CN1561345A - 抗vla－1的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异性结合VLA－1整联蛋白的抗体 和使用这些抗体治疗受试者的免疫疾病的方法。本发明还包括 VLA－1抗体及其配体形成的复合物的晶体结构，以及使用这 些结构的结构坐标鉴定出的VLA－1拮抗剂和激动剂。

Description

抗VLA-1的抗体
技术领域
本发明涉及抗VLA-1整联蛋白的抗体，以及所述抗体用于治疗炎症疾病和其它免疫疾病的用途。
本发明还涉及一个所述抗体与VLA-1的α1-I结构域之间的复合物的晶体结构，以及该结构信息在计算机药物设计中的用途。
背景技术
整联蛋白是介导细胞-细胞和细胞-基质粘附的细胞表面受体超家族。已知这些蛋白质可在发育和组织修复过程中为细胞生长、迁移和分化提供固着物和信号。它们也参与免疫和炎症过程。
整联蛋白是由两个非共价连接的多肽链α和β组成的异二聚体蛋白质。每条链的氨基末端形成球状头，负责链间连接和配体结合。球状头通过杆与跨膜区段连接。胞质尾的长度通常短于50个氨基酸残基。最初，以使用何种β亚单位形成异二聚体为基础来定义整联蛋白亚家族。含有β1的整联蛋白也被称为VLA分子，指的是“很晚活化的”抗原。VLA-1至VLA-6分别指的是含有α1至α6的β1亚家族成员(即CD49a至CD49f)。一般性的评述可参见例如Cellular and Molecular Immunology，Abul K.Abbas等编，W.B.Saunders Company，Philadelphia，PA，2000。
已知(I和IV型)胶原和层粘连蛋白是α1β1整联蛋白(即VLA-1)的配体。VLA-1参与胶原上的细胞粘附和迁移(Keely等，1995，J.Cell Sci.108：595-607；和Gotwals等，1996，J.Clin.Invest.97：2469-2477)；能促进胶原基质(创伤愈合的重要成分)的收缩和重组(Gotwals等，文献同上；和Chiro，1991，Cell 67：403-410)；并能调节参与胞外基质模型重建之基因的表达(Riikonen等，1995，J.Biol.Chem.270：1-5；和Langholz等，1995，J.Cell Biol.131：1903-1915)。因此，VLA-1调节不当会导致某些病理学状态，如纤维样变性。
另外，有人提出VLA-1可能在T细胞/单核细胞-引发的疾病中起作用。抗-VLA-1抗体能阻断依赖于T-细胞的细胞因子表达(Miyake等，1993，J.Exp.Med.177：863-868)。在持续活化的、2至4周龄经培养的T细胞中，VLA-1的表达有所增加(Hemler等，1985，Eur.J.Immunol.15：502-508)。VLA-1也能在分离自类风湿关节炎患者滑膜的高百分比的T细胞上表达(Hemler等，1986，J.Clin.Invest.78：692-702)。
已测定整联蛋白α亚单位的几种晶体结构，包括α2β1的α2-I结构域(PDB登录号laox；Emsley等，1997，J.Biol.Chem.272：28512-28517)；大鼠α1β1的α1-I结构域(PDB登录号lck4；Nolte等，1999，FEBS Lett.452：379-385；WO 00/20459)；人α1β1的α1亚单位(PDB登录号lqc5；Rich等，1999，J.Biol.Chem.274：24906-24913)；αL-I和αM-I结构域；和vWF-A3(Lee等，1995，Cell 80：631-635；Lee等，1995，Structure 3：1333-1340；Qu等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：10277-10281；Qu等，1996，Structure 4：931-942)的结构。α2β1结构展现出螺旋(即C-螺旋)，在金属-离子结合位点处，该螺旋在蛋白质的一个表面形成壕或沟(Emsley等，文献同上)。与基于短胶原的三股螺旋状肽复合的α2-I结构域的晶体结构揭示出：基于胶原的肽与所述壕沟结合，其中进行分子间或金属接触的α2-I氨基酸包括：Asp151，Asn154，Tyr157，Gln215，Asp219，Leu220，Thr221，Asp254，Glu256，His258，Tyr285，Leu286，Asn289，Leu291，Asn295，和Lys298(PDB登录号ldzi；Emsley等，2000，Cell 101：47-56；WO 01/73444)。上述氨基酸编号基于PDB登录号ldzi，本文称之为“晶体编号”。大鼠和人α1-I结构域的晶体结构显现出类似的壕沟。
发明简述
本发明提供了抗-VLA-1抗体和使用这些抗体治疗多种炎症和免疫疾病的方法。
具体地说，本发明包括与VLA-1(例如人VLA-1)特异性结合的抗体。所述抗体含有由SEQ ID NO：1的氨基酸残基24至33，49至55和88至96所限定的轻链互补决定区(“CDR”)，和/或由SEQ ID NO：2的氨基酸残基31至35，50至65和98至107所限定的重链互补决定区。由本文公开的晶体结构测定出这些CDR的非-抗原-接触部分可含有突变(例如缺失，插入和/或取代)，而不会影响抗体的VLA-1-结合活性。突变的例子有：轻链CDR中的S24N，G92S和D1O1A和重链CDR2中的G55S。在一个实施方案中，本发明的抗体含有SEQ ID NO：1的轻链可变区序列和/或SEQ ID NO：2的重链可变区序列。
在相关的实施方案中，本发明的抗体含有与杂交瘤mAQC2产生的抗体相同的重链和轻链多肽序列，所述杂交瘤于2001年4月18日保藏于美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)，10801 University Boulevard，Manassas，VA20110-2209，其ATCC为PTA3273(本文提及的所有ATCC保藏都是根据布达佩斯条约作出的)。通过例如杂交瘤mAQC2，或含有分离自该杂交瘤、且编码mAQC2单克隆抗体的重链和轻链的核酸序列的细胞即可产生该抗体。
在另一个实施方案中，抗体是人源化抗体，其含有至少一个(例如2，3，4或5个)下列轻链残基：Q1，L4，P46，W47和Y71；或至少一个(例如2，3，4，5，6或7个)下列重链残基：D1，V12，S28，F29，A49，T93，R94(Kabat编号惯例)。例如，抗体的轻链含有Q1，L4和Y71；和/或重链含有(i)F29，A49，T93和R94，或(ii)A49和T93。
本发明的人源化抗体可含有由SEQ ID NO：3的氨基酸残基1至106所限定的轻链可变区序列，和/或由SEQ ID NO：4的氨基酸残基1至118所限定的重链可变区序列。人源化抗体可含有与细胞系hAQC2(ATCC PTA3275；保藏于2001年4月18日)产生的抗体相同的重链和/或轻链多肽序列。
在另一个实施方案中，本发明的人源化抗体可在重链的一个或多个(例如2，3，4，5，6，7或8个)位置含有突变(例如缺失，取代或添加)，使得抗体的效应子功能(例如抗体与Fc受体或补体因子结合的能力)有所改变，但不影响抗体与VLA-1结合的能力(美国专利5,648,260)。这些重链位置包括但不限于：残基234，235，236，237，297，318，320和322(EU编号体系)。例如，人源化抗体的重链可含有突变L234A(即用丙氨酸取代未经修饰的抗体的第234位亮氨酸)和L235A(EU编号体系)。在一个相关的实施方案中，抗体含有与细胞系hsAQC2(ATCC PTA3356；保藏于2001年5月4日)产生的抗体相同的重链多肽序列。
在另一个实施方案中，本发明的人源化抗体可在身为糖基化位点的氨基酸残基处含有突变(例如缺失或取代)，使得糖基化位点消失。这种抗体在临床上是有利的，因为它们具有降低的效应子功能或其它不必要的功能，而保留了VLA-1结合亲和性。糖基化位点的突变对加工过程的开展(例如蛋白质表达和纯化)也是有利的。例如，抗体的重链可含有突变N297Q(EU编号体系)，使得重链在此位点不再能被糖基化。在一个相关的实施方案中，人源化抗体可含有与细胞系haAQC2(ATCC PTA3274；保藏于2001年4月18日)产生的抗体相同的重链多肽序列。
在另一个实施方案中，本发明抗体的重链和/或轻链含有能增加与VLA-1的结合亲和性的突变，从而增强了抗体治疗VLA-1-介导之疾病的潜力。
本发明还包括含有本发明的抗体和可药用载体的组合物；含有SEQ IDNO：1编码序列的分离的核酸；含有SEQ ID NO：2编码序列的分离的核酸；含有由杂交瘤mAQC2产生的抗体的轻链编码序列的分离的核酸；含有由杂交瘤mAQC2产生的抗体的重链编码序列的分离的核酸；含有由细胞系hAQC2产生的抗体的轻链编码序列的分离的核酸；含有由细胞系hAQC2产生的抗体的重链编码序列的分离的核酸；含有由细胞系haAQC2产生的抗体的重链编码序列的分离的核酸；含有由细胞系hsAQC2产生的抗体的重链编码序列的分离的核酸；含有SEQ ID NO：3的残基1至106编码序列的分离的核酸；含有SEQ ID NO：4的残基1至118编码序列的分离的核酸；杂交瘤mAQC2的细胞；细胞系hAQC2的细胞；细胞系haAQC2的细胞；和细胞系hsAQC2的细胞。
本发明还包括治疗患有由VLA-1介导的免疫疾病的受试者的方法，包括给受试者施用有效量的本发明的抗体。例如，使用该方法治疗人受试者以减轻、缓解、稳定化、逆转、阻止、延缓或延迟疾病的进程。或者，使用该方法预防性治疗有发展成免疫疾病之风险的人受试者，以阻止或延迟疾病的发作。可以一个或多个剂量施用“有效量的”组合物。
VLA-1介导的免疫疾病包括但不限于与正常受试者相比，一个或多个组织中的VLA-1活性水平升高的疾病。所述疾病的例子有：与皮肤有关的疾病(如牛皮癣、湿疹、烧伤、皮炎和毛囊细胞的异常增殖)，纤维变性(如肾或肺纤维变性)，过敏性鼻炎，呼吸窘迫综合征，气喘，支气管炎，腱炎，粘液囊炎，发烧，偏头疼，胃肠疾病(如炎性肠病、节段性回肠炎、胃炎、应激性肠综合征、结肠炎和结肠直肠癌)，血管病(如动脉粥样硬化)，结节性动脉外膜炎，甲状腺炎，再生障碍性贫血，恶性淋巴肉芽肿病，风湿热，骨关节炎，自身免疫病(如I型糖尿病、胃肌无力、类风湿关节炎、全身性红斑狼疮和多发性硬化)，肉样瘤病，肾病综合征，肾衰竭，Bechet综合征，多肌炎，龈炎，过敏(如迟发型超敏或即发型超敏)，移植物排斥，移植物抗宿主疾病(GVHD)，结膜炎，受伤后出现的肿胀，心肌缺血和内毒素休克综合征。
本发明还提供了测定组织(如组织样品和体液)中的VLA-1水平的方法，所述方法包括(例如在体内或体外)使组织与本发明的抗体接触，然后检测抗体与组织的结合，从而测定组织中的VLA-1水平。
本文所用的本发明抗体可以是例如鼠抗体，人源化抗体或嵌合抗体。可以是任何同种型和亚型(如IgM，IgD，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgE，IgA1和IgA2；具有κ或λ轻链)的完整抗体(即具有两个全长轻链和两个全长重链)。或者，本发明的抗体指的是完整抗体的能与抗原结合的片段(如Fab，F(ab’)2和单链Fv)。
本发明还提供了可结晶的组合物，由大鼠-人嵌合α1-I结构域(突变的RΔH)和hAQC2 Fab片段形成的复合物的晶体，以及使用所述组合物和晶体的方法。本发明还提供了嵌合结构域和hAQC2 Fab片段的结构坐标和结合位点。本文描述的晶体结构的原子坐标为hAQC2的生物活性提供了结构基础，也为合理设计具有推测的生物活性的VLA-1激动剂或拮抗剂(如小分子化合物或抗体，如hAQC2变体)提供了基础。
本文公开的晶体结构是首次公开的α1β1整联蛋白/Fab复合物α1-I结构域晶体结构。该结构显示出对于α1-I结构域与Fab的结合至关重要的残基。另外，Fab在推定的胶原-结合位点结合并抑制胶原结合。在α1-I结构域内的结合位点中发现的氨基酸残基包括Asp154，Ser156，Asn157，Ser158，Tyr160，Glu192，Glu218，Arg219，Gly220，Gly221，Arg222，Gln223，Thr224，Asp257，His261，Asn263，Arg291和Leu294(晶体编号)。Fab片段上与α1-I结构域结合的残基包括轻链残基Asn30，Tyr48，Trp90，Ser91，Asn93和Trp95，以及重链残基Ser30，Arg31，Trp47，Ser52，Gly53，His56，Tyr58，Phe99，Gly100和Asp101(晶体编号)。
本发明还提供了能产生分子复合物；或分子复合物同系物(该同系物与氨基酸主链原子的均方根误差不超过0.65A)的三维图像的计算机，其中由α1β1整联蛋白RΔH的嵌合I结构域和人源化抗体hAQC2的复合物的结构坐标(图19)定义分子复合物。计算机包括机器-可读数据存储介质(包括由机器-可读数据编码的数据存储材料)，其中数据含有图19所示复合物的至少一部分结构坐标；处理机器-可读数据的存储指令所用的工作存储器；与工作存储器和机器-可读数据存储介质相连接的中央处理部件，该部件可将机器可读数据处理为三维图像；以及与中央处理部件相连接、用于显示三维图像的显示器。
本发明还提供了能产生分子或分子复合物；或分子或分子复合物的同系物(其中该同系物包括与hAQC2氨基酸主链原子的均方根误差不超过1.10A的结合位点)的三维图像的计算机，其中分子或分子复合物包括由hAQC2氨基酸的结构坐标(图19)定义的结合位点，所述氨基酸包括轻链残基Asn30，Tyr48，Trp90，Ser91，Asn93和Trp95，以及重链残基Ser30，Arg31，Trp47，Ser52，Gly53，His56，Tyr58，Phe99，Gly100和Asp101(晶体编号)中的至少7个残基(例如7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个残基)。本发明还提供了用于产生下述结构的三维图像的计算机：由hAQC2氨基酸的结构坐标(图19)定义的结合位点，其中所述氨基酸包括轻链残基Asn30，Tyr48，Trp90，Ser91，Asn93和Trp95，以及重链残基Ser30，Arg31，Trp47，Ser52，Gly53，His56，Tyr58，Phe99，Gly100和Asp101(晶体编号)中的至少7个残基(例如7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个残基)；与hAQC2氨基酸主链原子的均方根误差不超过1.10_的同系物结合位点。
本发明还提供了鉴定整联蛋白I结构域的抑制剂的方法，所述方法包括下述步骤：使用hAQC2氨基酸的结构坐标(图19)或±相对于hAQC2氨基酸主链原子而言不超过1.10_的均方根误差，以产生结合位点的三维结构，其中所述氨基酸包括轻链残基Asn30，Tyr48，Trp90，Ser91，Asn93和Trp95，以及重链残基Ser30，Arg31，Trp47，Ser52，Gly53，His56，Tyr58，Phe99，Gly100和Asp101(晶体编号)中的至少7个残基(例如7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个残基)；利用该三维结构设计或选择潜在的拮抗剂；合成潜在的拮抗剂；使潜在的拮抗剂与hAQC2接触以测定潜在的拮抗剂与hAQC2相互作用的能力，其中潜在的拮抗剂与hAQC2相互作用的能力表示潜在的拮抗剂是I结构域的抑制剂。本发明还提供了由此方法鉴定的整联蛋白I结构域的抑制剂。
本发明还提供了能产生分子或分子复合物；或分子或分子复合物的同系物(其中该同系物包括与I结构域氨基酸主链原子的均方根误差不超过0.65_的第二结合位点)的三维图像的计算机，其中分子或分子复合物包括：由I结构域氨基酸残基Asp154，Ser156，Asn157，Ser158，Tyr160，Glu192，Gln218，Arg219，Gly220，Gly221，Arg222，Gln223，Thr224，Asp257，His261，Asn263，Arg291，和Leu294(晶体编号)的结构坐标(图19)定义的结合位点。本发明还提供了用于产生下述结构的三维图像的计算机：由I结构域氨基酸残基Asp154，Ser156，Asn157，Ser158，Tyr160，Glu192，Gln218，Arg219，Gly220，G1y221，Arg222，Gln223，Thr224，Asp257，His261，Asn263，Arg291，和Leu294(晶体编号)的结构坐标(图19)定义的第一结合位点；或与I结构域氨基酸主链原子的均方根误差不超过0.65_的同系物结合位点。
本发明还提供了能产生分子或分子复合物；或分子或分子复合物的同系物(其中该同系物包括与I结构域氨基酸主链原子的均方根误差不超过1.0_的第二结合位点)的三维图像的计算机，其中分子或分子复合物包括：由I结构域氨基酸的结构坐标(图19)定义的结合位点，所述氨基酸包括残基Glu192，Gln218，Arg219，Gly220和G1y221(晶体编号)中的至少3个残基。本发明还提供了用于产生下述结构的三维图像的计算机：由I结构域氨基酸的结构坐标(图19)定义的结合位点，所述氨基酸包括残基Glu192，Gln218，Arg219，Gly220和Gly221(晶体编号)中的至少3个残基；或与I结构域氨基酸主链原子的均方根误差不超过1.0_的同系物结合位点。
本发明还提供了使用这些三维图像设计化学个体的方法，所述个体能与嵌合结构域或hAQC2 Fab片段或其部分结合；并能作为嵌合结构域或hAQC2 Fab片段或其部分的潜在抑制剂起作用。本发明还涉及组合物，其中包括化学个体，如嵌合结构域的抑制剂和变体或hAQC2 Fab片段的变体，其中利用嵌合结构域或hAQC2 Fab片段或结合位点的结构坐标可以合理地设计出所述化学个体和变体。本发明还涉及上文所鉴定的化学个体用于治疗或预防受试者的与不适或异常α1β1活性相关之病症的用途。
本发明还提供了鉴定整联蛋白I结构域的抑制剂的方法，所述方法包括下述步骤：使用I结构域氨基酸残基Asp154，Ser156，Asn157，Ser158，Tyr160，Glu192，Gln218，Arg219，Gly220，Gly221，Arg222，Gln223，Thr224，Asp257，His261，Asn263，Arg291，和Leu294(晶体编号)的结构坐标(图19)，以产生结合位点的三维结构；利用该三维结构设计或选择潜在的拮抗剂；合成潜在的拮抗剂；使潜在的拮抗剂与I结构域接触以测定潜在的拮抗剂与I结构域相互作用的能力，其中潜在的拮抗剂与I结构域相互作用的能力表示潜在的拮抗剂是I结构域的抑制剂。
本发明还提供了鉴定整联蛋白I结构域的抑制剂的方法，所述方法包括下述步骤：使用包括残基Glu192，Gln218，Arg219，Gly220，Gly221(晶体编号)的I结构域氨基酸中的至少3个残基的结构坐标(图19)或±相对于I结构域氨基酸主链原子而言不超过0.65_的均方根误差，以产生结合位点的三维结构；利用该三维结构设计或选择潜在的拮抗剂；合成潜在的拮抗剂；使潜在的拮抗剂与I结构域接触以测定潜在的拮抗剂与整联蛋白I结构域相互作用的能力，其中潜在的拮抗剂与I结构域相互作用的能力表示潜在的拮抗剂是I结构域的抑制剂。本发明还提供了由此方法鉴定的整联蛋白I结构域的抑制剂。
由下文的详细描述和权利要求书可以明显看出本发明的其它特征和优点。
附图简述
图1.在活化的白细胞上与胶原结合的整联蛋白α1β1和α2β1。(A).IL-2-活化的脾细胞(d11)上α1和α2β1整联蛋白表达的流式细胞术分析。用抗α1mAb，抗α2 mAb或不结合的对照mAb(灰线)标记细胞，接着用FITC-抗-仓鼠免疫球蛋白标记细胞。(B).抗α1和抗α2 mAb对白细胞与胶原粘附的作用。用所述mAb处理105个经IL-2活化的脾细胞15分钟，然后铺于包被有IV型或I型胶原的孔，37℃放置1小时。按实施例1所述计算粘附，并表示为相对于经对照mAb处理的细胞的粘附百分比。做三份粘附试验，进行至少3个独立的实验。图中显示了一个代表性的实验。
图2.抗-整联蛋白mAb对延迟型超敏反应的效应期的作用。用所述mAb腹膜内注射SRBC-致敏小鼠，1小时后进行SRBC攻击。按实施例2所述，在抗原攻击20小时之后测定足垫厚度，将结果表示为足垫厚度增加的百分比±SEM。这些数据简要描述了8个实验，其中n＝79(PBS)，68(对照仓鼠Ig)，68(抗-α1)，29(抗-α2)，18(抗-α1+抗-α2)，45(抗-α4)，18(抗-α5)，20(抗-α6)，和10(抗-β1)。所用mAb是：Ha4/8(对照仓鼠2类Ig)，Ha31/8(抗-α1)，Ha1/29(抗-α2)，PS/2(抗-α4)，5H10-27(抗-α5)，GoH3(抗-α6)和HMβ1-1(抗-β1)。
图3.抗-整联蛋白mAb对接触超敏反应的效应期的作用。用所述mAb腹膜内注射FITC-致敏小鼠，4小时后进行FITC攻击。按实施例3所述，在基线处和24小时之后测定耳的厚度，将结果表示为耳厚度增加的百分比±SEM。这些数据简要描述了9个实验，其中n＝74(PBS)，60(对照仓鼠Ig)，26(抗-ICAM-1)，44(抗-α1)，44(抗-α2)，38(抗-α1+抗-α2)，36(抗-α4)，16(抗-α5)，26(抗-α4+抗-α5)，24(抗-α6)，和22(抗-β1)。所用仓鼠mAb是：Ha4/8(对照仓鼠2类Ig)，Ha31/8(抗-α1)，Ha1/29(抗-α2)，HMβ1-1(抗-β1)，3E2(抗-ICAM-1)；所用大鼠mAb是：R35-95和R35-38(分别为对照大鼠IgG2a和大鼠IgG2b)，PS/2(抗-α4)，5H10-27(抗-α5)，GoH3(抗-α6)。
图4.与野生型小鼠相比，α1-缺损小鼠的接触超敏反应。用所述mAb腹膜内注射FITC-致敏小鼠，4小时之后用FITC攻击。按实施例4所述，在基线处和24小时之后测定耳的厚度，将结果表示为耳厚度增加的百分比±SEM。所用实验组为每个条件下4至5只小鼠，所有实验至少进行3次。图中显示一个代表性实验。
图5.抗α1和抗α2 mAb对巴豆油-诱导的非特异性炎症的作用。用所述mAb腹膜内注射小鼠，4小时之后用巴豆油涂抹耳部。按实施例5所述，在基线处和24小时之后测定耳的厚度，将结果表示为耳厚度增加的百分比±SEM。所用实验组为每个条件下4至5只小鼠，所有实验至少进行3次。图中显示一个代表性实验。
图6.抗α1和抗α2 mAb对胶原mAb-诱导的关节炎的作用。第0天用抗-胶原mAb腹膜内注射小鼠，接着在第3天用LPS腹膜内注射小鼠。从第0天开始每隔3天用所述mAb腹膜内注射小鼠。注射LPS 2-3天后，临床关节炎较为明显，并且持续了几周。按实施例6所述，以0至4的评分每隔3天评价一次每肢的情况，将结果表示为第9至第15天四肢的平均关节炎评分(±SEM)。这些数据简要描述了4个实验，每个实验组由每个条件下的3至4只小鼠组成。
图7.抗α1和抗α2 mAb对胶原mAb-诱导的关节炎的作用。A.用抗α1或抗α2 mAb预防性地治疗小鼠能降低关节炎评分。第0天用抗-胶原mAb治疗小鼠，接着在第3天用LPS治疗小鼠。到第6天时，关节炎较为明显，并且持续了几周。从第0天开始每隔3天用所述mAb治疗小鼠。每隔3天评价一次每肢的情况并以0至4的分值进行评分。将结果表示为第9至第15天四肢的平均关节炎评分(±SEM)(最大分值为16)。使用了每个条件下有4只小鼠的实验组；图中显示了12次实验的平均值。B.与经抗-α1 mAb治疗的野生型小鼠差不多，α1-缺损小鼠也具有降低的关节炎评分。实验细节和评分如上所述。使用了每个条件下有4只小鼠的实验组；图中显示了2次实验的平均值。
图8.缺乏淋巴细胞时关节炎的发展被延迟，缺乏淋巴细胞时抗α1 mAb会抑制关节炎。第0天用抗-胶原mAb治疗野生型B6，129或RAG-1-缺损的B6，129小鼠，第3天用LPS进行治疗。到第6天时，关节炎较为明显，并且持续了几周。从第0天开始每隔3天用所述mAb治疗小鼠。每隔3天评价一次每肢的情况并以0至4的分值进行评分。将结果表示为每肢的平均关节炎评分(最大分值为4)。使用了每个条件下有4只小鼠的实验组。
图9.抗α1 mAb对关节炎的抑制作用的剂量反应。第0天用抗-胶原mAb治疗野生型Balb/c小鼠，接着在第3天用LPS治疗小鼠。到第6天时，关节炎较为明显，并且持续了几周。从第0天开始每隔3天用所述剂量的Ha4/8(同种型对照)或Ha31/8(抗-α1)mAb腹膜内治疗小鼠。每隔3天评价一次每肢的情况并以0至4的分值进行评分。将结果表示为每肢的平均关节炎评分(最大分值为4)。使用了每个条件下有4只小鼠的实验组。
图10.用抗-α1 mAb治疗可降低关节炎评分。第0天用抗-胶原mAb治疗野生型Balb/c小鼠，接着在第3天用LPS治疗小鼠。到第6天时，关节炎较为明显，并且持续了几周。从第4天开始每隔3天用mAb(250μg)或Ig融合蛋白(200μg)腹膜内治疗小鼠。小鼠接受了mAb(Ha4/8同种型对照或Ha31/8抗-α1)，Ig融合蛋白(同种型对照Ig或TNF-R55-Ig)或这两者的组合物(250μg Ha31/8和200μg TNF-R55-Ig)。每隔3天评价一次每肢的情况并以0至4的分值进行评分。将结果表示为每肢的平均关节炎评分(最大分值为4)。使用了每个条件下有4只小鼠的实验组。
图11.抗α1 I结构域阻断mAb之表位的定位。A.大鼠(上方；SEQ IDNO：63)和人(下方；SEQ ID NO：64)α1-I结构域的氨基酸序列。黑体表示含有MIDAS(依赖于金属离子的粘附位点)基元的残基。在方框区大鼠序列的下方显示出替代相应大鼠残基的人氨基酸(RΔH)。为了清楚起见，除非另有说明，该图上下文中的残基编号指的是晶体编号。B.增加浓度的mAb AJH10(根据布达佩斯条约于2001年8月2日保藏于美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA，USA，ATCC No.PTA-3580)与培养板结合，所述板上包被有30μg/ml人(圆形)，大鼠(三角形)或RΔH(方形)α1-I结构域。所示数据是3次实验的代表。
图12.人α1-I结构域(SEQ ID NO：64)的氨基酸序列。
图13.鉴定α1-I结构域的阻断mAb。A.增加浓度的mAb AEF3(三角形)或AJH10(圆形)与包被有30μg/ml α1-I结构域的培养板结合。B.用增加浓度的mAb AJH10(菱形)或mAb BGC5(方形)处理α1-I结构域，所述结构域与包被有IV胶原(2μg/ml)的培养板结合。C.用增加浓度的mAb AEF3(三角形)或AJH10(圆形)处理K562-α1细胞，所述细胞与包被有IV胶原(5μg/ml)的培养板结合。每孔中加入的45-50％的细胞与IV胶原粘附。所示数据是3个独立实验的代表。
图14.由荧光激活细胞分选仪(FACS)分析得到的阻断mAb的物种交叉-反应性。将兔的血管平滑肌细胞与mAb AJH10(下方)或鼠IgG对照(上方)保温，并用荧光激活细胞分选仪(FACS)进行分析。
图15.α1-I结构域与胶原结合。A.增加浓度的人α1-I结构域与预先用1μg/ml I胶原(方形)或IV胶原(圆形)包被的培养板结合。已用与BSA结合的背景校正了所示数值。B.使2μg/ml人α1-I结构域与增加浓度的抗-人α1整联蛋白抗体5E8D9(方形)或抗-人α2-整联蛋白抗体A2IIE10(圆形)混合，然后与预先用1μg/ml IV胶原包被的培养板结合。C.用1μg/ml IV胶原或3％BSA包被培养板。随后，在1mM Mn2+，1mM Mg2+，或5mM EDTA的存在下，使α1-I结构域(2μg/ml)与经包被的培养板结合。所示数据是3次独立实验的代表。
图16.鉴定人源化的AQC2形式。评价mAQC2(三角形)，chAQC2(圆形)，hAQC2(倒三角形)和hAQC2′(方形)。
A.抑制VLA-1与IV型胶原结合。
B.抑制α1-I结构域与IV型胶原结合。
C.与固定化的α1-I结构域结合。
D.与生物素化的mAQC2竞争与固定化α1-I结构域的结合。
图17.通过FACS鉴定人源化的AQC2形式。
图18.通过FACS鉴定人源化的AQC2形式。
图19.通过X-射线晶体学由蛋白质数据库(PDB)形式中的复合物的晶体获得α1-I结构域/Fab复合物的原子结构坐标。不对称单位中的两个复合物的坐标如下。
复合物1：分子A＝整联蛋白的I结构域
分子H＝hAQC2 Fab的重链
分子L＝hAQC2 Fab的轻链
分子M＝Mn+2
复合物2：分子B＝整联蛋白的I结构域
分子X＝hAQC2 Fab的重链
分子Y＝hAQC2 Fab的轻链
分子M＝Mn+2
图20.I结构域-Fab复合物。A.I结构域-Fab复合物的带状图。I结构域为绿色，抗体的重链和轻链分别为黄色和蓝色。Mn+2离子是白色的球体。B.MIDAS(依赖于金属离子的结合位点)位点的特写，其显示出在Asp101(晶体编号)附近的金属离子(白色球体)坐标。蛋白质主链表现为带状，侧链表现为球-棍状。蓝色圆柱表示金属离子与蛋白质原子之间的相互作用。细线表示H-键。图20是用应用软件程序RIBBONS(Carson，1991，J.Appl.Cryst.24：958-961)绘制的。
图21.运行由图22和23的存储介质所编码的指令所用的系统图。
图22.磁性存储介质横切面，
图23.光学-可读数据存储介质的横切面。
发明详述
本发明发现抗整联蛋白(如VLA-1)及其片段，特别是α1-整联蛋白亚单位的抗体能阻断促炎白细胞与胞外基质组分(包括但不限于胶原，层粘连蛋白和纤连蛋白)的相互作用。该发现阐明：在与炎症相关的病症中，整联蛋白家族的粘附分子，特别是α1β1在外周组织环境中意义重大。
本发明通过突显富含基质的外周组织环境对免疫应答的重要性，将整联蛋白家族及其片段在炎症中的作用延伸至内皮细胞界面的白细胞结合和外渗，本发明还揭示出外周组织是基于粘附之疗法的新的干预点。
I.抗-整联蛋白抗体
本发明的方法涉及使用抗整联蛋白的抗体，其中所述整联蛋白包括含有与α链非共价结合的β链的分子，所述α链包括但不限于α1，α2，α3，α4，α5，α6，α7，α8，α9，α10，αV，αL，αM，αX，αD，αE，αIIb，β链包括但不限于β1，β2，β3，β4，β5，β6，β7，β8。本发明涉及使用的多种整联蛋白的例子包括但不限于：
α1β1，α2β1，α3β1，α4β1，α5β1，α6β1，α7β1，α8β1，α9β1，α10β1，αVβ1，αLβ1，αMβ1，αXβ1，αDβ1，αIIbβ1，αEβ1；
α1β2，α2β2，α3β2，α4β2，α5β2，α6β2，α7β2，α8β2，α9β2，α10β2，αVβ2，αLβ2，αMβ2，αXβ2，αDβ2，αIIbβ2，αEβ2；
α1β3，α2β3，α3β3，α4β3，α5β3，α6β3，α7β3，α8β3，α9β3，α10β3，αVβ3，αLβ3，αMβ3，αXβ3，αDβ3，αIIbβ3，αEβ3；
α1β4，α2β4，α3β4，α4β4，α5β4，α6β4，α7β4，α8β4，α9β4，α10β4，αVβ4，αLβ4，αMβ4，αXβ4，αDβ4，αIIbβ4，αEβ4；
α1β5，α2β5，α3β5，α4β5，α5β5，α6β5，α7β5，α8β5，α9β5，α10β5，αVβ5，αLβ5，αMβ5，αXβ5，αDβ5，αIIbβ5，αEβ5；
α1β6，α2β6，α3β6，α4β6，α5β6，α6β6，α7β6，α8β6，α9β6，α10β6，αVβ6，αLβ6，αMβ6，αXβ6，αDβ6，αIIbβ6，αEβ6；
α1β7，α2β7，α3β7，α4β7，α5β7，α6β7，α7β7，α8β7，α9β7，α10β7，αVβ7，αLβ7，αMβ7，αXβ7，αDβ7，αIIbβ7，αEβ7；
α1β8，α2β8，α3β8，α4β8，α5β8，α6β8，α7β8，α8β8，α9β8，α10β8，αVβ8，αLβ8，αMβ8，αXβ8，αDβ8，αIIbβ8，αEβ8；
本发明的方法还涉及使用抗整联蛋白片段的抗体，包括例如仅抗β链的抗体以及仅抗α链的抗体，其中所述β链包括但不限于β1，β2，β3，β4，β5，β6，β7，β8，所述α链包括但不限于α1，α2，α3，α4，α5，α6，α7，α8，α9，α10，αV，αL，αM，αX，αD，αE，αIIb。另外，本发明的方法还涉及使用抗整联蛋白片段的抗体，包括例如抗α链的I结构域的抗体，所述I结构域包括但不限于：α1β1(Briesewitz等，1993，J.Biol.Chem.268：2989)，α2β1(Takada and Hemler，1989，J Cell Biol 109：397)，αLβ2(Larson等，1989，J Cell Biol 108：703)，αMβ2(Corbi等，1988，J Biol Chem 263：12403)，αXβ2(Corbi等，1987，EMBOJ 6：4023)，αDβ2(Grayson等，1988，J Exp Med 188：2187)，αEβ7(Shaw等，1994，J Biol Chem 269：6016)的I结构域。在一个实施方案中，α1-I结构域抗原决定簇包括至少6个邻接氨基酸的氨基酸序列，该邻接序列可在图12的序列中找到。在一个相关实施方案中，其中邻接的序列是Val-Gln-Arg-Gly-Gly-Arg。
制备本发明使用的整联蛋白的方法是本领域技术人员公知的技术(参见例如Springer等，1990，Nature 346：425-434)。
本发明的实施方案还包括抗-整联蛋白多克隆和单克隆抗体。本发明的实施方案包括单克隆抗体，例如抗α1单克隆抗体。用于治疗，特别是治疗人的抗体包括人抗体，人源化抗体，嵌合抗体和完整抗体的抗原-结合片段，如Fab，Fab′，F(ab′)2和F(v)抗体片段。本发明的一些抗体还可包括含有一个或多个免疫球蛋白轻链和/或重链的蛋白质，如这些链的单体和同-或异-多聚体(如二聚体或三聚体)，其中这些链任选为以二硫键结合或交联结合。这些抗体能与一种或多种抗原(例如α1，α2，α6或含有α-I结构域的整联蛋白亚单位)结合。
本文所用的阻断α1β1功能的抗体指的是：与α1-I结构域，如图12的残基92-97结合，并且，通过例如它们抑制对IV胶原的K562-α1依赖型粘附的能力检测(见实施例15)，能够阻断α1β1功能的抗体。
下文描述了多种制备本发明抗体的方法。本领域公知但本文未具体描述的方法也落入本发明的范围之内。例如，使用噬菌体展示的抗体文库也可鉴定出本发明的抗体，参见Smith，1985，Science 228：1315-7；美国专利5,565,332，5,733,743，6,291,650和6,303,313。通过使本文鉴定的重链与不相关的轻链，如通过噬菌体展示技术鉴定的轻链偶联，可以制备本发明的其它抗体。
II.非-人杂交瘤抗体
通过众所周知的杂交瘤技术可以产生本发明的单克隆抗体。例如，可以用纯化或粗制的α1β1制品，被编码α1，β1或这两种抗原的cDNA构建体转染的细胞，组成型表达α1β1的细胞等免疫β1-/-动物(例如小鼠，大鼠或兔)。可以以纯化的蛋白质，细胞上表达的蛋白质，蛋白质片段或其肽，或编码蛋白质、蛋白质片段或肽的裸DNA或病毒载体的形式传递抗原。然后检测经免疫动物的血清中是否存在抗α1β1抗体。从经检测为阳性的动物中分离B细胞，用这些B细胞制备杂交瘤。
以特异性结合VLA-1的能力(例如与被α1转染的细胞结合而不与未经转染的亲代细胞结合)，以及任何其它合乎需要的特征，例如具有所需的CDR共有序列，能抑制(或在非阻断剂的情况下不抑制)胶原与VLA-1之间的结合来筛选杂交瘤所分泌的抗体。
在允许细胞将单克隆抗体分泌至培养基中的条件下，在营养培养基中培养筛选试验的结果为阳性的杂交瘤细胞。然后收集条件杂交瘤培养物上清液，纯化上清液中所含的抗体。或者，通过将杂交瘤细胞注射至未经免疫的动物(如小鼠)的腹腔，而产生所需的抗体。杂交瘤细胞在腹腔中增殖，分泌出以腹水形式积累的抗体。然后通过用注射器从腹腔中抽取腹水而收获抗体。
也可通过下述方法产生单克隆抗体：从合乎需要的杂交瘤中分离编码抗体的cDNA，用该cDNA转染哺乳动物宿主细胞(如CHO或NSO细胞)，培养转染的宿主细胞，并从培养基中回收抗体。
III.嵌合抗体
也可通过对相关的杂交瘤(如鼠，大鼠或兔)抗体进行基因工程改造而产生本发明的单克隆抗体。例如，可通过重组DNA技术改变相关抗体，使得重链和/或轻链的部分或全部绞链区和/或恒定区被来自另一物种(如人)的抗体的相应组分所替代。一般说来，经改造抗体的可变区能保持与相关抗体的可变区相同或基本上相同。这种经改造的抗体被称为嵌合抗体，当给提供绞链区和/或恒定区的物种(如人)的个体施用时，其抗原性比相关抗体弱。制备嵌合抗体的方法是本领域众所周知的。人的恒定区包括得自IgG1和IgG4的恒定区。
IV.彻底的人抗体
本发明的单克隆抗体还包括彻底的人抗体。按照Boerner等，1991，J.Immunol.147：86-95所述，使用体外-致敏的人脾细胞，或者按照例如美国专利6,300,064所述，使用噬菌体展示的抗体文库，即可制备这种彻底的人抗体。
或者，按照Persson等，1991，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 88：2432-2436以及Huang和Stollar，1991，J.Immunol.Methods 141：227-236所述，通过所有组成成分克隆来制备彻底的人抗体。另外，美国专利5,798,230(1998年8月25日)描述了由人B细胞制备人单克隆抗体，其中通过用表达无限增殖化所需蛋白质Epstein-Barr病毒核抗原2(EBNA2)的Epstein-Barr病毒或其衍生物进行感染，使产生人抗体的B细胞无限增殖化。随后关闭EBNA2功能，导致抗体产量增加。
其它一些产生彻底人抗体的方法包括使用非人动物，所述动物具有灭活的内源性Ig基因座，并且转入了未重排的人抗体重链和轻链基因。可用α1β1免疫这种转基因动物，然后由得自该动物的B细胞制备杂交瘤。这些方法描述于例如与含有人Ig小基因座的转基因小鼠有关的多篇GenPharm/Medarex(Palo Alto，CA)出版物/专利(例如Lonberg美国专利5,789,650)；与XENOMICE有关的多篇Abgenix(Fremont，CA)出版物/专利(例如Kucherlapati美国专利6,075,181、6,150,584和6,162,963；Green等，1994，Nature Genetics 7：13-21；和Mendez等，1997，Nature Genetics 15(2)：146-56)；和与“transomic”小鼠有关的多篇Kirin(日本)出版物/专利(例如EP 843 961和Tomizuka等，1997，Nature Genetics 16：133-1443)。
V.人源化抗体
本发明的单克隆抗体还包括得自其它物种的相关抗-α1β1抗体的人源化形式。人源化抗体是通过重组DNA技术产生的抗体，其中，不是抗原结合所必需的人免疫球蛋白轻链或重链中的一些或全部氨基酸(例如恒定区和可变区的构架区)被用于取代相关非人抗体之轻链或重链的相应氨基酸。例如，抗给定抗原的人源化鼠抗体在其重链和轻链上具有(1)人抗体的恒定区；(2)人抗体可变区的构架区；和(3)鼠抗体的CDR。必要时，可将人构架区中的一个或多个残基变为鼠抗体相应位置的残基，以保留人源化抗体对抗原的结合亲和性。这一改变有时被称为“回复突变”。与嵌合人抗体相比，人源化抗体一般不太可能引发人的免疫应答，原因是前者含有的非人组分要少得多。
制备人源化抗体的方法描述于例如Winter EP 239 400；Jones等，1986，Nature 321：522-525；Riechmann等，1988，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等，1988，Science 239：1534-1536；Queen等，1989，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86：10029；美国专利6,180,370；和Orlandi等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：3833。一般说来，按下述将鼠(或其它非人)CDR移植至人抗体上。从杂交瘤中分离编码重链和轻链可变区的cDNA。通过测序测定可变区，包括CDR的DNA序列。通过定点诱变将编码CDR的DNA转移至人抗体重链或轻链可变区编码序列的相应区域。然后添加所需同种型的人恒定区基因区段(例如对CH而言为γ1，对CL而言为κ)。在哺乳动物宿主细胞(例如CHO或NSO细胞)中共表达人源化重链和轻链基因，以产生可溶性的人源化抗体。为了便于大规模生产抗体，经常需要在含有可表达抗体之细胞的生物反应器中生产这种人源化抗体，或者需要生产能在乳汁中表达抗体的转基因哺乳动物(例如山羊，奶牛或绵羊)(参见例如美国专利5,827,690)。
有时，将CDR直接转移至人构架会使所得抗体的抗原-结合亲和性受损。这是因为：在一些相关抗体中，构架区内的某些氨基酸与CDR相互作用，因此会影响抗体的整体抗原结合亲和性。在这种情况下，必需在受体抗体的构架区中导入“回复突变”(文献同上)，以保留相关抗体的抗原-结合活性。
制备回复突变的一般方法是本领域已知的。例如，Queen等(文献同上)，Co等，1991，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 88：2869-2873，和WO90/07861(Protein Design Labs Inc.)描述了包括两个关键性步骤的方法。第一步：通过用计算机分析与相关鼠抗体的V区域构架的最佳蛋白质序列同源性来选择人V构架区。然后，通过计算机制作鼠V区域的三级结构模型，以显示可能会与鼠CDR相互作用的构架氨基酸残基，然后将这些鼠氨基酸残基加在同源的人构架上。
在该两-步法中，有几个设计人源化抗体的标准。第一个标准是：将特定人免疫球蛋白的构架用作人受体，其中所述免疫球蛋白通常与非人供体免疫球蛋白同源；或者使用很多人抗体的共有构架。第二个标准是：如果人受体残基是不常见的，而特定构架残基处的供体残基对于人序列而言是有代表性的，则使用供体氨基酸而不是受体氨基酸。第三个标准是：在与CDR紧邻的位置，使用供体构架氨基酸残基，而不是受体构架氨基酸残基。
也可以使用不同的方法，其描述于例如Tempest，1991，Biotechnology 9：266-271。在此方法中，将分别得自NEWM和RE1重链和轻链的V区域构架用于CDR-移植，根本未导入鼠残基。使用该方法的优点是已从X-射线晶体学中了解到NEWM和RE1可变区的三维结构，因此可以容易地制作CDR和V区域构架残基之间的特异性相互作用的模型。
VI.其它组成成分
本发明的单克隆抗体还可包括其它组成成分以行使所需功能。例如，抗体可包括毒素组成成分(例如破伤风类毒素或蓖麻毒蛋白)或放射性核素(如111In或90Y)，以杀死抗体靶向的细胞(参见例如美国专利6,307,026)。为了易于分离或检测，抗体可包括组成成分(如生物素，荧光组成成分，放射性组成成分，组氨酸标记或其它肽标记)。抗体还可包括能延长其血清半寿期的组成成分，例如聚乙二醇(PEG)组成成分和免疫球蛋白超家族的成员或其片段(例如人IgG1重链恒定区的一部分，如绞链区，CH2和CH3区域)。
VII.可结晶的组合物和晶体
本发明还提供了含有下述物质的复合物的可结晶组合物：(1)大鼠-人嵌合α1-I结构域(如突变的RΔH)或其部分(例如包括大鼠-人嵌合α1-I结构域的135至336个氨基酸的多肽)；和(2)hAQC2的Fab片段或其部分(例如包括轻链的3至213个氨基酸的多肽和/或包括重链的3至219个氨基酸的多肽)。图20显示了例举的复合物。RΔH α1-I结构域可包括例如大鼠α1亚单位的氨基酸残基145至336(晶体编号)(SEQ ID NO：59，见下文)。hAQC2 Fab片段可包括SEQ ID NO：3的轻链氨基酸残基1至106(如1-213)和SEQ ID NO：4的重链氨基酸残基1至118(如1-219)。hAQC2 Fab片段可通过用木瓜蛋白酶消化完整的抗体来获得，或者通过重组方法来制备。Fab片段至少包括hAQC2轻链和/或重链可变区的抗原-结合部分。
145 TQLDIV
151 IVLDGSNSIY PWESVIAFLN DLLKRMDIGP KQTQVGIVQY
191 GENVTHEFNL NKYSSTEEVL VAANKIVQRG GRQTMTALGI
231 DTARKEAFTE ARGARRGVKK VMVIVTDGES HDNYRLKQVI
271 QDCEDENIQR FSIAILGHYN RGNLSTEKFV EEIKSIASEP
311 TEKHFFNVSD ELALVTIVKA LGERIF
(SEQ ID NO：59)
本发明的一些可结晶组合物和晶体可含有在氨基酸序列或三维结构水平上与α1-I结构域和/或hAQC2 Fab片段同源的分子或分子复合物。同系物的例子包括但不限于：具有突变，如保守取代、添加、缺失或其组合的α1-I结构域和/或hAQC2 Fab片段。“保守取代”指的是替代残基在大小、形状、疏水性、电荷和/或化学特性上与相应的参照残基类似。鉴定“相应”氨基酸的方法是本领域已知的，当与本发明所提供的晶体结构相比较时，所述方法基于序列、结构比对、其功能性位置或其组合。例如，可通过使用众所周知的应用软件，如QUANTA(Molecular Simulations，Inc.，San Diego，CA_1998，2000)，在α1-I结构域/hAQC2复合物以及α1-I结构域和/或hAQC2同系物中添加氨基酸的主链原子，从而鉴定出相应的氨基酸。也可使用序列比对程序，如可得自Genetics Computer Group的“bestfit”程序来鉴定相应的氨基酸，所述程序使用了Smith和Waterman在Adv.Appl.Math.2：482(1981)中描述的局部同源性算法。
本发明的可结晶组合物还可包括一个或多个能促进结晶和/或适合结晶条件的组分。所述组分包括但不限于缓冲液、盐、沉淀剂和其它试剂。一个组分可以是30％重量/体积的聚乙二醇1500(PEG1500)。
本发明还提供了由可结晶的组合物制备晶体的方法，所述组合物包括α1-I结构域和hAQC2的抗原-结合部分(如Fab，Fab’或其它片段，文献同上)的复合物。本发明可以使用多种结晶技术，包括但不限于蒸发-扩散、透析、微批量(microbatch)、批量(batch)和液体-液体扩散。蒸发扩散法包括但不限于sitting-drop、hanging-drop和sandwich-drop技术。蒸发-扩散法可利用一些技术来控制结晶速率，例如在液滴或储存溶液上加入油。结晶方法可包括使含有沉淀剂的储存溶液与α1-I结构域和hAQC2的抗原-结合部分的复合物的水溶液混合，以产生可结晶组合物。然后使用多种上述技术使混合物或可结晶组合物结晶。本发明的可结晶组合物可以是α1-I结构域和hAQC2的抗原-结合部分的复合物的水溶液，所述水溶液含有浓度约为1至50mg/mL的复合物，如浓度约为5至15mg/mL(如11mg/mL)的复合物。
VIII.晶体结构和结构坐标
本发明还以2.8_的分辨率提供了包括突变的RΔH和hAQC2 Fab片段之复合物的晶体的三维结构(实施例24，见下文)。使用本文所述和本领域已知的技术，也可测定其它相关晶体的三维结构。该复合物的三维结构由图19所示的一组结构坐标来限定。这些结构坐标是由数学等式获得的Cartesian原子坐标，所述等式与经过α1-I结构域和hAQC2 Fab片段的晶体复合物的原子或散射中心旁边的X-射线单色光束衍射所获得的图形相关。先用衍射数据计算晶体重复单位的电子密度图。然后用电子密度图确定复合物各个原子的位置。
本发明提供了由图19所示的所有氨基酸的全部或部分结构坐标所限定的分子或分子复合物，以及该分子或分子复合物的同系物，其中同系物与这些氨基酸主链原子的均方根误差为0.00_至0.65_，如0.00_至0.60_(如0.00_至0.50_)。术语“均方根误差”指的是与平均值的误差的平方的算术平均数的平方根。也可以表示与倾向或物体的误差或差异。在本发明中，“均方根误差”或“均方根位置误差”定义的是：蛋白质主链与本文所述结构坐标所定义的多肽主链的相关部分的误差。
本发明的分子或分子复合物也可包括由hAQC2 Fab片段的至少7个氨基酸的结构坐标(图19)所定义的结合位点，所述氨基酸选自轻链残基Asn30，Tyr48，Trp90，Ser91，Asn93和Trp95，以及重链残基Ser30，Arg31，Trp47，Ser52，Gly53，His56，Tyr58，Phe99，Gly100和Asp101(晶体编号)；或者，本发明还包括分子或分子复合物的同系物，其中同系物也包括结合位点，所述位点与一个或多个这些氨基酸的主链原子的均方根误差为0.00_至1.10_，如0.00_至1.00_(如0.00_至0.50_)。本文所用术语“结合位点”指的是因其形状和电荷而有利于与另一个化学个体结合的分子或分子复合物区域。术语“位点”包括但不限于沟、裂、槽或袋。例如，α1-I结构域上的结合位点包括胶原-结合位点(Emsley等，1997，文献同上)，抗体-结合位点和别构(或IDAS)结合位点(Huth等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97：5231-5236)。术语“化学个体”包括但不限于任何分子，分子复合物，化合物或其片段。术语“与......结合”指的是在靠近的条件下，化学个体或其部分与蛋白质上的结合袋或结合位点之间的结合。结合可以是非共价结合，其中并列在能量上有利于氢键或范得华力或静电作用，结合也可以是共价结合。
本发明的分子或分子复合物包括由α1-I结构域氨基酸的结构坐标(图19)所定义的结合位点，所述氨基酸选自Asp154，Ser156，Asn157，Ser158，Tyr160，Glu192，Gln218，Arg219，Gly220，Gly221，Arg222，Gln223，Thr224，Asp257，His261，Asn263，Arg291和Leu294(晶体编号)；或者，本发明还包括分子或分子复合物的同系物，其中同系物包括与α1-I结构域氨基酸的主链原子的均方根误差为0.00_至0.92_的结合位点。
本发明的分子或分子复合物包括由α1-I结构域氨基酸的结构坐标(图19)所定义的结合位点，所述氨基酸选自Glu192，Gln218，Arg219，Gly220和Gly221(晶体编号)；或者，本发明还包括分子或分子复合物的同系物，其中同系物包括与α1-I结构域氨基酸的主链原子的均方根误差为0.00_至0.30_的结合位点。
本领域技术人员应懂得一组多肽结构坐标是在三维空间上确定形状的相对的一组点。因此，对图19中的结构坐标进行数学操作可能会产生能限定类似或相同形状的完全不同的一组坐标。例如，通过对结构坐标进行晶体学排列，对结构坐标进行分级，对多组结构坐标进行整数加减，反演结构坐标或其任意组合，即可对结构坐标进行操作。另外，各个坐标中的微小差别对整体形状没什么影响。
或者，因构成晶体的任何多肽组分(如hAQC2 Fab片段或α1-I结构域)中的突变，如添加、取代和/或缺失氨基酸或其它变化而导致的晶体结构修饰也会导致结构坐标的变化。如果与原始坐标相比，所述变化处于可接受的标准误差范围内，可以认为所得三维形状与未经修饰的晶体相同。
因此，必需测定个体是否与本文所述的全部或部分结构足够类似以致于可以认为两者是相同的。使用目前所使用的应用软件，如QUANTA(Accelrys，Inc.and Molecular Simulations，Inc.，San Diego，CA(_1998，2000)和O(Jones等，1991，Acta Gast.A47：110-119)及其所附的用户手册即可进行这种分析。QUANTA的分子相似性应用和O的LSQ应用能够比较不同的结构，相同结构的不同构象以及相同结构的不同部分。这两个应用中使用的一般性方法是输入待比较的结构，确定这些结构中等效原子的位置，进行符合性操作并分析结果。
当将每个结构输入应用软件时，所述结构会获得一个名称，并被鉴定为固定的结构或可动的结构。对于所比较的两个结构之间的所有保守残基而言，通常用等效原子，如蛋白质主链原子(N，Cα，C和O)来定义原子等效性。平移并旋转可动的结构以获得与固定结构的最佳或最小-二乘方符合。这两个程序以埃为单位报道了与特定等效原子对符合性的均方根误差。
对于本发明而言，加入到图19所示结构坐标所描述的相关主链原子上时，保守残基主链原子(N，Cα，C和O)的均方根误差为0.00_至1.50_，如0.00_至1.00_(如0.00_至0.50_)的任何分子复合物都被认为是相同的。
IX.测定其它晶体结构
也可使用图19所示的结构坐标来辅助获得另一个结晶分子个体，如另一个在一个CDR中含有氨基酸取代的hAQC2的结构信息。通过任何众所周知的技术，包括分子替代都可达到此目的，分子替代是一种特别有用的方法，它可测定α1-I结构域/Fab突变体和同系物的结构。
也可使用图19所示的结构坐标来测定分子个体的至少一部分三维结构，所述分子个体至少含有一些与α1-I结构域或hAQC2 Fab的至少一部分相类似的结构特征。因此，本发明的另一个实施方案提供了利用分子替代获得具有未知结构的结晶分子或分子复合物的结构信息的方法，所述方法包括步骤：(a)由结晶分子或分子复合物产生X-射线衍射图形；和(b)将图19所示的至少一部分结构坐标应用于X-射线衍射图形以产生具有未知结构的分子或分子复合物的三维电子密度图。
通过使用分子替代，可以利用图19所示的全部或部分结构坐标，相对于从头开始测定结构信息而言，更快速而有效地测定结晶分子个体的未知结构。分子替代能够准确估计未知结构的相位。相位是解析不能被直接测定的晶体结构所用等式中的因数。通过除分子替代以外的方法获得相位的准确值经常是费时的方法，其包括重复循环地略计和精确化，严重阻碍了晶体结构的解析。然而，当至少含有同源部分的蛋白质的晶体结构已被解析时，已知结构的相位经常可提供对未知结构相位的令人满意的估计。
因此，分子替代包括通过将根据图19的复合物的相关部分定向和定位至未知分子或分子复合物晶体的单位晶胞内，以最佳地导致所观察到的未知结构的分子或分子复合物晶体的X-射线衍射图形，从而产生未知结构坐标的分子或分子复合物的初步模型。然后由此模型计算相位，与所观察到的X-射线衍射图形振幅组合，产生未知坐标之结构的电子密度图。反过来，可以对其进行任何众所周知的模型建立和结构精确化技术，以提供未知结晶分子或分子复合物的最终精确结构(Lattman，1985，Meth.Enzymol.115：55-77；Rossmann编，“The Molecular Replacement Method”，Int.Sci.Rev.Ser.，No.13，Gordon & Breach，New York，1972)。通过此方法可以解析与α1-I结构域和/或hAQC2 Fab片段(图19)的任何部分足够同源的任何结晶分子或分子复合物的任何部分的结构。
X.计算机和存储介质
为了使用本发明的结构坐标，例如图19所示的结构坐标，通常需要将坐标转变为三维图像或形状。可商购的作图软件程序包括但不限于O(Jones等，1991，Acta Cryst.A47：110-119)和INSIGHTII(Accelrys，Inc.andMolecular Simulations，Inc.，San Diego，CA)，这些程序能由一组结构坐标产生分子或分子复合物或其部分的三维图像。
根据本发明，将本发明的分子个体的结构坐标存储于机器(如计算机)可读的存储介质中。使用计算机和适当的软件，可将所述数据用于多种目的，如寻找药物和对其它蛋白质晶体进行X-射线晶体学分析。
因此，机器-可读的数据存储介质包括由机器-可读数据编码的数据存储材料，所述数据包括图19所示结构坐标的至少一部分。计算机可进一步包括通过处理本发明的机器-可读数据而产生α1-I结构域和hAQC2 Fab片段分子复合物的三维图像的指令。本发明的计算机还可包括显示器，即显示用的图像界面，或用于移动和操作结构坐标的三维图像的输入装置。
本发明还提供了用于测定对应于X-射线衍射数据的至少部分结构坐标的计算机，所述衍射数据得自α1β1整联蛋白和hAQC2抗体的Fab片段的分子复合物，其中计算机包括机器-可读的数据存储介质，所述介质包括由机器-可读数据编码的数据存储材料，其中数据包括根据图19的α1-I结构域和hAQC2 Fab片段分子复合物的至少部分结构坐标，或得自晶体分子复合物的X-射线衍射数据。计算机还包括对机器可读的坐标数据进行Fourier转化的指令，和将机器可读的衍射数据处理为结构坐标的指令。计算机还可包括处理机器-可读数据的存储指令所用的工作存储器；与工作存储器和机器-可读数据相连接的中央处理部件；以及还任选包括与中央处理部件相连接、用于显示分子或分子复合物结构坐标的三维图像的图像界面或显示器。
本发明还提供了能产生分子或分子复合物，或分子或分子复合物同系物的三维图像的计算机，其中由图19所示的全部α1-I结构域和hAQC2 Fab片段氨基酸的至少部分或全部结构坐标来定义所述分子或分子复合物，其中所述同系物与氨基酸主链原子的均方根误差为0.00_至1.50_，如0.00_至1.00_，(如0.00_至0.50_)。另外，在本发明中，计算机包括机器-可读数据存储介质，所述介质包括由机器-可读数据编码的数据存储材料，其中数据包括图19所示的全部α1-I结构域和hAQC2 Fab片段氨基酸的至少部分或全部结构坐标。
本发明还提供了能产生包括结合位点的分子或分子复合物，或分子或分子复合物同系物的三维图像的计算机。其中由hAQC2 Fab片段的至少7个氨基酸的结构坐标(图19)来定义结合位点，所述氨基酸选自轻链残基Asn30，Tyr48，Trp90，Ser91，Asn93和Trp95，以及重链残基Ser30，Arg31，Trp47，Ser52，Gly53，His56，Tyr58，Phe99，Gly100和Asp101(晶体编号)。其中同系物的结合位点与hAQC2 Fab片段至少一个氨基酸的主链原子的均方根误差为0.00_至1.10_，如0.00_至1.00_，(如0.00_至0.50_)。另外，本发明的计算机包括机器-可读数据存储介质，所述介质包括由机器-可读数据编码的数据存储材料，其中数据包括hAQC2 Fab片段的至少7个氨基酸的结构坐标(图19)，所述氨基酸选自轻链残基Asn30，Tyr48，Trp90，Ser91，Asn93和Trp95，以及重链残基Ser30，Arg31，Trp47，Ser52，Gly53，His56，Tyr58，Phe99，Gly100和Asp101(晶体编号)。
本发明还提供了能产生包括结合位点的分子或分子复合物，或分子或分子复合物同系物的三维图像的计算机。其中由I结构域氨基酸的结构坐标(图19)来定义结合位点，所述氨基酸选自残基Asp154，Ser156，Asn157，Ser158，Tyr160，Glu192，Gln218，Arg219，Gly220，Gly221，Arg222，Gln223，Thr224，Asp257，His261，Asn263，Arg291和Leu294(晶体编号)。其中同系物的结合位点与I结构域氨基酸的主链原子的均方根误差为0.00_至0.92_。另外，在本发明中，计算机包括机器-可读数据存储介质，所述介质包括由机器-可读数据编码的数据存储材料，其中数据包括I结构域氨基酸的结构坐标(图19)，所述氨基酸选自残基Asp154，Ser156，Asn157，Ser158，Tyr160，Glu192，Gln218，Arg219，Gly220，Gly221，Arg222，Gln223，Thr224，Asp257，His261，Asn263，Arg291和Leu294(晶体编号)。
本发明还提供了能产生包括结合位点的分子或分子复合物，或分子或分子复合物同系物的三维图像的计算机。其中由I结构域氨基酸的结构坐标(图19)来定义结合位点，所述氨基酸选自残基Glu192，Gln218，Arg219，Gly220和Gly221(晶体编号)。其中同系物的结合位点与I结构域氨基酸的主链原子的均方根误差为0.00_至0.30_。另外，在本发明中，计算机包括机器-可读数据存储介质，所述介质包括由机器-可读数据编码的数据存储材料，其中数据包括I结构域氨基酸的结构坐标(图19)，所述氨基酸选自残基Glu192，Gln218，Arg219，Gly220和Gly221(晶体编号)。
图21阐明了一个此类实施方案。系统10包括计算机11，其中包括中央-处理部件(“CPU”)20，可以是例如RAM(随机-存取的存储器)或“磁心”存储器的工作存储器22，大容量存储器24(例如一个或多个磁盘或磁带驱动器或CD-ROM或DVD-ROM驱动器)，一个或多个阴极射线管(“CRT”)显示器终端26，一个或多个键盘28，一根或多根输入线30和一根或多根输出线40，所有这些部件都通过常规的双向系统总线50来进行内部连接。
可以以多种方法来提供通过输入线30与计算机11连接的输入硬件36。通过使用经由电话线或所示数据线34连接的调制解调器32，即可输入本发明的机器-可读数据。或者或另外，输入硬件36可包括CD-ROM或DVD-ROM驱动器或磁带或磁盘驱动器24。与显示器终端26连接后，键盘28也可用作输入装置。
类似地，也可以通过常规的装置提供通过输出线40与计算机11连接的输出硬件46。例如，输出硬件46可包括CRT显示器终端26，用于按本文所述，使用如QUANTA的程序显示本发明结合位点的图像。输出硬件也可以包括打印机42，以产生复印文本输出，或者还可包括磁盘驱动器24以存储系统输出供以后使用。
在操作中，CPU20协同使用多个输入和输出装置36，46，协调从大容量存储器24中的数据读取和从工作存储器22中的数据存取，并确定数据处理步骤的顺序。可以使用多个程序来处理本发明的机器-可读数据。根据本文所述的通过计算机寻找药物的方法来讨论这些程序。在下文描述数据存储介质时，在适当的地方会特别地提到硬件系统10的组分。
图22显示了磁性数据存储介质100的横切面，所述介质可由机器-可读数据编码，所述数据可由系统，如图21的系统10来运行。介质100可以是具有适当基片101(可以是常规的)和在一侧或两侧具有适当涂层102(可以是常规的)的常规软盘或硬盘，所述涂层含有磁性区域(看不见)，其极性或方向可以被磁力改变。介质100也可以具有开口(未显示)以接受磁盘驱动器或其它数据存储装置24的轴。
介质100的涂层102的磁性区域被极化或定向，从而以常规的方式编码如本文所述的机器可读数据，供系统，如图21的系统10来运行。
图23显示了光学-可读数据存储介质110的横切面，所述介质也可由能被系统，如图21的系统10来运行的机器-可读数据或一组指令来编码。介质110可以是常规的小型磁盘或DVD磁盘只读存储器(CD-ROM或DVD-ROM)或可重写介质，如在光下可读和在磁-光下可写的磁-光盘。介质100可以具有适当的基片111(可以是常规的)，通常在基片111的一侧具有适当的涂层112(可以是常规的)。
众所周知，对于CD-ROM而言，涂层112是可反射的，上面刻有多个凹槽113以编码机器-可读数据。通过从涂层112的表面反射激光，读出凹槽的排布。在涂层112的上方还有基本上为透明的保护性涂层114。
众所周知，对于磁-光盘而言，涂层112不具有凹槽113，但具有多个磁性区域，当被激光加热至某个温度以上时，所述区域的极性或方向可以被磁力改变(未显示)。通过测定由涂层112反射的激光的极化，可以读出该区域的方向。该区域的排布编码上文所述的数据。
XI.合理的药物设计
本发明允许使用基于结构的合理的药物设计技术来设计、选择和合成或分离化学个体，如α1-I结构域的抑制剂，或者改良该结构域的已知抑制剂。这些抑制剂能阻断VLA-1的胶原-结合位点。本发明还允许使用基于结构的合理的药物设计技术来设计可用作胶原结合抑制剂的变体。
可以在实验室或计算机上使用本发明的三维图像以设计能够与本发明的hAQC2 Fab片段或嵌合α1-I结构域结合，并影响其生物学功能的潜在抑制剂，其它化学个体，Fab片段的变体或化学个体的组合。
本领域技术人员可以使用几种方法中的一种来筛选能够与本发明的hAQC2 Fab片段或嵌合α1-I结构域的复合物结合的化学个体，更具体地，筛选出具有I结构域或Fab片段的结合位点的化学个体。该方法的起始步骤是：基于图19中复合物的坐标，在计算机屏幕上观察例如I结构域或Fab片段的结合位点。然后在多个方向上定位选定的化学个体，或将其挂靠在I结构域或Fab片段的各个结合位点内。使用如QUANTA的软件，接着使用能进行能量最小化和具有标准分子力学力场的分子动力学分析的软件，如CHARMM(Molecular Simulations，Inc.，Burlington，MA_1994)和AMBER(P.A.Kollman，University of California at San Francisco，_1994)，即可完成挂靠。
专业化的计算机程序也有助于选择化学个体的过程。这些程序特别地包括：
1.GRID(Goodford，P.J.，1985，J.Med.Chem.28：849-857)。GRID可得自英国牛津的牛津大学。
2.MCSS(Miranker，A.and M.Karplus，1991，Proteins：Structure，Functionand Genetics 11：29-34)。MCSS可得自Molecular Simulations，Burlington，MA。
3.AUTODOCK(Goodsell，D.S.and A.J.Olsen，1990，Proteins：Structure，Function，and Genetics 8：195-202)。AUTODOCK可得自Scripps ResearchInstitute，La Jolla，CA。
4.DOCK(Kuntz，I.D等，1982，J.Mol.Biol.161：269-288)。DOCK可得自University of California，San Francisco，CA。
一旦选择出适当的化学个体，可将它们组装成单个的化合物。通过根据hAQC2 Fab片段和嵌合α1-I结构域的复合物的结构坐标，在计算机屏幕显示的三维图像上观察化学个体彼此之间的关系，即可进行组装。然后使用如Quanta或Sybyl的软件人工建立模型。
对于可与α1-I结构域结合的化合物或变体，可以类似的方式进行上述针对化学个体的评价过程。
有助于本领域技术人员联系各个化学个体的有用程序包括：
1.CAVEAT(Bartlett，P.A等，“CAVEAT：A Program to Facilitate theStructure-Derived Design of Biologically Active Molecules”。In“MolecularRecognition in Chemical and Biological Problems”，Special Pub.，1989，RoyalChem.Soc.，78：182-196)。CAVEAT可得自University of California，Berkeley，CA。
2.3D数据库系统，如MACCS-3D(MDL Information Systems，SanLeandro，CA)。有关该领域的评述可参见Martin，Y.C.，1992，J.Med.Chem.35：2145-2154。
3.HOOK(可得自Molecular Simulations，Burlington，MA)。
使用空结合位点(如α1-I结构域或hAQC2 Fab片段的结合位点)或任选包括已知α1-I结构域或hAQC2 Fab片段结合化合物的某些部分的结合位点，作为整体或“从头”设计结合化合物，而不是按上文所述，以一次一个化学个体的逐步方式组建抑制剂或结合化合物。这些方法包括：
1.LUDI(Bohm，H.-J.，1992，J.Comp.Aid.Molec.Design 6：61-78).LUDI可得自Biosym Technologies，San Diego，CA。
2.LEGEND(Nishibata，Y.and A.Itai，1991，Tetrahedron 47：8985)。LEGEND可得自Molecular Simulations，Burlington，MA。
3.LeapFrog(可得自Tripos Associates，St.Louis，MO)。
本发明还可使用其它制作分子模型的技术。参见例如Cohen，N.C等，1990，J Med.Chem.33：883-894。也可参见Navia，M.A.和M.A.Murcko，1992，Curr.Opin.Struct.Biol.2：202-210。
一旦通过上述方法设计或选择出化学个体，可通过计算机评价检测和优化该个体与α1-I结构域或hAQC2 Fab片段结合的效力。例如，当经设计或选择可用作α1-I结构域结合化合物的化合物与嵌合α1-I结构域结合时，所述化合物可以横跨被结合位点占据的不重叠体积。有效的α1-I结构域结合化合物的结合态和游离态相比，存在相对较小的能量差异(即结合的小的变形能量)。因此，最有效的α1-I结构域结合化合物应被设计为结合的变形能量不超过约10kcal/mole，如不超过7kcal/mole。α1-I结构域结合化合物可以以一种以上整体结合能量类似的构象与α1-I结构域相互作用。在这种情况下，结合的变形能量被认为是游离化合物的能量与化合物结合蛋白质时所观察到的构象的平均能量之间的差异。
可以用计算机进一步优化经设计或选择可与α1-I结构域结合的化合物，使得其结合态缺乏与靶蛋白质的排斥性静电作用。这种非-互补(如静电)作用包括排斥的电荷-电荷，偶极-偶极和电荷-偶极相互作用。具体地，当化合物与α1-I结构域结合时，化合物和蛋白质之间所有静电作用的总和应对结合焓作出中性的或有利的贡献。
可以使用本领域的特定计算机软件来评价化合物变形能量和静电作用。为此所设计的程序的例子包括：Gaussian 92，revision C(M.J.Frisch，Gaussian，Inc.，Pittsburgh，PA_1992)；AMBER，version 4.0(P.A.Kollman，University of California at San Francisco，_1994)；QUANTA/CHARMM(Molecular Simulations，Inc.，Burlington，MA_1994)；和Insight II/Discover(Biosysm Technologies Inc.，San Diego，CA_1994)。例如，可以使用SiliconGraphics工作站运行这些程序。其它硬件系统和软件包是本领域技术人员已知的。
本发明实施的一个其它的有用药物设计技术是重复药物设计。重复药物设计是通过测定和评价连续多组蛋白质/化合物复合物的三维结构，以最优化蛋白质和化合物(该化合物包括抗体)之间的结合的方法。在重复药物设计中，获得了一系列与化学个体复合的蛋白质的晶体，所述个体与蛋白质结合，然后确定每个分子复合物的三维结构。所述方法可以洞悉每个复合物的蛋白质和其它化学个体之间的结合。通过选择具有抑制活性的化学个体，获得这些新复合物的晶体，确定复合物的三维结构，并在新复合物和以前分析的复合物之间比较结合，即可达到此目的。通过观察复合物组分中的变化是如何影响结合的，即可最优化复合物内的结合。
在某些情况下，通过形成连续的复合物，然后结晶每个新的复合物来进行重复药物设计。或者，使预先形成的蛋白质晶体与另一种化学个体同时存在，从而形成复合物，而不必结晶每一种复合物。
XII.药物组合物
本发明的药物组合物含有一种或多种本发明的VLA-1拮抗剂(如抗VLA-1抗体和通过上述合理的药物设计方法鉴定的小分子VLA-1拮抗剂)或其药物可接受的衍生物。所述组合物还可含有可药用载体，如佐剂、载体、缓冲液和稳定剂。
本发明的药物组合物的给药方式有：口服、局部、静脉内、皮下、腹膜内、肌内、髓内、动脉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、脊柱内、(必要时)颅内，或仅局部施用于炎症或肿瘤生长位点。也可通过使用例如喷雾器、干粉吸入器或计量吸入器吸入，或者通过在受试者体内植入输注泵或生物相容性缓释植入物来施用本发明的药物组合物。
药物组合物可以是无菌的可注射制品的形式，例如，无菌的可注射水性或油脂性悬浮液。可根据本领域已知的技术，使用适当的分散剂、湿润剂和悬浮剂来配制该悬浮液。如果需口服，可以胶囊、片剂、含水悬浮液或溶液的形式施用药物组合物。如果是局部用药，可在适当的软膏中配制药物组合物。
能有效产生所需效果的本发明VLA-1拮抗剂的剂量和量率取决于多个因素，如待治疗疾病的特性，受试者体形的大小、治疗的目的、所用的特定药物组合物和治疗医师的判断。有用的剂量水平为每天约0.001至约100mg活性成分化合物/kg体重，例如，每天约0.1至约50mg活性成分化合物/kg体重。例如，可以约0.01mg/kg体重/天至约20mg/kg体重/天，例如约0.1mg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天的剂量范围，以每1至14天的间隔施用本发明的抗体。在另一个实施方案中，当腹膜内给药时，以约0.3至1mg/kg体重的剂量施用抗体。在另一个实施方案中，当静脉内给药时，以约5至12.5mg/kg体重的剂量施用抗体。在一个实施方案中，以能有效提供至少为1mg/ml的血浆抗体水平的量施用抗体组合物。
XIII.患病的状况和动物模型
本发明的VLA-1拮抗剂可用于治疗，包括预防α1β1-介导的疾病，如上文所述的那些疾病。本发明的治疗对受这些疾病影响的人和动物受试者都有效。本发明适用的动物受试者延及作为宠物或因商业目的而饲养的家畜。例如狗、猫、牛、马、绵羊、猪和山羊。
可在多种动物模型中检测本发明VLA-1拮抗剂的效力。例如，有用的牛皮癣和关节炎模型包括WO00/72881中描述的模型。肾纤维变性模型包括WO99/61040中描述的模型，Alport综合征肾模型描述于Cosgrove等，2000，Am.J.Path.157：1649-1659，狼疮肾炎的SNF1小鼠模型描述于Kalled等，2001，Lupus 10：9-22。再狭窄的血管纤维变性模型包括Smith等，1999，Circ.Res.84：1212-1222中描述的大鼠颈动脉囊损伤模型。自发性肺纤维变性和与硬皮病-相关的肺纤维变性的肺纤维变性模型包括Wang等，1999，Thorax54：805-812描述的博来霉素-诱导的肺纤维变性模型。丙型肝炎-或酒精-诱导的肝硬化的肝硬化模型包括George等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：12719-12724描述的胆小管连接模型和Shi等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：10663-10668描述的CCL4-诱导的肝纤维变性模型。
通过多种可利用的诊断工具，包括身体检查、血液检测、蛋白尿测定、肌酸酐水平和肌酸酐清除肺功能检测、胸部X-射线、支气管镜、支气管肺泡灌洗、肺活检、血浆血尿氮(BUN)水平、对瘢痕形成或纤维变性损害以及胞外基质(如胶原、平滑肌肌动蛋白和纤连蛋白)沉积进行观察和评分、肾功能检测、超声波、磁共振显像(MRI)和CT扫描。
XIV.诊断方法
可以使用本发明的抗体诊断与α1β1表达水平改变有关的疾病。可以在使用抗体的抗原捕获试验、ELISA、免疫组化试验等中检测取自受试者的组织样品，如组织活检样品。体液样品或灌洗液(例如肺泡灌洗液)。将取自正常个体的组织样品用作对照。
除非另有说明，本发明的实际操作会利用本领域技术人员熟知的常规细胞生物学、细胞培养、分子生物学、微生物学、重组DNA、蛋白质化学和免疫学技术。所述技术描述于文献中。参见例如Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd edition(Sambrook等编)，1989；OligonucleotideSynthesis，(M.J.Gait编)，1984；Mullis等的美国专利4,683,195；Nucleic AcidHybridization，(B.D.Hames and S.J.Higgins)，1984；Transcription andTranslation，(B.D.Hames and S.J.Higgins)，1984；Culture of Animal Cells(R.I.Freshney，Ed.)，1987；Immobilized cells and Enzymes，IRL Press，1986；APractical Guide to Molecular Cloning(B.Perbal)，1984；Methods in Enzymology，Volumes 154和155(Wu等编)，Academic Press，New York；Gene TransferVectors for Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos编)，1987；Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Mayer and Walker编)，1987；Handbook of Experiment Immunology，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell编)，1986；Manipulating the Mouse Embryo，1986。
除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的相同。下文举例描述了方法和材料，但在本发明的实际应用或检测中，也可以使用与本文所述方法和材料类似或等效的方法和材料。本文所提及的所有出版物和其它参考文献都全文列入本文作为参考。当有不一致的地方时，以本说明书，包括其中的定义为准。材料、方法和实施例仅是为了阐明而不是限制本发明。在本说明书和权利要求书中，“包含”或其变体，如“含有”应被理解为暗指包括所提及的整数或一组整数，但不排除任何其它整数或一组整数。
提供下述实施例是为了阐明本发明，而不应将其理解为限制本发明。
实施例
化学试剂
异硫氰酸荧光素(FITC)购自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。巴豆油购自ICN Biochemicals(Aurora，OH)。保存于Alsevers溶液中的绵羊全血得自East Acres Biologicals(South-bridge，MA)。I型大鼠尾胶原和IV型小鼠胶原分别购自Collaborative Research Inc.(Bedford，MA)和Gibco(Gaither-sburg，MD)。
6-8周龄的Balb/c雌性小鼠购自Taconic(Germantown，NY)，Balb/c背景上的α1β1整联蛋白-缺损小鼠如前所述(3)。
实施例1
单克隆抗体。以无叠氮化物和低内毒素的形式制备抗鼠抗原的功能-阻断mAb：Ha31/8(仓鼠抗-CD49a；整联蛋白α1)(Mendrick等.1995.Lab.Invest.72：367-375)，Ha1/29(仓鼠抗-CD49b；整联蛋白α2)(β1)(Mendrick等.1995.Lab.Invest.72：367375；Mendrick，D.L.and D.M.Kelly 1993 Lab.Invest.69：690-702)，仓鼠II组对照mAb Ha4/8(仓鼠抗-KLH)(Mendrick，D.L.and D.M.Kelly 1993 Lab.Invest.69：690-702)，和PS/2(大鼠抗-CD49d；整联蛋白α4β1链)(Miyake等.1991 J Exp.Med.173：599-607)。另外，下述抗鼠抗原的功能-阻断mAb作为无叠氮化物/低内毒素的制品购自Pharmingen(SanDiego，CA)：HMβ1-1(仓鼠抗-CD29；整联蛋白β1链)(Noto等.1995 Int.Immunol.7：835-842)，Ha2/5(仓鼠抗-CD29；整联蛋白β1链)(Mendrick，D.L.and D.M.Kelly 1993 Lab.Invest.69：690-702)，3E2(仓鼠抗-CD54，ICAM-1)(Scheynius等.1993 J.Immunol.150：655-663)，5H10-27(大鼠抗-CD49e；整联蛋白α5)(Kinashi，T.，and T.A.Springer.1994.Blood Cells.20：25-44)，GoH3(大鼠抗-CD49f；整联蛋白α6)(Sonnenberg等.1987 J.Biol.Chem.262：10376-10383)和大鼠同种型对照mAb R35-95(大鼠IgG2a)和R35-38(大鼠IgG2b)。
粘附试验。用20ng/ml IL-2培养Balb/c小鼠的脾细胞7至12天。如前所述(Gotwals等.1996 J.Clin.Invest.97：2469-2477)使细胞与I型和IV型胶原粘附。简单地说，用10μg/ml IV型或5μg/ml I型胶原包被96孔Maxisorp板(Nunc，Napierville，IL)，用1％BSA封闭非特异性位点。用2μM BCECF[2’，7’-双(羧乙基)-5(6)羧基荧光素五乙酰氧基甲酯](Molecular Probes，Eugene，OR)标记经IL-2活化的脾细胞，与10μg/ml所示mAb保温15分钟。然后在包被的孔中添加105个处于含0.25％BSA的RPMI中的细胞，37℃保温60分钟。通过用含0.25％BSA的RPMI清洗3次以除去未结合的细胞。使用CytoFluor 2350荧光板读数仪(Millipore，Bedford，MA)定量测定粘附。测定结合细胞与输入细胞的比率，计算相对于经对照mAb-处理的细胞(标准化至100％)的粘附百分比。减去因细胞粘附于仅用BSA包被的孔而引起的背景值。
在活化的白细胞上表达和功能性阻断α1β1和α2β1。假使白细胞在炎症中起关键作用，我们决定检测抗-α1和抗-α2 mAb是否能阻断白细胞对胶原的粘附。为了获得能高水平表达α1和α2的白细胞，在体外用IL-2刺激鼠T细胞达7至12天。这些细胞高水平地表达α1和α2(图1A)，与经IV型-和I型胶原-包被的表面结合良好(图1B)。对IV型胶原的粘附被单独的抗-α1mAb部分抑制，而不会被单独的抗-α2 mAb抑制。与之形成对照的是，对I型胶原的粘附被单独的抗-α2 mAb完全抑制，而单独的抗-α1 mAb仅对其有部分抑制作用。抗-β1 mAb以及抗-α1和抗-α2 mAb的组合物完全抑制对I型和IV型胶原的粘附。已阐明α1β1和α2β1整联蛋白在活化的T细胞上表达，抗-α1和α2 mAb能功能性阻断白细胞对胶原的粘附，我们在炎症疾病的动物模型中使用这些mAb研究这些整联蛋白的体内作用。
实施例2
通过抗-整联蛋白mAb抑制DTH反应。对已公开的方法(Hurtrel等，1992，Cell.Immunol.142：252-263)加以改动，进行SRBC-诱导的迟发型超敏(DTH)反应。简单地说，在第0天，用100μl含2×107个SRBC的PBS在小鼠背部进行皮下免疫。在第5天，通过在小鼠右后足垫皮下注射25μl含1×108个SRBC的PBS以攻击小鼠。用抗原攻击20小时之后，用工程师的卡钳(Mitutoyo/MTI，Paramus，NJ)测定足垫厚度，计算足垫肿胀的程度。结果被表示为足垫厚度增加的平均百分数±SEM，并被计算为％增加＝[1-(用抗原攻击20小时之后右足垫厚度/用抗原攻击20小时之后未注射的左足垫的厚度)]×100。为了阻断SRBC-诱导的DTH反应的效应期，在第5天，在用抗原攻击前1小时，腹膜内施用根据实施例1所述的方法制备的治疗性或对照mAb(100μg)。
SRBC-诱导的DTH是被较好鉴定的体内炎症(特别是牛皮癣)的模型，已使用该模型阐明了多种细胞因子和粘附分子在炎症中的重要性(Tedder等，1995，J.Exp.Med.181：2259-2264，Terashita等，1996，J.Immunol.156：4638-4643)。在足垫抗原攻击前1小时，SRBC-致敏的小鼠接受抗-整联蛋白mAb，20小时之后，通过测定增加的足垫厚度来评估炎症。抗原攻击20小时之后，经PBS和对照仓鼠Ig-处理的小鼠表现出足垫厚度60-70％的增加(图2)。与对照仓鼠Ig处理相比，抗-α1或抗-α2 mAb分别导致对足垫厚度68％和60％的抑制作用。联合使用抗-α1和α2 mAb导致71％的抑制作用，这表明：与单独的抗-α1或抗-α2 mAb相比，两者的组合没有什么加和效果。用其它抗-整联蛋白mAb处理也可有效抑制DTH效应反应。用多种mAb处理所观察到的抑制水平为49％(抗-α4)，23％(抗-α5)和57％(抗-α6)。最后，共有的β1整联蛋白亚单位的mAb阻断(mAb HMBI-1)能将效应DTH反应抑制67％。
实施例3
通过抗-整联蛋白mAb抑制CHS效应反应。按现有技术的描述(Gaspari等，1991，In Current Protocols in Immunology.J.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach，and W.Strober，editors.John Wiley & Sons，NewYork.Section 4.2：1)检测对FITC的接触超敏反应(CHS)。简单地说，在第0天，用100μl含0.5％FITC的1∶1丙酮/邻苯二甲酸二丁酯涂抹于小鼠被剃光的后背上以使小鼠致敏。10天后，在每只耳的两侧使用5μl 0.5％FITC以攻击动物。在用抗原攻击的当天(第10天)和24小时之后，通过用工程师用的卡钳(Mitutoyo/MTI，Paramus，NJ)测量耳的厚度来测定耳的肿胀反应，结果被表示为基线耳厚度增加的平均百分数±SEM。耳厚度的增加被计算为％增加＝[1-(用抗原攻击24小时之后的耳厚度/用抗原攻击时的耳厚度)]×100。为了阻断CHS反应的效应期，在第10天，在用抗原攻击前4小时，腹膜内施用治疗性或对照mAb(250μg)。将用抗原-致敏并且仅用载体进行耳攻击的小鼠(载体对照)或预先未致敏但接受耳攻击的小鼠(刺激物对照)用作阴性对照(耳厚度的增加从不超过2％)。
假使CHS与DTH机械地不同，并且涉及不同的效应细胞，我们想弄清楚抗-整联蛋白mAb对CHS反应的效应期有什么影响。在小鼠剃光的后背上使用FITC，对其进行半抗原致敏，10天后用FITC攻击耳，第二天出现炎症反应。FITC-致敏的小鼠表明用抗原攻击24小时之后，厚度增加了60-70％(图3)。与已公开的结果(Scheynius等，J.Immunol.150：655-663)一致，抗-ICAM-1 mAb处理导致51％的耳肿胀抑制作用。与对照仓鼠mAb相比，在用抗原攻击之前4小时用抗-α1或抗-α2 mAb处理小鼠分别导致37％和57％的耳肿胀抑制作用(图3)。联合使用抗-α1和抗-α2 mAb导致略有增加的耳肿胀抑制作用(65％)。用其它抗β1整联蛋白的mAb处理揭示出：尽管与对照大鼠mAb相比，抗-α4和抗-α5 mAb对FITC-诱导的CHS效应反应没有抑制作用，但用抗-α6 mAb处理导致对效应反应86％的抑制作用。最后，共有的β1整联蛋白亚单位的mAb阻断能将CHS效应反应抑制74％。使用不同品系的小鼠(C57/BL6，129/Sv)和不同的致敏剂(噁唑酮)可获得类似的CHS结果(数据未显示)。与在SRBC-诱导的DTH模型中观察到的结果类似，对发炎的耳朵的组织学分析揭示出：抗-α1和抗-α2 mAb处理能抑制水肿形成和白细胞浸润。
与α1β1和α2β1能在IL-2-活化的脾细胞上表达这一发现一致，对经抗原-致敏的小鼠(FITC或噁唑酮)的淋巴结的分析揭示出：α1β1和α2β1只在CD44hiLFA-1hi活化的CD4+和CD8+T细胞上表达(数据未显示)。用抗-α1和抗-α2 mAb处理小鼠不会导致这些细胞的缺失，因为在CHS模型对抗原致敏的反应中观察到的脾和淋巴结中活化T细胞的数目未受影响。另外，效应细胞的功能未受损失，因为用抗-α1和抗-α2 mAb长期处理经抗原致敏的小鼠(第10-16天)不会影响在第20天用抗原攻击的小鼠的炎症反应(数据未显示)。
实施例4
α1β1-缺损小鼠中CHS效应反应减少。为了排除FITC-介导的CHS的效应反应中α1β1的抑制作用由mAb-介导这一可能性，在野生型和α1β1-整联蛋白缺损小鼠中进行实验(图4)。野生型小鼠中mAb对效应期的抑制作用与以前的结果一致，用抗-α1观察到对耳厚度56％的抑制作用，抗-α2的抑制作用为56％，抗-α1和抗-α2的组合物的抑制作用为62％。与未经处理的野生型小鼠相比，未经处理的α1β1-缺损小鼠中CHS的效应期显著缩短(耳厚度的增加分别为30％和71％)。与预期的相同，未经处理的α1β1-缺损小鼠的耳肿胀程度与在经抗-α1 mAb处理的野生型小鼠中观察到的耳肿胀程度相当。最后，α1β1-缺损小鼠中α2β1的mAb阻断仅使对耳肿胀的抑制作用略有增加，这与用抗-α1和抗-α2 mAb组合物处理的野生型小鼠中观察到的结果一致。
实施例5
为了进一步排除抗-α1和抗-α2 mAb介导的一般性抗-炎症作用导致在炎症的DTH和CHS模型中观察到的抗-整联蛋白mAb抑制作用的可能性，我们研究了这些mAb对刺激性皮炎的作用。
为了评估刺激性皮炎，用5μl含0.8％巴豆油的丙酮涂抹小鼠每只耳的两侧。在使用刺激物之前4小时，施用治疗性或对照抗体。如上所述，24小时之后测量耳的肿胀，与使用巴豆油之前的耳厚度比较。如上所述，结果被表示为基线耳厚度增加的平均百分数±SEM。将仅用丙酮(载体对照)涂抹的小鼠用作阴性对照。
24小时之后，与仅接受载体(丙酮)的小鼠相比，用巴豆油处理的小鼠耳显示出显著的耳厚度增加(48％)。与经PBS或对照mAb处理的动物相比，在经抗-α1或抗-α2 mAb预处理的小鼠中，巴豆油导致的中毒的耳肿胀未受显著影响(图5)。对经巴豆油处理的耳的组织学检查揭示出：与经对照mAb-处理的小鼠或经-PBS处理的小鼠相比，在用抗-α1或抗-α2 mAb预处理的小鼠中，浸润细胞的数目或类型或水肿的形成没有差别(数据未显示)。
实施例6
通过α1β1和α2β1抑制关节炎。由于关节炎患者滑膜中的浸润细胞上能较好地表达α1β1，我们决定在以前描述的关节炎促进模型(Terato等，1992，J Immunol 148：2103-2108；Terato等，1995，Autoimmunity 22：137-147)中检查抗-α1或抗-α2 mAb是否为抑制性的。
Arthrogen-CIA抗体试剂盒购自Stratagene(La Jolla，CA)，使用已建立的方法(Terato等，1992，J.Immunol.148：2103-2108；Terato等，1995，Autoimmunity 22：137-147)诱导关节炎。简单地说，通过在第0天腹膜内注射4种抗-II型胶原mAb(每种1mg)的混合物，接着在第3天腹膜内注射50μgLPS以诱导关节炎。在接下来的3-4天，小鼠出现腕、踝和脚趾关节肿胀。在第0天注射抗-胶原mAb之前4小时，第3天施用LPS之前4小时，以及以后每隔3天，腹膜内施用治疗性或对照mAb(250μg)，持续至实验结束。从第3天开始，评价小鼠关节炎的进展情况。使用四点体系对四肢关节炎的严重程度进行评分。0＝正常；1＝轻微发红，踝或腕稍肿；2＝踝或腕中度肿胀；3＝包括一些脚趾、踝和足的严重肿胀；4＝最严重的发炎。
在注射LPS之后的72小时内在Balb/c小鼠中出现严重的关节炎，并且会持续3周以上。仅注射抗-胶原mAb或LPS都不会诱导关节炎。接受对照mAb处理的小鼠显示出与经PBS-处理的小鼠同等严重性的关节炎(图6)。与之形成对照的是，仅用抗-α1 mAb处理导致关节炎显著减缓(78％)，一直持续到实验结束。仅用抗-α2 mAb处理也具有良好的效果，与经对照mAb处理的小鼠相比，导致关节炎评分降低32％。抗-α1和抗-α2 mAb的组合导致与仅用抗-α1 mAb处理所观察到的相类似的抑制水平。
实施例7
抗-α1和抗-α2 mAb处理对炎性细胞浸润液之作用的组织学分析。对SRBC-诱导的DTH反应的进一步组织学分析证实了抗-α1和抗-α2 mAb处理具备调制引发的炎症反应的能力。与经SRBC-致敏的小鼠的经SRBC-攻击的足垫相比，相同小鼠未经攻击的足垫实质上未显示出炎性细胞浸润液。与经对照mAb-处理的小鼠相比，单独或联合使用抗-α1和抗-α2 mAb处理经SRBC-致敏的小鼠能大大减少经SRBC-攻击的足垫中出现的浸润细胞的数目。对浸润细胞进行更细致的检查，结果表明大多数细胞由嗜中性白细胞构成，也存在一些单核细胞和淋巴细胞，同时还证实：抗-α1和抗-α2 mAb处理能大大减少这些细胞的数目。
实施例8
经免疫组化分析阐明炎性细胞浸润液中表达α1的细胞。进行免疫组化分析以更精确地测定浸润细胞的特性以及它们是否表达与胶原结合的整联蛋白。对取自未经处理的小鼠的发炎足垫的浸润细胞进行检查，看它们是否表达α1β1整联蛋白和细胞谱系标记。发现很多浸润的白细胞上表达α1β1整联蛋白。利用双重免疫组化方法鉴定浸润细胞的特性和α1β1表达的分布。使用细胞谱系标记，发现浸润液主要由粒细胞/单核细胞(Mac-1+)构成，这些细胞很多是嗜中性白细胞(Gr1+)，还有较少量的是T淋巴细胞(CD3+)。在所有这三种细胞亚集中都发现了α1β1整联蛋白表达，α1在Mac-1+粒细胞/单核细胞亚集，Gr1+嗜中性白细胞亚集和大多数浸润CD3+T淋巴细胞上表达。详细的免疫组化分析揭示出：尽管抗-α1和抗-α2 mAb处理减少了浸润细胞的数目，但浸润液的细胞组成未见变化(数据未显示)。用FITC抗-仓鼠mAb进行免疫组化染色，结果证实抗-α1和抗-α2 mAb能定位至发炎的足垫(数据未显示)。
实施例9
在α1-缺损小鼠中通过抗α1β1和α2β1的mAb抑制关节炎。由于关节炎患者滑膜中的浸润细胞上能较好地表达α1β1，我们决定在以前描述的关节炎促进模型(Terato等，1992，J Immunol 148：2103-2108；Terato等，1995，Autoimmunity 22：137-147)中检查抗-α1或抗-α2 mAb是否为抑制性的。该模型包括给小鼠注射抗-II型胶原mAb的混合物，然后施用LPS，导致在接下来的3-7天发展为关节炎。从第0天开始，每隔3天给小鼠施用mAb，每隔3天对关节炎的发展情况进行评分。注射LPS后的72小时内，所有小鼠都发展为严重的关节炎，并且持续3周以上。仅注射抗-胶原mAb或LPS都不会诱导关节炎。接受对照mAb处理的小鼠显示出与经PBS-处理的小鼠同等严重性的关节炎(图7)。与之形成对照的是，仅用抗-α1 mAb处理导致关节炎显著减缓(79％和更高)，一直持续到实验结束。仅用抗-α2 mAb处理也具有良好的效果，与经对照mAb处理的小鼠相比，导致关节炎评分降低37％。抗-α1和抗-α2 mAb的组合导致与仅用抗-α1 mAb处理所观察到的相类似的抑制水平。在所有小鼠中都能观察到抗-α1 mAb处理可降低关节炎评分，这一点有利于与几种对关节炎的其它基于mAb的处理相比，例如可溶性TNF受体Ig融合蛋白(Mori等，1996，J.Immunol.157：3178-3182)，抗-Mac-1(Taylor等，1996，Immunology.88：315-321)，抗-α4(Seiffge，1996，J.Rheumatol.23：2086-2091)，和抗-ICAM-1(Kakimoto等，1992，Cell Immunol.142：326-337)。与显示出α1β1在关节炎中重要作用的基于-mAb的数据一致，与野生型小鼠相比，未经处理的α1-缺损小鼠显示出显著降低的关节炎评分。
实施例10
抗-α1 mAb处理对患关节炎关节的免疫病理学作用。接受对照mAb或抗-α1 mAb处理的野生型关节炎小鼠(第8天)的关节在外观和组织学上与正常的未处理小鼠差不多。从外观上看，取自经对照mAb处理之小鼠的关节表现为发红，包括脚趾的整个脚肿胀，而经抗-α1 mAb处理之小鼠的关节或脚趾中几乎没出现任何炎症的迹象。组织学检查显示出经对照mAb-处理的关节炎关节中存在严重变化，滑膜下组织被炎性细胞深度浸润，细胞粘附于关节表面，表现为蛋白聚糖损失的显著软骨损坏。与以前的报道(Terato等，1992，J.Immunol 148：2103-2108；Terato等，1995，Autoimmunity 22：137-147)一致，该模型中大多数的浸润细胞是嗜中性白细胞。对小鼠进行抗-α1 mAb处理能显著减少炎性浸润液的量和降低软骨损坏的程度。
实施例11
缺乏淋巴细胞时能延缓关节炎的发展，缺乏淋巴细胞时发生抗-α1 mAb 对关节炎的抑制作用。为了测定胶原mAb-诱导的关节炎模型中何种细胞类型是重要的，我们比较了野生型B6-129小鼠和RAG-1-缺损的B6-129小鼠发展为关节炎的能力(图8)。RAG-1(重组活化基因-1)基因的基因缺失导致成熟T和B淋巴细胞完全丧失(Mombaerts等，1992，Cell 68：869-877)。野生型和RAG-1-缺损小鼠都发展为关节炎，但RAG-1-缺损小鼠中的诱导动力学显著较慢(图8)。这些结果暗示：尽管淋巴细胞参与该关节炎模型，但该疾病的发展和进程不需要淋巴细胞。在其它关节炎模型中检查RAG-1-缺损小鼠作用的已公开报道也发现：T和B淋巴细胞的损失能延迟关节炎发作(Plows等，1999，J.Immunol.162：1018-1023)。用抗-α1 mAb处理野生型或RAG-1-缺损小鼠能完全抑制关节炎(图8)。这些结果表明抗-α1 mAb在此模型中的效力不取决于淋巴细胞的存在，这一点与先前实验(图7)所暗示的相同，抗-α1 mAb预防疾病的效力可能是通过它对其它表达α1的细胞，如巨噬细胞和嗜中性白细胞发挥作用来实现的。
实施例12
抗-α1 mAb对关节炎的抑制作用的剂量反应。假使抗-α1 mAb处理对预防关节炎有显著作用，我们将这些研究延伸至包括剂量反应分析(图9)。从第0天开始，每隔3天腹膜内施用不同剂量的mAb。与早期的数据一致，250μg剂量的抗-α1 mAb几乎完全能预防关节炎。较低剂量，即100μg抗-α1mAb对在此模型中预防关节炎部分有效，而较低剂量对关节炎评分没有任何明确的效果(图9)。
实施例13
用抗-α1 mAb治疗性处理可降低关节炎评分。假使抗-α1 mAb能有效预防关节炎，我们尝试治疗以其自己的方式发展疾病的小鼠。通过在第0天注射抗-II型胶原mAb混合物，接着在第3天施用LPS而在小鼠中诱导关节炎。然后，从第4天开始用抗-α1 mAb或可溶性TNF受体Ig融合蛋白处理小鼠。与从第4天开始接受对照仓鼠mAb的小鼠相比，从第4天开始接受抗-α1 mAb的小鼠中的关节炎进程完全被阻断(图10)。治疗性施用抗-α1mAb所观察到的抑制水平是完全的，与用抗-α1 mAb预防性处理(从第0天开始)所观察到的结果相同(图10)。与对照Ig融合蛋白相比，从第4天起用TNF受体Ig融合蛋白处理仅导致关节炎评分60-70％的抑制作用(图10)。联合使用抗-α1 mAb和TNF受体Ig融合蛋白进行处理能有效地完全抑制关节炎评分，假使仅用抗-α1 mAb处理即可完全有效地抑制关节炎，这一点也就不足为奇了。总的说来，这些结果表明：用抗-α1 mAb治疗性处理能有效抑制关节炎评分，这一点能有利地与用TNF拮抗剂治疗性处理相比。
实施例14
克隆和诱变α1-I结构域。使用人特异性引物5′-CAGGATCCGTCAGCCCCACATTTCAA-3′[正向](SEQ ID NO：7)，和5′-TCCTCGAGGGCTTGCAGGGCAAATAT-3′[反向](SEQ ID NO：8)，以及大鼠特异性引物5′-CAGGATCCGTCAGTCCTACATTTCAA-3′[正向](SEQ ID NO：9)，和5′-TCCTCGAGCGCTTCCAAAGCGAATAT-3′[反向](SEQ ID NO：10)，通过聚合酶链反应(PCR)(PCR CORE试剂盒；Boehringer Mannheim，GmbHGermany)，自全长cDNA扩增人和大鼠α1β1整联蛋白I结构域序列(Kern等，1994，J.Biol.Chem.269，22811-22816；Ignatius等，1990，J.Cell Biol.111，709-720)。
纯化所得PCR扩增产物，连接至pGEX4t-i(Pharmacia)，转化至感受态DH5α细胞(Life Technologies)。筛选氨苄青霉素抗性菌落约45kDa谷胱甘肽S-转移酶-I结构域融合蛋白的表达。通过DNA测序证实被选择用于进一步鉴定的克隆中质粒DNA插入物的序列。
产生大鼠/人嵌合α1-I结构域(RΔH)(MORPH诱变试剂盒；5prime-3prime)，将大鼠残基G92，R93，Q94和L97(图11)分别改变为相应的人残基V，Q，R和R。通过诊断性Stul限制性酶位点的丧失鉴定出携有RΔHI结构域的克隆，通过DNA测序证实插入物。图12中显示了人α1-I结构域的氨基酸序列。
实施例15
产生特异于α1-I结构域的mAb。经证明单克隆抗体是研究整联蛋白亚单位结构和功能之间关系的很有用的探针。例如，mAb被广泛用于研究与活化构象相连的β1亚单位区域(Qu，A.，and Leahy，D.J.(1996)Structure 4，931-942)。因此，为了鉴定α1-I结构域构象改变的潜在探针，我们制备了一系列抗人α1-I结构域的mAb。
制备抗-α1 I结构域单克隆抗体。用25μg经完全弗氏佐剂(Life Technologies)乳化的纯化人α1β1(Edwards等，1995，J.Biol.Chem.270，12635-12640；Gotwals等，1999，Biochemistry 38：8280-8)腹膜内(i.p.)免疫雌性Robertsonian小鼠(Jackson Labs)。用25μg经不完全弗氏佐剂(Life Technologies)乳化的α1β1腹膜内加强免疫小鼠3次。融合前3天，用100μg α1β1腹膜内加强免疫具有最高抗-α1-I结构域滴度的小鼠，在融合的前1天用50μg α1β1静脉内加强免疫该小鼠。以1∶6的比率使脾细胞与FL653骨髓瘤细胞融合，以每孔100,000和33,000的密度铺于96孔组织培养板。
通过单色FACS评估上清液与α1β1整联蛋白的结合。在FACS分析之前，使上清液与未经转染的K562细胞保温，以消除只与β亚单位结合的IgG。随后，于4℃，使悬浮于FACS缓冲液(含1％胎牛血清(FCS)，0.5％NaN3的PBS)中、被α1整联蛋白亚单位(K562-α1)转染的3-5×104个K562细胞与上清液保温45分钟，清洗并与同藻红蛋白缀合的抗-小鼠IgG保温。用FACS缓冲液清洗2次后，在Becton Dickinson流式细胞仪中分析细胞。
筛选所得杂交瘤的上清液与α1-I结构域的结合。简单地说，于4℃，用50μl含30μg/ml人α1-I结构域-GST融合蛋白的PBS包被96孔培养板(Nunc)的孔过夜。用PBS清洗培养板，用含1％BSA的PBS封闭孔，室温下使杂交瘤上清液与I结构域保温1小时。用含0.03％吐温20的PBS充分清洗之后，加入与碱性磷酸酶连接的抗-小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch)再放1小时。最终的清洗之后，室温下加入含1mg/ml对硝基苯磷酸(pNPP)的0.1M甘氨酸，1mM ZnCl2和1mM MgCl2，放置30分钟，在O.D.405下对培养板进行读数。
检测选定的上清液抑制与IV型胶原的K562-α1依赖型粘附的能力。于37℃，用含2mM 2’，7’(双-2-羧乙基-5和6)羧基荧光素五乙酰氧基甲酯(BCECF；Molecular Probes)和0.25％BSA的DMEM标记K562-α1细胞30分钟。用结合缓冲液(10mM Hepes，pH7.4；0.9％NaCl和2％葡萄糖)清洗被标记的细胞，重新悬浮于加入5mM MgCl2的的结合缓冲液中，使终浓度为1×106个细胞/ml。在96孔培养板的孔中使50μl上清液与等体积的2×105个K562-α1细胞保温。然后离心培养板并回收上清液。将细胞重新悬浮于结合缓冲液中，并转移至经胶原包被的培养板孔中，37℃保温1小时。保温之后，用结合缓冲液清洗3次以除去未-粘附的细胞。在Cytofluor(Millipore)上分析结合的细胞。
我们起初鉴定了19个杂交瘤，其上清液与表达α1β1整联蛋白的人白血病K562细胞(K562-α1)和α1-I结构域结合。从每个杂交瘤中纯化出免疫球蛋白，检测它们阻断K562-α1或α1-I结构域与IV型胶原结合的能力。以阻断和不阻断α1β1功能为特征将mAb分为两类。例如，尽管由克隆AEF3，BGC5，AQC2和AJH10产生的mAb与α1-I结构域结合(图13A，BGC5的数据未显示)，只有mAb AJH10和AQC2抑制与IV型胶原的α1-I结构域-依赖型(图13B；图16B)或K562-α1(图13C；图16C)粘附。
对互补决定区测序。为了确定这一组mAb的克隆源，我们通过PCR进行扩增，对19个抗体中的12个的CDR进行测序(数据未显示)。
使用各为25pM的下列引物逆转录(Ready-To-Go You Prime First Strand试剂盒，Pharmacia Biotech)2μg分离自107个杂交瘤(FastTrack mRNA分离试剂盒，Invitrogen)的mRNA：重链VH1FOR-2(Michishita等，1993，Cell72：857-867)；轻链VK4FOR，其限定了4个独立的寡核苷酸(Kern等，1994，JBiol.Chem.269：22811-22816)。对于每个杂交瘤，使用下列寡核苷酸的不同组合，在4个独立的PCR反应中扩增重链和轻链：1)重链：VHlFRlK(Kamata等，1995，J.of Biol.Chem.270：12531-12535)，VH1BACK，VH1BACK(Baldwin等(1998)Structure 6，923-935)，VHfrla，VHfrlb，VHfrle，VHfrlf，VHfrlg(Ignatius等(1990)J.Cell Biol.111，709-720)，或VH1FOR-2(Michishita，M.，Videm，V.，and Arnaout，M.A.(1993)Cell 72，857-867)；2)轻链：VK1BACK(Baldwin等(1998)Structure 6，923-935)，VK4FOR，VK2BACK寡核苷酸(Kern等(1994)J.Biol.Chem.269，22811-22816)或VKfrla，VHfrlc，VHfrle，VHfrlf(Ignatius等(1990)J.Cell Biol.111，709-720)。扩增产物(95℃5分钟；94℃1分钟，55℃2分钟，72℃2分钟50个循环；最后72℃10分钟1个循环)，凝胶纯化(QIAquick，Qiagen)，在ABI 377测序仪上使用多个所述寡核苷酸直接测序。
在整个互补决定区(CDR)和间插的构架区内，能产生功能-阻断mAb的克隆的序列几乎相同，这暗示着这些杂交瘤是克隆相关的。
实施例16
免疫印迹和FACS分析。非-阻断抗体可变区的序列显著不同于阻断抗体中出现的克隆相关家族的序列。由于阻断抗体似乎源自单个克隆，我们选择两个(AJH10和AQC2)进行进一步鉴定。
免疫印迹。用含1％Triton X-100的50mM Hepes，pH7.5，150mM NaCl，10mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，20μg/ml抑蛋白酶肽，10μg/ml亮抑蛋白酶肽，10mM乙二胺四乙酸(EDTA)提取解剖自绵羊主动脉的平滑肌细胞层和K562-α1细胞。对样品进行4-20％梯度的SDS-PAGE，电印迹至硝酸纤维素膜上。用含5％奶粉的TBS封闭印迹；在含0.03％吐温-20的TBS中清洗，在含0.05％NaN3的阻断缓冲液中与抗体保温2小时。然后如上所述清洗印迹，与同辣根过氧化物酶缀合的抗-小鼠IgG保温1小时，再次清洗，然后用ECL试剂(Amersham)处理。将印迹暴露于胶片(Kodak)30至60秒并显色。
免疫印迹和FACS分析(图14)表明：AJH10与人、兔和绵羊而不是大鼠的α1β1整联蛋白反应，这暗示着阻断mAb结合进化上保守的线性表位。非阻断mAb在免疫印迹中无效，它们也不能与除人以外的其它物种反应。
实施例17
α1-I结构域与胶原的结合依赖于二价阳离子
A.纯化α1-I结构域
在大肠杆菌中将α1-I结构域表达为与GST(谷胱甘肽-S-转移酶)的融合蛋白形式，在序列的接头处含有凝血酶裂解位点。将裂解于PBS中的细胞的澄清上清液上样于用PBS充分清洗过的谷胱甘肽Sepharose 4B柱(Pharmacia)。用50mM Tris-HCl，pH8.0，5mM谷胱甘肽(还原的)洗脱α1-I结构域-GST融合蛋白。为了进行变性研究，用含凝血酶的50mM Tris，pH7.5裂解I结构域，从GST融合配对物中纯化出I结构域。加入DTT至浓度为2mM，将样品上样于谷胱甘肽Sepharose 4B柱。收集流过和清洗级分，将它们上样于Q Sepharose FF柱(Pharmacia)。用50mM Tris HCl，pH7.5，10mM2-巯基乙醇，75mM NaCl洗脱α1-I结构域。通过电喷射离子化质谱(ESI-MS)分析，纯化的I结构域显示出其预测的质量(Lee等(1995)Structure 3，1333-1340，871Da)，通过SDS-PAGE观察到纯化的I结构域以单一条带迁移，通过在Superose 6 FPLC柱(Pharmacia)上进行大小排阻层析，观察到该蛋白质被洗脱为适当大小的单个峰。
B.功能分析
于4℃，用1μg/ml IV型胶原(Sigma)或I型胶原(Col-laborative Biomedical)将96孔培养板包被过夜，用Triton缓冲液(0.1％Triton X-100；1mM MnCl2；25mM Tris-HCl；150mM NaCl)清洗，用含有3％牛血清白蛋白(BSA)的25mMTris-HCl；150mM NaCl(TBS)封闭。室温下，在经包被的培养板上保温用含有1mM MnCl2和3％BSA的TBS连续稀释的α1-I结构域-GST融合蛋白1小时，用Triton缓冲液清洗。通过连续添加10μg/ml生物素化抗-GST多克隆抗体(Pharmacia)，用含有1mM MnCl2和3％BSA的TBS稀释3000倍的ExtrAvidin-辣根过氧化物酶(Sigma)，和1-Step ABTS(2，2′-丫嗪-二[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]；Pierce)来检测结合的α1-I结构域。在微量培养板读数仪(Molecular Devices)上，在O.D.405处对培养板进行读数。
结果。
在大肠杆菌中，人和大鼠(与人的同一性为95％)α1-I结构域被表达为与GST的融合蛋白形式，通过谷胱甘肽琼脂糖凝胶可对其进行纯化。可以使用以前描述的多种基于ELISA的检测法(Qu，A.，and Leahy，D.J.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA92，10277-10281)，检查这两种蛋白质与I和IV型胶原结合的情况。人α1-I结构域结合IV型胶原的效力比I型胶原高(图15A)。特异于α1-I结构域的抗体，而不是特异于α2-I结构域的抗体(图15B)取消了对这两种配体的结合(有关I型胶原的数据未显示)。Mn2+和Mg2+刺激结合，EDTA将结合降低至背景水平(图15C)。人和大鼠α1-I结构域之间在配体结合上没有可测的差别，这表明物种之间的序列差异在功能上不相关(数据未显示)。因此，α1-I结构域特别需要阳离子以进行有效的配体结合。
实施例18
依赖于阳离子的表位位于MIDAS基元附近。我们利用AJH10识别人而不是大鼠的α1-I结构域序列这一观察结果，对α1β1功能-阻断mAb的表位进行作图。人和大鼠序列仅有12个氨基酸的差别，其中4个位于与MIDAS基元中至关重要的苏氨酸(图11A，aa98)相邻的一段6氨基酸(aa92-97，图11A)序列内。为了检测6氨基酸残基Val-Gln-Arg-Gly-Gly-Arg含有阻断mAb之表位的假说，我们构建了嵌合I结构域(RΔH)，将大鼠残基G92，R93，Q94和L97分别改变为相应的人残基V，Q，R和R。AJH10以及所有的功能-阻断mAb都能识别嵌合I结构域(RΔH；图11B)。
为了在α1-I结构域三级结构的MIDAS结构域中定位这些残基，我们使用α2-I结构域晶体结构的坐标建立α1-I结构域的模型。
使用人α2-I结构域的X-射线晶体结构(Ward等(1989)Nature 341，544-546)建立人α1-I结构域的同源性模型。使用Insight II同源性模型制作组件(版本2.3.5；Biosym Technologies)建立模型。使用程序CHARMM(Clackson等(1991)Nature 352，624-628)和全-氢参数组22，其中相关性较远的介电常数是原子间距的两倍。我们首先在α1-I结构域的所有原子上进行1000步下降幅度最陡的最小化，权衡质量的谐和位置限制为1kcal/(molA2)。最小化之后，再对α1-I结构域的C-α原子进行1000步陡降和5000步Adopted-BasisNewton Raphson，其中谐和位置限制为0.1kcal/(molA2)，从而避免与α2-I结构域X-射线晶体结构的显著偏差。
α1β1和α2β1整联蛋白序列表现出51％的同一性，其中没有插入或缺失，表明这两个I结构域的整体结构类似。据推测，α1-I结构域和α2-I结构域中的金属配位点相同，含有阻断mAb表位的残基位于螺旋α3和螺旋α4之间的环上，所述环含有MIDAS基元内对阳离子结合至关重要的苏氨酸。α1-I结构域模型预测：Q92的酰胺氮(图11A)与和S32相邻的残基I33的羰基形成氢键。因此，含有表位的环可能对稳定MIDAS区域起着功能性的作用。
实施例19
单克隆抗体AQC2(即mAQC2；“m”表示鼠)(实施例15，见上文)是IgG1，κ抗体。为了鉴定编码该抗体重链和轻链的核苷酸序列，根据厂商说明使用QIAGEN RNEASY midi试剂盒，从AQC2鼠杂交瘤细胞中获得总细胞RNA。然后，根据厂商推荐的方法使用针对第一链cDNA合成的GIBCO BRLSUPERSCRIPT预扩增系统，通过RT-PCR从总细胞RNA中克隆编码重链和轻链可变区的cDNA。将随机的六聚体用于引发。
使用引物5′TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGC CCT TGG CCC C3′(SEQ ID NO：11)和5′AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G 3′(S＝C/G，M＝A/C，R＝A/G，和W＝A/T)(SEQ ID NO：12)，通过PCR由第一链cDNA扩增mAQC2的重链可变区。使用Clontech的Advantage Taq聚合酶进行30轮PCR循环：94℃变性30秒，50℃退火1分钟和68℃延伸1.5分钟。使用引物5′ACT AGT CGA CAT GGA TTT WCA GGT GCA GAT TWT CAG CTTC 3′(W＝A/T)(SEQ ID NO：13)和5′ACT GGA TGG TGG GAA GAT GGA3′(SEQ ID NO：14)，通过PCR扩增具有其信号序列的mAQC2轻链。使用Stratagene的克隆Pfu聚合酶进行30轮PCR循环：94℃变性1分钟，50℃退火1分钟和72℃延伸2分钟。根据厂商推荐的方法使用QIAGENQIAQUICK凝胶提取试剂盒对重链和轻链的PCR产物进行凝胶-纯化。
使用TOPO TA克隆试剂盒将纯化的重链产物亚克隆至Invitrogen的pCR2.1-TOPO TA载体。根据厂商推荐的方法使用其Zero blunt TOPO克隆试剂盒将纯化的轻链亚克隆至Invitrogen的pCRbluntIITOPO载体。对多个独立亚克隆的插入物进行测序。除了PCR引物内的简并位置外，独立亚克隆的插入物序列是相同的。
由其编码序列推导出mAQC2的多肽序列。由扩增得到的具有信号序列的PCR产物的cDNA序列推测出成熟轻链的N-末端氨基酸序列，该氨基酸序列与得自Edman降解的纯化mAQC2轻链的N-末端序列(DVKVVESGG；SEQ ID NO：15)精确匹配。对可变区序列的BLAST分析证实了它们的免疫球蛋白同一性。
mAQC2轻链可变区的多肽序列如下：
1 QIVLTQFPAL MSASPGEKVT MTCSASSSVN HMFWYQQKPK
41 SSPKPWIYLT SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISSMEAE
81 DAATYYCQQW SGNPWTFGGG TKLEIK 106(SEQ ID NO：1)
CDR以黑体表示。根据Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，5th Edition，The United States Department of Health and HumanServices，The United States GoVernment Printing Office，1991来定义CDR。使用Kabat编号体系，SEQ ID NO：1被表示如下，其中破折号表示缺乏氨基酸：
1 QIVLTQFPAL MSASPGEKVT MTCSASS-SV NHMFWYQQKP
41 KSSPKPWIYL TSNLASGVPA RFSGSGSGTS YSLTISSMEA
81 EDAATYYCQQ WSGNPWTFGG GTKLEIK 107
mAQC2重链可变区的多肽序列是：
1 DVKVVESGGG LVKPGGSLKL ACAASGFSFS RYTMSWVRQI
41 PEKRLEWVAT ISGGGHTYYL DSVKGRFTIS RDNAKNTLYL
81 QMSSLRSEDT AMYYCTRGFG DGGYFDVWGQ GTTVTVSS(SEQID NO：2)
CDR以黑体表示。使用Kabat编号体系，SEQ ID NO：2被表示如下，其中除非另有说明，位置编号是连串的数字：
1 DVKVVESGGG LVKPGGSLKL ACAASGFSFS RYTMSWVRQI
41 PEKRLEWVAT ISGGGHTYYL DSVKGRFTIS RDNAKNTLYL
81 QM
82a-c SSL
83 RSEDTAMY YCTRGFGDGG
100a-b YF
101 DVWGQGTTVT VSS 113
除非另有说明，根据Kabat编号体系命名本文所用的可变区残基位置编号。
实施例20
本实施例描述了鼠-人嵌合抗体chAQC2的产生。
使用编码mAQC2重链和轻链可变区的cDNA构建chAQC2表达载体，其中mAQC2可变区与人IgG1和κ恒定区相连接。
按下述构建重链嵌合体。将得自mAQC2重链质粒pAND083的0.33kbPstI-BstEII片段亚克隆至得自5a8重链质粒pLCB7的经磷酸酶处理的2.82kbPstI-BstEII载体片段，从而在mAQC2重链可变区的cDNA中添加鼠重链信号编码序列和鼠剪接供体位点。5a8是分子克隆CD4-特异性mAb(参见例如Boon等，2002，Toxicology 172：191-203)。在由所得质粒(pAND092)编码的成熟重链中，N-末端与相关mAQC2重链的N-末端(DVKVVE；SEQ ID NO：16)相差5个残基。
为了校正重链N-末端，根据厂商推荐的方法使用USE诱变试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)对pAND092进行单位点消除(USE)诱变。Q1D，Q3K，L4V，Q5V，Q6E取代由诱变引物5′GCA CCA GGT GCC CAC TCC GACGTC AAG GTG GTG GAG TCA GGG GGA GGC TTA GTG 3′(SEQ ID NO：17)编码。通过其新的AatII和Hinf1位点和消除的PstI位点来鉴定突变的质粒克隆。然后通过DNA测序证实重链编码序列。将正确突变的质粒称为pAND094。将pAND094的0.43kb NotI-HindIII片段和质粒pEAG964(含有人IgG1恒定区的编码序列)的1.21kb HindIII-NotI片段亚克隆至衍生自pCEP4 EBV表达载体(Invitrogen)的质粒pCH269的NotI位点。将所得质粒称为pAND099。
按下述制备轻链嵌合体。将得自mAQC2轻链可变区质粒pAND081的0.46kb EcoRI片段亚克隆至衍生自pUC的pNN09克隆载体经磷酸酶处理的2.7kb载体片段，以添加5’NotI位点。使用Amersham USE试剂盒(见上文)对所得质粒pAND091进行诱变，从而在编码序列的3’末端导入BglII位点。诱变引物的序列为5′GGA GGC ACC AAG CTG GAG ATC TAA CGG GCTGAT GCT GC 3′(SEQ ID NO：18)。通过其BglII和BstYI位点的改变鉴定出正确突变的质粒。通过DNA测序证实所得质粒pAND093中的轻链编码序列。然后将得自pAND093的0.44kb NotI-BglII轻链可变区片段和得自质粒pEAG963(含有人κ轻链恒定区的编码序列)的0.68kb BclI-NotI片段亚克隆至pCH269(见上文)的NotI位点，产生质粒pAND102。为了产生未被阻断的κ轻链(Q1E)，用诱变引物5′CAT AAT GTC CAG GGG AGA AAT TGT TCTCAC CCA G 3′(SEQ ID NO：19)对pAND093进行USE诱变，以产生XmnI位点。通过筛选XmnI位点改变来鉴定突变质粒。通过DNA测序证实所得质粒pAND097中的轻链序列。将得自pAND097的0.44kb NotI-BglII轻链可变区片段和得自质粒pEAG963(含有人κ轻链恒定区)的0.68kb BclI-NotI片段亚克隆至pCH269的NotI位点，产生质粒pAND098。
为了产生chAQC2抗体，将表达载体(chAQC2重链载体pAND099+chAQC2轻链载体pAND102，和chAQC2重链载体pAND099+chAQC2未被阻断的轻链载体pAND098)共-转染至293-EBNA细胞。检测转染子的抗体分泌和特异性。对照是被不含插入物的相应载体或编码ch5c8(描述于例如Elster等，2001，Transplantation 72：1473-1478中的分子克隆CD154-特异性mAb)或chCBE11(描述于例如Browning等，1996，J.Biol.Chem.271：24934-24938的分子克隆LTβR-特异性mAb)的DNA构建体转染的细胞。
裂解具有所需抗体分泌的转染子，对裂解液和条件培养基进行A蛋白免疫沉淀。用抗人重链和轻链抗体对沉淀物进行的Western印迹分析表明：被chAQC2转染的细胞能以类似于被ch5c8转染和被chCBE11转染之细胞的水平合成和有效分泌重链和轻链。另外，用得自转染细胞的条件培养基对表达huVLA-1的K562α1细胞染色，对染色细胞进行FACS分析。结果表明：chAQC2抗体产生类似于mAQC2的染色模式，而得自模拟-转染和ch5c8-转染之细胞的条件培养基不能染色K562α1细胞。纯化由放大的瞬时转染产生的嵌合AQC2，通过FACS滴定证实该嵌合AQC2能与VLA-1结合。具有野生型轻链或基因未被阻断之轻链的嵌合AQC2能与VLA-1结合。参见图16A-D(在下文中讨论)。
实施例21
本实施例描述使mAQC2单克隆抗体人源化的方法。
分析mAQC2可变区。使用软件程序FASTA将mAQC2轻链和重链可变区与小鼠和人亚组的共有序列(Kabat等，文献同上)相比较。发现轻链可变区是小鼠VI亚组的成员，109个氨基酸的重叠序列有89％的同一性。该区域还对应于人I亚组，113个氨基酸的重叠序列有72％的同一性。还发现重链可变区是小鼠IIId亚组的成员，129个氨基酸的重叠序列有86％的同一性。重链可变区还对应于人III亚组，130个氨基酸的重叠序列有79％的同一性。
根据Chothia等，Nature 342，pp.877-883(1989)将CDR分为规范的几类。定义每个规范类别的主要残基在很大程度上决定了CDR环的结构构象，因此，重构抗体中应该保留这些残基。mAQC2的L1环为规范1类(10个残基的环)，L2为1类(7个残基的环)，L3为1类(9个残基的环)。H1环为1类(5个残基的环)，H2环为1类(16个残基的环)残基。H3环看上去不属于任何规范的类别。对于这些类别至关重要的规范残基都包括在人源化抗体中。
通过在1999年9月版的Kabat数据库中分析所有小鼠和人可变链序列，测定mAQC2中不常见的构架残基。据信如果mAQC2-特异性差异靠近结合位点，则所述差异可能表示能增强结合亲和性的体细胞突变。如果离结合位点更远的不常见的mAQC2残基和不常见的人构架残基在人源化抗体中产生免疫原性表位，就除去这些残基。mAQC2中出现的不常见的构架残基是：轻链中的7(F)，10(L)，和41(K)；和重链中的4(V)，21(A)和40(I)。人源化抗体中未保留这些不常见的小鼠构架残基。
建立可变区结构模型。在非丰余数据库中比对mAQC2轻链和重链以确定使用哪个结构构架来构建mAQC2轻链和重链三维模型。使用FASTA，发现轻链与单克隆鼠抗体ab57(1CLOL)具有82％的序列同一性，而重链与鼠6d9 Fab片段(1HYY)具有76％的序列同一性。使用分子模型制作软件包SYBYL(Tripos Inc.)，分别使用ab57的轻链和6d9的重链建立mAQC2轻链和重链的大致三维结构。在仪表板上评估模型的结构完整性，发现该结构完整性是合理的。
设计重构可变区。使用两种方法选择人受体构架以“接受”mAQC2的CDR。第一种方法是通过同源性匹配，第二种方法是通过使用共有的人Ig序列。在同源性方法中，使用软件程序FASTA和BLAST检索Kabat数据库、得自NCBI，ENTREZ(国立健康研究所)的非丰余数据库和Incyte数据库。根据mAQC2构架和人构架(除以前被人源化的抗体的构架外)之间的序列同一性和抗体的来源选择人受体构架。
最终将GENBANK登录号为gi：587330(人κI亚组Vκ-1c147)的免疫球蛋白可变区基因的构架选择为人源化抗体的轻链(Welschof等，J.Immunol.Meth.179：203-14(1995))。将Amulcll(Kabat ID 044469；人III亚组)构架选择为人源化抗体的重链(Huang等，J.Immunol.151：5290-300(1993))。
人构架的回复突变。确定进行何种回复突变的策略可以镜像的形式得自Humanization bY Design站点： http：//mathbio.nimr.mrc.ac.uk/jsaldan和http：//www.crvst.bbk.ac.uk/～ubcg07s。以前的实验表明：重要的是要保留规范残基、界面堆积残基和靠近结合位点的不常见的鼠残基。另外，还应考虑形成CDR支撑平台的“游标尺地带”中的残基(Foote等，J Mol.Biol.224，p.487(1992))和靠近CDR H3的残基。
如表1所示，为每一条可变轻链和重链设计4种重构形式。通过同源性匹配为每条链设计4种重构形式中的两种(称为huAQC2-h1和-h2)，通过共有序列匹配设计另两种重构形式(huAQC2-c1和-c2)。应说明的是：huAQC-h1重链和huAQC-c1重链的序列是相同的。
表1.mAQC2、huAQC2和人构架的序列
轻链<u>FR1</u>Vk-1c147 D--M--S-SSL---V-DR--I--<sup>*</sup>huAQC2-h2 ------S-SSL---V-DR--I--huAQC2-h1 ------S-SSL---V-DR--I--mAQC2 QIVLTQFPALMSASPGEKVTMTChuAQC2-c1 --Q---S-SSL---V-DR--I--huAQC2-c2 --Q---S-SSL---V-DR--I--<u>CDR1</u><u>FR2</u>Vk-1c147 R--Q-ISYLN ------GKA--LL--huAQC2-h2 ---------- ------GKA--LL--huAQC2-h1 ---------- ------GKA------mAQC2 SASSSVNHMF WYQQKPKSSPKPWIYhuAQC2-c1 ---------- ------GKA------huAQC2-c2 ---------- ------GKA--LL--<u>CDR2</u><u>FR3</u>Vk-1c147 AA-S-Q- ---S---------DFT-----LQP--F-----huAQC2-h2 ------- ---S---------D-T-----LQP--F-----huAQC2-h1 ------- ---S---------D-T-----LQP--F-----mAQC2 LTSNLAS GVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYChuAQC2-c1 ------- ---S---------D-T-----LQP--F-----huAQC2-c2 ------- ---S---------D-T-----LQP--F-----<u>CDR3</u><u>FR4</u><u>框架变化</u>Vk-1c147 --SYST-L- ------V--- 25huAQC2-h2 --------- ------V--- 21huAQC2-h1 --------- ------V--- 19mAQC2 QQWSGNPWT FGGGTKLEIK<sup>**</sup> 0huAQC2-c1 --------- --Q---V--- 21huAQC2-c2 --------- --Q---V--- 23
重链<u>FR1</u><u>CDR1</u>AMU1C11 E-QL-------IQ-----R-S------TV- SNY--huAQC2-h2 E-QL-------IQ-----R-S------T-- -----huAQC2-h1 --QL--------Q-----R-S--------- -----mAQC2 DVKVVESGGGLVKPGGSLKLACAASGFSFS RYTMShuAQC2-c1 --QL--------Q-----R-S--------- -----huAQC2-c2 E-QL--------Q-----R-S------T-- -----<u>FR2</u><u>CDR2</u>AMU1C11 ----A-G-G----S V-YS--S---A-----huAQC2-h2 ----A-G-G----- ----------------huAQC2-h1 ----A-G-G----- ----------------mAQC2 WVRQIPEKRLEWVA TISGGGHTYYLDSVKGhuAQC2-c1 ----A-G-G----- ----------------huAQC2-c2 ----A-G-G----- ----------------<u>FR3</u><u>CDR3</u>AMU1C11 --------S--------N---A----V---AS IRFLEWS--YhuAQC2-h2 --------S--------N---A----V----- ----------huAQC2-h1 --------S--------N---A----V----- ----------mAQC2 RFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCTR GFGDGGYFDVhuAQC2-c1 --------S--------N---A----V----- ----------huAQC2-c2 --------S--------N---A----V----- ----------<u>FR4</u><u>框架变化</u>AMU1C11 -----L----- 20huAQC2-h2 -----L----- 16huAQC2-h1 -----L----- 13mAQC2 WGQGTTVTVSS<sup>***</sup> 0huAQC2-c1 -----L----- 13huAQC2-c2 -----L----- 15<sup>*</sup>破折号表示与mAQC2氨基酸序列的同一性。<sup>**</sup>SEQ ID NO：1部分。<sup>***</sup>SEO ID NO：2部分。
下文将讨论一些回复突变。
(1)轻链：
1 D->Q在所有重构形式中进行该突变，因为以前的重构实验(例如Kolbinger等，Protein Eng.6，p.971(1993))暗示了该突变对于抗原结合的重要性。
4 M->L游标尺残基，在所有重构形式中保留。
46 L->P该残基是界面残基，也是游标尺残基，仅在h1和c1中保留。
47 L->W游标尺残基，仅在h1和c1中保留。
71 F->Y该残基处于重要的规范位置，在所有重构形式中保留。
(2)重链：
1 E->D仅在h1(即c1)中进行此回复突变。
12 I->V残基I在人中不常见，仅在h2中保留。
28 T->S游标尺残基，仅在h1中保留。
29 V->F规范残基，在所有重构形式中保留。
49 S->A游标尺残基，在所有重构形式中保留。
93 A->T游标尺残基和界面残基，在所有重构形式中保留。
94 S->R规范残基，在两种重构形式中保留。
如上所述，使用chAQC2可变区质粒作为起始模板，通过USE诱变制备huAQC2可变区。人受体构架(“FR”)cDNA序列是Kabat#Z37334(轻链)和Kabat#U00490(重链)。为了便于鉴定突变的质粒，导入沉默突变以改变限制性位点。通过限制性位点的改变鉴定突变的质粒。通过DNA测序证实所得质粒中的可变区cDNA序列。
通过使用质粒pAND094为模板制备h1和c1形式的重链(两者相同)。诱变引物是：FR1引物5’GGT GCC CAC TCC GAC GTC CAG CTG GTCGAG TCA GGG GGA GGC TTA GTC CAG CCT GGA GGG TCC CTG AGACTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTG 3’(SEQ ID NO：20)，该引物导入了TaqI和PvuII位点，并消除了DdeI位点；FR2引物5’ATG TCT TGG GTT CGCCAG GCT CCG GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC GCA ACC 3’(SEQ IDNO：21)，该引物导入了NciI位点，消除了BspEI和EarI位点；FR3引物5’TTCACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACC CTG TAC CTG CAGATG AAC AGT CTG AGG GCC GAG GAC ACA GCC GTG TAT TAC TGTACA AGA 3’(SEQ ID NO：22)，该引物导入了PstI和DdeI位点；和FR4引物5’TGG GGC CAA GGT ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GAG3’(SEQ ID NO：23)，该引物导入了KpnI和Eco0109I位点。所得h1(即c1)重链质粒被称为pAND104。
使用下列诱变引物，以pAND104为模板制备c2形式的重链：导入AccI位点的FR1引物5′TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGGTAT ACT ATG TCT TGG GTT 3′(SEQ ID NO：24)；和导入FspI位点并消除AatII位点的FR1引物5′GCA CCA GGT GCG CAC TCC GAG GTC CAG CTGGTC GAG TCA 3′(SEQ ID NO：25)。所得c2重链质粒被称为pAND115。
使用下列引物，以pAND115为模板制备h2形式的重链：FR1引物5′GAG TCA GGG GGA GGC TTA ATC CAG CCT GGA GGG TCC CTG3′(SEQ ID NO：26)，该引物消除了DdeI位点。所得h2重链质粒被称为pAND113。
为了产生huAQC2重链的表达载体，将得自pAND104、pAND115或pAND113的0.43kb NotI-HindIII重链可变区片段和得自pEAG964(见上文)的1.21kb HindIII-NotI片段亚克隆至pCH269(见上文)的NotI位点。将所得重链表达质粒分别称为pAND114(h1)、pAND121(c2)和pAND124(h2)。
使用质粒pAND093为模板制备h1形式的轻链。诱变引物是：FR1引物5′CAA ATT GTT CTC ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCG TCTGTA GGG GAC AGA GTC ACC ATC ACA TGC AGT GCC AGC TCA 3′(SEQID NO：27)，该引物消除了BstEII和PstI位点；FR2引物5′TTC TGG TATCAG CAG AAG CCC GGG AAA GCC CCC AAA CCC TGG ATT 3′(SEQ IDNO：28)，该引物导入了NciI位点；FR3引物5′GCT TCT GGA GTC CCT TCACGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAT TAC ACT CTC ACAATC AGC AGC CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCC ACT TAT TAC TGCCAG 3′(SEQ ID NO：29)，该引物导入了DdeI位点并消除了Eco0109I和AvaII位点；和FR4引物5′GGT GGA GGC ACT AAG GTG GAG ATC TAA CGGGCT 3′(SEQ ID NO：30)，该引物导入了DdeI和StyI位点。所得h1轻链质粒被称为pAND103。
使用下列引物，以pAND103为模板制备h2形式的轻链：FR2引物5′CCCGGG AAA GCG CCC AAA CTC CTG ATT TAT CTC ACA TCC 3′(SEQ IDNO：31)，该引物导入了HhaI和HaeII位点。所得h2轻链质粒被称为pAND116。
c1形式的轻链使用质粒pAND103为模板，并使用下列引物：FR1引物5′GCC TCA GTC ATA ATG TCC CGG GGA CAA ATT CAG CTC ACC CAGTCT CCA TCC 3′(SEQ ID NO：32)，该引物导入了SmaI、NciI和HpaII位点；FR4引物5′GGT AAC CCG TGG ACG TTC GGT CAG GGC ACT AAG GTGGAG ATC TAA CGG GCT 3′(SEQ ID NO：33)，该引物导入了Bsp1286I位点。所得c1轻链质粒被称为pAND118。
c2形式的轻链使用质粒pAND116为模板，并使用下列引物：FR1引物5′GCC TCA GTC ATA ATG TCC CGG GGA CAA ATT CAG CTC ACC CAGTCT CCA TCC 3′(SEQ ID NO：34)，该引物导入了SmaI、NciI和HpaII位点；FR4引物5′GGT AAC CCG TGG ACG TTC GGT CAG GGC ACT AAG GTGGAG ATC TAA CGG GCT 3′(SEQ ID NO：35)，该引物导入了Bsp1286I位点。所得c2轻链质粒被称为pAND119。
为了产生huAQC2轻链的表达载体，将得自pAND103、pAND116、pAND118或pAND119的0.44kb NotI-BglII轻链可变区片段和得自pEAG963(见上文)的0.68kb BclI-NotI片段亚克隆至pCH269(见上文)的NotI位点。将所得轻链表达载体分别称为pAND117(h1)、pAND120(h2)、pAND122(c1)和pAND123(c2)。
将表达载体共转染至293-EBNA细胞，检测转染细胞的抗体分泌和特异性。将被空载体转染的细胞用作阴性对照。用A蛋白免疫沉淀全细胞裂解液和条件培养基。对沉淀物(用抗-人重链和轻链抗体产生)进行Western印迹分析，结果表明：huAQC2-转染细胞能以类似于chAQC2-转染细胞的水平合成和有效分泌重链和轻链。
然后对经过得自转染细胞的条件培养基染色的表达VLA-1的K562α1细胞进行FACS分析。为此，在冰上将K562α1细胞与条件培养基保温120分钟。然后用FACS缓冲液(含5％FBS和0.05％叠氮钠的PBS)将细胞清洗3次。将洗过的细胞重新悬浮于缓冲液中，在冰上与PE-缀合的抗-人IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch Labora-tories，Inc.)保温30分钟。保温之后，用FACS缓冲液将细胞清洗3次，重新悬浮于FACS缓冲液中供分析。数据示于表2，其中HuAQC2-h1指的是由h1形式的huAQC2重链(HC)和h1形式的huAQC2轻链(LC)组成的mAb(见表1)。类似地，huAQC2-h2是由h2形式的重链和轻链组成的mAb，huAQC2-c1是由c1形式的重链和轻链组成的mAb，huAQC2-c2是由c2形式的重链和轻链组成的mAb。在该表中，相对MFI指的是归一化至用阻断的chAQC2所观察到的结果的平均MFI。所示数据表示两次独立转染的平均值。这些数据表明：相对于chAQC2而言，huAQC2-h2和-c2 mAb比huAQC2-h1和-c1结合得差。
表2.通过chAQC2和huAQC2对K562α1细胞进行FACS染色
轻链<u>重链</u><u>相对MFI</u>chAQC2 pAND102 pAND099 1.00huAQC2-h1 pAND117 pAND114 1.50huAQC2-h2 pAND120 pAND124 0.64huAQC2-c1 pAND122 pAND114 1.50huAQC2-c2 pAND123 pAND121 0.68huAQC2 LC c1/HC c2 pAND122 pAND121 2.21huAQC2 LC c2/HC c1 pAND123 pAND114 0.76huAQC2 LC未被阻断的c1/HC c2 pAND150<sup>*</sup> pAND121 0.75huAQC2 LC L46P c2/HC c2 pAND133<sup>**</sup> pAND121 1.50huAQC2 LC L47W c2/HC c2 pAND132<sup>***</sup> pAND121 1.00<sup>*</sup>编码具有未被阻断的N-末端Q1D的huAQC2 LC c1。<sup>**</sup>编码具有L46P的huAQC2 LC c2。<sup>***</sup>编码具有L47W的huAQC2 LC c2。
大规模地用chAQC2和huAQC2-h1，h2，-c1和-c2共转染293-EBNA细胞。用A蛋白-Sepharose纯化条件培养基中的抗体。通过FACS检测纯化mAb的活性。方法如下：
1.在试验前一天，对一分为四的培养瓶中的细胞进行计数。
2.沉淀细胞并以2.5e5个细胞/ml的密度重新悬浮于FACS缓冲液(含5％FBS和0.02％叠氮化钠的PBS)。
3.将100μl细胞移入96孔V底培养板的孔中。
4.用FACS缓冲液，从3μg/ml开始制备1∶3连续稀释的AQC2。
5.以800×g沉淀细胞5分钟，轻弹培养板以除去缓冲液。
6.将细胞重新悬浮于100μl经连续稀释的系列抗体中。
7.在冰上保温2小时。
8.清洗培养板，以800×g沉淀细胞3分钟，轻弹培养板以除去缓冲液。
9.将细胞重新悬浮于100μl第二抗体(用FACS缓冲液稀释100倍)中。
10.在冰上保温30分钟。
11.清洗培养板(见上文)。
12.将细胞重新悬浮于25μl FACS缓冲液中。
13.短暂离心FACS管以确保管的底部有50μl液体。
14.强力涡旋每个管并收集5000个事件。
数据示于图17。这些数据证实：相对于chAQC2而言，huAQC2-h2和-c2比huAQC2-h1和-c1结合得差。
进一步研究huAQC2的共有区形式，因为当将它们用于治疗具有慢性指征的患者时，它们的免疫原性较差。进行混合-和-匹配共转染以鉴定是否由单个链负责用huAQC2-c2观察到的明显变弱的结合。共转染表明：结合变弱可能应归功于c2轻链(由pAND123编码)，该轻链与c1轻链(由pAND122编码)的差别仅为FR2区域的两个残基：P46L和W47L。
为了检查这两个变化中的每一个各自具有的贡献，构建新的c2轻链表达载体。使用pAND119为模板，以导入HhaI和HaeII位点的诱变引物FR2引物5′GGG AAA GCA CCC AAA CTC TGG ATC TAT CTC ACA TCC AAC3′(SEQ ID NO：36)制备c2轻链的L47W变体，即质粒pAND125。使用pAND119为模板，以导入BsaHI、BanI和NarI位点的诱变引物FR2引物5′AAG CCC GGG AAG GCG CCC AAA CCC CTG ATT TAT CTC ACA TCCAAC 3′(SEQ ID NO：37)制备c2轻链的L46P变体，即质粒pAND126。通过将得自pAND125或pAND126的0.44kb NotI-BglII轻链可变区片段和得自pEAG963(见上文)的0.68kb BcII-NotI片段亚克隆至pCH269(见上文)的NotI位点，制备出这些新huAQC2轻链的表达载体。将所得质粒分别称为pAND132(具有L47W的c2)和pAND133(具有L46P的c2)。
用每个huAQC2重链质粒和新的轻链质粒进行共转染。通过FACS检查VLA-1结合。数据表明：L47W回复突变不能改善结合。L46P突变能改善结合曲线的峰，但相对于huAQC2形式1(表2，见上文)的行为而言，EC50仍向右移动。这些结果表明：完全结合活性需要这两个回复突变。
制备基因未被阻断的c1轻链，因为Q1D变体可能是一个更加“人源化”的残基。用模板pAND118和下列诱变引物制备被称为pAND148的Q1D变体：FR1引物5′GTC ATA ATG TCC CGG GGA GAT ATC CAG CTC ACCCAG TCT 3′(SEQ ID NO：38)，所述引物可导入新的EcoRI位点并清除ApoI位点。通过将得自pAND148的0.44kb NotI-BglII轻链可变区片段和得自pEAG963的0.68kb BcII-NotI片段亚克隆至pCH269的NotI位点，产生轻链表达载体pAND150(具有未被阻断的N-末端Q1D的c1)，从而制备出最后一个huAQC2轻链变体的表达载体。基因未被阻断的轻链与c2重链的共表达(即“huAQC2 LC未被阻断的c1/HC c2”；称为huAQC2-c4)等同于“huAQC2LC c1/HC c2”(称为huAQC2-c3)。通过FACS证实表达VLA-1的K562α1细胞上的VLA-1结合(表2)。
用chAQC2和huAQC2-h1，-h2，-c1，-c2，-c3和-c4共转染293-EBNA细胞。在A蛋白-Sepharose上纯化条件培养基中的抗体。检测纯化mAb的活性(图17和18)。将HuAQC2-c3选择为候选药物，因为它的特性与chAQC2更加类似。然后设计载体以在CHO细胞中稳定表达huAQC2-c3。载体含有huAQC2 c1 LC或c2 HC的cDNA，5’和3’UTR被消除，通过基因工程方法使重链C-末端的赖氨酸缺失以确保产物的均一性。最终的载体是pAND162(轻链)，pAND160(重链)。本文所用的huAQC2-c3也被称为hAQC2。
hAQC2的完整多肽序列如下。
轻链(质粒：pAND162)
1 QIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASSSVN HMFWYQQKPG KAPKPWIYLT
51 SNLASGVPSR FSGSGSGTDY TLTISSLQPE DFATYYCQQW SGNPWTFGQG
101 TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS WCLLNNFYP REAKVQWKVD
151 NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL
201 SSPVTKSFNR GEC(SEQ ID NO：3)
重链(质粒：pAND160)
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYTMSWVRQA PGKGLEWVAT
51 ISGGGHTYYL DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCTRGFG
101 DGGYFDVWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSWTVP SSSLGTQTYI
201 CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD
251 TLMISRTPEV TCWVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
301 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
351 TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDLAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG(SEQ ID
NO：4)
其它重链和轻链多肽和核苷酸序列如下所示。
A.chAQC2重链(pAND099)(SEQ ID NO：39和40，前一个编号指的是核苷酸序列，后一个编号指的是多肽序列，下列编号使用相同的次序。)
1
GACGTCAAGGTGGTGGAGTCAGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAA
CTC
D V K V V E S G G G L V K P G G S L
K L
61
GCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTCAGTAGATATACTATGTCTTGGGTTCGCCAG
ATT
A C A A S G F S F S R Y T M S W V R
Q I
121
CCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGTGGTGGTCACACCTACTAT
CTA
P E K R L E W V A T I S G G G H T Y
Y L
181
GACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTAC
CTG
D S V K G R F T I S R D N A K N T L
Y L
241
CAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTACAAGAGGTTTT
GGA
Q M S S L R S E D T A M Y Y C T R G
F G
301
GACGGGGGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
D G G Y F D V W G Q G T T V T V S S
B.hAQC2 HC h1和c1(pAND114)(SEQ ID NO：41和42)
1
GACGTCCAGCTGGTCGAGTCAGGGGGAGGCTTAGTCCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGA
CTC
D V Q L V E S G G G L V Q P G G S L
R L
61
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTCAGTAGATATACTATGTCTTGGGTTCGCCAG
GCT
S C A A S G F S F S R Y T M S W V R
Q A
121
CCGGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGTGGTGGTCACACCTACTAT
CTA
P G K G L E W V A T I S G G G H T Y
Y L
181
GACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTAC
CTG
D S V K G R F T I S R D N S K N T L
Y L
241
CAGATGAACAGTCTGAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTACAAGAGGTTTT
GGA
Q M N S L R A E D T A V Y Y C T R G
F G
301
GACGGGGGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
D G G Y F D V W G Q G T L V T V S S
C.hAQC2 h2重链(pAND124)(SEQ ID NO：43和44)
1
GAGGTCCAGCTGGTCGAGTCAGGGGGAGGCTTAATCCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGA
CTC
E V Q L V E S G G G L I Q P G G S L
R L
61
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGGTATACTATGTCTTGGGTTCGCCAG
GCT
S C A A S G F T F S R Y T M S W V R
Q A
121
CCGGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGTGGTGGTCACACCTACTAT
CTA
P G K G L E W V A T I S G G G H T Y
Y L
181
GACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTAC
CTG
D S V K G R F T I S R D N S K N T L
Y L
241
CAGATGAACAGTCTGAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTACAAGAGGTTTT
GGA
Q M N S L R A E D T A V Y Y C T R G
F G
301
GACGGGGGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGG
D G G Y F D V W G Q G T L V T V S S
D.hAQC2 c2重链(pAND121)(SEQ ID NO：45和2)
1
GAGGTCCAGCTGGTCGAGTCAGGGGGAGGCTTAGTCCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGA
CTC
E V Q L V E S G G G L V Q P G G S L
R L
61
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGGTATACTATGTCTTGGGTTCGCCAG
GCT
S C A A S G F T F S R Y T M S W V R
Q A
121
CCGGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGTGGTGGTCACACCTACTAT
CTA
P G K G L E W V A T I S G G G H T Y
Y L
181
GACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTAC
CTG
D S V K G R F T I S R D N S K N T L
Y L
241
CAGATGAACAGTCTGAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTACAAGAGGTTTT
GGA
Q M N S L R A E D T A V Y Y C T R G
F G
301
GACGGGGGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGG
D G G Y F D V W G Q G T L V T V S S
E.chAQC2被阻断的轻链(pAND102)(SEQ ID NO：46和47)
1 CAAATTGTTCTCACCCAGTTTCCAGCACTCATGTCTGCGTCTCCAGGGGAGAAGGTCACC
Q I V L T Q F P A L M S A S P G E K
V T
61
ATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCA
AAA
M T C S A S S S V N H M F W Y Q Q K
P K
121
TCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCT
CGC
S S P K P W I Y L T S N L A S G V P
A R
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCT
GAA
F S G S G S G T S Y S L T I S S M E
A E
241
GATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTGGA
GGC
D A A T Y Y C Q Q W S G N P W T F G
G G
301 ACCAAGCTGGAGATCAAA
T K L E I K
F.hAQC2 h1轻链(pAND117)(SEQ ID NO：48和49)
1 CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCGTCTGTAGGGGACAGAGTCACC
Q I V L T Q S P S S L S A S V G D R
V T
61
ATCACATGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCC
GGG
I T C S A S S S V N H M F W Y Q Q K
P G
121
AAAGCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCA
CGC
K A P K P W I Y L T S N L A S G V P
S R
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAACCT
GAA
F S G S G S G T D Y T L T I S S L Q
P E
241
GATTTTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTGGA
GGC
D F A T Y Y C Q Q W S G N P W T F G
G G
301 ACTAAGGTGGAGATCAAA
T K V E I K
G.hAQC2 h2轻链(pAND120)(SEQ ID NO：50和51)
1
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCGTCTGTAGGGGACAGAGTC
ACC
Q I V L T Q S P S S L S A S V G D R
V T
61
ATCACATGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCC
GGG
I T C S A S S S V N H M F W Y Q Q K
P G
121
AAAGCGCCCAAACTCCTGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCA
CGC
K A P K L L I Y L T S N L A S G V P
S R
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAACCT
GAA
F S G S G S G T D Y T L T I S S L Q
P E
241
GATTTTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTGGA
GGC
D F A T Y Y C Q Q W S G N P W T F G
G G
301 ACTAAGGTGGAGATCAAA
T K V E I K
H.hAQC2 c1轻链(pAND122)(SEQ ID NO：52和1)
1
CAAATTCAGCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCGTCTGTAGGGGACAGAGTC
ACC
Q I Q L T Q S P S S L S A S V G D R
V T
61
ATCACATGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCC
GGG
I T C S A S S S V N H M F W Y Q Q K
P G
121
AAAGCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCA
CGC
K A P K P W I Y L T S N L A S G V P
S R
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAACCT
GAA
F S G S G S G T D Y T L T I S S L Q
P E
241
GATTTTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTCAG
GGC
D F A T Y Y C Q Q W S G N P W T F G
Q G
301 ACTAAGGTGGAGATCAAA
T K V E I K
I.hAQC2 c2轻链(pAND123)(SEQ ID NO：53和54)
1
CAAATTCAGCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCGTCTGTAGGGGACAGAGTC
ACC
Q I Q L T Q S P S S L S A S V G D R
V T
61
ATCACATGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCC
GGG
I T C S A S S S V N H M F W Y Q Q K
P G
121
AAAGCGCCCAAACTCCTGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCA
CGC
K A P K L L I Y L T S N L A S G V P
S R
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAACCT
GAA
F S G S G S G T D Y T L T I S S L Q
P E
241
GATTTTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTCAG
GGC
D F A T Y Y C Q Q W S G N P W T F G
Q G
301 ACTAAGGTGGAGATCAAA
T K V E I K
J.chAQC2未被阻断的轻链(pAND098)(SEQ ID NO：55和56)
1
GAAATTGTTCTCACCCAGTTTCCAGCACTCATGTCTGCGTCTCCAGGGGAGAAGGTC
ACC
E I V L T Q F P A L M S A S P G E K
V T
61
ATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCA
AAA
M T C S A S S S V N H M F W Y Q Q K
P K
121
TCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCT
CGC
S S P K P W I Y T S N L A S G V P
A R
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCT
GAA
F S G S G S G T S Y S L T I S S M E
A E
241
GATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTGGA
GGC
D A A T Y Y C Q Q W S G N P W T F G
G G
301 ACCAAGCTGGAGATCAAA
T K L E I K
K.huAQC2未被阻断的c1轻链(pAND150)(SEQ ID NO：57和58)
1
GATATCCAGCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCGTCTGTAGGGGACAGAGTC
ACC
D I Q L T Q S P S S L S A S V G D R
V T
61
ATCACATGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCC
GGG
I T C S A S S S V N H M F W Y Q Q K
P G
121
AAAGCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCA
CGC
K A P K P W I Y L T S N L A S G V P
S R
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAACCT
GAA
F S G S G S G T D Y T L T I S S L Q
P E
241
GATTTTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTCAG
GGC
D F A T Y Y C Q Q W S G N P W T F G
Q G
301 ACTAAGGTGGAGATCAAA
T K V E I K
实施例22
本实施例描述了本发明的多种AQC2抗体的鉴定。
α1 I结构域结合的固相检测法。在CORNING COSTAR EASY WASH聚苯乙烯96孔培养板中加入50μl 10mg/ml α1 I结构域-GST融合蛋白(Gotwals等，Biochemistry，38，8280-8(1999))。4℃保温16小时之后，在培养板清洗机中用350μl含0.1％吐温-20的PBS将培养板清洗4次。于25℃加入180μl含3％BSA的TBS放置60分钟以封闭培养板，然后按上述方法进行清洗。用含1mg/ml BSA的TBS(检测缓冲液)在96孔圆底培养板中制备抗体稀释液(50μl/孔)，将所述稀释液转移至被α1 I结构域包被的培养板中，25℃保温60分钟。最终的清洗之后，加入100μl/孔TMB试剂(Pierce)。10分钟之后，加入100μl 1M硫酸，在UV-Vis 96-孔分光光度计上读出450nm的光吸收值。
通过电化学发光试验检测α1β1整联蛋白或α1 I结构域与胶原的结合。根据厂商说明，用100μg/ml IV型胶原(Sigma)包被经甲苯磺酰基活化的DYNABEADS M-280(Dynal，Inc.)。按下述制备被α1-转染的K562细胞的细胞裂解液。离心收集细胞，以108个细胞/ml的密度重新悬浮于含有25mMTris，pH7.4，1％NP-40，1mM CaCl2，1mM MnCl2，1mM MgCl2，2％BSA和1mM PMSF的裂解缓中液中，4℃保温60分钟。以12,000rpm离心30分钟以除去细胞碎片，将所得上清液用于随后的实验。根据厂商说明，用TAG-NHS酯(IGEN Inter-national，Inc.，Gaithersburg，MD)标记抗-β1活化抗体TS2/16和多克隆抗-GST抗体(Pharmacia)。在SEPHADEX G25M(Pharmacia)上通过凝胶过滤层析纯化经标记的抗体。
为了进行结合试验，在含有50mM HEPES，pH7.5，150mM NaCl，和0.1％Triton X-100的检测缓冲液中，用8％Lewis大鼠血浆将经胶原-包被的珠(1mg/ml)封闭5分钟。为了进行α1β1结合试验，在含有1mM MnCl2的检测缓冲液中，将连续稀释的抗体与10μg珠、制备自105个被α1-转染的K562细胞的细胞裂解液(见上文)和0.1μg/ml TAG-TS2/16一起保温。为了进行α1I结构域结合试验，在含有1mM MnCl2的检测缓冲液中，将抗体与10μg珠、0.1μg/ml α1 I结构域GST融合蛋白和1μg/ml TAG-抗-GST一起保温。室温下振荡1至2小时之后，加入200μl检测缓冲液，在ORIGEN 1.5电化学发光检测仪(IGEN)上对样品进行读数。在纵轴上用任意的电化学发光单位(ECL)作图。
生物素化mAQC2竞争试验。用50μl 5μg/ml α1 I结构域GST融合蛋白包被96孔培养板，按上述用含有3％BSA的TBS封闭培养板。在96孔圆底培养板中制备用检测缓冲液稀释的抗体溶液(60μl/孔)，加入60μl含0.1μg/ml生物素化鼠AQC2的检测缓冲液。从每孔取出50μl，转移至经包被的培养板，25℃保温3小时。然后按上述清洗培养板，加入50μl 1μg/ml与过氧化物酶-缀合的EXTRAVBDIN(Sigma)，于25℃保温培养板2小时。最终的清洗之后，加入100μl/孔TMB试剂(Pierce)。10分钟之后，加入100μl1M硫酸，在UV-Vis 96-孔分光光度计上读出450nm的光吸收值。
实验结果。实验结果示于图16A-D和表3。测定mAQC2，chAQC2，hAQC2和hAQC2′(即huAQC2-c4；与hAQC2唯一的区别是：hAQC2′轻链的残基1是D而不是Q)(1)结合人α1-转染的K562细胞(通过FACS)；(2)结合固定化的α1-I结构域(通过ELISA)；(3)与mAQC2竞争与α1-I结构域的结合(ELISA)；(4)阻断α1-I结构域与胶原的结合(电化学发光试验)；或(5)阻断α1β1整联蛋白与胶原的结合(电化学发光试验)的能力。结果示于图16A-D，表3给出了计算出的IC50(针对抑制作用)或EC50(针对结合)值。在每个试验中，每个人源化AQC2形式显示出类似的结合VLA1(或α1结构域)或阻断与胶原的结合的能力(注意：在C组试验中，使用抗-鼠-IgG第二抗体而不是抗-人-IgG获得了所观察到的mAQC2和人源化形式之间的强度差别)。
表3.试验结果简述(所有数值的单位皆为nM)
抗体 FACS(EC50) VLA1抑制(IC50) α1I抑制(IC50) ELISA(EC50) 与生物素-AQC2竞争(IC50)
mAQC2 n.d. 0.0726(±0.014) 0.029(±0.011) 0.061(±0.015) 38(±8.7)
嵌合体 0.25 0.071(±0.002) 0.027(±0.007) 0.176(±0.058) 30(±6.9)
hAQC2 0.29 0.129(±0.005) 0.035(±0.005) 0.190(±0.010) 65(±2.2)
hAQC2’ 0.43 0.125(±0.018) 0.037(±0.001) 0.313(±0.072) 69(±25.7)
接下来我们检测的是：CDR中某些保守残基的改变是否能保留hAQC2的VLA-1结合活性。通过定点诱变制备编码具有下列突变的hAQC2变体的DNA构建体：(1)重链CDR2中的G55S；(2)轻链CDR1中的S24N(导入被占据的N-联糖基化位点)；(3)轻链CDR3中的G92S；(4)(1)和(2)的组合；和(5)(1)和(3)的组合。然后将编码重链和轻链的DNA构建体共转染至293-EBNA细胞，通过Western印迹和ELISA检测转染子条件培养基的抗体表达。结果表明：hAQC2变体能象相关的hAQC2一样被有效表达。使用表达VLA-1的K562细胞进行FACS分析，结果进一步证实这些变体的VLA-1-结合活性类似于hAQC2本身。总之，氨基酸取代不会改变hAQC2的VLA-1结合活性。实际上，RΔH/hAQC2 Fab复合物(见下文)的X-射线晶体结构表明：轻链的S24和G92以及重链的G55不在与α1-I结构域接触的结合袋中。
实施例23
免疫球蛋白的效应子功能将免疫球蛋白的抗原-结合活性与免疫系统的炎性、细胞毒性和刺激性武器联系起来。效应子功能可修复免疫球蛋白治疗产物的安全性和效力。为了降低hAQC2的潜在效应子功能，对其重链进行L234A和L235A突变，以产生hsAQC2。为了相同的理由，在hAQC2的重链中进行单点突变N297Q以产生糖基化形式的hAQC2，即haAQC2。进行研究以同相关的hAQC2比较其效力、残留的效应子功能、稳定性和免疫原性。除非另有说明，根据EU编号惯例命名本文所用恒定区中残基位置的编号。
haAQC2的重链多肽序列如下(质粒：pAND161)：
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYTMSWVRQAPGKGLEWVAT
51 ISGGGHTYYL DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDTAVYYCTRGFG
101 DGGYFDVWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDY
151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSWTVPSSSLGTQTYI
201 CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPSVFLFPPKPKD
251 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYQST
301 YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVY
351 TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLD
401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO：5)
hsAQC2的重链多肽序列如下(质粒：pAND171)：
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYTMSWVRQAPGKGLEWVAT
51 ISGGGHTYYL DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDTAVYYCTRGFG
101 DGGYFDVWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDY
151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYI
201 CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPSVFLFPPKPKD
251 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNST
301 YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVY
351 TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLD
401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO：6)
实施例24
本实施例描述了测定α1β1整联蛋白的大鼠/人嵌合α1-I结构域和hAQC2 Fab片段复合物晶体结构的方法。
制备蛋白质复合物
使用IMMUNOPURE_Fab制备试剂盒(Cat#44885，Pierce，Rockford，IL)所提供方法的变体，由hAQC2抗体制备hAQC2 Fab片段。在含有20mM磷酸盐，10mM EDTA和25mM半胱氨酸(pH7.0)的缓冲液中将完整的hAQC2抗体浓缩为12mg/ml。按酶与底物的比率为1∶50加入固定化的木瓜蛋白酶，37℃消化过夜。除去固定化的木瓜蛋白酶，用20mM醋酸钠缓冲液(pH4.5)透析粗消化液。使用盐梯度缓和的S-柱(Poros HS/M，PERSEPTIVEBiosytems #P042M26)，通过阳离子交换层析从残留的完整抗体、二聚体Fab片段和Fc片段中分离出Fab片段。然后将Fab片段调换至0.1M Hepes缓冲液(pH8.0)中。
本发明使用的嵌合α1-I结构域是含有大鼠α1整联蛋白链Thr145-Phe336残基的大鼠/人嵌合I结构域构建体(突变的RΔH)，其中残基Gly217，Arg218，Gln219和Leu222(晶体编号)分别被等效的人残基Val，Gln，Arg和Arg所取代以恢复抗体结合。嵌合RΔH、大鼠和人α1-I结构域的氨基酸序列分别示于下文的SEQ ID NO：59，60和61。在大肠杆菌中将重组的α1-I结构域表达为与GST的融合蛋白。用凝血酶裂解RΔH α1-I结构域，如前所述从巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)克隆中纯化该结构域(Gotwals等，1999，Biochemistry 38：8280-8288)。
145 TQLDIV
151 IVLDGSNSIY PWESVIAFLN DLLKRMDIGP KQTQVGIVQY
191 GENVTHEFNL NKYSSTEEVL VAANKIVQRG GRQTMTALGI
231 DTARKEAFTE ARGARRGVKK VMVIVTDGES HDNYRLKQVI
271 QDCEDENIQR FSIAILGHYN RGNLSTEKFV EEIKSIASEP
311 TEKHFFNVSD ELALVTIVKA LGERIF
(SEQ ID NO：59)
145 TQLDIV
151 IVLDGSNSIY PWESVIAFLN DLLKRMDIGP KQTQVGIVQY
191 GENVTHEFNL NKYSSTEEVL VAANKIGRQG GLQTMTALGI
231 DTARKEAFTE ARGARRGVKK VMVIVTDGES HDNYRLKQVI
271 QDCEDENIQR FSIAILGHYN RGNLSTEKFV EEIKSIASEP
311 TEKHFFNVSD ELALVTIVKA LGERIF
(SEQ ID NO：60)
145 TQLDIV
151 IVLDGSNSIY PWDSVTAFLN DLLKRMDIGP KQTQVGIVQY
191 GENVTHEFNL NKYSSTEEVL VAAKKIVQRG GRQTMTALGI
231 DTARKEAFTE ARGARRGVKK VMVIVTDGES HDNHRLKKVI
271 QDCEDENIQR FSIAILGSYN RGNLSTEKFV EEIKSIASEP
311 TEKHFFNVSD EIALVTIVKT LGERIF
(SEQ ID NO：61)
使hAQC2 Fab片段与过量的嵌合α1-I结构域混合，37℃保温15分钟。使用S200 Sephacryl柱(Pharmacia，Gibco)，通过大小排阻层析从未复合的α1-I结构域中分离出饱和的α1/Fab复合物。在20mM Tris(pH7.4)，150mMNaCl，1mM MnCl2，5mM β-巯基乙醇中将复合物进一步浓缩至11mg/ml。
制备晶体
使用Hampton Research(Laguna Niguel，CA)的CRYSTALSCREENTM KIT发现结晶条件。使用等量的蛋白质复合物溶液和20-30％PEG1500储液，通过蒸发扩散在20℃下培养上述复合物的晶体。一般说来，在2μl孔溶液中加入2μl蛋白质复合物以产生4μl滴剂。2至7天内长出六边杆状晶体，大小为0.8×0.05×0.05mm3。通过对溶解的晶体进行SDS-PAGE分析证实了α1-I结构域和hAQC2 Fab片段的存在。为了降低数据收集过程中固有的辐射损害，在约100K下收集X-射线衍射数据。为了在此低温下制备收集数据用的晶体，将晶体逐渐平衡到含有25％PEG400和30％PEG1500的冷冻保护剂溶液中，在液氮中迅速冷冻。
结构测定
在约100K，使用ADSC Quantum 4带电-连接装置检测仪，在BrookhavenNational Laboratory(BNL)National Synchrotron Light Source(NSLS)的光线X4A下收集单个晶体分辨率为2.8_的天然X-射线衍射数据。使用软件程序DENZO和SCALEPACK(Otwinowski & Minor，1997，Methods inEnzymol.276：307-326)处理数据。晶体属于空间群P61或其对映体P65，单位晶胞大小a＝b＝255.09_，c＝38.64_。数据集96.6％完全，R-合并为8.3％。Matthews系数(Matthews，1968，J.Mol.Biol.33：491-497)为2.59_3Da-1，溶剂含量为52.1％，这表明不对称单位中有两个复合物。不对称单位的两个复合物通过非-晶体学2-重对称性相关联。数据统计学示于表4。
用CCP4程序包(Collaborative Computational Project No.4.The CCP4Suite：programs for protein crystallography.1994，Acta Cryst.D50：760-763)中的程序AMoRe(Navaza，1994，Acta Cryst.A50：157-163)进行分子替代检索，用程序QUANTA进行分子制图操作。将大鼠α1β1整联蛋白的α1-I结构域(Protein Data Bank(PDB)登录号lck4；Nolte等，1999，FEBS Lett.452：379-385)结构的单个α1-I结构域用作模型或探针以进行旋转和平移检索。平移函数检索表明：旋转函数的第1和第9高峰对应于不对称单位中两个α1-I结构域的正确解法(相关系数(cc)＝21.1％，R＝53.1％)，空间群为P65。随后，检索hAQC2 Fab片段，将I结构域的解法固定，并使用hAQC2 Fab的Fv结构域模型作为检索探针。在两个Fv结构域的一个中发现了清楚的解法(cc＝22.1％，R＝52.6％)，但第二个Fv不能被定位。使用非-晶体学2-重对称性获得第二个Fv的位置。两个I结构域和两个Fv结构域的刚体精加工使R-因子降低为43.6％(R-free＝42.7％)。2Fo-Fc电子密度图清楚地显示出第一个Fab片段的恒定区(Fconst)的电子密度，但未显示出第二个Fab片段的Fconst区的电子密度。通过手工操作使第一个Fab的Fconst区模型符合所观察到的电子密度。随后使用分辨率范围为500-2.8_的数据，用软件程序CNX(Accelrys Inc.，San Diego，CA_2000；Brunger，1998，ActaCryst.D54：905-921)对刚体进行精加工，最优化所有结构域的位置，将R-因子降低为39.7％(R-free＝38.9％)。
用CNX程序进行随后的所有精加工步骤。为了降低模型偏性，将部分模型用于2Fo-Fc图计算和模型精加工。对最初的部分模型进行模拟退火和受非-晶体学对称性约束的分组B-因子精加工。R-working和R-free因子分别降低至28.3％和32.9％。接着进行几轮由重复模型建立，最可能位置的精加工和B-因子精加工。仅接受导致R-free因子降低的模型调节。建立好完整的模型之后，再利用体积-溶剂(bulk-solvent)校正。对于分辨率范围为500-2.8_的数据(F＞2σ)而言，最终模型的R-working和R-free因子分别为21.3％和27.2％。
对于大多数复合物而言，最终的2Fo-Fc电子密度图质量良好，但一个I结构域片段(图19中的A分子)的氨基酸残基288-295除外，它们的电子密度微弱，因此未包括在模型中。另外，一个Fab片段的整个恒定区没有可分辨的电子密度，这表明它是无序的。这可能是因为该Fab片段的恒定区位于大的溶剂通道中，因此无法与晶体接触所造成的后果。该结构域也未包括在最终的模型中，所述模型由构成6个多肽链的1030个氨基酸残基和2个锰离子组成。不对称单位中两个复合物的等量残基之间的r.m.s.位置偏差较小(1660个等量主链原子为0.37_)。用软件程序PROCHECK(Laskowski等，1993，J.Appl.Cryst.26：283-291；Morris等，1992，Proteins 12：345-364)和CNX计算立体化学统计学。用程序CONTACT(Tadeusz Skarzynski，ImperialCollege，London，1.12.88；CollaborativeComputational Project No.4.TheCCP4 Suite：programs for protein crystallography.1994，Acta Cryst.D50，760-763)发现氢键(＜3.6_)。所有非-甘氨酸残基(除下文将讨论的L链残基Thr50外)位于Ramachandran图允许的区域内，86％的残基位于最有利的区域内。主链原子的平均B-因子为38.5_2。晶体学分析数据列于表4。
表4：数据统计学和晶体学分析简述
数据收集
晶胞大小a，b，c(_) 255.09，255.09，38.64
空间群 P65
分辨率(_) 500-2.8(2.9-2.8)+
独特的反射 35275
完整性(％) 96.6(87.7)+
平均I/s 11.92(2.29)+
R合并*(％) 8.3(30.9)+
模型
非-H原子数目 7950
蛋白质残基数目 1030
不对称单位的内容 2个I结构域，1个Fab片段，1个Fv结构域
平均B-因子(_2) 38.5
精加工
所用分辨率范围(F＞2σ) 500-2.8
R-因子(R-working)(％) 21.3
R-free++(％) 27.2
立体化学
RMS偏差
键长度(A) 0.007
角(°) 1.43
*R合并＝∑h∑i|Ihi-Ih|/∑hiIhi
+括号内给出最高分辨率电子壳层的值。
++8％的数据被分派用于计算R-free因子。
实施例25
本实施例描述了α1β1整联蛋白的大鼠/人嵌合α1-I结构域和hAQC2Fab片段的复合物的晶体结构。
晶体结构的构造
α1β1整联蛋白的大鼠/人嵌合α1-I结构域和hAQC2 Fab片段的复合物的晶体结构为细长形(图20)。复合物的大小为100_×50_×35_。
Fab片段表现出典型的免疫球蛋白折叠。Fab片段的轻链和重链各形成两个宽的反平行β链折叠，它们紧紧堆积在一起形成自堆积的折叠延伸的互补决定区(CDR)环的支架。轻链和重链都含有3个CDR环。轻链环被称为L1，L2和L3，而重链环指的是H1，H2和H3。对于轻链L1，L2和L3环以及重链H1和H2环而言，互补决定区(CDR)环对应于规范结构1(Chothia等，1989，Nature 342：877-883)。重链H3环具有紧凑的β-发夹-样构象，该构象通过内部氢键以及两个朝着轻链方向堆积的芳香族残基(Tyr104和Phe105)稳定化。L2的残基Thr50采用主链双面角，该角落入Ramachandran图不被允许的区域。用其它抗体的相应残基也观察到相同的结果(Muller等，1998，Structure 6，pp.1153-11567)，这表明这是L2环的天然特性。
本发明的α1-I结构域具有非常类似于未复合的α1-I结构域(PDB登录号lck4；Nolte等，1999，FEBS Lett.452：379-385；PDB登录号lqc5；Rich等，1999，J.Biol.Chem.274：24906-24913)的结构。I结构域结构表现出“二核苷酸-结合”或“Rossman”折叠(Rao & Rossman，1973，J.Mol.Biol.76：241-256)，其中5个平行β-链和1个小的反平行-链的中央折叠片在两端被总共7个α-螺旋包围。本发明的6个β-链的结构被称为βA，βB，βC，βD，βE和βF，7个α-螺旋被称为α1，α2，α3，α4，α5，α6和α7。
I结构域存在3个特征性的结构特征。第一个特征性特征是：在βE-α6环中存在插入的小螺旋(称为C螺旋)。在本发明中，A分子(图19)的大多数C螺旋环与暗示无序的微弱电子密度相关。这似乎是缺乏能稳定环的晶体接触或Fab接触所引起的后果。然而，本发明B分子(图19)中的相同环却具有确定的电子密度，并且已被包括在模型中。α1-I结构域的第二个特征性特征是MIDAS或金属-离子-依赖型-粘附位点，其中金属离子和配体参与结合I结构域。形成部分MIDAS的5个关键残基被称为“DxSxS-T-D”基元。在I结构域中完全保守的这些残基与金属离子配位(Gotwals等，1999，Biochemistry 38：8280-8288)。在锰的存在下培养本发明的晶体，据观察，该结构中I结构域的MIDAS位点含有Mn+2金属离子。该离子由残基Ser156，Ser158和Thr224的侧链直接协调。2Fo-Fc电子密度图未显示出MIDAS残基Asp154和Asp257对金属离子进行水-介导的间接配位的证据(图20)。然而，明显缺乏水分子可能是电子密度图分辨率受限(2.8_)的后果。I结构域的第三个特征是I结构域所有确定的结构属于两个被称为“开口(open)”和“封闭(closed)”的构象中的一个。开口和封闭构象之间的差别包括不同模式的金属离子配位和I结构域C-末端螺旋的显著(约10_)位置移动。本发明复合物中的I结构域为封闭构象。
在本发明复合物的结构中，Fab片段在I结构域前方的上表面，以长35_宽30_的足印结合其表位。抗体-抗原界面的总遮盖表面积为1534_2，对于其它抗体-抗原复合物来说，这也是个典型的数值(Davies等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：7-12；Jones & Thornton，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：13-20)。表面的特征是25％疏水和75％亲水。重链构成复合物65％被遮盖的表面积，而其余的35％由轻链构成。抗体表位由位于I结构域4个环上的残基组成(Emsley等，2000，Cell 101：47-56)。其中的3个环形成MIDAS位点：含有保守的DXSXS序列的环1(βA-α1)，含有MIDAS Thr224的环2(α3-α4)和含有MIDAS残基Asp257的环3(βD-α5)。第四个环是C-螺旋环，该环仅参与较弱的接触。
抗原-抗体相互作用的主要特征是抗体CDR H3中的Asp101与MIDAS位点金属离子的配位(图20)。离子和Asp101的Oδ1之间的距离为2.4A。另外，Asp101的Oδ2原子与I结构域的His261相互作用。有趣的是，CDR H3含有几个与Asp101相邻的甘氨酸残基(序列GFGDGGY)(SEQ ID NO：62)，可能允许CDR环有足够的灵活性，从而允许金属离子适当配位。CDR H3序列在针对相同抗原产生的、属于同类的单克隆抗体中基本不变。参与抗体-抗原接触的大多数抗体残基位于L3，H1，H2和H3 CDR环。L1(Asn30)和L2(Tyr48)环的几个残基似乎形成较弱的范得华接触。L3主要通过两个大的疏水残基Trp90和Trp95参与接触。另外，L3的Asn93与I结构域的Gln223形成氢键。H2环的His56和Tyr58侧链与I结构域环2的主链原子形成氢键。H1的Arg31与I结构域环4的Arg291接触。I结构域环2的Arg222夹在几个抗体残基(包括Tyr58，Trp95和Asn93)之间。这是仅有的远离RΔHI结构域中四个突变残基的残基，它们参与与Fab的接触。因此，它们可能是在诱变之后负责恢复抗体结合的仅有残基。
将大鼠/人嵌合α1-I结构域和hAQC2 Fab片段的复合物的晶体结构与其它I结构域结构进行比较
嵌合RΔH α1-I结构域与大鼠α1-I结构域有4个序列差别(大鼠残基：217G，218R，219Q和222L)，与人α1-I结构域有8个序列差别(人残基：163D，166T，214K，264H，268K，288S，322I和380T)，与研究人α1-I结构域晶体结构所用的克隆有10个序列差别(克隆残基：163D，166T，174E，214K，230I，264H，268K，288S，322I和380T)。在未配位的大鼠α1β1 α1-I结构域晶体结构(PDB登录号lck4；Nolte等，1999，FEBS Lett.452：379-385)中，α1-I结构域不含有结合的金属离子，它采用“封闭”构象。在未配位的人α1-I结构域晶体结构(登录号lqc5；Rich等，1999，J.Biol.Chem.274：24906-24913)中，α1-I结构域含有结合的Mg+2，类似地采用封闭构象。添加这两个具有复合的嵌合α1-I结构域的结构表明hAQC2抗体结合仅造成很小的构象变化。对于所有768个主链原子而言，大鼠和嵌合α1-I结构域之间的r.m.s.位置偏差为1.04_。对于所有764个主链原子而言，人和嵌合α1-I结构域之间的r.m.s.位置偏差为0.69_。在α1-I结构域的环1(对于残基154-161的主链原子而言r.m.s.偏差为1.24_)和环4(C螺旋环)(对于残基288-296的主链原子而言r.m.s.偏差为1.55_)中观察到最大的差别(人和嵌合α1-I结构域对)。然而，这些差别可被更准确地描述为整个二级结构元件的移动而不是复合物的构象变化。这些可能属于蛋白质构象灵活性的正常范围。对于氨基酸残基Glu192，Gln218，Arg219，Gly220和Gly221的主链原子而言，人和嵌合α1-I结构域之间的r.m.s.位置偏差为0.33_。对于氨基酸残基Asp154，Ser156，Asn157，Ser158，Tyr160，Glu192，Gln218，Arg219，Gly220，Gly221，Arg222，Gln223，Thr224，Asp257，His261，Asn263，Arg291和Leu294(晶体编号)的主链原子而言，大鼠和嵌合α1-I结构域之间的r.m.s.位置偏差为0.97_。
I结构域维持“封闭的”I结构域构象，但仅在缺乏配体或与MIDAS位点结合的假-配体时结晶的未配位I结构域中能观察到这种构象。人和嵌合I结构域C-末端螺旋的r.m.s.位置偏差(针对残基321-335的主链原子计算)为0.64_。针对最终精加工模型计算出的模拟退火忽略图清楚地证实：C-末端螺旋和邻近结构元件的位置与封闭构象一致。
为了研究与金属离子配位方式结合的配体的作用，在本发明的结构上添加未配位的α2-I结构域(PDB登录号laox；Emsley等，1997，J.Biol.Chem.272：28512-28517)和与胶原肽复合的α2-I结构域(PDB登录号ldzi；Emsley等，2000，Cell 101：47-56)的结构。金属离子与抗体的Asp101的配位显著类似于α2-I结构域的金属离子与胶原肽的谷氨酸的配位。另一个保守的特征是同时与His261(α2-I结构域中的His258)的酸性基团相互作用。除Ser156和Ser158外，I结构域-Fab复合物的所有MIDAS残基都采用与在未配位的I结构域中观察到的非常类似的构象。与之形成对照的是，Ser156和Ser158的侧链以及金属采用类似于经配位的I结构域的构象。显然，金属离子与Asp101的配位不允许离子保持在未配位状态时所观察到的位置和配位距离。因此，金属离子不与Asp257直接配位，这样才能使离子保持高的亲电性。
生物学含义
在本发明中，金属不与Asp257直接配位，这样就可以通过降低封闭(未结合配体)和开口(结合了配体)构象之间的能量屏障获得高亲和性结合。然而，金属与抗体的天冬氨酸的配位不足以在本发明的I结构域中诱导开口构象。I结构域-Fab复合物结构表明：可以与采用封闭构象的I结构域强结合，金属离子与配体酸性残基的配位可能是必需的，但不足以诱使构象变成开口状态。抗体的结合有望稳定化整联蛋白的低亲和性状态，防止伴随有整联蛋白与胶原结合的全面信号传导。
尽管为了清楚地了解发明，通过说明和实施例详细描述了上述发明，但本领域技术人员能容易地对本发明进行某些改变和修饰。因此，不应将描述部分和实施例看成是对本发明范围的限制。

Claims (42)

1.抗-VLA-1抗体，其轻链互补决定区由SEQ ID NO：1的氨基酸残基24至33，49至55和88至96定义，其重链互补决定区由SEQ ID NO：2的氨基酸残基31至35，50至65和98至107定义。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体含有SEQ ID NO：1的轻链可变区序列和SEQ ID NO：2的重链可变区序列。
3.权利要求1的抗体，其中所述抗体含有与杂交瘤mAQC2(ATCCPTA3273)产生的抗体相同的重链和轻链多肽序列。
4.权利要求1的抗体，其中所述抗体是人源化抗体。
5.权利要求4的抗体，其中所述抗体的轻链含有至少一个下列残基：Q1，L4，P46，W47和Y71；或所述抗体的重链含有至少一个下列残基：D1，V12，S28，F29，A49，T93，R94(Kabat编号惯例)。
6.权利要求4的抗体，其中所述抗体含有由SEQ ID NO：3的氨基酸残基1至106定义的轻链可变区序列，和由SEQ ID NO：4的氨基酸残基1至118定义的重链可变区序列。
7.权利要求4的抗体，其中所述抗体含有与细胞系hAQC2(ATCCPTA3275)产生的抗体相同的重链和轻链多肽序列。
8.权利要求4的抗体，其中所述重链在一个或多个选自残基234，235，236，237，297，318，320和322(EU编号体系)的氨基酸残基处发生突变，使得与未经修饰的抗体相比，效应子功能发生改变，但保留了与VLA-1结合的能力。
9.权利要求8的抗体，其中所述抗体与未经修饰的抗体相比，在重链中含有突变L234A和L235A(EU编号体系)。
10.权利要求4的抗体，其中所述抗体含有与细胞系hsAQC2(ATCCPTA3356)产生的抗体相同的重链和轻链多肽序列。
11.权利要求4的抗体，其中所述抗体在糖基化位点的氨基酸残基处发生突变体，从而消除该糖基化位点。
12.权利要求11的抗体，其中所述抗体在其重链中含有突变N297Q(EU编号体系)。
13.权利要求4的抗体，其中所述抗体含有与细胞系haAQC2(ATCCPTA3274)产生的抗体相同的重链和轻链多肽序列。
14.一种组合物，含有权利要求4至13之一的抗体和可药用载体。
15.分离的核酸，含有SEQ ID NO：1的编码序列。
16.分离的核酸，含有SEQ ID NO：2的编码序列。
17.分离的核酸，其含有杂交瘤mAQC2(ATCC PTA3273)产生之抗体的轻链的编码序列。
18.分离的核酸，其含有杂交瘤mAQC2(ATCC PTA3273)产生之抗体的重链的编码序列。
19.分离的核酸，其含有细胞系hAQC2(ATCC PTA3275)产生之抗体的轻链的编码序列。
20.分离的核酸，其含有细胞系hAQC2(ATCC PTA3275)产生之抗体的重链的编码序列。
21.分离的核酸，其含有细胞系haAQC2(ATCC PTA3274)产生之抗体的重链的编码序列。
22.分离的核酸，其含有细胞系hsAQC2(ATCC PTA3356)产生之抗体的重链的编码序列。
23.分离的核酸，其含有SEQ ID NO：3的残基1至106的编码序列。
24.分离的核酸，其含有SEQ ID NO：4的残基1至118的编码序列。
25.治疗患有VLA-1介导之免疫疾病的受试者的方法，包括给受试者施用权利要求14的组合物。
26.测定组织中的VLA-1水平的方法，包括使该组织与权利要求1的抗体接触，检测该抗体与该组织的结合，从而测定该组织中的VLA-1水平。
27.杂交瘤mAQC2(ATCC PTA3273)的细胞。
28.细胞系hAQC2(ATCC PTA3275)的细胞。
29.细胞系haAQC2(ATCC PTA3274)的细胞。
30.细胞系hsAQC2(ATCC PTA3356)的细胞。
31.产生下述结构的三维图像的计算机：
(a)分子复合物，其中由根据图19所示的α1β1整联蛋白RΔH嵌合I结构域和人源化抗体hAQC2的复合物的结构坐标组合定义分子复合物；或
(b)所述分子复合物的同系物，所述同系物与所述氨基酸主链原子的均方根误差不超过0.65_；
其中所述计算机包括：
(i)机器-可读数据存储介质，其包括由机器-可读数据编码的数据存储材料，其中所述数据含有根据图19的所述复合物的至少一部分结构坐标；
(ii)处理所述机器-可读数据的存储指令所用的工作存储器；
(iii)与所述工作存储器和所述机器-可读数据存储介质相连接的中央处理部件，该部件可处理所述机器-可读数据存储介质，从而将所述机器可读数据处理为所述三维图像；和
(iv)与所述中央处理部件相连接、用于显示所述三维图像的显示器。
32.产生分子或分子复合物的三维图像的计算机，所述分子或分子复合物包括：
a)由根据图19的hAQC2氨基酸结构坐标定义的第一结合位点，所述氨基酸包括轻链残基Asn30，Tyr48，Trp90，Ser91，Asn93和Trp95，以及重链残基Ser30，Arg31，Trp47，Ser52，Gly53，His56，Tyr58，Phe99，Gly100和Asp101中的至少7个残基；或
b)所述分子或分子复合物的同系物，其中所述同系物含有与hAQC2氨基酸主链原子的均方根误差不超过1.10_的第二结合位点；和
其中所述计算机包括：
(i)机器-可读数据存储介质，其包括由机器-可读数据编码的数据存储材料，其中所述数据含有根据图19的hAQC2氨基酸的结构坐标，所述氨基酸包括轻链残基Asn30，Tyr48，Trp90，Ser91，Asn93和Trp95，以及重链残基Ser30，Arg31，Trp47，Ser52，Gly53，His56，Tyr58，Phe99，Gly100和Asp101中的至少7个残基；和
(ii)处理所述机器-可读数据的存储指令所用的工作存储器；
(iii)与所述工作存储器和所述机器-可读数据存储介质相连接的中央处理部件，该部件可处理所述机器-可读数据存储介质，从而将所述机器可读数据处理为所述三维图像；和
(iv)与所述中央处理部件相连接、用于显示所述三维图像的显示器。
33.产生下述结构的三维图像的计算机：
(a)由根据图19的hAQC2氨基酸的结构坐标定义的第一结合位点，其中所述氨基酸包括轻链残基Asn30，Tyr48，Trp90，Ser91，Asn93和Trp95，以及重链残基Ser30，Arg31，Trp47，Ser52，Gly53，His56，Tyr58，Phe99，Gly100和Asp101中的至少7个残基；
(b)与hAQC2氨基酸主链原子的均方根误差不超过1.10_的同系物第二结合位点；
其中所述计算机包括：
(i)机器-可读数据存储介质，其包括由机器-可读数据编码的数据存储材料，其中所述数据含有根据图19的hAQC2氨基酸的结构坐标，所述氨基酸包括轻链残基Asn30，Tyr48，Trp90，Ser91，Asn93和Trp95，以及重链残基Ser30，Arg31，Trp47，Ser52，Gly53，His56，Tyr58，Phe99，Gly100和Asp101中的至少7个残基；
(ii)处理所述机器-可读数据的存储指令所用的工作存储器；
(iii)与所述工作存储器和所述机器-可读数据存储介质相连接的中央处理部件，该部件可处理所述机器-可读数据存储介质，从而将所述机器可读数据处理为所述三维图像；
(iv)与所述中央处理部件相连接、用于显示所述三维图像的显示器。
34.鉴定整联蛋白I结构域的抑制剂的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)使用根据图19的hAQC2氨基酸的结构坐标或±相对于hAQC2氨基酸主链原子而言不超过1.10_的均方根误差，以产生结合位点的三维结构，其中所述氨基酸包括轻链残基Asn30，Tyr48，Trp90，Ser91，Asn93和Trp95，以及重链残基Ser30，Arg31，Trp47，Ser52，Gly53，His56，Tyr58，Phe99，Gly100和Asp101中的至少7个残基；
(b)利用所述三维结构设计或选择潜在的拮抗剂；
(c)合成所述潜在的拮抗剂；和
(d)使所述潜在的拮抗剂与hAQC2接触以测定所述潜在的拮抗剂与hAQC2相互作用的能力，其中所述潜在的拮抗剂与hAQC2相互作用的能力表示潜在的拮抗剂是I结构域的抑制剂。
35.通过权利要求34的方法鉴定出的整联蛋白I结构域抑制剂。
36.产生分子或分子复合物的三维图像的计算机，所述分子或分子复合物包括：
a)由根据图19的I结构域氨基酸残基Asp154，Ser156，Asn157，Ser158，Tyr160，Glu192，Gln218，Arg219，Gly220，Gly221，Arg222，Gln223，Thr224，Asp257，His261，Asn263，Arg291，和Leu294的结构坐标定义的第一结合位点；或
b)所述分子或分子复合物的同系物，其中所述同系物包括与所述I结构域氨基酸主链原子的均方根误差不超过0.92_的第二结合位点；
其中所述计算机包括：
(i)机器-可读数据存储介质，其包括由机器-可读数据编码的数据存储材料，其中所述数据含有根据图19的I结构域氨基酸残基Asp154，Ser156，Asn157，Ser158，Tyr160，Glu192，Gln218，Arg219，Gly220，Gly221，Arg222，Gln223，Thr224，Asp257，His261，Asn263，Arg291，和Leu294的结构坐标；和
(ii)处理所述机器-可读数据的存储指令所用的工作存储器；
(iii)与所述工作存储器和所述机器-可读数据存储介质相连接的中央处理部件，该部件可处理所述机器-可读数据存储介质，从而将所述机器可读数据处理为所述三维图像；和
(iv)与所述中央处理部件相连接、用于显示所述三维图像的显示器。
37.产生下述结构的三维图像的计算机：
a)由根据图19的I结构域氨基酸残基Asp154，Ser156，Asn157，Ser158，Tyr160，Glu192，Gln218，Arg219，Gly220，Gly221，Arg222，Gln223，Thr224，Asp257，His261，Asn263，Arg291，和Leu294的结构坐标定义的第一结合位点；或
b)与所述I结构域氨基酸主链原子的均方根误差不超过0.92_的同系物第二结合位点；
其中所述计算机包括：
(i)机器-可读数据存储介质，其包括由机器-可读数据编码的数据存储材料，其中所述数据含有根据图19的I结构域氨基酸残基Asp154，Ser156，Asn157，Ser158，Tyr160，Glu192，Gln218，Arg219，Gly220，Gly221，Arg222，Gln223，Thr224，Asp257，His261，Asn263，Arg291，和Leu294的结构坐标；和
(ii)处理所述机器-可读数据的存储指令所用的工作存储器；
(iii)与所述工作存储器和所述机器-可读数据存储介质相连接的中央处理部件，该部件可处理所述机器-可读数据存储介质，从而将所述机器可读数据处理为所述三维图像；和
(iv)与所述中央处理部件相连接、用于显示所述三维图像的显示器。
38.产生分子或分子复合物的三维图像的计算机，所述分子或分子复合物包括：
a)由根据图19的I结构域氨基酸的结构坐标定义的第一结合位点，所述氨基酸包括残基Glu192，Gln218，Arg219，Gly220和Gly221中的至少3个残基；或
b)所述分子或分子复合物的同系物，其中所述同系物含有与所述I结构域氨基酸主链原子的均方根误差不超过0.30_的第二结合位点；
其中所述计算机包括：
(i)机器-可读数据存储介质，其包括由机器-可读数据编码的数据存储材料，其中所述数据含有根据图19的I结构域氨基酸的结构坐标，所述氨基酸包括残基Glu192，Gln218，Arg219，Gly220和Gly221中的至少3个残基；和
(ii)处理所述机器-可读数据的存储指令所用的工作存储器；
(iii)与所述工作存储器和所述机器-可读数据存储介质相连接的中央处理部件，该部件可处理所述机器-可读数据存储介质，从而将所述机器可读数据处理为所述三维图像；和
(iv)与所述中央处理部件相连接、用于显示所述三维图像的显示器。
39.产生下述结构的三维图像的计算机：
(a)由根据图19的I结构域氨基酸的结构坐标定义的第一结合位点，所述氨基酸包括残基Glu192，Gln218，Arg219，Gly220和Gly221中的至少3个残基；或
(b)与所述I结构域氨基酸主链原子的均方根误差不超过0.30_的同系物第二结合位点；
其中所述计算机包括：
(i)机器-可读数据存储介质，其包括由机器-可读数据编码的数据存储材料，其中所述数据含有根据图19的I结构域氨基酸的结构坐标，所述氨基酸包括残基Glu192，Gln218，Arg219，Gly220和Gly221中的至少3个残基；和
(ii)处理所述机器-可读数据的存储指令所用的工作存储器；
(iii)与所述工作存储器和所述机器-可读数据存储介质相连接的中央处理部件，该部件可处理所述机器-可读数据存储介质，从而将所述机器可读数据处理为所述三维图像；和
(iv)与所述中央处理部件相连接、用于显示所述三维图像的显示器。
40.鉴定整联蛋白I结构域的抑制剂的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)使用根据图19的I结构域氨基酸残基Asp154，Ser156，Asn157，Ser158，Tyr160，Glu192，Gln218，Arg219，Gly220，Gly221，Arg222，Gln223，Thr224，Asp257，His261，Asn263，Arg291，和Leu294的结构坐标，以产生结合位点的三维结构；
(b)利用所述三维结构设计或选择潜在的拮抗剂；
(c)合成所述潜在的拮抗剂；
(d)使所述潜在的拮抗剂与I结构域接触以测定所述潜在的拮抗剂与I结构域相互作用的能力，其中所述潜在的拮抗剂与I结构域相互作用的能力表示潜在的拮抗剂是I结构域的抑制剂。
41.鉴定整联蛋白I结构域的抑制剂的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)使用包括根据图19的残基Glu192，Gln218，Arg219，Gly220，Gly221的I结构域氨基酸中的至少3个残基的结构坐标或±相对于I结构域氨基酸主链原子而言不超过0.30_的均方根误差，以产生结合位点的三维结构；
(b)利用所述三维结构设计或选择潜在的拮抗剂；
(c)合成所述潜在的拮抗剂；和
(d)使所述潜在的拮抗剂与I结构域接触以测定所述潜在的拮抗剂与整联蛋白I结构域相互作用的能力，其中所述潜在的拮抗剂与I结构域相互作用的能力表示潜在的拮抗剂是I结构域的抑制剂。
42.由权利要求40和41之一的方法鉴定的整联蛋白I结构域的抑制剂。
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