BRPI0821110B1 - anticorpo de neutralização de anti-nr10/il31ra, composição farmacêutica compreendendo o referido anticorpo e uso do mesmo - Google Patents

anticorpo de neutralização de anti-nr10/il31ra, composição farmacêutica compreendendo o referido anticorpo e uso do mesmo Download PDF

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Taichi Kuramochi
Keiko Kasutani
Souhei Ohyama
Hiroyuki Tsunoda
Tomoyuki Igawa
Tatsuhiko Tachibana
Hirotake Shiraiwa
Keiko Esaki
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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Abstract

ANTICORPO ANTI-NR10, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO O REFERIDO ANTICORPO E USO DO MESMO. Os presentes inventores obtiveram com sucesso anticorpos anti-NR 10 tendo uma atividade de neutralização eficaz contra NR 10. Os anticorpos anti-NR 10 proporcionados pela presente invenção são úteis, por exemplo, como produtos farmacêuticos para o tratamento ou prevenção de doenças inflamatórias.

Description

Campo Técnico
[0001] A presente invenção refere-se a anticorpos anti-NR10 e composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo anti-NR10.
Técnica Antecedente
[0002] Muitas citocinas são conhecidas como fatores humorais en volvidos no crescimento e diferenciação de vários tipos de células ou na ativação de funções de células maduras diferenciadas. Células estimuladas por citocina produzem diferentes tipos de citocinas, desse modo, formando redes de múltiplas citocinas no corpo. A homeostase biológica é mantida através de um equilíbrio delicado da regulação mútua entre citocinas nessas redes. Acredita-se que muitas doenças inflamatórias resultem de uma falha de tais redes de citocina. Assim, terapia anticitocina baseada em anticorpo tem atraído muita atenção. Por exemplo, foi demonstrado que anticorpos anti-TNF e anticorpos antirreceptor de IL-6 são altamente eficazes clinicamente. Por outro lado, há muitos exemplos de falha onde nenhum efeito terapêutico foi produzido quando uma única citocina, tal como IL-4, foi bloqueada isoladamente, em virtude da ativação de vias compensatórias em condições patológicas reais.
[0003] Os presentes inventores tiveram sucesso no isolamento de um novo receptor de citocina, NR10, que era altamente homólogo ao gp130, um receptor para transdução de sinal de IL-6 (Documento de Patente 1). O NR10 forma um heterodímero com o receptor de oncos- tatina M (OSMR) e funciona como um receptor de IL-31 (Documento de Não-Patente 1). Com relação a IL-31, foi reportado que camundongos transgênicos superexpressando IL-31 desenvolvem espontanea- mente dermatite prurítica (Documento de Patente 2).
[0004] Anticorpos que se ligam ao NR10 e inibem a ligação entre NR10 e IL-31 podem ser eficazes no tratamento de doenças inflamatórias. Para uso clínico, é requerido que anticorpos anti-NR10 tenham baixa imunogenicidade. Além disso, de forma a obter altos efeitos terapêuticos, anticorpos com forte atividade de neutralização ou ligação a NR10 são desejados.
[0005] Documentos da técnica anterior da presente invenção são descritos abaixo. Documento de Patente 1: WO00/75314 Documento de Patente 2: WO03/060090 Documento de Não-Patente 1: IL-31 is Associated With Cu-taneous Lymphocyte Antigen-Positive Skin Homing T Cells In Patients With Atopic Dermatitis, J Allergy Clin Immunol. Fevereiro de 2006; 117(2): 418-25.
Descrição da Invenção [Problemas a Serem Resolvidos pela Invenção]
[0006] A presente invenção foi obtida em vista das circunstâncias descritas acima. Um objetivo da presente invenção é proporcionar an-ticorpos anti-NR10 e composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo anti-NR10.
[Meios para Resolver os Problemas]
[0007] Os presentes inventores conduziram estudos dedicados para obter o objetivo descrito acima. Os presentes inventores obtiveram sucesso na obtenção de anticorpos anti-NR10 tendo uma atividade de neutralização contra NR10. Além disso, os presentes inventores obtiveram sucesso na humanização de anticorpos, ao mesmo tempo em que mantém sua atividade. Os presentes inventores também produziram com sucesso anticorpos com farmacocinética aprimorada, atividade de ligação a antígeno intensificada, estabilidade aprimorada e/ou risco reduzido de imunogenicidade. Esses anticorpos são úteis como agentes terapêuticos para doenças inflamatórias.
[0008] A presente invenção refere-se a anticorpos anti-NR10 e composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo anti-NR10. Mais especificamente, a presente invenção inclui: [1] um anticorpo que reconhece o domínio 1 de NR10; [2] o anticorpo de [1], o qual tem uma atividade de neutralização; [3] o anticorpo de [1] ou [2], o qual é um anticorpo humanizado; [4] um anticorpo anti-NR10 o qual é qualquer um de:
[0009] (1) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada a qual compreende uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3;
[00010] (2) um anticorpo compreendendo a região variável de ca deia pesada de SEQ ID NO: 4;
[00011] (3) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia leve o qual compreende uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7;
[00012] (4) um anticorpo compreendendo a região variável de ca deia leve de SEQ ID NO: 8;
[00013] (5) um anticorpo compreendendo a região variável de ca deia pesada de (1) e a região variável de cadeia leve de (3);
[00014] (6) um anticorpo compreendendo a região variável de ca deia pesada de (2) e a região variável de cadeia leve de (4);
[00015] (7) um anticorpo no qual um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos no anticorpo de qualquer um de (1) a (6), o qual tem uma atividade equivalente àquela do anticorpo de qualquer um de (1) a (6); e
[00016] (8) um anticorpo o qual se liga ao mesmo epitopo que um epitopo ligado pelo anticorpo de qualquer um de (1) a (7); [5] um anticorpo anti-NR10 o qual é qualquer um de:
[00017] (1) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada a qual compreende uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11;
[00018] (2) um anticorpo compreendendo a região variável de ca deia pesada de SEQ ID NO: 12;
[00019] (3) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia leve o qual compreende uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15;
[00020] (4) um anticorpo compreendendo a região variável de ca deia leve de SEQ ID NO: 16; (5) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia pesada de (1) e a região variável de cadeia leve de (3);
[00021] (6) um anticorpo compreendendo a região variável de ca deia pesada de (2) e a região variável de cadeia leve de (4);
[00022] (7) um anticorpo no qual um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos no anticorpo de qualquer um de (1) a (6), o qual tem uma atividade equivalente àquela do anticorpo de qualquer um de (1) a (6); e
[00023] (8) um anticorpo o qual se liga ao mesmo epitopo que um epitopo ligado pelo anticorpo de qualquer um de (1) a (7); [6] um anticorpo anti-NR10 o qual é qualquer um de:
[00024] (1) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada a qual compreende uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 17, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18 e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 19;
[00025] (2) um anticorpo compreendendo a região variável de ca deia pesada de SEQ ID NO: 20;
[00026] (3) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia leve o qual compreende uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 21, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 22 e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 23;
[00027] (4) um anticorpo compreendendo a região variável de ca deia leve de SEQ ID NO: 24;
[00028] (5) um anticorpo compreendendo a região variável de ca deia pesada de (1) e a região variável de cadeia leve de (3);
[00029] (6) um anticorpo compreendendo a região variável de ca deia pesada de (2) e a região variável de cadeia leve de (4);
[00030] (7) um anticorpo no qual um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos no anticorpo de qualquer um de (1) a (6), o qual tem uma atividade equivalente àquela do anticorpo de qualquer um de (1) a (6); e
[00031] (8) um anticorpo o qual se liga ao mesmo epitopo que um epitopo ligado pelo anticorpo de qualquer um de (1) a (7); [7] um anticorpo anti-NR10 o qual é qualquer um de:
[00032] (1) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada a qual compreende uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 25, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 26 e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 27;
[00033] (2) um anticorpo compreendendo a região variável de ca deia pesada de SEQ ID NO: 28;
[00034] (3) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia leve o qual compreende uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 29, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30 e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 31;
[00035] (4) um anticorpo compreendendo a região variável de ca deia leve de SEQ ID NO: 32;
[00036] (5) um anticorpo compreendendo a região variável de ca deia pesada de (1) e a região variável de cadeia leve de (3);
[00037] (6) um anticorpo compreendendo a região variável de ca deia pesada de (2) e a região variável de cadeia leve de (4);
[00038] (7) um anticorpo no qual um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos no anticorpo de qualquer um de (1) a (6), o qual tem uma atividade equivalente àquela do anticorpo de qualquer um de (1) a (6); e
[00039] (8) um anticorpo o qual se liga ao mesmo epitopo que um epitopo ligado pelo anticorpo de qualquer um de (1) a (7); [8] um anticorpo ou região variável de anticorpo a qual é qualquer um de:
[00040] (1) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 196, CDR2 de SEQ ID NO: 197 e CDR3 de SEQ ID NO: 11 (H17);
[00041] (2) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 176, CDR2 de SEQ ID NO: 197 e CDR3 de SEQ ID NO: 11 (H19);
[00042] (3) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 196, CDR2 de SEQ ID NO: 197 e CDR3 de SEQ ID NO: 184 (H28, H42);
[00043] (4) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 9, CDR2 de SEQ ID NO: 197 e CDR3 de SEQ ID NO: 184 (H30, H44);
[00044] (5) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 176, CDR2 de SEQ ID NO: 197, CDR3 de SEQ ID NO: 184 (H34, H46);
[00045] (6) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 9, CDR2 de SEQ ID NO: 198 e CDR3 de SEQ ID NO: 184 (H57, H78);
[00046] (7) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 176, CDR2 de SEQ ID NO: 198 e CDR3 de SEQ ID NO: 184 (H71, H92);
[00047] (8) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 9, CDR2 de SEQ ID NO: 199 e CDR3 de SEQ ID NO: 184 (H97, H98);
[00048] (9) uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 200, CDR2 de SEQ ID NO: 170 e CDR3 de SEQ ID NO: 193 (L11);
[00049] (10) uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 201, CDR2 de SEQ ID NO: 170 e CDR3 de SEQ ID NO: 193 (L12);
[00050] (11) uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 202, CDR2 de SEQ ID NO: 170 e CDR3 de SEQ ID NO: 193 (L17);
[00051] (12) uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 203, CDR2 de SEQ ID NO: 170 e CDR3 de SEQ ID NO: 193 (L50);
[00052] (13) um anticorpo compreendendo a região variável de ca deia pesada de (3) e a região variável de cadeia leve de (11);
[00053] (14) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia pesada de (4) e a região variável de cadeia leve de (11);
[00054] (15) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia pesada de (5) e a região variável de cadeia leve de (11);
[00055] (16) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia pesada de (6) e a região variável de cadeia leve de (11);
[00056] (17) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia pesada de (7) e a região variável de cadeia leve de (11);
[00057] (18) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia pesada de (8) e a região variável de cadeia leve de (12);
[00058] (19) um anticorpo no qual um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos no anticorpo de qualquer um de (13) a (18), o qual tem uma atividade equivalente àquela do anticorpo de qualquer um de (13) a (18); e
[00059] (20) um anticorpo o qual se liga ao mesmo epitopo que um epitopo ligado pelo anticorpo de qualquer um de (13) a (18); [9] um anticorpo ou região variável de anticorpo a qual é qualquer um de:
[00060] (1) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 204 (H17);
[00061] (2) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 205 (H19);
[00062] (3) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 206 (H28);
[00063] (4) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 207 (H30);
[00064] (5) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 208 (H34),
[00065] (6) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 209 (H42);
[00066] (7) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 210 (H44);
[00067] (8) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 211 (H46);
[00068] (9) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 212 (H57);
[00069] (10) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 213 (H71);
[00070] (11) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 214 (H78);
[00071] (12) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 215 (H92);
[00072] (13) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 216 (H97);
[00073] (14) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 217 (H98);
[00074] (15) uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 218 (L11);
[00075] (16) uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 219 (L12);
[00076] (17) uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 220 (L17);
[00077] (18) uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 221 (L50);
[00078] (19) um anticorpo compreendendo a região variável de ca deia pesada de (3) e a região variável de cadeia leve de (17) (H28L17);
[00079] (20) um anticorpo compreendendo a região variável de ca deia pesada de (4) e a região variável de cadeia leve de (17) (H30L17);
[00080] (21) um anticorpo compreendendo a região variável de ca deia pesada de (5) e a região variável de cadeia leve de (17) (H34L17);
[00081] (22) um anticorpo compreendendo a região variável de ca deia pesada de (6) e a região variável de cadeia leve de (17) (H42L17);
[00082] (23) um anticorpo compreendendo a região variável de ca deia pesada de (7) e a região variável de cadeia leve de (17) (H44L17);
[00083] (24) um anticorpo compreendendo a região variável de ca deia pesada de (8) e a região variável de cadeia leve de (17) (H46L17);
[00084] (25) um anticorpo compreendendo a região variável de ca deia pesada de (9) e a região variável de cadeia leve de (17) (H57L17);
[00085] (26) um anticorpo compreendendo a região variável de ca deia pesada de (10) e a região variável de cadeia leve de (17) (H71L17);
[00086] (27) um anticorpo compreendendo a região variável de ca deia pesada de (11) e a região variável de cadeia leve de (17) (H78L17);
[00087] (28) um anticorpo compreendendo a região variável de ca deia pesada de (12) e a região variável de cadeia leve de (17) (H92L17);
[00088] (29) um anticorpo compreendendo a região variável de ca deia pesada de (13) e a região variável de cadeia leve de (18) (H97L50);
[00089] (30) um anticorpo compreendendo a região variável de ca deia pesada de (14) e a região variável de cadeia leve de (18) (H98L50),
[00090] (31) um anticorpo no qual um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos no anticorpo de qualquer um de (19) a (30), o qual tem uma atividade equivalente àquela do anticorpo de qualquer um de (19) a (30); e
[00091] (32) um anticorpo o qual se liga ao mesmo epitopo que um epitopo ligado pelo anticorpo de qualquer um de (19) a (30); [10] o anticorpo anti-NR10 de qualquer um de [4] a [9], o qual é um anticorpo humanizado; [11] um anticorpo, cadeia pesada de anticorpo ou cadeia leve de anticorpo, a qual é qualquer um de:
[00092] (1) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 222 (H17);
[00093] (2) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 223 (H19);
[00094] (3) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 224 (H28);
[00095] (4) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 225 (H30);
[00096] (5) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 226 (H34);
[00097] (6) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 227 (H42);
[00098] (7) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 228 (H44);
[00099] (8) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 229 (H46);
[000100] (9) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 230 (H57);
[000101] (10) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 231 (H71); (11) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 232 (H78);
[000102] (12) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 233 (H92);
[000103] (13) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 234 (H97);
[000104] (14) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 235 (H98);
[000105] (15) uma cadeia leve compreendendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 236 (L11);
[000106] (16) uma cadeia leve compreendendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 237 (L12);
[000107] (17) uma cadeia leve compreendendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 238 (L17);
[000108] (18) uma cadeia leve compreendendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 239 (L50);
[000109] (19) um anticorpo compreendendo a cadeia pesada de (3) e a cadeia leve de (17) (H28L17);
[000110] (20) um anticorpo compreendendo a cadeia pesada de (4) e a cadeia leve de (17) (H30L17);
[000111] (21) um anticorpo compreendendo a cadeia pesada de (5) e a cadeia leve de (17) (H34L17);
[000112] (22) um anticorpo compreendendo a cadeia pesada de (6) e a cadeia leve de (17) (H42L17);
[000113] (23) um anticorpo compreendendo a cadeia pesada de (7) e a cadeia leve de (17) (H44L17);
[000114] (24) um anticorpo compreendendo a cadeia pesada de (8) e a cadeia leve de (17) (H46L17);
[000115] (25) um anticorpo compreendendo a cadeia pesada de (9) e a cadeia leve de (17) (H57L17);
[000116] (26) um anticorpo compreendendo a cadeia pesada de (10) e a cadeia leve de (17) (H71L17);
[000117] (27) um anticorpo compreendendo a cadeia pesada de (11) e a cadeia leve de (17) (H78L17); (28) um anticorpo compreendendo a cadeia pesada de (12) e a cadeia leve de (17) (H92L17);
[000118] (29) um anticorpo compreendendo a cadeia pesada de (13) e a cadeia leve de (18) (H97L50);
[000119] (30) um anticorpo compreendendo a cadeia pesada de (14) e a cadeia leve de (18) (H98L50);
[000120] (31) um anticorpo no qual um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos no anticorpo de qualquer um de (19) a (30), o qual tem uma atividade equivalente àquela do anticorpo de qualquer um de (19) a (30); e
[000121] (32) um anticorpo o qual se liga ao mesmo epitopo que um epitopo ligado pelo anticorpo de qualquer um de (19) a (30); [12] uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo de qualquer um de [1] a [11]; [13] a composição farmacêutica de [12], a qual é um agente para tratamento de uma doença inflamatória; [14] um método para tratamento ou prevenção de uma doença inflamatória, o qual compreende a etapa de administração do anticorpo de qualquer um de [1] a [11]; e [15] uso do anticorpo de qualquer um de [1] a [11] no preparo de um agente terapêutico para uma doença inflamatória.
Breve Descrição dos Desenhos
[000122] A figura 1 mostra as sequências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpos de camundongo NS18, NS22, NS23 e NS33.
[000123] A figura 2 mostra as sequências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia leve de anticorpos de camundongo NS18, NS22, NS23 e NS33.
[000124] A figura 3 é um gráfico que mostra a inibição de crescimento de células hNR10/hOSMR/BaF3 pelos sobrenadantes de cultura de hibridoma.
[000125] A figura 4 é um gráfico que mostra a inibição de crescimento de células cynNR10/cynOSMR/BaF3 pelos sobrenadantes de cultura de hibridoma.
[000126] A figura 5 é um gráfico que mostra a avaliação da atividade de NS22 quimérico (BaF).
[000127] A figura 6 é um gráfico que mostra a avaliação da atividade de NS22 quimérico (DU-145).
[000128] A figura 7 é um gráfico que mostra a avaliação da competição de NS22 quimérico com IL-31.
[000129] A figura 8 é um gráfico que mostra a atividade de ligação competitiva a NR10 de anticorpos anti-NR10.
[000130] A figura 9 é um conjunto de gráficos que mostra a avaliação da competição de NS22 humanizado (H0L0) com IL-31.
[000131] A figura 10 mostra o efeito da região constante do anticorpo anti-NR10 humanizado H0L0 sobre a heterogeneidade avaliada por meio de cromatografia de troca de cátions.
[000132] A figura 11 é um conjunto de gráficos que mostra a avaliação da competição de mutantes do anticorpo anti-NR10 humanizado do qual o ponto isoelétrico das regiões variáveis é diminuído sem perda significativa da ligação a NR10, com IL-31.
[000133] A figura 12 mostra o efeito da região constante do anticorpo antirreceptor de IL-6 sobre a heterogeneidade avaliada por meio de cromatografia de troca de cátions.
[000134] A figura 13 mostra o efeito da região constante do anticorpo antirreceptor de IL-6 sobre o pico de desnaturação avaliado por meio de DSC.
[000135] A figura 14 mostra o efeito da nova região constante M14 sobre a heterogeneidade em um anticorpo antirreceptor de IL-6, avaliada por meio de cromatografia de troca de cátions.
[000136] A figura 15 mostra o efeito da nova região constante M58 sobre a heterogeneidade em um anticorpo antirreceptor de IL-6, avaliada por meio de cromatografia de troca de cátions.
[000137] A figura 16 mostra o efeito da nova região constante M58 sobre o pico de desnaturação em um anticorpo antirreceptor de IL-6, avaliado por meio de DSC.
[000138] A figura 17 mostra o resultado de avaliação da retenção de huPM1-IgG1 e huPM1-M58 no plasma de camundongos transgênicos para FcRn humano.
[000139] A figura 18 mostra a atividade biológica de cada anticorpo avaliada usando BaF/NR10.
[000140] A figura 19 mostra a análise de amostras termicamente aceleradas (linha pontilhada) e não acelerada (linha sólida) de cada anticorpo modificado por meio de cromatografia de troca de cátions para comparar a geração de produtos da degradação entre antes e após aceleração térmica. As setas indicam a posição de pico do componente básico, o qual foi alterado.
[000141] A figura 20 é um conjunto de gráficos que mostra a avaliação (BaF) da atividade de cada variante.
[000142] A figura 21 é um gráfico que mostra a avaliação (BaF) da atividade de Ha401La402 e H0L0.
[000143] A figura 22 é um gráfico que mostra a avaliação (BaF) da atividade de H17L11 e H0L0.
[000144] A figura 23 é um gráfico que mostra a avaliação (BaF) da atividade de H19L12 e H0L0.
[000145] A figura 24 é um gráfico que mostra a atividade biológica de H0L12 e H0L17 avaliada usando BaF/NR10.
[000146] A figura 25-1 é um conjunto de gráficos que mostra a avaliação (BaF) da atividade de cada variante.
[000147] A figura 25-2 é uma continuação da figura 25-1.
[000148] A figura 26 é um diagrama esquemático para NR10-ECD humana/de camundongo do tipo silvestre e quimérica.
[000149] A figura 27 é um conjunto de fotografias que mostram a detecção do domínio de ligação por meio de Western blotting. A é uma fotografia que mostra o resultado de detecção usando um anticorpo anti-NR10 humana humanizado; B é uma fotografia que mostra o resultado de detecção usando um anticorpo anti-NR10 humana de camundongo; e C é uma fotografia que mostra o resultado de detecção usando um anticorpo anti-Myc. Com o anticorpo anti-NR10 humana, a ligação a antígeno foi detectada apenas em hhh, hhm e hmm, mas não em mmm, mmh e mhm.
[000150] A figura 28-1 mostra a sequência de aminoácido de cada variante de H0 (SEQ ID NO: 50).
[000151] A figura 28-2 é uma continuação da figura 28-1.
[000152] A figura 28-3 é uma continuação da figura 28-2.
[000153] A figura 29-1 mostra a sequência de aminoácido de cada variante de L0 (SEQ ID NO: 52).
[000154] A figura 29-2 é uma continuação da figura 29-1. Modo para Realização da Invenção NR10
[000155] NR10 é uma proteína que forma um heterodímero com o receptor de oncostatina M (OSMR) e funciona como um receptor de IL- 31. A NR10 é também conhecida como glm-r (J Biol Chem 277, 16831-6, 2002), GPL (J Biol Chem 278, 49850-9, 2003), IL31RA (Nat Immunol 5, 752-60, 2004) e semelhantes. Assim, a NR10 na presente invenção também inclui proteínas designadas por tais nomes.
[000156] Na presente invenção, NR10 (também referida como IL31RA, GPL ou glm-r) não está particularmente limitada em termos de sua origem e inclui aquelas derivadas de seres humanos, camundongos, macacos e outros mamíferos. NR10 derivada de seres humanos, camundongos e macacos é preferida e NR10 derivada de ser humano é particularmente preferida.
[000157] Existem muitas variantes com junções conhecidas de NR10 derivada de ser humano (WO 00/075314). Das variantes com junções descritas acima, NR10.1 consiste em 662 aminoácidos e contém um domínio transmembrana. NR10.2 é uma proteína tipo receptor solúvel consistindo em 252 aminoácidos sem o domínio transmembrana. Entretanto, variantes com junções de NR10 conhecidas que funcionam como proteínas do receptor transmembrana incluem NR10.3 e IL- 31RAv3. A NR10 humana da presente invenção não está particularmente limitada, na medida em que ela forme um heterodímero com o receptor de oncostatina M (OSMR) e funcione como um receptor de IL- 31. NR10 preferidas incluem NR10.3 (também referida como ILRAv4 (Nat Immunol 5, 752-60, 2004)) e IL-31RAv3. NR 10.3 (IL31RAv4) consiste em 662 aminoácidos (WO 00/075314; Nat Immunol 5, 752-60, 2004) e IL31RAv3 consiste em 732 aminoácidos (Acesso ao GenBank No: NM_139017). A sequência de aminoácido de IL31RAv4 é mostrada em SEQ ID NO: 79 e a sequência de aminoácido de IL31RAv3 é mostrada em SEQ ID NO: 80. Entretanto, NR10 derivadas de camundongo incluem proteínas compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 81. Além disso, NR10 derivadas de macaco cinomolgo incluem proteínas compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 66. Anticorpos (sequências) Modalidades preferidas do anticorpo anti-NR10 da presente invenção incluem os anticorpos anti-NR10 de qualquer um de (1) a (8) em (A) a (D) abaixo. (A)NS18
[000158] (1) anticorpos tendo uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 (HCDR1), CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 (HCDR2) e CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 (HCDR3);
[000159] (2) anticorpos tendo a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 4 (VH);
[000160] (3) anticorpos tendo uma região variável de cadeia leve que compreende uma CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5 (LCDR1), CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 (LCDR2) e CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7 (LCDR3);
[000161] (4) anticorpos tendo a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 8 (VL);
[000162] (5) anticorpos tendo a região variável de cadeia pesada de (1) e a região variável de cadeia leve de (3);
[000163] (6) anticorpos tendo a região variável de cadeia pesada de (2) e a região variável de cadeia leve de (4);
[000164] (7) anticorpos no qual um ou mais aminoácidos são substi tuídos, deletados, adicionados e/ou inseridos nos anticorpos de qualquer um de (1) a (6), os quais têm uma atividade equivalente àquela dos anticorpos de qualquer um de (1) a (6); e
[000165] (8) anticorpos que se ligam ao mesmo epitopo que um epi- topo ligado pelos anticorpos de qualquer um de (1) a (7). (B) NS22
[000166] (1) anticorpos tendo uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 (HCDR1), CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 (HCDR2) e CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 (HCDR3);
[000167] (2) anticorpos tendo a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 12 (VH);
[000168] (3) anticorpos tendo uma região variável de cadeia leve que compreende uma CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 (LCDR1), CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 (LCDR2) e CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15 (LCDR3);
[000169] (4) anticorpos tendo a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 16 (VL);
[000170] (5) anticorpos tendo a região variável de cadeia pesada de (1) e a região variável de cadeia leve de (3);
[000171] (6) anticorpos tendo a região variável de cadeia pesada de (2) e a região variável de cadeia leve de (4);
[000172] (7) anticorpos no qual um ou mais aminoácidos são substi tuídos, deletados, adicionados e/ou inseridos nos anticorpos de qualquer um de (1) a (6), os quais têm uma atividade equivalente àquela dos anticorpos de qualquer um de (1) a (6); e
[000173] (8) anticorpos que se ligam ao mesmo epitopo que um epi- topo ligado pelos anticorpos de qualquer um de (1) a (7).
[000174] Exemplos específicos da substituição, deleção, adição e/ou inserção descritas acima de um ou mais aminoácidos não estão parti-cularmente limitados e incluem, por exemplo, as seguintes modificações.
[000175] Substituição de Ile na posição 3 na cadeia pesada CDR1 de SEQ ID NO: 9 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos do mesmo incluem Val.
[000176] Substituição de Met na posição 4 na cadeia pesada CDR1 de SEQ ID NO: 9 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos do mesmo incluem Ile.
[000177] Substituição de Met na posição 4 na cadeia pesada CDR1 de SEQ ID NO: 9 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos do mesmo incluem Leu.
[000178] Substituição de Ile na posição 3 na cadeia pesada CDR1 de SEQ ID NO: 9 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos do mesmo incluem Ala.
[000179] Substituição de Leu na posição 1 na cadeia pesada CDR2 de SEQ ID NO: 10 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos do mesmo incluem Glu.
[000180] Substituição de Asn na posição 3 na cadeia pesada CDR2 de SEQ ID NO: 10 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos do mesmo incluem Asp.
[000181] Substituição de Gln na posição 13 na cadeia pesada CDR2 de SEQ ID NO: 10 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos do mesmo incluem Asp.
[000182] Substituição de Lys na posição 14 na cadeia pesada CDR2 de SEQ ID NO: 10 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos do mesmo incluem Gln.
[000183] Substituição de Lys na posição 16 na cadeia pesada CDR2 de SEQ ID NO: 10 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos do mesmo incluem Gln.
[000184] Substituição de Gly na posição 17 na cadeia pesada CDR2 de SEQ ID NO: 10 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos do mesmo incluem Asp.
[000185] Substituição de Lys e Gly nas posições 16 e 17, respectivamente, na cadeia pesada CDR2 de SEQ ID NO: 10 por outro ami- noácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos incluem substituição de Lys na posição 16 por Gln e Gly na posição 17 por Asp.
[000186] Substituição de Lys, Lys e Gly nas posições 14, 16 e 17, respectivamente, na cadeia pesada CDR2 de SEQ ID NO: 10 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos incluem substituição de Lys na posição 14 por Gln, Lys na posição 16 por Gln e Gly na posição 17 por Asp.
[000187] Substituição de Gln, Lys, Lys e Gly nas posições 13, 14, 16 e 17, respectivamente, na cadeia pesada CDR2 de SEQ ID NO: 10 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos incluem substituição de Gln na posição 13 por Asp, Lys na posição 14 por Gln, Lys na posição 16 por Gln e Gly na posição 17 por Asp.
[000188] Substituição de Ser na posição 10 na cadeia pesada CDR2 de SEQ ID NO: 10 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos do mesmo incluem Asp.
[000189] Substituição de Gln na posição 13 na cadeia pesada CDR2 de SEQ ID NO: 10 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos do mesmo incluem Pro.
[000190] Substituição de Tyr na posição 3 na cadeia pesada CDR3 de SEQ ID NO: 11 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos do mesmo incluem Leu.
[000191] Substituição de Met na posição 10 na cadeia pesada CDR3 de SEQ ID NO: 11 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos do mesmo incluem Leu.
[000192] Substituição de Asp na posição 11 na cadeia pesada CDR3 de SEQ ID NO: 11 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos do mesmo incluem Glu.
[000193] Substituição de Tyr na posição 12 na cadeia pesada CDR3 de SEQ ID NO: 11 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos do mesmo incluem Thr e Ser.
[000194] Substituição de Met, Asp e Tyr nas posições 10, 11 e 12, respectivamente, na cadeia pesada CDR3 de SEQ ID NO: 11 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos incluem substituição de Met na posição 10 por Leu, Asp na posição 11 por Glu e Tyr na posição 12 por Thr.
[000195] Substituição de Asp e Tyr nas posições 11 e 12, respectivamente, na cadeia pesada CDR3 de SEQ ID NO: 11 por outro ami- noácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos incluem substituição de Asp na posição 11 por Glu e Tyr na posição 12 por Thr.
[000196] Substituição de Tyr, Asp e Tyr nas posições 3, 11 e 12, respectivamente, na cadeia pesada CDR3 de SEQ ID NO: 11 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos incluem substituição de Tyr na posição 3 por Leu, Asp na posição 11 por Glu e Tyr na posição 12 por Thr ou Ser.
[000197] Substituição de Arg na posição 1 na cadeia leve CDR1 de SEQ ID NO: 13 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos do mesmo incluem Gln.
[000198] Substituição de Asn na posição 5 na cadeia leve CDR1 de SEQ ID NO: 13 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos do mesmo incluem Asp.
[000199] Substituição de Arg e Asn nas posições 1 e 5, respectivamente, na cadeia leve CDR1 de SEQ ID NO: 13 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos incluem substituição de Arg na posição 1 por Gln e Asn na posição 5 por Asp.
[000200] Substituição de Ser na posição 8 na cadeia leve CDR1 de SEQ ID NO: 13 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos do mesmo incluem Arg.
[000201] Substituição de Leu na posição 10 na cadeia leve CDR1 de SEQ ID NO: 13 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos do mesmo incluem Val.
[000202] Substituição de Ser e Leu nas posições 8 e 10, respectivamente, na cadeia leve CDR1 de SEQ ID NO: 13 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos incluem substituição de Ser na posição 8 por Arg e Leu na posição 10 por Val.
[000203] Substituição de Thr na posição 2 na cadeia leve CDR1 de SEQ ID NO: 13 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos do mesmo incluem Ala e Ser.
[000204] Substituição de Asn na posição 1 na cadeia leve CDR2 de SEQ ID NO: 14 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos do mesmo incluem Asp.
[000205] Substituição de Lys na posição 3 na cadeia leve CDR2 de SEQ ID NO: 14 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos do mesmo incluem Gln.
[000206] Substituição de Leu na posição 5 na cadeia leve CDR2 de SEQ ID NO: 14 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos do mesmo incluem Glu.
[000207] Substituição de Lys na posição 7 na cadeia leve CDR2 de SEQ ID NO: 14 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos do mesmo incluem Gln e Asp.
[000208] Substituição de Lys, Leu e Lys nas posições 3, 5 e 7, res-pectivamente, na cadeia leve CDR2 de SEQ ID NO: 14 por outro ami- noácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos incluem substituição de Lys na posição 3 por Gln, Leu na posição 5 por Glu e Lys na posição 7 por Gln.
[000209] Substituição de Glu na posição 5 na cadeia leve CDR3 de SEQ ID NO: 15 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos do mesmo incluem Asp.
[000210] Substituição de Ser na posição 6 na cadeia leve CDR3 de SEQ ID NO: 15 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos do mesmo incluem Asp.
[000211] Substituição de Thr na posição 9 na cadeia leve CDR3 de SEQ ID NO: 15 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado, mas exemplos preferidos do mesmo incluem Phe.
[000212] Cada uma das substituições descritas acima pode ser feita isoladamente ou múltiplas substituições podem ser feitas em combinação. Além disso, as substituições acima podem ser combinadas com outras substituições. Essas substituições podem aprimorar a farmaco- cinética do anticorpo (retenção no plasma), intensificar a atividade de ligação a antígeno, aprimorar a estabilidade e/ou reduzir o risco de imunogenicidade.
[000213] Na presente invenção, exemplos específicos das regiões variáveis tendo uma combinação das substituições descritas acima incluem, por exemplo, regiões variáveis de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 167 e região variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 168. Além disso, exemplos dos anticorpos tendo uma combinação das substituições descritas acima incluem, por exemplo, anticorpos que compreendem uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoáci- do de SEQ ID NO: 167 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 168.
[000214] Além disso, exemplos específicos de a cadeia pesada ou região variável de cadeia leve tendo uma combinação das substituições descritas acima incluem, por exemplo, as seguintes regiões variáveis:
[000215] (a) regiões variáveis de cadeia pesada que compreendem CDR1 de SEQ ID NO: 196, CDR2 de SEQ ID NO: 197 e CDR3 de SEQ ID NO: 11 (H17);
[000216] (b) regiões variáveis de cadeia pesada que compreendem CDR1 de SEQ ID NO: 176, CDR2 de SEQ ID NO: 197 e CDR3 de SEQ ID NO: 11 (H19);
[000217] (c) regiões variáveis de cadeia pesada que compreendem CDR1 de SEQ ID NO: 196, CDR2 de SEQ ID NO: 197 e CDR3 de SEQ ID NO: 184 (H28, H42);
[000218] (d) regiões variáveis de cadeia pesada que compreendem uma CDR1 de SEQ ID NO: 9, CDR2 de SEQ ID NO: 197 e CDR3 de SEQ ID NO: 184 (H30, H44);
[000219] (e) regiões variáveis de cadeia pesada que compreendem CDR1 de SEQ ID NO: 176, CDR2 de SEQ ID NO: 197 e CDR3 de SEQ ID NO: 184 (H34, H46);
[000220] (f) regiões variáveis de cadeia pesada que compreendem CDR1 de SEQ ID NO: 9, CDR2 de SEQ ID NO: 198 e CDR3 de SEQ ID NO: 184 (H57, H78);
[000221] (g) regiões variáveis de cadeia pesada que compreendem CDR1 de SEQ ID NO: 176, CDR2 de SEQ ID NO: 198 e CDR3 de SEQ ID NO: 184 (H71, H92);
[000222] (h) regiões variáveis de cadeia pesada que compreendem CDR1 de SEQ ID NO: 9, CDR2 de SEQ ID NO: 199 e CDR3 de SEQ ID NO: 184 (H97, H98);
[000223] (i) região variável de cadeia leve que compreende CDR1 de SEQ ID NO: 200, CDR2 de SEQ ID NO: 170 e CDR3 de SEQ ID NO: 193 (L11);
[000224] (j) região variável de cadeia leve que compreende CDR1 de SEQ ID NO: 201, CDR2 de SEQ ID NO: 170 e CDR3 de SEQ ID NO: 193 (L12);
[000225] (k) região variável de cadeia leve que compreende CDR1 de SEQ ID NO: 202, CDR2 de SEQ ID NO: 170 e CDR3 de SEQ ID NO: 193 (L17); e
[000226] (l) região variável de cadeia leve que compreende CDR1 de SEQ ID NO: 203, CDR2 de SEQ ID NO: 170 e CDR3 de SEQ ID NO: 193 (L50).
[000227] Além disso, exemplos específicos dos anticorpos tendo uma combinação das substituições descritas acima incluem, por exemplo:
[000228] (i) anticorpos que compreendem a região variável de cadeia pesada de (c) e a região variável de cadeia leve de (k);
[000229] (ii) anticorpos que compreendem a região variável de cadeia pesada de (d) e a região variável de cadeia leve de (k);
[000230] (iii) anticorpos que compreendem a região variável de ca deia pesada de (e) e a região variável de cadeia leve de (k);
[000231] (iv) anticorpos que compreendem a região variável de ca deia pesada de (f) e a região variável de cadeia leve de (k);
[000232] (v) anticorpos que compreendem a região variável de ca deia pesada de (g) e a região variável de cadeia leve de (k); e
[000233] (vi) anticorpos que compreendem a região variável de ca deia pesada de (h) e a região variável de cadeia leve de (l). (C) NS23
[000234] (1) anticorpos tendo uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 17 (HCDR1), CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18 (HCDR2) e CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 19 (HCDR3);
[000235] (2) anticorpos tendo a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 20 (VH);
[000236] (3) anticorpos tendo uma região variável de cadeia leve que compreende uma CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 21 (LCDR1), CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 22 (LCDR2) e CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 23 (LCDR3);
[000237] (4) anticorpos tendo a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 24 (VL);
[000238] (5) anticorpos tendo a região variável de cadeia pesada de (1) e a região variável de cadeia leve de (3);
[000239] (6) anticorpos tendo a região variável de cadeia pesada de (2) e a região variável de cadeia leve de (4);
[000240] (7) anticorpos no qual um ou mais aminoácidos são substi tuídos, deletados, adicionados e/ou inseridos nos anticorpos de qualquer um de (1) a (6), os quais têm uma atividade equivalente àquela dos anticorpos de qualquer um de (1) a (6); e
[000241] (8) anticorpos que se ligam ao mesmo epitopo que um epi- topo ligado pelos anticorpos de qualquer um de (1) a (7). (D) NS33
[000242] (1) anticorpos tendo uma região variável de cadeia pesada que compreendem CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 25 (HCDR1), CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 26 (HCDR2) e CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 27 (HCDR3);
[000243] (2) anticorpos tendo a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 28 (VH);
[000244] (3) anticorpos tendo uma região variável de cadeia leve que compreendem CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 29 (LCDR1), CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30 (LCDR2) e CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 31 (LCDR3);
[000245] (4) anticorpos tendo a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 32 (VL);
[000246] (5) anticorpos tendo a região variável de cadeia pesada de (1) e a região variável de cadeia leve de (3);
[000247] (6) anticorpos tendo a região variável de cadeia pesada de (2) e a região variável de cadeia leve de (4);
[000248] (7) anticorpos no qual um ou mais aminoácidos são substi tuídos, deletados, adicionados e/ou inseridos nos anticorpos de qualquer um de (1) a (6), os quais têm uma atividade equivalente àquela dos anticorpos de qualquer um de (1) a (6); e
[000249] (8) anticorpos que se ligam ao mesmo epitopo que um epi- topo ligado pelos anticorpos de qualquer um de (1) a (7).
[000250] Qualquer (quaisquer) região(ões) de quadro(FR) pode ser usada para os anticorpos de (1) ou (3) descritos acima; contudo, FRs derivadas de ser humano são, de preferência, usadas. Além disso, quaisquer regiões constantes podem ser usadas para os anticorpos de (1) a (8) descritos acima; contudo, regiões constantes derivadas de ser humano são, de preferência, usadas. Para os anticorpos da presente invenção, a sequência de aminoácido da região FR ou constante original pode ser usada sem modificação ou após ser modificada para uma sequência de aminoácido diferente mediante substituição, deleção, adição e/ou inserção de um ou mais aminoácidos.
[000251] A sequência de aminoácido da cadeia pesada do NS18 descrito acima é mostrada em SEQ ID NO: 34 e a sequência de nu- cleotídeo que codifica essa sequência de aminoácido é mostrada em SEQ ID NO: 33. Enquanto isso, a sequência de aminoácido da cadeia leve é mostrada em SEQ ID NO: 36 e a sequência de nucleotídeo que codifica essa sequência de aminoácido é mostrada em SEQ ID NO: 35.
[000252] A sequência de aminoácido da cadeia pesada de NS22 é mostrada em SEQ ID NO: 38 e a sequência de nucleotídeo que codifica essa sequência de aminoácido é mostrada em SEQ ID NO: 37. Enquanto isso, a sequência de aminoácido da cadeia leve é mostrada em SEQ ID NO: 40 e a sequência de nucleotídeo que codifica essa se- quência de aminoácido é mostrada em SEQ ID NO: 39.
[000253] A sequência de aminoácido da cadeia pesada de NS23 é mostrada em SEQ ID NO: 42 e a sequência de nucleotídeo que codifica essa sequência de aminoácido é mostrada em SEQ ID NO: 41. Enquanto isso, a sequência de aminoácido da cadeia leve é mostrada em SEQ ID NO: 44 e a sequência de nucleotídeo que codifica essa sequência de aminoácido é mostrada em SEQ ID NO: 43.
[000254] A sequência de aminoácido da cadeia pesada de NS33 é mostrada em SEQ ID NO: 46 e a sequência de nucleotídeo que codifica essa sequência de aminoácido é mostrada em SEQ ID NO: 45. Enquanto isso, a sequência de aminoácido da cadeia leve é mostrada em SEQ ID NO: 48 e a sequência de nucleotídeo que codifica essa sequência de aminoácido é mostrada em SEQ ID NO: 47.
[000255] Na presente invenção, a “atividade equivalente àquela do anticorpo de qualquer um de (1) a (6)” significa que a atividade de ligação e/ou neutralização de NR10 (por exemplo, NR10 humana) é equivalente. Na presente invenção, o termo “equivalente” significa que a atividade não é necessariamente a mesma, mas pode ser intensificada ou reduzida, na medida em que a atividade seja retida. Anticorpos com uma atividade reduzida incluem, por exemplo, anticorpos tendo uma atividade que é 30% ou mais, de preferência 50% ou mais e, mais preferivelmente, 80% ou mais daquela do anticorpo original.
[000256] Os anticorpos de qualquer um de (1) a (6) mencionados acima podem ter uma substituição, deleção, adição e/ou inserção de um ou mais aminoácidos na sequência de aminoácido das regiões variáveis (sequências de CDR e/ou sequências de FR), na medida em que a atividade de ligação e/ou neutralização de NR10 seja retida. Métodos bem-conhecidos por aqueles versados no campo para preparar uma sequência de aminoácido de um anticorpo que tenha uma substituição, deleção, adição e/ou inserção de um ou mais aminoácidos na sequência de aminoácido e retém a atividade de ligação e/ou neutralização de NR10 incluem métodos para introdução de mutações em proteínas. Por exemplo, aqueles versados no campo podem preparar mutantes funcionalmente equivalentes ao anticorpo tendo atividade de ligação e/ou neutralização de NR10 por meio de introdução de mutações apropriadas na sequência de aminoácido do anticorpo tendo atividade de ligação e/ou neutralização de NR10 usando mutagênese sítio-dirigida (Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y e Na- kagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275, Zoller, MJ e Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW, Kramer, B, Pflugfelder, M e Fritz, HJ (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W e Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492) ou semelhante. Assim, anticorpos que contêm uma ou mais mutações de aminoácido nas regiões variáveis e têm atividade de ligação e/ou neutralização de NR10 são também incluídos no anticorpo da presente invenção.
[000257] Quando um resíduo de aminoácido é alterado, de preferência, o aminoácido sofre mutação para (um) aminoácido(s) diferente(s) que conserva as propriedades da cadeia lateral de aminoácido. Exemplos de propriedades de cadeia lateral de aminoácido são: aminoáci- dos hidrofóbicos (A, I, L, M, F, P, W, Y e V), aminoácidos hidrofílicos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S e T), aminoácidos contendo cadeias laterais alifáticas (G, A, V, L, I e P), aminoácidos contendo cadeias laterais contendo grupo hidroxila (S, T e Y), aminoácidos contendo cadeias laterais contendo enxofre (C e M), aminoácidos contendo cadeias laterais contendo ácido carboxílico e amida (D, N, E e Q), aminoácidos contendo cadeias laterais básicas (R, K e H) e aminoácidos contendo cadeias laterais aromáticas (H, F, Y e W) (aminoácidos são representados pelos códigos de uma letra entre parênteses). Substituições de aminoácido dentro de cada grupo são denominadas substituições con- servativas. Já se sabe que um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácido modificada na qual um ou mais resíduos de aminoácido em uma determinada sequência de aminoácido são deletados, adicionados e/ou substituídos por outros aminoácidos pode reter a atividade biológica original (Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA; (1984) 81: 5662-6; Zoller, M. J. e Smith, M., Nucleic Acids Res. (1982) 10: 6487-500; Wang, A. et al., Science (1984) 224: 1431-3; Dalbadie- McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79: 6409-13). Tais mutantes têm uma identidade de aminoácido de pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%, ainda mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% e, mais preferivelmente, pelo menos 95%, com as regiões variáveis (por exemplo, sequências de CDR, sequências de FR ou regiões variáveis inteiras) da presente invenção. Aqui, a identidade de sequência é definida como o percentual de resíduos idênticos àqueles na sequência de aminoácido original da região variável de cadeia pesada ou região variável de cadeia leve, determinada após as sequências serem alinhadas e espaços são apropriadamente introduzidos para maximizar a identidade de sequência, conforme necessário. A identidade de sequências de aminoácido pode ser determinada por meio do método descrito abaixo.
[000258] Alternativamente, as sequências de aminoácido de regiões variáveis que têm a substituição, deleção, adição e/ou inserção de um ou mais aminoácidos na sequência de aminoácido das regiões variá- veis (sequências de CDR e/ou sequências de FR) e retêm a atividade de ligação e/ou neutralização de NR10 podem ser obtidas a partir de ácidos nucleicos que se hibridizam, sob condições estringentes, ao ácido nucleico composto da sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido das regiões variáveis. Condições de hibridi- zação estringentes para isolar um ácido nucleico que se hibridiza, sob condições estringentes, a um ácido nucleico que inclui a sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido das regiões variáveis incluem, por exemplo, as condições de ureia a 6M, SDS a 0,4%, 0,5x SSC e 37°C ou condições de hibridização com estringências equivalentes às mesmas. Com condições mais estringentes, por exemplo, as condições de ureia a 6M, SDS a 0,4%, 0,1x SSC e 42°C, isolamento de ácidos nucleicos com uma homologia muito maior pode ser esperado. As sequências dos ácidos nucleicos isolados pode ser determinada por meio de métodos conhecidos descritos abaixo. A ho- mologia global de sequência de nucleotídeo do ácido nucleico isolado é de pelo menos 50% ou mais de identidade de sequência, de preferência 70% ou maior, mais preferivelmente 90% ou maior (por exemplo, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou maior).
[000259] Ácidos nucleicos que se hibridizam sob condições estrin- gentes a um ácido nucleico composto da sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido das regiões variáveis podem também ser isolados usando, ao invés dos métodos descritos acima utilizando técnicas de hibridização, métodos de amplificação gênica, tal como reação em cadeia de polimerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) usando iniciadoriniciadores sintetizados baseado na informação da sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoá- cido das regiões variáveis.
[000260] Especificamente, a identidade de uma sequência de nucleo- tídeo ou sequência de aminoácido à outra pode ser determinada usan- do o algoritmo BLAST, por Karlin e Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 5873-7). Programas tais como o BLASTN e BLASTX foram desenvolvidos baseado nesse algoritmo (Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215, 403-10). Para analisar sequências de nucleotídeo de acordo com o BLASTN baseado no BLAST, os parâmetros são configurados, por exemplo, como escore = 100 e extensão de palavra = 12. Por outro lado, parâmetros usados para análise de sequências de aminoá- cido pelo BLASTX baseado no BLAST incluem, por exemplo, escore = 50 e extensão de palavra = 3. Os parâmetros de default para cada programa são usados quando se utiliza os programas BLAST e Gapped BLAST. Técnicas específicas para tais análises são conhecidas no campo (veja o website do National Center for Biotechnology Information (NCBI), Basic Local Alignment Search Tool (BLAST); http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
[000261] A presente invenção também proporciona anticorpos que se ligam ao mesmo epitopo que um epitopo ligado pelos anticorpos de qualquer um de (1) a (7).
[000262] Se um anticorpo reconhece o mesmo epitopo conforme aquele reconhecido por outro anticorpo pode ser confirmado pela competição entre os dois anticorpos contra o epitopo. A competição entre os anticorpos pode ser avaliada mediante ensaios de ligação competitiva usando meios tais como ELISA, o método de transferência de energia de fluorescência (FRET) e a tecnologia de ensaio em microvolume fluorométrico (FMAT®). A quantidade de anticorpos ligados a um antígeno se correlaciona indiretamente com a capacidade de ligação de anticorpos competidores candidatos (anticorpos de teste) que se ligam competitivamente ao mesmo epitopo. Em outras palavras, à medida que a quantidade ou a afinidade de anticorpos de teste que se ligam ao mesmo epitopo aumenta, a quantidade de anticorpos ligados ao antígeno diminui e a quantidade de anticorpos de teste liga- dos ao antígeno aumenta. Especificamente, anticorpos apropriadamente rotulados e anticorpos a serem avaliados são simultaneamente adicionados aos antígenos e os anticorpos assim ligados são detectados usando o rótulo. A quantidade de anticorpos ligados ao antígeno pode ser facilmente determinada por meio de rotulação dos anticorpos previamente. Esse rótulo não está particularmente limitado e o método de rotulação é selecionado de acordo com a técnica de ensaio usada. O método de rotulação inclui rotulação fluorescente, radiorrotulação, rotulação enzimática e semelhantes.
[000263] Por exemplo, anticorpos fluorescentemente rotulados e anticorpos não rotulados ou anticorpos de teste são simultaneamente adicionados a células animais expressando NR10 e os anticorpos rotulados são detectados por meio da tecnologia de ensaio em microvolume fluorométrico.
[000264] Aqui, o "anticorpo que reconhece o mesmo epitopo" refere- se a um anticorpo que pode reduzir a ligação do anticorpo rotulado em pelo menos 50% em uma concentração que é usualmente 100 vezes maior, de preferência 80 vezes maior, mais preferivelmente 50 vezes maior, ainda mais preferivelmente 30 vezes maior e, mais preferivelmente, 10 vezes maior do que uma concentração na qual o anticorpo não rotulado reduz a ligação do anticorpo rotulado em 50% (IC50).
[000265] Anticorpos que se ligam ao epitopo ao qual os anticorpos apresentados em qualquer um de (1) a (7) acima se ligam são úteis porque eles têm uma atividade de neutralização particularmente alta.
[000266] Os anticorpos apresentados em qualquer um de (1) a (8) acima são, de preferência, anticorpos humanizados, mas não estão particularmente limitados aos mesmos.
[000267] Além disso, a presente invenção proporciona genes que codificam os anticorpos anti-NR10 de qualquer um de (1) a (8) de (A) a (D) acima. Os genes da presente invenção podem ser qualquer forma de genes, por exemplo, DNAs ou RNAs. Anticorpos (humanizados)
[000268] Modalidades preferidas dos anticorpos da presente invenção incluem anticorpos humanizados que se ligam a NR10. Os anticorpos humanizados podem ser preparados por meio de métodos conhecidos por aqueles versados no campo.
[000269] A região variável de um anticorpo é, tipicamente, composta de três regiões de determinação de complementaridade (CDRs) em sanduíche entre quatro quadros (FRs). As CDRs determinam substancialmente a especificidade de ligação do anticorpo. As sequências de aminoácido de CDRs são altamente diversas. Em contraste, as sequências de aminoácido de FRs frequentemente exibem alta homolo- gia entre anticorpos tendo diferentes especificidades de ligação. Portanto, em geral, é dito que a especificidade de ligação de um anticorpo pode ser transplantada para um anticorpo diferente por meio de enxer- tagem das CDRs.
[000270] Anticorpos humanizados são também referidos como anticorpos humanos reformatados e eles são preparados transferindo as CDRs de um anticorpo derivado de um mamífero não-humano, tal como um camundongo, para as CDRs de um anticorpo humano. Técnicas de recombinação genética geral para seu preparo também são conhecidas (veja Publicação de Pedido de Patente Europeia No. 125023 e WO 96/02576).
[000271] Especificamente, quando as CDRs são derivadas de um anticorpo de camundongo, uma sequência de DNA criada de modo que as CDRs do anticorpo de camundongo sejam ligadas com as regiões de quadro (FRs) do anticorpo humano é sintetizada por meio de PCR usando, como iniciadoriniciadores, vários oligonucleotídeos que têm porções de sobreposição nas extremidades das CDRs e FRs (veja o método descrito no documento WO 98/13388). O DNA resultante é, então, ligado a um DNA que codifica uma região constante de anticorpo humano, inserido em um vetor de expressão e introduzido em um hospedeiro para produzir o anticorpo (veja Publicação de Pedido de Patente Europeia No. EP 239400 e Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WO 96/02576).
[000272] Regiões de quadro de anticorpo humano a serem ligadas com as CDRs são selecionadas de modo que as CDRs formem um sítio de ligação a antígeno favorável. Se necessário, substituição, de- leção, adição e/ou inserção de aminoácido podem ser introduzidas nas regiões de quadro da região variável de anticorpo, de modo que as CDRs do anticorpo humano reformatado formem um sítio de ligação a antígeno apropriado. Por exemplo, mutações podem ser introduzidas na sequência de aminoácido de FR aplicando o método de PCR, o qual é usado para enxertar CDRs de camundongo em FRs humanas. Especificamente, mutações podem ser introduzidas em uma porção das sequências de nucleotídeo de iniciadoriniciadores que se anelam às FRs. As mutações são introduzidas em FRs sintetizadas por tais iniciadoriniciadores. A atividade de ligação a antígeno de anticorpos mutantes tendo substituições de aminoácido pode ser determinada e avaliada por meio do método descrito acima e, desse modo, sequências de FR mutantes tendo propriedades desejadas podem ser selecionadas (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
[000273] Regiões constantes (C) de anticorpos humanos são usadas para aquelas de anticorpos humanizados. Por exemplo, CY1, CY2, CY3, CY4, Cμ, Cδ, Cα1, Cα2 e Cε são usadas para cadeias H; e CK e CÀ são usadas para cadeias L. A sequência de aminoácido de CK é mostrada em SEQ ID NO: 58 e a sequência de nucleotídeo que codifica essa sequência de aminoácido é mostrada em SEQ ID NO: 57. A sequência de aminoácido de CY1 é mostrada em SEQ ID NO: 60 e a sequência de nucleotídeo que codifica essa sequência de aminoácido é mostrada em SEQ ID NO: 59. A sequência de aminoácido de CY2 é mostrada em SEQ ID NO: 62 e a sequência de nucleotídeo que codifica essa sequência de aminoácido é mostrada em SEQ ID NO: 61. A sequência de aminoácido de CY4 é mostrada em SEQ ID NO: 64 e a sequência de nucleotídeo que codifica essa sequência de aminoácido é mostrada em SEQ ID NO: 63. Além disso, regiões C de anticorpo humano podem ser modificadas para aprimorar a estabilidade do anticorpo ou produção do anticorpo. Regiões C modificadas de anticorpo humano incluem, por exemplo, as regiões C descritas aqui abaixo. Anticorpos humanos usados para humanização podem ser de qualquer isotipo, tal como IgG, IgM, IgA, IgE ou IgD; contudo, IgG é, de preferência, usada na presente invenção. IgG que pode ser usada inclui IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e semelhantes.
[000274] Além disso, após um anticorpo humanizado ser preparado, aminoácidos na região variável (por exemplo, CDR e FR) e região constante do anticorpo humanizado podem ser deletados, adicionados, inseridos e/ou substituídos por outros aminoácidos. Os anticorpos da presente invenção também incluem tais anticorpos humanizados com substituições de aminoácido e semelhantes.
[000275] A origem de CDRs de um anticorpo humanizado não está particularmente limitada e pode ser de qualquer animal. Por exemplo, é possível usar as sequências de anticorpos de camundongo, anticorpos de rato, anticorpos de coelho, anticorpo de camelo e semelhantes. Sequências de CDR de anticorpos de camundongo são preferidas.
[000276] Em geral, é difícil humanizar anticorpos ao mesmo tempo em que se retém as atividades de ligação e neutralização dos anticorpos originais. A presente invenção, contudo, obteve sucesso na obtenção de anticorpos humanizados tendo as atividades de ligação e/ou neutralização equivalentes àquelas dos anticorpos de camundongo originais. Anticorpos humanizados são úteis quando administrados a seres humanos para fins terapêuticos porque eles exibem imunogeni- cidade reduzida no corpo humano.
[000277] Exemplos preferidos dos anticorpos humanizados anti- NR10 da presente invenção incluem, por exemplo:
[000278] (a) anticorpos humanizados que compreendem uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 (H0-VH);
[000279] (b) anticorpos humanizados que compreendem uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 112 (H1-VH);
[000280] (c) anticorpos humanizados que compreendem uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52 (L0-VL);
[000281] (d) anticorpos humanizados que compreendem uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 (H0-VH) e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52 (L0-VL); e
[000282] (e) anticorpos humanizados que compreendem uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 112 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
[000283] A região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 (H0-VH), região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 112 e região variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52 (L0-VL) podem ter uma substituição, deleção, adição e/ou inserção de um ou mais aminoácidos. A substituição, deleção, adição e/ou inserção de aminoácidos pode ser feita em uma ou ambas das CDRs e FRs.
[000284] Assim, outras modalidades preferidas do anticorpo anti- NR10 humanizado da presente invenção incluem, por exemplo:
[000285] (f) anticorpos que compreendem uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácido na qual um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 (H0-VH);
[000286] (g) anticorpos que compreendem uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácido na qual um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 112 (H1-VH);
[000287] (h) anticorpos que compreendem uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácido na qual um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52 (L0-VL);
[000288] (i) anticorpos que compreendem uma região variável de ca deia pesada tendo uma sequência de aminoácido na qual um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 (H0-VH) e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácido na qual um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52 (L0-VL);
[000289] (j) anticorpos que compreendem uma região variável de ca deia pesada tendo uma sequência de aminoácido na qual um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 112 (H1-VH) e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácido na qual um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52 (L0- VL);
[000290] Sem particular limitação, os anticorpos de qualquer um de (f) a (j) têm, de preferência, uma atividade similar àquela dos anticor- pos de qualquer um de (a) a (e).
[000291] A substituição, deleção, adição e/ou inserção de aminoáci- dos não estão particularmente limitadas, mas exemplos específicos incluem, por exemplo, as substituições de aminoácido descritas acima.
[000292] Mais especificamente, por exemplo, as seguintes substituições de aminoácido pode ser incluídas:
[000293] Substituição de Ile na posição 3 de CDR1 (SEQ ID NO: 9) na região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 50 ou 112 por Val (SEQ ID NO: 173). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia pesada nas quais a CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 é substituída por uma CDR 1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 173 em uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
[000294] Substituição de Met na posição 4 de CDR1 (SEQ ID NO: 9) na região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 50 ou 112 por Ile (SEQ ID NO: 174). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia pesada nas quais a CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 é substituída por uma CDR 1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 174 em uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
[000295] Substituição de Met na posição 4 de CDR1 (SEQ ID NO: 9) na região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 50 ou 112 por Leu (SEQ ID NO: 175). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia pesada nas quais a CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 é substituída por uma CDR 1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 175 em uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
[000296] Substituição de Ile na posição 3 de CDR1 (SEQ ID NO: 9) na região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 50 ou 112 por Ala (SEQ ID NO: 176). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia pesada nas quais a CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 é substituída por uma CDR 1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 176 em uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
[000297] Substituição de Leu na posição 1 de CDR2 (SEQ ID NO: 10) na região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 50 ou 112 por Glu (SEQ ID NO: 113). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia pesada nas quais a CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 é substituída por uma CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 113 em uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
[000298] Substituição de Asn na posição 3 de CDR2 (SEQ ID NO: 10) na região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 50 ou 112 por Asp (SEQ ID NO: 114). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia pesada nas quais a CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 é substituída por uma CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 114 em uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
[000299] Substituição de Gln na posição 13 de CDR2 (SEQ ID NO: 10) na região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 50 ou 112 por Asp (SEQ ID NO: 115). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia pesada nas quais a CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 é substituída por uma CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 115 em uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
[000300] Substituição de Lys na posição 14 de CDR2 (SEQ ID NO: 10) na região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 50 ou 112 por Gln (SEQ ID NO: 116). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia pesada nas quais a CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 é substituída por uma CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 116 em uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
[000301] Substituição de Lys na posição 16 de CDR2 (SEQ ID NO: 10) na região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 50 ou 112 por Gln (SEQ ID NO: 117). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia pesada nas quais a CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 é substituída por uma CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 117 em uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
[000302] Substituição de Gly na posição 17 de CDR2 (SEQ ID NO: 10) na região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 50 ou 112 por Asp (SEQ ID NO: 118). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia pesada nas quais a CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 é substituída por uma CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 118 em uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
[000303] Substituição de Lys na posição 16 e Gly na posição 17 de CDR2 (SEQ ID NO: 10) na região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 50 ou 112 por Gln e Asp, respectivamente (SEQ ID NO: 119). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia pesada nas quais a CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 é substituída por uma CDR2 tendo a sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 167 em uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
[000304] Substituição de Lys na posição 14, Lys na posição 16 e Gly na posição 17 de CDR2 (SEQ ID NO: 10) na região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 50 ou 112 por Gln, Gln e Asp, respectivamente (SEQ ID NO: 167). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia pesada nas quais a CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 é substituída por uma CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 171 em uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
[000305] Substituição de Gln na posição 13, Lys na posição 14, Lys na posição 16 e Gly na posição 17 de CDR2 (SEQ ID NO: 10) na região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 50 ou 112 por Asp, Gln, Gln e Asp, respectivamente (SEQ ID NO: 172). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia pesada nas quais a CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 é substituída por uma CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 172 em uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
[000306] Substituição de Ser na posição 10 de CDR2 (SEQ ID NO: 10) na região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 50 ou 112 por Asp (SEQ ID NO: 177). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia pesada nas quais a CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 é substituída por uma CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 177 em uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
[000307] Substituição de Gln na posição 13 de CDR2 (SEQ ID NO: 10) na região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 50 ou 112 por Pro (SEQ ID NO: 178). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia pesada nas quais a CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 é substituída por uma CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 178 em uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
[000308] Substituição de Tyr na posição 3 de CDR3 (SEQ ID NO: 11) na região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 50 ou 112 por Leu (SEQ ID NO: 179). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia pesada nas quais a CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 é substituída por uma CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 179 em uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
[000309] Substituição de Met na posição 10 de CDR3 (SEQ ID NO: 11) na região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 50 ou 112 por Leu (SEQ ID NO: 180). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia pesada nas quais a CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 é substituída por uma CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 180 em uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
[000310] Substituição de Asp na posição 11 de CDR3 (SEQ ID NO: 11) na região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 50 ou 112 por Glu (SEQ ID NO: 181). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia pesada nas quais a CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 é substituída por uma CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 181 em uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
[000311] Substituição de Tyr na posição 12 de CDR3 (SEQ ID NO: 11) na região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 50 ou 112 por Thr (SEQ ID NO: 182). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia pesada nas quais a CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 é substituída por uma CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 182 em uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
[000312] Substituição de Tyr na posição 12 de CDR3 (SEQ ID NO: 11) na região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 50 ou 112 por Ser (SEQ ID NO: 183). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia pesada nas quais a CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 é substituída por uma CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 183 em uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
[000313] Substituição de Met na posição 10, Asp na posição 11 e Tyr na posição 12 de CDR3 (SEQ ID NO: 11) na região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 50 ou 112 por Leu, Glu, Thr, respectivamente (SEQ ID NO: 184). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia pesada nas quais a CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 é substituída por uma CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 184 em uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
[000314] Substituição de Asp na posição 11 e Tyr na posição 12 de CDR3 (SEQ ID NO: 11) na região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 50 ou 112 por Glu e Thr, respectivamente (SEQ ID NO: 185). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia pesada nas quais a CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 é substituída por uma CDR3 tendo a sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 185 em uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
[000315] Substituição de Tyr na posição 3, Asp na posição 11 e Tyr na posição 12 de CDR3 (SEQ ID NO: 11) na região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 50 ou 112 por Leu, Glu e Thr, respectivamente (SEQ ID NO: 186). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia pesada nas quais a CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 é substituída por uma CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 186 em uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
[000316] Substituição de Tyr na posição 3, Asp na posição 11 e Tyr na posição 12 de CDR3 (SEQ ID NO: 11) na região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 50 ou 112 por Leu, Glu e Ser, respectivamente (SEQ ID NO: 187). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia pesada nas quais a CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 é substituída por uma CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 187 em uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
[000317] Substituição de Arg na posição 1 de CDR1 (SEQ ID NO: 13) na região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 52 por Gln (SEQ ID NO: 121). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia leve nas quais a CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 é substituída por uma CDR 1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 121 em uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
[000318] Substituição de Asn na posição 5 de CDR1 (SEQ ID NO: 13) na região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 52 por Asp (SEQ ID NO: 122). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia leve nas quais a CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 é substituída por uma CDR 1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 122 em uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
[000319] Substituição de Ser na posição 8 de CDR1 (SEQ ID NO: 13) na região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 52 por Arg (SEQ ID NO: 188). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia leve nas quais a CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 é substituída por uma CDR 1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 188 em uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
[000320] Substituição de Leu na posição 10 de CDR1 (SEQ ID NO: 13) da região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 52 por Val (SEQ ID NO: 189). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia leve nas quais a CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 é substituída por uma CDR 1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 189 em uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
[000321] Substituição de Ser na posição 8 e Leu na posição 10 de CDR1 (SEQ ID NO: 13) da região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 52 por Arg e Val, respectivamente (SEQ ID NO: 190). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia leve nas quais a CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 é substituída por uma CDR 1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 190 em uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
[000322] Substituição de Thr na posição 2 de CDR1 (SEQ ID NO: 13) na região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 52 por Ala (SEQ ID NO: 191). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia leve nas quais a CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 é substituída por uma CDR 1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 191 em uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
[000323] Substituição de Thr na posição 2 de CDR1 (SEQ ID NO: 13) na região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 52 por Ser (SEQ ID NO: 192). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia leve nas quais a CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 é substituída por uma CDR 1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 192 em uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
[000324] Substituição de Asn na posição 1 de CDR2 (SEQ ID NO: 14) na região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 52 por Asp (SEQ ID NO: 123). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia leve nas quais a CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 é substituída por uma CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 123 em uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
[000325] Substituição de Lys na posição 3 de CDR2 (SEQ ID NO: 14) na região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 52 por Gln (SEQ ID NO: 124). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia leve nas quais a CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 é substituída por uma CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 124 em uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
[000326] Substituição de Leu na posição 5 de CDR2 (SEQ ID NO: 14) na região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 52 por Glu (SEQ ID NO: 125). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia leve nas quais a CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 é substituída por uma CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 125 em uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
[000327] Substituição de Lys na posição 7 de CDR2 (SEQ ID NO: 14) na região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 52 por Gln (SEQ ID NO: 126). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia leve nas quais a CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 é substituída por uma CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 126 em uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
[000328] Substituição de Lys na posição 7 de CDR2 (SEQ ID NO: 14) na região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 52 por Asp (SEQ ID NO: 127). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia leve nas quais a CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 é substituída por uma CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 127 em uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
[000329] Substituição de Arg na posição 1 e Asn na posição 5 de CDR1 (SEQ ID NO: 13) na região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 52 por Gln e Asp, respectivamente (SEQ ID NO: 169). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia leve nas quais a CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 é substituída por uma CDR 1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 169 em uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
[000330] Substituição de Lys na posição 3, Leu na posição 5 e Lys na posição 7 de CDR2 (SEQ ID NO: 14) na região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 52 por Gln, Glu e Gln, respectivamente (SEQ ID NO: 170). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia leve nas quais a CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 é substituída por uma CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 170 em uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
[000331] Substituição de Glu na posição 5 de CDR3 (SEQ ID NO: 15) na região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 52 por Asp (SEQ ID NO: 193). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia leve nas quais a CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15 é substituída por uma CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 193 em uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
[000332] Substituição de Ser na posição 6 de CDR3 (SEQ ID NO: 15) na região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 52 por Asp (SEQ ID NO: 194). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia leve nas quais a CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15 é substituída por uma CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 194 em uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
[000333] Substituição de Thr na posição 9 de CDR3 (SEQ ID NO: 15) na região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 52 por Phe (SEQ ID NO: 195). Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia leve nas quais a CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15 é substituída por uma CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 195 em uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
[000334] Além disso, as outras substituições que não aquelas descritas acima incluem a substituição de Arg na posição 3 da FR2 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 97 por outro aminoácido. O aminoácido após substituição não está particularmente limitado; mas exemplos preferidos do mesmo incluem Gln. Quando Arg na posição 3 em SEQ ID NO: 97 foi substituída por Gln, Ala na posição 5 pode ser substituída por Ser para produzir uma sequência de FR2 humana. A sequência de aminoácido na qual Arg e Ala nas posições 3 e 5 na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 97 foram substituídas por Gln e Ser, respectivamente, é mostrada em SEQ ID NO: 120, Assim, a presente invenção proporciona regiões variáveis de cadeia pesada nas quais FR2 tendo a sequência de amino- ácido de SEQ ID NO: 97 é substituída por uma FR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 120 em uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
[000335] Cada uma das substituições de aminoácido descritas acima pode ser usada isoladamente ou em combinação com outras substituições de aminoácido descritas acima. Elas também podem ser combinadas com outras substituições de aminoácido que não aquelas des-critas acima.
[000336] Exemplos específicos dos anticorpos nos quais as substituições descritas acima foram realizadas incluem, por exemplo, anticorpos que compreendem uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 167, anticorpos que compreendem uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 168 e anticorpos que compreendem uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 167 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 168.
[000337] Além disso, exemplos específicos das regiões variáveis de cadeia pesada nas quais as substituições descritas acima foram realizadas incluem, por exemplo, as regiões variáveis de cadeia pesada a seguir:
[000338] (1) regiões variáveis de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 204 (H17);
[000339] (2) regiões variáveis de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 205 (H19);
[000340] (3) regiões variáveis de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 206 (H28);
[000341] (4) regiões variáveis de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 207 (H30);
[000342] (5) regiões variáveis de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 208 (H34);
[000343] (6) regiões variáveis de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 209 (H42);
[000344] (7) regiões variáveis de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 210 (H44);
[000345] (8) regiões variáveis de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 211 (H46);
[000346] (9) regiões variáveis de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 212 (H57);
[000347] (10) regiões variáveis de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 213 (H71);
[000348] (11) regiões variáveis de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 214 (H78);
[000349] (12) regiões variáveis de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 215 (H92);
[000350] (13) regiões variáveis de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 216 (H97); e
[000351] (14) regiões variáveis de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 217 (H98).
[000352] Enquanto isso, exemplos específicos das regiões variáveis de cadeia leve nas quais as substituições descritas acima são realizadas incluem, por exemplo, as regiões variáveis de cadeia leve a seguir:
[000353] (15) regiões variáveis de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 218 (L11);
[000354] (16) regiões variáveis de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 219 (L12);
[000355] (17) regiões variáveis de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 220 (L17); e
[000356] (18) regiões variáveis de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 221 (L50).
[000357] Além disso, exemplos específicos dos anticorpos compreendendo as regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve descritas acima incluem, por exemplo, os anticorpos a seguir:
[000358] (19) anticorpos que compreendem região variável de cadeia pesada de (3) e a região variável de cadeia leve de (17) (H28L17);
[000359] (20) anticorpos que compreendem região variável de cadeia pesada de (4) e a região variável de cadeia leve de (17) (H30L17);
[000360] (21) anticorpos que compreendem região variável de cadeia pesada de (5) e a região variável de cadeia leve de (17) (H34L17);
[000361] (22) anticorpos que compreendem região variável de cadeia pesada de (6) e a região variável de cadeia leve de (17) (H42L17);
[000362] (23) anticorpos que compreendem região variável de cadeia pesada de (7) e a região variável de cadeia leve de (17) (H44L17);
[000363] (24) anticorpos que compreendem região variável de cadeia pesada de (8) e a região variável de cadeia leve de (17) (H46L17);
[000364] (25) anticorpos que compreendem região variável de cadeia pesada de (9) e a região variável de cadeia leve de (17) (H57L17);
[000365] (26) anticorpos que compreendem região variável de cadeia pesada de (10) e a região variável de cadeia leve de (17) (H71L17);
[000366] (27) anticorpos que compreendem região variável de cadeia pesada de (11) e a região variável de cadeia leve de (17) (H78L17);
[000367] (28) anticorpos que compreendem região variável de cadeia pesada de (12) e a região variável de cadeia leve de (17) (H92L17);
[000368] (29) anticorpos que compreendem região variável de cadeia pesada de (13) e a região variável de cadeia leve de (18) (H97L50); e
[000369] (30) anticorpos que compreendem região variável de cadeia pesada de (14) e a região variável de cadeia leve de (18) (H98L50).
[000370] A região constante usada para os anticorpos humanizados da presente invenção pode ser qualquer região constante derivada de um anticorpo humano. Exemplos preferidos de tais regiões constantes derivadas de anticorpos humanos incluem, por exemplo, regiões constantes derivadas de IgG1 ou IgG2. Além disso, regiões constantes nas quais um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos na região constante derivada de um anticorpo hu- mano podem também ser usadas.
[000371] As regiões constantes nas quais um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos na região constante derivada de um anticorpo humano não estão particularmente limitadas e incluem, por exemplo, as regiões constantes a seguir:
[000372] regiões constantes tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 128 (M58)
[000373] regiões constantes tendo SEQ ID NO: 129 (M14); e
[000374] regiões constantes tendo SEQ ID NO: 62 (SKSC).
[000375] Exemplos específicos da do as regiões constantes descritas acima incluem, por exemplo:
[000376] (1) cadeias pesadas que compreendem uma região variável tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 167 e a região constante tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 128;
[000377] (2) cadeias pesadas nas quais a CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 171 nas cadeias pesadas de (1) é substituída por uma CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 172;
[000378] (3) anticorpos que compreendem a cadeia pesada de (1) e uma cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 152; e
[000379] (4) anticorpos que compreendem a cadeia pesada de (2) e uma cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 152.
[000380] Mais exemplos específicos dos anticorpos anti-NR10 humanizados da presente invenção incluem, por exemplo, os anticorpos a seguir:
[000381] (k) anticorpos que compreendem uma cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 54 (H0-VH + região constante);
[000382] (l) anticorpos que compreendem uma cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 130 (H1-VH + região constante);
[000383] (m) anticorpos que compreendem uma cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 56 (L0-VL + região constante);
[000384] (n) anticorpos que compreendem uma cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 54 (H0-VH + região constante) e uma cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 56 (L0-VL + região constante); e
[000385] (o) anticorpos que compreendem uma cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 130 (H1-VH + região constante) e uma cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 56 (L0-VL + região constante).
[000386] A cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 54 (H0-VH + região constante) e a cadeia leve tendo a sequên- cia de aminoácido de SEQ ID NO: 56 (L0-VL + região constante) podem ter uma substituição, deleção, adição e/ou inserção de um ou mais aminoácidos. A substituição, deleção, adição e/ou inserção de aminoácidos pode ser realizada em uma ou ambas das regiões variáveis e constantes.
[000387] Assim, a presente invenção proporciona:
[000388] (p) anticorpos que compreendem uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácido na qual um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 54 (H0-VH + região constante);
[000389] (q) anticorpos que compreendem uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácido na qual um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 130 (H1-VH + região constante);
[000390] (r) anticorpos que compreendem uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácido na qual um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 56 (L0-VL + região constante);
[000391] (s) anticorpos que compreendem uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácido na qual um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 54 (H0-VH + região constante) e uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácido na qual um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 56 (L0-VL + região constante); e
[000392] (t) anticorpos que compreendem uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácido na qual um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 130 (H1-VH + região constante) e uma ca- deia leve tendo uma sequência de aminoácido na qual um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 56 (L0-VL + região constante).
[000393] Sem limitação particular, os anticorpos de qualquer um de (p) a (t) têm, de preferência, uma atividade similar àquela dos anticorpos de qualquer um de (k) a (o).
[000394] A substituição, deleção, adição e/ou inserção de aminoáci- dos não estão particularmente limitadas, mas exemplos específicos das mesmas incluem, por exemplo, as substituições de aminoácido descritas acima.
[000395] Além disso, a sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada humanizada descrita acima (SEQ ID NO: 50) é mostrada em SEQ ID NO: 49. A sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve humanizada (SEQ ID NO: 52) é mostrada em SEQ ID NO: 51. A sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido da cadeia pesada humanizada (SEQ ID NO: 54) é mostrada em SEQ ID NO: 53. A sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido da cadeia leve humanizada (SEQ ID NO: 56) é mostrada em SEQ ID NO: 55.
[000396] Além disso, a presente invenção proporciona anticorpos que reconhecem o mesmo epitopo conforme reconhecido pelos anticorpos de qualquer um de (a) a (t) acima. A ligação ao mesmo epitopo é conforme já descrito acima.
[000397] Além disso, a presente invenção proporciona os anticorpos a seguir:
[000398] (u) anticorpos que compreendem uma cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 151;
[000399] (v) anticorpos que compreendem uma cadeia leve compre- endendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 152; e
[000400] (w) anticorpos que compreendem a cadeia pesada de (u) e a cadeia leve de (v).
[000401] Além disso, a presente invenção proporciona as cadeias pesadas e leves e anticorpos a seguir:
[000402] (1) cadeias pesadas tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 222 (H17);
[000403] (2) cadeias pesadas tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 223 (H19);
[000404] (3) cadeias pesadas tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 224 (H28);
[000405] (4) cadeias pesadas tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 225 (H30);
[000406] (5) cadeias pesadas tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 226 (H34);
[000407] (6) cadeias pesadas tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 227 (H42);
[000408] (7) cadeias pesadas tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 228 (H44);
[000409] (8) cadeias pesadas tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 229 (H46);
[000410] (9) cadeias pesadas tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 230 (H57);
[000411] (10) cadeias pesadas tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 231 (H71);
[000412] (11) cadeias pesadas tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 232 (H78);
[000413] (12) cadeias pesadas tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 233 (H92);
[000414] (13) cadeias pesadas tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 234 (H97);
[000415] (14) cadeias pesadas tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 235 (H98);
[000416] (15) cadeias leves tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 236 (L11)
[000417] (16) cadeias leves tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 237 (L12);
[000418] (17) cadeias leves tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 238 (L17);
[000419] (18) cadeias leves tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 239 (L50);
[000420] (19) anticorpos que compreendem a cadeia pesada de (3) e a cadeia leve de (17) (H28L17);
[000421] (20) anticorpos que compreendem a cadeia pesada de (4) e a cadeia leve de (17) (H30L17);
[000422] (21) anticorpos que compreendem a cadeia pesada de (5) e a cadeia leve de (17) (H34L17);
[000423] (22) anticorpos que compreendem a cadeia pesada de (6) e a cadeia leve de (17) (H42L17);
[000424] (23) anticorpos que compreendem a cadeia pesada de (7) e a cadeia leve de (17) (H44L17);
[000425] (24) anticorpos que compreendem a cadeia pesada de (8) e a cadeia leve de (17) (H46L17);
[000426] (25) anticorpos que compreendem a cadeia pesada de (9) e a cadeia leve de (17) (H57L17);
[000427] (26) anticorpos que compreendem a cadeia pesada de (10) e a cadeia leve de (17) (H71L17);
[000428] (27) anticorpos que compreendem a cadeia pesada de (11) e a cadeia leve de (17) (H78L17);
[000429] (28) anticorpos que compreendem a cadeia pesada de (12) e a cadeia leve de (17) (H92L17);
[000430] (29) anticorpos que compreendem a cadeia pesada de (13) e a cadeia leve de (18) (H97L50);
[000431] (30) anticorpos que compreendem a cadeia pesada de (14) e a cadeia leve de (18) (H98L50);
[000432] (31) cadeias pesadas tendo uma sequência de aminoácido na qual um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos nas cadeias pesadas de qualquer um de (1) a (14);
[000433] (32) cadeias leves tendo uma sequência de aminoácido na qual um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos nas cadeias leves de qualquer um de (15) a (18);
[000434] (33) anticorpos tendo uma sequência de aminoácido na qual um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos nos anticorpos de qualquer um de (19) a (30); e
[000435] (34) anticorpos que reconhecem o mesmo epitopo confor me reconhecido pelos anticorpos de qualquer um de (19) a (33).
[000436] A substituição, deleção, adição e/ou inserção de aminoáci- dos são conforme descritos acima. Anticorpos que reconhecem o mesmo epitopo conforme reconhecido por um anticorpo são também descritos acima.
[000437] A presente invenção também proporciona genes que codificam as regiões variáveis, cadeias pesadas, cadeias leves ou anticorpos da presente invenção.
[000438] A presente invenção também proporciona vetores trazendo os genes descritos acima.
[000439] A presente invenção também proporciona células hospedeiras transformadas com os vetores descritos acima.
[000440] A presente invenção também refere-se a métodos para produção de regiões variáveis, cadeias pesadas, cadeias leves ou an- ticorpos da presente invenção, os quais compreendem a etapa de cultura das células hospedeiras descritas acima.
[000441] Os vetores, células hospedeiras e cultura de células hospedeiras são descritos aqui abaixo. Anticorpos que reconhecem domínios
[000442] Modalidades preferidas do anticorpo anti-NR10 da presente invenção incluem anticorpos que reconhecem o domínio 1 ou domínio 2. Na presente invenção, domínio 1 refere-se à região de aminoácidos nas posições 21 a 120 (LPAKP a LENIA) na sequência de aminoácido da NR10 humana de SEQ ID NO: 76, onde a numeração de aminoáci- do é baseada na sequência incluindo o peptídeo sinalizador. Além disso, na presente invenção, domínio 2 refere-se à região de aminoácidos nas posições 121 a 227 (KTEPP a EEEAP) na sequência de aminoá- cido da NR10 humana de SEQ ID NO: 76, onde a numeração de ami- noácido é baseada na sequência incluindo o peptídeo sinalizador.
[000443] Tais anticorpos não estão particularmente limitados; contudo, em geral, eles têm uma atividade de neutralização e, de preferência, são anticorpos humanizados.
[000444] Exemplos dos anticorpos preferidos na presente invenção incluem anticorpos que reconhecem o domínio 1. Os anticorpos que reconhecem o domínio 1 têm uma forte atividade de neutralização e, assim, são particularmente úteis como produtos farmacêuticos. Anticorpos (atividade de neutralização)
[000445] A presente invenção também proporciona anticorpos anti- NR10 tendo uma atividade de neutralização.
[000446] Na presente invenção, a atividade de neutralização contra NR10 refere-se à atividade de inibição da ligação entre NR10 e seu ligante IL-31 e, de preferência, uma atividade de supressão de atividade biológica baseada em NR10.
[000447] Anticorpos tendo atividade de neutralização de NR10 po- dem ser selecionados, por exemplo, adicionando anticorpos candidatos a uma linhagem de célula dependente de IL e observando seu efeito de supressão de crescimento sobre a linhagem de célula. Nesse método, anticorpos que suprimem o crescimento da linhagem de células dependente de IL-31 são determinados como anticorpos tendo uma atividade de neutralização contra NR10. Anticorpos (geral)
[000448] Os anticorpos da presente invenção não estão limitados em termos de sua origem e podem ser derivados de quaisquer animais, tais como seres humanos, camundongos e ratos. Além disso, os anticorpos podem ser anticorpos recombinantes, tais como anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados. Conforme descrito acima, os anticorpos preferidos da presente invenção incluem anticorpos humanizados.
[000449] Os anticorpos quiméricos contêm, por exemplo, as regiões constantes de cadeias pesada e leve de um anticorpo humano e as regiões variáveis de cadeias pesada e leve de um anticorpo de um mamífero não-humano, tal como camundongo. Os anticorpos quiméricos podem ser produzidos por meio de métodos conhecidos. Por exemplo, os anticorpos podem ser produzidos através de clonagem de um gene de anticorpo obtido de hibridomas, inserção do mesmo em um vetor apropriado e introdução do construto em hospedeiros (veja, por exemplo, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Publicado no Reino Unido pela MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). Especificamente, cDNAs das regiões variáveis (regiões V) do anticorpo são sintetizados a partir do mRNA de hibridomas usando transcriptase reversa. Uma vez DNAs que codificam as regiões V de um anticorpo de interesse são obtidos, esses são ligados com DNAs que codificam as regiões constantes (regiões C) de um anticorpo humano desejado. Os construtos resultantes são inseridos em vetores de expressão. Alternativamente, os DNAs que codificam as regiões V do anticorpo podem ser inseridos em vetores de expressão compreendendo DNAs que codificam as regiões C de um anticorpo humano. Os DNAs são inseridos em vetores de expressão de modo que eles são expressos sob a regulação de regiões regulatórias de expressão, por exemplo, intensificadores e promotores. Na próxima etapa, células hospedeiras podem ser transformadas com os vetores de expressão para permitir expressão de anticorpos quiméricos.
[000450] Métodos para obtenção de anticorpos humanos são também conhecidos. Por exemplo, anticorpos humanos desejados com atividade de ligação a antígeno podem ser obtidos através de (1) sensibilização de linfócitos humanos com antígenos de interesse ou células expressando antígenos de interesse in vitro; e (2) fusão dos linfóci- tos sensibilizados com células de mieloma humano, tal como U266 (veja Publicação de Pedido de Patente Japonesa Kokoku No. (JP-B) H01-59878 (pedido de patente Japonesa examinada, aprovado, publicado para oposição)). Alternativamente, o anticorpo humano desejado pode também ser obtido através de imunização de um animal transgê- nico tendo um repertório inteiro de genes de anticorpo humano com um antígeno desejado (veja Publicações de Pedido de Patente Nos. WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 e WO 96/33735).
[000451] Além disso, técnicas para obter anticorpos humanos por meio de panning com uma biblioteca de fago de anticorpo humano são conhecidas. Por exemplo, a região variável de um anticorpo humano é expressa como um anticorpo com uma única cadeia (scFv) sobre a superfície de um fago, usando um método de exibição de fago e fagos que se ligam ao antígeno podem ser selecionados. Analisando os genes dos fagos selecionados, as sequências de DNA que codificam as regiões variáveis de anticorpos humanos que se ligam ao antígeno podem ser determinadas. Se as sequências de DNA de scFvs que se ligam ao antígeno são identificadas, vetores de expressão apropriados compreendendo essas sequências podem ser construídos para obter anticorpos humanos. Tais métodos são bem-conhecidos. Referência pode ser feita aos documentos WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388 e semelhantes.
[000452] Os anticorpos da presente invenção incluem não apenas anticorpos divalentes, conforme representado por IgG, mas também anticorpos monovalentes, anticorpos multivalentes conforme representado por IgM e anticorpos biespecíficos capazes de ligação a diferentes antígenos, na medida em que eles tenham uma atividade de ligação e/ou atividade de neutralização de NR10. Os anticorpos multivalentes da presente invenção incluem anticorpos multivalentes nos quais os sítios de ligação a antígeno são todos idênticos e anticorpos multivalentes nos quais alguns ou todos os sítios de ligação a antígeno são diferentes. Os anticorpos da presente invenção não estão limitados a moléculas de anticorpo de comprimento total, mas também podem ser anticorpos de baixo peso molecular ou produtos modificados dos mesmos, na medida em que eles se liguem à proteína NR10.
[000453] Alternativamente, os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos de baixo peso molecular. Tais anticorpos de baixo peso molecular são anticorpos incluindo fragmentos de anticorpo carecendo de algumas porções de um anticorpo inteiro (por exemplo, IgG inteira) e não estão particularmente limitados, na medida em que eles retenham a atividade de ligação e/ou neutralização de NR10. Na presente invenção, os anticorpos de baixo peso molecular não estão particularmente limitados, na medida em que eles contenham uma porção de anticorpos inteiros. Os anticorpos de baixo peso molecular contêm, de preferência, uma região variável de cadeia pesada (VH) ou região variável de cadeia leve (VL). Anticorpos de baixo peso molecular parti-cularmente preferidos contêm VH e VL. Além disso, exemplos preferidos dos anticorpos de baixo peso molecular da presente invenção incluem anticorpos de baixo peso molecular contendo CDRs de um anticorpo. As CDRs contidas nos anticorpos de baixo peso molecular podem incluir algumas ou todas as seis CDRs de um anticorpo.
[000454] Os anticorpos de baixo peso molecular da presente invenção têm, de preferência, um peso molecular menor do que aquele de anticorpos inteiros. Contudo, os anticorpos de baixo peso molecular podem formar multímeros, por exemplo, dímeros, trímeros ou tetrâme- ros e, assim, seus pesos moleculares podem ser maiores do que aqueles de anticorpos inteiros.
[000455] Exemplos específicos dos fragmentos de anticorpo incluem, por exemplo, Fab, Fab’, F(ab’)2 e Fv. Entretanto, exemplos específicos dos anticorpos de baixo peso molecular incluem, por exemplo, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, scFv (Fv com uma única cadeia), diacorpos e sc(Fv)2 ((Fv)2 com uma única cadeia). Multímeros (por exemplo, dí- meros, trímeros, tetrâmeros e polímeros) desses anticorpos são também incluídos nos anticorpos de baixo peso molecular da presente invenção.
[000456] Fragmentos de anticorpo podem ser obtidos, por exemplo, através de tratamento de anticorpos com enzimas para produzir fragmentos de anticorpo. Enzimas conhecidas por gerar fragmentos de anticorpo incluem, por exemplo, papaína, pepsina e plasmina. Alternativamente, um gene que codifica tal fragmento de anticorpo pode ser construído, introduzido em um vetor de expressão e expresso em células hospedeiras apropriadas (veja, por exemplo, Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994)152, 2968-2976; Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989)178, 476-496; Plueckthun, A. & Skerra, A. Meth ods in Enzymology (1989)178, 476-496; Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989)121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods in Enzy- mology(1989)121, 663-669; Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991)9, 132137).
[000457] Enzimas digestivas clivam um sítio específico de um fragmento de anticorpo, proporcionando fragmentos de anticorpo de estruturas específicas mostradas abaixo. Técnicas de engenharia genética podem ser aplicadas a tais fragmentos de anticorpo enzimaticamente obtidos para deletar uma porção arbitrária do anticorpo.
[000458] Fragmentos de anticorpo obtidos usando as enzimas digestivas descritas acima são como segue: Digestão com papaína: F(ab)2 ou Fab Digestão com pepsina: F(ab’)2 ou Fab’ Digestão com plasmina: Facb
[000459] Os anticorpos de baixo peso molecular da presente invenção incluem fragmentos de anticorpo carecendo de uma região arbitrária, na medida em que eles tenham atividade de ligação e/ou atividade de neutralização de NR10.
[000460] “Diacorpo” refere-se a um fragmento de anticorpo bivalente construído através de fusão gênica (Holliger P et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993); EP 404.097; WO 93/11161, etc). Dia- corpos são dímeros compostos de duas cadeias polipeptídicas. Em cada uma das cadeias polipeptídicas que forma um dímero, uma VL e uma VH são usualmente ligadas por meio de um ligante na mesma cadeia. Em geral, o ligante em um diacorpo é curto o bastante para que a VL e VH não possam se ligar uma à outra. Especificamente, o número de resíduos de aminoácido que constituem o ligante é, por exemplo, cerca de cinco resíduos. Assim, a VL e VH codificadas sobre o mesmo polipeptídeo não podem formar um fragmento de região variável com uma única cadeia e formarão um dímero com outro frag- mento de região variável com uma única cadeia. Como um resultado, o diacorpo tem dois sítios de ligação a antígeno.
[000461] Anticorpos de scFv são polipeptídeos com uma única cadeia produzidos através de ligação de uma região variável de cadeia pesada ([VH]) e uma região variável de cadeia leve ([VL]) via um ligan- te ou semelhante (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883; Pluckthun “The Pharmacology of Monoclonal Antibodies” Vol. 113, eds., Resenburg e Moore, Springer Verlag, New York, páginas 269-315, (1994)). A região V de cadeia H e a região V de cadeia L do scFv podem ser derivadas de qualquer anticorpo descrito aqui. O ligante peptídico para ligação das regiões V não está particularmente limitado. Por exemplo, um peptídeo com uma única cadeia arbitrário contendo cerca de três a 25 resíduos pode ser usado como o ligante. Especificamente, é possível usar os ligantes peptídicos ou semelhante descritos abaixo.
[000462] As regiões V de ambas as cadeias podem ser ligadas, por exemplo, através de PCR, conforme descrito acima. Primeiro, entre os DNAs a seguir, um DNA que codifica uma sequência de aminoácido desejada completa ou parcial é usado como um padrão para ligar as regiões V por meio de PCR:
[000463] Sequência de DNA que codifica uma cadeia H ou região V de cadeia H de um anticorpo e
[000464] Sequência de DNA que codifica uma cadeia L ou região V de cadeia L de um anticorpo.
[000465] DNAs que codificam as regiões V de cadeia H e cadeia L são amplificados por meio de PCR usando um par de iniciadoriniciado- res tendo sequências que correspondem àquelas em ambas as extremidades do DNA a ser amplificado. Então, um DNA que codifica a porção de ligante peptídico é preparado. O DNA que codifica ligante pep- tídico pode também ser sintetizado por meio de PCR. Aqui, sequên- cias nucleotídicas que podem ser ligadas aos produtos de amplificação de regiões V sintetizadas separadamente são adicionadas à extremidade 5' dos iniciadoriniciadores a serem usados. Então, PCR é realizada usando cada DNA de [DNA de região V de cadeia H] - [DNA de ligante peptídico] - [DNA de região V de cadeia L] e iniciadoriniciadores de PCR de montagem.
[000466] Os iniciadoriniciadores de PCR de montagem são compostos de uma combinação de um iniciadoriniciador que se anela à extremidade 5' do [DNA de região V de cadeia H] e um iniciadoriniciador que se anela à extremidade 3’ do [DNA de região V de cadeia L]. Em outras palavras, os iniciadoriniciadores de PCR de montagem são um conjunto de iniciadoriniciadores que pode ser usado para amplificar DNA que codifica a sequência de comprimento total do scFv a ser sintetizado. Entretanto, sequências de nucleotídeo que podem ser ligadas aos DNAs de região V foram adicionadas ao [DNA de ligante peptídi- co]. Assim, esses DNAs são ligados juntos e, então, todo o scFv é, por fim, gerado como um produto da amplificação pelos iniciadoriniciado- res de PCR de montagem. Uma vez que os DNAs que codificam scFv são gerados, vetores de expressão trazendo esses DNAs e células recombinantes transformadas com esses vetores de expressão podem ser obtidos por meio de métodos convencionais. Além disso, o scFv pode ser obtido mediante cultura das células recombinantes resultantes para expressar os DNAs que codificam scFv.
[000467] A ordem das regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve a serem ligadas não está particularmente limitada e elas podem estar dispostas em qualquer ordem. Exemplos da disposição são listados abaixo: [VH] ligante [VL] [VL] ligante [VH]
[000468] sc(Fv)2 é um anticorpo de baixo peso molecular com uma única cadeia produzido mediante ligação de duas VHs e duas VLs usando ligantes e semelhantes (Hudson et al., J Immunol. Methods 1999; 231: 177-189). Por exemplo, sc(Fv)2 pode ser produzido por meio de ligação de scFvs via um ligante.
[000469] Anticorpos nos quais duas VHs e duas VLs estão dispostas na ordem VH-VL-VH-VL ([VH] ligante [VL] ligante [VH] ligante [VL]) a partir do N-término do polipeptídeo com uma única cadeia são preferidos. Contudo, a ordem das duas VHs e duas VLs não está limitada à disposição acima e elas podem estar dispostas em qualquer ordem. Exemplos da disposição são listados abaixo: [VL] ligante [VH] ligante [VH] ligante [VL] [VH] ligante [VL] ligante [VL] ligante [VH] [VH] ligante [VH] ligante [VL] ligante [VL] [VL] ligante [VL] ligante [VH] ligante [VH] [VL] ligante [VH] ligante [VL] ligante [VH]
[000470] A sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada ou região variável de cadeia leve em um anticorpo de baixo peso molecular pode conter uma substituição, deleção, adição e/ou inserção. Além disso, a região variável de cadeia pesada e região variável de cadeia leve podem também carecer de algumas porções ou terem a adição de outros polipeptídeos, na medida em que elas tenham a capacidade de ligação a antígeno quando ligadas juntas. Alternativamente, as regiões variáveis podem ser quimerizadas ou humanizadas.
[000471] Na presente invenção, ligantes os quais se ligam às regiões variáveis do anticorpo incluem ligantes peptídicos arbitrários que podem ser introduzidos usando engenharia genética ou ligantes sintéticos, tais como aqueles divulgados em Protein Engineering, 9(3), 299305, 1996.
[000472] Os ligantes preferidos na presente invenção são ligantes peptídicos. Os comprimentos dos ligantes peptídicos não estão particularmente limitados e aqueles versados no campo podem selecionar apropriadamente os comprimentos, dependendo da finalidade. Comprimentos típicos são um a 100 aminoácidos, de preferência 3 a 50 aminoácidos, mais preferivelmente 5 a 30 aminoácidos e, particularmente de preferência, 12 a 18 aminoácidos (por exemplo, 15 aminoá- cidos).
[000473] Sequências de aminoácido de tais ligantes peptídicos incluem, por exemplo: Ser; Gly-Ser; Gly-Gly-Ser; Ser-Gly-Gly; Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 82); Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 83); Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 84); Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 85); Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 86); Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 87); Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 88); Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 89); (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 84))n; e (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 85))n, onde n é um número inteiro de 1 ou maior.
[000474] A sequência de aminoácido do ligante peptídico pode ser apropriadamente selecionada por aqueles versados no campo, dependendo da finalidade. Por exemplo, o "n" mencionado acima, o qual determina o comprimento do ligante peptídico, é usualmente 1 a 5, de preferência 1 a 3 e, mais preferivelmente 1 ou 2.
[000475] Ligantes sintéticos (agentes de ligação cruzada químicos) incluem agentes de ligação cruzada que são rotineiramente usados em ligação cruzada de peptídeos, por exemplo, N-hidroxi succinimida (NHS), suberato de di-succinimidila (DSS), suberato de bis(sulfo- succinimidila) (BS3), propionato de ditiobis(succinimidila) (DSP), propionato de ditiobis(sulfo-succinimidila) (DTSSP), succinato de bis(succinimidila) de etileno glicol (EGS), succinato de bis(sulfo- succinimidila) de etileno glicol (sulfo-EGS), tartarato de di-succinimidila (DST), tartarato de di-sulfo-succinimidila (sulfo-DST), bis[2- (succinimidoxicarbonilóxi)etil] sulfona (BSOCOES) e bis[2-(sulfo- succinimidoxicarbonilóxi)etil] sulfona (sulfo-BSOCOES). Esses agentes de ligação cruzada estão comercialmente disponíveis.
[000476] Quando quatro regiões variáveis de anticorpo são ligadas, três ligantes são usualmente requeridos. Tais ligantes múltiplos podem ser os mesmos ou diferentes.
[000477] Os anticorpos da presente invenção incluem anticorpos nos quais um ou mais resíduos de aminoácido foram adicionados à sequência de aminoácido de um anticorpo da presente invenção. Ainda, proteínas de fusão as quais resultam de uma fusão entre um dos anticorpos acima e um peptídeo secundário ou proteína são incluídas na presente invenção. As proteínas de fusão podem ser preparadas através de ligação de um polinucleotídeo que codifica um anticorpo da presente invenção e um polinucleotídeo que codifica um segundo pep- tídeo ou polipeptídeo em quadro, inserção desse em um vetor de expressão e expressão do construto de fusão em um hospedeiro. Algumas técnicas conhecidas por aqueles versados no campo estão disponíveis para essa finalidade. O peptídeo ou polipeptídeo parceiro a ser fundido com um anticorpo da presente invenção pode ser um pep- tídeo conhecido, por exemplo, FLAG (Hopp, T. P. et al., BioTechnology 6, 1204-1210 (1988)), 6x His consistindo em seis resíduos de His (his- tidina), 10x His, hemaglutinina de influenza (HA), fragmento c-myc humano, fragmento VSV-GP, fragmento p18HIV, T7-tag, HSV-tag, Etag, fragmento antigênico T de SV40, tag lck, fragmento de α-tubulina, B-tag, fragmento de Proteína C. Outros polipeptídeos de fusão a serem fundidos com os anticorpos da presente invenção incluem, por exemplo, GST (glutationa-S-transferase), HA (hemaglutinina de influenza), região constante de imunoglobulina, β-galactosidase e MBP (proteína de ligação à maltose). Um polinucleotídeo que codifica um desses peptídeos ou polipeptídeos comercialmente disponíveis pode ser fundido com um polinucleotídeo que codifica um anticorpo da presente invenção. O polipeptídeo de fusão pode ser preparado mediante expressão do construto de fusão.
[000478] Além disso, os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos conjugados os quais são ligados a qualquer uma de várias moléculas, incluindo substâncias poliméricas, tais como polietileno gli- col (PEG) e ácido hialurônico, substâncias radioativas, substâncias fluorescentes, substâncias luminescentes, enzimas e toxinas. Tais an-ticorpos conjugados podem ser obtidos mediante modificação química dos anticorpos obtidos. Métodos para modificação de anticorpos foram estabelecidos nesse campo (por exemplo, US 5057313 e US 5156840). Os “anticorpos” da presente invenção também incluem tais anticorpos conjugados.
[000479] Além disso, os anticorpos usados na presente invenção podem ser anticorpos biespecíficos. Anticorpo biespecífico refere-se a um anticorpo que tem regiões variáveis que reconhecem diferentes epitopos na mesma molécula de anticorpo. Na presente invenção, os anticorpos biespecíficos podem reconhecer diferentes epitopos sobre uma molécula de NR10 ou reconhecer a NR10 com um sítio de ligação a antígeno e uma substância diferente com outro sítio de ligação a an- tígeno.
[000480] Métodos para a produção de anticorpos biespecíficos são conhecidos. Anticorpos biespecíficos podem ser preparados, por exemplo, ligando dois anticorpos que reconhecem diferentes antíge- nos. Anticorpos a serem ligados juntos podem ser metades de moléculas, cada uma das quais contém uma cadeia H e uma cadeia L ou quartos de moléculas que consistem apenas em uma cadeia H. Alternativamente, hibridomas que produzem diferentes anticorpos mono- clonais podem ser fundidos para produzir uma célula fundida que produz anticorpo biespecífico. Além disso, anticorpos biespecíficos podem ser produzidos por meio de técnicas de engenharia genética.
[000481] Os anticorpos da presente invenção podem diferir quanto à sequência de aminoácido, peso molecular, ponto isoelétrico, presen- ça/ausência de cadeias de açúcar e conformação, dependendo da célula ou hospedeiro que produz o anticorpo ou do método de purificação, conforme descrito abaixo. Contudo, um anticorpo resultante é incluído na presente invenção, na medida em que ele seja funcionalmente equivalente a um anticorpo da presente invenção. Por exemplo, quando um anticorpo da presente invenção é expresso em células procariotas, por exemplo, E. coli, um resíduo de metionina é adicionado ao N-término da sequência de aminoácido do anticorpo original. Tais anticorpos são incluídos na presente invenção.
Produção de anticorpo
[000482] Os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos policlonais ou monoclonais. Tais anticorpos monoclonais tendo atividade de ligação e/ou neutralização de NR10 podem ser obtidos, por exemplo, por meio do procedimento a seguir: anticorpos monoclonais anti-NR10 são preparados usando, como um antígeno, NR10 ou um fragmento da mesma que é derivado de um mamífero, tal como um ser humano ou camundongo, através de métodos conhecidos e, então, anticorpos tendo atividade de ligação e/ou neutralização de NR10 são selecionados dos anticorpos monoclonais anti-NR10 assim obtidos. Especificamente, um antígeno desejado ou células expressando o an- tígeno desejado são usadas como um antígeno de sensibilização para imunização de acordo com métodos de imunização convencionais. An-ticorpos monoclonais anti-NR10 podem ser preparados fundindo as células imunes obtidas com células parentais conhecidas usando métodos de fusão celular convencionais e triagem dos mesmos quanto a células que produzem anticorpo monoclonal (hibridomas) através de métodos de triagem convencionais. Animais a serem imunizados incluem, por exemplo, mamíferos, tais como camundongos, ratos, coelhos, ovelha, macacos, cabras, burros, vacas, cavalos e porcos. O an- tígeno pode ser preparado usando a sequência do gene de NR10 conhecida de acordo com métodos conhecidos, por exemplo, através de métodos usando baculovírus (por exemplo, WO 98/46777).
[000483] Hibridomas podem ser preparados, por exemplo, de acordo com o método de Milstein et al. (Kohler, G. e Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) ou semelhante. Quando a imunogenicidade de um antígeno é baixa, imunização pode ser realizada após ligação do antígeno com uma macromolécula tendo imunogenicidade, tal como albumina.
[000484] Modalidades dos anticorpos da presente invenção que têm uma atividade de ligação e/ou neutralização contra NR10 incluem anticorpos monoclonais que têm uma atividade de ligação e/ou neutralização contra NR10 humana. Antígenos usados para preparar anticorpos monoclonais que têm uma atividade de ligação e/ou neutralização contra NR10 humana não estão particularmente limitados, na medida em que eles sejam capazes de preparar anticorpos que têm uma atividade de ligação e/ou neutralização contra NR10 humana. Por exemplo, sabe-se que existe uma série de variantes de NR10 humana e qualquer variante pode ser usada como um imunogênio, na medida em que ela permita o preparo de anticorpos que têm uma atividade de ligação e/ou neutralização contra NR10 humana. Alternativamente, sob a mesma condição, um fragmento peptídico de NR10 ou uma proteína na qual mutações artificiais tenham sido introduzidas na sequência da NR10 natural podem ser usados como um imunogênio. NR10.3 humana é um dos imunogênios preferidos no preparo de anticorpos que têm uma atividade de ligação e/ou neutralização de NR10 na presente invenção.
[000485] Além disso, a atividade de ligação e/ou neutralização de anticorpo contra NR10 pode ser medida, por exemplo, observando o efeito de supressão do crescimento da linhagem de célula dependente de IL-31 conforme descrito nos Exemplos.
[000486] Entretanto, anticorpos monoclonais podem também ser obtidos mediante imunização de DNA. Imunização de DNA é um método no qual um DNA de vetor construído de modo que o gene que codifica uma proteína antigênica pode ser expresso em um animal a ser imunizado é administrado ao animal e o imunogênio é expresso dentro do corpo do animal para proporcionar imunoestimulação. Quando comparado com métodos de imunização comuns baseados na administração de antígenos de proteína, espera-se que a imunização de DNA seja vantajosa pelo fato de que: - ela permite imunoestimulação, ao mesmo tempo em que retém a estrutura de uma proteína da membrana; e - o imunogênio não precisa ser purificado.
[000487] Por outro lado, é difícil combinar imunização de DNA com um meio de imunoestimulação, tal como um adjuvante.
[000488] De forma a obter um anticorpo monoclonal mediante imunização de DNA, primeiro, DNA que codifica NR10 é administrado a um animal a ser imunizado. O DNA que codifica NR10 pode ser sintetizado por meio de métodos conhecidos, tal como PCR. O DNA resultante é inserido em um vetor de expressão apropriado e administrado ao animal a ser imunizado. Vetores de expressão que podem ser usados incluem vetores de expressão comercialmente disponíveis, tal como pcDNA3.1. O vetor pode ser administrado ao corpo vivo por meio de métodos convencionais. Por exemplo, imunização de DNA pode ser realizada mediante introdução de partículas de ouro revestidas com o vetor de expressão em células através de uma pistola gênica. Reforço usando células que expressam NR10 após imunização com DNA é um método preferido para proporcionar um anticorpo monoclonal.
[000489] Uma vez que o mamífero é imunizado conforme descrito acima e o nível no soro de um anticorpo desejado é confirmado como estando aumentado, células imunes são coletadas do mamífero e submetidas à fusão celular. Células imunes preferidas são células de baço em particular.
[000490] Células de mieloma de mamífero são usadas para fusão com as células imunes acima. É preferido que as células de mieloma tenham marcadores de seleção apropriados para triagem. O marcador de seleção refere-se a um fenótipo que permite (ou não permite) sobrevivência sob condições de cultura particulares. Marcadores de seleção conhecidos incluem deficiência de fosforibosil transferase de hi- poxantina-guanina (aqui depois abreviada como "deficiência de HGPRT”) e deficiência de quinase de timidina (aqui depois abreviada como "deficiência de TK"). Células deficientes de HGPRT ou TK exibem sensibilidade à hipoxantina-aminopterina-timidina (aqui depois abreviada como "sensibilidade a HAT"). Em meio de seleção HAT, células sensíveis a HAT não podem sintetizar DNA e, assim, morrerão. Contudo, quando fundidas com células normais, elas podem continuar a sintetizar DNA através da via de salvamento das células normais e, assim, podem crescer mesmo em meio de seleção HAT.
[000491] Células deficientes em HGPRT ou TK podem ser selecionadas usando um meio contendo 6-tioguanina, 8-azaguanina (aqui depois abreviado como “8AG”) ou 5’-bromodeoxiuridina. Enquanto células normais são mortas em virtude da incorporação desses análogos de pirimidina no DNA, células carecendo dessas enzimas podem sobreviver no meio de seleção porque elas não podem incorporar esses análogos de pirimidina. Outro marcador de seleção denominado G418 confere resistência a antibióticos de 2-deoxiestreptamina (análogos de gentamicina) em virtude do gene de resistência à neomicina. Várias células de mieloma adequadas para fusão celular são conhecidas.
[000492] Fusão celular entre células imunes e células de mieloma pode ser realizada essencialmente de acordo com métodos conhecidos, por exemplo, o método de Kohler e Milstein (Kohler. G. e Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).
[000493] Mais especificamente, fusão celular pode ser realizada, por exemplo, em um meio de cultura comum na presença de um agente de promoção de fusão celular. O agente de promoção de fusão in- clui,por exemplo, polietileno glicol (PEG) e Sendai vírus (HVJ). Se requerido, um agente auxiliar, tal como sulfóxido de dimetila, pode também ser adicionado para aprimorar a eficiência de fusão.
[000494] As células imunes e células de mieloma podem ser usadas em uma proporção arbitrariamente determinada. Por exemplo, a proporção de células imunes para células de mieloma é, de preferência, de 1 para 10. Meios de cultura a serem usados para fusão celular incluem, por exemplo, meios que são adequados para o crescimento celular da linhagem de célula de mieloma, tais como RMPI 1640 e MEM e outros meios de cultura comuns usados para esse tipo de cultura de célula. Além disso, os meios de cultura podem também ser suplementados com suplemento de soro, tal como soro fetal de bezerro (FCS).
[000495] Quantidades predeterminadas de células imunes e células de mieloma são bem misturadas no meio de cultura e, então, misturadas com uma solução de PEG preaquecida para 37°C a fim de produzir células fundidas (hibridomas). No método de fusão celular, por exemplo, PEG com um peso molecular de cerca de 1.000-6.000 pode ser adicionado às células, tipicamente em uma concentração de 30% a 60% (peso/v). Então, adição sucessiva do meio de cultura apropriado listado acima e remoção do sobrenadante mediante centrifugação são repetidas para eliminar o agente de fusão celular e semelhantes, os quais são desfavoráveis para o crescimento de hibridomas.
[000496] Os hibridomas resultantes podem sofrer triagem usando um meio de seleção de acordo com o marcador de seleção possuído pelas células de mieloma usadas na fusão celular. Por exemplo, células deficientes em HGPRT ou TK podem sofrer triagem através de cultura das mesmas em um meio HAT (um meio contendo hipoxantina, ami- nopterina e timidina). Especificamente, quando células de mieloma sensíveis ao HAT são usadas em fusão celular, células fundidas com sucesso a células normais podem ser seletivamente crescidas em meio HAT. A cultura de célula usando o meio HAT acima é continuada durante um período de tempo suficiente para permitir que todas as células, exceto os hibridomas desejados (células não fundidas) morram. Especificamente, em geral, os hibridomas desejados podem ser selecionados através de cultura das células durante vários dias a várias semanas. Então, triagem e clonagem única de hibridomas que produzem um anticorpo de interesse podem ser realizadas procedendo a métodos de diluição limitativa comuns. Alternativamente, anticorpos que reconhecem a NR10 podem ser preparados por meio do método descrito no WO 03/104453.
[000497] Triagem e clonagem única de um anticorpo de interesse podem ser adequadamente realizadas por meio de métodos de tria- gem conhecidos baseado em reação antígeno-anticorpo. Por exemplo, um antígeno é ligado a um veículo, tal como glóbulos feitos de poliestireno ou semelhante e lâminas de microtitulação com 96 cavidades comercialmente disponíveis e, então, reagido com o sobrenadante de cultura de hibridoma. Em seguida, o veículo é lavado e, então, reagido com o anticorpo secundário rotulado com enzima ou semelhante. Quando o sobrenadante de cultura contém um anticorpo de interesse reativo ao antígeno de sensibilização, o anticorpo secundário se liga ao veículo via esse anticorpo. Finalmente, o anticorpo secundário ligado ao veículo é detectado para determinar se o sobrenadante de cultura contém o anticorpo de interesse. Hibridomas que produzem um anticorpo desejado capaz de ligação ao antígeno podem ser clonados por meio do método de diluição limitativa ou semelhante. Não apenas o antígeno usado para imunização, mas também uma proteína NR10 subsequentemente equivalente ao mesmo pode, de preferência, ser usada como um antígeno para essa finalidade. Por exemplo, uma linhagem de célula expressando NR10, o domínio extracelular de NR10 ou um oligopeptídeo composto de uma sequência de aminoácido parcial que constitui o domínio podem ser usados como o antígeno.
[000498] Além do método descrito acima para preparo de hibridomas através de imunização de um animal não-humano com um antígeno, anticorpos de interesse podem também ser obtidos por meio de sensi-bilização de linfócitos humanos com um antígeno. Especificamente, primeiro, linfócitos humanos são sensibilizados com proteína NR10 in vitro. Então, os linfócitos sensibilizados são fundidos com um parceiro de fusão apropriado. Por exemplo, células de mieloma derivadas de ser humano com a capacidade de se dividir permanentemente podem ser usadas como o parceiro de fusão (veja Publicação de Pedido de Patente Japonesa Kokoku No. (JP-B) H1-59878 (pedido de patente Japonesa examinado, aprovado, publicado para oposição). Anticorpos obtidos por meio desse método são anticorpos humanos tendo uma atividade de ligação à proteína NR10.
[000499] A sequência de nucleotídeo que codifica um anticorpo anti- NR10 obtido através do método descrito acima ou semelhante e sua sequência de aminoácido podem ser obtidas por meio de métodos conhecidos por aqueles versados no campo.
[000500] Baseado na sequência obtida do anticorpo anti-NR10, o anticorpo anti-NR10 pode ser preparado, por exemplo, por meio de técnicas de recombinação genética conhecidas por aqueles versados no campo. Especificamente, um polinucleotídeo que codifica um anticorpo pode ser construído baseado na sequência do anticorpo que reconhece NR10, inserido em um vetor de expressão e, então, expresso em células hospedeiras apropriadas (veja, por exemplo, Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. e Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. e Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzy- mol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R. E. e Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137).
[000501] Os vetores incluem vetores M13, vetores pUC, pBR322, pBluescript e pCR-Script. Alternativamente, quando se objetiva sub- clonar e excisar cDNA, os vetores incluem, por exemplo, pGEM-T, pDIRECT e pT7, além dos vetores descritos acima. Vetores de expressão são particularmente úteis quando usando vetores para a produção dos anticorpos da presente invenção. Por exemplo, quando se objetiva expressão em E. Coli, tal como JM109, DH5D, HB101 e XL1- Blue, os vetores de expressão não apenas têm as características descritas acima que permitem amplificação do vetor em E. coli, mas também devem trazer um promotor que permite expressão eficiente em E. coli, por exemplo, promotor lacZ (Ward et al., Nature (1989) 341, 544- 546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), promotor araB (Better et al., Science (1988) 240, 1041-1043), promotor T7 ou semelhante. Tais vetores incluem pGEX-5X-1 (Pharmacia), “QIAexpress System” (Qiagen), pEGFP ou pET (nesse caso, o hospedeiro é, de preferência, BL21 que expressa RNA polimerase T7), além dos vetores descritos acima.
[000502] Os vetores podem conter sequências sinalizadoras para secreção de anticorpo. Como uma sequência sinalizadora para secreção de anticorpo, uma sequência sinalizadora pelB (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) pode ser usada quando a proteína é se- cretada no periplasma de E. coli. O vetor pode ser introduzido em células hospedeiras por meio dos métodos com cloreto de cálcio ou eletroporação, por exemplo.
[000503] Além de vetores para E. coli, os vetores para produção dos anticorpos da presente invenção incluem vetores de expressão de mamífero (por exemplo, pcDNA3 (Invitrogen), pEF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17), página 5322), pEF e pCDM8), vetores de expressão derivados de célula de inseto (por exemplo, o “sistema de expressão de baculovírus Bac-to-BAC” (Gibco-BRL) e pBacPAK8), vetores de expressão derivados de planta (por exemplo, pMH1 e pMH2), vetores de expressão derivados de vírus animal (por exemplo, pHSV, pMV e pAdexLcw), vetores de expressão retrovirais (por exemplo, pZIPneo), vetores de expressão de levedo (por exemplo, “Pichia Expression Kit” (Invitrogen), pNV11 e SP-Q01) e vetores de expressão de Bacillus subtilis (por exemplo, pPL608 e pKTH50), por exemplo.
[000504] Quando objetivando expressão em células animais, tais como células CHO, COS e NIH3T, os vetores devem ter um promotor essencial para expressão em células, por exemplo, promotor SV40 (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), promotor MMLV-LTR, promotor EF1α (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) e promotor de CMV e, mais preferivelmente, eles têm um gene para se- leção de células transformadas (por exemplo, um gene de resistência a fármaco que permite avaliação usando um agente (neomicina, G418 ou semelhante). Vetores com tais características incluem pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV e pOP13, por exemplo.
[000505] Além disso, o método a seguir pode ser usado para expressão de gene estável e amplificação gênica em células: células CHO deficientes em uma via de síntese de ácido nucleico são introduzidas com um vetor (por exemplo, pSV2-dhfr (Molecular Cloning 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)) que traz um gene de DHFR o qual compensa a deficiência e o vetor é amplificado usando metotrexato (MTX). Alternativamente, o método a seguir pode ser usado para expressão gênica transitória: células COS com um gene expressando antígeno SV40 T sobre seu cromossomo são transformadas com um vetor (pcD e such) com uma origem de replicação de SV40. Origens de replicação derivadas do polioma vírus, adenovírus, papiloma vírus bovino (BPV) e semelhantes também podem ser usadas. Para amplificar o número de cópias do gene em células hospedeiras, os vetores de expressão podem ainda trazer marcadores de seleção, tais como o gene de transferase de aminoglicosídeo (APH), o gene de quinase de timidina (TK), o gene de fosforibosil transferase de xantina-guanina de E. coli (Ecogpt) e o gene de reductase de di- hidrofolato (dhfr).
[000506] Os anticorpos da presente invenção obtidos por meio dos métodos descritos acima podem ser isolados de dentro das células hospedeiras ou de fora das células (do meio ou semelhante) e purificados até homogeneidade. Os anticorpos podem ser isolados e purificados por meio de métodos rotineiramente usados para isolamento e purificação de anticorpos e o tipo de método não está limitado. Por exemplo, os anticorpos podem ser isolados e purificados selecionando e combinando apropriadamente cromatografia em coluna, filtração, ultrafiltração, dessalinização, precipitação de solvente, extração de solvente, destilação, imunoprecipitação, SDS-eletroforese em gel de poliacrilamida, isoeletrofocalização, diálise, recristalização e semelhantes.
[000507] As cromatografias incluem, por exemplo, cromatografia por afinidade, cromatografia de troca de íons, cromatografia hidrofóbica, filtração em gel, cromatografia de fase reversa e cromatografia de ad- sorção (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Os métodos cromatográficos descritos acima podem ser conduzidos usando cromatografia de líquido, por exemplo, HPLC e FPLC. Colunas que podem ser usadas para croma- tografia por afinidade incluem colunas de proteína A e colunas de proteína G. Colunas usando proteína A incluem, por exemplo, Hyper D, POROS e Sepharose FF (GE Amersham Biosciences). A presente invenção inclui anticorpos que são altamente purificados usando esses métodos de purificação.
[000508] A atividade de ligação a NR10 dos anticorpos obtidos pode ser determinada por meio de métodos conhecidos por aqueles versados no campo. Métodos para determinação da atividade de ligação a antígeno de um anticorpo incluem, por exemplo, ELISA (ensaio de imunoabsorção enzimática), EIA (imunoensaio enzimático), RIA (ra- dioimunoensaio) e o método de anticorpo fluorescente. Por exemplo, quando um imunoensaio enzimático é usado, amostras contendo anticorpo, tal como anticorpos purificados e sobrenadantes de cultura de células que produzem anticorpo, são adicionadas a lâminas revestidas de antígeno. Um anticorpo secundário rotulado com uma enzima, tal como fosfatase alcalina, é adicionado e as lâminas são incubadas. Após lavagem, um substrato enzimático, tal como p-nitrofenil fosfato, é adicionado e a absorbância é medida para avaliar a atividade de liga- ção a antígeno.
Composições farmacêuticas
[000509] A presente invenção também proporciona composições farmacêuticas compreendendo o anticorpo mencionado acima como um ingrediente ativo. Além disso, a presente invenção proporciona agentes terapêuticos para doenças inflamatórias os quais compreendem o anticorpo mencionado acima como um ingrediente ativo.
[000510] Na presente invenção, doença inflamatória refere-se a doenças com características patológicas envolvidas em reações citológi- cas e histológicas que ocorrem nos vasos sanguíneos e tecidos adjacentes afetados em resposta a uma lesão ou estímulo anormal causado por agentes físicos, químicos ou biológicos (Stedman’s Medical Dictionary, 5a Ed., MEDICAL VIEW CO., 2005). Em geral, doenças inflamatórias incluem dermatite (dermatite atópica, dermatite crônica e semelhantes), doenças intestinais inflamatórias (colite e semelhantes), asma, artrite (artrite reumatoide, osteoartrite e semelhantes), bronquite, doenças autoimunes Th1, lúpus eritematoso sistêmico, miastenia gravis, GVHD crônica, doença de Crohn, espondilite deformans, dor lombar, gota, inflamação após cirurgia ou lesão, edema, neuralgia, la- ringofaringite, cistite, hepatite (esteato-hepatite não alcoólica, hepatite alcoólica e semelhantes), hepatite B, hepatite C, arteriosclerose e prurido.
[000511] Exemplos preferidos de doenças inflamatórias que são assunto da presente invenção incluem dermatite atópica, dermatite crônica, reumatismo, osteoartrite, asma crônica e prurido.
[000512] A frase "compreende(m) um anticorpo anti-NR10 como um ingrediente ativo" significa compreendendo um anticorpo anti-NR10 como pelo menos um dos ingredientes ativos e não limita a proporção do anticorpo. Além disso, os agentes terapêuticos para doenças inflamatórias na presente invenção podem também compreender, em combinação com o anticorpo anti-NR10 mencionado acima, outros in-gredientes que intensificam o tratamento de doenças inflamatórias.
[000513] Os agentes terapêuticos da presente invenção podem também ser usados para fins preventivos.
[000514] O anticorpo anti-NR10 da presente invenção pode ser preparado como formulações de acordo com métodos padrões (veja, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Science, última edição, Mark Publishing Company, Easton, EUA). Ainda, eles podem conter veículos e/ou aditivos farmaceuticamente aceitáveis, se necessário. Por exemplo, eles podem conter tensoativos (por exemplo, PEG e Tween), excipientes, antioxidantes (por exemplo, ácido ascórbico), agentes de coloração, agentes de flavorização,, conservantes, estabilizantes, agentes de tamponamento (por exemplo, ácido fosfórico, ácido cítrico e outros ácidos orgânicos), agentes de quelação (por exemplo, EDTA), agentes de suspensão, agentes de isotonização, aglutinantes, desin- tegrantes, lubrificantes, promotores e corretores de fluidez. Contudo, sem limitação aos mesmos, os agentes para prevenção ou tratamento de doenças inflamatórias da presente invenção podem conter outros veículos comumente usados. Tais veículos incluem, especificamente, ácido silícico anidro leve, lactose, celulose cristalina, manitol, amido, carmelose de sódio, carmelose de cálcio, hidroxipropil celulose, hidro- xipropil metil celulose, polivinilacetal dietilamino acetato, polivinilpirroli- dona, gelatina, triglicerídeo de ácido graxo de cadeia média, polioxieti- leno de óleo de mamona hidrogenado 60, sacarose, carboximetil celulose, amido de milho e sal inorgânico. Os agentes podem também con-ter outros polipeptídeos de baixo peso molecular, proteínas tais como albumina de soro, gelatina e imunoglobulina e aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina e lisina. Quando o anticorpo anti-NR10 é preparado como uma solução aquosa para injeção, o anticorpo anti- NR10 pode ser dissolvido em uma solução isotônica contendo, por exemplo, solução salina fisiológica, dextrose ou outros adjuvantes. Os adjuvantes podem incluir, por exemplo, D-sorbitol, D-manose, D- manitol e cloreto de sódio. Além disso, agentes de solubilização apropriados, por exemplo, alcoóis (por exemplo, etanol), polialcoóis (por exemplo, propileno glicóis e PEG) e detergentes não-iônicos (polissor- bato 80 e HCO-50) podem ser usados concomitantemente.
[000515] Se necessário, anticorpos anti-NR10 podem ser encapsulados em micropartículas (micropartículas podem ser feitas de hidroxi- metil celulose, gelatina, metacrilato de polimetila e semelhantes) e transformados em camundongos de sistemas de distribuição de fár- maco coloidais (lipossomas, microesferas de albumina, microemul- sões, nanopartículas e nanocápsulas) (por exemplo, veja “Remington’s Pharmaceutical Science 16a edição” &, Oslo Ed. (1980)). Além disso, métodos para fabricação de fármacos com liberação sustentada são conhecidos e esses podem ser aplicados para anticorpos anti-NR10 (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15, 167-277; Langer, Chem. Tech. (1982) 12, 98-105; Patente US No. 3.773.919; Pedido de Patente Europeia (EP) No. 58,481; Sidman et al., Biopolymers (1983) 22, 547-56; EP 133.988).
[000516] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas oral ou parenteralmente mas, de preferência, são administradas parenteralmente. Especificamente, os agentes são administrados aos pacientes por meio de injeção ou administração percutânea. Injeções incluem, por exemplo, injeções intravenosas, injeções intramusculares e injeções subcutâneas, para administração sistêmica ou local. Os agentes podem ser fornecidos a locais onde inflamação tem de ser suprimida ou áreas que envolvem os locais através de infusão local, injeção intramuscular em particular. Os métodos de administração podem ser apropriadamente selecionados de acordo com a idade e condição do paciente. A dose para uma única adminis tração pode ser selecionada, por exemplo, da faixa de 0,0001 a 100 mg do ingrediente ativo por kg de peso corporal. Alternativamente, por exemplo, quando os agentes são administrados a pacientes humanos, a dose do ingrediente ativo pode ser selecionada da faixa de 0,001 a 1.000 mg/kg de peso corporal. A dose para uma única administração contém, de preferência, por exemplo, cerca de 0,01 a 50 mg/kg de peso corporal do anticorpo da presente invenção. Contudo, a dose de um agente para prevenção ou tratamento de doenças inflamatórias da presente invenção não está limitada a esses exemplos.
[000517] Todos os documentos da técnica anterior citados no presente relatório descritivo são aqui incorporados por referência. [Exemplos]
[000518] Aqui abaixo, a presente invenção será especificamente descrita com referência aos Exemplos, mas ela não deve ser construída como estando limitada aos mesmos. [Exemplo 1] Preparo de hibridomas 1.1. Preparo de plasmídeos de NR10 humana e de macaco cino- molgo para imunização de DNA 1.1.1. Preparo de vetores de expressão para hNR10 e cynNRIO
[000519] NR10 humana (sequência de nucleotídeo, SEQ ID NO: 75; sequência de aminoácido, SEQ ID NO: 76) foi inserida no vetor de expressão pMacII, o qual expressa a proteína sob o controle do promotor de β-actina de camundongo (WO2005/054467), para preparar um vetor de expressão para hNR10. Da mesma maneira, um vetor de expressão para cynNR10 foi construído a partir de NR10 de macaco ci- nomolgo (sequência de nucleotídeo, SEQ ID NO: 65; sequência de aminoácido, SEQ ID NO: 66). 1.1.2. Preparo de cartucho de DNA
[000520] De forma a usar o vetor de expressão de hNR10 ou cynNR10 preparado em 1.1.1 para imunização com DNA de camun- dongos, o kit Helios Gene Gun Cartridge (BIO-RAD) foi usado para produzir um cartucho de DNA para cada DNA que permite imunização com 1 μg de DNA de uma vez. 1.2. Preparo de hibridomas que produzem anticorpo anti-NR10 humana 1.2.1. Preparo de hibridomas usando camundongos imunizados com NR10 humana ou de macaco cinomolgo
[000521] Dez camundongos Balb/c (fêmeas; seis semanas de idade no início de imunização; Charles River Laboratories, Japão) foram imunizados com NR10 humana ou de macaco cinomolgo por meio do procedimento a seguir. Para imunização primária, os camundongos foram imunizados com o cartucho de DNA preparado com o vetor de expressão de hNR10 usando o Helios Gene Gun System (BIO-RAD). Uma semana depois, imunização secundária foi realizada através do Helios Gene Gun System (BIO-RAD) usando o cartucho de DNA preparado com o vetor de expressão de cynNR10. As terceira e subsequentes imunizações foram realizadas em intervalos de uma semana usando os vetores de expressão de hNR10 e cynNR10 alternadamente. Após a titulação de anticorpo no soro contra a NR10 humana ter sido confirmada como elevada, uma proteína NR10 humana (domínio extracelular) (Exemplo de Referência 4) diluída com PBS(-) foi intravenosamente administrada a 10 μg/animal como a imunização final. Quatro dias após a imunização final, células de baço de camundongo foram fundidas com células de mieloma de camundongo P3X63Ag8U.1 (abreviadas como P3U1; ATCC CRL-1597) por meio de um método convencional usando PEG1500 (Roche Diagnostics). As células fundidas resultantes, isto é, hibridomas, foram cultivadas em RPMI1640 su-plementado com FBS a 10% (aqui depois abreviado como FBS a 10%/RPMI1640). 1.2.2. Seleção de hibridomas
[000522] No dia seguinte após fusão, as células fundidas foram suspensas em um meio semissólido (StemCells) e cultivadas para seleção, bem como colonização de hibridomas.
[000523] Após nove ou dez dias de fusão, colônias de hibridoma foram selecionadas e cada colônia foi cultivada em cada cavidade de lâminas com 96 cavidades contendo o meio de seleção HAT (FBS a 10%/ RPMI1640, 2% em vol. de concentrado de HAT 50x (Dainippon Pharmaceutical) e 5% em vol. de BM-Condimed H1 (Roche Diagnostics)). Após três a quatro dias de cultura, o sobrenadante de cultura foi coletado de cada cavidade para determinar a concentração de IgG de camundongo no sobrenadante. Os sobrenadantes de cultura nos quais IgG de camundongo foi detectada foram avaliados quanto à atividade de neutralização usando uma linhagem de célula dependente de IL-31 humana (células hNR10/hOSMR/BaF3; Exemplo de Referência 2) e vários clones tendo uma forte atividade de neutralização de NR10 foram obtidos (figura 3). Clones que suprimem o crescimento de células induzido por IL-31 de uma maneira dependente da concentração e suprimem o crescimento de células induzido por IL-31 de macaco cino- molgo (células cynNR10/cynOSMR/BaF3s; Exemplo de Referência 2) de uma maneira dependente da concentração foram obtidos (figura 4). [Exemplo 2] Preparo de anticorpos quiméricos Preparo de vetores de expressão para anticorpos quiméricos
[000524] RNAs totais foram extraídos dos hibridomas usando kits RNeasy Mini (QIAGEN) e cDNAs foram sintetizados a partir dos mesmos usando o kit SMART RACE cDNA Amplification (BD Biosciences). Genes da região variável de anticorpo foram isolados por meio de PCR usando DNA polimerase PrimeSTAR HS (TaKaRa), 10x Universal Primer A Mix presa ao kit SMART RACE cDNA Amplification (BD Biosciences) e iniciadoriniciadores criados para cada região constante de anticorpo (cadeia H, mIgG1-rnot; cadeia L, mIgK-rnot). A sequência de nucleotídeo de cada fragmento de DNA isolado foi determinada com o Sequenciador de DNA ABI PRISM 3730xL ou o Sequenciador de DNA ABI PRISM 3700 (Applied Biosystems), usando o kit BigDye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems) de acordo com o método descrito no manual de instrução em anexo. As sequências de aminoácido de regiões variáveis de cadeia H e cadeia L determinadas nos anticorpos de camundongo NS18, NS22, NS23 e NS33 foram mostradas nas figuras 1 e 2, respectivamente.
[000525] Cada um dos fragmentos de cadeias H e L resultante foi submetido à PCR usando DNA polimerase PrimeSTAR HS (TaKaRa) e os conjuntos de iniciador mostrados na Tabela 1. Os fragmentos amplificados resultantes foram ligados com a região constante (Y1 ou Y2 humana e K humana, respectivamente) e, então, inseridos em um vetor de expressão de célula animal. A sequência de nucleotídeo de cada fragmento de DNA foi determinada com o Sequenciador de DNA ABI PRISM 3730xL ou o Sequenciador de DNA ABI PRISM 3700 (Applied Biosystems), usando o kit BigDye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems) de acordo com o método descrito no manual de instrução em anexo. Tabela 1
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Preparo de anticorpos quiméricos
[000526] A linhagem de célula de câncer de rim embriônico humano HEK293H (Invitrogen) foi suspensa em DMEM (Invitrogen) suplementado com soro bovino fetal a 10% (Invitrogen) e 10 ml de células foram cultivados em discos para células aderentes (10 cm de diâmetro; CORNING) em uma densidade celular de 6 x 105 células/ml. As células foram incubadas em uma incubadora de CO2 (37°C, 5% de CO2) durante um dia e noite inteiros. Então, o meio foi removido por meio de aspiração e 6,9 ml de meio CHO-S-SFMII (Invitrogen) foram adicionados. O meio CHO-S-SFMII foi adicionado à mistura de DNA de plas- mídeo preparada (13,8 μg no total) até um volume de 700 μl. Esse foi misturado com 20,7 μl de polietilenoimina a 1 μg/ml (Polysciences Inc.) e deixado descansar em temperatura ambiente durante 10 minutos. A solução foi adicionada às células em cada disco. As células foram incubadas em uma incubadora de CO2 (37°C, 5% de CO2) durante quatro a cinco horas. Então, 6,9 ml de meio CHO-S-SFMII (Invitrogen) foram adicionados e as células foram incubadas em uma incubadora de CO2 durante três a quatro dias. Os sobrenadantes de cultura foram coletados e, então, centrifugados (aprox. 2000 g, cinco minutos, temperatura ambiente) para remover as células. Os sobrenadantes foram filtrados através de um filtro de 0,22 μm MILLEX®-GV (Millipore). Cada amostra foi armazenada a 4°C até uso. Anticorpos foram purificados a partir dos sobrenadantes usando Proteína G Sepharose (Amersham Biosciences). Os anticorpos purificados foram concentrados com Ami- con Ultra 15 (Millipore) e, então, o solvente foi substituído por PBS(-) contendo NaN3 a 0,05% usando colunas PD-10 Desalting (Amersham Biosciences). A absorbância a 280 nm foi medida com um Espectrofo- tômetro ND-1000 (NanoDrop) e as concentrações foram determinadas por meio do método de Pace et al. (Protein Science (1995) 4: 24112423). Avaliação da atividade de NS22 quimérico
[000527] A atividade de neutralização de hIL-31 foi avaliada usando a linhagem de célula hNR10/hOSMR/BaF3, a qual cresce de uma maneira dependente de hIL-31, conforme descrito abaixo.
[000528] Células hNR10/hOSMR/BaF3 foram preparadas a 1,5 x 105 células/ml usando meio RPMI1640 (GIBCO) contendo FBS a 10% (MOREGATE) e Penicilina-Estreptomicina a 1% (Invitrogen). hIL-31 (R&D Systems) foi adicionada a uma alíquota das células para uma concentração final de 4 ng/ml (IL-31(+); conc. final: 2 ng/ml). A suspensão de célula restante foi usada como IL-31(-). O NS22 purificado foi ajustado para 2 μg/ml usando o meio e oito diluições seriais foram preparadas em uma proporção de diluição comum de 3 (conc. final: 1 μg/ml ou menos). 50 μl de cada um da suspensão de célula e da diluição de NS22 quimérico (Y1 , K humana) foram adicionados a cada cavidade de lâminas de fundo redondo com 96 cavidades (CORNING) e as células foram cultivadas em uma incubadora com 5% de CO2 a 37°C durante dois dias. Após cultura, 20 μl de uma mistura de quantidades iguais de Cell Counting Kit-8 (Dojindo) e PBS foram adicionados a cada cavidade e a absorbância (450 nm/620 nm) foi medida (TE- CAN, SUNRISE CLASSIC). Após a reação ter sido deixada continuar durante duas horas em uma incubadora com 5% de CO2 a 37°C, a ab- sorbância foi medida novamente. A atividade de neutralização de NS22 foi apresentada como a taxa de inibição usando um valor obtido subtraindo o valor a zero hora do valor a 2 horas. O resultado mostrou que o NS22 suprimiu o crescimento induzido por IL-31 da linhagem de célula hNR10/hOSMR/BaF3 de uma maneira dependente da concentração. Isso demonstra que o NS22 tem uma atividade de neutralização contra a sinalização a IL-31 humana (figura 5).
[000529] A atividade de neutralização de IL-31 foi avaliada conforme descrito abaixo usando a linhagem de célula DU145 (linhagem de célula de câncer de próstata humano), na qual a produção de IL-6 é induzida quando de estimulação de IL-31.
[000530] Células DU145 foram preparadas a 2,5 x 105 células/ml em MEM (Invitrogen) contendo FBS a 10% (MOREGATE), L-glutamina a 2 mmol/l (Invitrogen) e piruvato de sódio a 1 mmol/l (SIGMA) e alíquotas de 200 μl foram distribuídas em cada cavidade de lâminas com 48 cavidades (CORNING). As células foram incubadas a 37°C sob 5% de CO2 durante a noite. O NS22 quimérico purificado (y1, K humano) foi diluído para 100 μg/ml com MEM contendo FBS a 10%, L-glutamina a 2 mmol/l e piruvato de sódio. Usando essa solução, seis diluições seriais foram preparadas em uma proporção de diluição comum de 5. Cada diluição foi combinada com 100 ng/ml de interleucina-31 humana (R&D systems) em uma proporção de 1:1 e uma alíquota de 50 μl foi adicionada a cada cavidade. Após dois dias de cultura a 37°C sob 5% de CO2, a concentração de IL-6 no sobrenadante de cultura foi determinada usando o kit DuoSet ELISA Development (R&D systems). A atividade de neutralização de NS22 foi avaliada determinando a taxa de inibição (%). Especificamente, admitindo que a concentração de IL- 6 na ausência de IL-31 (A) como a atividade inibitória máxima (inibição de 100%) e a concentração de IL-6 na presença de IL-31 sem NS22 (B) como nenhuma atividade inibitória (inibição de 0%), a concentração de IL-6 na presença de IL-31 e NS22 (C) foi determinada de acordo com a fórmula a seguir: Taxa de inibição (%) = (B-C)/(B-A) x 100
[000531] O resultado mostrou que NS22 suprimiu a produção de IL-6 induzida por IL-31 na linhagem de célula DU145 de uma maneira de-pendente da concentração e, assim, demonstrou que o NS22 tinha uma atividade de neutralização contra a sinalização a IL-31 humana (figura 6). Avaliação de competição do anticorpo anti-NR10 quimérico com IL-31
[000532] IL-31 humana (R&D Systems) foi rotulada com FMAT Blue Monofunctional Reactive Dye (Applied Biosystems). 100 μl de hIL-31 preparada a 0,5 mg/ml usando tampão de fosfato de sódio a 50 mM (pH de 8,0) foram misturados com 5,25 μl de FMAT Blue a 25 nmols dissolvido em DMSO (Junsei). Após turbilhonamento, a mistura foi deixada descansar em temperatura ambiente durante 15 minutos. A reação de conjugação de FMAT Blue com hIL-31 foi terminada através da adição de 5 μl de Tris-HCl a 1 M (pH de 7,4) e 1,1 μl de Tween20 a 10% e, então, hIL-31 rotulada com FMAT Blue e FMAT Blue não reagido foram separados através de filtração em gel usando uma coluna Superdex 75 (GE Healthcare, 17-0771-01) com solução de revelação de Tween20/PBS a 0,1%.
[000533] Os anticorpos foram avaliados quanto à atividade de inibição de ligação IL-31/NR10 usando células CHO expressando hNR10, conforme descrito abaixo.
[000534] NS22 e NA633 (a região constante de cada um é y1, K) foram diluídos em uma concentração apropriada usando tampão de Ensaio (HEPES a 10 mM, NaCl a 140 mM, CaCl2 a 2,5 mM, MgCl2 a 3 mM, FBS a 2%, NaN3 a 0,01%) e, então, sete diluições seriais foram preparadas em uma proporção de diluição comum de 2. As diluições foram adicionadas a 40 μl/cavidade a lâminas (96-Well FMAT Plates; Applied Biosystems). Então, hIL-31 rotulado com FMAT Blue foi diluído 400 vezes com Tampão de ensaio e adicionado a 20 μl/cavidade. Finalmente, suspensões de célula ajustadas para 2,5 x 105 células/ml usando Tampão de ensaio foram adicionadas a 40 μl/cavidade (final 1 x 104 células/cavidade). Duas horas após a adição de células, a fluorescência (FL1) foi determinada usando o 8200 Cellular Detection System (Applied Biosystems). O resultado mostrou que NS22 inibiu a ligação de hIL-31/hNR10 de uma maneira dose-dependente e demonstrou que sua atividade era superior àquela do NA633 (figura 7). [Exemplo 3] Competição de anticorpo anti-NR10 contra NR10
[000535] O anticorpo NS22 purificado a partir de um sobrenadante de cultura de hibridoma foi rotulado com FMAT Blue (Applied Biosystems, 4328853). 170 μl de NS22 preparado a 1 mg/ml em PBS foram misturados com 17 μl de solução de NaHCO3 a 1 M e 3,4 μl de FMAT Blue (17 nmols) dissolvido em DMSO. Após turbilhonamento, a mistura foi deixada descansar em temperatura ambiente durante 30 minutos. A reação de conjugação de FMAT Blue com NS22 foi terminada através da adição de 8 μl de Tris-HCl a 1 M (pH de 7,4) e 1,9 μl de Tween 20 a 1% e, então, NS22 FMAT Blue-rotulado (FMAT Blue-NS22) e FMAT Blue não reagido foram separados por meio de filtração em gel usando uma coluna Superdex 75 (GE Healthcare, 17-0771-01) com solução de revelação de Tween20/PBS a 0,01%.
[000536] Cada anticorpo foi examinado com relação à inibição da ligação do FMAT Blue-NS22 preparado a células CHO expressando hNR10 (Exemplo de Referência 3) usando o 8200 Cellular Detection System (Applied Biosystems, 4342920). Os anticorpos anti-NR10 quiméricos (a região constante de cada é y1, K) foram adicionados em várias concentrações a cada cavidade contendo 7500 células e 8,8 x 10-2 μg/ml de FMAT Blue-NS22. As células foram deixadas descansar no escuro durante quatro horas e, então, o sinal fluorescente do FMAT Blue ligado às células foi medido. A reação foi realizada em Hepes- KOH a 10 mM contendo CaCl2 a 2,5 mM, MgCl2 a 3 mM, NaCl a 140 mM, FBS a 2% e NaNO3 a 0,01%. O resultado é mostrado na figura 8. O valor de fluorescência FL1, o qual representa a ligação de FMAT Blue-NS22 a células expressando NR10, foi reduzido com o aumento na concentração de anticorpo NS22 ou NS23. Por outro lado, FL1 dificilmente foi reduzido com o aumento na concentração de anticorpo NA633 (Exemplo de Referência 6) (figura 8). [Exemplo 4] Humanização de anticorpo NS22 Seleção de cada sequência de quadro
[000537] As regiões variáveis do anticorpo NS22 de camundongo foram comparadas com sequências de linhagem germinativa humana. Sequências de FR usadas para humanização são resumidas na Tabela 2. CDRs e FRs foram determinadas baseado na Numeração de Ka- bat. As sequências de região variável humanizadas de cadeia H compostas de FR1, FR2, FR3_1 e FR4 e compostas de FR1, FR2, FR3_2 e FR4, as quais são listadas na Tabela 2, são designadas como H0- VH (SEQ ID NO: 50) e H1-VH (SEQ ID NO: 112), respectivamente. Enquanto isso, a sequência de cadeia L composta de FR1, FR2, FR3 e FR4 é designada como L0 (SEQ ID NO: 52). Preparo de região variável for NS22 humanizado H0L0
[000538] Oligo DNAs sintéticos foram criados para cada uma das cadeias H e L para construir as regiões variáveis de NS22 humanizado no qual as CDRs do NS22 são enxertadas sobre as FRs usadas para humanização. Os respectivos oligo DNAs sintéticos foram misturados e, então, submetidos à PCR de montagem para construir um gene que codifica a região variável do NS22 humanizado. A PCR de montagem foi realizada usando KOD-Plus (TOYOBO) de acordo com as condições a seguir. Uma mistura de reação contendo 10 pmol de oligo DNAs sintéticos e o tampão de PCR em anexo, dNTPs, MgSO4 e KOD-Plus foi aquecida a 94°C durante cinco minutos. A mistura foi, então, submetida a dois ciclos de PCR de 94°C durante dois minutos, 55°C durante dois minutos e 68°C durante dois minutos. Então, 10 pmol cada de um iniciador no qual um sítio de restrição e sequência de Kozak tinham sido adicionados à extremidade 5' da região variável e um iniciador no qual um sítio de restrição tinha sido adicionado à extremidade 3’ da região variável, foram adicionados e submetidos a 35 ciclos de PCR de 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos e 68°C durante um minuto para proporcionar um fragmento amplificado. O fragmento amplificado resultante foi clonado no vetor de Clonagem TOPO TA (TOYOBO) e sua sequência de nucleotídeo foi determinada por meio de sequenciamento. As regiões variáveis construídas foram combinadas com as regiões constantes para preparar o H0-SKSC (SEQ ID NO: 54) e L0 (SEQ ID NO: 56). O constru- to resultante foi inserido em um vetor de expressão capaz de expressar o gene inserido em células animais. A sequência de nucleotídeo de cada fragmento de DNA foi determinada usando o kit BigDye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems) com o Sequenciador de DNA ABI PRISM 3730xL ou o Sequenciador de DNA ABI PRISM 3700 (Applied Biosystems) de acordo com o método descrito no manual de instrução em anexo. Preparo de região variável for NS22 humanizado H1
[000539] H1-SKSC (SEQ ID NO: 130) foi gerada substituindo a glu- tamina (E) na posição de numeração de Kabat 73 na FR3 de H0- SKSC (SEQ ID NO: 54) por lisina (K). O mutante foi preparado usando o kit QuikChange Site-Directed Mutagenesis (Stratagene) comercialmente disponível de acordo com o manual de instrução em anexo. Expressão de anticorpo IgG-convertido
[000540] Expressão de anticorpo foi realizada por meio do método descrito abaixo. A linhagem de célula derivada de célula de câncer renal fetal humano HEK293H (Invitrogen) foi suspensa em DMEM (Invi- trogen) contendo soro bovino fetal a 10% (Invitrogen) e 10 ml de células em uma densidade de 5-6 x 105 células/ml foram cultivados sobre discos para células aderentes (10 cm de diâmetro; CORNING). As células foram incubadas em uma incubadora de CO2 (37°C, 5% de CO2) durante um dia e noite inteiros. Então, o meio foi removido mediante aspiração e 6,9 ml de meio CHO-S-SFMII (Invitrogen) foram adi-cionados às células. A mistura de DNA de plasmídeo preparada (13,8 μg no total) foi misturada com 20,7 μl de polietilenoimina a 1 μg/ml (Polysciences Inc.) e 690 μl de meio CHO-S-SFMII e deixada descansar em temperatura ambiente durante 10 minutos. A mistura foi adicionada às células em cada disco e as células foram incubadas em uma incubadora de CO2 (5% CO2, 37°C) durante quatro a cinco horas. Então, 6,9 ml de meio CHO-S-SFMII (Invitrogen) foram adicionados e as células foram incubadas em uma incubadora de CO2 durante três dias. O sobrenadante de cultura foi coletado e centrifugado (aprox. 2000 g, cinco minutos, temperatura ambiente) para remover as células. O so- brenadante foi, então, esterilizado por meio de filtração através de um filtro de 0,22 μm MILLEX®-GV (Millipore). Cada amostra foi armazenada a 4°C até uso. Purificação de anticorpo IgG-convertido
[000541] 50 μl de rProteína A SepharoseTM Fast Flow (Amersham Biosciences) suspensa em TBS foram adicionados ao sobrenadante de cultura obtido e misturados mediante inversão a 4°C durante quatro horas ou mais. A solução foi transferida para um copo com filtro de 0,22 μm Ultrafree®-MC (Millipore). Após três lavagens com 500 μl de TBS, a resina rProteína A SepharoseTM foi suspensa em 100 μl de solução aquosa de acetato de sódio a 50 mM (pH de 3,3) e deixada descansar durante três minutos para eluir o anticorpo. A solução foi imediatamente neutrali- zada através da adição de 6,8 μl de Tris-HCl a 1,5 M (pH de 7,8). A elui- ção foi realizada duas vezes e 200 μl de anticorpo purificado foram obtidos. 2 μl de solução contendo anticorpo foram submetidos a um Espec- trofotômetro ND-1000 (NanoDrop) (Thermo Scientific NanoDropTM 1000 Spectrophotometer (Thermo Scientific)) ou 50 μl foram submetidos a um Espectrofotômetro DU-600 (BECKMAN) para medir a absorbância a 280 nm e a concentração de anticorpo foi calculada por meio do método de Pace et al. (Protein Science (1995) 4: 2411-2423). Medição de competição com IL-31 usando FMAT
[000542] Anticorpos foram avaliados quanto à atividade de inibição da ligação IL-31/NR10 usando células CHO que expressam hNR10, conforme descrito abaixo. O anticorpo quimérico NS22 e NS22_H0L0 (cadeia H, H0-SKSC/SEQ ID NO: 54; cadeia L, L0/SEQ ID NO: 56) foram diluídos em uma concentração apropriada usando tampão de Ensaio (HEPES a 10 mM, NaCl a 140 mM, CaCl2 a 2,5 mM, MgCl2 a 3 mM, FBS a 2%, NaN3 a 0,01%, pH de 7,4) e mais oito diluições seriais foram preparadas em uma proporção de diluição comum de 2. As diluições foram adicionadas a 40 μl/cavidade a lâminas (96-Well FMAT Plates, Applied Biosystems). Então, hIL-31 rotulado com FMAT Blue foi diluído 400 vezes com tampão de ensaio e adicionado a 20 μl/cavidade. Finalmente, uma suspensão de célula ajustada para 2,5 x 105 células/ml usando tampão de ensaio foi adicionada a 40 μl/cavidade (final 1 x 104 células/cavidade). Duas horas após a adição de células, a fluorescência (FL1) foi medida usando o 8200 Cellular Detection System (Applied Biosystems).
[000543] O resultado mostrou que, conforme mostrado na figura 9, anticorpos de NS22 humanizados H0L0 (cadeia H, H0-SKSC/SEQ ID NO: 54; cadeia L, L0/SEQ ID NO: 56) e H1L0 (cadeia H, H1- SKSC/SEQ ID NO: 130; cadeia L, L0/SEQ ID NO: 56) exibiam uma atividade de competição comparável àquela do anticorpo quimérico, sugerindo que H0L0 e H1L0 são anticorpos antirreceptor de IL-31 hu-manizados. Além disso, considera-se que as FRs usadas para H0L0 e H1L0 podem ser usadas para humanização.
[000544] Consequentemente, todas as mutações nas CDRs descritas nos Exemplos aqui depois podem ser introduzidas em H0 e H1. Tabela 2
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[Exemplo 5] Efeito de redução de heterogeneidade de novas regi-ões constantes M14 e M58 em anticorpo antirreceptor de IL31 humanizado
[000545] Conforme mostrado nos Exemplos de Referências 7 a 9, foi demonstrado que conversão da região constante de IgG2 para M14 ou M58 no anticorpo huPM1, um anticorpo antirreceptor de IL-6 humanizado, poderia reduzir a heterogeneidade derivada da região de dobradiça de IgG2 sem perda de estabilidade. Assim, anticorpos antirrecep- tor de IL-31 humanizados foram também testados para avaliar se a heterogeneidade pode ser reduzida mediante conversão de suas regiões constantes da IgG2 do tipo silvestre para M14 ou M58.
[000546] H0-M14, H0-M58, H0-IgG1 e H0-IgG2, os quais foram ge rados combinando IgG1 (SEQ ID NO: 60), IgG2 (SEQ ID NO: 132), M14 (SEQ ID NO: 129) e M58 (SEQ ID NO: 128) gerado nos Exemplos de Referências 8 e 9, com a região variável de cadeia H H0 (H0- VH/SEQ ID NO: 50) do anticorpo antirreceptor de IL-31 humanizado gerado no Exemplo 4, foram usadas como cadeias H e L0 (L0/SEQ ID NO: 56) produzida no Exemplo 4 foi usada como uma cadeia L, para gerar H0L0-IgG1 (cadeia H, H0-IgG1/SEQ ID NO: 133; cadeia L, L0/SEQ ID NO: 56), H0L0-IgG2 (cadeia H, H0-IgG2/SEQ ID NO: 134; cadeia L, L0/SEQ ID NO: 56), H0L0-M14 (cadeia H, H0-M14/SEQ ID NO: 135; cadeia L, L0/SEQ ID NO: 56) e H0L0-M58 (cadeia H, H0- M58/SEQ ID NO: 136; cadeia L, L0/SEQ ID NO: 56). Cada anticorpo foi expresso e purificado por meio do método descrito no Exemplo 4.
[000547] A heterogeneidade foi avaliada por meio de cromatografia de troca de cátions. Os anticorpos preparados foram avaliados quanto à heterogeneidade usando uma coluna ProPac WCX-10 (Dionex), acetato de sódio a 20 mM (pH de 5,0) como fase móvel A e acetato de sódio a 20 mM/NaCl a 1M (pH de 5,0) como fase móvel, com uma taxa de fluxo e gradiente apropriados. O resultado de avaliação por meio de cromatografia de troca de cátions (IEC) é mostrado na figura 10.
[000548] Conforme mostrado na figura 10, a heterogeneidade foi aumentada mediante conversão da região constante de IgG1 para IgG2 no anticorpo antirreceptor de IL-31 e a heterogeneidade pode ser reduzida mediante conversão da região constante para M14 ou M58 em qualquer anticorpo. [Exemplo 6] Efeito de aprimoramento de farmacocinética da nova região constante M58 em anticorpos antirreceptor de IL-31
[000549] Conforme mostrado no Exemplo de Referência 9, descobriu-se que conversão da região constante de IgG1 para M58 no anticorpo antirreceptor de IL-6 huPM1 aprimora sua atividade de ligação ao FcRn humano e a farmacocinética em camundongos transgênicos para FcRn humano. Assim, anticorpos antirreceptor de IL-31 foram também testados para avaliar se conversão da região constante para M58 aprimora sua farmacocinética.
[000550] H0L0-IgG1 (cadeia H: H0-IgG1/SEQ ID NO: 133; cadeia L: L0/SEQ ID NO: 56) e H0L0-M58 (cadeia H: H0-M58/SEQ ID NO: 136; cadeia L L0/SEQ ID NO: 56) preparados conforme descrito nos Exemplos 4 e 5 foram avaliados quanto à atividade de ligação ao FcRn humano por meio do método descrito no Exemplo de Referência 9. O resultado é mostrado na Tabela 3. Tabela 3
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[000551] Conforme mostrado na Tabela 3, conversão da região constante de IgG1 para M58 também aprimorou a atividade de ligação ao FcRn humano do anticorpo antirreceptor de IL-31 H0L0 conforme no anticorpo antirreceptor de IL-6 hPM1. Isso sugere que conversão da região constante de IgG1 para M58 pode aprimorar a farmacociné- tica do anticorpo antirreceptor de IL-31 em seres humanos. [Exemplo 7] Identificação de sítios de mutação que reduzem o ponto isoelétrico Produção de mutantes
[000552] Cada mutante foi produzido por meio do método descrito no Exemplo 4 ou através de PCR de montagem. No método usando PCR de montagem, oligo DNAs são sintetizados baseado em sequências dianteira e reversa que incluem um sítio alterado. O oligo DNA dianteiro incluindo um sítio alterado e o oligo DNA reverso que se liga ao vetor no qual o gene a ser alterado foi inserido foram combinados o oligo DNA reverso incluindo um sítio alterado e oligo DNA dianteiro que se liga ao vetor no qual o gene foi a ser alterado foi inserido foram combinados. PCR foi realizada usando PrimeSTAR (Takara) para produzir fragmentos de extremidade 5’ e extremidade 3’ incluindo o sítio alterado. Os dois fragmentos foram montados por meio de PCR de montagem para produzir cada mutante. O mutante produzido foi inserido em um vetor de expressão capaz de expressar o gene inserido em células animais. A sequência de nucleotídeo do vetor de expressão resultante foi determinada por meio de um método conhecido por aqueles versados no campo. Anticorpos foram produzidos e purificados por meio do método descrito no Exemplo 4. Identificação de sítios de mutação
[000553] Para aprimorar a farmacocinética de H0L0 (cadeia H, H0- SKSC/SEQ ID NO: 54; cadeia L, L0/SEQ ID NO: 56), sítios alterados capazes de reduzir o ponto isoelétrico da região variável foram examinados. Triagem de sítios de mutação nas regiões variáveis previstas a partir do modelo de estrutura tridimensional revelou sítios de mutação que diminuiriam o ponto isoelétrico das regiões variáveis sem reduzir significativamente sua ligação a NR10. Esses são resumidos na Tabela 4 (Hp5-VH/SEQ ID NO: 137, Hp7-VH/SEQ ID NO: 138, Hp8- VH/SEQ ID NO: 139, Hp6-VH/SEQ ID NO: 140, Hp9-VH/SEQ ID NO: 141, Hp1-VH/SEQ ID NO: 142, Hp13-VH/SEQ ID NO: 143, Lp1- VL/SEQ ID NO: 144, Lp2-VL/SEQ ID NO: 145, Lp3-VL/SEQ ID NO: 146, Lp4-VL/SEQ ID NO: 147, Lp7-VL/SEQ ID NO: 148, Lp5-VL/SEQ ID NO: 149, Lp6-VL/SEQ ID NO: 150). Cada variante foi produzida e purificada por meio do método descrito no Exemplo 4.
[000554] Cada variante foi testada com relação à atividade de inibição de ligação a hIL-31/hNR10 usando FMAT. O teste foi realizado de acordo com o método conforme descrito no Exemplo 4. Conforme mostrado na figura 11, a atividade de competição de cada variante não foi grandemente reduzida quando comparado com aquela do H0L0. Tabela 4
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[000555] Asterisco (*) na Tabela 4 acima indica um sítio que não era relevante para o ponto isoelétrico, mas alterado para conversão em uma sequência humana.
[000556] Exemplos dos anticorpos NS22 humanizados cujo ponto isoelétrico foi reduzido mediante combinação dessas alterações incluem Hp3Lp15 (cadeia H: Hp3-SKSC/SEQ ID NO: 151; cadeia L: Lp15/SEQ ID NO: 152). A afinidade pela NR10, ponto isoelétrico e retenção plasmática em camundongos foram comparados entre Hp3Lp15 e H0L0. Medição de afinidade
[000557] A afinidade de cada anticorpo pela NR10 foi determinada por meio do método descrito no Exemplo de Referência 10.
[000558] O resultado de medição de afinidade é mostrado na Tabela 5. Foi mostrado que a afinidade de Hp3Lp15 era quase a mesma conforme aquela do H0L0. Tabela 5
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Medição do ponto isoelétrico
[000559] Cada anticorpo foi analisado por meio de focalização isoe- létrica para avaliar alterações no ponto isoelétrico do anticorpo todo em virtude das alterações de aminoácido em sua região variável. Fo- calização isoelétrica foi realizada por meio do método a seguir.
[000560] Gel Phast-Gel Dry IEF (Amersham Biosciences) foi intumescido em Phastsystem Cassette (Amersham Biosciences) durante cerca de 30 minutos usando a solução de intumescimento mostrada abaixo. Água MilliQ 1,5 ml Pharmalyte 5-8 for IEF (Amersham Biosciences) 100 μl
[000561] Eletroforese foi realizada em PhastSystem (Amersham Biosciences) usando o gel intumescido de acordo com o programa indicado abaixo. As amostras foram carregadas sobre o gel na Etapa 2. Calibration Kit for pI (Amersham Biosciences) foi usado como um marcador de pI. Etapa 1: 2000 V 2,5 mA 3,5 W 15°C 75 Vh Etapa 2: 200 V 2,5 mA 3,5 W 15°C 15 Vh Etapa 3: 2000 V 2,5 mA 3,5 W 15°C 410 Vh
[000562] Após eletroforese, o gel foi fixado com TCA a 20% e, então, corado com prata usando o kit Silver Staining Protein (Amersham Biosciences), de acordo com o protocolo em anexo ao kit. Após coloração, o ponto isoelétrico da amostra (o anticorpo todo) foi calculado a partir dos pontos isoelétricos conhecidos dos marcadores de pI.
[000563] O resultado de medição do ponto isoelétrico por meio de focalização isoelétrica mostrou que o ponto isoelétrico de H0L0 era cerca de 7,8 e o ponto isoelétrico de Hp3Lp15 era cerca de 5,5, o que mostra que o ponto isoelétrico de Hp3Lp15 era diminuído em cerca de 2,3 quando comparado com o H0L0. Quando o ponto isoelétrico teórico da região variável VH/VL foi calculado pela GENETYX (GENETYX CORPORATION), os pontos isoelétricos teóricos das regiões variáveis de H0L0 e Hp3Lp15 foram 7,76 e 4,63, respectivamente. Assim, o ponto isoelétrico teórico de Hp3Lp15 era diminuído em 3,13 quando comparado com o H0L0. Avaliação de farmacocinética de anticorpo com ponto isoelétrico reduzido usando camundongos
[000564] De forma a avaliar a retenção plasmática de Hp3Lp15, um anticorpo modificado com ponto isoelétrico reduzido, a retenção plas- mática de H0L0 e Hp3Lp15 foi comparada em camundongos normais. Uma única dose de H0L0 ou Hp3Lp15 foi intravenosamente administrada a 1 mg/kg aos camundongos (C57BL/6J, Charles River Japan, Inc.) para comparar o curso de tempo da concentração plasmática. As concentrações plasmáticas foram determinadas por meio de ELISA. Concentrações apropriadas de uma amostra de calibração e amostras de plasma de teste foram distribuídas em Immunoplates (Nunc- Immuno Plate, MaxiSorp (Nalge Nunc International)) revestidas com anticorpo anti-IgG humana (Fc-específico) (Sigma). As amostras foram deixadas descansar em temperatura ambiente durante uma hora. Após reação com IgG-ALP de cabra anti-IgG humana (Sigma) em temperatura ambiente durante uma hora, a reação de desenvolvimento de cor foi realizada usando o BluePhos Microwell Phosphatase Substrates System (Kirkegaard & Perry Laboratories) como um substrato. A absorbância a 650 nm foi medida com um Microplate Reader. As con-centrações plasmáticas foram determinadas baseado na absorbância da curva de calibração usando o software analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices).
[000565] Os parâmetros farmacocinéticos (AUC e liberação sistêmi- ca (CL)) foram calculados a partir dos dados de curso de tempo obtidos da concentração plasmática usando o software de análise farma- cocinética WinNonlin (Pharsight). Os parâmetros são mostrados na Tabela 6. AUC e a liberação de Hp3Lp15 após a administração intravenosa foram aumentados em cerca de 14% e reduzidos em cerca de 12%, respectivamente, quando comparado com H0L0. Assim, foi demonstrado que Hp3Lp15, no qual o ponto isoelétrico do H0L0 foi reduzido, tinha farmacocinética aprimorada. Tabela 6
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[Exemplo 8] Efeito de combinações de região variável e região constante sobre a atividade biológica
[000566] De forma a avaliar os efeitos de diferentes regiões constantes sobre a atividade biológica, as variantes a seguir foram produzidas.
[000567] SKSC (SEQ ID NO: 62) e M58 (SEQ ID NO: 128), regiões constantes preparadas nos Exemplos de Referência 7 e 9, foram com-binadas com Hp3 (Hp3-VH/SEQ ID NO: 167), a região variável preparada no Exemplo 7, para produzir Hp3-M58 (SEQ ID NO: 240) e Hp3- SKSC (SEQ ID NO: 151) como cadeias H. As cadeias H preparadas foram combinadas com Lp15 (Lp15/SEQ ID NO: 152), uma cadeia L preparada no Exemplo 7, para produzir Hp3Lp15-SKSC (cadeia H, Hp3-SKSC/SEQ ID NO: 151; cadeia L, Lp15/SEQ ID NO: 152) e Hp3Lp15-M58 (cadeia H, Hp3-M58/SEQ ID NO: 240; cadeia L, Lp15/SEQ ID NO: 152). Cada anticorpo foi expresso e purificado por meio do método descrito no Exemplo 4.
[000568] Os anticorpos produzidos conforme descrito acima, H0L0- SKSC (cadeia H, H0-SKSC/SEQ ID NO: 54; cadeia L, L0/SEQ ID NO: 56) preparados usando a região constante SKSC (SEQ ID NO: 62) descrita no Exemplo de Referência 7 e H0L0-M58 (cadeia H, H0- M58/SEQ ID NO: 136; cadeia L, L0/SEQ ID NO: 56) e H0L0-IgG2 (cadeia H, H0-IgG2/SEQ ID NO: 134; cadeia L, L0/SEQ ID NO: 56) preparada no Exemplo 5, foram avaliados quanto à atividade biológica por meio do método descrito no Exemplo 2 usando BaF/NR10. O resultado é resumido na figura 18.
[000569] Conforme mostrado na figura 18, nenhuma diferença significativa na atividade biológica foi detectada entre as regiões constantes. Uma vez que a atividade biológica não foi afetada quando de combinação das duas regiões variáveis H0 e Hp3 com cada região constante, combinação de regiões variáveis criadas no futuro com qualquer região constante não resultaria em alteração na atividade biológica. [Exemplo 9] Identificação de sítios de mutação que suprimem a degradação através do estudo de aceleração térmica
[000570] Anticorpos usados para produtos farmacêuticos têm hete-rogeneidade, mesmo embora eles sejam anticorpos monoclonais obtidos a partir de clones derivados de células que produzem um único anticorpo. Tal heterogeneidade de anticorpo é conhecida como resultando de modificação, tal como oxidação ou deamidação, e será aumentada durante armazenamento a longo prazo ou quando de exposição a condições de estresse, tal como estresse pelo calor ou estresse pela luz (veja "Heterogeneity of Monoclonal Antibodies", Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 97, No. 7, 2426-2447). Contudo, quando um anticorpo é desenvolvido como um produto farmacêutico, as propriedades físicas da proteína, particularmente homogeneidade e estabilidade, são altamente importantes. Assim, é desejado que a heterogeneidade de substâncias desejadas/relacionadas seja reduzida e a substância seja composta da uma única substância tanto quanto possível. Nesse contexto, o experimento descrito abaixo foi conduzido pa- ra avaliar a heterogeneidade do anticorpo sob condições de estresse e reduzir a heterogeneidade.
[000571] Para avaliar os produtos da degradação, uma amostra acelerada de H0L0 (cadeia H, H0-SKSC/SEQ ID NO: 54; cadeia L, L0/SEQ ID NO: 56) foi preparada por meio do método descrito abaixo. A amostra acelerada preparada e a amostra não acelerada (inicial) foram analisadas por meio de cromatografia de troca de cátions usando o método descrito abaixo. - Método para preparo de amostras aceleradas Tampão: PBS Concentração de anticorpo: 0,2 a 1,0 mg/ml Temperatura de aceleração: 60°C Período de aceleração: um dia -Método para análise por meio de cromatografia de troca de cátions Coluna: ProPac WCX-10, 4 x 250 mm (Dionex) Fase móvel: (A) MES/NaOH a 25 mmol/l, pH de 6,1 (B) MES/NaOH a 25 mmol/l, NaCl a 250 mmol/l, pH de 6,1 Taxa de fluxo: 0,5 ml/min Temperatura da coluna: 40°C Gradiente: %B 0 a 0 (0-5 mrn)>0 a 30 (5-80 min) Detecção: 280 nm
[000572] Os cromatogramas resultantes para amostras de H0L0 antes e após aceleração são mostrados na figura 19. A amostra de H0L0 após aceleração tinha uma tendência a mostrar um pico básico aumentado.
[000573] Então, triagem foi realizada para reduzir esse pico. Como um resultado, Ha355, Ha356, Ha360 e Ha362 foram descobertas. Essas variantes de cadeia H foram combinadas com L0 para produzir Ha355L0 (cadeia H, Ha355-SKSC/SEQ ID NO: 242; cadeia L, L0/SEQ ID NO: 56), Ha356L0 (cadeia H, Ha356-SKSC/SEQ ID NO: 243; cadeia L, L0/SEQ ID NO: 56), Ha360L0 (cadeia H, Ha360-SKSC/SEQ ID NO: 244; cadeia L, L0/SEQ ID NO: 56) e Ha362L0 (cadeia H, Ha362- SKSC/SEQ ID NO: 245; cadeia L, L0/SEQ ID NO: 56). A sequência de cada variante é mostrada na Tabela 7. Tabela 7
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[000574] Cada um dos anticorpos identificados foi expresso e purificado por meio do método descrito no Exemplo 4. Conforme com H0L0, uma amostra acelerada de cada anticorpo preparado foi preparada e analisada por meio de cromatografia de troca de cátions. O resultado é mostrado na figura 19.
[000575] O resultado mostrou que a geração do pico básico aumentou após aceleração ser reduzida no anticorpo modificado contendo a substituição de ácido aspártico por ácido glutâmico na posição 101 na cadeia H, quando comparado com H0L0. Os anticorpos modificados foram avaliados quanto à atividade biológica por meio do método descrito no Exemplo 2 usando BaF/NR10. O resultado é mostrado na figu- ra 20. Conforme mostrado na figura 20, as atividades biológicas dos anticorpos modificados eram comparáveis ou mais fortes do que aquela do H0L0. Essas descobertas demonstraram que as modificações de Ha355, Ha356, Ha360 e Ha362 suprimiram a geração de produtos da degradação através de aceleração e, portanto, são eficazes no aprimoramento de estabilidade do anticorpo. [Exemplo 10] Identificação de sítios de mutação que aumentam a afinidade
[000576] Uma biblioteca na qual mutações foram introduzidas em sequências de CDR foi construída e examinada para aprimorar a afinidade de H0L0 pela NR10. Como um resultado de triagem da biblioteca na qual mutações foram introduzidas nas CDRs, mutações que aprimoram a afinidade pela NR10 foram descobertas. As mutações são mostradas na Tabela 8. Cada uma das variantes de cadeia H Ha101- SKSC (SEQ ID NO: 246), Ha103-SKSC (SEQ ID NO: 247), Ha111- SKSC (SEQ ID NO: 248), Ha204-SKSC (SEQ ID NO: 249) e Ha219- SKSC (SEQ ID NO: 250) foi combinada com L0 (L0/SEQ ID NO: 56); e cada uma das cadeias L modificadas La134 (SEQ ID NO: 251), La130 (SEQ ID NO: 252), La303 (SEQ ID NO: 253) e La328 (SEQ ID NO: 254) foi combinada com H0 (H0-SKSC/SEQ ID NO: 54), para construir um anticorpo. Cada variante foi produzida e purificada por meio do método descrito no Exemplo 4.
[000577] A afinidade de cada anticorpo pela NR10 foi avaliada usando Biacore. O resultado é mostrado na Tabela 9. O ensaio foi realizado usando o método descrito no Exemplo de Referência 10. Conforme mostrado na Tabela 9, descobriu-se que o valor de KD para cada variante era aprimorado quando comparado com aquele de H0L0 (cadeia H, H0-SKSC/SEQ ID NO: 54; cadeia L, L0/SEQ ID NO: 56). Tabela 8
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Tabela 9
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[000578] Exemplos de combinações dessas mutações que aprimoram a afinidade com as mutações para diminuição do ponto isoelétrico geradas no Exemplo 7 incluem, por exemplo, Ha401La402 (cadeia H, Ha401-SKSC/SEQ ID NO: 255; cadeia L, La402/SEQ ID NO: 256) e H17L11 (cadeia H, H17-M58/SEQ ID NO: 222; cadeia L, L11/SEQ ID NO: 236). Cada variante foi produzida e purificada por meio do método descrito no Exemplo 4.
[000579] Ha401La402 (cadeia H, Ha401-SKSC/SEQ ID NO: 255; ca deia L, La402/SEQ ID NO: 256) foi avaliada quanto à sua afinidade pela NR10 e sua atividade biológica por meio do método descrito no Exemplo de Referência 10 e do método usando BaF/NR10, conforme descrito no Exemplo 2, respectivamente e elas foram comparadas com aquelas de H0L0 (cadeia H, H0-SKSC/SEQ ID NO: 54; cadeia L, L0/SEQ ID NO: 56). O resultado de medição de afinidade é mostrado na Tabela 10 e a atividade biológica determinada usando BaF/NR10 é mostrada na figura 21. Descobriu-se que a afinidade e atividade biológica eram ambas aprimoradas quando comparado com aquelas do H0L0 (cadeia H, H0- SKSC/SEQ ID NO: 54; cadeia L, L0/SEQ ID NO: 56). Tabela 10
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[000580] Além disso, H17L11 (cadeia H, H17-M58/SEQ ID NO: 222; cadeia L, L11/SEQ ID NO: 236) foi avaliada quanto à sua afinidade pela NR10 e sua atividade biológica por meio do método descrito no Exemplo 7 e do método usando BaF/NR10, conforme descrito no Exemplo 2, respectivamente e elas foram comparadas com aquelas de H0L0 (cadeia H, H0-M58/SEQ ID NO: 136; cadeia L, L0/SEQ ID NO: 56). O resultado de medição de afinidade é mostrado na Tabela 11 e a atividade biológica determinada usando BaF/NR10 é mostrada na figura 22. Descobriu-se que a afinidade e atividade biológica eram ambas aprimoradas quando comparado com aquelas do H0L0 (cadeia H, H0- M58/SEQ ID NO: 136; cadeia L, L0/SEQ ID NO: 56). Tabela 11
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[Exemplo 11] Identificação de sítios de mutação que reduzem o risco de imunogenicidade Redução do risco de imunogenicidade em CDR1 de cadeia H
[000581] Epitopos de célula T presentes na sequência de região variável de H0L0 foram analisados usando TEPITOPE (Methods, Dezembro de 2004; 34(4): 468-75). Como um resultado, a CDR1 da ca- deia H foi prevista como tendo muitos epitopos de célula T que se ligam ao HLA (isto é, têm sequências com um alto risco de imunogeni- cidade). Então, análise TEPITOPE foi realizada para examinar substituições que reduziriam o risco de imunogenicidade da CDR1 de cadeia H. Como um resultado, descobriu-se que o risco de imunogenicidade era grandemente reduzido substituindo a isoleucina na posição 33 em numeração de Kabat por alanina (A) (Tabela 12). Então, essa alteração foi adicionada a H17 gerada no Exemplo 10 para produzir H19 (H19-M58/SEQ ID NO: 223). A H19 gerada foi combinada com L12 para produzir H19L12 (cadeia H, H19-M58/SEQ ID NO: 223; cadeia L, L12/SEQ ID NO: 237). Cada variante foi produzida e purificada por meio do método descrito no Exemplo 4.
[000582] O anticorpo foi avaliado quanto à afinidade for NR10 e a atividade biológica por meio do método descrito no Exemplo de Referência 10 e do método usando BaF/NR10, conforme descrito no Exemplo 2, respectivamente e elas foram comparadas com aquelas de H0L0 (cadeia H, H0-M58/SEQ ID NO: 136; cadeia L, L0/SEQ ID NO: 56). O resultado de medição de afinidade é mostrado na Tabela 13 e a atividade biológica determinada usando BaF/NR10 é mostrada na figura 23. Foi mostrado que a afinidade e atividade biológica são ambas quase iguais àquelas do H0L0. Tabela 12
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Tabela 13
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Redução do risco de imunogenicidade na CDR1 de cadeia L
[000583] Treonina (T) presente como uma posição 25 na numeração de Kabat na CDR1 da cadeia L corresponde à alanina (A) ou serina (S) na sequência de linhagem germinativa. Assim, é previsto que o risco de imunogenicidade é reduzido substituindo treonina (T) na posição 25 por alanina (A) ou serina (S) (Tabela 14). Portanto, a substituição acima foi adicionada a L12 para produzir L17 (SEQ ID NO: 238). A L17 produzida foi combinada com H0 para produzir H0L17 (cadeia H, H0-M58/SEQ ID NO: 136; cadeia L, L17/SEQ ID NO: 238). Cada variante foi produzida e purificada por meio do método descrito no Exemplo 4.
[000584] Cada variante foi avaliada quanto à afinidade pela NR10 e a atividade biológica por meio do método descrito no Exemplo de Referência 10 e do método usando BaF/NR10, conforme descrito no Exemplo 2, respectivamente e elas foram comparadas com aquelas do H0L0 (cadeia H, H0-M58/SEQ ID NO: 136; cadeia L, L0/SEQ ID NO: 56) e H0L12 (cadeia H, H0-M58/SEQ ID NO: 136; cadeia L, L12/SEQ ID NO: 237). Uma vez que L12 contém uma sequência que aprimora a afinidade, ela exibe uma afinidade cerca de duas vezes maior do que o H0L0. O resultado de medição de afinidade é mostrado na Tabela 15 e a atividade biológica determinada usando BaF/NR10 é mostrada na figura 24. Foi mostrado que a afinidade e atividade biológica são ambas quase iguais àquelas do H0L12. Tabela 14
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Tabela 15
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[Exemplo 12] Preparo de anticorpo NS22 completamente humanizado
[000585] Regiões variáveis de variantes NS22 foram preparadas combinando as múltiplas mutações que reduzem o pI, aumentam a afinidade, suprimem a degradação da cadeia H e reduzem o risco de imunogenicidade, todos os quais foram encontrados nos Exemplos acima, em H0 (H0-M58/SEQ ID NO: 136), H1 (H1-M58/SEQ ID NO: 257) ou L0 (L0/SEQ ID NO: 56) e submetidas a vários procedimentos de triagem. Como um resultado, H28L17 (cadeia H, H28-M58/SEQ ID NO: 224; cadeia L, L17/SEQ ID NO: 238), H30L17 (cadeia H, H30- M58/SEQ ID NO: 225; cadeia L, L17/SEQ ID NO: 238), H34L17 (cadeia H, H34-M58/SEQ ID NO: 226, cadeia L, L17/SEQ ID NO: 238), H42L17 (cadeia H, H42-M58/SEQ ID NO: 227; cadeia L, L17/SEQ ID NO: 238), H44L17 (cadeia H, H44-M58/SEQ ID NO: 228; cadeia L, L17/SEQ ID NO: 238), H46L17 (cadeia H, H46-M58/SEQ ID NO: 229; cadeia L, L17/SEQ ID NO: 238), H57L17 (cadeia H, H57-M58/SEQ ID NO: 230; cadeia L, L17/SEQ ID NO: 238), H71L17 (cadeia H, H71- M58/SEQ ID NO: 231; cadeia L, L17/SEQ ID NO: 238), H78L17 (ca-deia H, H78-M58/SEQ ID NO: 232; cadeia L, L17/SEQ ID NO: 238), H92L17 (cadeia H, H92-M58/SEQ ID NO: 233; cadeia L, L17/SEQ ID NO: 238), H97L50 (cadeia H, H97-M58/SEQ ID NO: 234; cadeia L, L50/SEQ ID NO: 239) e H98L50 (cadeia H, H98-M58/SEQ ID NO: 235; cadeia L, L50/SEQ ID NO: 239) foram descobertos. Cada variante foi produzida e purificada por meio do método descrito no Exemplo 4.
[000586] Cada variante foi avaliada quanto à afinidade pela NR10 e a atividade biológica por meio do método descrito no Exemplo de Referência 10 e do método usando BaF/NR10, conforme descrito no Exemplo 2, respectivamente e elas foram comparadas com aquelas de H0L0 (cadeia H, H0-M58/SEQ ID NO: 136; cadeia L, L0/SEQ ID NO: 56). O resultado de medição de afinidade é mostrado na Tabela 16 e a atividade biológica determinada usando BaF/NR10 é mostrada nas figuras 25-1 e 25-2. Foi mostrado que a afinidade e atividade biológica de cada anticorpo eram ambas quase iguais ou maiores do que aquelas do H0L0. Tabela 16
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[Exemplo 13] Análise do domínio de ligação do anticorpo de neu-tralização anti-NR10 (1) Preparo de antígenos humanos/de camundongo do tipo silvestre e quiméricos
[000587] Os genes que codificam os domínios extracelulares humano e de camundongo do tipo silvestre e domínios quiméricos extracelu- lares de NR10 (hhh (SEQ ID NO: 258), mmm (SEQ ID NO: 259), hhm (SEQ ID NO: 260), mmh (SEQ ID NO: 261), hmm (SEQ ID NO: 262), mhm (SEQ ID NO: 263) e mhh (SEQ ID NO: 264)), foram fundidos à tag His e tag Myc (HHHHHHEQKLISEEDL/SEQ ID NO: 287) em seus C-términos, inseridos em um vetor de expressão animal e transitoriamente expressos usando o FreeStyle 293 Expression System (Invitro- genTM). Diagramas esquemáticos para as NR10-EDCs humanas/de camundongo do tipo silvestre e quiméricas são mostrados na figura 26.
[000588] Os antígenos humano/de camundongo do tipo silvestre e quiméricos (hhh, mmm, hhm, mmh, hmm, mhm e mhh) foram purificados a partir dos sobrenadantes de cultura por meio de cromatografia em coluna Ni-NTA Superflow. Especificamente, 1 ml de Ni-NTA Superflow (QIAGEN) foi carregado sobre uma Coluna Poly-Prep Empty (BioRad) e 30 ml de cada sobrenadante de cultura foram adicionados à mesma. Após lavagem com D-PBS (solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco) contendo cloreto de sódio a 150 mM e imidazol a 20 mM, a coluna foi eluída com D-PBS contendo cloreto de sódio a 150 mM e imidazol a 250 mM. O tampão das frações eluídas foi trocado para D-PBS e as frações foram concentradas usando Amicon-Ultra (Millipore) com um corte de peso molecular de 10K. (2) Detecção de ligação a antígeno por meio de Western blotting
[000589] Cada um dos antígenos humano/de camundongo do tipo silvestre e quiméricos preparados foi submetido à eletroporação a 0,5 μg/fileira sobre três géis de poliacrilamida a 4-20% (Daiichi Pure Chemicals Co.). As proteínas foram eletrotransferidas para membranas de PVDF (Millipore) em um aparelho de blotting semisseco e as membra- nas foram bloqueadas com TBS contendo leite desnatado a 5%. Uma membrana foi incubada com 5 μg/ml de H44M58L17 (sistema de detecção para anticorpo anti-NR10 humana humanizado); outra com 5 μg/ml de ND41 (sistema de detecção para anticorpo anti-NR10 humana de camundongo); e a outra com anticorpo anti-Myc (SantaCruz, Cat.#sc-789) diluído 500 vezes com TBS contendo leite desnatado a 5% (sistema de detecção para a tag Myc) em temperatura ambiente durante uma hora.
[000590] Após lavagem três vezes com TBS contendo TweenTM 20 a 0,05%, os anticorpos secundários foram incubados com as membranas. Anticorpo de cabra anti-IgGY humana rotulada com fosfatase alcalina (BIOSOURCE, Cat. #AHI0305) foi usado para detectar o anticorpo anti-NR10 humana humanizado; anticorpo de cabra anti-IgG de camundongo rotulado com fosfatase alcalina (SantaCruz, Cat. #sc- 2008) foi usado para detectar o anticorpo anti-NR10 humana de camundongo; e anticorpo de cabra anti-IgG de coelho rotulado com fos- fatase alcalina (SantaCruz, Cat. #sc-2057) foi usado para detectar a tag Myc. A reação foi realizada em temperatura ambiente durante uma hora. Após lavagem quatro vezes TBS contendo TweenTM 20 a 0,05% durante três minutos, desenvolvimento da cor foi obtido usando substrato de Fosfatase BCIP/NBT, Sistema com 1 Componente (KPL). TBS (solução salina tamponada com Tris) usado aqui foi preparado dissolvendo um pacote de pó de TBS (solução salina tamponada com Tris) (TaKaRa) em 1 L de água destilado. O resultado é mostrado na figura 27.
[000591] Quando o anticorpo humanizado ou anticorpo de camundongo foi usado, a ligação foi detectada apenas para hhh, hhm e hmm, os quais são domínios extracelulares de NR10. [Exemplo de Referência 1] Isolamento dos genes de NR10, OSMR e IL-31 de macaco cinomolgo
[000592] Uma vez que a reatividade cruzada e atividade de neutralização em macacos cinomolgo foram consideradas importantes para avaliação de segurança em um estágio pré-clínico, os genes de NR10 e OSMR de macaco cinomolgo foram isolados. Iniciadores foram criados baseado na informação publicada do genoma de macaco Rhesus e outros e os genes de NR10 e OSMR foram amplificados com sucesso por meio de PCR a partir de cDNA pancreático de macaco cinomol- go. As sequências dos genes de NR10, OSMR e IL-31 de macaco ci- nomolgo isoladas são mostradas em SEQ ID NOs: 65, 69 e 67, respectivamente e as sequências de aminoácido de NR10, OSMR e IL-31 de macaco cinomolgo são mostradas em SEQ ID NOs: 66, 70 e 68, respectivamente. [Exemplo de Referência 2] Estabelecimento de linhagens de célula Ba/F3 expressando NR10 e OSMR
[000593] O cDNA de NR10 humana de comprimento total (SEQ ID NO: 75) foi inserido no vetor de expressão pCOS1 (Biochem. Biophys. Res. Commun. 228, páginas 838-45, 1996) e o vetor resultante foi denominado pCosNR10.3. Um cDNA do receptor de oncostatina M (OSMR, Acesso ao GenBank No. NM003999) foi isolado por meio de PCR de uma biblioteca placentária humana e o vetor de expressão pCosl-hOSMR foi construído da mesma maneira. 10 μg de cada um dos vetores foram simultaneamente introduzidos na linhagem de célula derivada de célula pró-B IL-3 dependente de camundongo Ba/F3 por meio de eletroporação (BioRad Gene Pulser, 960 μF, 0,33 kV). Após introdução, IL-31 humana (R&D Systems) foi adicionada e as células foram cultivadas para obter uma linhagem de célula (hNR10/hOSMR/BaF3 cell) que prolifera de uma maneira dependente de IL-31. Além disso, o gene de IL-31 de macaco cinomolgo (SEQ ID NO: 67) foi inserido em um vetor de expressão de célula de mamífero e introduzido na linhagem de célula CHO DG44. O sobrenadante de cultura resultante foi obtido como IL-31 de macaco cinomolgo. Conforme com hNR10/hOSMR/BaF3, os genes de NR10 e OSMR de macaco cinomolgo de comprimento total foram inseridos no vetor de expressão pCOS1 e expressos em células Ba/F3 e uma linhagem de célula dependente de IL-31 de macaco cinomolgo (células cynNR10/cynOSMR/BaF3) foi estabelecida usando o sobrenadante de cultura descrito acima. [Exemplo de Referência 3] Estabelecimento de linhagens de célula CHO expressando NR10
[000594] Os genes para NR10 humana carecendo do domínio cito- plásmico (SEQ ID NO: 73) e NR10 de macaco cinomolgo carecendo de domínio citoplásmico (SEQ ID NO: 71) foram, cada um, inseridos em um vetor de expressão de célula de mamífero. Os vetores resultantes foram linearizados com uma enzima de restrição e, então, introduzidos na linhagem de célula CHO DG44 por meio de eletroporação (BioRad Gene Pulser, 25 μF, 1,5 kV). Após seleção com fármaco, células expressando NR10 foram selecionadas e estabelecidas mediante análise FCM usando anticorpo anti-NR10 humana. A sequência de aminoácido codificada pela a sequência de nucleotídeo do gene de NR10 humana carecendo de domínio citoplásmico (SEQ ID NO: 73) é mostrada em SEQ ID NO: 74 e a sequência de aminoácido codificada pela sequência de nucleotídeo do gene de NR10 de macaco cinomol- go carecendo do domínio citoplásmico (SEQ ID NO: 71) é mostrada em SEQ ID NO: 72. [Exemplo de Referência 4] Preparo de proteína NR10 (domínio ex- tracelular)
[000595] O cDNA de NR10 humana foi usado como um padrãopara amplificar apenas o domínio extracelular por meio de PCR. A região amplificada foi, então, fundida a uma sequência de tag FLAG no C- término e inserida em um vetor de expressão de célula de mamífero. Dez μg do vetor linearizado foram introduzidos na linhagem de célula de ovário de hâmster Chinês DG44 por meio de eletroporação (BioRad Gene PulserII, 25 μF, 1,5 kV). Uma linhagem de célula que mostra expressão em alto nível foi obtida. O sobrenadante da linhagem de célula cultivada em larga escala foi purificado usando uma coluna anti- anticorpo FLAG (Sigma) e filtração em gel para obter NR10 solúvel. A sequência de nucleotídeo da NR10 solúvel é mostrada em SEQ ID NO: 77 e a sequência de aminoácido é mostrada em SEQ ID NO: 78. [Exemplo de Referência 5] Preparo de anticorpos anti-NR10 humana
[000596] Camundongos foram imunizados com proteína NR10 humana (domínio extracelular) (descrita no Exemplo de Referência 4) e hibridomas foram preparados por meio de um método convencional. Os sobrenadantes de cultura desses hibridomas foram avaliados quanto à atividade de neutralização usando a célula de célula IL-31 humana-dependente (hNR10/hOSMR/BaF3 cell) descrita no Exemplo de Referência 2 e, pelo que NA633, o qual tem uma atividade de neutralização de NR10 foi obtido.
[000597] Além disso, imunização com DNA foi realizada por meio da pistola de gene acionada a gás He usando um vetor de expressão de mamífero trazendo o gene de NR10 humano de comprimento total (SEQ ID NO: 75) e hibridomas foram preparados por meio de um método convencional. Os sobrenadantes de cultura desses hibridomas foram avaliados quanto à atividade de neutralização usando a célula de célula IL-31 humana-dependente (hNR10/hOSMR/BaF3 cell) descrita no Exemplo de Referência 2 e, pelo que ND41 o qual tem uma atividade de neutralização de NR10, foi obtido. [Exemplo de Referência 6] Preparo de anticorpo quimérico humano
[000598] As sequências de aminoácido das regiões variáveis de ca- deia pesada e cadeia leve de NA633 são mostradas em SEQ ID NOs: 104 e 108, respectivamente. As sequências de aminoácido de CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável de cadeia pesada de NA633 são mostradas em SEQ ID NOs: 105, 106 e 107, respectivamente, enquanto que aquelas de CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável de cadeia leve são mostradas em SEQ ID NOs: 109, 110 e 111, respectivamente. Além disso, um anticorpo quimérico entre essas regiões variáveis de camundongo e região constante humana (cadeia H, y1; cadeia L, K) foi produzido por meio de um método convencional. [Exemplo de Referência 7] Preparo de huPM1-SKSC no qual a he-terogeneidade de IgG2 do tipo silvestre é reduzida sem perda de estabilidade
[000599] Uma vez que o anticorpo NS22 é um anticorpo de neutralização de NR10, sua ligação ao receptor FCY pode ser desfavorável considerando-se a imunogenicidade e efeitos adversos. Um possível método para redução da ligação ao receptor FCY é selecionar IgG2 ou IgG4 ao invés de IgG1 como o isotipo da região constante (Ann Hema- tol. Junho de 1998; 76(6): 231-48.). Do ponto de vista do receptor de Fcy I e retenção plasmática, a IgG2 tem sido considerada mais desejável do que a IgG4 (Nat Biotechnol. Dezembro de 2007; 25(12): 136972). Entretanto, quando um anticorpo é desenvolvido como um produto farmacêutico, as propriedades da proteína, particularmente homogeneidade e estabilidade, são altamente importantes. O isotipo IgG2 foi reportado como tendo heterogeneidade muito alta resultante das ligações de dissulfeto na região de dobradiça (J Biol Chem. 6 de Junho de 2008; 283(23): 16206-15.). Não é fácil e seria muito caro fabricá-la como um produto farmacêutico em larga escala, ao mesmo tempo em que se mantém a diferença na heterogeneidade de substâncias dese- jadas/relacionadas entre produtos resultantes do acima. Consequentemente, é desejado que a substância seja composta de uma única substância tanto quanto possível. Assim, quando anticorpos de isotipo IgG2 são desenvolvidos como produtos farmacêuticos, é preferido reduzir a heterogeneidade resultante de ligações de dissulfeto, sem diminuir a estabilidade.
[000600] De forma a reduzir a heterogeneidade da IgG2 do tipo silvestre, cisteínas na região de dobradiça e domínio CH1 de IgG2 foram substituídos. Como um resultado de exame de diversas variantes, SKSC (SEQ ID NO: 62), a qual é a região constante obtida alterando a cisteína na posição 131 e arginina na posição 133 na numeração Norte Americana (Sequences of Proteins of Immunological Interest, Publicação NIH No.91-3242) dentro do domínio CH1 de cadeia H da sequência de região constante de IgG2 do tipo silvestre para serina e lisina, respectivamente e alterando a cisteína na posição de numeração Norte Americana 219 na dobradiça superior de cadeia H para serina, poderia reduzir a heterogeneidade sem diminuir a estabilidade. Entretanto, outros possíveis métodos para diminuição de heterogeneidade são alterar apenas a cisteína na posição de numeração Norte Americana 219 na dobradiça superior de cadeia H para serina e alterar apenas a cisteína na posição de numeração Norte Americana 220 pa-ra serina. Assim, a região constante SC (SEQ ID NO: 153) na qual cis- teína na posição de numeração Norte Americana 219 em IgG2 foi alterada para serina e a região constante CS (SEQ ID NO: 154) na qual a cisteína na posição de numeração Norte Americana 220 em IgG2 foi alterada para serina, foram produzidas.
[000601] huPM1-SC (SEQ ID NO: 157), huPM1-CS (SEQ ID NO: 158), huPM1-IgG1 (SEQ ID NO: 159), huPM1-IgG2 (SEQ ID NO: 160) e huPM1-SKSC (SEQ ID NO: 161), os quais foram preparados combinando as regiões constantes produzidas conforme acima, IgG1 (SEQ ID NO: 60) e IgG2 (SEQ ID NO: 132) com a região variável do anticorpo antirreceptor de IL-6 humanizado (região variável de cadeia H, huPM1-VH/SEQ ID NO: 155; região variável de cadeia L huPM1- VL/SEQ ID NO: 156) (Cancer Res. 15 de Fevereiro de 1993; 53(4): 851-6.), foram usadas como uma cadeia H e huPM1-L (SEQ ID NO: 162) foi usado como uma cadeia L, para produzir cada anticorpo. Cada anticorpo foi expresso e purificado por meio do método descrito no Exemplo 4.
[000602] Os anticorpos foram comparados uns com os outros em termos da heterogeneidade. A heterogeneidade de huPM1-IgG1, huPM1-IgG2, huPM1-SC, huPM1-CS e huPM1-SKSC foi avaliada por meio de cromatografia de troca de cátions. A cromatografia foi realizada usando uma coluna ProPac WCX-10 (Dionex), acetato de sódio a 20 mM (pH de 5,0) como fase móvel A e acetato de sódio a 20 mM/NaCl a 1M (pH de 5,0) como fase móvel B, com uma taxa de fluxo e gradiente apropriados. O resultado de avaliação por meio de croma- tografia de troca de cátions é mostrado na figura 12.
[000603] Conforme mostrado na figura 12, conversão da região constante de IgG1 em IgG2 aumentou a heterogeneidade. Em contraste, a heterogeneidade foi acentuadamente reduzida mediante conversão da região constante em SKSC. Enquanto que a região constante SC resultou em redução considerável da heterogeneidade conforme em SKSC, a região constante CS não aprimorou suficientemente a heterogeneidade.
[000604] Quando um anticorpo é desenvolvido como um produto farmacêutico, geralmente é desejável que o anticorpo tenha alta esta-bilidade, além de baixa heterogeneidade para a produção de preparados estáveis. Assim, para avaliar a estabilidade, a temperatura mediana de desnaturação térmica (valor de Tm) foi determinada por meio de calorimetria de varredura diferencial (Differential Scanning Calorimetry - DSC) (VP-DSC; Microcal). A temperatura mediana de desnaturação térmica (valor de Tm) serve como um indicador de estabilidade. De forma fazer preparados estáveis como produtos farmacêuticos, uma maior temperatura mediana de desnaturação térmica (valor de Tm) é preferida (J Pharm Sci. Abril de 2008; 97(4): 1414-26.). Assim, huPM1- IgG1, huPM1-IgG2, huPM1-SC, huPM1-CS e huPM1-SKSC foram submetidos à diálise contra uma solução de acetato de sódio a 20 mM/NaCl a 150 mM (pH de 6,0) (EasySEP; TOMY) e medição por DSC foi realizada usando cerca de 0,1 mg/ml de proteína em uma taxa de aquecimento de 1°C/min entre 40 e 100°C. As curvas de desnaturação obtidas através de DSC são mostradas na figura 13. Os valores de Tm dos domínios Fab são listados na Tabela 17 abaixo. Tabela 17
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[000605] Os valores de Tm de huPM1-IgG1 e huPM1-IgG2 eram quase os mesmos, isto é, cerca de 94°C (IgG2 era menor em cerca de 1°C). Entretanto, os valores de Tm de huPM1-SC e huPM1-CS eram cerca de 86°C, os quais eram significativamente menores do que aqueles huPM1-IgG1 e huPM1-IgG2. Por outro lado, o valor de Tm de huPM1-SKSC era cerca de 94°C e quase o mesmo que huPM1-IgG1 e huPM1-IgG2. Uma vez que a estabilidade do huPM1-SC e huPM1-CS era acentuadamente menor do que aquela da IgG2, huPM1-SKSC no qual cisteína no domínio CH1 também tinha sido alterada para serina pode ser mais preferido no desenvolvimento de produtos farmacêuticos. A diminuição significativa no valor de Tm do huPM1-SC e huPM1- CS, quando comparado com a IgG2, pode ser em virtude do padrão de ligação de dissulfeto do huPM1-SC e huPM1-CS que é diferente da- quele da IgG2.
[000606] Além disso, comparação das curvas de desnaturação por DSC mostrou que o pico de desnaturação para o domínio Fab era acentuado em huPM1-IgG1 e huPM1-SKSC, enquanto que ele era mais amplo em huPM1-SC e huPM1-CS do que os dois acima e huPM1-IgG2 proporcionou um pico menos acentuado sob o lado de temperatura do pico de desnaturação do domínio Fab. O pico de desnaturação em DSC geralmente se torna acentuado no caso de um único componente, mas pode se tornar amplo quando dois ou mais componentes com diferentes valores de Tm (isto é, heterogeneidade) estão presentes. Assim, foi sugerido que huPM1-IgG2, huPM1-SC e huPM1-CS continham dois ou mais componentes e a heterogeneidade da IgG2 natural não foi reduzida em huPM1-SC e huPM1-CS. Essa descoberta sugere que cisteínas presentes na região de dobradiça e no domínio CH1 estão envolvidos na heterogeneidade de IgG2 natural e é necessário alterar não apenas a cisteína na região de dobradiça, mas também aquela no domínio CH1 para diminuir a heterogeneidade quando de DSC. Além disso, conforme descrito acima, é possível obter apenas estabilidade equivalente àquela de IgG2 natural alterando não apenas a cisteína na região de dobradiça, mas também que no domínio CH1.
[000607] Conforme descrito acima, como as regiões constantes nas quais a heterogeneidade resultante da região de dobradiça de IgG2 foram reduzidas, descobriu-se que SC e CS, as quais são regiões constantes nas quais apenas a cisteína na região de dobradiça foi substituída por serina, pode ser insuficiente do ponto de vista de heterogeneidade e estabilidade e que é possível apenas reduzir significativamente a heterogeneidade, ao mesmo tempo em que se mantém a estabilidade comparável à IgG2 substituindo, adicionalmente, a cisteí- na na posição de numeração Norte Americana 131 no domínio CH1 por serina. Tais regiões constantes incluem SKSC. [Exemplo de Referência 8] Produção e avaliação da região constante M14 otimizada de ligação ao receptor não-FcY
[000608] No domínio de ligação ao receptor FCY da região constante de IgG2, os resíduos nas posições 233, 234, 235 e 236 da numeração Norte Americana são do tipo não-ligação, enquanto que os resíduos 327, 330 e 331 da numeração Norte Americana são diferentes daqueles de IgG4, os quais são do tipo não-ligação. Assim, é necessário alterar os aminoácidos nas posições de numeração Norte Americana 327, 330 e 331 para a sequência de IgG4 (G2Δa em Eur J Immunol. Agosto de 1999; 29(8): 2613-24). Contudo, uma vez que o aminoácido na posição de numeração Norte Americana 339 é alanina em IgG4, enquanto que ele é treonina em IgG2, mera alteração dos aminoácidos nas posições de numeração Norte Americana 327, 330 e 331 para a sequência de IgG4 gerará uma nova sequência peptídica de 9 amino- ácidos que não ocorre naturalmente que poderia ser um peptídeo de epitopo de célula T, desse modo, causando um risco de imunogenici- dade. Assim, descobriu-se que a ocorrência da nova sequência peptí- dica poderia ser impedida alterando a treonina na posição de numeração Norte Americana 339 em IgG2 para alanina, além das alterações descritas acima. Além das mutações descritas acima, metionina na posição de numeração Norte Americana 397 sofreu mutação para valina a fim de aprimorar a estabilidade de IgG2 sob condição ácida. Além disso, em SKSC (SEQ ID NO: 62) produzido no Exemplo de Referência 7, no qual a heterogeneidade resultante das ligações de dis- sulfeto na região de dobradiça foi aprimorada, introdução de mutações nas posições 131 e 133 gerará uma nova sequência peptídica de 9 aminoácidos que não ocorre naturalmente que poderia ser um peptí- deo de epitopo de célula T, desse modo, causando um risco de imu- nogenicidade. Assim, a sequência peptídica em torno das posições 131 a 139 foi convertida para o mesmo conforme em IgG1 mediante mutação de ácido glutâmico na posição de numeração Norte Americana 137 para glicina e mutação de serina na posição de numeração Norte Americana 138 para glicina. A sequência de região constante M14 (SEQ ID NO: 129) foi produzida introduzindo todas as mutações acima.
[000609] A expressão e purificação de huPM1-M14, preparado usando huPM1-M14 como uma cadeia H e huPM1-L (SEQ ID NO: 162) como uma cadeia L, foram realizadas por meio do método descrito no Exemplo de Referência 7. Os anticorpos huPM1-M14 (SEQ ID NO: 163), huPM1-IgG1 e huPM1-IgG2 preparados foram avaliados quanto à heterogeneidade usando cromatografia de troca de cátions por meio do método descrito no Exemplo de Referência 7.
[000610] Conforme mostrado na figura 14, a heterogeneidade foi também reduzida no huPM1-M14, assim como no huPM1-SKSC. [Exemplo de Referência 9] Preparo de huPM1-M58 com heterogeneidade do C-término de cadeia H reduzida e farmacocinética aprimorada Preparo da molécula huPM1-M58
[000611] huPM1 é um anticorpo de IgG1. Para a heterogeneidade na sequência C-terminal da cadeia H do anticorpo de IgG, a deleção do resíduo de lisina C-terminal e a amidação do grupo amino C-terminal em virtude de deleção dos dois aminoácidos C-terminais, glicina e lisina, foram reportadas (Anal Biochem. 1 de Janeiro de 2007; 360(1): 7583). Também, no huPM1, embora o principal componente seja uma sequência na qual a lisina C-terminal codificada pela sequência de nu- cleotídeo tenha sido deletada mediante modificação pós-traducional, há também um componente menor no qual a lisina permanece e um componente menor no qual o grupo amino C-terminal é amidado em virtude de deleção de glicina e lisina, o que contribuiu para a hetero- geneidade. Produção de um produto farmacêutico em larga escala, ao mesmo tempo em que se mantém a diferença na heterogeneidade de substâncias desejadas/relacionadas entre os produtos não é fácil mas, antes, resulta em aumento de custo e, assim, é desejado que a substância seja composta de uma única substância tanto quanto possível. Quando um anticorpo é desenvolvido como um produto farmacêutico, redução da heterogeneidade é desejada. Assim, é desejado que o C- término da cadeia H não tenha heterogeneidade quando desenvolvida como produtos farmacêuticos. Também é desejável prolongar a meia- vida plasmática do anticorpo de forma a reduzir a dose de anticorpo.
[000612] Assim, as alterações descritas abaixo foram introduzidas para preparar uma nova região constante na qual a heterogeneidade no C-término da cadeia H tenha sido reduzida, a farmacocinética tenha sido aprimorada quando comparado com o huPM1-IgG1 e a heterogeneidade derivada de IgG2 do tipo silvestre também tenha sido reduzida sem perda de estabilidade.
[000613] Especificamente, no huPM1-SKSC, o qual tem alta estabilidade e no qual a heterogeneidade mencionada acima referente aos anticorpos com regiões constantes de isotipo IgG2 é reduzida, ácido glutâmico na posição 127 da numeração Norte Americana 137 foi substituído por glicina; serina na posição 138 com glicina; histidina na posição 268 por Glutamina; arginina na posição 355 por Glutamina; e glutamina na posição 419 por Ácido glutâmico. Além das substituições acima, glicina e lisina nas posições 446 e 447 foram deletadas para reduzir a heterogeneidade do C-término da cadeia H, desse modo, obtendo o huPM1-M58 (SEQ ID NO: 164). huPM1-M58, preparado usando huPM1-M58 como uma cadeia H e huPM1-L (SEQ ID NO: 162) como uma cadeia L foi expresso e purificado por meio do método descrito no Exemplo 4.
[000614] Os anticorpos huPM1-M58, huPM1-IgG1 e huPM1-IgG2 foram avaliados quanto à heterogeneidade e estabilidade por meio dos métodos descritos no Exemplo 5 usando cromatografia de troca de cátions e DSC, respectivamente.
[000615] O resultado de DSC é mostrado na Tabela 18. Conforme mostrado nas figuras 13 e 16, descobriu-se que o huPM1-M58 mostra heterogeneidade reduzida, sem perda de estabilidade, conforme no huPM1-SKSC. Tabela 18
Figure img0024
Avaliação de huPM1-M58 quanto à retenção plasmática
[000616] A retenção prolongada (eliminação lenta) da molécula de IgG no plasma é em virtude da função do FcRn, o qual é conhecido como um receptor de salvamento da molécula de IgG (Nat Rev Immunol. 7 de Setembro de 2007; 7(9): 715-25). Quando incorporadas em endossomas via pinocitose, moléculas de IgG se ligam ao FcRn expresso em endossomas sob as condições ácidas dentro do endosso- ma (pH de aprox. 6,0). Enquanto moléculas de IgG que não estão ligadas ao FcRn são transferidas para e degradadas em lisossomas, aquelas ligadas ao FcRn são translocadas para a superfície celular e, então, liberadas do FcRn no plasma, novamente sob as condições neutras no plasma (pH de aprox. 7,4).
[000617] Anticorpos do tipo IgG são conhecidos por incluir os isoti- pos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. A meia-vida plasmática desses isotipos em seres humanos é reportada como sendo cerca de 36 dias para IgG1 e IgG2; cerca de 29 dias para IgG3; e 16 dias para IgG4 (Nat. Biotechnol. Dezembro de 2007; 25(12): 1369-72). Assim, acredita-se que a retenção plasmática de IgG1 e IgG2 seja a mais longa. Em geral, os isotipos de anticorpos usados como agentes farmacêuticos são IgG1, IgG2 e IgG4. Métodos reportados para aprimoramento adicional da farmacocinética desses anticorpos de IgG incluem métodos para aprimorar a atividade de ligação descrita acima ao FcRn humano alterando a sequência da região constante de IgG (J. Biol. Chem. 19 de Janeiro de 2007; 282(3): 1709-17; J. Immunol. 1 de Janeiro de 2006; 176(1): 346-56).
[000618] Existem diferenças de espécie entre o FcRn de camundongo e FcRn humano (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 5 de Dezembro de 2006; 103(49): 18709-14). Portanto, para prever a retenção de anticorpos de IgG tendo uma sequência de região constante alterada no plasma humano, pode ser desejável avaliar a ligação ao FcRn humano e a retenção plasmática em camundongos transgênicos para FcRn humano (Int. Immunol. Dezembro de 2006; 18(12): 1759-69). Avaliação da ligação a FcRn humano
[000619] FcRn é um complexo de FcRn e β2-microglobulina. Iniciadores de oligo-DNA foram preparados baseado na sequência do gene de FcRn humano publicada (J. Exp. Med. (1994) 180 (6), 2377-2381). Um fragmento de DNA que codifica todo o gene foi preparado por meio de PCR usando cDNA humano (Human Placenta MarathonReady cDNA, Clontech) como um padrão e os iniciadoriniciadores preparados. Usando o fragmento de DNA obtido como um padrão, um fragmento de DNA que codifica o domínio extracelular contendo a região sinalizadora (Met1-Leu290) foi amplificado por meio de PCR e inserido em um vetor de expressão de célula animal (a sequência de aminoácido do FcRn humano/SEQ ID NO: 165). Da mesma forma, ini- ciadoriniciadores de oligo-DNA foram preparados baseado na sequência do gene de β2-microglobulina humana publicada (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26), 16899-16903 (2002)). Um fragmento de DNA que codifica todo o gene foi preparada por meio de PCR usando cDNA humano (Hu-Placenta Marathon-Ready cDNA, CLONTECH) como um padrão e os iniciadoriniciadores preparados. Usando o fragmento de DNA obtido como um padrão, um fragmento de DNA que codifica toda a β2-microglobulina contendo a região sinalizadora (Met1-Met119) foi amplificado por meio de PCR e inserido em um vetor de expressão de célula animal (a sequência de aminoácido de β2-microglobulina huma- na/SEQ ID NO: 166).
[000620] FcRn humano solúvel foi expresso por meio do procedimento a seguir. Os plasmídeos preparados para FcRn humano e β2- microglobulina foram introduzidos na linhagem de célula derivada de câncer de rim embriônico humano HEK293H (Invitrogen) usando soro bovino fetal a 10% (Invitrogen) por meio de lipofecção. O sobrenadan- te de cultura resultante foi coletado e purificado usando IgG Sepharose 6 Fast Flow (Amersham Biosciences) através do método descrito em J. Immunol. 1 de Novembro de 2002; 169(9): 5171-80. Então, purificação adicional foi realizada usando HiTrap Q HP (GE Healthcare).
[000621] A ligação ao FcRn humano foi avaliada usando Biacore 3000. Um anticorpo foi ligado à Proteína L ou anticorpo de coelho anti- cadeia Kappa de IgG humana imobilizado sobre um Sensor Chip, FcRn humano foi adicionado como um analito para interação com o anticorpo e a afinidade (KD) foi calculada a partir da quantidade de FcRn humano ligado. Especificamente, Proteína L foi imobilizada sobre o Sensor Chip CM5 (BIACORE) por meio do método de acoplamento de amina usando tampão de Na-fosfato a 50 mM (pH de 6,0) contendo NaCl a 150 mM como o tampão contínuo. Então, um anticorpo foi diluído com o tampão contínuo contendo Tween20 a 0,02% e injetado e deixado se ligar ao chip. FcRn humano foi, então, injetado para avaliar a atividade de ligação do anticorpo ao FcRn humano.
[000622] A afinidade foi calculada usando o software BIAevaluation. O sensorgrama obtido foi usado para calcular a quantidade de hFcRn ligado ao anticorpo imediatamente antes do final de injeção de FcRn humano. Esse foi adaptado por meio do método de afinidade em estado uniforme para calcular a afinidade do anticorpo pelo FcRn humano. Avaliação prognóstica de retenção plasmática de huPM1-IgG1 e huPM1-M58 em seres humanos usando FcRn humano
[000623] As atividades de ligação de huPM1-IgG1 e huPM1-M58 ao FcRn humano foram avaliadas usando BIAcore. Conforme mostrado na Tabela 19, a atividade de ligação do huPM1-M58 foi maior do que aquela do huPM1-IgG1 em cerca de 1,4 vezes. Tabela 19
Figure img0025
Avaliação da retenção plasmática em camundongos transgênicos para FcRn humano
[000624] A farmacocinética em camundongos transgênicos para FcRn humano (camundongos B6.mFcRn-/-.hFcRn, linhagem Tg 276 +/+; Jackson Laboratories) foi avaliada por meio do procedimento a seguir. Um anticorpo foi intravenosamente administrado uma vez em uma dose de 1 mg/kg aos camundongos e sangue foi coletado em pontos de tempo apropriados. O sangue coletado foi imediatamente centrifugado a 15.000 rpm durante 15 minutos a 4°C para obter plasma. O plasma separado foi armazenado em um congelador a -20°C ou abaixo até uso. A concentração plasmática foi determinada por meio de ELISA. Avaliação prognóstica da retenção plasmática de huPM1-IgG1 e huPM1-M58 em seres humanos usando camundongos transgênicos para FcRn humano
[000625] A retenção plasmática de huPM1-IgG1 e huPM1-M58 em camundongos transgênicos para FcRn humano foi avaliada. Conforme mostrado na figura 17, o resultado demonstrou que a farmacocinética de huPM1-M58 era aprimorada quando comparado com huPM1-IgG1. Foi sugerido que a atividade de ligação ao FcRn humano estava correlacionada com a retenção plasmática em camundongos transgênicos para FcRn humano. [Exemplo de Referência 10] Medição da afinidade em reação antí- geno-anticorpo usando Biacore
[000626] Análise cinética da reação antígeno-anticorpo foi realizada usando Biacore T100 (GE Healthcare Biosciences). A interação antí- geno-anticorpo foi medida mediante imobilização de rec-Proteína A (aqui depois Proteína A) (ZYMED) sobre um Sensor Chip, captura do anticorpo sobre a Proteína A imobilizada e, então, reação do antígeno como um analito. Várias concentrações de rhNR10 foram usadas como o antígeno. Os parâmetros cinéticos, constante de taxa de associação ka (1/Ms) e constante de taxa de dissociação kd (1/s), foram calculados a partir dos sensorgramas obtidos pela medição. Então, a KD (M) foi determinada baseado nas constantes de taxa. Cada parâmetro foi determinado usando o Biacore T100 Evaluation Software versão 1.1 (GE Healthcare Biosciences). Imobilização de Proteína A sobre o Sensor Chip
[000627] Proteína A foi imobilizada sobre todas as células de fluxo do Sensor Chip CM5 (GE Healthcare Biosciences) por meio do método de acoplamento de amina. O experimento foi realizado usando HBS- EP+ (HEPES a 10 mM, NaCl a 0,15 M, EDTA a 3 mM, Tensoativo P20 a 0,05% v/v) como um tampão contínuo em uma taxa de fluxo de 10 μL/min. Os grupos carboxila de carboximetil dextrana sobre o Sensor Chip foram ativados com 100 μL de uma mistura a 1:1 de EDC (clori- drato de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida) a 75 mg/ml e NHS (N-hidróxi-succinimida) a 11,5 mg/ml e Proteína A preparada a 50 μg/ml usando tampão de acetato a 10 mM (pH de 4,5) foi deixada fluir para reação. Então, 100 μL de cloridrato de etanolamina a 1 M (pH de 8,5) foram deixados fluir para inativar os grupos ativos não reagidos. Por fim, cerca de 4000 a 5000 RU foram imobilizados. O experimento foi realizado a 25°C todas as vezes. Medição de afinidade em reação antígeno-anticorpo entre rhNR10 e anticorpo capturado sobre Proteína A
[000628] O tampão contínuo usado foi HBS-EP+. Cada anticorpo foi preparado a 0,25 μg/ml ou preparado de modo que cerca de 100 RU se ligassem à Proteína A. rhNR10 usada como um analito foi preparada a 0, 38,5, 77,0 e 154 nM ou a 0, 19,25 e 77,01 nM usando HBS- EP+. Na medição, primeiro, a solução de anticorpo foi capturada sobre Proteína A e uma solução de analito foi reagida em uma taxa de fluxo de 20 μL/min durante três minutos. Então, a solução foi trocada para HBS-EP+ e a fase de dissociação foi medida durante cinco minutos. Após medição da fase de dissociação, o Sensor Chip foi regenerado por meio de lavagem com glicina-HCl a 10 mM (pH de 1,5). Os sen- sorgramas obtidos foram cineticamente analisados usando o software de análise de dados Biacore-específico, Biacore T100 Evaluation Software Versão 1.1.
Aplicabilidade Industrial
[000629] Os anticorpos anti-NR10 obtidos pelos presentes inventores exibem uma atividade de neutralização contra NR10 e são úteis, por exemplo, como agentes terapêuticos para doenças inflamatórias.

Claims (6)

1. Anticorpo de neutralização de anti- NR10/ IL31RA, carac-terizado pelo fato de que se liga ao mesmo epitopo que um epitopo ligado pelos anticorpos que reconhecem a região de aminoácidos entre as posições 21 e 120 na sequência de aminoácido humana NR10/ IL31RA de SEQ ID NO: 76, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada a qual compreende uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11, e uma região variável de cadeia leve a qual compreende uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15.
2. Anticorpo de neutralização de anti- NR10/ IL31RA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de neutralização de anti- NR10/ IL31RA se liga ao mesmo epito- po que um epitopo ligado pelo anticorpo que reconhece a região de aminoácidos entre as posições 21 a 120 na sequência de aminoácido humana NR10/ IL31RA de SEQ ID NO: 76, em que o anticorpo compreende a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 12 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 16 .
3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo humanizado.
4. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que é um agente para tratamento de uma doença inflamatória.
6. Uso do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um agente terapêutico para tratamento de uma doença inflamatória.
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Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3050963T3 (da) 2005-03-31 2019-12-09 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fremgangsmåde til fremstilling af polypeptid ved regulering af arrangement
EP3345616A1 (en) 2006-03-31 2018-07-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody modification method for purifying bispecific antibody
US11046784B2 (en) * 2006-03-31 2021-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
CL2007001665A1 (es) 2006-06-08 2008-01-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo o fragmento del mismo con actividad neutralizante de la proteina nr 10; agente que lo comprende; y su uso para prevenir o tratar una enfermedad inflamatoria.
MX369784B (es) 2007-09-26 2019-11-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Metodo de modificacion del punto isoelectrico de anticuerpos mediante la sustitucion de aminoacidos en region de determinacion de complementariedad (cdr).
CA2700394C (en) 2007-09-26 2017-10-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant region
AU2008332271C1 (en) * 2007-12-05 2014-04-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-NR10 antibody and use thereof
US8431127B2 (en) 2007-12-05 2013-04-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for treating pruritus comprising administering an NR10 antagonist
CN107551270A (zh) 2008-04-11 2018-01-09 中外制药株式会社 与多个分子的抗原反复结合的抗原结合分子
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
JP5139517B2 (ja) * 2008-12-05 2013-02-06 中外製薬株式会社 抗ｎｒ１０抗体、およびその利用
JP2010210772A (ja) * 2009-03-13 2010-09-24 Dainippon Screen Mfg Co Ltd 液晶表示装置の製造方法
WO2010107110A1 (ja) 2009-03-19 2010-09-23 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
TWI646193B (zh) 2009-03-19 2019-01-01 中外製藥股份有限公司 抗體恆定區域改變體
US10150808B2 (en) 2009-09-24 2018-12-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
US20120322085A1 (en) 2009-11-05 2012-12-20 Osaka University Therapeutic agent for autoimmune diseases or allergy, and method for screening for the therapeutic agent
TWI505838B (zh) 2010-01-20 2015-11-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Stabilized antibody solution containing
WO2011108714A1 (ja) * 2010-03-04 2011-09-09 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
WO2011143318A2 (en) * 2010-05-11 2011-11-17 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Anti-fgfr2 antibodies
RU2658504C9 (ru) 2010-11-30 2018-08-21 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антигенсвязывающая молекула, способная многократно связываться с множеством антигенных молекул
US20130295613A1 (en) 2010-12-28 2013-11-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Animal cell culturing method
EP2735315B1 (en) 2011-07-19 2019-10-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Stable protein-containing preparation containing argininamide or valinamide
MY182178A (en) 2011-09-01 2021-01-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for preparing a composition comprising highly concentrated antibodies by ultrafiltration
CN104334581B (zh) * 2012-05-09 2018-02-02 伊莱利利公司 抗‑c‑Met抗体
PT2888283T (pt) 2012-08-24 2018-11-16 Univ California Anticorpos e vacinas para serem utilizados no tratamento de cancros que expressam ror1 e inibição de metástases
US11124576B2 (en) 2013-09-27 2021-09-21 Chungai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide heteromultimer
RU2714967C2 (ru) 2013-12-27 2020-02-21 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Способ очистки антител с низкой изоэлектрической точкой
EP4056993A1 (en) 2014-08-20 2022-09-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for measuring viscosity of protein solution
SI3221346T1 (sl) 2014-11-21 2020-11-30 Bristol-Myers Squibb Company Protitelesa vsebujoča modificirana težko konstantna območja
EA035766B1 (ru) 2014-11-21 2020-08-07 Бристол-Майерс Сквибб Компани Антитело к cd73 и его применения
TWI805046B (zh) 2015-02-27 2023-06-11 日商中外製藥股份有限公司 Il-6受體抗體用於製備醫藥組成物的用途
EP3279216A4 (en) 2015-04-01 2019-06-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha PROCESS FOR PREPARING POLYPEPTIDE HETERO OLIGOMER
KR102514173B1 (ko) 2015-04-14 2023-03-27 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Il-31 안타고니스트를 유효 성분으로서 함유하는 아토피성 피부염의 예방용 및/또는 치료용 의약 조성물
CA2980992C (en) 2015-04-14 2024-01-23 Akihisa Kaneko Pharmaceutical composition for prevention and/or treatment of atopic dermatitis containing il-31 antagonist as active ingredient
CN105331703B (zh) * 2015-11-16 2018-08-17 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种鉴定或辅助鉴定猪100kg体重眼肌面积的方法及其专用试剂盒
CA3004288A1 (en) 2015-12-28 2017-07-06 Nobuyuki Tanaka Method for promoting efficiency of purification of fc region-containing polypeptide
CN109641969A (zh) * 2016-01-08 2019-04-16 安口生物公司 用于分开单克隆抗体的同种型的方法
KR20230047507A (ko) 2016-06-27 2023-04-07 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 암 치료 조합
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
US11851486B2 (en) 2017-05-02 2023-12-26 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils
TWI827585B (zh) 2018-03-15 2024-01-01 日商中外製藥股份有限公司 對茲卡病毒具有交叉反應性的抗登革病毒抗體及其使用方法
EP3797752A4 (en) 2018-05-21 2022-03-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha FREEZE-DRIED FORMULATION SEALED IN A GLASS VIAL
CN115636142A (zh) 2018-05-28 2023-01-24 中外制药株式会社 填充喷嘴
TW202128222A (zh) 2019-11-20 2021-08-01 日商中外製藥股份有限公司 含有抗體之製劑
CN113637073B (zh) * 2020-05-11 2024-04-12 上海赛比曼生物科技有限公司 Bcma抗体及其制备和应用
KR20230047397A (ko) 2020-07-28 2023-04-07 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 신규 개변형 항체를 포함하는, 바늘 실드를 구비한 바늘 부가 프리필드 시린지 제제
MX2023002482A (es) 2020-09-01 2023-03-08 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Composicion farmaceutica para prevencion y/o tratamiento de prurito por dialisis que comprende antagonista de interleucina 31 (il-31) como ingrediente activo.
US20230242652A1 (en) * 2021-08-30 2023-08-03 Galderma Holding S.A. Treatments for atopic dermatitis
WO2023058723A1 (ja) 2021-10-08 2023-04-13 中外製薬株式会社 プレフィルドシリンジ製剤の調製方法
JPWO2023120561A1 (pt) * 2021-12-22 2023-06-29

Family Cites Families (149)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US5156840A (en) 1982-03-09 1992-10-20 Cytogen Corporation Amine-containing porphyrin derivatives
JPS58201994A (ja) 1982-05-21 1983-11-25 Hideaki Hagiwara 抗原特異的ヒト免疫グロブリンの生産方法
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS59162441U (ja) 1983-04-14 1984-10-31 千代田紙業株式会社 吹込口を有する重包包装
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
US5057313A (en) 1986-02-25 1991-10-15 The Center For Molecular Medicine And Immunology Diagnostic and therapeutic antibody conjugates
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5260203A (en) * 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US5670373A (en) * 1988-01-22 1997-09-23 Kishimoto; Tadamitsu Antibody to human interleukin-6 receptor
US5322678A (en) * 1988-02-17 1994-06-21 Neorx Corporation Alteration of pharmacokinetics of proteins by charge modification
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
EP0585287B1 (en) 1990-07-10 1999-10-13 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
DE69133476T2 (de) 1990-08-29 2006-01-05 GenPharm International, Inc., Palo Alto Transgene Mäuse fähig zur Produktion heterologer Antikörper
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ES2134212T3 (es) * 1991-04-25 1999-10-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo humano reconstituido contra el receptor de la interleuquina 6 humano.
US6136310A (en) 1991-07-25 2000-10-24 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant anti-CD4 antibodies for human therapy
CA2119930C (en) 1991-09-23 2002-10-01 Hendricus R. J. M. Hoogenboom Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
ATE207080T1 (de) 1991-11-25 2001-11-15 Enzon Inc Multivalente antigen-bindende proteine
ES2227512T3 (es) 1991-12-02 2005-04-01 Medical Research Council Produccion de anticuerpos contra auto-antigenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago.
JPH0767688B2 (ja) 1992-01-21 1995-07-26 近畿コンクリート工業株式会社 Ｐｃコンクリートパネル
WO1993019172A1 (en) 1992-03-24 1993-09-30 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
NZ255101A (en) 1992-07-24 1997-08-22 Cell Genesys Inc A yeast artificial chromosome (yac) vector containing an hprt minigene expressible in murine stem cells and genetically modified rodent therefor
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
BR9204244A (pt) 1992-10-26 1994-05-03 Cofap Ferro fundido cinzento
WO1994012215A1 (en) 1992-12-01 1994-06-09 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with l-selectin
AU6819494A (en) 1993-04-26 1994-11-21 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
GB9313509D0 (en) 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
IL107742A0 (en) 1993-11-24 1994-02-27 Yeda Res & Dev Chemically-modified binding proteins
WO1995015388A1 (en) 1993-12-03 1995-06-08 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
US5945311A (en) 1994-06-03 1999-08-31 GSF--Forschungszentrumfur Umweltund Gesundheit Method for producing heterologous bi-specific antibodies
DE122009000068I2 (de) 1994-06-03 2011-06-16 Ascenion Gmbh Verfahren zur Herstellung von heterologen bispezifischen Antikörpern
US8017121B2 (en) * 1994-06-30 2011-09-13 Chugai Seiyaku Kabushika Kaisha Chronic rheumatoid arthritis therapy containing IL-6 antagonist as effective component
CA2194907A1 (en) 1994-07-13 1996-02-01 Kouji Matsushima Reshaped human antibody against human interleukin-8
AU700819B2 (en) 1994-10-07 1999-01-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Rheumatoid arthritis remedy containing IL-6 antagonist as effective component
PL182089B1 (en) * 1994-10-21 2001-11-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Pharmaceutic compositions for treating diseases caused by production of il-6
US5876950A (en) 1995-01-26 1999-03-02 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibodies specific for different epitopes of human GP39 and methods for their use in diagnosis and therapy
FR2729855A1 (fr) 1995-01-26 1996-08-02 Oreal Utilisation d'un antagoniste de cgrp dans une composition cosmetique, pharmaceutique ou dermatologique et composition obtenue
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
EP1978033A3 (en) 1995-04-27 2008-12-24 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
JP3946256B2 (ja) 1995-09-11 2007-07-18 協和醗酵工業株式会社 ヒトインターロイキン５受容体α鎖に対する抗体
AU720232B2 (en) 1996-07-19 2000-05-25 Amgen, Inc. Analogs of cationic proteins
AU744146B2 (en) 1996-09-26 2002-02-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody against human parathormone related peptides
US7365166B2 (en) * 1997-04-07 2008-04-29 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
FR2761994B1 (fr) 1997-04-11 1999-06-18 Centre Nat Rech Scient Preparation de recepteurs membranaires a partir de baculovirus extracellulaires
US20020187150A1 (en) * 1997-08-15 2002-12-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Preventive and/or therapeutic agent for systemic lupus erythematosus comprising anti-IL-6 receptor antibody as an active ingredient
AU750453B2 (en) 1997-10-03 2002-07-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Natural human antibody
ATE383875T1 (de) * 1998-03-17 2008-02-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Prophylaktische oder therapeutische mittel gegen entzündliche erkrankungen des verdauungstraktes enthaltend antagonistische il-6 rezeptor antikörper
BR9909382A (pt) 1998-04-03 2000-12-05 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticorpo humanizado contra o fator tissular humano (tf) e processo de produção de anticorpo humanizado
AU764653B2 (en) 1998-04-30 2003-08-28 Tanox, Inc. G-CSF receptor agonist antibodies and screening method therefor
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
FR2780062B1 (fr) 1998-06-17 2000-07-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Anticorps monoclonaux diriges contre la proteine g3bp, et leurs utilisations
EP1105427A2 (en) 1998-08-17 2001-06-13 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
ATE477273T1 (de) * 1998-12-01 2010-08-15 Facet Biotech Corp Humanisierte antikoerper gegen gamma-interferon
CN1202128C (zh) 1998-12-08 2005-05-18 拜奥威神有限公司 修饰蛋白的免疫原性
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6972125B2 (en) 1999-02-12 2005-12-06 Genetics Institute, Llc Humanized immunoglobulin reactive with B7-2 and methods of treatment therewith
EP1188830B1 (en) 1999-06-02 2010-01-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Novel hemopoietin receptor protein ,nr10
SK782002A3 (en) * 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
SE9903895D0 (sv) 1999-10-28 1999-10-28 Active Biotech Ab Novel compounds
AU2001266272B2 (en) 2000-05-03 2005-09-15 Medigene Ag Cationic diagnostic, imaging and therapeutic agents associated with activated vascular sites
US20030096339A1 (en) * 2000-06-26 2003-05-22 Sprecher Cindy A. Cytokine receptor zcytor17
WO2002036165A1 (fr) * 2000-10-27 2002-05-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Agent à base d'antagoniste d'il-6, faisant baisser le niveau des mmp-3 dans le sang
KR20090010127A (ko) 2001-03-07 2009-01-28 메르크 파텐트 게엠베하 하이브리드 이소타입 항체 부분구조를 포함하는 단백질을 위한 발현 기술
UA80091C2 (en) 2001-04-02 2007-08-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Remedies for infant chronic arthritis-relating diseases and still's disease which contain an interleukin-6 (il-6) antagonist
DE60229509D1 (de) 2001-04-05 2008-12-04 Astellas Pharma Inc Anti-osteopontin-antikörper und dessen verwendung
SK288124B6 (sk) 2001-04-13 2013-09-03 Biogen Idec Ma Inc. Anti-VLA-1 antibody, composition comprising such antibodies, isolated nucleic acids sequence, use of composition, in vitro method of determining level of VLA-1 in tissue, cell of cell line hAQC2, haAQC2, hsAQC2 or hybridoma mAQC2 and method for identifying inhibitor of I domain of integrin
JP4281869B2 (ja) * 2001-06-22 2009-06-17 中外製薬株式会社 抗グリピカン３抗体を含む細胞増殖抑制剤
AU2003225525B2 (en) * 2002-01-18 2008-07-24 Zymogenetics, Inc. Novel cytokine zcytor17 ligand
ATE547430T1 (de) * 2002-01-18 2012-03-15 Zymogenetics Inc Multimere des cytokinrezeptors zcytor17
US20050130224A1 (en) 2002-05-31 2005-06-16 Celestar Lexico- Sciences, Inc. Interaction predicting device
WO2003104453A1 (ja) 2002-06-05 2003-12-18 中外製薬株式会社 抗体作製方法
CA2488836A1 (en) * 2002-06-12 2003-12-24 Genencor International, Inc. Methods and compositions for milieu-dependent binding of a targeted agent to a target
TW200407335A (en) * 2002-07-22 2004-05-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Non-neutralizing antibody to inhibit the inactivation of activated protein C
CA2492524A1 (en) 2002-08-15 2004-02-26 Epitomics, Inc. Humanized rabbit antibodies
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
KR100499989B1 (ko) 2002-12-27 2005-07-07 네오바이오다임 주식회사 아사이알로 α1-산 당단백질에 대한 단일클론 항체, 이 항체를 포함하는 아사이알로 α1-산 당단백질에 대한 단일클론 항체, 이 항체를 포함하는 면역크로마토그래피 스트립 및 이 스트립를 이용한 아사이알로 α1-산 당단백질 측정방법
US7223393B2 (en) 2003-02-07 2007-05-29 Pdl Biopharma, Inc Amphiregulin antibodies and their use to treat cancer and psoriasis
US20040223970A1 (en) * 2003-02-28 2004-11-11 Daniel Afar Antibodies against SLC15A2 and uses thereof
WO2004091543A2 (en) 2003-03-04 2004-10-28 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method of treating autoimmune disease by inducing antigen presentation by tolerance inducing antigen presenting cells
US20060134756A1 (en) 2003-03-24 2006-06-22 Wenfeng Xu Anti-IL-20 antibodies and binding partners and methods of using in inflammation
GB2401040A (en) 2003-04-28 2004-11-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for treating interleukin-6 related diseases
EP1636264A2 (en) 2003-06-24 2006-03-22 MERCK PATENT GmbH Tumour necrosis factor receptor molecules with reduced immunogenicity
WO2005035753A1 (ja) 2003-10-10 2005-04-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 機能蛋白質を代替する二重特異性抗体
EP2311945A1 (en) * 2003-10-14 2011-04-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Bispecific antibodies substituting for functional proteins
WO2005047327A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
US20050142133A1 (en) * 2003-12-03 2005-06-30 Xencor, Inc. Optimized proteins that target the epidermal growth factor receptor
AU2004295590B2 (en) 2003-12-03 2010-04-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Expression systems using mammalian beta-actin promoter
AR048210A1 (es) 2003-12-19 2006-04-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Un agente preventivo para la vasculitis.
CA2552523C (en) 2004-01-09 2019-11-26 Pfizer Inc. Monoclonal antibodies to mucosal addressin cell adhesion molecule(madcam)
AU2005227326B2 (en) * 2004-03-24 2009-12-03 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the Fc region
AR048335A1 (es) 2004-03-24 2006-04-19 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agentes terapeuticos para trastornos del oido interno que contienen un antagonista de il- 6 como un ingrediente activo
AR049390A1 (es) 2004-06-09 2006-07-26 Wyeth Corp Anticuerpos contra la interleuquina-13 humana y usos de los mismos
AU2005259992A1 (en) * 2004-06-25 2006-01-12 Medimmune, Llc Increasing the production of recombinant antibodies in mammalian cells by site-directed mutagenesis
EP1919950A1 (en) 2004-07-15 2008-05-14 Xencor, Inc. Optimized fc variants
CA2580319A1 (en) 2004-09-14 2006-03-23 National Institute For Biological Standards And Control Vaccine
US7563443B2 (en) 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
CA2584211C (en) * 2004-10-22 2014-07-08 Amgen Inc. Methods for refolding of recombinant antibodies
AU2005335714B2 (en) * 2004-11-10 2012-07-26 Macrogenics, Inc. Engineering Fc antibody regions to confer effector function
WO2006067847A1 (ja) * 2004-12-22 2006-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた抗体の作製方法
CA2592015A1 (en) 2004-12-27 2006-07-06 Progenics Pharmaceuticals (Nevada), Inc. Orally deliverable and anti-toxin antibodies and methods for making and using them
HUE026107T2 (en) * 2004-12-28 2016-05-30 Innate Pharma Monoclonal antibody to NKG2A
US8716451B2 (en) 2005-01-12 2014-05-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Stabilized human IgG2 and IgG3 antibodies
CA2595169A1 (en) * 2005-01-12 2006-07-20 Xencor, Inc. Antibodies and fc fusion proteins with altered immunogenicity
EP1858924A1 (en) 2005-02-14 2007-11-28 ZymoGenetics, Inc. Methods of treating skin disorders using an il-31ra antagonist
DK3050963T3 (da) 2005-03-31 2019-12-09 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fremgangsmåde til fremstilling af polypeptid ved regulering af arrangement
EP1876236B9 (en) 2005-04-08 2015-02-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody substituting for function of blood coagulation factor viii
PE20061323A1 (es) 2005-04-29 2007-02-09 Rinat Neuroscience Corp Anticuerpos dirigidos contra el peptido amiloide beta y metodos que utilizan los mismos
US8003108B2 (en) 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
JP2009510102A (ja) 2005-09-29 2009-03-12 ヴァイラル ロジック システムズ テクノロジー コーポレーション 免疫調節組成物およびその使用
RU2446826C2 (ru) 2005-10-14 2012-04-10 Фукуока Юниверсити Агенты для подавления повреждения трансплантированных островков после трансплантации островков
EP1941908B1 (en) 2005-10-21 2015-08-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Therapeutic agent for heart disease
EP2001906A2 (en) 2006-01-10 2008-12-17 Zymogenetics, Inc. Methods of treating pain and inflammation in neuronal tissue using il-31ra and osmrb antagonists
EP2463305B1 (en) * 2006-01-12 2016-05-11 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to OX-2/CD200 and uses thereof
JP4294082B2 (ja) * 2006-03-23 2009-07-08 協和発酵キリン株式会社 ヒトトロンボポエチン受容体に対するアゴニスト抗体
JP5033868B2 (ja) * 2006-03-23 2012-09-26 バイオアークティック ニューロサイエンス アーベー 改良型プロトフィブリル選択的抗体及びその使用
US11046784B2 (en) 2006-03-31 2021-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
EP3345616A1 (en) 2006-03-31 2018-07-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody modification method for purifying bispecific antibody
EP2025346B1 (en) * 2006-04-07 2016-08-10 Osaka University Muscle regeneration promoter
CL2007001665A1 (es) * 2006-06-08 2008-01-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo o fragmento del mismo con actividad neutralizante de la proteina nr 10; agente que lo comprende; y su uso para prevenir o tratar una enfermedad inflamatoria.
WO2007147122A2 (en) * 2006-06-15 2007-12-21 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Monoclonal antibodies that selectively recognize methamphetamine and methamphetamine like compounds
US20100034194A1 (en) 2006-10-11 2010-02-11 Siemens Communications Inc. Eliminating unreachable subscribers in voice-over-ip networks
WO2008092117A2 (en) 2007-01-25 2008-07-31 Xencor, Inc. Immunoglobulins with modifications in the fcr binding region
WO2008100995A1 (en) * 2007-02-14 2008-08-21 Vaccinex, Inc. Humanized anti-cd100 antibodies
AU2008218968B2 (en) 2007-02-23 2013-10-17 Merck Sharp & Dohme Llc Engineered anti-IL-23p19 antibodies
EP2138576A4 (en) * 2007-03-16 2011-02-23 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd ANTI-CLAUDIN-4 ANTIBODY
GB0708002D0 (en) 2007-04-25 2007-06-06 Univ Sheffield Antibodies
US20100291023A1 (en) 2007-05-31 2010-11-18 Genmab A/S Method for extending the half-life of exogenous or endogenous soluble molecules
EP2031064A1 (de) 2007-08-29 2009-03-04 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG Verfahren zur Steigerung von Proteintitern
WO2009041621A1 (ja) 2007-09-26 2009-04-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗il-6レセプター抗体
MX369784B (es) 2007-09-26 2019-11-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Metodo de modificacion del punto isoelectrico de anticuerpos mediante la sustitucion de aminoacidos en region de determinacion de complementariedad (cdr).
CA2700394C (en) 2007-09-26 2017-10-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant region
DK2196541T3 (da) * 2007-09-28 2012-11-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-glypican-3-antistof med forbedret kinetik i plasmaet
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
AU2008332271C1 (en) 2007-12-05 2014-04-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-NR10 antibody and use thereof
US8431127B2 (en) 2007-12-05 2013-04-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for treating pruritus comprising administering an NR10 antagonist
US20110059078A1 (en) 2008-02-08 2011-03-10 Medimmune, Llc Anti-ifnar1 antibodies with reduced fc ligand affinity
CN107551270A (zh) * 2008-04-11 2018-01-09 中外制药株式会社 与多个分子的抗原反复结合的抗原结合分子
MX2010011717A (es) 2008-05-01 2010-11-30 Amgen Inc Anticuerpos anti-hepcidina y metodos de uso.
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
TWI646193B (zh) 2009-03-19 2019-01-01 中外製藥股份有限公司 抗體恆定區域改變體
WO2010107110A1 (ja) * 2009-03-19 2010-09-23 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
US10150808B2 (en) * 2009-09-24 2018-12-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
WO2011108714A1 (ja) * 2010-03-04 2011-09-09 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
KR20150002894A (ko) 2010-03-11 2015-01-07 리나트 뉴로사이언스 코프. ｐＨ 의존성 항원 결합을 갖는 항체

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