CZ20033039A3 - Protilátky k VLA-1, přípravky obsahující tyto protilátky, nukleové kyseliny kódující tyto protilátky a hybridomy produkující tyto protilátky - Google Patents

Protilátky k VLA-1, přípravky obsahující tyto protilátky, nukleové kyseliny kódující tyto protilátky a hybridomy produkující tyto protilátky Download PDF

Info

Publication number
CZ20033039A3
CZ20033039A3 CZ20033039A CZ20033039A CZ20033039A3 CZ 20033039 A3 CZ20033039 A3 CZ 20033039A3 CZ 20033039 A CZ20033039 A CZ 20033039A CZ 20033039 A CZ20033039 A CZ 20033039A CZ 20033039 A3 CZ20033039 A3 CZ 20033039A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
domain
antibody
residues
amino acid
readable data
Prior art date
Application number
CZ20033039A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ303450B6 (cs
Inventor
Paul D. Lyne
Ellen A. Garber
Jose W. Saldanha
Michael Karpusas
Original Assignee
Biogen Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen Inc. filed Critical Biogen Inc.
Publication of CZ20033039A3 publication Critical patent/CZ20033039A3/cs
Publication of CZ303450B6 publication Critical patent/CZ303450B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C07K16/2842—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta1-subunit-containing molecules, e.g. CD29, CD49
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/06—Antimigraine agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Obesity (AREA)

Description

Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká protilátek k integrinu VLA-1 a použití těchto protilátek pro přípravu léčiva pro léčení zánětlivých nemocí a dalších imunologických poruch. Vynález se také týká krystalové struktury komplexu vytvořeného jednou takovou protilátkou a al-I doménou VLA-1, a dále použití těchto strukturích informací pro počítačové návrhování léčiv.
Dosavadní stav techniky
Integriny tvoří superrodinu receptorů buněčného povrchu, které zprostředkovávají adhezi buňka-buňka a buňka-matrix. Tyto proteiny jsou známy tím, že poskytují ukotvení a také signály pro buněčný růst, migraci a diferenciaci během vývoje a regenerace tkání. Soudí se, že se také podílejí na imunitních a zánětlivých procesech. Integriny jsou heterodimerické proteiny složené ze dvou nekovalentně spojených polypeptidových řetězců, oí a β. Aminokonec každého řetězce vytváří kulovitou „hlavu, která přispívá k meziřetězcové vazbě a k vazbě ligandu. Tyto kulovité hlavy jsou připojeny k transmembránovým segmentům tzv. „stonky. Cytoplazmatické „ocásky jsou obvykle dlouhé méně než 50 • · · ·· ♦ « • · aminokyselinovýh zbytků. Integrinové subrodiny byly původně definovány na základě toho, že β podjednotka byla použita ke vzniku heterodimerů. Integriny obsahující βΐ jsou také nazývány VLA molekuly, což souvisí se vztahem k antigenům velmi pozdní aktivace („very latě activation). Označení VLA-1 až VLA-6 se týkají subrodiny obsahující al až a6 (tj. CD49a až CD49f), v daném pořadí. Pro obecný přehled viz např. Cellular and Molecuiar Immunology, eds. Abul K. Abbas et al., W. B. Saunders Company, Philadelphia, PA, 2000.
Kolagen (jak typu I tak typu IV) a laminin jsou známé ligandy αϊβΐ integrinu (tj. VLA-1). Má se za to, že VLA-1 se podílí na buněčné adhezi a migraci na kolagenu (Keely et al., 1995, J. Cell Sci. 108: 595-607, Gotwals et al., 1996, J. Clin. Invest. 97: 469-2477), podporuje kontrakce a reorganizaci kolagenové matrice, je rozhodující komponentou při hojení ran (Gotwals et al., výše a Chiro, 1991,Cell 67: 403-410), a účastní se řízení exprese genů zapojených do reorganizace extracelulární matrix (Riikonen et al., 1995,J. Biol. Chem. 270: 1-5, and Langholz et al., 1995, J. Cell Biol. 131: 1903-1915). Takže nesprávná regulace VLA-1 může mít za následek určité patologické stavy, jako například fibrózu.
Navíc bylo také navrženo, že VLA-1 by mohl hrát úlohu v onemocněních, která jsou způsobena T lymfocyty/monocyty. anti-VLA-1 protilátky blokují expresi cytokinu závislou na T lymfocytech (Miyake et al., 1993, J.Exp. Med. 177: 863-868).
Exprese VLA-1 je zvýšena u perzistentně aktivovaných, 2 až 4 týdny starých, kutivovaných T lymfocytech (Hemler et al., 1985, Eur. J. Immunol. 15: 502-508). VLA-1 je také exprimován na vysokém procentu T lymfocytů izolovaných ze synovia pacientů s revmatoidní artritidou (Hemler et al., 1986, J.
Clin. Invest. 78: 692-702).
- 3 Několik krystalových struktur integrinové podjednotky a bylo určeno, včetně struktury domény a2-I z α2β1 (PDB přístupový kód laox, Emsley et al., 1997, J.Biol. Chem. 272: 28512-28517), al-I domény z potkanního αϊβΐ (PDB přístupový kód lck4, Nolte et al., 1999, FEBS Lett. 452: 379-385,
WO00/20459), al podjednotky humánního αϊβΐ (PDB přístupový kód lqc5, Rich et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 24906-24913), aL-I a aM-I domén a vWF-A3 (Lee et al., 1995, Cell 80: 631-635, Lee et al., 1995, Structure 3: 1333-1340, Qu et al., 1995, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92:10277-10281, Qu et al., 1996, Structure 4:931- 942). Struktura α2β1 byla odhalena jako šroubovice (helix) (tj . C-helix), která tvoří zářez nebo rýhu na jedné straně proteinu ve vazebném místě pro ion kovu (Emsley et al., supra).
Krystalová struktura «2-1 domény v komplexu s krátkým trojšroubovicovým peptidem na bázi kolagenu odhalila, že peptid na bázi kolagenu byl vázán k zářezu, kde aminokyseliny a2-I, které vytvářely intermolekulární kontakty nebo kontakty s kovem, byly Aspl51, Asnl54, Tyrl57, Gln215, Asp219, Leu220, Thr221, Asp254, Glu256, His258, Tyr285, Leu286, Asn289,
Leu291, Asn295 a Lys298 (PDB přístupový kód ldzi, Emsley et al., 2000, Cell 101: 47-56, WOOl/73444). Bezprostředně výše uvedené číslování aminokyselin je založeno na sekvenci s PDB přístupovým kódem ldzi, a v tomto textu se na ně dále odkazuje jako na „krystalové číslování. Krystalové struktury «1-1 domén laboratorního potkana a člověka vykazovaly podobné zářezy.
- 4 Podstata vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje protilátky anti-VLA-1, a dále se týká použití těchto protilátek při léčení celé řady zánštlivých a imunologických onemocnění.
Konkrétně se vynález týká protilátky, která se specificky váže k VLA-1 (např, humánnmu VLA-1). Tato protilátka obsahuje úseky určující komplementaritu (CDR) lehkého řetězce definované aminokyselinovými zbytky 24 až 33, 49 až 55 a 88 až 96 ze sekvence uvedené v seznamu sekvencí jako sekv. id. č. 1, a/nebo úseky určující komplementaritu těžkého řetězce definované aminokyselinovými zbytky 31 až 35, 50 až 65 a 98 až 107 ze sekvence uvedené zde v seznamu sekvencí jako sekv. id. č. 2. Tyto úseky CDR mohou obsahovat mutace (např. delece, inzerce a/nebo substituce) v částech, které nejsou v kontaktu s antigenem, jak bylo určeno z krystalové struktury popsané v tomto textu, aniž by to ovlivnilo VLA-l-vazebnou aktivitu protilátky, příklady takových mutací jsou S24N, G92S a D101A v CDR lehkého řetězce a G55S v CDR2 těžkého řetězce. V jednom provedení protilátka podle vynálezu obsahuje sekvenci id. č. 1 variabilní domény lehkého řetězce a/nebo sekvenci id. č. 2 variabilní domény těžkého řetězce.
V příbuzném provedení protilátka podle vynálezu obsahuje stejnou polypeptidovou sekvenci těžkého a lehkého řetězce jako protilátka produkovaná hybridomem mAQC2, který byl uložen 18. dubna 2001 v Americké sbírce mikroorganizmů (American Type Culture Collection, ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) a má ATCC přístupové číslo PTA3273. (Všechna uložení v ATCC popsaná v tomto textu byla provedena ve smyslu Budapešťské smlouvy) . Tato protilátka může být tedy produkována například hybridomem mAQC2 nebo buňkami, které • 9 ♦ 9 obsahují sekvenci nukleové kyseliny izolovanou z uvedeného hybridomu, kterážto sekvence kóduje těžký a lehký řetězec monoklonální protilátky mAQC2.
V dalším provedení vynálezu protilátka je humanizován protilátka obsahující alespoň jeden (např. 2, 3, 4 nebo 5) z následujících zbytků ve svém lehkém řetězci: Ql, L4, P46, W47 a Y71, nebo alespoň jeden (např. 2, 3, 4, 5, 6 nebo 7) z následujících zbytků ve svém těžkém řetězci: Dl, V12, S28,
F29, A49, T93, R94 (číslování odpovídá konvenci podle Kabata). Například protilátka obsahuje Ql, L4 a Y71 v lehkém řetězci a/nebo (i) F29, A49, T93 a R94 nebo (ii) A49 a T93 v těžkém řetězci.
Humanizovaná protilátka podle předkládaného vynálezu může obsahovat sekvenci variabilní domény lehkého řetězce definovanou aminokyselinovými zbytky 1 až 106 ze sekv. id.
č. 3 a/nebo sekvenci variabilní domény těžkého řetězce definovanou aminokyselinovými zbytky 1 až 118 ze sekv. id.
č. 4. Humanizovaná protilátka může obsahovat stejné polypeptidové sekvence těžkého a/nebo lehkého řetězce jako protilátka produkovaná buněčnou linií hAQC2 (ATCC přístupové číslo PTA3275, vzorek uložen 18. dubna 2001).
V dalším provedení humanizován protilátka podle vynálezu může obsahovat mutaci (např. deleci, substituci nebo adici) v jedné nebo více (např. 2, 3, 4, 5, 6, 7 nebo 8) určitých poloh těžkého řetězce, takže efektorová funkce protilátky (např. schopnost protilátky vázat se k Fc receptoru nebo faktoru komplementu) je změněna, anž by byla ovlivněna schopnost protilátky vázat se k VLA-1 (U. S. Patent 5 648 260). Tyto polohy v těžkém řetězci zahrnují, aniž by výčet byl limitující, zbytky 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 a 322 (systém číslování EU) . humanizovaná protilátka může • 9 * · ·. 9 ·· · ·
- 6 například obsahovat mutace L234A (tj. leucin v poloze 234 nemodifikované protilátky je nahrazen alaninem) a L235A (systém číslování EU) v těžkém řetězci. V jednom příbuzném provedení protilátka obsahuje stejnou polypeptidovou sekvenci těžkého řetězce jako protilátka produkovaná buněčnou linií hsAQC2 (ATCC přístupové číslo PTA3356, vzorek uložen 4. května 2001).
V ještě dalším provedení humanizovaná protilátka podle vynálezu může obsahovat mutaci (např. deleci nebo substituci) v aminokyselinovém zbytku, který je místem pro glykosylaci, takže glykosylační místo je odstraněno. Taková protilátka může být klinicky přínosná tím, že má redukovanou efektorovou funkci nebo další nežádoucí funkce, přičemž si udržuje svoji vazebnou afinitu pro VLA-1. Mutace glykosylačního místa mohou být také přínosné pro vývoj postupů zpracování (např. exprese proteinu a jeho purifikace). Například těžký řetězec protilátky může obsahovat mutaci N297Q (systém číslování EU) , takže takový těžký řetězec nemůže být glykosylován v tomto místě. V jednom příbuzném provedení humanizovaná protilátka může obsahovat stejnou polypeptidovou sekvenci těžkého řetězce jako protilátka produkovaná buněčnou linií haAQC2 (ATCC přístupové číslo PTA3274, vzorek uložen 18. dubna 2001).
V ještě dalším provedeni těžký a/nebo lehký řetězec protilátky podle vynálezu obsahují mutace, které zvyšují afinitu vazby k VLA1 a proto zvyšují účinnost pro léčení VLA-l-zprostředkovaných chorobných stavů.
Předkládaný vynález dále zahrnuje přípravek obsahující protilátku podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič, izolovanou nukleovou kyselinu obsahující kódující sekvenci pro sekv. id. č. 1, izolovanou nukleovou kyselinu obsahující kódující sekvenci pro sekv. id. č. 2, izolovanou nukleovou • · · • ·· · · • f kyselinu obsahující kódující sekvenci pro lehký řetězec protilátky produkované hybridomem mAQC2, izolovanou nukleovou kyselinu obsahující kódující sekvenci pro těžký řetězec protilátky produkované hybridomem mAQC2, izolovanou nukleovou kyselinu obsahující kódující sekvenci pro lehký řetězec protilátky produkované buněčnou linií hAQC2, izolovanou nukleovou kyselinu obsahující kódující sekvenci pro těžký řetězec protilátky produkované buněčnou linií hAQC2, izolovanou nukleovou kyselinu obsahující kódující sekvenci pro těžký řetězec protilátky produkované buněčnou linií haAQC2, izolovanou nukleovou kyselinu obsahující kódující sekvenci pro těžký řetězec protilátky produkované buněčnou linií hsAQC2, izolovanou nukleovou kyselinu obsahující kódující sekvenci pro zbytky 1 až 106 ze sekv. id. č. 3, izolovanou nukleovou kyselinu obsahující kódující sekvenci pro zbytky 1 až 118 ze kv. id. č. 4, buňky hybridomu mAQC2, buňky z buněčné linie hAQC2, buňky z buněčné linie haAQC2 a buňky z buněčné linie hsAQC2.
Předkládaný vynález se také týká léčení pacienta s imunologickým onemocněním zprostředkovaným VLA-1, kteréžto léčení spočívá v tom, že se podává pacientovi účinné množství protilátky podle vynálezu. Například se tento způsob používá při léčení humánních pacientů ke zmírnění, zlepšení, stabilizování, reverzi, zabránění, zpomalení nebo zdržení průběhu onemocnění. Jinak se profylakticky k léčbě humánních tento způsob používá pacientů, kteří jsou že ze u nich rozvine toto imunologické to buď pro prevenci nebo pro zpoždění nástupu Účinné množství přípravku může být podáno v nebezpečí, onemocnění, a onemocnění.
v jedné nebo ve více dávkách.
K imunologický onemocněním zprostředkovaným VLA-1 patří ···· aniž by však tento výčet byl omezující, chorobné stavy, při kterých je hladina VLA-1 aktivity zvýšena v jedné nebo ve více tkáních ve srovnání s normálním zdravým jedincem. Příklady takových chorobných stavů jsou stavy příbuzné kožním nemocem (např. psoriáza, ekzém, popáleniny, dermatitida a abnormální proliferace buněk vlasových váčků), fibróza (např. ledvin nebo plicní fibróza), alergická rinitida, syndrom respiračního distessu, astma, bronchitida, tendinitida, bursitida, horečka, migrény, gastrointestinální onemocnění (např. zánětlivé onemocnění střev, Crohnova nemoc, gastritida, syndrom tračníku, kolitida a kolorektální karcinom), (např. ateroskleróza), periarteritida aplastická anémie, Hodgkinova nemoc, revmatická horečka, osteoartritida, autoimunní nemoci (např. diabetes typu I, myasthenia gravis, revmatoidní artritida, systémový lupus erythematosus a sclerosis multiplex), sarkoidóza, nefrotický syndrom, renální selhání, Bechetův syndrom, polymyositida, gingivitida, přecitlivělost (např. opožděný typ hypersentivity nebo okamžitá hypersenzitivita), rejekce štěpu a transplantátu, onemocnění způsobené reakcí štěpu proti hostitelovi (GVHD), konjunktivitida, otoky nastávající po poranění, ischémie myokardu a syndrom endotoxinového šoku.
dráždivého vaskulární onemocnění nodosa, thyroiditida,
Předkládaný vynález také poskytuje způsob pro určení hladiny VLA-1 v tkáni (např. vzorku tkáně a tělní tekutiny), který zahrnuje krok, kdy se tkáň přivede do kontaktu (např. in vivo nebo in vitro) s protilátkou podle vynálezu a pak se detekuje vazba protilátky k tkáni, čímž se určí hladina VLA-1 v tkáni.
Jak se v tomto textu používá termín protilátka podle vynálezu, může to být například myší protilátka, humanizovaná » ·
- 9 protilátka nebo chimérická protilátka. Může to být celá protilátka (tj. se dvěma kompletními lehkými řetězci a dvěma kompletními těžkými řetězci) kteréhokoliv izotypu a podtypu (např. IgM, IgD, IgG, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA a IgA2, s lehkým řetězcem buďto typu kappa nebo lambda). Jinak se termín protilátka podle vynálezu také týká antigen-vazebného fragmentu (např. Fab, F (ab')2 a jednoduchého řetězce Fv) z celé protilátky.
Předkládaný vynález dále poskytuje krystalizovatelné kompozice a krystaly komplexů vytvořených chimérickou potkanní/humánní al-I doménou (mutanta RÁH) a Fab fragmentem hAQC2, a dále se vynález týká použití těchto kompozic a krystalů. Vynález také poskytuje strukturní koordináty (souřadnice) a vazebná místa chimérické domény a hAQC2 Fab fragmentu. Atomové koordináty pocházející z krystalové struktury popsané v tomto textu poskytují strukturní východisko pro biologické aktivity hAQC2, a také základ pro racionální navrhování („rational design) VLA-1 agonistů nebo antagonistů s predikovanými biologickými aktivitami (např.
sloučenin patřících mezi tzv. malé jako například hAQC2 variant) . molekuly nebo protilátek
Krystalová struktura popsaná v tomto textu je první
krystalovou strukturou al-I domény z komplexu
αϊβΐ integrin/Fab. Tato struktura ukazuje zbytky kritické pro vazbu Fab doménou al-I. Kromě toho, Fab se váže v předpokládaném vazebném místě pro kolagen a inhibuje vazbu kolagenu. Aminokyselinové zbytky zjištěné ve vazebném místě al-I domény zahrnují Aspl54, Serl56, Asnl57, Serl58, Tyrl60, Glul92, Glu218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 a Leu294 (krystalové číslování). Zbytky na Fab fragmentu, o kterých bylo zjištěno, ····
-10že váží oíl-I doménu, zahrnují zbytky lehkého řetězce Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 a Trp95 a zbytky těžkého řetězce Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO a AsplOl (krystalové číslování).
Předkládaný vynález také poskytuje počítač pro přípravu trojrozměrné reprezentace molekulárního komplexu, kde molekulární komplex je definován souborem strukturních koordinát komplexu chimérické domény I z αϊβΐ integrinu RAH a humanizované protilátky hAQC2, podle obr. 19, nebo homologického molekulárního komplexu, kde homolog nemá hodnotu odmocniny průměrného čtverce odchylky od atomů hlavního řetězce aminokyseliny vyšší než 0,65 Á. Počítač obsahuje strojově čitelné médium pro ukládání dat (parně'tové médium) včetně dat kódovaných se strojově čitelnými daty, kde data obsahují alespoň část strukturních koordinát komplexu podle obr. 19, pracovní paměť pro uložení instrukcí pro zpracování strojově čitelných dat, centrální procesorovou jednotku spojenou s pracovní pamětí a s paměťovým médiem pro ukládání strojově čitelných dat pro zpracování strojově čitelných dat do trojrozměrných reprezentací, a displej spojený s centrální procesorovou jednotkou pro zobrazování trojrozměrných reprezentací.
Předkládaný vynález dále poskytuje počítač pro přípravu trojrozměrné reprezentace molekuly nebo molekulárního komplexu včetně vazebných míst definovaných strukturními koordinátami aminokyselin hAQC2 včetně alespoň sedmi (např. 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 nebo 16) zbytků lehkého řetězce Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 a Trp95 a zbytků těžkého řetězce Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO a Asp 101 (krystalové číslování), podle obr. 19, nebo homologu molekuly nebo molekulárního komplexu, kde homolog obsahuje • · · ·
* ·· · ·
- 11 vazebné místo, které má hodnotu odmocniny průměrného čtverce odchylky od atomů hlavního řetězce aminokyselin hAQC2 ne vyšší než 1,10 Á. Tento vynález také poskytuje počítač pro přípravu trojrozměrné reprezentace: vazebného místa definovaného strukturními koordinátami hAQC2 aminokyselin včetně alespoň sedmi (např. 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 nebo 16) zbytků lehkého řetězce Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 a Trp95 a zbytků těžkého řetězce Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO a AsplOl (krystalové číslování), podle obr. 19, vazebného místa homologu, které má hodnotu odmocniny průměrného čtverce odchylky od atomů hlavního řetězce aminokyselin hAQC2 ne vyšší než 1,10 Á.
Předkládaný vynález také poskytuje způsob identifikace inhibitorů domény I integrinu, který zahruje kroky použití strukturních koordinát hAQC2 aminokyselin včetně alespoň sedmi (např. 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 nebo 16) zbytků lehkého řetězce Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 a Trp95 a zbytků těžkého řetězce Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO a AsplOl (krystalové číslování), podle obr. 19, nebo ± hodnotu odmocniny průměrného čtverce odchylky od atomů hlavního řetězce aminokyselin hAQC2 ne vyšší než 1,10 Á, vytvoření trojrozměrné struktury vazebného místa, využití trojrozměrné struktury pro návrh nebo selekci potenciálního antagonisty, syntézu potenciálního antagonisty a kontaktování potenciálního antagonisty s hAQC2 pro určení schopnosti potenciálního antagonisty interagovat s hAQC2, přičemž schopnost potenciálního antagonisty interagovat s hAQC2 ukazuje, že potenciální antagonista je inhibitor domény I. Tento vynález dále poskytuje inhibitor domény I integrinu identifikovaný výše popsaným způsobem.
Tento vynález také poskytuje počítač pro přípravu ♦ ···
- 12 trojrozměrné reprezentace molekuly nebo molekulárního komplexu obsahujícího: vazebné místo definované strukturními koordinátami aminokyselinových zbytkům domény I Asp 154, Serl56, Asnl57, Serl58, Tyrl60, Glul92, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 a Leu294 (krystalové číslování) , podle obr. 19, nebo homologu molekuly nebo molekulárního komplexu, kde homolog zahrnuje druhé vazebné místo, které má hodnotu odmocniny průměrného čtverce odchylky od atomů hlavního řetězce aminokyselin domény nejvýše 0,65 Á. Tento vynález také poskytuje počítač pro přípravu trojrozměrné reprezentace: prvního vazebného místa definovaného strukturními koordinátami aminokyselinových zbytků I domény Aspl54, Serl56, Asnl57, Serl58, Tyrl60, Glul92, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 a Leu294 (krystalové číslování), podle obr. 19, nebo vazebného místa homologu, který má hodnotu odmocniny průměrného čtverce odchylky od atomů hlavního řetězce aminokyselin domény nejvýše 0,65 Á.
Tento vynález také poskytuje počítač pro přípravu trojrozměrné reprezentace molekuly nebo molekulárního komplexu obsahujícícho: vazebné místo definované strukturními koordinátami aminokyselin domény I včetně alespoň tři zbytků Glul92, Gln218, Arg219, Gly220 a Gly221 (krystalové číslování), podle obr. 19, nebo homologu molekuly nebo molekulárního komplexu, kde homolog zahrnuje druhé vazebné místo, které má hodnotu odmocniny průměrného čtverce odchylky od atomů hlavního řetězce aminokyselin I domény nejvýše 1,0 Á. Vynález dále poskytuje počítač pro přípravu trojrozměrné reprezentace vazebného místa definovaného strukturními koordinátami aminokyseliny I domény včetně alespoň tří zbytků z Glul92, Gln218, Arg219, Gly220 a Gly221 (krystalové ; . ···*
- 13 číslování), podle obr. 19, nebo vazebné místo homologa, které má hodnotu odmocniny průměrného čtverce odchylky od atomů hlavního řetězce aminokyselin domény I nejvýše 1,0 Á.
Tento vynález dále poskytuje způsoby použití trojrozměrné reprezentace pro návrh chemických entit, které asociují s chimérickou doménou nebo Fab fragmentem hAQC2 nebo jeho částí a působí jako potenciální inhibitory chimérické domény nebo
Fab fragmentu hAQC2 nebo jeho části. přípravků obsahujících
Tento vynález se také týká
chemické entity, jako například inhibitory a varianty
chimérické domény nebo variany Fab fragmentu hAQC2, kde takové chemické entity a varianty jsou racionálně navrženy prostřednictvím strukturních koordinát chimérické domény nebo Fab fragmentu hAQC2 nebo vazebných míst. Vynález se dále týká použití výše identifikovaných chemických sloučenin k léčení nebo prevenci onemocnění sdružených s nepatřičnou nebo abnormální aktivitou αϊβΐ u pacienta.
použijí strukturní I domény Aspl54, Serl56, Asnl57, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221,
Asp257, His261, Asn263, číslování), podle obr.
Tento vynález dále poskytuje způsob identifikace inhibitoru domény I integrinu, který zahrnuje kroky, kdy se koordináty aminokyselinových zbytků
Serl58, Tyrl60, Glul92,
Arg222, Gln223, Thr224,
Arg291 a Leu294 (krystalové 19, pro vytvoření trojrozměrné struktury vazebného místa, využije trojrozměrné struktury pro návrh nebo selekci potenciálního antagonisty, syntézu potenciálního antagonisty a kontaktuje potenciální antagonista s doménou I, aby se určila schopnost potenciálního antagonisty interagovat s doménou I, přičemž schopnost potenciálního antagonisty interagovat s doménou I ukazuje, že potenciální antagonista je inhibitor domény I.
Předkládaný vynález také poskytuje způsob identifikace inhibitoru domény I integrinu, zahrnující kroky použití strukturních koordinát alespoň tří aminokyselinových zbytků z Glul92, Gln218, Arg219, Gly220 a Gly221 (krystalové číslování) domény I podle obr. 19, nebo ± hodnotu odmocniny průměrného čtverce odchylky od atomů aminokyselin domény I nejvýše 0,65 Á, vytvoření trojrozměrné struktury vazebného místa, použití trojrozměrné struktury pro návrh nebo selekci potenciálního antagonisty, syntézu potenciálního antagonisty a kontaktování potenciálního antagonisty s doménou I, aby se určila schopnost potenciálního antagonisty interagovat s doménou I integrinu, přičemž schopnost potenciálního antagonisty interagovat s doménou I ukazuje, že potenciální antagonista je inhibitor domény I. Tento vynález také I integrinu identifikovaný tímto poskytuje inhibitor domény způsobem.
Další vlastnosti a z následujícího podrobného nároků.
výhody vynálezu budou zjevné popisu, příkladů, obrázků a
Popis obrázků
Obrázek 1. Integriny αϊβΐ aktivovaných leukocytech. (A) a α2β1 vázající kolagen na Analýza exprese al a α2β1 integrinů na IL-2 aktivovaných splenocytech (dli) užitím průtokové cytometrie. Buňky byly značeny buďto anti-αΐ mAb (monoklonální protilátkou) , anti-o/2 mAb nebo nevázající se kontrolní mAb (šedé linie) a poté FITC-anti-křeččí imunoglobulin. (B) Účinek anti-α a anti-a2 mAb na adhezi ♦ · • · · 9 ♦ ··*
- 15 leukocytů ke kolagenu. 105 IL-2 aktivovaných splenocytů bylo podrobeno působení uvedených mAb po dobu 15 minut před vysetím na destičky s jamkami potaženými kolagenem buďto typu IV nebo typu I na dobu 1 hodiny při 37 °C. Adheze byla vypočtena jak je znázorněno v příkladu 1 a vyjádřena jako % adheze vzhledem ke kontrolním buňkám ošetřeným mAb. Testy Adheze byly provedeny ve třech opakováních a byly provedeny přinejmenším tři nezávislé experimenty. Ukázán je jeden reprezentativní experiment.
Obrázek 2. Účinek anti-integrinových mAb na efektorovou fázi hypersenzitivity opožděného typu. SRBC-sensitizované myši byly inj i kovány i. p. uvedenými mAb, a to 1 hodinu před SRBC výzvou („challenge). Tloušťka polštářků tlapky (dále zkráceně jen tlapky) byla měřena 20 hodin po expozici antigenu a výsledky jsou ukázaný jako % zvýšení tloušťky ± střední chyba průměru (SEM), jak je znázorněno v příkladu 2. Data představují souhrn z osmi experimentů s n = 79 (PBS), 68 (kontrolní Ig křečka), 68 (anti-al), 29 (anti-a2), 18 (antioíl+anti-o(2) , 45 (anti-a4), 18 (anti-a5), 20 (anti-a6) a 10 (anti-βΐ). Byly použity mAb Ha4/8 (kontrolní křeččí Ig skupiny 2), Ha31/8 (anti-al), Hal/ 29 (anti-«2), PS/2 (anti-a4), 5H1027 (anti-«5), GoH3 (anti-a6) a HMPL-1 (anti-βΐ).
injikovány výzvou. Tloušťka
Obrázek 3. Účinek anti-integrinových mAb na efektorovou fázi kontaktní hypersenzitivity. FITC-sensitizované myši byly i. p. uvedenými mAb, a to 4 hodiny před FITC ušního boltce byla změřena na počátku (výchozí hodnota) a za 24 hodin, a výsledky byly uvedeny jako % zvýšení tloušťky ucha ± střední chyba průměru (SEM), jak je ilustrováno v příkladu 3. Tato data představují shrnutí devíti
AA AA
- 16 experimentů s n = 74 (PBS), 60 (kontrolní Ig křečka), 26 (anti-ICAM-1), 44 (anti-al), 44 (anti-a2), 38 (anti-al + antioí2), 36 (anti-a4), 16 (anti-a5), 26 (anti-a4 + anti-a5) , 24 (anti-αδ) a 22 (anti-βΐ). byly použity křečci mAb: Ha4/8 (kontrolní křečci Ig skupiny 2), Ha31/8 (anti-al), Hal/ (antia2), HMSS1-1 (anti-βΐ), 3E2 (anti-ICAM-1), a byly použity mAb laboratorního potkana: R35-95 a R35-38 (kontrolní IgG2a laboratorního potkana, a IgG2b laboratorního potkana, v daném pořadí), PS/2 (anti-a4), 5H10-27 (anti-a5), GoH3 (anti-a6).
Obrázek 4. reakce kontaktní hypersenzitivity u al-deficitní myši ve srovnání s myší divokého typu. FITC-sensitizované myši byly injikovány i. p. uvedenými mAb, a to 4 hodiny před FITC výzvou. Tloušťka ušního boltce byla změřena na počátku (výchozí hodnota) a za 24 hodin, a výsledky byly uvedeny jako % zvýšení tloušťky ucha ± střední chyba průměru (SEM), jak je ilustrováno v příkladu 4. Skupiny čtyř až pěti myší byly užity pro jednotlivé typy ošetření a všechny experimenty byly provedeny nejméně třikrát. Jeden reprezentativní experiment je ukázán.
Obrázek 5. Účinek anti-al a anti-a2 mAb na nespecifický zánět indukovaný krotonovým olejem. Myši byly injikovány i. p. uvedenými mAb 4 h před potřením uší krotonovým olejem. Tloušťka ucha byla změřena na počátku (bazální hodnota) a o 24 hodin později, a výsledky byly ukázána jako % zvýšení tloušťky ± střední chyba průměru, jak je znázorněno v příkladu 5. Skupiny čtyř až pěti myší byly užity pro jednotlivé typy ošetření a všechny experimenty byly provedeny nejméně třikrát. Jeden reprezentativní experiment je ukázán.
9 · · ; · ···· • · :
Obrázek 6. Účinek anti-al a a2 mAb na artritidu indukovanou mAb proti kolagenu. Myši byly injikovány i. p. anti-kolagen mAb v den 0, poté následované LPS v den 3. Myši byly injikovány i. p. uvedenými mAb každý 3. Den počínaje dnem 0. Klinická artritida byla patrná 2-3 dny po LPS injekci a trvala několik týdnů. Každá končetina byla ohodnocena podle škály 0 až 4 každý 3. den, jak je znázorněno v příkladu 6, a výsledky byly vajádřeny jako průměrné artritické skóre mezi dnem 9 a dnem 15 (+SEM) z údajů pro všechny čtyři končetiny. Data představují shrnutí ze čtyř experimentů, kdy každý experiment byl proveden na skupině tří až čtyři myší.
Obrázek 7. Účinek anti-oíl a a2 mAb na artritidu indukovanou mAb proti kolagenu.
A. Preventivní léčba myší buď anti-al nebo anti-a2 mAb snížila artritické skóre. Myši byly podrobeny působení antikolagen mAb v den 0, poté následoval LPS v den 3. Artritida byla .patrná v den 6 a pokračovala několik týdnů. Myši byly podrobeny působení uvedených mAb každý 3. den počínaje dnem 0. Každá končetina byla ohodnocena podle škály 0 až 4 každý 3. den, jak je znázorněno v příkladu 6, a výsledky byly vajádřeny jako průměrné artritické skóre mezi dnem 9 a dnem 15 (±SEM) pro všechny čtyři končetiny (maximální skóre 16) . Skupina čtyř myší byla použita pro každý druh experimetálního ošetření, uvedená data jsou průměrem ze 12 experimentů.
B. al deficitní myši měly redukované artritické skóre srovnatelné se skupinou myší divokého typu ošetřených anti-al mAb. skupiny čtyř myší byly užity pro každý experiment, je uvedena průměrná hodnot aze dvou experimentů.
• · • · « ·«
- 18 Obrázek 8. Rozvoj artritidy je opožděn za absence lymfocytů a inhibice artritidy anti-al mAb nastává za absence lymfocytů. Myši divokého typu B6,129 nebo RAG-1 deficientní myši B6,129 myši byly podrobeny působení anti-kolagen mAb v den 0, následoval LPS v den 3. Artritida byl patrná v den 6 a trvala několik týdnů. Myši byly podrobeny působení uvedených mAb každý 3. Den počínaje dnem 0. Každá končetina byla hodnocena a byla vyhodnocena na skóre 0 až 4 každý 3. den. Výsledky byly vyjádřeny jako průměrné artritické skóre pro končetinu {maximální skóre 4). Pro každé ošetření byly použity skupiny 4 myš 1.
Obrázek 9. Reakce na dávku při anti-al mAb inhibici artritidy, myši divokého typu Balb/c byly podrobeny působení anti-kolagen mAb v den 0, následoval LPS v den 3. Artritida byla patrná v den 6 a trvala několik týdnů. Myši byly podrobeny působení i. p. uvedených dávek buďto Ha4/8 (izotypová kontrola) nebo Ha31/8 (anti-al) mAb každý 3. den počínaje dnem 0. Každá končetina byla hodnocena a byla skórována v rozsahu škály 0 až 4 každý 3. den. Výsledky byly vyjádřeny jako průměrné artritické skóre na končetinu (maximální skóre 4) . Pro každé ošetření byly použity skupiny 4 myší.
Obrázek 10. Terapeutické ošetření s anti-al mAb může snížit artritické skóre, myši Balb/c divokého typu byly podrobeny působení anti-kolagen mAb v den 0, následoval LPS v den 3. Artritida byla patrna v den 6 a trvala několik týdnů. Myši byly podroben působení i. p. mAb (250 gg) nebo Ig fúzního proteinu (200 μg) každý 3. Den počínaje dnem 4. Myši dostaly buď mAb (Ha4/8 izotypová kontrola nebo Ha31/8 anti-al), Ig fúzní protein (Ig izotypová kontrola nebo TNF-R55-Ig) nebo • · · • ·♦·*
- 19 kombinaci obou (250 μς Ha31/8 a 200 μς TNF-R55-Ig) . Každá končetina byla hodnocena a byla skórována v rozsahu škály 0 až 4 každý 3. den. Výsledky byly vyjádřeny jako průměrné artritické skóre na končetinu (maximální skóre 4) . Pro každé ošetření byly použity skupiny 4 myší.
Obrázek 11. Lokalizace epitopu pro anti-αΐ mAb blokující doménu I.
A. Aminokyselinová sekvence al-I domény laboratorního potkana (nahoře, sekv. id. č. 63) a člověka (dole, sekv. id. č. 64) . Zbytky zahrnující motiv MIDAS (adhezní místo závilsé na kovovém iontu) jsou ukázány tučně, humánní aminokyseliny, které nahradily odpovídající zbytky laboratorního potkana (RÁH) jsou ukázána pod sekvencí laboratorního potkana v rámečku. Pro jasnost, číslování zbytků v textu se vztahuje právě k tomuto obrázku, není-li uvedeno jiné číslování, např. krystalové číslování.
B. Zvyšující se koncentrace mAb AJH10 (ATCC č. PTA-3580, uložena podle Budapešťské smlouvy ve sbírce ATCC, Manassas, VA, USA, 2. srpna 2001) byla navázána na destičky potažené 30pg/ml humánní (kroužky), potkanní (trojúhelníky) nebo RAH (čtverečky) al-I domény. Uvedená data reprezentující tři experimenty.
Obrázek 12. Aminokyselinová sekvence humánní al-I domény (sekv. id. č. 64).
Obrázek 13. Identifikace blokující mAb al-I domény
A. Zvyšující se koncentrace mAb AEF3 (trojúhelníky) nebo ·· ····
- 20 « ····
AJH10 (kruhy) byly navázány na destičky potažené 30 pg/ml al-1 domény.
B. od-I doména byla podrobena působení zvyšující se koncentrace mAb AJH10 (kosočtverce) nebo mAb BGC5 (čtverce) a navázána na destičky potažené kolagenem IV (2 pg/ml).
C. K562-oí1 buňky byly podrobeny působení zvyšující se koncentrace mAb AEF3 (trojúhelníky) nebo AJH10 (kruhy) a navázány na destičky potažené kolagenem IV (5 pg/ml). 45 - 50 % buněk přidaných ke každé jamce adherovalo ke kolagenu IV. Uvedená data reprezentují tři nezávislé experimenty.
Obrázek 14. Druhově zkřížená reaktivita blokujících mAb analyzovaná FACS (fluorescencí aktivované třídění buněk). Králičí buňky hladkého svalstva cév byly inkubovány buď s mAb AJH10 (dole) část nebo myší IgG kontrolou (nahoře) a analyzovány FACS (fluorescencí aktivované třídění buněk).
Obrázek 15. al-1 doména váže kolagen.
A. Zvyšující se koncentrace humánní al-I domény byla navázána na destičky předtím potažené 1 pg/ml kolagenu I (čtverečky) nebo kolagu IV (kroužky). Uvedené hodnotybyly korigovány na pozadí vazby k BSA.
B. 2 pg/ml humánní al-I domény bylo smícháno se zvyšující se koncentrací protilátky 5E8D9 proti humánnímu al-integrinu (čtverečky) nebo protilátky A2IIE10 proti humánnímu oí2integrinu (kroužky) a pak navázáno na destičky předtím potažené 1 pg/ml kolagenu IV.
C. Destičky byly potaženy 1 pg/ml kolagenu IV nebo 3% BSA. al-I doména (2 pg/ml) byla následovně navázána na destičky ·
···· »··· · * ·
0 · • ···<
potažené v přítomnosti 1 mM Mn2+, 1 mM Mg2+ nebo 5 mM EDTA.
Uvedená data reprezentují tři nezávislé experimenty.
Obrázek 16. Charakterizace humanizovaných forem AQC2. Byly hodnoceny mAQC2 (trojúhelníky), chAQC2 (kruhy), hAQC2 (obrácené trojúhelníky) a hAQC2' (čtverce) byly.
A. Inhibice VLA-1 vazby ke kolagenu typu IV.
B. Inhibice vazby al-I domény ke kolagenu typu IV. .
C. Vazba k imobilizované doméně al-I.
D. Kompetice s biotinylovanou k imobilizované doméně al-I.
mAQC2 vazbu
Obrázek 17. Charakterizace humanizovaných forem AQC2 pomocí FACS.
Obrázek 18. Charakterizace humanizovaných forem AQC2 pomocí FACS.
Obrázek 19. Koordináty atomové struktury komplexu „al-I doména/Fab, jak byly určeny rentgenovou krystalografií krystalů komplexu ve formátu proteinové databanky (PDB). Koordináty dvou komplexů v asymetrické jednotce jsou uvedeny následovně:
Komplex 1: molekula A = I doména integrinu molekula H = těžký řetězec hAQC2 Fab molekula L = lehký řetězec hAQC2 Fab molekula M= Mn+2 ·· ···· .**· · • ί . · · • · · · :
• -·..* ·· · ···· ··
- 22 Komplex 2: molekula Β= I doména integrinu molekula X = těžký řetězec hAQC2 Fab molekula Y = lehký řetězec hAQC2 Fab molekula M= Mn+2
Obrázek 20. Komplex „I doména/Fab.
A. Pásový diagram komplexu doména I/Fab. Doména a lehký řetězec protilátky jsou značeny. Mn+2 ion jako koule.
B. Zvětšení místa MIDAS (adhezní místo závislé na kovovém iontu) ukazující koordinaci kovového iontu (koule) zbytkem AsplOl (krystalové číslování) . proteinové hlavní řetězce jsou ukázány jako stuhy a postranní řetězce jsou znázorněny formou kuliček a tyčinek, válce představují interakce mezi kovovým iontem a proteinovými atomy. Tenké čáry představují H-vazby. Obr. 20 byl vytvořen pomocí softwaru RIBBONS (Carson, 1991, J. Appl. Cryst. 24: 958-961).
Obrázek 21. Diagram systému použitého k realizaci instrukce kódované paměťovým médiem na obr. 22 a 23.
Obrázek 22. Průřez magnetickým paměťovým médiem.
I a těžký je ukázán
Obrázek 23. Průřez opticky čitelným paměťovým médiem.
Podrobný popis vynálezu
Objevem, na kterém je založen předkládaný vynález, je to, že protilátka k integrinu (např. VLA-1) a jeho fragmentu, konkrétně podjednotce αΐ-integrinu, může blokovat interakci prozánětlivých leukocytů se složkami extracelulární matrix, včetně kolagenů, lamininu a fibronektinu, aniž by tento výčet složek byl omezující. Tento objev ukazuje důležitost adhezních molekul z rodiny integrinů, zejména αϊβΐ, v prostředí periferních tkání v průběhu stavů příbuzných zánětu.
To také rozšiřuje úlohu členů rodiny integrinů a jejich fragmentů při zánětu nad pouhé navázání leukocytů a extravasaci na hranici endotelu tím, že zdůrazňuje důležitost matrix-bohatého prostředí periferní tkáně pro imunitní reakce a odhaluje tak periferní tkáně jako nový cílový bod intervence při terapii založené na adhezi.
I. Anti-integrinové protilátky
Způsoby podle předkládaného vynálezu uvažují s použitím protilátek k integrinům, kde integriny zahrnují molekuly, které obsahují řetězec β, včetně, ale bez omezení βΐ, β2, β3, β4, β5, ββ, β7, β8, nekovalentně vázaný k řetězci oí, včetně, ale bez omezení, αΐ, a2, oí3, cí4, oí5, oí6, oé7, a8, «9, alO, aV, aL, aM, aX, aD, aE, allb. Příklady různých integrinů, přicházejících do úvahy pro použití podle vynálezuu, zahrnují, ale bez omezení, následující integriny:
• · · · · · · αϊβΐ, α2β1, α3β1, α4β1, α5β1, αδβΐ, α7β1,αδβΐ,α9β1,αΙΟβΙ, αΥβΙ, cxLpl, αΜβΙ, αΧβυ αϋβΐ, ctllbpl, αΕβΙ;
α1β2, α2β2, α3β2, <χ4β2, α5β2, αόβ2, α7β2, α8β2, α9β2, <χ10β2, αΥβ2, αΣβ2, αΜβ2, αΧβ2, αϋβ2, αΠδβ2,αΕβ2;
<χ!β3, α2β3, α3β3, α4β3, α5β3, α6β3, α7β3, α8β3, <χ9β3, α10β3, αΥβ3, ούϋβ3, αΜβ3, άΧβ3, αϋβ3, αΙΒ?β3, <χΕβ3;
α1β4, α2β4, α3β4, α4β4, α5β4, α6β4, ά7β4, α8β4, α9β4, α10β4, ανβ4, αΙΜ «Μβ4, αΧβ4 «Πβ4, αΙΗ)β4, αΕβ4;
ά1β5, α2β5, α3β5» α4β5, α5β5, <χ6β5, α7β5, α8β5, α9β5, <χ1Οβ5, «νβ5, αΕβ5, αΜβ5, αΧβ5, αϋβ5, «Πόβδ, αΕβ5;
αϊβό, α2β6, α3β6, α4βό, α5β6, αόβό, α7βό, α8βό, α9βό, αΙΟβό, ανβό, αΐ,βό, αΜβδ, αΧβό, αϋβό, αΐΐάβό, αΕβό;
α!β7, «2β7, α3β7, α4β7, <χ5β7, αόβ7, α7β7, α8β7, α9β7, «10β7, άνβ7, άΙ,β7, <χΜβ7, αΧβ7, αθβ7, αΠόβ7, <χΕβ7;
ά1β8, <χ2β8, α3βδ, ά4β8, α5β8, αόβδ, α7β8, α8β8, ά9β8, αΙΟβδ, άΥβ8, <xl$8, αΜβδ, «Χβ8, αϋβ8, αΠδβδ, αΕβ8;
Způsoby podle předkládaného vynálezu také zahrnují použití protilátek k fragmentům integrinu včetně například protilátek proti samotnému řetězci β, včetně, ale bez omezení, βΐ, β2, β3, β4, β5, β6, β7, β8, stejně jako samotnému řetězci α, včetně, ale bez omezení, al, a2, a3, a4, a5, a6, a7, a8, a9,
• · · · · «· αΙΟ, oíV, aL, aM, aX, aD, aE, allb. Navíc způsoby podle předkládaného vynálezu dále uvažují i použití protilátek k fragmentům integrinu včetně například protilátek k doméně I řetězce a, včetně, ale bez omezení, domény I z αϊβΐ (Briesewitz et al., 1993, J. Biol.Chem. 268: 2989), α2β1 (Takada and Hemler, 1989,1 Cell Biol 109: 397), αύβ2 (Larson et al., 1989,J Cell Biol 108: 703), αΜβ2 (Corbi et al., 1988,JBiol Cheer 263: 12403), αΧβ2 (Corbi et al., 1987, EMBO J 6: 4023), αϋβ2 (Grayson et al., 1988,JExp Med 188: 2187), αΕβ7 (Shaw et al., 1994, JBiolChetsz 269: 6016). V jednom provedení antigenní determinanta al-I domény zahrnuje aminokyselinovou sekvenci přinejmenším 6 po sobě jdoucích aminokyselin, přičemž tato souvislá sekvence se vyskytuje v sekvenci uvedené na obr. 12. V příbuzném provedení ja tato souvislá sekvence Val-Gln-Arg-Gly-Gly-Arg (aminokyselinové zbytky 91 až 97 ze sekv. id. č. 64).
Způsoby produkce integrinů pro použití podle předkládaném vynálezu jsou odborníkům známy (viz např. Springer et al., 1990, Nátuře 346: 425-434).
Provedení předkládaného vynálezu dále zahrnuje antiintegrinové polyklonální a monoklonální protilátky. Provedení předkládaného vynálezu zahrnují monoklonální protilátky jako je např. anti-αΐ monoklonální protilátka. Protilátky pro léčení, konkrétně pro humánní léčbu, zahrnují humánní protilátky, humanizován protilátky, chimérické protilátky a antigen-vazebné fragmenty celých protilátek, jako jsou například Fab, Fab', F(ab')2 a F(v) protilátkové fragmenty. Některé protilátky podle vynálezu mohou také zahrnovat proteiny obsahující jeden nebo více imunoglobulinových lehkých řetězců a/nebo těžkých řetězců, jako například monomery a homo- nebo heteromultimery (např. dimery nebo trimery) těchto
řetězců, kde jsou tyto řetězce případně vázány disulfidickou vazbou nebo jsou zesítěny jiným způsobem. Protilátky jsou schopné vazby k jednomu nebo více antigenům (např. αΐ, «2, «6 nebo podjednotkám integrinu obsahujícím a-I doménu).
Označení protilátka blokující funkci αϊβΐ, jak se v tomto textu používá, se týká protilátky, která se váže na al-I doménu, například zbytky 92 až 97 sekvence na obr. 12, a blokuje tím αϊβΐ funkci, která je testována např. například podle schopnosti inhibovat K562-al závislou adhezi ke kolagenu IV (viz příklad 15).
V následující části jsou popsány různé způsoby přípravy protilátek podle předkládaného vynálezu. Způsoby, které jsou v oboru známy, ale nejsou specificky popisovány v tomto textu, spadají také do rozsahu předkládaného vynálezu. Například protilátky podle vynálezu mohou také být identifikovány s použitím fágové displejové protilátkové knihovny, jak je např. popsáno v Smith, 1985, Science 228: 1315-7, nebo v U.S. patentech č. 5 565 332, 5 733 743, 6 291 650 a 6 303 313. Další protilátky podle vynálezu mohou být připraveny kondenzací těžkých řetězců identifikovaných podle vynálezu s nepříbuzným lehkým řetězce, např. lehkým řetězcem, který byl identifikován metodou displeje na fágu („phage display).
II. Protilátky z hybridomů jiných než humánních
Monoklonální protilátky podle vynálezu mohou být tvořeny známou hybridomovou technologií. Například zvířata βΐ-/(např. myši, laboratorní potkani nebo králíci) mohou být imunizovány purifikovaným nebo surovým preparátem αϊβΐ, buňky mohou být transfekovány cDNA konstruktem kódujícím al, βΐ nebo oba antigeny, buňky mohou konstitutivně exprimovat αϊβΐ apod. antigen může být podán jako purifikovaný protein, protein • · · · • ·
- 27 exprimovaný na buňkách, proteinový fragment nebo jeho peptid, jako holá DNA nebo virový vektor kódující protein, proteinový fragment nebo peptid. Séra imunizovaných zvířat jsou pak testována na přítomnost anti-αΐβΐ protilátky. B lymfocyty jsou izolovány ze zvířat, která jsou v testu pozitivní a s B lymfocyty jsou vytvořeny hybridomy.
Protilátky sekretované hybridomy jsou podrobeny screeningu na jejich schopnost vázat se specificky k VLA-1 (např. vázat se na buňky transfekované al a nikoliv na parentální netransfekované buňky) a na jakékoliv další požadované vlastnosti, např. zda mají požadované CDR kanonické sekvence, zda inhibují (nebo neinhibují, v případě hledání neblokujících agens) vazbu mezi kolagenem a VLA-1.
Hybridomové buňky, které jsou pozitivní v screeningovém testu, ' jsou kultivovány v živiném médiu za podmínek, které dovolují buňkám sekretovat monoklonální protilátky do kultivačního média. Kondicionovaný supernatant hybridomové kultury je pak odebrán a protilátky obsažené v supernatant jsou purifikována. Jinak mohou být požadované protilátky vytvořeny tak, že se injikují hybridomové buňky do pobřišniční dutiny neimunizovaného zvířete (např. myši). Hybridomové buňky se pak množí v pobřišniční dutině, a sekretující protilátku, která se hromadí jako tekutý ascites. Protilátka pak může být sklizena tím, že se odebere ascitická tekutina z pobřišniční dutiny pomocí injekční stříkačky.
Monoklonální protilátky mohou také být připraveny tak, že se izoluje cDNA kódující protilátku z požadovaného hybridomu, tato cDNA se transfekují do savčích hostitelských buněk (např. buňky CHO nebo NSO), transfekované hostitelské buňky se kultivují a protilátka se získá z kultivačního média.
III. Chimérické protilátky
Monoklonální protilátky podle vynálezu mohou také být připraveny tak, že se připraví příbuzná protilátka z hybridomu (např. myši, laboratorního potkana nebo králíka). Například příbuzná protilátka může pak být změněna technikou rekombinantní DNA ttak, že část nebo celá kloubová oblast a/nebo konstantní úseky těžkého a/nebo lehkého řetězce jsou nahrazeny odpovídajícími složkami protilátky jiného biologického druhu (např. humánní protilátky).
Obecně, variabilní domény geneticky připravené protilátky zůstanou totožné nebo v podstatě totožné s variabilními doménami příbuzné protilátky. Taková geneticky upravená protilátka se nazývá chimérická protilátka a je méně antigenní než příbuzná protilátka, když je podávána příjemci, který je biologickým druhem, ze kterého pocházejí celá kloubová oblast a/nebo konstantní úseky těžkého a/nebo lehkého řetězce (např. člověk). Způsoby přípravy chimérických protilátek jsou v oboru dobře známy. Humánní konstantní úseky zahrnují ty, které pocházejí z IgGl a IgG4.
IV. Plně humánní protilátky
Monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu také zahrnují plně humánní protilátky. Ty mohou být připraveny užitím in vitro iniciovaných („primed) humánních splenocytů, jak bylo popsáno v Boerner et al., 1991, J. Immunol. 147: 8695, nebo s využitím fágové displejové knihovny protilátek, jak bylo popsáno např. v U. S. patentu č. 6 300 064.
Jinak plně humánní protilátky mohou také být připraveny pomocí tzv. repertoárového klonování, jak bylo popsáno v Persson et al., 1991, Proč. Nat. Acad. Sci. USA 188: 24322436, « · · · • · ·· · · · ·
- 29 and Huang and Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141: 227-236. Kromě toho, U. S. patent č. 5 798 230 (25. srpen 1998) popisuje přípravu humánní monoklonální protilátky z humánních B lymfocytů, kde humánní B lymfocyty produkující protilátky jsou imortalizovány infekcí virem Epstein-Barrové nebo jeho derivátem, který exprimuje nukleární antigen 2 (EBNA2) viru Epstein-Barrové, což je protein požadovaný pro imortalizaci. EBNA2 funkce je následně vyřazena, což pak vede ke zvýšení produkce protilátky.
Některé další metody produkce plně humánních protilátek zahrnují použití zvířat jiného než lidského původu, která mají deaktivovaná endogenní Ig lokusy a jsou transgenní pro geny těžkého řetězce a lehkého řetězce humánních protilátek, které
Taková transgenní zvířata mohou být a z jejich B lymfocytů se pak připraví metody jsou popsány např. v různých nejsou přeskupeny imunizována αϊβΐ hybridomy. Tyto publikacích GenPharm/Medarex (Palo Alto, CA) a patentech týkajících se transgenní myší obsahující humánní Ig minilokusy patent 5 789 650), různých (Fremont, CA) týkajících S. patenty 6 075 181, (např. Lonberg, (J. S. publikacích/patentech firmy Abgenix se XENOMICE (např. Kucherlapati U.
150 584 a 6 162 963, Green et al., 1994, Nátuře Genetics 7: 13-21 a Mendez et al·., 1997, Nátuře Genetics 15 (2): 146-56) a různých publikacích/patentech firmy Kirin (Japonsko) týkajících se transomické myši (např., EP 843961 a Tomizuka et al., 1997, Nátuře Genetics 16: 133-1443).
V. Humanizované protilátky
Monoklonální protilátky podle vynálezu také zahrnují humanizované verze příbuzných anti-αΐβΐ protilátek pocházejících z jiných biologických druhů. Humanizovaná
- 30 protilátka je protilátka připravená metodami rekombinantní DNA, ve které jsou některé nebo všechny aminokyseliny humánního imunoglobulinového lehkého nebo těžkého řetězce, které nejsou vyžadované pro vazbu antigenu (např. konstantní úseky a rámcové úseky variabilních domén) použity k nahrazení nebo těžkého řetězce lidského původu. Tak protilátky k určitému odpovídajících aminokyselin lehkého v příbuzné protilátce jiného než například humanizovaná verze myší antigenu má jak v těžkém tak i v lehkém řetězci (1) konstantní úseky humánní protilátky, (2) rámcové úseky z variabilní domény humánní protilátky a (3) úseky CDR z myší protilátky. Když je to nutné, jeden nebo více zbytků v humánním rámcovém úseku může být změněno na zbytky odpovídající polohám v myší protilátce, aby se zachovala vazebná afinita humanizovamé protilátky k antigenu. Tato změna je někdy nazývána „zpětnou mutací(back mutation'
Humanizované protilátky obecně vyvolávají imunitní reakce u lidí s menší pravdšposobností ve srovnání s chimérickými humánními protilátkami, protože humanizované protilátky obsahují podstatně méně složek jiného než lidského původu.
Způsoby přípravy humanizovaných protilátek jsou známy a byly popsány např. ve Winter, EP 239 400, Jones et al., 1986, Nátuře 321: 522-525, Riechmann et al., 1988, Nátuře 332: 323327, 1988, Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536, Queen et al., 1989, Proč. Nat. Acad. Sci. USA 86: 10029, U. S. patent 6,180,370, a Orlandi et al., 1989, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 3833. Obecně, transplantace myších (nebo obecně jiného než lidského původu) úseků CDR na humánní protilátku se provádí následujícím způsobem.
Z hybridomu se izolují cDNA kódující variabilní domény těžkého a lehkého řetězce. DNA sekvence variabilních domén, • · ··♦· požadovaného izotypu (např. humanizovaného těžkého a konstantních a k pro CL) . řetězce jsou úseků
Geny pak zahrnující úseky CDR, jsou určeny sekvencováním. DNA kódující CDR jsou pak přeneseny do odpovídajících úseků sekvence kódující variabilní domény těžkého nebo lehkého řetězce humánní protilátky metodou místně cílené mutageneze. Pak jsou přidány genové segmenty humánních yl pro CH lehkého koexprimovány (současně exprimovány) v savčích hostitelských buňkách (např. CHO nebo NSO), čímž je produkována rozpustná humanizovaná protilátka. Aby bylo možné produkovat protilátky v průmyslovém měřítku, je často potřeba produkovat takové humanizované protilátky v bioreaktorech obsahujících buňky exprimující protilátky nebo pomocí transgenních savců (jako jsou např. kozy, krávy nebo ovce), kteří exprimují protilátku v mléce (viz např. U. S. patent č. 5 827 690).
Někdy přímý přenos úseků CDR do humánního rámce vede k ztrátě antigen-vazebné afinity pro antigen u takto vzniklé protilátky. To je tím, že některé v některých příbuzných protilátkách určité aminokyseliny v rámcovém úseku interagují s CDR a tak ovlivňují celkovou vazebnou afinitu protilátky k antigenu. V takovém případě by bylo rozhodující vnést zpětné mutace (viz výše) do rámcového úseku akceptorové protilátky, aby se udržela antigen-vazebná aktivita příbuzné protilátky.
Obecný popstup vnášení zpětných mutací je v oboru znám. Například Queen et al. (viz výše), Co et al., 1991, Proč. Nat. Acad. Sci. USA 88: 2869-2873 a W090/07861(Protein Design Labs lne.) popisují způsob, který zahrnuje dva klíčová kroky. V prvním kroku humánní úseky V rámce počítačové analýzy podle optimální homologie s V rámcovými úseky příbuzné myší protilátky. Pak je terciární struktura myšího V úseku modelována počítačem, aby jsou vybrány pomocí sekvenční proteinové • ·
9 9
9 9 9« bylo možné vizualizovat aminokyselinové zbytky rámcového úseku, které by mohly pravděpodobně interagovat s myšími úseky CDR, a tyto myší aminokyselinové zbytky jsou pak superponovány na homologní humánní rámcový úsek.
Při tomto dvoufázovém postupu je několik kritérií pro navrhování humanizovaných protilátek. Prvním kritériem je použití jakožto humánního akceptoru rámcového úseku z určitého humánního imunoglobulinu, který je obvykle homologní s donorovým imunoglobulinem jiného než lidského původu, a nebo použití kanonické sekvence rámce z mnoha humánních protilátek. Druhým kritériem je použití aminokyseliny donora spíše než akcpetoru, jestliže humánní akceptorový zbytek je neobvyklý a aminokyselinový zbytek donora je typický pro humánní sekvence ve specifickém zbytku rámcového úseku. Třetím kritériem je použití aminokyselinového zbytku rámcového úseku donora spíše než akcpetora v· polohách bezprostředně sousedících s úseky CDR.
Může být ale použit také zcela jiný přístup, jak byl popsán např. v Tempest, 1991, Biotechnology 9: 266-271. Podle tohoto postupu úseky V rámců pocházející z těžkého a lehkého řetězce NEWM a REI, v daném pořadí, byly použity pro CDRroubování, aniž by byly vnášeny radikálně myší zbytky. Výhodou při použití tohot přístupu je to, že trojrozměrné struktury variabilních úseků NEWM a REI jsou známy z rentgenové krystalografie, takže specifické interakce mezi CDR úseky a zbytky úseku V rámce mohou být snadno modelovány.
VI. Další skupiny
Monoklonální protilátky podle vynálezu mohou dále zahrnovat další skupiny pro vykonávání požadovaných funkcí. Například protilátky mohou obsahovat toxinovou skupin (např.
4 4 4 4 44 444
4 49 4 4444 « 944 4 9 44 49944 tetanový toxoid nebo ricin) nebo radionuklid (např. 111In nebo 90Y) pro usmrcení buněk cílených protilátkami (viz např. U. S. patent 6 307 026). Protilátky mohou obsahovat skupinu umožňující detekci nebo snadnou izolaci (např. biotin, fluorescenční skupiny, radioaktivní skupiny, histidinový „přívěsek - tag, nebo další peptidové tágy). Protilátky mohou také obsahovat skupiny, které mohou prodloužit jejich sérový poločas, například polyethylenglykolovou (PEG) skupinu, a člena superrodiny imunoglobulinů nebo jeho fragment (např. část konstantního úseku těžkého řetězce humánního IgGl, například pantový úsek, CH2 a CH3 úseky).
VII. Krystalizovatelné kompozice a krystaly
Předkládaný vynález také poskytuje krystalizovatelnou kompozici obsahující komplex: (1) potkan-humánní chimérické al-I domény (např. mutanta RAH) nebo její část (např. polypeptid zahrnující aminokyseliny 135 až 336 z potkanhumánní chimérické al-I domény) a (2) Fab fragment z hAQC2 nebo jeho část (např. polypeptid zahrnující aminokyseliny 3 až 213 lehkého řetězce a/nebo polypeptid zahrnující aminokyseliny 3 až 219 těžkého řetězce). Příklad takového komplexu je ukázán na obr. 20. RAH al-I doména může obsahovat např. aminokyselinové zbytky 145 až 336 (krystalové číslování) (sekv. id. č. 59, viz výše) al podjednotkay laboratorního potkana. hAQC2 Fab fragmenty mohou obsahovat aminokyselinové zbytky 1 až 106 (např. 1 až 213) lehkého řetězce, který má sekv. id. č. 3, a aminokyselinové zbytky 1 až 118 (např. 1 až 219) těžkého řetězce, který má sekv. id. č. 4. Fragmenty hAQC2 Fab mohou být získány papainovým štěpením celé protilátky nebo mohou být připraveny metodami rekombinantní DNA. Fab fragmenty obsahují alespoň antigen-vazebnou část variabilní domény •· 9 9··
9 • 9 9
9 9 9 • 9 99 9
9 9 ·
- 34 lehkého řetězce a/nebo těžkého řetězce z hAQC2.
145 TQLDIV
151 IVLDGSNSIY PNESVIAFLN DLLKRMDIGP KQTQVGIVQY
191 GENVTHEFNL NKYSSTEEVL VAANKIVQRG GRQTMTALGI
231 DTARKEAFTE ARGARRGVKK VMVIVTDGES HDNYRLKQVI
271 QDCEDENIQR FSIAILGHYN RGNLSTEKFV EEIKSIASEP
311. TEKHFFNVSD ELALVTIVKA LGERIF (Sekv. id. č. 59)
Některé krystalizovatelné kompozice a krystaly podle vynálezu mohou obsahovat molekulu nebo molekulární komplex, který je homologní k oíl-I doméně a/nebo hAQC2 Fab fragmentu podle aminokyselinové sekvencce nebo trojrozměrné struktury. Příklady homologů zahrnují, avšak bez omezení: al-I doménu a/nebo hAQC2 Fab fragment s mutacemi, jako jsou například konzervativní substituce, adice, delece nebo jejich kombinace. Termín konzervativní substituce označuje nahrazení zbytku jiným zbytkem, který je fyzicky podobný velikostí, tvarem, hydrofobicitou, nábojem a/nebo chemickými vlastnostmi odpovídajícímu referenčnímu zbytku. Způsoby identifikace odpovídající aminokyseliny jsou v oboru známy a jsou založeny na sekvenčním porovnání, strukturním porovnání, funkční poloze nebo jejich kombinaci ve srovnání s krystalovou strukturou řešenou podle předkládaného vynálezu. Například odpovídající aminokyseliny mohou být identifikován tím, že se superponují atomy aminokyselin hlavního řetězce komplexu al-I doména/hAQC2 a homologů al-I domény a/nebo hAQC2 s použitím odborníkovi dobře známých programů (softwarových aplikací), jako je například QUANTA (Molecular Simulation, lne., San Diego, CA, ©1998, 2000). Odpovídající aminokyseliny mohou také • · ·««·
4 být identifikovány s použitím počítačových programů pro porovnávání sekvencí, jako je například program Bestfit dostupný od Genetics Computer Group, který používá algoritmus lokální homologie popsaný v publikaci Smith and Waterman, Adv.Appl. Math. 2: 482, 1981.
podle vynálezu mohou dále součásti, které podporují kompatibilní s podmínkou
Krystalizovatelné kompozice obsahovat jednu nebo více krystalizaci a/nebo jsou krystalizace. K takovým složkám patří, ale bez omezení, pufr, soli, precipitační činidla a další činidla. Jedna složka může být 30 % (hmotnost/objem) polyethylenglykolu 1500 (PEG1500).
Předkládaný vynález také poskytuje způsoby přípravy krystalů z krystalizovatelné kompozice obsahující komplex al-I domény a antigen-vazebné části hAQC2 (např. Fab, Fab' nebo jiného fragmentu, viz výše). Různé techniky krystalizace mohou být použity ve vynálezu, včetně difúze páry, dialýzy, mikrodávkové a dávkové difúze, a difúze kapalina-kapalina.
Metody difúze páry zahrnují, ale bez omezení, metody přisedlé kapky („sitting-drop), zavěšené kapky („hangingdrop) a sendvičové kapky („sandwich-drop). Metody difúze páry mohou využívat postupy ke kontrole rychlosti krystalizace, jako je například přidání olejů na kapky nebo roztoku v zásobníku. Krystalizační metody mohou zahrnovat míchání roztoku v zásobníku obsahujícího srážedlo s vodným roztokem komplexu al-I domény a antigen-vazebné část hAQC2 za vzniku krystalizovatelné kompozice. Směs nebo krystalizovatelná kompozice mohou pak být krystalizovány s použitím různých výše zmíněných postupů. Krystalizovatelná kompozice podle tohoto vynálezu může být vodný roztok komplexu al-I domény a antigen-vazebné části hAQC2, který obsahuje komplex v koncentraci přibližně 1 až 50 mg na 1 ml, jako například φ · · · * · ·· · • · φ φ · φφ · • · φφφ φ • · φ · · φφφ φφφ φφφ · φφφφ φφ φφ ··· φφφ φ φφφφ koncentraci přibližně 5 až 15 mg na 1 ml (např. 11 mg na 1 ml) .
VIII. Krystalové struktury a strukturní koordináty
Předkládaný vynález dále poskytuje trojrozměrnou strukturu krystalu včetně komplexu mutanty RAH a hAQC2 Fab fragmentu při rozlišení 2,8 Á (viz příklad 24). Trojrozměrné struktury dalších příbuzných krystalů mohou také být určeny s použitím způsobů popsaných v tomto textu a postupů známých v oboru. Trojrozměrná struktura tohoto komplexu je definována souborem strukturních koordinát (souřadnic) uvedených na obr. 19. Tyto strukturní koordináty jsou kartézské koordináty atomů odvozené z matematických rovnic týkajících se vzorců získaných difrakcí monochromatického paprsku rentgenového záření na atomech nebo rozptylových centrech krystalického komplexu al-I domény a hAQC2 Fab fragmentu. Difrakční (rozptylová) data jsou nejdříve použita pro výpočet mapy elektronové hustoty (denzity) opakující se krystalové jednotky. Mapa elektronové hustoty je pak použita ke stanovení polohy jednotlivých atomů komplexu.
Předkládaný vynález poskytuje molekulu nebo molekulární komplex definovaný všemi nebo některými strukturními koordinátami všech aminokyselin uvedených na obr. 19, a také homologní molekulu nebo molekulární komplex, kde homolog má odmocninu průměrného čtverce odchylky od atomů hlavního řetězce těchto aminokyselin mezi 0,00 Á a 0,65 Á, například mezi 0,00 Á a 0,60 Á (např. mezi 0,00 Á a 0,50 Á) .
Termín odmocnina průměrného čtverce odchylky nebo r. m. s. odchylky znamená druhou odmocninu aritmetického průměru čtverců odchylek od průměru. To je způsob, jak vyjádřit odchylku nebo variaci od trendu nebo předmětu. Pro účely tohoto vynálezu, termíny odmocnina průměrného čtverce
ΦΦ φφφφ • Φ · ·♦ · φ φφ φ φ · • φ φφφφ φ φ · φ φφφφ • · ΦΦΦ
Φ· ΦΦΦ φφ · odchylky nebo r. m. s. poziční odchylky definují odchylku hlavního řetězce proteinu od relevantní části hlavního řetězce polypeptidu, jak byl definován strukturními koordinátami popsanými v tomto textu.
Molekula nebo molekulární komplex podle tohoto vynálezu mohou také zahrnovat vazebné místo definované strukturními koordinátami alespoň sedmi aminokyselin z hAQC2 Fab fragmentu vybraných ze skupiny obsahující zbytky lehkého řetězce Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 a Trp95 a zbytky těžého řetězce Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO a AsplOl (krystalové číslování) podle obr. 19, nebo homolog molekuly nebo molekulárního komplexu, kde homolog zahrnuje vazebné místo, které má odmocninu průměrného čtverce odchylky od atomů hlavního řetězce jedné nebo více z těchto aminokyselin mezi 0,00 Á a 1,10 Á, například mezi 0,00 Á a 1,00 Á (např. mezi 0,00 Á a 0,50 Á) . Termín vazebné místo, jak se v tomto textu používá, se týká úseku molekuly nebo molekulárního komplexu, který se, v důsledku svého tvaru a náboje, příznivě asociuje s další chemickou entitou. Termín místo zahrnuje, ale není tím omezen, prohloubeninu, rýhu, kanál nebo kapsu. Například vazebná místa na al doméně mohou zahrnovat vazebné místo pro kolagen (Emsley et al., 1997, viz výše), vazbné místo pro antigen a alosterické (nebo MIDAS) vazebné místo (Huth et al., 2000, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 97: 5231-5236). Termín chemická entita zahrnuje, ale není tím omezen, jakoukoliv molekulu, molekulární komplex, sloučeninu nebo její fragment. Termín asociovat se se týká asociace nebo vazby v podmínkách blízkosti chemické entity nebo její části a vazebné kapsy nebo vazebného místa proteinu. Asociace může být nekovalentní - kde vzájemné postavení vedle sebe je energicky zvýhodněno vodíkovými vazbami nebo van der Waalsovými nebo elektrostatickými interakcemi - nebo může být
9·9·9· ·· *
9 9··· 99
9 9 9 9 9 9 • 9999 9999 • 9
9999 • 999 9* ·· ··♦ ♦·
- 38 kovalentní.
Molekula nebo molekulární komplex podle vynálezu může také obsahovat vazebné místo definované strukturními koordinátami aminokyselinových zbytků al-I domény vybraných ze skupiny obsahující Asp 154, Serl56, Asnl57, Serl58, Tyrl60, Glul92, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 a Leu294 (krystalové číslování), podle obr. 19, nebo homolog molekuly nebo molekulárního komplexu, kde homolog zahrnuje vazebné místo, které má hodnotu odmocniny průměrného čtverce odchylky od atomů hlavního řetězce aminokyselin al-I domény mezi 0,00 a 0,92 Á.
Molekula nebo molekulární komplex podle vynálezu může také obsahovat vazebné místo definované strukturními koordinátami aminokyselinových zbytků al-I domény vybraných ze skupiny obsahující Glul92, Gln218, Arg219, Gly220 a Gly221 (krystalové číslování), podle obr. 19, nebo homolog molekuly nebo komplexu, který obsahuje vazebné místo, které má hodnotu odmocniny průměrného čtverce odchylky od atomů hlavního řetězce aminokyselin al-I domény mezi 0,00 a 0,30 Á.
Odbornici rozumějí, že soubor strukturních koordinát pro polypeptid je relativní soubor bodů, které definují tvar ve třech rozměrech (v prostoru). Takže je možné, že zcela odlišný soubor koordinát, který definuje podobný nebo totožný tvar, může být vytvořen pomocí matematických úprav strukturních koordinát na obr. 19. Například strukturní koordináty by mohly být upravovány krystalografickými permutacemi strukturních koordinát, frakcionalizací strukturních koordinát, přičtením nebo odečtením celého čísla od souboru strukturních koordinát, inverzí strukturních koordinát nebo jakoukoliv jejich kombinací. Navíc malé změny v jednotlivých koordinátách mají «« ···· ·· • · 9 9 9
9 9 9 • · · · · ···· ·< ·· • ·· Φ ·· 9 9 9
9 9 9 9
9 9 9 9999
9 9 9
999 99 9 jen malý účinek na celkový tvar.
Jinak modifikace v krystalové struktuře způsobená mutací, jako je například adice, substituce, a/nebo delece aminokyseliny, nebo další změny ve kterékoliv složce polypeptidu (např. hAQC2 Fab fragmentu nebo al-I doméně), která tvoří krystal, může také odpovídat za změny strukturních koordinát. Jestliže takové variace jsou v přijatelném rozsahu střední chyby ve srovnání s původními koordinátami, výsledný trojrozměrný tvar je považován za shodný s nemodifikovaným krystalem.
Je proto nutné určit, zda entita je dostatečně podobná celé nebo části struktury popsané v tomto textu, pokud jde o to, zda může být považována za stejnou.
Takové analýzy mohou prováděn s použitím móděních softwarových aplikací, jako je například program QUANTA (Accelrys, lne. and Molecular Simulations, lne., San Diego, CA © 1998, 2000) a program O (Jones et al., 1991, ActaGast. A47: 110-119) , viz příslušné uživatelské příručky. Aplikace Molecular Similarity z programu QUANTA a aplikace LSQ z programu O umožňují srovnání mezi různými strukturami, různými konformacemi stejné struktury a různými částmi stejné struktury, obecný postup použitý v obou aplikacích je vložení struktur, které mají být srovnávány, definování ekvivalentních atomových poloh v těchto strukturách, provedení přiřazovacích operací a analyzování výsledků.
Po vložení každé struktury do aplikace je jí přiděleno jméno a struktura je identifikována jako fixovaná struktura nebo pohyblivá struktura. Atomová ekvivalence je obvykle definována ekvivalentními atomy jako například atomy proteinového řetězce (N, Ca, C a O) pro všechny konzervativní zbytky mezi dvěma strukturami, které jsou srovnávány.
Pohyblivá struktura je translatována a otáčena, aby se dosáhlo optimální shody nebo shody s nejmenším čtvercem odchylek s fixovnou strukturou. Odmocnina průměrného čtverce odchylek pro všechny specifikované páry ekvivalentních atomů je uváděna oběma programy v ángstrómech (Á).
Pro účel tohoto vynálezu, kterýkoliv molekulární komplex, který má odmocninu průměrného čtverce odchylek atomů hlavního řetězce konzervativních zbytků (N, Ca, C, O) mezi 0,00 Á a 1,50 Á, jako například mezi 0,00 a 1,00 Á (např. mezi 0,00 a 0,50 Á) , když je superponován na relevantní atomy hlavního řetězce popsané strukturními koordinátami uvedenými na obr. 19, je považován za totožný.
IX. Určování dalších krystalových struktur
Strukturní koordináty uvedené na obr. 19 mohou také být použity jako pomůcka pro získání strukturních informací o jiných krystalizovaných molekulárních entitách, například jiné hAQC2 obsahující substituce aminokyselin v jednom z úseků CDR. Toho může být dosaženo kteroukoliv ze známých technik, zahrnujících molekulární substituci, což je obzvláště užitečný způsob pro určování struktury mutant a homologů al-I domény/Fab.
Strukturní koordináty uvedené na obr. 19 mohou také být použity pro určení alespoň části trojrozměrné struktury molekulárních entit, které obsahují alespoň některé strukturní rysy podobné alespoň části al-I domény nebo hAQC2 Fab. Proto další provedení tohoto vynálezu poskytuje způsob využití molekulární substituce pro získání strukturní informace o krystalizované molekule nebo molekulárním komplexu s neznámou strukturou zahrnuje! kroky: (a) vytvoření rentgenového difrakčního vzorce pro krystalizovanou molekulu nebo ·· ···· A A · AAA • · A AAAA · · ·
A A AAA AAAA
A AAA A A AA AAAA
AAA AAA AAA
AAAA AA AA AAA AA A molekulární komplex a (b) aplikace alespoň části strukturních koordinát uvedených na obr. 19 na rentgenový difrakční vzorec, aby se vytvořila trojrozměrná mapa elektronové denzity molekuly nebo molekulárního komplexu s neznámou strukturou.
Aplikací molekulární substituce mohou být všechny nebo část strukturních koordinát uvedených na obr. 19 použity k rychlejšímu a účinnějšímu určení neznámé struktury krystalizované molekuly, než kdyby se takové informace získávaly znovu od samého počátku (ab initio). Molekulární substituce poskytuje přesné určení fází pro neznámou strukturu. Fáze jsou faktory v rovnicích určených pro řešení krystalových struktur, který nemohou být určeny přímo. Získání přesnchý hodnot pro fáze, metodami jinými než je molekulární substituce, může být často časově velmi náročný postup, který zahrnuje iterační cykly aproximací a dalšího zpřesňování, a výrazně ztěžuje vyřešení krystalového struktury. Nicméně když je vyřešena krystalová struktura proteinu obsahujícího alespoň homologní část, fáze ze známé struktury mohou často poskytnout uspokojivý odhad fází pro neznámou strukturu.
Takže molekulární substituce zahrnuje vytvoření předběžného modelu molekuly nebo molekulárního komplexu, jehož strukturní koordináty jsou neznámé, tím, že se orientuje a polohuje relevantní část komplexu podle obr. 19 v rámci jednotkové buňky krystalu neznámé molekuly nebo molekulárního komplexu tak, aby nejlépe odpovídala pozorovanému vzorci rentgenové difrakce krystalu molekuly nebo molekulárního komplexu, jehož struktura je neznámá. Fáze mohou pak být vypočteny z tohoto modelu a v kombinaci s amplitudami pozorovaného vzorce rentgenové difrakce poskytnou mapu elektronové denzity struktury, jejíž koordináty jsou neznámé. Ta potom může být dále podrobena jakékoliv známé metodě výstavby modelu a upřesňování struktury, aby byla získána přesná struktura neznámé krystalizované molekuly nebo molekulárního komplexu (Lattman, 1985, Meth. Enzymol. 115: 5577, Rossmann, ed., The Molecular Replacement Method, Int. Sci. Rev. Ser., No. 13, Gordon & Breach, New York, 1972). struktura kterékoliv části kterékoliv krystalizované molekuly nebo molekulárního komplexu, které jsou dostatečně homologní s kteroukoliv částí al-I domény a/nebo hAQC2 Fab fragmentu (podle obr. 19), může být vyřešena tímto způsobem.
X. Počítač a paměťové médium
Aby bylo možné použít strukturní koordináty podle tohoto vynálezu, např. koordináty uvedené na obr. 19, je obvykle nutné konvertovat tyto koordináty na trojrozměrnou (tj. prostorovou) reprezentaci nebo tvar. Komerčně dostupné grafické programy (software) včetně, ale bez omezení, programu 0 (Jones et al., 1991, Acta Cryst. A47: 110-119) a INSIGHTII (©Accelrys, lne. a Molecular Simulation, lne., San Diego, CA), jsou schopné ze souboru strukturních koordinát vytvořit trojrozměrnou reprezentaci molekuly nebo molekulárního komplexu nebo jejich částí.
Podle předkládaného vynálezu strukturní koordináty molekulárních entit podle vynálezu jsou uloženy na paměťovém médiu, které je čitelné strojově (např. počítačem) . S použitím počítače a vhodného programového vybavení (softwaru) mohou být taková data použita pro celou řadu účelů, jako například objevování léčiv a rentgenokrystalografickou analýzu krystalů dalších proteinů.
V souladu s tím, strojově čitelné médium pro uchování dat (paměťové médium) může zahrnovat datový materiál kódovaný do strojově čitelných dat zahrnující alespoň část strukturních • ·
- 43 koordinát uvedených na obr. 19. Počítač může dále zahrnovat instrukce pro vytvoření trojrozměrné reprezentace molekulárních komplexů al-I domény a hAQC2 Fab fragmentu zpracováním strojově čitelných dat podle tohoto vynálezu. Počítač podle vynálezu může také zahrnovat displej, grafické rozhraní pro zobrazení nebo vstupní zařízení pro pohybování a manipulace s trojrozměrnou grafickou reprezentací strukturních koordinát.
Předkládaný vynález také poskytuje počítač pro určení alespoň části strukturních koordinát odpovídající datům rentgenové difrakce získaným pro molekulární komplex αϊβΐ integrinu a Fab fragmentu z hAQC2 protilátky, kde počítač zahrnuje strojově čitelné médium obsahující datový materiál kódovaný se strojově čitelnými daty, kde data zahrnují alespoň část strukturních koordinát molekulárního komplexu z al-I domény a hAQC2 Fab fragmentu podle obr. 19 nebo data rentgenové difrakce získaná z krystalického molekulárního komplexu. Počítač dále zahrnuje instrukce pro provádění Fourierovy transformace strojově čitelných koordinátových dat a instrukce pro zpracování těchto strojově čitelných difrakčních dat do strukturních koordinát. Tento počítač může dále zahrnovat: pracovní paměť pro ukládání instrukcí pro zpracování strojově čitelných dat, centrální procesorovou jednotku spojenou s pracovní paměti a se strojově čitelnými daty, a volitelně grafické rozhraní nebo displej spojený s centrální procesorovou jednotkou pro zobrazení trojrozměrné grafické reprezentace strukturních koordinát molekuly nebo molekulárního komplexu.
Vynález dále poskytuje počítač pro vytvoření trojrozměrné reprezentace: molekuly nebo molekulárního komplexu definovaného tím, že alespoň část nebo všechny strukturní «····· ·· · ··· • · · · · · · · « · • · · · » ···· • ··· · · · · ·····
9 9 9 9 9 9 9 9
9 99 9 9 9 9 9 99 99 9 koordináty všech aminokyselin al-I domény a hAQC2 Fab fragmentu, uvedených na obr. 19, nebo homologu molekuly nebo molekulárního komplexu, kde homolog má odmocninu čtverce průměrné odchylky od atomů aminokyselin hlavního řetězce mezi 0,00 Á a 1,50 A, například mezi 0,00 a 1,00 A (např. mezi 0,00 a 0,50 A) . Dále v tomto vynálezu počítač zahrnuje: strojově čitelné paměťové médium pro uložení dat obsahující uložený datový materiál kódovaný se strojově čitelnými daty, kde data zahrnují alespoň část nebo všechny strukturní koordináty všech aminokyselin al-I domény a Fab hAQC2 fragmentu, jak jsou uvedeny na obr. 19.
Počítač podle vynálezu může vytvořit trojrozměrnou reprezentaci molekuly nebo molekulárního komplexu včetně vazebných míst. Vazebné místo může být definováno strukturními koordinátami alespoň sedmi aminokyselin z hAQC2 Fab fragmentu vybraných ze skupiny obsahující zbytky lehkého řetězce Asn30,Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 a Trp95 a zbytky těžkého řetězce Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO a AsplOl (krystalové číslování) podle obr. 19, nebo homologu molekuly nebo molekulárního komplexu, kde homolog zahrnuje vazebné místo, které má má hodnotu odmocniny průměrného čtverce odchylek atomů hlavního řetězce alespoň jedé aminokyseliny z hAQC2 Fab fragmentu mezi 0,00 A a 1,10 A, jako například mezi 0,00 A a 1,00 A (např. mezi 0,00 A a 0,50 A). Dále počítač podle tohoto vynálezu zahrnuje: strojově čitelné paměťové médium pro ukládáná dat včetně uloženého datového materiálu kódovaného se strojově čitelnými daty, kde data zahrnují strukturní koordináty alespoň sedmi aminokyselin z hAQC2 Fab fragmentu vybraných ze skupiny obsahující zbytky lehkého řetězce Asn30,Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 a Trp95 a zbytky těžkého řetězce Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO a AsplOl (krystalové číslování) podle obr. 19
Vynález také poskytuje počítač pro vytvoření trojrozměrné reprezentace molekuly nebo molekulárního komplexu včetně vazebného místa definovaného strukturními koordinátami aminokyselin domény I vybraných ze skupiny, kterou tvoří zbytky Aspl54, Serl56, Asnl57, Serl58, Tyrl60, Glul92, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 a Leu294 (krystalové číslování), podle obr. 19, nebo homologu molekuly nebo molekulárního komplexu, kde homolog zahrnuje vazebné místo, které má má hodnotu odmocniny průměrného čtverce odchylek atomů aminokyselin domény I mezi 0,00 Á a 0,92 Á. Dále v tomto vynálezu počítač zahrnuje: strojově čitelné paměťové médium pro ukládání dat včetně uloženého datového materiálu kódovaného se strojově čitelnými daty, kde data zahrnují strukturní koordináty aminokyselin domény I vybraných ze skupiny, kterou tvoří zbytky Aspl54, Serl56, Asnl57, Serl58, Tyrl60, Glul92, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 a Leu294 (krystalové číslování) podle obr. 19.
Tento vynález také poskytuje počítač pro vytvoření trojrozměrné reprezentace molekuly nebo molekulárního komplexu včetně vazebného místa definovaného strukturními koordinátami aminokyselin domény I vybraných ze skupiny, kterou tvoří zbytky Glul92, Gln218, Arg219, Gly220 a Gly221 (krystalové číslování), podle obr. 19, nebo homologu molekuly nebo molekulárního komplexu, kde homolog zahrnuje vazebné místo, které má hodnotu odmocniny průměrného čtverce odchylky od atomů aminokyselin hlavního řetězce domény mezi 0,00 Á a 0,30 Á. Dále v tomto vynálezu počítač zahrnuje: strojově čitelné paměťové médium pro ukládání dat včetně uloženého datového materiálu kódovaného se strojově čitelnými daty, kde data zahrnují strukturní koordináty aminokyselin domény I vybraných ze skupiny, kterou tvoří zbytky Glul92, Gln218, Arg219, Gly220 a Gly221 (krystalové číslování), podle obr. 19.
Obr. 21 demonstruje jedno takové provedení. Systém 10 zahrnuje počítač 11 včetně centrální procesorové jednotky (CPU) 20, pracovní paměť 22, která může být např. RAM (paměť typu „random-access) nebo feritová paměť, paměť 24 pro hromadné ukládání (jako například jedna nebo více jednotek driverů - pro disk nebo pásku nebo CD-ROM nebo DVD-ROM), jeden nebo více obrazovkových (CRT) terminálů 26, jednu nebo více klávesnic 28, jedno nebo více vstupních vedení 30 a jedno nebo více výstupních vedení 40, každé z nich je propojeno obvyklou oboustrannou systémovou sběrnicí 50.
Vstupní hardware 36, spojený s počítačem 11 vstupním vedením 30, může být realizován celou řadou cest. Strojově čitelná data podle tohoto vynálezu mohou být vkládána prostřednictvím modemu nebo modemů 32 připojených telefonní linkou nebo zvláštní linkou 34 pro přenos dat. Alternativně nebo i navíc, vstupní hardware 36 může zahrnovat CD-ROM nebo DVD-ROM jednotky nebo páskové nebo diskové jednotky 24. Ve spojení s displejovým terminálem 26 může být také klávesnice 28 použita jako vstupní zařízení.
Výstupní hardware 46, spojený s počítačem 11 výstupním vedením 40, může být podobně realizován obvyklými zařízeními. Například výstupní hardware 46 může zahrnovat obrazovkový CRT terminál 26 pro zobrazení grafické reprezentace vazebného místa podle tohoto vynálezu s použitím programu jako je například program QUANTA, jak bylo popsáno výše v tomto textu. Výstupní hardware by mohl také zahrnovat tiskárnu 42, takž by bylo možné vytvářet výstupní výtisky, nebo diskovou jednotku
- 47 24 pro uložení celého systémového výstupu pro pozdější použití.
Za provozu CPU 20 koordinuje použití různých vstupních a výstupních zařízení 36, 46, koordinuje zpřístupnění datového materiálu z hromadné paměti 24 a umožňuje vstup a výstup z pracovní paměti 22, a také určuje sled jednotlivých kroků zpracování dat.
Ke zpracování strojově čitelných dat podle tohoto vynálezu může být použita celá řada programů. Tyto programy jsou diskutovány ve vztahu k výpočetním metodám pro navrhování léčiv popsaným v tomto textu. Specifické odkazy na jednotlivé komponenty hardwarového systému 10 jsou zahrnuty tam, kde je to vhodné, v následujícím popisu média pro uchovávání dat.
Obr. 22 ukazuje průřez magnetickým paměťovým médiem 100, které může být kódováno strojově čitelnými daty, což může být provedeno systémem jako například systém 10 na obr 21. Médium 100 může být obvyklá pružná disketa nebo pevný disk, mající vhodný substrát 101, a vhodnou obalovou vrstvu 102, která může obvykle obsahovat, na jedné nebo na obou stranách, magnetické domény (neviditelné), jejichž polarita nebo orientace mohou být změněny magneticky.
Médium 100 může také mít otvor (není ukázán) pro vsunutí hřídele diskové jednotky nebo jiného zařízení pro uchovávání dat 24.
Magnetické domény ve vrstvě 102 na médiu 100 jsou polarizované nebo orientované tak, aby kódovaly způsobem, který je obvyklý, strojově čitelná data jako například data popsaná v tomto textu, pro zpracování systémem jako je například systém 10 na obr. 21.
Obr. 23 ukazuje průřez opticky-čitelným paměťovým médiem
110 pro uchovávání dat, která také mohou být kódována se strojově čitelnými daty nebo souborem instrukcí, který mohou být prováděny systémem, jako je například systém 10 na obr. 21.
Médium 110 může být obvyklý kompaktní disk nebo DVD disk typu ROM („Read Only Memory), t j. CD-ROM nebo DVD-ROM, nebo přepisovatelné médium, jako například magneto-optický disk, který je opticky čitelný a magneto-opticky zapisovatelný. Médium 100 má vhodný substrát 111, který může být obvyklý, a vhodný povrch 112, který může být obvyklý, a to obvykle na jedné straně substrátu 111.
V případě CD-ROM, jak je dobře známo, povrchová vrstva 112 je reflexivní a je pokryta velkým množstvím jamek 113, které kódují strojově čitelná data. Uspořádání jamek je čteno laserovým světlem odraženým z povrchu vrstvy 112. Ochranná vrstva 114, která je v podstatě průhledná, je nanesena na povrchu vrstvy 112.
V případě magneto-optického disku, jak je dobře známo, vrstva 112 nemá žádné jamky 113, ale obsahuje velké množství magnetických domén, jejichž polarita nebo orientace mohou být změněny magneticky, když se zahřejí nad určitou teplotu, např. laserem (není uvedeno). orientace domén je čtena měřením polarizace laserového světla odráženého od vrstvy 112. uspořádání domén kódujících data je jak bylo popsáno výše.
XI. Racionální návrh léčiv
Předkládaný vynález dovoluje použít postupy návrhu léčiv založené na strukturních údajích a postupy tzv. racionálního návrhování léčiv („Rational Drug Design) pro návrh, selekci, syntézu nebo izolaci chemických entit, jako jsou například «····· ·· · «*· « · « · · · · · φ · • « ·· 4 · · · Φ • φ * Φ · · Φ · Φ · · · Φ
999999 9 9 999 · · * inhibitory al-I domény, a také ke zlepšení známých inhibitorů této domény.
Tyto inhibitory mohou být schopné blokovat vazebné místo VLA-I pro kolagen. Tento vynález také dovoluje použít postupy založené na strukturních údajích a postupy tzv. racionálního návrhování léčiv pro návrhy variant, které mohou působit jako inhibitory vazby kolagenu.
Trojrozměrné reprezentace podle tohoto vynálezu mohou být použity experimentálně nebo v počítačové formě pro navrhování potenciálních inhibitorů, dalších chemických entit, variant Fab fragmentů nebo kombinace chemický entit, které se mohou vázat na biologickou funkci hAQC2 Fab fragmentu nebo chimérické al-I domény podle vynálezu a ovlivňovat ji.
Odborník může použít jednu nebo několik metod screeningu chemických entit na jejich schopnost asociovat se s komplexem hAQC2 Fab fragmentu nebo chimérické al-I domény podle předkládaného vynálezu a konkrétně s vazebným místem buďto domény I nebo Fab fragmentu. Tento postup může začít vizuálním vyhledáváním, například vazebného místa buďto pro doménu I nebo Fab fragment, na počítačové obrazovce, na základě koordinát komplexu uvedných na obr. 19.
Vybrané chemické entity se pak umístí v celé řada orientací nebo se usadí v individuálních vazebých místech buďto domény I nebo Fab fragmentu. Toto usazování může být uskutečněno s použitím softwaru jako je například program QUANTA, po kterém následuje minimalizace energií a molekulární dynamika s využitím standardních silových polí molekulární mechaniky, jako jsou například programy CHARMM (Molecular Simulations, lne., Burlington, MA ©1994) a AMBER (P. A. Kollman, University of California at San Francisco, (©1994).
···· 9 9 · 9 « 9 99 9999 9 9 9 9 9 9 9
9 9 99 9 9 9
- 50 Specializované počítačové programy mohou také pomoci v postupu selekce chemický entit. Kromě dalších k takovým programům patří následující:
1. GRID (Goodford, P. J., 1985, J. Med. Cliern. 28: 849857). Program GRID lze získat z Oxford University, Oxford, UK
2. MCSS (Miranker, AAA. and M. Karplus, 1991, Proteins.
Structure, Function and Genetics 11: 29-34). MCSS je dostupný od Molecular Simulations, Burlington, MA.
3. AUTODOCK (Goodsell, D. S. and AAA. J. Olsen, 1990,
Proteins: Structure, Function, and Genetics 8: 195-
202). AUTODOCK je dostupný ze Scripps Research
Institute, La Jolla, CA.
4. DOCK (Kuntz, I. D. et al., 1982, J. Mol. Biol. 161:269-
288) . DOCK lze získat z University of California, San Francisco, CA.
Jakmile byly vhodné chemické entity vybrány, mohou být sestaveny do jednotlivých sloučenin. Sestavování může pokračovat vizuální prohlídkou vztahu entit k sobě navzájem ve trojrozměrném zobrazení na počítačové obrazovce ve vztahu ke strukturním koordinátám komplexu hAQC2 Fab fragmentu a chimérické al-I domény. Poté následuje ruční sestavení modelu s použitím softwaru jako je například program „Quanta nebo „Sybyl.
Výše popsané postupy vyhodnocování chemických entit mohou být prováděny podobným způsobem pro sloučeniny nebo pro varianty, který mohou vázat al-I doménu.
φφφφ ·· φ φφ φ φφ φ φφφφ φφφ φφ φφφ φφφφ φ φφφ « φ φφ φφφφ φφφ φφφ φφφ φφφφ φφ «φ φφφ φφ φ
- 51 Κ užitečným programům, které odborníkovi pomohou ve spojování individuálních chemických entit patří např. následuj ící:
1. CAVEAT (Bartlett, P. AAA. et al, CAVEAT: A Program to
Facilitate the Structure-Derived Design of Biologically Active Molecules. In Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems, Spacial Pub., 1989, Royal Chem. Soc., 78: 182-196). CAVEAT lze získat z
University of California, Berkeley, CA.
2. 3D databázové systémy jako je například MACCS-3D (MDL
Information Systems, San Leandro, CA) . Tato oblast je v přehledu zhodnocena v publiakci Martin, Y. C., 1992,
J. Med. Chem. 35: 2145-2154.
3. HOOK (dostupný od firmy Molecular Simulations, Burlington, MA).
Místo toho, aby pokračovalo sestavování inhibitoru nebo vazebné sloučeniny postupným způsobem vždy po jedné chemické entitě, jak bylo popsáno výše, vazebné sloučeniny mohou být také navrženy najednou v celku nebo de novo” s použitím buďto prázdného vazebného místa (jako je například vazebné místo al-I domény nebo hAQC2 Fab fragmentu) nebo volitelně zahrnující nějakou část nebo části známé vazebné sloučeniny al-I domény nebo hAQC2 Fab fragmentu. K takovým postupům patří např. následující:
1. LUDI (Bohm, H.-J., 1992, J. Comp. Aid. Molec. Design 6: 61-78) . LUDI je dostupný od firmy Biosym Technologies, San Diego, CA.
2. LEGEND (Nishibata, Y. and AAA. Itai, 1991, Tetrahedron 47: 8985). LEGEND je dostupný od Molecular Simulations, • · 4 · 4 4
4 4 « · • 4 4 • 4 4 4
444 4 44 • 4 4 4 4 4
4 44 4444
4444 44 ··· 44 4
Burlington, ΜΑ.
3. LeapFrog (dostupný od Tripos Associates, St. Louis, MO) .
V předkládaném vynálezu mohou být užity i další techniky molekulárního modelování, viz např. Cohen, N. C. et al., 1990, J Med. Chem. 33:883-894. Viz také Navia, M. A. a M. A. Murcko, 1992, Curr. Opin. Struct. Biol. 2: 202-210.
Jakmile je jednou entita navržena nebo vybrána výše popsanými metodami, účinnost, se kterou se taková entita může vázat k al-I doméně nebo hAQC2 Fab fragmentu, může být testována a optimalizována pomocí vyhodnocování výpočtů. Například sloučenina, která byla navržena nebo vybrána, aby fungovala jako vazebná sloučenina al-I domény, se může rozprostírat v objemu, který se nepřekrývá s objemem, který zabírá vazebné místo, al-I deformační sloučeniny když je vázáno k chimérické doméně. Účinná vazebná sloučenina al-I domény může vykazovat relativně malý rozdíl v energii mezi svým vázaným a volným stavem (tj. malá deformační energie vazby). Takže nejúčinnější vazebná sloučenina al-I domény by měla být navržena tak, aby deformační energie vazby nebyla větší než přibližně 41,868 kJ/mol (10 kcal/mol), např. ne větší než 29,308 kJ/mol (7 kcal/mol). Vazebné sloučeniny al-I domény mohou interagovat s al-I doménou ve více než jedné konformacích, které jsou podobné v celkové energii vazby. V takových případech, energie vazby je rozdílem mezi energií volné a průměrnou energií konformace, kterou lze pozorovat, když se sloučenina váže na protein.
Sloučenina navržená nebo vybraná jako jako vazebná sloučenina al-I domény může být dále počítačově optimalizována tak, aby ve svém vázaném stavu postrádala odpudivé elektrostatické interakce s cílovým proteinem. Takové
9· ·*··
9999 nekomplementární (např. elektrostatické) interakce zahrnují odpudivé interakce typu náboj-náboj, dipól-dipól a nábojdipól. Specificky, suma všech elektrostatických interakcí mezi sloučeninou a proteinem, když je sloučenina vázána k al-I doméně, by měla být neutrálním nebo prospěšným příspěvkem k entalpii vazby.
Pro výpočty deformační energie sloučenin a elektrostatických interakcí je odborníkům k dipsozici specifický počítačový software. Příklady programů určených pro taková použití zahrnují: Gaussian 92, revize C (M. J. Frisch, Gaussian, lne., Pittsburgh, PA, ©1992), AMBER, verze 4.0 (P. A.Kollman, University of California at San Francisco, (©1994),QUANTA/CHARMM (Molecular Simulations, lne., Burlington, ΜΆ, ©1994), a Insight II/Discover (Biosysm Technologies lne., San Diego, CA (©1994). Tyto programy mohou být implementovány například na počítačích (workstation) Silicon Graphics. Další hardwarové systémy a softwarové balíky jsou odborníkům také známy.
Jednou z dalších technik použitelnou pro navrhování léčiv, kterou umožňuje předkládaný vynález, je iterační navrhování léčiv. Iterční navrhování léčiv je způsob, jak optimalizovat vztahy mezi proteinem a sloučeninou (včetně sloučeniny, kterou je protilátka) tím, že se určují a vyhodnocují trojrozměrné struktury postupných souborů komplexů protein/sloučenina. Při iteračním navrhování léčiv jsou získány série proteinových krystalů v komplexu s entitami, které se vážou na protein, a pak se řeší trojrozměrné struktury každého molekulárního komplexu. Takový přístup poskytuje možnost nahlédnout do spojení mezi proteiny a dalšími entitami každého komplexu. To je uskutečněno tak, že se selektují chemické entity s inhibiční aktivitou, získají se krystaly nových komplexů, • · ·· • *
- 54 • · · · · · · • · · · · · · • · · ·· 9 9999
9 9 9 9 9
999 99 9 vyřeší se trojrozměrné struktury komplexů a srovnají se spojení (asociace) mezi novými komplexy a dříve řešenými komplex. Spojení v komplexu mohou být optimalizována tím, že se pozoruje, jak změny ve složkách komplexu ovlivňují spojení.
V některých případech iterativní návrh léčiv je prováděn tak, že se vytvoří postupné komplexy a pak se krystalizuje každý nový komplex. Alternativně jsou přeformované proteinové krystaly navlhčeny v přítomnosti další chemické entity, čímž se vytvoří komplex, a tak se odstraní nutnost krystalizovat každý individuální komplex.
XII. Farmaceutické přípravky
Farmaceutické přípravky podle tohoto vynálezu obsahují jeden nebo více VLA-1 antagonistů podle předkládaného vynálezu (např. anti-VLA-1 protilátky a VLA-1 antagonisty typu malé molekuly, které byly identifikovány výše popsaným způsobem léčiv) nebo jejich farmaceuticky Přípravky mohou dále obsahovat racionálního návrhu přijatelné deriváty, farmaceuticky přijatelný nosič, vehikulum, pufr a stabilizátor.
jako například adjuvans,
Farmaceutické přípravky podle tohoto vynálezu mohou být podávány perorální, intraperitoneální, intraarteriální, topickou, intravenózní, subkutánní, intramuskulární, intramedulární, intraartikulární, intrasynoviální, intrasternální, intrathékální, intrahepatickou, intraspinální nebo intrakraniální cestou podle požadavků, nebo přímo lokálně do místa zánětu nebo růstu nádoru, farmaceutické přípravky podle tohoto vynálezu mohou také být podávány inhalací, např. pomocí nebulizéru, inhalátoru pro suchý prášek nebo inhalátoru s odměřenými dávkami, a nebo implantací infúzní pumpy nebo biologicky kompatibilního implantátu s prodlouženým • · • · 0 0 0 · · · · • · · · · · · · 0 0··· 000 000 000
0000 ·· 00 0·· 0· ·
- 55 uvolňováním přímo do těla pacienta.
Farmaceutické přípravky mohou být také ve formě sterilního přípravku pro injekci, například sterilní vodné nebo olejové suspenze pro injekci. Takové suspenze mohou být formulovány postupy, které jsou v oboru známy, s použitím vhodných dispergačních, smáčecích a suspendujících činidel. Jestliže je přípravek podáván perorálně, pak farmaceutická kompozice může být podávána ve formě tobolky, tablety, vodné suspenze nebo roztoku. Pro topické aplikace farmaceutické kompozice mohou být formulovány jako vhodné masti.
Dávka a dávkovači režim VLA-1 antagonistů podle tohoto vynálezu, které jsou účinné pro dosažení požadovaného účinku, závisí na celá řadě faktorů, jako například povaha onemocnění, které se léčí, velikost pacienta, požadovaný cíl léčby, použitý specifický farmaceutický přípravek a názor ošetřujícího lékaře.
Použitelné jsou např. dávkové hladiny účinné složky mezi přibližně 0,001 a přibližně 100 mg/kg tělesné hmotnosti za den, například mezi přibližně 0,1 a přibližně 50 mg/kg tělesné hmotnost za den. Například protilátka podle vynálezu bude podávána v dávkách v rozmezí od přibližně 0,01 mg/kg tělesné hmotnosti za den a přibližně 20 mg/kg tělesné hmotnosti za den, např. v rozmezí od mezi přibližně 0,1 mg/kg tělesné hmotnosti za den a přibližně 10 mg/kg tělesné hmotnosti za den, a to v intervalech jedenkrát denně až jedenkrát za čtrnáct dnů.
V jiném provedení je protilátka podávána v dávce přibližně 0,3 až 1 mg/kg tělesné hmotnosti, pokud je podávána intraperitoneálně. V ještě dalším provedení je protilátka podávána v dávce přibližně 5 až 12,5 mg/kg tělesné hmotnosti, když je podávána intravenózně. V dalším provedení je • · «
- 56 protilátkový přípravek podáván v množství, které je dostatečně účinné na to, aby poskytlo plazmatickou hladinu protilátky alespoň 1 mg/ml.
XIII. Nemoci a modely na zvířatech
VLA-1 antagonisté podle předkládaného vynálezu jsou užiteční při léčení, včetně prevence, αΐβΐ-zprostředkovaných nemocí jako jsou například nemoci již vyjmenované výše. Léčení užitím přípravků podle tohoto vynálezu je účinné jak u lidí tak i u zvířat, postižených uvedenými nemocemi. Zvířata, u kterých je vynález použitelný, zahrnují jak domácí tak hospodářská zvířata, chovaná buďto jako domácí mazlíčci nebo pro komerční účely. Příkladem jsou psi, kočky, dobytek, koně, ovce, prasata a kozy.
Účinnost VLA-1 antagonistů podle vynálezu může být testována na různých zvířecích modelech. Například k užitečným modelům psoriázy a artritidy patří modely popsané ve WOOO/72881. K modelům fibrózy ledvin patří modely popsané ve WO 99/61040, model Alportova syndromu ledvin je popsán v Cosgrove et al., 2000, Am. J. Path. 157: 1649-1659 a model lupus nephritis na SNF1 myších je popsán v Kalled et al., 2001, Lupus 10: 9-22. Model vaskulární fibrózy pro restenózu zahrnuje model poškození karotidy balónkem u laboratorního potkana popsaný v Smith et al., 1999, Circ. Res. 84: 12121222. Model fibrózy plic modelující idiopatickou plicní fibrózu a plicní fibrózu asociovanou se sklerodermou zahrnuje model bleomycinem indukované plicní fibrózy popsaný ve Wang et al., 1999, Thorax 54: 805-812. Modely cirhózy jater pro hepatitidu C nebo pro alkoholem indukovanou cirhózu zahrnuje model s ligací žlučovodu popsaný v George et al., 1999, Proč.
Nati. Acad. Sci. USA 96: 12719-12724 a model CCLA-indukované
9·99 · 9 99 99 »99
9 «9 9 9999
9999 »9999999
999 99 9 999
9999 99 99 999 99 9
- 57 fibrózy jater popsaný v Shi et al., 1997, Proč. Nati. Acad.
Sci. USA 94: 10663-10668.
Účinnost léčení užitím přípravků podle tohoto vynálezu může být odnocena řadou dostupných diagnostických protředků, včetně fyzikálního vyšetření, krevních testů, měření proteinurie, hladiny kreatininu a clearance kreatininu, funkčního plicního testu, rentgenu hrudníku, bronchoskopie, bronchoalveolární laváže, biopsie plic, hladin dusíku v plazmě, krvi a moči (BUN), pozorování a skórování jizvení nebo fibrotických lézí, depozitu extracelulární matrix, například kolagenu, aktinu hladkého svalstva a fibronektinu, funkčních testů ledvin, a vyšetření pomocí ultrazvuku, zobrazování pomocí magnetické resonance (MRI) a vyšetření počítačovou tomografií (CT).
XIV. Diagnostické postupy
Protilátky podle tohoto vynálezu mohou být použity pro diagnostické stanovení nemocí asociovaných se změnami expresní hladiny αϊβΐ. Tkáňový vzorek od pacienta, jako například tkáňová biopsie, vzorek tělesné tekutiny nebo laváž (např. alveolární laváž), může být testován v testu založeném na zachycení antigenu, ELISA testu, imunohistochemickém testu apod. s použitím protilátky. Tkáňový vzorek od normálního zdravého jedince je použit jako kontrola.
Při provedení předkládaného vynálezu se využije, pokud není specificky uvedeno jinak, obvyklých technik buněčné biologie, tkáňových kultur, molekulární biologie, mikrobiologie, rekombinantní DNA, proteinové chemie a imunologie, které jsou odborníkům známy a patří k jejich rutinním dovednostem. Takové techniky jsou popsány v odborné literatuře, například Molecular Clonig: A Laboratory Manual,
- 58 »» φφφφ
Λφ • Φ ΦΦΦ
Φ Φ · · « ΦΦΦΦ
ΦΦΦ Φ Φ
ΦΦΦΦ ΦΦ ΦΦ
Φ ΦΦ·
ΦΦ ΦΦΦ
Φ ΦΦΦΦ
ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ Φ ΦΦΦ
ΦΦΦ ΦΦ ·
2nd edition (Sambrook et al., Eds.), 1989, Oligonucleotide Synthesis, (M. J. Gait, Ed.), 1984, U. S. Patent 4,683,195,
Mullis et al., Nucleic Acid Hybridization, (B. D. Hames and S. J. Higgins), 1984, Transcription and Translation, (B. D. Hames and S. J. Higgins), 1984, Culture of Animal Cells (R. I. Freshney, Ed.), 1987, Immobilized cells and Enzymes, IRL
Press, 1986, A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984, Methods in Enzymology, Volumes 154 and 155 (Wu et al., Eds.), Academie Press, New York, Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. H. Miller and Μ. P. Calos, Eds.), 1987, Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, Eds.), 1987, Handbook of Experiment Immunology, VolumesI-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, Eds.), 1986, Manipulating the Mouše Embryo, 1986.
Není-li uvedeno jinak, všechny technické a vědecké termíny použité v tomto textu mají stejný význam, jak mu obvykle rozumí odborník v příslušném oboru techniky, do kterého spadá tento vynález. Příklady metod a materiálů jsou popsány níže, ačkoliv v praxi nebo testech podle předkládaného vynálezu mohou také být použity metody a materiály podobné nebo ekvivalentní s těmi, které jsou popsány v tomto textu. Všechny publikace a další odkazy, které jsou uvedeny v tomto textu, jsou formou odkazu celé zahrnuty v předkládané přihlášce, v případě konfliktu, je rozhodný předkládaný popis, včetně uvedených definic. Materiály a metody, a také uvedené příklady, jsou pouze ilustrativní a nijak předkládaný vynález neomezuj i.
V tomto popisu a nárocích, termín obsahovat nebo jeho tvary (obsahuje nebo obsahující) je třeba chápat tak, že znamená zahrnutí daného celého čísla nebo skupiny celých čísel, ale přitom nevylučuje jakákoliv další celá čísla nebo • · ·· · 9 · · · · · 9
9 9 9 9 9 9 9 9
999 9 9 99 9999
9 9 9 9 9 9 9 9
9999 99 99 999 99 ·
- 59 skupiny celých čísel.
Následující příklady, které jsou poskytnuty s cílem podrobněji objasnit předkládaný vynález, nijak neomezují rozsah vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Chemická činidla
Isothiokyanát fluorescein (FITC) byl koupen od firmy Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) . Krotonový olejový byl koupen od ICN Biochemicals (Aurora, OH) . Plná ovčí krev v Alseverově roztoku byl získána od East Acres Biologicals (Southbridge, MA). Kolagen typu I z ocasu laboratorního potkana a myší kolagen typu IV byly koupeny od Collaborative Research lne. (Bedford, MA) a Gibco (Gaithersburg, MD) , v daném pořadí.
Samice myší Balb/c ve stáří 6 až 8 týdnů byly koupeny od firmy Taconic (Germantown, NY) a myši αΐβΐ-deficitní s Balb/c základem byly získány jak bylo popsáno dříve (3).
Přiklad 1
Monoklonální protilátky
Funkci-blokující monoklnální protilátky (mAb) proti myším antigenům byly připraveny ve formátu bez azidu a s nízkým endotoxinem: Ha31/8 (křeččí anti-CD49a, integrin al) (Mendrick et al. 1995. Lab. Invest. 72: 367-375), Hal/29 (křeččí antiCD49b, integrin α2) (βΐ) (Mendrick et al. 1995. Lab. Invest.
• · · · · · · · · · • · · · · · · · · • ··· · · · · · · · ·
72: 367-375, Mendrick, D. L. and D. M. Kelly 1993 Lab. Invest. 69: 690-702), křeččí kontrolní mAb Ha4/8 skupiny II (křečci anti-KLH) (Mendrick, D. L. and D. M. Kelly 1993 Lab. Invest. 69: 690-702) a PS/2 (potkaní anti-CD49d, řetězec integrin α4β1) (Miyake et al. 1991 J Exp. Med. 173: 599-607). Kromě toho, následující funkci-blokující monoklonální protilátky proti myším antigenům byly zakoupeny jako preparáty bez azidu/s nízkým obsahem endotoxinu od firmy Pharmingen (San Diego, CA) : ΗΜβΙ-1 (křeččí anti- CD29, řetězec integrin βΐ) (Noto et al. 1995 Int. Immunol. 7:835-842), Ha2/5 (křeček anti-CD29, řetězec integrin βΐ) (Mendrick, D. L. and D. M. Kelly 1993 Lab. Invest. 69: 690-702), 3E2 (křeččí anti-CD54,
ICAM-1) (Scheynius et al. 1993 J. Immunol. 150: 655-663),
5H10-27 (potkaní anti-CD49e, integrin oí5) (Kinashi, T. , and T. A. Springer. 1994. Blood Cells. 20: 25-44), GoH3 (potkaní anti-CD49f, integrin a6) (Sonnenberg et al. 1987J, Biol. Chem. 262: 10376-10383) a potkaní izotypová kontrolní monoklonální protilátky R35-95 (potkaní IgG2a) a R35-38 (potkaní IgG2b).
Testy adheze
Splenocyty z Balb/c myší byly pěstovány s 20 ng/ml IL-2 po dobu 7 až 12 dnů. Adheze buněk ke kolagenu typu I a typu IV byla taková, jak bylo již dříve popsáno (Gotwals et al. 1996J. Clin. Invest. 97: 2469-2477). Stručně, 96 jamkové destičky
Maxisorp (Nunc, Napierville, IL) byly potaženy buďto 10 pg/ml kolagenu typu IV nebo 5 pg/ml kolagenu typu I a nespecifická místa byla blokována 1% BSA. IL-2 aktivované splenocyty byly značeny s 2 μΜ BCECF [pentaacetoxymethylester 2 ', 7 ' bis(karboxyethyl)-5(6)karboxylfluoresceinu] (Molecuiar Probes, Eugene, OR) a inkubován s 10 pg/ml uvedené protilátky po dobu 15 minut. 105 buněk v 0,25% BSA v RPMI bylo pak přidáno
k potaženým jamkám a inkubováno po dobu 60 minut v 37 C. Nenavázané buňky byly odstraněny promytím třikrát s 0,25% BSA v RPMI. Adheze byl kvantifikován s použitím čtecího zařízení Cytofluor 2350 pro fluorescenci na destičkách (Millipore, Bedford, MA).
Poměr navázaných buněk k celkvému počtu vstupujících buněk byl měřen a procento adheze vzhledem k buňkám ošetřeným kontrolní protilátkou (normalizován ke 100 %) bylo vypočteno, hodnoty pozadí způsobené buněčnou adhezí na jamky potažené samotným BSA byly odečteny.
Expresní a funkční blokáda αϊβΐ a α1β2 aktivovaných leukocytů
Vzhledem ke klíčové úloze leukocytů při zánětu, původci se rozhodli testovat, zda anti-al a anti-a2 monoklonální protilátky byly schopny blokovat adhezi leukocytů ke kolagenu. Aby se získaly leukocyty exprimující vysoké hladiny jak al tak i a2, myší T lymfocyty byly stimulovány in vitro s IL-2 po dobu 7 až 12 dnů. Tyto buňky exprimovaly vysoké hladiny jak al tak i a2 (Obr. 1A) a vázaly se dobře k oběma povrchům potaženým kolagenem typu IV a typu I (Obr. 1B) . Adheze ke kolagenu typu IV byl částečně inhibována samotnou anti-al mAb a samotnou anti-a2 mAb inhibována nebyla. Na rozdíl od toho adheze ke kolagenu typu I byl kompletně inhibována anti-a2 mAb a anti-al mAb samotná projevovala pouze parciální inhibici. Jak anti-βΐ mAb tak kombinace anti-al a anti-a2 mAb úplně inhibovaly adhezi ke kolagenu typu I a IV. Poté, co bylo ukázáno, že integriny αϊβΐ a α1β21 jsou exprimovány na aktivovaných T lymfocyech a že anti-al a a2 monoklonální protilátky jsou schopny funkčně blokovat adhezi leukocytů ke kolagenu, byly tyto monoklonální protilátky použity k in vivo zkoumání role uvedených integrinů ve zvířecích modelech zánětlivých onemocnění.
Příklad 2
Inhibice DTH reakce anti-integrinovými monoklonálními protilátkami
SRBC-indukovaná hypersenzitivní reakce opožděného typu (DTH) byla adaptována z již dříve publikovaného protokolu (Hurtrel et al., 1992, Cell. Immunol. 142: 252-263). Krátce, myši byly imunizovány na hřbetě s.c. injekcí dávkou 2 x 107 SRBC v 100 μΐ PBS v den 0. myši byly podruhé s. c. injikovány (byla provedena tzv. antigenní výzva, „challenge) v den 5 dávkou 1 x 108 SRBC v 25 μΐ PBS do pravého tlapky. Tloušťka tlapky byla měřena inženýrským posuvným měřítkem (kaliperem) firmy Mitutoyo/MTI, Paramus, NJ, 20 hODIN po expozici antigenu a byla vypočtena míra otoku tlapky. Výsledky jsou uvedeny jako průměrná hodnota procentního nárůstu tloušťky tlapky ± střední chyba průměru (SEM) a vypočteny jako % zvýšení = [1- (tloušťka pravé tlapky 20 hodin po expozici antigenu/tloušťka neinjikované levé tlapky 20 hodin po expozici antigenu)] x 100. Pro zablokování efektorové fáze SRBC-indukované DTH reakce byly terapeutické nebo kontrolní mAb (100 pg) , které byly připraveny postupy popsanými v příkladu 1, podávány i. p. 1 hodinu před antigenní výzvou v den 5.
SRBC-indukovaná DTH je dobře charakterizovaný in vivo model zánětu, konkrétně psoriázy, který byl použit k demonstraci významu celé řady cytokinů a adhezních molekul při zánětu (Tedder et al., 1995, J. Exp. Med. 181: 2259-2264, Terashita at al., 1996, J. Immunol. 156: 4638-4643). SRBC63 • * · · · · ··· • · · · · · · · · • · β · * · · · ···· senzibilizované myši dostaly anti-integrinové mAb 1 hodinu před antigenní výzvou provedenou na chodidle a zánět byl vyhodnocen po 20 hodinách jako míra zvětšení tloušťky tlapky. Kontrolní myši ošetřené PBS a kontrolní myši ošetřené křeččím Ig ukázaly 60 až 70% zvýšení tloušťky tlapky 20 hodin po antigenní výzvě (obr. 2). Ve srovnání s kontrolou ošetřenou křeččím Ig, anti-αΐ nebo anti-a2 mAb vedly k 68% a 60% inhibici v tloušťce tlapky, v daném pořadí. Kombinace z antial a anti-oí2 mAb vedla k 71% inhibici, což ukázalo velmi malý aditivní účinek proti samotným anti-αΐ nebo anti-a2 mAb. Ošetření dalšími anti-integrin mAb bylo také účinné v inhibici efektorové reakce DTH. Míra inhibice pozorovaná pro různé mAb byla 49 % (anti- oí4), 23 % (anti-a5) a 57 % (anti-αδ) .
A nakonec mAb blokáda obecné integrinové podjednotky βΐ (mAb HMBI-1) vedla k inhibici efektorové DTH reakce o 67%.
Příklad 3
Inhibice CHS efektorové reakce anti-integrinovými monoklonálním protilátkami
Kontaktní hypersenzitivita (CHS) na FITC byl testována jak bylo popsáno dříve (Gaspari et al., 1991, Current Protocols in Immunology. J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, and W. Strober, editors. John Wiley & Sons, New York. Sekce 4. 2: 1). Krátce, myši byly senzibilizovány nanesením 100 μΐ 0,5% FITC ve směsi 1:1 aceton/dibutylftalát na oholený hřbet v den 0, po 10 dnech byla provedena antigenní výzva („challenge) nanesením 5 μΐ 0,5% FITC na obě strany každého ucha. Reakce otoku ucha byla hodnocena tloušťkou ucha
1« «··· «· · ♦» · ♦ · 0 ··«· · · · • * · · · ···· • · · · · « ·· ···· «··· ·» «· · ·· ·· 0 měřenou inženýrským posuvným měřítkem (Mitutoyo/MTI, Paramus, NJ) v době antigenní výzvy (den 10) a o 24 hodin později a výsledky byly uvedeny jako jako průměrné procentní zvýšení bazální hodnota tlošťky ušního boltce ± SEM (střední chyba průměru).
Zvýšení tloušťky ucha bylo vypočteno jako % zvýšení = [1(tloušťka ucha 24 h po antigenní výzvě/tloušťka ucha v okamžiku antigenní výzvy)] x 100. Pro zablokování efektorové fáze CHS reakce, terapeutické nebo kontrolní mAb (250 pg) byly podávány i. p. 4 hodiny před antigenní výzvou v den 10. Myši, které byly antigenně-senzibilzovány pouze vehikulem a také do ucha bylo injikováno samotné vehikulum (vehikulová kontrola) nebo myši, u kterých byla provedena antigenní výzva ucha bez předchozí senzibilizace (kontrola iritujícícm činidlem), sloužily jako negativní kontroly (nikdy překročil 2 % zvýšení tloušťky ucha).
Vzhledem k tomu, že CHS je co do mechanizmu zřetelně odlišný od DTH a podílejí se na něm také odlišné efektorové buňky, původci zkoumali, jaké účinky mají anti-integrinové mAb na efektorovou fázi CHS reakce. Myši byly haptenověsenzibilizovány s použitím FITC naneseným na vyholený hřbet, poté následovala o 10 dnů později FITC výzva aplikací na uši, která vedla k zánětlivé reakci následující den. FITCsenzibilizované myši vykazovaly 60-70% zvýšení tloušťky (ucha) 24 hodin po antigenní výzvě (obr. 3) . V souladu s publikovanými výsledky (Scheynius et al.,J. Immunol. 150: 655-663), léčení podáváním anti-ICAM-1 mAb vedlo k 51% inhibici otoku ucha. Ve srovnání s kontrolní křečci mAb, léčba myší podáváním anti-αΐ nebo anti-a2 mAb 4 hodiny před antigenní výzvou vedla k 37% a 57% inhibici otoku ucha, v daném pořadí (obr. 3) . Kombinace z anti-αΐ a anti-a2 mAb vedlo k mírně vyšší inhibici otoku ucha (65%).
Léčení dalšími mAb proti βΐ integrinu odhalilo, že zatímco mAb anti-a4 a anti-a5 nevedly k žádné inhibici FITC-indukované CHS efektorové reakce ve srovnání s kontrolní mAb laboratorního potkana, léčení anti-a6 mAb vedlo k 86% inhibici efektorové reakce. A nakonec mAb blokáda společné βΐ integrinové podjednotky inhibovala CHS efektorovou reakci o 74 %. Podobné CHS výsledky byly získány s použitím různých kmenů myší (C57/BL6,129/Sv) a různých senzibilizujících činidel (oxazolon) (data nejsou ukázána). Podobně jako výsledky pozorované u SRBC-indukovaného modelu DTH, histologické analýzy uší se zánětem odhalily, že jak vytváření edému tak infiltrace leukocytů byly inhibovány podáváním anti-al a anti-a2 mAb.
V souladu se zjištěními, že αϊβΐ a α2β1 mohou být exprimovány na IL-2-aktivovaných splenocytech, analýza lymfatických uzlin z antigenem senzibilizovaných myši (FITC nebo oxazolon) ukázala, že αϊβΐ a α2β1 jsou exprimovány výlučně na CD44hl LFA-lhl aktivovaných CD4+ a CD8+ T lymfocytech (data nejsou ukázána). Léčení myší podáváním anti-al a anti-a2 mAb nevedlo k odstranění těchto buněk, když množství aktivovaných T lymfocytů jak ve slezině tak lymfatických uzlinách zůstalo neovlivněno v reakci na senzibilizaci antigenem v CHS modelu. Kromě toho, efektorové buňky nebyly funkčně odstraněny, když dlouhodobé léčení antigenem senzibilizovaných myší anti-al a anti-a2 mAb (den 10 až 16) neovlivnilo zánětlivé reakce myší, u kterých byla aplikována antigenní výzva v den 20 (data nejsou ukázána).
• * • · · · « ·
Příklad 4
CHS efektorové reakce jsou sníženy u αΐβΐ-deficitních myší
Aby byla vyloučena možnost, že inhibiční úloha αϊβΐ v efektorové reakci FITC-zprostředkované CHS byla zprostředkována monoklonální protilátkou, experimenty byly prováděny u myší divokého typu a myší deficientních na αϊβΐ (obr. 4) . Inhibice mAb efektorové fáze u myší divokého typu byla shodná s předchozími výsledky, kdy 56% inhibice v tloušťce ucha byla pozorována s anti-al, 56% s anti-a2 a 62% s kombinací anti-al a anti-a2. Efektorová fáze CHS byl významně redukován u neošetřených αΐβΐ-deficientních myší ve srovnání s neošetřenými myšmi divokého typu (30% vs. 71% zvýšení v tloušťce ucha, v daném pořadí). Jak se dalo očekávat, míra otoku ucha u neošetřených αΐβΐ-deficientních myší byla ekvivalentní s mírou otoku ucha pozorovanou u myší divokého typu podrobených působení anti-al mAb. A nakonec, mAb blokáda α2β1 a αΐβΐ-deficientních myší vedla pouze k mírně zvýšené inhibici otoku ucha, což bylo v souhlasu s pozorováním u myší divokého typu podrobených působení kombinace anti-al a anti-a2 mAb.
Příklad 5
Aby byla dále vyloučena možnost, že inhibiční účinek antiintegrinových mAb, pozorovaný jak u DTH tak i CHS modelů zánětu, je způsoben obecným protizánětlivým účinkem zprostředkovaným anti-al a anti-a2 mAb, byl zkoumán účinek mAb na dermatitidu vyvolanou dráždivým činidlem (iritantem).
tf 00 A • · 0 0 0 • · · · 0
A · 0 000·
Pro hodnocení dermatitidy vyvolané iritantem bylo myším naneseno 5 μΐ 0,8% krotonového oleje v acetonu na obou stranách každého ucha. Terapeutické nebo kontrolní protilátky byly podávány 4 hodiny před použitím iritantu. Otok ucha byl měřen o 24 hodin později, jak bylo popsáno výše, a byl srovnán s tloušťkou ucha před aplikací krotonového oleje. Výsledky jsou uváděny jako průměr procentního zvýšení bazální hodnoty tloušťky ucha ± SEM, jak bylo popsáno výše. Myši, u kterých byl aplikován samotný aceton (kontrola vehikulem) sloužily jako negativní kontrola.
Za 24 hodin uši myší podrobené působení krotonového oleje vykazovaly významné zvýšení tloušťky ucha (48%) ve srovnání k myším dostávajícím samotné vehikulum (aceton). Toxické otoky ucha způsobené krotonovým olejem nebyly významné ovlivněny u myší předem ošetřených anti-αΐ nebo anti-a2 mAb ve srovnání s kontrolnímo zvířaty oštřenými buďto PBS nebo kontrolní mAb (obr. 5). Histologické vyšetření uší ošetřených krotonovým olejem neodhalilo žádné rozdíly v počtu nebo typu infiltrujících buněk nebo tvorbě edému u myší podrobených působení anti-αΐ nebo anti-a2 mAb ve srovnání s myšmi ošetřenými kontrolní mAb nebo PBS (data nejsou ukázána).
Příklad 6
Inhibice artritidy podáváním αϊβΐ a α1β2
Jelikož αϊβΐ je dobře exprimován na infiltrujících buňkách buňkách v synoviu pacientů s artritidou, původci se rozhodli zkoumat, zda anti-αΐ nebo anti-a2 mAb by působily jako inhibiční ve zrychleném modelu artritidy dříve popsaném
444444 ·· · 99 9 »4 · · » <· 4 4 4 • · · · 4 4··· • 444 4 9 44 44444
444 444 444
4444 «4 44 444 44 4
- 68 (Terato et al., 1992, J Immunol. 148: 2103-2108, Terato et al., 1995, Autoimmunity 22: 137-147).
Soupravy artrogen-CIA protilátek byly koupeny od Stratagene (La Jolla, CA) a artritida byla indukována s použitím zavedeného protokolu (Terato et al., 1992, J.
Immunol. 148: 2103-2108, Teratoet al., 1995, Autoimmunity 22: 137-147). Krátce, artritida byl indukována podáváním i. p. injekce koktejlu z 4 mAb anti-kolagen typu II (1 mg každé) v den 0, poté následovala i. p. injekce 50 μΐ LPS v den 3.
V průběhu dalších 3-4 dnů se u myší vyvinuly otoky zápěstí, kotníků a prstů. Terapeutické nebo kontrolní mAb (250 pg) byly podávány i. p. 4 hodiny před injekcí anti-kolagenových mAb v den 0 a znovu 4 hodiny před podáním LPS v den 3 a pak podávání pokračovalo každý 3. Den po celou délku trvání experimentu. Počínaje dnem 3 myši byly vyhodnocovány na rozvoj artritidy. Závažnost artritidy v každé končetině byla zaznamenávána s použitím čtyřbodového systému: 0 = normální, 1 = mírné zčervenání, nepatrný otok kotníku nebo zápěstí, 2 = mírný otok kotníku nebo zápěstí, 3 = závažný otok včetně některých prstů, kotníku a tlapky, 4= maximální zánět.
Závažná artritida se u Balb/c myší vyvinula za 72 hodin po LPS injekci a přetrvávala po více než 3 týdny. Ani injekce anti-kolagenových mAb samotných ani LPS samotného neindukovala artritidu. Myši dostávající kontrolní mAb vykazovaly stejně závažnou artritidu jako byla pozorována u myší, kterým byl podáván PBS (Obr. 6) . Na rozdíl od toho, léčba anti-αΐ mAb samotnou vedla k výraznému potlačení (78%) artritidy, které trvalo po celou dobu experimentu. Léčba anti-a2 mAb samotnou měla také příznivý účinek, vedla k 32% snížení artritického skóre ve srovnání s myšmi léčenými kontrolními mAb. Kombinace anti-αΐ a anti-a2 mAb vedla k podobné míře inhibice jaká byla
- 69 pozorována pro anti-αΐ mAb samotnou.
Příklad 7
Histologická analýza účinku léčení anti-αΐ a anti-a2 mAb na zánětový buněčný infiltrát
Další histologické analýzy SRBC-indukované DTH reakce potvrdily schopnost anti-αΐ a anti-a2 mAb léčby modulovat vyvolanou zánětlivou reakci. Polštářky tlapky (dále zkráceně tlapky) bez aplilace antigenní výzvy u SRBC-senzibilizovných myší skutečně nevykazovaly žádný zánětový buněčný infiltrát, ve srovnání s chodidly po SRBC-výzvě u stejných myší. Léčení SRBC-senzibilizovaných anti-αΐ a anti-a2 mAb buďto samotnými nebo v kombinaci vedlo k redukci počtu infiltrujících buněk zjištěných v tlapkách po SRBC-výzvě, ve srovnání s myšmi léčenými kontrolní mAb. Podrobnější vyšetření infiltrujících buněk odhalilo, že většinu buněk představovaly neutrofily, s výskytem několika monocytů a lymfocytů, a potvrdile tak, že léčba anti-oíl a anti-a2 mAb vede k velkému snížení počtu těchto buněk.
Příklad 8
Imunohistochemická demonstrace buněk exprimujících αϊβΐ v zánětovém infiltrátu
Imunohistochemické vyšetření bylo provedeno podrobněji kvůli přesnějšímu určení povahy infiltrujících buněk a ke » <
• · · • 99 9 zjištění toho, zda exprimují integriny vázající kolagen. Infiltrující buňky ze zanícených chodidel neošetřených myší byly vyšetřeny na exprese αϊβΐ integrinu a výskyt markérů buněčných linií. Exprese αϊβΐ integrinu byla zjištěna na mnoha infiltrujících leukocytech. Dvojí imunohistochemické značení bylo použito k rozpoznání povaha infiltrujících buněk a distribuci αϊβΐ exprese. S použitím markérů buněčných linií bylo zjištěno, že infiltrát je složen převážně z granulocytů/monocytů (Mac-1+), přičemž mnohé z těchto buněk jsou neutrofily (Grl+), spolu s menším počtem T lymfocytů (CD3+). Exprese αϊβΐ integrinu byla zjištěna u všechny třech podmnožin buněk, s al exprimovanou na podmnožině Mac-1+ granulocytů/monocytů, podmnožině Grl+ neutrofilů a na většině infiltrujících CD3+ T lymfocytů. Detailní imunohistochemická analýza odhalila, že ačkoli léčení anti-αΐ a anti-a2 mAb redukovalo množství infiltrujících buněk, nebyla pozorována žádná změna ve složení infiltrátu (data nejsou ukázána). Imunohistochemické vyšetření s barvením pomocí FITC antikřeččí mAb potvrdilo schopnost anti-αΐ a anti-a2 mAb lokalizovat se do zanícené tlapky (data nejsou ukázána).
Příklad 9
Inhibice artritidy mAb proti αϊβΐ a α1β2 u αΐβΐ-deficitních myší
Jelikož αϊβΐ je dobře exprimován na infiltrujících buňkách buňkách v synoviu pacientů s artritidou, původci se rozhodli zkoumat, zda anti-αΐ nebo anti-a2 mAb by působily jako inhibiční ve zrychleném modelu artritidy dříve popsaném
A · · AA *
A A AAAA AAA
A A AAA AAAA
A A·· A A AA A AAAA
AAAA AA AA AAA AA A
- 71 (Terato et al., 1992, J Immunol. 148: 2103-2108, Terato et al., 1995, Autoimmunity 22: 137-147).
Tento model zahrnuje injekci koktejlu z 4 mAb anti-kolagen typu II (1 mg každé) v den 0 do myší, následovanou podáním LPS, což vede v průběhu dalších 3-7 dnů k vývoji artritidy.
Myši dostávaly mAb každý 3. den počínaje dnem 0 a byly vyhodnocovány na rozvoj artritidy také každý 3. den. Závažná artritida se vyvinula u všech myší za 72 hodin po LPS injekci a přetrvávala po více než 3 týdny. Ani injekce antikolagenových mAb samotných ani LPS samotného neindukovala artritidu. Myši dostávající kontrolní mAb vykazovaly stejně závažnou artritidu jako byla pozorována u myší, kterým byl podáván PBS (Obr. 7). Na rozdíl od toho, léčení samotnou antial mAb vedlo k výraznému potlačení (79% a vyšší) artritidy, které trvalo po celou dobu experimentu. Léčení samotnou antia2 mAb mělo také příznivý účinek, vedlo k 37% snížení artritického skóre ve srovnání s myšmi léčenými kontrolními mAb. Kombinace anti-al a anti-a2 mAb vedla k podobné míře inhibice jaká byla pozorována pro anti-al mAb samotnou.
Redukce artritického skóre podáváním anti-al mAb byla pozorována u všech myší a porovnání vyznělo příznivě oproti jiným mAb pro léčení artritidy, jako je například fúzní protein rozpustného TNF receptoru a Ig (Moři et al., 1996, J. Immunol. 157: 31783182), anti-Mac-1 (Taylor et al., 1996, Immunology. 88: 315-321), anti-a4 (Seiffge, 1996, J. Rheumatol. 23: 2086-2091) a anti-ICAM-1 (Kakimoto et al., 1992, Cell Immunol. 142: 326-337). Ve shodě s údaji založenými na mAb ukazujícími důležitou úlohu αϊβΐ při artritidě, neošetřené αΐ-deficientní myši vykazovaly významné snížení artritického skóre ve srovnání divokého typu myši.
9 99 9 9 »9 9 • 9
- 72 Příklad 10
Účinky léčení anti-al mAb na imunopatologii artritických kloubů
Klouby z divokého typu artritické myši (den 8) dostávajících buďto kontrolní mAb nebo anti-al mAb byly srovnávány vizuálně a histologicky s klouby z normálních neošetřených myší. Vizuálně klouby z kontrolní mAb-treated myši demonstrovaly zčervenání a otok celé nohy včetně prstů, zatímco myši léčené anti-al mAb vykazovaly malé, pokud vůbec, známky zánětu buďto v kloubech nebo prstech.
Histologické vyšetření ukázalo závažné změny na artritických kloubech po ošetřené kontrolní mAb, s rozsáhlou infiltrací subsynoviálních tkání buňkami zánětlivé reakce, adhezi buněk na povrch kloubu a značnou destrukcí chrupavky,což prokazuje ztráta proteoglykanů. V souladu s předchozími publikacemi (Terato et al., 1992, J. Immunol 148: 2103-2108, Terato et al., 1995, Autoimmunity 22: 137-147), byla většina infiltrujících buněk v tomto modelu neutrofily. léčba anti-al mAb myší dramaticky redukovala množství zánětového infiltrátu a míru destrukce chrupavky.
Příklad 11
Rozvoj arthritidy je zpožděn v přítomnosti lymfocytů a inhibice arthritidy anti-al mAb nastává při absenci lymfocytů
Pro určení toho, jaké buněčné typy by mohly být důležité v modelu kolagen mAb-indukované artritidy, původci porovnali *
- 73 9999 • 9 9 »9 99 999
9 99 9 9999
9 9 9 9 9 99 9999
999 999 999
9999 99 99 999 99 9
68:869-877). Jak deficientních myší schopnost myší B6-129 divokého typu a B6-129 RAG-ldef icientních myší rozvinout artritidu (obr. 8). Genetická delece genu RAG-1 (rekombinace aktivující gen 1) vedla k úplné ztrátě zralých T a B lymfocytů (Mombaerts et al., 1992, Cell u myší divokého typu tak u RAG-1se vyvinula artritida, ačkoli kinetika indukce u RAG-l-deficientních myších byla významně pomalejší (obr. 8) . Výsledky svědčí pro to, že zatímco lymfocyty jsou zapojeny do tohoto modelu artritidy, nejsou vyžadovány pro rozvoj a průběh onemocnění. Jiné publikace zkoumající účinek RAG-1 deficitních myší v dalších modelech artritidy také zjistily, že ztráta T a B lymfocytů zpožďuje nástup artritidy (Plows et al., 1999, J. Immunol. 162:1018-1023).
Léčení jak myší divokého typu tak i RAG-l-deficientních myší anti-oíl mAb kompletně inhibovalo artritidu (obr. 8) . Výsledky demonstrují, že účinnost anti-oíl mAb v tomto modelu není závislá na přítomnosti lymfocytů, a že účinnost anti-al mAb v prevenci onemocnění může být prostřednictvím jejího působení na další al-exprimující buňky, jako například makrofágy a neutrofily, jak již bylo navrženo v předchozích experimentech (obr. 7).
Příklad 12
Reakce na dávku při inhibici artritidy podáváním anti-al mAb
Vzhledem k překvapujícím účinkům podávání anti-al mAb na prevenci artritidy původci vynálezu rozšířili tyto studie tak, aby byla zahrnuta i analýza reakce na dávku (viz obr. 9) . Různé dávky mAb byly podávány i. p. každý 3. den počínaje v • 9 9« ·· • 9 ·
9 »999 99 den 0. Ve shodě s dřívějšími daty, 250 pg dávka anti-al mAb vedla k téměř kompletní prevenci artritidy. Nižší dávka 100 pg anti-al mAb byla částečně účinná v prevenci artritidy v tomto modelu, zatímco nižší dávky neměly žádný prokazatelný účinek na artritické skóre (obr. 9).
Příklad 13
Terapeutické podávání anti-al mAb může snížit artritické skóre
Vzhledem k účinnosti anti-al mAb při prevenci artritidy se původci pokusili o léčení myší, které jsou na cestě k tomu, aby se u nich vyvinulo toto onemocnění. Artritida byla indukována u myší injekcí koktejlu mAb anti-kolagen typu II v den 0, následovanou podáním LPS v den 3. Myši byly pak podrobeny působení buďto anti-al mAb nebo fúzního proteinu rozpustného TNF receptoru s Ig počínaje dnem 4. Progrese artritidy byla zcela zablokována u myší dostávajících anti-al mAb počínaje dnem 4 ve srovnání k myšmi dostávajícími kontrolní křeččí mAb počínaje dnem 4 (obr. 10). Míra inhibice pozorovaná při terapeutickém podávání anti-al mAb byla kompletní a byla stejná jako ta, která byla pozorována při preventivním podávání anti-al mAb (zahájeném v den 0) (obr. 10) . Pro srovnání, léčba fúzním proteinem TNF receptoru s Ig ode dne 4 vedla pouze k 60-70% inhibici artritického skóre ve srovnání s kontrolním Ig fúzním proteinem (obr. 10) . Kombinovaná léčba anti-al mAb a fúzí TNF receptoru s Ig vedla k účinné kompletní inhibici artritického skóre, což není překvapující, vzhledem k plné účinnosti podávání samotné antial mAb na potlačení artritidy. Lze tedy shrnout výsledky, • · · · ·· ·
- 75 • · ··· · · » · • · * · · · · · · ·· · • · · · φ · ΦΦΦ ···· φ · ·· ΦΦΦ φ · · které ukázaly, že terapeutické podávání anti-al mAb je účinné v inhibici artritického skóre a lze ho příznivě srovnat s terapeutickým podáváním TNF antagonisty.
Příklad 14
Klonování a mutageneze al-I domény
Sekvence humánní a potkaní domény I integrinu αϊβΐ byly amplifikovány z kompletních cDNA (Kern, et al., 1994, J.Biol. Chefra. 269, 22811-22816, Ignatius et al., 1990, J. Cell Biol. 111, 709-720) polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) (užitím soupravy PCR CORE Kit, Boehringer Mannheim, GmbH, Německo), s využitím buďto specifických humánních primerů:
5'-CAGGATCCGTCAGCCCCACATTTCAA-3' [přímý] (sekv. id. č. 7) a
5'-TCCTCGAGGGCTTGCAGGGCAAATAT-3' [reverzní] (sekv. id. č. 8) nebo primerů specifických pro laboratorního potkana:
5'-CAGGATCCGTCAGTCCTACATTTCAA-3' [přímý] (sekv. id. č.: 9) a
5'-TCCTCGAGCGCTTCCAAAGCGAATAT-3' [reverzní] (sekv. id. č: 10).
Výsledné PCR amplifikované produkty byly purifikovány, ligován do plazmidu pGEX4t-i (Pharmacia) a transformována do kompetentních buněk DH5a (Life Technologies). Ampicillinu odolné kolonie byly podrobeny screeningu na expresi fúzního proteinu „glutathion-S-transferáza - doména I velikosti přibližně 45 kDa. Sekvence z inzertů plazmidů DNA klonů, které byly selektovány pro další charakterizaci, byly potvrzeny sekvencováním DNA.
Chimérická humánní/potkaní doména al-I (RAH) byla • « · · · ·
9 9 9 9 9 9 9 9
999 φ 9 9 9 99999
9 9 9 9 9 9 9 9
9999 99 99 999 ·· ·
- 76 připravena (souprava pro mutagenezi MORPH Mutagenesis kit, od firmy „5 prime-3 prime), přičemž zbytky G92, R93, Q94 a L97 laboratorního potkana (Obr. 11) nahradily odpovídající humánní zbytky V, Q, R a R, v uvedeném pořadí. Klony nesoucí RAH I doménu byly identifikovány podle toho, že ztrátily diagnostické místo pro restrikční enzym Stu 1 a inzerty pak byly potvrzeny DNA sekvencováním. Aminokyselinová sekvence humánní al-I domény je ukázána na obr. 12.
Příklad 15
Příprava mAb specifických pro al-I doménu
Prokázalo se, že monoklonální protilátky jsou velmi užitečné jako sondy při zkoumání vztahu mezi strukturou a funkcí integrinových podjednotek. Například mAb byly využity velmi extenzivně při studiu úseků βΐ podjednotky spojené s aktivovanou konformací (Qu, A., and Leahy, D. J., 1996,
Structure 4, 931-942). Takže pro identifikaci potenciální sondy vhodné pro konformační změny al-I domény byl původci vytvořen panel mAb k humánní al-I doméně.
Příprava monoklonálních protilátek k al-I doméně („anti-al-I doména mAb)
Samice Robertsonových myší (Jackson Labs) byly imunizovány intraperitoneálne (i. p.j 25 pg purifikovaného humánního αϊβΐ (Edwards et al., 1995, J.Biol. Chem. 270, 12635-12640, Gotwals et al., 1999, Biochemistry 38: 8280-8) emulgovaného s kompletním Freundovým adjuvans (LifeTechnologies). Byly •4 4444
4
44
4
4 4 ·
4 4
4 třikrát stimulovány zesilovací dávkou („boost) i. p. 25 pg αϊβΐ emulgovaného s neúplným Freundovým adjuvans (LifeTechnologies). Myš s nejvyšším titrem protilátky anti-alI doména byla znovu stimulována i. p. 100 pg αϊβΐ tři dny před fúzí a pak intravenózně 50 pg αϊβΐ i.p. jeden den před fúzí. Buňky sleziny byly fúzovány buňkami myelomu FL653 v pměru 1:6 a pak vysety v množství 100,000 a 33,000 na jamku do 96 jamkových destiček pro tkáňové kultivace.
Supernatanty pak byly hodnoceny na vazbu αϊβΐ integrinu pomocí FACS s jednoduchých barvením. Před FACS analýzou byly supernatanty inkubovány s netransfekovanými buňkami K562, aby se vyloučil IgG, který se váže pouze βΐ podjednotce. Následně bylo 3 - 5 x 104 buněk K562 transfekováných podjednotkou al integrinu (K562-al) suspendovaných ve FACS pufru (1% fetální telecí sérum (FCS) v PBS obsahující 0,5% NaN3) inkubováno se supernatantem po dobu 45 minut ve 4 °C , promyto a inkubováno s anti-myším IgG konjugovaným s fykoerytrinem. Po promytí dvakrát FACS pufrem byly buňky analyzovány průtokovým cytometrem Becton Dickinson.
Supernantant ze vzniklých hybridomů byly podrobeny screeningu na vazbu k al-I doméně. Krátce, 50 pl fúze „humánní al-I doména - GST v PBS (30 pg/ml byl) byla užita k potažení jamek 96 jamkových destiček (Nunc) přes noc ve 4 °C. Destičky byly promyty PBS, blokovány 1% BSA v PBS a hybridomový supernatant byl inkubován s doménou I při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Po důkladném promytí v PBS obsahujícím 0,03% Tween 20, byl přidán na další hodinu anti-myší IgG s navázanou alkalickou fosfatázou (Jackson ImmunoResearch). Po konečném promytí bylo přidáno 1 mg/ml p-nitrofenylfosfátu (pNPP) v 0,1 M glycinu, 1 mM ZnCl2 a 1 mM MgCl2 na dobu 30 minut při teplotě místnosti a destičky pak byly čteny při O. D. 405.
···· «· 0 00 0 • 0 0 0 0 00 000
0 00 0 0000
000 0 0 00 0000
000 000 000
0000 00 00 000 00 0
- 78 Vybrané supernatanty byly testovány na jejich schopnost inhibovat K562-al závislou adhezi ke kolagenu typu IV. Buňky K562-al byly značeny 2 mM pentaacetoxymethylesterem 2',7'(bis2-karboxyethyl-5 a 6)karboxyfluoresceinu (BCECF, Molecular Probes) v DMEM obsahujícím 0,25% BSA ve 37 °C po dobu 30 minut.
Značené buňky byly promyty vazebným pufrem (10 mM Hepes, pH 7,4, 0,9% NaCI a 2% glukóza) a resuspendovány ve vazebném pufru s 5 mM MgCl2 na konečnou koncentraci 1 x 106 buněk/ml. 50 μΐ supernatantu bylo inkubováno se stejným objemem 2 x 105 buněk K562-al v jamkách 96 jamkové destičky. Destička pak byla stočena a supernatanty byly odstraněny. Buňky byly resuspendovány ve vazebném pufru a přeneseny do jamek kolegenem potažené destičky a inkubovány po dobu 1 hodiny ve 37 °C. Po inkubaci byly odstraněny neadherující buňky promytím třikrát vazebným pufrem. Přisedlé buňky byly analyzovány na zařízení Cytofluor (Millipore).
Původci zpočátku identifikovali 19 hybridomů, jejichž supernatanty se vázaly k humánním leukémickým buňkám K562 exprimujícím αϊβΐ integrin (K562-al) a k al-I doméně, imunoglobuliny byly purifikovány z každého z hybridomů a byly testovány na schopnost blokovat vazbu buď K562-al nebo al-I domény ke kolagenu IV. Mab spadaly do dvou kategorií: ty, které blokovaly, a ty, které neblokovaly αϊβΐ funkce. Například zatímco mAb produkované klony klony AEF3, BGC5, AQC2 a AJH10 vážou al-I doménu (viz obr. 13A, data nejsou ukázána pro BGC5), pouze mAb AJH10 a AQC2 inhibují adhezi ke kolagenu IV závislo na al-I doméně (obr. 13B, obr. 16B) nebo K562-al (obr. 13C, obr. 16C).
·· ···· • · φ · · • ····
1995, J. Biol, (Baldwin et al.
Sekvencování úseků určujících komplementaritu (CDR)
Pro ustanovení klonálního původu tohoto panelu mAb, původci amplifikovali pomocí PCR a sekvencovali úseky CDR u 12 z 19 připravených protilátek (data nejsou ukázána).
pg mRNA, izolované 107 hybridomů (užitím soupravy pro izolaci mRNA FastTrackmRNA, Invitrogen), bylo reverzně transkribováno (užitím soupravy Ready-To-Go You Prime First Strand Kit, Pharmacia Biotech) s využitím 25 pM každého z následujících primerů: těžký řetězec VH1FOR-2 (Michishita et al., 1993, Cell 72: 857-867), lehký řetězec, VK4F0R, který definuje čtyři samostané oligonukleotidy (Kern et al., 1994, J Biol.Chem. 269: 22811-22816). Pro každý hybridom, těžké a lehké řetězce byly amplifikovány ve čtyřech oddělených PCR reakcích s použitím různých kombinací následujících oligonukleotidů: 1) Těžký řetězec: VH1FR1K (Kamata et al., Chem. 270: 12531-12535), VH1BACK, VH1BACK
1998, Structure 6, 923-935), VHfrla, VHfrlb,
VHfrle, VHfrlf, VHfrlg (Ignatius et al., 1990, J. Cell Biol. 111, 709-720), nebo VH1FOR-2 (Michishita, Μ. , Videm, V., and
Arnaout, Μ. AAA., 1993, Cell 72, 857-867), a 2) Lehký řetězec: VK1BACK (Baldwin et al., 1998, Structure 6, 923-935), VK4FOR,
VK2BACK oligonukletidy (Kern et al., 1994, J, Biol. Chem. 269, 22811-22816) nebo VKfrla, VHfrlc, VHfrle, VHfrlf, (Ignatius et al., 1990, J. Cell Biol. 111, 709-720). Produkty byly amplif ikovány (5 minut v 95 °C, 50 cyklů 1 minuta/94 °C, 2 minuty 55 °C, 2 minuty 72°C, a nakonec cyklu 10 minut v 72 °C) , purifikovány z gelu (QIAQUICK, Qiagen) a přímo sekvencovány s použitím různých výše uvedených oligonukleotidů užitím sekvenátoru ABI 377.
Sekvence z klonů produkujících funkci blokující mAb byly téměř totožné ve všech úsecích určujících komplementaritu ·· «ΦΦΦ φ φ φφφφ φ φ
ΦΦΦ φ φ φ φ
(CDRS) a vložené úseky rámcové sekvence naznačují, že hybridomy jsou klonálně příbuzné.
Příklad 16
Imunopřenos a FACS Analýza
Sekvence variabilních úseků neblokující protilátky byly významně odlišné od klonálně příbuzné rodiny sekvencí zjištěných pro blokující protilátky. Jelikož se zdá, že blokující protilátky pocházejí z jediného klonu, původci vybrali dvě protilátky (AJH10 a AQC2) pro další charakterizaci.
Imunopřenos („immunoblotting)
Vrstva buněk hladkého svalstva odebraná z ovčí aorty a K562-al buňky byly extrahovány užitím 1% Triton X-100 v 50 mM Hepes, pH 7,5,150 mM NaCl, 10 mM fenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 20 pg/ml aprotinin, 10 pg/ml leupeptin, 10 mM ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA). Vzorky byly podrobeny SDS-PAGE na 4-20% gradientu a přeneseny elektroforeticky (blotovány) na nitrocelulózovou membránu Bloty byly blokovány 5% sušeným mlékem v TBS, promyty TBS obsahujícím 0,03% Tween-20 a inkubovány s protilátkami v blokačním pufru obsahujícím 0,05% NaN3 po dobu 2 hodin. Bloty byly pak promyty jako předtím, inkubovány s anti-myším IgG konjugovaným s křenovou peroxidázou po dobu jedné hodiny, znovu promyty a pak podrobeny působení ECL činidla (Amersham). Bloty pak byly exponovány na film (Kodak) po dobu 30 až 60
sekund a vyvolány.
Imunoblot a FACS analýza (viz obr. 14) ukázaly, že AJH10 reaguje s humánním, králičím a ovčím αϊβΐ integrinem, ale nikoliv s potkaním αϊβΐ integrinem, což vede k názoru, že blokující mAb se vážou na evolučně konzervativní, lineární epitop. Neblokující mAb nebyly účinné ani v imunoblotu ani nereagovaly s jiným biologickým druhem než člověkem.
Příklad 17
Vazba al-I domény ke kolagenu je závislá na dvojmocném kationtu
A. Purifikace al-I domén al-I domény byly exprimovány v E. coli jako fúzní proteiny s GST (glutathion-S-transferázou) obsahující místo pro štěpení trombinem ve spojení sekvencí. Vyčištěný supernatant z buněk lyžovaných v PBS byl nanesen na kolonu glutathion-Sepharose 4B (Pharmacia), která byla důkladně promyta PBS. Fúzní protein „al-I doména - GST byl eluován pufrem obsahujícím 50 mMTrisHC1, pH 8,0, 5 mM glutathion (redukovaný). Pro denaturační studie I doména byl odštěpena trombinem v pufru 50 mM Tris, pH
7,5 a purifikována od GST fúzního partnera. Ke vzorku byl přidán 2 mM DTT a vzorek byl nanesen na na kolonu glutathion Sepharose 4B. Proteklý pufr a promývací frakce byly sloučeny a naneseny na kolonu Q Sepharose FF (Pharmacia). al-I doména byla eluována pufrem obsahujícím 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 10 mM 2-merkaptoethanol, 75 mM NaCl. Purifikovaná I doména vykazovala predikovanou hmotnost (Leea et al., 1995, Structure 3, 1333-1340: 871 Da) podle elektrosprejové ionizační hmotové spektrometrie (ESI-MS), na SDS-PAGE se pohybovala jako jednoduchý pás a protein se eluoval jako jednoduchý vrchol odpovídající velikosti při vylučovací chromatografií na koloně Superose 6 FPLC (Pharmacia).
B. Funkční analýza jamkové destičky byly potaženy přes noc ve 4 °C 1 pg/ml kolagenu typu IV (Sigma) nebo kolagenu typu I (Collaborative Biomedical), promyty tritonovým pufrem (0,1% Triton X-100, 1 mM MnCl2, 25 mM Tris-HCl,150 mM NaCl) a blokovány užitím 3% bovinního sérového albuminu (BSA) v pufru obsahujícím 25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl (TBS).
Sériové ředění fúzního proteinu „al-I doména-GST v TBS obsahujícím 1 mM MnCl2 a 3% BSA bylo inkubováno na potažených destičkách při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny a promyto tritonovým pufrem. Navázaná al-I doména byla detekována sériovým přidáním 10 pg/ml biotinylované anti-GST polyklonální protilátka (Pharmacia), ExtrAvidin-křenové peroxidázy (Sigma) naředěné 1: 3000 v TBS obsahujícím 1 mM MnCl2 a 3% BSA, a 1-Step ABTS (2,2'-azin-di[3-ethylbenzthiazolinsulfonát], od firmy Pierce) . Destičky byly vyhodnoceny na O. D. 405 na čtecím zařízení pro mikrotitrační destičky (Molecular Devices).
Výsledky al-I domény člověka a laboratorního potkana (95% identita s humánní sekevmcí) byly exprimovány v E. coli jako GST-fúzní proteiny a purifikovány přes glutathion-Sepharose. Oba
999999 9 9 · 9 9 9 • · · · · · 9 9 9 9 • · 9 9 9 9 9 9 9 • 9 · 9 · · 9 9 9 9 9 9 · * 999 999
9999 99 99 999 99 9 proteiny byly vyšetřeny na vazbu ke kolagenu I a IV s použitím obměněného testu založenéo na ELISA, který byl již dříve popsán (Qu, A. a Leahy, D. J., 1995, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92, 10277-10281) . Humánní al-I doména váže kolagen IV s lepší účinností než kolagen I (viz obr. 15A). Protilátka specifická k al-I doméně, ale nikoliv protilátka specifický k a2-I doméně (obr.l5B) ruší vazbu k oběma ligandům (data pro kolagen I nejsou ukázána) . Jak Mn2+ tak Mg2+ stimuluje vazbu, EDTA redukuje vazbu na hladinu šumu (pozadí) (obr. 15C). Žádné měřitelné rozdíly ve vazbě ligandu nebyly detekovány mezi humánní a doménou al-I a stejnou doménou potkana, což vede k předpkladu, že sekvenční rozdíly mezi biologickými druhy nejsou funkčně relevantní (data nejsou ukázána). Takže al-I doména pro účinnou vazbu ligandu specificky vyžaduje přítomnost kationtů.
Příklad 18
Epitop závislý na kationtů je umístěn v blízkosti MIDAS motivu
Původci využili pozorování, že AJH10 rozpoznává humánní al-I doménové sekvence, ale nikoliv potkaní, pro mapování epitopu pro αΐβΐ-funkci blokující mAb. Humánní sekvence a sekvence laboratorní potkan se liší pouze ve 12 aminokyselinách, z nichž 4 leží v úseku 6 aminokyseliny (aa 92-97, obr. 11A) sousedícím s kritickým threoninem (obr. 11A, aa 98) v motivu MIDAS. Pro testování hypotézy, že 6 aminokyselinových zbytků, Val-Gln-Arg-Gly-Gly-Arg, zahrnuje epitop pro blokující mAb, původci zkonstruovali chimérickou I doménu (RAH) , kde zbytky G92, R93, Q94 a L97 laboratorního • · · · · · potkana byly vyměněny za odpovídající humánní zbytky V, Q, R a R, v daném pořadí. AJH10, spolu se všemi funkci blokujícími mAb, rozpoznává chimérickou I doménu (RAH, obr. 11B) . Pro orientaci těchto zbytků vzhledem k foméně MIDAS v terciární struktuře al-I domény, původci modelovali al-I doménu s použitím koordinát krystalové struktury oí2 I domény.
Homologní model humánní od I domény byl postaven s použitím rentgenově zjištěné krystalové struktury humánní α2 I domény (Ward et al., 1989, Nátuře 341, 544-546). Model byl postaven s použitím modulu pro homologní modelování InsightlI (verze 2.3.5, Biosym Technologies). Program CHARMM (Clackson et al., 1991, Nátuře 352, 624-628) byl použit se souborem všech vodíkových parametrů 22 se vzdálené závislou dielektrickou konstantou dvojnásobku vzdálenosti oddělující atomy. Nejprve bylo provedeno prvních 1000 kroků nej strmější sestupné minimalizace s hmotnostně-váženou harmonickou polohovou zábranou 4,19 kJ/(mol Á2) (1 kcal·/ (mol Á2)) na všech atomech oíl-I domény. Po této minimalizaci následovalo dalších 1000 kroků nejstrmějšího sestupu a 5000 kroků z Adopted-Basis Newton Raphson se zábranami 0,419 kJ/(mol Á2) (0,1 kcal/ (mol Á2) ) C-oí atomech al-I domény, aby se zabránilo významným odchylkám od rentgenografické krystalové struktury «2-1 domény.
Sekvence integrinu αϊβΐ a α1β2 projevují 51% identitu bez jakýchkoliv inzercí nebo delecí, což vede k předpokládu, že celková struktura obou I domén bude podobná. Koordinační místo kovu je podle predikce stejné v al-I doméně jako v oí2-I doméně, a rezidua, která obsahují epitop pro blokující mAb leží na kličce mezi helixem a3 a helixem a4, který obsahuje threonin v MIDAS motivu, který je kritický pro vazbu kationtu. Model al-I domény predikuje, že amidový dusík zbytku Q92 (obr.
11A) vytváří vodíkovou vazbu s karbonylovou skupinou zbytku 133, což je zbytek sousedící se zbytkem S32. Takže klička, která obsahuje epitop, může hrát funkční úlohu ve stabilizaci úseku MIDAS.
Příklad 19
Monoklonální protilátka AQC2 (tj. mAQC2, kde m označuje, že se jedná o myší protilátku) (Příklad 15, viz výše) je protilátka typu IgGi, kappa. Pro identifikaci nukleotidové sekvence kódující těžký a lehký řetězec této protilátky byla připravena celková buněčná RNA z myších hybridomových buněk AQC2 použitím soupravy QIAGEN RNEASY midi kit podle instrukce výrobce. Pak byly cDNA kódující variabilní úseky těžkého a lehkého řetězce klonovány metodou RT-PCR z celkové buněčné RNA s použitím soupravy „GIBCO BRL SUPERSCRIPT Preamplification System for the First Strand cDNA Synthesis podle protokolu doporučeného výrobcem. Náhodné hexamery byly použity jako reakční primery.
Variabilní doména těžkého řetězce mAQC2 byla amplifikována pomocí PCR z prvního vlákna cDNA s primery:
5' TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGC CCT TGG CCC C 3' (sekv. id. č. 11) a
5' AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G 3' (S=C/G, M=A/C, R=A/G a
W=A/T) (sekv. id. č. 12).
PCR byla provedena ve 30 cyklech s použitím Clontech’s Advantage Taq polymerázy: denaturace 30 vteřin v 94 °C, nasednutí 1 minuta v 50 °C a prodlužování 1,5 minuty v 68 °C.
Lehký řetězec mAQC2 a jeho signální sekvence byly amplifikovány pomocí PCR s použitím primerů:
5' ACT AGT CGA CAT GGA TTT WCA GGT GCA GAT TWT CAG CTT C 3' (W=A/T) (sekv. id. č. 13) a
5' ACT GGA TGG TGG GAA GAT GGA 3' (sekv. id. č. : 14).
PCR byla provedena ve 30 cyklech s použitím klonované Pfu polymerázy Stratgene: denaturace 1 minuta v 94 °C, nasednutí 1 minuta v 50 °C a prodlužování 2 minuty v 70 °C. PCR produkty pro těžký a lehký řetězec byly purifikovány z gelu s použitím soupravy QIAGEN QIAQUICK pro gelovou extrakci podle výrobcem doporučeného protokolu.
Purifikovaný produkt - těžký řetězec byl subklonován do vektoru pCR2,l-TOPO TA firmy Invitrogen s použitím klonovací soupravy TOPO TA, Invitrogen. Purifikovaný lehký řetězec byl subklonován do vektoru pCRbluntlITOPO od Invitrogen s použitím klonovací soupravy Zero Blunt TOPO, Invitrogen, podle protokolu doporučeného výrobcem. Inzerty z mnoha nezávislých subklonů byly sekvencovány. S výjimkou degenerovaných poloh v PCR primerech byly sekvence inzertů nezávislých subklonů totožné.
Polypeptidové sekvence mAQC2 byly dedukovány z jejich kódujících sekvencí. N-koncová aminokyselinová sekvence pro zralý lehký řetězec predikovaná z cDNA sekvence PCR produktu amplifikovaného se signální sekvencí přesně odpovídala N-koncové sekvenci purifikovaného lehkého řetězce mAQC2 získané Edmanovou degradaci (DVKVVESGG, sekv. id. č. 15) . BLAST analýzy sekvencí variabilních domén potvrdily jejich imunoglobulinovou identitu.
.1 QIVLTQFPAL MSASPGEKVT MTCSASSSVN HMFWYQQKPK 41 SSPKPWIYLT SNLASGVPAR FSGSGSGTSY· SLTISSMEAE 81 DAATYYCQQW SGNPWTFGGG TKLEIK 106 (Sekv.id. č. 1)
CDR úseky jsou znázorněny tučně. CDR úseky jsou definovány podle Kabat et al., Sequences of Eroteins of Immunological Interest, 5th Edition, the United States Department of Health and Human Services, the United States Government Printing Office, 1991. S použitím systém číslování podle Kabata, sekv. id. č. 1 je reprezentována následovně, přičemž pomlčka označuje nepřítomnost aminokyseliny:
QIVLTQFPAL
KSSPKPWIYL
EDAATYYCQQ
MSASPGEKVT
TSNLASGVPA
WSGNPWTFGG
MTCSASS-SV NHMFWYQQKP RFSGSGSGTS YSLTISSMEA GTKLEIK 107
Polypeptidová sekvence variabilní domény těžkého řetězce mAQC2 je následující:
DVKVVESGGG LVKPGGSLKL ACAASGFSFS RYTMSWVRQI 41 PEKRLEWVAT ISGGGHTYYL DSVKGRFTIS RDNAKNTLYL 81 QMSSLRSEDT AMYYCTRGFG DGGYFDVWGQ GTTVTVSS (Sekv. id. č. 2)
CDR úseky jsou znázorněny tučně. S použitím systém číslování podle Kabata, sekv. id. č. 1 je reprezentována následovně, přičemž čísla poloh jsou po sobě následující čísla, pokud není uveden jinak:
1 DVKWESGGG LVRPGGSLKL ACAASGFSFS RYTMSWVRQI
41 PEKRLEWVAT ISGGGHTYYL DSVKGRFXTIS RDNAKNTLYL
81 QM
82a-c SSL
83 RSEDTAMY YCTRGFGDGG
1.00a-b YF
101 DVWGQGTTVT VSS 113
Jak se v aminokyselinových systémem číslování tomto textu používá, čísla poloh zbytků variabilních domén jsou ve shodě se podle Kabata, není-li uvedeno jinak.
Příklad 20
Tento příklad popisuje přípravu chimérické myší-humánní protilátky chAQC2.
CDNA kódující variabilní úseky těžkého a lehkého řetězce mAQC2 byly použity ke konstrukci expresních vektorů chAQC2, ve kterých variabilní úseky mAQC2 byly spojeny s humánním IgGi a konstantními úseky kappa.
Chiméra těžkého řetěze byla konstruován následujícím postupem: Fragment KbPstl-BstEII velikosti 0,33 kb z plazmidu pAND083 těžkého řetězce mAQC2 byl subklonován do fosfatázou ošetřeného Pstl-BstEII vektorového fragmentu velikosti 2,82 kb z plazmidu 5a8 těžkého řetězce pLCB7, aby byla přidána signál-kódující sekvence myšího těžkého řetězce a myší donorové sestřihové místo k cDNA variabilního úseku těžkého řetězce mAQC2. 5a8 je molekulárně klonovaná CD4-specifická mAb (viz, např., Boon et al., 2002, Toxicology 172: 191-203). Ve «4···· 44 4 444
4 44 44 444 • 4 44 4 444*
444 4 4 44 44444
4444 44 44 444 44 4 zralém těžkém řetězci kódovaném vzniklým plazmidem (pAND092) se N-konec liší v pěti aminokyselinových zbytkách od N-konce (DVKVVE, sekv. id. č. 16) příbuzného těžkého řetězce mAQC2.
Pro opravu N-konce těžkého řetězce byl pAND092 podroben mutagenezi eliminací jedinečných míst (USE) s použitím soupravy pro USE mutagenezi (Amersham Pharmacia Biotech) podle protokolu doporučeného výrobcem. Substituce Q1D, Q3K, L4V, Q5V a Q6E byly kódovány mutagenním primerem: 5' GCA CCA GGT GCC CAC TCC GAC GTC AAG GTG GTG GAG TCA GGG GGA GGC TTA GTG 3’ (sekv. id. č. 17). Mutované plazmidové klony byly identifikovány podle jejich nových AatlI a Hinfl míst a ztráty Pstl místa. kódující sekvence těžkého řetězce pak byla potvrzena DNA sekvencováním. správně mutovaný plazmid byl nazván pAND094. Notl-HindlII fragment velikosti 0,43 kb z pAND094 a HindlII-Notl fragment velikosti 1,21 kb z plazmidu pEAG964 (obsahující kódující sekvence pro konstantní úsek humánního IgGi) byly subklonovány do Notl místa v pCH269, plazmidu pocházejícím z pCEP4 EBV expresního vektoru (Invitrogen). Výsledný plazmid byl nazván pAND099.
Chiméra lehkého řetězce byl připravena následujícím způsobem: EcoRI fragment velikosti 0,46 kb z plazmidu dpAND081 variabilní domény lehkého řetězce mAQC2 byl subklonován do fosfatázou ošetřeného fragmentu velikosti 2,7 kb z vektoru pNN09 odvozeného z klonovacího vektoru pUC, aby bylo přidáno 5' Notl místo. Vzniklý plazmid, pAND091, byl podroben mutagenezi s použitím soupravy pro USE mutagenezi (Amersham), viz výše)), aby se vneslo BglII místo na 3' konec kódující sekvence. Mutagenní primer měl sekvenci: 5’GGA GGC ACC AAG CTG GAG ATC TAA CGG GCT GAT GCT GC 3 ' (sekv. id. č. 18).
Správně mutovaný plazmid byl identifikován podle změn polohy míst BglII a BstYI. Sekvence kódující lehký řetězec ve
- 90 výsledném plazmidu pAND093 byla potvrzena DNA sekvencováním. Pak byl Notl-BglII fragment variabilní doména lehkého řetězce velikosti 0,44 kb z pAND093 a BclI-Notl fragment z plazmidu pEAG963 velikosti 0,68 kb (obsahující kódující sekvenci konstantní doménu humánního lehkého řetězce kappa) subklonovány do Notl místa pCH269 (viz výše), čímž byl vytvořen plazmid pANDlO2. Pro vytvoření neblokovaného lehkého řetězce kappa (Q1E), pAND093 byl podroben USE mutagenezi s mutagenním primerem: 5'CAT AAT GTC CAG GGG AGA AAT TGT TCT CAC CCA G 3 ' (sekv. id. č. 19), pro vnesení XmnI místa, mutovaný plazmid byl identifikován screeningem na změnu polohy XmnI. Sekvence lehkého řetězce ve vzniklém plazmidu pAND097 byla potvrzena DNA sekvencováním. Fragment Notl-BglII variabilní domény lehkého řetězce z pAND097 velikosti 0,44 kb a BclI-Notl fragment z plazmidu pEAG963 velikosti 0,68 kb (obsahující konstantní doménu humánního lehkého řetězce kappa) byly subklonovány do Notl místa pCH269, čímž byl vytvořen plazmid pAND098.
Pro tvorbu protilátky chAQC2 byly expresní vektory (vektor pAND099 pro těžký řetězec chAQC2 + vektor pAND102 pro lehký řetězec chAQC2 a vektor pAND099 pro těžký řetězec chAQC2 + vektor pAND098 pro neblokovaný lehký řetězec chAQC2) kotransfekovány do buněk 293-EBNA. Transfektanty byly testovány na sekreci protilátky a její specifitu. Kontrolu tvořily buňky transfekované odpovídající vektory bez inzertu nebo s DNA konstrukty kódujícími ch5c8 (molekulárně klonovaná CDl54-specifická mAb popsaná např. v Elster et al., 2001, Transplantation 72:1473-1478) nebo chCBEll (molekulárně klonovaná LTR-specifická mAb popsaná např. v Browning et al., 1996, J.Biol. Chem. 271: 24934-24938).
Pak byly transfektanty, které sekretovaly požadovanou
9 · · · · ·9 9 99 9
9 9 9 9 99 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
999 9 9 99 99999
9 9 9 9 9 9 9 9
9999 99 99 999 99 9 protilátku, lyžovány a s lyzáty a kondicionovaným médiem byla provedena imunoprecipitace proteinem A. Western blot analýza precipitátů prováděná s protilátkami proti humánním těžkému a lehkému řetězci ukázala, že chAQC2-transfekované buňky syntetizovaly a účinně sekretovaly těžký a lehký řetězec v hladině podobné ch5c8-transfekovaným a chCBElltransfekovaným buňkám. Dále huVLA-l-exprimující buňky K562al byly označeny (obarveny) pomocí kondicionovaného média z transfekovaných buněk a na takto označených buňkách byla provedena FACS analýza. Výsledky ukázaly, že protilátka chAQC2 vytvořila obarvené profily podobné profilům mAQC2, zatímco kondicionovaná média ze slepě transfekovaných a ch5c8transfekovaných buněk neuspěly v obarvení buněk K562al. Chimérická AQC2 produkovaná po přechodné transfekci ve větším měřítku byla purifikována a pomocí FACS titrace bylo ukázáno, že se váže k VLA-1. Chimérická AQC2 buďto divokého typu nebo s geneticky odblokovaným lehkým řetězcem se váže k VLA-1. Viz také obrázky 16 A - D (diskutované dále).
Přiklad 21
Tento příklad popisuje způsob humanizace monoklonální protilátky mAQC2.
Analýza variabilní domény mAQC2
Variabilní domény lehkého a těžkého řetězce mAQC2 byly srovnány s kanonickými sekvencemi pro myší a humánní podskupiny (Kabat et al., viz výše) s použitím počítačového programu FASTA. Bylo zjištěno, že variabilní doména lehkého s 89% identita Tato doména také identitou dále bylo
72' řetězce je členem myší podskupiny VI v překrývajícím se úseku 109 aminokyselin odpovídala humánní podskupině I se v překrývajícím se úseku 113 aminokyselin. Ά zjištěno, že variabilní doména těžkého řetězce je členem myší podskupiny Illd s 86% identitou v překrývajícím se úseku 129 aminokyselin. Tato variabilní doména těžkého řetězce také odpovídala humánní podskupině III se 79% identitou v překrývajícím se úseku 130 aminokyselin.
CDR úseky byly kategorizovány roztříděny do kanonických tříd podle Chothia et al., Nátuře 342, pp. 877-883, 1989. klíčové zbytky definující každou z kanonických tříd rozhodují do značné míry o strukturní konformace CDR kličky, takže by měly být zachovány v reorganizované (přestavěné) protilátce. Ukázalo se, že LI klička mAQC2 spadá do kanonické třídy 1 (klička z 10 zbytků), L2 do třídy 1 (klička ze 7 zbytků) a L3 také do třídy 1 (klička z 9 zbytků). H1 klička spadá spadá do třídy 1 (klička 5 zbytků) a H2 klička také do třída 1 (klička ze 16 zbytků) . Zdá se, že H3 klička nepatří do žádné kanonické třídy. Kanonické zbytky důležité pro tyto třídy byly všechny zahrnuty v humanizovaných protilátkách.
Neobvyklé zbytky rámce mAQC2 byly určeny pomocí analýzy všech myších a humánních sekvencí variabilních řetězců podle 1999 verze databáze Kabata. Věřilo se, že mAQC2-specifické rozdíly by mohly ukazovat na somatické mutace, které zesilují vazebnou afinitu, jestliže se rozdíly vyskytují blízko vazebného místa. Neobvyklé mAQC2 zbytky ve větší vzdálenosti od vazebného místa a neobvyklé zbytky humánního rámce byly odstraněny v případě, že by vytvářely imunogenní epitopy v humanizované protilátce. Neobvyklé zbytky rámce zjištěné v mAQC2 byly 7 (F), 10 (L) a 41 (K) v lehkém řetězci a 4 (V), 21
4
4 4 4
- 93 (A) a 40 (I) v těžkém řetězci. Žádný z neobvyklých zbytků myšího rámce nebyl ponechán v humanizovaných protilátkách.
Modelování struktury variabilních úseků
Lehký a těžký řetězec mAQC2 byly porovnány proti nonredundantní databázi pro stanovení toho, které strukturní rámce by měly být použity ke konstrukci trojrozměrných modelů lehkého a těžkého řetězce mAQC2. S použitím programu FASTA bylo zjištěno, že lehký řetězec má 82% sekvenční identitu s myší monoklonální protilátkou ab57 (1CLOL), zatímco těžký řetězec má 76% sekvenční identitu s myším 6d9 Fab fragmentem (1HYY). S použitím programového balíku pro molekulární modelování SYBYL (Tripos lne.), byla sestavena přibližná trojrozměrná struktura lehkého a těžkého řetězce mAQC2 s využitím lehkého řetězce z ab57 a těžkého řetězce z 6d9, v daném pořadí. Strukturní integrita modelů byl vyhodnocena přímo u počítače a shledána jako rozumná.
Návrh reorganizovaných variabilních úseků
Byly použity akceptorového rámce, přístup byla metoda homologní shody druhým přístupem bylo dva přístupy pro výběr humánního aby přijal CDR úseky z mAQC2c. První („homology matching) a kanonických humánních Ig využití sekvencí. Při homologické metodě byla databáze Kabata, nonredundantní databáze NCBI, ENTREZ (The National Institutes of Health) a databáze Incyte prohledávány použitím programů FASTA a BLAST. Volba humánního akceptorového byla učiněna na základě sekvenční identity mezi rámcem mAQC2 a humánním rámcem (s vyloučením rámců již dříve humanizovaných protilátek) a zdrojem protilátky.
····«· 9· 9
9 9 9 9 99 9
9 9 9 9 9
9999 999
9 9 9 9 9 9
9999 99 99 999
Rámce z genů variabilních úseků imunoglobulinu mající přístupové číslo v GENBANK gi:587330 (humánní kappa podskupinal VK-lcl47) byly nakonec zvoleny pro lehký řetězec humanizované protilátky (Welschof et al., J. Immunol. Meth. 179: 203-14, 1995). Rámce z Amulcll (Kabat ID 044469, humánní podskupina III) byly zvoleny pro těžký řetězec humanizované protilátky (Huang et al., J. lmmnunol. 151: 5290-300, 1993).
Zpětné mutace humánního rámce
Strategie pro určení toho, které zpětné mutace udělat, jsou dostupné webových stránkách Humanization bY Design na url adresách http://mathbio.nimr.mrc.ac.uk/j saldan a http://www. cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s. Předchozí experimenty prokázaly, že je důležité zachovat kanonické zbytky, zbytky „sbalování rozhraní a neobvyklé myší zbytky, které jsou blízko vazebného místa. Kromě toho by měly být zváženy zbytky ve Vernier zóně, která tvoří platformu, na které spočívají úseky CDR (Foote et al.,J Mol. Biol. 224, p. 487, 1992), a zbytky v blízkosti CDR H3 by měl být považován.
Čtyři reorganizované verze byly navrženy pro každý variabilní lehký a těžký řetězec, jak je ukázáno v tabulce 1. Dvě ze čtyř verzí pro každý řetězec byly navrženy metodou shody podle homologie (označené huAQC2-hl a -h2) a další dvě verze metodou kanonické shody (huAQC2-cl a -c2). Je nutné poznamenat, že sekvence pro těžký řetězec huAQC-hl a těžký řetězec huAQC-cl jsou identické.
•0 0000
- 95 Tabulka 1
Sekvence mAQC2, huAQC2 a humánní rámce
AMU1C11 huAQC2-h2 huAQC2-hl mAQC2 huAQC2-cl huAQC2-c2
AMU1C11 huAQC2-h2 huAQC2-hl mAQC2 huAQC2-cl huAQC2-c2
TĚŽKÝ ŘETĚZEC
FR1 CDR1
E-QL-------IQ.....R-S------TV- SNY-E-QL-------IQ-----R-S------T-- ------QI».....—Q-----R-S......... .....
DVKWESGGGLVKPGGSLKLACAASGFSFS RYTMS
--QL--------q ---R-S-------------E-QL........Q-----R-S------T-- ----FR2 CDR2
----A-G-G----S V-YS--S---A--------A-G-G..... ................
- —-A-G-G----- ---------------WVRQIPEKRLEWVA TISGGGHTYYLDSVKG
----A-G-G.....................
----A-G-G----- ---------------FR3
CDR3
AMU1C11 huAQC2-h2 huAQC2-hl mAQC2 huAQC2-cl huAQC2-c2
--------S--------N---A----V---AS
--------g........N---A----V------------s--------N---A----V----RFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCTR
-.......S........N---A----V.....
--------s--------N---A----V----IRFLEWS--Y
GFGDGGYFDV
AMU1C11 FR4 -----L-----
huAQC2-h2 -----L-----
huAQC2-hl -----L-----
mAQC2 WGQGTTVTVSS
huAQC2-Cl -----L-----
huAQC2-c2 -----L.....
Změny rámce * pomlčky ukazují na identitu s aminokyselinovou sekvencí AQC2. * ** Část sekv. id. č. 1. ***Část sekv. id.
č. 2. Sekvence id. č. 67, 44, 42, 2, 42 a 68 v tom pořadí, jak jdou za sebou *
«< 9999 • · ♦
9··· «
·· • · • 9 » · · • 9 «·
9
9
9 9
9 9 9 9
9999
999 99 9
- 96 Vk-lcl47 huAQC2-h2 huAQC2-hl mAQC2 huAQC2-cl huAQC2-c2
LEHKÝ ŘETĚZEC FR1
D--M--S-SSL---V-DR--I--*
------g-SSL---V-DR--I-------S-SSL---V-DR--I-QIVLTQFPALMSASPGEKVTMTC
--Q---S-SSL---V-DR--I-CDR1
Vk-lcl47 huAQC2-h2 huAQC2-hl mAQC2 huAQC2-Cl huAQC2-c2
R--Q-ISYLN
SASSSVNHMF
FR2
------GKA--LL-......GKA--LL-......GKA-----WYQQKPKSSPKPWIY
------GKA......
------GKA--LL-Vk-lcl47 huAQC2-h2 huAQC2-hl mAQC2 huAQC2-cl huAQC2-c2
CDR2
AA-S-QLTSNLAS
FR3 —-S.........DFT.....LQP--F----___g---------D-t-----LQP--F.....
---S---------d-T-----LQP--F----GVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYC —-S--......D-T.....LQP--F----___S---------D-T.....LQP--F.....
Vk-lcl47 huAQC2-h2 huAQC2-hl mAQC2 huAQC2-cl huAQC2-c2 i
Sekvence id. pořadí, jak
Změny
CDR3 FR4 rámce
--SYST-L.......V— 25
...............V--- 21
.......-.......V--- 19
QQWSGNPWT FGGGTKLEIK** 0
......... --Q---V—- 21
-.........-q—v— 23
č. 65, 51, 49, 1, 66 a 54, v tom jdou za sebou ······ ·· · · · · ·· · ···· ··· • · ·· · · · · · • ··· · · · · ♦ ···· ······ · · · ···· ·· ·· ··· ·· ·
Některé zpětné mutace jsou diskutovány ještě dále.
(1) Lehký řetězec:
D -> Q Tato mutace byl vytvořena ve všech verzích, protože předchozí reorganizační experimenty (např. Kolbinger et al., Protein Eng. 6, p. 971, 1993) předpokládají její důležitost pro vazbu antigenu.
M -> L Toto je „vernier zbytek a byl zachován ve všech verzích.
L -> P Tento zbytek je jak zbytek rozhraní tak i „vernier zbytek a byl zachován pouze v hl a cl.
L -»W Toto je „vernier zbytek a byl zachován pouze v hl a cl.
F -> Y Tento zbytek je v důležité kanonické poloze a byl zachován ve všech verzích.
(2) Těžký řetězec:
E -> D Tato zpětná mutace byla vytvořena v pouze hl (tj . cl) .
I -» V Zbytek I je neobvyklý v humánní sekvenci a byl zachován pouze v h2.
T S Toto je „vernier zbytek a byl zachován pouze v hl.
29 V F Toto je kanonický zbytek a byl zachován ve všech
verzích
49 S A Toto je „vernier zbytek a byl zachován ve všech
verzích
93 A T Tento zbytek je jak zbytek rozhraní tak i „vernier
zbytek a byl zachován ve všech verzích.
S -> R Toto je kanonický zbytek a byl zachován v obou verzích.
Variabilní úseky huAQC2 byly připraveny pomocí USE mutageneze, jak bylo popsáno výše, s využitím plazmidů variabilní domény chAQC2 jakožto výchozích templátů. cDNA sekvence humánního akceptorového rámce (FR) byly Kabat # Z37334 pro lehký řetězec a Kabat #U00490 pro těžký řetězec. Pro snazší identifikaci mutovaných plazmidů byly vneseny umlčené mutace, aby se změnila restrikční místa. Mutované plazmidy byly identifikovány podle změny restrikčních míst. cDNA sekvence variabilních úseků ve výsledných plazmidech byla ověřena DNA sekvencováním.
Verze těžkých řetězců hl a cl (které byly totožné) byly vytvořeny s použitím plazmidů pAND094 jako templátů. mutagenní primery byly následující:
FR1 primer 5' GGT GCC CAC TCC GAC GTC CAG CTG GTC GAG TCA GGG GGA GGC TTA GTC CAG CCT GGA GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC 3’ (sekv. id. č. 20), který vnesl místa Taql a PvuII a eliminoval místo Ddel,
FR2 primer 5' ATG TCT TGG GTT CGC CAG GCT CCG GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC GCA ACC 3' (sekv. id. č. 21), který vnesl místo Ncil a eliminoval místa BspEI a Earl,
FR3 primer 5’ TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACC CTG TAC CTG CAG ATG AAC AGT CTG AGG GCC GAG GAC ACA GCC GTG TAT TAC TGT ACA AGA 3' (sekv. id. č. 22), který vnesl místa Pstl a Ddel, a
FR4 primer 5' TGG GGC CAA GGT ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GAG 3' (sekv. id. č. 23), který vnesl místa KpnI a Eco0109I. Výsledný plazmid těžkého řetězce hl (tj. cl) byl nazván pAND104.
Verze c2 těžkého řetězce byla vytvořena s použitím pAND104 jako templátů s následujícími mutagenními primery:
999999 9 9 9 9 9 9 • · 9 9 9 9 ···
9 9 9 9 9999
999 9 9 99 9999
9 9 99 9 · 99 9 9 9 9 9
- 99 -
FR1 primer 5 ' TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGG TAT
ACT ATG TCT TGG GTT 3' ( sekv . id Č. 24) , který zavedL AccI
místo, a
FR1 primer 5 GCA CCA GGT GCG CAC TCC GAG GTC CAG CTG GTC GAG
TCA 3' (sekv. id. č. 25), který zavedL FspI místo a eliminoval AatlI místo. Výsledný plazmid těžkého řetězce c2 byl nazván pAND115.
Verze h2 těžkého řetězce byla vytvořena s použitím pAND115 jako templátu s následujícím primerem:
FR1 primer 5'GAG TCA GGG GGA GGC TTA ATC CAG CCT GGA GGG TCC CTG 3' (sekv. id. č. 26), který eliminoval Ddel místo, výsledný plazmid těžkého řetězce h2 byl nazván pAND113.
Pro vytvoření expresních vektorů pro těžký řetězec huAQC2, Notl-HindlII fragment variabilní domény těžkého řetězce velikosti 0,43 kb z pAND104, pAND115 nebo pAND113 a HindlIINotl fragment velikosti 1,21 kb z pEAG964 (viz výše) byly subklonovány do Notl místa v pCH269 (viz výše). Vzniklé exprese plazmidy pro těžké řetězce byly nazván pANDll4 (hl), pAND121 (c2) a pANDl24 (h2), v daném pořadí.
Verze hl lehkého řetězce byla vytvořena s použitím plazmidu pANDO93 jakožto templátu. mutagenní primery byly následující:
FR1 primer 5' CAA ATT GTT CTC ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCG TCT GTA GGG GAC AGA GTC ACC ATC ACA TGC AGT GCC AGC TCA 3' (sekv. id. č. 7), který odstranil stEII a Pstl místa,
FR2 primer 5' TTC TGG TAT CAG CAG AAG CCC GGG A GCC CCC A CCC TGG ATT 3' (sekv. id. č. 28), který zavedel Ncil místo,
FR3 primer 5' GCT TCT GGA GTC CCT TCA CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAT TAC ACT CTC ACA ATC AGC AGC CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCC ACT TAT TAC TGC CAG 3' (sekv. id. č. 29), který
100 ·« ···( · *Φ Φ ·· φ · · · · ···
Φ Φ φ · · φ··· • ΦΦΦ Φ Φ · Φ ΦΦΦΦ « · · ΦΦΦ ΦΦΦ
ΦΦΦΦ Φ· ΦΦ ΦΦΦ Φ* · zavedl Ddel místo a odstranil Eco0109I a Aval místa, a
FR4 primer 5' GGT GGA GGC ACT AAG GTG GAG ATC TAA CGG GCT 3' (sekv. id. č. 30), který zavedl Ddel a Styl místa. Vzniklý plazmid lehkého řetězce hl byl nazván pAND103.
Verze h2 lehkého řetězce byla vytvořena s použitím pAND103 jakožto templátu s následujícími primery:
FR2 primer 5' CCC GGG A GCG CCC A CTC CTG ATT TAT CTC ACA TCC 3' (sekv. id. č. 31), který vnesl Hhal a Haell místa. Vzniklý plazmid lehkého řetězce h2 byl nazván pANDH6.
Pro verzi cl lehkého řetězce byl použit plazmid pAND103 jako templát s následujícími primery:
FR1 primer 5' GCC TCA GTC ATA ATG TCC CGG GGA CAA ATT CAG CTC ACC CAG TCT CCA TCC 3' (sekv. id. č. 32), který vnesl místa Smál, Ncil a Hpall,
FR4 primer 5' GGT AAC CCG TGG ACG TTC GGT CAG GGC ACT AAG GTG GAG ATC TAA CGG GCT 3' (sekv. id. č. 33), který vnesl Bspl286I místo. Výsledný plazmid lehkého řetězce byl nazván pANDH8.
Verze c2 lehkého řetězce byla vytvořena s použitím plazmidu pAND 116 jako templátu s následující primery:
FR1 primer 5' GCC TCA GTC ATA ATG TCC CGG GGA CAA ATT CAG CTC ACC CAG TCT CCA TCC 3' (sekv. id. č. 34), který zavedl místa Smál, Ncil a Hpall,
FR4 primer 5' GGT AAC CCG TGG ACG TTC GGT CAG GGC ACT AAG GTG GAG ATC TAA CGG GCT 3' (sekv. id. č. 35), který zavedl Bspl286l místo. Výsledný plazmid lehkého řetězce c2 byl nazván pANDH9.
Pro vytvoření expresních vektorů pro lehké řetězce huAQC2, Notl-BglII fragmenty variabilní domény lehkého řetězce velikosti 0,44 kb z pAND103, pAND116, pANDH8 nebo pAND119 a
101 ······ ·* · ·» · • · · ···· ··· ·· · · · · · · · • · · · · · · · · · · · ······ · t · »t·· *· ·<· ·»· ·· ·
BclI-Notl fragment velikosti 0,68 kb z pEAG963 (viz výše) byly subklonovány do Notl místa v pCH269 (viz výše). Výsledné expresní vektory lehkého řetězce byly nazvány pAND117 (hl) , pANDl20 (h2), pAND122 (cl) a pAND123 (c2), v daném pořadí.
Expresní vektory byly kotransfekovány do buněk 293-EBNA a transfekované buňky pak byly testovány na sekreci protilátky a její specifitu. Buňky transfekované prázdným vektorem sloužily jako negativní kontrola. lyzáty z celých buněk a kondicionovaná média byly imunoprecipitovány s proteinem A. Western blot analýza precipitátů (vyvolaná s protilátkami proti humánnímu těžkému a lehkému řetězci) ukázala, že huAQC2transfekované buňky syntetizovaly a účinně sekretovaly těžký a lehký řetězec protilátky v hladinách podobných chAQC2transfekovaným buňkám.
FACS analýza VLA-l-exprimujících buněk K562a obarvených kondicionovaným médiem z kultivace transfekovaných buněk pak byl provedena. Pro tento účel buňky K562a byly inkubovány s kondicionovaným médiem na ledu po dobu 120 minut, buňky pak byly promyty třikrát FACS pufrem (PBS s 5% FBS a 0,05% azidem sodným). promyté buňky byly resuspendovány v pufru a inkubovány s PE-konjugovaným anti-humánním IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, lne.) na ledu po dobu 30 minut. Po inkubaci byly buňky promyty třikrát FACS pufrem a resuspendovány ve FACS pufru pro analýzu. Data jsou ukazázna v tabulce 2, kde HuAQC2-hl označuje mAb, sestávající z hl verze těžkého řetězce (HC) huAQC2 a hl verze lehkého řetězce (LC) z huAQC2 (viz Ttbulka 1). Podobně, huAQC-h2 je mAb, kterou tvoří h2 verze těžkého a lehkého řetězce, u huAQC2-cl je to cl verze a u uAQC2-c2 je to c2 verze. V tabulce se MF1 týká průměrné MF1 normalizované k hodnotě, která byla pozorována pro blokovanou chAQC2. Uvedená data reprezentují průměr ze dvou
102
9 9·· «999
999 9 9 99 99999 nezávislých transfekcí. Tato data ukazují, že huAQC2-h2 a -c2 mAb se vázaly hůře než huAQC2-hl a -cl vzhledem k chAQC2.
Tabulka 2
FACS barvení buněk K562oí užitím chAQC2 a huAQC2
Lehký Těžký Relativní
řetězec řetězec MFI
chAQC2 pAND102 pANDO99 1,00
huAQC2-hl PAND117 pAND114 1,50
huAQC2-h2 pAND120 PAND124 0,64
huAQC2-cl pAND122 PAND114 1,50
huAQC2-c2 PAND123 PAND121 0, 68
huAQC2 LC cl/HC c2 pAND122 pAND121 2,21
huAQC2 LC c2/HC cl PAND123 pANDH4 0,76
huAQC2 LC neblokovaný cl/HC c2 PAND150* PAND121 0,75
huAQC2 LC L46P c2/HC c2 pANDl33** PAND121 1,50
huAQC2 LC L47W c2/HC c2 pAND132*** PAND121 1,00
* kóduje huAQC2 LC cl s neblokovaným N-koncem QlD. ** kóduje huAQC2 LC c2 s L4 6P.
*** kóduje huAQC2 LC c2 s L47W.
Kotransfekce buněk 293-EBNA s chAQC2 a huAQC2-hl, -h2, -cl a -c2 byly provedeny ve větším měřítku. Protilátky z kondicionovaného média byly purifikovány na Sepharose s proteinem A. Purifikované mAb byly testovány na aktivitu pomocí FACS. Protokol byl následující:
1. Spočítej buňky z baňky, která byla rozdělena 1:4 den před testem.
2. Peletuj buňky a resuspenduj je na 2,5 x 105 buněk/ml ve FACS pufru (5% FBS v PBS s 0,02% azidem sodným).
103 •4» 0 · 0 «0 9
3. Pípetuj po 100 μΐ buněk do jamek 96jamkové destičky se denm typu V.
4. Připrav sériové ředění 1:3 z AQC2 ve FACS pufru počínaje koncentrací 3pg/ml.
5. Peletuj buňky po dobu 5 minut při 800 g a odstraň pufr z destičky vytřepnutím.
6. Resuspenduj buňky ve 100 μΐ naředěné protilátkové série.
7. Inkubuj po dobu 2 hodin na ledu.
8. Opláchni destičku. Pelet buňky po dobu 3 minuty v 8 00 g a odstraň pufr z destičky vytřepnutím.
9. Resuspenduj buňky ve 100 μΐ sekundární protilátky (naředěné 1:100 ve FACS pufru).
10. Inkubuj po dobu 30 minut na ledu.
11. Opláchni destičku (viz výše).
12. Resuspenduj buňky ve 25 μΐ FACS pufru.
13. Centrifuguj krátce FACS zkumavky, aby bylo jisté, že objem 50 μΐ je na dně zkumavky.
14. Protřep důkladně na vortexu každou zkumavku a odeber 5000 případů.
Data jsou ukázána na obr. 17. Tato data potvrdila, že huAQC2-h2 a -c2 se váží hůře než huAQC2-hl a -cl vzhledem k chAQC2.
Kanonické verze huAQC2 byly zkoumány dále, protože byly méně imunogenní, když byly použity k léčení pacientů s chronickými indikacemi.
Kotransfekce tzv. typu „mix-and-match byly provedeny s cílem určit, zda jediný řetězec je zodpovědný za zjevné • « ·»· ···· * · · » <* · ·· · « · 9 ····«* 9 9 9
9 99 9 9 9 9 99 9 9 9 »
- 104 zhoršení vazby pozorované u huAQC2-c2. Kotransfekce vedly k názoru, že zhoršení vazby lze přisoudit lehkému řetězci c2 (kódovanému pAND123), který se liší od lehkého řetězce cl (kódovaného pAND122) pouze ve dva zbytkách FR2 úseku: P46L a W47L.
Aby se určily individuální příspěvky každé z těchto dvou záměn, byly zkonstruovány nové expresní vektory lehkého řetězce c2. Plazmid pAND125, L47W varianta lehkého řetězce c2, byl vytvořen s použitím pAND119 jako templátu s následujícím mutagenním primerem:
FR2 primer 5' GGG A GCA CCC A CTC TGG ATC TAT CTC ACA TCC AAC 3' (sekv. id. č. 36), který vnesl Hhal a Haell místa. Plazmid pAND 126, L46P varianta lehkého řetězce c2, byl vytvořen s použitím pAND119 jako templátu s následujícím mutagenním primerem:
FR2 primer 5' AAG CCC GGG AAG GCG CCC A CCC CTG ATT TAT CTC ACA TCC AAC 3' (sekv. id. č. 37), který vnesl místa BsaHI, Bani a Narl. Expresní vektory pro nové lehké řetězce huAQC2 byly vytvořeny subklonováním Notl-BglII fragmentu variabilní domény lehkého řetězce velikosti 0,44 kb z pAND125 nebo PAND126 a BcII-Notl fragmentu velikosti 0,68 kb z pEAG963 (viz výše) do Notl místa pCH269 (viz výše). Takto vzniklé plazmidy byly nazvána pAND132 (c2 s L47W) a pAND133 (c2 s L46P), v daném pořadí.
Byla provedena kotransfekce plazmidů s novým lehkým řetězcem s každým z plazmidů těžkého řetězce huAQC2. VLA-1 vazba byla pak vyšetřována užitím FACS. data ukazují, že zpětná mutace L47W nedokázala zlepšit vazbu. L46P mutace zlepšila vrchol vazebné křivky, ale hodnota EC5o byla posunuta ještě více doprava vzhledem k chování huAQC2 verze 1 (Tabulka 2, viz výše) . Tyto výsledky vedou k názoru, že obě zpětné • · «··· ·· · ·· 9
105
Φ · » · · 9 9 9 9 · · · 9 » 99 9 9999 • · ·*· 99 99 999 ·· · mutace byly potřebné pro plnou vazebnou aktivitu.
Geneticky neblokovaný lehký řetězec cl byl také vytvořen, protože Q1D varianta by byla o jeden zbytek více humanizovaná. Q1D mutanta, označená pAND148, byl vytvořena s templářem pANDll8 s následujícím mutagenním primerem:
FR1 primer 5' GTC ATA ATG TCC CGG GGA GAT ATC CAG CTC ACC CAG TCT 3' (sekv. id. č. 38), který zavedl nový EcoRI místo a odstranil Apol místo. Expresní vektor pro tuto poslední variantu lehkého řetězce huAQC2byl vytvořen subklonováním Notl-BglII fragmentu variabilní domény lehkého řetězce velikosti 0,44 kb z pANDl48 a BcII-Notl fragmentu velikosti 0,68 kb z pEAG963 do Notl místa v pCH269, čímž byl připraven expresní vektor lehkého řetězce pANDl50 (cl s neblokovaným N-koncem Q1D). Koexprese geneticky neblokovaného lehkého řetězce s těžkým řetězcem c2 (tj. huAQC2 LC cl neblokovaný/HC c2, označený huAQC2-c4) byl ekvivalentní s huAQC2 LC cl/HC c2 (označeným huAQC2-c3). VLA-1 vazba byla potvrzena pomocí FACS na VLAl-exprimujících buňkách K562al (tabulka 2).
Kotransfekce buněk 293-EBNA chAQC2 a huAQC2-hl,- h2, -cl, -c2, -c3 a -c4. Protilátky v kondicionovaném médiu byly purifikovány na protein-A-sepharose a purifikované mAb byly testovány na aktivitu (obr. 17 a 18). HuAQC2-c3 byla vybrána jako kandidátní léčivo, protože její vlastnosti byly podobnější chAQC2. Pak byly navrženy vektory pro stabilní expresi huAQC2-c3 v CHO buňkách, vektory obsahovaly cDNA pro huAQC2 cl LC nebo c2 HC, s deletovanými úseky 5’ a 3' UTR vyloučený a geneticky deletovaným C-koncovým lysinem těžkého řetězce, aby byla zajištěna homogenita produktu. Výsledné vektory byly pAND162 (lehký řetězec) a pAND160 (těžký řetězec). Jak se v tomto textu užívá, huAQC2-c3 je také nazývána hAQC2.
• 4 ···· 4· · 4 4 4
106
4 · 4 · 4 4 4 4
44» 4 4 44 4444
444 44 * 4*4 «·** 44 44 44* 44 4
Úplná polypeptidová sekvence hAQC2 je následující: Lehký řetězec (Plasmid: pAND162)
QIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASSSVN HMPWYQQKPG KAPKPWIYLT
SNLASGVPSR FSGSGSGTDY TťiTISSLQPE DFATYYCQQW SGNPWTFGQG
101 TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS WCLLNNFYP REAKVQWKVD
151 NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV
YACEVTHQGL
201 SSPVTKSFNR GEC (Sekv. id. č. 3)
Těžký řetězec (Plazmid: pAND160)
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYTMSWVRQA PGKGLEWVAT .51 ISGGGHTYYL DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCTRGFG
101 DGGYFDVWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSWTVP SSSLGTQTYI
201 CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD .
251; ; TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPgVKFNWYV. DGVEVHNAKT KPREEQYNST
301 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
351 TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKŤŤPPVLD
401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG (Sekv. id. č. 4) • 4 <
- 107 • 44» • · 4 4 4 4 · 44 4444
4 4 4 4
Další polypeptidy těžkého a lehkého řetězce a nukleotidové sekvence jsou ukázány dále.
A. Těžký řetězec chAQC2 (Pand099) (sekv. id. č. 39 a 40. První číslo označuje nukleotidovou sekvenci a druhé číslo polypeptidovou sekvenci. Stejné pořadí je použito i v následujícím číslování).
GAČGTCAAGGTGGTGGAGTCAGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAA
CTC
DVKVVESGGGLVKPGG S L K L
GCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTCAGTAGATATACTATGTCTTGGGTTCGCCAG ATT .
acaas.gfsf SRY T MSWVR Q I
121
CCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGTGGTGGTCACACCTACTAT
CTA
- 108 ·· · A • AAA AA AA »*» AA A pekrlewvatx sggghty
Y L
-181
GACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTAC.
CTG dsvkgrfti srdnakntl
Y L 241 caaatgagcagtctgaggtctgaggacacagccatgtattactgtacaagaggtttt
GGA
QMS SLRSEDTAMYYCTRG
F G
301
GACGGGGGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
DGGYFDVWGQGTTVTVSS
B. chAQC2 HC hl a cl (Pandll4) (sekv. id. č. 41 a 42)
GACGTCCAGCTGGTCGAGTCAGGGGGAGGCTTAGTCCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGA
CTC
DVQLVES GGGLVQ PGGSL R L 61
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTCAGTAGATATACTATGTCTTGGGTTCGCCAG
GCT
SCAASGFSFSRYTMSWVR
- 109 • · » · · · · · · ♦ · · * 9 » ♦ · * »»»· <«·· «· ·· ·φ 9
121
CCGGGGTkAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGTGGTGGTGACACCTACTAT
CTA
PGKGLEWVATISGGGHTY
Y L
181
GACAGTGTGAAGGGCCGATTGACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTAC
CTG
DSVKGRFTISRDNSKNTL
Y L
241
CAGATGAACAGTCTGAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTACAAGAGGTTTT
GGA
QMN SLRAEDTAVYYCTRG
F G
301
GACGGGGGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
DGGYFDVWGQGTLVTVSS
C. chAQC2 těžký řetězec h2 (pAND124) (sekv. id. č. 43 a 44)
- 110 9 · ♦ • 999
GAGGTCCAGCTGGTCGAGTCAGGGGGAGGCTTAATCCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGA
CTC
EVQLVE SGGGLIQPG GSL
R I» tcctgtgcagcctctggattcaccttcagtaggtatactatgtcttgggttcgccag
GCT
SCAASGFTFSRYTMSWVR
Q A
121 ccggggaaggggctggagtgggtcgcaaccattagtggtggtggtcacacctactat
CTA
PGKGLEWVATISGGGHTY'
Y L
181 gacagtgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacaccctgtac
CTG
DSVKGRFTISRDNSKNTL
Y L
241
CAGATGAACAGTCTGAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTACAAGAGGTTTT
GGA
QMNSLRAEDTAVYYCTRG
F G
301
GACGGGGGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGG
DGGYFDVWGQGTLVTVSS
111 ·· ·· «·
D. chAQC2 těžký řetězec c2 (pANDl21) (sekv. id. č. 45 a 69)
GAGGTCCAGCTGGTCGAGTCAGGGGGAGGCTTAGTCCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGA
CTC
EVQLVESGGGLVQPGGSL
R L 61
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGGTATACTATGTCTTGGGTTCGČCAG
GCT
SCAASGFTFSRYTMSWVR Q A
121
CCGGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGTGGTGGTCACACCTACTAT
CTA
PGKGLEWVATI SGGGHTY
Y L
181
GACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTAC
CTG
DSVKGRFTISRDNSKNTL-.
Y L
241
CAGATGAACAGTCTGAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTACAAGAGGTTTT
GGA
QM NSLRAEDTAVYYCTRG
F G
301
GACGGGGGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGG PGG YFDVWGQGTLVTVSS
112
999999 9 9 · 9 9 9 «9 · 9999 999
9 99 9 999·
999 9 9 99 9 99 9 «999 9« 99 999 99 ·
E. chAQC2 blokovaný lehký řetězec (Pandl02) (sekv. id. č. 46 a 47)
... 1 CAAATTGTTCTCACCCAGTTTCCAGCACTCATGTCTGCGTCTCCAGGGGAGAAGGTCACC Q I V L T Q. F PALM S AS P G E. K
V T
ATGACGTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCA
AAÁ
MTCSAS S. S V NHMPWYQQK & P K
121
TCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATGTCACATCCAACGTGGCTTCTGGAGTCCCTGCT
CGC
SSP KPW1YLTSNLASGVP A R
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCT
GAA
FSGSGSGTSYSLTISSME
A E
241
GATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTGGA
GGC
DAATY.Y CQQWSGNPWTFG'
G G
301 ACCAAGCTGGAGATCAAA T K L E I K
113 ·#·· • 9 9
9 • 9
9**9 «· * · 9 9 * 0*99
9
F. hAQC2 lehký řetězec hl (pANDH7) (sekv. id. č. 48 a 49)
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCGTČTGTAGGGGACAGAGTCACC Q I V I» T Q S P 3 8 L S A S V G D R
V T
ATCACATGCAGTGCeAGCTCAAGTGTÁAATCACAŤGTTCTGGTAŤCÁGCAGÁAGCCC
GGG
I T CSASS SVNHMF WYQ QK
P G
121
AAAGCČCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTGCCTTCA
CGC
KAPKPWIYLTSNLASGV P
S R
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAACCT
GAA
FSGSGSGTDYTLTI SSLQ
P E
241
GATTTTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTGGA
GGC
DFA T Y Y C Q Q W S GNP WT F G
G G
301 ACTAAGGTGGAGATCAAA Τ K V E X K
114
999999 99 9 • 9 9 9 ·99
9 9 9 9 ♦ 9 9 · 9 · 9
4» 9 9 9 9
9999 99 99 999
G. hAQC2 lehký řetězec h2 (pAND120) (sekv. id. č. 50 a 51)
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCGTCTGTAGGGGACAGAGTC
ACC
QIVLTQSPSSLSASVGDR
V T
ATCACATGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCC
GGG
ITCSASSSVNHMPWYQQK
P G
121
AAAGCGCCCAAACTCCTGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCA
CGC
KAPKLLIYLTSNLASGVP
S R
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAACCT
GAA
FSGSGSGTDYTLTISSLQ
P B
241
GATTTTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTGGA
GGC
DFATYYCQQWSGNPWTFG
G G
301 ACTAAGGTGGAGATCAAA T K V E I K
115
♦ · * • · · • · · · • · ···· ·· ·
H. hAQC2 lehký řetězec cl (pAND122) (sekv. id. č.: 52 a 70)
CAAATTCAGCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCGTCTGTAGGGGACAGAGTC
ACC
QIQLTQSP S SLSASVGDR
V T atcacatgcagtgccagctcaagtgtaaatcacatgttctggtatcagcagaagccc
GGG
ITCSASSSVNHMFWYQQK
P G
121
AAAGCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCA
CGC
KAPKPWXYLTSNLASGVP
S R
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAACCT
GAA
FSG.SGSGTDYTLTI SSLQ
P E
241
GATTTTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTCAG
GGC dfatyycqqwsgnpwtfg
Q G
301 ACTAAGGTGGAGATCAAA Τ K V Ε I K
116 ·· ·« 41 * · 4 • ·
I. hAQC2 lehký řetězec c2 (pAND123) (sekv. id. č. 53 a 54)
CAAATTCAGCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCGTCTGTAGGGGACAGAGTC
ACC
Q I QLTQS P S SLSASVGDR
V T
ATCACATGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACAŤGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCC
GGG
I TCSASSSVNHMP WYQQK
P G
121
AAAGCGCCCAAACTCCTGATTTAŤCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCA
CGC
KAPKLLIYLTSNLASGVP
S R
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAACCT
GAA
FSGSGS GTDYTLTISSLQ
P E
241
GATTTTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTCÁG
GGC
DFATYYCQQWSGNPWT.FG
Q G
301 ACTAAGGTGGAGATCAAA Τ K V E I K ·» ι·»«
9 99 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 ··· ··«« • 999 9 9 99 9 999
9 9 9 9 9 9 9 9
9999 99 99 999 99 9
- 117 J. chAQC2 neblokovaný lehký řetězec (pAND098) (sekv. id. č. 55 a 56)
GAAATTGTTCTCACCCAGTTTCCAGCACTCATGTCTGGGTCTCCAGGGGAGAAGGTC
ACC
EIVLTQFPALMSASPGEK
V T
ATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCA
AAA
MTCSAS S SVNHMFWYQQK P K
121
TCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCT
CGC
SSPKPWIY TSNLASGVP
A R
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCT
GAA
FSGSGSGTSYS LTISSME
A E
241
GATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTGGA
GGC
DAATYYCQQWSGNPWTFG G G
301 ACCAAGCTGGAGATCAAA T K L E I K
118 ·· ··♦» ·* • · · · · • · · · • φ φ · · • ΦΦΦ φ φ ·· • · φ φφφφφ ♦ ΦΦΦ ·Φ· ·Φ ·
Κ. huAQC2 neblokovaný lehký řetězec cl (pAND150) (sekv. id. č. 57 a 58)
GATATCCAGCTCACCCAGTGTCCATCCTCCCTGTCTGCGTCTGTAGGGGACAGAGTC
ACC
DIQLTQSPSS LS a s v g d r V T
ATGACATGCAGTGČČAGCrCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCC
GGG
ITCSASSS VNH MP WYQQK
P G .121
ÁAAGCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCA
CGC
KAPKPWIYLTSNLASGVP
SR
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGÁTTACACTCTČACAAŤCAGCAGCCTGCAACCT GAA '
P S .G S GSGTDY TLT I S S LQ
P E
241
GATTTTGCCACTTATTACTGCCAGCÁGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTCAG
GGC
DPATYYCQQWSGNPWTFG
Q G
301 ACTAAGGTGGAGATCAAA
·· · • · · • · · ·
119
Příklad 22
Tento příklad popisuje charakterizaci různých AQC2 protilátek podle vynálezu.
Test vazby al I domény na pevné fázi μΐ fúzního proteinu „al I doména-GST o koncentraci 10 pg/ml bylo naneseno na polystyrénové 96jamkové destičky CORNING COSTAR EASY WASH (Gotwals et al., Biochemistry, 38, 8280-8, 1999) . Po inkubaci 16 hodin ve 4 °C byly destičky promyty čtyřikrát 350 μΐ 0,1 % Tween-20 v PBS v promývačce destiček. Destička byl blokována nanesením 180 μΐ 3% BSA v TBS a inkubací 60 minut v 25 °C, a pak promyta jako výše.
Ředění protilátek (50 μΐ/jamka) v TBS obsahujícím 1 mg/ml BSA (testový pufr) byla připravena na 96jamkových destičkách s kulatým dnem, přenesena na destičku potaženou al I doménou a inkubována po dobu 60 minut ve 25 °C. Po posledním promytí bylo přidáno 100 μΐ/jamka TMB činidla (Pierce). Po 10 minutách bylo přidáno 100 μΐ 1 M kyseliny sírové a absorbance ve 450 nm byla odečtena na UV-VIS spektrofotometru pro 96jamkové destičky.
Elektrochemiluminescenční testy na vazbu αϊβΐ integrinu nebo al I domény ke kolagenu.
Tosyl-aktivované perličky DYNABEADS M-280 (Dynal, lne.) byly potaženy kolagenem typu IV (Sigma) v koncentraci 100 pg/ml podle instrukce výrobce. Buněčné lyzáty z altransfekovaných buněk K562 byly připraveny následujícím způsobem: Buňky byly sklizeny centrifugací, resuspendovány na koncentraci 108 buněk/ml v lyzačním pufru obsahujícím 25 mM
- 120 ·· ···· ·· · • · · · · ·· • · · · · • · · · · · • · · · · ♦ ···· ·· ·· ··· • e * • · · • · · · • · ···· · » · ·· ·
Tris, pH 7,4, 1 % NP-40, 1 mM CaCI2, 1 mM MnCl2, 1 mM MgCl2, 2% BSA a 1 mM PMSF, a byly inkubovány ve 4 °C po dobu 60 minut. Buněčné zbytky (debris) byly odstraněny centrifugací v 12,000 rpm po dobu 30 minut a vzniklý supernatant byl použit v následujícím experimentu. Anti-βΐ aktivující protilátka TS2/16 a polyklonální anti-GST protilátka (Pharmacia) byly značeny TAG-NHS esterem (IGEN International lne., Gaithersburg, MD) podle instrukce výrobce. Značené protilátky byly purifikovány gelovou filtrační chromatografií na SEPHADEX G25M (Pharmacia).
Pro uskutečnění vazebného testu byly perličky potažené kolagenem (1 mg/ml) byly blokovány po dobu 5 minut 8% plazmou laboratorního potkana kmene Lewis v testovém pufru obsahujícím 50 mM HEPES, pH 7,5, 150 mM NaCl a 0,1% Triton X-100. Pro vazebný test αϊβΐ bylo sériové ředění protilátek inkubováno s 10 pg perliček, buněčným lyzátem připraveným z 105 altransfekovaných buněk K562 (viz výše) a 0,1 g/ml TAG-TS2/16 v testovém pufru obsahujícím 1 mMMnCl2. Pro vazebný test oíl I domény byly protilátky inkubovány s 10 pg perliček, 0,1 g/ml fúzního proteinu al I doména-GST a 1 pg/ml TAG-antiGST v testovém pufru obsahujícím 1 mM MnClž· Po jedné až dvou hodinách třepání při teplotě místnosti, bylo přidáno 200 pl testového pufru a vzorky byly čteny na detektoru elektrochemiluminescence ORIGEN1.5 (IGEN). Grafy výsledků jsou prezentovány s uvedením arbitrárních jednotek elektrochemiluminescence (ECL) na ose x.
Kompetiční test s biotinylovaným mAQC2
96jamková destička byl potažena 50 pl fúzního proteinu al I doména-GST a blokován s 3% BSA v TBS, jak již bylo popsáno výše. Ředění protilátek (60 pl/jamka) v testovém pufru • ·
- 121 bylo připraveno na 96jamkových destičkách s kulatým dnem a 60 μΐ biotinylované myší AQC2 ředěné na 0,1 pg/ml v testovém pufru bylo přidáno. 50 μΐ z každé jamky bylo přeneseno na potaženou destičku a inkubováno po dobu 3 hodin ve 25 °C.
destička pak byla promyta, jak bylo uvedeno výše, a bylo přidáno 50 μΐ EXTRAVIDINU konjugovaného s peroxidázou (Sigma) v koncentraci 1 g/ml a destička byla inkubována další 2 hodiny ve 25 °C. Po posledním promytí bylo přidáno TMB činidlo (Pierce) 100 μΐ/jamka. Po 10 minutách bylo přidáno 100 μΐ 1 M kyseliny sírové a absorbance ve 450 nm byla odečtena na UV-Vis spektrofotometru pro 96 jamkové destičky.
Experimentální výsledky
Experimentální výsledky jsou ukázány na obr. 16A-D a v tabulce 3. Byla určena schopnost mAQC2, chAQC2, hAQC2 a hAQC2' (t j . huAQC2-c4, lišící se od hAQC2 pouze v tom, že zbytek 1 lehkého řetězce hAQC2' je D místo Q) (1) vázat se K562 buňky transfekované humánní al (pomocí FACS), (2) vázat se na imobilizovanou al-I doménu (pomocí ELISA), (3) soutěžit s mAQC2 o vazbu k al-I doméně (pomocí ELISA), (4) blokovat vazbu a-I domény ke kolagenu (pomocí elektrochemiluminescenčního testu) nebo (5) blokovat vazbu integrinu αϊβΐ ke kolagenu (pomocí elektrochemiluminescenčního testu). Výsledky jsou ukázány na obr. 16A-D a vypočtené hodnoty IC50 (pro inhibici) nebo EC50 (pro vazbu) jsou uvedeny v tabulce 3. V každém test každá z forem humanizované AQC2 projevila podobnou schopnost vázat buďto VLA1 (nebo al doménu) nebo blokovat vazbu ke kolagenu (je třeba upozornit, že na panelu C pozorované rozdíly v intenzitě mezi mAQC2 a humanizovanými formami pocházejí z toho, že byla použita sekundární protilátka anti-myší-IgG namísto anti-humánní-IgG).
- 122 Tabulka 3
Shrnutí výsledků testů (všechny hodnoty uvedeny v nM)
Protilátka FACS (EC50) VLA1 Inhibice (IC50) all Inhibice (IC50) ELISA (EC50) Kompetice s biotinAQC2 (IC50)
mAQC2 neurčeno 0,0726 (±0,014) 0,029 (±0,011) 0,061 (±0,015) 38 (±8,7)
Chiméra 0,25 0,071 (±0,002) 0,027 (±0,007) 0,176 (±0,058) 30 (±6,9)
hAQC2 0,29 0,129 (±0,005) 0,035 (±0,005) 0,190 (±0,010) 65 (±2,2)
hAQC2' 0,43 0,125 (±0,018) 0, 037 (±0,001) 0,313 (±0,072) 69 (±25,7)
Jako další původci testovali, zda změny určitých konzervativních zbytků v úsecích CDR mohou zachovávat VLA-1 vazebnou aktivitu hAQC2. DNA konstrukty kódující varianty hAQC2 s následujícími mutacemi byly vytvořeny místně cílenou mutagenezí: (1) G55S v CDR2 těžkého řetězce, (2) S24N v CDR1 lehkého řetězce (vnesení obsazeného místa N-vázané glykosylace), (3) G92S v CDR3 lehkého řetězce, (4) kombinace (1) a (2), a (5) kombinace (1) a (3). DNA konstrukty kódující jak těžký tak lehký řetězec pak byly kotransfekovány do buněk 293-EBNA a kondicionovaná média z transfektant byla testována na expresi protilátku užitím analýzy Western blot a ELISA. Výsledky ukázaly, že hAQC2 varianty byly exprimovány stejně účinně jako příbuzný hAQC2. FACS analýza s použitím VLA-1exprimujících buněk K562 dále ukázala, že VLA-l-vazebné aktivity těchto variant byly podobné samotné hAQC2. Lze tedy shrnout, že substituce aminokyselin nezměnila VLA-1 vazebnou aktivitu hAQC2. A opravdu, rentgenostrukturní analýzy krystalů RáH/HAQC2 Fab komplexu (viz výše) ukázala, že S24 a G92 • ·
- 123 lehkého řetězce a G55 těžkého řetězce nejsou lokalizovány ve vazebné kapse, která je v kontaktu s al-I doménou.
Přiklad 23
Efektorové funkce imunoglobulin spojuji imunoglobulinovou antigen-vazebnou aktivitu se zánětlivou, cytotoxickou a stimulační větví imunitního systému. Efektorové funkce mohou narušit bezpečnost a účinnost imunoglobulinového terapeutického produktu. Aby byly omezeny potenciální efektorové funkce hAQC2, byly vytvořeny mutace L234A a L235A na těžkém řetězci této protilátky, čímž byla připravena hsAQC2. Ze stejného důvodu byl vytvořena jednoduchá mutace N297Q v těžkém řetězci hAQC2, čímž byla připravena neglykosylovaná forma hAQC2, nazvaná haAQC2.
Mohou být provedeny studie srovnávající jejich účinnost, reziduální efektorové funkce, stabilitu a imunogenicitu vzhledem k hAQC2. Pokud není uvedeno jinak, poziční čísla aminokyselinových zbytků v konstantních úsecích použitá v tomto textu jsou v souladu s EU konvencí číslování.
Polypeptidová sekvence těžkého řetězce haAQC2 je následující (plazmid: pAND161):
• ·
- 124 1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYTMSWVRQA PGKGLEWVAT
ISGGGHTYYL DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCTRGFG
101 DGGYFDVWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSWTVP SSSLGTQTYI
201 CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD
251 TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYQST ,301 YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
351 TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH ĚALHNHYTQK SLŠLSPG· (sekv. id. č. 5)
Polypeptidová sekvence těžkého řetězce hsAQC2 je následující (plazmid: pAND171):
125
EVQLVĚSGGG LVQPGGSLRL- SCAASGFTFS RYTMSWVRQA PGKGLEWVAT
XSGGGHTYYL DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRÁEDT AVYYGTRGFG .101 DGGYFDVWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSWTVP SSSLGTQTYI
201 CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD
251 TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
301 YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
351 TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG(sekv. id. č. 6)
Příklad 24
Tento příklad popisuje způsob určení krystalové struktury komplexu chimérické „potkaní/humánní al-I domény al integrinu a Fab fragmentu hAQC2.
Příprava proteinového komplexu
Fab fragment hAQC2 byl připraven z protilátky hAQC2s použitím obměněného postupu podle soupravy IMUNOPURE ® Fab Preparation Kit (katalog, č. 44885, Pierce, Rockford, IL).
• · • 99
- 126 ·· φφφφ φ « • · · · ·
9 9 9 • Φ Α φ φ • · · φ φ • · · · · · · · φ φ • Φ Φ Φ * · φ Φ · Φ
9 9
Φ
Intaktní hAQC2 protilátka byla koncentrována na 12 mg/ml v pufru obsahujícím 20 mM fosfát, 10 mM EDTA a 25 mM cystein (pH 7,0). Imobilizovaný papain byl přidán v poměru enzym k substrátu 1:50 a štěpení bylo ponecháno probíhat přes noc ve 37 °C. Imobilizovaný papain byl odstraněn a surový naštěpený materiál byl dialyzován proti pufru 20 mM octanu sodného (pH 4,5). Fab fragment byl separován od reziduální intaktní protilátky, dimerního Fab fragmentu a Fc fragmentu kationtovou výměnnou chromatografií s použitím S-kolony (Poros HS/M, PERSEPTIVE Biosytems, katalog, č. PO42M26) s pozvolným solným gradientem. Fab fragment pak byl dialyzován do 0,1 M Hepes pufru (pH 8,0).
v uvedeném pořadí, aby aminokyselinové sekvence
Chimérická al-I doména, která byla použita v předkládaném vynálezu, je konstrukt chimérické potkan/humánní I domény (mutanta RAH) obsahující zbytky Thrl45 až Phe336 z řetězce al integrinu laboratorní potkan, kde zbytky Gly217, Arg218,
Gln219 a Leu222 (krystalové číslování) byly nahrazeny odpovídajícími humánními zbytky Val, Gin, Arg a Arg, se obnovila chimérické laboratorního potkana a humánní al-I domény jsou uvedeny níže v sekv. id. č. 59, 60 a 61, v daném pořadí. Rekombinantní al-I doména byla exprimována v E. coli jako GST-fúzní protein. RAH al-I doména byla štěpena trombinem a purifikována z klonu Pichia pastoris, jak bylo popsáno dříve (Gotwals et al., 1999, Biochemistry 38: 8280-8288).
vazba protilátky. RAH, al-I domény *♦ ··· ·
- 127 145 TQLDIV
1S1 IVLDGSNSIY PWESVIAFLN DLLKRMDIGP KQTQVGIVQY
191 GENVTHEFNL NKYSSTEEVL VAANKIVQRG GRQTMTALGI
231 DTARKEAFTE ARGARRGVKK VMVIVTDGES . HDNYRLKQVI
271 QDCEDENIQR FSIAILGHYN RGNLSTEKFV EEIKSIASEP
311 TEKHFFNVSD ELALVTIVKA LGERIF (Sekv. id. č. 59)
145 TQLDIV
151 IVLDGSNSIY PWESVIAFLN DLLKRMDIGP KQTQVGIVQY 191 GENVTHEFNL NKYSSTEEVL VAANKIGRQG GLQTMTALGI
231 DTARKEAFTE ARGARRGVKK VMVIVTDGES HDNYRLKQVI
271 QDCEDENIQR FSIAILGHYN RGNLSTEKFV EEIKSIASEP
311 TEKHFFNVSD ELALVTIVKA LGERIF (Sekv. id. č. 60)
Í45 TQLĎIV
151 IVLDGSNSIY PWDSVTAFLN DLLKRMDIGP KQTQVGIVQY
191 GENVTHEFNL NKYSSTEEVL VAAKKIVQRG GRQTMTALGI
231 DTARKEAFTE ARGARRGVKK VMVIVTDGES HDNHRLKKVI
271 QDCEDENIQR FSIAILGSYŇ RGNLSTEKFV EEIKSIASEP
311 TEKHFFNVSD EIALVTIVKT LGERIF (Sekv. id. č. 61)
Fab fragment hAQC2 byl smíchán s nadbytkem chimérické al-I domény a inkubován ve 37 °C po dobu 15 minut. Saturované al/Fab komplexy byly odděleny od al-I domény nezahrnuté v komplexech vylučovací chromatografií s použitím kolony S200 Sephakryl (Pharmacia, Gibco). komplex byl dále koncentrován na 11 mg/ml v pufru obsahujícím 20 mM Tris (pH7,4), 150 mM NaCl,
- 128 • · · ·
9 99 9 • > « • · 9 mM MnCl2, 5 mM β-merkaptoethanol.
Příprava krystalů
Krystalizační podmínky byly zjištěny s použitím soupravy CRYSTAL SCREEN™ KITs od frimy Hampton Research (Laguna Niguel, CA) . Krystaly komplexu popsaného výše byly pěstovány ve 20 °metodou difúze par s použitím stejného množství roztoku proteinového komplexu a 20-30% roztoku PEG 1500.
Typicky 2 μΐ proteinového komplexu! bylo přidáno k 2 μΐ jamkového roztoku, čímž se získaly kapky o objemu 4 μΐ. Krystaly rostly dva až sedm dnů jako šestiúhelníkové pruty s rozměry 0,8 x 0,05 x 0, 05 mm3, přítomnost z al-I domény a hAQC2 Fab fragmentu byl potvrzeny SDS-PAGE analýzou rozpuštěných krystalů. Aby se zredukovalo nevyhnutelné poškození zářením v průběhu sběru dat, data difrakce rentgenového záření byla měřena přibližně při 100 K. Pro přípravu krystalů pro sběr dat v takové nízké teplotě, krystaly byly postupně ekvilibrovány s kryoprotektivním roztokem obsahujícím 25 % PEG 400 a 30 % PEG 1500 a velmi rychle ochlazeny v kapalném dusíku.
Určení struktury
Nativní data rentgenové difrakce při rozlišení 2,8 Á byla získána z jediného krystalu přibližně ve 100 K pomocí nabitého spřaženého detektoru ADSC Quantum 4 v paprskové dráze X4A synchrotronu v National Synchrotron Light Source (NSLS) Brookhaven National Laboratory (BNL). Data byla zpracována s použitím počítačových programů DENZO a SCALEPACK (Otwinowski & Minor, 1997, Methods in Enzymol. 276: 307-326). Krystaly patřily do prostorové skupiny P6i nebo jejího enantiomorfu P65,
- 129 s rozměry jednotkové buňky a = b = 255,09 Á , c=38,64 Á.
Soubor dat byl z 96,6 % kompletní a měl hodnotu „R-merge
8,3%. Matthewsův koeficient (Matthews, 1968, J. Mol. Biol. 33: 491-497) byl 2,59 Á3 Da“1 s obsahem rozpouštědla 52,1 %, což ukazovalo, že se jedná o dva komplexy v asymetrické jednotce. Tyto dva komplexy v asymetrické jednotce byly ve vztahu nekrystalografické dvojité symetrie. statistika datové je ukázána v tabulce 4.
Vyhledávání programem AMoRe z programového molekulárních náhrad bylo (Navaza, 1994, Acta Cyst.
balíku CCP4 (Collaborative prováděno s A50: 157-163)
Computational for protein
Project No. 4. The CCP4 Suitě: Programs
Crystalography. 1994, Acta Cryst. D50: 760-763) a molekulární grafické manipulace byly prováděny pomocí programu QUANTA. Jediná al-I doména ze struktury al-I domény z αϊβΐ integrinu laboratorního potkana (Protein Data bank (PDB) přístupové číslo lck4, Nolte et al., 1999, FEBS Lett. 452: 379-385) byla použita jako model nebo sonda pro rotační a translační vyhledávání, vyhledávání translační funkcí ukázalo, že 1. a 9. nejvyšší vrcholy rotační funkce odpovídaly správnému řešení pro dvě al-I domény v asymetrické jednotce (korelační koeficient (cc) = 21,1%, R = 53,1 %), a že prostorová skupina byla P65. Následně bylo provedeno vyhledávání pro hAQC2 Fab fragmenty, přičemž bylo zachováno řešení pro I doménu a byl použit model Fv domény z hAQC2 Fab jako vyhledávací sonda. Jasné řešení bylo nalezeno pro jednu ze dvou Fv domén (cc = 22,1%, R =52,6 %), ale druhá Fv nemohla být lokalizována. Poloha druhé Fv byla určena pomocí nekrystalografické dvojité symetrie, upřesnění tuhých těles těles dvou I domén a dvou Fv domén redukovalo R-faktor na 43,6 % (R-free = 42,7 %) . Mapa elektronové hustoty 2Fo-Fc ukázala jasnou elektronovou hustotu pro konstantní doménu (Fconst) prvního Fab fragmentu, ale
- 130 • · ···*
žádnou hustotu pro Fconst doménu druhého Fab fragmentu. Model Fconst domény prvního Fab byl ručně „napasován na pozorovanou elektronovou hustotu. Po zpřesnění tuhého tělesa pomocí programu programem CNX (Accelrys lne., San Diego, CAt) 2000, Brunger, 1998, Acta Cryst. D54: 905-921), s použitím dat v rozlišení 500-2,8 Á optimalizace poloha všech domén snížila R-faktor na 39,7 % (R-free = 38,9%).
Všechny následné zpřesňovací kroky byly prováděny programe CNX. Pro redukci nejistot modelu byly užity parciální modely pro výpočty 2Fo-Fc mapy a zpřesňování modelu. Výchozí parciální model byl podroben simulovanému nasednutí a seskupenému B-faktorovému zpřesnění s omezením nekrystalografické symetrie. Faktory „R-working a „R-free se snížily na 28,3 % a 32,9 %, v daném pořadí. Následovalo několik cyklů sestávajících z iterační výstavby modelu, pozičního upřesnění s maximální pravděpodobností a upřesnění B-faktoru. Pouze upřesnění modelu, která vedla k poklesu faktoru R-free byla přijata. Po vybudování kompletního modelu byla použita oprava na rozpouštědlo. faktory R-working a R-free konečného modelu jsou 21,3 % a 27,2 %, v daném pořadí pro data (F > 2o) při rozlišení 500-2,8 Á.
Výsledná mapa elektronové hustoty 2Fo-Fc je dobré kvality pro většinu komplexu s výjimkou aminokyselinových zbytků 288 až 295 z jednoho fragmentu I doména (molekula A na obr. 19), které jsou spojeny se slabou elektronovou hustotou a nebyly zahrnuty v modelu. Kromě toho, celá konstantní doména jednoho Fab fragmentu nemá žádnou viditelnou elektronovou hustotu, což ukazuje, že jde o poruchu. To je zřejmě důsledek nepřítomnosti krystalových kontaktů pro konstantní doménu Fab fragmentu způsobené její polohou ve velkém kanálu rozpouštědlovém kanálu. Tato doména také nebyla zahrnuta v konečném modelu, ·· 4 · 4 4
- 131 • · · 4 • 4 4444
4 4
9 který se skládá z 1030 aminokyselina zbytků, vytvářejících 6 polypeptidových řetězců, a 2 manganových iontů. Hodnota r. m. s. odchylky poloh mezi rovnocennými zbytky va komplexů v asymetrické jednotce je malá (0,37 Á pro 1660 ekvivalentních atomů hlavního řetězce).
Stereochemické statistické hodnoty byly vypočteny programy PROCHECK (Laskowski et al·., 1993, J. Appl. Cryst. 26: 283-291, Morris et al., 1992, Proteins 12: 345-364) a CNX. Vodíkové vazby (< 3,6 Á) byly zjištěny programem CONTACT (Tadeusz Skarzynski, Imperiál College, London, 1.12.88, Collaborative Computational Project 4. CCP4 Suitě: Progams for Protein Crystalography. 1994, Acta Cryst.D50, 760-763). Všechny zbytky jiné než glycin (kromě zbytku Thr50 v L řetězci, který bude ještě diskutován dále) jsou v povoleném úseku Ramachandranova diagramu a 86 % zbytků leží v nejvýhodnějších úsecích, průměrný B-faktor atomů hlavního řetězce je 38,5 Á2. Data z krystalografické analýzy jsou uvedena v tabulce 4.
Tabulka 4
Shrnutí statistických údajů a krystalografické analýzy
Sběr dat
Rozměry buňky, a, b, c (Á) Prostorová skupina Rozlišení (Á)
Unikátní odrazy Úplnost (%)
Průměr I/s R-merge* (%)
Model
Počet atomů jiných než H Počet protein, zbytků Obsah asymetrické jednotky Průměrný B-faktor (Á2)
255,09, 255,09, 38,64
P65
500 - 2,8 (2,9-2,8)+
35275
96,6 (87,7)+
11, 92 (2,29) +
8,3 (30,9)+
7950
1030 domény I, 1 fragment Fab, doména Fv
38,5 • · · · · · • 4
- 132 • 4
4»
Zpřesňování Použitý rozsah rozlišení(F R-faktor (R-working) (%) R-free++ (%) > 2σ) 500-2,8 21,3 27,2
S tereochemie
RMS odchylky délky vazeb (Á) 0,007
Úhly (°) 1,43
* Rmerge = ShSi Hhi-Ih l/Shi Ihi
+ Hodnoty pro obal při nejvyšším rozlišení jsou uvedeny
v závorce.
++ 8 % dat bylo přiděleno pro výpočet faktoru R-free.
Přiklad 25
Tento příklad popisuje krystalovou strukturu komplexu chimérické potkaní/humánní al-I domény αϊβΐ integrinu a Fab fragmentu hAQC2.
Architektura krystalu
Krystalová struktura komplexu chimérické potkaní/humánní al-I domény αϊβΐ integrinu a Fab fragmentu hAQC2 má protáhlý tvar (viz obr. 20). Rozměry komplexu jsou 100 Á x 50 Á x 35 o
A .
Fab fragment projevuje svinutí molekuly typické pro imunoglobuliny. Lehký řetězec a těžký řetězce Fab fragmentu vytvářejí dva široké listy antiparalelních β řetězců, které jsou vzájemně těsně sbaleny a vytvářejí tak kostru pro kličky úseků určujících komplementaritu (CDR), které vyčnívají se sbalených listů. Jak lehký tak i těžký řetězec obsahují tři CDR kličky, přičemž kličky lehkého řetězce jsou označeny LI,
133
L2 a L3, zatímco kličky těžkého řetězec jsou označeny Hl, H2 a H3. Kličky úseků určujících komplementaritu (CDR) odpovídají kanonické struktuře 1 pro kličky Ll, L2 a L3 lehkého řetězce a pro kličky Hl a H2 těžkého řetězce (Chothia et al., 1989, Nátuře 342: 877-883). Klička H3 těžkého řetězce má kompaktní konformaci β-vlásenky, která je stabilizovaná vnitřními vodíkovými vazbami, a také dvěma aromatickými zbytky (Tyrl04 a Phel05), které jsou umístěny proti lehkému řetězci. Zbytek Thr50 z L2 zaujímá úhly dvoj stěnu hlavního řetězce, které spadají do zakázaných úseků Ramachandranova diagramu, stejné pozorování pro odpovídající zbytky bylo učiněno i u jiných protilátek (Muller et al., 1998, Structure 6, pp. 1153-11567), což ukazuje, že se jedná o přirozenou vlastnost L2 smyčky.
al-I doména podle předkládaného vynálezu má strukturu velmi podobnou al-I doméně nevázané v komplexu (PDB přístupové číslo lck4, Nolte et al., 1999, FEBS Lett. 452: 379-385, PDB přístupové číslo lqc5, Rich et al., 1999, J. Biol.Chem. 274: 24906-24913). Struktura I domény má dinukleotid-vázající nebo Rossmanův záhyb (Rao & Rossman, 1973, J. Mol. Biol. 76: 241-256), ve kterém jsou centrální list pěti paralelních β řetězců a jeden malý antiparalelní řetězec obklopeny na obou stranách celkem sedmi α-šroubovicemi. Šest β-řetězců struktury podle předkládaného vynálezu je označováno βΑ, βΒ, βΰ, βϋ, βΕ a βΡ a sedm α-šroubovic je označováno al, a2, a3, a4, a5, a6 a a7.
V I doméně existují tři charakteristické strukturná znaky. Prvním charakteristickým znakem je přítomnost vložené malé šroubovice v βΕ-α6 kličce, nazývané C šroubovice. Většina kličky C spirály molekuly A (viz obr. 19) podle předkládaného vynálezu je spojena se slabou elektronovou hustotou, která svědčí o poruše. Zdá se, že je to důsledek nepřítomnosti
• · 4 44 4 • · ·4 4 4 4 • · 4 4 4 4 4 • · 4 4 4 4 444 • · · 4 4 4 ·· ··* 44 4
- 134 krystalových kontaktů nebo kontaktů s Fab, které by jinak kličku stabilizovaly. Nicméně, stejná klička v molekule B (viz obr. 19) podle předkládaného vynálezu má jasně definovanou elektronovou hustotu a byla zahrnuta v modelu. druhým charakteristickým znakem al-I domény je MIDAS neboli adhezní místo závislé na iontu kovu (Metal Ion Dependent-AdhesionSite), kde kovové ionty a ligandy jsou zapojeny do vazby I doméně. Pět klíčových zbytků, které vytvářejí část MIDAS, j označováno jako motiv DxSxS-T-D. Tyto zbytky, které jsou naprosto konzervativní mezi I doménami, koordinují kovový iont (Gotwals et al., 1999, Biochemistry 38: 8280-8288). Krystaly podle předkládaného vynálezu byly pěstovány v přítomnosti manganu a MIDAS místo I domény v této struktuře obsahuje, jak bylo pozorováno, kovový ion Mn+2. Ion je přímo koordinován postranními řetězci zbytků Serl56, Serl58 a Thr224. Mapa 2Fo-Fc elektronové hustoty neukazuje žádný důkaz toho, že MIDAS zbytky Aspl54 a Asp257 vytvářejí vodou zprostředkovanou nepřímou koordinaci kovového iontu (obr. 20). Nicméně, zjevná nepřítomnost molekuly vody by mohla být důsledkem omezeného rozlišení (2,8 Á ) mapy elektronové hustoty. Třetím znakem I domény je to, že všechny určené struktury I domény patří k jedné ze dvou konformací nazvaných otevřená a uzavřená, rozdíly mezi otevřenou a uzavřenou konformací zahrnují odlišný způsob koordinace kovového iontu a významný (přibližně 10 Á) polohový posun C-koncové šroubovice I domény. I doména v komplexu podle předkládaného vynálezu je v uzavřené konformaci.
Ve struktuře komplexu podle předkládaného vynálezu se Fab fragment váže se ke svému epitopu na předním horním povrchu I domény se „stopou 35 Á x 30 Á. celková obsazená plocha rozhraní protilátka-antigen je 1534 Á2, což je typické i pro ostatní komplexy protilátka-antigen (Davies et al., 1996, φ · ····
- 135
Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93: 7-12, Jones & Thornton, 1996,
Proč. Nati. hydrofobní přispívá 65
Acad. Sci. USA 93: 13-20). povrch má z 25 % ze 75 % hydrofilní charakter. Těžký řetězec % k ploše obsazeného povrchu v komplexu, zatímco zbývajícími 35 % přispívá lehký řetězec, protilátkový epitop sestává ze zbytků lokalizovaných ve čtyřech kličkách I domény (Emsley et al., 2000, Cell 101: 47-56). Tři z těchto kliček vytvářejí MIDAS místo: klička 1 (βΑ-αΙ), která obsahuje konzervativní DXSXS sekvenci, klička 2 (α3-α4), která obsahuje MIDAS Thr224, a klička 3 (βϋ-α5), která obsahuje MIDAS zbytek
Asp257. čtvrtá klička je C-šroubovicová klička a je zapojena pouze do minoritních kontaktů.
Ústředním znakem interakce antigen-protilátka je koordinace kovového iontu v MIDAS místě AsplOl z CDR H3 protilátky (obr. 20). vzdálenost mezi iontem a z AsplOl je 2,4 Á. Kromě toho atom 052 z AsplOl interaguje s His261 z I domény. Je zajímavé, že CDR H3 obsahuje několik glycinových zbytků v sousedství AsplOl (sekvence GFGDGGY) (sekv. id. č. 62), pravděpodobně proto, aby byla umožněna dostatečná flexibilita CDR kličky a tak byla možná správná koordinace kovového iontu. CDR H3 sekvence je v podstatě neměnná v monoklonálních protilátkách, které byly připraveny proti stejnému antigenu a bylo o nich zjištěno, že patří do stejné třídy. Většina protilátkových kontaktu protilátka-antigen, je
Hl, H2 a H3 CDR. Zdá se, že několik zbytků z kličky LI (Asn30) a L2 (Tyr48) vytváří méně významné van der Waalsovy vazby. L3 primárně přispívá ke kontaktům prostřednictvím dvou velkých hydrofobních zbytků, Trp90 a Trp95. Kromě toho Asn93 z kličky L3 tvoří vodíkové vazby s Gln223 z I domény. Postranní řetězce His56 a Tyr58 z kličky H2 tvoří vodíkové vazby s atomy hlavního řetězce kličky 2 z I domény. Arg31 z kličky Hl je zbytků, které se účastní lokalizováno v kličkách L3, ·· ·00·
- 136 • · 0 • 0 0 ·
000 0 0 0 • 00 0 v kontaktu s Arg291 kličky 4 z I domény. Arg222 kličky 2 z I domény je vmezeřen mezi několik protilátkových zbytků včetně Tyr58, Trp95 a Asn93. To jediný zbytek ze čtyř mutovaných v RAH I doméně, který je zapojen do kontaktů s Fab. Je to proto pravděpodobně jediný zbytek zodpovědný za obnovení vazby protilátky po mutagenezi.
Srovnání krystalové soustavy komplexu chimérické potkaní/humánní al-I domény a hAQC2 Fab fragmentu s jinými strukturami I domény
Chimérická al-I doména RAH má čtyři sekvenční v al-I doméně laboratorního potkana (zbytky ze sekvence laboratorní potkana: 217G, 218R, 219Q a 222L), osm sekvenčních rozdílů v humánní al-I doméně (zbytky z humánní sekvence: 163D, 166T,
214K, 264H, 268K, 288S, 3221 a 380T) a deset sekvenčních rozdílů v klonu použitém v krystalové struktuře použité ke studiu humánní al-I domény (zbytky ze sekvence klonu: 163D, 166T, 174E, 214K, 2301, 264H, 268K, 288S, 3221 a 380T).
V krystalové struktuře al-I domény αϊβΐ laboratorního potkana bez navázaného ligandu (PDB přístupový kód lck4, Nolte et al., 1999, FEBS Lett. 452:379-385), al-I doména neobsahuje žádné navázané kovové ionty a zaujímá uzavřenou konformaci.
V krystalová struktuře humánní al-I domény bez navázaného ligandu (přístupový kód lqc5, Rich et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 24906-24913), al-I doména obsahuje vázaný Mg+2 a podobně zaujímá uzavřenou konformaci. Superimpozice těchto dvou struktur s komplexem chimérické al-I domény ukazuje, že jsou zde pouze málo významné konformační změny při vazbě protilátky hAQC2. Hodnota r. m. s. polohové odchylky mezi chimérickou al-I doménou a al-I doménou laboratorního potkana je 1,04 A pro všech 768 atomů hlavního řetězce. Hodnota r. m.
•··· ··
- 137 s. polohové odchylky mezi humánní a chimérickou al-I doménou je 0,69 A pro všech 764 atomů hlavního řetězce. Největší rozdíly (pár humánní a chimérické al-I domény) byl pozorován v kličce 1 (r. m. s. odchylky 1,24 A pro atomy hlavního řetězce zbytků 154 až 161) a kličce 4 (C šroubovicová klička) al-I domény (r. m. s. odchylky 1,55 A pro atomy hlavního řetězce zbytků 288 až 296) . Nicméně tyto rozdíly mohou být přesněji popsány jako posuny celých elementů sekundární struktury spíše než komplexní konformační změny. Zdá se, že jsou v běžném rozsahu konformační flexibilty proteinů. Hodnota r. m. s. polohové odchylka mezi humánní a chimérickou al-I doménou pro atomy hlavní řetězec aminokyselinových zbytků Glul92, Gln218, Arg219, Gly220 a Gly221 (krystalové číslování) je 0,33 A. Hodnota r. m. s. polohové odchylka mezi potkaní a chimérickou al-I doménou pro atomy hlavního řetězce aminokyselinových zbytků Aspl54,
Gln218, Arg219,
Asp257, His261,
Serl56, Asnl57, Gly220, Gly221,
Serl58, Arg222, a Leu294
Tyrl60, Glul92, Gln223, Thr224,
Asn263, Arg291 (krystalové číslování) je 0,97Á.
I doména zachovává konformaci zavřené I domény, která byla pozorována pouze pro I domény bez ligandu krystalizované bez přítomnosti ligandů nebo pseudoligandů vázaných k místu MIDAS. Hodnota r. m. s. polohové odchylka C-koncové šroubovice humánní a chimérické I domény (vypočtená pro atomy hlavního řetězce zbytků 321 až 335) je 0,64 A. Simulovaná mapa zanedbávající nasednutí vypočtená pro konečný zpřesněný model jednoznačně potvrdila, že poloha C-koncové šroubovice a přilehlého strukturního elementu je v souladu s uzavřenou konformaci.
Aby bylo možné zkoumat účinky vazby ligandu na způsob koordinace kovového iontu, struktura podle předkládaného ·· ···· bez al..
* · · · · · • « · · • · · · · • · · « · ·♦·· ·· ·> *
- 138 vynálezu byla superponována se strukturou a2-I domény navázaného ligandu (PDB přístupový kód laox, Emsley et 1997, J. Biol. Chem. 272:28512-28517) a a2-I domény v komplexu s kolagenovým peptidem (PDB přístup. Kód ldzi, Emsley et al., 2000, Cell 101: 47-56). Koordinace kovového iontu AsplOl z protilátky je pozoruhodně podobná koordinaci kovového iontu a2-I domény glutamovou kyselinou z kolagenového peptidu. Dalším znakem, který je konzervativní, je současná interakce kyselé skupiny s His261 (His258 v «2-1 doméně). Všechny MIDAS zbytky z komplexu I doména-Fab, kromě Serl56 a Serl58, zaujímají konformaci velmi podobnou té, která je pozorována u I domény bez navázaného ligandu. Na rozdíl od toho postranní řetězce Serl56 a Serl58, a také kov, zaujímají konformaci podobnou konformaci I domény s ligandem. Je tedy jasné, že koordinace kovového iontu AsplOl neumožňuje iontu zachovat polohu a koordinační vzdálenosti, který jsou pozorovány ve stavu bez ligandu. Takže kovový ion není přímo koordinován Asp257, což je fakt, který dovoluje, že si ion zachovává vysokou elektrofilnost.
Biologické důsledky
Podle předkládaného vynálezu neexistuje žádná přímá koordinace kovu Asp257, která by mohla umožňovat vysokou afinitu vazby tím, že by snížila energetickou bariéru mezi zavřenou (ligand není vázán) a otevřenou (ligand je navázán) konformaci. Nicméně, koordinace kovu asparagovou kyselinou protilátky není dostatečná k tomu, aby indukovala otevřenou konformaci I domény podle předkládaného vynálezu. Struktura komplexu „I doména-Fab ukazuje, že je možné mít silnou vazbu k I doméně, která zaujímá uzavřenou konformaci, a že koordinace kovového iontu kyselým zbytkem z ligandu je nutná, ···* • · · • 9 • · · 9 9 9
9999 ··
·· φ • 9 9 • · · 9 • ·99·· • · · ·· ·
- 139 nikoliv však otevřený stav. nizkoafinitni vnějšku, která postačující pro indukci změny konformace na Očekává se, že navázání protilátky stabilizuje stav integrinů a brání tak signalizaci z by doprovázela vazbu integrinů ke kolagenu.
Ačkoli byl předkládaný vynález popsán velmi podrobně formou příkladů výhodných provedení a ilustrativních příkladů pro účely jasnosti popisu, odborníkovi je zřejmé, že mohou být provedeny určité změny a modifikace, aniž by došlo k odchýlení od vynálezecké myšlenky. Proto ani popis ani příklady by neměly být vyloženy tak, aby omezovaly rozsah vynálezu.
• · · ·
- 140 Seznam sekvencí <160> 70 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 106 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptid <400> 1
Gin 1 Ile Val Leu Thr Gin Phe Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 15
5 10
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala 20 25 Ser Ser Ser Val Asn His Met 30
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Lys Ser 35 40 Ser Pro Lys Pro 45 Trp Ile Tyr
Leu Thr 50 Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val 55 Pro Ala Arg Phe 60 Ser Gly Ser
Gly 65 Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr 70 Ile Ser 75 Ser Met Glu Ala Glu 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser 85 90 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptid <400> 2 Gly Asn Pro Trp Thr 95
Asp 1 Val Lys Val Val Glu Ser Gly Gly 5 Gly Leu 10 Val Lys Pro Gly Gly 15
Ser Leu Lys Leu Ala Cys Ala Ala Ser 20 25 Gly Phe Ser Phe Ser Arg Tyr 30
• · · ·
- 141 ·· ··· ·· *
Thr Met Ser Trp Val ' 35 Arg Gin Ile 40 Pro Glu Lys Arg Leu 45 Glu Trp
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75
Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
Val
Lys
Leu
Thr
Thr <210> 3 <211> 213 <212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický
polypeptid
<400> 3
Gin Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His
20 25 30
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp
85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin
145 150 155
Gly
Met
Tyr
Ser
Glu
Thr
Pro
Thr
Lys
Glu
160 • ·
- 142 -
Ser Val Thr Glu Gin 165 Asp Ser Lys Asp Ser 170 Thr Tyr Ser Leu Ser 175 Ser
Thr Leu Thr Leu 180 Ser Lys Ala Asp Tyr 185 Glu Lys His Lys Val 190 Tyr Ala
Cys Glu Val 195 Thr His Gin Gly Leu 200 Ser Ser Pro Val Thr 205 Lys Ser Phe
Asn Arg Gly Glu Cys
210 <210> 4 <211> 447 <212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický
polypeptid
<400> 4
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin 165 170 175 • · • · · ·
- 143 -
Ser Ser Gly Leu 180 Tyr Ser Leu Ser Ser 185 Val Val Thr Val Pro 190 Ser Ser
Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 5
<211> 447 <212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220>
• · • · · ·
- 144 -
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptid
<400> 5
Glu 1 Val Gin Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gin Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser Gly 25 Phe Thr Phe Ser 30 Arg Tyr
Thr Met Ser Trp 35 Val Arg Gin Ala Pro Gly 40 Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val
Ala Thr Ile Ser 50 Gly Gly Gly His Thr Tyr 55 Tyr Leu 60 Asp Ser Val Lys
Gly 65 Arg Phe Thr Ile Ser 70 Arg Asp Asn Ser Lys 75 Asn Thr Leu Tyr Leu 80
Gin Met Asn Ser Leu 85 Arg Ala Glu Asp Thr 90 Ala Val Tyr Tyr Cys 95 Thr
Arg Gly Phe Gly 100 Asp Gly Gly Tyr Phe Asp 105 Val Trp Gly Gin 110 Gly Thr
Leu Val Thr Val 115 Ser Ser Ala Ser Thr Lys 120 Gly Pro Ser 125 Val Phe Pro
Leu Ala Pro Ser 130 Ser Lys Ser Thr Ser Gly 135 Gly Thr 140 Ala Ala Leu Gly
Cys 145 Leu Val Lys Asp Tyr 150 Phe Pro Glu Pro Val 155 Thr Val Ser Trp Asn 160
Ser Gly Ala Leu Thr 165 Ser Gly Val His Thr 170 Phe Pro Ala Val Leu 175 Gin
Ser Ser Gly Leu 180 Tyr Ser Leu Ser Ser Val 185 Val Thr Val Pro 190 Ser Ser
Ser Leu Gly Thr 195 Gin Thr Tyr Ile Cys Asn 200 Val Asn His 205 Lys Pro Ser
Asn Thr Lys Val 210 Asp Lys Lys Val Glu Pro 215 Lys Ser 220 Cys Asp Lys Thr
His 225 Thr Cys Pro Pro Cys 230 Pro Ala Pro Glu Leu 235 Leu Gly Gly Pro Ser 240
Val Phe Leu Phe Pro 245 Pro Lys Pro Lys Asp 250 Thr Leu Met Ile Ser 255 Arg
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285
- 145 -
Lys Thr Lys 290 Pro Arg Glu Glu 295 Gin Tyr Gin Ser Thr Tyr Arg 300 Val Val
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445 <210> 6 <211> 447 <212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220> <223> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptid <400> 6
Glu Val Gin 1 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30
Thr Met Ser 35 Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45
Ala Thr Ile 50 Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys 55 60
Gly Arg Phe 65 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95
• · • 44 ·
- 146 Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr 100
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180
Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile 195 200
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 210 215
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 290 295
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin 305 310
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 340
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 355 360
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375
Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390
Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr 105 110
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 125
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 140
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 155 160
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin 170 175
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 185 190
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 205
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 220
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 235 240
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 250 255
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 265 270
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 285
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 315 320
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 330 335
Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 345 350
Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys 365
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 380
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 395 400
- 147 •· ···· ·· • * · · ·· · • · · • * · · • 9 9999 • 99
Ser Asp Gly Ser Phe 405 Phe Leu Tyr Ser Lys 410 Leu Thr Val Asp Lys 415 Ser
Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 caggatccgt cagccccaca tttcaa 26 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Ηοιαο sapiens <400> 8 tcctcgaggg cttgcagggc aaatat 26 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Rattus sp.
<400> 9 caggatccgt cagtcctaca tttcaa 26 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Rattus sp.
<400> 10 tcctcgagcg cttccaaagc gaatat 26 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer • · · · • ·
- 148 • · <400> 11 tgaggagacg gtgaccgtgg cccttggccc c 31 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer <400> 12 aggtsmarct gcagsagtcw gg 22 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer <400> 13 actagtcgac atggatttwc aggtgcagat twtcagcttc 40 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer <400> 14 actggatggt gggaagatgg a 21 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický peptid • · • · · ·
- 149 <400> 15
Asp Val Lys Val Val Glu Ser Gly Gly 1 5 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický peptid <400> 16
Asp Val Lys Val Val Glu 1 5 <210> 17 <211> 54 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer <400> 17 gcaccaggtg cccactccga cgtcaaggtg gtggagtcag ggggaggctt agtg <210> 18 <211> 38 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer <400> 18 ggaggcacca agctggagat ctaacgggct gatgctgc <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer ···· • ·
- 150 <400> 19 cataatgtcc aggggagaaa ttgttctcac ccag 34 <210> 20 <211> 93 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer <400> 20 ggtgcccact ccgacgtcca gctggtcgag tcagggggag gcttagtcca gcctggaggg 60 tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga ttc 93 <210> 21 <211> 51 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer <400> 21 atgtcttggg ttcgccaggc tccggggaag gggctggagt gggtcgcaac c 51 <210> 22 <211> 93 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer <400> 22 ttcaccatct ccagagacaa ttccaagaac accctgtacc tgcagatgaa cagtctgagg 60 gccgaggaca cagccgtgta ttactgtaca aga 93 <210> 23 <211> 39 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer
- 151 -
<400> 23 tggggccaag gtaccctggt caccgtctcc tcaggtgag 39 <210> 24 <211> 51 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer <400> 24 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aggtatacta tgtcttgggt t 51 <210> 25 <211> 39 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer <400> 25 gcaccaggtg cgcactccga ggtccagctg gtcgagtca 39 <210> 26 <211> 39 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer <400> 26 gagtcagggg gaggcttaat ccagcctgga gggtccctg 39 <210> 27 <211> 81 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer <400> 27 • · φ φ · · • ·
- 152 φ φ φ • · φ · • · · φφφ φ · φ φφ φ caaattgttc tcacccagtc tccatcctcc ctgtctgcgt atcacatgca gtgccagctc a ctgtagggga cagagtcacc 60 81 <210> 28 <211> 45 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer <400> 28 ttctggtatc agcagaagcc cgggaaagcc cccaaaccct ggatt
<210> 29
<211> 105
<212> DNA
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer
<400> 29
gcttctggag tcccttcacg cttcagtggc agtgggtctg ggacagatta cactctcaca 60 atcagcagcc tgcaacctga agattttgcc acttattact gccag 105 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer <400> 30 ggtggaggca ctaaggtgga gatctaacgg gct 33 <210> 31 <211> 39 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer <400> 31 ·· ····
- 153 cccgggaaag cgcccaaact cctgatttat ctcacatcc 39 <210> 32 <211> 51 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer <400> 32 gcctcagtca taatgtcccg gggacaaatt cagctcaccc agtctccatc c 51 <210> 33 <211> 51 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer <400> 33 ggtaacccgt ggacgttcgg tcagggcact aaggtggaga tctaacgggc t 51 <210> 34 <211> 51 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer <400> 34 gcctcagtca taatgtcccg gggacaaatt cagctcaccc agtctccatc c 51 <210> 35 <211> 51 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer <400> 35 ggtaacccgt ggacgttcgg tcagggcact aaggtggaga tctaacgggc t 51
0 ·· 0 0 0 • 0 0
154 <210> 36 <211> 39 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer <400> 36 gggaaagcac ccaaactctg gatctatctc acatccaac 39 <210> 37 <211> 45 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer <400> 37 aagcccggga aggcgcccaa acccctgatt tatctcacat ccaac <210> 38 <211> 39 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer <400> 38 gtcataatgt cccggggaga tatccagctc acccagtct 39 <210> 39 <211> 354 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<221> CDS <222> (1) .. (354) <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický oligonukleotid ···«
- 155 <400> 39
gac Asp 1 gtc Val aag gtg gtg Val 5 gag tea ggg gga Glu Ser Gly Gly ggc tta Gly Leu 10 gtg Val aag Lys cct Pro gga Gly 15 ggg Gly 48
Lys Val
tcc ctg aaa ctc gcc tgt gca gcc tet gga ttc agt ttc agt aga tat 96
Ser Leu Lys Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
act atg tet tgg gtt ege cag att ccg gag aag agg ctg gag tgg gtc 144
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ile Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
gca acc att agt ggt ggt ggt cac acc tac tat cta gac agt gtg aag 192
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
ggc ega ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac acc ctg tac ctg 240
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
caa atg age agt ctg agg tet gag gac aca gcc atg tat tac tgt aca 288
Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
aga ggt ttt gga gac ggg ggg tac ttc gat gtc tgg ggc caa ggg acc 336
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
acg gtc acc gtc tcc tea 354
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 40 <211> 118 <212> PRT <213> Umělá sekvence
<220> <223> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptid
<400> 40
Asp Val Lys 1 Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Arg Tyr 20 25 30
Thr Met Ser 35 Trp Val Arg Gin Ile Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 40 45
Ala Thr Ile 50 Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys 55 60
- 156 -
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 41 <211> 354 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<221> CDS <222> (1)..(354) <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický oligonukleotid.
<400> 41
gac gtc Asp Val 1 cag ctg gtc gag tea Glu Ser ggg gga ggc tta gtc cag cct Pro gga Gly 15 ggg Gly 48
Gin Leu Val 5 Gly Gly Gly 10 Leu Val Gin
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tet gga ttc agt ttc agt aga tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
act atg tet tgg gtt ege cag get ccg ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gca acc att agt ggt ggt ggt cac acc tac tat cta gac agt gtg aag 192
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
ggc ega ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acc ctg tac ctg 240
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
cag atg aac agt ctg agg gcc gag gac aca gcc gtg tat tac tgt aca 288
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
aga ggt ttt gga gac ggg ggg tac ttc gat gtc tgg ggc caa ggt acc 336
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
•9 9999
9
- 157 • 9 · 9999 999
9 99 9 9999
999 9 9 99 99999
999 999 999
9999 99 99 999 99 9
ctg gtc acc gtc tcc tca Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 118
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický
polypeptid <400> 42
Asp Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 43 <211> 356 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<221> CDS <222> (1) .. (354) <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický oligonukleotid <400> 43 gag gtc cag ctg gtc gag tca ggg gga ggc tta atc cag cct gga ggg 48
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gin Pro Gly Gly
10 15 ······ ·· * ·· · • · · · · · · ··· • * ··· · · · · • · · · · · · · ···· ·· ·· ·· · · · · · · · ·
- 158 -
tcc Ser ctg aga ctc tcc tgt Cys gca Ala gcc tet gga Gly ttc Phe acc Thr ttc Phe agt Ser 30 agg Arg tat Tyr 96
Leu Arg Leu 20 Ser Ala Ser 25
act atg tet tgg gtt ege cag get ccg ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gca acc att agt ggt ggt ggt cac acc tac tat cta gac agt gtg aag 192
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
ggc ega ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acc ctg tac ctg 240
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
cag atg aac agt ctg agg gcc gag gac aca gcc gtg tat tac tgt aca 288
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
aga ggt ttt gga gac ggg ggg tac ttc gat gtc tgg ggc caa ggt acc 336
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
ctg gtc acc gtc tcc tea gg 356
Leu Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 44 <211> 118 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptid <400> 44
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 10 Ile Gin Pro Gly 15 Gly
1 5
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
' 35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 • · ···· · · « · · · · · *· · · · ·
159
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 45 <211> 356 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<221> CDS <222> (1) .. (354) <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický oligonukleotid <400> 45
gag gtc Glu Val 1 cag Gin ctg gtc Leu Val 5 gag Glu tea Ser ggg Gly gga Gly ggc tta gtc cag cct gga Gly 15 ggg Gly 48
Gly 10 Leu Val Gin Pro
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tet gga ttc acc ttc agt agg tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
act atg tet tgg gtt ege cag get ccg ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gca acc att agt ggt ggt ggt cac acc tac tat cta gac agt gtg aag 192
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
ggc ega ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acc ctg tac ctg 240
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
cag atg aac agt ctg agg gcc gag gac aca gcc gtg tat tac tgt aca 288
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
aga ggt ttt gga gac ggg ggg tac ttc gat gtc tgg ggc caa ggt acc 336
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
ctg gtc acc gtc tcc tea gg 356
Leu Val Thr Val Ser Ser
<210> 46 <211> 318
115 • · • 4
- 160 4 4 4 4 4 4 ·
4 · 4 4 4
444 4 4 44 44444
444 444
44 444 44 4 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<221> CDS <222> (1) . . (318) <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický oligonukleotid <400> 46
caa Gin 1 att Ile gtt Val ctc Leu acc Thr 5 cag Gin ttt Phe cca Pro gca Ala ctc Leu 10 atg Met tet Ser gcg Ala tet Ser cca Pro 15 ggg Gly 48
gag aag gtc acc atg acc tgc agt gcc age tea agt gta aat cac atg 96
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
ttc tgg tat cag cag aag cca aaa tcc tcc ccc aaa ccc tgg att tat 144
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Lys Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
ctc aca tcc aac ctg get tet gga gtc cct get ege ttc agt ggc agt 192
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
ggg tet ggg acc tet tac tet ctc aca atc age age atg gag get gaa 240
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
gat get gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt ggt aac ccg tgg acg 288
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
ttc ggt gga ggc acc aag ctg gag atc aaa 318
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> <211> <212> <213> 47 106 PRT Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický
polypeptid
<400> 47
Gin Ile Val Leu Thr Gin Phe Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
- 161 -
4
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Lys Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 <210> 48 <211> 318 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<221> CDS <222> (1).,(318) <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický oligonukleotid <400> 48
caa att gtt Val ctc Leu acc Thr 5 cag Gin tet Ser cca Pro tcc Ser tcc Ser 10 ctg tet gcg tet gta Val 15 ggg Gly 48
Gin 1 Ile Leu Ser Ala Ser
gac aga gtc acc atc aca tgc agt gcc age tea agt gta aat cac atg 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
ttc tgg tat cag cag aag ccc ggg aaa gcc ccc aaa ccc tgg att tat 144
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
ctc aca tcc aac ctg get tet gga gtc cct tea ege ttc agt ggc agt 192
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
ggg tet ggg aca gat tac act ctc aca atc age age ctg caa cct gaa 240
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
gat ttt gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt ggt aac ccg tgg acg 288
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
318 ttc ggt gga ggc act aag gtg gag atc aaa Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 ······ ·· · * · · ·· 9 9 9 9 0 9 9 9
9« 9*· *900 * *9* · * 99 99990
0**0 9* 9* ··· 9* *
162 <210> 49 <211> 106 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptid <400> 49
Gin Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser 15 10
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser 20 25
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala 35 40
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile 65 70
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp 85 90
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
Leu Ser Ala Ser Val Gly 15
Ser Ser Val Asn His Met 30
Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 45
Ser Arg Phe Ser Gly Ser 60
Ser Ser Leu Gin Pro Glu 75 80
Ser Gly Asn Pro Trp Thr 95 <210> 50 <211> 318 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<221> CDS <222> (1)..(318) <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický oligonukleotid
<400> 50 gta Val 15 ggg Giy 48
caa Gin 1 att Ile gtt Val ctc Leu acc Thr 5 cag Gin tet Ser cca Pro tcc Ser tcc Ser 10 ctg Leu tet Ser gcg tet
Ala Ser
gac aga gtc acc atc aca tgc agt gcc age tea agt gta aat cac atg 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
- 163 ······ ·· · φ · · • φ φ · · · · φφφ • · φφφ φφφφ • ««· · · φ φ φ φ φ φ · φφφφ φ φ ·’ · φ φ · φ φ φ
ttc tgg tat Tyr 35 cag Gin cag Gin aag Lys CCC Pro ggg aaa Gly Lys 40 gcg ccc aaa ctc Leu 45 ctg Leu att Ile tat Tyr 144
Phe Trp Ala Pro Lys
ctc aca tcc aac ctg get tet gga gtc cct tea ege ttc agt ggc agt 192
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
ggg tet ggg aca gat tac act ctc aca atc age age ctg caa cct gaa 240
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
gat ttt gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt ggt aac ccg tgg acg 288
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
ttc ggt gga ggc act aag gtg gag atc aaa 318
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 51
<211> 106
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický
polypeptid
<400> 51
Gin 1 Ile Val Leu Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val Gly 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 52 <211> 318 <212> DNA • · • « · 9
9 · · · · • 9 · · · «· 9 9 9 • · 9·· 9 9 9 9 • · 9 9 · · ·· 9 9 9 99
9 9 9 9 9 999 • 999 ·· ·· 999 99 9
- 164 -
<213> Umělá sekvence
<220> <221> CDS <222> (1).. (318)
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický
oligonukleotid
<400> 52 cca tcc tcc ctg tet gcg tet gta Val 15 ggg Gly 48
caa Gin 1 att Ile cag ctc acc Thr 5 cag tet Gin Ser
Gin Leu Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser
gac aga gtc acc atc aca tgc agt gcc age tea agt gta aat cac atg 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
ttc tgg tat cag cag aag ccc ggg aaa gcc ccc aaa ccc tgg att tat 144
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
ctc aca tcc aac ctg get tet gga gtc cct tea ege ttc agt ggc agt 192
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
ggg tet ggg aca gat tac act ctc aca atc age age ctg caa cct gaa 240
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
gat ttt gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt ggt aac ccg tgg acg 288
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
ttc ggt cag ggc act aag gtg gag atc aaa 318
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 <210> 53 <211> 318 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<221> CDS <222> (1)..(318) <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický oligonukleotid <400> 53 • * ··· ·
- 165 -
caa Gin 1 att Ile cag ctc Gin Leu acc Thr 5 cag Gin tet Ser cca Pro tcc tcc Ser Ser 10 ctg Leu tet Ser gcg Ala tet Ser gta Val 15 ggg Gly 48
gac aga gtc acc atc aca tgc agt gcc age tea agt gta aat cac atg 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
ttc tgg tat cag cag aag CCC ggg aaa gcg CCC aaa ctc ctg att tat 144
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
ctc aca tcc aac ctg get tet gga gtc cct tea ege ttc agt ggc agt 192
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
ggg tet ggg aca gat tac act ctc aca atc age age ctg caa cct gaa 240
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
gat ttt gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt ggt aac ccg tgg acg 288
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
ttc ggt cag ggc act aag gtg gag atc aaa 318
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100
105
<210> 54 <211> 106 <212> PRT <213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický
polypeptid
<400> 54 Gin Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
- 166 φ • φ φφφ • φφφφ φ φ
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val 100
Glu Ile Lys 105 <210> 55 <211> 318 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<221> CDS <222> (1)..(318) <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický oligonukleotid <400> 55
gaa Glu 1 att Ile gtt Val ctc Leu acc Thr 5 cag Gin ttt Phe cca Pro gca Ala ctc Leu 10 atg Met tet Ser gcg Ala tet Ser cca Pro 15 ggg Gly 48
gag aag gtc acc atg acc tgc agt gcc age tea agt gta aat cac atg 96
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
ttc tgg tat cag cag aag cca aaa tcc tcc ccc aaa ccc tgg att tat 144
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Lys Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
ctc a ca tcc aac ctg gct tet gga gtc cct gct ege ttc agt ggc agt 192
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
ggg tet ggg acc tet tac tet ctc aca atc age age atg gag gct gaa 240
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt ggt aac ccg tgg acg 288
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
ttc ggt gga ggc acc aag ctg gag atc aaa 318
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 <210> 56 <211> 106 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptid ···· 99 9 999
9 999 999
99 9 999«
999 9 9 99 99999
999 «99
99 999 99 9 • 9 99
167
<400> 56
Glu Ile Val Leu Thr Gin Phe Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Lys Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 57 <211> 318 <212> DNA <213> Umělá sekvence
<220> <221> <222> CDS (i).. (318)
<220> <223> Popis umělé sekvence: Syntetický
oligonukleotid <400> 57
gat Asp 1 atc Ile cag Gin ctc Leu acc Thr 5 cag Gin tet Ser cca Pro tcc Ser tcc Ser 10 ctg Leu tet Ser gcg Ala tet Ser gta Val 15 ggg Gly 48
gac aga gtc acc atc aca tgc agt gcc age tea agt gta aat cac atg 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
ttc tgg tat cag cag aag CCC ggg aaa gcc CCC aaa CCC tgg att tat 144
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
ctc aca tcc aac ctg get tet gga gtc cct tea ege ttc agt ggc agt 192
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
ggg tet ggg aca gat tac act ctc aca atc age age ctg caa cct gaa 240
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
0« 0000
- 168 0 0 00 0« · 0 000 000 •000 00 00 000 00 0
gat ttt gcc Asp Phe Ala act Thr tat Tyr 85 tac tgc cag cag Gin Gin tgg agt ggt aac ccg tgg Gly Asn Pro Trp 95 acg Thr
Tyr Cys Trp 90 Ser
ttc ggt cag ggc act aag gtg gag atc aaa
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> <211> <212> <213> 58 106 PRT Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence:
polypeptid
<400> 58 Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp 1 Ile Gin Leu Thr Gin 5 Ser Pro
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 <210> 59 <211> 192 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: konstrukt chimérické domény I typu „potkan/člověk” <400> 59
Thr 1 Gin Leu Asp Ile 5 Val Ile Val Leu Asp Gly 10 Ser Asn Ser Ile 15 Tyr
Pro Trp Glu Ser Val Ile Ala Phe Leu Asn Asp Leu Leu Lys Arg Met
20 25 30
• ·
- 169 • · ··♦·
Asp Ile Gly Pro Lys Gin Thr Gin Val Gly Ile Val Gin Tyr Gly Glu 35 40 45
Asn Val Thr His Glu Phe Asn Leu Asn Lys Tyr Ser Ser Thr Glu Glu 50 55 60
Val Leu Val Ala Ala Asn Lys Ile Val Gin Arg Gly Gly Arg Gin Thr
70 75 80
Met Thr Ala Leu Gly Ile Asp Thr Ala Arg Lys Glu Ala Phe Thr Glu
90 95
Ala Arg Gly Ala Arg Arg Gly Val Lys Lys Val Met Val Ile Val Thr 100 105 110
Asp Gly Glu Ser His Asp Asn Tyr Arg Leu Lys Gin Val Ile Gin Asp 115 120 125
Cys Glu Asp Glu Asn Ile Gin Arg Phe Ser Ile Ala Ile Leu Gly His 130 135 140
Tyr Asn Arg Gly Asn Leu Ser Thr Glu Lys Phe Val Glu Glu Ile Lys
145 150 155 160
Ser Ile Ala Ser Glu Pro Thr Glu Lys His Phe Phe Asn Val Ser Asp
165 170 175
Glu Leu Ala Leu Val Thr Ile Val Lys Ala Leu Gly Glu Arg Ile Phe 180 185 190 <210> 60 <211> 192 <212> PRT <213> Rattus sp.
<400> 60
Thr Gin Leu Asp Ile Val Ile Val Leu Asp Gly Ser Asn Ser 1 5 10
Pro Trp Glu Ser Val Ile Ala Phe Leu Asn Asp Leu Leu Lys 20 25 30
Asp Ile Gly Pro Lys Gin Thr Gin Val Gly Ile Val Gin Tyr 35 40 45
Asn Val Thr His Glu Phe Asn Leu Asn Lys Tyr Ser Ser Thr 50 55 60
Val Leu Val Ala Ala Asn Lys Ile Gly Arg Gin Gly Gly Leu 65 70 75
Met Thr Ala Leu Gly Ile Asp Thr Ala Arg Lys Glu Ala Phe 85 90
Ile Tyr 15
Arg Met
Gly Glu
Glu Glu
Gin Thr 80
Thr Glu 95 ····
- 170 • · · « · • Λ · · * · · · · • · · · · ···· ·· ·« • · · • · · · • · ···· • « · ·· ·
Ala Arg Gly Ala 100 Arg Arg Gly Val Lys 105 Lys Val Met Val Ile 110 Val Thr
Asp Gly Glu 115 Ser His Asp Asn Tyr 120 Arg Leu Lys Gin Val 125 Ile Gin Asp
Cys Glu 130 Asp Glu Asn Ile Gin 135 Arg Phe Ser Ile Ala 140 Ile Leu Gly His
Tyr 145 Asn Arg Gly Asn Leu 150 Ser Thr Glu Lys Phe 155 Val Glu Glu Ile Lys 160
Ser Ile Ala Ser Glu 165 Pro Thr Glu Lys His 170 Phe Phe Asn Val Ser 175 Asp
Glu Leu Ala Leu 180 Val Thr Ile Val Lys 185 Ala Leu Gly Glu Arg 190 Ile Phe
<210> 61 <211> 192 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 61
Thr Gin Leu Asp Ile Val Ile Val Leu Asp Gly Ser Asn Ser Ile Tyr
1 5 10 15
Pro Trp Asp Ser Val Thr Ala Phe Leu Asn Asp Leu Leu Lys Arg Met
20 25 30
Asp Ile Gly Pro Lys Gin Thr Gin Val Gly Ile Val Gin Tyr Gly Glu
35 40 45
Asn Val Thr His Glu Phe Asn Leu Asn Lys Tyr Ser Ser Thr Glu Glu
50 55 60
Val Leu Val Ala Ala Lys Lys Ile Val Gin Arg Gly Gly Arg Gin Thr
65 70 75 80
Met Thr Ala Leu Gly Ile Asp Thr Ala Arg Lys Glu Ala Phe Thr Glu
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Arg Arg Gly Val Lys Lys Val Met Val Ile Val Thr
100 105 110
Asp Gly Glu Ser His Asp Asn His Arg Leu Lys Lys Val Ile Gin Asp
115 120 125
Cys Glu Asp Glu Asn Ile Gin Arg Phe Ser Ile Ala Ile Leu Gly Ser
130 135 140
Tyr Asn Arg Gly Asn Leu Ser Thr Glu Lys Phe Val Glu Glu Ile Lys
145 150 155 160
*44* • *
- 171 4 4 · 4 · « • · · ·
4 4 4 4
4 4 4 4
4444 44 44 4 • ·
4 44
Ser Ile Ala Ser Glu Pro Thr Glu Lys His Phe 165 170
Glu Ile Ala Leu Val Thr Ile Val Lys Thr Leu 180 185
Phe Asn Val
Gly Glu Arg 190
Ser Asp 175
Ile Phe <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický peptid.
<400> 62
Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr 1 5 <210> 63 <211> 214 <212> PRT <213> Rattus sp.
<400> 63
Val Ser Pro Thr Phe Gin Val Val Asn Ser Phe Ala Pro Val Gin Glu 15 10 15
Cys Ser Thr Gin Leu Asp Ile Val Ile Val Leu Asp Gly Ser Asn Ser 20 25 30
Ile Tyr Pro Trp Glu Ser Val Ile Ala Phe Leu Asn Asp Leu Leu Lys 35 40 45
Arg Met Asp Ile Gly Pro Lys Gin Thr Gin Val Gly Ile Val Gin Tyr 50 55 60
Gly Glu Asn Val Thr His Glu Phe Asn Leu Asn Lys Tyr Ser Ser Thr
70 75 80
Glu Glu Val Leu Val Ala Ala Lys Lys Ile Gly Arg Gin Gly Gly Leu
90 95
Gin Thr Met Thr Ala Leu Gly Ile Asp Thr Ala Arg Lys Glu Ala Phe 100 105 110
Thr Glu Ala Arg Gly Ala Arg Arg Gly Val Lys Lys Val Met Val Ile 115 120 125
Val Thr Asp Gly Glu Ser His Asp Asn Tyr Arg Leu Lys Gin Val Ile 130 135 140 ·· ··«« • ·
- 172 Gin Asp Cys Glu Asp Glu Asn Ile Gin Arg Phe Ser Ile Ala Ile Leu
145 150 155 160
Gly His Tyr Asn Arg Gly Asn Leu Ser Thr Glu Lys Phe Val Glu Glu
165 170 175
Ile Lys Ser Ile Ala Ser Glu Pro Thr Glu Lys His Phe Phe Asn Val 180 185 190
Ser Asp Glu Leu Ala Leu Val Thr Ile Val Lys Ala Leu Gly Glu Arg 195 200 205
Ile Phe Ala Leu Glu Ala 210 <210> 64 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64
Val Ser Pro Thr Phe Gin Val Val Asn Ser Ile Ala Pro Val Gin Glu 15 10 15
Cys Ser Thr Gin Leu Asp Ile Val Ile Val Leu Asp Gly Ser Asn Ser 20 25 30
Ile Tyr Pro Trp Asp Ser Val Thr Ala Phe Leu Asn Asp Leu Leu Lys 35 40 45
Arg Met Asp Ile Gly Pro Lys Gin Thr Gin Val Gly Ile Val Gin Tyr 50 55 60
Gly Glu Asn Val Thr His Glu Phe Asn Leu Asn Lys Tyr Ser Ser Thr
70 75 80
Glu Glu Val Leu Val Ala Ala Lys Lys Ile Val Gin Arg Gly Gly Arg
90 95
Gin Thr Met Thr Ala Leu Gly Thr Asp Thr Ala Arg Lys Glu Ala Phe 100 105 110
Thr Glu Ala Arg Gly Ala Arg Arg Gly Val Lys Lys Val Met Val Ile 115 120 125
Val Thr Asp Gly Glu Ser His Asp Asn His Arg Leu Lys Lys Val Ile 130 135 140
Gin Asp Cys Glu Asp Glu Asn Ile Gin Arg Phe Ser Ile Ala Ile Leu
145 150 155 160
Gly Ser Tyr Asn Arg Gly Asn Leu Ser Thr Glu Lys Phe Val Glu Glu
165 170 175
Ile Lys Ser Ile Ala Ser Glu Pro Thr Glu Lys His Phe Phe Asn Val 180 185 190
- 173 -
Ser Asp Glu Leu Ala Leu Val Thr Ile Val Lys Thr Leu Gly Glu Arg
195 200 205
Ile Phe Ala 210 Leu Glu Ala
<210> 65 <211> 106 <212> PRT <213> Umělá sekvence
<220> <223> Popis umělé sekvence: Syntetický
polypeptid
<400> 65 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp 1 Ile Val Met Thr Gin 5 Ser Pro Ser Ser 10
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Tyr Leu
20 25 30
Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 <210> 66 <211> 106 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický
polypeptid
<400> 66
Gin 1 Ile Gin Leu Thr Gin Ser 5 Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met 25 30
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 35 Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 40 45
·· φφφφ • Φ • · · · · • φ φ φ φ φ φ φ φ
ΦΦΦ · φ • ΦΦΦ φφ ·· ·· • · • · • φ φ • · · • Φ φ • · ·· ··
- 174 -
Leu Thr 50 Ser Asn Leu Ala Ser 55 Gly Val Pro Ser Arg 60 Phe Ser Gly Ser
Gly 65 Ser Gly Thr Asp Tyr 70 Thr Leu Thr Ile Ser 75 Ser Leu Gin Pro Glu 80
Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gin Gin Trp 90 Ser Gly Asn Pro Trp 95 Thr
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 <210> 67 <211> 118 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptid <400> 67
Glu 1 Val Gin Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Ile Gin Pro Gly 15 Gly
Ser Leu. .Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Val Ser 30 Ser Asn
Tyr Met Ser 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val
Ser Val 50 Ile Tyr Ser Gly Gly 55 Ser Thr Tyr Tyr Ala 60 Asp Ser Val Lys
Gly 65 Arg Phe Thr Ile Ser 70 Arg Asp Asn Ser Lys 75 Asn Thr Leu Tyr Leu 80
Gin Met Asn Ser Leu 85 Arg Ala Glu Asp Thr 90 Ala Val Tyr Tyr Cys 95 Ala
Ser Ile Arg Phe 100 Leu Glu Trp Ser Phe 105 Asp Tyr Trp Gly Gin 110 Gly Thr
Leu Val Thr 115 Val Ser Ser
<210> 68 <211> 118 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptid
- 175 <400> 68
Glu 1 Val Gin Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gin Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Arg Tyr
Thr Met Ser 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val
Ala Thr 50 Ile Ser Gly Gly Gly 55 His Thr Tyr Tyr Leu 60 Asp Ser Val Lys
Gly 65 Arg Phe Thr Ile Ser 70 Arg Asp Asn Ser Lys 75 Asn Thr Leu Tyr Leu 80
Gin Met Asn Ser Leu 85 Arg Ala Glu Asp Thr 90 Ala Val Tyr Tyr Cys 95 Thr
Arg Gly Phe Gly 100 Asp Gly Gly Tyr Phe 105 Asp Val Trp Gly Gin 110 Gly Thr
Leu Val Thr 115 Val Ser Ser
<210> 69 <211> 118 <212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický
polypeptid
<400> 69 Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
- 176 • · ···· · · · · · · • · · · · · · ··· ·· ··· · · · · • ··· · · ·· ····· ···· ·· ·· ··· ·· ·
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 70 <211> 106 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický
polypeptid
<400> 70
Gin 1 Ile Gin Leu Thr Gin Ser 5 Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 . 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met 25 30
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 35 Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser 50 55 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 60
Gly 65 Ser Gly Thr Asp Tyr Thr 70 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 • · · · · · · · · ·· · • · · · · · · ··· ·· · · · ···· • ··· · · · · ····· ···· ·· ·· ··· ·· ·
177

Claims (10)

PATENTOVÉ NÁROKY
1/131
POČET BUNĚK α2
F------7...,-,
1. Protilátka anti-VLA-1, jejíž úseky určující komplementaritu lehkého řetězce jsou definovány aminokyselinovými zbytky 24 až 33, 49 až 55 a 88 až 96 ze sekv. id. č. 1, a jejíž úseky určující komplementaritu těžkého řetězce jsou definovány aminokyselinovými zbytky 31 až 35, 50 až 65 a 98 až 107 ze sekv. id. č. 2.
2. Protilátka podle nároku 1, která obsahuje variabilní doménu lehkého řetězce mající sekvenci uvedenou jako sekv. id. č. 1, a variabilní doménu těžkého řetězce mající sekvenci uvedenou jako sekv. id. č. 2.
3. Protilátka podle nároku 1, která obsahuje stejné polypeptidové sekvence těžkého a lehkého řetězce jako protilátka produkovaná hybridomem mAQC2 (ATCC přístupové číslo PTA3273).
4 44 4 4444
444 4 4 44 44444
444 444 444
4444 44 44 444 44 4 (d) potenciální antagonista se přivede do kontaktu s I doménou, aby se určila schopnost potenciálního antagonisty interagovat s I doménou, přičemž schopnost potenciálního antagonisty interagovat s I doménou ukazuje, že potenciální antagonista je inhibitor I domény.
41. Způsob identifikace inhibitoru I domény integrinu vyznačující se tím, že zahrnuje kroky, kdy (a) použijí se strukturní koordináty alespoň tří aminokyselinových zbytků I domény obsahující zbytky Glul92, Gln218, Arg219, Gly220 a Gly221 podle obr. 19, nebo ± hodnota odmocniny průměrného čtverce odchylek od atomů hlavního řetězce aminokyselin I domény nejvýše 0,30 Á, pro vytvoření trojrozměrné struktury vazebného místa, (b) trojrozměrná struktura se použije k navržení nebo výběru potenciálního antagonisty, (c) syntetizuje se potenciální antagonista a (d) potenciální antagonista se přivede do kontaktu s I doménou, aby se určila schopnost potenciálního antagonisty interagovat s I doménou, přičemž schopnost potenciálního antagonisty interagovat s I doménou ukazuje, že potenciální antagonista je inhibitor I domény.
42. Inhibitor I domény integrinu identifikovaný způsobem podle kteréhokoliv z nároků 40 a 41.
4 44 44 444
4 4 (iv) obrazovku sdruženou s centrální procesorovou jednotkou pro zobrazení trojrozměrné reprezentace.
38. Počítač pro vytvoření trojrozměrné reprezentace molekuly nebo molekulárního komplexu obsahujícího:
a) první vazebné místo definované strukturními koordinátami aminokyselinových zbytků I domény obsahující alespoň tři ze zbytků Glul92, Gln218, Arg219, Gly220 a Gly221, podle obr. 19 nebo
b) homolog molekuly nebo molekulárního komplexu, kde homolog obsahuje druhé vazebné místo, které má hodnotu odmocniny průměrného čtverce odchylek od atomů hlavního řetězce I domény nejvýše 0,30 Á, vyznačující se tím, že počítač obsahuje:
(i) strojově čitelné médium pro ukládání dat obsahující uložená data kódovaná se strojově čitelnými daty, kde data obsahují strukturní koordináty aminokyselin I domény obsahující alespoň tři ze zbytků Glul92, Gln218, Arg219,
Gly220 a Gly221 podle obr. 19, a (ii) pracovní paměť pro uchovávání instrukcí pro zpracování strojově čitelných data, (iii) centrální procesorovou jednotku sdruženou s pracovní paměti a strojově čitelným médiem pro uchování dat pro zpracování strojově čitelného média pro uchování dat pro zpracování strojově čitelných dat do trojrozměrných reprezentací a (iv) obrazovku sdruženou s centrální procesorovou jednotkou pro zobrazení trojrozměrné reprezentace.
39. Počítač pro vytvoření trojrozměrné reprezentace:
a) prvního vazebného místa definovaného strukturními koordinátami aminokyselinových zbytků I obsahujícího alespoň
187 tři ze zbytků Glul92, Gln218, Arg219, Gly220 a Gly221 podle obr. 19 nebo
b) druhého vazebného místa homologu, které má hodnotu odmocniny průměrného čtverce odchylek od atomů hlavního řetězce aminokyselin I domény nejvýše 0,30 Á, vyznačující se tím, že počítač obsahuje:
(i) strojově čitelné médium pro ukládání dat obsahující uložená data kódovaná se strojově čitelnými daty, kde data obsahují strukturní koordináty aminokyselin I domény obsahující alespoň tři ze zbytků Glul92, Gln218, Arg219,
Gly220 a Gly221 podle obr. 19 a (ii) pracovní paměť pro uchovávání instrukcí pro zpracování strojově čitelných dat, (iii) centrální procesorovou jednotku sdruženou s pracovní paměti a strojově čitelným médiem pro uchování dat pro zpracování strojově čitelného média pro uchování dat pro zpracování strojově čitelných dat do trojrozměrných reprezentací a (iv) obrazovku sdruženou s centrální procesorovou jednotkou pro zobrazení trojrozměrné reprezentace.
40. Způsob identifikace inhibitoru I domény integrinu vyznačující se tím, že zahrnuje kroky, kdy (a) použijí se strukturní koordináty aminokyselinových zbytků I domény Aspl54, Serl56, Asnl57, Serl58, Tyrl60, Glul92, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223,
Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 a Leu294 podle obr. 19 pro vytvoření trojrozměrné struktury vazebného místa, (b) trojrozměrná struktura se použije k navržení nebo výběru potenciálního antagonisty, (c) syntetizuje se potenciální antagonista a
188
4444*4 · · 4 44 4
4 ·4·44
4. Protilátka podle nároku 1, která je humanizovaná protilátka.
5. Protilátka podle nároku 4, která obsahuje ve svém lehkém řetězci alespoň jeden z následujících zbytků: Ql, L4, P46, W47 a Y71, nebo ve svém těžkém řetězci alespoň jeden z následujících zbytků: Dl, V12, S28, F29, A49, T93, R94 (číslování podle Kabata).
6. Protilátka podle nároku 4, která obsahuje sekvenci variabilní domény lehkého řetězce definovanou aminokyselinovými zbytky 1 až 106 ze sekv. id. č. 3a sekvenci
178 variabilní domény těžkého řetězce definovanou aminokyselinovými zbytky 1 až 118 ze sekv. id. č. 4.
7. Protilátka podle nároku 4, která obsahuje stejné polypeptidové sekvence těžkého a lehkého řetězce jako protilátka produkovaná buněčnou linií hAQC2 (ATCC přístupové číslo PTA3275).
8. Protilátka podle nároku 4, kde těžký řetězec je mutován v jednom nebo ve více aminokyselinových zbytcích vybraných ze skupiny, kterou tvoří zbytky 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 a 322 (systém číslování EU), čímž je způsobena změna efektorové funkce, zatímco je zachována vazba k VLA-1, ve srovnání s nemodifikovanou protilátkou.
9. Protilátka podle nároku 8, která obsahuje mutace L234A a L235A (systém číslování EU) ve svém těžkém řetězci, ve srovnání s nemodifikovanou protilátkou.
10. Protilátka podle nároku 4, která obsahuje stejné polypeptidové sekvence těžkého a lehkého řetězce jako protilátka produkovaná buněčnou linií hsAQC2 (ATCC přístupové číslo PTA3356).
11. Protilátka podle nároku 4, která je mutovaná v aminokyselinovém zbytku, který je glykosylačním místem, čímž je glykosylační místo eliminováno.
12. Protilátka podle nároku 11, která obsahuje mutaci N297Q ve svém těžkém řetězci (systém číslování EU).
179
13. Protilátka podle nároku 4, která obsahuje stejné polypeptidové sekvence těžkého a lehkého řetězce jako protilátka produkovaná buněčnou linií haAQC2 (ATCCC přístupové číslo PTA3274).
14. Přípravek vyznačující se tím, že obsahuje protilátku podle kteréhokoliv z nároků 4 až 13 a farmaceuticky přijatelný nosič.
15. Izolovaná nukleová kyselina obsahuj ící kódující sekvenci pro sekv. id. č. 1. 16. Izolovaná nukleová kyselina obsahující kóduj ící sekvenci pro sekv. id. č. 2. 17. Izolovaná nukleová kyselina obsahuj ící kódující sekvenci pro lehký řetězec protilátky produkované hybridomem mAQC2 (ATCC přístupové číslo PTA3273). 18. Izolovaná nukleová kyselina obsahující kóduj ící sekvenci pro těžký řetězec protilátky produkované hybridomem mAQC2 (ATCC přístupové číslo PTA3273). 19. Izolovaná nukleová kyselina obsahuj ící kóduj ící sekvenci pro lehký řetězec protilátky produkované buněčnou linií hAQC2 (ATCC přístupové číslo PTA3275). 20. Izolovaná nukleová kyselina obsahující kóduj ící sekvenci pro těžký řetězec protilátky produkované buněčnou
linií hAQC2 (ATCC přístupové číslo PTA3275).
180 • · · · · · • · · · · · • · 0 0 0 0 · 0 · 0 0 · 0 0 0 · 0 0 •0 ·00 00 0
21. Izolovaná nukleová kyselina obsahující kódující sekvenci pro těžký řetězec protilátky produkované buněčnou linií haAQC2 (ATCC přístupové číslo PTA3274).
22. Izolovaná nukleová kyselina obsahující kódující sekvenci pro těžký řetězec protilátky produkované buněčnou linií hsAQC2 (ATCC přístupové číslo PTA3356).
23. Izolovaná nukleová kyselina sekvence pro zbytky 1 až 106 ze sekv. id
24. Izolovaná nukleová kyselina sekvenci pro zbytky 1 až 118 ze sekv. id obsahující
č. 3.
kóduj ící obsahuj ící
č. 4.
kóduj ící
25. Způsob léčení pacienta s imunologickou nemocí zprostředkovanou VLA-1 vyznačující se tím, že zahrnuje podávání přípravku podle nároku 14 pacientovi.
26. Způsob určování hladiny VLA-1 ve tkáni vyznačující se tím, že zahrnuje kroky, kdy se tkáň přivede do kontaktu s protilátkou podle nároku 1 a detekuje se vazba protilátky ke tkáni, čímž se určí hladina VLA-1 ve tkáni.
27. Buňka hybridomu mAQC2 (ATCC přístupové číslo PTA3273).
28. Buňka buněčná linie hAQC2 (ATCC přístupové číslo PTA3275).
29. Buňka buněčné linie haAQC2 (ATCC přístupové číslo PTA3274).
• · 9
181
30. Buňka buněčné linie hsAQC2 (ATCC přístupové číslo PTA3356).
31. Počítač pro vytvoření trojrozměrné reprezentace:
(a) molekulárního komplexu, kde molekulární komplexní je definován souborem strukturních koordinát komplexu chimérické I domény alfcl integrinu RAH a humanizované protilátky hAQC2, podle obr. 19, nebo (b) homologu molekulárního komplexu, kde homolog má hodnotu odmocniny průměrného čtverce odchylek od atomů hlavního řetězce aminokyselin nejvýše 0,65 Á, vyznačující se tím, že počítač obsahuje:
(i) strojově čitelné médium pro ukládání dat obsahující uložená data kódovaná se strojově čitelnými daty, kde data obsahují alespoň část strukturních koordinát komplexu podle obr. 19, (ii) pracovní paměť pro uchovávání instrukcí pro zpracování strojově čitelných dat, (iii) centrální procesorovou jednotku sdruženou s pracovní paměti a strojově čitelným médiem pro uchování dat pro zpracování strojově čitelného média pro uchování dat pro zpracování strojově čitelných dat do trojrozměrných reprezentací a (iv) obrazovku sdruženou s centrální procesorovou jednotkou pro zobrazení trojrozměrné reprezentace.
32. Počítač pro vytvoření trojrozměrné reprezentace molekuly nebo molekulárního komplexního obsahujícího:
a) první vazebné míst definované strukturními koordinátami aminokyselin hAQC2 obsahující alespoň sedm zbytků ze zbytků lehkého řetězce Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 a Trp95 a
182
444444 ·· · 4 4 · • · 4 4 4 4 4 4 · 4 ·· ·«· 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 4 4 4···· zbytků těžkého řetězce Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO a AsplOl podle obr. 19 nebo
b) homolog molekuly nebo molekulárního komplexu, kde homolog obsahuje druhé vazebné místo, které má hodnotu odmocniny průměrného čtverce odchylek od atomů hlavního řetězce aminokyselin hAQC2 nejvýše 1,10 A, vyznačující se tím, že počítač obsahuje:
(i) strojově čitelné médium pro ukládání dat obsahující uložená data kódovaná se strojově čitelnými daty, kde data obsahují strukturní koordináty aminokyselin hAQC2 obsahující alespoň sedm zbytků ze zbytků lehkého řetězce Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 a Trp95 a zbytků těžkého řetězce Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO a AsplOl podle obr. 19 a (ii) pracovní paměť pro uchovávání instrukcí pro zpracování strojově čitelných data, (iii) centrální procesorovou jednotku sdruženou s pracovní paměti a strojově čitelným médiem pro uchování dat pro zpracování strojově čitelného média pro uchování dat pro zpracování strojově čitelných dat do trojrozměrných reprezentací a (iv) obrazovku sdruženou s centrální procesorovou jednotkou pro zobrazení trojrozměrné reprezentace.
33. Počítač pro vytvoření trojrozměrné reprezentace: a) prvního vazebného místa definovaného strukturními koordinátami aminokyselin hAQC2 obsahujícího alespoň sedm zbytků ze zbytků lehkého řetězce Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 a Trp95 a zbytků těžkého řetězce Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO a AsplOl podle obr. 19 nebo
183
b) druhého vazebného místa homologu, které má hodnotu odmocniny průměrného čtverce odchylek od atomů hlavního řetězce aminokyselin hAQC2 nejvýše 1,10 Á, vyznačující se tím, že počítač obsahuje:
(i) strojově čitelné médium pro ukládání dat obsahující uložená data kódovaná se strojově čitelnými daty, kde data obsahují strukturní koordináty aminokyselin hAQC2 vybraných ze skupiny obsahující alespoň sedm zbytků ze zbytků lehkého řetězce Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 a Trp95 a zbytků těžkého řetězce Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO a AsplOl podle obr. 19 a (ii) pracovní paměť pro uchovávání instrukcí pro zpracování strojově čitelných data, (iii) centrální procesorovou jednotku sdruženou s pracovní paměti a strojově čitelným médiem pro uchování dat pro zpracování strojově čitelného média pro uchování dat pro zpracování strojově čitelných dat do trojrozměrných reprezentací a (iv) displej sdružený s centrální procesorovou jednotkou pro zobrazení trojrozměrné reprezentace.
34. Způsob identifikace inhibitoru I domény integrinu vyznačující se tím, že zahrnuje kroky, kdy se (a) použijí strukturní koordináty aminokyselin hAQC2 obsahující alespoň sedm zbytků ze zbytků lehkého řetězce Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 a Trp95 a zbytků těžkého řetězce Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO a AsplOl podle obr. 19, nebo + hodnota odmocniny průměrného čtverce odchylek atomů hlavního řetězce aminokyselin hAQC2 nejvýše 1,10 Á, pro vytvoření trojrozměrné struktury vazebného místa,
184
Φ Φ φφφφ φφ φ φφ φ • Φ φ φφφφ φφφ φφ φφφ φφφφ • φφφ φ φ φφ φφφφ φφφφ φφ φφ φφφ φφ φ (b) trojrozměrná struktura se použije k navržení nebo výběru potenciálního antagonisty, (c) syntetizuje se potenciální antagonista a (d) potenciální antagonista se přivede do kontaktu s hAQC2, aby se určila interagovat s hAQC2, schopnost potenciálního antagonisty přičemž schopnost potenciálního ukazuje, že potenciální antagonisty interagovat s hAQC2 antagonista je inhibitor I domény.
35. způsobem Inhibitor I domény podle nároku 34. integrinu, který byl identifikován 36. Počítač pro vytvoření trojrozměrné reprezentace molekuly nebo molekulárního komplexu obsahujícího: a) první vazebné místo definované strukturními
koordinátami aminokyselinových zbytků I domény Aspl54, Serl56, Asnl57, Serl58, Tyrl60, Glul92, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 a Leu294 podle obr. 19 nebo
b) homolog molekuly nebo molekulárního komplexu, kde homolog obsahuje druhé vazebné místo, které má hodnotu odmocniny průměrného čtverce odchylek od atomů hlavního řetězce I domény nejvýše 0,92 Á, vyznačující se tím, že počítač obsahuje:
(i) strojově čitelné médium pro ukládání dat obsahující uložená data kódovaná se strojově čitelnými daty, kde data obsahují strukturní koordináty aminokyselin I domény Aspl54, Serl56, Asnl57, Serl58, Tyrl60, Glul92, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 a Leu294 podle obr. 19, a (ii) pracovní paměť pro uchovávání instrukcí pro zpracování strojově čitelných data,
185 (iii) centrální procesorovou jednotku sdruženou s pracovní paměti a strojově čitelným médiem pro uchování dat pro zpracování strojově čitelného média pro uchování dat pro zpracování strojově čitelných dat do trojrozměrných reprezentací a (iv) obrazovku sdruženou s centrální procesorovou jednotkou pro zobrazení trojrozměrné reprezentace.
37. Počítač pro vytvoření trojrozměrné reprezentace:
a) prvního vazebného místa definovaného strukturními koordinátami aminokyselinových zbytků I domény Aspl54, Serl56, Asnl57, Serl58, Tyrl60, Glul92, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 a Leu294 podle obr. 19 nebo
b) druhého vazebného místa homologu, které má hodnotu odmocniny průměrného čtverce odchylek od atomů hlavního řetězce aminokyselin I domény nejvýše 0,92 Á, vyznačující se tím, že počítač obsahuje:
(i) strojově čitelné médium pro ukládání dat obsahující uložená data kódovaná se strojově čitelnými daty, kde data obsahují strukturní koordináty aminokyselin I domény Aspl54, Serl56, Asnl57, Serl58, Tyrl60, Glul92, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 a Leu294 podle obr. 19 a (ií) pracovní paměť pro uchovávání instrukcí pro zpracování strojově čitelných dat, (iii) centrální procesorovou jednotku sdruženou s pracovní paměti a strojově čitelným médiem pro uchování dat pro zpracování strojově čitelného média pro uchování dat pro zpracování strojově čitelných dat do trojrozměrných reprezentací a
4444
4
186
4
4444 44 • 4 4 4
10° 1Q1 ίο2 103 10
INTENZITA FLUORESCENCE
CZ20033039A 2001-04-13 2002-04-12 Protilátky k VLA-1, kompozice je obsahující a nukleové kyseliny, které je kódují, zpusob stanovení hladiny VLA-1 a použití pri lécení imunologického onemocnení CZ303450B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US28379401P 2001-04-13 2001-04-13
US30368901P 2001-07-06 2001-07-06

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20033039A3 true CZ20033039A3 (cs) 2004-03-17
CZ303450B6 CZ303450B6 (cs) 2012-09-19

Family

ID=26962254

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20033039A CZ303450B6 (cs) 2001-04-13 2002-04-12 Protilátky k VLA-1, kompozice je obsahující a nukleové kyseliny, které je kódují, zpusob stanovení hladiny VLA-1 a použití pri lécení imunologického onemocnení

Country Status (29)

Country Link
US (7) US7358054B2 (cs)
EP (1) EP1423431B1 (cs)
JP (2) JP4303475B2 (cs)
KR (1) KR100927670B1 (cs)
CN (1) CN1561345B (cs)
AR (1) AR036330A1 (cs)
AT (1) ATE471344T1 (cs)
AU (1) AU2002258778C1 (cs)
BG (1) BG66334B1 (cs)
BR (1) BRPI0209792B8 (cs)
CA (1) CA2443903C (cs)
CZ (1) CZ303450B6 (cs)
DE (1) DE60236735D1 (cs)
EA (1) EA006705B1 (cs)
EE (1) EE200300509A (cs)
ES (1) ES2347532T3 (cs)
GE (1) GEP20074252B (cs)
HU (1) HUP0402250A3 (cs)
IL (3) IL158376A0 (cs)
IS (1) IS6982A (cs)
MX (1) MXPA03009390A (cs)
MY (1) MY138286A (cs)
NO (1) NO20034554L (cs)
NZ (1) NZ529494A (cs)
PL (1) PL367324A1 (cs)
SK (1) SK288124B6 (cs)
UA (1) UA83791C2 (cs)
WO (1) WO2002083854A2 (cs)
YU (1) YU80903A (cs)

Families Citing this family (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
DK1488806T3 (en) * 1999-06-01 2016-02-08 Biogen Ma Inc Blocking monoclonal antibody to VLA-1 and its use in the treatment of vascular disorders
AU2002258778C1 (en) 2001-04-13 2008-12-04 Biogen Ma Inc. Antibodies to VLA-1
NZ535425A (en) 2002-03-13 2008-05-30 Biogen Idec Inc Anti-alphavbeta6 antibodies
US20080038824A1 (en) * 2004-01-29 2008-02-14 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Composition and Method for Elevating Gene Transfer Efficiency
EP3050963B1 (en) 2005-03-31 2019-09-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for production of polypeptide by regulation of assembly
WO2006124269A2 (en) * 2005-05-16 2006-11-23 Amgen Fremont Inc. Human monoclonal antibodies that bind to very late antigen-1 for the treatment of inflammation and other disorders
WO2006133286A2 (en) * 2005-06-07 2006-12-14 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Treatment of tnf antagonist-resistant inflammatory disorders and related methods
CN104072614B (zh) 2005-07-08 2017-04-26 生物基因Ma公司 抗-αvβ6 抗体及其用途
CN105177091A (zh) * 2006-03-31 2015-12-23 中外制药株式会社 用于纯化双特异性抗体的抗体修饰方法
JP5624276B2 (ja) * 2006-03-31 2014-11-12 中外製薬株式会社 抗体の血中動態を制御する方法
AU2013204572B2 (en) * 2006-05-25 2015-06-18 Biogen Ma Inc. Methods of Treating Stroke
EP2034830B1 (en) * 2006-05-25 2014-09-03 Biogen Idec MA Inc. Anti-vla-1 antibody for treating stroke
EA200970108A1 (ru) 2006-07-10 2009-12-30 Байоджен Айдек Ма Инк. Композиции и способы для ингибирования роста smad4-дефицитных форм рака
EP1878747A1 (en) 2006-07-11 2008-01-16 greenovation Biotech GmbH Glyco-engineered antibodies
EP2031064A1 (de) * 2007-08-29 2009-03-04 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG Verfahren zur Steigerung von Proteintitern
AU2008304748C1 (en) * 2007-09-26 2014-06-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant region
CA2700701C (en) 2007-09-26 2020-12-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in cdr
EP3095862B9 (en) 2007-12-05 2021-04-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-nr10 antibody and use thereof
MY195714A (en) 2008-04-11 2023-02-07 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-Binding Molecule Capable of Binding to Two or More Antigen Molecules Repeatedly
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
CA2742786A1 (en) * 2008-11-13 2010-05-20 Femta Pharmaceuticals, Inc. Humanized anti-il-6 antibodies
EP2409990A4 (en) 2009-03-19 2013-01-23 Chugai Pharmaceutical Co Ltd VARIANT OF A CONSTANT ANTIBODY REGION
US9228017B2 (en) 2009-03-19 2016-01-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
AU2010248365A1 (en) 2009-05-15 2011-12-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-AXL antibody
EP2481752B1 (en) 2009-09-24 2016-11-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
IN2012DN02604A (cs) * 2009-10-23 2015-09-04 Millennium Pharm Inc
EP2543730B1 (en) 2010-03-04 2018-10-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
DK2644698T3 (en) 2010-11-17 2018-01-22 Chugai Pharmaceutical Co Ltd MULTI-SPECIFIC ANTIGEN-BINDING MOLECULE WITH ALTERNATIVE FUNCTION TO BLOOD COAGULATION FACTOR FUNCTION VIII
RU2642318C2 (ru) 2010-11-30 2018-01-24 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антигенсвязывающая молекула, способная многократно связываться с множеством антигенных молекул
CA2824089A1 (en) * 2011-02-03 2012-08-09 Santarus, Inc. Selection and treatment of subjects
LT3075745T (lt) 2011-02-10 2018-11-26 Roche Glycart Ag Mutavę interleukino-2 polipeptidai
JP6032818B2 (ja) 2011-02-25 2016-11-30 中外製薬株式会社 ＦｃγＲＩＩｂ特異的Ｆｃ抗体
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
TW201817744A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
WO2013047748A1 (ja) 2011-09-30 2013-04-04 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
NZ629204A (en) 2012-02-16 2016-09-30 Santarus Inc Anti-vla1 (cd49a) antibody pharmaceutical compositions
AU2013251312B2 (en) 2012-04-27 2018-03-22 Takeda Pharmaceutical Company Limited Anti-GCC antibody molecules and use of same to test for susceptibility to GCC-targeted therapy
NZ714549A (en) 2012-04-30 2016-10-28 Biocon Ltd Targeted/immunomodulatory fusion proteins and methods for making same
AU2013288641B2 (en) 2012-07-13 2017-07-06 Roche Glycart Ag Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies and their use in the treatment of ocular vascular diseases
BR112015022733B1 (pt) * 2013-03-12 2023-02-14 Biocon Ltd Proteínas de fusão imunomoduladoras e métodos para a produção das mesmas
US10035859B2 (en) 2013-03-15 2018-07-31 Biogen Ma Inc. Anti-alpha V beta 6 antibodies and uses thereof
WO2014143739A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Biogen Idec Ma Inc. Anti-alpha v beta 6 antibodies and uses thereof
SG10201803449VA (en) 2013-09-27 2018-05-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for producing polypeptide heteromultimer
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
SG10201710322VA (en) 2014-12-19 2018-02-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-c5 antibodies and methods of use
TWI808330B (zh) 2014-12-19 2023-07-11 日商中外製藥股份有限公司 抗肌抑素之抗體、含變異Fc區域之多胜肽及使用方法
AU2016216079A1 (en) 2015-02-05 2017-07-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibodies comprising an ion concentration dependent antigen-binding domain, Fc region variants, IL-8-binding antibodies, and uses therof
CN107249637A (zh) 2015-02-27 2017-10-13 中外制药株式会社 用于治疗il‑6相关疾病的组合物
EP3279216A4 (en) 2015-04-01 2019-06-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha PROCESS FOR PREPARING POLYPEPTIDE HETERO OLIGOMER
JP7141336B2 (ja) 2015-12-25 2022-09-22 中外製薬株式会社 抗ミオスタチン抗体および使用方法
EP3398965A4 (en) 2015-12-28 2019-09-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha METHOD FOR PROMOTING THE EFFICIENCY OF CLEANING POLYPEPTIDE WITH FC REGION
TW202342540A (zh) 2016-03-14 2023-11-01 日商中外製藥股份有限公司 用於癌之治療的細胞傷害誘導治療劑
JP6527643B2 (ja) 2016-08-05 2019-06-05 中外製薬株式会社 Ｉｌ−８関連疾患の治療用又は予防用組成物
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
EP3620531A4 (en) 2017-05-02 2021-03-17 National Center of Neurology and Psychiatry METHOD OF PREDICTION AND EVALUATION OF THERAPEUTIC EFFECT IN DISEASES RELATING TO IL-6 AND NEUTROPHILS
EP3655011A4 (en) * 2017-07-20 2021-03-31 University Of Virginia Patent Foundation PROCEDURES FOR THE TREATMENT OR PREVENTION OF A NEUROLOGICAL DISORDER OF THE IMMUNE SYSTEM
CR20200229A (es) 2017-11-01 2020-07-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Variantes e isoformas de anticuerpos con actividad biológica reducida
KR20200132938A (ko) 2018-03-15 2020-11-25 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 지카 바이러스에 대해 교차-반응성을 갖는 항-뎅기 바이러스 항체 및 사용 방법
WO2020150214A1 (en) * 2019-01-14 2020-07-23 University Of Virginia Patent Foundation Use of integrin inhibitors for treatment or prevention of a neurological immunity disorder and/or nervous system injury
CA3154710A1 (en) 2019-10-04 2021-04-08 TAE Life Sciences Antibody compositions comprising fc mutations and site-specific conjugation properties
GB2595299B (en) 2020-05-21 2022-08-03 Mabsolve Ltd Modified immunoglobulin FC regions

Family Cites Families (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
JP3101690B2 (ja) * 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
WO1991010737A1 (en) * 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US6673986B1 (en) * 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) * 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) * 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5789650A (en) * 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5391481A (en) * 1990-08-31 1995-02-21 The Trustees Of Columbia University Antibody which is directed against and inhibits collagen binding to a VLA-1 epitope and uses thereof
US5871907A (en) * 1991-05-15 1999-02-16 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
ES2136092T3 (es) * 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
ATE150319T1 (de) 1992-01-13 1997-04-15 Biogen Inc Behandlung von asthma
US5733743A (en) * 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US6307026B1 (en) * 1992-12-10 2001-10-23 Celltech Limited Humanized antibodies directed against A33 antigen
CA2153692C (en) 1993-01-12 2011-11-08 Roy R. Lobb Recombinant anti-vla4 antibody molecules
CA2155303C (en) 1993-02-09 2010-04-20 Linda C. Burkly Treatment for insulin dependent diabetes
US6111598A (en) * 1993-11-12 2000-08-29 Peveo, Inc. System and method for producing and displaying spectrally-multiplexed images of three-dimensional imagery for use in flicker-free stereoscopic viewing thereof
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US5840299A (en) 1994-01-25 1998-11-24 Athena Neurosciences, Inc. Humanized antibodies against leukocyte adhesion molecule VLA-4
PT804237E (pt) 1994-01-25 2006-10-31 Elan Pharm Inc Anticorpos humanizados contra a molecula de adesao leucocitaria vla-4
WO1995028961A1 (fr) * 1994-04-26 1995-11-02 Kanebo, Ltd. Medicament pour polyarthrite rhumatoide
JPH08131185A (ja) 1994-11-14 1996-05-28 Sumitomo Electric Ind Ltd マウスｖｌａ−１分子に対するモノクローナル抗体
JPH08160972A (ja) 1994-12-01 1996-06-21 Sega Enterp Ltd エフェクト制御方法、制御装置およびこれを利用したカラオケ装置
CA2219486A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
GB9516399D0 (en) 1995-08-10 1995-10-11 Camelot Superabsorbents Ltd Process for the production of water-absorbing compositions
WO1997008320A1 (en) * 1995-08-18 1997-03-06 Morphosys Gesellschaft Für Proteinoptimierung Mbh Protein/(poly)peptide libraries
WO1997007671A1 (fr) 1995-08-29 1997-03-06 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Animal chimerique et procede de constitution
DE19534177A1 (de) * 1995-09-15 1997-03-20 Merck Patent Gmbh Cyclische Adhäsionsinhibitoren
GB9519667D0 (en) 1995-09-27 1995-11-29 Univ Manchester Pharmaceutical composition
DE19541844C1 (de) * 1995-11-09 1997-07-24 Gsf Forschungszentrum Umwelt Verfahren zur Herstellung von menschlichen Antikörpern und deren Verwendung
US6127524A (en) * 1996-10-18 2000-10-03 Dade Behring Inc. Binding molecules and computer-based methods of increasing the binding affinity thereof
WO1998024893A2 (en) 1996-12-03 1998-06-11 Abgenix, Inc. TRANSGENIC MAMMALS HAVING HUMAN IG LOCI INCLUDING PLURAL VH AND Vλ REGIONS AND ANTIBODIES PRODUCED THEREFROM
CA2292730C (en) 1997-06-13 2008-09-16 Genentech, Inc. Stabilized antibody formulation
HUP0202048A3 (en) 1998-05-22 2006-11-28 Boys Town Nat Res Hospital Oma Use of alpha1betha1 integrin receptor inhibitors and tgf-betha1 inhibitors in the treatment of kidney disease
DE19831710A1 (de) * 1998-07-15 2000-01-20 Merck Patent Gmbh Diacylhydrazinderivate
HK1039341A1 (zh) 1998-10-06 2002-04-19 Biogen Idec Ma Inc. α1β1合成(「α1β1」)I-领域的结晶体及其使用
AU783054B2 (en) * 1999-04-22 2005-09-22 Biogen Ma Inc. Method for the treatment of fibrosis using an antagonist of the integrin alpha-4 subunit
DK1488806T3 (en) 1999-06-01 2016-02-08 Biogen Ma Inc Blocking monoclonal antibody to VLA-1 and its use in the treatment of vascular disorders
JP2003502094A (ja) 1999-06-17 2003-01-21 デジンガー カイ 侵害を最小限にした組織採取のための外科用ゾンデ
AU4259901A (en) 2000-03-28 2001-10-08 Cambridge University Technical Services Limited Receptor/peptide crystal structure for identification of inhibitors
US8288322B2 (en) 2000-04-17 2012-10-16 Dyax Corp. Methods of constructing libraries comprising displayed and/or expressed members of a diverse family of peptides, polypeptides or proteins and the novel libraries
DE10028402A1 (de) 2000-06-13 2001-12-20 Merck Patent Gmbh Pyridin-2-yl-aminoalkycarbonylglycyl-beta-alanin und Derivate
US7153944B2 (en) 2000-07-31 2006-12-26 The General Hospital Corporation High affinity integrin polypeptides and uses thereof
AU2002258778C1 (en) 2001-04-13 2008-12-04 Biogen Ma Inc. Antibodies to VLA-1
AU2003215298A1 (en) 2002-02-14 2003-09-04 Biogen, Inc. Alpha1beta1 antagonists for treatment of atherosclerosis
EP1546203B1 (en) 2002-08-01 2012-06-20 Immunomedics, Inc. Alpha-fetoprotein immu31 antibodies and fusion proteins and methods of use thereof
US20040208870A1 (en) 2003-01-30 2004-10-21 Medimmune, Inc. Stabilized high concentration anti-integrin alphanubeta3 antibody formulations
WO2005016883A2 (en) 2003-08-14 2005-02-24 Icos Corporation Acrylamide derivatives as vla-1 integrin antagonists and uses thereof
WO2005019200A2 (en) 2003-08-14 2005-03-03 Icos Corporation Aryl piperidine derivatives as vla-1 integrin antagonists and uses thereof
US7285530B2 (en) 2004-10-21 2007-10-23 Viron Therapeutics, Inc. Use of SERP-1 as an antiplatelet agent
WO2006124269A2 (en) 2005-05-16 2006-11-23 Amgen Fremont Inc. Human monoclonal antibodies that bind to very late antigen-1 for the treatment of inflammation and other disorders
WO2006133286A2 (en) 2005-06-07 2006-12-14 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Treatment of tnf antagonist-resistant inflammatory disorders and related methods
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
MY149159A (en) 2005-11-15 2013-07-31 Hoffmann La Roche Method for treating joint damage
US20080118496A1 (en) 2006-04-10 2008-05-22 Medich John R Uses and compositions for treatment of juvenile rheumatoid arthritis
JO3324B1 (ar) 2006-04-21 2019-03-13 Amgen Inc مركبات علاجية مجففة بالتبريد تتعلق بالعصارة الهضمية
EP2034830B1 (en) 2006-05-25 2014-09-03 Biogen Idec MA Inc. Anti-vla-1 antibody for treating stroke
JP4951596B2 (ja) 2008-07-31 2012-06-13 株式会社日立製作所 冷却システム及び電子装置
TW201039854A (en) 2009-03-06 2010-11-16 Genentech Inc Antibody formulation
RU2017102553A (ru) 2009-12-21 2018-12-19 Дженентек, Инк. Состав, содержащий антитело
CA2824089A1 (en) 2011-02-03 2012-08-09 Santarus, Inc. Selection and treatment of subjects
EP2804208A4 (en) 2012-01-11 2015-07-29 Panasonic Ip Man Co Ltd PRESSURE CONTACT SEMICONDUCTOR DEVICE AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF
NZ629204A (en) 2012-02-16 2016-09-30 Santarus Inc Anti-vla1 (cd49a) antibody pharmaceutical compositions

Also Published As

Publication number Publication date
BG66334B1 (bg) 2013-06-28
NZ529494A (en) 2005-08-26
US20040081651A1 (en) 2004-04-29
DE60236735D1 (de) 2010-07-29
NO20034554D0 (no) 2003-10-10
US7358054B2 (en) 2008-04-15
US20110189177A1 (en) 2011-08-04
YU80903A (sh) 2006-05-25
WO2002083854A9 (en) 2003-11-06
BRPI0209792B8 (pt) 2021-05-25
AU2002258778C1 (en) 2008-12-04
CA2443903A1 (en) 2002-10-24
IL213564A0 (en) 2011-07-31
EE200300509A (et) 2004-08-16
CZ303450B6 (cs) 2012-09-19
US9644030B2 (en) 2017-05-09
BR0209792A (pt) 2005-04-26
US10336826B2 (en) 2019-07-02
US20100272716A1 (en) 2010-10-28
SK13742003A3 (sk) 2004-07-07
ES2347532T3 (es) 2010-11-02
US7723073B2 (en) 2010-05-25
WO2002083854A3 (en) 2004-04-08
US20120177638A1 (en) 2012-07-12
US20170335000A1 (en) 2017-11-23
NO20034554L (no) 2003-12-15
CN1561345A (zh) 2005-01-05
ATE471344T1 (de) 2010-07-15
US20090010930A1 (en) 2009-01-08
EA006705B1 (ru) 2006-02-24
AU2002258778A2 (en) 2002-10-28
AR036330A1 (es) 2004-09-01
CN1561345B (zh) 2011-09-14
US20150299323A1 (en) 2015-10-22
EP1423431B1 (en) 2010-06-16
IS6982A (is) 2003-10-08
BRPI0209792B1 (pt) 2017-03-28
MXPA03009390A (es) 2004-01-29
EP1423431A4 (en) 2005-04-27
KR20040062879A (ko) 2004-07-09
CA2443903C (en) 2018-03-20
MY138286A (en) 2009-05-29
IL213564B (en) 2018-06-28
BG108340A (bg) 2004-10-29
WO2002083854A2 (en) 2002-10-24
JP4303475B2 (ja) 2009-07-29
JP2004536580A (ja) 2004-12-09
HUP0402250A3 (en) 2007-06-28
IL158376A0 (en) 2004-05-12
US7910099B2 (en) 2011-03-22
KR100927670B1 (ko) 2009-11-20
HUP0402250A2 (hu) 2005-01-28
EP1423431A2 (en) 2004-06-02
JP2009079047A (ja) 2009-04-16
AU2002258778B2 (en) 2008-01-17
GEP20074252B (en) 2007-12-10
SK288124B6 (sk) 2013-09-03
EA200301117A1 (ru) 2004-08-26
UA83791C2 (ru) 2008-08-26
US8084028B2 (en) 2011-12-27
PL367324A1 (en) 2005-02-21
IL158376A (en) 2011-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10336826B2 (en) Antibodies to VLA-1
AU2002258778A1 (en) Antibodies to VLA-1
US20120087925A1 (en) Method for the treatment of inflammatory disorders
ZA200308568B (en) Antibodies to VLA-1.
HK1112193A (en) A blocking monoclonal antibody to vla-1 and its use for the treatment of inflammatory disorders

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20210412