SK13742003A3 - Protilátky k VLA-1, kompozície obsahujúce tieto protilátky, nukleové kyseliny kódujúce tieto protilátky a hybridómy, ktoré ich produkujú - Google Patents

Protilátky k VLA-1, kompozície obsahujúce tieto protilátky, nukleové kyseliny kódujúce tieto protilátky a hybridómy, ktoré ich produkujú Download PDF

Info

Publication number
SK13742003A3
SK13742003A3 SK1374-2003A SK13742003A SK13742003A3 SK 13742003 A3 SK13742003 A3 SK 13742003A3 SK 13742003 A SK13742003 A SK 13742003A SK 13742003 A3 SK13742003 A3 SK 13742003A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
domain
antibody
machine
residues
amino acid
Prior art date
Application number
SK1374-2003A
Other languages
English (en)
Other versions
SK288124B6 (sk
Inventor
Paul D. Lyne
Ellen A. Garber
Jose W. Saldanha
Michael Karpusas
Original Assignee
Biogen, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen, Inc. filed Critical Biogen, Inc.
Publication of SK13742003A3 publication Critical patent/SK13742003A3/sk
Publication of SK288124B6 publication Critical patent/SK288124B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C07K16/2842—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta1-subunit-containing molecules, e.g. CD29, CD49
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/06—Antimigraine agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)

Description

Oblasť techniky
Predkladaný vynález sa týka prcrilátok k integrínu VLA-1 a použitia týchto protilátok na prípravu liečiva na liečenie zápalových ochorení a ďalších imunologických porúch. Vynález sa tiež týka kryštálovej štruktúry komplexu vytvoreného jednou takouto protilátkou a al-I doménou VLA-1, a ďalej použitia týchto štruktúrnych informácií na počítačové navrhovanie liečiv.
Doterajší stav techniky
Integríny tvoria superrodinu receptorov bunkového povrchu, ktoré sprostredkovávajú adhéziu bunka-bunka a bunka-matrix. Tieto proteíny sú známe tým, že poskytujú ukotvenie a tiež signály pre bunkový rast, migráciu a diferenciáciu počas vývoja a regenerácie tkanív. Predpokladá sa, že sa tiež podieľajú na imunitných a zápalových procesoch. Integríny sú heterodimérne proteíny zložené z dvoch nekovalentne spojených polypeptidových reťazcov, a a β. Aminokoniec každého reťazca vytvára guľovitú „hlavu, ktorá prispieva k medzireťazcovej väzbe a k väzbe ligandu. Tieto guľovité hlavy sú pripojené k transmembránovým segmentom tzv. „stonky. Cytoplazmatické „chvostíky sú dlhé zvyčajne menej ako 50 aminokyselinových zvyškov. Integrínové subrodiny boli pôvodne definované na základe toho, že β podjednotka sa použila na vznik heterodimérov. Integríny obsahujúce βΐ sa tiež nazývajú VLA molekuly, čo súvisí so vzťahom k antigénom veľmi neskorej aktivácie („very late activation). Označenia VLA-1 až VLA-6 sa týkajú subrodiny obsahujúcej od az a6 (t.j. CD49a až CC49f), v danom ooradí. Pre všeobecný prehľad pozri napr. Cellular and Volecular Immunolcgy, eds. Abul K. Abbas et al., W. B. Sannoers Company, ahiiadelphia, BA, 2000.
Kolagén (tak typ I ako aj typ ZV) a laminin sú známe Ugandy αϊβΐ integrír.u (t.j. VLA-1). Predpokladá sa, že VLA-1 sa podieľa na bunkovej adhézii a migrácii na kolagéne (Keely et al., 1995, J. Celí Sci. 103: 595-507, Gotvais et al., 1996,J. Clin. Invest. 97: 469-2477), podporuje kontraxcie a reorganizáciu kolagénovej matrice, je rozhodujúcim komponentom pri hojení rán (Gotwaís et al., vyššie a Chiro, 1991,Celí 6^: 403-410), a zúčastňuje sa riadenia expresie génov zapojených do reorganizácie extracelulárneho matríxu (Riikonen et al., 1995, J. Biol. Chem. 270: 1-5, and Langholz et al., 1 995, J. Celí Biol. 131: 1903-1915). Takže nesprávna regulácia VLA-1 môže spôsobiť určité patologické stavy, axo )s napríklad žibróza.
Navyše sa tiež navrhlo, že VLA-1 by mohol hrať úlohu v ochoreniach, ktoré sú spôsobené z lymfocyrmi/monocytmi. AntiVLA-1 protilátky blokujú expresiu cytokínu závislú na T lymfocytoch (Miyake et al., 1993, J. Exp. Ved. 177: 863-868). Expresia VLA-1 je zvýšená u perzistentr.e aktivovaných, 2 až 4 týždne starých, kultivovaných T lymfccytoch (Hemler et al·., 1985, Eur. J. Immunol. 15: 502-508). VLA-1 sa tiež exprimuje na vysokom percente T lymzccytov izolovaných zo synovia pacientov s reumatoidnou artritídou (Hemler et al., 1986, ú. Clm. Invest. 78: 692-702).
Určilo sa niekolko kryštálových štruktúr integrínovej podjednotky a, vrátane štruktúry domény o2-l z ο2β1 (PDB prístupový kód laox, Emsley et al., 1997 , V. Biol. Cnem. 2/2: 28512-28517), od-I domény z potkanieho οΐβΐ (?DB prístupový kód lck4, Nočte et al., 1999, FEBS Lett. 452: 375-385, WO00/20459), al podjednotky ľudského αϊβΐ (PDB prístupový kód lqc5, Ruch et al., 1999,J. Biol. Chem. 274: 24906-24913), aL-I a aM-I domén a vWF-A3 (Lee et al., 1995,Celí 80: 631-635, Lee et al., 1995,
Structure 3: 1333-1340, Q'.: et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10277-10281, Qu et al·., 1996, Structure 4:931- 942).
Zistilo sa , že štruktúra α2β! je závitnica (helix) (t.j. Chelix) , ktorá tvorí zárez alebo ryhu na jednej strar.e proteínu vo väzbovom mieste pre ión kovu (Emsley et al., supra).
Kryštálová štruktúra a2-I domény v komplexe s krátkym trojzávitnicovým peptidom na báze kolagénu odhalila, že peptid na báze kolagénu sa viazal k zárezu, kde aminokyseliny a2-I, ktoré vytvárali intermolekulové kontakty alebo kontakty s kovom, boli AsplSl, Asnl54, Tyrl57, Gln215, Asp219, Leu220, Thr221, Asp254, Glu256, His258, Tyr285, Leu286, Asn289, Leu291, Asn295 a Lys298 (PDB prístupový kód ldzi, Emsley et al., 2000, Celí 101: 47-56, WO01/73444). Bezprostredne vyššie uvedené číslovanie aminokyselín je založené na sekvencii s PDB prístupovým kódom ldzi, a v tomto texte sa naňho ďalej odkazuje ako na „kryštálové číslovanie. Kryštálové štruktúry c<i-I domén laboratórneho potkana a človeka vykazovali podobné zárezy.
Podstata vynálezu
Predkladaný vynález poskytuje protilátky anti-VLA-1, a ďalej sa týka použitia týchto protilátok pri liečení celého radu zápalových a imunologických ochorení.
Konkrétne sa vynález týka protilátky, ktorá sa špecificky viaže k VLA-1 (napr. ludskému VLA-L). Táto protilátka obsahuje úseky určujúce komplementaritu (CDR) ľahkého reťazca definované aminokyselinovými zvyškami 24 až 33, 49 aš 55 a 88 až 96 zo sekvencie uvedenej v zozname sekvencií aso SEQ ID NO: 1, a/alebo úseky určujúce komplementaritu ťažkého reťazca definované aminokyselr.nový.mi zvyškami 31 až 35, 50 až 65 a 98 až 107 zo sekvencie uvecenej zu v zozname sekvencií ako SEQ ID NO: 2. Tieto úseky CDR môže obsahovať mutácie (napr. delécie, inzercie a/alebo substitúcie) v častiach, ktoré me sú v rontakte s antigénom, ako sa určilo z kryštálovej štruktúry opísanej v tomto texte, pričom by to neovplyvnilo VLA-l-väzbcvú aktivitu protilátky. Príklady takýchto mutácií sú S24N, G92S a D131A v CDR ľahkého reťazca a G55S v CDR2 ťažkého reťazca. V jednom uskutočnení protilátka podlá vynálezu obsahuje sekvenciu SEQ ID NO: 1 variabilnej domény ľahkého reťazca a/aiebo sekvenciu SEQ TD NO: 2 variabilnej domény ťažkého reťazca.
V príouznom uskutočnení protilátka podľa vynálezu obsahuje rovnakú polypeptidovú sekvenciu ťažkého a ľahkého reťazca ako protilátka produkovaná hybrrdómom mAQC2, ktorý sa uložil 18.
apríla 20G1 v Americkej zbierke mikroorganizmov (American Type Culture Collection, ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) a má ATCC prístupové číslo PTA3273.
(Všetky u v zmysle ; produkovať obsahujú hybridómu,
Vozenia v ATCC c Budapeštianskej z; : napríklad ny'cr sekvenciu r.uklec iísane v tomto texte sa uskutočnili Vuvy) . Táto protilátka sa môže teda idemom mAQC2 alebo bunkami, ktoré vej kyseliny izolovanú z uvedeného ktorá kóduje ťažký a lahký reťazec monoklonálnej protilátky mAQC2.
V ďalšom uskutočnení vynálezu protilátka je humanizovaná protilátka obsahujúca aspoň jeden (napr. 2, 3, 4 alebo 5) z nasledujúcich zvyškov v svojom ľahkom reťazci: Ql, L4, P46,
W47 a V71, alebo aspoň jeosn (napr. 2, 3, 4, 5, 6 alebo 7) z nasledujúcich zvyškov v svojom ťažkom reťazci: Dl, V12, S28,
F29, A49, 193, R94 (číslovanie zodpovedá konvencii podľa
Kabata) . Napríklad protilátka obsahuje Ql, L4 a Y71 v ľahkom reťazci a/alebo (i) .F29, A49, T93 a R94 alebo (ii) A49 a T93
-r v ťažkom reťazec.
Humanizované protilátka podlá predkladaného vynálezu môže obsahovať sekvenciu variabilnej domény ľahkého reťazca definovanú aminokyselinovými zvyškami 1 až 106 zo SEQ ID NO: 3 a/alebo sekvenciu variabilnej dorr.ény ťažkého reťazca definovanú aminokyselinovými zvyškami 1 až 118 zo SEQ ID NO: 4. Humanizované protilátka môže obsahovať rovnaké polypeptidové sekvencie ťažkého a/alebo ľahkého reťazca ako protilátka produkovaná bunkovou líniou hAQC2 (ATCC prístupové číslo PTA3275, vzorka uložená 18. apríla 2001).
V ďalšom uskutočnení humanizované protilátka podľa vynálezu môže obsahovať mutáciu (napr. deléciu, substitúciu aleoo adíciu) v jednej alebo viacerých (napr. 2, 3, 4, 5, 6, 7 alebo 8) určitých polohách ťažkého reťazca, takže efektorová funkcia protilátky (napr. schopnosť protilátky viazať sa k Fc receptoru alebo faktoru komplementu) je zmenená, pričom sa neovplyvní schopnosť protilátky viazať sa k VLA-1 (U. S. Patent 5 648 260). Tieto polohy v ťažkom reťazci zahrnujú, pričom ich zoznam nie je limitujúci, zvyškami 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 a 322 (systém, číslovania EU) . Humanizované protilátka môže napríklad obsahovať mutácie L234A (t.j. leucín v polohe 234 nemodifikovanej protilátky je nahradený alanínom) a L235A (systém číslovania EU) v ťažkom reťazci. V jednom príbuznom uskutočnení protilátka obsahuje rovnakú polypeptidovú sekvenciu ťažkého reťazca ako protilátka produkovaná bunkovou líniou hsAQC2 (ATCC prístupové číslo PTA3356, vzorka uložená 4. mája 2001) .
V ešte ďalšom uskutočnení humanizované protilátka podľa vynálezu môže obsahovať mutáciu (napr. deléciu alebo substitúciu) v aminokyselinovom zvyšku, ktorý je miestom pre glykozyláciu, takže glykozylačné miesto sa odstráni. Takáto protilátka môže byť klinicky výhodná tým, že má redukovanú efektorovú funkciu alebo ďalšie nežiaduce funkcie, pričom si udržiava svoju väzbovú afinitu pre VLA-1. Mutácie glykozylačného miesta môžu byť tiež výhodné pre vývoj postupov spracovania (napr. expresie proteínu a jeho purifikácie). Napríklad ťažký reťazec protilátky môže obsahovať mutáciu N237Q (systém c^s^ovania Eu/ r taz.že takýto tužky reťazec sa nemôže giykozymovat v tomto mieste. V jednom príouznom uskutočnení humanizované protilátka môže obsahovať rovnakú polypeptidová sekvenciu ťažkého reťazca ako protilátka produkovaná ounkovcu líniou haAQ02 (ATCC prístupové číslo PTA3274, vzorka uložená 18. apríla 2001(.
V ešte ďalšom uskutočnení ťažký a/alebo lahký reťazec protilátky podlá vynálezu obsahuje mutácie, ktoré zvyšujú afinitu väzby k VLA1 a preto zvyšujú účinnosť pre liečenie VLA-l-sprostredkovaných chorobných stavov.
Predkladaný vynález ďalej zahrnuje kompozíciu obsahujúcu protilátku podlá vynálezu a farmaceutický prijatelný nosič, izolovanú nukleovú kyselinu obsahujúcu kódujúcu sekvenciu pre
SEQ ID NO: 1, izolovanú nukleovú kyselinu obsahujúcu kódujúcu
sekvenciu pre SEQ ID NO: 2, izolovanú nukleovú kyselinu
obsahujúcu kódujúcu sekvenciu pre lahký reťazec p r o 111 á t k y
produkovaný hyoridómom mAQC2, izolovanú nukleovú kyselinu
obsahuj úcu kódujúcu sekvenciu pre ťažký reťazec protilátky
produkovaný hybridómom mAQC2, izolovanú nukleovú kyselinu
obsahuj úcu xódujúcu sekvenciu pre lahký reťazec prctilá tky
produkovaný bunkovou líniou hÄQC2, izolovanú nukleovú kyselinu obsahujúcu kódujúcu sekvenciu pre ťažký reťazec protilátky produkovaný bunkovou líniou hAQC2, izolovanú nukleovú kyselinu obsahujúcu kódujúcu sekvenciu pre ťažký reťazec protilátky produkovaný bunkovou líniou haAQC2, izolovanú nukleovú kyselinu obsahujúcu kódujúcu sekvenciu pre ťažký reťazec protilátky produkovaný bunkovou líniou hsAQC2, izolovanú nukleovú kyselinu obsahujúcu kódujúcu sekvenciu pre zvyšky 1 až 106 zo sekvencie SEQ ΙΕ KO: 3, izolovanú nukleovú kyselinu obsahujúcu kódujúcu sekvenciu pre zvyšky 1 až 118 zo sekvencie SEQ ID NO: 4, bunky hybridómu mAQC2, bunky z bunkovej línie hAQC2, bunky z bunkovej línie haAQC2 a bunky z bunkovej línie hsAQC2.
Predkladaný vynález sa tiež týka liečenia pacienta s imunologickým ochorením sprostredkovaným VLA-1, ktorého liečenie spočíva v tom, že sa pacientovi podáva účinné množstvo protilátky pcdla vynálezu. Napríklad sa tento spôsob používa pri liečení humánnych pacientov na zmiernenie, zlepšenie, stabilizovanie, reverziu, zabránenie, spomalenie alebo zdržanie priebehu ochorení. Inak sa tento spôsob používa profylaktický na liečbu humánnych pacientov, ktorí sú v nebezpečenstve, že sa u nich vyvinie toto imunologické ochorenie, a to buď na prevenciu alebo na oneskorenie nástupu ochorenia. Účinné množstvo prípravku sa môže podať v jednej alebo vo viacerých dávkach.
K imunologickým ochoreniami sprostredkovaným VLA-1 patria, pričom však tento zoznam nie je obmedzený, chorobné stavy, pri ktorých je hladina VLA-1 aktivity zvýšená v jednej alebo vo viacerých tkanivách v porovnaní s normálnym zdravým jedincom. Príklady takýchto chorobných stavov sú stavy príbuzné kožným chorobám (napr. psoriáza, ekzém, popáleniny, dermatitída a abnormálna proliferácia buniek vlasových vačkov), fibróza (napr. obličiek alebo pľúcna fibróza), alergická rinitída, syndróm respiračného distresu (ťažkosti s dýchaním), astma, bronchitída, tendinitída, burzitída, horúčka, migrény, gastromtestinálne ochorenia (napr. zápalové ochorenie čriev, Crohnova choroba, gastritída, syndróm dráždivého kólonu, kolitída a kolorektálny karcinóm), vaskulárne ochorenia (napr. ateroskleróza), nodózna períarteritída, tyroiditída, aplastická anémia, Hodgkinova choroba, reumatická horúčka, osteoartrítída, autoimúnne choroby (napr. diabetes typu I, ťažká myasténia, reumatoidná artritída, systémový lupus erythematosus a skleróza multiplex) , sarkoidóza, nefrotický syndróm, renálne zlyhanie, Bechetov syndróm, polymyozitída, gingivitída, precitlivelosť (napr. oneskorený typ hypersenzitívity alebo okamžitá hypersenzitivita), rejekcia štepu a transplantátu, ochorenie spôsobené reakciou štepu proti hostiteľovi (GVHD) , konjunktivi t ída, opuchy nastávajúce po poranení, ischémia myokardu a syndróm endotoxínového šeku.
Predkladaný vynález tiež poskytuje spôsob na určenie hladiny VLA-1 v tkanive (napr. vzorke tkaniva a telovej tekutiny), ktorý zahrnuje krok, keď sa tkanivo privedie do kontaktu (napr. in vivo alebo in vitro) s protilátkou podľa vynálezu a potom sa deteguje väzba protilátky k tkanivu, čím sa určí hladina VLA-1 v tkanive.
Ako sa v tomto texte používa termín protilátka podlá vynálezu, môže to byť napríklad myšacia protilátka, humanizované protilátka alebo chimérna protilátka. Môže to byť celá protilátka (t.j. s dvoma kompletnými ľahkými reťazcami a dvoma kompletnými ťažkými reťazcami) ktoréhokoľvek izotycu a pedtypu (napr. IgM, IgD, IgG, lgG2, igG3, igG4, TgE, IgA a IgAz, s ľahkým reťazcom buď typu kappa alebo lambda). Inak sa termín protilátka podľa vynálezu tiež týka antigén-väzocvébo fragmentu (napr. Fab, F (ab')2 a jednoduchého reťazca Fv) z celej protilátky.
Predkladaný kompozície a vynález kryštály ďalej poskytuje kryšcalizovatelné komplexov vytvorených chimérnou
Vynález tiež poscytuje štruktúrne koordináty a väzbové miesta chimérnej domény a hAQC2 Fab potkaňou/Iudskou doménou (mutant Ρ.ΔΗ) a rab fragmentom hAQC2, a ďalej sa vynález týka použitia týchto Kompozícií a kryštálov.
(súradnice) fragmentu. Atómové koordináty pochádzajúce z kryštálovej štruktúry opísané v tomto texte poskytujú štruktúrne východisko pre biologické aktivity h.AQC2, a tiež základ pre racionálne navrhovanie („rational design) VLA-Í agonistov alebo antagonistov s predikovanými biologickými aKtívitami (napr. zlúčenín patriacich medzi tzv. malé molekuly alebo protilátok ako napríklad hAQC2 variant).
Kryštálová štruktúra opísaná v tomto texte je prvou kryštálovou štruktúrou al-I domény z komplexu αϊβΐ integrín/Fab. Táto štruktúra ukazuje zvyšky kritické pre väzbu Fab doménou alI. Okrem toho, Fab sa viaže v predpokladanom väzbovom mieste pre kolagén a inhibuje väzbu kolagénu. Aminokyselinové zvyšky zistené vo väzbovom mieste al-I domény zahrnujú Aspl54, Serl56, Asnl57, Serl58, Tyrl60, Glul92, Glu218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His2 61, Asn263, Arg2 91 a Leu2 94 (kryštálové číslovanie). Zvyšky na Fab fragmente, o ktorých sa zistilo, že viažu al-I doménu, zahrnujú zvyšky lahkého reťazca Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 a Trp95 a zvyšky ťažkého reťazca Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO a AsplOl (kryštálové číslovanie).
Predkladaný vynález tiež poskytuje počítač na prípravu trojrozmernej reprezentácie molekulového komplexu, kde molekulový komplex je definovaný súborom štruktúrnych koordinát komplexu chimérnej domény I z αϊβΐ integrínu RÄH a humanizovanej protilátky hAQC2, podľa obr. 19, alebo homologického molekulového komplexu, kde homológ nemá hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlky od atómov hlavného reťazca aminokyseliny vyššiu ako 0,65 Ä. Počítač obsahuje strojom čitateľné médium na ukladanie údajov (pamäťové médium) vrátane údajov kódovaných so strojom čitateľnými údajmi, kde údaje obsahujú aspoň časť štruktúrnych koordinát komplexu podľa obr. 19, pracovnú pamäť na uloženie inštrukcií pre spracovanie strojom čitateľných údajov, centrálnu procesorovú jednotku spojenú s pracovnou pamäťou a s pamäťovým médiom na ukladanie strojom čitateľných údajov na spracovanie strojom čitateľných údajov do trojrozmerných reprezentácií, a displej spojený s centrálnou procesorovou jednotkou na zobrazovanie trojrozmerných reorezentácií.
Predkladá n y vynález d a 1 e j ρ c s k y c d j d p o c _ L a c ησ u r i p r a v u trojrozmernej reprezentácie molekuly alebo molekulového komplexu vrátane väzbových miest definovaných štruktúrnymi koordinátami aminokyselín h.AQC2 vrátane aspoň siedmych (napr. 7, 8, 9, 10,
11, 12, 13, 14, 15 alebo 16) zvyškov ľahkého reťazca Asn30,
Tyr48, Trp90, Ser91, Asr.93 a Trp95 a zvyškov ťažkého reťazca Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, Eis56, Tyr5 8, Phe99, Gly100 a Asp 101 (kryštálové číslovanie), podľa obr. 19, alebo homológ molekuly alebo molekulového komplexu, kde homológ obsahuje väzbové miesio, ktoré má hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlky od atómov hlavného reťazca aminokyselín hAQC2 nie vyššiu ako 1,10 Ä. Tento vynález tiež poskytuje počítač na prípravu trojrozmernej reprezentácie väzbového miesta definovaného štruktúrnym:! koordinátami nAQC2 aminokyselín vrátane aspoň siedmych (napr. 7, 8, S, 10, 11, 12, 13, 14, 15 alebo 16) zvyškov ľahkého reťazca Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 a Trp95 a zvyškov ťažkého reťazca SeroO, Arq31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, Gly100 a Asp101 (kryštálové číslovanie), podlá obr. 19, väzbového miesta homedóga, ktoré má hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlky od atómov hlavného reťazca aminokyselín hAQC2 nie vyššiu ako í,10 Á.
Predkladaný vynález tiež poskytuje spôsob identifikácie inhibítorov domény I ir.tegrínu, ktorý zahrnuje kroky použitia štruktúrnych koordinát hAQCz aminokyselín vrátane aspoň siedmych (napr. 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 alebo 16) zvyškov ľahkého reťazca Asn30, Tyr48, Trp90, Ser9i, Asn93 a Trp95 a zvyškov ťažkého reťazca Ser30, Arc31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, PheS9, GlylOO a ÄsplOl (kryštálové číslovanie), podľa obr. 19, alebo ± hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlky od atómov hlavného reťazca aminokyselín hAQC2 nie vyššiu ako 1,10 Ä, vytvorenie trojrozmernej štruktúry väzbového miesta, využitie trojrozmernej štruktúry pre návrh alebo selekciu potenciálneho antagonistu, syntézu potenciálneho antagonistu a kontaktovanie potenciálneho antagonistu s hAQC2 na určenie schopnosti potenciálneho antagonistu interagovať s hAQC2, pričom schopnosť potenciálneho antagonistu interagovať s hAQC2 ukazuje, že potenciálny antagonista je inhibítor domény I. Tento vynález ďalej poskytuje inhibítor domény I integrínu identifikovaný vyššie opísaným spôsobom.
Tento vynález tiež poskytuje počítač na prípravu trojrozmernej reprezentácie molekuly alebo molekulového komplexu obsahujúceho; väzbové miesto definované štruktúrnymi koordinátami aminokyselinových zvyškov domény I Asp 154, Serl56, Äsnl57, Serl58, Tyrl60, Glul92, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 a Leu294 (kryštálové číslovanie), podlá obr. 19, alebo homológa molekuly alebo molekulového komplexu, kde homológ zahrnuje druhé väzbové miesto, ktoré má hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlky od atómov hlavného reťazca aminokyselín domény najviac 0,65 Ä. Tento vynález tiež poskytuje počítač na prípravu trojrozmernej reprezentácie: prvého väzbového miesta definovaného štruktúrnymi koordinátami aminokyselinových zvyškov I domény Aspl54, Serl56, Asnl57, Serl58, Tyrl60, Glul92, Gln218, Arg219, Gly22Q, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 a Leu294 (kryštálové číslovanie), podľa obr. 19, alebo väzbového miesta homológa, ktorý má hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlky od atómov hlavného reťazca aminokyselín domény najviac 0,65 Ä.
Tento vynález tiež poskytuje počítač na prípravu trojrozmernej reprezentácie molekuly alebo molekulového komplexu obsahujúceho; väzbové miesto definované štruktúrnymi koordinátami aminokyselín domény I vrátane aspoň tri zvyškov Glul92, Gln218, Arg219, Gly220 a Gly221 (kryštálové číslovanie), podlá obr. 19, alebo homológa molekuly alebo molekulového' komplexu, kde homológ zahrnuje druhé väzbové miesto, ktoré má hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlky od atómov hlavného reťazca aminokyselín ľ domény najviac 1,C A. Vynález ďalej poskytuje počítač na prípravu trojrozmernej reprezentácie väzbového miesta definovaného štruktúrnymi koordinátami aminokyseliny I domény vrátane aspoň troch zvyškov z Giul92, Glr.2i8, Arg21S, Gly223 a Gly221 (kryštálové číslovanie;, podlá obr. 19, alebo väzbové miesto nomológa, ktoré má hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlky od atómov hlavného reťazca aminokyselín comény I najviac 1,0 A.
Tento vynález ďalej poskytuje spôsoby použitia trojrozmernej reprezentácie pre návrh chemických, entít, ktoré asociujú s chimérnou doménou alebo Fab fragmentom h.AQC2 alebo jeho časťou a pôsobia ako potenciálne inhibítory chimérnej domény alebo Fab fragmentu hAQC2 alebo jeho časti.
Tento vynález sa tiež týka kompozícií obsahujúcich chemické entity, ako napríklad inhibítory a varianty chimérnej domény alebo varianty Fab fragmentu nA.QC2, kde takéto chemické entity a varianty sú racionálne navrhnuté prostredníctvom štruktúrnych koordinét chimérnej domény alebo Fab fragmentu ľiA.QC2 alebo väzbových miest. Vynález sa ďalej týka použitia vyššie identifikovaných chemických zlúčenín na liečenie alebo prevenciu ochorení zoružených s nevhodnou alebo abnormálnou aktivitou αϊβΐ u pacienta.
Tento vynález ďalej poskytuje spôsob identifikácie inhibítora domény I integrínu, ktorý zahrnuje kroky, keď sa použijú štruktúrne koordináty aminokyselinových zvyškov I domény Aspl54, Ser15 6, Asnl57, Ser158, Tyr160, Glul92, Gin218, Arg219, Giy220, Gly 221, Arg222, Gln223, Thr22 4 , Asp257, His261, A,sn2 63, Arg291 a Leu294 (kryštálové číslovanie), podlá obr. 19, na vytvorenie trojrozmernej štruktúry väzbového miesta, využije trojrozmerné štruktúry pre návrh alebo selekciu potenciálneho antagonistu, syntézu potenciálneho antagonistu a kontaktuje potenciálneho antagonistu s doménou 1, aby sa určila schopnosť potenciálneho antagcnistu interagovať s doménou- I, pričom schopnosť potenciálneho antagor.istu interagovať s doménou I ukazuje, že potenciálny antagonisra je inhibítor domény I.
Predkladaný vynález tiež poskytuje spôsob identifikácie inhibítora domény I integrínu, zahrnujúci kroky použitia štruktúrnych koordinát aspoň troch aminokyselinových zvyškov z Glul92, Gln218, Arg219, Gly220 a Gly221 (kryštálové číslovanie) domény I podlá obr. 19, alebo ± hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlky od atómov aminokyselín domény I najviac 0,65 Ä, vytvorenie trojrozmernej štruktúry väzbového miesta, použitie trojrozmernej štruktúry pre návrh alebo selekciu potenciálneho antagonistu, syntézu potenciálneho antagonistu a kontaktovanie potenciálneho antagonistu s doménou I, aby sa určila schopnosť potenciálneho antagonistu interagovať s doménou I integrínu, pričom schopnosť potenciálneho antagonistu interagovať s doménou I ukazuje, že potenciálny antagonista je inhibítor domény I. Tento vynález tiež poskytuje inhibítor domény I integrínu identifikovaný týmto spôsobom.
Ďalšie vlastnosti a výhody vynálezu budú zjavné z nasledujúceho podrobného opisu, príkladov, obrázkov a nárokov.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1. Integríny αϊβΐ a α2β1 viažuce kolagén na aktivovaných leukocytoch. (A). Analýza expresie al a α2β1 integrínov na IL-2 aktivovaných splenocytoch (dll) s použitím prietokovej cytometrie. Bunky sa označili buď anti-al mAb (monoklonálnou protilátkou), anti-a2 mAb alebo neviažucou sa kontrolnou mAb (sivá čiara) a potom FITC-anti-škrečací imunoglobulín. (B) Účinok anti-a a anti-a2 mAb na adhéziu leukocytov ku kolagénu. Na 105 IL-2 aktivovaných splenocytov sa nechalo pôsobiť uvedených mAb 15 minút pred vysiatím na došzičky s jamkami potiahnutými kolagénom buď typu IV alebo typu I r.a 1 hodinu pri 37 °C. Aohézia sa vyrátala ako je uvedené v príklade 1 a vyjadrila ako % adhézie vzhíadom na kontrolné bunky opracované mAb. Testy adhézie sa uskutočnili v troch opakovaniach a uskutočnili najmenej tri nezávislé experimenty. Uvedený je jeden reprezentac ívny experiment.
Obrázok 2. Účinok anti-integrínových mAb na efektorovú fázu hypersenzioivity oneskoreného typu. SRBC-senzitizované myšr sa injikovali i. p. uvedenými mAb, a tc 1 hodinu pred SRBC výzvou („chaiienge). Hrúbka vankúšikov labky (ďalej skrátene iba labky) sa merala 20 hodín po expozícii antigénu a výsledky sú uvedené ako % zvýšenie hrúbky ± stredná cnyba priemeru (SEM), ako je uvedené v príklade 2. Dáta predstavujú súhrn z ôsmych experimentov s n = 79 (PBS), 68 (kontrolný Ig škrečka), 68 (anti-al), 29 !anti-a2), 18 (anti-ol + anti-al) , 45 (antr-a4), 18 (anti-a5), 20 (anti-a6) a 10 (anti-βί). Použili sa mAb Ha4/'8 (kontrolné škrečky Ig skupiny 2), Ha31/8 (anti-al), Hal,/ 29 (anti-o2), PS/2 (auti-a4), 5H10-27 (anti-a5), GoH3 (anti-a6) a HMPL-1 (anti-βί) .
Obrázok 3. Účinok anti-integrinových mAb na efektorovú fázu kontaktnej hypersenzrcivity. FITC-senziti zované myši boli injikované i. p. uvedenými mAb, a to 4 hodiny pred FITC výzvou. Hrúbka ušnice sa zmerala na začiatku (východisková hodnota) a po 24 hodinách, a výsledky boli uvedené ako % zvýšenie hrúbky ucha ± stredná chyba priemeru (SEM), ako je ilustrované v príklade 3. Tieto dáta predstavujú zhrnutie deviatich experimentov s n = 74 (PBS), 60 (kontrolná Ig škrečka), 26 (antr-ICAM-1), 44 (antial), 44 (anti-ai), 38 (anti-al + anti-a2), 36 (anti-«4), 16 (anti-«5), 26 (anti-a4 + anti-a5), 24 (anti-a6) a 22 (anti-βί). Použili sa škrečacia mAb: Ha4/8 (kontrolný škrečací Ig skupiny
2), Ha31/8 (antí-ol), Hal/ (anti-a2), HMSS1-1 (anti-βΐ), 3E2 (anti-ICAM-1), a použili sa mAb laboratórneho potkana: R35-95 a R35-38 (kontrolná IgG2a laboratórneho potkana, a IgG2b laboratórneho potkana, v danom poradí), PS/2 (anti-a4), 5H10-27 (antí-o:5), GoH3 (anti-αβ).
Obrázok 4. Reakcia kontaktnej hypersenzicivity u αΐ-deficientnej myši v porovnaní s myšou divého typu. FITC-senzitizované myši boli injikované i. p. uvedenými mAb, a to 4 hodiny pred FIFC výzvou. Hrúbka ušnice sa zmerala na počiatku (východisková hodnota) a po 24 hodinách, a výsledky boli uvedené ako % zvýšenie hrúbky ucha ± stredná chyba priemeru (SEM), ako je ilustrované v príklade 4. Skupiny štyroch až piatich myší sa použili pre jednotlivé typy ošetrenia a všetky experimenty sa uskutočnili najmenej trikrát. Jeden reprezentatívny experiment je ukázaný.
Obrázok 5. Účinok anti-al a anti-a2 mAb na nešpecifický zápal indukovaný krotonovým olejom. Myši boli injikované i. p. uvedenými mAb 4 h pred potrením uší krotonovým olejom. Hrúbka ucha sa zmerala na počiatku (bazálna hodnota) a o 24 hodín neskôr, a výsledky boli ukázané ako % zvýšenie hrúbky ± stredná chyba priemeru, ako je znázornené v príklade 5. Skupiny štyroch až piacich myší sa použili pre jednotlivé typy ošetrenia a všetky experimenty boli uskutočnené najmenej trikrát. Jeden reprezentatívny experiment je ukázaný.
Obrázok 6. Účinok anti-al a oí2 mAb na artritídu indukovanú mAb proti kolagénu. Myši boli injikované i. p. anti-kolagén mAb v deň 0, potom nasledované LPS v deň 3. Myši boli injikované i. p. uvedenými mAb každý 3. deň začínajúc dňom 0. Klinická artritída bola zjavná 2-3 dni po LPS injekcii a trvala niekoľko týždňov. Každá končatina sa ohodnotila podľa škály 0 až 4 každý 3. deň, ako je znázornené v príklade 6, a výsledky boli i 6
vyj adrené ako priemer né artritické skóre medzi . dne n. 9 a dňom 15
(±SEM) z údaj ov pre všetky štyri končatiny. Dáta predstavujú
zhrnutie zo štyroch experimentov, keď sa kažcý experiment
uskutočnil na skupine troch až štyroch myší.
Obrázok 7. Účinok anti-al a a2 mAb na artritídu indukovanú mAb proti kolagénu.
A. Preventívna liečba myšacou buď anti-al alebo anti-o2 mAb znížila artrrtícké skóre. Na myši sa nechal pôsobiť anti-kclagén mAb v deň 0, potom nasledoval LPS v deň 3. Artritída bola v deň S a pokračovala niekoľko týždňov. Na myši sa nesiali pôsobiť uvedené rmAb každý 3. deň začínajúc dňom 0. Kažaá končatina sa ohodnotila podlá škály 0 až 4 každý 3. deň, ako je znázornené v príklade 6, a výsledky sa vyjadrili ako priemerné artriaické skóre medzi dňom 9 a dňom 15 (±SEM) pre všetky štyri končatiny (maximálne skóre 16}. Skupina štyrocn myší sa poušria pre každý druh experimentálneho ošetrenia, uvedené dáta sú priemerom z 12 experimenrov.
B. «1 deficitné myši mali redukované artrrtické skóre porovnateľné so skupinou myší divého typu ošetrených anti-al mAb. Pre každý experiment sa použili skupiny šiyroeh myší, uvedená je priemerná hodnota z dvoch experimentov.
Obrázok 8. Rozvoj artritídy je oneskorený za absencie lymfocytov a inhioície artriaídy anti-al rmAb nastáva za absencie lymfocytov. Myši divého typu B6,12S alebo RAG-1 deficientné myši B6,129 boli podrobené pôsobeniu anti-kolagén mAc v deň Q, nasledoval LPS v deň 3. Artritída oola zjavná v deň 6 a trvala niekoľko týždňov. Myši sa podrobili pôsobeniu uvedených. mAb každý 3. deň začínajúc dňom 0. Každá končatina sa hodnotila a vyhodnotila na skóre 0 až 4 každý 3. ceň. Výsledky boli vyjadrené ako priemerné artritické skóre pre končatinu (maximálne skóre 4). Pre každé ošetrenie sa použili saupiny 4 myší .
Obrázok 9. Reakcia na dávku pri anti-αΐ mAb inhibícii artritídy. Myši civého typu Balb/c sa podrobili pôsobeniu antí-kclagér. mAb v deň 0, nasledoval LPS v deň 3. Artrirída bola zjavná v deň 6 a trvala niekoľko týždňov. Myši sa podrobili pôsobeniu i. p. uvedených dávok buď Ha4/8 (izotypová kontrola) alebo Ha31/8 (anti-αΐ) mAb každý 3. deň začínajúc dňom 0. Každá končatina sa hodnotila a bola ohodnotená v rozsahu škály 0 až 4 každý 3. deň. Výsledky boli vyjadrené ako priemerné artritické skóre na končatinu (maximálne skóre 4). Pre každé ošetrenie sa použili skupiny 4 myší.
Obrázok 10. Terapeutické ošetrenie s anti-αΐ mAb môže znížiť artritické skóre. Myši Balb/c divého typu sa podrobili pôsobeniu anti-kolagén mAb v deň 0, nasledoval LPS v deň 3. Artrirída bola zjavná v deň 6 a trvala niekoľko týždňov. Myši sa podrobili pôsobeniu i. p. mAb (250 pg) alebo Ig fúznehc proteínu (200 pg) každý 3. deň začínajúc dňom 4. Myši dostali buď mAb (Ba4/8 izotypová kontrola alebo Ha31/8 anti-αΐ), Ig fúzny proueín (Ια izotypová kontrola alebo TNF-R55-Ig) alebo kombináciu obidvoch (250 pg Ha31/8 a 200 pg TNF-R55-Ig). Každá končatina bola hodnotená a bola skórovaná v rozsahu škály 0 až 4 každý 3. deň. Výsledky boli vyjadrené ako priemerné artritické skóre na končatinu (maximálne skóre 4). Na každé ošetrenie sa použili skupiny 4 myší.
Obrázok 11. Lokalizácia epitopu pre anti-αΐ mAb blokujúcu doménu
I .
A. Aminokyselínová sekvencia al-I domény laboratórneho potkana (hore, SEQ ID NC: 53) a človeka (dole, SEQ ID NO: 54). Zvyšky zahrnujúce motív MIDAS (adhézne miesto závislé na kovovom ióne) sú uvedené tučné. Ľudské aminokyseliny, ktoré nahradili zodpovedajúce zvyšky laboratórneho potuana (RAH) sú ukázané pod sekvenciou laboratórneho potkana v rámčeku. Pre jasnosť, číslovanie zvyškov v textu sa vzťahuje práve k ocrr.uto obrázku, ak nie je uvedené iné číslovanie, napr. kryštálové číslovanie.
B. Zvyšujúca sa koncentrácia mAb AJH10 (ATCC č. BTA-358C, uložená podlá Budapeštianskej zmluvy v zbierke ATCC, banassas, VA, USA, 2. augusta 2001) bola naviazaná na doštičky potiahnuté
30pg/ml ľudskou (krúžky), potkaňou (uroj uholníky) alebo RAH
(štvorčeky) Cíi-i doménou. U v e o e n é dáta reprezentujú tri
experimenty.
Obrázok 12. Aminokyselinové sekvencia ľudskej al-I domény (SEQ
ID NO: 64 ) .
Obrázok 13. Identifikácia blokujúcej mAb a 1 -1 domény
A. Zvyšujúca sa koncentrácia mAb AEF3 (trojuholníky) alebo AJH1Q (kruhy) boli naviazané na doštičky potiahnuté 3C pg/rnl al-1 domény.
B. ol-I doména sa podrobila pôsobeniu zvyšujúcej sa koncentrácie mAb AJH1C (kosoštvorce! alebo mAb BGC5 (štvorce) a naviazaná na doštičky potiahnuté kolagénom IV (2 pg/ml).
C. K562-al bunky sa podrobili pôsobeniu zvyšujúcej sa koncentrácie mAb AEF3 (trojuholníky; alebo AJH10 (kruhy) a naviazali sa na doštičky potiahnnné kolagénom IV (5 pg/'mi). 45 - 50 % buniek pridaných ku každej jamke aaherovaio ku kolagénu IV. Uvedené dáta reprezentujú tri nezávislé experimenty.
Obrázok 14. Druhovo skrížená reaktivita blokujúcich mAb analyzovaná FACS (fluorescenciou aktivované triedenie buniek). Králičie bunky hladkého svalstva ciev sa inkubovali buď s mAb A JH10 (dole) časťou alebo myšacou IgG kontrolou (hore) a analyzovali s FACS (fluorescenciou aktivované triedenie buniek).
Obrázok 15. al-1 doména viaže kolagén.
A. Zvyšujúca sa koncentrácia ľudskej al-I domény bola naviazaná na doštičky predtým potiahnuté 1 pg/ml kolagénu I (štvorčeky) alebo kolagénu IV (krúžky). Uvedené hodnoty sa korigovali na pozadí väzby k BSA.
B. 2 pg/ml ľudskej al-I domény sa zmiešalo so zvyšujúcou sa koncentráciou protilátky 5E8D9 proti ľudskému al-integrínu (štvorčeky) alebo protilátky A2IIE10 proti ľudskému a2-integrínu (krúžky) a potom sa naviazalo na doštičky predtým potiahnuté s 1 pg/ml kolagénu IV.
C. Doštičky sa potiahli s 1 pg/ml rolagénu IV alebo 3% BSA.
al-I doména (2 pg/ml) sa nasledovne naviazala na doštičky potiahnuté v prítomnosti 1 mM Μη2*, 1 mM Mg2+ alebo 5 mM EDTA.
Uvedené dáta reprezentujú tri nezávislé experimenty.
Obrázok 16. Charakterizácia humanizovaných foriem AQC2. Hodnotili sa mAQC2 (trojuholníky), chAQC2 (kruhy), hAQC2 (obrátené trojuholníky) a hAQC2' (štvorce).
A. Inhibícia VLA-1 väzby ku kolagénu typu IV.
B. Inhibícia väzby al-I domény ku kolagénu typu IV..
C. Väzba k imobilizovanej doméne al-I.
D. Kompetícía s biotinylovanou mAQC2 o väzbu k imobilizovanej doméne al-I.
Obrázok 17. Charakterizácia humanizovaných foriem AQC2 pomocou FACS .
Obrázok 18. Charakterizácia humanizovaných foriem AQC2 pomocou
FACS .
0
Obrázok 19. Koordináty atómovej štruktúry komplexu „al-I doména/Fab, ako boli určené róntgenovou kryštalografiou kryštálov komplexu vo formáte proteínovej databanky (ťDB). Koordináty dvoch komplexov v asymetrickej jednotke sú uvedené nasledovne :
Komplex 1: molekula A = I doména integrínu molekula II = ťažký reťazec hAQC2 Fab molekula L = lahký reťazec hAQC2 Fab molekula M= Mn+Z
Komplex 2: molekula B= I doména integrínu molekula X = ťažký reťazec HAQC2 Fab mole'Kula Y = ľahký reťazec hAQC2 Fab molekula M= Mn+:
Obrázok 2C. Komplex „I doména/Fab.
A. Pásový diagram komplexu doména I/Fab. Doména I a ťažký a lahxý reťazec protilátky sú označené. Kn+2 =ión je označený ako guľa.
B. Zväčšenie miesta MIDA3 (adhézne miesto závislé na kovovom ióne) ukazujúce koordináciu kovového iónu ígula) zvyškom AspíOl (kryštálové číslovanie). Proteínové hlavné reťazce sú uvedené ako stuhy a bočné reťazce sú znázornené formou guličiek a tyčiniek. Valce credstavujú interakcie medzi kovovým iónom a atómami proteínu. Tenké čiary predstavujú H-väzby. Obr. 20 sa vytvoril pomocou softwaru RIBBONS (Carson, 1991, J. Appl. Cryst. 24: 958-361).
Obrázok 21. Diagram, systému použitého na realizáciu inštrukcie kódované pamäťovým médiom na obr. 22 a 23.
Obrázok 22. Pri erez magnetickým pamäťovým médiom.
Obrázok 23. Prierez opticky čitateľným pamäťovým médiom.
Podrobný opis vynálezu
Zistením;, na ktorom je založený predkladaný vynález, je to, že protilátka k integrínu (napr. VLA-l) a jeho fragmentu, konkrétne podjednotke αΐ-integrínu, môže blokovať interakciu prozápalcvých leukocytov so zložkami extracelulárneho matrixu, vrátane kolagénov, laminínu a fibronektínu, bez toho aby tento zoznam zložiek bol obmedzujúci. Tento objav ukazuje dôležitosť adhéznych molekúl z rodiny integrínov, konkrétne αϊβΐ, v prostredí periférnych tkanív v priebehu stavov príbuzných zápalu.
To tiež rozširuje úlohu členov rodiny integrínov a ich fragmentov pri zápale nad jednoduché naviazanie leukocytov a extravasáciu na hranici endotelu tým, že zdôrazňuje dôležitosť na matrix bohatého prostredia periférneho tkaniva pre imunitné reakcie a odhaľuje tak periférne tkanivá ako nový cieľový bod intervencie pri terapii založenej na adhézii.
I. Anti-integrínové protilátky
Spôsooy podľa predkladaného vynálezu uvažujú s použitím! protilátok k integrínom, kde integríny zahrnujú molekuly, ktoré obsahujú reťazec β, vrátane, ale bez obmedzenia βΐ, β2, β3, β4, β5, β 6, β7, β 8, ne kovalentne viazaný k reťazcu a, vrátane, ale bez obmedzenia, al, a2, a3, a4, a5, a6, a7, a8, a9, alO, aV, aL, aM, aX, aD, aE, allb. Príklady rôznych integrínov, prichádzajúcich do úvahy pre použitie podľa vynálezu, zahrnujú, ale bez obmeczenia, nasledujúce integríny:
2 αϊβ 1, α2β1, α3β1, α4β1, α5β1, αόβΐ, α7β 1, αδβΐ, α9β1, αΙΟβΙ, ανβΐ, αί,βΐ, αΜβΙ, αΧβΙ, αϋβΐ, αΙΓοβΙ, αΕβΙ;
α1β2, α2β2, α3β2, α4β2, «5β2, α6β2, α7β2, α8β2, α9β2, α10β2, ανβ2, aLp2, αΜβ2, αΧβ2, αϋβ2, αΙΚ)β2, αΕβ2;
α1β3, α2β3, «3β3, α4β3, α5β3, «6β3, α7β3, α8β3, α9β3, «10β3, ανβ3, «Κβ3, αΜβ3, αΧβ3, αΕβ3, cellbp3, αΕβ3;
α1β4, α2β4, α3β4, α4β4, α5β4, α6β4, α7β4, α8β4, α9β4, α10β4, ανβ4, α]ρβ4, «Μβ4, αΧβ4 αθβ4, αΐΓοβ4; αΕβ4;
α1β5, α2β5, α3β5, α4β5, α5β5, α6β5, α7β5, α8β5, α9β5, αΐ0β5, ανβ5, αΕβ5, αΜβ5, αΧβ5, αϋβ5, ctllbp5, α.Εβ5;
αϊβό, α2β6, α3βδ, α4β6, α5β6, αόβό, α7β6, α8β6, α9βό, αΙΟβό, α.νβ6, αΕβ63 αΜβό, αΧβό, αϋβό, αΐΐδβό, αΕβό;
α1β7, α2β7, α3β7, α4β7, α5β7, α6β7, α7β7, α8β7, α9β7, α!0β7, ανβ7, aLp7, αΜβ7, αΧβ7, αΕβ7, αΙ&β7, αΕβ7;
α!β8, α2β8, α3β8, α4β8, α5β8, α6βδ, α7β8, αδβδ, α9β8, α10β8, αΥβδ, αΕβδ, αΜβ8, αΧβ8, <χϋβ8, αΐΐόβδ, αΕβδ;
Spôsoby podlá predkladaného vynálezu tiež zahrnujú použitie protilátok k fragmentom integrínu, vrátane napríklad protilátok proti samotnému reťazcu β, vrátane, ale bez comedzenia, βΐ, β2, βό, 34, β5, β6, β7, 38, rovnako ako sanačnému reťazcu α, vrátane, ale bez obmedzenia, al, a2, a3, a4, aá, ao, a7, a8, a9, alľ, aV, aL, aM, aX, aD, aE, allb. Navyše spôsoby podľa predkladaného vynálezu ďalej uvažujú aj použitie protilátok k fragmentom integrínu vrátane napríklad protilátok k doméne I reťazca a, vrátane, ale bez obmedzenia, domény I z αϊβΐ (Briesewitz et al., 1993, J. Biol. Chem. 263: 2989;, α2β1 (Takada and Hemler, 1989,1 Celí Biol 109: 397), αΒβ2 (Ľarson et al., 1989,J Celí Biol 108: 703), αΜβ2 (Corbi et al., 1988,JBiol Cheer 263: 12403), αΧβ2 (Corbi et al., 1987 , EMBO J 6: 4023), αθβ2 (Grayson et al., 1988,JExp Med 188: 2187), αΕβ7 (Shaw et al., 1994, J. Biol. Chem. 269: 6016). V jednom uskutočnení antigénny determinant al-I domény zahrnuje aminokyselinovú sekvenciu najmenej 6 po sebe idúcich aminokyselín, pričom táto súvislá sekvencia sa vyskytuje v sekvencii uvedenej na obr. 12. V príbuznom uskutočnení ja táto súvislá sekvencia Val-Gln-ArgGly-Gly-Arg (aminokyselinové zvyšky 91 až 97 zo SEQ ID NO: 64).
Spôsoby produkcie integrínov na použitie podľa predkladaného vynálezu sú odborníkom známe (pozri napr. Springer et al., 1990, Náture 346: 425-434).
uskutočnenie vynálezu ďalej zahrnuje anti-integrínové polyklcnálne a monoklonálne protilátky. Uskutočnenia vynálezu zahrnujú monoklonálne protilátky, ako je napr. anti-al monoklonálna protilátka. Protilátky na liečenie, konkrétne na liečbu ľudí, zahrnujú ľudské protilátky, chimérne protilátky a celých protilátok, ako sú napríklad Fab, Fab', F(ab')2 a F(v) protilátkové fragmenty. Niektoré protilátky podľa vynálezu môžu tiež zahrnovať proteíny obsahujúce jeden alebo viac imunoglobulínových ľahkých reťazcov a/alebo ťažkých reťazcov, ako napríklad monoméry a homo- alebo heteromultiméry (napr. diméry alebo triméry) týchto reťazcov, kde sú tieto reťazce prípadne viazané disulfidickou väzbou alebo sú zosietené iným spôsobom. Protilátky sú schopné viazať sa k jednému alebo viacerým antigénom (napr. al, a2, a6 alebo podjednotkám protilátky, humanizované antigén-väzbové fragmenty integrínu obsahujúcom a-I doménu).
4
Označenie protilátka blokujúca funkciu αϊβΐ, ako sa v tomto texte používa, sa týka protilátky, ktorá sa viaže na al-I doménu, napríklad zvyšky 92 až 92 sekvencie na obr. 12, a blokuje tým αίβΐ funkciu, ktorá je testovaná napríklad pódia schopnosti inhibovať K562-al závislú adhéziu ku kolagénu IV (p o z r i príklad 15).
V nasledujúcej časti sú opísané rôzne spôsoby prípravy protilátok podľa predkladaného vynálezu. Spôsoby, ktoré sú v odbore známe, ale nie sú špecificky opisované v tomto texte, spadajú tiež do rozsahu predkladaného vynálezu. Napríklad protilátky podľa vynálezu sa môžu tiež identifikovať s použitím fágovej displejovej proti lát rovej knižnice, ako je napr. opísané v Smith, 1985, Science 228: 1315-7, alebo v U.S. patentoch č. 5 565 332, 5 733 743, 6 291 650 a 6 303 313. Ďalšie protilátky podľa vynálezu sa môžu pripraviť kondenzáciou ťažkých reťazcov identifikovaných podľa vynálezu s nepríbuzným ľahkým reťazcom, napr. ľahkým reťazcom, ktorý bol identifikovaný metódou displeja na fágu („phage dispľav).
II. Protilátky z hybridómov iných ako ľudských
Monoklonálne protilátky podľa vynálezu sa môžu tvoriť známou hybridómovou technológiou. Napríklad zvieratá βΐ —/ — (napr. myši, laboratórne potkany alebc králiky) sa môžu ímunizovať purifikovar.ým alebo surovým preparátom alpl, bunky sa môžu transfekovať s cDNA xonštruktom kódujúcim al, βΐ alebo obidvoma antigénmi, bunky môžu konštitutívne exprimovať αϊβΐ a pod., antigén sa môže podať ako purifikovaný proreín, proteín exprimovaný na bunkách, proteínový fragment alebo jeho peptid, ako nahá DNA alebo vírusový vektor kódujúci proteín, proteínový fragment alebo peptid. Séra irnun.i zcvaných zvierat sa potom testujú na prítomnosť anti-αΐβΐ protilátky. B lymfocyty sa izolujú zo zvierat, ktoré sú v teste pozitívne a s B lymfocytmi sú vytvorené hybridómy.
Protilátky sekrétované hybridómami sú podrobené skríningu na ich schopnosť viazať sa špecificky k VLA-1 (napr. viazať sa na bunky transfekované al, ale nie na parentálne netransfekované bunky) a na akékoľvek ďalšie požadované vlastnosti, napr. či majú požadované CDR kanonické sekvencie, či inhibujú (alebo neinhibujú, v prípade hľadania neblokujúcich agens) väzbu medzi kolagénom a VLA-1.
Hybridómové bunky, ktoré sú pozitívne v skríningovom teste, sa kultivujú v živnom médiu za podmienok, ktoré dovoľujú bunkám sekrétovať monoklonálne protilátky do kultivačného média. Kondicronovaný supernatant hybridómovej kultúry sa potom odoberie a purifikujú sa protilátky nachádzajúce v supernatante sa. Inak sa môžu požadované protilátky vytvoriť tak, že sa injikujú hybridómové bunky do pobrušnicovej dutiny neimunizovaného zvieraťa (napr. myši). Hybridómové bunky sa potom množia v pobrušnicovej dutine a sekrétujú protilátku, ktorá sa hromadí ako tekutý ascites. Protilátka sa potom môže zozbierať tak, že sa odoberie ascitická tekutina z pobrušnicovej dutiny pomocou injekčnej striekačky.
Monoklonálne protilátky sa môžu tiež pripraviť tak, že sa izoluje cDNA kódujúca protilátku z požadovaného hybridómu, touto cDNA sa transfekujú cicavčie hostiteľské bunky (napr. bunky CHO alebo NSO), transfekované hostiteľské bunky sa kultivujú a protilátka sa získa z kultivačného média.
III. Chimérne protilátky
Monoklonálne protilátky podľa vynálezu sa môžu tiež pripraviť tak, že sa pripraví príbuzná protilátka z hybridómu (napr. myši, laboratórneho potkana alebo králika). Napríklad príbuzná protilátka sa môže potom zmeniť technikou rekombinantnej DNA tak, že časť alebo celá kĺbová oblasť a/alebo konštantné úseky ťažkého a/alebo ľahkého reťazca sa nahradia zodpovedajúcimi zložkami protilátky iného biologického druhu (napr. ľudskej protilátky).
Všeobecne, variabilné domény geneticky pripravenej protilátky zostanú totožné alebo v podstate totožné s variabilnými doménami príbuznej protilátky. Takáto geneticky upravená protilátka sa nazýva chimérna protilátka a je menej antigénna ako príbuzná protilátka, keď je podávaná príjemcovi, ktorý je biologickým druhom, z ktorého pochádzajú celá kĺbová oblasť a/alebo konštantné úseky ťažkého a/a_ebo ľahkého reťazca (napr. človek). Spôsoby prípravy chimérnych protilátok sú v odbore dobre známe. Ľudské konštantné úseky zahrnujú tie, ktoré pochádzajú z IgGl a IgG4 .
IV. Plne ľudské protilátky
Monoklonálne protilátky podlá preoxlaoanéno vynálezu tiež zahrnujú plne ľudské protilátky. Tie sa môžu pripraviť s použitím in vitro iniciovaných („primeo) ludských splenocytov, ako bolo opísané v Boerner et al., 1991, J. immunol. 147: 86-95, alebo s využitím iágovej dispiejovej knižnice protilátok, ako bolo opísané napr. v U.S. patente č. 6 130 C-í 4 .
Inak plne ľudské protilátky sa môžu tiež pripraviť pomocou tzv. repertoárového klonovania, ako bolo opísané v Persson et al., 1991, Proc. Pat. Acad. Sci. USA 138: 24322436, and Huang and Stollar, 1991, J. Immunol. Meťhods 141: 227-236. Okrem toho, U. S. patent č. 5 798 230 (25. august 1 99 2) opisuje prípravu ľudskej monoklonálnej protilátky z ludskýcn B lymfocytov, kde ľudské B lymfocyty produkujúce protilátky sú imortalizované infekciou Epstem-Barrcve j vírusom alebo jeno derivátom, ktorý exprimuje nukleárny antigén 2 (EBNA2) Epstein-Barrovej vírusu, čo je protein požadovaný pre imortalizáciu. E3NA2 funkcia je následne vyradená, čo potom spôsobí zvýšenie produkcie protilátky.
Niektoré ďalšie produkcie plne ľudských protilátok zahrnujú použitie zvierat iného ako ľudského pôvodu, ktoré majú deaktivované endogénne Ig lokusy a sú transgénne pre gény ťažkého reťazca a ľahkého reťazca ľudských protilánok, ktoré nie sú preskupené. Takéto transgénne zvieratá sa môžu imunizovať αϊβΐ a z ich B lymfocytov sa potom pripravia hybridómy. Tieto metódy sú opísané napr. v rôznych publikáciách Ger.äharm/Medarex (Palo Alto, CA) a patentoch týkajúcich sa transgénnych myší obsahujúcich ľudské Ig minilokusy (napr. Lonberg, u. S. patent 5 789 650), rôznych publikáciách/patentoch firmy Abgenix (Fremont, CA) týkajúcich sa XENOMICE (napr. Kucheriapati U. S. patenty 6 075 181, 6 150 584 a 6 162 963, Green et al., 1994, Náture Genetics 7: 13-21 a Mendez et al., 1997, Náture Genetícs (2): 146-56) a rôznych publikáciách/patentoch firmy Kirin (Japonsko) týkajúcich sa transomickej myši (napr., EP 843961 a Tomizuka et al., 1997, Náture Genetics 16: 133-1443' .
V. Humanizované protilátky
Moncklonálne protilátky podľa vynálezu tiež zahrnujú humanizované verzie príbuzných anti-αΐβΐ protilátok pochádzajúcich z iných biologických druhov. Humanizované protilátka je protilátka pripravená metódami rekombinantnej DNA, v ktorej sú niektoré alebo všetky aminokyseliny ludského imunoglobulínového ľahkého alebo ťažkého reťazca, ktoré nie sú vyžadované pre väzbu antigénu (napr. konštantné úseky a rámcové úseky variabilných domén) použité na nahradenie zodpovedajúcich aminokyselín ľahkého alebo ťažkého reťazca v príbuznej protilátke iného ako ľudského pôvodu. Tak napríklad humanizované verzia myšacej protilátky k určitému antigénu má tak v ťažkom ako aj v ľahkom reťazci (1) konštantné úseky ľudskej protilátky, (2) rámcové úseky z variabilnej domény ľudskej protilátky a (3) úseky CDR z myšacej protilátky. Keď je to nutné, jeden alebo viac zvyškov v ľudskom rámcovom úseku sa môže zmeniť na zvyšky zodpovedajúce polohám v myšacej protilátke, aby sa zachovala väzbová afinita humanizovanej protilátky k antigénu. Táto zmena sa niekedy nazýva „spätnou mutáciou(back mutation). Humanizované protilátky všeobecne vyvolávajú imunitné reakcie u ludí s menšou pravdepocobnosťou v porovnaní s chimérnymi ľudskými protilátkami, pretože humanizované protilátky obsahujú podstatne mene; zložiek iného ako ľudského pôvodu.
Spôsoby prípravy humanizovaných protilátok sú známe a boli opísané napr. vo Winter, EP 233 403, Jones et al., 1986, Náture 321: 522-525, Riechmann et al., 1988, Náture 332: 323-327, 1983, Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536, Queen et ai., 1989,Proc. Nat. Acad. Sci. OSA 86: 10029, U. S. patent 6,180,370, a Orlaudi et al . , 1 989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833. Všeobecne, transplantácia myšacích (alebo všeobecne iného ako ľudského pôvodu; úsekov CDR na ľudskú protilátku sa uskutočňuje nasledovným spôsobom.
Z hybridómu sa izolujú cDNA kódujúce variabilné domény ťažkého a ľahkého reťazca. DNA sekvencie variabilných domén, zahrnujúce úseky CDR, sa určia sekvenovaním. DNA kódujúce CDR sa potom prenesú do zodpovedájúcich úsekov sekvencie kódujúcej variabilné domény ťažkého alebo ľahkého reťazca ľudskej protilátky metóaou miestne cielenej mutagenézy. Potom sa pridajú génové segmenty ľudských konštantných úsekov požadovaného izotypu (napr. yl pre CH a k pre CL) ťažkého a ľahkého reťazca sa potom exprimujú) v cicavčích hostiteľských bunkách (napr. CHO alebo NSO), čím sa produkuje rozpustná humanizovaná protilátka. Aby bolo možné produkovať protilátky v priemyselnom: meradle, je často nutné produkovať takéto humanizované protilátky v bioreaktorcch obsahujúcich bunky exprimujúce protilátky alebo pomocou transgénnyeh cicavcov -ako sú napr. kozy, kravy alebo ovce), ktoré exprimujú protilátku v mlieku (pozri napr. U. S. patent č. 5 827 690).
Gény humanizovaného koexprimujú (súčasne
Niekedy priamy prenos úsekov CDR do ľudského rámca spôsobuje stratu antigén-väzbovej afinity pre antigén u takto vzniknutej protilátky. Je to tým, že v niektorých príbuzných protilátkach určité aminokyseliny v rámcovom úseku interagujú s CDR a tak ovplyvňujú celkovú väzbovú afinitu protilátky k antigénu. V takomto prípade by bolo rozhodujúce vniesť spätné mutácie (pozri vyššie) do rámcového úseku akceptorovej protilátky, aby sa udržala antigén-väzbová aktivita príbuznej protilátky.
Všeobecný postup vnášania spätných mutácií je v odbore známy. Napríklad Queen et al. (pozri vyššie), Co et al., 1991,Proc. Nat. Acad. Sci. JSA 88: 2869-2873 a W090/07861(Protein Design Labs Inc.) opisujú spôsob, ktorý zahrnuje dva kľúčové kroky. V prvom kroku ľudské úseky V rámca sú vybrané pomocou počítačovej analýzy podľa optimálnej sekvenčnej proteínovej homológie s V rámcovými úsekmi príbuznej myšacej protilátky. Potom je terciárna štruktúra myšacieho V úseku modelovaná počítačom, aby bolo možné vizualizovať aminokyselinové zvyšky rámcového úseku, ktoré by mohli pravdepodobne interagovať s myšacími úsekmi CDR, a tieto myšacie aminokyselinové zvyšky sú potom superponované na homologický ludský rámcový úsek.
Pri tomto dvojfázovom postupe je niekoľko kritérií na navrhovanie humanizovaných protilátok. Prvým kritériom je použitie ako ľudského akceptora rámcového úseku z určitého ľudského imunoglobulínu, ktorý je zvyčajne homologický s donorovým imunoglobulínom iného ako ľudského pôvodu, a alebo použitie kanonickej sekvencie rámca z mnohých ľudských protilátok. Druhým kritériom je použitie aminokyseliny donora skôr ako akceptora, ak ludský akceptorový zvyšok je nezvyčajný a aminokyselinový zvyšok donora je typický pre ľudské sekvencie v špecifickom zvyšku rámcového úseku. Tretím kritériom je použitie aminokyselinového zvyšku rámcového úseku donora skôr ako akceptora v polohách bezprostredne susediacich s úsekmi CDR.
Môže sa ale použiť tiež úplne iný prístup, akc bol opísaný napr. v Tempest, 199i, Biotechnology S: 266-271. Podía tohto postupu úseky V rámcov pochádzajúce z ťažkého s ľahkého reťazca NEWM a REZ, v danom poradí, sa použili na CDR-štepenre, bez toho aby sa vniesli radikálne myšacie zvyšky. Výhodou pre použití tohto prístupu je to, že trojrozmerné štruktúry variabilných úsekov NEWM a REI sú známe z rôntgenovej kryštalografie, takže špecifické interakcie medzi CDR úsekmi a zvyškami úseku V rámca sa môžu lahko modelovať.
VI. Ďalšie skupiny
Monoklonálne protiláoky podľa vynálezu môžu ďalej zanrnovať ďalšie skupiny na vykonávanie požadovaných funkcií. Napríklad protilátky môžu obsahovať toxínovú skupinu (napr. tetanový toxoid alebo ricín) alebo rádionuklid (napr. iHIn alebo d0Y) na usmrtenie buniek cielených protilátkami (pozri napr. U. S. patent 6 307 026). Protilátky môžu obsahovať skupinu umožňujúcu oetekciu aleoo ľahkú izoláciu (napr. oiotín, fluorescenčné skupiny, rádioaktívne skupiny, histidínový „prívesok'' - tag, alebo ďalšie peptidové tagy). Protilátky môžu tiež obsahovať skupiny, ktoré môžu predĺžiť ich sérový polčas, napríklad polyetylénglykolovú (PEG) skupinu, a člena superrodiny imunoglobulínov’ alebo jeho fragment (napr. časť konštantného úseku ťažkého reťazca ľudského IgGl, napríklad kĺbový úsek, CH2 a CH3 úseky).
VII. Kryšta1 izovateIné kompozície a kryštály
Predkladaný vynález tiež poskytuje kryštálizovatelnú kompozíciu obsahujúcu komplex: (1) potkanie-Iuaské chimérne al-I domény (napr. mutant ΡΔΗ) alebo jej časť (napr. pciypeptid zahrnujúci aminokyseliny 135 až 336 z potkanej-ľudskéj chimérr.ej al-I domény) a (2) Fab fragment z hAQC2 alebo· jeho časť (napr.
polypeptid zahrnujúci aminokyseliny 3 až 213 ľahkého reťazca a/alebo polypeptid zahrnujúci aminokyseliny 3 až 219 ťažkého reťazca) . Príklad takéhoto komplexu je uvedený na obr. 20. RAH al-I doména môže obsahovať napr. aminokyselinové zvyšky 145 až 336 (kryštálové číslovanie) (SEQ ID NO: 59, pozri vyššie) al podjednotky laboratórneho potkana. hAQC2 Fab fragmenty môžu obsahovať aminokyselinové zvyšky 1 až 106 (napr. 1 až 213) lahkého reťazca, ktorý má SEQ ID NO: 3, a aminokyselinové zvyšky 1 až 118 (napr. 1 až 219) ťažkého reťazca, ktorý má SEQ ID NO: 4. Fragmenty hAQC2 Fab sa môžu získať papaínovým štiepením celej protilátky alebo môžu sa pripraviť metódami rekombinantnej DNA. Fab fragmenty obsahujú aspoň antigén-väzbovú časť variabilnej domény lahkého reťazca a/alebo ťažkého reťazca z hAQC2.
145 TQLDIV
151 IVLDGSNSIY PWESVIAFLN DLLKRMDIGP KQTQVGIVQY
191 GENVTHEFNL NKYSSTEEVL VAANKIVQRG GRQTMTALGI
231 DTARKEAFTE ARGARRGVKK VMVIVTDGES HDNYRLKQVI
271 QDCEDENIQR FSIAILGHYN RGNLSTEKFV EEIKSIASEP
311 TEKHFFNVSD ELALVTIVKA LGERIF
(SEQ ID NO: 59)
Niektoré kryštalizovateiné kompozície a kryštály podľa vynálezu môžu obsahovať molekulu alebo molekulárny komplex, ktorý je homologický s al-I doménou a/alebo hAQC2 Fab fragmentom podľa aminokyselinovej sekvencie alebo trojrozmernej štruktúry. Príklady homológov zahrnujú, avšak bez obmedzenia: al-I doménu a/alebo hAQC2 Fab fragment s mutáciami, ako sú napríklad konzervatívne substitúcie, adície, delécie alebo ich kombinácie. Termín konzervatívna substitúcia označuje nahradenie zvyšku iným zvyškom, ktorý je fyzicky podobný veľkosťou, tvarom, hydrofobícitou, nábojom a/alebo chemickými vlastnosťami zodpovedajúcemu referenčnému zvyšku. Spôsoby identifikácie zodpovedajúcej aminokyseliny sú v odbore známe a sú založené na sekvenčnom porovnaní, štruktúrnom porovnaní, funkčnej polohe alebo ich kombináciou v porovnaní s kryštálovou štruktúrou riešenou podía predkladaného vynálezu. Napríklad zodpovedajúce aminokyseliny môžu byť identifikované tým, že sa superponujú atómy aminokyselín hlavného reťazca komplexu al-I doména/hAQC2 a nomoióga al-1 domény a/alebo hAQC2 s použiuím odborníkovi dobre známych programov (softwarových aplikácií;, ako je napríklad QoANTÄ (Molecular Simuláciou, Inc., San Diego, CA, £1998, 2000). Zodpovedajúce aminokyseliny sa môžu tiež identifikovať s použitím počíračových programov pre porovnávanie sekvencií, ako je napríklad program Bestfit dostupný od Genetics Compuuer Group, ktorý používa algoritmus lokálnej homológie opísaný v publikácii Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 432, 1961.
Kryštalizovateľné kompozície podľa vynálezu súčastí, ktoré koinoatibilné obsahovať jednu alebo viac kryšralizáciu a/alebo sú kryštalizácie. K takýmto zložkám patria, ale bez pufor, soli, precipitačné činidlá a ďalšie činidlá, môže byť 30% (hmôtnosť/objem) poiyetylénglykolu 1500 môžu ďalej podporuj ú s podmienkou obmedzenia, Jedna zložka (PEG1500).
Predkladaný vynález tiež poskytuje spôsoby prípravy kryštálov z kryštalizovateľnej kompozície obsahujúce uomplex ol1 domény a antigén-väzbové časti hAQC2 (napr. Fab, Fab' alebo iného fragmentu, pozri vyššie). Rôzne techniky kryšualizácie sa môžu použiť vo vynálezu, vrátane difúzie pary, dialýzy, mi krcdávkove j a dávkovej difúzie, a difúzie kvapalina-kvapalma.
Meuódy difúzie pary zahrnujú, ale bez obmedzenia, metódy prisadnutej kvapky („sitting-drop) , zavesenej kvapky („nangingcrop) a sendvičovej kvapky („sandwich-drop) . Metódy difúzie pary môžu využívať posrupy na kontrolu rýchlosti kryštalizácie, čko je napríklad pridanie olejov na kvapky alebo roztoku v zásobníku. Kryštalizačné metódy môžu zahrnovať miešanie roztoku v zásobníku obsahujúceho zrážadlo s vodným roztokom komplexu alI domény a antigén-väzbové časti hAQC2 za vzniku kryštálizovateľnej kompozície. Zmes alebo kryštalizovateľné kompozície sa môžu potom kryštalizovať s použitím rôznych vyššie zmienených postupov. Kryštalizovateiná kompozícia podľa tohto vynálezu môže byť vodný roztok komplexu al-I domény a antigénväzbové časti hAQC2, ktorý obsahuje komplex s koncentráciou približne 1 až 50 mg na 1 ml, ako napríklad s koncentráciou približne 5 až 15 mg na 1 ml (napr. 11 mg na 1 ml).
VIII. Kryštálové štruktúry a štruktúrne koordináty
Predkladaný vynález ďalej poskytuje trojrozmernú štruktúru kryštálu vrátane komplexu mutanta RáH a hAQC2 Fab fragmentu pri rozlíšení 2,8 Á (pozri príklad 24). Trojrozmerné štruktúry ďalších príbuzných kryštálov sa môžu tiež určiť s použitím spôsobov opísaných v tomto texte a postupov známych v odbore. Trojrozmerná štruktúra tohto komplexu je definovaná súborom štruktúrnych koordinát (súradníc) uvedených na obr. 19. Tieto štruktúrne koordináty sú kartézské koordináty atómov odvodené z matematických rovníc týkajúcich sa vzorcov získaných difrakciou monochromatického lúča róntgenového žiarenia na atómoch alebo rozptylových centrách kryštalického komplexu al-I domény a hAQC2 Fab fragmentu. Difrakčné (rozptylové) dáta sú najskôr použité na výpočet mapy elektrónovej hustoty (denzity) opakujúcej sa kryštálovej jednotky. Mapa elektrónovej hustoty sa potom použije na stanovenie polohy jednotlivých atómov komplexu.
Predkladaný vynález poskytuje molekulu alebo molekulárny komplex definovaný všetkými alebo niektorými štruktúrnymi koordinátami všetkých aminokyselín uvedených na obr. 19, a tiež homciogickú molekulu alebo molekulárny komplex, kde homológ má odmocninu priemerného štvorca odchýlky od atómov hlavného reťazca týchto aminokyselín medzi 0,00 Ä a 0,65 Ä, napríklad medzi 0,00 Ä a 0,60 Á (napr. medzi 0,00 Ä a 0,50 Ä).
Termín odmocnina priemerného štvorca odchýlky alebo r. m. s. odchýlky znamená druhu odmocninu aritmetického priemeru štvorcov odchýlok od priemeru. Tc je spôsob, ako vyjadriť odchýlku alebo variáciu cd trendu alebo predmetu. Pre tento vynález termíny odmocnina priemerného štvorca odchýlky alebo r. m. s. pozičnej odchýlky definujú odchýlku hlavného reťazca proteínu od relevantnej časti hlavného reťazca polypeptidu, ako bol definovaný štruktúrnymi koordinátami opísanými v tomto texte.
Molekula alebo molekulárny komplex podľa tohto vynálezu môžu tiež zahrnovať väzbové miesto definované štruktúrnymi koordinátami aspoň siedmych aminokyselín z hAQC2 Fab fragmentu vybraných zo skupiny obsahujúcej zvyšky ľahkého reťazca Asn30, Tvr4 8, Trp90, Ser91, Asn93 a Trp95 a zvyšky ťažkého reťazca Ser3C, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO a AsplOl (kryštálové číslovanie) podlá obr. 19, alebo homológ molekuly alebo molekulového komplexu, kde homológ zahrnuje väzbové miesto, ktoré má odmocninu priemerného štvorca odchýlky od atómov hlavného reťazca jednej alebo viac z týchto aminokyselín medzi 0,30 Ä a 1,10 Ä, napríklad medzi 0,00 A a 1,00 Ä (napr. medzi 0,00 Ά a 0,50 A). Termín väzbové miesto, ako sa v tomto texte používa, sa týra úseku molekuly alebo molekulového komplexu, ktorý sa, v dôsledku svojho tvaru a náboja, priaznivo asociuje s ďalšou chemickou entitou. Termín miesto zahrnuje, ale nie je tým obmedzený, prehĺbenmu, ryhu, kanál alebo vrecko. Napríklad väzbové miesta na oí doméne môžu zahrnovať väzbové miesto pre kolagén (Smsley et al., 1997, pozri vyššie), väzbové miesto pre antigén a alostericxé (alebo MľDAS) väzbové miesto (Huth et al., 20C0, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97: 5231-5236). Termín chemická entita zahrnuje, ale nie je tým obmedzený, akúkoľvek molekulu, molekulárny komplex, zlúčeninu alebo jej fragment. Termín asociovať sa sa týka asociácie alebo väzby v podmienkach blízkosti chemickej entity alebo jej časti a väzbového vrecka alebo väzbového miesta proteínu. Asociácia môže byť nekovalentná - kde vzájomné postavenie vedia seba je energeticky zvýhodnené vodíkovými väzbami alebo van der Waalsovými alebo elektrostatickými interakciami - alebo môže byť kovalentné.
Molekula alebo molekulárny komplex podlá vynálezu môže tiež obsahovať väzbové miesto definované štruktúrnymi koordinátami aminokyselinových zvyškov al-I domény vybraných zo skupiny obsahujúcej Asp 154, Serl56, Asnl57, Serl58, Tyrl60, Glul92, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 a Leu294 (kryštálové číslovanie), podlá obr. 19, alebo homológ molekuly alebo molekulového komplexu, kde homológ zahrnuje väzbové miesto, ktoré má hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlky od atómov hlavného reťazca aminokyselín al-I domény medzi 0,00 a 0,92 Á.
Molekula alebo molekulárny komplex podľa vynálezu môže tiež obsahovať väzbové miesto definované štruktúrnymi koordinátami aminokyselinových zvyškov al-I domény vybraných zo skupiny obsahujúcej Glul92, Gln218, Arg219, Gly220 a Gly221 (kryštálové číslovanie), podľa obr. 19, alebo homológ molekuly alebo komplex, ktorý obsahuje väzbové miesto, ktoré má hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlky od atómov hlavného reťazca aminokyselín al-I domény medzi 0,00 a 0,30 Ä.
Odborníci chápu, ze súbor štruktúrnych koordinát pre polypeptid je relatívny súbor bodov, ktoré definujú tvar v troch rozmeroch (v priestore). Takže je možné, že úplne odlišný súbor koordinát, ktorý definuje podobný alebo totožný tvar, sa môže vytvoriť pomocou matematických úprav štruktúrnych koordinát na obr. 19. Napríklad štruktúrne koordináty by sa mohli upravovať kryštalografickými frakcionalizáciou odrátaním celého permutáciami štruktúrnych koordinát, štruktúrnych koordinát, prirátaním alebo čísla od súboru štruktúrnych koordinát, inverziou štruktúrnych koordir.át alebo akoukoľvek ich kombináciou. Navyše malé zmeny v jednotlivých koordinátach majú iba malý účinok na celkový tvar.
Inak modifikácia v kryštálovej štruktúre spôsobená mutáciou, ako je napríklad adícia, suostítúcia, a/alebc delécia aminokyseliny, alebo ďalšie zm.eny v ktorejkoľvek zložke polypeptidu í.napr. h.AQC2 Fab fragmentu alebo al-I doméne), ktorá tvorí kryštál, môže tiež zodpovedať za zmeny štruktúrnych koordinát. Ak sú takéto variácie v prijateľnom rozsahu strednej chyby v porovnaní s pôvodnými koordinátami, výsledný trojrozmerný tvar je považovaný za zhodný s nemodifi kovaným kryštálom.
Je preto nutné určiť, či entita je dostatočne podobná celej alebo iba časti štruktúry opísanej v tomto texte, pokial ide o tc, či môže byt považovaná za rovná kú.
Takéto analýzy sa môžu uskutočňovať s použitím moderných softwarových aplikácií, ako je napríklad program QUÄNTA (Accelrvs, Inc. and Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA © 1998, 2000) a program O (Jones et al., 1991, ActaGast. A47: 110119), pozri príslušné užívateľské príručky. Aplikácia Molecular Similarity z programu QUANTA a aplikácia LSQ z programu O umožňujú porovnanie medzi rôznymi štruktúrami, rôznymi konformáciami rovnakej štruktúry a rôznymi časťami rovnakej štruktúry. Všeobecný postup použitý v obidvoch aplikáciách je vloženie štruktúr, ktoré sa majú porovnávať, definovanie ekvivalentných atómových polôh v týchto štruktúrach, uskutočnenie priraďovacích operácií a analyzovanie výsledkov.
Po vložení každej štruktúry do aplikácie sa jej pridelí meno a štruktúra sa identifikuje ako fixovaná štruktúra alebo pohyblivá štruktúra. Atómová ekvivalencia je zvyčajne definovaná ekvivalentnými atómami ako napríklad atómami proteínového reťazca (N, Ce, C a C) pre všetky konzervatívne zvyšky medzi dvoma štruktúrami, ktoré sú porovnávané. Pohyblivá štruktúra sa translatuje a otáča, aby sa dosiahla optimálna zhoda alebo zhoda s najmenším štvorcom odchýlok s fixovanou štruktúrou. Odmocnina priemerného štvorca odchýlok pre všetky špecifikované páry ekvivalentných atómov je uvádzaná obidvoma programami v ángstrómoch (Ä) .
Pre tento vynález, ktorýkoľvek molekulárny komplex, ktorý má odmocninu priemerného štvorca odchýlok atómov hlavného reťazca konzervatívnych zvyškov (N, Ca, C, 0) medzi 0,00 Ä a 1,50 Ä, ako napríklad medzi 0,00 a 1,00 Á (napr. medzi 0,00 a 0,50 Á), keď je superponovaný na relevantné atómy hlavného reťazca opísané štruktúrnymi koordinátami uvedenými na obr. 19, považuje sa za totožný.
IX. Určovanie ďalších kryštálových štruktúr
Štruktúrne koordináty uvedené na obr. 19 sa môžu tiež použiť ako pomôcka na získanie štruktúrnych informácií o iných kryštalizovaných molekulárnych entitách, napríklad iné hAQC2 obsahujúce substitúcie aminokyselín v jednom z úsekov CDR. To sa môže dosiahnuť ktoroukolvek zo známych techník, zahrnujúcich molekulárnu substitúciu, čo je osobitne užitočný spôsob na určovanie štruktúry mutantov a homológov al-I domény/Fab.
Štruktúrne koordináty uvedené na obr. 19 sa môžu tiež použiť na určenie aspoň časti trojrozmernej štruktúry molekulárnych entít, ktoré obsahujú aspoň niektoré štruktúrne rysy podobné aspoň časti al-I domény alebo hAQC2 Fab. Preto ďalšie uskutočnenie tohto vynálezu poskytuje spôsob využitia molekulárnej substitúcie pre získanie štruktúrnej informácie o kryštalizovanej molekule alebo molekulárnom komplexe s neznámou štruktúrou zahrnujúci kroky: (a) vytvorenie róntgenového difrakčného vzorca pre kryštalizovanú molekulu alebo molekulárny komplex a (b) aplikácia aspoň časti štruktúrnych koordinát uvedených na obr. 19 na róntgenový difrakčný vzorec, aby sa
8 vytvorila trojrozmerné maca elektrónovej denzity molekuly alebo molekulového komplexu s neznámou štruktúrou.
Aplikáciou mol e k; časť štruktúrnych kc; rýchlejšie a úča rarne' môžu byť všetky aiebc kryštalizovanej t.oleauly, rdinát uvedených na obr. 19 cnejšie určenie neznámej axo kebv získavali znova od £ substitúcia poskytuje Fázy sú faktory v rov štruktúr, ktoré sa non pre fázy, metódami ir byť často časovo veľrr. cykly aproximácie a vyriešenie kryštálov; kryštálová štruktúra časť, fázy zo známej odhad fáz pre neznámu použité nd štruktúry informácie
Molekulárna sa takéto ;amého začiatku {ab initio'/ . presné určenie fáz pre neznámu štruktúru, ciciach určených pre riešenie kryštálových côžu určiť priamo. Získanie presných hodnôt ;ými ako je molekulárna substitúcia, môže i náročný postup, ktorý zahrnuje rteračné ďalšieho spresňovania, a výrazne sťažuje ;j štruktúry. Avšak keď je vyriešená proteínu obsahujúceho aspoň homologicxú štruktúry môžu často posxytnúť uspokojivý štruktúru.
Takže molekulárna substitúcia zahrnuje vytvorenie predbežného modelu molekuly alebo molekulového komplexu, ktorého štruktúrne kcordináty sú neznáme, tým, že sa orientuje a polohuje relevantná časť komplexu podía obr. 19 v rámci jednotkovej bunky xryšcálu neznámej molekuly alebo molekulového komplexu tan, aby najlepšie zodpovedala pozorovanému vzorcu rontgenovej difrakcie kryštálu molekuly alebo molekulového komplexu, ktorého štruktúra je neznáma. Fázy sa môžu potom vyrátať z tohto modelu a v kombinácii s amplitúdami pozorovaného vzorca rôntgenovej difrakcie poskytnú mapu elektrónovej denzity štruktúry, ktorej koorcináty sú neznáme. Tá sa potom, môže ďalej podrobiť akejkolvek známej metóde výstavby modelu a upresňovania štruktúry, aby sa získala presná štruktúra neznámej kryštál czovanej molekuly alebo molekulového komplexu (Lattmar, 1985, Meth. Fnzymoi. 555: 55-77, Rossmann, ed., The Molecular Replacement Method, int. Sci. Rev. Ser., No. 13, Gordon á
Breach, New York, 1972). Štruktúra ktorejkoľvek časti ktorejkoľvek kryštalizovanej molekuly alebo molekulového komplexu, ktoré sú dostatočne homologické s ktoroukolvek časťou al-ϊ domény a/alebo hAQC2 Fab fragmentu (podľa obr. 19), môže sa vyriešiť týmto spôsobom.
X. Počítač a pamäťové médium
Aby sa dali použiť štruktúrne koordináty podľa tohto vynálezu, napr. koordináty uvedené na obr. 19, je zvyčajne nutné konvertovať tieto koordináty na trojrozmernú (t.j. priestorovú) reprezentáciu alebo tvar. Komerčne dostupné grafické programy (Software) vrátane, ale bez obmedzenia, programu 0 (Jones et al., 1991, Acta Cryst. A47: 110-119) a INSIGHTII (©Accelrys, Inc. a Molecular Simulation, Inc., San Diego, CA) , sú schopné zo súboru štruktúrnych koordinát vytvoriť trojrozmernú reprezentáciu molekuly alebo molekulového komplexu alebo ich častí.
Podľa predkladaného vynálezu štruktúrne koordináty molekulárnych entít podľa vynálezu sú uložené na pamäťovom médiu, ktoré je čitateľné strojovo (napr. počítačom). S použitím počítača a vhodného programového vybavenia (softwaru) sa môžu takéto dáta použiť pre celý rad účelov, ako napríklad objavovanie liečiv a rôntgenokryštalografickú analýzu kryšuálov ďalších proteínov.
V súlade s tým, strojovo čitateľné médium na uchovanie dát (pamäťové médium) môže zahrnovať dátový materiál kódovaný do strojovo čitateľných dát zahrnujúci aspoň časť štruktúrnych koordinát uvedených na obr. 19. Počítač môže ďalej zahrnovať inštrukcie pre vytvorenie trojrozmernej reprezentácie molekulárnych komplexov al-I domény a hAQC2 Fab fragmentu spracovaním strojovo čitateľných dát podľa tohto vynálezu. Počírač podľa vynálezu môže tiež zahrnovať displej, grafické rozhranie pre zobrazenie alebo vstupné zariadenie pre pohybovanie a manipulácie s trojrozmernou grafickou reprezentáciou štruktúrnych koordinát.
Predkladaný vynález tiež poskytuje počítač pre určenie aspoň časti štruktúrnych koordinát zodpovedajúcich dátarr róntgenovej difrakcie získaným pre molekulárny komplex οΊβΙ integrínu a Fab fragmentu z hAQC2 protilátky, ude oočítač zahrnuje strojovo čitateľné médium obsahujúce dátový materiál kódovaný so strojovo čitateľnými dátami, kde dáta zahrnujú aspoň časť štruktúrnych koordinát molekulového komplexu z «1-1 domény a hAQC2 Fab fragmentu pocľa obr. 19 alebo dáta rónogenovej difrakcie získané z kryštalického molekulového komplexu. Počítač ďalej zahrnuje inštrukcie pre uskutočňovanie Fourierovej transformácie strojovo čitateľných koordmátových dát a inštrukcie pre spracovanie týchto strojovo čitateľných oifrakčných dát do štruktúrnych koordinát. Tento počítač môže ďalej zahrnovať: pracovnú pamäť pre ukladanie inštrukcií pre spracovanie strojovo čitateľných dát, centrálnu procesorovú jednotku spojenú s pracovnou pamäťou a so strojovo čitateinými dátami, a voliteľné grafické rozhranie alebo displej spojený s centrálnou procesorovou jednotkou pre zobrazenie trojrozmernej grafickej reprezentácie štruktúrnych koordinát molekuly alebo molekulového komplexu.
Vynález ďalej poskytuje počítač na vytvorenie trojrozmernej reprezentácie: molekuly alebo molekulového komplexu definovaného tým, že aspoň časť alebo všetky štruktúrne koordináty všetkých aminokyselín ol-I domény a hAQC2 Fab fragmentu, uvedených na obr. 19, alebo homológa molekuly alebo molekulového komplexu, kde homológ má odmocninu štvorca priemernej odchýlky od atómov aminokyselín hlavného reťazca medzi 0,00 Ä a 1,50 Ä, napríklad medzi 0,00 a 1,00 A 'napr. medzi 0,00 a 0,50 Ä). Ďalez v tomto vynáleze počítač zahrnuje: strojovo čitateľné pamäťové médium pre uloženie dát obsahujúce uložený dátový materiál kódovaný so strojovo čitateľnými dátami, kde dáta zahrnujú aspoň čast alebo všetky štruktúrne koordináty všetkých aminokyselín al-I domény a Fab hAQC2 fragmentu, ako sú uvedené na obr. 19.
Počítač podľa vynálezu môže vytvoriť trojrozmernú reprezentáciu molekuly alebo molekulového komplexu vrátane väzbových miest. Väzbové miesto sa môže definovať štruktúrnymi koordinátami aspoň siedmych aminokyselín z hAQC2 Fab fragmentu vybraných zo skupiny obsahujúcej zvyšky ľahkého reťazca Asn30,Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 a Trp95 a zvyšky ťažkého reťazca Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO a AsplOl (kryštálové číslovanie) podlá obr. 19, alebo homológa molekuly alebo molekulového komplexu, kde homológ zahrnuje väzbové miesto, ktoré má hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlok atómov hlavného reťazca aspoň jednej aminokyseliny z hAQC2 Fab fragmentu medzi 0,00 Á a 1,10 Á, ako napríklad medzi 0,00 Á a 1,00 Ä (napr. medzi 0,00 Á a 0,50 Ä). Ďalej počítač podlá tohto vynálezu zahrnuje: strojovo čitateľné pamäťové médium, pre ukladané dáta vrátane uloženého dátového materiálu kódovaného so strojovo čitateľnými dátami, kde dáta zahrnujú štruktúrne koordináty aspoň siedmych aminokyselín z hAQC2 Fab fragmentu vybraných zo skupiny obsahujúcej zvyšky ľahkého reťazca Asn30,Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 a Trp95 a zvyšky ťažkého reťazca Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO a AsplOl (kryštálové číslovanie) podlá obr. 19.
Vynález tiež poskytuje počítač na vytvorenie trojrozmernej reprezentácie molekuly alebo molekulového komplexu vrátane väzbového miesta definovaného štruktúrnymi koordinátami aminokyselín domény I vybraných zo skupiny, ktorú tvoria zvyšky Aspl54, Serl56, Asnl57, Serl58, Tyrl60, Glul92, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, C-ln223, Thr224, Asp257, His261, Asn2S3, Arg291 a Leu294 (kryštálové číslovanie), podľa obr. 19, alebo homológa molekuly alebo molekulového komplexu, kde homológ zahrnuje väzbové miesto, ktoré má hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlok atómov aminokyselín domény 1 medzi G, 00 A a 0,92 Ä. Ďalej v tomto vynáleze počítač zanrnu^e: strojovo
čitateľné pamäťové médium pre ukladanie dát vrátaš .e uloženého
dátového materiálu kódovaného so strojovo čitatele .ými dátami,
kde dáta zahrnujú štruktúrne koordináty aminoaysel in domény I
vybraných zo skupiny, ktorú tvoria zvyšky Aspl 54, S e r 15 6,
Asnl57, Serl58, Tyrl60, Glul92, Gln.218, Arc219, Gljt 520, Glj/221,
Arg222, Gln223, Thr224, Asp2 57, His2 61, Asn2 63, Are 1 -91 a Leu2 94
(kryštálové číslovanie) podľa obr. 19.
Tento vynález tiež poskytuje počítač na vytvorenie
trojrozmernej reprezentácie molekuly alebo molekuloví ího komolenú
vrátane väzbového miesta definovaného štruktúrnymi ) loordiná tami
aminokyselín domény I vybraných zo skupiny, ktorú ť. soria zvyšky
Glul92, Gin218, Arg219, Gly220 a Gly221 (kryštálové : líslovanie) ,
podlá obr. 19, alebo homológa molekuly aieoo ľ mole kalového
komplexu, kde homológ zahrnuje väzbové miesto, (more : má hodnotu
odmocniny priemerného štvorca odchýlky od atómov ; ^minc kyselín
hlavného reťazca domény medzi 0,00 A a 0,30 A. Da lej v tomto
vynáleze počítač zahrnuje: strojovo čitateľné pase ťové médium
pre ukladanie dát vrátane uloženého dátového materiálu kódovaného so strojovo čitateľnými dátami, kde dáta zahrnujú štruktúrne koordináty aminokyselín domény i vybraných zo
Skupiny, ktorú tvoria zvyšky Giul92, Gln218, Arg21 5, Gly220 a
Gly221 (kryštálové číslovanie), podľa obr. 19.
Obr. 21 demonštruje jedno takéto uskutočnenie. Systém 10
zahrnuje počítač 11 vrátane centrálnej procesorov^ ej jednotky
(CPU) 20, pracovnú pamäť 22, ktorá môže byť napr. RAM (pamäť
typu „random-access) alebo feritová pamäť, pa: täť 24 pre
hromadné ukladanie (ako napríklad jedna alebo viac jednotiek -
driverov - pre disk alebo pásku alebo CD-ROM aleb o DVD-ROM),
jeden alebo viac obrazovkových (CRT) terminálov 26, jednu
alebo viac klávesníc 28, jedno alebo viac vstupných vedení 30 a
jedno alebo viac výstupných vedení 48, každé z nich j e prepojené
zvyčajnou obojstrannou systémovou zbernicou 50.
Vstupný hardware 36, spojený s počítačom^ il vstupným vedením 30, sa môže realizovať celým radom spôsobov. Strojovo čitatelné dáta podlá tohto vynálezu sa môžu vkladať prostredníctvom modemu alebo modemov 32 pripojených telefónnou linkou alebo zvláštnou linkou 34 pre prenos dát. Alternatívne alebo aj navyše, vstupný hardware 36 môže zahrnovať CD-ROM alebo DVD-ROM jednotky alebo páskové alebo diskcvé jednotky 24 . V spojení s displejovým terminálom 26 môže byť tiež klávesnica 2.8 použitá ako vstupné zariadenie.
Výstupný hardware 4 6, spojený s počítačom 11 výstupným vedením 4 0, sa môže podobne realizovať zvyčajnými zariadeniami. Napríklad výstupný hardware 46 môže zahrnovať obrazovkový CRT terminál 2 6 pre zobrazenie grafickej reprezentácie väzbového miesta podlá tohto vynálezu s použitím programu ako je napríklad program QUANTA, ako bolo opísané vyššie v tomto texte. Výstupný hardware by mohol tiež zahrnovať tlačiareň 42, takže by sa dali vytvárať vytlačené výstupy, alebo diskovú jednotku 2 4 na uloženie celého systémového výstupu pre neskoršie použitie.
Pri prevádzke CPU 20 koordinuje použitie rôznych vstupných a výstupných zariadení 36, 46, koordinuje sprístupnenie dátového materiálu z hromadnej pamäte 24 a umožňuje vstup a výstup z pracovnej pamäte 22, a tiež určuje sled jednotlivých krokov spracovania dát.
Na spracovanie strojovo čitateľných dát podlá tohto vynálezu sa môže použiť celý rad programov. Tieto programy sú diskutované vo vzťahu k výpočtovým metódam na navrhovanie liečiv opísanom v tomto texte. Špecifické odkazy na jednotlivé komponenty hardwarového systému 10 sú zahrnuté tam, kde je to vhodné, v nasledujúcom opise média pre uchovávanie dát.
Obr. 22 ukazuje prierez magnetickým pamäťovým médiom 100, ktoré môže byť kódované strojovo čitateľnými dátami, čo sa môže uskutočniť systémom ako je napríklad systém 10 na obr. 21. Médium 10C môže byť zvyčajná pružr.á disketa alebo pevný disk, s vhodným substrátom 13í, a vhodnou obalovou vrstvou 102, ktorá môže zvyčajne obsahovať, na jednej alebo na obidvoch stranách, magnetické domény (neviditeľné), ktorých polarita alebo orientácia sa môžu zmeniť magneticky.
Médium 100 môže tiež mať otvor (nie je ukázaný) na vsunutie hriadeľa diskovej jednotky aleoo iného zariadenia na uchovávanie dát 24 .
Magnetické com.ény vo vrstve 102 na médiu 100 sú polarizované alebo orientované tak, aby kódovali spôsobom, ktorý je zvyčajný, stredovo čitateľné dáta ako· napríklad dáta opísané v tomto texte, na spracovanie systémom ako je napríklad systém 10 na obr. 21.
Obr. 23 ukazuje prierez cpticky-čitatelným pamäťovým médiom 110 na uchovávanie dát, ktoré tiež môžu byť kódované so strojovo čitateľnými dátami alebo súborom inštrukcií, ktoré sa môžu uskutočňovať systémom, ako je napríklad systém. 10 na obr. 21.
Médium ]1Q môže byť obyčajný kompaktný disk alebo DVD disk typu ROM („Read Gniy Memory), t.j. CD-ROM alebo DVD-ROM, alebo prepisovateľné médium, ako napríklad magneto-optický disk, ktorý je opticky čitateľný a magneto-optícky zapisovatelný. Médium 100 má vhodný substrát 111, ktorý môže byť obyčajný, a vhodný povrch 112, ktorý môže byť obyčajný, a to zvyčajne na jednej strane substrátu i 11.
V prípade CD-ROM, ako je dobre známe, povrchová vrstva 112 je reflexívna a je poxrytá veľrým množstvom jamiek í 13, ktoré kódujú strojovo čitateľné dáta. Usporiadanie jamiek je čítané laserovým svetlom, odrazeným z povrchu vrstvy 112. Ochranná vrstva 114, ktorá je v podstate priehľadná, je nanesená na povrchu vrstvy 112.
V prípade magnetc-optického disku, ako je dobre známe, vrstva 112 nemá žiadne jamky 113, ale obsahuje velké množstvo magnetických domén, ktorých polarita alebo orientácia sa môžu zmeniť magneticky, keď sa zahrejú nad určitú teplotu, napr. laserom (nie je uvedené). Orientácia domén je čítaná meraním polarizácie laserového svetla odrážaného od vrstvy 112. Usporiadanie domén kódujúcich dáta je také ako bolo opísané vyššie.
XI. Racionálny návrh liečiv
Predkladaný vynález dovoľuje použiť postupy návrhu liečiv založené na štruktúrnych údajoch a postupy tzv. racionálneho navrhovania liečiv („Rational Drug Design) pre návrh, selekciu, syntézu alebo izoláciu chemických entít, ako sú napríklad inhibítory «1-1 domény, a tiež na zlepšenie známych inhibítorov tejto domény.
Tieto inhibítory môžu byť schopné blokovať väzbové miesto VLA-I pre kolagén. Tento vynález tiež dovoľuje použiť postupy založené na štruktúrnych údajoch a postupy tzv. racionálneho navrhovania liečiv pre návrhy variantov, ktoré môžu pôsobiť ako inhibítory väzby kolagénu.
Trojrozmerné reprezentácie podľa tohto vynálezu sa môžu použiť experimentálne alebo v počítačovej forme na navrhovanie potenciálnych inhibítorov, ďalších chemických entít, variantov Fab fragmentov alebo kombinácie chemických entít, ktoré sa môžu viazať na biologickú funkciu hAQC2 Fab fragmentu alebo chimérnej Oťl-I domény podľa vynálezu a ovplyvňovať ju.
Odborník môže použiť jednu alebo niekoľko metód skríningu chemických entít na ich schopnosť asociovať sa s komplexom hAQC2 Fab fragmentu alebo chimérnej «1-1 domény podľa predkladaného vynálezu a konkrétne s väzbovým miestom buď domény I alebo Fab fragmentu. Tento postup môže začať vizuálnym vyhľadávaním, napríklad väzbového miesta buď pre doménu I alebo Fab fragment, na počítačovej obrazovke, na základe koordinát komplexu uvedených na obr. 19.
Vybrané chemické enticy sa potom umiestnia v celom race orientácii alebo sa usadia v individuálnych väzbových miestach buď domény I aieoo Fab fragmentu. Toto usadzovanie sa môže uskutočniť s použitím softwaru ako je napríklad program QUANTA, po ktorom nasleduje mini realizácia energií a molekulárna dynamika s využitím štandardných silových polí molekulárnej mechaniky, ako sú napríklad programy CHARMM (Molecular Simulations, ľne., Burlington, MA ©1994 a AMBER (P. A. Kollman, University of California at San Francisco, (©1994).
Špecializované počítačové programy môžu tiež pomôcť v postupe selekcie chemických entít. Okrem ďalších k takýmto programom patria nasledujúce:
1. GRID (Goodford, P. J., 1985,J. Med. Cliern. 28: 8 4 9857) . Program GRID sa dá získať z Oxford University, Oxford, UK
2. MCSS (Miranker, AAA. and M. Karplus, 1991, Proteins.
Structore, Funttion and Genetics 11: 29-34). MCSS je dostupný od Molecular Simulations, Burlington, MA.
3. AUTODOCK ÍGooosell, D. S. and AAA. J. Olsen, 1990,
Proteins: Strutture, Function, and Genetics 8: 195-202).
AUTODOCK je dostupný zo Scripps Research Inštitúte, La Jolla, CA.
4. DOCK (Kur.tz, I. D. et al., 1 982 , J. Mol. Biol. 161:269288) . DOCK sa dá získať z University of California, San Francisco, CA.
Keď sa vhodné chemické entity vybrali, môžu sa zostaviť do jednotlivých zlúčenín. Zostavovanie môže pokračovať vizuálnou prehliadkou vzťahu entít k sebe navzájom v trojrozmernom!
zobrazení na počítačovej obrazovke vo vzťahu k štruktúrnym koordinátam komplexu hAQC2 Fab fragmentu a chimérnej al-I domény. Potom nasleduje ručné zostavenie modelu s použitím softwaru ako je napríklad program „Quanta alebo „Sybyl.
Opísané postupy vyhodnocovania chemických entít sa môžu uskutočňovať podobným spôsobom pre zlúčeniny alebo pre varianty, ktoré môžu viazať al-I doménu.
K užitočným programom, ktoré odborníkovi pomôžu v spájaní individuálnych chemických entít patria napr. nasledujúce:
1. CAVEAT (Bartlett, P. ΆΆΆ. et al, CAVEAT: A Program to
Facilitate the Szructure-Derived Design of Biologically Active Molecules. In Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems, Spacial Pub., 1989, Royal Chem. Soc., 78: 182-196). CAVEAT sa dá získať z
Universitv of California, Berkeley, CA.
2. 3D databázové systémy ako je napríklad MACCS-3D (MDL
Information Systems, San Leandro, CA) . Táto oblasť je v prehľade zhodnotená v publikácii Martin, Y. C., 1992,
J. Med. Chem. 35: 2145-2154.
3. HOOK (dostupný od firmy Molecular Simulations, Burlington, MA).
Namiesto toho, aby pokračovalo zostavovanie inhibítora alebo väzbovej zlúčeniny postupným spôsobom vždy po jednej chemickej entite, ako bolo opísané vyššie, väzbové zlúčeniny sa môžu tiež navrhnúť naraz v celku alebo de novo s použitím buď prázdneho väzbového miesta (ako je napríklad väzbové miesto al-I domény alebo hAQC2 Fab fragmentu) alebo ľubovoľne zahrnujúcu nejakú časť alebo časti známej väzbovej zlúčeniny al-I domény alebo hAQC2 Fab fragmentu. K takýmto postupom patria napr. nasleduj úce:
1. LUDI (Bohm, H.-J., 1992, J. Comp. Aid. Molec. Design 6:
8
61-73) . LUDI je dostupný od firmy Biosym Technologies, San Diego, CA.
2. LEGEND (Nishibata, Y. and AAA. Itai, 1991, Tetrahedron
47: 8985). LEGEND je dostupný od Molecular S im.u lat ions ,
Burlingccn, MA.
3. LeapFrog (dostupný od Tripos Associates, St. Louis, MO).
V predkladanom vynáleze sa môžu použiť ap ďalšie techniky molekulového modelovania, pozri napr. Cohen, N. C. et al., 1990, J Med. Chem. 33:883-894. Pozri tiež Navia, M. A. a M. A. Murcko, 1992, Curr. Opm. Struot. Biol. 2: 202-210.
Keď sa raz entita navrhne alebo vyberie už opísanými metódami, účinnosť, s ktorou sa takáto entita môže viazať k od-I doména alebo h.AQC2 Fab fragmentu, sa môže testovať a optima1izovať pomocou vyhodnocovania výpočtov. Napríklad zlúčenina, ktorá bola navrhnutá alebo vybraná, aby fungovala ako väzbová zlúčenina al-I domény, sa môže rozprestierať v objeme, ktorý sa neprekrýva s objemom, ktorý zaberá väzbové miesto, keď je viazané k chimérnej al-I doméne. Učir.ná väzbová zlúčenina al1 domény môže vykazovať relatívne malý rozdiel v energii medzi svojim viazaným a voľným stavom (t. j. malá deformačná energia väzby). Takže najúčinnejšia väzbová zlúčenina al-I domény by sa mala navrhnúť tak, aby deformačná energia väzby nebola väčšia ako približne 41,868 kJ/mol (10 kcal/mol), napr. nie väčšia ako 29,308 kJ/mol (7 kcal/mol). Väzbové zlúčeniny al-I domény môžu mteragovať s al-I doménou vo viac ako jednej kcnformácii, ktoré sú podobné v celkovej energii väzby. V takýchto prípadoch, deformačná energia väzby je rozdielom medzi energiou voľnej zlúčeniny a priemernou energiou konformácie, ktorá sa môže pozorovať, keď sa zlúčenina viaže na proteín.
Zlúčenina navrhnutá alebo vybraná ako väzbová zlúčenina al1 domény môže byť ďalej počítačovo oDcimalizovaná tak, aby v svojom viazanom stave nemala odpudivé elektrostatické interakcie s cieľovým proteínom. Takéto nekomplementérne (napr. elektrostatické) interakcie zahrnujú odpudivé interakcie typu náboj-náboj, dipól-dipól a náboj-dipól. Špecificky, suma všetkých elektrostatických interakcií medzi zlúčeninou a proteínom, keď je zlúčenina viazaný k al-I doméne, by mala byť neutrálnym alebo prospešným príspevkom k entalpii väzby.
Na výpočty deformačnej energie zlúčenín a elektrostatických interakcií je odborníkom k dispozícii špecifický počítačový Software. Príklady programov určených na takéto použitie zahrnujú: Gaussian 92, revízia C (M. J. Frisch, Gaussian, Inc., Pittsburgh, PA, ©1992), AMBER, verzia 4.0 (P. A. Kollman, University of California at San Francisco, (©1994),QUANTA/CHARMM (Molecular Simulations, Inc., Burlington, MA, ©1994), a Insight II/Discover (Biosysm Technologies Inc., San Diego, CA (©1994). Tieto programy môžu byť implementované napríklad na počítačoch (workstation) Sillicon Graphics. Ďalšie hardwarové systémy a softwarové balíky sú odborníkom tiež známe.
Jednou z ďalších techník použiteľnou pre navrhovanie liečiv, ktorú umožňuje predkladaný vynález, je iteračné navrhovanie liečiv. Iteračné navrhovanie liečiv je spôsob, ako optimalczovať vzťahy medzi proteínom a zlúčeninou (vrátane zlúčeniny, ktorou je protilátka) tým, že sa určujú a vyhodnocujú trojrozmerné štruktúry postupných súborov komplexov proteín/zlúčenina. Pri iteračnom navrhovaní liečiv sú získané série proteínových kryštálov v komplexe s entitami, ktoré sa viažu na protein, a potom sa riešia trojrozmerné štruktúry každého molekulového komplexu. Takýto prístup poskytuje možnosť nahliadnuť do spojenia medzi proteínmi a ďalšími entitami každého komplexu. To sa uskutoční tak, že sa selektujú chemické enzity s inhibičnou aktivitou, získajú sa kryštály nových komplexov, vyriešia sa trojrozmerné štruktúry komplexov a porovnajú sa spojenia (asociácie) medzi novými komplexmi a skôr riešenými komplexmi. Spojenia v komplexu sa môžu ootimalizovať tým, že sa pozoruje, ako zmeny v zložkách komplexu ovplyvňujú spoj enie.
V niektorých prípadoch íteratívny návrh liečiv sa uskutočňuje tak, že sa vytvoria postupné komplexy a potom sa kryštalizuje každý nový komplex. Alternatívne sú preforrr.ované proteínové kryštály navlhčené v prítomnosti ďalšej chemickej entity, čím sa vytvorí komplex, a tak sa odstráni nutnosť kryštalizovať každý individuálny komplex.
XII. Farmaceutické kompozície
Farmaceutické kompozície podľa tohto vynálezu obsahujú jeden alebo viac VLA-l antagonistov podľa predkladaného vynálezu (napr. anti-VLA-1 protilátky a VLA-l antagonisty typu malej molekuly, ktoré boli identifikované vyššie opísaným spôsobom: racionálneho návrhu liečiv) alebo ich farmaceutický prijatelné deriváty. Kompozične môžu ďalej obsahovať farmaceutický prijatelný nosič, ako napríklao adjuvans, vehikulum., pufor a stabilizátor.
Farmaceutické kompozície podľa tohto vynálezu môžu byť podávané perorálnou, topickou, intravenóznou, subkutánnou, intrsperitoneálnou, intramuskulárnou, intramedulárnou, intraarteriálnou, mtraartikulárnou, intrasynoviálnou, intrasternálnou, intrate káInou, mtrahepatickou, intraspinálnou alebc intrakraniálnou cestou podľa požiadaviek, alebo priamo lokálne do miesta zápalu alebo· rastu nádoru. Farmaceutické kompozície podlá tohto vynálezu sa môžu tiež podávať inhaláciou, napr. pomocou nebulizéra, inhalátora pre suchý prášok alebo inhalátora s odmeranými dávkami, a/alebo implantáciou infúznej pumpy alebo biologicky kompatibilného implantátu s predĺženými uvoľňovaním priamo dc tela pacienta.
Farmaceutické kompozície môžu byť tiež vo forme sterilného prípravku pre injekciu, napríklad sterilné vodr.é alebo olejové suspenzie pre injekciu. Takéto suspenzie sa môžu formulovať postupy, ktoré sú v odbore známe, s použitím vhodných dispergačných, zmáčacích a suspendujúcich činidiel. Ak je orípravok podávaný perorálne, potom farmaceutická kompozícia sa môže podávať vo forme tobolky, tablety, vodnej suspenzie alebo roztoku. Na topické aplikácie farmaceutické kompozície sa môžu formulovať ako vhodné masti.
Dávka a dávkovací režim VLA-1 antagonistov podľa tohto vynálezu, ktoré sú účinné pre dosiahnutie požadovaného účinku, závisí na celom rade faktorov, ako napríklad povaha ochorenia, ktoré sa lieči, velkosť pacienta, požadovaný ciel liečby, použitá špecifická farmaceutická kompozície a názor ošetrujúceho lekára.
Použiteľné sú napr. dávkové hladiny účinnej zložky medzi približne 0,001 a približne 100 mg/kg telesnej hmotnosti za deň, napríklad medzi približne 0,1 a približne 50 mg/kg telesnej hmotnosti za deň. Napríklad protilátka podlá vynálezu sa bude podávať v dávkach v rozsahu od približne 0,01 mg/kg telesnej hmotnosti za deň a približne 20 mg/kg telesnej hmotnosti za deň, napr. v rozsahu od približne 0,1 mg/kg telesnej hmotností za deň a približne 10 mg/kg telesnej hmotnosti za deň, a to v intervaloch raz denne až raz za štrnásť dní.
V inom uskutočnení je protilátka podávaná v dávke približne 0,3 až 1 mg/kg telesnej hmotnosti, pokial je podávaná intraperitoneálne. V ešte ďalšom uskutočnení je protilátka podávaná v dávke približne 5 až 12,5 mg/kg telesnej hmotnosti, keď je podávaná intravenózne. V ďalšom uskutočnení je protiiátková kompozícia podávaná v množscve, ktoré je dostatočne účinné na to, aby poskytlo plazmatickú hladinu protilátky aspoň 1 mg/ml.
r. n Z
XIII. Ochorenia a nodelv na zvieratách
VLA-1 antagonisti pódia predkladaného vynálezu sú užitoční pri liečení, vrátane prevencie, αΐβι-sprostredkovaných ochorení ako sú napríklad ochorenia už vymenované vyššie. Liečenie s použitím prípravkov podľa tohto vynálezu je účinné tak u ludí ako aj u zvierat, postihnutých uvedenými ocncreniamt. Zvieratá, u ktorých je vynález použiteľný, zahrnujú tak domáce ako aj hospodárske zvieratá, chované buď ako domáce maznáčiky alebo na komerčné účely. Príkladom sú psy, mačky, dobytok, kone, ovce, prasce a kozy.
Účinnosť VLA-1 antagonistov podlá vynálezu sa môže testovať na rôznych zvieracích modeloch. Napríklad k užitočným modelom, psoriázy a artritídy patria modely opísané v WO00/72881. K modelom fibrózy obličiek patria modely opísané v WO 59/61040, model Alportovho syndrómu obličiek je opísaný v Cosgrcve et al., 2000, Am. J. Path. 157: 164 9-1659 a model lupus nephritis na SNF1 myšiach je opísaný v Kailed et al., 2001 , Lupus 10: 9-22. Model vaskulárnej fibrózy pre restenózu zahrnuje model poškodenia karotídy balónikom u laboratórneho potkana opísaný v Smith et al., 1S9S, Circ. Res. 64: 1212—1222. 'lode! fibrózy pľúc modelujúci idiopatickú pľúcnu fibrózu a pľúcnu ftbrózu asociovanú so sklerodermou zahrnuje model bleomycínom indukovanej pľúcnej fibrózy opísaný vo Wang et al., 1999, Thorax 54: 805-812. Modely cirhózy pečene pre hepatitídu C alebo pre alkoholom indukovanú cirhózu zahrnuje mocel s ligáciou žlčovodu opísaný v George et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 12719-12724 a model CCLA-tndukovanej fibrózy pečene opísaný v
Shi et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:
i 663-10668.
Účinnosť liečenia s použitím prípravkov podlá tohto vynálezu sa môže hodnotiť radom dostupných diagnostických prostriedkov, vrátane fyzikálneho vyšetrenia, krvných testov, merania preteínurie, hladiny kreatinínu a clesrance kreatínínu, funkčného pľúcneho testu, rôntgenu hrudníka, bronchoskópie, bronchoalveolárnej laváže, biopsie pľúc, hladín dusíka v plazme, krvi a moči (BUN), pozorovanie a skórovanie jazvenia alebo fibrotíckých lézii, depozitu extracelulárneho matrixu, napríklad kolagénu, aktínu hladkého svalstva a fibronektínu, funkčných testov obličiek, a vyšetrenia pomocou ultrazvuku, zobrazovania pomocou magnetickej rezonancie (MRI) a vyšetrenia počítačovou tomografiou (CT).
XIV. Diagnostické postupy
Protilátky podľa tohto vynálezu sa môžu použiť na diagnostické stanovenie ochorení asociovaných so zmenami expresnej hladiny αϊβΐ. Tkanivová vzorka pacienta, ako napríklad tkanivová biopsia, vzorka telesnej tekutiny alebo laváž (napr. alveolárna laváž), sa môže testovať v teste založenom na zachytení antigénu, ELISA teste, imunohistochemickom teste a pod., s použitím protilátky. Tkanivová vzorka z normálneho zdravého jedinca sa použije ako kontrola.
Pri uskutočnení predkladaného vynálezu sa využijú, pokiaľ nie je; špecificky uvedené inak, zvyčajné techniky bunkovej biológie, tkanivových kultúr, molekulárnej biológie, mikrobiológie, rekombinantnej DNA, proteínovej chémie a imunológie, ktoré sú odborníkom známe a patria k ich rutinným schopnostiam. Takéto techniky sú opísané v odbornej literatúre, napríklad Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (Sambrook et al., Eds.), 1989, Oligonucleotide Synthesis, (M. J. Gaít, Ed.), 1984, U. S. Patent 4,683,195, Mullis et al., Nucleic Acid Hybridization, (B. D. Hames and S. J. Higgins) , 1984 ,
Transcription and Translation, (B. D. Hames and S. u. Higgins), 1984, Culture of Animal Cells (R. I. Freshney, Ed.), 1987,
Immobiiized cells and Enzymes, IRL Press, 1986, A. Practical 1984, Methods in . , Eds . ) , Academic
Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), Enzymology, Volumes 154 and 155 (Wu et al
Press, New York, Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos, Eds.j, 1987, Inmunochemical Methods in Celí and Molecular Biology (Mayer and Walker, Eds.j, 1987, Handbook cf Experiment Immunolcgy, Yolumes I-IV (D. M. Weir and
C. C. Blackwell, Eds.j, 1966, Manrpulating the Mouse Embryo, 1986.
Ak nie je uvedené inak, v š použité v tom.ro texte majú r rozumie odborník v príslušnom c tento vynález. Príklady metód a keď v praxi alebo testoch podie tiež použiť metódy a materi; s tými, ktoré sú opísané v tc ďalšie odkazy, ktoré sú uvedené celé zahrnuté v predkladanej pr rozhodujúci predkladaný opis, Materiály a metódy, a tiež uvede a nijako predkladaný vynález nec =tky technické a vedecké termíny evnaaý význam, ako mu zvyčajne tbore techniky, do ktorého spadá materiálov sú opísané nižšie, aj predkladaného vynálezu sa môžu ly podobné alebo ekvivalentné m.to texte. Všetky publikácie a v tomto texte, sú formou odkazu ihláške. V prípade konfliktu, je vrátane uvedených definícií, m.é príklady, sú iba ilustratívne :omedzu j ú.
V tomto opise a nárokoch, termín obsahovať alebo jeho tvary (obsahuje alebo obsahujúce) je treba rozumieť tak, že znamená zahrnutie daného celér.o čísla alebo skupiny celých čísel, are pritom nevylučuje akékoivek ďalšie celé čísla alebo skupiny celých čísel.
Nasledujúce príklady, ktoré sú poskytnuté s cielom podrobnejšie objasniť predkladaný vynález, nijako neobmedzujú rozsah vynálezu.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Chemické činidlá
Izotiokyanát fluorescein (SITCJ sa kúpil od firmy Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Krotonový olej sa kúpil od ICN
Biochemicals (Aurors, OH) . Plné ovčia krv v Alseverovom roztoku bola získaná od East Acres Biologicals (Southbrídge, MA). Kolagén typu ľ z chvosta laboratórneho potkana a myšací kolagén typu IV boli kúpené od Collaborative Research Inc. (Bedford, MA) a Gibco (Gaithersburg, MD), v danom poradí.
Samice myší Balb/c vo veku 6 až 8 týždňov boli kúpené od firmy Taconic (Germantown, NY) a myši αΐβΐ-deficientné s Balb/c základom boli získané ako bolo opísané skôr (3).
Príklad 1
Monoklonálne protilátky
Funkciu-blokujúce monoklonálne protilátky (mAb) proti myšacím antigénom boli pripravené vo forme bez azidu a s nízkym obsahom endotoxínu: Ha31/8 (škrečia anti-CD49a, integrín al) (Mendrick et al. 1995. Lab. Invest. 72: 367-375), Hal/29 (škrečia anti-CD49b, integrín α2) (βΐ) (Mendrick et al. 1995. Lab. Invest. 72: 367-375, Mendrick, D. L. and D. M. Kelly 1993 Lab. Invest. 69: 690-702), škrečia kontrolná mAb Ha4/8 skupiny II (škrečia antr-KLH) (Mendrick, D. L. and D. M. Kelly 1993 Lab. Invest. 69: 690-702) a PS/2 (potkaní anti-CD49d, reťazec integrín α4β1) (Miyake et al. 1991 J Exp. Med. 173: 599-607). Okrem toho, nasledujúce funkciu-blokujúce monoklonálne protilátky proti myšacím antigénom boli kúpené ako preparáty bez azidu/s nízkym obsahom endotoxínu od firmy Pharmingen (San Diego, CA) : ΗΜβΙ-1 (škrečia anti- CD29, reťazec integrín βΐ) (Noto et al. 1995 Int. Immunol. 7:835-842), Ha2/5 (škrečí antiCD29, reťazec integrín βΐ) (Mendrick, D. L. and D. M. Kelly 1993 Lab. Invest. 69: 690-702), 3E2 (škrečí anti-CD54, ICAM-1) (Scheynius et al. 1993 J. Immunol. 150: 655-663), 5H10-27 (potkania anti-CD49e, integrín a5) (Kinashi, T., and T. A. Springer. 1994. Blood Cells. 20: 25-44), GoH3 (potkania antiCD49f, integrín a6) (Sonnenberg et al. I987J, Biol. Chem. 262:
10376 -10383) a potKania izotypová kontrolná monoklonálna
proti látka R33-95 (potkania IgG2a) a R35-38 (potkania Ig32o).
Testy adhézie Splenocyty z 3alb/c myší sa kultivovali 7 až 12 dní s 20
ng/ml IL-2. Aohézia buniek ku kolagénu typu I a typu IV bola
taká, ako už bolo skôr opísané (Gotwais et al. 1996J. Clin.
Inves- z. 97: 2469-2477). Stručne, 96 jamkové doštičky Maxisorp
dune , Napierville, ÍL) boli potiahnuté buď 1C pg/mi kolagénu
t ypu IV alebo 5 pg/ml kolagénu typu I a nešpecifické miesta sa
blokc žali s 11 BSA. IL-2 aktivované splenocyty sa označili s 2
3CECF [pentaacetoxymetylester 2 ' ,7'-bis(karboxyetyl)-
5(6) k; zrboxylfluoresceínu] (Molecular Probes, Eugene, OR) a
m kube zvali 15 mbnút s 10 pg/'ml uvedenej protilátky. 105 buniek v
0, 251 BSA v RPM1 sa potom pridalo k potiahnutým jamkám a
mkub: zvalo· 60 minút pri 37 °C. Nenaviazané bunky sa odstránili
premy: zím trikrát s 0,25% BSA v RPM1. Achézia sa kvánt i f i ková la s
použi: zím čítacieho zariadenia Cytofluor 2350 pre fluorescenciu
na dc: (tičkách (Millipore, Bedforč, MA) .
vstup: Zmeral sa pomer naviazaných buniek k celkovému počtu zjúcich buniek a vyrátalo sa percente adhézie vzhľadom na
bunky ošetrené kontrolnou protilátkou (normalizované k 100%).
Odrátz :ii sa hodnoty pozadia spôsobené bunkovou adhéziou na jamxy
potia? znuté samotným BSA.
Exprez ?ná a funxčná blokáda αϊβΐ a α1β2 aktivovaných leukocytov
c: co v- zhladom oa kľúčovú úlohu leukocytov pri zápale, pôvodcovia z zhodli cestovať, či anti-al a anti-a2 monoklonálne
protil .átky boli schopné blokovať adhéziu leukocytov ku kolagénu.
Aby s: ?. získali leukocyty exprimujúce vysoké hladiny tak al ako
a; a2, myšacie ľ lymfocyty sa stimulovali 7 až 12 dní in vitro s IL-2. Tieto bccky exprimovall vysoké hladiny tak al ako aj «2 (Obr. IA) a viazali sa dobre k obidvom povrchom potiahnutým kolagénom typu IV a typu I (Obr. 1B) . Adhézia ku kolagénu typu IV bola čiastočne inhibovaná samotnou anti-αΐ mAb, a inhibovaná nebola samotnou snti-a2 mAb. Na rozdiel od toho adhézia ku kolagénu typu I bola kompletne inhibovaná anti-a2 mAb, a anti-al mAb samotná prejavovala iba parciálnu inhibíciu. Tak anti-βΐ mAb ako aj kombinácia anti-al a anti-a2 mAb úplne inhibovali adhéziu ku kolagénu typu I a IV. Potom, čo sa ukázalo, že integríny αϊβΐ a α1β21 sú exprimcvané na aktivovaných T lymfocytoch a že antial a a2 monoklonálne protilátky sú schopné funkčne blokovať adhéziu leukocytov ku kolagénu, tieto monoklonálne protilátky sa použili na in vivo skúmanie úlohy uvedených integrínov na zvieracích modeloch zápalových ochorení.
Príklad 2
Inhibícia CTH protilátkami reakcie anti-integrínovými monoklonálnymi
SBBC-indukovaná hypersenzitívna reakcia oneskoreného typu (DTH) sa adaptovala z už skôr publikovaného protokolu (Hurtrel et al., 1992, Celí. Immunol. 142: 252-263). Krátko, myši sa imunizovali na chrbte s.e. injekciou dávkou 2 x 1CĎ SRBC v 100 μΐ PBS v deň 0. Myši sa druhý krát s. c. injikovali (uskutočnila sa tzv. antigénna výzva, „challenge) v deň 5 dávkou 1 x 108 SRBC v 25 pl PBS do pravej labky. Hrúbka labky sa merala inžinierskym posuvným meradlom (kaliperom) firmy Mitutoyo/MTI, Paramus, NJ, 20 hedín po expozícii antigénu a vyrátala sa miera opuchu labky. Výsledky sú uvedené ako priemerná hodnota percentuálneho nárastu hrúbky labky ± stredná chyba priemeru (SEM) a vyrátali sa ako % zvýšenie = [1- (hrúbka pravej labky 20 hodín po expozícii antigénu/ hrúbka neinjikovanej lavej labky 20 hodín po expozícii antigénu)] x 100. Na zablokovanie efektorovej fázy SRBC-indukovanej DTH reakcie sa terapeutické alebo kontrolné mAb (100 pg) , ktoré boli pripravené postupmi opísanými v príklade 1, podávali i. p. 1 hodina pred antigénnou výzvou v deň 5 .
SRBC-indukovaná DTH je dobre charakterizovaný rn vivo modeí zápalu, konkrétne psoriázy, ktorý sa použil na demonštráciu významu celého radu cytokínov a aďr.éznych molekúl pri zápale (Tedder et al., 1995,J. Exp. Med. 18 1: 2259-2264, Terashita at a 1. , 19 96, J. Immunol. 1 56: 4638-4 643) . SRBC-senzibrlizované myši dostala anti-integrínovú mAb 1 hodinu pred antigénnou výzvou uskutočnenou na chodidle a zápal sa vyhodnotil po 20 hodinách ako miera zväčšenia hrúbky labky. Kontrolné myši ošetrené PBS a kontrolné myši ošetrené škrečou Ig ukázali 60 až 70% zvýšenie hrúbky labky 20 hodín po antigénnej výzve (obr. 2). V porovnaní s kontrolou ošelreacu škrečím Ig, antí-al alebo anti-a2 mAb spôsobili 68% a 60% inhibíciu v hrúbke labky, v danom poradí. Kombinácia z anti-al a anti-o'2 mAb spôsobila 71% inhibíciu, čo ukázalo na velmi malý aditívny účinok prcti samotným anti-αΐ alebo anti-a2 mAb. Ošetrenie ďalšou antiintegrínovou mAb bolo tiež účinné pri inhibícii efektorovej reakcie DTH. Miera inhibície pozorovaná pre rôzne mAb bola 49% (anti-o.4), 23% (anti-oS) a 57% (anti-a6). A. nakoniec mAb blokáda všeobecnej integrínovej podjednotky 31 (mAb HMBI-1) spôsobila inhibíciu efektorevej DTH reakcie o 67%.
P r í k 1 a o 3
Inhibícia CHS efektorovej reakcie anti-integrínovými monoklc.nálnyrr.i protilátkami
Kontaktná hypersenzitivita (CHS) na FITC sa testovala ako bolo opísané skôr (Gašpari et al., 1991, Current Protocols in
Immunology. J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, and W. Strober, editors. John Wiley & Sons, New York. Sekcia 4. 2: i). Krátko, myši boli senzibilizované nanesením 100 pl 0,5% FITC v zmesi 1:1 acezón/dibutylftalát na oholený chrbát v deň 0, po 10 dňoch sa uskutočnila antigénna výzva („challenge) nanesením 5 gl 0,5% FITC na obrdve strany každého ucha. Reakcia opuchu ucha sa hodnotila hrúbkou ucha meranou inžinierskym posuvným meradlom. (Mitutoyo/MTI, Paramus, NJ) v čase antigénnej výzvy (deň 10) a o 24 hodín neskôr a výsledky boli uvedené ako priemerné percentuálne zvýšenie bazálnej hodnoty hrúbky ušnice i SEM (stredná chyba priemeru).
Zvýšenie hrúbky ucha sa vyrátalo ako % zvýšenie = [1(hrúbka ucha 24 h po antigénnej výzve/hrúbka ucha v okamžiku antigénnej výzvy)] x 100. Na zablokovanie efektorovej fázy CHS reakcie, terapeutické alebo kontrolné mAb (250 pg) sa podávali i. p. 4 hodiny pred antigénnou výzvou v deň 10. Myší, ktoré bolí antigénne-senzibilizované iba vehikulom a tiež do ucha sa injikovalo samotné vehikulum (vehikulová kontrola) alebo myši, u ktorých sa uskutočnila antigénna výzva ucha bez predchádzajúcej senzibrlrzácie (kontrola iritujúcim činidlom), slúžili ako negatívne kontroly (nikdy neprekročili 2% zvýšenie hrúbky ucha).
Vzhladom na to, že CHS je podľa mechanizmu zreteľne odlišný od DTH a podieľajú sa na ňom tiež odlišné efektorové bunky, pôvodcovia skúmali, aké účinky majú anti-integrínové mAb na efektorovú fázu CHS reakcie. Myši boli hapténovo senzibilizované s použitím FITC naneseným na vyholený chrbát, potom nasledovala o 10 dní neskôr FITC výzva aplikáciou na uši, ktorá spôsobila zápalovú reakciu nasledujúci deň. FITC-senzibilizované myši vykazovali 60-70% zvýšenie hrúbky (ucha) 24 hodín po antigénnej výzve (obr. 3). V súlade s publikovanými výsledkami (Scheynius et al., J. Immunol. 150: 655-663), liečenie podávaním anti-ICAM1 mAb spôsobilo 51% inhibíciu opuchu ucha. V porovnaní s kontrolnou škrečou mAb, liečba myší podávaním anti-αΐ alebo anti-a2 mAb 4 hodiny pred antigénnou výzvou spôsobila 37% a 57% inhibíciu opuchu ucha, v danom poradí (obr. 3). Kombinácia anticxl a anti-a2 mAb spôsobila mierne vyššiu inhibíciu opuchu ucha (65%) .
Liečenie ďalšou mAb proti βι integrínu odhalilo, že zatiaľ čo mAb anti-«4 a anti-c<5 nespôsobili žiadnu inhibíciu FITCindukovanej CHS efektorovej reakcie v porovnaní s konorolnou mAb laboratórneho potkana, liečenie anui-06 m.Ab spôsobilo 86% inhibíciu efekoorcvej reakcie. A nakoniec mA’o blokáda spoločnej βΐ integrínovej podjednotky inhibovsha CHS efektorovú reakciu c 74 %. Podobné CHS výsledky sa získali s použitím rôznych kmeňov myší (C57 ,/BL6, 12 9/Sv) a rôznych senzibilizujúcioh činidiel (cxazolonj (dáta nie sú ukázané) . Podobne ako výsledky pozorované u SRBC-indukovaného modelu DTH, histologické analýzy uší so zápalom odhalili, že uak vytváranie edému ako aj infiltrácia leukocytov boli inhibované podávaním anti-«l a anti«2 mAb.
V súlade so zisteniami, že αϊβΐ a α2β1 sa .môžu exprimovat’ na IL-2-aktivovaných splenocyton, analýza lymfatických uzlín z antigénom senzibilizovaných myší (FITC alebo oxazolon) ukázala, že αϊβΐ a «2β1 sú exprimované výhradne na CD44ni LFA-lhl aktivovaných CD4+ a CD8+ T lymfocyicch (dáta nie sú uvecené). Liečenie myší podávaním, anti-al a anti-al mAb nespôsobilo odstránenie týchto buniek, keď množstvo aktivovaných T lymfocytov tak v slezine ako aj lýmfaticrých uzlinách zostalo neovplyvnené v reakcii na senzibilizáciu antigénom v CHS modeli. Okrem toho, efektorové bunky sa funkčne neodstránili, keď dlhodobé liečenie antigénom senzibilizovaných. myší anti-al a anti-a2 mAb (deň 10 až 16) neovplyvnilo zápalové reakcie myší, u ktorých sa aplikovala antigénna výzva v deň 20 (dáta nie sú uvedené) .
Príklad 4
CHS efektorové reakcie sú znížené u o.íβΐ-deficientných myší
Aby sa vylúčila možnosť, že inhioičná úloha αϊβΐ v efektorovej reakcii FITC-sprostreokovanej CHS sa sprostredkovala monoklonálnou protilátkou, experimenty sa uskutočňovali u myší divého typu a myší deficientných na αϊβΐ (obr. 4). Inhibícia mAb efektorovej fázy u myší divého typu bola zhodná s predchádzajúcimi výsledkami, keď 56% inhibícia v hrúbke ucha sa pozorovala s anti-al, 56% s anti-a2 a 62% s kombináciou anti-al a anti-a2. Efektorová fáza CHS bola významne redukovaná u neošetrených αΐβΐ-deficientných myší v porovnaní s neošetrenými myšami divého typu (30% vs. 71% zvýšenie v hrúbke ucha, v danom poradí). Ako sa dalo očakávať, miera opuchu ucha u neošetrených αΐβΐ-deficientných myší bola ekvivalentná s mierou opuchu ucha pozorovanou u myší divého typu podrobených pôsobeniu anti-al mAb. A nakoniec, mAb blokáda α2β1 a αΐβΐ-deficientných myší spôsobila iba mierne zvýšenú inhibíciu opuchu ucha, čo bolo v súlade s pozorovaním u myší divého typu podrobených pôsobeniu kombinácie anti-al a anti-a2 mAb.
Príklad 5
Aby sa ďalej vylúčila možnosť, že inhibičný účinok antiintegrínových mAb, pozorovaný tak u DTH ako aj CHS modelov zápalu, je spôsobený všeobecným proti zápalovým účinkom sprostredkovaným anti-al a anti-a2 mAb, skúmal sa účinok mAb na dermatitídu vyvolanú dráždivým činidlom (iritantom).
Na hodnotenie dermatitídy vyvolanej iritantom sa myšiam nanieslo 5 μΐ 0,8% krotonového oleja v acetóne na obidve strany každého ucha. Terapeutické alebo kontrolné protilátky sa podávali 4 hodiny pred použitím íritantu. Opuch ucha sa meral o 24 hodín neskôr, ako bolo opísané vyššie, a porovnal sa s hrúbkou ucha pred aplikáciou krotonového oleja. Výsledky sú uvádzané ako priemer percentuálneho zvýšenia bazálnej hodnoty hrúbky ucha ± SEM, ako bolo opísané vyššie. Myši, u ktorých sa aplikoval samotný acetón (kontrola vehikulom) slúžili ako negatívna kontrola.
Za 24 hodín uši .myši podrobené pôsobeniu krotonového oleja vykazovali významné zvýšenie hrúbky ucha (48%) v porovnaní s myšami, kcoré dostávali samotné vehikulum (acetón). Toxické opuchy ucha spôsobené kreténovým olejom neboli významne ovplyvnené u myši dopredu ošetrených anti-al alebo anti-u2 mAb v porovnaní s kontrolnými zvieratami ošetrenými buď PBS aleoo kontrolní rmAb (obr. 5). Histologické vyšetrenie uší ošetrených krotonovým. olejom neodhalilo žiadne rozdiely v počte alebo type infiltrujúcich buniek alebo tvorbe edému u myší podrobeným pôsobeniu anti-al alebo antl-a2 mAb v porovnaní s myšami ošetrenými kontrolnou mAb alebo PBS (dáta nie sú uvedené).
Príklad 6
Inhibícia artritídy podávaním αϊβΐ a α1β2
Keďže αϊβΐ je dobro exprimovaný na infiltrujúcich bunkách v synovia pacientov s artritídou, pôvodcovia sa rozhodli skúmať, či antr-al alebo anti-a2 rmAb by pôsobili ako inhibičné v skôr opísanom zrýchlenom modeli artritídy (Terato et al., 1992, J Imm.unol. 148: 21 03-2108, Terato et al., 1995, Autoimmunrty 22: 13 7-147) .
Súpravy artrogén-CIA protilátok boli kúpené od Stratagene (La Jclla, CA) a artritída sa indukovala s použitím zavedeného protokolu (Terato et al., 1992, J. Immunol. 148: 2103-2108, Teratoet al., 1995, Autoímmunity 22: 137-147). Krátko, artritída sa indukovala podávaním i. p. injekcie koktejlu z 4 mAb antikolagén typu 11 (1 mg každej) v deň 0, potom nasledovala i. p. injekcia 51 pl LPS v deň 3. V priebehu ďalších 3-4 dn.í sa u myší vyvinuli cpucr.y zápästí, členkov a prstov. Terapeutické alebo kontrolné rmAb (250 pg) sa podávali i. p. 4 hodiny pred injekciou anti-kolagénových mAb v deň 0 a znova 4 hodiny pred podaním LPS v deň 3 a octom podávanie pokračovalo každý 3. deň po celú dlžnú trvania experimentu. Počínajúc dňom 3 sa myši vyhodnocovali na rozvoj artritídy. Závažnosť artritídy v každej končatine sa zaznamenávala s použitím štvorbodového systému: 0 = normálne, 1 = mierne sčervenanie, nepatrný opuch členka alebo zápästia, 2 == mierny opuch členka alebo zápästia, 3 = závažný opuch vrátane niektorých prstov, členka a labky, 4= maximálny zápal.
Závažná artritída sa u Balb/c myší vyvinula za 72 hodín po LPS injekcii a pretrvávala viac ako 3 týždne. Ani injekcia antikolagénových mAb samotných, ani LPS samotného neindukovala artritídu. Myši dostávajúce kontrolnú mAb vykazovali rovnako závažnú artritídu ako sa pozorovala u myší, ktorým sa podával PBS (Obr. 6) . Na rozdiel od toho, liečba anti-al mAb samotnou spôsobila výrazné potlačenie (78%) artritídy, ktoré trvalo po celý čas experimentu. Liečba anti-a2 mAb samotnou mala tiež priaznivý účinok, spôsobila 32% zníženie artritického skóre v porovnaní s myšami liečenými kontrolnými mAb. Kombinácia anti-al a anti-a2 mAb spôsobila podobnú mieru inhibície aká bola pozorovaná pre anti-al mAb samotnú.
Príklad 7
Histologická analýza účinku liečenia anti-al a anti-a2 mAb na zápalový bunkový infiltrát
Ďalšie histologické analýzy SRBC-indukovanej DTH reakcie potvrdili schopnosť anti-al a anti-a2 mAb liečby modulovať vyvolanú zápalovú reakciu. Vankúšiky labky (ďalej skrátene labky) bez aplikácie antigénnej výzvy u SRBC-senzibilizovaných myší skutočne nevykazovali žiadny zápalový bunkový infiltrát, v porovnaní s chodidlami po SRBO-výzve u rovnakých myší. Liečenie SRBC-senzibilizovaných anti-al a anti-a2 mAb, buď samotnými alebo v kombinácii, spôsobilo redukciu počtu infiltrujúcich buniek zistených v labkách po SRBC-výzve, v porovnaní s myšami liečenými kontrolnou mAb. Podrobnejšie vyšetrenie infiltrujúcich buniek odhalilo, že väčšinu buniek predstavovali neutrofily, s výskytom niekoľkých monocytov a lymfocytov, a potvrdili tak, že liečba anti-αΐ a anti-a2 mAb spôsobuje velké zníženie počtu týchto buniek.
Príklad 8
Imunohistochemické demonštrácia buniek exprimujúcich αϊβΐ v zápalovom infiltráte imunohistochemické vyšetrenie sa uskutočnilo podrobnejšie kvôli presnejšiemu určeniu povahy infiltrujúcich buniek a na zistenie toho, či exprimujú integríny viažuce kolagén. Infiltrujúce bunky zo zapálených chodidiel neošetrených myší sa vyšetrili na expresiu αϊβΐ integrínu a výskyt markerov bunkových línií. Expresia αϊβΐ integrínu sa zistila na mnohých infiltrujúcich leukocytoch. Dvojaké imunohistochemické označenie sa použilo na rozpoznanie povahy infiltrujúcich buniek a distribúciu αϊβΐ expresie. S použitím markerov bunkových línií sa zistilo, že infiltrát je zložený prevažne z granulocytov/rnonocytov (Mac-1+), pričom mnohé z týchto buniek sú neutrofily (Grl+), spolu s menším, počtom T lymfocytov (CD3+). Expresia αϊβΐ integrínu sa zistila u všetkých iroch podmnožín buniek, s al exprimovancu na podmnožine Mac-1+ granulocytov/rnonocytov, podmnožine Grl+ neutrofilov a na väčšine infiltrujúcich CD3+ T lymfocytov. Detailná imunohistochemická analýza odhalila, že aj keď liečenie anti-αΐ a anti-c<2 mAb redukovalo m.nožsovo infiltrujúcich buniek, nepozorovala sa žiadna zmena v zložení infiltrátu (dáta nie sú uvedené). Imunohistochemické vyšetrenie s farbením pomocou EľTC antiškrečcu mAb potvrdilo schopnosť anti-ai a anti-a2 mAb lokalizovať sa do zapálenej labky (dáta nie sú uvedené).
Príklad 9
Inhibícia artritídy mAb proti αϊβΐ a α1β2 u αΐβΐ-deficientných myší
Keďže αϊβΐ je dobre exprimovaný na infiltrujúcich bunkách v synoviu pacientov s artritídou, pôvodcovia sa rozhodli skúmať, či anti-al alebo anti-a2 mAb by pôsobili ako inhibičné v skôr opísanom zrýchlenom modeli artritídy (Terato et al., 1992, J Immunol. 148: 2103-2108, Terato et al., 1995, Autoimmunity 22: 137-147) .
Tento model zahrnuje injekciu koktejlu z 4 mAb anti-kolagén typu II (1 mg každej) v deň 0 do myší, nasledovanou podaním LPS, čo spôsobí v priebehu ďalších 3-7 dní vývoj artritídy.
Myši dostávali mAb každý 3. deň počínajúc dňom 0 a vyhodnocovali sa na rozvoj artritídy tiež každý 3. deň. Závažná artritída sa vyvinula u všetkých myší za 72 hodín po LPS injekcii a pretrvávala viac ako 3 týždne. Ani injekcia antikolagénových mAb samotných ani LPS samotného neindukovala artritídu. Myši dostávajúce kontrolnú mAb vykazovali rovnako závažnú artritídu ako sa pozorovala u myší, ktorým sa podával PBS (Obr. 7). Na rozdiel od toho, liečenie samotnou anti-al mAb spôsobilo výrazné potlačenie (79% a vyššie) artritídy, ktoré trvalo po celý čas experimentu. Liečenie samotnou anti-a2 mAb malo tiež priaznivý účinok, spôsobilo 37% zníženie artritického skóre v porovnaní s myšami liečenými kontrolnými mAb. Kombinácia anti-al a anti-a2 mAb spôsobila podobnú mieru inhibície aká sa pozorovala pre anti-al mAb samotnú.
Redukcia artritického skóre podávaním anti-al mAb sa pozorovala u všetkých myší a porovnanie vyznelo priaznivo oproti iným mAb na liečenie artritídy, ako je napríklad fúzny prcceín rozpustného TNF receptora a Ig (Mori et al., 1996, J. Immunol. 157: 31783182), anti-Mac-1 (Taylor et al., 1996, Imrnunology. 88:
315-321), anti-a4 (Seiffge, 1996, J. Rheumatol. 23: 2056-2591) a anti-ICAM-1 (Kakimoto et al., 1992, Celí Immunol. 142: 326-337). V zhode s údajmi založenými na mAb ukazujúcimi dôležitú úlohu αϊβΐ pri artritíde, neošetrené αΐ-deficientné myši vykazovali významné zníženie artritického skóre v porovnaní s divým typom myši.
Príklad 10
Účinky liečenia anti-al mAb na imunopatológiu artriuických kĺbov
KÍby z divého typu artritickej myši (deň 8) dostávajúcej buď kontrolnú mAb alebo anti-al mAb sa porovnávali vizuálne a histologický s kĺbmi z normálnych neošetrených myší. 77izuálne kĺby z kontrolnej mAb-ošetrenej myši demonštrovali sčervenanie a opuch celej nohy vrátane prstov, zatiaľ čo myši liečené anti-al mAb vykazovali malé, pokial vôbec, známky zápalu buď v kĺboch alebo prstoch.
Histologické vyšetrenie ukázalo závažné zmeny na artritických kĺboch po ošetrení s kontrolnou mAb, s rozsiahlou infiltráciou subsynoviálnych tkanív bunkami zápalovej reakcie, adhéziu buniek na povrch kĺbu a značnú deštrukciu chrupavky, čo dokazuje stratu proteoglykánov. V súlade s predchádzajúcimi publikáciami (Terato et al., 1992, J. Immunol 14c: 2103-2108,
Terato et al., 1995, Autoimmunity 22: 137-147), bola väčšina infiltrujúcich buniek v tomto modeli neutrofily. liečoa myši s anti-al mAb dramaticky redukovala množstvo zápalového infiltrátu a mieru deštrukcie chrupavky.
Príklad 11
Rozvoj artritídy je oneskorený v prítomnosti lymfocytov a inhibícia artritídy anti-al mAb nastáva pri absencii lymfocytov
Aby sa určilo to, aké bunkové typy by mohli byť dôležité v modeli kolagén mAb-indukovanej artritídy, pôvodcovia porovnali schopnosť myší B6-129 divého typu a B6-129 RAG-l-deficiencných myší rozvinúť artritídu (obr. 8). Genetická delécia génov RAG-1 (rekombinácia aktivujúca gén 1) spôsobila úplnú stratu zrelých T a B lymfocytov (Mombaerts et al., 1992, Celí 68:869-897) . Tak u myší divého typu ako aj u RAG-l-def icientných myší sa vyvinula artritída, aj keď kinetíka indukcie u RAG-l-deficientných myší bola významne pomalšia (obr. 8). Výsledky ukazujú na to, že zatial čo lymfocyty sú zapojené do tohto modelu artrtcídy, nie sú vyžadované na rozvoj a priebeh ochorenia. Iné publikácie skúmajúce účinok RAG-1 deficientných myší v ďalších modeloch artritídy tiež zistili, že strata T a B lymfocytov oneskoruje nástup artritídy (Plows et al., 1999, J. Immunol. 162:10181023) .
Liečenie tak myší divého typu ako aj RAG-l-deficientných myší anti-αΐ mAb kompletne inhibovalo artritídu (obr. 8). Výsledky demonštrujú, že účinnosť anti-αΐ mAb v tomto modeli nie je závislá na prítomnosti lymfocytov, a že účinnosť anti-αΐ mAb v prevencii ochorenia môže byť prostredníctvom jej pôsobenia na ďalšie αΐ-exprimujúce bunky, ako napríklad makrofágy a neutrofily, ako sa už navrhlo v predchádzajúcich experimentoch (obr. 7).
Príklad 12
Reakcia na dávku pri inhibícii artritídy podávaním anti-αΐ mAb
Vzhľadom na prekvapujúce účinky podávania anti-αΐ mAb na prevenciu artritídy pôvodcovia vynálezu rozšírili tieco štúdie tak, aby bola zahrnutá aj analýza reakcie na dávku (pozri obr. 9) . Rôzne dávky mAb sa podávali i. p. každý 3. deň počínajúc v deň 0. V zhode so skoršími dátami, 250 pg dávka anci-αΐ mAb spôsobila takmer kompletnú prevenciu artritídy. Nižšia dávka
100 pg anti-ol mAb bola čiastočne účinná v prevencii artritídy v tomto modeli, zatiaľ čo nižšie dávky nemali žiadny preukázateľný účinok na artritícké skóre (obr. 9;.
Príklad 13
Terapeutické podávanie anti-ol mAb môže znížiť artritické skóre
Vzhladom na účinnosť anti-ol mAb pri prevencii artritídy sa pôvodcovia pokúsili o liečenie myší, otoré sú na ceste k tomu, aby sa u nich vyvinulo toto ochorenie. Artritída sa indukovala u myší injekciou koktejlu mAb anti-kolagén typu II v deň 0, nasledovanou podaním LPS v deň 3. Vyši sa potom podrobili pôsobeniu buď anti-ol mAb alebo fúzneho proteínu rozpustného TNF receptora s Ig počínajúc dňom 4. Progresía artritídy sa úplne zablokovala u myší dostávajúcich anti-ol mAb počínajúc dňom 4 v porovnaní s myšami dostávajúcimi kontrolnú škrečiu mA.b počínajúc dňom 4 (obr. 10) . Miera inhibície pozorovaná pri eerapeutíckom podávaní anti-ol mAb bola kompletná a bola rovnaká ako tá, ktorá sa pozorovala pri preventívnom podávaní anti-ol mAb (začatom v deň 0) (obr. 10). Na porovnanie, liečba fúznym proteínom TNF receptora s Ig od dňa 4 spôsobila iba 60-70% inhibíciu artritického skóre v porovnaní s kontrolným Ig fúznym proteínom (obr. 10). Kombinovaná liečba anti-ol mAb a fúziou TNF receptora s Ig spôsobila účinne kompletnú inhibíciu artritického skóre, čo nie je prekvapujúce, vzhladom na plnú účinnosť podávania samotnej anti-αΐ mAb na potlačenie artritídy. Môžu sa teda zhrnúť výsledky, ktoré ukázali, že terapeutické podávanie antiol mAb je účinné pri inhibícií artritického skóre a môže sa priaznivo porovnať s terapeutickým podávaním TNF antagonistu.
9
Príklad 14
Klonovanie a mutagenéza al-I domény
Sekvencia ludskej a potkanej domény I integrínu αϊβΐ sa amplifí kovali z kompletných cDNA (Kern, et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 22811-22816, Ignatius et al., 1990, J. Celí Biol.
111, 709-720) polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) (s použitím súpravy PCR CORE Kit, Boehringer Mannheim, GmbH, Nemecko), s využitím buď špecifických (Ľudských primérov:
5'-CAGGATCCGTCAGCCCCACATTTCAA-3' [priamy] (SEQ ID NO: 7) a
5'-TCCTCGAGGGCTTGCAGGGCAAATAT-3' [reverzný] (SEQ ID NO: 8) alebo primérov špecifických pre laboratórneho potkana:
5'-CAGGATCCGTCAGTCCTACATTTCAA-3' [priamy] (SEQ ID NO: 9) a
5'-TCCTCGAGCGCTTCCAAAGCGAATAT-3' [reverzný] (SEQ IDNO: 10).
Výsledné PCR amplifikované produkty sa purifikovali, ligovali do plazmidu pGEX4t-i (Pharmacia) a použili na transformáciu kompetentných buniek DH5a (Life Technologies). Ampicilin rezistentné kolónie sa podrobili skríningu na expresiu fúzneho proteínu „glutatión-S-transferáza - doména I s veľkosťou približne 45 kDa. Sekvencia z inzeruov plazmidovej DNA klonov, ktoré sa selektovali pre ďalšiu charakterizáciu, sa potvrdili sekvenovaním DNA.
Chimérna ludská/potkania doména al-I (ΚΔΗ) sa pripravila (súprava pre mutagenézu MORPH Mutagenesis kit, od firmy „5 prime-3 prime), pričom zvyšky G92, R93, Q94 a L97 laboratórneho potkana (Obr. 11) nahradili zodpovedajúce ľudské zvyšky V, Q, R a R, v uvedenom poradí. Klony s RAH I doménou sa identifikovali podľa toho, že stratili diagnostické miesto pre reštrikčný enzým Stul a ínzerty sa potom potvrdili DNA sekvenovaním. Aminokyselinová sekvencia ludskej al-I domény je uvedená na obr. 12.
0
Príklad 15
Príprava mAb špecifických pre al-I doménu
Dokázalo sa, že monoklonálne protilátky sú veľmi užitočné ako sondy pri skúmaní vzťanu medzi štruktúrou a funkcicu incegrínových pcdjeonotiek. Napríklad mAb sa využili veľmi extenzívne pri štúoru úsekov βΐ poojednotky spojenej s aktivovanou konformácicu (Qu, A., and Leahy, D. J., Í 996, Structure 4, 931-942;. Takže pre identifikáciu potenciálnej sondy vhodnej pro konformačné zmeny al-I domény pôvodcovia vytvorili panel mAb k ľudskej al-I doméne.
Príprava monoklonálnych protilátok k al-I doméne („anti-al-I doména mAb)
Samice Pober t s cm. o vých myší (Jackson Labs ) sa imuni zovali intraperitoneálne (i. p.) s 25 pg purífi kovaného ľudského αϊβι (Edwards et al·., 1995, J. Biol. Chem. 270, 12635-12640, Gotwals et al., 1999, Biochemistry 38: 8280-8) emulgovaného s kompletným Freundovým adjuvans ÍĽiŕeTechnologies). Trikrát sa stimulovali zosilňovacou dávkou („boost) i. p. 25 pg αϊβΐ emulgovaného s neúplným Freundovým adjuvans (LifeTechnologies). Myš s najvyšším titrom protilátky anti-al-I doména sa znova stimulovala i. p. so 100 pg αϊβΐ tri dni pred fúziou a potom intravenózne 50 pg αϊβΐ i.p. jeden deň pred fúziou. Bunky sleziny sa fúzovali s bunkami myelómu FL653 v pomere 1:6 a potom sa vysiali v množstve 100,000 a 33,000 na jamku do 96 jamkových doštičiek pre tkanivové kultivácie.
Supernatanty sa potom hodnotili na väzbu αϊβΐ integrínu pomocou FACS s jednoduchých farbením. Pred FACS analýzou sa supernatanty inkubovali s netransfekovanými bunkami K562, aby sa vylúčil IgG, ktorý sa viaže iba k βΐ podjednotke. Následne sa 35 x 104 buniek K562 transfekovaných podjednotkou al integrínu (K562-al) a suspendovaných vo FACS pufri (1% fetálne teľacie sérum (FCS) v PBS obsanujúcom 0,5% NaN3) inkubovalo so supernatantom 45 minút pri 4 °C, premylo a inkubovalo s antimyšacím IgG konjogovaným s fykoerytrínom. Po premytí dvakrát FACS pufrom sa bunky analyzovali prietokovým cytometrom Bector. Dickinson.
Supernatanty zo vzniknutých hybridómov sa podrobili skríningu na väzbu k al-I doméne. Krátko, 50 pl fúzie „ľudská al-I doména - GST v PBS (30 pg/ml bol) sa použila na potiahnutie jamiek 96 jamkových doštičiek (Nunc) cez noc pri 4 °C. Doštičky sa premyli s PBS, blokovali s 1% BSA v PBS a hybridómový supernatant sa inkuboval s doménou I pri teplote miestnosti 1 hodinu. Po dôkladnom premytí v PBS obsahujúcom 0,03% Tween 20, sa pridal na ďalšiu hodinu anti-myšací IgG s naviazanou alkalickou fosfatázou (Jackson ImmunoResearch) . Po konečnom premytí sa pridalo 1 mg/ml p-nitrofenylfosfátu (pNPP) v 0,lM glycíne, lmM ZnCl2 a ImM MgCl2 30 minút pri teplote miestnosti a doštičky sa potom čítali pri O.D. 405.
Vybrané supernatanty sa testovali na ich schopnosť inhibovať K562-al závislú adhéziu ku kolagénu typu IV. Bunky K562-al sa označili s 2 mM pentaacetoxymetylesterom 2',7'(bis-2karboxyethyl-5 a 6)karboxyfluoresceínu (BCECF, Molecular Probes) v DMEM obsahujúcom 0,25% BSA pri 37 °C 30 minút.
Označené bunky sa premyli väzbovým pufrom (10 mM Hepes, pH 7,4, 0,9% NaCl a 2% glukóza) a resuspendovali vo väzbovom pufri s 5 mM MgCl2 na konečnú koncentráciu 1 x 106 buniek/ml. 50 pl supernatantu sa inkubovalo s rovnakým objemom 2 x 105 buniek K562-al v jamkách 96 jamkovej doštičky. Doštička sa potom stočila a supernatanty sa odstránili. Bunky sa resuspendovali vo väzbovom pufri a preniesli do jamiek kolagénom potiahnutej d'štíčxy a inkubovali 1 hodinu pri 37 °C. Po inkubácii sa odstránili neadherujúce bunky premytím trikrát s väzbovým pufrom. Prisadnuté bunky sa analyzovali na zariadení Cytofluor (Millipore).
Pôvodcovia spočiatku identifikovali 19 hybrfáónov, ktorých superr.Htanty sa viazali k ľudským leukerr.ickýrr. bunkám K562 exprimvjúcim ο.ίβΐ integrín (K562-al) a k al-I doméne. boli Purifikovali sa imunogicbulíny z raždého z hybridómov a testovali sa na schopnosť blokovať väzbu buď K562-al alebo al-l domény ku kolagénu IV. Mab spadali do· dvoch kategórií: tie, ktoré blokovali, a tie, ktoré neblokovali al β 1 funkcie. Napríklad zatiaľ čo mAb produkované klony AEF3, 3GC5, AQC2 a AJH10 viažu al-I doménu (pozri obr. 13A, dáta nie sú ukázané pre BGC5), iba mAb AJH10 a AQC2 inhibujú adhéziu ku kolagénu IV v závislosti na al-I doméne (obr. 133, obr. 16B) alebo K562-al (obr. 13C, obr. 16C).
Sekvencvanie úsekov určujúcich komplementaritu (CDR)
Aicy sa určil klonálny pôvod tohto panelu rrAb, pôvodcovia amplif okovali pomocou PCR a sekvenovali úseky CDR. u 12 z 19 pripravenýcío protilátok (dáta nie sú uvecené) .
ug mRNA, izolovanej z ÍCČ hybridómov (s použitím súpravy na izoláciu mRNA FastľrackmRNA, Invitrogen), sa reverzne transkribovalo (s použitím súpravy Reacy-To-Go You Prime First Strana Kit, Pharmacia Biotecn) s využitím 25 pM každého z nasledujúcich primérov: ťažký reťazec VHlrOR-2 (Michishita et al., 1993, Celí 72: 857-867), ľahký reťazec, VK4FOR, ktorý definuje štyri samostatné oligonukleotidy (Kern et al., 1994, J Biol. Cnem. 269: 22811-22816). Pre každý hybridom, ťažké a lahké reťazce sa amplifikovali v štyroch oddelených PCR reakciách s použitím rôznych kombinácií nasledujúcich oligonukleotidov: 1) Ťažký reťazec: VH1FR1K (Kamata et al., 1995, J. Biol. Chem. 270: 12531-72535', VHlBACK, VHlBACK (Baldwin et al. 1998, Structure 6, 923-935), VHfrla, VKfrlb, VHfrle, VHfrlf, VHfrlc (Ignatius et al., 1 990 , J. Celí Biol. 111, 709-720), alebo VH1FOR-2 (Michisnita, M., Videm, V., and Arnaout, Y. AAA.., 1 993, Celí 72,
857-867), a
Structure 6, al., 1994,
2) Ľahký reťazec: VK1BACK (Baldwin et al., 1998,
923-935), VK4F0R, VK2BACK oligonuxlectidy (Kern et
J, Biol. Chem. 269, 22811-22816) alebo VKfrla,
VHfrlc, VHfrle, VHfrlf,(Ignatius et al., 1990, J. Celí Biol. lll,
709-720) . Produkty sa amplifikovali (5 minút pri 95 °C, cyklov 1 minúta/94 °C, 2 minúty 55 °C, 2 minúty 72°C, nakoniec cyklu 10 minút pri 72 °C), purifikovali z gélu (QIAQUICK, Qiagen) a priamo sekvenovali s použitím rôznych vyššie uvedených oligonukleotidov s použitím sekvenátora ABI 377 .
Sekvencie z klonov produkujúcich takmer totožné vo všetkých úsekoch (CDRS) a vložené úseky rámcovej hybridómy sú klonálne príbuzné.
funkciu blokujúcu mAb boli určujúcich komplementaritu sekvencie naznačujú, že
Príklad 16
Imunoprenos a FACS Analýza
Sekvencie variabilných úsekov neblokujúcej protilátky boli významne odlišné od klonálne príbuznej rodiny sekvencii zistených pre blokujúce protilátky. Keďže sa zdá, že blokujúce protilátky pochádzajú z jediného klonu, pôvodcovia vybrali dve protilátky (AJH10 a AQC2) pre ďalšiu charakterizáciu.
Imunoprenos („immunoblotting)
Vrstva buniek hladkého svalstva odobratá z ovčej aorty a K562-al bunky sa extrahovali s použitím 1% Triton X-100 v 50 mM Hepes, pH 7,5,150 mM NaCl, 10 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 20 pg/ml aprotinín, 10 pg/ml leupeptín, 10 mM kyselina etyléndiamíntetraoctová (EDTA). Vzorky sa naniesli na 4—20% gradient SDS-PAGE a preniesli elektroforeticky (blotovali sa) na nitrocelulózovú membránu. Bloty sa blokovali 5% sušeným mliekom
4 v TBS, premyli TBS obsahujúcim 0,03% Tween-20 a mkuoovali s protilátkami v blokovacom pufri obsahujúcom 0,05% NsN3 2 hodiny. Bloty sa potom premyli ako predtým, inkubovali 1 hodinu s antimyšacím IgG konjugovaným s chrenovou peroxidázou, znova premyli a potom podrobili pôsobeniu ECL činidla (Amersham; . Sdoty sa potom exponovali na film (Kodak.) 30 až 60 sekúnd a vyvolali.
Imunoblot a FACS analýza (pozri obr. 14) ukázali, že AJII10 reaguje s ludský, králičím a ovčím al3I mtegrínom, ale vôbec nie s potkaním αϊβΐ mtegrínom, čo vedie k názoru, že blokujúce mAb sa viažu na evolučné konzervatívny lineárny epitop. Neblokujúce mAb neboli účinné ani v imunoblote, ani nereagovali s iným biologickým druhom ako je človek.
Príklad 17
Väzba al-I domény ku kolagénu p c závislá na dvojmocnom katióne
A. Purifikácia al-I domén al-I domény sa exprimovall v E. coli ako fúzne proteíny s GST (glutatión-S-transferázou) obsahujúce miesto pre štiepenie s trombínom v spojení sekvencií. Vyčistený supernatant z buniek lyzovaných v PBS sa naniesol na kolónu giutatión-Sepharose 43 (Pharmacia), ktorá sa dôkladne premyla s PBS. Fúzny protein „alI doména - GST” sa eluoval pufrom obsahujúcim 5CmM Tris-HCl, pH 8,0, 5mM glutatión (redukovaný). Pre aenaturačné štúdie I doména sa odštiepila trombínom v aOrr.M Tris, pH 7,5 pufri a purifikovala sa od GST fúznehc partnera. K vzorke sa pridal 2m.M CTT a vzorka sa naniesla na kolónu glutatión Sepharose 4B.
Pretečený pufor a premývané frakcie sa spojili a naniesli na kolónu Q Sepharose FF (Pharmacia) . al-I doména sa eluovala pufrom obsahujúcim 5QmM Tris-HCl, pH 7,5, ICmM 2-merkaptoetanol,
5mM NaCl. Purifikovaná T doména vykazovala predpovedanú hmotnosť (Leea et al., 1995, Structure 3, 1333-1340: 871 Da) podľa elektrosprejovej ionizačnej hmotnostnej spektrometrie (ESI-MS), na SDS-PAGE sa pohybovala ako jednoduchý pás a proteín sa eluoval ako jednoduchý vrchol zodpovedajúci veľkosti pri vylučovacej chromatografii na kolóne Superose 6 FPLC (Pharmacia).
B. Funkčná analýza jamkové doštičky sa potiahli cez noc pri 4 °C s 1 pg/ml kolagénu typu IV (Sigma) alebo kolagénu typu I (Collaborative Biomedical), premyli s tritónovým pufrom (0,1% Triton X-100, 1 mM MnCl2, 25 mM Tris-HCl,150 mM NaCI) a blokovali s použitím 3% hovädzieho sérového albumínu (BSÄ) v pufri obsahujúcom 25mM Tris-HCl, 150mM NaCI (TBS).
Sériové riedenie fúzneho proteínu „al-I doména-GST v TBS obsahujúcom lmM MnCl2 a 3% BSA sa inkubovalo na potiahnutých doštičkách pri teplote miestnosti 1 hodinu a premylo tritónovým pufrom. Naviazaná al-I doména sa detegovala sériovým pridaním 10 pg/ml biotinylovanej anti-GST polyklonálnej protilátky (Pharmacia), ExtrAvidín-chrenovej peroxidázy (Sigma) nariedenej 1:3000 v TBS obsahujúcom lmM MnCl2 a 3% BSA, a 1-Step ABTS (2,2'-azin-di[3-etylbenztiazolinsulfonát) , od firmy Pierce) . Doštičky sa vyhodnotili na O.D. 405 na čítacom zariadení pre mikrotitračné doštičky (Molecular Devices).
Výsledky al-I domény človeka a laboratórneho potkana (95% identita s ľudskou sekvenciou) sa exprimovali v E. coli ako GST-fúzne proteíny a purifikovali pomocou glutatión-Sepharose. Obidva proteíny sa vyšetrili na väzbu ku kolagénu I a IV s použitím obmeneného testu založeného na ELISA, ktorý bol už skôr opísaný (Qu, A. a Leahy, D. J., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10277-10281). Ľudská al-1 doména viaže kolagén IV s Lepšou
Ί6 účinnosťou ako kolagén 1 (pozri cór. loA) . Protilátka špecifická k al-I doméne, ale nie protilátka špecifická k a2-I doméne (obr.lSB) ruší väzbu k obom ligar.dom (dáta pre kolagén I nie sú uvedené) . Tak Mn2 ako aj Mg^+ stimuluje väzbu, EDTA redukuje väzbu na hladinu šumu (pozadie) (obr. 15C) . Žiadne merateľné rozdiely vo väzbe ligandu sa r.edetegcvaai medzi ľudskou doménou al-I a rovnakou doménou potkana, čo vedie k predpokladu, že sekvenčné rozdiely medzi biologickými druhy nie sú funkčne relevantné (dáta nie sú uvedené) . Tauže al-I doména pre účinnú väzbu ligandu špecificky vyžaduje prítomnosť katiónu.
Príklad 18
Epitop závislý na katióne je umiestnený v blízkosti MIDAS motívu
Pôvodcovia využili pozorovanie, že AJH10 rozpoznáva ľudské al-I doménové sekvencie, ale nie potkanie, na mapovanie epitopu pre αΐβΐ-funkciu blokujúcej mAb. Ľuoské sekvencie a sekvencie laboratórneho potkana sa líšia iba v 12 aminokyselinách, z ktorých 4 ležia v úseku 6 aminokyseliny (aa 92-97, obr. 11A) susediacej s kritickým treonínom (obr. 11A, aa 98) v motíve MIDAS. Na otestovanie hypotézy, že 6 aminokyselinových zvyškov, Val-Gln-Arg-Gly-Gly-Arg, zahrnuje epitop pre blokujúcu mAb, pôvodcovia skonštruovali chimérnu I doménu (RÚH), kde zvyšky G92, R93, Q94 a L97 laboratórneho potkana sa vymenili za zodpovedajúce ľudské zvyšky V, Q, R a R, v danom poraaí. AJH10, spolu so všetkými funkciu blokujúcimi mAb, rozpoznáva chimérnu I doménu (RáH, obr. 11B). Pre orientáciu týchto zvyškov vzhladom na doménu MIDAS v terciárnej štruktúre al-I domény, pôvodcovia modelovali al-I doménu s použitím koordinát kryštálovej štruktúry α2 I domény.
Homologický model ludskej al I domény sa postavil s použitím róntgenovo zistenej kryštálovej štruktúry ludskej α2 I domény (Ward et al., 1989, Náture 341, 544-546). Model sa postavil s použitím modulu pre homologické modelovanie Insightll (verzia 2.3.5, Biosym Technologies). Použil sa program CHARMM (Clackson et al., 1991, Náture 352, 624-628) so súborom všetkých vodíkových parametrov 22 so vzdialene závislou dielektrickou konštantou dvojnásobku vzdialenosti oddeľujúcej atómy. Najskôi: sa uskutočnilo prvých 1000 krokov najstrmšej zostupnej minimalizácie s hmotnostne-váženou harmonickou polohovou zábranou 4,19 kJ/(mol Ä2) (1 kcal/ (mol Ä2)) na všetkých atómoch al-I domény. Po tejto minimalizácii nasledovalo ďalších 1000 krokov najstrmšieho zostupu a 5000 krokov z Adopted-Basis Newton Raphson so zábranami 0,419 kJ/(mol Á2) (0,1 kcal/ (mol Ά2)) C-a atómoch al-I domény, aby sa zabránilo významným odchýlkam od róntgenografickej kryštálovej štruktúry a2-I domény.
Sekvencie integrínov αϊβΐ a α1β2 prejavujú 51% identitu bez akýchkoľvek inzercií alebo delécií, čo vedie k predpokladu, že celková štruktúra obidvoch I domén bude podobná. Koordinačné miesto kovu je pódia predikcie rovnaké v al-I doméne ako v a2-I doméne, a rezídua, ktoré obsahujú epitop pre blokujúcu mAb ležia na kľučke medzi helixom a3 a helixom a4, ktorý obsahuje treonín v MIDAS motíve, ktorý je kritický pre väzbu katiónu. Model al-I domény predikuje, že amidový dusík zvyšku Q92 (obr. 11A) vytvára vodíkovú väzbu s karbonylovou skupinou zvyšku 133, čo je zvyšok susediaci so zvyškom S32. Takže slučka, ktorá obsahuje epitop, môže hrať funkčnú úlohu v stabilizácii úseku MIDAS.
Príklad 19
Monoklonálna protilátka AQC2 (tj. mAQC2, kde m označuje, že ide o myšaciu protilátku) (Príklad 15, pozri vyššie) je protilátka typu IgGi, kappa. Na identifikáciu nukleotidovej sekvencie kódujúcej ťažký a ľahký reťazec tejto protilátky sa pripravila celková bunková RNA z myšacích hybndómových buniek AQC2 s použitím súpravy QIAGEN RNEASY midi kit pódia inštrukcie výrobcu. Potom sa cDNA kódujúce variabilné úseky ťažkého a ľahkého reťazca klonovali metódou RT-PCR z celkovej bunkovej Rite s použitím súpravy „GIBCO BRL SUPERSCRIPT Preamplificaticn System for the First Srrar.d cDNA Synthesis'' podľa protokolu odporučeného výrobcom. Náhodné hexaméry sa použili ako reakčné priméry.
Variabilná doména ťažkého reťazca mAQCŽ sa ampli fi Revala pomocou PCR z prvéno vlákna cDNA s primármi:
5’ TGA CGA GAC GGT GAG CGT GGC CCT TGG CCC C 3' (SEQ ID NO: 11) a
5' AGG TSM ARC TGG AGS AGT CWG G 3' (S=C/G, M=A/C, R-A/G ä
W=A/T) (SEQ ID NO: 12).
PCR sa uskutočnila v 30 cykloch s použitím Clontech's
Advantage Taq polymerázy: denaturácia 30 sekúnd pri 94 °C,
nasadnutie 1 minúta v 50 °C a predlžovanie 1,5 minúty pri 68 °C. Ľahký reťazec mAQCŽ a jeho signálna sekvencia sa ampli fi koval i pomocou PCR s použitím prrmérov:
5' ACT AGT CGA CAT GGA TT? WCA GGT GCA GAT TWT GAG CTT C 3’ (W=A/T) (SEQ ID NO: 13) a
5' ACT GGA TGG TGG GAA GAT GGA 3' (SEQ ID NO:: 14).
PCR sa uskutočnila v 30 cykloch s použitím kionovanej Pfu polymerázy Stratagene: denaturácia 1 minúta pri 94 ° C, nasadnutie 1 minúta pri 50 °C a predlžovanie 2 minúty pri 70 °C. PCR produkty pre ťažký a ľahký reťazec sa purifikovali z gélu s použitím súpravy QIAGEN QIAQUICK pre gélovú extrakciu podľa výrobcom odporučeného protokolu.
Purifikovaný produkt - ťažký reťazec sa subklcnoval do vektora pCR2,l-TOPO TA firmy Invitrogen s použitím klonovacej súpravy TOF'O TA, Invitrogen. Purifikovaný lahký reťazec sa subklonoval do vektoru pCRbluntIITOPO od Invitrogen s použitím klonovacej súpravy Zero Blunt TOPO, Invitrogen, podľa protokolu odporučeného výrobcom. Inzerty z mnohých nezávislých subklonov sa sekvenovali. S výnimkou degenerovaných polôh v PCR priméroch boli sekvencie inzertov nezávislých subklonov totožné.
Polypeptidové sekvencie mAQC2 sa odvodili z ich kódujúcich sekvencií. N-koncová aminokyselinové sekvencia pre zrelý ľahký reťazec predikovaná z cDNA sekvencie PCR produktu amplifi kovaného so signálnou sekvenciou presne zodpovedala N-koncovej sekvencii purifikovaného lahkého reťazca mAQC2 získaného Edmanovou degradáciou (DVKVVESGG, SEQ ID NO: 15) .
BLAST analýzy sekvencií variabilných domén potvrdili ich
imunoglobulínovú identitu.
Polypeptido\ rá sekvencia variabilnej domény lahkého reťazca
mACQ2 je uvedená ďalej:
1 QIVLTQFPAL MSASPGEKVT MTCSASSSVN HMFWYQQKPK
41 SSPKPWIYLT SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISSMEAE
81 DAATYYCQQW SGNPWTFGGG TKLEIK 106
(SEQ ID NO: 1)
CDR úseky sú znázornené tučné. CDR úseky sú definované podlá Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunologica.1 Interest, 5th Edition, the United States Department of Health and Human Services, the United States Government Printing Office, 1991. S použitím systému číslovania podľa Kabata, SEQ ID NO: 1 je reprezentovaná nasledovne, pričom pomlčka označuje neprítomnosť aminokyseliny:
QIVLTQFPAL MSASPGEKVT MTCSASS-SV NHMFWYQQKP 41 KSSPKPVJIYL TSNLASGVPA RFSGSGSGTS YSLTISSMEA 81 EDAATYYCQQ WSGNPWTFGG GTKLEIK 107
Polypeptidové sekvencia variabilnej domény ťažkého reťazca mAQC2 je nasledujúca:
0
1 DVKWESGGG LVKPGGSLKL ACAASGFSFS RYTMSWVRQI
41 PEKRLEWVA'Jľ ISGGGHTYYL DSVKGRFTIS RDNÄXNTLYL
81 QMSSLRSEDT AMYYCTRGFG DGGYFDVWGQ GTTVTVSS
(SEQ ID NO: 2)
CDR úseky sú z n á z o rnené tučné. S použití .m systému
číslovanie podľa Kabata, SEQ ID NO: 1 je rep rezentovaná
nasledovne, ρ ričom čísla polôh sú po sebe nasledujúce čís la,
pokial nie je uvedené inak
1 DVKWESGGG LVKPGGSLKL ACAASGFSFS RYTMSWVRQI
41 PEKRLEWVAT ISGGGHTYYL DSVKGRFTIS RDNAKNTLYL
61 QM
82a-c SSL
83 RSEDTAMY YCTRGFGDGG
100a-b YF
101 DVWGQGTTVT VSS 113
Ako sa v tomto texte používa, č: í s 1a polôh ami no k y s e1 i nov ý ch
zvyškov variabilných domén sú v zhode so systémom číslovania podlá Kabata, ak nie je uvedené inak.
Príklad 20
Tento príklad opisuje prípravu chimérnej myšacej-ľudskej protilátky chAQC2.
cDNA kódujúce variabilné úseky ťažkého a lahkého reťazca mAQC2 sa použili na Konštrukciu expresných vektorov chAQG2, v ktorých variabilné úseky mAQC2 boli spojené s luoským IgG; a konštantnými úsekmi kappa.
Chiméra ťažkého reťazca sa konštruovala nasledujúcim postupom: Fragment KbPstl-BstEII velký 0,33 kb z cmzrr.idu pAND083 ťažkého reťazca mAQC2 sa subklonoval do fosfatázou opracovaného Pstl-BstEII vektorového fragmentu velkosti 2,82 kb z plazmidu 5aS ťažkého reťazca pLCB7, aby sa pridali signálkódujúce sekvencie myšacieho ťažkého reťazca a myšacie donorové zostrihové miesto k cDNA variabilného úseku ťažkéno reťazca mAQC2. 5a8 je molekulárne klonovaná CD4-špecifická mAb (pozri napr., Boon et al., 2002, Toxicology 172: 191-203). V zrelom ťažkom reťazci kódovanom vzniknutým plazmidom (pAND092) sa Nkoniec líši v piatich aminokyselinových zvyškoch od N-konca (DVKVVE, SEQ ID NO: 16) príbuzného ťažkého reťazca mAQC2 .
Pre opravu N-konca ťažkého reťazca sa pAND092 mutagenézou eliminovali jedinečné miesta (USE) s použitím súpravy pre USE mutagenézu (Amersham Pharmacia Biotech) podlá protokolu odporučeného výrobcom. Substitúcie Q1D, Q3K, L4V, Q5V a Q6E boli kódované mutagénnym primérom: 5' GCA CCA GGT GCC CAC TCC GAC GTC AAG GTG GTG GAG TCA GGG GGA GGC TTA GTG 3' (SEQ ID NO: 17). Mutované plazmidové klony sa identifikovali podía ich nových AatlI a Hmfl miest a straty PstI miesta. Kódujúce sekvencie ťažkého reťazca sa potom potvrdili DNA sekvenovaním. Správne mutovaný plazmid sa pomenoval pAND094. Notl-HindlII fragment s veľkosťou 0,43 kb z pAND094 a HindlII-NotI fragment s veľkosťou 1,21 kb z plazmidu pEAG964 (obsahujúce kódujúce sekvencie pre konštantný úsek ludského IgGi) sa subklonovalí do Nôti miesta v pCH269, plazmidu pochádzajúcom z pCEP4 EBV expresného vektora (Invitrogen). Výsledný plazmid sa nazval pAND099.
Chiméra ľahkého reťazca sa pripravila nasledujúcim spôsobom: EcoRI fragment s veľkosťou 0,46 kb z plazmidu dpANDOSl variabilné; domény ľahkého reťazca mAQC2 sa subklonoval do fosfatázou ošeirenáho fragmentu s veľkosťou 2,7 kb z vektora pNN09 odvedeného z klonovacieho vektora pUC, aby sa pridalo 5' Noci miesia. Vzniknutý plazmid, pAND091, sa mutagenizoval s použitím súpravy pre USE mutagenézu (Amersham), pozri vyššie)1, aby sa vnieslo BglII miesto na 3' koniec kódujúcej sekvencie.
2
Mutagénny primér mal sekvenciu: 5' GGA GGC ACC AAG CTG GAG ATC TAA CGG GCT GAT GCT GC 3 ’ (SEQ ID NO: 18) .
Správne mutovaný plazmid sa identifikoval oodľa zmien polohy miest Bgili a BstYI. Sekvencia kódujúca ľahký reťazec vc výslecrom plazmide pANDC93 sa potvrdila DNA sekvenovaním. Potom sa Notl-BglII fragment variabilnej domény ľahkého reťazca s veľkoscou 0,44 kb z pAND093 a BclI-Noti fragment z plazmidu pEAG963 s veľkosťou 0,68 kb (obsahujúce kódujúce sekvencie konštantnej domény ľudského iahkéno reťazca kappa) subklonovali do Notl miesta pCH269 (pozri vyššie), čím. sa vytvoril plazmid pAND102. Na vytvorenie neblokovaného ľahkého reťazca kappa (Q1E), pAND093 sa USE mutagenizova1 s mutagénnym primérom,: 5 1 CAT AAT GTC CAG GGG AGA AAT TGT TCT CAC CCA G 3 ' (SEQ ID NO: 19), na vnesenie XmnI miesta. Mutovaný plazmid sa identifikoval skrínir.gom na zmenu polohy XmnI . Sekvencia iahkého reťazca vo vzniknutom plazmide pAND097 sa potvrdila DNA sekvenovaním. Fragment Notl-BglII variabilnej domény ľahkého reťazca z pAND097 s veľkosťou 0,44 kb a BclI-Noti fragment z plazmidu pEAG963 s veľkosťou 0,68 kb (obsahujúce konštantnú doménu ľudského ľahkého reťazca kappa) sa subklonovali. do Notl miesta pCN269, čím sa vytvoril plazmid pAND098.
Na tvorbu protilátky chAQC2 sa expresnými vektormi (vektor pANDQ99 pre ťažký reťazec chAQC2 + vektor pAND102 pre lahký reťazec chAQC2 a vektor pAND099 pre ťažký reťazec chAQC2 + vektor pAND098 pre neblokovaný ľahký reťazec chAQC2) kotran.sfekovali bunky 293-EBNA. Transfekcanty sa testovali na sekréciu protilátky a jej špecificitu. Kontrolu nvorili bunky transfekované zodpovedajúcimi vektormi bez inzertu alebo s DNA konštruktmi kódujúcimi ch5c8 (molekulárne klonovaná CD154špecifická mAb opísaná napr. v Elster et al. , 2001, Transplantáciou 72:1473-1478) alebo, chCBEll (molekulárne klonovaná LTR-špecifická mAb opísaná napr. v Broxning et al., Í996, J. Biel. Chem. 271: 24934-24938).
Potom sa transfektanty, ktoré sekrétovali požadovanú protilátku, lyžovali a s lyzátmi a kondicionovaným médiom sa urobila imunoprecipitäcia proteínom A. Western blot analýza preoipitátov uskutočnená s protilátkami proti ľudskému ťažkému a ľahkému reťazcu ukázala, že chAQC2-transfekované bunky syntetizovali a účinne sekrétovali ťažký a ľahký reťazec v hladine podobnej ch5c8-transfekovaným a chCBEll-transfekovaným bunkám. Ďalej huVLA-l-exprimujúce bunky K562al sa označili (zafarbili) pomocou kondicionovaného média z transfekovaných buniek a na takto označených bunkách sa uskutočnila FACS analýza. Výsledky ukázali, že protilátka chAQC2 vytvorila zafarbené profily podobné profilom mAQC2, zatial čo kondicionované médiá zo slepo transfekovaných a ch5c8transfekovaných buniek nezafarbili bunky K562al. Chimérna AQC2 produkovaná po prechodnej transfekcii vo väčšom meradle sa purifikovala a pomocou FACS titrácie sa ukázalo, že sa viaže k VLA-1. Chimérna AQC2 buď divého typu alebo s geneticky odblokovaným ľahkým reťazcom sa viaže k VLA-1. Pozri tiež obrázky 16 A - D (diskutované ďalej).
Príklad 21
Tento príklad opisuje spôsob humanizácie monoklonálnej protilátky mAQC2.
Analýza variabilnej domény mAQC2
Variabilné domény ľahkého a ťažkého reťazca mAQC2 sa porovnali s kanonickými sekvenciami pre myšacie a ľudské podskupiny (Kabat et al., pozri vyššie) s použitím počítačového programu FASTA. Zistilo sa, že variabilná doména ľahkého reťazca je členom myšacej podskupiny VI s 89% identitou v prekrývajúcom sa úseku 109 aminokyselín. Táto doména tiež zodpovedala ľudskej podskupine I so 72% identitou v prekrývajúcom sa úseku 113 aminokyselín. A ďalej sa zistilo, že variabilná doména ťažkého reťazca je členom myšacej podskoč iny 11 Ic. s 86% identitou v prekrývajúcom sa úseku 129 aminokyselín. Táto variabilná doména ťažkého reťazca tiež zodpovedala ludskej podskupine Iľl so 79% identiuou v prekrývajúcom sa úseku 130 aminokyselín.
CDR úseky sa kategorizovali a roztriedila do kanonických tried podľa Chothia et al., Názore 342, pp. 877-883, 1989. kľúčové zvyšky definujúce každú z kanonických zried rozhodujú do značnej miery o štruktúrnej konformácii CDR siučky, takže by mali byť zachované v reorganizovanej (prestavanej) protilátke. Ukázalo sa, že Ll slučka mAQC2 spadá dc kanonickej triedy 1 (slučka z 10 zvyškov), L2 do triedy 1 (slučka zo 7 zvyškov) a L3 tiež do triedy 1 (slučka z 9 zvyškov), hl slučka spadá do triedy 1 (slučka 5 zvyškov) a E2 slučka tiež do triedy 1 (slučka zo 16 zvyškov). Zdá sa, že H3 slučka nepatrí co žiadnej kanonickej triedy. Kanonické zvyšky dôležité pre tieto triedy boli všetky zahrnuté v humanizovanýcn protilátkach.
Nezvyčajné zvyšky rámca rzAQC2 sa určili pomocou analýzy všetkých myšacích a ľudských sekvencii variabilných reťazcov podlá 1999 verzie databázy Kabata. Predpokiacalo sa, že mAQC2špecifické rozdiely by mohli ukazovať na somatické mutácie, ktoré zosilňujú väzbová afinitu, ak sa rozdiely vyskytujú blízko väzbového miesta. Nezvyčajné mAQC2 zvyšky vo väčšej vzdialenosti od väzbového miesta a nezvyčajné zvyšky ľudského rámca odstránili v prípade, že by vyrvárali imunogénne epitopy v humanizovanej protilátke. Nezvyčajné zvyšky rámca zistené v mAQC2 boli 7 (ľ), 10 (L) a 41 (K) v ľahkom reťazci a 4 (V), 21 (A) a 40 (I) v ťažkom reťazci. Žiadny z nezvyčajných zvyškov myšacieho rámca sa neponechal v humanizovaných protilátkach.
Modelovanie štruktúry variabilných úsekov
Ľahký a ťažký reťazec mAQC2 sa porovnali oproti nonredundantnej databáze, aby sa stanovilo to, ktoré štruktúrne rámce by sa mali použiť na konštrukciu trojrozmerných modelov ľahkého a ťažkého reťazca mAQC2. S použitím programu FASTA sa zistilo, že ľahký reťazec má 62% sekvenčnú identitu s myšacou monoklonálnou protilátkou ab57 (1CLOL), zatial čo ťažký reťazec má 76% sekvenčnú identitu s myšacím 6d9 Fab fragmentom (1HYY). S použitím programového balíka na molekulárne modelovanie SYBYL (Trípos Inc.), sa zostavila približná trojrozmerná štruktúra ľahkého a ťažkého reťazca mAQC2 s využitím ľahkého reťazca z ab57 a ťažkého reťazca z 6d9, v danom poradí. Štruktúrna integrita modelov sa vyhodnotila priamo u počítača a vyhodnotila sa ako rozumná.
Návrh reorganizovaných variabilných úsekov
Použili sa dva prístupy pre výber ľudského akceptorového rámca, aby prijal CDR úseky z mAQC2c. Prvý prístup bola metóda homologickej zhody („homology matching) a druhým prístupom bolo využitie kanonických ľudských Ig sekvencii. Pri homologickej metóde sa databáza Kabata, nonredundantná databáza NCBI, ENTREZ (The National Institutes of Health) a databáza Incyte prehľadávala s použitím programov FASTA a BLAST. Voľba ľudského akceptorového miesta sa urobila na základe sekvenčnej identity medzi rámcom mAQC2 a ľudským rámcom (s vylúčením rámcov už skôr humanizovaných protilátok) a zdrojom protilátky.
Rámce z génov variabilných úsekov imunoglobulínu s prístupovým číslom v GENBANK gi:587330 (ľudská kappa podskupina I VK-lcl47) sa nakoniec zvolili pre ľahký reťazec humanizovanéj protilátky (Welschof et al., J. Immunol. Meth. 179: 203-14, 1995). Rámce z Amulcll (Kabat ID 044469, ludská podskupina III) sa zvolili pre ťažký reťazec humanizovanéj protilátky (Huang et al., J. Immunol. 151: 5290-300, 1993).
Spätné mutácie ľudského rámca
Stratégia na určenie toho, ktoré spätné mutácie urobiť, sú dostupné na webových stránkach Humanization bY Design na url adresách nttp : //mathbio. nimr .mrc.ac.uk/jsaldari a ht tp : //uww . oryst.bbk.ac.uk/~ubcgC7s. Predchádza júce experimenty cokázali, že je dôležité zachovať kanonické zvyšky, zvyšky „zbalcvania rozhrania a nezvyčajné myšacie zvyšky, ktoré sú blízko väzbového miesta. Okrem toho by sa mali zvážiť zvyšky vo Vernier zóne, ktorá tvorí platformu, na ktorej ležia úseky CDR (Foote et al., J. Mol. Biol. 224 , p. 487, 1992), a malo by sa uvažovať o zvyškoch v clízkosti CDR H3.
Styrr reorganizované verzie navrhli pre každý variabilný ľahký a ťažký reťazec, ako je uvedené v tabuľke 1. Dve zo štyroch verzií pre každý reťazec sa navrhli metódou zhody podlá homológie (označené huAQC2-hl a -h.2) a ďalšie dve verzie metódou kanonické; zhody (hu.DQC2-cl a -c2) . Je nutné poznamenať, že sekvencie pre ťažký reťazec nuAQC-hl a ťažký reťazec huAQC-cl sú identické.
Tabuľka 1
Sekvencia mAQC2, huAQC2 a ľudské rámce
AMU1C11 hu_AQC2-h2 huAQC2-hl mAQC2 huAQC2-Cl huAQC2-c2
AMU1C11 huAQC2-h2 huAQC2-hl mAQC2 huAQC2-cl huAQC2-c2
TAZKY REŤAZEC
PRI CDRl
E-QL-------IQ-----R-S------TV- SNY-E-QL-------IQ-----R-S------T-- ------QL--------Q-----R-S--------- ----DVKWESGGGLVKPGGSLKLACAASGFSFS RYTMS
--QL.....---Q--.-i.R-s--------- ----E-QL--------Q-----R-S......T-- ----FR2 CDR2
----A-G-G----S V-YS--S---A.....
----A-G-G..... ................
----A-G-G---..................
WVRQIPEKRLEWVA TISGGGHTYYLDSVKG ----A-G-G----- -------------------A-G-G----- ---------------FR3
AMU1C11 huAQC2-h2 huAQC2-hl raAQC2 huAQC2-cl huAQC2-c2
CDR3
-AS IRFLEWS--Y
----N---A----V----N-.-A----V----- -----------------s--------N A----y----- ---------RFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCTR GFGDGGYFDV
---.....S--------N---A----V----------------------£--------N--.A„--V----- ----------S-SZmeny rámca
FR4
AMU1C11 -----L----- 20
huAQC2-h2 .....L..... 16
huAQC2-hl -----L----- 13
mAQC2 WGQGTTVTVS5*** 0
huAQC2-Cl .....L..... 13
huAQC2-c2 .....L----- 15
* pomlčky ukazujú na identitu s aminokyselinovou sekvenciou AQC2. ** Časť SEQ ID NO: 1. *** Časť SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 57, 44, 42, 2, 42, 68, v tom poradí ako idú za sebou.
ĽAHKÝ REŤAZEC
FR1
Vk-lcl47 D--M--S-SSL---V-DR--I--* huAQC2-h2 ------S-SSL V-DR--I-huAQC2-hl ------S-SSL---V-DR--I-mAQC2 QIVLTQFPALMSASPGEKVTMTC huAQC2-cl --Q---S-SSL---V-DR--I-huAQC2-c2 --Q---S--SSL---V-DR--1-CDR1 FR2
Vk-lcl47 R--Q-ISYLN GKA--LL-huAQC2-h2 ---------- ------GKA--LL-huAQC2-hl ---------- ------GKA-----mAQC2 SASSSVNHMF WYQQKPKSSPKPWIY huAQC2-cl ---------- ------GKA-----huAQC2-c2 .......... ......GKA--LL-CDR2 FR3
Vk-lcl47 AA-S-Q- ---S---------DFT-----LQP--F----huAQC2-h2 ---S---------D-T-----LQP--F----huAQC2-hl S---------D-T-----LQP--F----mAQC2 LTSNLAS GVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYC huAQC2-cl S---------D-T-----LQP--F----huAQC2-c2 S---------D-T-----LQP--F----Zmeny cdr3 FR4 rámca
Vk-lcl47 --SYST-L- ------V--- 25 huAQC2-h2 ---------- ------V--- 21 huAQC2-hl --------- ------V 19 mAQC2 QQWSGNPWT FGGGTKLEIK** O huAQC2-cl --------- --Q---V 21 huAQC2-c2 --------- --Q V 23
SEQ ID NO: 65, 51,49, 1,66, 54, v tom poradí ako idú za sebou
9
Niektoré spätné mutácie sú diskutované ešte ďalej.
(1) Ľahký reťazec:
D -> Q Táto mutácia sa vytvorila vo všetkých verziách, pretože predchádzajúce reorganizačné experimenty (napr. Kclbinger et al., Protein Eng. 6, p. 971, 1993) predpokladajú jej dôležitosť pre väzbu antigénu.
M -> L Toto je „vernier zvyšok a zachoval sa vo všetkých verziách.
L P Tento zvyšok je tak zvyšok rozhrania ako aj „vernier zvyšok a zachoval sa iba v hl a cl.
L - W Toto je „vernier zvyšok a zachoval sa iba v hl a cl.
F Y Tento zvyšok je v dôležitej kanonickej polohe a zachoval sa vo všetkých verziách.
(2) Ťažký reťazec:
E D Táto spätná mutácia sa vytvorila v iba hl (tj. cl).
I -> V Zvyšok I je nezvyčajný v ľudskej sekvencii a zachoval sa iba v h2.
T - S Toto je „vernier zvyšok a zachoval sa iba v hl.
2 9 V - F Toto je kanonický zvyšok a zachoval sa vo všetkých
verziách.
49 S - A Toto je „vernier zvyšok a zachoval sa vo všetkých
verziách.
93 A T Tento zvyšok je tak zvyšok rozhrania ako aj „vernier
zvyšok a zachoval sa vo všetkých verziách.
S R Toto je kanonický zvyšok a zachoval sa v obidvoch verziách.
Variabilné úseky huAQC2 sa pripravili pomocou USE mutagenézy, ako bolo opísané vyššie, s využitím plazmidov variabilnej domény chAQC2 ako východiskových templátov. cDNA sekvencie ludského skceptcrového rámca (FR; boli Kabat # Z37334 pre ľahký reťazec a Kabat ICO G 4 SO pre ťažký reťazec. Pre ľahšiu identifikáciu mutovaných piazmidov sa vniesli umlčané mutácie, aby sa zmenili reštrikčné miesta. Murované plazmidy sa identifikovali podľa zmeny reštrikčných miesi. cDNA sekvencie variabilných úsekov vo výsledných plazmidoch sa overili DNA sekvenovaním.
Verzie ťažkých reťazcov hl a cl (ktoré boli totožné) sa vytvorili s použitím plazmidu pANDOSÍ amo tern,plátu. Mutagénne primery bolí nasledujúce:
FR1 primér 5' GGT GCC CAG TGC GAC GTC CAG CTG GTC GAG TCA GGG GGA GGC TTA GTC CAG CCT GGA GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TGT GGA TTC 3' (SEQ· ID NO: 20), ktorý vniesol miesta Taql a PvuII a eliminoval mieste Ddel,
FR2 primér 5' ATG TCT TGG GTT CGC CAG GCT CCG GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC GCA ACC 3' (SSQ ID NO: 21), ktorý vniesol miesto Ncíl a eliminoval miesta BspEI a EarI,
FR3 primér 5' TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAC AAC ACC CTG TAC CTG CAG ATG AAC AGT CTG AGG GCC GAG GAC ACA GCC GTG TAT TAC TGT ACA AGA 3' (SEQ ID NO: 22), ktorý vniesol miesta Pst! a Ddel, a
FR4 primér 5' TGG GGC CAA GGT ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GAG 3' (SEQ ID NO: 23), ktorý vniesol miesta KpnI a Eco0109I. Výsledný plazmid ťažkého reťazca hi (tj. cl) sa nazval pAED104.
Verzia c2 ťažkého reťazca sa vytvorila s použitím pAND104 ako templátu s nasledujúcimi mutagénnymi primérmi:
FR1 primér 3 ' TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGG TAT ACT ATG TCT TGG GTT 3' (SEQ ID NC: 24), ktorý zaviedol Accl miesto, a
FR1 primér 5' GCA CCA GGT GCG CAC TCC GAG GTC GAG CTG GTC GAG
TCA 3' (SEQ ID NO: 25), ktorý zaviedol EspI miesme a eliminoval AatlI miesto. Výsledný plazmid ťažkého reťazca c2 sa nazval pAND115.
Verzia h2 ťažkého reťazca sa vytvorila s použitím! pAND115 ako templátu s nasledujúcimi primárom:
ER1 primér 5'GAG TCA GGG GGA GGC TTA ATC CAG CCT GGA GGG TCC GTG 3' (SEQ ID NO: 26), ktorý eliminoval Ddel miesto, výsledný plazmid ťažkého reťazca h2 sa nazval pAND113.
Na vytvorenie expresných vektorov pre ťažký reťazec huAQC2, Notl-HindlII fragment variabilnej domény ťažkého reťazca s veľkosťou 0,43 kb z pAND104, pAND115 alebo pAND113 a HindlIINotl fragment s veľkosťou 1,21 kb z pEAG964 (pozri vyššie) sa subklonovali do Notl miesta v pCH269 (pozri vyššie) . Vzniknuté expresné plazmidy pre ťažké reťazce sa nazvali pAND114 (hl), pAND121 (c2) a pAND124 (h2), v danom poradí.
Verzia hl lahkého reťazca sa vytvorila s použitím plazmidu pAND093 ako templátu. Mutagénne priméry boli nasledujúce:
FR1 primér 5' CAA ATT GTT CTC ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCG TCT GTA GGG GAC AGA GTC ACC ATC ACA TGC AGT GCC AGC TCA 3' (SEQ ID NO: 7), ktorý odstránil StEII a PstI miesta,
FR2 primér 5' TTC TGG TAT CAG CAG AAG CCC GGG A GCC CCC A CCC
TGG ATT 3' (SEQ ID NO: 28) , ktorý zaviedol Ncil miesmo,
FR3 primér 5' GCT TCT GGA GTC CCT TCA CGC TTC AGT GGC AGT GGG
TCT GGG ACA GAT TAC ACT CTC ACA ATC AGC AGC CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCC ACT TAT TAC TGC CAG 3' (SEQ ID NO: 29), ktorý zaviedol Ddel miesto a odstránil Eco0109I a Aval miesta, a
FR4 primér 5' GGT GGA GGC ACT AAG GTG GAG ATC TAA CGG GCT 3' (SEQ ID NO: 30), ktorý zaviedol Ddel a Styl miesta. Vzniknutý plazmid lahkého reťazca hl sa nazval pAND103.
Verzia h2 lahkého reťazca sa vytvorila s použztĺm pAND103 ako templátu s nasledujúcimi primérmi:
FR2 primér 5' CCC GGG A GCG CCC A CTC CTG ATT TAT CTC ACA TCC 3' (SEQ ID NC: 31), ktorý vniesol Hhal a HaeiI miesta. Vzniknutý plazmid ľahkého reťazca h2 sa nazval pANDllfc.
Pre verziu cl ľahkého reťazca sa použil plazmid pAND!03 ako
temolát s nasledujúcimi primármi
FR1 primér 5' GCC TCA GTC ATA G AG TGC CGG GGA CAA ATT CAG CTC
ACC CAG TCT CCA TCC 3 1 (seq :: NO: 32 i f k z o r ý vnieso 1 mi esta
Smal, Ncil a Hpall,
FR4 primér 5' GGT AAC CCG TGG á .CG TTC GGT CAG GGC AGT AAG GTG
GAG ATC TAA CGG GGT 3 ' (SEQ1 IC NG: 33), . k t orý vniesol Bspl28 61
miesto. Výsledný plazmi d ľahkého reťazca sa n a z v al pANDH8.
Verzia c2 lahkého reťazca sa vytvorila s použitím plazmicu pAND 116 ako tenplátu s nasledujúcimi primármi:
FR1 primér 5' GCC TCÄ GTC ATA ATG TCC CGG GGA CTA ATT CAG CTC ACC CAG TCT CCA TCC 3' (SEQ IT NO: 34), ktorý zaviedol miesta Smal, Ncil a Hpall,
FR4 primér 5' GGT AAC CCG TGG .TTG TTC GGT CAG GGC ACT AAG GTG GAG ATC TAA CGG GCT 3' (SEQ ID NO: 35), ktorý zaviedol Bspl286I miesto. Výsledný plazmid ľahkého reťazca c2 sa nazval pAND119.
Na vytvorenie expresných vektorov pre ľahké reťazce huAQC2, Notl-BglII fragmenty variabilnej domény lahkého reťazca s veľkosťou 0,44 kb z pANDlOl, pANDllo, pANDllS alebo pANDll9 a BclI-NotI fragment s veľkosťou 0,68 kb z pEAG963 (pozri vyššie) sa subklonovali do Nôti miesta v OCH269 (pozri vyššie). Výsledné expresné vektory lahného reťazca sa nazvali pANDlll (hl), pAND120 (h2) , pAND122 (cl) a pANI123 (c2), v danom poradí.
Expresné vektory sa použili na kotransfekciu buniek 293EBNA. a transfekované bunkj7 sa potom testovali na sekréciu protilátky a jej špecificitu. Bunky transfekované prázdnym vektorom, slúžili ako negatívna kontrola. Lyzály z celých buniek a kondieioncvané médiá sa ímunoprecipitovali s proteínom. A.
Western blot analýza precipitátov 'vyvolaná s protilátkami proti ľudskému ťažkému a ľahkému reťazcu) ukázala, že huAQC2transfekované bunky syntetizovali a účinne sekrétovali ťažký a ľahký reťazec protilátky v hladinách podobných chAQC2transfekovaným bunkám.
Potom sa uskutočnila FACS analýza VLA-1-exprimujúcich buniek K562a zafarbených kondicicnovaným médiom z kultivácie transfekovaných buniek. Bunky F562o sa preto inkubovali s kondicionovaným médiom na ľade 120 minút. Potom sa bunky premyli trikrát s FACS pufrom (P3S s 5% FBS a 0,05% azidom sodným). Premyté bunky sa resuspendovali v pufri a inkubovali 30 minút s PE-konjugovaným anti-ľudským IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Lnc.) na ľade. Po inkubácii sa bunky premyli trikrát s FACS pufrom a resuspendovali vo FACS pufri pre analýzu. Dáta sú uvedené v tabuľke 2, kde HuAQC2-hl označuje mAb, pozostávajúca z hl verzie ťažkého reťazca (HC) huAQC2 a hl verzie ľahkého reťazca (LC) z huAQC2 (pozri Tabuľka 1). Podobne, huAQC-h2 je mAb, ktorú tvoria h2 verzia ťažkého a ľahkého reťazca, u huAQC2-cl je tc· cl verzia a u uAQC2-c2 je to c2 verzia. V tabuľke sa MF1 týka priemernej MF1 normalizovanej k hodnote, ktorá sa pozorovala pre blokovanú chAQC2. Uvedené údaje reprezentujú priemer z dvoch nezávislých transfekcii. Tieto dáta ukazujú, že huAQC2-h.2 a -c2 mAb sa viazali horšie ako huAQC2-hl a -cl vzhľadom na chAQC2.
Tabuľka 2
FACS farbenie buniek K562a s použitím ch.AQC2 a huAQC2
Ľahký reťazec Ťažký reťazec Relatívna MFI
chAQC2 pAND102 pAND099 1,00
huAQC2-hl pANDlľ' pAND114 1,50
huAQC2-h2 pAND120 pAND124 0, 64
huAQC2-ci pANDl22 pANC114 1,50
LuAQC2-c2 pANDl23 pANDl21 0, 68
ň u A Q C 2 L C c 1 / 3 C c 2 pANDl22 pAND121 2,21
ňuAQC2 LC c2/HC cl pAND123 pANDl14 0, 3 6
ňuAQC2 LC neclokovan.ý si/HC c2 pANDÍSO* * pANDÍ2 3 'j , : J
huAQC2 LC L4 6P c2/3C c2 pANDl33** pAND121 3 , 5 0
ňuAQC2 LC L4 7C c2/'3C c2 pAND132*** p.ANDl 21 1, 0 0
* kóduje hu.AQCz LC cl s neblokovaným N-koncom QIC.
★ * kóduje hu.AQC2 LC c2 s L46P.
”** kóduje nu.AQC2 LC c2 s L47W.
Kotransfekcie buniek 293-EBNA s chAQC2 a huAQC2-hl, -h2, cl a -c2 sa uskutočnili vo väčšom meradle. Protilátky z kondicionovaného médta sa purifikovali na Sepharose s proteínom A. Purifrkované mAb sa testovali na aktivitu pomocou FACS. Protokol bol nasledujúci:
1. Zrátaj bunky z banky, ktorá sa rozdelila 1:4 derú pred testom.
2. Peletuj banky a resuspenduj ich na 2, o x 105 buniek/ml vo FACS pufri '5% F3S v 3BS s 9,02% azidom sodným).
3. Papetuj po· 100 μΐ buniek do jamiek 96jamkovej doštičky s dnom typu V.
4. Priprav sériové riedenie 1:3 z AQC2 v FACS pufri počínajúc koncentráciou 3pg/ml.
5. Peletuj bunky 5 minút pri 800 g a odstráň pufor z doštičky vytrepnutím.
6. Resuspenduj bunky v 100 μΐ r.ariedenej protilátkovej série.
7. Inkubuj 2 hodiny na ľade.
8. Opláchní doštičku. Peletuj bu.oky 3 minúty pri 800 g a odstráň. pufor z doštičky vytrepnutím.
9. Resuspenduj banky v 100 μΐ sekundárnej protilátky (nariedenej 1:100 vo FACS pufri).
10. Inkubuj 30 minút na lade.
11. Opláchni doštičku (pozri vyššie).
12. Resuspenduj bunky v 25 μΐ FACS pufra.
13. Centrifuguj krátko FACS skúmavky, aby bolo isté, že objem 50 μΐ je na dne skúmavky.
14. Pretrep dôkladne na vortexe každú skúmavku a odober 5000 prípadov.
Dáta sú uvedené na obr. 17. Tieto dáta potvrdili, že huAQC2-h2 a -c2 sa viažu horšie ako huAQC2-hl a -cl vzhladom na chAQC2.
Kanonické verzie huAQC2 sa ďalej skúmali, pretože boli menej imunogénne, keď sa použili na liečenie pacientov s chronickými indikáciami.
Uskutočnili sa kotransfekcie tzv. typu „mix-and-match aby sa určilo, či jediný reťazec je zodpovedný za zjavné zhoršenie väzby pozorovanej u huAQC2-c2. Kotransfekcie viedli k názoru, že zhoršenie väzby je zodpovedný lahký reťazec c2 (kódovaný pAND123), ktorý sa líši od lahkého reťazca cl (kódovaného pAND122) iba v dvoch zvyškoch FR2 úseku: P46L a W47L.
Aby sa určili individuálne príspevky každej z týchto dvoch zámien, skonštruovali sa nové expresné vektory lahkého reťazca c2. Plazmid OÄND125, L47W variant lahkého reťazca c2, sa vytvoril s použitím pANDll9 ako templátu s nasledujúcim mutagénnym primárom:
FR2 primér 5' GGG A GCA CCC A CTC TGG ATC TAT CTC ACA TCC AAC 3' (SEQ ID NO: 36), ktorý vniesol Hhal a HaelI miesta. Plazmid pAND 126, L46P variant lahkého reťazca c2, sa vytvoril s použitím pAND119 ako templátu s nasledujúcim mutagénnym primárom:
FR2 primér 5’ AAG CCC GGG AAG GCG CCC A CCC CTG ATT TAT CTC ACA TCC AAC 3' (SEQ ID NC: 37), ktorý vniesol miesta BsaHI, Bani a
Narl. Expresné vektory pre nové lanke reťazce nuAQC2 sa vytvorili subklonovaním. NotT-Bg.lJI fragmente variabilnej domény ľahkého reťazca s veľkosťou 0,44 kb z pANC'25 aieoc pAND126 a 3cII-NotI fragmentu s veľkosťou 0,68 kb z pEAG963 (pozri vyššie) do Norí miesta pCH269 (pozri vyššie). Takte vzniknuté plazmidy sa nazvali pAND132 (c2 s L47W) a pAND133 (o2 s L46?) , v danom poradí.
Uskutočnila sa kotransfekcia plazmidov s novým ľahkým, reťazcom s každým z plazmidov ťažkého reťazca huAQC2. VLA-1 väzba sa vyšetrovala s použitím FACS. Dáta ukazujú, že spätná mutácia L47W nedokázala zlepšiť väzbu. L46? mutácia zlepšila vrchol väzbovej krivky, ale hodnota EC50 sa posunula ešte viac doprava vzhladom na správanie huAQC2 verzie i (Tabulka 2, pozri vyššie) . Tieto výsledky vedú k názoru, že obidve spätné mutácie boli potrebné pre plnú väzbovú aktivitu.
Geneticky neblokovaný ľahký reťazec cl sa tiež vytvoril, pretože Q1D variant by bol c jeden zvyšok viac. humanizovaný . Q1D mutant, označený pAND148, sa vytvoril s templátcm pANDllS s nasledujúcim mutagénnym primárom:
FR1 primér 5' GTC ATA ATG TCC GGG GGA GAT ATC CAG CTC ACC CAG TCT 3' (SEQ ID NO: 38), ktorý zaviedol nové EcoRI miesto a odstránil Apol miesto. Expresný vektor pre tento posledný variant ľahkého reťazca huAQC2 sa vytvoril subklonovaním NotiBglII fragmentu variabilnej domény ľahkého reťazca s veľkosťou 0,44 kb z pAND148 a BcII-NotI fragmentu s veľkosťou 0,68 kb z pEAG963 do Nôti miesta v pCH269, čim sa pripravil expresný vektor ľahkého reťazca pAND150 (cl s neblokovaným N-koncom Q1D). Koexpresia geneticky neblokovaného ľahkého reťazca s ťažkým reťazcom c2 (t.j. huAQG2 LC cl neblckovaný/HC c2, označený huAQC2-c4) bola ekvivalentná s huAQC2 LC cl/HC o2 (označený huAQC2-c3). VLA-i väzba sa potvrdila pomocou FACS na VLA1exprimujúcich bunkách K562al (tabulka 2).
KGtransfekcie buniek 293-EBNA chAQC2 a huAQC2-hl,- h2, -cl, -c2, -c3 a -c4 . Protilátky v kondicionovanom médiu sa purifikovaii na proteín-A-sepharose a purifikcvané mAb sa testovali .na aktivitu (obr. 17 a 18) . HuAQC2-c3 sa vybrala ako kandidátne liečivo, pretože jej vlastnosti boli podobnejšie chAQC2. Potom sa navrhli vektory pre stabilnú expresiu huAQC2-c3 v CHO bunkách. Vektory obsahovali cDNA pre huAQC2 cl LC alebo c2 HC, s deletovanými úsekmi 5’ a 3' UTR vylúčeným a geneticky deletovaným C-koncovým lyzínom ťažkého reťazca, aby sa zaistila homogenita produktu. Výsledné vektory boli pAND162 (ľahký reťazec) a pAND160 (ťažký reťazec) . Ako sa v tomto texte používa, huAQC2-c3 sa tiež nazýva hAQC2.
Úplná polypeptidová sekvencia hAQC2 je nasledujúca:
Ľahký reťazec (Plazmid: pAND162)
QIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASSSVN HMFWYQQKPG KAPKPWÍYLT
SNIASGVPSR FSGSGSGTDY TLTISSLQPE DFATYYCQQW SGNPWTFGQG
101 TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLRSGTAS WCLLNNFYP REAKVQWKVD
151 NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV
YACEVTHQGL
201 SSPVTKSFNR GEC (SEQ ID NO: 3)
Ťažký reťazec (Plazmid: pAND160)
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYTMSWVRQA PGKGLEWVAT .51 ISGGGHTYYL DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCTRGFG
101 DGGYFDVWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSWTVP SSSLGTQTYI
201 CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD
251 TLMISRTPEV TCWVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVKNAKT KPREEQYNST
301 YRVVSVĽľVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
351 TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG (SEQ ID NO: 4 ;
Ďalšie polypeptidy ťažkého a lahkého reťazca a nukleotidové sekvencie sú uvedené ďalej.
A. Ťažký reťazec chAQCŽ (Pand099) (SEQ ID NO: 38 a 40. Prvé číslo označuje nuklectidovú sekvenciu a druhé číslo polypeptidovú sekvenciu. Rovnaké poradie sa ooužrje aj v následníkom číslovaní; .
GAČGTCAAGGTGGTGGAGTCAGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAA
CTC
DVKVVESGGGLVKPGGSL
K L
GCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTCAGTAGATATACTATGTCTTGGGTTCGCCAG ATT .
acaas.gfsfsrytmswvr
Q I
121
CCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGTGGTGGTCACACCTACTAT
CTA pekrlewvati sggghty
Y .L
T81 gacagtgtgaagggccgattcaccatctccagagacäatgccaagaacaccctgtac ctg dsvkgrfti srdnakntl
Y L
241 caaatgagcagtctgaggtctgaggacacagccatgtattactgtacaagaggtttt
GGA
QMSSLRSEDTAMYYCTRG
F G
301
GACGGGGGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTC C TCA DGGYFDVWGQGTTVTVSS
B. chAQC2 HC hl a cl (Pandll4) (SEQ ID NO: 41 a 42)
100
GACGTCCAGCTGGTCGAGTCAGGGGGAGGCTTAGTCCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGA
CTC
DVQ LV E S GGGLVQ PGGSL
R L tcctgtgcagcctctggattcagtttcagtagatatactatgtcttgggttcgccag
GCT
SCAASGFSFSRYTMSWVR
Q A
121
CCGGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGTGGTGGTCACACCTACTAT
CTA
PGKGLEWVATISGGGHTY
Y L
181
GACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTAC
CTG
DSVKGRFTISRDNSKNTL
Y L
241
CAGATGAACAGTCTGAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTACAAGAGGTTTT
GGA
QMNSLRAEDTAVYYCTRG
F G
301
GACGGGGGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
DGGYFDVWGQGTLVTVSS
101
C. chAQC2 ťažký reťazec h2 (pAND124) (SEQ ID NO: 43 a 44)
GAGGTCCAGCTGGTCGAGTCAGGGGGAGGCTTAATCCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGA
CTC
EVQLVESGGGLIQPG GSL
R L
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGGTATACTATGTCTTGGGTTCGCCAG
GCT
102
SCAASGFTFSRYTMSWVR
Q A
121
CCGGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGTGGTGGTCACACCTACTAT
CTA
PGKGLEWVATISGGGHTY
Y L
181
GACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTAC
CTG
DSVKGRFTISRDNSKNTL
Y L
241
CAGATGAACAGTCTGAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTACAAGAGGTTTT
GGA
QMNSLRAEDTAVYYCTRG
F G
301
GACGGGGGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGG
DGGYFDVWGQGTLVTVSS chAQCľz ťažký reťazec c2 (pANDl21) ÍSEQ ID NO: 45 a 69)
GAGGTCCAGCTGGTCGAGTCAGGGGGAGGCTTAGTCCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGA
CTC
EVQLVESGGGLVQPGGSL
103
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGGTATACTATGTCTTGGGTTCGCCAG
GCT
SCAAS GFTFSRYTMSWVR
Q A
121
CCGGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGTGGTGGTCACACCTACTAT
CTA
PGKGLEWVATI S G G G H T Y
Y L
181
GACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTAC
CTG
D S V K G R F T I S R D N S K N T L · .
Y L
241
CAGATGAACAGTCTGAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTACAAGAGGTTTT
GGA
QMNSLRAEDTAVYYCTRG
F G
301
GACGGGGGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGG PGG YFDVWGQGTLVTVSS
1Q 4
E. chAQC2 blokovaný ľahký reťazec (Pandl02) (SEQ ID NO: 46 a 47
CAAATTGTTCTCACCGAGTTTCCAGCACTCATGTCTGCGTCTCCAGGGGAGAAGGTCACC QIVLTQ FPALMSASPGEK
V T
ATGACCTGCAGTGCCÄGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCA
AAA
MTCSASSSVNHMFWYQQK P K
121
TCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCT7CTGGAGTCCCTGCT
CGC s s p'kpwiyltsnlasgvp
A R
181 ttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagcatggägc-ct
GAA
FSGSGSGTSYSLTISSME
A E
241
GATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTGGA
GGC
DAATYYCQQWSGNPWTFG'
G G
301 ACCAAGCTGGAGATCAAA T K L E I K
105
F. hAQC2 lahký reťazec hl (pAND117) (SEQ ID NO: 48 a 49)
... i. caaattgttctcacccagtctccatcctccctgtctgčgťctgtaggggacagagtcacc QIVLTQSPSSLS ASVGDR
V T
ATCACATGCAGTGCCAGCTCAAGTGTÁAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGÄAGCCC
GGG
IT CSASSSVNHMFWYQQK
P G
121
AAAGCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCA
CGC
KAPKPWIYLTSNLASGVP
S R
181
TTCAGTC-GCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAACCT
GAA
FSGSGSGTDYTLTISSLQ
P E
241
GATTTTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTGGA
GGC
D FATYYCQQWS G N P W T F G
G G
301 ACTAAGGTGGAGATCAAA T K V E I K
106
G. hAQC2 ľahký reťazec h2 (pANDl20) (SľQ ID NO: 50 a 5l
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCACCCTCCCTGTCTGCGTCTGTAGGGGACAGAGTC
ACC
QIVLTQSPSSLSASVGDR
V T
ATCACATGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCC
GGG ____
ITCSASSSVNHMFWYQQK
P G
121
AAAGCGCCCAAACTCCTGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCA
CGC
KAPKLLIYLTSNLASGVP
S R
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAACCT
GAA
FSGSGSGTDYTLTISSLQ
P E
241
GATTTTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTGGA
GGC
DFATYYCQQWSGNPWTFG
G G
301 ACTAAGGTGGAGATCAAA
T K V E I K
107
H. hAQC2 ľahký reťazec cl (pAND122) (SEQ ID NO: 52 a 70)
CAAATTCAGCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCGTCTGTÄGGGGACAGAGTC
ACC
QIQLTQSP SSLSASVGDR
V T
ATCACATGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCC
GGG
ITCSASSSVNHMFWYQQK
P G
121
AAAGCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCA
CGC
KAPKPWIYLTSNLASGVP
S R
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAACCT
GAA
FSG SGSGTDYTLTI SSLQ
P E
241
GATTTTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTCAG
GGC dfatyycqqwsgnpwtfg Q G
301 ACTAAGGTGGAGATCAAA
T K V E I K
108
I. hAQC2 lahký reťazec c2 (pAND123 or :D NO:
CTiAATTCAGCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGrCTGCGTCTGTAGGGGACAGAGTC
ACC
QIQLTQSPSSLSASVGDR
V T
ATCACATGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTC-GTATCAGCAGAAGCCC
GGG
ITCSASSSVNHMFWYQQK
P G
121
AAAGCGCCCAAACTCCTGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCA
CGC
KAPKLLIYLTSNLASGVP
S R
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAACCT
GAA
FSGSGS GTDYTLTI SSLQ
P E
241
GATTTTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTCAG
GGC
DFATYYCQQWSGNPWT .FG
Q G
301 ACTAAGGTGGAGATCAAA
T K V E I K
109
J. chAQC2 neblokovaný ľahký reťazec (pAND098) (SEQ ID NO: 56) a
GAAATTGTTCTCACCCAGTTTCCAGCACTCATGTCTGCGTCTCCAGGGGAGAAGGTC
ACC
EIVLTQFPALMSASPGEK
V T
ATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCA
AAA
M T C S A S S SVNHMFWYQQK
P K
121
TCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCT
CGC
SSPKPWIY TSNLASGVP
A R
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCT
GAA
FSGSGSGTSYS LTISSME
A E
241
GATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTGGA
GGC
DAATYYCQQWSGNPWTFG
G G
301 ACCAAGCTGGAGATCAAA
T K L E I K
110
K. huAQC2 neblokovaný ľahký reťazec cl (pAND150) (SEQ ID NC: 5/ a 58)
GATATCCAGCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCGTCTGTAGGGGACAGAGTC
ACC
DIQLTQSPSSLSASVGDR
V T
ATCACATGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCC
GGG
ITCSASSSVNHMF WYQQK
P G
121
AAAGCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCA
CGC
KAPKPWIYLTSNLASGVP
S R
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAACCT
GAA
FSGSG SGTDYTLTISSLQ
P E
241
GATTTTGCCACTTATTACTGCCÄGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTCAG
GGC
DFATYYCQQWSGNPWTFG
Q G
301 ACTAAGGTGGAGATCAAA
T K V E I K
111
Príklad 22
Tento príklad opisuje charakterizáciu rôznych AQC2 protilátok podľa vynálezu.
Test väzby al I domény na pevnej fáze pl fúzneho proteínu „al I doména-GST s koncentráciou 10 pg/ml sa nanieslo na polystyrénové 96jamkové doštičky CORNING COSTAR EASY WASH (Gotwals et al., Biochemistry, 38, 8280-8, 1999). Po inkubácii 16 hodín pri 4 °C sa doštičky premyli štyrikrát s 350 pl 0,1 % Tween-20 v PBS v premývačke doštičiek. Doštička sa blokovala nanesením 180 μΐ 3% BSA v TBS a inkubáciou 60 minút pri 25 °C, a potom sa premyla ako vyššie. Riedenie protilátok (50 μΙ/jamka) v TBS obsahujúcom 1 mg/ml BSA (testový pufor) sa pripravila na 96jamkových doštičkách s guľatým dnom, preniesla na doštičku potiahnutú al I doménou a inkubovala 60 minút pri 25 °C. Po poslednom premytí sa pridalo 100 μΙ/jamka TMB činidla (Pierce) . Po 10 minútach sa pridalo 100 ul IM kyseliny sírovej a odrátala sa absorbancia pri 450 nm na UV-VIS spektrof otom.etri pre 96jamkové doštičky.
Elektrochemiluminescenčné testy na väzbu αϊβΐ integrínu alebo o:l I domény ku kolagénu.
Tosyl-aktivované perličky DYNABEADS M-280 (Dynal, Inc.) sa potiahli kolagénom typu IV (Sigma) s koncentráciou 100 pg/ml podľa inštrukcií výrobcu. Bunkové lyzáty z αΐ-transfekovaných buniek K562 sa pripravili nasledujúcim spôsobom: Bunky sa zozbierali centrifugáciou, resuspendovali do koncentrácie 108 buniek/ml v lyzačnom pufri obsahujúcom 25mM Tris, pH 7,4, 1 %
NP-40, ImM CaCI2, lmM MnCl2, ImM MgCl2, 2% BSA a lm.M PMSF, a inkubovali sa pri 4 °C 60 minút. Bunkové zvyšky (debris) sa odstránili centrifugáciou pri 12,000 rpm 30 minút a vzniknutý supernatant sa použil v nasledujúcom experimente. Anti-βΐ
112 aktivujúca protilátka TS2/16 a polyklonáina anti-GST protilátka (ľharmacis) sa označili s TAG-NHS esterom (IGEN Internát!onal inc., Gaithersburg, MD) podía inštrukcie výrobca. Označené protilátky sa purifikovali gélovou filtračnou chromatografiou na SEPHADEX G25M (Pharmacia).
Ea uskutočnenie väzbového testu sa perličky octiahli kolagénom (1 mg/ml) a blokovali sa 5 minút 8% plazmou laboratórneho potkana kmeňa Lewis v testovacom pufri obsahujúcom 50mM HErľS, pH 7,5, 150mh NaO a G, 1% Tnton X-1CG. Ea väzbový test a-1 β i sa sériové riedenie protilátok in kubova i o s 10 μ g perličiek, bunkovým lyzátom pripraveným z 105 al-tra.osfekovar.ých buniek K562 (pozri vyššie) a 0,1 g/mi TAG-TS2/16 v testovacom.
pufri obsahujúcom ImM K.iCl2. Ea väzbový test ai I domény sa protilátky inkubovali s 10 pg perličiek, 0,1 g/ml fúzneho proteínu al I doméns-GST a 1 pg/ml TAG-anti-GST v testovacom pufri obsahujúcom. Im.M MnCl2. ?o jednej až dvoch hoainách trepania pri teplote miestnosti sa pridalo
200 pi puf r.
vzorry odráta) na ;estovacieho detektore ýsledkov sú elektrochemiluminescencie ORIGEN1.5 (IGEN). Grafy prezentované s uvedením arbitrárnych jednotiek elektrochem luminescencie (ECL) na osi x.
Kompetičný test s bictmylovaným mAQC2
Oojamková doštička sa potiahla s 50' pi fúzneno proteínu al I dorr.éna-GST a blokovala s 3% BSA v TBS, ak už oolo opísané vyššie. Riedenie protilátox (60 μΙ/jamka) v testovacom pufri sa pripravilo na 96jamkových doštičkách s guľatým dnom a 60 μΐ biotinylovanej myšacej AQC2 riedenej na 0,1 pg/ml v testovacom pufri sa pridalo. 50 pi z každej jamky sa prenieslo na potiahnutí! doštičku a mkubovalo 3 hodiny pri 25 °C. Doštička sa potom, premyla, ako oolo uvedené vyššie, a pridalo sa 50' pl EXTRAVIC1EU kon j ucovar.ého s peroxidázou (Sigma) s koncentráciou 1 g/ml a doštička sa inkubovala ďalšie 2 hodiny pri. 25 “C. Po
113 poslednom premytí sa pridalo TMB činidlo (Pierce) 100 μΙ/jamka. Po 10 minútach sa pridalo 100 μΐ IM kyseliny sírovej a odrátala sa absorbancia pri 450 nm na UV-Vis spektrof otometri pre 96 jamkové doštičky.
Experimentálne výsledky
Experimentálne výsledky sú uvedené na obr. 16A-D a v tabulke 3. Určila sa schopnosť mAQC2, chAQC2, hAQC2 a hAQC21 (t.j. huAQC2-c4, líšiaca sa od hAQC2 iba v tom, že zvyšok 1 ľahkého reťazca hAQC2' je D miesto Q) (1) viazať sa na K562 bunky transfekované ľudským al (pomocou FACS), (2) viazať sa na imobilizovanú al-I doménu (pomocou ELISA), (3) súťažiť s mAQC2 o väzbu k al-I doméne (pomocou ELISA), (4) blokovať väzbu a~I domény ku kolagénu (pomocou elektrochemiluminescenčného testu) alebo (5) blokovať väzbu integrínu αϊβΐ ku kolagénu (pomocou elektrochemiluminescenčného testu). Výsledky sú ukázané na obr. 16A-D a vyrátané hodnoty IC53 (pre inhibíciu) alebo EC50 (pre väzbu) sú uvedené v tabulke 3. V každom teste každá z foriem humanizovanej AQC2 prejavila podobnú schopnosť viazať buď VLA1 (alebo al doménu) alebo blokovať väzbu ku kolagénu (je treba upozorniť, že na paneli C pozorované rozdiely v intenzite medzi mAQC2 a humanizovanými formami pochádzajú z toho, že sa použila sekundárna protilátka anti-myšacia-IgG namiesto anti-ludskejIgG) .
114
Tabuľka 3
Zhrnutie výsledkov testov (všetky hodnoty uvedené v níi’
erotilátka FACS (EC50) VLA1 Inhibícia (IC50) r all Inhibícia (IC50) V ’ T C 1 (FO5ÍL .Kompe t i cis s b i o 11 n - v. qq y ! (IC50)
mAQC2 neurčené 0,0726 (+0,014) 0, 02 9 (±0,011) 0,061 (= C, 01 5 ) 38 (=8,7)
Chiméra 9,25 0, 071 (±0,002) 0, 027 (±0,007) 0,17 6 (=0,055) 30 ( = 6,9) )
r.AQC2 0,29 0,129 í ± 0, 0 C 5) 0,035 (±0,005: 0,190 (±0,010, 65 : (±2,2) 1
hAQC2' 0,43 0,12 5 (±0,018) 0, 037 (±0,001: 0,313 (t C,07 2) 69 Ί (±25,7) í i
Pôvoocovia ďalej testovali, či zmeny určitých konzervatívnych zvyškov v úsekoch CDR môžu zachovávať VLA-1 väzbovú aktivitu LAQC2. DNA konštrukty kódujúce varianty hAQC2 s nasledujúcimi mutáciami sa vytvorili miestne cielenou mutagenézou: (1) G55S v CDR2 ťažkého reťazca, (2; S24N v CCR1 ľahkého reťazca (vnesenie obsadeného miesta N-viazanej glykozyláciei , (3) G92S v CDR3 lahkého reťazca, (4) kombinácie (1) a (2), a (5) kombinácie (1) a (3). DNA konštrukty kódujúce tak ťažký ako aj ľahký reťazec sa potom kotransfekovali do buniek 2S3-E3NA a kondicionované médiá z transfektantu sa testovali na expresiu protilátky s použitím analýzy Western blot a ELISA. Výsledky ukázali, že hAQC2 varianty sa exprimovali rovnako účinne ako príbuzný hAQC2. FACS analýza s použitím VLA1-exprimujúcich buniek K562 ďalej ukázala, že VLA-l-väzbcvé aktivity týchto variantov boli podobné samotnej n.AQC2 . Môže sa teda zhrnúť, že substitúcia aminokyselín nezmenila VLA-1 väzbovú aktivitu hAQC2. A naozaj, róntgencštruktúrne analýzy kryštálov RAH/HAQC2 Fab komplexu (pozri vyššie) ukázali, že S24 a G92
115 ľahkého reťazca a G55 ťažkého reťazca nie sú lokalizované vo väzbovom vrecku, ktorá je v kontaktu s al-I doménou.
Príklad 23
Efektorové funkcie imunoglobulínu spájajú imuncglobulínovú antigén-väzbovú aktivitu so zápalovou, cytotoxickou a stimulačnou vetvou imunitného systému. Efektorové funkcie môžu narušiť bezpečnosť a účinnosť imunoglobulínového terapeutického produktu. Aby sa obmedzil potenciálne efektorové funkcie hAQC2, vytvorili sa mutácie L234A a L235A na ťažkom reťazci tejto protilátky, čím sa pripravila hsAQC2. Z rovnakého dôvodu sa vytvorila jednoduchá mutácia N297Q v ťažkom reťazci hAQC2, čím sa pripravila neglykozylovaná forma hAQC2, nazvaná haAQC2.
Môžu sa uskutočniť štúdie porovnávajúce ich účinnosť, reziduálne efektorové funkcie, stabilitu a imunogenicitu vzhľadom na hAQC2. Pokial sa inak neuvádza, pozičné čísla aminokyselinových zvyškov v konštantných úsekoch použité v tomto texte sú v súlade s EU konvenciou číslovania.
Polypeptidová sekvencia ťažkého reťazca haAQC2 je nasledujúca (plazmid: pAND161):
116
EVQLVESGGG
PGKGLEWVAT
ISGGGHTYYL
AVYYCTRGFG
101 DGGYFDVWGQ
AALGCLVKĽY
151 FPEPVTVSWN
SSSLGTQTYI
201 CNVNHKPSNT
VFLFPPKPKD
251 TLMISRTPEV
KPREEQYQST
01 YRWSVLTVL KGQPREPQVY 351 TLPPSRDELT NYKTTPPVLD
401 SDGSFFLYSK
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS
DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL
GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA
SGALTSGVHT FPAVLQSSGL
KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC
TCWVDVSHE DPEVKFNWYV
HQDWLNGKEY KCKVSNKALP
KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV
LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH
RYTMSWVRQA
QMNSLRAEDT
PSSKSTSGGT
YSLSSWTV?
PAPELLGGPS
DGVEVHNAKT
APIEKTISKA
EWESNGQPEN
EALHNHYTQK SLSLSPG (SEQ ID NO: 5)
Polypeptidová sekvencia ťažkého reťazca r.sAQC2 je nasledujúca (plazmid: pANDlll):
117
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL- SCAASGFTFS RYTMSWVRQA PGKGLEWVAT
ISGGGHTYYL DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCTRGFG
101 DGGYFDVWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSWTVP SSSLGTQTYI
201 CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD
251 TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
01 YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
351 TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG(SEQ ID NO: 6)
Príklad 24
Tento príklad opisuje spôsob určenia kryštálovej štruktúry komplexu chimérnej „potkanej/ľudskéj al-I domény al integrínu a Fab fragmentu hAQC2.
Príprava proteínového komplexu
Fab fragment hAQC2 sa pripravil z protilátky hAQC2s použitím pozmeneného postupu podľa súpravy IMUNOPURE ® Fab Preparation Kit (katalóg. č. 44885, Pierce, Rockford, IL). Intaktná hAQC2 protilátka sa koncentrovala na 12 mg/mi v pufri obsahujúcom 20mM fosfát, lOmM EDTA a 25mM cysteín (pH *,0). Imobilizovaný papaín sa pridal v pomere enzým k substrátu 1:50 a štiepenie prebiehalo cez noc pri 37 °C. Imobilizovaný papaín sa
118 odstránil a surový naštiepený materiál sa dialyzoval proti pufru 20mM octanu sodného (ph 4,5). Fab fragment sa separoval od reziduálnej intaktnej protilátky, dimérneho Fab fragmentu a Fc fragmentu katiónovou výmennou chromatografiou s použitím Skolóny (Poros HS/M, FERSEPTIVE Fiosystems, katalóg, č. PO42M26) s postupným soľným, grsdientom. Fab fragment sa potom dialyzoval do O,1M Repes pufru (pH 8,0).
brvna, ktorá sa použila v predkladanom cnimérnej pot ranej/ludskej I domény zvyšky Thr 145 integrínu laboratórneho potkana,
Gln219 a Leu222 (kryštálové zodpovedajúcimi ľudskými zvýš kam v uvedenom poradí, aoy sa obnovila aminokyselinové sekvencie cnimérnej laboratórneho potkana a ľudskej al-I domény sú uvedené nižšie v SEQ ID NO: 59, 60 a 61, v canom. poradí. Rekombmantná al-I
Chimérna al-I vynáleze, je konštrukt (mutant RAH) obsahujúci ž Fhe336 z retazca a í e zvyšky Gly2í7, Arg218, : í s 1 o u a n r e) Val, n a h r a d i 1 i Gin, Arg a Arg, väzba protilátky.
RÚH, al-I aomeny doména sa exprimovala v E. coli ako· GSI-: doména sa štiepila trombínom a purifi) pastori s, ako bolo opísané skôr (Go Biochemistry 38: 8280-8288).
úzny proteín. RúH ai-I .ovala z klonu Pichla jwals et al., 1999,
145 TQLDIV
151 IVLDGSNSIY PWESVIAFLN DLLKRMDIGP KQTQVGIVQY
191 GENVTHEFNL NKYSSTEEVL VAANKIVQRG GRQTMTALGI
231 DTARKEAFTE ARGARRGVKK VMVIVTDGES HDNYRLKQVI
271 QDCEDENIQR FSIAILGHYN RGNLSTEKFV EEIKSIASEP
311 TEKHFFNVSD ELALVTIVKA LGERIF (SEQ ID NO: 53)
145 TQLDIV
151 IVLDGSNSIY PWESVIAFLN DLLKRMDIGP KQTQVGIVQY
119
191
231
271
311 (SEQ ID NO:
GENVTHEFNL
DTARKEAFTE
QDCEDENIQR
TEKHFFNVSD
60)
NKYSSTEEVL
ARGARRGVKK
FSIAILGHYN
ELALVTIVKA
VAANKIGRQG
VMVIVTDGES
RGNLSTEKFV
LGERIF
GLQTMTALGI
HDNYRLKQVI
EEIKSIASEP
145 TQLDIV
151 IVLDGSNSIY PWDSVTAFLN DLLKRMDIGP KQTQVGIVQY 191 GENVTHEFNL NKYSSTEEVL VAAKKIVQRG GRQTMTAĹGI 231 DTARKEAFTE ARGARRGVKK VMVIVTDGES HDNHRLKKVI 271 QDCEDENIQR FSIAILGSYN RGNLSTEKFV EEIKSIASEP 311 TEKHFFNVSD EIALVTIVKT LGERIF (SEQ ID NO: 61)
Fab fragment hAQC2 sa zmiešal s nadbytkom chimérnej al-I domény a inkuboval 15 minút pri 27 °c. Saturované al/Fab komplexy sa oddelili od al-I domény nezahrnutej v komplexoch vylučovacou chromatografiou s použitím kolóny S200 Sephacryl (Pharmacia, Gibco). komplex sa ďalej koncentroval na 11 mg/ml v pufri obsahujúcom 20mM Tris (pE7,4(, 150mM NaCl, ImM Μη012,
5mM β-merkaptoetanol.
Príprava kryštálov
Kryštalizačné podmienky sa ziscili s použitím súpravy CRYSTAL SCREEN™ KITs od firmy Hampton Research (Lagúna Niguel, CA) . Kryštály komplexu opísaného vyššie sa pestovali v 20 μΐ metódou difúzie pár s použitím rovnakého množscva roztoku proteínového komplexu a 20-30% roztoku ?EG 1500.
Typicky 2 μΐ proteínového komplexu sa pridalo k 2 μΐ jamkového roztoku, čím sa získali kvapky s objemom 4 μΐ. Kryštály rástli dva až sedem dní ako šesťuholníkové prúty s rozmermi 0,8 x 0,05 x 0,05 mm3. Prítomnosť z al-I domény a hAQC2
120
Fsb fragmentu sa potvrdili SDS-PAGE analýzou rozpustených kryštálov. Aby sa zredukovalo nevyhnutné poškodenie žiarením v priebehu zberu dáz, dáta difrakcie rontgenového žiarenia sa merali približne pri 100 K. Na prípravu kryštálov na zoer dát pri takejto nízkej cepiote, sa kryštály postupne ekviliorovali s kryoprotektívnym roztokom obsahujúcim 25% PEG 400 a 30% PEG 1500 a velmi rýchlo ochladili v kvapalnom dusíku.
Určenie štruktúry
Natívne dáta rdntgenovej difrakcie pri rozlíšení 2,8 Ä sa získali z jediného kryštálu približne pri 100 K pomocou nabitého spriahnutého detektora ADSC Quantum. 4 v dráhe lúča X4A synchrotrónu v National Synchrotro.n Light Source (NSLS) Brookhaven Naeional Laboratory (BNL). Dáta sa spracovali s použitím počítačových programov DENZO a SCALEPACK (Otwinowski & Minor, 1991, Methods in Enzýmei. 276: 307-326). Kryštály patrili do priestorovej skupiny P6i alebo jej enancicmorfu P65, s rozmery jednotkovej bunky a = b = 255,09 A , c=38,64 A. Súbor dát bol na 96,6 % kompletný a mal hodnotu „R-merge 8,3%.
Matohewsov koeficier.o (Matthews, 1968, J. Mol. Biol. 33: 4 91497) bol 2,59 Ä3 Da'‘ s obsahom rozpúšťadla 52,1 %, čo ukazovalo, že ide c dva komplexy v komplexy v asymetrickej nekryšťalografickej dvojitej uvedená v tabuľke 4.
asymetrickej j ednotke symetrie.
jednotke. Tieto dva boli vo vzťahu
Štatistika údajov je
Vyhľadávanie molekulárnych náhrad sa uskutočňovalo s programom AMoRe (Navaza, 1994, Äcza Cýst. A50: 157-163) z programového balíka CCP4 (Collaborazive Computationa_ Project No. 4. The CCP4 Suioe: Programs for proteín Crystalography. 1994, Acta Crysť. D50: 760-763) a molekulárne grafické manipulácie sa uskutočňovali pomocou programu QUANTA. Jediná od I doména zo štruktúry al-I domény z αϊβΐ integrínu laborauórneho potkana (Protein Data bank (PDB) prístupové číslo lck4, Nolte et
121 al., 1999, FEBS Lett. 452: 379-385) sa použila ako model alebo sonda na rotačné a translačné vyhľadávanie. Vyhľadávanie translačnej funkcie ukázalo, že 1. a 9. najvyššie vrcholy rotačnej funkcie zodpovedali správnemu riešeniu pre dve al-I domény v asymetrickej jednotke (korelačný koeficient (cc) 21,1%, R = 53,1 %) , a že priestorová skupina bola P65. Následne sa uskutočnilo vyhľadávanie pre hAQC2 Fab fragmenty, pričom sa zachovalo riešenie pre I doménu a použil sa model Fv domény z hAQC2 Fab ako vyhladávacia sonda. Jasné riešenie sa našlo pre jednu z dvoch Fv domén (cc = 22,1%, R =52,6 %), ale druhá Fv nemohla byť lokalizovaná. Poloha druhej Fv sa určila pomocou nekryštalografickej dvojitej symetrie. Upresnenie tuhých telies dvoch I domén a dvoch Fv domén redukovalo R-faktor na 43,6% (Rfree = 42,7%) . Mapa elektrónovej hustoty 2Fo-Fc ukázala jasnú elektrónovú hustotu pre konštantnú doménu (Fconst) prvého Fab fragmentu, ale žiadnu hustotu pre Fconst doménu druhého Fab fragmentu. Model Fconst domény prvého Fab sa ručne „napasoval na pozorovanú elektrónovú hustotu. Po spresnení tuhého telesa pomocou programu programom CNX (Accelrys Inc., San Diego, CAt) 2000, Brunger, 1998, Acta Cryst. D54: 905-921), s použitím dát s rozlíšením 500-2,8 A optimalizácie, poloha všetkých domén znížila R-faktor na 39,7% (R-free = 38,9%).
Všetky ďalšie upresňovacie kroky sa uskutočňovali programom CNX. Na redukciu neistotu modelu sa použili parciálne modely pre výpočty 2Fo-Fc mapy a upresňovanie modelu. Východiskový parciálny model sa podrobil simulovanému nasadnutiu a zoskupenému B-faktorovému upresneniu s obmedzením nekryštalografickej symetrie. Faktory „R-working a „R-free sa znížili na 28,3% a 32,9%, v danom poradí. Nasledovalo niekolko cyklov pozostávajúcich z iteračnej výstavby modelu, pozičného upresnenía s maximálnou pravdepodobnosťou a upresnením Bfaktora. Prijali sa iba upresnenia modelu, ktoré spôsobili pokles faktora R-free. Po vybudovaní kompletného modelu sa
122 použila oprava na rozpúšťadlo. Faktory R-;;or king a R-free konečného modelu sú 21,3% a 27,21, v danom poradí pre cára (F > 2 o) pri rozlíšení 500-2,8 Ä.
Výsledná mapa elektrónovej hustoty 2Fo-Fc je dobrej kvality pre väčšinu komplexu s výnimkou aminokyselinových zvyškov 288 až 295 z jedného fragmentu I domény (molekula A na obr. 19), ktoré sú spojené so slabou elektrónovou hustotou a neboli zahrnuté v modeli. Okrem toho, celá konštantná doména jedného Fab fragmentu nemá žradnu viditeľnú elektrónovú hustotu, čo ukazuje, že ide o poruchu. To je zrejme dôsledok neprítomnosti kryštálových kontaktov pre konštantnú doménu Fab fragmentu spôsobenú jej polohou vo veľkom kanáli rozpúšťaclového kanála. Táto doména tiež nebola zahrnutá v konečnom modeli, ktorý sa sklaoá z 1030 aminokyselinových zvyškov, vytvárajúcich c polypeptidových reťazcov, a 2 mangánových iónov. Hodnota r. m. s. odchýlay polôh medzi rovnocennými zvyškami v komplexov v asymetrickej jednotke je malá (0,37 Á pre 1660 ekvivalentných atómov hlavného reťazca).
Stereochemícké štatistické hodnoty sa vyrátali programami PROCHECK (Laskowski et al., 1993, J. Appi. Cryst. 26: 283-291,
Morris et al., 1992, Proteins 12: 345—364) a CNX. Vodíkové väzby (< 3,6 A) sa zistili programom CCMTACT (Tadeusz Skarzynski,
Imperiál College, Eondon, 1.12.88, Collaôoratrve Computatlonal Project 4. CCP4 Suite: Programs for Proteín Crystalography. 1994, Acta Cryst.D50, 760-763). Všetky zvyšky iné ako glycín (okrem zvyšku Thr5C v L reťazci, ktorý bude ešte diskutovaný ďalej) sú v povolenom úseku Ramachandranovhc diagramu a 86% zvyškov leží v najvýhodnejších úsekoch. Priemerný 3-faktor atómov hlavného reťazca je 38,5 A'
Dáta z kr rafickej analýzy sú uvedené v tabuľke 4.
123
Tabulka 4
Zhrnutie štatistických údajov
Zber dát
Rozmery bunky, a, b, c (A) Priestorová skupina Rozlíšenie (Á)
Unikátne odrazy Úplnosť (%)
Priemer I/s R-merge* (%)
Model
Počet atómov iných ako H
Počet proteín. zvyškov
Obsah asymetrickej jednotky Priemerný B-faktor (Á2)
Spresňovanie
Použitý rozsah rozlíšenia(F > 2o) R-faktor (R-working) (%)
R-freeT+ (%) a kryštalografickej analýzy
255,09, 255,09, 38,64
P65
500 - 2,8 (2,9-2,8) +
35275
96, 6 (87,7)+
11,92 (2,29) +
8,3 (30,9) +
7950
1030 domény I, 1 fragment Fab, 1 doména Fv 38, 5
500-2,8
21,3
27,2
Stereochémia
RMS odchýlky dĺžky väzieb (Ä) 0,007
Uhly (°) 1,43
Rmerge Σ^Σί I Ihi Ih I /2hi Ihi + Hodnoty pre obal pri najvyššom rozlíšení sú uvedené v zátvorke.
++ 8% dát sa pridelilo pre výpočet faktora R-free.
Príklad 25
Tento príklad opisuje kryštálovú štruktúru komplexu chimérnej potkanej/ľudskéj al-I domény αϊβΐ integrínu a Fab fragmentu hAQC2.
Architektúra kryštálu
Kryštálová štruktúra komplexu chimérnej potkanej/ľudskej al-I domény αϊβΐ integrínu a Fab fragmentu HAQC2 má pretiahnutý tvar (pozri obr. 20). Rozmery komplexu sú 100 Ä x 50 Ä x 35 Ä.
124
Fab fragment prejavuje zvinutie molekuly typické pre imunoglobulíny. Ľahký reťazec a ťažký reťazce Fao fragmentu vytvárajú tíva široké listy antiparalelných S reťazcov, ktoré sú vzájomne tesne zbalené a vytvárajú tak kostru pre slučky úsekov určujúcich komplementaritu (CDR), ktoré vyčnievajú zo zbalených listov. Tak lanky ako aj ťažký reťazec obsahujú tri CDR slučky, pričom slučky ľahkého reťazca sú označené Ll, L2 a 22, zatial čo slučky ťažkého reťazca sú označené bl, Hl a H3. Kľučky úsekov určujúcich komplementaritu (CDR) zodpovedajú kanonickej štruktúre 1 pre slučky Ll, L2 a L3 ľahkého reťazca a pre slučky Hl a H2 ťažkého reťazca (Chothia et al., 1989, Náture 342: 8'Π8 8 3) . Kľučka H3 ťažkého reťazca má kompaktnú koniormáciu βvláser.ky, ktorá je stabilizovaná vnútornými vodíkovými väzbami, a trež dvoma aromatickými zvyškami (TyrlC'4 a PhelOt), ktoré sú umiestnené oproti ľahkému reťazcu. Zvyšok ThrčO z L2 zaujíma uhly dvojstému hlavného reťazca, ktoré spadajú do zakázaných úsekov Ramachandranovhc diagramu. Rovnaké pozorovanie pre zodoovedajúce zvyšky sa urobilo aj u iných protilátok (Muller et al., 1998, Structure 6, pp. 1153-11561), čo ukazuje, že ice o prirodzenú vlastnosť L2 slučky.
al-I doména pocľa predkladaného vynálezu má štruktúru veľmi
podobnú al-I doméne neviazanej v komplexe (PDB prístupové číslo
lcki, Nolte et al., 1999, FEBS Lett. 452: 319-385, PDB
prístupové číslo lqc5, Rrch et al., 1999, J. Biel. Chem. 274 :
24906-24913) . Štruktúra domény má di mu klectid-viažuci a lebo
Rossmanov záhyb (Rao & Rossman, 1973, J. Mol. Biol. 16: 241-
256) , v ktorom sú centrálne listy piatich paralelných β reťazcov
a rnden malý antiparalelný reťazec obklopené na obidvoch
stranách celkom siedmimi a-závitnic ami. Šesť β- -reťazcov
štruktúry pódia predkladaného vynálezu : sa označuse βΑ, ýB, pc,
βϋ, SE a pf a sedem, α-závitnic sa označ a6 a a 7 . u pe o; i. f <3.2 f <3.21 α4 , a5,
V I doméne existujú tri charakteristické štruktúrne znaky.
125
Prvým charakteristickým znakom je prítomnosť vloženej malej závitnice v βΕ-α6 slučke, nazývanej C závitr.ica. Väčšina slučky C špirály molekuly A (pozri obr. 19) podlá predkladaného vynálezu je spojená so slabou elektrónovou hustotou, ktorá svedčí c poruche. Zdá sa, že je to dôsledok neprítomnosti kryštálových kontaktov alebo kontaktov s Fab, ktoré by inak slučku stabilizovali. Avšak, rovnaká slučka v molekule E (pozri obr. 19) podľa predkladaného vynálezu má jasne definovanú elektrónovú hustotu bola zahrnutá v modeli. Druhým charakteristickým, znakom al-I domény je MIDAS alebo adhézne miesto závislé na ióne kovu (Metal Ton Dependent-Adhesion-Site), kde kovové ióny a ligandy sú zapojené do väzby I domény. Päť kľúčových zvyškov, ktoré vytvárajú časť MIDAS, sa označuje ako motív DxSxS-T-D. Tieto zvyšky, ktoré sú úplne konzervatívne medzi I doménami, koordinujú kovový ión (Gotwals et al., 1999, Biochemistry 38: 8280-8288). Kryštály podľa predkladaného vynálezu sa pestovali v prítomnosti mangánu a MIDAS miesto 1 domény v tejto štruktúre obsahuje, ako sa pozorovalo, kovový ión Mn+2. Ión je priamo koordinovaný bočnými reťazcami zvyškov Serl56, Serl58 a Thr224. Mapa 2Fo-Fc elektrónovej hustoty neukazuje žiadny dôkaz roho, že MIDAS zvyšky Aspl54 a Asp257 vytvárajú vodou sprostredkovanú nepriamu koordináciu kovového iónu (obr. 20). Avšak, zjavná neprítomnosť molekuly vody by mohla byť dôsledkom obmedzeného rozlíšenia (2,8 Ä ) mapy elektrónovej hustoty. Tretím znakom I domény je to, že všetky určené štruktúry I domény patria k jednej z dvoch konformácií nazvaných otvorená a uzavretá. Rozdiely medzi otvorenou a uzavretou konformáciou zahrnujú odlišný spôsob koordinácie kovového iónu a významný (približne 10 Ä) polohový posun Ckoncovsj závitnice I domény. I doména v komplexe podľa predkladaného vynálezu je v uzavretej konformácií.
V štruktúre komplexu podlá predkladaného vynálezu sa Fab fragment viaže k svojmu epitopu na prednom hornom povrchu
6
I domény so „stopou 35 Ä x 30 A. Celková obsadená plocha rozhrania protilátka-antigén je 1534 Ä2, čo je typické aj pre ostatné komplexy protilátka-antigén 'Davies et al., 1 996, Proc. Natl . Acad. Sci . USA. 93 : i -12, Jones & Thornton, 19 9 6, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 13-20) . Povrch má na 253 hyarofóbny a na 75% hydrofilný charakter. Ťažký reťazec prispieva 65% k ploche obsadeného povrchu v komplexe, zatiai čc zostávajúcimi 35% prispieva lanky reťazec. Protilátkový epítop pozostáva zo zvyškov lokalizovaných v štyroch slučkách I domény (Emsley et al., 2000, Celí 101: 47-56). Tri z týchto slučiek vytvárajú MIDAS miesto: slučka 1 (βΑ-cci), ktorá obsahuje konzervatívnu DXSXS sekvenciu, slučka 2 (α3-α4), ktorá obsahuje MIDAS Thr224, a slučka 3 (3D-a5), ktorá obsanuje MIDAS zvyšok Asp257. Štvrtá slučka je C-závitnicová slučka a je zapojená iba do minoritných kontaktov.
Ústredným znakom interakcie antigén-protilátka je koordinácia kovového iónu v MIDAS mieste AsplOl z CDR H3 protilátky (obr. 20) . Vzdialenosť meczi iónom a z AsplOl je 2,4 Ä. Okrem toho atóm 052 z AsplOl interaguje s His261 z I domény. Je zaujímavé, že CDR H3 obsahuje niekoľko glycinových zvyškov v susedstve AsplOl (sekvencia GFGDGGY) (SEQ ID NO: 62), pravdepodobne preto, aby sa umožnila dostatočná flexibilita CDR slučky, a tav sa umožnil správna koordinácia kovového iónu. CDR H3 sekvencia je v podstate nezmenená v monoklonálnych protilátkach, ktoré sa pripravili proti rovnakému antigénu a zistilo sa o nich, že patria do rovnakej triedy. Väčšina prot i lát kových zvyškov, ktoré sa zúčastňujú kontaktu protilátkaantigén, je lokalizovaná v slučkách L3, Hl, H2 a H3 CDR. Zdá sa, že niekolko zvyškov z slučky Ll (Asn30) a L2 (Tyr48) vytvára menej významné van der Waalscve väzby. L3 primárne prispieva ku kontaktom prostredníctvom dvoch velkých hydrofóbnych zvyškov, TrpSO a Trp95. Okrem toho Asn93 z slučky L3 tvoria vodíkové väzby s Gln223 z I domény. Bočné reťazce His56 a Tyr53 zo slučky
127
Η2 tvoria vodíkové väzby s atómami hlavného reťazca slučky 2 z I domény. Arg31 z slučky Hl je v kontakte s Arg291 slučky 4 z I domény. Arg222 slučky 2 z ľ domény je vmedzerený medzi niekolko protilátkových zvyškov vrátane Tyr58, Trp95 a Asn93. To jediný zvyšok zo štyroch mutovaných v RAH I doméne, ktorý je zapojený do kontaktov s Fab. Je to preto pravdepodobne jediný zvyšok zodpovedný za obnovenie väzby protilátky po mutagenéze.
Porovnanie kryštálovej sústavy komplexu chimérnej
pot kanej/ludskej al-I domény a hAQC2 Fab fragmentu s inými
štruktúrami I domény
Chimérna al-I doména RAH má štyri sekvenčné v al-I doméne
laboratórneho potkana (zvyšky zo sekvencie laboratórneho
potkana: 217G, 218R, 219Q a 222L) , osem sekvenčných rozdielov v
ľudskej al-I doméne (zvyšky z ľudskej sekvencie: 163D, 166T,
214K, 264H, 268K, 288S, 3221 a 380T ) a desať sekvenčných
rozdielov v klene použitom v kryštálovej štruktúre použitej na štúdium ľudskej al-I domény (zvyšky zo sekvencie klonu: 163D, 166T, 174E, 214K, 2301, 264H, 268K, 288S, 3221 a 380T).
V kryštálovej štruktúre al-I domény αϊβΐ laboratórneho potkana bez naviazaného ligandu (PDB prístupový kód lck4, Nolte et al., 1999, FEBS Lett. 452:379-385), al-I doména neobsahuje žiadne naviazané kovové ióny a zaujíma uzavretú konformáciu.
V kryštálovej štruktúre ľudskej al-I domény bez naviazaného ligandu (prístupový kód lqc5, Rich et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 24906-24913), al-I doména obsahuje viazaný Mg+2 a podobne zaujíma uzavretú konformáciu. Superimpozícia týchto dvoch štruktúr s komplexom chimérnej al-I domény ukazuje, že sú tu iba málo významné konformačné zmeny pri väzbe protilátky hAQC2. Hodnota r. m. s. polohovej odchýlky medzi chimérnou al-1 doménou a al-I doménou laboratórneho potkana je 1,04 Ä pre všetkých 768 atómov hlavného reťazca. Hodnota r. m. s. polohovej odchýlky medzi ľudskou a chimérnou al-I doménou je C, 69 Ä pre všetkých
128
^64 atómov hlavného· ľ reťazca. Najväčšie rozdiely (pár ludskej a
chimérnej al-I aoro ény) sa pozoroval v slučke 1 Ír. m. s.
odchýlky 1,24 A pre atómy hlavného reťazca zvyškov 154 až 161)
a slučke 4 (C závitni: cová slučka) al-I domény (r. m. s. odchýlky
1,55 Ä pre atómy hla .vnéh.c reťazca zvyškov 288 až 296). Avšak
cieto rozdiely môžu byť presnejšie opísané ako posuny celých
elementov sekundárnej štruktúry skôr ako komplexné konformačné
zmeny. Zdá sa, že sú v bežnom rozsahu konformačnej flexib:hity
proteínov. Hodnota r. m. s. polohovej odchýlky medzi ludskou a
chimérnou al-I c: zmenou pre atómy hlavného reťazca
aminokyselr nových zv; ,-škcv Glul92, Gln218, Arg219, Giy220 a
Giy221 (kryštálové č ŕslovanie) je 0,33 Ä. Hodnota r. nt. s.
polohovej odchýlky medzi potkaňou a chimérnou al-I doménou pre atómy hlavného reťazca aminokyselinových zvyškov Aspl54, Serl56, Asnl57, Serl58, TyrlOO, Glul92, Gln218, Arg2T9, Gly220, Gly221,
Arg222, Gln223, Thr22 4, Asp257, His261, Asn263, Arg291 a Leu294
(kryštálové číslovaní; r) je 0,97Ά.
I doména zachová va konformáciu zavretej I domény, ktorá
sa pozorovala iba pre I domény bez ligandu kryštalizovanej bez
prítomnosti ligandov alebo pseudoligandov viazaných k miestu
_DAS. Hodnota r. m. s. polohovej odchýlky C-koncovej závionice
ľudskej a chimérnej I domény (vyrátaná pre atómy hlavného
reťazca zvyškov 321 až 335) je 0,64 Ä. Simulovaná mapa
zanedbávajúca nasadnú cia vyrátané pre konečný spresnený mcdel
jednoznačne potvrdil a, že poloha C-koncovej závitnice a
priľahlého štruktúrna eho elementu je v súlade s uzavretou
konŕormáciou.
Aby bolo možne skúmať účinky väzby ligandu na spôsob
koordinácie xcvcvéh.c iónu, štruktúra podlá predkladaného
vynálezu bola superc onovaná so štruktúrou a2-I domény bez
naviazaného liganau ?DB prístupový kód laox, Emsley et al.,
' 997, J. Biol. Chem. 2 7 2:28512-28517) a oc2 —1 domény v komplexe s kolagénovým pepciacm (?DB prístup. Kód ídzi, Emsley et al.,
129
2000, Celí 101: 47-56). Koordinácia kovového iónu AsplOl z protilátky je pozoruhodne podobná koordinácii kovového iónu cx2-I domény kyselinou glutámovou z kolagénového peptidu. Ďalším znakom, ktorý je konzervatívny, je súčasná interakcia kyslej skupiny s His261 (His258 v a2-I doméne). Všetky MIDAS zvyšky z komplexu I doména-Fab, okrem Serl56 a Serl58, zaujímajú konformáciu velmi podobnú tej, ktorá je pozorovaná u I domény bez naviazaného ligandu. Na rozdiel od toho bočné reťazce Serl56 a Serl58, a tiež kov, zaujímajú konformáciu podobnú konformácii I domény s ligandom. Je teda jasné, že koordinácia kovového iónu AsplOl neumožňuje iónu zachovať polohu a koordinačné vzdialenosti, ktoré sú pozorované v stave bez ligandu. Takže kovový ión nie je priamo koordinovaný Asp257, čo je fakt, ktorý dovoľuje, že si ión zachováva vysokú elektrofilnosť.
Biologické dôsledky
Podľa predkladaného vynálezu neexistuje žiadna priama koordinácia kovu Asp257, ktorá by mohla umožňovať vysokú afinitu väzby tým, že by znížila energetickú bariéru medzi zavretou (ligand nie je viazaný) a otvorenú (ligand je naviazaný) konformáciu. Avšak, koordinácia kovu kyselinou asparágovou protilátky nie je dostatočná na to, aby indukovala otvorenú konformáciu I domény podlá predkladaného vynálezu. Štruktúra komplexu „I doména-Fab ukazuje, že je možné mať silnú väzbu k I doméne, ktorá zaujíma uzavretú konformáciu, a že koordinácia kovového iónu kyslým zvyškom z ligandu je nutná, avšak nie postačujúca na indukciu zmeny konformácie na otvorený stav. Očakáva sa, že naviazanie protilátky stabilizuje nízkoafinitný stav integrínov a bráni tak signalizácii zvonka, ktorá by sprevádzala väzbu integrínu ku kolagénu.
Aj keď bol predkladaný vynález opísaný velmi podrobne formou príkladov výhodných uskutočnení a ilustratívnych príkladov pre jasnosť opisu, odborníkovi je zrejmé, že sa môžu
130 uskutočniť určité zmeny a modifikácie bez tono, aby k odchýleniu od myšlienky vynálezu. Preto ani oois ani t by nemali byť chápané tak, že obmedzujú rozsah vynálezu.
ooš lo í klady
131
Zoznarr. sekvencií <160> 70 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 106 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický polypeptid <4 00> 1
Gin 1 íle Val Leu Thr 5 Gin Phe Pro Ala Leu 10 Met Ser Ala Ser Pro 15 Gly
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Lys Ser Ser Pro Lys Pro Trp íle Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
& n 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr íle Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu íle Lys
100 105 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický polypeptid <400> 2
Asp Val Lys Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin íle Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 4C 45
132
Λ-<5 Thr 50 íle Ser Gly G1 y ά _ y ' 5 His Thr Tyr Tyr s ľ r . d
g: y 65 Arg Phe Thr Íle Ser Arg As? Asn Ala Lys — c r c - ^ee _yr
G 2 η Met Ser Ser leu 85 A. r g Ser G5o Asn Thr A5a 90 Lee Tyr 9 5
Arg Gl y Phe Gly 100 Asp Gly C ' ; Tyr Phe 105 H S p V ô _L Trp G5y Gin Gly
Thr V a 1 Thr Val Ser Ser
115 <210> 3 <211> 213 <212> PRT
<21; 3> V melá sekvenc. r a
<22 ( 0>
<221 3> G prs i tme 1 e; s í e kvej acr e : S y ntetl .oký
olype sptiä
<4G0> 3
Gin íle Gin Leu Thr Gin Ser r r o Ser Ser Leu Ser A 5 a Ser Val
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr íle Thr G i ·' s 7 b) Ser Ala Ser S e r S e r y l A s n P i s
2 0 25 3 C
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro i- y s P r S Trp íle
35 u
Leu Thr S e r Asn Leu Al a 0 cz -r Gly Val Pro Ser r g D a Ser Gly
50 5 5 ' n
Gly Ser G1 y Thr Asp Tyr Thr Leu Thr íle Ser Ser Le Gin Pro
65 7 5
Λ S U Prie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser 31- A s r Pro Tro
85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu íle Lys Arg Thr V a Ala -, _ a
100 105 - i n _ i v
Ser Val Phe íle Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu L y s Ser GGy
115 120 12 a
.Al 6 Ser Val Val Cys Leu Len Asn Asn Phe Tyr Pro A r g Gin - G
130 i 0 0 11 0
Val Gin Trp L y' s Val Asp Asn Ala Leu L _ Γ. Ser Glv A. e Ser 5-In
1 5 15 0' 15 5
Ser V a 1 Thr Glu Gin A s u Ser lys Asd ber T n r ľ vr S e L e o Ser
_ 7 Ο
133
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Giu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Pne
133 200 205
Asn Arg Gly Glu Gys
21C <210> 4 <211> 447 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický polypeptid <400> 4
Glu 1 Val Gin Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gin Pro Gly 15 c-iy
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg T·; r
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr íle Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr La u
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tnr
85 90 95
Arg dy Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Tnr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Tnr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu c-iy
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val ’ 7 _ 7 Thr Val Pro Ser Se’-
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr íle Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asr. Thr Lys Val Asp Ly
Pro. Lys Ser 220
Lys T'n r
His 22 5 ys ro Cys Pro Ala .-ro Gly Lea Leu Gly Gly Pro Ser
Val Pre Leu t- r í z -:
Pro Lys Pro ľ ys Asp Thr Leu Cer
Thr Pro Clu :1 A:
ber or s G_u Aso Pre
GLu
-í27;
o1 r. e
G - 3 a L ό 1 u v a r o r s a s r 1 a
Lys tlζριο rys aro
80
Gin
Ar Thr Lyr Arg Val Va. 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Ty:
05
310
Lys Cys Lys Val Ser A.sn Lys A.la Leu P:
;20 :o íle Glu Lys T’nr 335 íle Ser Lys Ala Lys Gly
Pro Arg Glu Pro Gin o .· o lyr iiar Leu
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asr Gin Val Ser Leu 355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375
Val Glu Trp Glu 38 0
Asr. Gly Glr. Pre Glu Asr. Asr. Tyr Lys Thr Hor Pro pro 385 390 395 .i G U m S O 3 0 0
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
Leu Thr Val asp Lys Sei 415
Arg Trp Gin Gin Gly Asr. 420
Phe Ser Cvs Ser Val Ver His Glu Ala
30
Leu Lis Asr. His Tyr Thr Glr. Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
440
<210> 5
< 2 11 > 437
<212> PPL
<213> U íl L Θ _ Čl se kver.ee
<220>
<223> Opis u~elej sekvencie
polyp eps i d
<3 00> č
;ick'
Ílu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly _,eu var _n Pro Gly Gl: 15
135
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20
Thr Met Ser Trp Val Arg Glu Ala 35 40
Ala Thr íle Ser Gly Gly Gly His 5C 55
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp 65 30
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 85
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr 100
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120
Leu Ala Pre Ser Ser Lys Ser Thr 130 135
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180
Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr íle 195 200
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 210 215
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245
Thr Pro Glu Val· Thr Cys Val Val 260
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 235 280
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 290 295
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin 305 310
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 2 5 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 45
Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys 60
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu '5 80
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 90 95
Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr 105 110
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 125
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 140
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 155 160
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin 17C 175
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 185 190
Cys Asn Val Asr. His Lys Pro Ser 205
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 220
Pro Glu Leu Leu Giy Gly Pro Ser 235 240
Lys Asp Thr Leu Met íle Ser Ara 250 255
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 265 * 270
Asp Giy Val· Glu Val His Asn Ala 285
Tyr Gin Ser Thr Tyr Arg Val Val 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 315 320
Leu Pro Ala Pro Íle Glu Lys Thr 330 335
136 i:e ber ^yi
Gly Gin Pro Arg Glu uro GI O
Pre Pro Se , y s A s r Gla Val Ser
Len Val Vys 370
Pro Ser Asp _le Ala Val Glu Tro 375 300
A s r. 385
Gly cin
Asn 3 9C ľyr Lys Thr Thr Pro Pro
Ser Asp Gly Ser Pas Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
410
1:
Δ r. TU
Phe Ser Cys Ser Val Met Hi s 425 430
Leu His .Asa Hr 4 35
Th:
Lvs Ser Leu Ser Leu Ser Pro G
440
145 <210 c <211> 447 <212> PRľ <215> Umelá sekver.oia <220 <223> Opis umele; sekvencie: Syntetický polypeptid <450> 6
Glu Val Gla Le 1
Ser Leu Arg Le
Z
Thr Piet Ser Tr t s
Ala Thr Íle Se 5 0
Gly Arg Pne Ti. 65
Gin Met Asn Se
Arg Gly Pae Gi 10
Leu Val Thr Va
Val Glu Ser Γ1 v ciy Gly 10 Leu Val Gin L r o Gly Gly 1 5
Ser Cys ALa A j. a Ser 25 Gly ?ne Thr Pne Ser Arg Tyr
Val Arg Gin rh _ cl 4 0 Pro g; y Lys Gly 4 5 G l· u Trp Val
Gly Gly Gly 55 His Thr Tyr Tyr Leu 60 Asp Ser Val Lys
íle Ser 70 Arg Asp Asn Ser Lys 75 Asn Thr Leu Tyr Leu 80
Leu Arg 85 Ala Glu Asp Thr 90 Ala Val Tyr Tyr Gys Thr 95
A s c ? 1 y Gly Tyr Phe 105 Asp Val Trp Gly Gin 110 Gly Tnr
Ser Ser Ala S e -i- 12 0 Thr Lys G i. v Pro S e r 12 5 ehe S-ο
Ser Lys Ser T L r Ser Gly Gly P ’η r~ a. _i. a .a. i. a Leu Gly
3 5 1 4 C·
137
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pre Ser Ser 180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr íle Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met íle Ser Are
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 ' 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
3C5 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro íle Glu Lys Thr
325 330 335 íle Ser Lys Ala Lys Gly Gir Pre Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp íle Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380
Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly'
435 440 445
8
<2 10 > < 2 i 1 > <2 12> <2 1 3> 7 26
DNA Hor o S 3 !3 ΐ Q P. S
<4 2O> 7
caggat cca t CR (CCCdCči ~ 7 t C ä ä
<2 2 O> 6
<2 11 > 2 c
< 2 12 > DNA.
<213> Hon. o s a p i en s
<4C0> 8
tcctcgaggg catgcaggga a a a t a 7
<210> 9 <211> 26 <212> DNUA
<213> Ha c rus sp.
<4QO> 9
caggatccgc cagccctaca cttcaa
<210> 10
<211 > 26
<212> DNA.
<213> RaLt'd S S C1
<4OO> 10
tcctcg agcg cccccaaagc gaaíac
<210> il
<211> 31
<212> DNA.
<2 1 3> Umelá sekvencia
<220> <223> Opis smelej sekvencie primér
< 4 C 0 > 11
Syntetický tgaggagacg gtgaccgtgg cccttggccc c <210> 1.2 <2il> 22<212> JNA<213> Umelá sekvencia <2 2 O>
139 <223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400 12 aggtsmarct gcagsagtcw gg 22 <210 13 <210 40 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Cpis umelej sekvencie: Syntecický primér <400 13 actagtcgac atggatttwc aggtgcagat twtcagcttc 40 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400 14 actggarggc gggaagatgg a 21 <210 15 <211> 9 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: Syntetický peptid <400> 15
Asp Val Lys Val Val Glu Ser Gly Gly 1 5 <210> 16 <210 6 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: Syntetický peptid
140 < 40 Ο> 16
Asp Val Lys Val Val Glu 1 J S <210> 17 <211> 54 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220 <223> Cpis umelej sekvencie: Syntetický primér <400> 17 gcaccaggtg cccactccga cgccaaggug gtggagtcag ggggaggctt agug
<210 18
<2 11 > 38
<2 12> DNA
<21 3> Umelá sekv e n c i a
<220
<223> Opis umelej sekver.c pr i mér
<4 00> 18
ggaggcacca agctggaqac ctnacgcgct gatgccgc 38
<2 10> 19
<2 11> 34
<212> DNA
<213> Umelá sekvencia
<220
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér
<4 00> 19
cataac gtcc aggggagaaa ttgcccceac ccag
<210> 2C
<210 93
<2I2> DNA
<213> Umelá sekvencia
<220>
<223> Cpis umelej sekvencie: Synterick primér
<400> 2 0
ggtgcccact ccgacctcca gctggtcgag tcagggggac gcctagccca gcccggaggg tccctgagac tctcccgtgc agcccccgaa ttc
141
<210> <211> <212> <213> 21 51 DNA Umelé j sekvencia
<220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický
primér <400> 21 atgtcttggg ttcgccaggc tccggggaag gggctggagt gggtcgcaac c 51
<210> 22
<211> 93
<212> DNA
<213> Umelá sekvencia
<220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér
<400> 22
ttcaccatct ccagagacaa ttccaagaac accctgtacc tgcagatgaa cagtctgagg 60 gccgaggaca cagccatgta ttactgtaca aga 93 <210> 23 <211> 39 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400> 23 tggggccaag gtaccctggt caccgtctcc tcaggtgag 39 <210> 24 <211> 51 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400> 24 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aggtatacta cgtcrtgggt t 51 <210> 25 <211> 39
142
<212> <213> DNA Umelá sekvencia
<220
< 2 2 2 > Qr- i u. umelej sekvencie: cyntecicn
D ** 7 · Ó V
H- --1·
< 1 OC > 25
gcacca cgcactcccá ggtccagctg gtcge
<210 2 6
<210 39
<212 > DNA
<2 13 > Urnel á sekvencia
<220>
<223> Opis umele sekvencie: Syncetick'
nnmér <400> 26 gagtcagggg gaggcttaat ccaccctgga gggtccctg <210> 27 <211> 31 DNA <2 . i> Urr.eia seKvencic <22:0 <223> Opis umelej sekvencie: Syntetický <400> 27 caaattgttc tcacccagtc tccatcctcc ctgtctgcgt ctgtagggga cagagtcacc 60 atcacatgca gtgccagctc a SI
<210> 28
<210 45
<212> DNA
<213> Umelá sekvencia
<220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér
< 4 0 0 > 28
ttccgg rate agcagaagcc cgggaaagcc cccaaa
<210> 29
<210 105
<212> DNA
<213> Umelá sekvencia
143 <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400> 29 gcttctggag tcccttcacg cttcagtggc agtgggtcig cgacagatta cactctcaca 60 atcagcagcc tgcaacctga agattttgcc actaattact gccag 105 <210> 30 <210 33 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický prim.ér <100> 30 ggtggaggca ctaaggtgga gatctaacgg get <210 31 <211> 39 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400 31 cccgggaaag cgcccaaact cctgatttat ctcacatcc <210 32 <211> 51 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400> 32 gcctcagrca taatgtcccg ggcacaaatt cagctcaccc agtctccatc c <210> 33 <211> 51 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér
4
<4 03> 33
ggtaac ccgt ggacgct cgg tcagggcact aaggtggaga
<2 2 3> -5 .
<2 11 >
<222> ycr
<213> D m e 1 á sek v e n c i a
<220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér
<4 00> 3 i
gcctca grcá taatgicccg gggacaaatt cagctcaccc
<210> 3 5
< 2 11 > c j
<212> DNA
<213> Umelá sekver.cia
< 2 2 0 >
<22 3> Cpis umelej sekvencie: Syntetický o r i m é r
<400> r t
ggtaac ccgt ggacgttcgg tcagggcact aaggtggaga
tctaacggg a g t c t c c a t tctaacggc
<210> 3 6
<2 11> 3 5
<2 i 2> C N Ά
<2 2 3> tmela sekvencie
<220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér
< 4 0 0 > 36
gggaaagcac ccaaactctg gatctacctc acamcaac
3S
<210> 3i
<2 11> 4 5
<212> DNA
<213> Smelá sekvencia
<220> <223> Opis umelej sen terrcie: Syntetický
primér
<4 30> 31
a a g c c c g g g a a c g c g c c c a a a c c c c t g a 11 tatctcacat
<210> a c
<211> a o
caac
145 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400> 38 gtcataatgt cccggggaga tatccagcuc acccagtct 3S <210> 39 <211> 354 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<221> CDS < 22 2 > (1)..(354) <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický oligonukleotid <400> 39
gac Asp 1 gtc Val aag Lys gtg Val gtg Val 5 gag Glu tca Ser ggg Gly gga Gly ggc Gly 10 tta Leu gtg Val aag Lys cct Pro gga dy 15 ggg Gly 48
tcc ctg Ô3S ctc gcc tgt gca gcc tet gga ttc agt ttc agt aga tat 96
Ser Leu Lys Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
act atg tet tgg gtt ege cag att ccg gag aag agg ctg gag tgg gtc 144
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin íle Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
gca acc att agt ggt ggt ggt cac acc tac tat cta gac agt gtg aag 192
Ala Thr íle Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
ggc ega ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac acc ctg tac ctg 240
Gly Arg Phe Thr I ie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
caa atg age agt ctg agg tet gag gac aca gcc atg tat tac tgt aca 288
Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr
8 5 90 95
aga ggt tet gga gac ggg ggg tac ttc gat gtc tgg ggc caa ggg acc 336
Arg Gly Phe G_y Asp Gly Giy Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
acg gtc acc gtc tcc tca Thr Val Thr Val Ser Ser
115
354
146
<210 <210 <212?· <213? 40 118 PAT L'r.el
<220
<223> Opi s
poly
<400> 40
Asp Val Lys Val Val Glu Ser Giy Gly Giy Le 1 5 ló er Leu Lys Leu Ala Cys Ala ALs Ser Gly Pr.e : e r sa ľhr Met Ser Trp Val Arg Gin íle Pro Glu Lys Arg
Ala Thr íle Ser Gly Gly Gly Hrs Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser íly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Lt
Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Giu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys :g Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp
100
105 ľhr Val Thr Val Ser Ser
y y 5
< 210 > 41
<211> 354
<212> DNA
<213> Lime 1 á sekvencia
<220
<221 > CDS
<222> (D · . í 354)
<220
<223> Opis umelej sekvencie
<4 00> 41 gac gtq cag oliqonukleotid :tg gtc gag tca ggg gga ggc tta gtc cac .-.sp .'al Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val gg
Gl e c ctg aga ;r Leu Arg Leu Ser 20 c tcc tgt gca g c c tct gga ľys Ala Ala Se:
2[ uy tne Ser ;er ta11 147
äCt Thr atg Met tet Ser 35 tgg Trp gtt Val cgc Arg cag Gin get Ala 40 ccg Pro ggg ciy aag Lys ggg Gly ctg Leu 45 gag Glu c z g Trp gtc Val
cca acc att agt ggt ggt ggt cac acc tac tac cca gac agt ccg a a c
Ala Thr íle Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
cgc ega ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acc ctg teľ ccg
C-ly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Lee
65 70 75 8 G
cag atg aac agt ctg agg gcc gag gac aca gcc gtg tat tac tgc aca
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 9 5
aga ggt ttt gga gac ggg ggg tac ttc gat gcc tgg ggc caa ggc acc
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
ctg gtc acc gtc tcc tca
Leu Val Thr 115 Val Ser Ser
<21 0> 42
<21 1> 118
<212> PRT
<213> Umelá sekvencia
<220
<223> Opis umelej sekvencie : Syntet ický
polypeptid
<400> 42
Asp Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tro Val
35 40 45
Ala Thr íle Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Al a Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
143
<210> 4 3
<211> 35 6
<212> DNA
<213> Umel
<220>
<221> CDS
<222> (L -
<220>
<223> Opis
oligonukleotic <400> 43 gag gtc cag ctg gtc gag tca ggg gga gg c Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
5 1 ΙΟΙ v Gl ícc ctg aga ctc tcc tgt gca ccc tct gga Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
0 2 5 aqc n, < -yact a t g tct tgg Thr Net Ser Tro gtt cgc cag ccg ggg aac
L Θ la 1 Arg Gin Ala Pro Gl 4 0 ;tg g: .. e u G1 t c.
cgc T rr gtc >C1 gca acc a 11 ag L ggt ggt ggt Ala Thr íle Ser Gly Gly Gly
55 g g c ega 11 c acc a t c tcc ta:
Ty;
192
Aso S e
Gly Arg Pne Thr íle 65 a c a g a c aat tcc A r g Asp Asm Ser ta:
Ty;
ctg
Leu n
0 cag atg aac agt ctg agg gcc gag gac ac= gc Gin Net Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Al
5 90 t g e cy;
aga ggt ttt gga gac ggg ggg tac ttc gac Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp gtc v s i ľrp qg* acc
Th;
ó
100 ctg gtc acc gtc tcc Leu Val Thr Val Se; 115
<210> 44
< 211 > 118
<212> PRT
<213> Umelá sekvencia
<220>
<223> Opis umelej sek
polypeptid
<400> v 4
Glu V a . — Gin íj θ ’j '7 s 1 <3
Glu Ser Gly Gly Gly
Gl i
149
Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Arg Tyr
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val·
35 40 45
Ala T c r íle Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Val Lys
z Z 5 5 60
Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 7 5 8 0
Gin M e Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
35 90 95
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin dy Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 45 <211> 356 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<221> CDS <222> (1)..(354) <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický oligonukleotid <4 OCO 4 5
gag gtc cag ctg gtc gag tca ggg gga ggc tta gtc cag cct gga ggg 48
o 1 u Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pre Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt agg tat 96
Ser Len Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
act atg tct tgg gtt cgc cag get ccg ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
ccs acc att agt ggt ggt ggt cac acc tac tat cta gac agt gtg aag 192
Ala Thr íle Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
5 0 55 60
c u c cca tcc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acc ctg tac ctg 240
Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Len Tyr Leu
6 5 70 75 80
cag atg a a c agt ctg agg gcc gag gac aca gcc gtg tat tac tgt aca 238
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
3 Q 3 CCJ t Arg Gly bit Phe gga Gly 100 Asp Gly Gly 3 d C ÍL t 3 Ο a u 3 3 3 ľ y r Phe Asp Val 105 vi v; 1 v; S
c t g g t c acc CSC -cc u 3 5 0 C 35 5
Leu val Tnr Val cer Scľ
115
<210> 45 <211> 318 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<221> CDS <222> (1! . . ί3 18) <220>
<223> Opis umelej sekver.cie: Syntetický oligonuklectid <400> 4b
Ο1 ο
C 3 ä at t 3 t t ctc acc cag ttt c c a gca ctc d _ 3 :cr gcg to - cca ggg 4 8
Q y n íle Val Lee T h r Gin Phe Pro Ala Leu 1 j Λ ľ Ser Ala Se r Pre viy
1 5 15
gag aa g gtc acc arg acc tgc agt gce a g c t C 3 a 3 u gta a cu - c 3 c atg 96
Glu Lys Val T h r V e t Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val A s n His Met
2 Q 25 3
11 C tgg t a t cag cag aag cca c ä ä tcc tcc CCC a a a CCC t c G 3 _ _ ta t 8 4 4
Pne Trp Tyr Gin Gin Lys Pre Lys Ser Ser P r 0 Lys Pro T r P íle Tyr
35 d ,'L 1 5
c L c 3 C 3 tcc aac ;— G get tet gga gtc cc t 3 c t ege ttc a 0 t GGC agt 1 92
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser G^y Val Pro Ala Arg Phe S e r G11'· Ser
5 0 55 30
ggq tet ggg acc tet tac tet CCC a ca acc a g c age atg 3 a G gcc gaa 240
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr íle Ser Ser Met Gl u Ala Glu
65 7 0 d 80
gat gcc gcc a c t — ~ 4- tac tgc cag cag tgg 3 3 3 ggt aac c c G 3 33 acg 28 8
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly p_ 5 f- Pr Q Trp Thr
3 5 90 95
ttc ggt gga ggc acc aag ctg gag atc a a a 318
Phe Gly G ô y Gly Tnr Lys Leu Glu íle Lys
100 105 <210> 40 <211> 106 <212> PP.'ľ <213> Umelá sekvencia
151 <220>
<223> Opis umelej sekve ncie : Syntetický
polypeptid
<400> 47
Gin íle Val Leu Thr Gin Phe Pro A.la Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Hrs Met
20 2 5 30
Phe Trp Tyr Gin Glr. Lys Pro Lys Ser Ser Pro Lys Pro Trp íle Tyr
35 40 4 5
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr íle Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 9 0 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu íle Lys
100 105
<210> 48 <211> 318 <212> DNA <213> Umelá sekvencia
<220> <221> <222> COS (D · . (318)
<220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický
oligonukleotíd
<4 00> 48 cca Pro tcc Ser tcc Ser 10 ctg Len t ct Ser gcg tet gta Val 15 ggg Gly 4 8
caa Gin 1 att íle gtt Val ctc Leu acc Thr 5 cag Gin tet Ser
Ar a Ser
gac aga gtc acc atc aca tgc agt gcc age tca agt gta aat cac atg 96
Asp Arg Val Thr íle Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
ttc tgg tat cag cag aag CCC ggg aaa gcc CCC aaa CCC tgg att tat 144
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp íle Tyr
35 40 45
ctc aca tcc aac ctg get u Ct π n zj g t c cct tca ege ttc agt ggc agt 192
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
152
O dl t ct ggg aca gat tac a ct ctc aca atc agc agc ctg c c
Ser Gly Thr Asp Tyr ľhr Leu Thr lie Sex Ser Leu Gl a cct gaa n Pro Glu ň n g g t g: ti v rv
Thr Tyr 8 5 cay cag rgg agi G T r. G T r. T r o Sei i g ľ a a c .? i y ?·. r r ;g tgg ;o Tro ggc act a a c Glv Thr Ly:
gag atc Glu iic
10:
< 21 3 > á S <210 10c <212> PRT <213> Úmera sekvencia <22:
<22;
> Opis umelej sekvencie: Synteticky polypeptid c 4 C: lán i
Leu Tr.r Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 5 10 15
Asp Arg Val Thr íle Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser ,sn His Me: 30 kly
i... -j j y
0 □ y s P r o T r ρ I. .1. e T y r
Thr Ser Asn Leu A.Ia 50
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 60 er Gly Thr Asp Tyr Sr.r Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Pro Glu ?0
-.sp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Tn:
Gly T n r L y s
100 íle Lys : 0 5 <210 50 <210 318 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <2 2 0 <222> CD5 <222> (lk . . ; 31 s;
23> Opis umelej sekvenc: oligonukleotití
S vr. t. e 11 c ký
153 <400> 50
caa Gin 1 ctt ľ I e gtt Val ctc Leu acc Thr c cag Gin tct Ser cca Pro tcc Ser tcc Ser 10 ctg Leu tct Ser gcg Ala tct Ser gta Val 15 ggg Gly
gac 5 3 ä gtc acc atc cCô tgc agt gcc age L C G agt gta aat cac atg
Asp Arg Val Thr íle Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
ttc gg tct cag cag aag ccc ggg aaa gcg ccc aaa ctc ctg att tat
Phe Trp Tyr Gin Glr. Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu íle Tyr
35 40 45
ctc ctä tcc aac ctg get tct gga gtc cct t C ä ege ttc agt ggc agt
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val· Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
ggg cct ggg aca gat tac act ctc aca atc age age ctg caa cct gaa
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 10 75 80
gat tct gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt ggt aac ccg tgg acg
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
ttc ggt gga ggc act aag gtg gag atc aaa
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu íle Lys
100 105
144
192
240
288
318
<210> 51 <211> 106 <212> PRT <213> ’Jmelá sekvencia
<220>
<223> Opis umelej s ekvencie : Syntetický
polypeptid
<400> 51 Gin Íle Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 c 10 15
Asp Arg Val Thr íle Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu íle Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
5 0' 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
154
-y Gly
Lys Val Glu íle Lys 105 <21ú> 52 < 2 ±1> 3 2 5 <2i2> DMA < 22 0 >
<221> CCS < 2 2 2 > ( 1 ' . . ; 3 2 g ;
<220>
<223> Opis ľ,cele; sekvencie: Syntetický o _ s q o n u < I e e c c c <4 00> 52 caa att aag Gin íle Gin
cag ;ct cca t CC t CC c l g
Gin Ser Pro Ser Ser 10 Lee
Q ô C 5CJc: C C C c C C Asp Arg Vsi t n r aca rgc T n r Cys a y r y C C t 'ý Ľ t C 3 c. 5'í Ser Ala Ser Ser Ser
5 g t a a ci Val As tro rgg rat cag ca Phe trp tyr G3.n G2
5 ctc aca rcc aac cr Lea Thr Ser As n te g g r. c t ggg ara g a
5 gat r r t gcc a cr ta Asp Phe Ala Tr.r Ty
CP CQ ttc ggt cag ggc ac Phe Gly G i r. Gly Tr
100
aag CCC ggg a a a gcc ccc c a a CCC rgg att c a t 1 2 4
Lys Pro Gly Lys /ara Pro Lys Pre C £·£) o r y r
4 0 Á b
get tet gga gt c cct tca cqc +--,M L· O a g t ggc a gt j 9 2
Ala Ser G1 y Val Pro Ser Arg Phe Ser dy S sr
5 5 60
tac act c t c aca atc age age ctg caa cct 3 aa 2 4 0
Tyr Thr I.ea Thr Iic Ser Ser I.ou G1 n Pro C 1 u
7 0 7 5 3 0
r a c tgc cag cag tgg agr ggt aac ccg tgg a c g 286
Tyr Cys G O Gin T rp Ser Gly Asn Pro tro r- c r
90 95
aag gtq gag atc aaa 318
Lys Val Glu íle Lys
105 <210 5?
<210 315 <222> DM2 <2 2 3> Umelá seaveccra <220 <221> CCS <222> (22 . . (32 5;
155 <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický oiigonukieotid <400> 53
caa Gin 1 att íle cag Gin ctc Leu acc Thr 5 cag Gin tcc Ser cca Pro tcc Ser tcc Ser 10 ctg Leu tct Ser gcg Ala tct Ser gta Val ggg Giy 48
gac aga gtc acc atc aca tcc agt gcc age tca agt gta aat cac atg 96
Asp Arg Val Thr íle Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
ttc tgg oat cag cag aag CCC ggg aaa gcg CCC aaa ctc ctg att tat 14 4
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu íle Tyr
35 40 45
ctc aca tcc aac ctg get tct gga gtc cct tca ege ttc agt ggc agt 192
Leu Thr Ser Asn Leu Al a Ser Gly Val Pre Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
ggg tct ggg aca gat tac act ctc aca atc age age ctg caa cct gaa 240
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pre Glu
65 7 0 75 80
gac ttt gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt ggt aac ccg tgg acg 288
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
ttc ggt cag ggc act aag gtg gag atc aaa 318
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu íle Lys
100 105 <210> 54 <211> 106 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický polypeptid
<400> 54 Leu ľhr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Gin 1 íle Gin
Asp Arg Val Thr íle Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 2 5 30
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu íle Tyr
35 40 45
Leu Tnr Ser Asn Leu A_ a Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pre Glu
65 7 0 75 80
0
Asp Phe Ala Thr Tyi <210 55 <210 30 <212> DNA <213> Umelá sekvencií <220>
<22 0 CDS <222> (1) .
(318:
<220 <223>
ongo ime le j s e k ver. c i '.ukleotič
Syntetický <4C0> 55 gaa att att Glu íle Val ctc acc ttt cca gca ct
Leu Thr Gin Phe Pro A. 1 ί gag aag gtc Glu Lys Val a c c a t g Thr Met gcc agc A. 1 a Ser
5 ttc tgg .a t cag cag aag cca aa a Lee tcc ccc c a s ccc Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pre Lys Ser Ser Pro Lys Pre
40 45 ctc aca tcc Leu Thr Ser aac ctg get tet gca gtc cct
Asn L e u
Val Pro ggg tet ggg Gly Ser Gly acc tet tac tet ctc aca atc Thr Ser Tvr Ser Leu Thr íle ser atg
Met gag
Glu
240 g a t get gcc
Asp Ala Ala act tat tac Thr Tyr Tyr cag cag tgg
Cys Gin Gin : rp SO aac A s n cc: P r:
ttc ggt gga Phe Gly Gly ggc acc aag ctg gag a:
11y Thr Lys .00
Hu 11:
i cl ä
-V s <210 5o <211> 106 <212> PRT <215> Umelá sekvencií <220
157 <223> Opis umelej sekvencie: Syntetický polypeptid <400> 56
Glu 1 íle Val Leu Thr 5 Gin Phe Pro Ala Leu 10 Met Ser Ala Ser Pro
Glu Lys Val Thr 2 0' Met Thr Cys Ser Ala 25 Ser Ser Ser Val Asn 30 His *
Phe Trp Tyr 35 Gin Gin Lys Pro Lys 40 Ser Ser Pro Lys Pro 45 Trp ľ le i vr
Leu Thr 50 Ser Asn Leu Ala Ser 55 Gly Val Pro Ala Arg Phe 60 Ser Giy
Gly 65 Ser g-y Thr Ser Tyr 70 Ser Leu Thr íle Ser 7 5 Ser Met Glu Äiä Git
Asp Ala Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gin Gin Trp 90 Ser Gly Asn Pro ľz s G r. r
Phe Gly Gly Gly 100 Thr Lys Leu Glu íle 105 Lys
<210> 57 <211> 318 <212> DNA <213> Umelá sekvencia
<220> <221> CDS
<222> (1)..(318)
<220> <223> Opis umelej sekvencie: Syntetický
oligonukleotid
<400> 57 tcc Ser tcc Ser 10 ctg Leu tet Ser gcg Ala tet Ser gta Val ggg Giy L
gat Asp 1 atc íle cag Gin ctc Leu acc Thr 5 cag Gin tet Ser cca Pro
gac aga gtc acc atc aca tgc agt gcc age tca agt gta aat cac atg 96
Asp Arg Val Thr íle Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Has Met
20 25 30
ttc tgg tat cag cag aag ccc ggg aaa gcc ccc aaa ccc tgg att tat 144
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp ľ 1 s Tyr
35 40 45
ctc aca tcc aac ctg get tet gga gtc cct tca ege ttc agt ggt agt 152
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Are Phe Ser Gly Ser
50 C c O 6 0
ggg tet ggg aca gat tac act ctc aca atc age age ctg caa cct gaa 24'
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Pro Git
65 70 75 8 0
158 gat ttt gc Asp Phe • la Thr Tyr Tyr Cys Gin tcc ggt cac Phe Glv Glr
C u d č Q r r Lvs
II
318 <210 >53 < 211 > 10 6 <212> PRT <213> Urne J seKvenci a <220 <223> Opis umelej sekvencie: Syntetický polypepcid <4 00 58
Asp íle G In Lei ľ h r Gin Ser
Se:
a Ser Oa_ Gly
Asp Arg Val Thr lle Thr Cys Ser Ala Ser Ser 2 0 2 5 r var Asn Pes Met
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Giy Lys Ala Pro 3 5 4 C ra Thr Se: 5 0
Ala Ser Ciy Val Pro Ser •s Pro Trp íle Tyr ‘g Pne Ser Gly Ser
Gly7 Ser 65
Thr Asp i'yr 70
Lea Glr: Pro Glu 8 0
Asp Phe Ala
Gin Trp 90
Pne Gly Glr: Gly Tur Lys Vc 100 íle Lys 105 <210> 59 <211> 192 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej senvencie: konštrukt c „potkan/človek
'.imérnej domény i typu <400 59
Thr G. n rec a. s ρ I.
Vai Leu Asp 1 0
Pre Trp Glu ;p
5
Aso íle Gly 35 Pro Lys Gin Thr Gin 40 Val Gly íle Val Glu 4 5 Tyr Gly Glu
Asn Val Thr His Glu Phe Asn Leu Asn Lys Tyr Ser Ser Thr Glu Glu
50 55 60
Val Leu Val Aia Ala Asn Lys íle Val Gin Arg Gly Gly Arg Gin n ľ
6 5 70 75 8 0
Met Thr Ala Leu dy Íle Asp Thr Ala Arg Lys Glu Ala Phe Thr Glu
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Arg Arg Gly Val Lys Lys Val· Me Val íle Val Thr
100 105 110
Asp Gly Glu Ser His Asp Asn σ’ . , y~ Arg Leu Lys Gin Val íle Gin Asp
115 12 0 125
Cys Glu Asp GLu Asn íle Gin Arg Phe Ser I le Ala íle Leu Gly His
13C: 135 140
Tyr Asr. Arg Gly Asn Leu Ser Thr Glu Lys Phe Val Glu Glu íle Lys
145 150 155 160
Ser íle Ala Ser Glu Pro Thr Glu Lys His Phe Phe Asn Val Ser Asp
165 170 175
Glu Leu Ala Leu Val Thr Íle Val Lys v 1 a Leu Gly Glu Arg íle Phe
180 185 190
<210> 60 <210 192 <212> PPT <213> Rattus sp.
<400 60 Thr Gin Leu Asp íle Val íle Val Leu Asp Gly Ser Asr. Ser íle Tyr
1 5 10 15
Pro Trp Glu Ser Val íle Ala Phe Leu Asn Asp Leu Leu Lys Arg Met
20 25 30
Asp íle Gly Pro Lys Gin Thr Gin Val Gly íle Val Gin Tyr Gly Glu
35 40 45
Asn Val Thr His Glu Phe Asn Leu Asn Lys Tyr Ser Ser Thr Glu Glu
50 55 60
Val Leu Val Ala Ala Asn Lys íle Gly Arg Gin Gly Gly Leu Gin Thr
65 70 75 80
Met Thr Ala Leu Gly íle Asp Thr Ala Arg Lys Glu Ala Pne ľnr Glu
85 SO 95
Ala Arg Gly Ala Arg Arg Gly Val Lys Lys Val Met Val Íle ľal Thr
100 105 110
160 í'.sd civ .j*·- ber .-.;s ŕsd A;
i y: - o r
Are reu Lys íin Asr
Cys Glu Ase Glu
Are o h e
G i y His
Tyr Asr. Are Gly i á e .-.sa Leu Ser Thr Glu Lvs ?'
Glu Ie Lys 160
G r u ~eu A. a Leu .dl T .u r 1 _ e v a _ _r/s 180 185 jeu Glv Glu Are íle Pnr < 2 1 C > 61 <211> 192 <212> PRT <213> ho.ro saaie:. s iOO 61 i r Glu Le_ Asp íle T v r
Pro Trp Asp Ser Tel Tur Ale Phe Leu Asn Asp Leu Leu Lys Arg Met 20 25 30
Asp Íle Gly Pro Lys Glu 'Thr 35 íle Tel Gin Tyr Gly Glu 4 5
As u
His G-T.1 Phe Asn Leu Asn Lys Tyr Se;
u; 64
Thr Glu Glu
Val Leu 6 5
Met Tur íle Gal Gin Ar
-5 u-y
Arg Gin Thr 8 0 íle Asc Thr Ala Arq Lys Glu Ala Phe Thr Glu
Ala Arg Gly Ala Arg Are Gly Var Lys 100 105
Var Met Val íle Val Thr a -i lsp Gly Glu Ser Pes Asp Asr. His .rg Leu Lys Lys Val íle Gin Asp 125 íle Gin Arg m.e Ser íle 131 le Leu Gly Ser
Tyr Asn Are Sly Asr. Leu Ser Thr Glu Lys Phe Val 145 150 155
Glu íle Lyí 166
Ser íle Ala Ser Glu Pro Thr Glu Lys His Phe Phe
Ser a.sr 4 I 5
161
Glu íle Ala Leu Val Thr íle Val Lys Thr Leu Gly Glu Arg íle Phe 180 185 190 <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> OdIs umelej sekvencie: Syntetický
peptic Gly Tyr
<400> 62 Gly 5
Gly 1 Phe Gly Asp
<210> 63 <211> 214 <212> PRT <213> Rattus sp <400> 63
Val 1 Ser Pro Thr Phe 5 Gin Val Val
Cys Ser Thr Gin 20 Leu Asp íle Val
Íle Tyr Pro Trp 3 5 Glu Ser Val íle 4 0
Arg Met 50 Asp íle Gly- Pro Lys Gin 55
Gly 65 Glu Asn Val Thr His 70 Glu Phe
Glu Glu Val Leu Val 85 Ala Ala Lys
Gin Thr Met Thr 10C Ala Leu Gly íle
Thr Glu Ala Arg 115 Gly Ala Arg Arg 120
Val Thr 130 Asp Gly Glu Ser His A.sp 135
Gin 145 Asp Cys Glu Asp Glu 150 A.sn íle
Gly His Tyr Asn Arg 165 Gly Asn Leu
Asn Ser 10 ?Le Au.ä Pro Val Gin 15 Glu
íle 25 Val Leu Asp Gly Ser 30 Asn Ser
Ala Phe Leu Asn Asp 45 Leu Leu Lys
Thr Gin v Ô _ Gly 60 íle Val Gin Tyr
Asn Leu Lsn Lys Tyr Ser Ser Thr 80
Lys íle 90 Gly Arg Gin Gly Gly 95 Leu
Asp 105 Thr r ‘ f—. _ a Arg Lys Glu 110 Ala Phe
Gly Val Lys Lys Val 125 Met Val íle
Asn Tyr Ara Leu 140 Lys Gin Val íle
Gin Arg G n e Ser íle Ala íle Leu 160
Ser Thr 170 Glu Lys Phe Val Glu 175 Glu
íle Lys Ser Íle .O Ser Glu ?ro Tnr GI 15 0' 13 5
Ser Asp Olu Lee A. L s Lee Val Thr íle Va íle Phe Ala Leu GLa Ala 210 s His Phe Phe <210> 64 <21I> 214 <2I2> FP1 <213> Η:~ο sasiers < 4 0 0 > 6 4
Val Ser Pro T hr P h
Cys Ser . nr Sir. Le íle Tyr .-ro . rp As j 5
Arg Met A.sp Íle GI 50
Gly Glu Asn Gal y a 65
Gla G r n . a .1 .. e u . a
Gin Thr Met Tnr Al
Thr Gla .Ala Ara GI 115
Val Thr Asp Gly GI 130
Gin Asp Gys Gla As 145
Gly Ser tyr Asr. A r íle Lys Ser Íle A_
Ser Asp O Lea Al
Gla Val Val Asa Se: 10 íle Ala Pro V a 1 15 Ό tu
Asn íle Val íle 25 L a 1 Leu Asp G i y Ser Asr. Ser
Ser Val Thr 4 0 Ala Phe r e u Asn Asp 4 5 Leu Leu Lys
Pre lys 5 5 Gin Thr Gla Val Gly 60 íle V a t Gin o ~r - j -
His o - - Pae Asn Leu Asr / 5 Gys Tyr Ser Ser G r r c 0
Ala ŕv _ a ^y s Lys íle S 0 Val Gin Arg o 1 y G _ y ς Arg
Lea s v Thr Asp 105 Thr Ala Arg L. y s Glu 110 Ala Phe
Ala Are Aru 120 Gly Val Lys Lys Val Met 7 / -o v c _ Zle
Ser His 135 Asp Asn His Arg Leu 1 4 0 Lys L v s V a _ íle
Glu 150 Asr íle Gin Arg Phe 155 Ser íle Hli íle Leu 1 6 0
Gly Asr Leu Ser Tnr 170 Glu Lys Phe Val Glu Glu
Ser Glu Pro Thr 185 Glu Lys H r s Phe Phe 190 Asr V 5 1
Lea V a i 2 00 íle Val Gys Thr Leu 205 Gly Glu Ai r g
íle Phe .-.la 210
163 <210> 65 <2L1> 106 <212> PFT <2'3> ijmelá sekvencia <220>
<223> Op p c is umelej sekve) iypepTvd ncie : S v ntetický
<400> 65
Asp íle V e 1 Het Thr Gin Ser Pre Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr íle Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser íle Ser Tyr Leu
20 25 30
Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pre Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu íle Tyr
35 4 0 45
Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
5 0 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 8 0
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Glr. Gin Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
85 90 95
ľl e Gly Gly e r y Thr Lys Val Glu íle Lys
100 105 <210> 66 <211> 106 <212> PRľ <213> Urr.elá sekvencia
<220> <223> Op pc is umel lypepti ej sekvencie d : Syntetický
<400> 66 Gin íle 1 Gin Leu Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr 2 0 íle Thr Cys Ser Ala 25 Ser Ser Ser Val Asn 30 His Met
Phe Trp Tyr Gin 35 Gin Lys Pro Gly 40 Lys Ala Pro Lys Pro 45 Trp íle Tyr
Leu Thr 5 0 Ser Asn Leu A_a Ser 55 Gly Val Pro Ser Arg 60 Phe Ser Gly Ser
Gly 65 Ser G_y Thr Asp Tyr D Q Thr Leu Thr íle Ser 75 Ser Leu Gin Pre Glu 8 0
Asp Phe , Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gin Gin Trp 90 Ser Gly Asn Pro Trp 95 Thr
164
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu II 1 O C K < 21 O > 6 7 < 211> 128 <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický pciypepeid <400> 67
Glu Val Gin Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly G1 y 10 Lea Íle Γ- J V- o j. A Pre Gly 5
Ser Leu Are Leu Ser Cys Ala Ala Ser G1 y Phe Thr v a _ Ser Ser
20 2 5 30
Tyr Met: Ser Trp V a 1 Arg o _ r. Ala Pro Gly L y s G1 v L e a c la Trp
35 40 4 5
Ser Val íle Tyr Ser Gly Giy Ser Thr 1 yr Tyr Ala Asp Ser i ’ - g v a _l
50 5 5 n a o u
Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg A. s p A s n Ser T,y5 Asn Thr Leu Tyr
6 5 7 0 75
Gin Met Asn Ser Len Arg Ala Glu Asp Thr A.la Val Tyr Tyr C G/ S
85 9 C a a
Ser íle Arg Phe Len Glu Trp Ser Pne Asp Tyr Trp G - y Gin G1 y
100 105 110
Leu Val Thr Val ’ n, Ser Ser
<210> 68
<211> 118
<212> PRT
<213> Umelá sekvenc: -a
<220>
<223> Opis ume 1 e ý sekvencie: Syn ucti cky
polypeptič
< 4 0 0 > 68
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly G1 y Leu Val Gin Pro Gly
j 5 10 g c
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg
2 0 25 3 0
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly T (2i 1 n Glu r' r c
3 5 4 0 ,1 Z Hl
.Ala Thr íle Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr n e u A s p Ser 7 d _
5 0 S s 6 0
165
Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
70 75 80
Glr. Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tnr
90 95
Are Gly ?ne Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210 69 <21 O 118 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: Syntetický po_ypeptid <4C0> 69
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu .Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Thr íle Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys 50 '55 60
Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Len
70 75 80
Glr: Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
90 95
Ara Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp val Trp Gly Gin Gly Thr 100 ' 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210 70 <210 106 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <2 20 <223> Opis umelej sekvencie: Syntetický poivpeptld <40C> 7C
6
Gin íle Gin Leu Thr Gle Se: Pro Ser Se
Asp Are val Thr Íle
Ala
A s r: S r s V ;
Phe Trp Tyr 35
Leu Thr Ser Asn Leu Als Se 50 :
Vc.1 Pro Se:
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu ľhr 65 T1
Asp Phe Ala Thr
G· ln T r o· Ser
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu :le Lyv 10C 105

Claims (35)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Protilátka anti-VLA-1, ktorej úseky určujúce komplementaritu ľahkého reťazca sú definované aminokyselinovými zvyškami 24 až 33, 49 až 55 a 88 až 96 zo SEQ ID NO: 1, a ktorej úseky určujúce komplementaritu ťažkého reťazca sú definované aminokyselinovými zvyškami 31 až 35, 50 až 65 a 98 až 107 zo SEQ ID NO: 2.
  2. 2. Protilátka podía nároku 1, ktorá obsahuje variabilnú doménu ľahkého reťazca so sekvenciou uvedenou ako SEQ ID NO: 1, a variabilnú doménu ťažkého reťazca so sekvenciou uvedenou ako SEQ ID NO: 2.
  3. 3. Protilátka podľa nároku 1, ktorá obsahuje rovnaké polypeptidové sekvencie ťažkého a ľahkého reťazca ako protilátka produkovaná hybridómom mAQC2 (ATCC prístupové číslo PTA3273).
  4. 4. Protilátka podľa nároku 1, ktorou je humanizovaná protilátka.
  5. 5. Protilátka pódia nároku 4, ktorá obsahuje vc svojom ľahkom reťazci aspoň jeden z nasledujúcich zvyškov: Ql, L4, P46, W47 a Y71, alebo vo svojom ťažkom reťazci aspoň jeden z nasledujúcich zvyškov: Dl, V12, S28, F29, A49, T93, R94 (číslovanie podľa Kabata) .
  6. 6. Protilátka podľa nároku 4, ktorá obsahuje sekvenciu variabilnej domény ľahkého reťazca definovanú aminokyselinovými zvyškami 1 až 106 zo SEQ ID NO: 3 a sekvenciu variabilnej domény ťažkého reťazca definovanú aminokyselinovými zvyškami 1 až 118 zo SEQ ID NO: 4.
    168
  7. 7. Protilátka podľa nároku 4, ktorá obsahuje rovnaké polypeptidové sekvencie ťažkého a ľahkého reťazca ako protilátka produkovaná bunkovou líniou hAQC2 (ATCC prístupové číslo PTA3275) .
  8. 8. Protilátka podlá nároku 4, kde ťažký reťazec je mutovaný v jednom alebo vo viacerých aminokyselinových zvyškoch vybraných zo skupiny, ktorú tvoria zvyšky 234, 235, 236, 237, 297, 328, 320 a 322 (systém číslovanie EU), čím je spôsobená zmena efektorovej funkcie, zatual čo je zachovaná vázba k VLA-l, v porovnaní s r.emodi f i kovanou protilátkou.
  9. 9. Protilátka pocta nároku 8, ktorá obsahuje mutácie L234A a L235A (systém číslovania EU) v svojom ťažkom reťazci, v porovnaní s nemodifikovanou protilátkou.
  10. 10. Protilátka podlá nároku 4, ktorá obsahuje rovnaké polypeptidové sekvencie ťažkého a ľahkého reťazca ako protilátka produkovaná bunkovou líniou hsAQC2 (ATCC prístupové číslo PTA3356).
  11. 11. Protilátka podľa nároku 4, ktorá je mutovaná v aminokyselinovom zvyšku, ktorý je glykozylačným miestom, čím je glykozylačné miesto eliminované.
  12. 12. Protilátka podľa nároku 11, ktorá obsahuje mutáciu N297Q v svojom ťažkom reťazci (systém číslovania EU).
  13. 13. Protilátka podľa nároku 4, ktorá obsahuje rovnaké polypeptidové sekvencie ťažkého a ľahkého reťazca ako protilátka
    169 produkovaná bunkovou líniou haAQC2 (ATCCC prístupové číslo PTA3274).
  14. 14. Kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje protilátku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 4 až 13 a farmaceutický prijateľný nosič.
    15 . pre Izolovaná nukleová SEQ ID NO: 1. kyselina obsahuj úca kóduj úcu sekvenciu 16. Izolovaná nukleová kyselrna obsahuj úca kóduj úcu sekvenciu pre SEQ ID NO: 2. 17. Izolovaná nukleová kyselina obsahuj úca kódujúcu sekvenciu pre ľahký reťazec protilátky produkovaný hybr 'idómom mAQC2 (ATCC
    prístupové číslo PTA3273).
  15. 18. Izolovaná nukleová kyselina obsahujúca kódujúcu sekvenciu pre ťažký reťazec protilátky produkovaný hybridómom mAQC2 (ATCC prístupové číslo PTA3273).
  16. 19. Izolovaná nukleová kyselina obsahujúca kódujúcu sekvenciu pre ľahký reťazec protilátky produkovaný bunkovou líniou hAQC2 (ATCC prístupové číslo PTA3275).
  17. 20. Izolovaná nukleová kyselina obsahujúca kódujúcu sekvenciu pre ťažký reťazec protilátky produkovaný bunkovou líniou hAQC2 (ATCC prístupové číslo PTA3275).
    170
  18. 21. Izolovaná nukleová kyselina obsahujúca kódujúcu sekvenciu pre ťažký reťazec protilátky produkovaný bunkovou líniou haAQC2 (ATCC prístupové číslo PTA3274).
  19. 22. Izolovaná nukleová kyselina obsahujúca kódujúcu sekvenciu pre ťažký reťazec protilátky produkovaný bunkovou líniou hsAQC2 ÍATCC prístupové číslo ΡΤΆ3356).
    23. pre Izolovaná nukleová kyselina obsahujúca kódujúcu sekvenciu zvyšky 1 až 106 zo SEQ ID NO: 3 . 24 . Izolovaná nurleová kry s e 1 i n a obsahujúca kódujúcu sekvenciu pre zvyšky 1 až 118 zo SEQ ID NC: z) . 25. Spôsob liečenia pacient a s imunologickou chorobou sprostredkovanou VLA-l, v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že
    zahrnuje podávanie kompozície podía nároku 14 pacientovi.
  20. 26. Spôsob určovania hladiny VLA-l v tkanive v y znač u j ú c i sa t ý m, že zahrnuje kroky, keď sa tkanivo privedie do kontaktu s protilátkou podľa nároku i a detecuje sa väzba protilátky ku tkanivu, čím sa určí hladina VLA-l v tkanive.
  21. 27. Bunka hybridómu mAQC2 ÍATCC prístupové číslo PTA3273;.
  22. 28. Bunka bunkovej línie hAQC2 ÍATCC prístupové číslo PTA3275).
  23. 29. Bunka ounkovej línie haAQC2 ÍATCC prístupové číslo PTA.3274) .
    171
  24. 30. Bunka bunkovej línie hsAQC2 (ATCC prístupové číslo PTA3356).
  25. 31. Počítač na vytvorenie trojrozmernej reprezentácie:
    (a) molekulového komplexu, kde molekulový komplex je definovaný súborom štruktúrnych koordinát komplexu chimérnej I domény alól integrínu RAH a humanizovanej protilátky hAQC2, podlá cbr. 19, alebo (b) homológu molekulového komplexu, kde homológ má hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlok od atómov hlavného reťazca aminokyselín najviac 0,65 Ä, vyznačujúci sa tým, že počítač obsahuje:
    (i) strojovo čitateľné médium na ukladanie dát obsahujúce uložené dáta kódované so strojovo čitateľnými dátami, kde dáta obsahujú aspoň časť štruktúrnych koordinát komplexu podľa obr. 19, (ii) pracovnú pamäť na uchovávanie inštrukcií na spracovanie strojovo čitateľných dát, (iii) centrálnu procesorovú jednotku združenú s pracovnou pamäťou a strojovo čitateľným médiom na uchovanie dát na spracovanie strojovo čitateľného média na uchovanie dát na spracovanie strojovo čitateľných dát do trojrozmerných reprezentácií a (iv) obrazovku združenú s centrálnou procesorovcu jednotkou na zobrazenie -roj rozmernej reprezentácie.
  26. 32. Počítač na vytvorenie trojrozmernej reprezentácie molekuly alebo molekulového komplexu obsahujúceho:
    a) prvé väzbové miesto definované štruktúrnymi koordinátami aminokyselín hAQC2 obsahujúce aspoň sedem zvyškov zo zvyškov lahkého reťazca Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 a Trp95 a
    172 zvyškov ťažkého reťazca Ser30, Arg31, Trp47, SerS2, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlvlOO a AsplOl pocta cbr. 19 alebo
    b) homológ molekuly alebo molekulového komplexu, kde homológ obsahuje druhé väzbové miesto, ktoré má hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlok od atómov nlavnéhc reťazca aminokyselín hAQC2 najviac í,íO Ä, vyznačujúci sa t ý m, že počítač obsahuje:
    (i) strojovo čitateľné médium, na ukladanie dát obsahujúce uložené dáta kódované so strojovo čitaternymi dátami, kde dáta obsahujú štruktúrne koordináty aminokyselín nAQCz ocsahujúce aspoň sedem zvyškov zo zvyškov ľahkého reťazca Asn3G, Tyr48, Trp9C, Ser91, Asn93 a Trp95 a zvyškov ťažkého reťazca Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Giy53, His56, Tyr58, Phe99, GlyíOO a AsplOl podlá obr. 19 a pracovnú pamäť na uchovávanie ir.struk.cr í na spracovanie strojovo čitateľných, dát, (iii) centrálnu procesorov!] jednotku združenú s pamäťou a strojovo čitateľným médiom, na uchovanie spracovanie strojovo čitateľného média na uchovanie spracovanie strojovo čitateľných dát do trcjr reprezentácií a racovnou dát r. a dát r.a zmerných (iv) obrazovku združenú s centrálnou procesorcvcu jednotkou na zobrazenie trojrozmernej reprezentácie.
  27. 33. Počítač na vytvorenie trojrozmernej reprezentácie:
    a) prvého väzbového miesta definovaného štruktúrnymi koordinátami aminokyselín hAQC2 obsahujúceho aspoň, sedem, zvyškov zo zvyškov ľahkého reťazca Asn30, ľyr48, Trp9C, Ser9i, Asn93 a Trp95 a zvyškov ťažkého reťazca SerdG, Arg31, lrp4?, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GiylOO a AsplOl podľa cbr. 19 alebo
    173
    b) druhého väzbového miesta homológa, ktoré má hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlok od atómov hlavného reťazca aminokyselín hAQC2 najviac 1,ÍO Ä, vyznačujúci sa tým, že počítač obsahuje:
    (i) strojovo čitateľné médium na ukladanie dác obsahujúce uložené dáta kódované so strojovo čitatelnými dátamii, kde dáta obsahujú štruktúrne koordináty aminokyselín hAQC2 vybraných zo skupiny obsahujúce aspoň sedem zvyškov zo zvyškov ľahkého reťazca Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 a Trp95 a zvyškov ťažkého reťazca Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO a AsplOl podlá obr. 19 a (ii) pracovnú pamäť na uchovávanie inštrukcií na spracovanie strojovo čitateľných dát, iii) centrálnu procesorovú jednotku združenú s pracovnou na uchovanie dát na na uchovanie dáo na do trojrozmerných pamäťou a spracovanie spracovanie strojovo čitateľným médiom strojovo čitateľného média strojovo čitateľných dát reprezentácií a
    (iv) displej združený s centrálnou procesorovou reprezentácie. j ednotkou na zobrazenie troj rozmernej 34. Spôsob identifikácie inhibítora I domény integrínu vyznaču j ú c i sa tým, že zahrnuje kroky, keď sa
    (a) použijú štruktúrne koordináty aminokyselín hAQC2 obsahujúce aspoň sedem zvyškov zo zvyškov ľahkého reťazca Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 a Trp95 a zvyškov ťažkého reťazca Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO a AsplOl podľa obr. 19, alebo ± hodnota odmocniny priemerného štvorca odchýlok atómov hlavného reťazca aminokyselín hAQC2 najviac 1,10 Á, na vytvorenie trojrozmernej štruktúry väzbového miesta, (b) trojrozmerná štruktúra sa použije na navrhnutie alebo výber potenciálneho antagonistu, (c) syntetizuje sa potenciálny anta goni sta a (č) potenciálny anta pomsta sa c r i vedie do kontaktu s hAQC2, aby sa suma schopnosť pozcnczálr.eho antagonistu interagovať s hAQC2, pričom, scnopnosť potenciálneho antagonistu interagovať s hAQC2 ukazuje, že potenciálny antagonista je inhibítor ľ domény.
  28. 35. Inhibítor I domény integrínu, ktorý bol identifikovaný spôsobom podľa nároku 34.
  29. 36. Počítač na vytvorenie trojrozmernej reprezentácie molekuly alebo molekulového komolexu obsahujúceho:
    a) prvé väzbové miesto definované štruktúrnymi koordinátami aminokyselinových zvyškov I domény Asplti, Serl56, Asnl57, Serl58, Tyrl60, Glul92, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Ärg222, Gln223, Thr224 , Asp237, Hís263, Asn263, Arg29í a Leu294 pódia obr. 19 alebo
    b) homológ molekuly alebo molekulového komplexu, kde homológ obsahuje druhé väzbové miesto, ktoré má hodnotu odmocniny priemerného· štvcrc odchýlok od atómov hlavného reťazca I domény nsjmc Ch 92 A, vyznačujúci sa tým, že počítač obsahuje:
    (i) strojovo čizatelné médium na ukladanie dát obsahujúce
    uložené dáta kódované so stroj ovo čitateľnými dátami, kde dáta obsahujú štruktúrne coordinát\ / aminokyselín 7 aomény Aspl54, Ser156, Asnl57, Ser13 3, Tyrl60, GlulS2, Gln.218 , Arq219, Gly220, GIy221, Arg222, Gln22; 8, Thr224, Asc257, His.2 61, Asn2 63, Arg2 91 a Leu294 podľa obr. 19, a
    175 (ϋ) spracovan (iii pamäťou spracovan spracovan reprezent pracovnú pamäť na uchovávanie inštrukcií na ie strojovo čitateľných dát, ) centrálnu procesorom) jednotku združenú u pracovnou a strojovo čitateľným médiom na uchovanie dát na ie strojovo čitateľného média na uchovanie dát na ie strojovo čitateľných dát do trojrozmerných ácií a (iv) obrazovku združenú s centrálnou procesorovou jednotkou na zobrazenie trojrozmernej reprezentácie.
  30. 37. Počítač na vytvorenie trojrozmernej reprezentácie:
    a) prvého väzbového miesta definovaného štruktúrnymi koordinátami aminokyselinových zvyškov I domény Aspl54, Serl56, Asnl57, Serl58, Tyrl60, Glul92, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 a Leu294 podľa obr. 19 alebo
    b) druhého väzbového miesta homológa, ktoré má hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlok od atómov hlavného reťazca aminokyselín I domény najviac 0,92 Ä, vyznačujúci sa tým, že počítač obsahuje:
    (i) strojovo čitateľné médium na ukladanie dát obsahujúce uložené dáta kódované so strojovo čitateľnými dátami, kde dáta obsahujú štruktúrne koordináty aminokyselín I domény Aspl54, Serl56, Asnl57, Serl58, Tyri60, Glul92, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Glr.223, Thr224, Asp257, His26i, Asn263, Arg291 a Leu294 podľa obr. 19 a
    (11) pracovnú pamäť na uchovávanie inštrukcií na spracovanie stroj ovo čitateľných dát, (iii) centrálnu procesorov! jednookú združenú s pracovnou pamäťou a strojovo čitateľným médiom na uchovanie dát na
    ne spracovanie strojovo čitateľného média na uchovanie- dát na spracovanie strojové čícatelných dát do trojrozmerných reprezentácií a (iv) obrazovku združenú s centrálnou procesorovou jednotkou na zobrazenie trojrozmernej reprezentácie.
  31. 38. Počítač na vytvorenie trojrozmernej reprezentácie molekuly alebo molekulového komplexu obsahujúceho:
    a) prvé väzbové mesto definované štruktúrnymi koordinátami
    a min o k y s e 11n o v ých Z V V £ Ä O \ I domény obsahujúce a spoň tri zo zvyškov Glu192, G 1 n 2 i m , G .rg212, Gly220 a Giy221, pcdla obr. 19 alebo b; n omo ieg molekúl y alebo molekulového komple: . u, kde
    homológ obsahuje druhé väzbové miesto, ktoré má hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlok od atómov hlavného reťazca I domény najviac C,30 A, vyznačujúci sa t ý m, že počítač obsahuje:
    (i) strojovo čitateľné médium na ukladanie dát obsahujúce uložené dáta kódované so strojovo čitateľnými dátami, kde dáta obsahujú štruktúrne kcordináty aminokyselín I domény obsahujúce aspoň tri zo zvyškov Glul92, Gln218, Arg219, Gly220 a Gly221 podía obr. 19, a (ii) pracovnú pamäť na uchovávanie inštrukcií na spracovanie strojovo čitateľných dát, (iii) centrálnu orocescrovú jednotku združenú s pracovnou pamäťou a strojovo čitateľným médiom na uchovanie dát na spracovanie strojovo čitateľného média na uchovanie dát na spracovanie strojovo čitateľných dát do trojrozmerných reprezentácií a
    177 (iv) obrazovku združenú s centrálnou procesorovou jednotkou na zobrazenie trojrozmernej reprezentácie.
  32. 39. Počítač na vytvorenie trojrozmernej reprezentácie:
    a) prvého väzbového miesta definovaného štruktúrnymi koordinátami aminokyselinových zvyškov I obsahujúceho aspoň tri zo zvyškov Glul92, Gln213, Arg219, Gly220 a Gly221 podľa obr. 19 alebo
    b) druhého väzbového miesta homológa, ktoré má hodnotu odmocniny priemerného štvorca odchýlok od atómov hlavného reťazca aminokyselín I domény najviac 0,30 Ä, vyznačujúci sa tým, že počítač obsahuje:
    (i) strojovo čitateľné médium na ukladanie dát obsahujúce uložené dáta kódované so strojovo čitateľnými dátami, kde dáta obsahujú štruktúrne koordináty aminokyselín I domény obsahujúce aspoň tri zo zvyškov Giul92, Gln218, Arg219, Gly220 a Gly221 podľa obr. 19 a (ii) pracovnú pamäť na uchovávanie inštrukcií na spracovanie strojovo čitateľných dát, (iii) centrálnu procesorovú jednotku pamäťou a spracovanie spracovanie reprezentácií a strojovo čicateľným médiom strojovo čitateľného média strojovo čitateľných dát združenú s pracovnou na uchovanie dát na na uchovanie dát na do trojrozmerných (iv) obrazovku združenú s centrálnou procesorovou jednotkou na zobrazenie trojrozmernej reprezentácie.
  33. 40. Spôsob identifikácie inhibítora I domény integrínu vyznačujúci sa tým, že zahrnuje kroky, keď
    178 (a) sa použijú štruktúrne koordináty aminokyselinových zvyškov _ domény Asplal Gln213, Arg219, Gly22Q, His261, Asn263, Arg291 trojrozmernej štruktúry
    Serl56, Asiil57, 3eri58, TyrloO, Glul92,
    Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, a Leu294 podlá obr. 19 na vytvorenie väzbového miesta, (b) trojrozmerná štruktúra sa použije na navrhnutie alebo výber potenciálneho antagonistu, (c) syntetizuje sa potenciálny antagonista a (d) potenciálny antagonista sa privedie do kontaktu s I doménou, aby sa určila schopnosť potenciálneho antagonistu interacovať s I doménou, pričom schopnosť potenciálneho antagonistu mteragovať s I doménou ukazuje, že potenciálny antagonista je inhioitor I domény.
  34. 41. Spôsob identifikácie inhibítora č domény integrínu vyznačujúci sa t ý m, že zahrnuje kroky, keď (a) sa použijú štruktúrne koordináty aspoň troch aminokyselinových zvyškov I domény obsahujúce zvyšky Glul92, Gln218, Arg219, Gly220 a Giy221 podlá obr. 19, alebo c hodnota odmocniny priemerného štvorca odchýlok od atómov hlavného reťazca aminokyselín I domény najviac 0,33 A, na vytvorenie trojrozmernej štruktúry väzbového miesta, (b) trojrozmerná štruktúra sa použije na navrhnutie alebo výber potenciálneho anragonistu, (c) syntetizuje sa potenciálny antagonista a (d' potenciálny antagonista sa privedie do kontaktu s I doménou, aby sa určila schopnosť potenciálneho antagonistu interagovať s I doménou, pričom schopnosť potenciálneho antagonista interagovať s I doménou ukazuje, že potenciálny antagonista je inhibítor i domény.
    179
  35. 42. Inhibítor I domény integrínu identifikovaný spôsobom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 40 a 41.
SK1374-2003A 2001-04-13 2002-04-12 Anti-VLA-1 antibody, composition comprising such antibodies, isolated nucleic acids sequence, use of composition, in vitro method of determining level of VLA-1 in tissue, cell of cell line hAQC2, haAQC2, hsAQC2 or hybridoma mAQC2 and method for identifying inhibitor of I domain of integrin SK288124B6 (sk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US28379401P 2001-04-13 2001-04-13
US30368901P 2001-07-06 2001-07-06
PCT/US2002/011521 WO2002083854A2 (en) 2001-04-13 2002-04-12 Antibodies to vla-1

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK13742003A3 true SK13742003A3 (sk) 2004-07-07
SK288124B6 SK288124B6 (sk) 2013-09-03

Family

ID=26962254

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1374-2003A SK288124B6 (sk) 2001-04-13 2002-04-12 Anti-VLA-1 antibody, composition comprising such antibodies, isolated nucleic acids sequence, use of composition, in vitro method of determining level of VLA-1 in tissue, cell of cell line hAQC2, haAQC2, hsAQC2 or hybridoma mAQC2 and method for identifying inhibitor of I domain of integrin

Country Status (29)

Country Link
US (7) US7358054B2 (sk)
EP (1) EP1423431B1 (sk)
JP (2) JP4303475B2 (sk)
KR (1) KR100927670B1 (sk)
CN (1) CN1561345B (sk)
AR (1) AR036330A1 (sk)
AT (1) ATE471344T1 (sk)
AU (1) AU2002258778C1 (sk)
BG (1) BG66334B1 (sk)
BR (1) BRPI0209792B8 (sk)
CA (1) CA2443903C (sk)
CZ (1) CZ303450B6 (sk)
DE (1) DE60236735D1 (sk)
EA (1) EA006705B1 (sk)
EE (1) EE200300509A (sk)
ES (1) ES2347532T3 (sk)
GE (1) GEP20074252B (sk)
HU (1) HUP0402250A3 (sk)
IL (3) IL158376A0 (sk)
IS (1) IS6982A (sk)
MX (1) MXPA03009390A (sk)
MY (1) MY138286A (sk)
NO (1) NO20034554L (sk)
NZ (1) NZ529494A (sk)
PL (1) PL367324A1 (sk)
SK (1) SK288124B6 (sk)
UA (1) UA83791C2 (sk)
WO (1) WO2002083854A2 (sk)
YU (1) YU80903A (sk)

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2529706T3 (es) 1999-06-01 2015-02-24 Biogen Idec Ma Inc. Un anticuerpo monoclonal bloqueante contra el dominio alfa1-I de VLA-1, y su uso para el tratamiento de trastornos inflamatorios
SK288124B6 (sk) 2001-04-13 2013-09-03 Biogen Idec Ma Inc. Anti-VLA-1 antibody, composition comprising such antibodies, isolated nucleic acids sequence, use of composition, in vitro method of determining level of VLA-1 in tissue, cell of cell line hAQC2, haAQC2, hsAQC2 or hybridoma mAQC2 and method for identifying inhibitor of I domain of integrin
MY154009A (en) 2002-03-13 2015-04-30 Biogen Idec Inc Anti-alpha v beta 6 antibodies
WO2005073385A1 (ja) * 2004-01-29 2005-08-11 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology 遺伝子導入効率を上昇させるための組成物および方法
DK3050963T3 (da) 2005-03-31 2019-12-09 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fremgangsmåde til fremstilling af polypeptid ved regulering af arrangement
WO2006124269A2 (en) * 2005-05-16 2006-11-23 Amgen Fremont Inc. Human monoclonal antibodies that bind to very late antigen-1 for the treatment of inflammation and other disorders
WO2006133286A2 (en) * 2005-06-07 2006-12-14 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Treatment of tnf antagonist-resistant inflammatory disorders and related methods
CN102875681A (zh) 2005-07-08 2013-01-16 拜奥根Idec马萨诸塞公司 抗-αvβ6抗体及其用途
EP3345616A1 (en) 2006-03-31 2018-07-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody modification method for purifying bispecific antibody
US11046784B2 (en) * 2006-03-31 2021-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
AU2013204572B2 (en) * 2006-05-25 2015-06-18 Biogen Ma Inc. Methods of Treating Stroke
AU2007267579B2 (en) * 2006-05-25 2013-05-30 Biogen Ma Inc. Methods of treating stroke
WO2008008315A2 (en) 2006-07-10 2008-01-17 Biogen Idec Ma Inc. Compositions and methods for inhibiting growth of smad4-deficient cancers
EP1878747A1 (en) 2006-07-11 2008-01-16 greenovation Biotech GmbH Glyco-engineered antibodies
EP2031064A1 (de) * 2007-08-29 2009-03-04 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG Verfahren zur Steigerung von Proteintitern
MX369784B (es) 2007-09-26 2019-11-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Metodo de modificacion del punto isoelectrico de anticuerpos mediante la sustitucion de aminoacidos en region de determinacion de complementariedad (cdr).
CA2700394C (en) * 2007-09-26 2017-10-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant region
AU2008332271C1 (en) 2007-12-05 2014-04-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-NR10 antibody and use thereof
CN107551270A (zh) 2008-04-11 2018-01-09 中外制药株式会社 与多个分子的抗原反复结合的抗原结合分子
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
BRPI0921665A2 (pt) * 2008-11-13 2019-04-16 Femta Pharmaceuticals, Inc. humanizado anti-il-6 anticorpos
TWI646193B (zh) 2009-03-19 2019-01-01 中外製藥股份有限公司 抗體恆定區域改變體
WO2010107110A1 (ja) 2009-03-19 2010-09-23 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
CA2761891A1 (en) 2009-05-15 2010-11-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-axl antibody
US10150808B2 (en) 2009-09-24 2018-12-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
EA201792376A3 (ru) * 2009-10-23 2018-08-31 Милленниум Фармасьютикалз, Инк. Молекулы анти-gcc антитела и соответствующие композиции и способы
WO2011108714A1 (ja) 2010-03-04 2011-09-09 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
RU2620071C2 (ru) 2010-11-17 2017-05-22 Чугаи Сеияку Кабушики Каиша Мультиспецифическая связывающая антиген молекула, которая обладает альтернативной функцией к функции фактора свертывания крови viii
RU2658504C9 (ru) 2010-11-30 2018-08-21 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антигенсвязывающая молекула, способная многократно связываться с множеством антигенных молекул
CN103370081A (zh) * 2011-02-03 2013-10-23 桑塔鲁斯股份有限公司 受试者的选择和治疗
DK3489255T3 (da) 2011-02-10 2021-08-23 Roche Glycart Ag Muterede interleukin-2-polypeptider
KR20230005405A (ko) 2011-02-25 2023-01-09 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 ＦｃγＲＩＩｂ 특이적 Ｆｃ 항체
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
TW201817744A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
EP2762493B1 (en) 2011-09-30 2021-06-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
ES2732243T3 (es) * 2012-02-16 2019-11-21 Santarus Inc Composiciones farmacéuticas de anticuerpos ANTI-VLA1 (CD49A)
CA2871614C (en) 2012-04-27 2021-08-31 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Anti-gcc antibody molecules and use of same to test for susceptibility to gcc-targeted therapy
EA032192B1 (ru) 2012-07-13 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Биспецифическое антитело к vegf/ang-2, нуклеиновая кислота, кодирующая это антитело, вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, клетка-хозяин, способ получения биспецифического антитела и содержащая его фармацевтическая композиция
RU2662991C2 (ru) 2013-03-12 2018-07-31 Биокон Лтд. Слитые иммуномодулирующие белки и способы их получения
WO2014143739A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Biogen Idec Ma Inc. Anti-alpha v beta 6 antibodies and uses thereof
US10035859B2 (en) 2013-03-15 2018-07-31 Biogen Ma Inc. Anti-alpha V beta 6 antibodies and uses thereof
US11124576B2 (en) 2013-09-27 2021-09-21 Chungai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide heteromultimer
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
TWI808330B (zh) 2014-12-19 2023-07-11 日商中外製藥股份有限公司 抗肌抑素之抗體、含變異Fc區域之多胜肽及使用方法
TW201809008A (zh) 2014-12-19 2018-03-16 日商中外製藥股份有限公司 抗ｃ５抗體及使用方法
SG10201907215QA (en) 2015-02-05 2019-09-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibodies Comprising An Ion Concentration Dependent Antigen-Binding Domain, Fc Region Variants, Il-8-Binding Antibodies, And Uses Therof
TWI805046B (zh) 2015-02-27 2023-06-11 日商中外製藥股份有限公司 Il-6受體抗體用於製備醫藥組成物的用途
EP3279216A4 (en) 2015-04-01 2019-06-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha PROCESS FOR PREPARING POLYPEPTIDE HETERO OLIGOMER
JP7141336B2 (ja) 2015-12-25 2022-09-22 中外製薬株式会社 抗ミオスタチン抗体および使用方法
CA3004288A1 (en) 2015-12-28 2017-07-06 Nobuyuki Tanaka Method for promoting efficiency of purification of fc region-containing polypeptide
CA3016424A1 (en) 2016-03-14 2017-09-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell injury inducing therapeutic drug for use in cancer therapy
SG11201801024XA (en) 2016-08-05 2018-05-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Therapeutic or preventive compositions for il-8-related diseases
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
US11851486B2 (en) 2017-05-02 2023-12-26 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils
WO2019018688A1 (en) * 2017-07-20 2019-01-24 The University Of Virginia Patent Foundation METHODS OF TREATING OR PREVENTING A NEUROLOGICAL DISORDER OF THE IMMUNE SYSTEM
TWI827585B (zh) 2018-03-15 2024-01-01 日商中外製藥股份有限公司 對茲卡病毒具有交叉反應性的抗登革病毒抗體及其使用方法
MA54752A (fr) * 2019-01-14 2021-11-24 Univ Virginia Patent Foundation Utilisation d'inhibiteurs d'intégrine pour le traitement ou la prévention d'un trouble immunitaire neurologique et/ou d'une lésion du système nerveux

Family Cites Families (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
JP3101690B2 (ja) * 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
AU7247191A (en) * 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US6673986B1 (en) * 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) * 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) * 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5789650A (en) * 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5391481A (en) * 1990-08-31 1995-02-21 The Trustees Of Columbia University Antibody which is directed against and inhibits collagen binding to a VLA-1 epitope and uses thereof
US5871907A (en) * 1991-05-15 1999-02-16 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
ATE255131T1 (de) 1991-06-14 2003-12-15 Genentech Inc Humanisierter heregulin antikörper
ES2136092T3 (es) * 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
DE69309044T3 (de) 1992-01-13 2004-12-23 Biogen, Inc., Cambridge Behandlung von asthma
US5733743A (en) * 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US6307026B1 (en) * 1992-12-10 2001-10-23 Celltech Limited Humanized antibodies directed against A33 antigen
NZ261259A (en) 1993-01-12 1996-12-20 Biogen Inc Humanised recombinant anti-vla4 antibody and diagnostic compositions and medicaments
DK0682529T4 (da) 1993-02-09 2006-05-15 Biogen Idec Inc Antistof til behandling af insulinkrævende diabetes
US6111598A (en) * 1993-11-12 2000-08-29 Peveo, Inc. System and method for producing and displaying spectrally-multiplexed images of three-dimensional imagery for use in flicker-free stereoscopic viewing thereof
US5827690A (en) * 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
ES2424292T3 (es) 1994-01-25 2013-09-30 Biogen Idec Ma Inc. Anticuerpos humanizados contra la molécula de adhesión leucocitaria VLA-4
US5840299A (en) 1994-01-25 1998-11-24 Athena Neurosciences, Inc. Humanized antibodies against leukocyte adhesion molecule VLA-4
ES2151054T3 (es) * 1994-04-26 2000-12-16 Kanebo Ltd Farmaco para el tratamiento de la artritis reumatoide.
JPH08131185A (ja) 1994-11-14 1996-05-28 Sumitomo Electric Ind Ltd マウスｖｌａ−１分子に対するモノクローナル抗体
JPH08160972A (ja) 1994-12-01 1996-06-21 Sega Enterp Ltd エフェクト制御方法、制御装置およびこれを利用したカラオケ装置
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
GB9516399D0 (en) 1995-08-10 1995-10-11 Camelot Superabsorbents Ltd Process for the production of water-absorbing compositions
DE69621940T2 (de) * 1995-08-18 2003-01-16 Morphosys Ag Protein-/(poly)peptidbibliotheken
ATE352613T1 (de) 1995-08-29 2007-02-15 Kirin Brewery Chimäres tier und methode zu dessen herstellung
DE19534177A1 (de) * 1995-09-15 1997-03-20 Merck Patent Gmbh Cyclische Adhäsionsinhibitoren
GB9519667D0 (en) 1995-09-27 1995-11-29 Univ Manchester Pharmaceutical composition
DE19541844C1 (de) * 1995-11-09 1997-07-24 Gsf Forschungszentrum Umwelt Verfahren zur Herstellung von menschlichen Antikörpern und deren Verwendung
US6127524A (en) * 1996-10-18 2000-10-03 Dade Behring Inc. Binding molecules and computer-based methods of increasing the binding affinity thereof
JP4215172B2 (ja) 1996-12-03 2009-01-28 アムジェン フレモント インク． 複数のＶ▲下Ｈ▼およびＶ▲下κ▼領域を含むヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック哺乳動物、ならびにそれから産生される抗体
ATE230277T1 (de) 1997-06-13 2003-01-15 Genentech Inc Stabilisierte antikörperformulierung
NZ508317A (en) 1998-05-22 2004-01-30 Boys Town Nat Res Hospital Use of alpha1beta1 integrin receptor inhibitors and tgf-beta1 inhibitors in the treatment of kidney disease
DE19831710A1 (de) * 1998-07-15 2000-01-20 Merck Patent Gmbh Diacylhydrazinderivate
JP2003513005A (ja) 1998-10-06 2003-04-08 バイオジェン インコーポレイテッド α１β１インテグリンＩ−ドメインの結晶およびそれらの使用
RS50086B (sr) * 1999-04-22 2009-01-22 Biogen Idec Ma Inc., Upotreba antagonista subjedinica alfa-4 integrina za pripremanje farmaceutskog preparata za tretiranje fibroze
ES2529706T3 (es) 1999-06-01 2015-02-24 Biogen Idec Ma Inc. Un anticuerpo monoclonal bloqueante contra el dominio alfa1-I de VLA-1, y su uso para el tratamiento de trastornos inflamatorios
AU4545600A (en) 1999-06-17 2001-01-09 Kai Desinger Surgical, grooved director for collecting tissue in a minimally invasive manner
AU4259901A (en) 2000-03-28 2001-10-08 Cambridge University Technical Services Limited Receptor/peptide crystal structure for identification of inhibitors
US8288322B2 (en) 2000-04-17 2012-10-16 Dyax Corp. Methods of constructing libraries comprising displayed and/or expressed members of a diverse family of peptides, polypeptides or proteins and the novel libraries
DE10028402A1 (de) 2000-06-13 2001-12-20 Merck Patent Gmbh Pyridin-2-yl-aminoalkycarbonylglycyl-beta-alanin und Derivate
US7153944B2 (en) 2000-07-31 2006-12-26 The General Hospital Corporation High affinity integrin polypeptides and uses thereof
SK288124B6 (sk) 2001-04-13 2013-09-03 Biogen Idec Ma Inc. Anti-VLA-1 antibody, composition comprising such antibodies, isolated nucleic acids sequence, use of composition, in vitro method of determining level of VLA-1 in tissue, cell of cell line hAQC2, haAQC2, hsAQC2 or hybridoma mAQC2 and method for identifying inhibitor of I domain of integrin
AU2003215298A1 (en) 2002-02-14 2003-09-04 Biogen, Inc. Alpha1beta1 antagonists for treatment of atherosclerosis
AU2003248982B2 (en) 2002-08-01 2009-12-10 Immunomedics, Inc. Alpha-fetoprotein immu31 antibodies and fusion proteins and methods of use thereof
US20040208870A1 (en) 2003-01-30 2004-10-21 Medimmune, Inc. Stabilized high concentration anti-integrin alphanubeta3 antibody formulations
WO2005016883A2 (en) 2003-08-14 2005-02-24 Icos Corporation Acrylamide derivatives as vla-1 integrin antagonists and uses thereof
WO2005019200A2 (en) 2003-08-14 2005-03-03 Icos Corporation Aryl piperidine derivatives as vla-1 integrin antagonists and uses thereof
US7285530B2 (en) 2004-10-21 2007-10-23 Viron Therapeutics, Inc. Use of SERP-1 as an antiplatelet agent
WO2006124269A2 (en) 2005-05-16 2006-11-23 Amgen Fremont Inc. Human monoclonal antibodies that bind to very late antigen-1 for the treatment of inflammation and other disorders
WO2006133286A2 (en) 2005-06-07 2006-12-14 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Treatment of tnf antagonist-resistant inflammatory disorders and related methods
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
MY149159A (en) 2005-11-15 2013-07-31 Hoffmann La Roche Method for treating joint damage
US20080118496A1 (en) 2006-04-10 2008-05-22 Medich John R Uses and compositions for treatment of juvenile rheumatoid arthritis
JO3324B1 (ar) 2006-04-21 2019-03-13 Amgen Inc مركبات علاجية مجففة بالتبريد تتعلق بالعصارة الهضمية
AU2007267579B2 (en) 2006-05-25 2013-05-30 Biogen Ma Inc. Methods of treating stroke
JP4951596B2 (ja) 2008-07-31 2012-06-13 株式会社日立製作所 冷却システム及び電子装置
TW201039854A (en) 2009-03-06 2010-11-16 Genentech Inc Antibody formulation
WO2011084750A1 (en) 2009-12-21 2011-07-14 Genentech, Inc. Antibody formulation
CN103370081A (zh) 2011-02-03 2013-10-23 桑塔鲁斯股份有限公司 受试者的选择和治疗
US9018035B2 (en) 2012-01-11 2015-04-28 Panasonic Intellectual Property Management Co., Ltd. Pressed-contact type semiconductor device and method for manufacturing the same
ES2732243T3 (es) 2012-02-16 2019-11-21 Santarus Inc Composiciones farmacéuticas de anticuerpos ANTI-VLA1 (CD49A)

Also Published As

Publication number Publication date
EA006705B1 (ru) 2006-02-24
KR100927670B1 (ko) 2009-11-20
BG108340A (bg) 2004-10-29
EP1423431B1 (en) 2010-06-16
US20090010930A1 (en) 2009-01-08
BRPI0209792B8 (pt) 2021-05-25
WO2002083854A3 (en) 2004-04-08
DE60236735D1 (de) 2010-07-29
JP2009079047A (ja) 2009-04-16
BG66334B1 (bg) 2013-06-28
US7910099B2 (en) 2011-03-22
EP1423431A2 (en) 2004-06-02
US9644030B2 (en) 2017-05-09
US10336826B2 (en) 2019-07-02
WO2002083854A9 (en) 2003-11-06
CA2443903C (en) 2018-03-20
CZ20033039A3 (cs) 2004-03-17
CN1561345B (zh) 2011-09-14
NO20034554L (no) 2003-12-15
WO2002083854A2 (en) 2002-10-24
HUP0402250A3 (en) 2007-06-28
KR20040062879A (ko) 2004-07-09
AU2002258778A2 (en) 2002-10-28
AU2002258778C1 (en) 2008-12-04
US20170335000A1 (en) 2017-11-23
CN1561345A (zh) 2005-01-05
IL213564A0 (en) 2011-07-31
IL158376A0 (en) 2004-05-12
US8084028B2 (en) 2011-12-27
US20150299323A1 (en) 2015-10-22
US20100272716A1 (en) 2010-10-28
MXPA03009390A (es) 2004-01-29
UA83791C2 (ru) 2008-08-26
MY138286A (en) 2009-05-29
ES2347532T3 (es) 2010-11-02
EA200301117A1 (ru) 2004-08-26
US7723073B2 (en) 2010-05-25
GEP20074252B (en) 2007-12-10
CA2443903A1 (en) 2002-10-24
IS6982A (is) 2003-10-08
EE200300509A (et) 2004-08-16
NO20034554D0 (no) 2003-10-10
US7358054B2 (en) 2008-04-15
IL213564B (en) 2018-06-28
ATE471344T1 (de) 2010-07-15
YU80903A (sh) 2006-05-25
EP1423431A4 (en) 2005-04-27
JP2004536580A (ja) 2004-12-09
US20110189177A1 (en) 2011-08-04
IL158376A (en) 2011-07-31
CZ303450B6 (cs) 2012-09-19
NZ529494A (en) 2005-08-26
PL367324A1 (en) 2005-02-21
AU2002258778B2 (en) 2008-01-17
SK288124B6 (sk) 2013-09-03
BRPI0209792B1 (pt) 2017-03-28
AR036330A1 (es) 2004-09-01
US20120177638A1 (en) 2012-07-12
JP4303475B2 (ja) 2009-07-29
HUP0402250A2 (hu) 2005-01-28
BR0209792A (pt) 2005-04-26
US20040081651A1 (en) 2004-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10336826B2 (en) Antibodies to VLA-1
AU2002258778A1 (en) Antibodies to VLA-1
TW201132759A (en) Novel antagonist antibodies and their FaB fragments against GPVI and uses thereof
AU2006201540A1 (en) A Blocking Monoclonal Antibody to VLA-1 and Its Use for the Treatment of Inflammatory Disorders
ZA200308568B (en) Antibodies to VLA-1.

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20210412