to c 1 verzia a pri uAQC2-c2 je to c2 verzia. V tabuľke sa MFI týka priemernej MFI normalizovanej k hodnote, ktorá sa pozorovala pre blokovanú chAQC2. Uvedené údaje reprezentujú priemer z dvoch
SK 288124 Β6 nezávislých transfekcií. Tieto dáta ukazujú, že huAQC2-h2 a-c2 mAb sa viazali horšie ako huAQC2-hl a -cl vzhľadom na chAQC2.
Tabuľka 2
FACS farbenie buniek K562a s použitím chAQC2 a huAQC2
Ľahký reťazec Ťažký reťazec Relatívna MFI
chAQC2 pANDl 02 pAND099 1,00
huAQC2-hl pANDl 17 pANDl 14 1,50
huAQC2-h2 pAND120 pAND124 0,64
huAQC2-cl pAND122 pANDl 14 1,50
huAQC2-c2 pANDl 23 pAND121 0,68
huAQC2 LC cl/HC c2 pAND122 pAND121 2,21
huAQC2 LC c2/HC cl pAND123 pANDl 14 0,76
huAQC2 LC neblokovaný cl/HC c2 pANDl 50* pAND121 0,75
huAQC2 LC L46P c2/HC c2 pAND133** pAND121 1,50
huAQC2 LC L47W c2/HC c2 pAND132*** p AND 121 1,00
* kóduje huAQC2 LC cl s neblokovanýmN-koncom Q1D.
** kóduje huAQC2 LC c2 s L4 6P.
*** kóduje huAQC2 LC c2 s L47W.
Kotransfekcie buniek 293-EBNA s chAQC2 a huAQC2-hl, -h2, - cla -c2 sa uskutočnili vo väčšom meradle. Protilátky z kondicionovaného média sa purifikovali na Sepharose s proteínom A. Purifikované mAb sa testovali na aktivitu pomocou FACS. Protokol bol nasledujúci:
1. Zrátaj bunky z banky, ktorá sa rozdelila 1 : 4 deň pred testom.
2. Peletuj bunky a resuspenduj ich na 2,5 x 105 buniek/ml vo FACS pufri (5 % FBS v PBS s 0,02 % azidom sodným).
3. Pipetuj po 100 μΐ buniek do jamiek 96jamkovej doštičky s dnom typu V.
4. Priprav sériové riedenie 1 : 3 z AQC2 v FACS pufri počínajúc koncentráciou 3 pg/ml.
5. Peletuj bunky 5 minút pri 800 g a odstráň pufor z doštičky vytrepnutím.
6. Resuspenduj bunky v 100 μΐ nariedenej protilátkovej série.
7. Inkubuj 2 hodiny na ľade.
8. Opláchni doštičku. Peletuj bunky 3 minúty pri 800 g a odstráň pufer z doštičky vytrepnutím.
9. Resuspenduj bunky v 100 μΐ sekundárnej protilátky (nariedenej 1 : 100 vo FACS pufri).
10. Inkubuj 30 minút na ľade.
11. Opláchni doštičku (pozri skôr).
12. Resuspenduj bunky v 25 μΐ FACS pufra.
13. Centrifúguj krátko FACS skúmavky, aby bolo isté, že objem 50 pije na dne skúmavky.
14. Pretrep dôkladne na vortexe každú skúmavku a odober 5000 prípadov.
Dáta sú uvedené na obr. 17. Tieto dáta potvrdili, že huAQC2-h2 a -c2 sa viažu horšie ako huAQC2-hl a cl vzhľadom na chAQC2.
Kanonické verzie huAQC2 sa ďalej skúmali, pretože boli menej imunogénne, keď sa použili na liečenie pacientov s chronickými indikáciami.
Uskutočnili sa kotransfekcie tzv. typu „mix-and-match“, aby sa určilo, či jediný reťazec je zodpovedný za zjavné zhoršenie väzby pozorovanej pri huAQC2-c2. Kotransfekcie viedli k názoru, že za zhoršenie väzby je zodpovedný ľahký reťazec c2 (kódovaný pAND123), ktorý sa líši od ľahkého reťazca cl (kódovaného pAND122) iba v dvoch zvyškoch FR2 úseku: P46L a W47L.
Aby sa určili individuálne príspevky každej z týchto dvoch zámen, skonštruovali sa nové expresné vektory ľahkého reťazca c2. Plazmid pAND125, L47W variant ľahkého reťazca c2, sa vytvoril s použitím pANDl 19 ako templátu s nasledujúcim mutagénnym primérom:
FR2 primér 5' GGG A GCA CCC A CTC TGG ATC TAT CTC ACA TCC AAC 3' (SEQ ID NO: 36), ktorý vniesol Hhal a HaelI miesta. Plazmid pAND 126, L46P variant ľahkého reťazca c2, sa vytvoril s použitím pANDl 19 ako templátu s nasledujúcim mutagénnym primérom:
FR2 primér 5' AAG CCC GGG AAG GCG CCC A CCC CTG ATT TAT CTC ACA TCC AAC 3’ (SEQ ID NO: 37), ktorý vniesol miesta BsaHI, Bani a Narl. Expresné vektory pre nové ľahké reťazce huAQC2 sa vytvorili subklonovaním Notl-Bglll fragmentu variabilnej domény ľahkého reťazca s veľkosťou 0,44 kb z pAND125 alebo pAND126 a BcII-NotI fragmentu s veľkosťou 0,68 kb z pEAG963 (pozri skôr) do Nôti miesta pCH269 (pozri skôr). Takto vzniknuté plazmidy sa nazvali pAND132 (c2 s L47W) a pAND133 (c2 s L46P), v danom poradí.
Uskutočnila sa kotransfekcia plazmidov s novým ľahkým reťazcom s každým z plazmidov ťažkého reťazca huAQC2. VLA-1 väzba sa vyšetrovala s použitím FACS. Dáta ukazujú, že spätná mutácia L47W nedokázala zlepšiť väzbu. L46P mutácia zlepšila vrchol väzbovej krivky, ale hodnota EC50 sa posunula ešte viac doprava vzhľadom na správanie huAQC2 verzie 1 (pozri tabuľka 2). Tieto výsledky vedú k názoru, že obidve spätné mutácie boli potrebné pre plnú väzbovú aktivitu.
Geneticky neblokovaný ľahký reťazec cl sa tiež vytvoril, pretože Q1D variant by bol o jeden zvyšok viac „humanizovaný“. Q1D mutant, označený pAND148, sa vytvoril s templátom pANDl 18 s nasledujúcim mutagénnym primérom:
FR1 primér 5' GTC ATA ATG TCC CGG GGA GAT ATC CAG CTC ACC CAG TCT 3' (SEQ ID NO: 38), ktorý zaviedol nové EcoRI miesto a odstránil Apol miesto. Expresný vektor pre tento posledný variant ľahkého reťazca huAQC2 sa vytvoril subklonovaním Notl-BglII fragmentu variabilnej domény ľahkého reťazca s veľkosťou 0,44 kb z pAND148 a BcII-NotI fragmentu s veľkosťou 0,68 kb z pEAG963 do Nôti miesta v pCH269, čím sa pripravil expresný vektor ľahkého reťazca pANDl50 (cl s neblokovaným N-koncom Q1D). Koexpresia geneticky neblokovaného ľahkého reťazca s ťažkým reťazcom c2 (t. j. „huAQC2 LC cl neblokovaný/HC c2“, označený huAQC2-c4) bola ekvivalentná s „huAQC2 LC cl/HC c2“ (označený huAQC2-c3). VLA-1 väzba sa potvrdila pomocou FACS na VLA1-exprimujúcich bunkách K562al (tabuľka 2).
Kotransfekcie buniek 293-EBNA chAQC2 a huAQC2-hl,- h2, -cl, -c2, -c3 a -c4. Protilátky v kondicionovanom médiu sa purifikovali na proteín-A-sepharose a purifikované mAb sa testovali na aktivitu (obr. 17 a 18). HuAQC2-c3 sa vybrala ako kandidátne liečivo, pretože jej vlastnosti boli podobnejšie chAQC2. Potom sa navrhli vektory pre stabilnú expresiu huAQC2-c3 v CHO bunkách. Vektory obsahovali cDNA pre huAQC2 cl LC alebo c2 HC, s deletovanými úsekmi 5' a 3' UTR vylúčeným a geneticky deletovaným C-koncovým lyzínom ťažkého reťazca, aby sa zaistila homogenita produktu. Výsledné vektory boli pAND162 (ľahký reťazec) a pANDl60 (ťažký reťazec). Ako sa v tomto texte používa, huAQC2-c3 sa tiež nazýva hAQC2.
Úplná polypeptidová sekvencia hAQC2 je nasledujúca:
Ľahký reťazec (Plazmid: pANDl62)
QIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASSSVN HMFWYQQKPG KAPKPWIYLT
SNLASGVPSR FSGSGSGTDY TLTISSLQPE DFATYYCQQW SGNPWTFGQG
101 TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD
151 NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL
201 SSPVTKSFNR GEC (SEQ ID NO: 3)
Ťažký reťazec (Plazmid: pANDl 60)
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYTMSWVRQA PGKGLEWVAT
ISGGGHTYYL DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCTRGFG
101 DGGYFDVWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI
201 CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKP
251 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
301 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
351 TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH ÉALHNHYTQK SLSLSPG (SEQ ID NO: 4)
Ďalšie polypeptidy ťažkého a ľahkého reťazca a nukleotidové sekvencie sú uvedené neskôr.
A. Ťažký reťazec chAQC2 (Pand099) (SEQ ID NO: 39 a 40. Prvé číslo označuje nukleotidovú sekvenciu a druhé číslo polypeptidovú sekvenciu. Rovnaké poradie sa použije aj v nasledujúcom číslovaní).
GACGTCAAGGTGGTGGAGTCAGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTC
DVKVVESGGGLVKPGGSLKL
GCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTCAGTAGATATACTATGTCTTGGGTTCGCCAGATT ACAASGFS FSRYTMSWVRQI
SK 288124 Β6
121
CCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGTGGTGGTCACACCTACTATCTA
PEKRLEWVATISGGGHTYYL
181
GACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTG
DSVKGRFTISRDNAKNTLYL
241
CAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTACAAGAGGTTTTGGA
QMSSLRSEDTAMYYCTRGFG
301
GACGGGGGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
DGGYFDVWGQGTTVTVSS
B. chAQC2HChl acl (Pandl 14) (SEQ IDNO:41 a42)
GACGTCCAGCTGGTCGAGTCAGGGGGAGGCTTAGTCCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTC
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLRL
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTCAGTAGATATACTATGTCTTGGGTTCGCCAGGCT
SCAASGFSFSRYTMSWVRQA
121
CCGGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGTGGTGGTCACACCTACTATCTA
PGKGLEWVATISGGGHTYYL
181
GACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTACCTG
DSVKGRFTISRDNSKNTLYL
241
CAGATGAACAGTCTGAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTACAAGAGGTTTTGGA
QMNSLRAEDTAVYYCTRGFG
301
GACGGGGGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
DGGYFDVWGQGTLVTVSS
C. chAQC2 ťažký reťazec h2 (pAND124) (SEQ ID NO: 43 a 44)
GAGGTCCAGCTGGTCGAGTCAGGGGGAGGCTTAATCCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTC
EVQLVESGGGLIQPGGSLRL
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGGTATACTATGTCTTGGGTTCGCCAGGCT
SCAASGFTFSRYTMSWVRQA
121
CCGGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGTGGTGGTCACACCTACTATCTA
PGKGLEWVATISGGGHTYYL
181
GACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTACCTG
DSVKGRFTISRDNSKNTLYL
241
SK 288124 Β6
CAGATGAACAGTCTGAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTACAAGAGGTTTTGGA
QMNSLRAEDTAVYYCTRGFG
301
GACGGGGGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGG
DGGYFDVWGQGTLVTVSS
D. chAQC2 ťažký reťazec c2 (pAND121) (SEQ ID NO: 45 a 69)
GAGGTCCAGCTGGTCGAGTCAGGGGGAGGCTTAGTCCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTC
EVQLVESGGGLVQPGGSLRL
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGGTATACTATGTCTTGGGTTCGCCAGGCT
SCAASGFTFSRYTMSWVRQA
121
CCGGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGTGGTGGTCACACCTACTATCTA
PGKGLEWVATISGGGHTYYL
181
GACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTACCTG
DSVKGRFTISRDNSKNTLYL
241
CAGATGAACAGTCTGAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTACAAGAGGTTTTGGA
QMNSLRAEDTAVYYCTRGFG
301
GACGGGGGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGG
PGGYFDVWGQGTLVTVSS
E. chAQC2 blokovaný ľahký reťazec (Pandl02) (SEQ ID NO: 46 A 47)
CAAATTGTTCTCACCCAGTTTCCAGCACTCATGTCTGCGTCTCCAGGGGAGAAGGTCACC
QIVLTQFPALMSASPGEKVT
ATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCAAAA
MTCSASSSVNHMFWYQQKPK
121
TCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGC
SSPKPWIYLTSNLASGVPAR
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAA
FSGSGSGTSYSLTISSMEAE
241
GATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTGGAGGC
DAATYYCQQWSGNPWTFGGG
301 CCAAGCTGGAGATCAAA K L E I K
F. hAQC2 ľahký reťazec hl (pANDl 17) (SEQ ID NO: 48 A 49)
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCGTCTGTAGGGGACAGAGTCACC
QIVLTQSPSSLSASVGDRVT
ATCACATGCAGTGCEAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGG
ITCSASSSVNHMFWYQQKPG
121
AAAGCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCACGC
KAPKPWIYLTSNLASGVPSR
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAACCTGAA
FSGSGSGTDYTLTISSLQPE
241
GATTTTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTGGAGGC
DFATYYCQQWSGNPWTFGGG
301
ACTAAGGTGGAGATCAAA T K V E I K
G. hAQC2 ľahký reťazec h2 (pAND120) (SEQ ID NO: 50 A 51)
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCGTCTGTAGGGGACAGAGTCACC
QIVLTQSPSSLSASVGDRVT
ATCACATGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGG
ITCSASSSVNHMFWYQQKPG
121
AAAGCGCCCAAACTCCTGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCACGC
KAPKLLIYLTSNLASGVPSR
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAACCTGAA
FSGSGSGTDYTLTISSLQPE
241
GATTTTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTGGAGGC
DFATYYCQQWSGNPWTFGGG
301
ACTAAGGTGGAGATCAAAT T K V E I K
H. hAQC2 ľahký reťazec cl (pAND122) (SEQ ID NO: 52 A 66)
CAAATTCAGCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCGTCTGTÄGGGGACAGAGTCACC
QIQLTQSPSSLSASVGDRVT
ATCACATGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGG
ITCSASSSVNHMFWYQQKPG
SK 288124 Β6
121
AAAGCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCACGC
KAPKPWIYLTSNLASGVPSR
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAACCTGAA
FSGSGSGTDYTLTISSLQPE
241
GATTTTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTCAGGGC
DFATYYCQQWSGNPWTFGQG
301
ACTAAGGTGGAGATCAAA T K V E I K
I. hAQC2 ľahký reťazec c2 (pAND123) (SEQ ID NO: 53 A 54)
CAAATTCAGCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCGTCTGTAGGGGACAGAGTCACC
QIQLTQSPSSLSASVGDRVT
ATCACATGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACAŤGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGG
ITCSASSSVNHMFWYQQKPG
121
AAAGCGCCCAAACTCCTGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCACGC
KAPKLLIYLTSNLASGVPSR
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAACCTGAA
FSGSGSGTDYTLTISSLQPE
241
GATTTTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTCAGGGC
DFATYYCQQWSGNPWTFGQG
301
ACTAAGGTGGAGATCAAA T K V E I K
J. chAQC2 neblokovaný ľahký reťazec (pAND098) (SEQ ID NO: 55 a 56)
GAAATTGTTCTCACCCAGTTTCCAGCACTCATGTCTGCGTCTCCAGGGGAGAAGGTCACC
EIVLTQFPALMSASPGEKVT
ATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCAAAA
MTCSASSSVNHMFWYQQKPK
121
TCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGC
SSPKPWIYTSNLASGVPAR
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAA
FSGSGSGTSYSLTISSMEAE
SK 288124 Β6
241
GATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTGGAGGC
DAATYYCQQWSGNPWTFGGG
301 ACCAAGCTGGAGATCAAA T K L E I K
K. huAQC2 neblokovaný ľahký reťazec cl (pAND150) (SEQ ID NO: 57 a 58)
GATATCCAGCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCGTCTGTAGGGGACAGAGTCACC
DIQLTQSPSSLSASVGDRVT
ATCACATGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGG
ITCSASSSVNHMFWYQQKPG
121
AAAGCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCACGC
KAPKPWIYLTSNLASGVPSR
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAACCTGAA
FSGSGSGTDYTLTISSLQPE
241
GATTTTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTCAGGGC
DFATYYCQQWSGNPWTFGQG
301
ACTAAGGTGGAGATCAAA
T K V E I K
Príklad 22
Tento príklad opisuje charakterizáciu rôznych AQC2 protilátok podľa vynálezu.
Test väzby al I domény na pevnej fáze μΐ fuzneho proteínu „al I doména-GST“ s koncentráciou 10 pg/ml sa nanieslo na polystyrénové 96-jamkové doštičky CORNING COSTAR EASY WASH (Gotwals et al., Biochemistry, 38, 8280-8, 1999). Po inkubácii 16 hodín pri 4 °C sa doštičky premyli štyrikrát s 350 pl 0,1 % Tween-20 v PBS v premývačke doštičiek. Doštička sa blokovala nanesením 180 pl 3 % BSA v TBS a inkubáciou 60 minút pri 25 °C, a potom sa premyla ako vyššie. Riedenie protilátok (50 pl/jamka) v TBS obsahujúcom 1 mg/ml BSA (testový pufer) sa pripravila na 96-jamkových doštičkách s guľatým dnom, preniesla na doštičku potiahnutú al I doménou a inkubovala 60 minút pri 25 °C. Po poslednom premytí sa pridalo 100 pl/jamka TMB činidla (Pierce). Po 10 minútach sa pridalo 100 pl IM kyseliny sírovej a odrátala sa absorbancia pri 450 nm na UV-VIS spektrofotometri pre 96-jamkové doštičky.
Elektrochemiluminescenčné testy na väzbu αϊβί integrínu alebo al I domény ku kolagénu.
Tosyl-aktivované perličky DYNABEADS M-280 (Dynal, Inc.) sa potiahli kolagénom typu IV (Sigma) s koncentráciou 100 pg/ml podľa inštrukcií výrobcu. Bunkové lyzáty z αΐ-transfekovaných buniek K562 sa pripravili nasledujúcim spôsobom: Bunky sa zozbierali centrifugáciou, resuspendovali do koncentrácie 108 buniek/ml v iyzačnom pufri obsahujúcom 25mM Tris, pH 7,4, 1 % NP-40, lmM CaCI2, lmM MnCl2, lmM MgCl2, 2 % BSA a lmM PMSF, a inkubovali sa pri 4 °C 60 minút. Bunkové zvyšky (debris) sa odstránili centrifugáciou pri 12,000 rpm 30 minút a vzniknutý supematant sa použil v nasledujúcom experimente. Anti-βΐ aktivujúca protilátka TS2/16 a polyklonálna anti-GST protilátka (Pharmacia) sa označili s TAG-NHS esterom (IGEN International Inc., Gaithersburg, MD) podľa inštrukcie výrobcu. Označené protilátky sa purifikovali gélovou filtračnou chromatografiou na SEPHADEX G25M (Pharmacia).
Na uskutočnenie väzbového testu sa perličky potiahli kolagénom (1 mg/ml) a blokovali sa 5 minút 8 % plazmou laboratórneho potkana kmeňa Lewis v testovacom pufri obsahujúcom 50mM HEPES, pH 7,5, 150mM NaCl a 0,1 % Tritón X-100. Na väzbový test αϊβί sa sériové riedenie protilátok inkubovalo s 10 pg perličiek, bunkovým lyzátom pripraveným z 105 αΐ-transfekovaných buniek K.562 (pozri skôr) a 0,1 g/ml TAG-TS2/16 v testovacom pufri obsahujúcom lmM MnCl2. Na väzbový test al I domény sa protilátky in42 kubovali s 10 pg perličiek, 0,1 g/ml fuzneho proteínu al I doména-GST a 1 pg/ml TAG-anti-GST v testovacom pufŕi obsahujúcom lmM MnCl2. Po jednej až dvoch hodinách trepania pri teplote miestnosti sa pridalo 200 pl testovacieho pufra a vzorky sa odrátali na detektore elektrochemiluminescencie ORIGEN1.5 (IGEN). Grafy výsledkov sú prezentované s uvedením arbitrárnych jednotiek elektrochemiluminescencie (ECL) na osi x.
Kompetičný test s biotinylovaným mAQC2
96-jamková doštička sa potiahla s 50 pl fuzneho proteínu al I doména-GST a blokovala s 3 % BSA v TBS, ak už bolo opísané skôr. Riedenie protilátok (60 pl/jamka) v testovacom pufŕi sa pripravilo na 96-jamkových doštičkách s guľatým dnom a 60 pl biotinylovanej myšacej AQC2 riedenej na 0,1 pg/ml v testovacom pufŕi sa pridalo, 50 pl z každej jamky sa prenieslo na potiahnutú doštičku a inkubovalo 3 hodiny pri 25 °C. Doštička sa potom premyla, ako bolo uvedené skôr, a pridalo sa 50 pl EXTRA VIDINU konjugovaného s peroxidázou (Sigma) s koncentráciou 1 g/ml a doštička sa inkubovala ďalšie 2 hodiny pri 25 °C. Po poslednom premytí sa pridalo TMB činidlo (Pierce) 100 pl/jamka. Po 10 minútach sa pridalo 100 pl IM kyseliny sírovej a odrátala sa absorbancia pri 450 nm na UV-Vis spektrofotometri pre 96 jamkové doštičky. Experimentálne výsledky
Experimentálne výsledky sú uvedené na obr. 16A-D a v tabuľke 3. Určila sa schopnosť mAQC2, chAQC2, hAQC2 a hAQC2' (t. j. huAQC2-c4, líšiaca sa od hAQC2 iba v tom, že zvyšok 1 ľahkého reťazca hAQC2' je D miesto Q) (1) viazať sa na K562 bunky transfekované ľudským al (pomocou FACS), (2) viazať sa na imobilizovanú al-I doménu (pomocou ELISA), (3) súťažiť s mAQC2 o väzbu k al-I doméne (pomocou ELISA), (4) blokovať väzbu α-I domény ku kolagénu (pomocou elektrochemiluminescenčného testu) alebo (5) blokovať väzbu integrínu al β 1 ku kolagénu (pomocou elektrochemiluminescenčného testu). Výsledky sú ukázané na obr. 16A-D a vyrátané hodnoty IC50 (pre inhibíciu) alebo EC50 (pre väzbu) sú uvedené v tabuľke 3. V každom teste každá z foriem humanizovanej AQC2 prejavila podobnú schopnosť viazať buď VLA1 (alebo al doménu), alebo blokovať väzbu ku kolagénu (je treba upozorniť, že na paneli C pozorované rozdiely v intenzite medzi mAQC2 a humanizovanými formami pochádzajú z toho, že sa použila sekundárna protilátka anti-myšacia-IgG namiesto anti-ľudskej-IgG).
Tabuľka 3
Zhrnutie výsledkov testov (všetky hodnoty uvedené v nM)
Protilátka FACS (EC50) VLA1 Inhibícia (IC50) all Inhibícia (IC50) ELISA (EC50) Kompetícia s biotin-AQC2 (IC50)
mAQC2 neurčené 0,0726 (±0,014) 0, 029(+0,011) 0,061 (±0,015) 38 (±8,7)
Chiméra 0,25 0,071 (±0,002) 0, 027 (±0,007) 0, 176 (±0,058) 30 (±6,9)
hAQC2 0,29 0,129(+0,005) 0,035 (±0,005) 0,190(+0,010) 65 (±2,2)
hAQC2' 0,43 0,125(+0,018) 0,037(+0,001) 0,313 (±0,072) 69 (±25,7)
Pôvodcovia ďalej testovali, či zmeny určitých konzervatívnych zvyškov v úsekoch CDR môžu zachovávať VLA-1 väzbovú aktivitu hAQC2. DNA konštrukty kódujúce varianty hAQC2 s nasledujúcimi mutáciami sa vytvorili miestne cielenou mutagenézou: (1) G55S v CDR2 ťažkého reťazca, (2) S24N v CDR1 ľahkého reťazca (vnesenie obsadeného miesta N-viazanej glykozylácie), (3) G92S v CDR3 ľahkého reťazca, (4) kombinácie (1) a (2), a (5) kombinácie (1) a (3). DNA konštrukty kódujúce tak ťažký ako aj ľahký reťazec sa potom kotransfekovali do buniek 293-EBNA a kondicionované médiá z transfektantu sa testovali na expresiu protilátky s použitím analýzy Western blot a ELISA. Výsledky ukázali, že hAQC2 varianty sa exprimovali rovnako účinne ako príbuzný hAQC2. FACS analýza s použitím VLA-1-exprimujúcich buniek K562 ďalej ukázala, že VLA-1-väzbové aktivity týchto variantov boli podobné samotnej hAQC2. Môže sa teda zhrnúť, že substitúcia aminokyselín nezmenila VLA-1 väzbovú aktivitu hAQC2. A naozaj, rôntgenoštruktúme analýzy kryštálov RAH/HAQC2 Fab komplexu (pozri skôr) ukázali, že S24 a G92 ľahkého reťazca a G55 ťažkého reťazca nie sú lokalizované vo väzbovom vrecku, ktorá je v kontakte s al-I doménou.
Príklad 23
Efektorové funkcie imunoglobulínu spájajú imunoglobulínovú antigén-väzbovú aktivitu so zápalovou, cytotoxickou a stimulačnou vetvou imunitného systému. Efektorové funkcie môžu narušiť bezpečnosť a účinnosť imunoglobulínového terapeutického produktu. Aby sa obmedzili potenciálne efektorové funkcie hAQC2, vytvorili sa mutácie L234A a L235A na ťažkom reťazci tejto protilátky, čím sa pripravila hsAQC2. Z rovnakého dôvodu sa vytvorila jednoduchá mutácia N297Q v ťažkom reťazci hAQC2, čím sa pripravila neglykozylovaná forma hAQC2, nazvaná haAQC2.
Môžu sa uskutočniť štúdie porovnávajúce ich účinnosť, reziduálne efektorové funkcie, stabilitu a imuno43
SK 288124 Β6 genicitu vzhľadom na hAQC2. Pokiaľ sa inak neuvádza, pozičné čísla aminokyselinových zvyškov v konštantných úsekoch použité v tomto texte sú v súlade s EU konvenciou číslovania.
Polypeptidová sekvencia ťažkého reťazca haAQC2 je nasledujúca (plazmid: pANDlól):
EVQLVESGGG 51 ISGGGHTYYL 101 DGGYFDVWGQ 151 FPEPVTVSWN 201 CNVNHKPSNT 251 TLMISRTPEV 301 YRVVSVLTVL 351 TLPPSRDELT 401 SDGSFFLYSK (SEQ ID NO: 5)
LVQPGGSLRL
DSVKGRFTIS
GTLVTVSSAS
SGALTSGVHT
KVDKKVEPKS
TCVVVDVSHE
HQDWLNGKEY
KNQVSLTCLV
LTVDKSRWQQ
SCAASGFTFS
RDNSKNTLYL
TKGPSVFPLA
FPAVLQSSGL
CDKTHTCPPC
DPEVKFNWYV
KCKVSNKALP
KGFYPSDIAV
GNVFSCSVMH
RYTMSWVRQA
QMNSLRAEDT
PSSKSTSGGT
YSLSSVVTVP
PAPELLGGPS
DGVEVHNAKT
APIEKTISKA
EWESNGQPEN
EALHNHYTQK
PGKGLEWVAT
AVYYCTRGFG
AALGCLVKDY
SSSLGTQTYI
VFLFPPKPKD
KPREEQYQST
KGQPREPQVY
NYKTTPPVLD
SLSLSPG
Polypeptidová sekvencia ťažkého reťazca hsAQC2 je nasledujúca (plazmid: pAND171):
EVQLVESGGG 51 ISGGGHTYYL 101 DGGYFDVWGQ 151 FPEPVTVSWN 201 CNVNHKPSNT 251 TLMISRTPEV 301 YRVVSVLTVL 351 TLPPSRDELT 401 SDGSFFLYSK (SEQ ID NO: 6)
LVQPGGSLRL
DSVKGRFTIS
GTLVTVSSAS
SGALTSGVHT
KVDKKVEPKS
TCVVVDVSHE
HQDWLNGKEY
KNQVSLTCLV
LTVDKSRWQQ
SCAASGFTFS
RDNSKNTLYL
TKGPSVFPLA
FPAVLQSSGL
CDKTHTCPPC
DPEVKFNWYV
KCKVSNKALP
KGFYPSDIAV
GNVFSCSVMH
RYTMSWVRQA
QMNSLRAEDT
PSSKSTSGGT
YSLSSVVTVP
PAPEAAGGPS
DGVEVHNAKT
APIEKTISKA
EWESNGQPEN
EALHNHYTQK
PGKGLEWVAT
AVYYGTRGFG
AALGCLVKDY
SSSLGTQTYI
VFLFPPKPKD
KPREEQYNST
KGQPREPQVY
NYKTTPPVLD
SLSLSPG
Príklad 24
Tento príklad opisuje spôsob určenia kryštálovej štruktúry komplexu chimémej „potkanej/ľudskej“ al-I domény al integrínu a Fab fragmentu hAQC2.
Príprava proteínového komplexu
Fab fragment hAQC2 sa pripravil z protilátky hAQC2 s použitím pozmeneného postupu podľa súpravy IMUNOPURE ® Fab Preparation Kit (katalóg, č. 44885, Pierce, Rockford, IL). Intaktná hAQC2 protilátka sa koncentrovala na 12 mg/ml v pufri obsahujúcom 20mM fosfát, lOmM EDTA a 25mM cystein (pH 7,0). Imobilizovaný papaín sa pridal v pomere enzým k substrátu 1 : 50 a štiepenie prebiehalo cez noc pri 37 °C. Imobilizovaný papaín sa odstránil a surový naštiepený materiál sa dialyzoval proti pufru 20mM octanu sodného (pH 4,5). Fab fragment sa separoval od reziduálnej intaktnej protilátky, dimémeho Fab fragmentu a Fc fragmentu katiónovou výmennou chromatografiou s použitím S-kolóny (Poros HS/M, PERSEPTIVE Biosystems, katalóg, č. P042M26) s postupným soľným gradientom. Fab fragment sa potom dialyzoval do 0,1 M Hepes pufra (pH 8,0).
Chiméma al-I doména, ktorá sa použila v predkladanom vynáleze, je konštrukt chimémej potkanej/ľudskej I domény (mutant RAH) obsahujúci zvyšky Thrl45 až Phe336 z reťazca al integrínu laboratórneho potkana, kde zvyšky Gly217, Arg218, Gln219 a Leu222 (kryštálové číslovanie) sa nahradili zodpovedajúcimi ľudskými zvyškami Val, Gin, Arg a Arg, v uvedenom poradí, aby sa obnovila väzba protilátky, aminokyselinové sekvencie chimémej RAH, al-I domény laboratórneho potkana a ľudskej al-I domény sú uvedené v SEQ ID NO: 59, 60 a 61, v danom poradí. Rekombinantná al-I doména sa exprimovala v E. coli ako GST-fúzny proteín. RAH al-I doména sa štiepila trombínom a purifikovala z klonu Pichiapastoris, ako bolo opísané skôr (Gotwals et al., 1999, Biochemistry 38: 8280 - 8288).
145 TQLDIV 151 IVLDGSNSIY 191 GENVTHEFNL 231 DTARKEAFTE 271 QDCEDENTQR 311 TEKHFFNVSD (SEQ ID NO: 59) 145 TQLDIV 151 IVLDGSNSIY 191 GENVTHEFNL
PWESVIAFLN
NKYSSTEEVL
ARGARRGVKK
FSIAILGHYN
ELALVTIVKA
DLLKRMDIGP
VAANKIVQRG
VMVIVTDGES
RGNLSTEKFV
LGERIF
KQTQVGIVQY
GRQTMTALGI
HDNYRLKQVI
EEIKSIASEP
PWESVIAFLN
NKYSSTEEVL
DLLKRMDIGP
VAANKIGRQG
KQTQVGIVQY
GLQTMTALGI
SK 288124 Β6
231 DTARKEAFTE ARGARRGVKK VMVIVTDGES HDNYRLKQVI
271 QDCEDENIQR FSIAILGHYN RGNLSTEKFV EEIKSIASEP
311 TEKHFFNVSD ELALVTIVKA LGERIF (SEQ ID NO: 60)
145 TQLDIV
151 IVLDGSNSIY PWDSVTAFLN DLLKRMDIGP KQTQVGIVQY
191 GENVTHEFNL NKYSSTEEVL VAAKKIVQRG GRQTMTALGI
231 DTARKEAFTE ARGARRGVKK VMVIVTDGES HDNHRLKKVI
271 QDCEDENIQR FSIAILGSYN RGNLSTEKFV EEIKSIASEP
311 TEKHFFNVSD EIALVTIVKT LGERIF (SEQ ID NO: 61)
Fab fragment hAQC2 sa zmiešal s nadbytkom chimémej al-I domény a inkuboval 15 minút pri 37 °C. Saturované al/Fab komplexy sa oddelili od al-I domény nezahrnutej v komplexoch vylučovacou chromatografiou s použitím kolóny S200 Sephacryl (Pharmacia, Gibco). Komplex sa ďalej koncentroval na 11 mg/ml v pufri obsahujúcom 20mM Tris (pH7,4), 150mM NaCl, lmM MnCl2, 5mM β-merkaptoetanol.
Príprava kryštálov
Kryštalizačné podmienky sa zistili s použitím súpravy CRYSTAL SCREEN™ KITs od firmy Hampton Research (Lagúna Niguel, CA). Kryštály opísaného komplexu sa pestovali v 20 μΐ metódou difúzie pár s použitím rovnakého množstva roztoku proteínového komplexu a 20 - 30 % roztoku PEG 1500.
Typicky 2 μΐ proteínového komplexu sa pridalo k 2 μΐ jamkového roztoku, čím sa získali kvapky s objemom 4 μΐ. Kryštály rástli dva až sedem dní ako šesťuholníkové prúty s rozmermi 0,8 x 0,05 x 0,05 mm3. Prítomnosť z al-I domény a hAQC2 Fab fragmentu sa potvrdili SDS-PAGE analýzou rozpustených kryštálov. Aby sa zredukovalo nevyhnutné poškodenie žiarením v priebehu zberu dát, dáta difrakcie rôntgenového žiarenia sa merali približne pri 100 K. Na prípravu kryštálov na zber dát pri takejto nízkej teplote sa kryštály postupne ekvilibrovali s kryoprotektívnym roztokom obsahujúcim 25 % PEG 400 a 30 % PEG 1500 a veľmi rýchlo ochladili v kvapalnom dusíku.
Určenie štruktúry
Natívne dáta rôntgenovej difrakcie pri rozlíšení 2,8 Á sa získali z jediného kryštálu približne pri 100 K pomocou nabitého spriahnutého detektora ADSC Quantum 4 v dráhe lúča X4A synchrotrónu v National Synchrotron Light Source (NSLS) Brookhaven National Laboratory (BNL). Dáta sa spracovali s použitím počítačových programov DENZO a SCALEPACK (Otwinowski & Minor, 1997, Methods in Enzymol. 276: 307 - 326). Kryštály patrili do priestorovej skupiny P6! alebo jej enantiomorfú P65, s rozmermi jednotkovej bunky a = b = 255,09 Á, c = 38, 64 Á. Súbor dát bol na 96,6 % kompletný a mal hodnotu „R-merge“ 8,3 %. Matthewsov koeficient (Matthews, 1968, J. Mol. Biol. 33: 491 - 497) bol 2,59 Á3 Da'1 s obsahom rozpúšťadla 52,1 %, čo ukazovalo, že ide o dva komplexy v asymetrickej jednotke. Tieto dva komplexy v asymetrickej jednotke boli vo vzťahu nekryštalografickej dvojitej symetrie. Štatistika údajov je uvedená v tabuľke 4.
Vyhľadávanie molekulárnych náhrad sa uskutočňovalo s programom AMoRe (Navaza, 1994, Acta Cýst. A50: 157 - 163) z programového balíka CCP4 (Collaborative Computational Project No. 4. The CCP4 Suite: Programs for proteín Crystalography. 1994, Acta Cryst. D50: 760 - 763) a molekulárne grafické manipulácie sa uskutočňovali pomocou programu QUANTA. Jediná al-I doména zo štruktúry al-I domény z αϊβΐ integrínu laboratórneho potkana (Proteín Data bank (PDB) prístupové číslo lck4, Nolte et al., 1999, FEBS Lett. 452: 379 - 385) sa použila ako model alebo sonda na rotačné a translačné vyhľadávanie. Vyhľadávanie translačnej funkcie ukázalo, že 1. a 9. najvyššie vrcholy rotačnej funkcie zodpovedali správnemu riešeniu pre dve al-I domény v asymetrickej jednotke (korelačný koeficient (cc) = 21,1 %, R = 53,1 %), a že priestorová skupina bola P65. Následne sa uskutočnilo vyhľadávanie pre hAQC2 Fab fragmenty, pričom sa zachovalo riešenie pre I doménu a použil sa model Fv domény z hAQC2 Fab ako vyhľadávacia sonda. Jasné riešenie sa našlo pre jednu z dvoch Fv domén (cc = 22,1 %, R =52,6 %), ale druhá Fv nemohla byť lokalizovaná. Poloha druhej Fv sa určila pomocou nekryštalografickej dvojitej symetrie. Upresnenie tuhých telies dvoch I domén a dvoch Fv domén redukovalo R-faktor na 43,6 % (R-fŕee = 42,7 %). Mapa elektrónovej hustoty 2Fo-Fc ukázala jasnú elektrónovú hustotu pre konštantnú doménu (Fconst) prvého Fab fragmentu, ale žiadnu hustotu pre Fconst doménu druhého Fab fragmentu. Model Fconst domény prvého Fab sa ručne „napasoval“ na pozorovanú elektrónovú hustotu. Po spresnení tuhého telesa pomocou programu programom CNX (Accelrys Inc., San Diego, CAt) 2000, Brunger, 1998, Acta Cryst. D54: 905 - 921), s použitím dát s rozlíšením 500 - 2,8 Á optimalizácie, poloha všetkých domén znížila R-faktor na 39,7 % (R-fŕee = 38,9 %).
Všetky ďalšie upresňovacie kroky sa uskutočňovali programom CNX. Na redukciu neistotu modelu sa použili parciálne modely pre výpočty 2Fo-Fc mapy a upresňovanie modelu. Východiskový parciálny model sa podrobil simulovanému nasadnutiu a zoskupenému B-faktorovému upresneniu s obmedzením nekryštalografickej symetrie. Faktory „R-working“ a „R-fŕee“ sa znížili na 28,3 % a 32,9 %, v danom poradí. Nasledo45
SK 288124 Β6 valo niekoľko cyklov pozostávajúcich z iteračnej výstavby modelu, pozičného upresnenia s maximálnou pravdepodobnosťou a upresnením B-faktora. Prijali sa iba upresnenia modelu, ktoré spôsobili pokles faktora R-free. Po vybudovaní kompletného modelu sa použila oprava na rozpúšťadlo. Faktory R-working a R-free konečného modelu sú 21,3 % a 27,2 %, v danom poradí pre dáta (F > 2σ) pri rozlíšení 500 - 2,8 Á.
Výsledná mapa elektrónovej hustoty 2Fo-Fc je dobrej kvality pre väčšinu komplexu s výnimkou aminokyselinových zvyškov 288 až 295 z jedného fragmentu I domény (molekula A na obr. 19), ktoré sú spojené so slabou elektrónovou hustotou a neboli zahrnuté v modeli. Okrem toho, celá konštantná doména jedného Fab fragmentu nemá žiadnu viditeľnú elektrónovú hustotu, čo ukazuje, že ide o poruchu. To je zrejme dôsledok neprítomnosti kryštálových kontaktov pre konštantnú doménu Fab fragmentu spôsobenú jej polohou vo veľkom kanáli rozpúšťadlového kanála. Táto doména tiež nebola zahrnutá v konečnom modeli, ktorý sa skladá z 1030 aminokyselinových zvyškov, vytvárajúcich 6 polypeptidových reťazcov, a 2 mangánových iónov. Hodnota r. m. s. odchýlky polôh medzi rovnocennými zvyškami v komplexov v asymetrickej jednotke je malá (0,37 Á pre 1660 ekvivalentných atómov hlavného reťazca).
Stereochemické štatistické hodnoty sa vyrátali programami PROCHECK (Laskowski et al., 1993, J. Appl. Cryst. 26: 283 - 291, Morris et al., 1992, Proteins 12: 345 - 364) a CNX. Vodíkové väzby (< 3,6 Á) sa zistili programom CONTACT (Tadeusz Skarzynski, Imperiál College, London, 1.12.88, Collaborative Computational Project 4. CCP4 Suite: Programs for Protein Crystalography. 1994, Acta Cryst. D50, 760 - 763). Všetky zvyšky iné ako glycín (okrem zvyšku Thr50 v L reťazci, ktorý bude ešte diskutovaný ďalej) sú v povolenom úseku Ramachandranovho diagramu a 86 % zvyškov leží v najvýhodnejších úsekoch. Priemerný B-faktor atómov hlavného reťazca je 38,5 Á2. Dáta z kryštalografickej analýzy sú uvedené v tabuľke 4.
Tabuľka 4
Zhrnutie štatistických údajov Zber dát
Rozmery bunky, a, b, c (Á) Priestorová skupina Rozlíšenie (Á)
Unikátne odrazy Úplnosť (%)
Priemer I/s R-merge* (%) a kryštalografickej analýzy
255,09, 255,09, 38,64 P65
500 - 2,8 (2,9 - 2,8)+
35275
96,6 (87,7)+
11,92 (2,29)+
8,3 (30,9)+
Model
Počet atómov iných ako H Počet proteín. zvyškov Obsah asymetrickej jednotky Priemerný B-faktor (Á2) Spresňovanie
Použitý rozsah rozlíšenia(F > 2σ) R-faktor (R-working) (%) R-free++ (%)
Stereochémia
RMS odchýlky dĺžky väzieb (Á)
Uhly (°)
7950
1030 domény I, 1 fragment Fab, 1 doména Fv 38,5
500 - 2,8
21,3
27,2
0,007
1,43 * Rmerge = ĽhĽj|Ihi - Ih|/Shi Ihi + Hodnoty pre obal pri najvyššom rozlíšení sú uvedené v zátvorke. ++ 8 % dát sa pridelilo pre výpočet faktora R-free.
Príklad 25
Tento príklad opisuje kryštálovú štruktúru komplexu chimémej potkanej/ľudskej al-I domény αϊβΐ integrínu a Fab fragmentu hAQC2.
Architektúra kryštálu
Kryštálová štruktúra komplexu chimémej potkanej/ľudskej al-I domény αϊβΐ integrínu a Fab fragmentu hAQC2 má pretiahnutý tvar (pozri obr. 20). Rozmery komplexu sú 100 Á x 50 Á x 35 Á.
Fab fragment prejavuje zvinutie molekuly typické pre imunoglobulíny. Ľahký reťazec a ťažký reťazce
SK 288124 Β6
Fab fragmentu vytvárajú dva široké listy antiparalelných β reťazcov, ktoré sú vzájomne tesne zbalené a vytvárajú tak kostru pre slučky úsekov určujúcich komplementaritu (CDR), ktoré vyčnievajú zo zbalených listov. Tak ľahký ako aj ťažký reťazec obsahujú tri CDR slučky, pričom slučky ľahkého reťazca sú označené Ll, L2 a L3, zatiaľ čo slučky ťažkého reťazca sú označené Hl, H2 a H3. Kľučky úsekov určujúcich komplementaritu (CDR) zodpovedajú kanonickej štruktúre 1 pre slučky Ll, L2 a L3 ľahkého reťazca a pre slučky Hl a H2 ťažkého reťazca (Chothia et al., 1989, Náture 342: 877 - 883). Kľučka H3 ťažkého reťazca má kompaktnú konformáciu β-vlásenky, ktorá je stabilizovaná vnútornými vodíkovými väzbami, a tiež dvoma aromatickými zvyškami (Tyr 104 a Phe 105), ktoré sú umiestnené oproti ľahkému reťazcu. Zvyšok Thr50 z L2 zaujíma uhly dvoj stenu hlavného reťazca, ktoré patria do zakázaných úsekov Ramachandranovho diagramu. Rovnaké pozorovanie pre zodpovedajúce zvyšky sa urobilo aj pri iných protilátkach (Muller et al., 1998, Structure 6, pp. 1153 - 11567), čo ukazuje, že ide o prirodzenú vlastnosť L2 slučky.
al-I doména podľa predkladaného vynálezu má štruktúru veľmi podobnú al-I doméne neviazanej v komplexe (PDB prístupové číslo lck4, Nolte et al., 1999, FEBS Lett. 452: 379 - 385, PDB prístupové číslo lqc5, Rich et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 24906 - 24913). Štruktúra I domény má „dinukleotid-viažuci“ alebo „Rossmanov“ záhyb (Rao & Rossman, 1973, J. Mol. Biol. 76: 241 - 256), v ktorom sú centrálne listy piatich paralelných p reťazcov a jeden malý antiparalelný reťazec obklopené na obidvoch stranách celkom siedmimi α-závitnicami. Šesť β-reťazcov štruktúry podľa predkladaného vynálezu sa označuje βΑ, βΒ, βθ, βϋ, βΕ a βΡ a sedem α-závitníc sa označuje al, a2, a3, a4, a5, a6 a a7.
V I doméne existujú tri charakteristické štruktúrne znaky. Prvým charakteristickým znakom je prítomnosť vloženej malej závitnice v βΕ-α6 slučke, nazývanej C závitnica. Väčšina slučky C špirály molekuly A (pozri obr. 19) podľa predkladaného vynálezu je spojená so slabou elektrónovou hustotou, ktorá svedčí o poruche. Zdá sa, že je to dôsledok neprítomnosti kryštálových kontaktov alebo kontaktov s Fab, ktoré by inak slučku stabilizovali. Ale, rovnaká slučka v molekule B (pozri obr. 19) podľa predkladaného vynálezu má jasne definovanú elektrónovú hustotu a bola zahrnutá v modeli. Druhým charakteristickým znakom al-I domény je MIDAS alebo adhézne miesto závislé od iónu kovu (Metal Ion Dependent-Adhesion-Site), kde kovové ióny a ligandy sú zapojené do väzby I domény. Päť kľúčových zvyškov, ktoré vytvárajú časť MIDAS, sa označuje ako motív „DxSxS-T-D“. Tieto zvyšky, ktoré sú úplne konzervatívne medzi I doménami, koordinujú kovový ión (Gotwals et al., 1999, Biochemistry 38: 8280 - 8288). Kryštály podľa predkladaného vynálezu sa pestovali v prítomnosti mangánu a MIDAS miesto I domény v tejto štruktúre obsahuje, ako sa pozorovalo, kovový ión Mn+2. Ión je priamo koordinovaný bočnými reťazcami zvyškov Serl56, Serl58 a Thr224. Mapa 2Fo-Fc elektrónovej hustoty neukazuje žiadny dôkaz toho, že MIDAS zvyšky Aspl54 a Asp257 vytvárajú vodou sprostredkovanú nepriamu koordináciu kovového iónu (obr. 20). Ale, zjavná neprítomnosť molekuly vody by mohla byť dôsledkom obmedzeného rozlíšenia (2,8 Á) mapy elektrónovej hustoty. Tretím znakom I domény je to, že všetky určené štruktúry I domény patria k jednej z dvoch konformácií nazvaných „otvorená“ a „uzavretá“. Rozdiely medzi otvorenou a uzavretou konformáciou zahrnujú odlišný spôsob koordinácie kovového iónu a významný (približne 10 Á) polohový posun C-koncovej závitnice I domény. I doména v komplexe podľa predkladaného vynálezu je v uzavretej konformácii.
V štruktúre komplexu podľa predkladaného vynálezu sa Fab fragment viaže k svojmu epitopu na prednom hornom povrchu I domény so „stopou“ 35 Á x 30 Á. Celková obsadená plocha rozhrania protilátka-antigén je 1534 Á2, čo je typické aj pre ostatné komplexy protilátka-antigén (Davies et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7 - 12, Jones & Thomton, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 13 - 20). Povrch má na 25 % hydrofóbny a na 75 % hydrofilný charakter. Ťažký reťazec prispieva 65 % k ploche obsadeného povrchu v komplexe, zatiaľ čo zostávajúcimi 35 % prispieva ľahký reťazec. Protilátkový epitop pozostáva zo zvyškov lokalizovaných v štyroch slučkách I domény (Emsley et al., 2000, Celí 101: 47 - 56). Tri z týchto slučiek vytvárajú MIDAS miesto: slučka 1 (βΑ-al), ktorá obsahuje konzervatívnu DXSXS sekvenciu, slučka 2 (α3-α4), ktorá obsahuje MIDAS Thr224, a slučka 3 (βϋ-α5), ktorá obsahuje MIDAS zvyšok Asp257. Štvrtá slučka je C-závitnicová slučka a je zapojená iba do minoritných kontaktov.
Ústredným znakom interakcie antigén-protilátka je koordinácia kovového iónu v MIDAS mieste AsplOl z CDR H3 protilátky (obr. 20). Vzdialenosť medzi iónom a z AsplOl je 2,4 Á. Okrem toho atóm 052 z AsplOl interaguje s His261 z I domény. Je zaujímavé, že CDR H3 obsahuje niekoľko glycínových zvyškov v susedstve AsplOl (sekvencia GFGDGGY) (SEQ ID NO: 62), pravdepodobne preto, aby sa umožnila dostatočná flexibilita CDR slučky, a tak sa umožnila správna koordinácia kovového iónu. CDR H3 sekvencia je v podstate nezmenená v monoklonálnych protilátkach, ktoré sa pripravili proti rovnakému antigénu a zistilo sa o nich, že patria do rovnakej triedy. Väčšina protilátkových zvyškov, ktoré sa zúčastňujú kontaktu protilátka-antigén, je lokalizovaná v slučkách L3, Hl, H2 a H3 CDR. Zdá sa, že niekoľko zvyškov zo slučky Ll (Asn30) a L2 (Tyr48) vytvára menej významné van der Waalsove väzby. L3 primáme prispieva ku kontaktom prostredníctvom dvoch veľkých hydrofóbnych zvyškov, Trp90 a Trp95. Okrem toho Asn93 zo slučky L3 tvoria vodíkové väzby s Gln223 z I domény. Bočné reťazce His56 a Tyr58 zo slučky H2 tvoria vodíkové väzby s atómami hlavného reťazca slučky 2 z I domény. Arg31 zo slučky Hl je v kontakte s Arg291 slučky 4 z I domény. Arg222 slučky 2 z I domény je vmedzerený medzi niekoľko protilátkových zvyškov vrátane
Tyr58, Trp95 a Asn93. To jediný zvyšok zo štyroch mutovaných v RAH I doméne, ktorý je zapojený do kontaktov s Fab. Je to preto pravdepodobne jediný zvyšok zodpovedný za obnovenie väzby protilátky po mutagenéze.
Porovnanie kryštálovej sústavy komplexu chimémej potkanej/ľudskej al-I domény a hAQC2 Fab fragmentu s inými štruktúrami I domény
Chiméma al-I doména RAH má štyri sekvenčné v al-I doméne laboratórneho potkana (zvyšky zo sekvencie laboratórneho potkana: 217G, 218R, 219Q a 222L), osem sekvenčných rozdielov v ľudskej al-I doméne (zvyšky z ľudskej sekvencie: 163D, 166T, 214K, 264H, 268K, 288S, 3221 a 380T) a desať sekvenčných rozdielov v klone použitom v kryštálovej štruktúre použitej na štúdium ľudskej al-I domény (zvyšky zo sekvencie klonu: 163D, 166T, 174E, 214K, 2301, 264H, 268K, 288S, 3221 a 380T). V kryštálovej štruktúre al-I domény αϊβΐ laboratórneho potkana bez naviazaného ligandu (PDB prístupový kód lck4, Nolte et al., 1999, FEBS Lett. 452: 379 - 385), al-I doména neobsahuje žiadne naviazané kovové ióny a zaujíma „uzavretú“ konformáciu. V kryštálovej štruktúre ľudskej al-I domény bez naviazaného ligandu (prístupový kód lqc5, Rich et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 24906 - 24913), al-I doména obsahuje viazaný Mg+2 a podobne zaujíma uzavretú konformáciu. Superimpozícia týchto dvoch štruktúr s komplexom chimémej al-I domény ukazuje, že sú tu iba málo významné konformačné zmeny pri väzbe protilátky hAQC2. Hodnota r. m. s. polohovej odchýlky medzi chimémou al-I doménou a al-I doménou laboratórneho potkana je 1,04 Á pre všetkých 768 atómov hlavného reťazca. Hodnota r. m. s. polohovej odchýlky medzi ľudskou a chimémou al-I doménou je 0,69 Á pre všetkých 764 atómov hlavného reťazca. Najväčšie rozdiely (pár ľudskej a chimémej al-I domény) sa pozoroval v slučke 1 (r. m. s. odchýlky 1,24 Á pre atómy hlavného reťazca zvyškov 154 až 161) a slučke 4 (C závitnicová slučka) al-I domény (r. m. s. odchýlky 1,55 Á pre atómy hlavného reťazca zvyškov 288 až 296). Ale tieto rozdiely môžu byť presnejšie opísané ako posuny celých elementov sekundárnej štruktúry skôr ako komplexné konformačné zmeny. Zdá sa, že sú v bežnom rozsahu konformačnej flexibility proteínov. Hodnota r. m. s. polohovej odchýlky medzi ľudskou a chimémou al-I doménou pre atómy hlavného reťazca aminokyselinových zvyškov Glu 192, Gln218, Arg219, Gly220 a Gly221 (kryštálové číslovanie) je 0,33 Á. Hodnota r. m. s. polohovej odchýlky medzi potkaňou a chimémou al-I doménou pre atómy hlavného reťazca aminokyselinových zvyškov Aspl54, Serl56, Asnl57, Serl58, Tyrl60, Glul92, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 a Leu294 (kryštálové číslovanie) je 0,97Ä.
I doména zachováva konformáciu „zavretej“ I domény, ktorá sa pozorovala iba pre I domény bez ligandu kryštalizovanej bez prítomnosti ligandov alebo pseudoligandov viazaných k miestu MIDAS. Hodnota r. m. s. polohovej odchýlky C-koncovej závitnice ľudskej a chimémej I domény (vyrátaná pre atómy hlavného reťazca zvyškov 321 až 335) je 0,64 Á. Simulovaná mapa zanedbávajúca nasadnutia vyrátané pre konečný spresnený model jednoznačne potvrdila, že poloha C-koncovej závitnice a priľahlého štruktúrneho elementu je v súlade s uzavretou konformáciou.
Aby bolo možné skúmať účinky väzby ligandu na spôsob koordinácie kovového iónu, štruktúra podľa predkladaného vynálezu bola superponovaná so štruktúrou a2-I domény bez naviazaného ligandu (PDB prístupový kód laox, Emsley et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 28512 - 28517) a a2-I domény v komplexe s kolagénovým peptidom (PDB prístup. Kód ldzi, Emsley et al., 2000, Celí 101: 47 - 56). Koordinácia kovového iónu AsplOl z protilátky je pozoruhodne podobná koordinácii kovového iónu a2-I domény kyselinou glutámovou z kolagénového peptidu. Ďalším znakom, ktorý je konzervatívny, je súčasná interakcia kyslej skupiny s His261 (His258 v a2-I doméne). Všetky MIDAS zvyšky z komplexu I doména-Fab, okrem Serl56 a Serl58, zaujímajú konformáciu veľmi podobnú tej, ktorá je pozorovaná pri I doméne bez naviazaného ligandu. Na rozdiel od toho bočné reťazce Serl56 a Serl58, a tiež kov, zaujímajú konformáciu podobnú konformácii I domény s ligandom. Je teda jasné, že koordinácia kovového iónu AsplOl neumožňuje iónu zachovať polohu a koordinačné vzdialenosti, ktoré sú pozorované v stave bez ligandu. Takže kovový ión nie je priamo koordinovaný Asp257, čo je fakt, ktorý dovoľuje, že si ión zachováva vysokú elektrofilnosť.
Biologické dôsledky
Podľa predkladaného vynálezu neexistuje žiadna priama koordinácia kovu Asp257, ktorá by mohla umožňovať vysokú afinitu väzby tým, že by znížila energetickú bariéru medzi zavretou (ligand nie je viazaný) a otvorenou (ligand je naviazaný) konformáciou. Ale, koordinácia kovu kyselinou asparágovou protilátky nie je dostatočná na to, aby indukovala otvorenú konformáciu I domény podľa predkladaného vynálezu. Štruktúra komplexu „I doména-Fab“ ukazuje, že je možné mať silnú väzbu k I doméne, ktorá zaujíma uzavretú konformáciu, a že koordinácia kovového iónu kyslým zvyškom z ligandu je nutná, ale nie postačujúca na indukciu zmeny konformácie na otvorený stav. Očakáva sa, že naviazanie protilátky stabilizuje nízkoafmitný stav integrínov a bráni tak signalizácii zvonka, ktorá by sprevádzala väzbu integrínu ku kolagénu.
Aj keď bol predkladaný vynález opísaný veľmi podrobne formou príkladov výhodných uskutočnení a ilustratívnych príkladov pre jasnosť opisu, odborníkovi je zrejmé, že sa môžu uskutočniť určité zmeny a modi48
SK 288124 Β6 fikácie bez toho, aby došlo k odchýleniu od myšlienky vynálezu. Preto ani opis ani príklady by nemali byť chápané tak, že obmedzujú rozsah vynálezu.
Zoznam sekvencii <160> 70 < 170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 106 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický polypeptid
<400> 1
Gin íle Val Leu Thr Gin Phe Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Lys Ser Ser Pro Lys Pro Trp íle Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr íle Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu íle Lys
100 105 <210>2 <211> 118 <212> PRT <213> Umelá sekvencia
<220> <223> Opis umelej sekvencie: Syntetický polypeptid
<400> 2
Asp Val Lys Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin íle Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr íle Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210>3 <211> 213 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický polypeptid <400> 3
Gin 1 íle Gin Leu Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr íle Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp íle Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu íle Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe íle Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210 <210>4 <211> 447 <212>PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický polypeptid <400>4
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr íle Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
SK 288124 Β6
Arg Gly Phe Gly 100 Asp Gly Gly Tyr Phe Asp 105 Val Trp Gly Gin Gly 110 Thr
Leu Val Thr 115 Val Ser Ser Ala Ser 120 Thr Lys Gly Pro Ser 125 Val Phe Pro
Leu Ala 130 Pro Ser Ser Lys Ser Thr 135 Ser Gly Gly Thr 140 Ala Ala Leu Gly
Cys 145 Leu Val Lys Asp Tyr 150 Phe Pro Glu Pro Val 155 Thr Val Ser Trp Asn 160
Ser Gly Ala Leu Thr 165 Ser Gly Val His Thr 170 Phe Pro Ala Val Leu 175 Gin
Ser Ser Gly Leu Tyr 180 Ser Leu Ser Ser Val 185 Val Thr Val Pro Ser 190 Ser
Ser Leu Gly 195 Thr Gin Thr Tyr íle 200 Cys Asn Val Asn His 205 Lys Pro Ser
Asn Thr 210 Lys Val Asp Lys Lys Val 215 Glu Pro Lys Ser 220 Cys Asp Lys Thr
His 225 Thr Cys Pro Pro Cys 230 Pro Ala Pro Glu Leu Leu 235 Gly Gly Pro Ser 240
Val Phe Leu Phe Pro 245 Pro Lys Pro Lys Asp 250 Thr Leu Met íle Ser 255 Arg
Thr Pro Glu Val 260 Thr Cys Val Val Val Asp 265 Val Ser His Glu Asp 270 Pro
Glu Val Lys 275 Phe Asn Trp Tyr Val 280 Asp Gly Val Glu Val 285 His Asn Ala
Lys Thr 290 Lys Pro Arg Glu Glu Gin 295 Tyr Asn Ser Thr 300 Tyr 1 Arg Val Val
Ser 305 Val Leu Thr Val Leu 310 His Gin Asp Trp Leu 315 Asn Gly Lys Glu Tyr 320
Lys Cys Lys Val Ser 325 Asn Lys Ala Leu Pro 330 Ala Pro íle Glu Lys 335 Thr
íle Ser Lys Ala 340 Lys Gly Gin Pro Arg Glu 345 Pro Gin Val Tyr Thr 350 Leu
Pro Pro Ser 355 Arg Asp Glu Leu Thr 360 Lys Asn Gin Val Ser 365 Leu Thr Cys
Leu Val 370 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 375 Asp íle Ala Val 380 Glu Trp Glu Ser
Asn 385 Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 390 Lys Thr Thr 395 Pro Pro Val Leu Asp 400
Ser Asp Gly Ser Phe 405 Phe Leu Tyr Ser Lys 410 Leu Thr Val Asp Lys 415 Ser
Arg Trp Gin Gin 420 Gly Asn Val Phe Ser Cys 425 Ser Val Met His Glu 430 Ala
Leu His Asn 435 His Tyr Thr Gin Lys 440 Ser Leu Ser Leu Ser 445 Pro Gly
<210> 5 <211> 447 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický polypeptid <400> 5
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
SK 288124 Β6
Ala Thr 50 íle Ser Gly Gly Gly His 55 Thr Tyr Tyr Leu 60 Asp Ser Val Lys
Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr íle Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met íle Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Gin Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro íle Glu Lys Thr
325 330 335
íle Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp íle Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 6 <211> 447 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický polypeptid <400> 6
SK 288124 Β6
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr 25 Phe Ser 30 Arg Tyr
Thr Met Ser 35 Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly 40 Leu 45 Glu Trp Val
Ala Thr 50 íle Ser Gly Gly Gly 55 His Thr Tyr Tyr Leu 60 Asp Ser Val Lys
Gly 65 Arg Phe Thr íle Ser 70 Arg Asp Asn Ser Lys Asn 75 Thr Leu Tyr Leu 80
Gin Met Asn Ser Leu 85 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 90 Tyr Tyr Cys 95 Thr
Arg Gly Phe Gly 100 Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp 105 Gly Gin 110 Gly Thr
Leu Val Thr 115 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 120 Ser 125 Val Phe Pro
Leu Ala 130 Pro Ser Ser Lys Ser 135 Thr Ser Gly Gly Thr 14C Ala 1 Ala Leu Gly
Cys 145 Leu Val Lys Asp Tyr 150 Phe Pro Glu Pro Val Thr 155 Val Ser Trp Asn 160
Ser Gly Ala Leu Thr 165 Ser Gly Val His Thr Phe Pro 170 Ala Val Leu 175 Gin
Ser Ser Gly Leu 180 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 185 Val Pro 190 Ser Ser
Ser Leu Gly 195 Thr Gin Thr Tyr íle Cys Asn Val Asn 200 His 205 Lys Pro Ser
Asn Thr 210 Lys Val Asp Lys Lys 215 Val Glu Pro Lys Ser 220 Cys Asp Lys Thr
His 225 Thr Cys Pro Pro Cys 230 Pro Ala Pro Glu Ala Ala 235 Gly Gly Pro Ser 240
Val Phe Leu Phe Pro 245 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 250 Met íle Ser 255 Arg
Thr Pro Glu Val Thr 260 Cys Val Val Val Asp Val Ser 265 His Glu 270 Asp Pro
Glu Val Lys 275 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 280 Val 285 His Asn Ala
Lys Thr 290 Lys Pro Arg Glu Glu 295 Gin Tyr Asn Ser Thr 300 Tyr Arg Val Val
Ser 305 Val Leu Thr Val Leu 310 His Gin Asp Trp Leu Asn 315 Gly Lys Glu Tyr 320
Lys Cys Lys Val Ser 325 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 330 íle Glu Lys 335 Thr
íle Ser Lys Ala 340 Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin 345 Val Tyr 350 Thr Leu
Pro Pro Ser 355 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val 360 Ser 365 Leu Thr Cys
Leu Val 370 Lys Gly Phe Tyr Pro 375 Ser Asp íle Ala Val 38C Glu 1 Trp Glu Ser
Asn 385 Gly Gin Pro Glu Asn Asn 390 Tyr Lys Thr Thr Pro 395 Pro Val Leu Asp 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe 405 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 410 Val Asp Lys 415 Ser
Arg Trp Gin Gin Gly Asn 420 Val Phe Ser Cys Ser Val 425 Met His Glu 430 Ala
Leu His Asn 435 His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 440 Ser 445 Pro Gly
<210>7 <211> 26 <212>DNA <213> Homo sapiens
SK 288124 Β6 <400>7 caggatccgt cagccccaca tttcaa <210> 8 <211>26 <212>DNA <213> Homo sapiens <400>8 tcctcgaggg cttgcagggc aaatat <210> 9 <211> 26 <212>DNA <213> Rattus sp.
<400>9 caggatccgt cagtcctaca tttcaa <210> 10 <211> 26 <212>DNA <213> Rattus sp.
<400> 10 tcctcgagcg cttccaaagc gaatat <210> 11 <211> 31 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400> 11 tgaggagacg gtgaccgtgg cccttggccc c <210> 12 <211>22 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400> 12 aggtsmarct gcagsagtcw gg <210> 13 <211>40 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400> 13 actagtcgac atggatttwc aggtgcagat twtcagcttc <210> 14 <211>21 <212>DNA
SK 288124 Β6 <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400> 14 actggatggt gggaagatgg a 21 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický peptid <400> 15
Asp Val Lys Val Val Glu Ser Gly Gly 1 5 <210> 16 <211>6 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický peptid <400> 16
Asp Val Lys Val Val Glu
5 <210> 17 <211> 54 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400> 17 gcaccaggtg cccactccga cgtcaaggtg gtggagtcag ggggaggctt agtg 54 <210> 18 <211> 38 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400> 18 ggaggcacca agctggagat ctaacgggct gatgctgc 38 <210> 19 <211> 34 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér
SK 288124 Β6 <400> 19 cataatgtcc aggggagaaa ttgttctcac ccag 34 <210> 20 5 <211>93 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400> 20 ggtgcccact ccgacgtcca gctggtcgag tcagggggag gcttagtcca gcctggaggg 60 tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga ttc 93 <210> 21 <211> 51 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400>21 atgtcttggg ttcgccaggc tccggggaag gggctggagt gggtcgcaac c 51 <210>22 <211> 93 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400> 22 ttcaccatct ccagagacaa ttccaagaac accctgtacc tgcagatgaa cagtctgagg 60 gccgaggaca cagccgtgta ttactgtaca aga 93 <210>23 40 <211>39 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400> 23 tggggccaag gtaccctggt caccgtctcc tcaggtgag 39 <210>24 <211> 51 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400> 24 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aggtatacta tgtcttgggt t 51 <210> 56
SK 288124 Β6 <211> 39 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400> 25 gcaccaggtg cgcactccga ggtccagctg gtcgagtca 39 <210 26 <211>39 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400> 26 gagtcagggg gaggcttaat ccagcctgga gggtccctg 39 <210> 27 <211> 81 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400> 27 caaattgttc tcacccagtc tccatcctcc ctgtctgcgt ctgtagggga cagagtcacc 60 atcacatgca gtgccagctc a 81 <210>28 <211>45 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400> 28 ttctggtatc agcagaagcc cgggaaagcc cccaaaccct ggatt 45 <210>29 <211> 105 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400> 29 gcttctggag tcccttcacg cttcagtggc agtgggtctg ggacagatta cactctcaca 60 atcagcagcc tgcaacctga agattttgcc acttattact gccag 105 <210>30 <211>33 <212>DNA <213> Umelá sekvencia
SK 288124 Β6 <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400> 30 ggtggaggca ctaaggtgga gatctaacgg get 33 <210>31 <211> 39 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400>31 cccgggaaag cgcccaaact cctgatttat ctcacatcc 39 <210> 32 <211> 51 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400> 32 gcctcagtca taatgtcccg gggacaaatt cagctcaccc agtctccatc c 51 <210> 33 <211>51 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér < 400>33 ggtaacccgt ggacgttcgg tcagggcact aaggtggaga tctaacgggc t 51 <210>34 <211> 51 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400> 34 gcctcagtca taatgtcccg gggacaaatt cagctcaccc agtctccatc c 51 <210> 35 <211> 51 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400> 35 ggtaacccgt ggacgttcgg tcagggcact aaggtggaga tctaacgggc t 51
SK 288124 Β6 <210> 36 <211> 39 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400> 36 gggaaagcac ccaaactctg gatctatctc acatccaac 39 <210> 37 <211> 45 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400> 37 aagcccggga aggcgcccaa acccctgatt tatctcacat ccaac 45 <210> 59 <211> 39 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400> 38 gtcataatgt cccggggaga tatccagctc acccagtct 39 <210>39 35 <211>354 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<221>CDS <222> (1)..(354) <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický oligonukleotid <400> 39
gac Asp gtc Val aag Lys gtg Val gtg Val gag Glu tca Ser ggg Gly gga Gly ggc Gly tta Leu gtg Val aag Lys cct Pro gga Gly ggg Gly 48
50 1 5 10 15
tcc ctg aaa ctc gcc tgt gca gcc tet gga ttc agt ttc agt aga tat 96
Ser Leu Lys Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
act atg tet tgg gtt cgc cag att ccg gag aag agg ctg gag tgg gtc 144
55 Thr Met Ser Trp Val Arg Gin íle Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
gca acc att agt ggt ggt ggt cac acc tac tat cta gac agt gtg aag 192
Ala Thr íle Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
60 ggc ega ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac acc ctg tac ctg 240
SK 288124 Β6
288
Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
caa atg agc agt ctg agg tct gag gac aca gcc atg tat tac tgt aca
Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
aga ggt ttt gga gac ggg ggg tac ttc gat gtc tgg ggc caa ggg acc
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
acg gtc acc gtc tcc tca
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 40 <211> 118 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický polypeptid <400> 40
Asp Val Lys Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin íle Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr íle Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210>41 <211> 354 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220 <221>CDS <222> (1)..(354) <220 <223> Opis umelej sekvencie: Syntetický oligonukleotid <400 41
336
354
gac gtc cag ctg gtc gag tca ggg gga ggc tta gtc cag cct gga ggg
Asp Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc agt ttc agt aga tat
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
act atg tct tgg gtt cgc cag get ccg ggg aag ggg ctg gag tgg gtc
144
Thr Met Ser 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val
gca acc att agt ggt ggt ggt cac acc tac tat cta gac agt gtg aag
Ala Thr íle Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
ggc ega ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acc ctg tac ctg
Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
cag atg aac agt ctg agg gcc gag gac aca gcc gtg tat tac tgt aca
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
aga ggt ttt gga gac ggg ggg tac ttc gat gtc tgg ggc caa ggt acc
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
ctg gtc acc gtc tcc tca
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
192
240
288
336
354 <210> 42 20 <211> 118 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický polypeptid <400> 42
Asp Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr íle Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 43 <211> 356 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<221>CDS <222> (1)..(354) <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický oligonukleotid <400> 43
SK 288124 Β6
gag gtc cag ctg gtc gag tca ggg gga ggc tta atc cag cct gga ggg 48
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu íle Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt agg tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
act atg tct tgg gtt cgc cag get ccg ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gca acc att agt ggt ggt ggt cac acc tac tat cta gac agt gtg aag 192
Ala Thr íle Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
ggc ega ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acc ctg tac ctg 240
Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
cag atg aac agt ctg agg gcc gag gac aca gcc gtg tat tac tgt aca 288
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
aga ggt ttt gga gac ggg ggg tac ttc gat gtc tgg ggc caa ggt acc 336
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
ctg gtc acc gtc tcc tca gg 356
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>44 <211> 118 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický polypeptid <400>44
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu íle Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arq Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr íle Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 45 <211>356 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<221>CDS <222> (1)..(354)
SK 288124 Β6 <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický oligonukleotid <400> 45
gag gtc cag ctg gtc gag tca ggg gga ggc tta gtc cag cct gga ggg
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tet gga ttc acc ttc agt agg tat
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
act atg tet tgg gtt ege cag get ccg ggg aag ggg ctg gag tgg gtc
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gca acc att agt ggt ggt ggt cac acc tac tat cta gac agt gtg aag
Ala Thr íle Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
ggc ega ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acc ctg tac ctg
Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
cag atg aac agt ctg agg gcc gag gac aca gcc gtg tat tac tgt aca
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
aga ggt ttt gga gac ggg ggg tac ttc gat gtc tgg ggc caa ggt acc
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
ctg gtc acc gtc tcc tca gg
Leu Val Thr Val Ser Ser
115 <210>46 <211> 318 212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<221>CDS <222> (1)..(318) <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický oligonukleotid <400> 46
caa att gtt ctc acc cag ttt cca gca ctc atg tet gcg tet cca ggg
Gin íle Val Leu Thr Gin Phe Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
gag aag gtc acc atg acc tgc agt gcc age tca agt gta aat cac atg
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
ttc tgg tat cag cag aag cca aaa tcc tcc ccc aaa ccc tgg att tat
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Lys Ser Ser Pro Lys Pro Trp íle Tyr
35 40 45
ctc aca tcc aac ctg get tet gga gtc cct get ege ttc agt ggc agt
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
ggg tet ggg acc tet tac tet ctc aca atc age age atg gag get gaa
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr íle Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 7 5 80
gat get gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt ggt aac ccg tgg acg
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
SK 288124 Β6 ttc ggt gga ggc acc aag ctg gag atc aaa 318
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu íle Lys
100 105 <210>47 <211> 106 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický polypeptid <400> 47
15 Gin íle Val Leu Thr Gin Phe Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Lys Ser Ser Pro Lys Pro Trp íle Tyr
20 35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr íle Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
25 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu íle Lys
100 105 <210>48 <211> 318 <212>DNA <213> Umelá sekvencia
35 <220> <221>CDS <222> (1)..(318)
<220>
40 <223> Opis umelej sekvencie: Syntetický oligonukleotid
<400> 48
caa att gtt ctc acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gcg tct gta ggg 48
45 Gin íle Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
gac aga gtc acc atc aca tgc agt gcc agc tca agt gta aat cac atg 96
Asp Arg Val Thr íle Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
50 ttc tgg tat cag cag aag ccc ggg aaa gcc ccc aaa ccc tgg att tat 144
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp íle Tyr
35 40 45
ctc aca tcc aac ctg get tct gga gtc cct tca ege ttc agt ggc agt 192
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
55 50 55 60
ggg tct ggg aca gat tac act ctc aca atc agc agc ctg caa cct gaa 240
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
gat ttt gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt ggt aac ccg tgg acg 288
60 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
SK 288124 Β6 ttc ggt gga ggc act aag gtg gag atc aaa 318
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu íle Lys
100 105 <210 49 <211> 106 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický polypeptid <400> 49
15 Gin 1 Asp Phe íle Arg Trp Val Val Tyr Leu Thr 20 Gin Thr 5 íle Gin Gin Thr Lys Ser Cys Pro Pro Ser Gly Ser Ala 25 Lys Ser 10 Ser Ala Leu Ser Pro Ser Ser Lys Ala Val Pro Ser Asn 30 Trp Val 15 His íle Gly Met Tyr
20 35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
25 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu íle Lys
100 105 <210>50 <211>318 <212> DNA <213> Umelá sekvencia
35 <220> <221>CDS <222> (1)..(318)
<220>
40 <223> Opis umelej sekvencie: Syntetický oligonukieotid
<400> 50
caa att gtt ctc acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gcg tct gta ggg 48
45 Gin íle Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
gac aga gtc acc atc aca tgc agt gcc age tca agt gta aat cac atg 96
Asp Arg Val Thr íle Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
50 ttc tgg tat cag cag aag ccc ggg aaa gcg ccc aaa ctc ctg att tat 144
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu íle Tyr
35 40 45
ctc aca tcc aac ctg get tct gga gtc cct tca ege ttc agt ggc agt 192
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
55 50 55 60
ggg tct ggg aca gat tac act ctc aca atc age age ctg caa cct gaa 240
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
gat ttt gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt ggt aac ccg tgg acg 288
60 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
SK 288124 Β6 ttc ggt gga ggc act aag gtg gag atc aaa 318
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu íle Lys
100 105 <210>51 <211> 106 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický polypeptid <400>51
15 Gin 1 Asp Phe íle Arg Trp Val Val Tyr Leu Thr 20 Gin Thr 5 íle Gin Gin Thr Lys Ser Cys Pro Pro Ser Gly Ser Ala 25 Lys Ser 10 Ser Ala Leu Ser Pro Ser Ser Lys Ala Val Leu Ser Asn 30 Leu Val 15 His íle Gly Met Tyr
20 35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
25 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu íle Lys
100 105 <210>52 <211> 318 <212>DNA <213> Umelá sekvencia
35 <220> <221>CDS <222> (1)..(318)
<220>
40 <223> Opis umelej sekvencie: Syntetický oligonukleotid
<400> 52
caa att cag ctc acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gcg tct gta ggg 48
45 Gin íle Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
gac aga gtc acc atc aca tgc agt gcc age tca agt gta aat cac atg 96
Asp Arg Val Thr íle Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
50 ttc tgg tat cag cag aag CCC ggg aaa gcc ccc aaa ccc tgg att tat 144
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp íle Tyr
35 40 45
ctc aca tcc aac ctg get tct gga gtc cct tca ege ttc agt ggc agt 192
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
55 50 55 60
ggg tct ggg aca gat tac act ctc aca atc age age ctg caa cct gaa 240
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
gat ttt gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt ggt aac ccg tgg acg 288
60 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
SK 288124 Β6 ttc ggt cag ggc act aag gtg gag atc aaa 318
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu íle Lys
100 105 <210>53 <211>318 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<221>CDS <222> (1)..(318) <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický oligonukleotid <400> 53
caa att cag ctc acc cag tet cca tcc tcc ctg tet gcg tet gta ggg 48
Gin íle Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
gac aga gtc acc atc aca tgc agt gcc age tca agt gta aat cac atg 96
Asp Arg Val Thr íle Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
ttc tgg tat cag cag aag ccc ggg aaa gcg ccc aaa ctc ctg att tat 144
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu íle Tyr
35 40 45
ctc aca tcc aac ctg get tet gga gtc cct tca ege ttc agt ggc agt 192
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
ggg tet ggg aca gat tac act ctc aca atc age age ctg caa cct gaa 240
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
gat ttt gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt ggt aac ccg tgg acg 288
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
ttc ggt cag ggc act aag gtg gag atc aaa 318
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu íle Lys
100 105 <210> 54 <211> 106 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický polypeptid <400> 54
Gin 1 íle Gin Leu Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr íle Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu íle Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr 85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu íle Lys 100 105 <210>55 <211> 318 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<221>CDS <222> (1)..(318) <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický oligonukleotid <400> 55
20 gaa Glu 1 gag Glu att íle aag Lys gtt Val gtc Val ctc Leu acc Thr acc Thr 5 atg Met cag Gin acc Thr ttt Phe tgc Cys cca Pro agt Ser gca Ala gcc Ala ctc Leu 10 age Ser atg Met tca Ser tct Ser agt Ser gcg Ala gta Val tct Ser aat Asn cca Pro 15 cac His ggg Gly atg Met 48 96
25 20 25 30
ttc tgg tat cag cag aag cca aaa tcc tcc ccc aaa ccc tgg att tat 144
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Lys Ser Ser Pro Lys Pro Trp íle Tyr
35 40 45
ctc aca tcc aac ctg get tct gga gtc cct get ege ttc agt ggc agt 192
30 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
ggg tct ggg acc tct tac tct ctc aca atc age age atg gag get gaa 240
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr íle Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
35 gat get gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt ggt aac ccg tgg acg 288
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
ttc ggt gga ggc acc aag ctg gag atc aaa 318
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu íle Lys
40 100 105
<210> 56 <211> 106 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický polypeptid <400> 56
Glu 1 íle Val Leu Thr 5 Gin Phe Pro Ala Leu 10 Met Ser Ala Ser Pro 15 Gly
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Lys Ser Ser Pro Lys Pro Trp íle Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr íle Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
SK 288124 Β6
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr 85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu íle Lys 100 105 <210> 57 <211> 318 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<221>CDS <222> (1)..(318) <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický oligonukleotid <400> 57
20 gat Asp 1 gac Asp atc íle aga Arg cag Gin gtc Val ctc Leu acc Thr acc Thr 5 atc íle cag Gin aca Thr tct Ser tgc Cys cca Pro agt Ser tcc Ser gcc Ala tcc Ser 10 agc Ser ctg Leu tca Ser tct Ser agt Ser gcg Ala gta Val tct Ser aat Asn gta Val 15 cac His ggg Gly atg Met 48 96
25 20 25 30
ttc tgg tat cag cag aag ccc ggg aaa gcc ccc aaa ccc tgg att tat 144
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp íle Tyr
35 40 45
ctc aca tcc aac ctg get tct gga gtc cct tca cgc ttc agt ggc agt 192
30 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
ggg tct ggg aca gat tac act ctc aca atc agc agc ctg caa cct gaa 240
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
35 gat ttt gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt ggt aac ccg tgg acg 288
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
ttc ggt cag ggc act aag gtg gag atc aaa 318
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu íle Lys
40 100 105
<210>58 <211> 106 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický polypeptid <400> 58
Asp 1 íle Gin Leu Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr íle Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp íle Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr 85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu íle Lys 100 105 <210>59 <211> 192 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: konštrukt chimémej domény I typu „potkan/človek“ <400> 59
Thr Gin Leu Asp íle Val íle Val Leu Asp Gly Ser Asn Ser íle Tyr
1 5 10 15
Pro Trp Glu Ser Val íle Ala Phe Leu Asn Asp Leu Leu Lys Arg Met
20 25 30
Asp íle Gly Pro Lys Gin Thr Gin Val Gly íle Val Gin Tyr Gly Glu
35 40 45
Asn Val Thr His Glu Phe Asn Leu Asn Lys Tyr Ser Ser Thr Glu Glu
50 55 60
Val Leu Val Ala Ala Asn Lys íle Val Gin Arg Gly Gly Arg Gin Thr
65 70 75 80
Met Thr Ala Leu Gly íle Asp Thr Ala Arg Lys Glu Ala Phe Thr Glu
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Arg Arg Gly Val Lys Lys Val Met Val íle Val Thr
100 105 11( 0
Asp Gly Glu Ser His Asp Asn Tyr Arg Leu Lys Gin Val íle Gin Asp
115 120 125
Cys Glu Asp Glu Asn íle Gin Arg Phe Ser íle Ala íle Leu Gly His
130 135 140
Tyr Asn Arg Gly Asn Leu Ser Thr Glu Lys Phe Val Glu Glu íle Lys
14! 5 150 155 160
Ser íle Ala Ser Glu Pro Thr Glu Lys His Phe Phe Asn Val Ser Asp
165 170 175
Glu Leu Ala Leu Val Thr íle Val Lys Ala Leu Gly Glu Arg íle Phe
180 185 190 <210>60 <211> 192 <212> PRT <213> Rattus sp.
<400> 60
Thr Gin Leu Asp íle Val íle Val Leu Asp Gly Ser Asn Ser íle Tyr
1 5 10 15
Pro Trp Glu Ser Val íle Ala Phe Leu Asn Asp Leu Leu Lys Arg Met
20 25 30
Asp íle Gly Pro Lys Gin Thr Gin Val Gly íle Val Gin Tyr Gly Glu
35 40 45
Asn Val Thr His Glu Phe Asn Leu Asn Lys Tyr Ser Ser Thr Glu Glu
50 55 60
Val Leu Val Ala Ala Asn Lys íle Gly Arg Gin Gly Gly Leu Gin Thr
65 70 75 80
Met Thr Ala Leu Gly íle Asp Thr Ala Arg Lys Glu Ala Phe Thr Glu
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Arg Arg Gly Val Lys Lys Val Met Val íle Val Thr
100 10! 110
Asp Gly Glu Ser His Asp Asn Tyr Arg Leu Lys Gin Val íle Gin Asp
115 120 125
Cys Glu Asp Glu Asn íle Gin Arg Phe Ser íle Ala íle Leu Gly His
130 135 140
Tyr Asn Arg Gly Asn Leu Ser Thr Glu Lys Phe Val Glu Glu íle Lys
145 150 155 160
Ser íle Ala Ser Glu Pro Thr Glu Lys His Phe Phe Asn Val Ser Asp
165 170 175
Glu Leu Ala Leu Val Thr íle Val Lys Ala Leu Gly Glu Arg íle Phe
180 185 190 <210> 61 <211> 192 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>61
Thr Gin Leu Asp íle Val íle Val Leu Asp Gly Ser Asn Ser íle Tyr
1 5 10 15
Pro Trp Asp Ser Val Thr Ala Phe Leu Asn Asp Leu Leu Lys Arg Met
20 25 30
Asp íle Gly Pro Lys Gin Thr Gin Val Gly íle Val Gin Tyr Gly Glu
35 40 45
Asn Val Thr His Glu Phe Asn Leu Asn Lys Tyr Ser Ser Thr Glu Glu
50 55 60
Val Leu Val Ala Ala Lys Lys íle Val Gin Arg Gly Gly Arg Gin Thr
65 70 75 80
Met Thr Ala Leu Gly íle Asp Thr Ala Arg Lys Glu Ala Phe Thr Glu
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Arg Arg Gly Val Lys Lys Val Met Val íle Val Thr
100 105 1H 0
Asp Gly Glu Ser His Asp Asn His Arg Leu Lys Lys Val íle Gin Asp
115 120 125
Cys Glu Asp Glu Asn íle Gin Arg Phe Ser íle Ala íle Leu Gly Ser
130 135 140
Tyr Asn Arg Gly Asn Leu Ser Thr Glu Lys Phe Val Glu Glu íle Lys
14! 5 150 155 160
Ser íle Ala Ser Glu Pro Thr Glu Lys His Phe Phe Asn Val Ser Asp
165 170 175
Glu íle Ala Leu Val Thr íle Val Lys Thr Leu Gly Glu Arg íle Phe
180 185 190
<210> 62 <211> 7 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický peptid <400> 62
Gly Phe Gly Asp 1 Gly Gly Tyr 5
<210> 63 <211> 214 <212> PRT <213> Rattus sp.
<400> 63
Val Ser Pro Thr Phe Gin Val Val Asn Ser Phe Ala Pro Val Gin Glu
1 5 10 15
Cys Ser Thr Gin Leu Asp íle Val íle Val Leu Asp Gly Ser Asn Ser
20 25 30
íle Tyr Pro Trp Glu Ser Val íle Ala Phe Leu Asn Asp Leu Leu Lys
35 40 45
Arg Met Asp íle Gly Pro Lys Gin Thr Gin Val Gly íle Val Gin Tyr
50 55 60
Gly Glu Asn Val Thr His Glu Phe Asn Leu Asn Lys Tyr Ser Ser Thr
65 70 75 80
Glu Glu Val Leu Val Ala Ala Lys Lys íle Gly Arg Gin Gly Gly Leu
85 90 95
Gin Thr Met Thr Ala Leu Gly íle Asp Thr Ala Arg Lys Glu Ala Phe
100 105 110
Thr Glu Ala Arg Gly Ala Arg Arg Gly Val Lys Lys Val Met Val íle
115 120 125
Val Thr Asp Gly Glu Ser His Asp Asn Tyr Arg Leu Lys Gin Val íle
130 135 140
Gin Asp Cys Glu Asp Glu Asn íle Gin Arg Phe Ser íle Ala íle Leu
145 150 155 160
Gly His Tyr Asn Arg Gly Asn Leu Ser Thr Glu Lys Phe Val Glu Glu
165 170 175
íle Lys Ser íle Ala Ser Glu Pro Thr Glu Lys His Phe Phe Asn Val
180 185 190
Ser Asp Glu Leu Ala Leu Val Thr íle Val Lys Ala Leu Gly Glu Arg
195 200 205
íle Phe Ala Leu Glu Ala
210 <210>64 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 64
Val Ser Pro Thr Phe Gin Val Val Asn Ser íle Ala Pro Val Gin Glu
1 5 10 15
Cys Ser Thr Gin Leu Asp íle Val íle Val Leu Asp Gly Ser Asn Ser
20 25 30
íle Tyr Pro Trp Asp Ser Val Thr Ala Phe Leu Asn Asp Leu Leu Lys
35 40 45
Arg Met Asp íle Gly Pro Lys Gin Thr Gin Val Gly íle Val Gin Tyr
50 55 60
Gly Glu Asn Val Thr His Glu Phe Asn Leu Asn Lys Tyr Ser Ser Thr
65 70 75 80
Glu Glu Val Leu Val Ala Ala Lys Lys íle Val Gin Arg Gly Gly Arg
85 90 95
Gin Thr Met Thr Ala Leu Gly Thr Asp Thr Ala Arg Lys Glu Ala Phe
100 105 110
Thr Glu Ala Arg Gly Ala Arg Arg Gly Val Lys Lys Val Met Val íle
115 120 125
Val Thr Asp Gly Glu Ser His Asp Asn His Arg Leu Lys Lys Val íle
130 135 140
Gin Asp Cys Glu Asp Glu Asn íle Gin Arg Phe Ser íle Ala íle Leu
145 150 155 160
Gly Ser Tyr Asn Arg Gly Asn Leu Ser Thr Glu Lys Phe Val Glu Glu
165 170 175
SK 288124 Β6
íle Lys Ser íle Ala Ser Glu Pro Thr Glu Lys His Phe Phe Asn Val
180 185 190
Ser Asp Glu Leu Ala Leu Val Thr íle Val Lys Thr Leu Gly Glu Arg
195 200 205
íle Phe Ala Leu Glu Ala
210 <210> 65 <211> 106 <212> PRT <213> Umelá sekvencia
<220> <223> Opis umelej sekvencie: Syntetický polypeptid
<400> 65
Asp íle Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr íle Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser íle Ser Tyr Leu
20 25 30
Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu íle Tyr
35 40 45
Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu íle Lys
100 105
<210> 66
<211> 106
<212> PRT
<213> Umelá sekvencia
<220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický polypeptid
<400> 66
Gin íle Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr íle Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp íle Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu íle Lys 100 105 <210> 67 <211> 118 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický polypeptid <400> 67
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu íle Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val íle Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ser íle Arg Phe Leu Glu Trp Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 68 <211> 118 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický polypeptid <400> 68
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr íle Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 69 <211> 118 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický polypeptid <400> 69
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
SK 288124 Β6
Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser Gly 25 Phe Thr Phe Ser 30 Arg Tyr
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr íle Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 70 <211> 106 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický polypeptid <400> 70
Gin 1 íle Gin Leu Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr íle Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp íle Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu íle Lys 100 105

Claims (19)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Protilátka anti-VLA-1 alebo jej fragment viažuci antigén, ktorých úseky určujúce komplementaritu ľahkého reťazca sú definované aminokyselinovými zvyškami 24 až 33,49 až 55 a 88 až 96 zo SEQ ID NO: 1, a ktorých úseky určujúce komplementaritu ťažkého reťazca sú definované aminokyselinovými zvyškami 31 až 35, 50 až 65 a 98 až 107 zo SEQ ID NO: 2.
  2. 2. Protilátka podľa nároku 1, ktorá obsahuje vo svojom ťažkom reťazci aspoň jeden z nasledujúcich zvyškov: V12, F29, A49, T93 a R94.
  3. 3. Protilátka podľa nároku 1, ktorá obsahuje vo svojom ľahkom reťazci aspoň jeden z nasledujúcich zvyškov: Ql, L4 a Y71.
  4. 4. Protilátka alebo jej fragment viažuci antigén podľa nároku 1, ktorá obsahuje:
    a) variabilnú doménu ľahkého reťazca so sekvenciou SEQ ID NO: 1 a variabilnú doménu ťažkého reťazca so sekvenciou SEQ ID NO: 2; alebo
    b) rovnaké polypeptidové sekvencie ťažkého a ľahkého reťazca ako protilátka produkovaná hybridómom mAQC2 s ATCC prístupovým číslom PTA3273.
  5. 5. Protilátka alebo jej fragment viažuci antigén podľa nároku 1, pričom protilátkou alebo fragmentom je humanizovaná protilátka.
  6. 6. Protilátka alebo jej fragment viažuci antigén podľa nároku 5, pričom protilátka alebo fragment obsahuje:
    a) vo svojom ľahkom reťazci aspoň jeden z nasledujúcich zvyškov: Ql, L4, P46, W47 a Y71; alebo vo svo75 jom ťažkom reťazci aspoň jeden z nasledujúcich zvyškov: Dl, V12, S28, F29, A49, T93, R94 s číslovaním podľa Kabata; alebo
    b) sekvenciu variabilnej domény ľahkého reťazca definovanú aminokyselinovými zvyškami 1 až 106 zo sekvencie SEQ ID NO: 3 a sekvenciu variabilnej domény ťažkého reťazca definovanú aminokyselinovými zvyškami 1 až 118 zo sekvencie SEQ ID NO: 4; alebo
    c) rovnaké polypeptidové sekvencie ťažkého a ľahkého reťazca ako protilátka produkovaná bunkovou líniou hAQC2 s ATCC prístupovým číslom PTA3275; alebo
    d) rovnaké polypeptidové sekvencie ťažkého a ľahkého reťazca ako protilátka produkovaná bunkovou líniou hsAQC2 s ATCC prístupovým číslom PTA3356; alebo
    e) rovnaké polypeptidové sekvencie ťažkého a ľahkého reťazca ako protilátka produkovaná bunkovou líniou haAQC2 s ATCC prístupovým číslom PTA3274.
  7. 7. Protilátka alebo jej fragment viažuci antigén podľa nároku 5, kde ťažký reťazec je mutovaný v jednom alebo vo viacerých aminokyselinových zvyškoch vybraných zo skupiny, ktorú tvoria zvyšky 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 a 322 podľa systému číslovanie EU, čím je spôsobená zmena efektorovej funkcie, zatiaľ čo je zachovaná väzba k VLA-1, v porovnaní s nemodifikovanou protilátkou.
  8. 8. Protilátka alebo jej fragment viažuci antigén podľa nároku 7, pričom protilátka alebo fragment obsahuje mutácie L234A a L235A podľa systému číslovania EU vo svojom ťažkom reťazci, v porovnaní s nemodifikovanou protilátkou.
  9. 9. Protilátka alebo jej fragment viažuci antigén podľa nároku 5, pričom protilátka alebo fragment sú mutované v aminokyselinovom zvyšku, ktorý je glykozylačným miestom, čím je glykozylačné miesto eliminované.
  10. 10. Protilátka alebo jej fragment viažuci protilátku podľa nároku 9, ktorá obsahuje vo svojom ťažkom reťazci mutáciu N297Q podľa systému číslovania EU.
  11. 11. Kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje protilátku alebo jej fragment viažuci antigén podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10 a farmaceutický prijateľný nosič.
  12. 12. Sekvencia izolovanej nukleovej kyseliny obsahujúca DNA, ktorá je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z:
    a) kódujúcej sekvencie pre SEQ ID NO: 1 a kódujúcej sekvencie pre SEQ ID NO: 2;
    b) kódujúcej sekvencie pre ľahký reťazec protilátky produkovanej hybridómom mAQC2 s ATCC prístupovým číslom PTA3273 a kódujúcej sekvencie pre ťažký reťazec protilátky produkovanej hybridómom mAQC2 s ATCC prístupovým číslom PTA3273;
    c) kódujúcej sekvencie pre ľahký reťazec protilátky produkovanej bunkovou líniou hAQC2 s ATCC prístupovým číslom PTA3275 a kódujúcej sekvencie pre ťažký reťazec protilátky produkovanej bunkovou líniou hAQC2 s ATCC prístupovým číslom PTA3275;
    d) kódujúcej sekvencie pre ťažký reťazec protilátky produkovanej bunkovou líniou haAQC2 s ATCC prístupovým číslom PTA3274;
    e) kódujúcej sekvencie pre ťažký reťazec protilátky produkovanej bunkovou líniou hsAQC2 s ATCC prístupovým číslom PTA3356;
    f) kódujúcej sekvencie pre zvyšky 1 až 106 zo SEQ ID NO: 3 a kódujúcej sekvencie pre zvyšky 1 až 118 zo SEQ ID NO: 4; a
    g) kódujúcej sekvencie pre protilátku anti-VLA-1 alebo jej fragment viažuci antigén, ktorých úseky určujúce komplementaritu ľahkého reťazca sú definované aminokyselinovými zvyškami 24 až 33, 49 až 55 a 88 až 96 zo SEQ ID NO: 1, a ktorých úseky určujúce komplementaritu ťažkého reťazca sú definované aminokyselinovými zvyškami 31 až 35, 50 až 65 a 98 až 107 zo SEQ ID NO: 2.
  13. 13. Použitie kompozície podľa nároku 11 na prípravu farmaceutickej kompozície na liečenie imunologických porúch.
  14. 14. Spôsob určovania hladiny VLA-1 in vitro v tkanive, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje kroky, keď sa tkanivo privedie do kontaktu s protilátkou podľa nároku 1 a deteguje sa väzba protilátky ku tkanivu, čím sa určí hladina VLA-1 v tkanive.
  15. 15. Použitie kompozície podľa nároku 11 na prípravu kompozície na určovanie hladiny VLA-1 v tkanive na použitie v diagnostike imunologických porúch.
  16. 16. Bunka z bunkovej línie hAQC2 s ATCC prístupovým číslom PTA3275, haAQC2 s ATCC prístupovým číslom PTA3274, hsAQC2 s ATCC prístupovým číslom PTA335 6 alebo z hybridómu mAQC2 s ATCC prístupovým číslom PTA3273.
  17. 17. Spôsob identifikácie inhibítora I domény integrínu, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje kroky, keď sa
    a) použijú štruktúrne koordináty aminokyselín hAQC2 obsahujúce zvyšky ľahkého reťazca Asn30, Tyr48, Trp90, Asn93 a Trp95 a zvyšky ťažkého reťazca Arg31, His56, Tyr58, GlylOO a AsplOl, alebo hodnota odmocniny priemerného štvorca odchýlok atómov hlavného reťazca aminokyselín hAQC2 najviac ± 1,10 Ä, na vytvorenie trojrozmernej štruktúry väzbového miesta,
    SK 288124 Β6
    b) trojrozmerná štruktúra použije na navrhnutie alebo výber potenciálneho antagonistu,
    c) syntetizuje sa potenciálny antagonista a
    d) potenciálny antagonista privedie do kontaktu s hAQC2, aby sa určila schopnosť potenciálneho antagonistu interagovať s hAQC2, pričom schopnosť potenciálneho antagonistu interagovať s hAQC2 ukazuje, že po5 tenciálny antagonista je inhibítor I domény.
  18. 18. Použitie podľa nároku 13 alebo 15, pričom imunologická porucha je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z gastrointestinálnych porúch, autoimunitných ochorení, fibrózy, kožných porúch, vaskulámych ochorení, alergickej rinitídy, syndrómu respiračnej tiesne, astmy, bronchitídy, tendinitídy, burzitídy, migrény, nodóznej periarteritídy, tyroiditídy, aplastickej anémie, Hodgkinovej choroby, reumatickej horúčky, osteoartritídy, sar10 koidózy, nefrotického syndrómu, renálneho zlyhania, Bechetovho syndrómu, polymyozitídy, gingivitídy, hypersenzitivity, odmietnutie štepu a transplantátu, ochorenie spôsobené reakciou štepu proti hostiteľovi (graft versus host disease), konjunktivitídy, opuchov po poranení, ischémie myokardu a syndrómu endotoxínového šoku.
  19. 19. Protilátka alebo jej fragment viažuci antigén podľa niektorého z nárokov 1 až 10, pričom fragment
    15 viažuci antigén je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z Fab, F(ab')2 a jednoduchého reťazca Fv.
    131 výkresov
SK1374-2003A 2001-04-13 2002-04-12 Anti-VLA-1 antibody, composition comprising such antibodies, isolated nucleic acids sequence, use of composition, in vitro method of determining level of VLA-1 in tissue, cell of cell line hAQC2, haAQC2, hsAQC2 or hybridoma mAQC2 and method for identifying inhibitor of I domain of integrin SK288124B6 (sk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US28379401P 2001-04-13 2001-04-13
US30368901P 2001-07-06 2001-07-06
PCT/US2002/011521 WO2002083854A2 (en) 2001-04-13 2002-04-12 Antibodies to vla-1

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK13742003A3 SK13742003A3 (sk) 2004-07-07
SK288124B6 true SK288124B6 (sk) 2013-09-03

Family

ID=26962254

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1374-2003A SK288124B6 (sk) 2001-04-13 2002-04-12 Anti-VLA-1 antibody, composition comprising such antibodies, isolated nucleic acids sequence, use of composition, in vitro method of determining level of VLA-1 in tissue, cell of cell line hAQC2, haAQC2, hsAQC2 or hybridoma mAQC2 and method for identifying inhibitor of I domain of integrin

Country Status (29)

Country Link
US (7) US7358054B2 (sk)
EP (1) EP1423431B1 (sk)
JP (2) JP4303475B2 (sk)
KR (1) KR100927670B1 (sk)
CN (1) CN1561345B (sk)
AR (1) AR036330A1 (sk)
AT (1) ATE471344T1 (sk)
AU (1) AU2002258778C1 (sk)
BG (1) BG66334B1 (sk)
BR (1) BRPI0209792B8 (sk)
CA (1) CA2443903C (sk)
CZ (1) CZ303450B6 (sk)
DE (1) DE60236735D1 (sk)
EA (1) EA006705B1 (sk)
EE (1) EE200300509A (sk)
ES (1) ES2347532T3 (sk)
GE (1) GEP20074252B (sk)
HU (1) HUP0402250A3 (sk)
IL (3) IL158376A0 (sk)
IS (1) IS6982A (sk)
MX (1) MXPA03009390A (sk)
MY (1) MY138286A (sk)
NO (1) NO20034554L (sk)
NZ (1) NZ529494A (sk)
PL (1) PL367324A1 (sk)
SK (1) SK288124B6 (sk)
UA (1) UA83791C2 (sk)
WO (1) WO2002083854A2 (sk)
YU (1) YU80903A (sk)

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2529706T3 (es) 1999-06-01 2015-02-24 Biogen Idec Ma Inc. Un anticuerpo monoclonal bloqueante contra el dominio alfa1-I de VLA-1, y su uso para el tratamiento de trastornos inflamatorios
SK288124B6 (sk) 2001-04-13 2013-09-03 Biogen Idec Ma Inc. Anti-VLA-1 antibody, composition comprising such antibodies, isolated nucleic acids sequence, use of composition, in vitro method of determining level of VLA-1 in tissue, cell of cell line hAQC2, haAQC2, hsAQC2 or hybridoma mAQC2 and method for identifying inhibitor of I domain of integrin
MY154009A (en) 2002-03-13 2015-04-30 Biogen Idec Inc Anti-alpha v beta 6 antibodies
WO2005073385A1 (ja) * 2004-01-29 2005-08-11 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology 遺伝子導入効率を上昇させるための組成物および方法
DK3050963T3 (da) 2005-03-31 2019-12-09 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fremgangsmåde til fremstilling af polypeptid ved regulering af arrangement
WO2006124269A2 (en) * 2005-05-16 2006-11-23 Amgen Fremont Inc. Human monoclonal antibodies that bind to very late antigen-1 for the treatment of inflammation and other disorders
WO2006133286A2 (en) * 2005-06-07 2006-12-14 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Treatment of tnf antagonist-resistant inflammatory disorders and related methods
CN102875681A (zh) 2005-07-08 2013-01-16 拜奥根Idec马萨诸塞公司 抗-αvβ6抗体及其用途
EP3345616A1 (en) 2006-03-31 2018-07-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody modification method for purifying bispecific antibody
US11046784B2 (en) * 2006-03-31 2021-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
AU2013204572B2 (en) * 2006-05-25 2015-06-18 Biogen Ma Inc. Methods of Treating Stroke
AU2007267579B2 (en) * 2006-05-25 2013-05-30 Biogen Ma Inc. Methods of treating stroke
WO2008008315A2 (en) 2006-07-10 2008-01-17 Biogen Idec Ma Inc. Compositions and methods for inhibiting growth of smad4-deficient cancers
EP1878747A1 (en) 2006-07-11 2008-01-16 greenovation Biotech GmbH Glyco-engineered antibodies
EP2031064A1 (de) * 2007-08-29 2009-03-04 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG Verfahren zur Steigerung von Proteintitern
MX369784B (es) 2007-09-26 2019-11-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Metodo de modificacion del punto isoelectrico de anticuerpos mediante la sustitucion de aminoacidos en region de determinacion de complementariedad (cdr).
CA2700394C (en) * 2007-09-26 2017-10-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant region
AU2008332271C1 (en) 2007-12-05 2014-04-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-NR10 antibody and use thereof
CN107551270A (zh) 2008-04-11 2018-01-09 中外制药株式会社 与多个分子的抗原反复结合的抗原结合分子
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
BRPI0921665A2 (pt) * 2008-11-13 2019-04-16 Femta Pharmaceuticals, Inc. humanizado anti-il-6 anticorpos
TWI646193B (zh) 2009-03-19 2019-01-01 中外製藥股份有限公司 抗體恆定區域改變體
WO2010107110A1 (ja) 2009-03-19 2010-09-23 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
CA2761891A1 (en) 2009-05-15 2010-11-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-axl antibody
US10150808B2 (en) 2009-09-24 2018-12-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
EA201792376A3 (ru) * 2009-10-23 2018-08-31 Милленниум Фармасьютикалз, Инк. Молекулы анти-gcc антитела и соответствующие композиции и способы
WO2011108714A1 (ja) 2010-03-04 2011-09-09 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
RU2620071C2 (ru) 2010-11-17 2017-05-22 Чугаи Сеияку Кабушики Каиша Мультиспецифическая связывающая антиген молекула, которая обладает альтернативной функцией к функции фактора свертывания крови viii
RU2658504C9 (ru) 2010-11-30 2018-08-21 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антигенсвязывающая молекула, способная многократно связываться с множеством антигенных молекул
CN103370081A (zh) * 2011-02-03 2013-10-23 桑塔鲁斯股份有限公司 受试者的选择和治疗
DK3489255T3 (da) 2011-02-10 2021-08-23 Roche Glycart Ag Muterede interleukin-2-polypeptider
KR20230005405A (ko) 2011-02-25 2023-01-09 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 ＦｃγＲＩＩｂ 특이적 Ｆｃ 항체
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
TW201817744A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
EP2762493B1 (en) 2011-09-30 2021-06-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
ES2732243T3 (es) * 2012-02-16 2019-11-21 Santarus Inc Composiciones farmacéuticas de anticuerpos ANTI-VLA1 (CD49A)
CA2871614C (en) 2012-04-27 2021-08-31 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Anti-gcc antibody molecules and use of same to test for susceptibility to gcc-targeted therapy
EA032192B1 (ru) 2012-07-13 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Биспецифическое антитело к vegf/ang-2, нуклеиновая кислота, кодирующая это антитело, вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, клетка-хозяин, способ получения биспецифического антитела и содержащая его фармацевтическая композиция
RU2662991C2 (ru) 2013-03-12 2018-07-31 Биокон Лтд. Слитые иммуномодулирующие белки и способы их получения
WO2014143739A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Biogen Idec Ma Inc. Anti-alpha v beta 6 antibodies and uses thereof
US10035859B2 (en) 2013-03-15 2018-07-31 Biogen Ma Inc. Anti-alpha V beta 6 antibodies and uses thereof
US11124576B2 (en) 2013-09-27 2021-09-21 Chungai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide heteromultimer
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
TWI808330B (zh) 2014-12-19 2023-07-11 日商中外製藥股份有限公司 抗肌抑素之抗體、含變異Fc區域之多胜肽及使用方法
TW201809008A (zh) 2014-12-19 2018-03-16 日商中外製藥股份有限公司 抗ｃ５抗體及使用方法
SG10201907215QA (en) 2015-02-05 2019-09-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibodies Comprising An Ion Concentration Dependent Antigen-Binding Domain, Fc Region Variants, Il-8-Binding Antibodies, And Uses Therof
TWI805046B (zh) 2015-02-27 2023-06-11 日商中外製藥股份有限公司 Il-6受體抗體用於製備醫藥組成物的用途
EP3279216A4 (en) 2015-04-01 2019-06-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha PROCESS FOR PREPARING POLYPEPTIDE HETERO OLIGOMER
JP7141336B2 (ja) 2015-12-25 2022-09-22 中外製薬株式会社 抗ミオスタチン抗体および使用方法
CA3004288A1 (en) 2015-12-28 2017-07-06 Nobuyuki Tanaka Method for promoting efficiency of purification of fc region-containing polypeptide
CA3016424A1 (en) 2016-03-14 2017-09-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell injury inducing therapeutic drug for use in cancer therapy
SG11201801024XA (en) 2016-08-05 2018-05-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Therapeutic or preventive compositions for il-8-related diseases
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
US11851486B2 (en) 2017-05-02 2023-12-26 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils
WO2019018688A1 (en) * 2017-07-20 2019-01-24 The University Of Virginia Patent Foundation METHODS OF TREATING OR PREVENTING A NEUROLOGICAL DISORDER OF THE IMMUNE SYSTEM
TWI827585B (zh) 2018-03-15 2024-01-01 日商中外製藥股份有限公司 對茲卡病毒具有交叉反應性的抗登革病毒抗體及其使用方法
MA54752A (fr) * 2019-01-14 2021-11-24 Univ Virginia Patent Foundation Utilisation d'inhibiteurs d'intégrine pour le traitement ou la prévention d'un trouble immunitaire neurologique et/ou d'une lésion du système nerveux

Family Cites Families (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
JP3101690B2 (ja) * 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
AU7247191A (en) * 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US6673986B1 (en) * 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) * 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) * 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5789650A (en) * 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5391481A (en) * 1990-08-31 1995-02-21 The Trustees Of Columbia University Antibody which is directed against and inhibits collagen binding to a VLA-1 epitope and uses thereof
US5871907A (en) * 1991-05-15 1999-02-16 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
ATE255131T1 (de) 1991-06-14 2003-12-15 Genentech Inc Humanisierter heregulin antikörper
ES2136092T3 (es) * 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
DE69309044T3 (de) 1992-01-13 2004-12-23 Biogen, Inc., Cambridge Behandlung von asthma
US5733743A (en) * 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US6307026B1 (en) * 1992-12-10 2001-10-23 Celltech Limited Humanized antibodies directed against A33 antigen
NZ261259A (en) 1993-01-12 1996-12-20 Biogen Inc Humanised recombinant anti-vla4 antibody and diagnostic compositions and medicaments
DK0682529T4 (da) 1993-02-09 2006-05-15 Biogen Idec Inc Antistof til behandling af insulinkrævende diabetes
US6111598A (en) * 1993-11-12 2000-08-29 Peveo, Inc. System and method for producing and displaying spectrally-multiplexed images of three-dimensional imagery for use in flicker-free stereoscopic viewing thereof
US5827690A (en) * 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
ES2424292T3 (es) 1994-01-25 2013-09-30 Biogen Idec Ma Inc. Anticuerpos humanizados contra la molécula de adhesión leucocitaria VLA-4
US5840299A (en) 1994-01-25 1998-11-24 Athena Neurosciences, Inc. Humanized antibodies against leukocyte adhesion molecule VLA-4
ES2151054T3 (es) * 1994-04-26 2000-12-16 Kanebo Ltd Farmaco para el tratamiento de la artritis reumatoide.
JPH08131185A (ja) 1994-11-14 1996-05-28 Sumitomo Electric Ind Ltd マウスｖｌａ−１分子に対するモノクローナル抗体
JPH08160972A (ja) 1994-12-01 1996-06-21 Sega Enterp Ltd エフェクト制御方法、制御装置およびこれを利用したカラオケ装置
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
GB9516399D0 (en) 1995-08-10 1995-10-11 Camelot Superabsorbents Ltd Process for the production of water-absorbing compositions
DE69621940T2 (de) * 1995-08-18 2003-01-16 Morphosys Ag Protein-/(poly)peptidbibliotheken
ATE352613T1 (de) 1995-08-29 2007-02-15 Kirin Brewery Chimäres tier und methode zu dessen herstellung
DE19534177A1 (de) * 1995-09-15 1997-03-20 Merck Patent Gmbh Cyclische Adhäsionsinhibitoren
GB9519667D0 (en) 1995-09-27 1995-11-29 Univ Manchester Pharmaceutical composition
DE19541844C1 (de) * 1995-11-09 1997-07-24 Gsf Forschungszentrum Umwelt Verfahren zur Herstellung von menschlichen Antikörpern und deren Verwendung
US6127524A (en) * 1996-10-18 2000-10-03 Dade Behring Inc. Binding molecules and computer-based methods of increasing the binding affinity thereof
JP4215172B2 (ja) 1996-12-03 2009-01-28 アムジェン フレモント インク． 複数のＶ▲下Ｈ▼およびＶ▲下κ▼領域を含むヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック哺乳動物、ならびにそれから産生される抗体
ATE230277T1 (de) 1997-06-13 2003-01-15 Genentech Inc Stabilisierte antikörperformulierung
NZ508317A (en) 1998-05-22 2004-01-30 Boys Town Nat Res Hospital Use of alpha1beta1 integrin receptor inhibitors and tgf-beta1 inhibitors in the treatment of kidney disease
DE19831710A1 (de) * 1998-07-15 2000-01-20 Merck Patent Gmbh Diacylhydrazinderivate
JP2003513005A (ja) 1998-10-06 2003-04-08 バイオジェン インコーポレイテッド α１β１インテグリンＩ−ドメインの結晶およびそれらの使用
RS50086B (sr) * 1999-04-22 2009-01-22 Biogen Idec Ma Inc., Upotreba antagonista subjedinica alfa-4 integrina za pripremanje farmaceutskog preparata za tretiranje fibroze
ES2529706T3 (es) 1999-06-01 2015-02-24 Biogen Idec Ma Inc. Un anticuerpo monoclonal bloqueante contra el dominio alfa1-I de VLA-1, y su uso para el tratamiento de trastornos inflamatorios
AU4545600A (en) 1999-06-17 2001-01-09 Kai Desinger Surgical, grooved director for collecting tissue in a minimally invasive manner
AU4259901A (en) 2000-03-28 2001-10-08 Cambridge University Technical Services Limited Receptor/peptide crystal structure for identification of inhibitors
US8288322B2 (en) 2000-04-17 2012-10-16 Dyax Corp. Methods of constructing libraries comprising displayed and/or expressed members of a diverse family of peptides, polypeptides or proteins and the novel libraries
DE10028402A1 (de) 2000-06-13 2001-12-20 Merck Patent Gmbh Pyridin-2-yl-aminoalkycarbonylglycyl-beta-alanin und Derivate
US7153944B2 (en) 2000-07-31 2006-12-26 The General Hospital Corporation High affinity integrin polypeptides and uses thereof
SK288124B6 (sk) 2001-04-13 2013-09-03 Biogen Idec Ma Inc. Anti-VLA-1 antibody, composition comprising such antibodies, isolated nucleic acids sequence, use of composition, in vitro method of determining level of VLA-1 in tissue, cell of cell line hAQC2, haAQC2, hsAQC2 or hybridoma mAQC2 and method for identifying inhibitor of I domain of integrin
AU2003215298A1 (en) 2002-02-14 2003-09-04 Biogen, Inc. Alpha1beta1 antagonists for treatment of atherosclerosis
AU2003248982B2 (en) 2002-08-01 2009-12-10 Immunomedics, Inc. Alpha-fetoprotein immu31 antibodies and fusion proteins and methods of use thereof
US20040208870A1 (en) 2003-01-30 2004-10-21 Medimmune, Inc. Stabilized high concentration anti-integrin alphanubeta3 antibody formulations
WO2005016883A2 (en) 2003-08-14 2005-02-24 Icos Corporation Acrylamide derivatives as vla-1 integrin antagonists and uses thereof
WO2005019200A2 (en) 2003-08-14 2005-03-03 Icos Corporation Aryl piperidine derivatives as vla-1 integrin antagonists and uses thereof
US7285530B2 (en) 2004-10-21 2007-10-23 Viron Therapeutics, Inc. Use of SERP-1 as an antiplatelet agent
WO2006124269A2 (en) 2005-05-16 2006-11-23 Amgen Fremont Inc. Human monoclonal antibodies that bind to very late antigen-1 for the treatment of inflammation and other disorders
WO2006133286A2 (en) 2005-06-07 2006-12-14 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Treatment of tnf antagonist-resistant inflammatory disorders and related methods
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
MY149159A (en) 2005-11-15 2013-07-31 Hoffmann La Roche Method for treating joint damage
US20080118496A1 (en) 2006-04-10 2008-05-22 Medich John R Uses and compositions for treatment of juvenile rheumatoid arthritis
JO3324B1 (ar) 2006-04-21 2019-03-13 Amgen Inc مركبات علاجية مجففة بالتبريد تتعلق بالعصارة الهضمية
AU2007267579B2 (en) 2006-05-25 2013-05-30 Biogen Ma Inc. Methods of treating stroke
JP4951596B2 (ja) 2008-07-31 2012-06-13 株式会社日立製作所 冷却システム及び電子装置
TW201039854A (en) 2009-03-06 2010-11-16 Genentech Inc Antibody formulation
WO2011084750A1 (en) 2009-12-21 2011-07-14 Genentech, Inc. Antibody formulation
CN103370081A (zh) 2011-02-03 2013-10-23 桑塔鲁斯股份有限公司 受试者的选择和治疗
US9018035B2 (en) 2012-01-11 2015-04-28 Panasonic Intellectual Property Management Co., Ltd. Pressed-contact type semiconductor device and method for manufacturing the same
ES2732243T3 (es) 2012-02-16 2019-11-21 Santarus Inc Composiciones farmacéuticas de anticuerpos ANTI-VLA1 (CD49A)

Also Published As

Publication number Publication date
EA006705B1 (ru) 2006-02-24
KR100927670B1 (ko) 2009-11-20
BG108340A (bg) 2004-10-29
EP1423431B1 (en) 2010-06-16
US20090010930A1 (en) 2009-01-08
BRPI0209792B8 (pt) 2021-05-25
WO2002083854A3 (en) 2004-04-08
DE60236735D1 (de) 2010-07-29
JP2009079047A (ja) 2009-04-16
BG66334B1 (bg) 2013-06-28
US7910099B2 (en) 2011-03-22
EP1423431A2 (en) 2004-06-02
US9644030B2 (en) 2017-05-09
US10336826B2 (en) 2019-07-02
WO2002083854A9 (en) 2003-11-06
CA2443903C (en) 2018-03-20
CZ20033039A3 (cs) 2004-03-17
CN1561345B (zh) 2011-09-14
NO20034554L (no) 2003-12-15
WO2002083854A2 (en) 2002-10-24
HUP0402250A3 (en) 2007-06-28
KR20040062879A (ko) 2004-07-09
AU2002258778A2 (en) 2002-10-28
AU2002258778C1 (en) 2008-12-04
US20170335000A1 (en) 2017-11-23
CN1561345A (zh) 2005-01-05
IL213564A0 (en) 2011-07-31
IL158376A0 (en) 2004-05-12
US8084028B2 (en) 2011-12-27
US20150299323A1 (en) 2015-10-22
US20100272716A1 (en) 2010-10-28
MXPA03009390A (es) 2004-01-29
UA83791C2 (ru) 2008-08-26
MY138286A (en) 2009-05-29
ES2347532T3 (es) 2010-11-02
EA200301117A1 (ru) 2004-08-26
US7723073B2 (en) 2010-05-25
GEP20074252B (en) 2007-12-10
CA2443903A1 (en) 2002-10-24
IS6982A (is) 2003-10-08
EE200300509A (et) 2004-08-16
NO20034554D0 (no) 2003-10-10
US7358054B2 (en) 2008-04-15
IL213564B (en) 2018-06-28
ATE471344T1 (de) 2010-07-15
YU80903A (sh) 2006-05-25
EP1423431A4 (en) 2005-04-27
JP2004536580A (ja) 2004-12-09
US20110189177A1 (en) 2011-08-04
IL158376A (en) 2011-07-31
CZ303450B6 (cs) 2012-09-19
NZ529494A (en) 2005-08-26
PL367324A1 (en) 2005-02-21
AU2002258778B2 (en) 2008-01-17
SK13742003A3 (sk) 2004-07-07
BRPI0209792B1 (pt) 2017-03-28
AR036330A1 (es) 2004-09-01
US20120177638A1 (en) 2012-07-12
JP4303475B2 (ja) 2009-07-29
HUP0402250A2 (hu) 2005-01-28
BR0209792A (pt) 2005-04-26
US20040081651A1 (en) 2004-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10336826B2 (en) Antibodies to VLA-1
AU2002258778A1 (en) Antibodies to VLA-1
US20120087925A1 (en) Method for the treatment of inflammatory disorders
ZA200308568B (en) Antibodies to VLA-1.

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20210412