BG108340A - Антитела срещу vla-1 - Google Patents

Антитела срещу vla-1 Download PDF

Info

Publication number
BG108340A
BG108340A BG108340A BG10834003A BG108340A BG 108340 A BG108340 A BG 108340A BG 108340 A BG108340 A BG 108340A BG 10834003 A BG10834003 A BG 10834003A BG 108340 A BG108340 A BG 108340A
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
domain
antibody
residues
data
reader
Prior art date
Application number
BG108340A
Other languages
English (en)
Other versions
BG66334B1 (bg
Inventor
Paul Lyne
Ellen Garber
Jose Saldanha
Michael Karpusas
Original Assignee
Biogen, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen, Inc. filed Critical Biogen, Inc.
Publication of BG108340A publication Critical patent/BG108340A/bg
Publication of BG66334B1 publication Critical patent/BG66334B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C07K16/2842—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta1-subunit-containing molecules, e.g. CD29, CD49
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/06—Antimigraine agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)

Abstract

Изобретението се отнася до антитела, които специфично се свързват с VLA-1 интегрин, до използване на тези антитела за лечение на имунологични разстройства, до кристални структури на комплекси, образувани от VLA-1 антитела и техни лиганди, и до VLA-1 антагонисти и агонисти, идентифицирани при използването на структурни координати на тези структури. а

Description

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО Настоящето изобретение предоставя анти-VLA-l антитела и методи за използване на тези антитела за лечение на различни ©възпалителни и имунологични разстройства.
Специално, изобретението обхваща антитяло, което специфично се свързва с VLA-1 (например, човешки VLA-1). Това антитяло съдържа лековерижни определящи комплементарността области (“CDR”s), определени от аминокиселинни остатъци 24 до 33, 49 до 55 и 88 до 96 на SEQ ID N0:1, и/или тежковерижни определящи комплементарността области, определени от аминокиселинни остатъци 31 до 35, 50 до 65 и 98 до 107 на SEQ ID N0:2. Тези CDRs могат да съдържат мутации (например, делеции, инсерции и/или замени) в не-антиген-съдържащите части, определени от кристалната структура представена тук, без да се засяга VLA-1-свързващата активност на антитялото. Примерни мутации са S24N, G92S и D101A в лековерижните CDRs и G55S в тежковерижната CDR2. В едно изпълнение, антитялото на това изобретение съдържа последователност на лековерижен променлив домен на SEQ ID N0:1 и/или последователност на тежковерижен променлив домен на SEQ IF N0:2.
В сродно изпълнение, антитялото на това изобретение съдържа същите тежко и лековерижни полипептидни последователности, като антитяло произведено с хибридома © mAQC2, депозирана на 18 април 2001 при American Type Culture Collection (“ATCC), 10801 University Boulevrd, Manassas, VA 201102209 c ключов номер PTA3273. (Всички ATCC депозити цитирани тук са изготвени съгласно Будапещенския Договор). Това антитяло може да бъде получено например от хибридома AQC2, или клетки съдържащи последователности на нуклеинова киселина, изолирана от тази хибридома, които кодират тежките и леките вериги на mAQC2 моноклонално антитяло.
В друго изпълнение, антитялото е хуманизирано антитяло, включващо най-малко един (например 2,3,4 или 5) от следните остатъци в неговата лека верига: Q1, L4, Р46, W47 и Y71; или най® малко един (например 2, 3, 4, 5, 6 или 7) от следните остатъци в неговата тежка верига: D1, V12, S28, F29, А49, Т93, R94 (Kabat конвенция за номериране). Например, антитялото включва Q1, L4 и Y71 в леката верига; и/или (i) F29, А49, Т93 и R94, или (ii) А49 и Т93, в тежката верига.
Хуманизираното антитяло на това изобретение може да съдържа една последователност на лековерижен променлив домен, определен от аминокиселинни остатъци 1 до 106 на SEQ ID N0:3, и/или последователност на тежковерижен променлив домен, определен от аминокиселинна последователности 1 до 118 на SEQ
ID N0:4. Хуманизираното антитяло може да съдържа същите тежко и/или леко верижни полипептидни последователности като антитяло произведено от клетъчна линия hAQC2 (АТСС ключов номер
РТА3275; депозирано на 18 април 2001.
В друго изпълнение, хуманизираното антитяло на това изобретение може да съдържа мутация (например, делеция, заместване или добавяне) при една или повече (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8) от известни позиции в тежката верига, така че една ефекторна функция на антитялото (например, способност на антитялото да се свързва с Fc рецептор или комплемент фактор) е променена без засягане способността на антитялото да се свързва с VLA-1 (U.S. Patent 5,648,260). Тези тежковерижни позиции включват, без ограничения, остатъци 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 и 322 (EU система за номериране). Хуманизираното антитяло може, например да съдържа мутациите L234A (т.е. заместване на левцин в позиция 234 на немодифицирано антитяло с аланин) и L235A (EU система за номериране) в неговата тежка верига. В едно сродно изпълнение, антитялото съдържа същата тежковерижна полипептидна последователност както едно антитяло, получено от клетъчна линия hsAQC2 (АТСС ключов номер РТА3356; депозирана на 4 май 2001).
В друго изпълнение, хуманизираното антитяло на това изобретение може да съдържа мутация (например, делеция или заместване) при аминокиселинен остатък, който е място за гликозилиране, така че гликозилиращото място е елиминирано. Такова антитяло може да бъде клинично благоприятно за това, че притежава намалени ефекторни функции или други нежелани функции, като се запазва неговия VLA-1 свързващ афинитет. Мутации на места за гликозилиране могат също да бъдат благоприятни за процеса на развитие (например, белтъчна експресия и пречистване). Например, тежката верига на антитялото може да съдържа мутацията N297Q (EU система за номериране), така че тежката верига може да не бъде повече гликозилирана на това място. В сродно изпълнение, хуманизпраното антитяло може да съдържа същата тежковерижна полипептидна последователност, както антитялото получено от клетъчна линия haQC2 (АТСС ключов номер РТА3274; депозирано на 18 април 2001).
В друго изпълнение, тежката и/или леката вериги на антитялото на това изобретение съдържат мутации, които Ф повишават афинитета за свързване с VLA-1 и при това се повишава ефективността за лечение на VLA-1 медиирани разстройства.
В това изобретение са включени също състав, съдържащ едно антитяло на изобретението и фармацевтично приемлив носител; изолирана нуклеинова киселина съдържаща кодираща последователност за SEQ ID N0:1; изолирана нуклеинова киселина съдържаща кодираща последователност за SEQ ID N0:2; изолирана нуклеинова киселина съдържаща кодираща последователност за леката верига на антитяло, получено с хибридома mAQC2; изолирана нуклеинова киселина съдържаща кодираща последователност за тежката верига на антитяло, получено с ® клетъчна линия hAQC2; изолирана нуклеинова киселина съдържаща кодираща последователност за леката верига на антитяло получено с клетъчна линия hAQC2; изолирана нуклеинова киселина съдържаща кодираща последователност за тежката верига на антитяло получено с клетъчна линия haAQC2; изолирана нуклеинова киселина съдържаща кодираща последователност за тежката верига на антитяло получено с клетъчна линия hsAQC2; изолирана нуклеинова киселина съдържаща кодираща последователност за остатъци 1 до 106 на SEQ ID N0:3; изолирана нуклеинова киселина съдържаща кодираща последователност за остатъци 1 до 118 на SEQ ID N0:4; клетки от хибридома mAQC2; клетки от клетъчна линия hAQC2; клетки от клетъчна линия haAQC2; и клетки от клетъчна линия hsAQC2.
Настоящето изобретение предоставя също метод за лечение на индивид с имунологично нарушение, медиирано от VLA-1, характеризиращ се с това, че се въвежда на индивида ефективно количество антитяло на това изобретение. Например, този метод е използван за лечение на човек да облекчава, подобрява, стабилизира, възстановява, предпазва, намалява или © забавя прогресиране на разстройството. Алтернативно, този метод е използван профилактично за лечение на индивид в риск от развитие на имунологично нарушение, така че да предотвратява или забавя началото на разстройството. “Ефективно количество” от състава може да бъде въвеждано в една или повече дозировки.
VLA-1 медиирани имунологични разстройства включват, но не се ограничават до разстройства, при които нивото на VLA-1 активността е повишено в една или повече тъкани, в сравнение с нормалния индивид. Примери за такива разстройства са кожни състояния (например, псориазис, екзема, изгаряния, дерматит и абнормна пролиферация на клетките на космения фоликул), © фиброза (например бъбречна или белодробна фиброза), алергичен ринит, респираторен дистрес синдром, астма, бронхит, тендинит, бурсит, треска, мигренозни главоболия, гастроинтестинални състояния (например, възпалително заболяване на червата, болест на Crohn, гастрит, възбудим чревен синдром, колит и колоректален рак), съдови заболявания (например, атеросклероза), periarteritis nodosa, тиреоидит, апластична анемия, болест на Hodgkin, ревматична треска, остеоартрит, автоимунни заболявания (например, тип I диабет, миастения гравис, ревматоиден артрит, системен лупус еритематозус и множествена склероза), саркоидоза, нефротичен синдром, бъбречна недостатъчност, Bechet’s синдром, полимиозит, гингивит, свръхчувствителност (например, забавен тип свръхчувствителност или непосредствена свръхчувствителност), отхвърляния на трансплант, заболяване на реципиента спрямо присадката (GVHD), конюнктивит, оток появяващ се след нараняване, миокардна исхемия и ендотоксин шок синдром.
Настоящето изобретение предоставя също метод за определяне нивото на VLA-1 в тъкан (например, тьканна проба и телесна течност), характеризира ще се с контактуване на тъканта (например, in vivo или in vitro) с антитялото на изобретението и след това определяне свързването на антитялото с тъканта, при което се определя нивото на VLA-1 в тъканта.
Както тук е използвано, антитялото на това изобретение може да бъде, например мишо антитяло, хуманизирано антитяло или химерно антитяло. То може да бъде цяло антитяло (т.е. с две пълноверижни леки вериги и две пълноверижни тежки вериги) на всеки изотип и подтип (например, IgM, IgD, IgG-i, lgG2, lgG3, lgG4, IgE, 1дА1 и lgA2; c kappa или lambda лека верига). Алтернативно, антитялото на това изобретение се отнася за антиген-свързващ фрагмент (например, Fab, F(ab’)2 и единична верига Fv) на цяло антитяло.
Настоящето изобретение предоставя още кристализируеми състави и кристали на комплекси, образувани от плъши-човешки химерен α1 -I домен (мутант RAH) и hAQC2 Fab фрагмент, и методи за използване на такива състави и кристали. Това изобретение предоставя също структурните координати и свързващи места на химерния домен и hAQC2 Fab фрагмента. Атомните координати производни от кристалната структура описана тук, предоставят структурна база за биологичните активности на hAQC2, както и база за рационален дизайн на VLA-1 агонисти или антагонисти с . предсказани биологични активности (например, нискомолекулни съединения или антитела като hAQC2 варианти).
Кристалната структура представена тук е първата кристална структура на а1-1 домен на един а1р1интегрин/ЕаЬ комплекс. Тази структура показва остатъците, критични за Fab свързване с а1-1 домен. В допълнение, Fab се свързва във възможното колаген-свързващо място и инхибира свързването на колаген. Аминокиселинни остатъци открити в свързващото място на а1-1 домена включват Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, ® Glu192, GIU218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224,
Asp257, His261, Asn263, Arg291 и Leur294 (номериране на кристал). Остатъци на Fab фрагмента, които е намерено, че се свързват с α1 -I домена включват лековерижни остатъци Asn30, Tyr48, Тгр90, Ser91, Asn93 и Тгр95, и тежковерижни остатъци Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, Gly 100 и Asp101 (кристално номериране).
Това изобретение предоставя също компютер за получаване три-димензионално изображение на молекулен комплекс, където молекулният комплекс е определен от набор структурни координати на един комплекс на химерен I домен на един Οα1β1 интегрин RAH и хуманизирано антитяло hAQC2, съгласно Фигура 19; или хомолог на молекулния комплекс, хомологът притежава средно квадратно отклонение от атомите на гръбнака на аминокиселините не повече от 0.65 А. Компютерът включва устройство за четене и носител (запаметяващо устройство, медиум), включително запаметен материал, кодиран с устройство за четене на данни, където данните съдържат най-малко една част от структурните координати на комплекса, съгласно Фигура 19; работна памет за съхранение на инструкции за обработка на данни с устройство за четене; централна процесираща единица, свързана с работната памет и с устройство за четене с носител, за обработка на данни с устройство за четене в три-димензионални изображения; и монитор свързан с централна-процесираща единица за представяне три-димензионалното изображение.
Това изобретение освен това представя компютер за тридимензионално изображение на молекула или молекулен комплекс, включително свързващо място, определено със структурни координати на hAQC2 аминокиселини, включително най-малко седем (например, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16) лековерижни остатъци Asn30, Туг48, Trp90, Ser91, Asn93 и Тгр95 и тежковерижни © остатъци Ser30, Arg31, Тгр47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO и Asp101 (кристално номериране), съгласно Фигура 19; или хомолог на молекулата или комплекса, кьдето хомологът включва свързващо място, което има средно квадратно отклонение от атомите на гръбнака на hAQC2 аминокиселините не повече от 1.10 А. Това изобретение предоставя също компютер за получаване на три-димензионално изображение на: едно свързващо място, определено от структурни координати на hAQC2 аминокиселини, включително най-малко седем (например, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16) на лековерижни остатъци Asn30, Туг48, Тгр90, Ser91, Λ Asn93 и Тгр95, и тежковерижни остатъци Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, ® Gly53, His56, Туг58, Phe99, GlylOO и Asp101 (кристално номериране), съгласно Фигура 19, едно свързващо място на хомолог, който има средно квадратно отклонение от атомите на гръбнака на hAQC2 аминокиселините не повече от 1.10 А
Това изобретение предоставя също метод за идентифициране инхибитор на I домен на един интегрин, включително етапите на използване на структурни координати на hAQC2 аминокиселини, включително най-малко седем (например, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16) на лековерижни остатъци Asn30, Туг48,
Trp90, Ser91, Asn93 и Trp95 и тежковерижни остатъци Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO и Asp1O1 (номериране на кристал), съгласно Фигура 19 или + средно квадратно отклонение от атомите на гръбнака на hAQC2 аминокиселините не повече от 1.10 А, за създаване на тридимензионална структура на свързващо място; използвайки тридимензионалната структура за планиране или подбор на потенциален антагонист; синтезиране на потенциален антагонист; и контактуване на потенциален антагонист с hAQC2 за определяне способността на потенциален антагонист да взаимодейства с hAQC2, където способността на потенциалния антагонист да взаимодейства с hAQC2 показва, че потенциалният антагонист е инхибитор на I домен. Изобретението освен това предоставя инхибитор на I домен на интегрин, идентифициран по този метод.
Изобретението предоставя също компютер за получаване три-димензионално изображение на молекула или молекулен комплекс включително: свързващо място определено от структурни координати на I домен аминокиселинни остатъци Asp 154, Ser 156, Asn 157, Ser 158, Tyr 160, Glu192, Gln218, Arg 219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 и Leu294 (кристално номериране), съгласно Фигура 19; или хомолог на молекулата или молекулен комплекс, където хомологът включва второ свързващо място, което има средно квадратно отклонение от атомите на гръбнака на I домен аминокиселините, не повече от 0.65А. Това изобретение предоставя също компютер за получаване три-димензионално изображение на: първо свързващо място, определено от структурни координати на I домен аминокиселинни остатъци Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 и Leu 294 (кристално номериране), съгласно фигура
19; или свързващо място на хомолог, който има средно квадратно отклонение от атомите на гръбнака на I домен аминокиселините не по-голямо от 0.65А.
Това изобретение предоставя също компютер за получаване три-димензионално изображение на молекула или молекулен комплекс включително: едно свързващо място, определено от структурни координати на I домен аминокиселини, включващо най-малко три от остатъците Glu192, Gln218, Arg219, Gly220 и Gly221 (кристално номериране), съгласно Фигура 19; или хомолог на молекулата или молекулен комплекс, където хомологът включва второ свързващо място, което има средно квадратно отклонение от атомите на гръбнака на I домен аминокиселините не по-голямо от 1.0 А. Освен това изобретението предоставя компютер за получаване три-димензионално изображение на свързващо място, определено от структурни координати на I домен аминокиселини, включващо най-малко три от остатъци Glu192, Gln218, Arg219, Gly220 и Gly221 (кристално номериране), съгласно Фигура 19; или свързващо място на хомолог, който има средно квадратно отклонение от атомите на гръбнака на I домен аминокиселините не по-голямо от 1.0 А.
Освен това изобретението предоставя методи за използване на тези три-димензионални изображения, за планиране на химични единици, които се свързват с химерния домен или hAQC2 Fab фрагмента, или части от него и действат като потенциални инхибитори на химерния домен или hAQC2 Fab фрагмента, или части от него. Това изобретение също е свързано със състави, включващи химични единици, като инхибитори и варианти на химерния домен или варианти на hAQC2 Fab фрагмента, където такива химични единици и варианти са разумно планирани с помощта на структурните координати на химерния домен или hAQC2 Fab фрагмента, или свързващи места.
Изобретението освен това се отнася за използване на гореидентифицираните химични единици за лечение или профилактика на състояния, свързани с несъответна или абнормна α1β1 активност у даден индивид.
Освен това изобретението предоставя метод за идентифициране инхибитор на I домен на един интегрин, включително етапите на използване структурните координати на I домен аминокиселинни остатъци Asp154, Ser156, Asn 157, Ser158, Tyr160, Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, © Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 и Leu294 (кристално номериране), съгласно Фигура 19, за създаване на тридимензионална структура на свързващо място; използване тридимензионалната структура за планиране или подбор на потенциален антагонист; синтезиране на потенциален антагонист; и контактуване на потенциалния антагонист с I домен, за определяне способността на потенциалния антагонист да взаимодейства с I домен, където способността на потенциалния антагонист да взаимодейства с I домен показва, че потенциалният антагонист е инхибитор на I домен.
Това изобретение предоставя също метод за v идентифициране инхибитор на I домен на един интегрин, характеризиращ се с етапите на използване структурните координати на най-малко три от I домен аминокиселини, включително остатъци Glu192, Gln218, Arg219, Gly220 и Gly221 (кристално номериране), съгласно Фигура 19, или + средно квадратно отклонение от атомите на гръбнака на I домен аминокиселините не по-голямо от 0.65А, за създаване три-димензионална структура на свързващо място; използване три-димензионалната структура за планиране или подбор на потенциален антагонист;
синтезиране на потенциален антагонист; и контактуване потенциалния антагонист с I домен, за определяне способността на потенциалния антагонист да взаимодейства с I домен на интегрин, където способността на потенциалния антагонист да взаимодейства с I домен показва, че потенциалният антагонист е инхибитор на I домен. Това изобретение предоставя също инхибитор на I домен на интегрин, идентифициран с този метод.
Други особености и предимства на изобретението ще бъдат видими от следното подробно описание и от претенциите.
© КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ПРИЛОЖЕНИТЕ ФИГУРИ
Фигура 1. Колаген-свързващи интегрини α1β1 и α2β1 на активирани левкоцити. (А). Проточен цитометричен анализ на експресията на а1 и α2β1 по IL-2-акгивирани спленоцити (d 11). Клетките са белязани или с анти-а1 mAb, анти-а2 mAb, или несвързващо се контролно mAb (сиви линии) и последвано от FITCанти-хамстер имуноглобулин. (В) Ефект на анти-а1 и анти-а2 mAbs върху левкоцитна адхезия с колаген. 105 IL-2 активирани спленоцити са третирани с указаните mABs за 15 минути преди посяване върху тип IV или тип I колаген-покрити ямки за 1 час на 37°С. Адхезия е изчислена както е илюстрирано в Пример I и е изразена като % v адхезия спрямо контролни mAb-третирани клетки. Тестове за адхезия са правени в три успоредни проби и са проведени наймалко три независими експерименти. Показан е един представителен експеримент.
Фигура 2. Ефект на анти-интегрин mAbs върху ефекторната фаза на забавен-тип свръхчувствителност. SRBCсензитизирани мишки са инжектирани интраперитонеално с указаните mAbs 1 час преди SRBC провокация. Дебелина на възглавничката на лапа е измервана 20 часа след антигенна провокация и резултати са представени като % увеличение дебелината на възглавничката на лапата + SEM както е илюстрирано в Пример 2. Тези данни представляват обобщение на осем експеримента с п= 79 (PBS), 68 (контролни Ig от хамстер), 68 (анти-а1), 18 (анти-а1+анти-а2), 45 (анти-а4),18 (анти-а5), 20 (антиаб) и 10 (анти-βΐ). Използваните mAbs са: На4/8 (контролна 1д група 2 от хамстер), На31/8 (анти-а1), На1/29 (анти-а2), PS/2 (анти-а4), 5Н10-27 (анти-а5), GoH3 (анти-аб) и ΗΜβ1-1(8ΗΤΠ-β1).
Фигура 3. Ефект на анти-интегрин mAbs върху ефекторната фаза на контактна свръхчувствителност. FITCсензитизирани мишки са инжектирани интраперитонеално с указаните mAbs 4 часа преди FITC провокация. Измервана е дебелината на ухо в началото и след 24 часа, и резултатите са представени като % нарастване дебелината на ухото + SEM, както е илюстрирано в Пример 3. Тези данни представят обобщение на осем експеримента с n=74 (PBS) , 60 (контролни Ig от хамстер), 26 (анти-1САМ-1), 44 (анти-а1), 44 (анти-а2), 38 (анти-а1 + анти-а2), 36 (анти-а4), 16 (анти-а5), 26 (анти-а4+анти-а5), 24 (анти-аб), и 22 (анти-βΐ). Използвани са mAbs от хамстер: На4/8 (контролна Ig група 2 от хамстер), На31/8 (анти-а1), На1/29 (анти-а2), ΗΝβ1-1 (анти-βΐ), ЗЕ2 (анти-1САМ-1); използвани са mAbs от плъх : R35-95 и R35-38 (контролен плъши lgG2a и плъши lgG2b, сътоветно), PS/2 (анти-а4), 5Н10-27 (анти-а5), GoH3 (анти-аб).
Фигура 4. Контактни хиперсензитивни отговори в alдефицитни мишки, сравнени с див-тип мишки. FITC-сензитизирани мишки са инжектирани интраперитонеално с указаните mAbs 4 часа преди FITC провокация. Дебелината на ухото е измерена при изходното ниво и след 24 часа, и резултатите са представени като % повишение дебелината на ухо + SEM, както е илюстрирано в Пример 4. Използвани са групи от четири до пет мишки за дадено условие и всички експерименти са проведени минимум три пъти. Показан е един представителен експеримент.
Фигура 5. Ефект на анти-а1 и анти-а2 mAbs върху индуцирано с кротоново масло неспецифично възпаление. Мишки са инжектирани интраперитонеално с указаните mAbs 4 часа преди намазването на ухото с кротоново масло. Дебелината на ухото е измервана на изходното ниво и след 24 часа и резултатите са представени като % нарастване дебелината на ухото + SEM, както е илюстрирано в Пример 5. Използвани са групи от четири до пет мишки за дадено условие и всички експерименти са проведени минимум три пъти. Показан е един представителен експеримент.
Фигура 6. Ефект на анти-а1 и а2 mAbs при колаген тАЬиндуциран артрит. Мишки са инжектирани интраперитонеално с анти-колаген mAbs при ден 0, последвано от LPS на ден 3. Мишки са инжектирани интраперитонеално с указаните mAbs всеки 3-ти ден, започвайки на ден 0. Клинично артрит е проявен 2-3 дни след LPS инжекция и продължава за няколко седмици. Всеки крайник е оценяван по 0 до 4 скала всеки 3-ти ден, както е илюстрирано в Пример 6 и резултатите са изразени като средна аритметична стойност между ден 9 и ден 15 (+SEM) на всичките четири крака. Тези данни представляват обобщение от четири експеримента, като всеки експеримент се състои от групи с по три до четири мишки за дадено условие.
Фигура 7. Ефект на анти-а1 и а2 mAbs при колаген тАЬиндуциран артрит. Превантивно третиране на мишки с анти-а1 или с анти-а2 mAb понижава артритните стойности. Мишки са третирани с анти-колаген mAbs на ден 0, последвано от LPS на ден 3. Артрит е проявен на ден 6 и продължава за няколко седмици. Мишки са третирани с указаните mAbs всеки трети ден, започвайки от ден 0. Всеки крайник е оценяван и е определен въз основа на 0 до 4 скала всеки 3-ти ден. Резултатите са изразени като средна аритметична стойност между ден 9 и ден 15 ( + SEM) на всичките четири крака (максимална стойност 16). Използвани са групи от по 4 мишки за дадено условие; представена е средна от 12 експеримента. В. а1дефицитни мишки имат редуцирана артритна стойност, сравнима с анти-а1 mAb-третирани див-тип мишки. Експериментални подробности и отчитане са представени по-горе. Използвани са групи от по 4 мишки за дадено условие; представена е средната стойност от 2 експеримента.
Фигура 8. Развитието на артрит е забавено в отсъствието на лимфоцити и инхибиране на артрит с анти-1а mAb се проявява в отсъствието на лимфоцити. Див-тип В6,129 или RAG-1-дефицитни В6,129 мишки са третирани с анти-колаген mAbs на ден 0, последвано от LPS на ден 3. Артритът е видим на ден 6 и продължава за няколко седмици. Мишки са третирани с указаните антитела всеки 3-ти ден, започвайки от ден 0. Всеки крайник е оценяван и е давана стойност по 0 до 4 скала всеки 3-ти ден. Резултатите са изразени като средна артритна стойност за крайник (максимална оценка 4). Използвани са групи от 4 мишки за дадено условие.
Фигура 9. Доза отговор на анти-а1 mAb инхибиране на артрит. Див тип Balb/c мишки са третирани с анти-колаген mAbs на ден 0, последвано от LPS на ден 3. Артрит е изявен на ден 6 и продължава няколко седмици. Мишки са третирани интраперитонеално с указаната доза с На4/8 (изотип контрола) или На31/8 (анти-а1) mAbs всеки 3-ти ден започвайки на ден 0. Всеки крайник е оценяван по 0 до 4 скала всеки 3-ти ден. Резултатите са изразени като средна артритна оценка за крайник (максимум оценка 4). Използвани са групи от 4 мишки за дадено условие.
Фигура 10. Терапевтично третиране с анти-а1 mAb може да понижи артритната оценка. Див-тип Balb/c мишки са третирани с анти-колаген mAbs на ден 0, последвано от LPS на ден 3. Артрит е проявен на ден 6 и продължава за няколко седмици. Мишки са третирани интраперитонеално с mAbs (250 pg) или Ig слет белтък (200 pg) всеки 3-ти ден, започвайки на ден 4. Мишките са получавали mAb (На4/8 изотипна контрола или На31/8 анти-а1), Ig слет белтък (изотипна контрола Ig или TNF-R55-lg) или комбинация от двата (250 pg На31/8 и 200 pg TNF-R55-lg). Всеки крайник е оценяван по 0 до 4 скала всеки 3-ти ден. Резултатите са изразени като средна артритна оценка за крайник (максимална оценка 4). Използвани са групи от 4 мишки за дадено условие.
Фигура 11. Локализиране на епитоп за анти-а1 I домен блокиращи mAbs. Аминокиселинна последователност на плъши (горе; SEQ ID N0:63) и човешки (долу; остатъци 91-97 на SEQ ID N0:64) α1-Ι домен. Остатъците, които включват MIDAS (метален йон зависимо адхезионно място) мотив, са представени задебелено. Човешките аминокиселини, които заместват съответните плъши остатъци (RAH), са представени под плъшата последователност в заградената област. За яснота, номерирането на остатъците в текста се отнасят за тази фигура, ако не е обозначено по друг начин, например номериране на кристал. В. Нарастващи концентрации на mAb AJH10 (АТСС No. РТА-3580; депозирано съгласно Будапещенски Договор с Американската колекция за типове култури (American Type Culture Collection) Manassas, VA, USA на 2 август, 2001) са свързани с платки, покрити с 30 pg/ml човешки (кръгчета), плъши (триъгълничета) или RAH (квадратчета) а1-1 домен. Показаните данни са представителни за три експеримента.
Фигура 12. Аминокиселинна последователност на човешки а1-1 домен (SEQ ID N0: 64).
Фигура 13. Идентифициране на блокиращо тАЬ за а1-1 домена. А. Нарастваща концентрация на mAbs AEF3 (триъгълничета) или AJH1O (кръгчета) са свързани с платки покрити с 30 pg/ml α1-Ι домен. В. а1-1 доменът е третиран с нарастващи концентрации от mAbs AJH10 (ромбчета) или mAb BGC5 (квадратчета) и платки покрити със свързан колаген IV (2 pg/ml). С. К562-а1 клетки са третирани с нарастваща концентрация от mAbs AEF3 (триъгълничета) или AJH10 (кръгчета) и са свързани с покрити с колаген IV платки (5 pg/ml). 45-50% от добавените клетки адхерират с колаген IV. Показаните данни са представителни за три независими експерименти.
Фигура 14. Видова кръстосанафеактивност на блокиращите mAbs, анализирана с флуоресцентно активирано клетъчно сортировачно устройство (FACS). Клетки от заешки съдов гладък мускул са инкубирани с mAb AJH10 (долу) или мишо IgG контролно (горе) и са анализирани с флуоресцентно активирано клетъчно сортировачно устройство (FACS).
Фигура 15. а1-1 доменът свързва колаген. А. Нарастващи концентрации от човешкия а1-1 домен са свързани с платки, предварително покрити с 1цд/т1 колаген I (квадратчета) или колаген IV (кръгчета). Показаните стойности са коригирани за изходно свързване с BSA. В. 2 pg/ml човешки а 1-1 домен е смесен с нарастваща концентрация от едно анти-човешко а1 интегрин антитяло 5E8D9 (квадратчета) или едно анти-човешко а2-интегрин антитяло Α2ΙΙΕ10 (кръгчета), и след това е свързано с платки, предварително покрити с 1 цд/ml колаген IV. С. Платките са покрити с 1цд/т1 колаген IV или 3% BSA. al-Ι домен (2 цд/ml) е последователно свързан с покрити платки, платки в присъствието на 1тМ Мп2+, 1тМ Мд2+ или 5тМ EDTA. Показаните данни са представителни от три независими експерименти.
Фигура 16. Характеризиране на хуманизирани AQC2 форми. Оценявани са mAQC2 (триъгълничета), chAQC2 (кръгчета), hAQC2 (обърнати триъгълничета) и hAQC2’ (квадратчета).
A. Инхибиране на VLA-1 свързване с тип IV колаген.
B. Инхибиране на а1-1 домен свързване с тип IV колаген.
C. Свързване с имобилизиран а1-1 домен.
D. Конкуренция с биотинилирано mAQC2 за свързване с имобилизиран а1-1 домен.
Фигура 17. Характеризиране на хуманизирани AQC2 (форми с FACS.
Фигура 18. Характеризиране на хуманизирани AQC2 (форми с FACS.
Фигура 19. Координати на атомна структура за а1-1 домен/Fab комплекса, получени с рентгенова кристалография от кристали на този комплекс в Protein Data Bank (PDB) формат. Координатите на двата комплекса в асиметричната единица са изброени както следва.
Комплекс 1: молекула A = I домен на интегрин.
молекула Н = тежка верига на hAQC2 Fab молекула L = лека верига на hAQC2 Fab молекула М = Мп2+
Комплекс 2: молекула В = I домен на интегрин молекула X = тежка верига на hAQC2 Fab молекула Y = лека верига на hAQC2 Fab молекула М = Мп2+
Фигура 20. / домен-Fab комплекс. Панделковидна диаграма на I домен-Fab комплекса. I Доменът тежката и лека верига на антитялото са белязани. Мп2+ йон е показан като сфера. В. Едър план на MIDAS (Metal-Ion-Dependent-Adhesion-Site - металенйон-зависимо-адхезионно място) място, показващо образуването на координационна връзка на металния йон (сфера) с Asp101 (кристално номериране). Белтъчните главни вериги са представени като панделки и страничните вериги в топки и пръчици изображение. Цилиндрите представят взаимодействия между металния йон и белтъчните атоми. Тънките линии представляват Нвръзки. Фиг.20 е направена с софтуерна програма RIBBONS (Carson, 1991, J.Appl. Cryst. 24:958-961).
Фигура 21. Диаграма на система, използвана за провеждане инструкциите кодирани от средата за запаметяване от Фигури 22 и 23.
Фигура 22. Напречен срез на магнитна среда за запаметяване.
Фигура 23. Напречен срез на оптично устройство за четене на данни с носител (среда за запаметяване).
ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Откритие на настоящето изобретение е, че едно антитяло срещу интегрин (например, VLA-1) и негов фрагмент, по-специално, една а1-интегрин субединица, може да блокира взаимодействието на про-възпалителни левкоцити с компоненти на екстрацелуларния матрикс, включително, но не ограничено до, колаген, ламини и фибронектин. Това откритие илюстрира важността на адхезионните молекули на интегрин семейството, по-специално α1β1, в заобикалящата среда на периферната тъкан, при условия свързани с възпаление. То също се отнася за ролята на семейството на интегрини и техни фрагменти при възпаление, извън левкоцитно прикрепване и излизане от съдовете при ендотелната гранична повърхност, като подчертава важността на богатата на матрикс околна среда на периферната тъкан при имунни отговори и то разкрива периферните тъкани като нов пункт на интервенция за базирани на адхезия терапии.
I. Анти-интегрин антитела
Методите на настоящето изобретение планират използването на антитела срещу интегерини, където предвидените интегрини включват молекули, които съдържат една β верига, включително, но не ограничено до β1, β1, β3, β4, β5, β6, β7, βδ, нековлентно свързани с една а верига, включително, но не ограничено до α1, α2, α3, а4, а5, аб, а7, а8, а9, аЮ, aV, aL, аМ, аХ, aD, аЕ, allb. Примери на различните интегрини, предвидени за използване в изобретението включват, но не се ограничават до:
αϊβΐ, α2β1, α3β1, α4β1, α5βΙ, αόβΐ, α7β1, αδβΐ, α9β1, αΙΟβΙ, ανβΐ, αΐ,βΐ, αΜβΙ, αΧβΙ, αϋβΐ, αΐΐόβΐ, αΕβΙ;
α1β2, α2β2, α3β2, α4β2, α5β2, α6β2, α7β2, α8β2, α9β2, α10β2, ανβ2, οΦβ2, αΜβ2, αΧβ2, αϋβ2, αΙΙ6β2, αΕβ2;
α1β3, α2β3, α3β3, α4β3, α5β3, αόβ3, α7β3, α8β3, α9β3, α10β3, ανβ3, οΦβ3, αΜβ3, αΧβ3, αθβ3, αΙΠ>β3, αΕβ3;
α1β4, α2β4, α3β4, α4β4, α5β4, α6β4, α7β4, α8β4, α9β4, α10β4, ανβ4, αΙ,β4, αΜβ4, αΧβ4 αϋβ4, αΙΠ)β4, αΕβ4;
α1β5, α2β5, α3β5, α4β5, α5β5, αόβ5, α7β5, α8β5, α9β5, α10β5, ανβ5, aL₽5, αΜβ5, αΧβ5, αϋβ5, αΐη>β5, αΕβ5;
αϊβό, α2β6, α3β6, α4β6, α5β6, α6β6, α7β6, α8β6, α9β6, α10β6, ανβό, α£β6, αΜβ6, αΧβ6, αΒβό, αΙΙόβδ, αΕβ6;
α1β7, α2β7, <χ3β7, <χ4β7, α5β7, αόβ7, α7β7, α8β7, α9β7, α10β7, ανβ7, αΙφ7, αΜβ7, αΧβ7, αϋβ7, αΠδβ7, αΕβ7;
αϊβδ, α2β8, α3β8, α4β8, α5β8, α6β8, α7β8, α8β8, α9β8, αΙΟβδ, αΥβ8, ο±β8, αΜβ8, «Χβ8, αϋβ8, ccllbp8, αΕβ8;
Методите на настоящето изобретение също предвиждат използването на антитела срещу интегрин фрагменти, включително например антитела срещу само β верига, включително, но не ограничено до β1, β2, β3, β4, βδ, β6, β7, β8, както и само една α верига, включително, но не ограничено до α1, α2, α3, а4, а5, аб, а7, а8, а9, аЮ, aV, aL, аМ, аХ, aD, аЕ, allb. В допълнение, методите на настоящето изобретение освен това предвиждат използването на антитела срещу интегринови фрагменти, включително например антитела срещу I домена на а веригата, включително, но не ограничено до I домена от α1β1 (Briesewitz et al., 1993, J.Biol.Chem. 268:2989); α2β1 (Takada and Hemler, 1989, J.Cell Biol. 109:397), αΙ_β2 (Larson et al., 1989, J.Cell Biol. 108:703), αΜβ2 (Corbi et al., 1988, J.Biol.Chem., 263:12403) αΧβ2 (Corbi et all., 1987, EMBO J. 6:4023), αϋβ2 (Grayson et al., 1988, J.Exp.Med. 188:2187), αΕβ7 (Shaw et al., 1994, J.Biol.Cehm. 269:6016). В едно изпълнение, α1-Ι домен антигенен детерминант включва една аминокиселинна последователност от най-малко 6 съседни аминокиселини, където съседната последователност е намерена в рамките на последователността от Фигура 12. В сродно изпълнение, съседната последователност е Val-GIn-Arg-Gly-Gly-Arg (остатъци 91-96 на SEQ ID N0:64).
Методи за получаване на интегрини, за употреба в настоящето изобретение са известни на специалиста в тази област (виж например, Springer et al., 1990, Nature 346:425-434).
Изпълненията на настоящето изобретение освен това включват анти-интегрин поликлонални и моноклонални антитела. Изпълнения на настоящето изобретение включват моноклонално антитяло като анти-а1 моноклонално антитяло. Антитела за лечение, по-специално за лечение на хора, включват човешки антитела, хуманизирани антитела, химерни антитела и антиген свързващи фрагменти от цели антитела като Fab, Fab’, F(ab’)2 и F(v) антитяло фрагменти. Някои антитела на това изобретение могат също да включват белтъци, съдържащи една или повече имуноглобулинови леки вериги и/или тежки вериги, като мономери и хомо- или хетеро-мултимери (например, димери или тримери) на тези вериги, където тези вериги са по избор свързани с дисулфидни мостове или кръстосано свързани. Тези антитела могат да бъдат способни за свързване с един или повече антигени (например, а1, α2, аб или алфа-l домен съдържащ интегринови субединици).
Едно α1β1 функционално блокиращо антитяло както е използвано тук, се отнася за антитяло, което се свързва с а1-1 домена, например, остатъци 91-97 от Фигура 12 и блокира α1β1 функция, както е тестирано, например, по неговата способност да инхибира К562-а1 зависима адхезия с колаген IV (виж Пример 15).
Следващото описва различните методи за получаване на антитела на това изобретение. Методи, които са известни в тази област, но не са специфично описани тук, също са в обсега на това изобретение. Например, антитела на това изобретение могат също да бъдат идентифицирани като се използват фагов-дисплей антитяло библиотеки, като тези описани от Smith, 1985, Science 228:1315-7; U.S.Patents 5,565,332, 5,733,743, 6,291,650 и 6,303,313. Допълнителни антитела на това изобретение могат да бъдат получени чрез свързване тежките вериги, идентифицирани тук с несродна лека верига, например лека верига идентифицирана с фагов дисплей технология.
II. Не-човешки хибридомни антитела
Моноклоналните антитела на това изобретение могат да бъдат създадени с добре известна хибридомна технология. Например, Зг/-животни (например, мишки, плъхове или зайци) могат да бъдат имунизирани с пречистени или сурови αιβι препарати, клетки трансфектирани с кДНК конструкти, кодиращи оц, βι или и двата антигена, клетки които конститутивно експресират α-ιβ-ι и подобни. Антигенът може да бъде предоставен като пречистен белтък, белтък експресиран върху клетки, белтъчен фрагмент или негов пептид или като гола ДНК или вирусни вектори, кодиращи белтъка, белтъчен фрагмент или пептид. Серуми на имунизираните животни след това са тестирани за наличието на анти-αιβι антитела. В клетки са изолирани от животни, които са тестирани положително и са направени хибридоми с тези В клетки.
Антитела, секретирани от хибридоми, са скринирани за тяхната способност да се свързват специфично с VLA-1 (например, свързване с агтрансфекгирани клетки и не с не-трансфектирани родителски клетки) и за всякакви други желани особености, например притежание на желаните CDR консензус последователности, инхибиране (или не инхибиране в случая на неблокери) свързването между колаген и VLA-1.
Хибридомни клетки, които са тестирани положителни при скрининг тестовете, са култивирани в хранителна среда в условия, които позволяват клетките да секретират моноклоналните антитела в културелната среда. След това е събирана кондиционирана хибридомна културелна надстояща течност и антитела съдържащи се в надстоящата течност са пречистени. Алтернативно, желаното антитяло може да бъде получено чрез инжектиране хибридомните клетки в перитонеалната кухина на неимунизирано животно (например мишка). Хибридомните клетки пролиферират в перитонеалната кухина, секретирайки антитялото, което акумулира като асцитна течност. Антитялото може след това да бъде събрано чрез аспириране асцитната течност от перитонеалната кухина със спринцовка.
Моноклоналните антитела могат също да бъдат създадени чрез изолиране антитяло-кодиращите кДНКи от желаните хибридоми, трасфектиране на клетки гостоприемници от бозайник (например, СНО или NSO клетки) с кДНКи, култивиране на трансфектираните клетки гостоприемници и получаване на антитялото от културелната среда.
III. Химерни антитела
Моноклоналните антитела на това изобретение могат също да бъдат създадени чрез инженерно манипулиране на сродно хибридомно (например мишо, плъшо или заешко) антитяло. Например, сродно антитяло може да бъде променено чрез рекомбинантна ДНК технология, така че част или цялата прикачена и/или константни области на тежката и/или леката вериги са заменени със съответните компоненти на антитяло от други видове (например човек). Общо, променливите домени на инженерно манипулираното антитяло се запазват идентични или съществено такива на променливите домени на сродното антитяло. Такова инженерно манипулирано антитяло е наречено химерно антитяло и е по-малко антигенно в сравнение със сродното антитяло, когато е въведено у индивид от видовете, от които произхожда прикрепената и/или константна област (например човек). Методи за получаване на химерни антитела са добре известни в тази област. Човешки константни области включват такива произхождащи от IgG 1 и lgG4.
IV. Изцяло човешки антитела
Моноклоналните антитела на това изобретение включват също изцяло човешки антитела. Те могат да бъдат получени като се използват in vitro-праймирани човешки спленоцити, както е описано от Boerner et al., 1991, J.Immunol. 147:86-95, или като се използват фагов-дисплей антитяло библиотеки, както е описано в U.S.Patent 6,300,064.
Алтернативно, изцяло човешки антитела могат да бъдат получени с репертоарно клониране както е описано от Persson et al., 1991, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2432-2436; и Huang and Stellar, 1991, J.Immunol.Methods 141:227-236. В допълнение, U.S.Patent 5,798,230 (Aug. 25,1998) описва препарат от човешки моноклонални антитела от човешки В клетки, където човешки антитяло-продуциращи В клетки са обезсмъртени чрез инфектиране с Epstein-Barr вирус, или негово производно, което експресира Epstein-Barr вирус ядрен антиген 2 (EBNA2), един белтък необходим за обезсмъртяване. EBNA2 функцията впоследствие е изключена, което има за резултат повишаване на антитяло продукцията.
Някои други методи за получаване на изцяло човешки антитела включват използването на животни, които имат инакгивирани ендогенни lg локуси и са трансгенни за не-прередени човешки антитяло тежковерижни и лековерижни гени. Такива трансгенни животни могат да бъдат имунизирани с и след това са получени хибридоми от В клетки произхождащи от тях. Тези методи са описани в например, различните GenPharm/Medarex (Palo Alto, СА) публикации/патенти, отнасящи се до трансгенни мишки, съдържащи човешки lg минилокуси (например, Lonberg U.S. Patent 5,789,650); различните Abgenix (Fremont, СА) публикации/патенти с оглед на XENOMICE (например, Kucherlapati U.S. Patents 6,075,181, 6,150,584 и 6,162,963; Green et al., 1994, Nature Genetics 7:13-21; и Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15(2): 146-56); и различните Kirin (Japan) публикации/патенти отнасящи се за “трансомни” мишки (например, ЕР 843 961, и Tomizuka et al., 1997, Nature Genetics 16:133-1443).
V. Хуманизирани антитела
Моноклоналните антитела на това изобретение включват също хуманизирани версии на сродни анти-α-ιβι антитела, произхождащи от други видове. Едно хуманизирано антитяло е антитяло получено с рекомбинантна ДНК технология, при която някои или всички аминокиселини на човешка имуноглобулинова лека или тежка верига, които не са необходими за антигенно свързване (например, константните области и областите на рамката на променливите домени), са използвани да заместват съответните аминокиселини от леката или тежката верига на сродното, нечовешко антитяло. Например, една хуманизирана версия на мишо антитяло срещу даден антиген има на неговите тежка и лека вериги (1) константни области на човешко антитяло; (2) рамкови области от променливите домени на човешко антитяло; и (3) CDRs от мишо антитяло. Когато е необходимо, един или повече остатъци в човешките области на рамката могат да бъдат заменени с остатъци при съответните позиции в мишото антитяло, така че да запази свързващия афинитет на хуман изпраното антитяло спрямо антигена. Тази замяна понякога е назовавана “обратна мутация”. Хуманизирани антитела общо е по-малко вероятно да предизвикват имунен отговор у хора, в сравнение с химерни човешки антитела, тъй като първите съдържат значително по-малко не-човешки компоненти.
Методите за получаване на хуманизирани антитела са описани в, например Winter ЕР 239 400; Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-327 (1988); Vehoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536; Queen et al.,, 1989, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029; U.S.Patent 6,180,370; и Orlandi et al., 1989, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:3833. Общо, трансплантацията на миши (или други не-човешки) CDRs върху човешко антитяло е постигната както следва. кДНКи кодиращи тежко и лековерижни променливи домени са изолирани от хибридома. ДНК последователностите на променливите домени, включително CDRs, са определени чрез секвениране. ДНКи кодиращи CDRs са пренесени до съответните области на кодираща последователност на човешки антитяло тежко или лековерижен променлив домен чрез място насочена мутагенеза. След това са добавени генни сегменти от човешка константна област на желан изотип (например γ1 за СН и k за CL). Хуманизпраните тежко и лековерижни гени са коекспресирани в клетки гостоприемници от бозайник (например, СНО или NSO клетки) за получаване на разтворимо хуманизирано антитяло. За улесняване на широкомащабно получаване на антитела, често е желателно да се произвеждат такива хуманизирани антитела в биореакгори, съдържащи антитялоекспресиращите клетки, или да се произвеждат трансгенни бозайници (например, кози, крави или овце), които експресират антитялото в млякото (виж, например U.S.Patent 5,827,690).
Понякога, директен пренос на CDRs до човешка рамка, води до загуба на антиген-свързващ афинитет на полученото антитяло. Това е поради факта, че при някои сродни антитела, известни аминокиселини в областите на рамката, взаимодействат с CDRs и така повлияват общия антиген свързващ афинитет на антитялото. В такива случаи, би било критично да се въвеждат “обратни мутации” (по-горе) в области на рамката на акцепторното антитяло, за да се запази антиген-свързващата активност на сродното антитяло.
Общият подход за получаване на обратни мутации е известен в тази област. Например, Queen et al., (по-горе), Co et al.,
1991, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2869-2873 и WO 90/07861 (Protein
Design Labs Inc.) описват подход, който включва два ключови етапа.
Първо, човешките V рамкови области са избрани с компютерен анализ за оптимална хомология на белтъчна последователност с V регионална рамка на сродно мишо антитяло. След това, терциерната структура на миша V област е моделирана с компютер, за визуализиране аминокиселинни остатъци на рамката, които е възможно да взаимодействат с мишите CDRs и тези миши аминокиселинни остатъци след това са насложени върху хомоложна човешка рамка.
При този дву-етапен подход, има няколко критерии за планиране на хуманизирани антитела. Първият критерии е да се използва като човешки акцептор рамката от даден човешки имуноглобулин, който обикновено е хомоложен на не-човешкия донорен имуноглобулин, или да се използва една консензус рамка от много човешки антитела. Вторият критерий е да се използва донорната аминокиселина, а не акцепторната, ако човешкият акцепторен остатък е необичаен и донорният остатък е типичен за човешки последователности при един специфичен остатък на рамката. Третият критерий е да се използва донорния аминокиселинен остатък на рамката, а не акцепторния в позиции непосредствено съседни на CDRs.
Може също да бъде използван различен подход, както е описано в например, Tempest, 1991, Biotechnology 9:266-271. При този подход, V регионалните рамки производни от NEWM и REI тежки и леки вериги, съответно, са използвани за CDR-присадки без радикално въвеждане на миши остатъци. Едно предимство при използване на този подход е, че три-димензионалните структури на NEWM и REI променливи области са познати от рентгенова кристалография и така могат директно да бъдат моделирани специфични взаимодействие между CDRs и V остатъци на регионална рамка.
VI. Други средства
Моноклоналните антитела на това изобретение могат още да включват други съставки за да проявяват желаните функции. Например, антителата могат да включват една токсична част (например, тетанус токсоид или рицин) или радионуклид (например, 111 In или за насочено убиване на клетки от антителата (виж например, U.S.Patent 6,307,026). Антителата могат да включват една част (например биотин, флуоресциращи части, радиоактивни части, хистидин tag или други пептидни tags) за лесно изолиране или откриване. Антителата могат също да включват една част, която може да удължава техния полу-живот в серум, например една полиетилен гликол(РЕб) част и един член на имуноглобулиновото суперсемейство или негов фрагмент (например, част от човешка lgG1 тежковерижна константна област като прикрепените СН2 и СН3 области).
VII. Кристализиращи състави и кристали
Настоящето изобретение предоставя един кристализиращ състав, съдържащ комплекс от: (1) плъши-човешки химерен а1-1 домен (например, мутантен RAH), или част от него (например, полипептид включващ 135 до 336 аминокиселини на плъши-човешки химерен а 1-1 домен); и (2) един Fab фрагмент от hAQC2, или част от него (например, един полипептид включващ 3 до 213 аминокиселини на леката верига и/или един полипептид включващ 3 до 219 аминокиселини на тежката верига). Един примерен комплекс е представен на Фиг. 20. RAH а1-1 доменът може да включва, например аминокиселинни остатъци 145 до 336 (кристално номериране) (SEQ ID N0:59, по-долу) на плъшата а1 субединица. hAQC2 Fab фрагментите могат да включват лековерижни аминокиселинни остатъци 1 до 106 (например, 1-213) на SEQ ID
N0:3 и тежковерижни аминокиселинни остатъци 1 до 118 (например, 1-219) на SEQ ID N0:4. hAQC2 Fab фрагментите могат да бъдат получени чрез хидролиза с папаин на цялото антитяло или могат да бъдат направени с рекомбинантни методи. Fab фрагментите включват най-малко една антиген-свързваща част на променливите домени на леката верига и/или на тежките вериги на hAQC2.
145 TQLDIV
151 IVLDGSNSIY PWESVIAFLN DLLKRMDIGP KQTQVGIVQY
191 GENVTHEFNL NKYSSTEEVL VAANKIVQRG GRQTMTALGI
231 DTARKEAFTE ARGARRGVKK VMVIVTDGES HDNYRLKQVI
271 QDCEDENIQR FSIAILGHYN RGNLSTEKFV EEIKSIASEP
311 TEKHFFNVSD ELALVTIVKA LGERIF
(SEQ ID N0:59)
Някои кристализиращи състави и кристали на това изобретение могат да съдържат една молекула или молекулен комплекс, който е хомоложен на <х1-1 домена и/или на hAQC2 Fab фрагмента чрез аминокиселинна последователност или чрез тридимензионална структура. Примери на хомолози включват, но не се ограничават до: а1-1 домена и/или hAQC2 Fab фрагмента с мутации, като консервативни замествания, добавяния, делеции или техни комбинации. “Консервативни замествания” се отнасят за заместващи остатъци, които са физически сходни по големина, форма, хидрофобност, заряд, и/или химични свойства със съответните референтни остатъци. Методи за идентифициране на една “съответна” аминокиселина, са известни в тази област и се базират на последователност, структурно подреждане, нейна функционална позиция или нейна комбинация в сравнение с кристалната структура, решена в настоящето изобретение.
Например, съответни аминокиселини могат да бъдат идентифицирани чрез наслагване атомите на главната верига на аминокиселините в а1-1 домен/пАОС2 комплекса и а1-1 домен и/или hAQC2 хомолог, като се използват известни софтуерни приложения, като QUANTA (Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA ©1998, 2000). Съответните аминокиселини могат също да бъдат идентифицирани като се използват програми за подреждане на последователности като “bestfit” програма, достъпна от Genetics Computer Group, която използва локалния алгоритъм на хомоложност, описан от Smith and Waterman в Adv.Appl. Math.2:482 ® (1981).
Кристализиращи състави на това изобретение могат освен това да включват един или повече компоненти, които улесняват кристализацията и/или са съвместими с условия на кристализация. Такива компоненти могат да включват, но не се ограничават до, буфер, соли, преципитиращи агенти и други агенти. Един компонент може да бъде 30% тегло/обем полиетилен гликол 1500 (PEG1500).
Настоящето изобретение предоставя също методи за получаване на кристали от кристализиращи състави, включително един комплекс на а 1-1 домен и една антиген-свързваща част от hAQC2 (например, Fab, Fab’ или други фрагменти, по-горе). Могат да бъдат използвани различни техники за кристализация в претендираното изобретение, включително, но не ограничени до парна-дифузия, диализа, микропартидна (microbatch), партидна и течно-течна дифузия. Парни дифузионни методи включват, но не са ограничени до стояща-капка (sitting-drop), висяща-капка (hangingdrop) и сандвич-капка (sandwich-drop) техники. Парни-дифузионни методи могат да използват техники за контрол степента на кристализация, като добавяне на масла върху капките или резервоарен разтвор. Кристализационни методи могат да включват смесване на резервоарен разтвор съдържащ преципитиращ агент с воден разтвор на комплекс от α1 -I домен и антиген-свързваща част на hAQC2, за получаване на кристализиращ състав. Сместа или кристализиращият състав могат след това да бъдат кристализирани като се използват различни горе-изброени техники. Кристализиращият състав на това изобретение може да бъде воден разтвор на един комплекс на а1-1 домен и антиген-свързваща част на hAQC2, съдържащ комплекса в концентрация от около 1 до 50 mg за ml, като концентрация около 5 до 15 mg за ml (например, 11 mg за ml).
VIII. Кристални структури и структурни координати
Това изобретение освен това предоставя тридимензионална структура на кристал, включително един комплекс на мутант RAH, и един hAQC2 Fab фрагмент при 2.8 А разделяне (Пример 24, по-долу). Три-димензионалните структури на други сродни кристали може също да бъде определена като се използват техники, описани тук и такива известни в тази област. Тридимензионалната структура на този комплекс е определена с набор от структурни координати, представени във Фиг. 19. Тези структурни координати са Cartesian атомни координати, производни на математически уравнения, свързани с образците, получени от дифракция на монохроматичен лъч на рентгенови лъчи с атомите или центровете на разсейване на кристалния комплекс на а1-1 домена и hAQC2 Fab фрагмента. Дифракционни данни най-напред са използвани за изчисление карта на електронната плътност на повтарящата се единица на кристала. Картата на електронната плътност след това е използвана за установяване позициите на отделните атоми на комплекса.
Това изобретение предоставя молекула или молекулен комплекс, определени от всички или от част от структурните координати на всички аминокиселини представени във Фиг. 19, както и хомолог на молекула или молекулен комплекс, където хомологът има средно квадратно отклонение от атомите на основната верига на тези аминокиселини между 0.00 А и 0.65 А, както и между 0.00 А и 0.60 А (например, между 0.00 А и 0.50 А). Терминът “средно квадратно отклонение” или “r.m.s.deviation означава среден квадрат
на средната аритметична от квадратите на отклоненията от средната. Това е начин за изразяване на отклонението или вариация от една тенденция или обект. За целите на това изобретение, “средно квадратно отклонение” или “r.m.s.positional deviation” (средно квадратно позиционно отклонение) определя вариацията в основната верига на един белтък от съответната част на основната верига на полипептида, както е определено от структурните координати описани тук.
Една молекула или молекулен комплекс на това изобретение може също да включват едно свързващо място, определено от структурни координати на най-малко седем аминокиселини на hAQC2 Fab фрагмента, подбран от групата включваща лековерижни остатъци Asn30, Tyr48, Тгр90, Ser91, Asn93 и Тгр95 и тежковерижни остатъци Ser30, Arg31, Тгр47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO и Asp101 (кристално номериране) съгласно Фиг. 19; или хомолог на молекулата или молекулния комплекс, където хомологът включва едно свързващо место, което има средно квадратно отклонение от атомите на основната верига на една или повече от тези аминокиселини между 0.00 А и 1.10 А, така както между 0.00 А и 1.00 А (например, между 0.00А и 0.50 А). Терминът “свързващо място както тук е използван, се отнася за област от молекула или молекулен комплекс, която в резултат на нейната форма и заряд, преимуществено се свързва с друга химична единица. Терминът “място” включва, но не е ограничен до бразда, цепка, канал или джоб. Например, свързващи места на α1 -I домена включват едно колаген-свързващо място (Emsley et al., 1997, по-горе), едно антитяло-свързващо място и едно алостерично (или IDAS) свързващо място (Huth et al., 2000, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:5231-5236). Терминът “химична единица” включва, но не се ограничава до, всяка молекула, молекулен комплекс, съединение или негов фрагмент. Терминът “асоцииран със” се отнася за асоцииране или свързване в условия на близост между химична единица, или част от нея и свързващ джоб или свързващо място на белтъка. Асоциирането може да бъде не-ковалентно - където юкста позицията е енергетично благоприятна за свързване с водородни връзки или van der Waals или елекгрични взаимодействия - или може да бъде ковалентно.
Молекула или молекулен комплекс на това изобретение могат да включват едно свързващо място, определено от структурни координати на а1-1 домен аминокиселини, подбрани от групата състояща се от остатъци Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 и Leu294 (кристално номериране), съгласно Фиг. 19, или един хомолог на молекула или молекулен комплекс, където хомологът включва едно свързващо място, което има средно квадратно отклонение от атомите на основната верига на α1 -I домена аминокиселини между 0.00 А и 0.92 А
Молекула или молекулен комплекс на това изобретение също могат да включват едно свързващо място, определено от структурни координати на а1-1 домен аминокиселини, подбрани от групата състояща се от остатъци Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, и Gly221, (кристално номериране), съгласно Фиг. 19, или един хомолог на молекулата или молекулния комплекс, където хомологът включва едно свързващо место, което има средно квадратно отклонение от атомите на основната верига на а1-1 домена аминокиселини между 0.00А и 0.30 А.
Специалистът в тази област ще разбере, че един набор от структурни координати за полипептид е относителен набор от точки, които определят форма в три измерения. Така, възможно е, един изцяло различен набор от координати, които определят сходна или идентична форма, да бъдат създадени като се използват математични манипулации на структурните координати във Фиг.19. Например, структурните координати могат да бъдат манипулирани с кристалографски пермутации на структурните координати, фракционализиране на структурните координати, добавяния на цяло число или изваждания от набори на структурни координати, инверсия на структурни координати или всякаква тяхна комбинация. Освен това, леки вариации на индивидуалните координати ще имат слаб ефект на общата форма.
Алтернативно, модификация в кристалната структура дължаща се на мутации, като добавяния, замествания и/или делеции на аминокиселини, или други промени в някой от полипептидните компоненти (например, hAQC2 Fab фрагмент или един а 1-1 домен), които изграждат кристала, могат също да са за сметка на вариации в структурните координати. Ако такива вариации са в рамките на приемлива стандартна грешка, в сравнение с оригиналните координати, получената три-димензионална форма се разглежда като същата както немодифицирания кристал.
Следователно е необходимо да се определи, дали една единица е достатъчно сходна с цялата или част от структурата, описана тук, за да бъде разглеждана като същата. Такива анализи могат да бъдат направени като се използват текущи софтуерни приложения, като QUANTA (Accelrys, Inc. and Molecular Simulations, Inc. San Diego, CA © 1998, 2000) и 0 (Jones et al., 1991, Acta Cryst. Α47Ί10-119), и придружаващи указания за ползване. Приложението на Молекулно Сходство на QUANTA и LSQ приложението на О, позволява сравнения между различни структури, различни конформации на същата структура и различни части на същата структура. Общата процедура използвана в двете приложения е да се въведе структурата, която ще се сравнява, да се определят еквивалентните атомни позиции в тези структури, да се извърши операция на напасване и да се анализират резултатите.
Когато всяка структура е вложена в заявката, дава се едно наименование и се идентифицира като фиксираната структура или подвижни структури. Атомната еквивалентност обикновено е определена с еквивалентни атоми, като атоми на белтъчната основна верига (N, Са, С и 0) за всички консервирани остатъци между двете структури, които се сравняват. Подвижната структура е транслирана и ротирана за получаване на един оптимум или наймалки квадрати съответни на фиксираната структура. Средната квадратна разлика на съвпадението спрямо специфицирани чифтове на еквивалентен атом е съобщено с двете програми в енгстрьоми.
За целите на това изобретение, всеки молекулен комплекс, който има средно квадратно отклонение на консервирани атоми на остатък от главната верига (N, Са, С, 0) между 0.00 А и 1.50 А, като между 0.00 А и 1.00 А (например между 0.00 А и 0.50 А), когато е насложен върху съответните атоми на главната верига, описани със структурни координати изброени във Фиг. 19, са разглеждани като идентични.
IX. Определяне на други кристални структури
Структурните координати представени във Фиг. 19 могат също да бъдат използвани да помагат за получаване на структурна информация за друга кристализирана молекулна единица, като други hAQC2 съдържащи аминокиселинни замествания в една от неговите CDRs. Това може да бъде постигнато с добре известни техники, включително молекулно заместване, един особено полезен метод за определяне структурите на мутанти и хомолози на а1-1 домен/Fab.
Структурните координати представени във Фиг. 19 могат също да бъдат използвани за определяне на поне една част от тридимензионапната структура на молекулни единици, които включват поне някои структурни особености, сходни с най-малко една част от а1-1 домена на hAQC2 Fab. Следователно, друго изпълнение на това изобретение предоставя метод за използване молекулно заместване, за получаване структурна информация за една кристализирана молекула или молекулен комплекс с неизвестна структура, включващ етапите на: (а) създаване на рентгенова дифракционна картина от кристализирала молекула или молекулен комплекс; и (Ь) прилагане на поне една част от структурните координати, представени във Фиг. 19 към рентгеновата дифракционна картина, за създаване на три-димензионална карта на електронна плътност на молекулата или молекулен комплекс с неизвестна структура.
Използвайки молекулно заместване на всички или част от структурните координати, представени във Фиг. 19, може да бъде използвано за определяне неизвестна структура на кристализирала молекулна единица, по-бързо и ефективно, отколкото да се опитва да се определи такава информация ab initio. Молекулно заместване осигурява точно определение на фазите за неизвестна структура.
Фазите са един фактор в уравнения, използвани за решаване кристални структури, които не могат пряко да бъдат определени. Получаване на точни стойности за фазите, с методи различни от молекулно заместване, често може да бъде продължителен процес, който включва повтарящи се цикли на апроксимиране и усъвършенстване и силно затруднява решението на кристални структури. Обаче, когато кристалната структура на един белтък, съдържащ най-малко една хомоложна част е решена, фазите от известната структура често могат да предоставят задоволително определение на фазите за неизвестната структура.
© Така, молекулно заместване включва създаване на предварителен модел на молекула или молекулен комплекс, чиито структурни координати са неизвестни, чрез ориентиране и позициониране на съответната част от комплекса съгласно Фиг. 19, в рамките на единицата клетка на кристала на неизвестната молекула или молекулен комплекс, така както би съответствало най-добре за наблюдаваната рентгенова дифракционна картина на кристала на молекулата или молекулния комплекс,чиято структура е неизвестна. Фазите могат след това да бъдат изчислени от този модел и да бъдат комбинирани с наблюдаваните рентгенови дифракционни моделни амплитуди, за създаване карта на електронната плътност ® на структурата, чиито координати са неизвестни. Така, на свой ред могат да бъдат подложени на всякакви техники за моделно изграждане и структурно усъвършенстване, за получаване на крайна, точна структура на неизвестната кристализирана молекула или молекулен комплекс (Lattman, 1985, Meth.Enzymol. 115:55-77; Rossmann, ed., “The Molecular Replacement Method, lnt.Sci.Rev.Ser., No. 13, Gordon& Breach, New York, 1972). C този метод може да бъде решена структурата на всяка част от всяка кристализирала молекула или молекулен комплекс, която е достатъчно хомоложна на която и да е част на а1-1 домена и/или hAQC2 Fab фрагмента (съгласно Фиг. 19.).
X. Компютер и носител (среда за запаметяване)
За да се използват структурните координати на това изобретение, например тези представени във Фиг. 19, обикновено е необходимо да се превърнат координатите в три-димензионално изображение или форма. Търговски достъпни графични софтуерни програми, включително, но не ограничено до O(Jones et al., 1991, Acta Cryst. A47:110-119) и INSIGHTII (© Accelrys, Inc. and Molecular Simulations, Inc., San Diego, СА) са способни да създават тридимензионални изображения на молекули или молекулни комплекси, или части от тях, от един набор на структурни координати.
В съответствие с настоящето изобретение, структурните координати на молекулните единици на това изобретение, са съхранени в носителя с устройство за четене (например, един компютер). Използвайки компютер и съответен софтуер, такива данни могат да бъдат използвани за различни цели, като откриване на лекарства и рентгенов кристалографски анализ на други белтъчни кристали.
Съответно, устройство за четене на данни с носител може да включва материал за запаметяване на данни, кодиран устройство за четене, включително поне една част от структурните координати, представени на Фиг. 19. Компютерът може освен това да включва инструкции за получаване на три-димензионални изображения на молекулните комплекси на а1-1 домен и hAQC2 Fab фрагмента, чрез обработка с устройство за четене на данни на това изобретение. Компютерът на това изобретение може също да включва дисплей, графичен интерфейс за представяне, или едно входно устройство за придвижване и манипулиране на три-димензионалното графично изображение на структурните координати.
Това изобретение предоставя също компютер за определяне поне на една част от структурните координати, съответстващи на данните от рентгенова дифракция, получени от молекулен комплекс на α1β1 интегрин и Fab фрагмента на hAQC2 антитяло, където компютерът включва устройство за четене на данни с носител, включително запаметен материал, кодиран с устройство за четене, където данните включват поне част от структурните координати на молекулния комплекс на а1-1 домен и hAQC2 Fab фрагмента, съгласно Фигура 19 или данни от рентгенова дифракция, получени от кристалния молекулен комплекс. Компютерът освен това включва инструкции за извършване на Fourier трансформиране на координатни данни с устройство за четене и инструкции за обработка на тези дифракционни данни с устройство за четене в структурни координати. Този компютер може още да включва: функционираща памет за съхранение на инструкции за обработка на данни с устройство за четене; централна-процесираща единица свързана с функциониращата памет и с устройство за четене на данни; и по избор графичен интефейс или дисплей, свързан с централната-процесираща единица за представяне на три-димензионалното графично изображение на структурните координати на молекулата или молекулния комплекс.
Това изобретение предоставя още компютер за получаване на три-димензионално изображение на: молекула или молекулен комплекс, определени от поне една част или всичките структурни координати на всичките аминокиселини на а1-1домен и hAQC2 Fab фрагмента, представени във Фигура 19, или хомолог на молекулата или молекулния комплекс, където хомологът има средното квадратно отклонение от атомите на аминокиселините на основната верига между 0.00А и 1.50 А, като между 0.00 А и 1.00 А, (например между 0.00 А и 0.50 А). Още в това изобретение компютерът включва: устройство за четене на данни с носител, включително запаметен материал, кодиран с устройство за четене на данни, където данните включват поне част или всичките структурни координати на аминокиселините на целия а1-1 домен и Fab hAQC2 фрагмента, представени във Фигура 19.
Компютер на това изобретение може също да прави тридимензионално изображение на молекула или молекулен комплекс, включително едно свързващо место. Свързващото място може да бъде определено от структурни координати на най-малко седем аминокиселини на: hAQC2 Fab фрагмента, подбран от групата включваща лековерижни остатъци Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 и Тгр95, и тежковерижни остатъци Ser30, Arg31, Тгр47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO и Asp101 (кристално номериране), съгласно Фигура 19; или хомолог на молекулата или молекулния комплекс, където хомологът включва едно свързващо място, което има средно квадратно отклонение от атомите на основната верига на поне една аминокиселина на hAQC2 Fab фрагмента между 0.00 А и 1.10 А, като между 0.00 А и 1.00 А (например, между 0.00 А и 0.50 А). Освен това, компютерът на това изобретение включва: устройство за четене на данни с носител, включително запаметен материал, кодиран с устройство за четене на данни, където данните включват структурните координати на най-малко седем аминокиселини на hAQC2 Fab фрагмента, подбрани от групата състояща се от лековерижни остатъци Asn30, Туг48, Тгр90, Ser91, Asn93 и Тгр95, и тежковерижни остатъци Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Туг58, Phe99, GlylOO и Asp 101 (кристално номериране) съгласно Фигура 19.
Това изобретение предоставя също компютер за получаване три-димензионално изображение на: молекула или молекулен комплекс, включващ едно свързващо място, определено от структурни координати I домен аминокиселини, подбрани от групата състояща се от остатъци Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 и Leu294 (кристално номериране, съгласно Фигура 19; или хомолог на молекулата или молекулния комплекс, където хомологът включва едно свързващо място, което има средно квадратно отклонение от атомите на основната верига на I домен аминокиселините между 0.00 А и 0.92 А. Още в това изобретение, компютерът включва: устройство за четене на данни с носител, включително запаметен материал, кодиран с устройство за четене на данни, където данните включват структурните координати на I домен аминокиселини, подбрани от групата състояща се от остатъци Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, ТуИбО, Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Aeg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 и Leu294 (кристално номериране) съгласно Фигура 19.
Това изобретение предоставя също компютер за получаване на три-димензионално изображение на молекула или молекулен комплекс, включително едно свързващо място, определени от структурни координати на I домен аминокиселини, подбрани от групата състояща се от остатъци Glu192, Gln218, Arg219, Gly220 и Gly221 (кристално номериране), съгласно Фигура 19; или хомолог на молекула, включващ свързващо място, което има средно квадратно отклонение от атомите на главната верига на I домен аминокиселини между 0.00 А и 0.30 А. Още в това изобретение компютерът включва: устройство за четене данни с носител, включително запаметен материал, кодиран с устройство за четене на данни, където данните включват структурните координати на I домен аминокиселини, подбрани от групата състояща се от остатъци Glu192, Gln218, Arg219, Gly220 и Gly221 (кристално номериране), съгласно Фигура 19.
Фигура 21 демонстрира такова едно изпълнение. Система 10 включва един компютер 11, включително една централнапроцесираща единица (“CPU), една работна памет 22, която може да бъде, например RAM (random-access memory) или “core” (“сърцевинна”) памет, съхраняваща масова памет 24 (като един или повече дискови или лентови драйвери (двигателни механизми) или CD-ROM или DVD-ROM драйвери, една или повече катодно-лъчева тръба (“CRT”) дисплей терминали 26, една или повече клавиатури 28, една или повече входящи линии 30, една или повече изходящи линии 40, всички от които са взаимно свързани с конвенционална би-насочена система bus 50.
Входящ хардуер 36, свързан с компютер 11 чрез входящи линии 30, може да бъде осъществен по различни начини. Устройство за четене на данни на това изобретение може да бъде свързано като се използва модем или модеми 32, свързани чрез телефонна линия или определена линия 34 за данни. Алтернативно или допълнително, входящият хардуер 36 може да включва CD-ROM или DVD-ROM драйвери или лентови или дискови драйвиери 24 . За свръзка с дисплей терминал 26, клавиатура 28 може също да бъде използвана като входящо устройство.
Изходящ хардуер 46, свързан с компютер 11 чрез изходящи линии 40, може подобно да бъде осъществен чрез конвенционални устройства. Като пример, изходящ хардуер 46 може да включва CRT дисплей терминал 26, за представяне на графично изображение на свързващо място на това изобретение, като се използва програма, като QUANTA, както тук е описано. Изходящ хардуер може също да включва един принтер 42, така, че може да бъде получен изход на хардкопи (устройство за отпечатване на данни от екрана на дисплей) или диск драйв 24, да съхранява системен изход за покъсна употреба.
При опериране, CPU 20 координира използването на различни входящи и изходящи устройства 36, 46, координира достъпи за данни от масовото запаметяване 24 и достъпи за и от работната памет 22, и определя последователността на етапите за процесиране на данни. Могат да бъдат използвани известен брой програми за процесиране на данни с устройство за четене на това изобретение. Такива програми са обсъдени в съответствие с изчислителните методи за откритие на лекарство, както тук е описано. Специфични цитати за компонентите на хардуер система 10, са включени като подходящи навсякъде в следното описание на средата за запаметяане.
Фиг.22 представя напречен разрез на магнитна среда за запаметяване на данни 100, която може да бъде кодирана с устройство за четене на данни, което може да бъде извършено със система като 10 на Фигура 21. Среда 100 може да бъде конвенционална флопи дискета или хард диск, притежаващ подходящ субстрат 101, който може да бъде конвенционален, и подходящо покритие 102, което може да бъде конвенционално, от едната или двете страни, съдържащ магнитни домени (не видими), чийто поларитет или ориентация могат да бъдат магнитно променени. Среда 100 може също да има едно отверстие (не представено) за приемане оста на един диск драйв или друго съхраняващо данни устройство 24.
Магнитните домени на покритие 102 на среда 100, са поляризирани или ориентирани, така че да кодират по начин, който може да бъде конвенционален, устройство за четене на данни като това описано тук, за изпълнение със система, като система 10 на Фигура 21.
Фигура 23 представя напречен разрез на среда за запаметяване на оптично четими данни 110, която също може да бъде кодирана с такова устройство за четене на данни, или един набор от инструкции, което може да бъде изпълнено със система като система 10 на Фигура 21. Среда 110 може да бъде конвенционален компакт диск или DVD диск четящ само памет (CDROM или DVD-ROM) или презаписваща среда, като магнито-оптичен диск, който е оптично четим и магнито-оптично записващ. Среда 100 има подходящ субстрат 111, който може да бъде конвенционален и подходящо покритие 112, което може да бъде конвенционално, обикновено от едната страна на субстрат 111.
В случая на CD-ROM, както е добре известно, покритие 112 е отразяващо и е отпечатано с множество от вдлъбнатини 113 за кодиране данни с устройство за четене. Подреждането на вдлъбнатините е прочитано с отразяваща лазерна светлина на повърхността на покритие 112. Защитно покритие 114, което е значително прозрачно е предоставено отгоре на покритие 112.
В случая на магнитно-оптичен диск, както е добре известно, покритие 112 няма вдлъбнатини, но има множество магнитни домени, чийто поляритет или ориентация могат да бъдат променени магнитно, когато се загряват над известна температура, както с лазер (не е представено). Ориентацията на домените може да бъде разчетена чрез измерване поляризацията на лазерна светлина, отразена от покритие 112. Подреждането на домените кодира данните, както е описано по-горе.
XI. Рационален лекарствен дизайн
Настоящето изобретение позволява използването на структурно базирани и рационални техники за лекарствен дизайн, за планиране на подбрани и синтезирани или изолирани химични единици, като инхибитори на а1-1 домена, и за усъвършенстване на известни инхибитори на този домен. Тези инхибитори могат да бъдат способни да блокират колаген-свързващото място на VLA-1. Това изобретение позволява още използването на струкгурнобазирани и рационални техники за лекарствен дизайн, за планиране на варианти, които могат да действат като инхибитори на свързването на колаген.
Три-димензионалното изображение на това изобретение може да бъде използвано експериментално или изчислително за планиране на потенциални инхибитори, други химични единици, варианти на Fab фрагмент или комбинации от химични единици, които могат да се свързват и повлияват биологичните функции на hAQC2 Fab фрагмент или химерен а1-1 домен на текущото изобретение.
Специалистът в тази област може да използва един или няколко методи за подбор на химични единици, за тяхната способност да се асоциират с комплекс на hAQC2 Fab фрагмент или химерния а 1-1 домен на настоящето изобретение и по-специално със свързващо място на I домена или на Fab фрагмента.Този процес може да започне с визуален оглед на, например свързващото място за I домена или за Fab фрагмента на компютерния екран, въз основа координатите на комплекса във Фигура 19. Подбрани химични единици след това могат да бъдат позиционирани в разнообразие от ориентации, или поставени в рамките на едно индивидуално свързващо място или на I домен или на Fab фрагмента. Поставянето може да бъде направено като се използва софтуер като QUANTA, последвано от минимализиране на енергията и молекулните динамики със стандартни молекулни механични силови полета, като CHARMM (Molecular Simulations, Inc., Burlington, МА ©
1994) и AMBER (P.A.Kollman, University of California at San Francisco, © 1994).
Специализирани компютерни програми могат да участват в процеса на подбор на химични единици. Такива включват, inter alia:
1. GRID (Goodford, P.J., 1985, J.Med.Chem. 28:849-857). GRID e достъпна от Oxford University, Oxford, UK.
2. MCSS (Miranker, A. and M.Karplus, 1991, Proteins: Structure, Function and Genetics 11:29-34). MCSS е достъпна от Molecular Simulations, Burlington, MA.
3. AUTODOCK (Goodsell, D.S. and A.J. Olsen, 1990, Proteins: Structure, Function and Genetics 8:195-202). AUTODOCK e достъпна от Scripps Research Institute, La Jolla, CA.
4. DOCK (Kuntz, I.D. et al., 1982, J. Mol.Biol. 161:269-288). DOCK e достъпна от University of California, San Francisco, CA.
След като са подбрани подходящи химични единици, те могат да бъдат асемблирани в едно съединение. Асемблирането може да протича при визуален контрол върху взаимозависимостта на единиците една с друга върху три-димензионапното изображение, проявено на компютерния екран, във връзка със структурните координати на комплекса на hAQC2 Fab фрагмента и химерния α1 -I домен. Това е последвано от изграждане с мануален модел, като се използва софтуер като QUANTA или Sybyl.
Гореописаният процес на оценка за химични единици, може да бъде проведен по сходен начин за съединения или за варианти, които могат да свързват α1 -I домена.
Полезни програми в помощ на специалиста в тази област във връзка с индивидуалните химични единици включват:
1. CAVEAT (Bartlett, Р.А. et al. “CAVEAT: A Program to Facilitate the Structure-Derived Design of Biologically Active Molecules, In “Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems”, Special Pub., 1989, Royal Chem.Soc., 78:182-196). CAVEAT е достъпна от University of California, CA.
2. 3D Database systems като MACCS-3D (MDL Information Systems, San Leandro, СА). Тази област е обобщена в Martin, Y.C., 1992, J.Med.Chem. 35:2145-2154).
Φ 3. HOOK (достъпна от Molecular Simulations, Burlington, МА).
Вместо да се действа като се създаде инхибитор или свързващо съединение, по начин с последователни етапи една химична единица в дадено време, както е описано по-горе, свързващи съединения могат да бъдат планирани като цяло или “de novo”, като се използва или празно свързващо място (като свързващо място на а1-1 домена или hAQC2 Fab фрагмент) или по избор включвайки известна част(и) на известен а1-1 домен или hAQC2 Fab фрагмента свързващо съединение. Тези методи включват:
© 1. LUDI (Bohm, H.-J., 1992, J.Comp.Aid.Molec. Design 6:61-78).
LUDI е достъпен от Biosym Technologies, San Diego, CA.
2. LEGEND (Nishibata, Y. and A.ltai, 1991, Tetrahedron 47:8985). LEGED е достъпен от Molecular Simulations, Burlington, MA.
3. LeapFrog (достъпен от Tripos Associates, St.Louis, MO).
Други техники за молекулно моделиране могат също да бъдат използвани, в съответствие с това изобретение. Виж например,
Cohen, N.C. et al., 1990, J.Med.Chem.33.883-894. Виж също Navia, M.A. and M.A.Murcko, 1992, Ci/rrOp/'n.Sfract β/о/.2:202-210.
След като една единица е планирана или избрана с горните методи, ефективността, с която може да се свързва с α1 -I домена или hAQC2 Fab фрагмента, може да бъде тестирана и оптимизирана с компютерна оценка. Например, едно съединение, което е планирано или избрано да функционира като α1 -I домен свързващо съединение, може да премине един обем , който не се припокрива с този заеман от свързващото място, когато то е свързано с химерния а1-1 домен. Едно ефективно а1-1 домен свързващо ф съединение, може да показва относително малка разлика в енергия между неговото свързано и свободно състояния (т.е. малка енергия на деформация на свързване). Така, най-ефективното а1-1 домен свързващо съединение трябва да бъде планирано с деформираща енергия на свързване не по-голяма от около 10 kcal/mole, например не по-голяма от 7 kcal/mole. α1-Ι домен свързващи съединения могат да взаимодействат с а1-1 домен в повече от една конформация, което е сходно при общата свързваща енергия. При тези случаи деформиращата енергия на свързване е прието да е разликата между енергията на свободното съединение и средната енергия на конформациите, наблюдавани когато съединението се свързва с © белтък.
Едно съединение, планирано или избрано като свързващо се с а1-1 домен, може освен това да бъде компютерно оптимизирано, така че в неговото свързано състояние, да няма отблъскващо електростатично взаимодействие с прицелния белтък. Такива не-комплементарни (например електростатични) взаимодействия включват отблъскващи заряд-заряд, дипол-дипол и заряд-дипол взаимодействия. Специфично, сумата от всички електростатични взаимодействия между съединението и белтъка, когато съединението е свързано с α1 -I домен, трябва да дават един неутрален или благоприятен принос към енталпията на свързването.
На разположение е специфичен компютерен софтуер в тази област, за определяне деформираща енергия на съединението и електростатично взаимодействие. Примери на програми предназначени за такава употреба включват: Gaussian 92, revision С (M.J.Frisch, Gaussian, Inc., Pittsburgh, PA ©1992); AMBER, version 4.0 (P.A.Kollman, University of California at San Francisco, ©1994); и Insight ll/Discover (Biosysm Technologies Inc., San Diego, CA ©1994). Тези програми могат да бъдат осъществявани, например като се Ф използва Silicon Graphics workstation. Други хардуерни системи и софтуерни пакети са известни на специалиста в тази област.
Друга използваема техника за дизайн на лекарство, която се осъществява от това изобретение, е повтарящ се лекарствен дизайн. Итеративен лекарствен дизайн е метод за оптимизиране асоциации между белтък и съединение (това съединение включва едно антитяло) чрез определяне и оценяване на тридимензионалните структури на последователни набори от белтък/съединение комплекси. При итеративен лекарствен дизайн, са получени серии от кристали на белтък, свързан с единици, които свързват белтъка и след това е решена три-димензионалната • структура на всеки молекулен комплекс. Такъв подход осигурява поглед върху връзките между белтъци и други единици на всеки комплекс. Това се осъществява чрез подбор на химични единици с инхибиторна активност, получаване кристали от тези нови комплекси, решаване на три-димензионалната структура на комплексите и сравнение връзките между новите комплекси и предишния решен комплекс. Връзки в един комплекс могат да бъдат оптимизирани, чрез наблюдение как промени в компонентите на комплекса повлияват свързването.
В някои случаи, итеративен лекарствен дизайн е осъществен чрез образуване на последователни комплекси и след това кристализиране на всеки нов комплекс. Алтернативно, предварително образуван белтъчен кристал е потопен в присъствието на друга химична единица, при което се образува един комплекс и се избягва необходимостта да кристализира всеки отделен комплекс.
XII. Фармацевтични състави
Фармацевтичните състави на това изобретение съдържат един или повече VLA-1 антагонисти на настоящето изобретение (например, анти-VLA-l антитела и нискомолекулни VLA-1 антагонисти, идентифицирани с гореописаните рационални методи за лекарствен дизайн), или техни фармацевтично приемливи производни. Съставите могат освен това да съдържат фармацевтично приемлив носител, като един адювант, вехикулум, буфер и стабилизатор.
Фармацевтичните състави на това изобретение могат да бъдат прилагани орално, топично, интравенозно, подкожно, интраперитонеално, мускулно, интра-медуларно, интра-артериално, интра-артикуларно, интра-синовиално, интра-стернално, интратекално, интрахепатално, интраспинално, интракраниално, както е желателно, или точно локално на места на възпаление или туморен растеж. Фармацевтичните състави на това изобретение могат също да бъдат въвеждани чрез инхалации, като се използват например, небулайзер, инхалатор на сух прах, аерозолен дозатор или чрез имплантация на инфузионна помпа или биосъвместим имплант със забавено освобождаване у индивида.
Фармацевтичните състави могат да бъдат във формата на стерилен инжекционен препарат, например стерилна инжекционна водна или маслена суспензия. Тази суспензия може да бъде комбинирана съгласно техниките, известни в тази област, като се използват подходящи диспергиращи, овлажняващи и суспендиращи агенти. Ако се прилагат орално, фармацевтичните състави могат да бъдат въвеждани във формата на капсули, таблетки, водни суспензии или разтвори. За топични приложения, фармацевтичните състави могат да бъдат комбинирани в подходящ мехлем.
Дозировката и нивото на дозата на VLA-1 антагонистите на това изобретение, ефективни за получаване на желаните ефекти ще зависят от различни фактори, като природата на заболяването, което ще бъде третирано, големината на индивида, целите на третирането, специфичният фармацевтичен състав, който се използва и преценката на лекуващия лекар. Използват се нива на дозировка между около 0.001 и около 100 mg/kg телесно тегло дневно, например между около 0.1 и 50 mg/kg телесно тегло дневно, от активната съставка. Например, едно антитяло на изобретението ще бъде въвеждано в дозировка в границите между около 0.01 mg/kg телесно тегло дневно и около 20 mg/kg телесно тегло/ дневно, например в рамките между около 0.1 mg/kg телесно тегло/дневно и около 10 mg/kg телесно тегло/дневно и в интервали за всяка една до 14 дни. В друго изпълнение, антитялото е въвеждано в доза около 0.3 до 1.0 mg/kg телесно тегло, когато е въвеждано интраперитонеално. В друго изпълнение, антитялото е въвеждано в доза около 5 до 12.5 mg/kg телесно тегло когато е въвеждано интравенозно. В едно изпълнение, е въвеждан антитяло състав, в количество ефективно да осигури плазмено ниво на антитяло от най-малко 1 mg/ml.
XIII. Болестни състояния и животински модели
VLA-1 антагонистите на изобретението са полезни за лечение, включително профилактика, на а-фгмедиирани заболявания, като тези изброени по-горе. Третиранията на това изобретение са ефективни при хора и при животни, засегнати от такива състояния. Животните, при които е приложимо изобретението са както домашни животни и добитък, отглеждани като домашни любимци или за търговски цели. Примери са кучета, котки, говеда, коне, овце, свине и кози.
Ефикасността на VLA-1 антагонистите на изобретението
Ф може да бъде тестирана на различни животински модели.
Например, използваеми модели на псориазис и артрит включват такива описани в WO 99/61040, Alport’s синдром на бъбречен модел, описан в Cosgrove et al., 2000, Am. J.Path. 157:1649-1659, и SNF1 мишия модел на lupus nephritis описан в Kalled et al., 2001, Lupus 10:9-22. Модели на васкуларна фиброза за рестеноза включват един плъши модел на каротиден балон увреждане, описан в Smith et al., 1999, Circ.Res. 84:1212-1222. Модели на белодробна фиброза за идиопатична белодробна фиброза и склеродерма-свързана белодробна фиброза, включват модел на индуцирана с bleomycin белодробна фиброза, описан в Wang et al., 1999, Thorax 54:805-812.
® Модели на чернодробна цироза за хепатит С - или индуцирана с алкохол цироза включват модел на лигиране на жлъчния канал, описан в George et al., 1999, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:12719-12724 и модел на индуцирана с CCL4 чернодробна фиброза, описан в Shi et al., 1997, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:10663-10668.
Ефикасността на третиранията на това изобретение, може да бъде измерена с известен брой диагностични методи, които са на разположение, включително физикално изследване, кръвни тестове, измервания за протеинурия, креатининови нива и креатининов клирънс, белодробни функционални тестове, рентгенография на гръден кош, бронхоскопия, бронхоалвеоларен лаваж, белодробна биопсия, нива на уреен азот (BUN) в кръвна плазма, наблюдения и оценка на цикатрикси или фиброзни лезии, отлагания в екстрацелуларния матрикс като колаген, гладкомускулен актин и фибронектин, бъбречни функционални тестове, ултразвук, магнитен резонанс (MRI) и СТ скан.
XIV. Диагностични методи
Антителата на това изобретение могат да бъдат използвани © за диагностициране на болестни състояния, свързани с променени нива на α-ιβιекспресия. Тъканна проба от даден индивид, като например тъканна биопсия, проба от телесна течност или лаваж (например, алвеоларен лаваж), могат да бъдат тестирани в тест за залавяне на антиген, ELISA, имунохистохимичен тест и подобни, като се използват антителата. Като контрола е използвана тъканна проба от нормален индивид.
Практиката на настоящето изобретение ще използва, ако друго не е указано, конвенционални техники на клетъчната биология, белтъчната химия и имунология, които са в обсега на специалиста в тази област. Такива техники са описани в литературата. Виж например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (Sambrook et al., Eds), 1989; Oligonucleotide Synthesis, (M.J. Gait, Ed.), 1984; U.S.Patent 4,683,195 to Mullis et al.; Nucleic Acid Hybridization, (B.D.Hames and S.J.Higgis), 1984; Transcription and Translation, (B.D.Hames and S. J.Higgins), 1984; Culture of Animal Cells (R.I.Freshney, Ed.), 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B.Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volumes 154 and 155 (Wu et al., Eds), Academic Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H.Miller and
M.P.Calos, Eds.), 1987; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, Eds. )1987; Handbook of Experimental Immunology, Volumes l-IV (D.M.Weir and C.C.Blackwell, Eds.), 1986; Manipulating in Mouse Embryo, 1986.
Ако друго не е определено, всички техники и научни термини използвани тук имат същото значение, както обичайно се разбират от специалиста в тази област, към която принадлежи това изобретение. Примерни методи и материали са описани тук по-долу, въпреки че методи и материали сходни или еквивалентни на тези описани тук, могат също да бъдат използвани в практиката или ЙЬй тестирането на настоящето изобретение. Всички публикации и други справки споменати тук, са включени тук чрез цитат в тяхната цялост. В случай на противоречие, настоящата спецификация, включително дефиниции, ще контролират. Материалите, методите и примерите са само илюстративни и не са предвидени да бъдат ограничаващи. Навсякъде в тази спецификация и претенции, думата “включва” или варианти като “включва” или “съдържа” ще бъде разбирана като означаваща включването на посочено цяло число или група от цели числа, но не изключването на всяко друго цяло число или група от цели числа.
Следните примери са предоставени да илюстрират ® настоящето изобретение и не трябва да се разглеждат като ограничаващи.
ПРИМЕРИ
Химични реагенти
Флуоресцеин изотиоцианат (FITC) е закупен от Sigma Chemical Co. (StLouis, МО). Кротоново масло е закупено от ICN Biochemicals (Aurora, ОН). Цяла овча кръв в Alsevers разтвор е получена от East Acres Biologicals (Southbridge, МА). Тип I колаген от опашка и тип IV миши колаген са закупени от Collaborative Research
Inc. (Bedford, МА) и Gibco (Gaithersburg, MD), съответно.
Balb/c женски мишки на възраст 6-8 седмици са закупени от
Taconic (Germantown, NY) и α1β1 интегрин-дефицитни мишки на базата на Balb/c са както преди е описано (3).
Пример 1
Моноклонални антитела. Блокиращи функцията mAbs срещу миши антигени са изготвени в свободен от азид и нисък ендотоксин формат: На31/8 (хамстер анти-С49а; интегрин а1) (Mendrick et al. 1995. Lab.Invest. 72:367-375), Ha1/29 (хамстер антиCD49b; интегрин α2) (β1) (Mendrick et al., 1995. Lab.lnvest. 69:690702), хамстер група II контролно mAb Ha4/8 (хамстер анти-KLH) (Mendrick D,L. and D.K.Kelly 1993 Lab. Invest. 69-690-702) и PS/2 (плъши aHTH-CD94d; интегрин α4β1 верига) (Miyake et al. 1991, J.Exp.Med. 173:599-607). В допълнение, следните блокиращи функция mAbs срещу миши антигени са закупени като без азид/нисък ендотоксин препатарати от Pharmingen (San Diego, СА); ΗΜβ1-1 (хамстер анти-СО29; интегрин β1 верига) (Noto et al. 1995 Int.lmmunol. 7:835-842), Ha2/5 (хамстер анти-СО29; интегрин β1 верига) (Mendrick, D.L. and D.M.Kelly 1993 Lab.lnvest. 69-690-702), 3E2 (хамстер анти-СО54, ICAM-1) (Scheynius et al. 1993 J.Immunol. © 150-655-663), 5H10-27 (плъшо CD49e; интегрин α5) (Kinashi, T., and
T.A. Springer. 1994, Blood Ce//s.20:25-44), GoH3 (плъшо aHTH-CD49f; интегрин α6) (Sonnenberg etal. 1987 J.Biol.Chem. 262:10376-10383), и плъшите изотип контролни mAbs R35-95 (плъши lgG2a) и R35-38 (плъши lgG2b).
Адхезионен тест. Спленоцити от Balb/c мишки са култивирани с 20 ng/ml IL-2 за 7-12 дни. Адхезия на клетки към тип I и тип IV колаген е правена както е описано предварително (Gotwals et al. 1996 J.CIin.Invest. 97:2469-2477). Накратко, 96-ямкови Maxisorp платки (Nunc, Napierville, IL) са покрити или с 10 цд/ml тип IV или 5pg/ml тип I колаген и неспецифичните места са блокирани с 1% BSA. IL-2 активирани спленоцити са белязани с 2μΜ BCECF [2’,7’бис(карбоксиетил)-5(6)карбоксил флуоресцеин пента ацетоксиметилестер ] (Molecular Probes, Eugene, OR) и са инкубирани с 10μg/ml от указаните mAbs за 15 минути. 105 клетки в 0.25% BSA в RPMI след това са прибавени към покрити ямки и са инкубирани за 60 минути на 37°С. Несвързани клетки са отстранявани с измиване три пъти с 0.25% BSA в RPMI. Адхезия е определяна количествено като е използван CytoFluor 2350 fluorescent plate reader (Millipore, Bedford, МА). Измервано е отношението свързани клетки спрямо нанесени клетки и е изчислен процента адхезия спрямо контролни mAb-третирани клетки (нормализирани спрямо 100%). Изходни стойности дължащи се на клетъчна адхезия върху ямки покрити самосВБА, са изваждани.
Експресия и (функционална блокада на α 1β 1 и α2β1 върху активирани левкоцити. Като се има предвид ключовата роля, която левкоцитите имат при възпаление, ние решихме да тестираме дали анти-а1 и анти-а2 mAbs са способни да блокират адхезията на левкоцити върху колагени. За да се получат левкоцити експресиращи високи нива от а1 и а2, миши Т клетки са стимулирани in vitro с IL-2 за 7-12 дни. Тези клетки експресират високи нива от а1 и а2 (Фиг. 1А), и се свързват добре с колаген тип IV и тип l-покрити повърхности (Фиг. 1В). Адхезията към тип IV колаген беше частично инхибирана от само анти-а1 mAb и не е инхибирана от само анти-а2 mAb. За разлика от това, адхезия към тип I колаген е напълно инхибирана от анти-а2 mAb, и анти-а1 mAb показва само частично инхибиране. Анти-βΐ mAb и комбинацията на анти-а1 и анти-а2 mAbs напълно инхибират адхезията към типове I и IV колаген. След като е демонстрирано, че α1β1 и α2β1 интегрини са експресирани по активирани Т клетки и че анти-а1 и а2 mAbs са в състояние да блокират функционално левкоцитна адхезия към колагени, ние използвахме тези mAbs за изследване in vivo ролята на тези интегрини в животниски модели на възпалителни нарушения.
Пример 2
Инхибиране на DTH отговори с анти-интегрин mAbs. SRBC-индуцирани забавен тип отговори на свръхчувствителност (DTH) са адаптирани от предварително публикуван протокол (Hurtrel et al., 1992, Cell. Immunol. 142:252-263). Накратко, мишки са имунизирани подкожно в гърба с 2 х 107SRBC в 100 μΙ PBS на ден 0. Мишките са провокирани на ден 5 чрез инжектиране 1 х 108 SRBC в 25 μΙ PBS подкожно в дясната задна лапа. Дебелината на лапата е измервана с инженерен шублер (Mitutoyo/MTI, Paramus, NJ) 20 часа след антигенната провокация и е изчислявана степента на оток. Резултатите са представени като среден процент повишение дебелината на лапата +средната стандартна грешка и са изчислени като % нарастване = [1-(дебелина на дясна лапа 20 часа след антигенна провокация/дебелина на неинжектирана лява лапа 20 часа след антигенна провокация)]х100. За блокиране ефекторната фаза на SRBC-индуцирания DTH отговор, терапевтично и контролно mAb (100 pg) са изготвени съгласно методите описани в Пример 1, и са прилагани интраперитонеално 1 час преди антигенната провокация на ден 5.
SRBC-индуцирана DTH е добре характеризиран in vivo модел на възпаление, и в частност псориазис, който е използван за демонстриране значението на различни цитокини и адхезионни молекули при възпаление (Tedder et al., 1995, J.Exp.Med. 181:22592264, Terashita et al., 1996, J.Immunol. 156:4638-4643). SRBCсензитизирани мишки са получавали анти-интегрин Abs 1 час преди антигенната провокация на лапата и възпалението е определено 20 часа по-късно, измерено чрез повишение дебелината на лапата. PBS и контролните третирани с Ig от хамстер мишки, показват 70% нарастване дебелината на лапата 20 часа след антигенна провокация (Фиг.2). Сравнени с контролно третиране с Ig от хамстер, анти-а1 или анти-а2 mAbs предизвикват съответно 68% и 60% инхибиране дебелината на лапата. Комбинацията от анти-а1 и а2 mAbs води до 71% инхибиране, което показва малък адитивен ефект пред анти-а1 или анти-а2 mAbs самостоятелно. Третирането с други анти-интегрин mAbs е било също ефективно за инхибиране DTH ефекгорен отговор. Степента на инхибиране наблюдавана с различни третирания с mAb е била 49% (анти-а4), 23% (анти-а5) и (анти-аб). Накрая, mAb блокада на обичайната β1 интегрин субединица (mAb HMBI-1) е инхибирала ефекторния DTH отговор с 67%.
Пример 3
Инхибиране на CHS есректорни отговори с антиинтегрин mAbs. Контактна свръхчувствителност (CHS) спрямо FITC е тестирана както е описано преди (Gaspari et al., 1991, в Current Protocols in Immunology, J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies,
E.M. Shevach and W.Strober, editors. John Wiley & Sons, New York, Section 4.2:1). Накратко, мишки са сензитизирани чрез намазване 100μΙ 0.5% FITC в 1:1 ацетон/дибутилфталат върху обръснат гръб на ден 0. След десет дни, животните са провокирани чрез нанасяне на 5 μΙ 0.5% FITC от двете страни на всяко ухо. Отговора с оток на ухото е определян чрез измерване дебелината на ухото с инженерен шублер (Mitutoyo/MTI, Paramus, NJ) по време на антигенната провокация (ден 10) и 24 часа по-късно, и резултатите са представени като среден процент нарастване от изходната дебелина на ухото + средна стандартна грешка. Нарастването дебелината на ухото е изчислено като % нарастване = [1-(дебелина на ухото 24 часа след антигенна провокация/дебелина на ухото по време на антигенната провокация)] х 100. За блокиране ефекгорната фаза на CHS отговор, е прилагано интраперитонеално терапевтично или контролно mAb (250 цд) 4 часа преди антигенна провокация на ден 10. Мишки, които са сензитизирани с антиген и ушно провокирани само с вехикулум (вехикулум контрола) или мишки, които са ушно провокирани без предварителна сензитизация (дразнеща контрола) служат като отрицателна контрола (никога не превишават 2% нарастване дебелината на ухото).
При условие, че CHS е механистично различна от DTH и включва различни ефекторни клетки, ние изследвахме какъв ефект имат анти-интегрин mAbs върху ефекгорната фаза на CHS отговора. Мишките са били сензитизирани с хаптен като е използван FITC приложен на бръснатите им гърбове, последвано след 10 дни от FITC провокация на ухото, което предизвиква възпалителен отговор на следващия ден. FITC-сензитизираните мишки показват 60-70% нарастване дебелината 24 часа след антигенна провокация (Фиг.З). В съответствие с литературни данни (Scheynius et al., J.Immunol. 150:655-663), третиране c анти-ICAM mAb води до 51% инхибиране на отока на ухото. Сравнено с контролно mAb от хамстер, третиране на мишки с анти-а1 или анти-а2 mAb 4 часа преди антигенна провокация има за резултат съответно 37% и 57% инхибиране отока на ухото (Фиг.З). Комбинацията на анти-а1 и анти-а2 mAbs има за резултат малко по-голямо инхибиране на ушния оток (65%). Третиране с други mAbs спрямо β1 интегрини разкрива, че докато анти-а4 и анти-а5 mAbs не предизвикват инхибиране на FITCиндуциран CHS ефекторен отговор в сравнение с контролно плъшо mAb, третиране с анти-аб mAb предизвиква 86% инхибиране на ефекторни отговори. Накрая, mAb блокада на обичайната β1 интегрин субединица е инхибирала с 74% CHS ефекторни отговори. Подобни CHS резултати са получени като са използвани различни линии мишки (C57/BL6, 19/Sv) и различен сензитизиращ агент (оксазолон) (данните не са представени). Подобно на резултатите наблюдавани при SRBC-индуциран DTH модел, хистологичен анализ на възпалени уши разкрива, че образуването на едем и левкоцитна инфилтрация са инхибирани с анти-а1 и анти-а2 mAb третиране.
В съответствие с откритието, че α1β1 и α2β1 могат да бъдат експресирани върху IL-2-активирани спленоцити, анализ на лимфни възли от антиген-сензитизирани мишки (FITC или оксазолон) разкрива, че α1β1 и α2β1 са експпресирани изключително по CD44hl LFA-1hl активирани CD4+ и CD8+ клетки (данни не са представени). Третиране на мишки с анти-а1 и анти-а2 mAbs не води до делеция на тези клетки, тъй като броят на активирани Т клетки в слезката и лимфни възли, наблюдаван в отговор на антигенно сензитизиране при CHS модела не е повлиян. В допълнение, ефекторни клетки не са били функционално делетирани, тъй като продължително третиране на антиген-сензитизирани мишки с анти-а1 и анти-а2 mAbs (ден 10-16) не повлиява възпалителния отговор на мишки провокирани с антиген на ден 20 (данни не са представени).
Пример 4
CHS ефекторни отговори са понижени при α1β1дефицитни мишки. За да се изключи възможността, че инхибиторната роля на α1β1 при ефекторния отговор на FITCмедиирана CHS е mAb-медиирана, са проведени експерименти с див тип α1β1-интегрин дефицитни мишки (Фиг.4). mAb инхибиране на ефекторната фаза при див-тип мишки е в съответствие с предишни резултати, с 56% инхибиране дебелината на ухото, наблюдавано с анти-а1, 56% с анти-а2 и 62% с една комбинация от анти-а1 и анти-а2. Ефекторната фаза на CHS е значително редуцирана при нетретирани с α1β1-дефицитни мишки в сравнение с нетретирани див-тип мишки (30% спрямо 71% нарастване дебелината на ухото, съответно). Както се очаква, степента на ушен оток при нетретирани α1β1 -дефицитни мишки е еквивалентна на степента на ушен оток, наблюдаван при анти-а1 mAb-третирани дивтип мишки. Накрая, mAb блокада на α2β1 у α1β1-дефицитните мишки има за резултат само слабо повишено инхибиране на ушния оток, което е в съответствие с резултатите, наблюдавани при дивтип мишки, третирани с комбинация от анти-а1 и анти-а2 mAbs.
® Пример 5
Освен това за да се изключи възможността инхибиторният ефект на анти-интегрин mAbs, наблюдаван при двата - DTH и CHS модели на възпаление, да е предизвикан от общ противовъзпалителен ефект, медииран от анти-а1 и анти-а2 mAbs, беше проучен ефекта на тези mAbs върху възпалителен дерматит.
За изследване на възпалителен дерматит, мишки са намазвани с 5 μΙ 0.8% кротоново масло в ацетон от двете страни на всяко ухо. Въведени са терапевтични или контролни антитела 4 часа преди приложението на дразнителя. Ушният оток е определян ©24 часа по-късно, както е описано по-горе и е сравнен с дебелината на ухото преди прилагането на кротоново масло. Резултатите са представени като среден процент нарастване спрямо изходната дебелина на ухото + средна стандартна грешка, както е описано погоре. Мишки намазани само с ацетон (вехикулум контрола) служат като отрицателна контрола.
След 24 часа, ушите на мишки третирани с кротоново масло показват значително повишение на дебелината на ухото (48%) в сравнение с мишки получавали само вехикулум (ацетон).
Токсично отичане на ухото предизвикано от кротоново масло, не е значително повлияно при мишки, предварително третирани с антиа1 или анти-а2 mAbs в сравнение с PBS или контролни mAbтретирани животни (Фиг.5). Хистологично изследване на уши третирани с кротоново масло не показва разлики в броя и типовете инфилтриращи клетки или образуването на едем у мишки третирани с анти-а1 или анти-а2 mAbs, в сравнение с контролни mAbтретирани мишки или PBS-третирани мишки (данни не са представени).
Пример 6
Инхибиране на артрит с α1β1 и α2β1. Тъй като α1β1 е добре експресиран по инфилтриращи клетки в синовиума на пациенти с артрит, ние решихме да изпитаме дали анти-а1 или антиа2 mAbs ще бъдат инхибиторни в един ускорен модел на артрит, описан преди (Terato et al., 1992, J.Immunol. 148:2103-2108; Terto et al., 1995, Autoimmunity 22:137-147).
Arthrogen-CIA Antibody Kits са закупени от Stratagen (La Jolla, СА) и е индуциран артрит като е използван утвърден протокол Terto et al., 1992, J.Immunol. 148:2103-2108; Terato et al., 1995, Autoimmunity 22:137-147). Накратко, артрит е индуциран с интраперитонеална инжекция на коктейл от 4 анти-колаген тип II mAbs (1 mg всяко) на ден 0, последвана от интраперитонеална инжекция на 50 pg LPS на ден 3. В продължение на следващите 3-4 дни, мишките развиват оточни китки, глезени и пръсти. Въведени са терапевтично или контролно mAb (250 цд) интраперитонеално 4 часа преди инжектирането на анти-колаген mAbs на ден 0 и отново 4 часа преди въвеждане на LPS на ден 3 и след това продължавайки на всеки 3-ти ден за времетраенето на експеримента. Започвайки от ден 3, мишките са оценявани за развитие на артрит. Тежестта на артрита във всеки крайник е оценяван като е използвана четири точкова система. 0 = нормално; 1 = леко зачервяване; леко подуване на глезен или китка; 2= умерено подуване на глезен или китка; 3= силно подуване включително на някои пръсти, глезен и крак; 4=максимално възпаление.
Тежък артрит при Balb/c мишки се развива в рамките на 72 часа след LPS инжектиране и се задържа за повече от 3 седмици. Нито инжектиране на анти-колаген mAbs самостоятелно, нито LPS самостоятелно индуцират артрит. Мишки получаващи контролно гпАЬ третиране проявяват еднакво тежък артрит както този, наблюдаван при PBS-третирани мишки (Фиг.6). За разлика от това, третиране с анти-а1 mAb самостоятелно, предизвиква подчертано намаление (78%) на артрита, което трае до продължителността на експеримента. Третиране с анти-а2 mAb самостоятелно също има благоприятен ефект, което предизвиква 32% понижение на артритната оценка в сравнение с контролни mAb-третирани мишки. Комбинацията от анти-а1 и анти-а2 mAbs предизвиква сходна степен на инхибиране, както наблюдаваната с анти-а1 mAb самостоятелно.
Пример 7
Хистологичен анализ на ефекта от третиране с антиа1 и анти-а2 тАЬ върху възпалителния клетъчен инфилтрат. Последващ хистологичен анализ на SRBC-индуцирания DTH отговор потвърждава способността на анти-а1 и анти-а2 mAb третиране да модулира предизвикания възпалителен отговор. Непровокирана лапа от SRBC-сензитизирани мишки показва фактически отсъствие на възпалителен клетъчен инфилтрат, когато е сравнена с SRBCпровокирана лапа от същата мишка. Третиране на SRBCсензитизирани мишки с анти-а1 и анти-а2 mAbs самостоятелно или в комбинация силно редуцира броя на тези инфилтриращи клетки, открити в SRBC-провокирани лапи, в сравнение с контролни mAbтретирани мишки. Близко изследване на инфилтриращи клетки разкрива, че повечето клетки са неутрофили, с известни налични моноцити и лимфоцити, и потвърждава, че анти-а1 и анти-а2 mAb третиране силно понижава броя на тези клетки.
Пример 8
Имунохистохимично демонстриране на а1-експресиращи клетки във възпалителния клетъчен инфилтрат. Проведена е имунохистохимия за по-прецизно определяне природата на инфилтриращите клетки и дали те експресират колаген-свързващи интегрини. Изследвани са инфилтриращи клетки от възпалена лапа на нетретирана мишка за експресия на α1β1 интегрин и маркери за клетъчен произход. Намерено е, че α1β1 интегрин е експресиран върху множество инфилтриращи левкоцити. Използвана е двойна имунохистохимия за идентифициране природата на инфилтриращите клетки и разпространението на α1β1 експресия. Използвайки клетъчни маркери за произход е намерено, че инфилтратът е съставен главно от гранулоцит/моноцити (Мас-1+), като много от тези клетки са неутрофили (Gr1+), заедно с по-малък брой Т лимфоцити (CD3+). Експресия на α1β1 интегрин е намерена в рамките на всичките три подвида клетки, с а1 експресиран по един подвид от Мас-1+ гранулоцит/моноцити, един подвид от Gr1+ неутрофли и по голямата част от инфилтриращи CD3+ Т лимфоцити. Подробен имунохистохимичен анализ разкрива, че въпреки че анти-а1 и анти-а2 mAb третиране редуцира броя на инфилтриращите клетки, не е наблюдавана промяна в клетъчния състав на инфилтрата (данни не са представени). Имунохистохимично оцветяване с FITC анти-хамстер mAb потвърждава способността на анти-а1 и анти-а2 mAb да се локализират във възпалената лапа (данни не са представени).
Пример 9
Инхибиране на артрит с mAbs срещу α 1β 1 и α2β1 и в alдефицитни мишки. Тъй като α1β1 е добре експресиран по инфилтриращи клетки в синовиума на артритни пациенти, ние решихме да изследваме дали анти-а1 или анти-а2 mAbs биха били инхибиторни при един ускорен модел на артрит, описан преди (Terato et al., 1992, J.Immunol. 148:2103-2108; Terato et al., 1995, Autoimmunity 22:137-147). Този модел включва инжектиране на коктейл от анти-колаген тип II mAbs на мишки, последвано по-късно от въвеждане на LPS, което води до развитие на артрит в продължение на следващите 3-7 дни. На мишките е давано mAb всеки 3-ти ден започвайки от ден 0 и оценяване за развитие на артрит е правено на всеки 3-ти ден. Тежък артрит е развит у всички мишки в продължение на 72 часа след LPS инжектиране и се задържа за повече от 3 седмици. Инжектиране само с анти-колаген mAbs или само с LPS не индуцира артрит. Мишки получаващи контролно mAb третиране проявяват еднакво тежък артрит, както този наблюдаван у PBS-третирани мишки (Фиг.7). За разлика от това, третиране с анти-а1 mAb самостоятелно, предизвиква подчертано намаление (79% и по-високо) на артрит, което се задържа докато продължава експеримента. Третиране с анти-а2 mAb самостоятелно също има благоприятен ефект, който се проявява като 37% понижение на артритната оценка в сравнение с контролни mAb-третирани мишки. Комбинацията от анти-а1 и антиа2 mAbs предизвиква сходна степен на инхибиране, както е наблюдавано с анти-а1 mAb самостоятелно. Редуциране на артритната оценка с анти-а1 mAb третиране е наблюдавано у всички мишки и е сравнено като благоприятно с няколко други mAbтретирания за артрит, като разтворим TNF рецепторен lg слет белтък (Mori et al., 1996, J.Immunol. 157:3178-3182), анти-Мас-1 (Taylor et al., 1996, Immunology. 88:315-321), анти-ос4 (Seiffge, 1996, J.Rheumatol. 23:2086-2091) и анти-1САМ-1 (Kakimoto et al., 1992, Cell. Immunol. 142:326-337). В съответствие c данни основаващи се на mAb, показващи важна роля за α1β1 при артрит, нетретирани ос1дефицитни мишки проявяват значително намаление на артритната оценка, в сравнение с див-тип мишки.
Пример 10
Ефект на третиране с анти-а1 тАЬ върху имунопатологията на артритни стави. Стави от див-тип артритни мишки (ден 8), получаващи контролно mAb или анти-а1 mAb третиране, са сравнени визуално и хистологично със стави от нормална нетретирана мишка. Визуално, стави от контролни mAbтретирани мишки демонстрират зачервяване и подуване на целия крак, включително пръсти, докато анти-а1 mAb-третирани мишки показват малки или никакви признаци на възпаление в стави или пръсти. Хистологично изследване показва тежки промени в контролни mAb-третирани артритни стави, със силно възпаление на субсиновиялната тъкан с възпалителни клетки, адхериране на клетки по ставната повърхност и подчертана деструкция на хрущяла, която се проявява със загуба на протеогликан. В съответствие с предишни данни (Terato et al. 1992, J. Immunol. 148:2103-2108; Terato et al., 1995, Autoimmunity 22:137-147), голямата част от инфилтриращите клетки при този модел са неутрофили. Анти-а1 mAb третиране на мишки драматично намалява количеството на възпалителния инфилтрат и степента на хрущялна деструкция.
Пример 11
Развитието на артрит е забавено в отсъствие на лимфоцити и инхибиране на артрит с анти-а1 тАЬ се проявява в отсъствие на лимфоцити. За определяне какви клетъчни типове могат да бъдат от значение при колаген mAb-индуциран артритен модел, ние сравнихме способността на див-тип В6-129 мишки и RAG-1-дефицитни В6-129 мишки да развиват артрит (Фиг.8). Генетична делеция на RAG-1 (рекомбинантен активиращ ген-1) ген води до пълна загуба на зрели Т и В лимфоцити (Mombaerts et al., 1992, Cell 68:869-877). Дивият тип и RAG-1-дефицитни мишки развиват артрит, въпреки че кинетиката на индуцирани при RAG-1 дефицитни мишки е значително по-бавна (Фиг.8). Тези резултати насочват, че докато лимфоцити са включени в този модел на артрит, те не се изискват за развитието и прогресиране на заболяването. Публикувани съобщения, изследващи ефекта на RAG-1 дефицитни мишки при други модели на артрит, също намират, че липсата на Т и В лимфоцити забавя началото на артрит (Plows et al., 1999, J. Immunol. 162:1018-1023). Третиране на див-тип или RAG-1 дефицитни мишки с анти-а1 mAb напълно инхибира артрит (Фиг.8). Тези резултати демонстрират, че ефективността на анти-а1 mAb при този модел не е зависима от наличието на лимфоцити и че както е насочено от предишни експерименти (Фиг.7), ефикасността на анти-а1 mAb за предотвратяване на заболяване, може да бъде чрез неговото действие върху други а 1-експресиращи клетки, като макрофаги и неутрофили.
Пример 12
Доза отговор на анти-а1 тАЬ инхибиране на артрит. Имайки предвид силните ефекти на анти-а1 mAb третиране върху предотвратяване на артрит, ние разширихме тези проучвания да включват доза отговор анализ (Фиг. 9). Въведени са интраперитонеално различни дози mAb всеки 3-ти ден, започвайки от ден 0. В съответствие с по-ранни данни, доза от 250 pg анти-а1 mAb предизвиква пълно предотвратяване на артрит. По-ниска доза от 100 pg анти-а1 mAb е била частично ефективна при предотвратяване на артрит в този модел, докато по-ниски дози нямат някакъв забележим ефект върху артритната оценка (Фиг.9). Пример 13
Терапевтично третиране с анти-а1 тАЬ може да понижи артритната оценка. Имайки предвид ефективността на анти-а1 mAb за предотвратяване на артрит, ние се опитахме да третираме мишки, които са започнали да развиват заболяване. Артрит е индуциран у мишки с инжектиране на коктейл от анти-колаген тип II mAbs на ден 0, последвано от въвеждане на LPS на ден 3. След това мишки са третирани с анти-а1 mAb или разтворим TNF рецепторен Ig слет белтък, започвайки на ден 4. Прогресирането на артрит е напълно блокирано у мишки получаващи анти-а1 mAb, започвайки на ден 4, в сравнение с мишки, получаващи контролно mAb от хамстер, започвайки на ден 4 (Фиг. 10). Степента на инхибиране, наблюдавана с терапевтично въвеждане на анти-а1 mAb е била пълна и равна на тази, наблюдавана с профилактично третиране с анти-а1 mAb (започвайки на ден 0) (Фиг. 10). За сравнение, третиране с TNF рецепторен Ig слет белтък от ден 4 нататък, предизвиква само 60-70% инхибиране на артритната оценка при сравнение с контролен Ig слет белтък (Фиг. 10). Комбинирано третиране с анти-а1 mAb и TNF рецепторен Ig слет белтък заедно, е било ефективно за пълно инхибиране на артритната оценка, което не е учудващо, като се има предвид пълната ефективност на самостоятелно анти-а1 mAb третиране за потискане на артрит. Обобщено, тези резултати показват, че терапевтично третиране с анти-а1 mAb е ефективно за инхибиране артритна оценка и се сравнява като благоприятно за терапевтично третиране с TNF антагонист.
Пример 14
Клониране и мутагенеза на а1-1 домен. Последователности на човешки и плъши α1β1 интегрин I домен са амплифицирани от пълноверижни кДНКи (Kern et al., 1994, J.Biol.Chem. 269, 22811-22816; Ignatius et al., 1990, J.Cell Biol. 111, 709-720) c полимеразна верижна реакция (PCR) (PCR CORE Kit; Boehringer Mannheim, GmbH Germany), като са използвани или човешки специфични праймери,
5’-CAGGATCCGTCAGCCCCACATTTCAA-3’ [напред] (SEQ ID N0:7); и 5’-TCCTCGAGGGCTTGCAGGGCAAATAT-3’ [обратно] (SEQ ID N0:8), или плъши специфични праймери, 5’-CAGGATCCGTCAGTCCTACATTTCAA-3’ [напред] (SEQ ID N0:9), и 5’-TCCTCGAGCGCTTCCAAAGCGAATAT-3’ [обратно] (SEQ ID N0:10).
Получените PCR амплифицирани продукти са пречистени, лигирани в pGEX4t-l (Pharmacia) и трансформирани в компетентни DH5a клетки (Life Technologies). Ампицилин резистентни колонии са скринирани за експресия на ~45 kDa глутатион S-трансфераза-! домен слет белтък. Последователностите от инсерти на плазмидна ДНК на клонове, които са подбрани за последващо характеризиране, са потвърдени с ДНК секвениране.
Плъши/човешки химерен а1-1 домен (RAH) е генериран (MORPH Mutagenesis Kit; 5 prime- 3 prime), заменяйки плъшите остатъци G91, R92, Q93 и L96 (Фиг.11) за съответните човешки остатъци, V, Q, R и R съответно. Клонове закрепващи RAH I домена, са идентифицирани по липсата на едно диагностично Stu I място за рестрикционен ензим и инсертите са потвърдени с ДНК секвениране. Аминокиселинната последователност на човешкия α1 -I домен е представена във Фиг. 12.
Пример 15
Създаване на mAbs специфични за а1-1 домена. Доказано е, че моноклонални антитела са много полезни проби при изучаване взаимозависимостта между структура и функция на интегринови субединици. Например, mAbs са използвани нашироко за изследване области на β1 субединицата, свързана с една активирана конформация (Qu, A., and Leahy, D.J. (1996) Structure 4, 931-942). Така, за идентифициране на потенциални проби за конформационни промени на а1-1 домена, ние създадохме един панел от mAbs срещу човешкия α1 -I домен.
Създаване на анти-а1 I домен моноклонални антитела. Женски Robertsonian мишки (Jackson Labs) са имунизирани интраперитонеално (i.p.) с 25 цд пречистен α1β1 (Edwards et al., 1995, J.Biol.Chem. 270,12635-12640; Gotwals et al., 1999, Biochemistry 38:8280-8) емулгиран c пълен адювант на Freund (Life Technologies). Те са бустерно инжектирани i.p. три пъти c 25 цд α1β1 емулгиран в непълен адювант на Freund (Life Technologies). Мишката с най-висок анти-а1-1 домен титър е инжектирана бустерно i.p. със 100 цд α1β1 три дни преди фузия и интравенозно с 50 цд α1β1 един ден преди фузия. Клетки от далак са слети с FL653 миеломни клетки при отношение 1:6 и са посети при 100,000 и 30,000 за ямка в 96-ямкови платки за клетъчни култури.
Надстоящите течности са тестирани за свързване с α1β1 интегрин с единичен цветен FACS. Преди FACS анализа, супернатантите са инкубирани с нетрансфектирани К562 клетки за елиминиране на IgG, който се свърза единствено с β субединицата. Впоследствие, 3-5 X 104 К562 клетки, трансфектирани с а1 интегрин субединицата (К562-а1), суспендирани във FACS буфер (1% фетален телешки серум (FCS) в PBS съдържащ 0.5% NaN3) са инкубирани със супернатанта за 45 минути на 4°С, измити са и са инкубирани с анти-миши IgG конюгиран с фикоеритрин. След двукратно измиване с FACS буфер, клетките са анализирани в Becton Dickinson Flow Cytometer.
Надстоящите течности от получените хибридоми са скринирани за свързване с а1-1 домена. Накратко, 50 μΙ от 30 pg/ml човешки а1-1 домен-GST фузия в PBS бяха нанесени върху ямки на 96-ямкова платка (Nunc) за една нощ на 4°С. Платките са измити с PBS, блокирани са с 1% BSA в PBS и хибридомната надстояща течност е инкубирана с I домен на стайна температура за 1 час. След обилно измиване с PBS съдържащ 0.03% Tween 20, е добавена алкална фосфатаза свързана с анти-миши IgG (Jackson ImmunoResearch) за допълнителен един час. След едно крайно измиване, е добавен 1 mg/ml р-нитрофенилфосфат (pNPP) в 0.1 М глицин, 1mM ZnCI2 и 1тМ MgCI2 за 30 минути на стайна температура, и платките са отчетени при O.D. 405.
Подбрани супернатанти са тестирани за тяхната способност да инхибират К562-а1 зависима адхезия с Колаген IV. К562-а1 клетки са белязани с 2тМ 2’,7’,(бис-2-карбоксиетил-5 и 6) карбоксифлуоресцеин пента ацетоксиметилестер (BCECF; Molecular Probes) в DMEM съдържащ 0.25% BSA на 37°С за 30 минути. Белязани клетки са измити със свързващ буфер (10 mM Hepes, pH 7.4; 0.9%NaCI; и 2% глюкоза) и са ресуспендирани в свързващ буфер плюс 5тМ MgCI2 до крайна концентрация 1 х 106 клетки/ml. Инкубирани са 50 μΙ от супернатантата с равен обем от 2 х 105 К562а1 клетки в ямка на 96-ямкова платка. След това платката е центрофугирана и супернатантите са отстранени. Клетките са ресуспендирани в свързващ буфер и са прехвърлени в ямки на покрита с колаген платка и са инкубирани за един час на 37°С. След инкубация, не адхериралите клетки са отстранени чрез трикратно измиване със свързващ буфер. Прикрепените клетки са анализирани на Cytofluor (Millipore).
Ние най-напред идентифицирахме 19 хибридоми, супернатантите на които се свързват с човешки левкемия К562 клетки, експресиращи α1β1 интегрин (К562) и с а1-1 домена. Имуноглобулините са пречистени от всяка от тези хибридоми и са тестирани за способност да блокират К562-а1 или а1-1 домен свързване с колаген IV. mAbs попадат в два класа: такива, които блокират и такива, които не блокират α1β1 функция. Например, докато mAbs получени от клонове AEF3, BGC5, AQC2 и AJH10 свързват а1-1 домена (Фиг. 13А, данни не са представени за BGC5), само mAbs AJH10 и AQC2 инхибират а1-1 домен зависима (Фиг. 13В; Фиг.16В) или К562-а1 (Фиг. 13С; Фиг. 16С) адхезия за колаген IV.
Секвениране на определящи комплементарността области. За определяне клоналния произход на този панел от mAbs, ние амплифицирахме с PCR и секвенирахме CDRs на 12 от 19-те антитела (данни не са представени).
2цд мРНК, изолирани от 107 хибридоми (FastTrack mRNA isolation kit, Invitrogen), са обратно транскрибирани (Ready-To-Go You Prime First Strand Kit, Pharmacia Biotech) като са използвани 25 pM от всеки от следващите праймери: тежковерижен VH1FOR-2 (Michishita et al., 1993, Се//72:857-867); лековерижен, VK4FOR, който определя четири отделни олигонуклеотида (Kern et al., 1994, J.Biol.Chem. 269:228111-22816). За всяка хибридома, тежки и леки вериги са амплифицирани в четири отделни PCR реакции, като е използвана различна комбинация от следните олига: 1) тежка верига: VH1FR1K (Kamata et al., 1995, J.Biol.Chem. 270:12531-12535), VH1BACK, VH1BACK (Baldwin et al. (1998) Structure 6, 923-935), VHfr1a, VHfr1b, VHfr1e, VHfr1f, VHfr1g (Ignatius et al. (1990) J.Cell Biol. 111, 709-720), или VH1F0R-2 (Michishita, М, Videm, V, and Arnout, M.A. (1993) Cell 72,857-867); 2) Лека верига: VK1BACK (Baldwin et al. (1994) Structure 6,923-935), VK4FOR, VK2BACK олига (Kern et al. (1994) J.Biol.Chem. 269, 22811-22816), или VKfr1a, VHfr1c, VHfr1e, VHfr1f (Ignatius et al. (1990) J.Cell Biol. 111, 709-720). Продукти са амплифицирани (5 мин. на 95°С, 50 цикли по 1 минута на 94°С, 2 мин. на 55°С, 2 мин. на 72°С и краен цикъл от 10 мин. на 72°С), гелно пречистване (QIAquick, Qiagen) и са секвенирани директно като са използвани различни от изброените олига на ABI377 Sequencer.
Последователности от клонове произвеждащи блокиращи функция mAbs бяха почти идентични върху всички определящи комплементарността области (CDRs) и участващите области на рамката, което насочва, че тези хибридоми са клонално свързани. Пример 16
Имуноблотинг и FACS анализ. Последователности на променливи области на не-блокиращите антитела бяха подчертано различни от клонално сродното семейство на последователности, открити за блокиращите антитела. Тъй като блокиращите антитела изглежда произхождат от единичен клон, ние избрахме два (AJH10 и AQC2) за да ги характеризираме по-нататък.
Имуноблотинг. Гладкомускулен клетъчен слой сециран от аорта на овца и К562-а1 клетки са екстрахирани с 1% Тритон-Х-100 в 50 mM Hepes, pH 7.5, 150 тМ NaCI, 10 тМ фенилметилсулфонил флуорид (PMSF), 20 pg/ml апротинин, 10 цд/ml леупептин, ЮтМ етилендиаминтетраоцетна киселина (EDTA). Проби са подлагани на 4-20% градиент SDS-PAGE и електроблотинг върху нитроцелулозни мембрани. Блотовете са блокирани с 5% сухо мляко в TBS; измити са в TBS съдържащ 0.03% Tween-20 и са инкубирани с антитела в блокиращ буфер съдържащ 0.05% NaN3 за 2 часа. След това блотовете са измити както по-горе, инкубирани са с пероксидаза от хрян конюгиран анти-миши IgG за един час, измити са отново и след това са третирани с ECL reagent (Amersham). След това блотовете са експонирани на филм (Kodak) за 30 до 60 минути и са проявени.
Имуноблотинг и FACS анализ (Фиг. 14) демонстрират, че AJH10 реагира с човешки, заешки и овчи, но не с плъши α1β1 интегрин, което насочва, че блокиращите mAbs се свързват с еволюционно консервиран, линеен епитоп. Не-блокиращите mAbs не бяха нито ефективни при имуноблотинг, нито реагираха с видове освен човешки.
Пример 17
Свързване на а1-1 домен с колаген е дивалентен катийонзависимо
А. Пречистване на а1-1 домени.
а1-домените са експресирани в E.coli като GST (глутатионS-трансфераза) слети белтъци, съдържащи едно тромбин разцепващо място при свързването на последователностите. Избистрената супернатанта от клетки лизирани в PBS е нанесена върху глутатион-сефароза 4В колона (Pharmacia), която е обилно измита с PBS. а1-1 домен-GST слетият белтък е елюиран с 50 mM Трис-HCI, pH 8.0, 5тМ глутатион (редуциран). За денатурационни проучвания, I доменът е разцепван с тромбин в 50 mM Трие, pH 7.5 и пречистван от GST слетия участник. Добавян е DTT до 2тМ и пробата е нанасяна върху колона от глутатион сефароза 4В. Фракциите от протичане и измиване са събрани и нанесени върху Q Sepharose FF колона (Pharmacia). α1-Ι доменът е елюиран с 50тМ Трис-HCI, pH 7.5, ЮтМ 2-меркаптоетанол, 75mM NaCl. Пречистеният I домен проявява предсказаната за него маса (Lee et al. (1995) Structure 3, 1333-1340, 871 Da) c електроспрей йонизационна-мас спекгрометрия (ESI-MS), мигрира като единична ивица с SDS-PAGE, и белтъкът е елюиран като единичен пик със съответна големина с помощта на гелово проникваща хроматография на Сефароза 6 FPLC колона (Pharmacia).
В. Функционален анализ
96-ямкови платки са покрити за една нощ на 4°С с 1дд/т1 колаген IV (Sigma) или колаген Тип I (Collaborative Biomedical) измити са с Тритон буфер (0.1% Тритон-Х-100; 1mM МпС12, 25тМ Трис-HCI; 150 mM NaCI), и са блокирани с 3%говежди серум албумин (BSA) в 25 тМ Трис-HCI; 150 mM NaCI (TBS). Серийни разреждания на α1 -I домен-GST слет белтък в TBS, съдържащ 1 mM MnCI2 и 3% BSA, са инкубирани в покритите платки на стайна температура за 1 час, и са © измити в Тритон буфер. Свързан а1-1 домен е открит със серийни добавки на 10 pg/ml биотинилирано анти-GST поликлонално антитяло (Pharmacia); ExtraAvidin-horseradish peroxidase (Sigma) разредена 1:3000 в TBS, съдържащ 1 mM MnCI2 и 3% BSA и 1-Step ABTS (2,2’-азин-ди[3-етилбензтиазолин сулфонат]; Pierce). Платки са отчитани при O.D. 405 на microplate reader (Molecular Devices).
Резултати.
Човешките и плъши (95% идентичност с човешки) а1-1 домени са експресирани в E.coli като GST-слети белтъци и са пречистени върху глутатион сефароза. Двата белтъка са изследвани за свързване с колаген I и IV, като е използван един вариант на тест ® основаващ се на ELISA, описан по-рано (Qu, A., and Leahy, D.J. (1995) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92, 10277-10281). Човешкият α1-Ι домен свързва колаген IV с по-добра ефективност отколкото колаген I (Фиг. 15А). Едно антитяло специфично за а1-1 домена, но не антитяло специфично за α2-Ι домена (Фиг. 15В), отменя свързване с двата лиганда (данни за колаген I не са представени). Мп2+ и Мд2+ стимулират свързване, и EDTA редуцирано свързване до изходните нива (Фиг. 15С). Не са открити измерими разлики в свързване на лиганди между човешкия и плъши α1 -I домени, което насочва, че разлики в последователностите между видовете, не са функционално съответни (данни не са представени). Така, а1-1 доменът, специфично изисква катйон за ефективно лигандно свързване.
Пример 18
Катйон-зависими остатъци на епитоп близо до MIDAS мотива. Ние използвахме наблюдението, че AJH10 разпознава последователности на човешкия, но не на плъшия а1-1 домен, за картиране епитопа за α1β1 блокиращи функция mAbs. Човешките и плъшите последователности се различават само с 12 аминокиселини, четири от които са разположени в едно продължение от 6 аминокиселини (аа 91-96, Фиг. 11 А), съседни на критичния треонин (Фиг.11А, аа 98), в рамките на MIDAS мотива. За тестиране хипотезата, че 6-те аминокиселинни остатъци, Val-GInArg-Gly-Gly-Arg (остатъци 91-96 на SEQ ID N0:64), включват епитопа за блокиращите mAbs, ние конструирахме един химерен I домен (RAH), заменяйки плъшите остатъци G91, R92, Q93 и L976 за съответните човешки остатъци, V, Q, R и R, съответно. AJH10, заедно с всички блокиращи функция mAbs, разпознава химерния I домен (RAH; Фиг. 11В).
За ориентиране тези остатъци по отношение на MIDAS домена в терциерната структура на а1-1 домена, ние моделирахме а1-1 домена, като използвахме координатите на кристалната структура на α2-Ι домена.
Хомоложен модел на човешкия а1-1 домен беше изграден, използвайки рентгенова кристална структура на човешкия α2 Iдомен (Ward et al., (1989) Nature 341, 544-546). Моделът е създаден като е използван моделиращ хомология модул на Insight II (version 2.3.5; Biosym Technologies). Използвана е програмата CHARMM (Clackson et al. (1991) Nature 352, 624-628) c all-parameter set 22 c една дистантно зависима диелектрична константа на два пъти разстоянието на атомно разделяне. Ние най-напред направихме 1000 степени на най-стръмното низходящо минимализиране с маснатоварени хармонични позиционни противодействия от 1kcal (mol А2) върху всички атоми на а1-1 домена. Това минимализиране е последвано от други 1000 степени на най-стръмно спускане и 5000 степени на Adopted-Basis Newton Raphson с противодействия от 0.1kcal/(mol А2) върху С-α атомите на а1-1 домена, за избягване значими отклонения от α2-Ι домен рентгеновата кристална структура.
α1β1 и α2β1 интегрин последователностите проявяват 51% идентичност без инсерции или делеции, което насочва, че цялата структура на двата I домена ще бъде сходна. Местото на координационно свързания метал е предсказано да бъде същото в а1-1 домена както в α2-Ι домена и остатъците, които включват епитопа за блокиращите mAbs са разположени в една бримка между спирала аЗ и спирала а4, която съдържа треонин в рамките на MIDAS мотива, критичен за катйонно свързване. а1-1 моделът предсказва, че амидният азот на Q92 (Фиг. 11 А) водород се свързва с карбонилна група на Ι33, остатъкът съседен на S32. Така, бримката, която съдържа епитопа, може да играе функционална роля за стабилизиране MIDAS областта.
Пример 19
Моноклонално антитяло AQC2 (т.е. mAQC2; “m” за мишо) (Пример 15, по-горе) е IgGi, kappa антитяло. За идентифициране нуклеотидните последователности кодиращи тежката и леката вериги на това антитяло, тотална клетъчна РНК от AQC2 миши хибридомни клетки беше получена като е използван QIAGEN RNEASY midi kit, в съответствие с указанията на производителя. След това кДНКи кодиращи променливите области на тежката и леката вериги са клонирани с RT-PCR от тотална клетъчна РНК, като е използвана GIBCOI BRL SUPERSCRIPT Preamplification
System for First Strand cDNA Synthesis, следвайки препоръчания протокол от производителя. За праймиране са използвани случайни хексамери.
Тежковерижният променлив домен на AQC2 е амплифициран с PCR от първата верига кДНК с праймерите: 5’ TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGC ССТ TGG ССС С 3’ (SEQ ID N0:11) и 5’ AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G 3’ (S=C/G, M=A/C, R=A/G и W=A/T) (SEQ ID N0:12). PCR е подложена на 30 цикъла като е използвана Clontech’s Advantage Taq полимераза: денатуриране 30 секунди на 94°С, асоцииране 1 минута на 50°С и удължаване 1.5 минута на 68°С. mAQC2 леката верига с нейната сигнална последователност е амплифицирана с PCR като са използвани праймерите: 5’ ACT AGT CGA CAT GGA TTT WCA GGT GCA GAT TWT CAG CTT C 3’ (W=A/T) (SEQ ID N0:13) и 5’ ACT GGA TGG TGG GAA GAT GGA 3’ (SEQ ID N0:14). PCR е подложена на 30 цикъла като е използвана Startagene’s cloned Pfu polymerase: денатуриране 1 минута на 94°С, асоцииране 1 минута на 50°С и удължаване 2 минути на 72°С. PCR продуктите за тежката и леката вериги са гелно пречистени с QIAGEN QIAQUICK gel extraction kit като е използван препоръчания от производителя протокол.
Пречистен тежковерижен продукт е субклониран в Invitrogen’s pCR2.1-T0P0 ТА вектор като е използван неговия ТОРО ТА cloning kit. Пречистена лека верига е субклонирана в Invitrogen’s pCRbluntllTOPO vector като е използван неговия Zero blunt ТОРО cloning kit и е следван препоръчания протокол от производителя. Секвенирани са инсерти от множество независими субклонове. С изключение на дегенератни позиции в рамките на PCR праймерите, последователностите на инсерти на независимите субклонове са били идентични.
Полипептидните последователности на mAQC2 са изведени от техните кодиращи последователности. N-терминалната аминокиселинна последователност за зрялата лека верига, предсказана от кДНК последователността от PCR продукта, амплифициран с една сигнална последователност, точно съвпада с N-терминалната последователност на пречистена mAQC2 лека верига, производна на Edman деградация (DVKWESGG; SEQ ID N0:15). BLAST анализи на променливите доменни © последователности потвърждават тяхната имуноглобулинова идентичност.
Полипептидната последователност на лековерижния променлив домен на mAQC2 е представена по-долу:
QIVLTQFPAL MSASPGEKVT MTCSASSSVN HMFWYQQKPK
SSPKPWIYLT SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISSMEAE 81 DAATYYCQQW SGNPWTFGGG TKLEIK 106 (SEQIDNO:1)
CDRs са показани задебелени. CDRs са дефинирани съгласно Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, © Th United States Department of Health and Human Services, The United States Government Printing Office, 1991. Използвайки Kabat numbering system, SEQ ID N0:1 е представен както следва, където тирето отбелязва отсъствието на аминокиселина:
QIVLTQFPAL MSASPGEKVT MTCSASS-SV NHMFWYQQKP
KSSPKPWIYL TSNLASGVPA RFSGSGSGTS YSLTISSMEA
EDAATYYCQQ WSGNPWTFGG GTKLEIK 107
Полипептидната последователност на тежковерижния променлив домен на mAQC2 е:
DVKWESGGG
LVKPGGSLKL
ACAASGFSFS
RYTMSWVRQI
PEKRLEWVAT
ISGGGHTYYL
DSVKGRFTIS
RDNAKNTLYL
QMSSLRSEDT
AMYYCTRGFG
DGGYFDVWGQ
GTTVTVSS (SEQ ID N0:2)
CDRs са показани със задебеляване. Използвайки Kabat системата за номериране, SEQ ID N0:2 е представена както следва, където позиционните номера са последователно номерирани, ако специално друго не е указано:
1 DVKWESGGG LVKPGGSLKL ACAASGFSFS RYTMSWVRQI
41 PEKRLEWVAT ISGGGHTYYL DSVKGRFTIS RDNAKNTLYL
81 QM
82а-с SSL
83 RSEDTAMY YCTRGFGDGG
100а-Ь YF
101 DVWGQGTTVT VSS 113
Както тук е използвано, номерата на позиция на остатък от променливи домени, са обозначени в съответствие с Kabat системата за номериране, ако друго не е указано.
Пример 20
Този пример описва създаване на мишо-човешко химерно антитяло, chAQC2.
кДНК кодиращи променливите области на mAQC2 тежка и лека верига, са използвани за конструиране chAQC2 експресионни вектори, при които mAQC2 променливите области са свързани с човешки IgGi и kappa константни области.
Тежковерижният химер е конструиран както следва. Един 0.33 kb Pst-BstEII фрагмент от mAQC2 тежковерижен плазмид PAND083 е субклониран в свъзрзан с фосфатаза 2.82 kb Pst-BstEII векторен фрагмент от 5а8 тежковерижен плазмид pl_CB7, така че да се прибави една миша тежковерижна сигнал-кодираща последователност и мишо снаждащо донорно място към кДНК на mAQC2 тежковерижната променлива област. 5а8 е молекулно кпонирано CD-4 специфично mAb (виж, например Boon et al., 2002, Toxicology 172:191-203). В зрялата тежка верига, кодирана от получения плазмид (pAND092), N-краят се различава с пет остатъци © от N-края (DVKWE; SRQ ID N0:16) на сродната mAQC2 тежка верига.
Точният тежковерижен N-край, pAND092 беше подложен на уникална място елиминираща мутагенеза (USE) като е използван USE mutagenesis kit (Amersham Pharmacia Biotech) и е следван препоръчания от производителя протокол. QID, Q3K, L4V, Q5V, Q6E замествания са кодирани с мутагенен праймер 5’ GCA ССА
GGT GCC САС ТСС GAC GTC AAG GTG GTG GAG ТСА GGG GGA GGC ТТА GTG 3’ (SEQ ID N0:17). Мутирани плазмидни клонове са идентифицирани по техните нови Aatll и Hinfl места и елиминирано Pstl място. Тежковерижната кодираща последователност след това е потвърдена с ДНК секвениране. Коректно мутиран плазмид е наречен pAND094. Фрагментът 0.43 kb Notl-Hindlll от pAND094 и 1.21 kb Hindlll-Notl фрагмента от плазмида pEAG964 (съдържащ една кодираща последователност за човешки lgG1 константна област) са субклонирани в Notl мястото на рСН269, един плазмид, който произлиза от рСЕР4 EBV експресионен вектор (Invitrogen). Полученият плазмид е наречен pAND099.
Лековерижният химер е създаден както следва. Фрагмент
0.46 kb EcoRI от mAQC2 лековерижния променлив домен плазмид pAND081, е субклониран в свързан с фосфатаза 2.7 kb векторен фрагмент на pUC-производен pNN09 клониращ вектор, за прибавяне на 5’ Notl място. Полученият плазмид, pAND091, е подложен на мутагенеза като е използван Amersham USE kit (погоре) за вмъкване на едно Bglll място при 3’ края на кодиращата последователност. Мутагенният праймер има последователността 5’ GGA GGC ACC AAG CTG GAG ATC TAA CGG GCT GAT GCT GC 3’ (SEQ ID N0:18). Коректно мутираният плазмид е идентифициран по неговите Bglll и BstYI промени на мястото. Лековерижната кодираща последователност в получения плазмид pAND093 е потвърдена с ДНК секвениране. След това 0.44 kb Notl-Bglll фрагмент на лековерижния променлив домен от pAND093 и 0.68 kb Bcll-Notl фрагмент от плазмида pEAG963 (съдържащ една кодираща последователност от човешки kappa лековерижен константен домен) са субклонирани в Notl мястото на рСН269 (погоре), произвеждайки плазмид pAND102. За създаване на неблокирана kappa лека верига (QIE), pAND093 е подложен на USE мутагенеза с мутагенния праймер 5’ CAT ААТ GTC CAG GGG AGA ААТ TGT ТСТ CAC CCA G 3’ (SEQ ID N0:19), за въвеждане на едно Xmnl място. Мутираният плазмид е идентифициран чрез скрининг за една промяна на Xmnl място. Лековерижната последователност в получения плазмид pAND097 е потвърдена чрез ДНК секвениране. Фрагментът 0.44 kb Notl-Bglll на лековерижния променлив домен от pAND097 и 0.68 kb Bcll-Notl фрагментът от плазмид pEAG963 (съдържащ един човешки карр лековерижен константен домен) са субклонирани в Notl мястото на рСН269, създавайки плазмид PAND098.
За създаване на chAQC2 антитела, експресионни вектори (chAQC2 тежковерижен вектор pAND099 + chAQC2 лековерижен вектор pAND102 и chAQC2 тежковерижен вектор pAND099 + chAQC2 неблокиран лековерижен вектор pAND098) са ко-трансфектирани в 293-EBNA клетки. Трансфектантите са тестирани за антитяло секреция и специфичност. Контроли са били клетки трансфектирани със съответните вектори без един инсерт или с ДНК конструкти, кодиращи ch5c8 (едно молекулно клонирано CD-154-специфично mAb, описано например в Elster et al. 2001, Transplantation 72:14731478) или chCBE11 (едно молекулно клонирано LTbR-специфично mAb, описано например в Browning et al., 1996, J.Biol.Chem. 271:24934-24938).
Трансфектантите c желаната антитяло секреция са лизирани, и е правена протеин А имунопреципитация на лизатите и кондиционирана среда. Western blot анализ на преципитатите, проведен с анти-човешки тежко и лековерижни антитела, показва, че с11АОС2-трансфектираните клетки синтезират и ефективно секретират тежка и лека вериги в нива сходни на ch5c8трансфекгирани и chCBE11-трансфектирани клетки. Освен това, huVLA-l-експресиращи К562а1 клетки са оцветени с кондиционираната среда от трансфектираните клетки и е правен FACS анализ на оцветените клетки. Резултатите показват, че chAQC2 антитялото дава цветни характеристики, сходни с тези на mAQC2, докато кондиционираната среда от лъжливо-трасфектирани и с1п5с8-трансфектирани клетки не оцветява К562 клетки. Химерно AQC2 получено от повишена преходна трансфекция, е пречистено и показва, че се свързва с VLA-1 чрез FACS титруване. Химерно AQC2 с див тип или генетично неблокирана лека верига се свързва с VLA-1. Виж също Фигури 16A-D (обсъдено по-долу).
Пример 21
Този пример описва метод за хуманизиране mAQC2 моноклоналното антитяло.
Анализ на mAQC2 променливи домени. Променливите домени в леката и тежката вериги на mAQC2 са сравнени с консензус последователностите от миша и човешка подгрупи (Kabat et al. по-горе), като е използвана софтуерна програма FASTA. Лековерижният променлив домен е намерено, че е член на мишата подгрупа IV с 89% идентичност в едно 109 аминокиселинно припокриване. Този домен също съответства на човешка подгрупа I със 72% идентичност в едно 113 аминокиселинно припокриване. Намерено е, че тежковерижният променлив домен е член на една миша подгрупа llld с 86% идентичност в едно 129 аминокиселинно припокриване. Този тежковерижен променлив домен също съответства на човешка подгрупа III със 79% идентичност в едно 130 аминокиселинно припокриване.
CDRs са категоризирани в признати класове, съгласно Chothia et al., Nature 342, pp. 877-883 (1989). Ключовите остатъци определящи всеки признат клас, определят в голяма степен структурната конформация на CDR бримката и така трябва да бъдат задържани в преформпраното антитяло. L1 бримката на mAQC2 попада в приетия клас 1 (10 остатъка бримка), L2 в клас 1 (7 остатъци бримка) и L3 в клас 1 (9 остатъци бримка). Н1 бримката попада в клас 1 (5 остатъци бримка) и Н2 бримката в клас 1 (16 остатъка бримка) остатъци. НЗ бримката изглежда не принадлежи към някакъв признат клас. Признатите остатъци важни за тези класове всички бяха включени в хуманизираните антитела.
Необичайни остатъци на рамката в mAQC2 бяха определени чрез анализиране на всички миши и човешки последователности с променлива верига, във версията от септември 1999 на Kabat база данните. Считаше се, че mAQC2специфични разлики могат да показват соматични мутации, които повишават свързващия афинитет, ако тези разлики са близо до свързващото място. Необичайни mAQC2 остатъци още по-далеч от свързващото място и необичайни остатъци на човешка рамка са отстранени в случай, че те биха създали имуногенни епитопи в хуманизираното антитяло. Необичайни остатъци на рамката, открити в mAQC2 бяха 7(F), 10(L) и 41 (К) в леката верига; и 4(V), 21(A) и 40(1) в тежката верига. Никой от тези необичайни остатъци на човешка рамка не беше задържан в хуманизирани антитела.
Моделиране структурата на променливите области.
Леката и тежката вериги на mAQC2 бяха подредени срещу една не изобилна база данни, за определяне кои структурни рамки да се използват за конструиране три-димензионални модели на mAQC2 леката и тежката вериги. Използвайки FASTA, беше открито, че леката верига има 82% идентичност на последователността с моноклонално мишо антитяло ab57 (1CLOL), докато тежката верига беше намерено, че има 76% идентичност на последователността с миши 6d9 Fab фрагмент (1HYY). Използвайки софтуерния пакет за молекулно моделиране SYBYL (Tripos Inc.), приблизителните тридимензионални структури на mAQC2 леката и тежката вериги бяха изградени, използвайки леката верига на аЬ57 и тежката верига на 6d9, съответно. Структурния интегритет на моделите беше определен при конзолата и беше намерено, че е приемлив.
Дизайн на преформирани променливи области. Използвани са два подхода за избор на човешки акцепторни рамки за приемане” mAQC2’s CDRs. Първият подход беше чрез хомоложно съвпадение и другият използвайки консензус човешки lg последователности. При хомоложния подход, Kabat база данните, не изобилната база данни от NCBI, ENTREZ (The National Institutes of Health) и the Incyte база данни бях търсени, като бяха използвани софтуерни програми FASTA и BLAST. Изборът на човешки акцепторни рамки беше правен въз основа идентичност на последователността между mAQC2 рамки и човешки рамки (изключвайки рамки от предишни хуманизирани антитела) и източника на антитялото.
Рамките от ген на имуноглобилинова променлива област, притежаващи GENBANK ключов номер gi:587330 (човешка kappa подгрупа I Vk-Ic147) бяха накрая избрани за леката верига от хуманизираното антитяло (Welschof et al., J.lmmunol.Meth. 179:20314 (1995)). Рамките за Amulc11 (Kabat ID 044469; човешка подгрупа III) бяха подбрани за тежката верига от хуманизираното антитяло (Huang et al., J.Immunol. 151:5290-300 (1993)).
Обратни мутации на човешки рамки. Стратегии за определяне кои обратни мутации да бъдат направени, са на разположение в the Humanization bY Design web страници: http://mathbio.nimr.mrc.ac.uk/isaldan и http://www.cryst.bbk.ac. uk./~ubcq07s. Предишни експерименти са показали, че е важно да бъдат запазени признати остатъци, интерфейс пакетиращи остатъци и необичайни миши остатъци, които са близо до свързващото място. В допълнение, остатъци в “Vernier Zone”, които образуват една платформа, върху която остават CDRs (Foot et al., J.Mol.Biol. 224, p.487 (1992)) и такива близо до CDR НЗ трябва да бъдат разгледани.
Четири преформирани версии бяха планирани за всяка от променливите лека и тежка вериги, както е представено на Таблица
1. Две от четирите версии за всяка верига бяха планирани с хомоложно съвпадение (обозначени huAQChl и -h2) и другите две версии чрез консензусно съвпадение (hu-AQC2-c1 и -с2). Трябва да се отбележи, че последователностите за huAQC-hl тежка верига и huAQC2-c1 тежка верига са идентични.
Таблица 1. Последователности на mAQC1, huAQC2 и човешки рамки
ЛЕКА ВЕРИГА:
Vk-lcl47 huAQC2-h2 huAQC2-hl mAQC2 huAQC2-cl huAQC2-c2
FR1
D--M--S-SSL---V-DR--I--* ------S-SSL---V-DR--I-------g_SSL---V-DR--I-QIVLTQFPALMSASPGEKVTMTC __q___s.ssl___V-DR--I-_ _q_ _ __ggL_ _ _ V-DR--1 - -
CDR1 FR2
Vk-lcl47 R--Q-ISYLN ------GKA--LL-huAQC2-h2 .......... ......GKA--LL-huAQC2-hl ---------- ------GKA-----mAQC2 SASSSVNHMF WYQQKPKSSPKPWIY huAQC2-Cl ---------- ------GKA-----huAQC2-c2 ---------- ------GKA—LL—
CDR2 FR3
Vk-lcl47 AA-S-Q- ---S---------DFT-----LQP--F----huAQC2-h2 ....... ---S---------D-T-----LQP---F----huAQC2-hl ------- ---S---------D-T-----LQP--F----mAQC2 LTSNLAS GVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYC huAQC2-cl ------- ---S---------D-T-----LQP--F----huAQC2-c2 ------- ---S---------D-T-----LQP--F----Промени на
Vk-lcl47 huAQC2-h2 huAQC2-hl mAQC2 huAQC2-cl huAQC2-c2
CDR3
--SYST-LQQWSGNPWT
FR4 рамката
------ν---25
------ν---21
------V-.-19
FGGGTKLEIK**0
--Q---V---21
--Q--VV---23
SEQ ID NOS: 65, 51, 49,1, 66 и 54 , съответно, по реда на появяване
ТЕЖКА ВЕРИГА:
FR1
CDR1
AMU1C11 huAQC2-h2 huAQC2-hl mAQC2 huAQC2-cl huAQC2-c2
AMU1C11 huAQC2-h2 huAQC2-hl mAQC2 huAQC2-cl huAQC2-c2
AMU1C11 huAQC2-h2 huAQC2-hl
E-QL-------IQ-----R-S------TVSNY-E-QL-------IQ-----R-S------T-- ----- -QL--------Q-----R-S-.......- ----DVKWESGGGLVKPGGSLKLACAASGFSFS RYTMS
- —QL--------Q-----R-S........E-QL--------Q.....R-S......T-FR2
CDR2
--A-G-G----S V-YS--S---A—
--A-G-G-—A-G-G-WVRQIPEKRLEWVA TISGGGHTYYLDSVKG
--A-G-G----A-G-G-FR3
CDR3
--------S--.....-N---A----V---AS IRFLEWS--Y
S--------N---A----V
S......--N---A----V mAQC2 RFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCTR GFGDGGYFDV huAQC2-cl huAQC2-c2
S.......-N---A----V
S--------N---A----V
FR4
AMU1C11 -----L-----
huAQC2-h2 -----L.....
huAQC2-hl -----L-----
mAQC2 WGQGTTVTVSS
huAQC2-cl -----L-----
huAQC2-c2 -----L-----
Промени на рамката
Тиретата означават идентичност с mAQC2 аминокиселинната последовател-ност. **4acroTSEQ ID N0:1; ***Част от SEQ ID N0:2.
SEQ ID NOS: 67,44,42, 2,42 и 68, съответно, по реда на появяване.
Някои от обратните мутации са обсъдени по-долу.
(1) лека верига:
D-> Q Тази мутация е направена във всички версии, тъй като предишни преформиращи експерименти (например, Kolbinger et al., Protein Eng. 6, p.971 (1993) насочват за нейното значение за антигенно свързване.
М-> L това е един спомагателен остатък и е запазен във всички версии.
46L-> Р Този остатък е и двете - интерфейсен и Ф спомагателен остатък и беше запазен само в hi и с1.
47L->W Това е един спомагателен остатък и е запазен само в hi и с1.
71F-> Y Този остатък е във важна призната позиция и е запазен във всички версии.
(2) тежка верига:
1 Е-> D Тази обратна мутация е направена в hi (т.е. с1) само.
12l-> V Този остатък I е необичаен у човека и е запазен само в h2.
28Т-> S Това е един спомагателен остатък и е запазен само в hi.
29V-> F Това е един признат остатък и е запазен във всички версии.
49S-> A Това е един спомагателен остатък и е запазен във всички версии.
93А-> Т Това е един признат остатък и интерфейсен и е запазен във всички версии.
94S-> R Това е един признат остатък и е запазен в двете версии.
Променливите huAQC2 области са направени с USE мугагенеза, както е описано по-горе, като са използвани chAQC2 променлив домен плазмиди като изходни матрици. кДНК последователностите на човешката акцепторна рамка (“FR”) бяха Kabat #Z37334 за леката верига и Kabat#U00490 за тежката верига. За улесняване идентификация на мутирани плазмиди, са въведени тихи мутации за промяна на рестрикционни места. Мутантни © плазмиди са идентифицирани чрез промени на рестрикционни места. кДНК последователностите на променилавата област в получените плазмиди са потвърдени с ДНК секвениране.
Верисиите hi и с1 на тежката верига ( които са идентични) са получени използвайки плазмидна pAND904 матрица. Мутагенните праймери са : FR1 праймер 5’ GGT GCC CAO ТСС GAC GTC CAG CTG GTC GAG ТСА GGG GGA GGC ТТА GTC CAG ССТ GGA GGG ТСС CTG AGA СТС ТСС TGT GCA GCC ТСТ GGA ТТС 3’ (SEQ ID N0:20), който е въвел Taql и Pvull места и е елиминирал Ddel място; FR2 праймер 5’ ATG ТСТ TGG GTT CGC CAG GCT CCG GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC GCA ACC 3’ (SEQ ID N0:21), който e © въвел Neil място, и е елиминирал BspEI и Earl места; FR3 праймер 5’ ТТС ACC АТС ТСС AGA GAC ААТ ТСС AAG AAC ACC CTG ТАС CTG CAG ATG AAC AGT CTG AGG GCC GAG GAC АСА GCC GTG TAT TAC TGT АСА AGA 3’ (SEQ ID N0:22), който е въвел Pstl и Ddel места; и FR4 праймер 5’ TGG GGC CAA GGT ACC CTG GTC ACC GTC ТСС TCA GGT GAG 3’ (SEQ ID N0:23), който е въвел Kpml и Eco01091 места. Полученият hi (т.е. c1) тежковерижен плазмид е обозначен pAND104.
Версията с2 на тежката верига е получена използвайки pAND104 като матрица със следните мутагенни праймери: FR1 праймер ТСС TGT GCA GCC ТСТ GGA ТТС ACC ТТС AGT AGG ТАТ ACT ATG ТСТ TGG GTT 3’ (SEQ ID N0:24), който въвежда едно Accl място; и FR1 праймер 5’ GCA ССА GGT GCG САС ТСС GAG GTC CAG CTG GTC GAG ТСА 3’ (SEQ ID N0:25), който въвежда едно Fspl място и елиминира едно Aatll място. Полученият с2 тежковерижен плазмид е обозначен pAND115.
Версията h2 на тежка верига е получена използвайки pAND115 като матрица със следния праймер: FR1 праймер 5’ GAG • ТСА GGG GGA GGC ТТА ATC CAG OCT GGA GGG ТСС CTG 3’ (SEQ ID NO:26|, който елиминира едно Ddel място. Полученият h2 тежковерижен плазмид е обозначен pAND113.
За създаване експресионни вектори за huAQC2104 тежките вериги, 0.43 kb Notl-Hindlll фрагментът на тежковерижния променлив домен от pAND104, pAND115 или pAND113 и 1.21 kb Hindlll-Notl фрагментът от pEAG964 (по-горе), са клонирани в Notl мястото на рСН269 (по-горе). Получените тежковерижни експресионни плазмиди са обозначени pAND114 (hi), pAND121 (с2) и pAND124 (h2), съответно.
Версията hi на леката верига е получена използвайки ® плазмид pAND093 като матрица. Мутагенните праймери са: FR1 праймер 5’ CAA ATT GTT СТС ACC CAG ТСТ ССА ТСС ТСС CTG ТСТ GCG ТСТ GTA GGG GAC AGA GTC ACC АТС АСА TGC AGT GCC AGC ТСА 3’ (SEQ ID N0:27), който отстранява BstEII и Pstl места; FR2 праймер 5’ ТТС TGG TAT CAG CAG AAG ССС GGG ААА GCC ССС ААА ССС TGG АТТ 3’ (SEQ ID N0:28), който въвежда едно Neil място; FR3 праймер 5’ GCT ТСТ GGA GTC ССТ ТСА CGC ТТС AGT GGC AGT GGG ТСТ GGG АСА GAT ТАС ACT СТС АСА АТС AGC AGC CTG САА ССТ GAA GAT ТТТ GCC ACT ТАТ ТАС TGC CAG
3’ (SEQ ID N0:29), който въвежда едно Ddel място и елиминира ЕсоОЮ91 и Avail места; и FR4 праймер 5’ GGT GGA GGC ACT AAG GTG GAG ATC TAA CGG GCT 3’ (SEQ ID N0:30), който въвежда Ddel и Styl места. Полученият hi лековерижен плазмид е обозначен PAND103.
Версията h2 на леката верига е получена използвайки pAND103 като матрица със следния праймер: FR2 прймер 5’ ССС GGG AAA GCG ССС АДА СТС CTG АТТ ТАТ СТС АСА ТСС 3’ (SEQ ID N0:31), който въвежда Hhal и Haell места. Полученият h2 лековерижен плазмид е обозначен pAND116.
© Версията с1 на леката верига използва плазмид pAND103 матрица със следните праймери: FR1 праймер 5’ GCC ТСА GTC АТА ATG ТСС CGG GGA САА АТТ CAG СТС ACC CAG ТСТ ССА ТСС 3’ (SEQ ID N0:32), който въвежда Smal, Neil и Hpall места; FR4 праймер 5’ GGT AAC CCG TGG ACG ТТС GGT CAG GGC ACT AAG GTG GAG ATC TAA CGG GCT 3’ (SEQ IF N0:33), който въвежда едно Bsp1286l място. Полученият с1 лековерижен плазмид е обозначен PAND118.
Версията с2 на леката верига е получена използвайки плазмид pAND116 матрица със следните праймери: FR1 праймер 5’ GCC ТСА GTC АТА ATG ТСС CGG GGA САА АТТ CAG СТС АСС ® CAG ТСТ ССА ТСС 3’ (SEQ ID N0:34), който въвежда Smal, Neil и Hpall места; FR4 праймер 5’ GGT AAC CCG TGG ACG ТТС GGT CAG GGC ACT AAG GTG GAG ATC TAA CGG GCT 3’ (SEQ ID N0:35), който въвежда едно Bsp1286l място. Полученият с2 лековерижен плазмид е обозначен pAND119.
За създаване експресионни вектори за huAQC2 леките вериги, 0.44 kb Notl-Bglll фрагментът на лековерижния променлив домен от pAND103, pAND116, pAND118 или pAND119 и 0.68 kb BcllNotl фрагментът от pEAG963 (по-горе) са субклонирани в Notl мястото на рСН269 (по-горе). Получените лековерижни експресионни вектори са обозначени pAND117 (hi), pAND120 (h2), pAND122 (c1) и pAND123 (c2), съответно.
Експресионните вектори са ко-трансфектирани в 293-EBNA клетки и трансфектираните клетки са тестирани за антитяло секреция и специфичност. Клетки трансфектирани с празен вектор служат като отрицателна контрола. Лизатите от цели клетки и кондиционирана среда са имуно-преципитирани с протеин А. Western blot анализ на преципитатите (изявен с анти-човешки леко и тежковерижно антитела) показват, че 1пиАОС2-трансфктирани Ф клетки синтезират и ефективно секретират тежки и леки вериги, с нива сходни с тези при сЬАОС2-трансфектирани клетки.
Проведен е FACS анализ на VLA-1-експресиращи К562-а1 клетки, оцветени с кондиционирана среда от трансфектираните клетки. За да се извърши това, К562-а1 клетките са инкубирани с кондиционираната среда на лед за 120 минути. След това клетките са измити три пъти с FACS буфер (PBS с 5% FBS и 0.05% натриев азид). Измитите клетки са ресуспендирани в буфера и са инкубирани с РЕ-конюгиран анти-човешки IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) на лед за 30 минути. След инкубацията, клетките са измити три пъти с FACS буфер и са ресуспендирани във FACS © буфер за анализ. Данните са представени на Таблица 2, в които HuAQC2-h1 се отнася за едно mAb състоящо се от hi версията на huAQC2 тежка верига (НС) и hi версията на huAQC2 лека верига (LC) (виж Таблица 1). Подобно, huAQC2-h2 е mAb състоящо се от h2 версии на тежката и леката вериги, huAQC2-c1, с1 версията и huAQC2-2c с2 версиите. В таблицата, относително MFI са отнася за средно MFI нормализирано с това, наблюдавано за chAQC2 блокиран. Показаните данни представляват средна от две независими трансфекции. Тези данни показват, че huAQC2-h2 и -с2 mAbs се свързват по-слабо отколкото huAQC2-h1 и -с1 в сравнение с chAQC2.
Таблица 2. FACS оцветяване на К562а1 клетки с chAQC2 и huAQC2
Лека верига Тежка верига Относително MFI
chAQC2 pAND102 pAND099 1.00
huAQC2-hl pANDll? pAND114 1.50
huAQC2-h2 pAND120 pAND124 0.64
huAQC2-cl pAND122 pAND114 1.50
huAQC2-c2 pAND123 pAND121 0.68
huAQC2 LC cl/НС c2 pAND122 pAND121 2.21
huAQC2 LC c2/HC cl pAND123 pAND114 0.76
huAQC2 LC unblocked cl/НС c2 pAND150* pAND121 0.75
huAQC2 LC L46P c2/HC c2 PAND133** pAND121 1.50
huAQC2 LC L47W c2/HC c2 pAND132*** pAND121 1.00
*То кодира huAQC2 LC с1 с един неблокиран N-край Q1D.
** То кодира huAQC2 LC с2 с L46P.
*** То кодира huAQC2 LC с2 с L47W.
Ко-трансфекции на 293-EBNA клетки с chAQC2 и huAQC2h1, -h2, с-1 и -с2 са постепенно повишени. Антитела в кондиционираната среда са пречистени с Protein A-Sepharose. Пречистени mAbs са тестирани с FACS за активност. Протоколът е както следва.
1. Преброяване на клетки от съдчето, което е разсято 1:4 в деня преди тестирането.
2. Утаяване на клетки и ресуспендиране при 2.5е5 клетки/ml във FACS буфер (5% FBS в PBS-c 0.02% натриев азид).
3. Пипетиране 100 μΙ от клетките в ямки на 96-ямкова Vдънна платка.
4. Изготвяне 1:3 серийни разреждания на AQC2 започвайки от 3 цд/т! във FACS буфер.
5. Утаяване на клетките за 5 минути на 800 х g и почукване платката за отстраняване на буфера.
6. Ресуспендиране на клетките в 100 μΙ от разредените антитяло серии.
7. Инкубиране за два часа на лед.
8. Измиване на платката. Утаяване на клетките за 3 минути на 800 х g и почукване на платката за отстраняване на буфера.
9. Ресуспендиране на клетките в 100 μΙ от второто антитяло (разреждане 1:100 във FACS буфер).
10. Инкубиране за 30 минути на лед.
11. Измиване на платката (виж по-горе).
12. Ресуспендиране на клетките в 25 μΙ FACS буфер.
13. Центрофугиране на FACS епруветките за кратко, за да се осигурим, че 50 μΙ са на дъното на епруветките.
14. Разбъркване на вортекс интензивно епруветката и събиране на 5000 броя.
Данните са представени на Фигура 17. Тези данни потвърждават, че huAQC2-h2 и -с2 свързват по-слабо отколкото huAQC2-h1 и -с1 в сравнение с chAQC2.
Консензус версиите на huAQC2 са проучени по-нататък, тъй като те биха били по-малко имуногенни, когато се използват за лечение на пациенти с хронични индикации. Правени са mix- и match котрансфекции за идентифициране дали една единична верига е отговорна за видимото намаление на свързване, наблюдавано с hu-AQC2-c2. Ко-трансфекциите насочват, че намалението може да бъде приписано на с2 леката верига (кодирана от pAND123), която се различава от с1 леката верига (кодирана от pAND122) само с два остатъка в FR2 областта: P46L и W47L.
За изследване индивидуалните приноси на всяка от тези промени, са конструирани нови с2 лековерижни експресионни вектори. Плазмид pAND125, L47W вариантът на с2 леката верига е получен използвайки pAND119 като матрица със следния мутагенен праймер: FR2 праймер 5’ GGG AAA GCA ССС ААА СТС TGG АТС ТАТ СТС АСА ТСС ААС 3’ (SEQ ID N0:36), който въвежда Hhal и Haell места. Плазмид pAND126, L46P вариантът на с2 леката верига, е получен използвайки pAND119 като матрица със следния © мутагенен праймер: FR2 праймер 5’ AAG ССС GGG AAG GCG ССС ААА ССС CTG АТТ ТАТ СТС АСА ТСС ААС 3’ (SEQ ID N0:37), който въвежда BsaHI, Banl и Narl места. Експресионни вектори за тези нови huAQC2 леки вериги са получени чрез субклониране 0.44 kb Notl-Bglll фрагмента на лековерижния променлив домен от pAND125 или pAND126 и 0.68 kb Bcll-Notl фрагмент от pEAG963 (погоре) в Notl мястото на рСН269 (по-горе). Получените плазмиди са обозначени pAND132 (с2 с L47W) и pAND133 (с2 с L46P), съответно.
Правени са ко-трансфекции на новите лековерижни плазмиди с всеки от huAQC2 тежковерижните плазмиди. Изследвано е VLA-1 свързване с FACS. Данните показват, че L47W © обратна мутация не подобрява свързването. L46P мутацията подобрява пика на кривата на свързване, но ЕС50 е бил все още изместен надясно в сравнение с поведението на huAQC2 версия 1 (Таблица 2, по-горе). Тези резултати насочват, че двете обратни мутации са необходими за пълна свързваща активност.
Получена е също една генетично неблокирана лека верига, тъй като Q1D вариантът би бил един остатък повече “хуманизиран”. Q1D мутантът, обозначен pAND148 е получен с матрицата pAND118 със следния мутагенен праймер: FR1 праймер 5’ GTC АТА ATG ТСС
100
CGG GGA GAT ATC CAG CTC ACC CAG TCT 3’ (SEQ ID N0:38), който въвежда едно ново EcoRI място и отстранява едно Apol място. Получен е един експресионен вектор за този последен вариант на huAQC2 леката верига, чрез субклониране 0.44 kb Notl-Bglll фрагмент на лековерижния променлив домен от pAND148 и 0.68 kb Bcll-Notl фрагмент от pEAG963 в Notl мястото на рСН269, създавайки лековерижния експресионен вектор pAND150 (с1 с неблокиран N-край Q1D). Ко-експресия на генетично неблокираната лека верига с с2 тежката верига (т.е. “huAQC2 Lc с1 неблокирана/НС с2”, обозначена huAQC2-c4) е еквивалентна на тази на “huAQC2 LC © d/НС с2” (обозначена като huAQC2-c3). VLA-1 свързване е потвърдено с FACS на VLAI-експресиращи К562а1 клетки (Таблица 2)·
Ко-трансфекция на 293-ΕΒΝΑ клетки с chAQC2 и huAQC2h1, -h2, -с1, -с2, -сЗ и с4. Антитела в кондиционираната среда са пречистени на Protein A-Sepharose. Пречистените mAbs са тестирани за активност (Фигури 17 и 18). HuAQC2-c3 е избран като кандидат за лекарство, тъй като неговите свойства са по-сходни с chAQC2. След това са планирани вектори за стабилна експресия на huAQC2-c3 в СНО клетки. Векторите съдържат една кДНК за huAQC2 с1 или с2 НС, с 5’ и 3’ UTRs елиминирани и тежковерижният С-краен лизин е генетично делетиран за осигуряване хомогенност на продукта. Крайните вектори бяха PAND162 (лека верига), pAND160 (тежка верига). Както тук е използвано, huAQC2-c3 също е наричан hAQC2.
Пълните полипетидни последователности на hAQC2 са както следва.
101
Лека верига (Плазмид: pAND162)
QIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASSSVN HMFWYQQKPG
KAPKPWIYLT
SNLASGVPSR FSGSGSGTDY TLTISSLQPE DFATYYCQQW
SGNPWTFGQG
101 TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS WCLLNNFYP
REAKVQWKVD
151 NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV
YACEVTHQGL
201 SSPVTKSFNR GEC (SEQ ID N0:3)
Тежка верига (Плазмид: pAND160)
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYTMSWVRQA PGKGLEWVAT
ISGGGHTYYL DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT
AVYYCTRGFG
101 DGGYFDVWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSWTVP SSSLGTQTYI
102
201 CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD
251 TLMISRTPEV TCWVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
301 YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
351 TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG (SEQ Ш N0:4)
Други тежко- и лековерижни полипептидни и нуклеотидни последователности са представени по-долу.
A. chAQC2 тежка верига (Pand099) (SEQ ID Nos:39 и 40). Първият номер се отнася за нуклеотидната последователност и последния за полипептидна последователност. Същият порядък е използван в следващото номериране.)
GACGTCAAGGTGGTGGAGTCAGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAA СТС
DVKVVESGGGLVKPGGSL
К L
GCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTCAGTAGATATACTATGTCTTGGGTTCGCCAG
АТТ
ACAASGFSFSR YTMSWVR
Q I
121
CCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGTGGTGGTCACACCTACTAT
СТА
103
PEKRLEWVAT I SGGGHTY
Y L
181
GACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTAC
CTG
DSVKGRFTIS RDNAKNTL
Y L
241
CAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTACAAGAGGTTTT © сол
QMSSLRSEDTAMYYCTRG
F G
301
GACGGGGGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
DGGYFDVWGQ GTTVTVSS
B. hAQC2 HC hi и c1 (pAND114) (SEQ ID Nos:41 и 42)
O 1 ! GACGTCCAGCTGGTCGAGTCAGGGGGAGGCTTAGTCCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGA
CTC
DVQLVESGGG LVQPGGSL
R L
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTCAGTAGATATACTATGTCTTGGGTTCGCCAG GCT
SCAASGFSFS RYTMSWVR
Q A
104
121
CCGGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGTGGTGGTCACACCTACTAT
СТА
PGKGLEWVAT I SGGGHTY
Y L
1S1
GACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTAC
CTG
DSVKGRFTISRDNSKNTL
Y L
241
CAGATGAACAGTCTGAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTACAAGAGGTTTT
GGA
QMNSLRAEDTAVYYCTRG
F G
301
GACGGGGGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
DGGYFDVWGQGTLVT.VSS ^^4
C. hAQC2 h2 тежка верига (pAND124) (SEQ ID Nos: 43 и 44)
GAGGTCCAGCTGGTCGAGTCAGGGGGAGGCTTAATCCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGA
CTC
EVQLVESGGGLIQPGGSL
R L
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGGTATACTATGTCTTGGGTTCGCCAG
GCT
105
SCAASGFTFSRY TMSWVR
121
CCGGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGTGGTGGTCACACCTACTAT
CTA
PGKGLEWVATI SGGGHTY
181
GACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTAC
CTG
DSVKGRFTISRDNSKNTL
241
CAGATGAACAGTCTGAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTACAAGAGGTTTT
GGA
QMNSLRAED TA VYYCTRG
301
GACGGGGGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGG DGGYFDVWGQG TLVTVSS
D. hAQC2 c2 тежка верига (pAND121) (SEQ ID Nos:43 и 2)
GAGGTCCAGCTGGTCGAGTCAGGGGGAGGCTTAGTCCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGA
CTC
EVQLVESGGGL VQ PGGSL
106
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGGTATACTATGTCTTGGGTTCGCCAG
GCT
SCAASGFTFSRYTMSWVR
Q A
121
CCGGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGTGGTGGTCACACCTACTAT
CTA
PGKGLEWVATI SGGGHTY
181
GACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTAC
CTG
DSVKGRFTISRDNSKNTL
Y L
241
CAGATGAACAGTCTGAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTACAAGAGGTTTT
GGA
QMNSLRAEDTAVYYCTRG
F G
301
GACGGGGGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGG
PGGYFDVWGQGTLVTVSS
E. chAQC2 блокирана верига (Pand102) (SEQ ID Nos:46 и
47)
107
CAAATTGTTCTCACCCAGTTTCCAGCACTCATGTCTGCGTCTCCAGGGGAGAAGGTCACC
ATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCA
121
TCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCT
CGC
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCT
241
GATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTGGA
GGC
ACCAAGCTGGAGATCAAA
F. hAQC2 hi лека верига (pAND117) (SEQ ID Nos:48 и 49)
108
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCGTCTGTAGGGGACAGAGTCACC QIVLTQSPSSLSASVGDR
V T
ATCACATGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCC GGG ITCSASSSVNHMFWYQQK P G ф 121
AAAGCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCA
CGC
KAPKPWIYLTSNLASGVP
S R
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAACCT
GAA
FSGSGSGTDYTLTI SSLQ
P E ©241
GATTTTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTGGA
GGC
DFATYYCQQWSGNPWTFG
G G
301 ACTAAGGTGGAGATCAAA
T K V Е I K
G. hAQC2 h2 лека верига (pAND120) (SEQ ID Nos:50 и 51)
109
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCGTCTGTAGGGGACAGAGTC
ACC
QIVLTQSPSSL SASVGDR
V T
ATCACATGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCC
GGG ____
ITCSAS'SSVNH MFWYQQK P G © 121
AAAGCGCCCAAACTCCTGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCA
CGC
KAPKLLIYLTS NLASGVP
S R
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAACCT
GAA
FSGSGSGTDYT LTISSLQ
P E
GATTTTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTGGA
GGC
DFATYYCQQWS GNPWTFG
G G
301 ACTAAGGTGGAGATCAAA
T K V Е I K
H. hAQC2 d лека верига (pAND122) (SEQ ID Nos:52 и 1)
110
CAAATTCAGCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCGTCTGTAGGGGACAGAGTC
ACC
QIQLTQSPS SLSASVGDR
V T
ATCACATGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCC GGG
I TCSASSSVNHMFWYQQK
P G
121
AAAGCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCA CGC
KAPKPWIYLTSNLASGVP
S R
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAACCT
GAA
PSGSGSGTDYTLTISSLQ
P E
241
GATTTTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTCAG
GGC
DFATYYCQQWS GNPWTFG
Q G
301 ACTAAGGTGGAGATCAAA
T K V Е I K hAQC2 c2 лека верига (pAND123) (SEQ ID Nos:53 и 54)
Ill
CAAATTCAGCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCGTCTGTAGGGGACAGAGTC ACC
Q I Q L T Q S P S S L S A S V G D R
V T
ATCACATGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCC GGG
IT CSASSSVNHMF WYQQK © ; P G
121
AAAGCGCCCAAACTCCTGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCA
CGC
KAPKL LIYLTS NLAS GV P
SR '
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAACCT GAA
FSGSGS GTDYT LTISSL Q
Ope
241
GATTTTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTCAG
GGC
DFATYYCQQWS GNP WT .FG
Q G
301 ACTAAGGTGGAGATCAAA I
T K V Е I K
112
J. chAQC2 неблокирана лека верига (pAND098) (SEQ ID Nos:55 и 56)
GAAATTGTTCTCACCCAGTTTCCAGCACTCATGTCTGCGTCTCCAGGGGAGAAGGTC
ACC
EIVLTQFPALMSAS PGEK
ATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCA
AAA
MTCSASSSVNHMFWYQQK
121
TCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCT
CGC
SSPKPWIYLTSNLASGVP
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCT
GAA
FSGSGSGTSYS LTI SSME
241
GATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTGGA
GGC
DAATYYCQQWSGNPWTFG
G G
301 ACCAAGCTGGAGATCAAA
T K L Е I K
113
K. huAQC2 неблокирана с1 лека верига (pAND150) (SEQ ID Nos:57 и
58) ί GATATCCAGCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCGTCTGTAGGGGACAGAGTC ACC
DIQLTQSPSSLSASVGDR
V T
ATCACATGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCC GGG
ITCSASSSVNHMFWYQQK
P G
121
AAAGCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCA
CGC
KAPKPWIYLT SNLASGVPS R
181 TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAACCT GAA
FSGSGSGTDYTLTISSLQ
P E
241
GATTTTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTCAG
GGC
DFATYYCQQW SGNPWTFG
Q G
301 ACTAAGGTGGAGATCAAA
114
Т К V Е I К
Пример 22
Този пример описва характеризирането на различни AQC2 антитела на изобретението.
Твърдофазен тест за a1 I домен свързване. Петдесет μΙ от 10mg/ml α1 I домен-GST слет белтък са добавени към CORNING COSTAR EASY WASH полистиренова 96-ямкова платка (Gotwals et al., Biochemistry, 38, 8280-8 (1999)). След инкубация на 4°С за 16 часа, платката е измита четири пъти с 350 μΙ 0.1% Tween-20 в PBS в приспособление за измиване на платки. Платката е блокирана чрез добавяне на 180 μΙ 3% BSA в TBS на 25°С за 60 минути и след това е измита както по-горе. Изготвени са разреждания на антитела (50 μΙ/ямка) в TBS съдържащ 1 mg/ml BSA (тест буфер) в 96-ямкова кръглодънна платка, прехвърлени са в α1 I домен-покрита платка и са инкубирани за 60 минути на 25°С. След едно последно измиване, е добавен 100 μΙ/ямка ТМВ реагент (Pierce). След 10 минути, са добавени 100 μΙ 1М сярна киселина и е отчетена абсорбцията при 450 nm на UV-Vis 96-ямков спектрофотометър.
Електрохемилуминисцентни тестове за свързване на α1β1 интегрин или a 1 I домен с колаген. Tosyl- activated DYNABEADS (Dynal, Inc.) са покрити със 100 μg/ml тип IV колаген (Sigma), съгласно указанията на производителя. Изготвени са клетъчни лизати от а1-трансфекгирани К562 клетки както следва. Клетките са събрани чрез центрофугиране, ресуспендирани са при 108 клетки/ ml в лизис буфер съдържащ 25 тМ Трие-, pH 7.4, 1% NP40, 1тМ CaCI2, 1тМ MnCI2, 1тМ MgCI2, 2% BSA и 1тМ PMSF и са инкубирани на 4°С за 60 минути. Клетъчните фрагменти са отстранени чрез центрофугиране на 12,000 об.мин. за 30 минути и получената надстояща течност е използвана в последващите
115 експерименти. Анти-βΐ активиращо антитяло TS2/16 и поликлонално анти-GST антитяло (Pharmacia) са белязани с TAGNHS естер (IGEN International, Inc., Gaithersburg, MD), в съответствие с указанията на производителя. Белязаните антитела са пречистени с гел филтрация хроматография на SEPHADEX G25M (Pharmacia).
За провеждане на свързващия тест, покрити с колаген зърна (1mg/ml) са блокирани за 5 минути с 8% Lewis плазма от плъх в тест буфер, съдържащ 50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl и 0.1% Тритон-Х-100. За α1β1 свързващия тест, серийни разреждания от антитела са инкубирани с 10 цд зърна, изготвян е клетъчен лизат от 105 а1-трансфектирани К562 клетки (по-горе) и 0.1 gg/ml TAG-TS2/16 в тест буфер съдържащ 1mM MnCI2. За свързващия тест на α1 I домен, антителата са инкубирани с 10 цд зърна, 0.1 цд/т1 α1 I домен GST слет белтък, и 1 pg/ml TAG-aHTH-GST в тест буфер, съдържащ MnCI2. След един до два часа разклащане на стайна температура, са добавени 200 μΙ тест буфер и пробите са отчетени на ORIGEN 1.5 елекгрохемилуминисцентен детектор (IGEN). Диаграмите са представени в условни елекгрохемилуминисцентни единици (ECL) на ординатната ос.
Биотинилирано mAQC2 конкурентен тест. 96-ямкова платка е покрита с 50 μΙ 5pg/ml α1 I домен GST слет белтък и е блокирана с 3% BSA в TBS, както е описано по-горе. Изготвени са разреждания на антитела (60 μΙ/ямка) в тест буфер в 96-ямкова кръглодънна платка и са добавени 60 μΙ 0.1 μg/ml биотинилирано мишо AQC2 в тест буфер. Петдесет микролитра от всяка ямка са прехвърлени в покритата платка и са инкубирани за 3 часа на 25°С. След това платката е измита както по-горе, добавени са 50 μ11 pg/ml пероксидаза-конюгиран EXTRAVIDIN (Sigma) и платката е инкубирана още 2 часа на 25°С. След последно измиване, са
116 добавени 100 μΙ/ямка ТМВ реактив (Pierce). След 10 минути са добавени 100 μΙ 1М сярна киселина и е отчетена абсорбцията при 450 nm на UV-Vis 96-ямков спекгрофотометър.
Експериментални резултати. Експерименталните резултати са представени на Фигури 16A-D и Таблица 3. Способността на mAQC2, chAQC2, hAQC2 и hAQC2’ (т.е. huAQC2с4; различаващо се от hAQC2 само в това, че остатък 1 на hAQC2’ леката верига е D вместо Q) да (1) се свързват с човешки а1трансфектирани К 562 клетки (с FACS); (2) се свързват с имобилизиран а1-1 домен (с ELISA); (3) се конкурират с mAQC2 за свързване с α1 -I домен (ELISA); (4) блокират а1 -I домен свързване с колаген (Електрохемилуминисцентен тест); или (5) определено е блокиране на α1β1 интегрин свързване с колаген (Електрохемилуминисцентен тест). Резултатите са представени на Фигури 16A-D и изчислени стойности IC50 (за инхибиране) или ЕС50 (за свързване) са представени в Таблица 3. Във всеки тест, всяка от хуманизираните AQC2 форми показва сходна способност да свързва VLA1 (или а1 домен) или да блокира свързване с колаген (отбележи, че в панел С, наблюдаваната разлика в интензитета между mAQC2 и хуманизираните форми произтича от използването на анти-мишо1дС вторично антитяло, вместо анти-човешки-lgG).
117
Таблица 3. Обобщение на резултати от тестове (всички стойности са в пМ)
Антитяло FACS (EC50) VLA1 Инхибиране (IC50) all Инхибиране (IC50) ELISA (EC50) Конку рентнос биотин- AQC2 (IC50)
mAQC2 n.d. 0.0726 (±0.014) 0.029 (±0.011) 0.061 (±0.015) 38 (±8.7)
Chimera 0.25 0.071 (±0.002) 0.027 (±0.007) 0.176 (±0.058) 30 (±6.9)
hAQC2 0.29 0.129 (±0.005) 0.035 (±0.005) 0.190 (±0.010) 65 (±2.2)
hAQC2' 0.43 0.125 (±0.018) 0.037 (±0.001) 0.313 (±0.072) 69 (±25.7)
След това ние тестирахме дали промени при някои консервативни остатъци в CD Rs могат да запазят VLA-1 свързващата активност на hAQC2. Изготвени са ДНК конструкти, кодиращи варианти на hAQC2 със следните мутации, чрез мястонасочена мутагенеза: (1) G55S в тежковерижна CDR2; (2) S24N в лековерижната CDR1 (въвеждайки едно заето N-свързано място на гликолизиране); (3) G92S в лековерижната CDR3; (4) една комбинация на (1) и (2); и (5) една комбинация на (1) и (3). ДНК конструктите кодиращи тежката и леката вериги след това са котрансфекгирани в 293-EBNA клетки и кондиционираната среда от трансфекгантите е тестирана за антитяло експресия с Western blot и ELISA. Резултатите показват, че hAQC2 вариантите са експресирани толкова ефективно, колкото са сродни с hAQC2. FACS анализ използвайки VLA-1-експресиращи К562 клетки освен това показва, че VLA-1 свързващите активности на тези варианти са сходни с
118 hAQC2. Общо, аминокиселинните замени не променят VLA-1 свързващата активност на hAQC2. Наистина, рентгенова кристална структура на RAH/hAQC2 Fab комплекса (по-долу) показва, че S24 и
G92 на леката верига и G55 на тежката верига не са в свързващата вдлъбнатина, която е в контакт с а1-1 домена.
Пример 23
Ефекторните функции на един имуноглобулин, свързват имуноглобулиновата антиген-свързваща активност с възпалителни, цитотоксични и стимулаторни способи на имунната система. Ефекторни функции могат да нарушат безопасността и ефикасността на имуноглобулинов терапевтичен продукт. За редуциране на потенциалните ефекторни функции на hAQC2, са изготвени мутации на L234A и L235A в тяхната тежка верига за създаване на hsAQC2. На същото основание, е направена една единична мутация на N297Q в тежката верига на hAQC2, за създаване на агликолизирана форма на hAQC2, наречена haAQC2. Могат да бъдат направени проучвания за сравнение на тяхната ефикасност, остатъчна ефекторна функция, стабилност и имуногенност спрямо сродния hAQC2. Ако друго не е указано, позиционните номера на остатъци в константни области, както тук е употребено, са обозначени в съответствие с Конвенция за номериране на Европейския съюз (EU numbering convention).
Тежковерижната полипептидна последователност на haAQC2 е както следва (Плаозмид: pAND161):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYTMSWVRQA
PGKGLEWVAT
ISGGGHTYYL DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT
AVYYCTRGFG
101 DGGYFDVWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT
AALGCLVKDY
151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSWTVP
SSSLGTQTYI
201 CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS
VFLFPPKPKD
119
251 TLMISRTPEV TCWVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYQST
301 YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
351 TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG (SEQ ID N0:5)
Тежковерижната полипептидна последователност на hsAQC2 е както следва (Плазмид: pAND171):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYTMSWVRQA
PGKGLEWVAT ' 51 ISGGGHTYYL DSVKGRFTIS RDNSKNTbYL QMNSLRAEDT
AVYYCTRGFG
101 DGGYFDVWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT
AALGCLVKDY
151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSWTVP
SSSLGTQTYI
201 CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS
VFLFPPKPKD
251 TLMISRTPEV TCWVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT
KPREEQYNST
301 YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA
KGQPREPQVY
351 TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN
NYKTTPPVLD
401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG (SEQ ID N0:6)
120
Пример 24
Този пример описва метод за определяне кристалната структура на комплекса от плъши/човешки химерен а1-1 домен на α1β1 интегрин и hAQC2 Fab фрагмента.
Получаване на белтъчния комплекс hAQC2 Fab фрагментът е получен от hAQC2 антитяло, използвайки вариант на процедурата на IMMUNOPURE® Fab preparation kit (Cat# 44885, Pierce, Rockford, IL). Интактното hAQC2 антитяло е концентрирано до 12 mg/ml в буфер съдържащ 20mM фосфат, 10 mM EDTA и 25 mM цистеин (pH 7.0). Добавен е © имобилизиран папаин при съотношение ензим към субстрат 1:50 и е оставен за поява на хидролиза за една нощ на 37°С. Имобилизираният папаин е отстранен и суровият хидролизат е диализиран срещу 20 тМ натриев ацетат буфер (pH 4.5). Fab фрагментът е отделен от остатъчното интактно антитяло, димерен Fab фрагмент и Fc фрагмент, чрез катийнообменна хроматография с S-колона (Poros HS/M, PERSEPTIVE Biosystems #РО42М26) с незначителен солеви градиент. След това Fab фрагментът е обменен в 0.1 М Hepes буфер (pH 8.0).
Химерният а1-1 домен, използван в настоящето изобретение е плъши/човешки химерен I домен конструкт (мутантен ® RAH), съдържащ остатъци Thr145-Phe336 на плъшата а1 интегрин верига, където остатъци Gly217, Arg218, Gln219 и Leu222 (кристално номериране) са заменени с еквивалентни човешки остатъци Val, Gin, Arg и Arg съответно, за възстановяване на антитяло свързване. Аминокиселинните последователности на химерен RAH, плъши и човешки а1-1 домени, са представени подолу в SEQ ID Nos:59, 60 и 61, съответно. Рекомбинантен а1-1 домен е експресиран в E.coli като GST-слет белтък. RAH а1-1 доменът е разцепен с тромбин и пречистен от Pichia pastoris клон
121 както е описано по-рано (Gotwals et al., 1999, Biochemistry 38:82808288).
145 TQLDIV
151 IVLDGSNSIY PWESVIAFLN DLLKRMDIGP KQTQVGIVQY
191 GENVTHEFNL NKYSSTEEVL VAANKIVQRG GRQTMTALGI
231 DTARKEAFTE ARGARRGVKK VMVIVTDGES HDNYRLKQVI
271 QDCEDENIQR FSIAILGHYN RGNLSTEKFV EEIKSIASEP
311 TEKHFFNVSD ELALVTIVKA LGERIF (SEQ Ш N0:59)
145 TQLDIV
151 IVLDGSNSIY PWESVIAFLN DLLKRMDIGP KQTQVGIVQY
191 GENVTHEFNL NKYSSTEEVL VAANKIGRQG GLQTMTALGI
231 DTARKEAFTE ARGARRGVKK VMVIVTDGES HDNYRLKQVI
271 QDCEDENIQR FSIAILGHYN RGNLSTEKFV EEIKSIASEP
311 TEKHFFNVSD ELALVTIVKA LGERIF (SEQ ID N0:60)
145 TQLDIV
151 IVLDGSNSIY PWDSVTAFLN DLLKRMDIGP KQTQVGIVQY
191 GENVTHEFNL NKYSSTEEVL VAAKKIVQRG GRQTMTALGI
231 DTARKEAFTE ARGARRGVKK VMVIVTDGES HDNHRLKKVI
271 QDCEDENIQR FSIAILGSYN RGNLSTEKFV EEIKSIASEP
311 TEKHFFNVSD EIALVTIVKT LGERIF (SEQ ID N0:61) hAQC2 Fab фрагментът е смесен c излишък от химерен α1-Ι домен и инкубиран на 37°С за 15 минути. Наситените a1/Fab комплекси са отделени от несвързания в комплекс а1-1 домен с гел проникваща хроматография, като е използвана S200 Sephacryl
122 колона (Pharmacia, Gibco). След това комплексът е концентриран до 11mg/ml в 20тМ Трие (pH 7.4), 150 mM NaCI, 1 mM MnCI2, 5 тМ β-меркаптоетанол.
Получаване на кристали
Условия за кристализация са намерени като е използван CRYSTAL SCREEN™ KITs от HAMPTON Research (Laguna Niguel, СА). Кристали на комплекса, описан по-горе, са нараствали на 20°С с парна дифузия, като е използвано равно количество разтвор на белтъчен комплекс и 20-30% PEG 1500 резервоарен разтвор. Обикновено, 2μΙ белтъчен комплекс е добавян към 2 μΙ от ямков © разтвор, за получаване на капки от 4 μΙ. Кристалите нарастват за два до седем дни като хексагонапни пръчици с размери 0.8 х 0.05 х 0.05 mm3. Наличието на а1-1 домена и hAQC2 Fab фрагмент е потвърдено с SDS-PAGE анализ на разтворени кристали. За да се редуцира присъщото от радиация увреждане по време на събиране на данни, данни от рентгенова дифракция са събирани при приблизително 100 К. За изготвяне на кристалите за събиране на данни при тази ниска температура, кристали постепенно са уравновесявани в криопротекгиращ разтвор, съдържащ 25% PEG400 и 30% PEG 1500, и мигновено са охлаждани в течен азот.
Структурно определяне ® Данни от рентгенова дифракция до 2.8 А разделителна способност, са събрани от единичен кристал при около 100 К, използвайки едно ADSC Quantum 4 charged-coupled device detector (детекторно устройство) при линия на лъча Х4А на Brookhaven National Laboratory (BNL) National Synchrotron Light Source (NSLS). Данните са обработени със софтуерни програми DENZO и SCALEPACK (Otwinowski & Minor, 1997, Methods in Enzymol. 276:307326). Кристали принадлежат към пространствената група Ρ6Ί или нейния енантиоморф Р65, с размери на единична клетка а=Ь=255.09
123
A, c=38.64 А. Комплектът данни беше 96.6% пълен и има R-сливане от 8.3%. Matthews коефициентът (Matthews, 1968, J.Mol.Biol.33:491497) беше 2.59 А 3 Da1 със съдържание на разтворител 52.1%, което показва, че има два комплекса в асиметричната единица. Двата комплекса в асиметричната единица са свързани с некристалографска 2-кратна симетрия. Данни от статистиката са представени в Таблица 4.
Търсения на молекулни замени са правени с програмата AMoRe (Navaza, 1994, Acta Cryst. A50:157-163) от CCP4 програмния пакет (Collaborative Computational Project No.4. The CCP4 Suite: programs for protein crystalography, 1994, Acta Cryst. D50-760-763) и манипулации на молекулни графики са правени с програмата QUANTA. Единичен α1 -I домен от структурата на плъшия α1 -I домен на α1β1 интегрин (Protein Data Bank (PDB) ключов номер 1ck4; Nolte et al., 1999, FEBS Lett. 452:379-385), е използван като модел или проба за ротация и транслационно търсене. Търсенето на транслационна функция показва, че 1-ият и 9-ия най-високи пикове на ротационната функция съответстват на точните разтвори за двата а1-1 домени в асиметричната единица (корелационен коефициент (сс)=21.1%, R=53.1% ) и че пространствената група беше Р65. Впоследствие, е проведено изследване за hAQC2 Fab фрагменти, като са запазвани I домен разтворите фиксирани и използвайки модел на Fv домена на hAQC2 Fab като търсена проба. Намерен е бистър разтвор за един от двата Fv домена (сс=22.1%, R=52.6%), но вторият Fv не можеше да бъде локализиран. Позицията на втория Fv беше изведена, използвайки некристалографска 2-кратна симетрия. Усъвършенстване на неподвижното тяло на двата I домена и два Fv домена, редуцира Rфактора до 43.6% (R-CBo6ofleH= 42.7%). Една 2Fo-Fc карта на електронна плътност, показва ясно електронна плътност за
124 константния домен (Fconst) на първия Fab фрагмент, но не плътност за Fconst домена на втория Fab фрагмент. Модел на Fconst домена на първия Fab беше мануално нагласен в наблюдаваната електронна плътност. Последователно усъвършенстване на твърдото тяло със софтуерна програма CNX (Accelrys Inc., San Diego, СА ®2000; Brunger, 1998, Acta Cryst. D54:905-921), използвайки данни в 500-2.8 А разделителния диапазон, оптимизира позицията на всички домени, редуцирайки Rфактора до 39.7% (R-свободен = 38.9%).
Всички последващи етапи на усъвършенстване са © проведени с CNX програмата. За редуциране моделното отклонение, използвани са частични модели за 2Fo-Fc изчисление на карта и моделно усъвършенстване. Изходният частичен модел е подложен на симулирано асоцииране и усъвършенстване на групов В-фактор с не-кристалографски ограничения на симетрията. Rработещият и R-свободният фактори спадат до 28.3% и 32.9%, съответно. Няколко цикли състоящи се от повтарящо се моделно изграждане, следват максимално подобие на позиционно усъвършенстване и В-фактор усъвършенстване. Приети са само моделни нагласяния, които имат за резултат намаление на Rсвободния фактор. След изграждане на пълния модел е приложена © корекция на общия разтворител. R-работният и R-свободният фактори на крайния модел са 21.3% и 27.2%, съответно за данните (F>2n) в 500-2.8 А разделителния диапазон.
Окончателната карта на 2Fo-Fc електронна плътност е с добро качество за голямата част от комплекса, с изключение на аминокиселинни остатъци 288-295 на едни I домен фрагмент (молекула А във Фиг. 19), които са асоциирани със слаба електронна плътност и не са включени в модела. В допълнение, целият константен домен на един Fab фрагмент няма видима електронна
125 плътност, което показва, че той е разбъркан. Това изглежда, че е последствие от отсъствието на кристални контакти за константния домен на Fab фрагмента, дължащо се на неговата позиция в голям канал на разтворителя. Този домен също не беше включен в окончателния модел, който се състои от 1030 аминокиселинни остатъци, съставляващи 6 полипептидни вериги и 2 манганови йона. Позиционното отклонение r.m.s. между еквивалентни остатъци от двата комплекса в асиметричната единица е малко (0.37 А за 1660 еквивалентни атоми на главната верига). Стереохимични статистики са изчислени със софтуерни програми PROCHECK (Laskowski et al., 1993, J.Appl.Cryst. 26:283-291; Morris et al., 1992, Proteins 12:345-364) и CNX. Водородни връзки (<3.6 А) са открити c програма CONTACT (Tadeusz Skarzynski, Imperial College, London, 1.12.88; Collaborative Computational Project No.4. The CCP4 Suite: programs for protein crystalography. 1994, Acta Cryst. D50, 760-763). Всички не-глицинови остатъци (c изключение на Thr50 на L веригата, което ще бъде обсъдено по-долу), са в позволените области на Ramachandran диаграмата и 86% от остатъците са в най-благоприятните области. Средният В-фактор на атомите на главната верига е 38.5 А2. Данни от кристалографски анализ са в Таблица 4.
126
Таблица 4: Обобщение на статистически данни и кристалографски анализ
Колекция от данни
Клетъчни размери а, Ь, с (А) Пространствена група Разделителна способност (А) Уникални отражения Пълнота (%)
Средно l/s
Рсливане*(%)
255.09, 255.09, 38.64
Р65
500-2.8(2.9-2.8)1
35275
96.6 (87.7)1
11.92 (2.29)1
8.3 (30.9)1
Модел
Брой на не-Н атоми
Брой на белтъчни остатъци
Съдържания на асиметрична единица
Среден В-факгор (А2)
7950
1030
I домени, 1 Fab фрагмент
Fv фрагмент
38.5
Усъвършенстване
Използван диапазон на разделителна способност (F>2a)
R-факгор (R-работен) (%)
Р-свободен11(%)
500-2.8
21.3
27.2
Стереохимия
RMS отклонения
Дължини на връзките (А) Ъгли (*)
0.007
1.43 ‘Исливане = ΣήΣ, |lhi-lh|/ ΣμΙγη
Стойности за най-високата разделителна скица, дадена в скоби. Ц8% от данните са отделени за изчислението на R-свободен фактор.
127
Пример 25
Този пример описва кристалната структура на комплекса от плъши/човешки химерен а1-1 домен на α1β1 интегрин и hAQC2 Fab фрагмента.
Архитектура на кристална структура
Кристалната структура на комплекса от плъши/човешки химерен а1-1домен на α1β1 интегрин и hAQC2 Fab фрагмент има удължена форма (Фиг.20). Размерите на комплекса са 100А х 50 А х35 А.
Fab фрагментът проявява типичното имуноглобулиново нагъване. Леката верига и тежките вериги на Fab фрагмента, всяка образува два широки листа от антипаралелни β-вериги, които се пакетират плътно заедно, за образуване един скелет за бримки на определящата комплементарността област (CDR), които се източват от пакетираните листа. Леката верига и тежката верига съдържат три CDR бримки. Бримките на леката верига са наречени L1, L2 и L3, докато тежковерижните бримки са определени като Н1, Н2 и НЗ. Бримките на определящата комплементарността област съответстват на приетата структура 1 за лека верига L1, L2 и 3 бримки и за тежковерижни Н1 и Н2 бримки (Chothia et al., 1989, Nature 342:877-883). Тежковерижната НЗ бримка има опъната βподобна на фиба конформация, която е стабилизирана чрез вътрешни водородни връзки, както и два ароматни остатъци (Туг104 и Phe105), които са пакетирани срещу леката верига. Остатък Thr50 на L2 приема дихедрални ъгли на главната верига, които попадат в не-разрешените зони на Ramachandran диаграмата. Същото наблюдение за съответния остатък е направено за други антитела (Muller et al., 1998, Structure 6, pp. 1153-11567), което показва, че това са естествени характеристики на L2 бримки.
128
Доменът α1-Ι в настоящето изобретение има структура много сходна на некомплексирания а1-1 домен (PBD ключов номер 1ck4; Nolte et al., 1999, FEBS Lett. 452:379-385; PBD ключов код 1qc5; Rich et al., 1999, J.Biol.Chem., 274:24906-24913). I домен структурата проявява едно “динуклеотидно свързване” или “Rossman “ нагъване (Rao & Rossman, 1973, J. Mol.Biol. 76:241-256), при което един централен лист от 5 паралелни β-вериги и една малка антипаралелна верига е заобиколено от двете страни общо от седем α-спирали. Шестте β-вериги на структурата в това изобретение ще бъдат обозначени като βΑ, βΒ, βθ, βΕ и βΡ и С седемте α-спирали са наречени α1, α1, α3, а4, а5, аб и а7.
Три характерни структурни особености съществуват за I домен. Първата характерна особеност е наличието на една вмъкната чрез инсерция малка спирала в βΕ-аб бримката, наречена С-спиралата. Голямата част на С спиралната бримка на молекула 0 (Фиг.19) в настоящето изобретение, е асоциирана със слаба електронна плътност, което насочва за безпорядък. Това изглежда е последствие от липсата на кристални контакти или контакти с Fab, което би стабилизирало бримката. Обаче, същата бримка в молекула В (Фиг. 19) на настоящето изобретение има добре определена електронна плътност и е включена в модела. Втората ® характерна особеност на а1-1 домените е MIDAS или Метал-ЙонЗависимо-Адхезионно-Място, където метални йони и лиганди са включени да се свързват с I домена. Пет ключови остатъци, които формират част от MIDAS са обозначени като “DxSxS-T-D” мотив. Тези остатъци, които са напълно консервирани между I домени, свързват координационно металния йон (Gotwals et al., 1999, Biochemistry 38:8280-8288). Кристалите в настоящето изобретение са нараствали в присъствието на манган и MIDAS мястото на I домена в тази структура е наблюдавано, че съдържа Мп2+ метален
129 йон. Йонът е директно свързан с координационна връзка от страничните вериги на остатъци Ser156, Ser158 и Thr224. 2Fo-Fc картата на електронна плътност не показва данни, че MIDAS остатъците Asp154 и Asp257 правят водно медиирано индиректно свързване на металния йон с координационна връзка (Фиг.20). Обаче, видимото отсъствие на водни молекули може да бъде последствие от ограничена разделителна способност (2.8 А) на картата на електронна плътност. Третата особеност на I домените е, че всички определени структури на I домени принадлежат на една от две конформации наречени “отворена” и “затворена”. Разликите ф между отворената и затворената конформация включва различен начин на свързване на метален йон с координационна връзка и едно значително (около 10 А) позиционно отместване на С-крайната спирала на I домена. I Доменът в комплекса на настоящето изобретение е в затворената конформация.
В структурата на комплекса в настоящето изобретение, Fab фрагментът се свързва с неговия епитоп на предната горна повърхност на I домена с един отпечатък на стъпката 35 А на 30 А. Общата скрита област от повърхността в антитяло-антиген интерфейса е 1534 А2, което е типично за други антитяло-антиген комплекси (Davies et al., 1996, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:7-12; Jones β & Thornton, 1996, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:13-20). Повърхността e 25% хидрофобна и 75% хидрофилна по характер. Тежката верига допринася 65% от скритата област на повърхността за комплекса, докато оставащите 35% са за сметка на тежката верига. Антитяло епитопът се състои от остатъци локализирани в четири бримки на I домена (Emsley et al., 2000, Cell 101:47-56). Три от бримките от MIDAS мястото: бримка 1 (βΑ-α1), която съдържа консервираната DXSXS последователност, бримка 2 (α3-α4), която съдържа MIDAS Thr224 и бримка 3 (βϋ-α5), която съдържа MIDAS остатък Asp257.
130
Четвъртата бримка е С-спиралната бримка и е включена само в минорни контакти.
Централната особеност на антиген-антитяло взаимодействието е свързването с координационна връзка на металния йон на MIDAS мястото чрез Asp101 от CDR НЗ на антитялото (Фиг.20). Разстоянието между йона и Οδ1 на Asp101 е 2.4 А. В допълнение, Οδ2 атомът на Asp101 взаимодейства с His261 на I домена. Интересно е, че CDR НЗ съдържа няколко глицинови остатъци, съседни на Asp101 (последователност GFGDGGY) (SEQ ID N0:62), вероятно да позволяват достатъчна подвижност към CDR бримката, за да разрешава точно свързване на металния йон с координационна връзка. CDR НЗ последователността е по същество непроменяема в моноклонални антитела, които са предизвикани срещу същия антиген и открити, че принадлежат на същия клас. Повечето от антитяло остатъците, които са включени в антитялоантиген контакти, са локализирани в L3, Н1, Н2 и НЗ CDR бримки. Няколко остатъци от L1 (Asn30) и L2 (Туг48) бримките, изглежда че формират минорни Van Der Waals контакти. L3 преди всичко допринася за контакти чрез два големи хидрофобни остатъци, Тгр90 и Тгр 95. В допълнение, Asn93 от L3 образува водородни връзки с Gln223 на I домена. Страничните вериги на His56 и Туг58 от Н2 бримката образуват водородни връзки с атомите на главната верига на бримка 2 на I домена. Агд31 на Н1 е в контакт с Агд 291 на бримка 4 на I домена. Агд222 от бримка 2 на I домена е включен в сандвич между няколко антитяло остатъци, включително Туг58, Тгр95 и Asn93. Това е единственият остатък извън четирите мутирани в RAH I домена, който участва в контакти с Fab. Следователно е възможно да бъде единственият остатък, отговорен за възстановяване свързването на антитялото след мутагенезата.
131
Сравнение кристалната структура на комплекса на плъши/човешки химерен а1-1 домен и hAQC2 Fab (фрагмента с други структури на I домена
Химерният RAH а1-1 домен има четири разлики в последователности с плъши а1-1 домена (плъши остатъци: 217G, 218R, 219Q и 222L), осем разлики на последователност с човешкия сс1 -I домен (човешки остатъци: 163D, 166Т, 214К, 264Н, 268К, 288S, 322Ι и 380Т) и десет разлики на последователността с клона, използван в проучванията на кристалната структура на човешки α1 -I домен (остатъци на клона: 163D, 166Т, 174Е, 214К, 230Ι, 264Н, 268К, 288S, 322Ι и 380Т). В кристалната структура на не-лигандния плъши α1β1 α1-Ι домен (PBD ключов код 1 ck4; Nolte et al., 1999, FEBS Lett. 452:379-385), α1-Ι доменът сдържа не свързани метални йони и приема “затворената” конформация. В кристалната структура на нелигандния човешки а1-1 домен (ключов код 1qc5; Rich et al., 1999, J.Biol.Chem. 274:24906-24913), α1-Ι доменът съдържа свързани Mg2+ и подобно приема затворена конформация. Суперналагане на тези две структури с комплексирания химерен α1 -I домен показва, че има само минорни конформационни промени върху hAQC2 антитяло свързване. Позиционното отклонение r.m.s. между плъшия и химерен α1 -I домен е 1.04 А за всички 768 атоми на главната верига. Позиционното отклонение r.m.s. между човешкия и химерния а1-1 домен е 0.69 А за всичките 764 атоми на главната верига. Найголемите разлики (човешки и химерен а1-1 домен чифт) са наблюдавани в бримка 1 (r.m.s. отклонения 1.24 А за атоми на остатъци на главната верига 154-161) и бримката 4 (С спирална бримка) на а1-1 домена (r.m.s. отклонения 1.55 А за атоми на остатъци на главната верига 288-296). Обаче, тези разлики могат по-точно да бъдат описани като премествания на елементи на цялата вторична структура, а не конформационни промени на
132 комплекса. Позиционното отклонение r.m.s. между човешкия и химерния а1-1 домен за атоми на главната верига на аминокиселинни остатъци Glu192, Gln218, Arg219, Gly220 и Gly221 (кристално номериране) е 0.33 А. Позиционното отклонение r.m.s. между плъшия и химерния аа1-1 домен за атоми на главната верига на аминокиселинните остатъци Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 и Leu294 (кристално номериране) е 0.97 A.
I Доменът подържа “затворена” конформация, която е наблюдавана само за не-лигандни I домени, кристализирали в отсъствието на лиганди или псевдо-лиганди, свързани с MIDAS мястото. Позиционното отклонение r.m.s. на С терминалните спирали на човешки и химерен I домени (изчислено за атомите на главната верига на остатъци 321-335) е 0.64 А. Симулирано асоцииране с пропускане на карта, изчислено за крайния усъвършенстван модел, ясно потвърждава, че позицията на С-терминалната спирала и съседни структурни елементи, са в съответствие със затворената конформация.
За да се изследват ефектите на лигандно свързване върху начините на свързване метални йони с координационна връзка, структурата на настоящето изобретение е супернасложена със структурите на не-лигандно свързан α2-Ι домен (PDB ключов код 1аох; Emsley et al., 1997, J.Biol.Chem. 272:28512-28517) и α2-Ι доменът, комплексно свързан с колагенов пептид (PDB ключов код 1dzi; Emsley et al., 2000, Cell, 101:47-56). Свързването c координационна връзка на металния йон чрез Asp101 от антитялото, е забележително сходно със свързването с координационна връзка на металния йон на α2-Ι домена чрез глутаминова киселина от колагенов пептид. Друга особеност, която е консервирана, е
133 едновременното взаимодействие на киселинната група с His261 (His258 в α2-Ι домена). Всички MIDAS остатъци на I домен-Fab комплекса, с изключение на Ser 156 и Ser158 приемат конформации много сходни с тези наблюдавани в не-лигандно свързания I домен. За разлика от това, страничните вериги на Ser 156 и Ser158, както и метала, приемат конформации сходни с тези на лигандно свързания I домен. Ясно е, че свързването с координационна връзка на металния йон от Asp101, не разрешава йонът да запази позиционното и координационното разстояния, които се наблюдават при не свързаното с лиганд състояние. Така, металният йон не е директно свързан с координационна връзка от Asp257, един факт, който позволява на йона да запази висока електрофилност.
Биологични участия
В настоящето изобретение, няма пряко свързване с координационна връзка на метала от Asp257, което може да позволява високо афинитетно свързване чрез намаляване енергетичната бариера между една затворена (не свързана с лиганд) и отворена (свързана с лиганд) конформация. Обаче, свързването с коопдинационна връзка на метала от аспаргинова киселина на антитялото, не е достатъчно да индуцира отворената конформация за I домена в настоящето изобретение. Структурата на I домен-Fab комплекса показва, че е възможно да има силно свързване с I домена, който приема затворена конформация, и че свързването с координационна връзка на метала чрез един киселинен остатък от лиганда, може да бъде необходимо, но не достатъчно да индуцира една конформационна промяна на отвореното състояние. Свързване на антитялото се очаква да стабилизира ниско афинитетното състояние на интегрина и да предотврати сигнализирането отвън навътре, което би придружавало свързването на интегрин с колаген.
134
Въпреки че изобретението е описано с известни подробности, с илюстрации и примери за целите на яснота и разбиране, за специалиста в тази област ще бъде очевидно, че могат да се прилагат известни промени и модификации. Следователно, описанието и примерите не трябва да се разглеждат като ограничаващи обхвата на изобретението.

Claims (39)

  1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ
    1. Анти-VLA-I антитяло, чиито лековерижни определящи комплементарността области са определени от аминокиселинни остатъци 24 до 33, 49 до 55 и 88 до 96 на SEQ ID N0:1, и чиито тежковерижни определящи комплементарността области са определени от аминокиселинни остатъци 31 до 35, 50 до 65 и 98 до 107 на SEQ ID N0:2.
  2. 2. Антитяло съгласно претенция 1, където антитялото включва една лековерижна последователност на променлив домен от SEQ ID N0:1 и една тежковерижна последователност на променлив домен от SEQ ID N0:2.
  3. 3. Антитяло съгласно претенция 1, където антитялото включва същите тежко и лековерижни полипептидни последователности както антитяло, получено с хибридома mAQC2 (АТТС ключов номер РТА3273).
  4. 4. Антитяло съгласно претенция 1, където антитялото е хуманизирано антитяло.
  5. 5. Антитяло съгласно претенция 4, където антитялото включва най-малко един от следните остатъци в неговата лека верига: Q1, L4, Р46, W47 и Y71; или най-малко един от следните остатъци в неговата тежка верига: D1, V12, S28, F29, А49, Т93, R94 (Kabat конвенция за номериране).
  6. 6. Антитяло съгласно претенция 4, където антитялото включва една лековерижна последователност на променливия домен, определена от аминокиселинни остатъци 1 до 106 на SEQ ID
    136
    N0:3 и една тежковерижна последователност на променливия домен, определена от аминокиселинни остатъци 1 до 118 на SEQ ID N0:4.
  7. 7. Антитяло съгласно претенция 4, където антитялото включва същата тежко и лековерижна полипептидии последователности, както антитяло получено с клетъчна линия hAQC2 (АТСС ключов номер РТА3275).
  8. 8. Антитяло съгласно претенция 4, където тежката верига е © мутирана при един или повече аминокиселинни остатъци, подбрани от групата състояща се от остатъци 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 и 322 (EU система за номериране), при което се предизвиква промяна в една ефекторна функция, като се запазва свързването с VLA-1, в сравнение с немодифицирано антитяло.
  9. 9. Антитяло съгласно претенция 8, където антитялото съдържа мутациите L234A и L235A (EU система за номериране) в неговата тежка верига, в сравнение с немодифицирано _ антитяло.
    ©
  10. 10. Антитяло съгласно претенция 4, където антитялото включва същите тежка и лека полипептидии последователности, както антитяло получено с клетъчна линия hsAQC2 (АТСС ключов номер РТА3356).
  11. 11. Антитяло съгласно претенция 4, където антитялото е мутирано при аминокиселинен остатък, който е гликолизиращо място, при което се елиминира гликолизиращото място.
    137
  12. 12. Антитяло съгласно претенция 11, където антитялото включва мутацията N297Q в неговата тежка верига (EU система за номериране).
  13. 13. Антитяло съгласно претенция 4, където антитялото включва същите тежко и лековерижна полипептидни последователности, както антитяло получено с клетъчна линия haAQC2 (ATCC ключов номер РТА3274).
  14. 14. Състав съдържащ антитяло, съгласно всяка една от претенции 4-13 и фармацевтично приемлив носител.
  15. 15. Изолирана нуклеинова киселина, последователност за SEQ ID N0:1.
  16. 16. Изолирана нуклеинова киселина, последователност за SEQ ID N0:2.
    съдържаща кодираща съдържаща кодираща
  17. 17. Изолирана нуклеинова киселина, съдържаща кодираща последователност за леката верига на антитяло, получено с хибридома mAQC2 (ATCC ключов номер РТА3273).
  18. 18. Изолирана нуклеинова киселина, съдържаща кодираща последователност за тежката верига на антитяло, получено с хибридома mAQC2 (ATCC ключов номер РТА3273).
  19. 19. Изолирана нуклеинова киселина, съдържаща кодираща последователност за леката верига на антитяло, получено с клетъчна линия hAQC2 (ATCC ключов номер РТА3275).
    138
  20. 20. Изолирана нуклеинова киселина, съдържаща кодираща последователност за тежката верига на антитяло, получено с клетъчна линия hAQC2 (АТСС ключов номер РТА3275).
  21. 21. Изолирана нуклеинова киселина, съдържаща кодираща последователност за тежката верига на антитяло, получено с клетъчна линия haAQC2 (АТСС ключов номер РТА3274).
  22. 22. Изолирана нуклеинова киселина, съдържаща кодираща последователност за тежката верига на антитяло, получено с клетъчна линия hsAQC2 (АТСС ключов номер РТА3356).
  23. 23. Изолирана нуклеинова киселина, съдържаща кодираща последователност за остатъци 1 до 106 на SEQ ID N0:3.
  24. 24. Изолирана нуклеинова киселина, съдържаща кодираща последователност за остатъци 1 до 118 на SEQ ID N0:4.
  25. 25. Използване на състав, съгласно претенция 14, като лекарствено средство за лечение на индивид с имунологично разстройство, медиирано от VLA-1
  26. 26. Метод за определяне нивото на VLA-1 в тъкан, характеризиращ се с това, че тъканта се поставя в контакт с антитялото, съгласно претенция 1 и определяне свързването на антитялото с тъканта, при което се определя нивото на VLA-1 в тъканта.
  27. 27. Клетка на хибридома mAQC2 (АТСС ключов номер РТА3273).
    139
    28. Клетка на клетъчна линия hAQC2 (ATCC ключов номер РТА3275). 29. Клетка на клетъчна РТА3274). линия haAQC2 (ATCC ключов номер 30. Клетка на клетъчна линия hsAQC2 (ATCC ключов номер
    РТА3356).
  28. 31. Компютер за получаване на три-димензионално изображение © на:
    (a) молекулен комплекс, където споменатият молекулен комплекс е определен от набор структурни координати на комплекс от един химерен I домен на α1β1 интегрин RAH и хуманизирано антитяло hAQC2, съгласно Фиг. 19; или (b) хомолог на споменатия молекулен комплекс, споменатият хомолог, притежаващ средно квадратно отклонение от атомите на главната верига на споменатите аминокиселини не повече от 0.65 А;
    където споменатият компютер включва:
    w (i) устройство за четене на данни с носител, включващо запаметен материал, кодиран с устройство за четене на данни, където споменатите данни включват поне част от структурните координати на споменатия комплекс, съгласно Фиг. 19;
    (ii) работна памет за съхранение инструкции за обработка на споменатите данни с устройство за четене на данни;
    140 (iii) централна процесираща единица, свързана със споменатата работна памет и със споменатото устройство за четене на данни с носител, за процесиране споменатото устройство за четене на данни с носител, за обработка на споменатите данни с устройство за четене в споменатите тридимензионални изображения; и (iv) дисплей свързан със споменатата централна процесираща единица, за представяне на споменатото втри-димензионално изображение.
  29. 32. Компютер за получаване три-димензионално изображение на молекула или молекулен комплекс, включващ:
    (a) първо свързващо място, определено със структурни координати на hAQC2 аминокиселини, включващо наймалко седем лековерижни остатъци Asn30, Туг48, Тгр90, Ser91, Asn93 и Тгр95, и тежковерижни остатъци Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO и Asp101, съгласно Фиг.19; или (b) хомолог на споменатата молекула или молекулен комплекс, където споменатият хомолог включва второ свързващо място, което има средно квадратно отклонение от атомите на главната верига на hAQC2 аминокиселините, не повече от 1.10 А ; и където споменатият компютер включва:
    (i) устройство за четене на данни с носител, включващо запаметен материал, кодиран с устройство за четене на данни, където споменатите данни включват структурните координати на hAQC2 аминокиселини, съдържащи най-малко седем лековерижни остатъци
    141
    Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 и Trp95 и тежковерижни остатъци Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO и Asp101, съгласно Фиг. 19; и (ii) работна памет за съхранение инструкции за обработка на споменатите данни с устройство за четене на данни;
    (iii) централна процесираща единица, свързана със споменатата работна памет и със споменатото устройство за четене на данни с носител, за процесиране на споменатото устройство за четене на данни с носител, за обработка на споменатите данни с устройство за четене, в споменатите тридимензионални изображения;
    (iv) дисплей свързан със споменатата централна процесираща единица за представяне на споменатото три-димензионално изображение.
  30. 33. Компютер за получаване три-димензионално изображение на:
    (a) първо свързващо място, определено от структурни координати на hAQC2 аминокиселини, включващо наймалко седем лековерижни остатъци Asn30, Туг48, Тгр90, Ser91, Asn93 и Тгр95 и тежковерижни остатъци Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO и Asp101 .съгласно Фиг. 19; или (b) второ свързващо място на хомолог, което има средно квадратно отклонение от атомите на главната верига на hAQC2 аминокиселините, не по-голямо от 1.10 А.
    където споменатият компютер включва:
    142 (i) устройство за четене на данни с носител, включващо запаметен материал, кодиран с устройство за четене на данни, където споменатите данни включват структурните координати на hAQC2 аминокиселини, подбрани от група съдържаща най-малко седем лековерижни остатъци Asn30, Tyr48, Тгр90, Ser91, Asn93 и Тгр95, и тежковерижни остатъци Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, Gly100 и Asp 101,съгласно Фиг. 19;
    (ii) работна памет за съхранение инструкции за обработка на споменатите данни, с устройство за четене на данни;
    (iii) централна процесираща единица, свързана със споменатата работна памет и със споменатото устройство за четене на данни с носител, за процесиране на споменатото устройство за четене на данни с носител, за обработка на споменатите данни с устройство за четене в споменатите тридимензионални изображения;
    (iv) дисплей, свързан със споменатата централна процесираща единица, за представяне на споменатото три-димензионално изображение.
  31. 34. Метод за идентифициране инхибитор на I домен от един интегрин, характеризиращ се с етапите на:
    (а) използване структурни координати на hAQC2 аминокиселини, включващи най-малко седем лековерижни остатъци Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 и Тгр95, и тежковерижни остатъци Ser30, Arg31, Тгр47, Ser52, Gly53, His56, Туг58, Phe99, GlylOO и
    143
    Asp101, съгласно Фиг. 19 или + средно квадратно отклонение от атомите на главната верига на споменатите hAQC2 аминокиселини не по-голямо от
    1.1 ОА, за създаване три-димензионална структура на свързващо място;
    (b) използване на споменатата три-димензионална структура за планиране или подбор на потенциален антагонист;
    (c) синтезиране на споменатия потенциален антагонист; и (d) поставяне в контакт на споменатия потенциален антагонист с hAQC2, за определяне способността на споменатия потенциален антагонист да взаимодейства с hAQC2, където способността на споменатия потенциален антагонист да взаимодейства с hAQC2, показва, че потенциалният антагонист е инхибитор на I домен.
  32. 35. Инхибитор на I домен на интегрин, идентифициран с метод съгласно претенция 34.
  33. 36. Компютер за получаване три-димензионално изображение на молекула или молекулен комплекс, включващ:
    (a) първо свързващо място, определено със структурни координати на I домен аминокиселинни остатъци Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 и Leu294, съгласно Фиг. 19; или (b) хомолог на споменатата молекула или молекулен комплекс, където споменатият хомолог включва второ
    144 свързващо място, което има средно квадратно отклонение от атомите на главната верига на споменатия I домен аминокиселини, не по-голямо от 0.92 А;
    кьдето споменатият компютер включва:
    (i) устройство за четене на данни с носител, включващо запаметен материал, кодиран с устройство за четене, кьдето споменатите данни включват структурните координати на I домен аминокиселинни остатъци Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, © Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 и Leu294, съгласно Фиг. 19; и (ii) работна памет за съхранение инструкции за обработка на данни с устройство за четене на данни;
    (iii) централна процесираща единица свързана със споменатата работна памет и със споменатото устройство за четене с носител, за процесиране на устройство за четене на данни с носител, за обработка на споменатите данни с устройство за четене в споменатите три-димензионални изображения; и © (iv) дисплей свързан със споменатата централно процесираща единица за представяне на споменатото три-димензионално изображение.
  34. 37. Компютер за получаване три-димензионално изображение на:
    (а) първо свързващо място, определено със структурни координати на I домен аминокиселинни остатъци Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, Glu192, Gln218, Arg219,
    145
    Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 и Leu294, съгласно Фиг. 19; или (b) второ свързващо място на хомолог, който има средно квадратно отклонение от атомите на главната верига на споменатия I домен аминокиселини не по-голямо от 0.92 А; където споменатият компютер включва:
    (i) устройство за четене с носител, включващо запаметен материал с устройство за четене на данни, където споменатите данни включват структурни координати на I домен амино остатъци Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, Glu192, Gln218, Arg219, Gly220,
    Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261,
    Asn263, Arg291 и Leu294, съгласно Фиг. 19; и (ii) работна памет за съхранение инструкции за обработка на споменатите данни с устройство за четене;
    (iii) централна процесираща единица, свързана със споменатата работна памет и със споменатото устройство за четене на данни с носител, за процесиране на споменатите данни с устройство за четене с носител, за обработка на споменатите данни с устройство за четене в споменатите тридимензионални изображения; и (iv) дисплей свързан със споменатата централна процесираща единица за представяне на споменатото три-димензионално изображение;
  35. 38. Компютер за получаване на три-димензионално изображение на молекула или молекулен комплекс, включващ:
    146 (a) първо свързващо място, определено от структурни координати на I домен аминокиселини, включващо наймалко три от остатъци Glu199, Gln218, Arg219, Gly220 и Gly221, съгласно Фиг. 19; или (b) хомолог на споменатата молекула или молекулен комплекс, където споменатият хомолог включва второ свързващо място, което има средно квадратно отклонение от атомите на главната верига на споменатия I домен аминокиселини, не по-голямо от 0.30 А;
    където споменатият компютер включва:
    (i) устройство за четене на данни с носител, включващо запаметен материал, кодиран с устройство за четене на данни, където споменатите данни включват структурните координати на I домен аминокиселини, съдържащи наймалко три от остатъци Glu192, Gln218, Arg219, Gly220 и Gly221, съгласно Фиг. 19; и (ii) работна памет за съхранение инструкции за обработка на споменатите данни с устройство за четене;
    (Ш) централна процесираща единица, свързана със споменатата работна памет и със споменатото устройство за четене на данни с носител, за процесиране на данни със споменатото устройство за четене с носител, за обработка на споменатите данни с устройство за четене в три-димензионални изображения; и (iv) дисплей свързан със споменатата централна процесираща единица за представяне на споменатото три-димензионално изображение;
  36. 39. Компютер за получаване три-димензионално изображение на:
    147 (a) първо свързващо място, определено от структурни координати на I домен аминокиселини, включващо наймалко три от остатъци Glu192, Gln218, Arg219, Gly220 и Gly221, съгласно Фиг. 19; или (b) второ свързващо място на хомолог, който има средно квадратно отклонение от атомите на главната верига на споменатите I домен аминокиселини, не по-голямо от 0.30 А;
    където споменатият компютер включва:
    (i) устройство за четене на данни с носител, включващо запаметен материал, кодиран с устройство за четене на данни, където споменатите данни включват структурните координати на I домен аминокиселини, включващи наймалко три от остатъци Glu192, Gln218, Arg219, Gly220 и Gly221, съгласно Фиг. 19; и (ii) работна памет за съхранение инструкции за обработка на споменатите данни с устройство за четене;
    (iii) централна процесираща единица, свързана със споменатата работна памет и със споменатото устройство за четене на данни с носител, за процесиране на споменатото устройство за четене на данни с носител, за обработка на споменатите данни с устройство за четене в три-димензионални изображения; и (iv) дисплей свързан със споменатата централна процесираща единица за представяне на споменатото три-димензионално изображение;
    148
  37. 40. Метод за идентифициране инхибитор на един I домен на интегрин, характеризиращ се с това, че включва етапи на:
    (a) използване структурните координати на I домен аминокиселинни остатъци Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 и Leu294, съгласно Фиг. 19, за създаване на три-димензионална структура на едно свързващо място;
    (b) използване на споменатата три-димензионална структура за планиране или подбор на потенциален антагонист;
    (c) синтезиране на споменатия потенциален антагонист; и (d) поставяне в контакт на споменатия антагонист с I домен, за определяне способността на споменатия потенциален антагонист да взаимодейства с I домен, където способността на споменатия потенциален антагонист да взаимодейства с I домена, показва, че потенциалният антагонист е инхибитор на I домена.
  38. 41. Метод за идентифициране на един I домен на интегрин, характеризиращ се с това, че включва етапите на:
    (a) използване структурните координати на най-малко три I домен аминокиселини, включващи остатъци Glu192, Gln218, Arg219, Gly220 и Gly221, съгласно Фиг.19, или + средно квадратно отклонение от атомите на главната верига на споменатия I домен аминокиселини, не по-голямо от 0.30 А, за създаване три-димензионална структура на едно свързващо място;
    (b) използване на споменатата три-димензионална структура за планиране или подбор на потенциален антагонист;
    (c) синтезиране на споменатия потенциален антагонист; и
    149 (d) поставяне в контакт на споменатия потенциален антагонист с I домен, за определяне способността на споменатия потенциален антагонист да взаимодейства с I домен на интегрин, където способността на споменатия потенциален антагонист да взаимодейства с I домен показва, че потенциалният антагонист е инхибитор на I домена.
  39. 42. Инхибитор на I домен на интегрин, идентифициран с метода съгласно всяка една от претенции 40 и 41.
BG108340A 2001-04-13 2003-11-10 Антитела срещу vla-1 BG66334B1 (bg)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US28379401P 2001-04-13 2001-04-13
US30368901P 2001-07-06 2001-07-06
PCT/US2002/011521 WO2002083854A2 (en) 2001-04-13 2002-04-12 Antibodies to vla-1

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG108340A true BG108340A (bg) 2004-10-29
BG66334B1 BG66334B1 (bg) 2013-06-28

Family

ID=26962254

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG108340A BG66334B1 (bg) 2001-04-13 2003-11-10 Антитела срещу vla-1

Country Status (29)

Country Link
US (7) US7358054B2 (bg)
EP (1) EP1423431B1 (bg)
JP (2) JP4303475B2 (bg)
KR (1) KR100927670B1 (bg)
CN (1) CN1561345B (bg)
AR (1) AR036330A1 (bg)
AT (1) ATE471344T1 (bg)
AU (1) AU2002258778C1 (bg)
BG (1) BG66334B1 (bg)
BR (1) BRPI0209792B8 (bg)
CA (1) CA2443903C (bg)
CZ (1) CZ303450B6 (bg)
DE (1) DE60236735D1 (bg)
EA (1) EA006705B1 (bg)
EE (1) EE200300509A (bg)
ES (1) ES2347532T3 (bg)
GE (1) GEP20074252B (bg)
HU (1) HUP0402250A3 (bg)
IL (3) IL158376A0 (bg)
IS (1) IS6982A (bg)
MX (1) MXPA03009390A (bg)
MY (1) MY138286A (bg)
NO (1) NO20034554L (bg)
NZ (1) NZ529494A (bg)
PL (1) PL367324A1 (bg)
SK (1) SK288124B6 (bg)
UA (1) UA83791C2 (bg)
WO (1) WO2002083854A2 (bg)
YU (1) YU80903A (bg)

Families Citing this family (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
TR200103432T2 (tr) * 1999-06-01 2002-10-21 Biogen, Inc. Engelleyici monoklonal VLA-1 antikoru ve enflamasyonlu hastalıkların tedavisinde kullanımı.
EA006705B1 (ru) 2001-04-13 2006-02-24 Байоджен Айдек Ма Инк. Антитела против vla-1
NZ535425A (en) 2002-03-13 2008-05-30 Biogen Idec Inc Anti-alphavbeta6 antibodies
EP1715052A4 (en) * 2004-01-29 2007-10-03 Nat Inst Of Advanced Ind Scien COMPOSITION AND METHOD FOR INCREASING GENTRANSFER EFFICIENCY
WO2006106905A1 (ja) 2005-03-31 2006-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 会合制御によるポリペプチド製造方法
WO2006124269A2 (en) * 2005-05-16 2006-11-23 Amgen Fremont Inc. Human monoclonal antibodies that bind to very late antigen-1 for the treatment of inflammation and other disorders
WO2006133286A2 (en) * 2005-06-07 2006-12-14 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Treatment of tnf antagonist-resistant inflammatory disorders and related methods
CN104072614B (zh) 2005-07-08 2017-04-26 生物基因Ma公司 抗-αvβ6 抗体及其用途
US11046784B2 (en) * 2006-03-31 2021-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
EP4218801A3 (en) * 2006-03-31 2023-08-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody modification method for purifying bispecific antibody
DK2034830T3 (da) * 2006-05-25 2014-10-27 Biogen Idec Inc Anti-vla-1-antistof til behandling af slagtilfælde
AU2013204572B2 (en) * 2006-05-25 2015-06-18 Biogen Ma Inc. Methods of Treating Stroke
AU2007272995B2 (en) 2006-07-10 2013-02-07 Biogen Idec Ma Inc. Compositions and methods for inhibiting growth of smad4-deficient cancers
EP1878747A1 (en) 2006-07-11 2008-01-16 greenovation Biotech GmbH Glyco-engineered antibodies
EP2031064A1 (de) * 2007-08-29 2009-03-04 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG Verfahren zur Steigerung von Proteintitern
SI2202245T1 (sl) 2007-09-26 2016-10-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Postopek modificiranja izoelektrične točke protitelesa preko aminokislinske substitucije v CDR
ES2687808T3 (es) * 2007-09-26 2018-10-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Región constante de anticuerpo modificado
KR101643005B1 (ko) 2007-12-05 2016-07-28 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항ｎｒ１０ 항체 및 그의 이용
PL2275443T3 (pl) * 2008-04-11 2016-05-31 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Cząsteczka wiążąca antygen zdolna do wiązania dwóch lub więcej cząsteczek antygenu w sposób powtarzalny
TWI440469B (zh) * 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
AU2009313958B2 (en) * 2008-11-13 2015-09-10 Femta Pharmaceuticals, Inc. Humanized anti-IL-6 antibodies
TWI544077B (zh) 2009-03-19 2016-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibody constant region change body
JP5717624B2 (ja) 2009-03-19 2015-05-13 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
CN102459344A (zh) 2009-05-15 2012-05-16 中外制药株式会社 抗axl抗体
EP2481752B1 (en) 2009-09-24 2016-11-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
BR112012007523A2 (pt) * 2009-10-23 2017-06-20 Amgen British Columbia moléculas de anticorpo anti-gcc e composições e métodos relacionados
WO2011108714A1 (ja) 2010-03-04 2011-09-09 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
KR101398363B1 (ko) 2010-11-17 2014-05-22 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 혈액응고 제viii 인자의 기능을 대체하는 기능을 갖는 다중특이성 항원 결합 분자
MX365235B (es) 2010-11-30 2019-05-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molécula de unión a antígeno capaz de unir repetidamente a la pluralidad de moléculas de antígeno.
WO2012106497A2 (en) * 2011-02-03 2012-08-09 Santarus, Inc. Selection and treatment of subjects
SG192673A1 (en) 2011-02-10 2013-09-30 Roche Glycart Ag Mutant interleukin-2 polypeptides
EP2679681B2 (en) 2011-02-25 2023-11-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha FcgammaRIIB-specific FC antibody
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
US20150050269A1 (en) 2011-09-30 2015-02-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
TW201817745A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
MX370199B (es) * 2012-02-16 2019-12-05 Santarus Inc Composiciones farmaceuticas de anticuerpo anti-antigeno muy tardio (cd49a).
MA37569B1 (fr) 2012-04-27 2020-08-31 Millennium Pharm Inc Molécules d'anticorps anti-gcc et leur utilisation en vue de tester la sensibilité à une thérapie ciblée sur la gcc
PT3489254T (pt) 2012-04-30 2022-12-30 Biocon Ltd Proteínas de fusão direcionadas/imunomoduladoras e seus métodos de fabrico
AR092027A1 (es) 2012-07-13 2015-03-18 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos anti-vegf/anti-ang-2 y su utilizacion en el tratamiento de enfermedades vasculares oculares
RU2662991C2 (ru) * 2013-03-12 2018-07-31 Биокон Лтд. Слитые иммуномодулирующие белки и способы их получения
WO2014144466A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Biogen Idec Ma Inc. Anti-alpha v beta 6 antibodies and uses thereof
WO2014143739A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Biogen Idec Ma Inc. Anti-alpha v beta 6 antibodies and uses thereof
EP3050896B1 (en) 2013-09-27 2021-07-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide heteromultimer
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
EA201791366A1 (ru) 2014-12-19 2018-02-28 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антитела к c5 и способы их применения
KR102650420B1 (ko) 2014-12-19 2024-03-21 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-마이오스타틴 항체, 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩타이드, 및 사용 방법
US9969800B2 (en) 2015-02-05 2018-05-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha IL-8 antibodies
CA2972393A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Composition for treating il-6-related diseases
US11142587B2 (en) 2015-04-01 2021-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide hetero-oligomer
US11359009B2 (en) 2015-12-25 2022-06-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
MX2018007781A (es) 2015-12-28 2018-09-05 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Metodo para promover la eficiencia de purificacion del polipeptido que contiene la region de fragmento cristalizable (fc).
KR20180116215A (ko) 2016-03-14 2018-10-24 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 암의 치료에 이용하기 위한 세포상해 유도 치료제
EP3494991A4 (en) 2016-08-05 2020-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING DISEASES RELATING TO IL-8
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
US11851486B2 (en) 2017-05-02 2023-12-26 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils
US11312775B2 (en) * 2017-07-20 2022-04-26 University Of Virginia Patent Foundation Methods for treatment or prevention of a neurological immunity disorder
TWI827585B (zh) 2018-03-15 2024-01-01 日商中外製藥股份有限公司 對茲卡病毒具有交叉反應性的抗登革病毒抗體及其使用方法
EP3911363A1 (en) * 2019-01-14 2021-11-24 University of Virginia Patent Foundation Use of integrin inhibitors for treatment or prevention of a neurological immunity disorder and/or nervous system injury
GB2595299B (en) 2020-05-21 2022-08-03 Mabsolve Ltd Modified immunoglobulin FC regions

Family Cites Families (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2, Inc., Danville, Calif. Geänderte antikörper.
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
WO1991010737A1 (en) 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5391481A (en) * 1990-08-31 1995-02-21 The Trustees Of Columbia University Antibody which is directed against and inhibits collagen binding to a VLA-1 epitope and uses thereof
US5871907A (en) 1991-05-15 1999-02-16 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
AU675916B2 (en) 1991-06-14 1997-02-27 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
ATE150319T1 (de) 1992-01-13 1997-04-15 Biogen Inc Behandlung von asthma
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US6307026B1 (en) 1992-12-10 2001-10-23 Celltech Limited Humanized antibodies directed against A33 antigen
AU688751B2 (en) 1993-01-12 1998-03-19 Biogen Idec Ma Inc. Recombinant anti-VLA4 antibody molecules
NZ262615A (en) 1993-02-09 1996-02-27 Biogen Inc Treating insulin dependent diabetes (type i) with anti vla4 (very late antigen) antibodies
US6111598A (en) * 1993-11-12 2000-08-29 Peveo, Inc. System and method for producing and displaying spectrally-multiplexed images of three-dimensional imagery for use in flicker-free stereoscopic viewing thereof
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
DK1759709T3 (da) 1994-01-25 2013-06-10 Elan Pharm Inc Humaniserede antistoffer mod leukocytadhæsionsmolekyle VLA-4
US5840299A (en) 1994-01-25 1998-11-24 Athena Neurosciences, Inc. Humanized antibodies against leukocyte adhesion molecule VLA-4
PT759302E (pt) 1994-04-26 2001-01-31 Akzo Nobel Nv Farmaco para o tratamento da artrite reumatoide
JPH08131185A (ja) 1994-11-14 1996-05-28 Sumitomo Electric Ind Ltd マウスｖｌａ−１分子に対するモノクローナル抗体
JPH08160972A (ja) 1994-12-01 1996-06-21 Sega Enterp Ltd エフェクト制御方法、制御装置およびこれを利用したカラオケ装置
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
GB9516399D0 (en) 1995-08-10 1995-10-11 Camelot Superabsorbents Ltd Process for the production of water-absorbing compositions
CA2229043C (en) 1995-08-18 2016-06-07 Morphosys Gesellschaft Fur Proteinoptimierung Mbh Protein/(poly)peptide libraries
EP0843961B1 (en) 1995-08-29 2007-01-24 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Chimeric animal and method for constructing the same
DE19534177A1 (de) 1995-09-15 1997-03-20 Merck Patent Gmbh Cyclische Adhäsionsinhibitoren
GB9519667D0 (en) 1995-09-27 1995-11-29 Univ Manchester Pharmaceutical composition
DE19541844C1 (de) 1995-11-09 1997-07-24 Gsf Forschungszentrum Umwelt Verfahren zur Herstellung von menschlichen Antikörpern und deren Verwendung
US6127524A (en) 1996-10-18 2000-10-03 Dade Behring Inc. Binding molecules and computer-based methods of increasing the binding affinity thereof
AU5702298A (en) 1996-12-03 1998-06-29 Abgenix, Inc. Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and VK regions nd antibodies produced therefrom
AU740284B2 (en) 1997-06-13 2001-11-01 Genentech Inc. Stabilized antibody formulation
CA2329757C (en) 1998-05-22 2013-11-19 Boys Town National Research Hospital Use of .alpha.1.beta.1 integrin receptor inhibitors and tgf-.beta.1 inhibitors in the treatment of kidney disease
DE19831710A1 (de) 1998-07-15 2000-01-20 Merck Patent Gmbh Diacylhydrazinderivate
WO2000020459A1 (en) 1998-10-06 2000-04-13 Biogen, Inc. Crystals of the alpha 1 beta 1 integrin i-domain and their use
RS50086B (sr) * 1999-04-22 2009-01-22 Biogen Idec Ma Inc., Upotreba antagonista subjedinica alfa-4 integrina za pripremanje farmaceutskog preparata za tretiranje fibroze
TR200103432T2 (tr) 1999-06-01 2002-10-21 Biogen, Inc. Engelleyici monoklonal VLA-1 antikoru ve enflamasyonlu hastalıkların tedavisinde kullanımı.
JP2003502094A (ja) 1999-06-17 2003-01-21 デジンガー カイ 侵害を最小限にした組織採取のための外科用ゾンデ
AU4259901A (en) 2000-03-28 2001-10-08 Cambridge University Technical Services Limited Receptor/peptide crystal structure for identification of inhibitors
US8288322B2 (en) 2000-04-17 2012-10-16 Dyax Corp. Methods of constructing libraries comprising displayed and/or expressed members of a diverse family of peptides, polypeptides or proteins and the novel libraries
DE10028402A1 (de) 2000-06-13 2001-12-20 Merck Patent Gmbh Pyridin-2-yl-aminoalkycarbonylglycyl-beta-alanin und Derivate
US7153944B2 (en) 2000-07-31 2006-12-26 The General Hospital Corporation High affinity integrin polypeptides and uses thereof
EA006705B1 (ru) 2001-04-13 2006-02-24 Байоджен Айдек Ма Инк. Антитела против vla-1
WO2003068262A1 (en) 2002-02-14 2003-08-21 Biogen, Inc. Alpha1beta1 antagonists for treatment of atherosclerosis
AU2003248982B2 (en) 2002-08-01 2009-12-10 Immunomedics, Inc. Alpha-fetoprotein immu31 antibodies and fusion proteins and methods of use thereof
US20040208870A1 (en) 2003-01-30 2004-10-21 Medimmune, Inc. Stabilized high concentration anti-integrin alphanubeta3 antibody formulations
WO2005019177A1 (en) 2003-08-14 2005-03-03 Icos Corporation Aminopiperidine amide derivatives as vla-1 integrin antagonists and uses thereof
WO2005019200A2 (en) 2003-08-14 2005-03-03 Icos Corporation Aryl piperidine derivatives as vla-1 integrin antagonists and uses thereof
US7285530B2 (en) 2004-10-21 2007-10-23 Viron Therapeutics, Inc. Use of SERP-1 as an antiplatelet agent
WO2006124269A2 (en) 2005-05-16 2006-11-23 Amgen Fremont Inc. Human monoclonal antibodies that bind to very late antigen-1 for the treatment of inflammation and other disorders
WO2006133286A2 (en) 2005-06-07 2006-12-14 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Treatment of tnf antagonist-resistant inflammatory disorders and related methods
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
MY149159A (en) 2005-11-15 2013-07-31 Hoffmann La Roche Method for treating joint damage
US20080118496A1 (en) 2006-04-10 2008-05-22 Medich John R Uses and compositions for treatment of juvenile rheumatoid arthritis
US9283260B2 (en) 2006-04-21 2016-03-15 Amgen Inc. Lyophilized therapeutic peptibody formulations
DK2034830T3 (da) 2006-05-25 2014-10-27 Biogen Idec Inc Anti-vla-1-antistof til behandling af slagtilfælde
JP4951596B2 (ja) 2008-07-31 2012-06-13 株式会社日立製作所 冷却システム及び電子装置
SG174258A1 (en) 2009-03-06 2011-10-28 Genentech Inc Antibody formulation
CA2783846C (en) 2009-12-21 2021-01-19 Genentech, Inc. Antibody formulation
WO2012106497A2 (en) 2011-02-03 2012-08-09 Santarus, Inc. Selection and treatment of subjects
EP2804208A4 (en) 2012-01-11 2015-07-29 Panasonic Ip Man Co Ltd PRESSURE CONTACT SEMICONDUCTOR DEVICE AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF
MX370199B (es) 2012-02-16 2019-12-05 Santarus Inc Composiciones farmaceuticas de anticuerpo anti-antigeno muy tardio (cd49a).

Also Published As

Publication number Publication date
CN1561345A (zh) 2005-01-05
SK13742003A3 (sk) 2004-07-07
US20120177638A1 (en) 2012-07-12
YU80903A (sh) 2006-05-25
US7358054B2 (en) 2008-04-15
JP4303475B2 (ja) 2009-07-29
CN1561345B (zh) 2011-09-14
US7723073B2 (en) 2010-05-25
ES2347532T3 (es) 2010-11-02
US8084028B2 (en) 2011-12-27
US20110189177A1 (en) 2011-08-04
WO2002083854A3 (en) 2004-04-08
AU2002258778B2 (en) 2008-01-17
EA200301117A1 (ru) 2004-08-26
US20040081651A1 (en) 2004-04-29
WO2002083854A9 (en) 2003-11-06
EP1423431A2 (en) 2004-06-02
BG66334B1 (bg) 2013-06-28
NZ529494A (en) 2005-08-26
IL158376A0 (en) 2004-05-12
AR036330A1 (es) 2004-09-01
IS6982A (is) 2003-10-08
DE60236735D1 (de) 2010-07-29
BRPI0209792B8 (pt) 2021-05-25
AU2002258778C1 (en) 2008-12-04
WO2002083854A2 (en) 2002-10-24
GEP20074252B (en) 2007-12-10
KR20040062879A (ko) 2004-07-09
CA2443903A1 (en) 2002-10-24
SK288124B6 (sk) 2013-09-03
MXPA03009390A (es) 2004-01-29
US20100272716A1 (en) 2010-10-28
US9644030B2 (en) 2017-05-09
EE200300509A (et) 2004-08-16
CZ20033039A3 (cs) 2004-03-17
IL158376A (en) 2011-07-31
US20170335000A1 (en) 2017-11-23
HUP0402250A3 (en) 2007-06-28
CZ303450B6 (cs) 2012-09-19
EA006705B1 (ru) 2006-02-24
US10336826B2 (en) 2019-07-02
UA83791C2 (ru) 2008-08-26
PL367324A1 (en) 2005-02-21
US7910099B2 (en) 2011-03-22
EP1423431B1 (en) 2010-06-16
HUP0402250A2 (hu) 2005-01-28
IL213564A0 (en) 2011-07-31
IL213564B (en) 2018-06-28
ATE471344T1 (de) 2010-07-15
NO20034554L (no) 2003-12-15
JP2009079047A (ja) 2009-04-16
US20150299323A1 (en) 2015-10-22
US20090010930A1 (en) 2009-01-08
MY138286A (en) 2009-05-29
KR100927670B1 (ko) 2009-11-20
EP1423431A4 (en) 2005-04-27
JP2004536580A (ja) 2004-12-09
BRPI0209792B1 (pt) 2017-03-28
CA2443903C (en) 2018-03-20
AU2002258778A2 (en) 2002-10-28
NO20034554D0 (no) 2003-10-10
BR0209792A (pt) 2005-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10336826B2 (en) Antibodies to VLA-1
AU2002258778A1 (en) Antibodies to VLA-1
JP5843783B2 (ja) ＧＰＶＩに対する新規アンタゴニスト抗体および該抗体のＦａｂフラグメントならびにこれらの使用
AU2006201540A1 (en) A Blocking Monoclonal Antibody to VLA-1 and Its Use for the Treatment of Inflammatory Disorders
ZA200308568B (en) Antibodies to VLA-1.