KR20100056503A - 용액 내 아스파라기나아제 활성의 증가 방법 - Google Patents

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크리스토퍼 제임스 고
제임스 케이쓰 헨슨
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프리토-래이 노쓰 아메리카, 인코포레이티드
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Abstract

안정한 아스파라기나아제 용액이 개시되어 있다. 한면에서, 식수는 아스파라기나아제의 잔류 효소 활성 증가를 위하여 염소 수준이 감소되도록 처리되었다. 처리는 염소 성분의 제거 또는 염소 수준을 감소시키는 첨가제의 공급에 의하여 발생할 수 있다. 첨가제는 환원제 및 염소 제거제를 포함할 수 있다. 제거 기술은 활성 탄소, 이온 교환, 및 공기 스트리핑의 사용을 포함할 수 있다

Description

용액 내 아스파라기나아제 활성의 증가 방법 {METHOD FOR INCREASING ASPARAGINASE ACTIVITY IN A SOLUTION}
본 발명은 식품에서 아크릴아미드의 전구체인 아스파라긴의 양의 감소 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 용액 내 효소 아스파라기나아제의 안정성 증가에 관한 것이다.
미국 특허 제 7,037,540호에서 논의된 바와 같이, 아크릴아미드는 아스파라긴을 포함하는 열 가공 식품에서 발견된다. 몇몇 식품 내에서 형성된 아크릴아미드 수준은 식품의 조리 전에 효소 아스파라기나아제를 식품에 첨가함으로써 감소될 수 있다.
배치(batch) 규모에서와는 반대로, 상업적 규모에서 식품에 아스파라기나아제와 같은 아크릴아미드 감소 효소를 첨가하는 것은 몇 가지 도전 과제를 가지고 있다. 예를 들어, 효소 아스파라기나아제는 아스파라긴의 가수분해를 용이하게 하기 위하여 자유 아스파라긴과 접촉해야만 한다. 효소가 일반적으로 비교적 농축된 형태로 공급되기 때문에, 효소는 이상적으로 효소 용액과 식품의 접촉 전에 수성 용액과 혼합 및 희석된다. 예를 들어, 효소 용액과 식품을 접촉시켜 도우(dough)를 형성하고 도우와 효소 용액을 혼합하는 것을 포함할 수 있다.
알려진 효소 활성의 정량화 방법은 단위로 환산한 효소를 말하는 것이다. 효소 활성의 1 단위는 1분 동안 기질 1 마이크로몰을 전환하는데 촉매로써 요구되는 효소의 양으로 정의된다. 따라서, 식품에서 아스파라긴과 같은 화합물 또는 기질의 상대 농도, 및 식품의 양을 안다면, 원하는 화합물을, 이 경우에는 아스파라긴을, 다른 화합물로 전환하는데 요구되는 아스파라기나아제와 같은 효소의 단위를 계산할 수 있다.
예전에 알려져 있지 않은 이유로, 심지어 과량의 (수학적으로 식품 내 모든 아스파라긴의 전환에 요구되는 예상치 이상의 의미) 아스파라기나아제 효소가 으깬 감자 또는 옥수수 마사(masa)와 같은 식품에 사용된 경우에도, 도우 내 아스파라긴 수준이 여전히 측정가능한 양으로 자주 존재한다. 어떤 식품이 열 가공될 때 형성되는 아크릴아미드 수준이 감소하는 것이 바람직하기 때문에, 상업적 규모로 만들어지는 식품 내 아크릴아미드 전구체의 감소를 위해 사용되는 효소의 효능을 극대화하는 방법 및 시스템을 갖는 것이 바람직할 것이다.
발명의 요약
한면에서, 본 발명은 물에서 염소를 제거함으로써 식수로부터 안정한 아스파라기나아제 용액의 제조 방법에 관한 것이다. 한면에서, 염소는 이온 교환, 역삼투, 활성 탄소, 및/또한 공기 스트리핑(air stripping)에 의하여 제거된다. 한면에서, 환원제 및 염소 제거제(scavenger)와 같은 첨가제가 식수를 처리하는데 사용된다. 한면에서, 처리된 식수를 그 후 아스파라기나아제와 혼합하여 아스파라기나아제 용액을 제조한다. 본 발명의 상기 및 추가적 특징 및 장점은 다음에 기술된 상세한 설명에서 명확해질 것이다.
본 발명의 특징으로 여겨지는 신규한 특성은 첨부된 청구항에 설명되어 있다. 그러나, 본 발명 그 자체뿐 아니라 그의 바람직한 사용 방식, 추가의 목적 및 장점은 수반되는 도면과 함께 읽을 때 다음에 기재된 실시예의 상세한 설명을 참고함으로써 가장 잘 이해될 것이다.
도 1a는 식수의 다양한 처리 후 잔류 효소 활성 도표; 및
도 1b는 다양한 염수 혼합물의 잔류 효소 활성 도표이다.
상세한 설명
일 실시예에서, 본 발명은 아스파라기나아제 안정성을 향상시키고 아스파라기나아제 활성을 보존하는 수성 용액의 제공을 목적으로 한다. 향상된 아스파라기나아제 활성은 아스파라긴이 아크릴아미드의 전구체이기 때문에 식품에서 더욱 효과적인 아크릴아미드의 감소로 바뀔 수 있다. 여기에서 사용된 "효소 활성" 용어는 단위로 표현된다. 아스파라기나아제 각 단위는 1분 동안 아스파라긴 1 마이크로몰을 가수분해할 수 있다.
일 실시예에서, 열 가공시 형성되는 아크릴아미드 수준을 감소시키는 것이 바람직한 식품은 도우에서 형성되는 것이다. 용어 "제조 스낵"은 출발 성분으로써 원래의 및 바뀌지 않은 전분 출발 물질이 아닌 다른 것을 사용하는 스낵 식품을 의미한다. 예를 들어, 제조 스낵은 말린 감자를 출발 물질로 하는 제조된 감자칩 및 마사 가루를 출발 물질로 하는 옥수수칩을 포함한다. 이때 말린 감자는 감자 가루, 감자 플레이크(potato flakes), 감자 알갱이(potato granules), 또는 말린 감자가 존재하는 다른 형태가 될 수 있다. 상기 용어들 중 어느 것이 본 발명에 사용될 때, 상기의 변화형도 모두 포함하는 것으로 이해된다. 제한 없이 단지 예로써 아스파라기나아제 용액이 첨가될 수 있는 "제조 식품"의 예는 토르티야(tortilla)칩, 옥수수칩, 감자 플레이크 및/또한 신선한 으깬 감자로 만든 감자칩, 다곡물칩, 부풀린 옥수수(corn puffs), 부풀린 밀(wheat puffs), 부풀린 쌀(rice puffs), 크래커, 빵 (호밀, 밀, 귀리, 감자, 흰빵, 통곡물, 및 혼합 가루와 같은), 부드러운 및 딱딱한 프레첼, 페스트리, 쿠키, 토스트, 옥수수 토르티야, 밀가루 토르티야, 피타(pita) 빵, 크로와상, 파이 크러스트, 머핀, 브라우니, 케이크, 베이글, 도넛, 씨리얼, 압출형 스낵, 그래놀라 식품, 밀가루, 옥수수 가루, 마사, 감자 플레이크, 폴렌타(polenta), 반죽 혼합 및 도우, 냉장 및 냉동 도우, 재구성된 식품, 가공 및 냉동 식품, 고기 및 야채 빵, 해시 브라운, 으깬 감자, 크레페, 팬케이크, 와플, 피자 크러스트, 땅콩 버터, 잘게 썬 및 가공된 견과류를 포함하는 식품, 젤리, 소(filling), 으깬 과일, 으깬 야채, 맥주 및 에일과 같은 알콜성 음료, 코코아, 코코아 가루, 초콜렛, 핫 초콜렛, 치즈, 개 및 고양이 먹이와 같은 동물 식품, 및 시트화 또는 압출을 겪는 또는 도우 또는 성분들의 혼합물로부터 만들어지는 임의의 다른 인간 또는 동물 식품을 포함한다.
여기에서 용어 "제조 식품"의 사용은 앞서 정의된 제조 스낵을 포함한다. 여기에서 용어 "식품"의 사용은 앞서 정의된 모든 제조 식품 및 제조 스낵을 포함한다.
언급되었다시피, 열 가공 식품은 아스파라기나아제 용액으로 처리될 수 있는 식품, 제한 없이 예를 들면, 제조 스낵 및 제조 식품의 예로서 앞서 나열된 모든 식품 뿐 아니라, 프렌치 후라이, 얇게 썬 감자, 얌(yam) 후라이, 다른 뿌리덩이 또는 뿌리 재료, 조리된 아스파라거스, 양파, 및 토마토를 포함하는 조리된 야채, 커피 원두, 코코아 원두, 조리된 육류, 말린 과일 및 야채, 열 가공된 동물 먹이, 담배, 차, 구운 또는 조리된 견과류, 콩, 당밀, 바비큐 소스와 같은 소스, 플랜테인(plantain)칩, 사과칩, 튀긴 바나나, 및 다른 조리된 과일을 포함한다.
몇몇 실시예에 따르면, 도우를 만들기에 바람직한 성분은 물과 함께 혼합되고, 바람직한 양의 아스파라기나아제도 아스파라기나아제 용액을 만들기 위해 처리된 식수와 혼합된다. 아스파라기나아제 용액은 그 후 도우에 첨가될 수 있다. 일 실시예에서, 아스파라기나아제 용액은 도우를 만들기 위해 바람직한 성분들과 직접 혼합된다. 도우는 그 후 열 가공 식품으로 만들어질 수 있다.
상업 시설에서, 도우 및 아스파라기나아제 용액을 형성하는데 사용되는 물은 일반적으로 지자체 상수도로부터 최종 소비자에게 공급되는 식수인 시설에서 쉽게 이용할 수 있는 물이다. 여기에서 사용되는 "식수"는 음료로 적합한 상수도로부터 공급되는 물을 뜻하고, 지자체 상수도로부터 공급되는 물을 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않는다. 대부분의 모든 미국 지자체 상수도는 충분한 염소를 식수에 첨가하여 식수는 소비자의 수도꼭지에서 잔류 염소를 갖는다. 많은 지자체 수도 지구는 클로라민이 염소보다 더 안정하기 때문에 클로라민을 식수에 첨가한다. 여기에서 사용된, 염소는 염소의 산화 형태로 정의되고, 클로라민 및 차아염소산염을 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않는다. 유사하게, 염산 (HCl) 및 염화 나트륨 (NaCl)에 의해 공급되는 것과 같은 염화물 이온의 비산화 형태는 정의에서 배제된다.
본 발명자는 식수의 특정 특성, 예를 들어, 염소의 존재는 아스파라기나아제 효소 활성을 식품의 생산을 위한 상업적 설정에는 유용하지 않는 정도로 감소시킨다는 것을 발견했다. 여기에서 사용된, "잔류 효소 활성" (%로 표현)은 샘플의 효소 활성으로 대조군의 효소 활성을 나눈 것을 뜻하며, 다양한 실험 환경 하에서 효소 활성의 상대적 측정값을 제공한다. 본 발명자는 또한 상업적 설정에 유용할 수 있도록 효소 활성에 대한 식수의 영향을 경감하고, 아스파라기나아제의 잔류 효소 활성을 보존하는 방법 및 시스템을 발견하였다. 다음의 예는 앞의 실례이다.
<실시예 1>
동일한 초기 아스파라기나아제 (노보자임(Novozymes) A/S) 활성이 첨가되고, 각 용액이 약 50 ml의 총 부피를 갖도록 증류수 또는 식수로 희석된 각 분취액으로부터 네 개의 용액을 형성하였다. 용액 제 3 및 4번의 식수는 북 텍사스(North Texas) 지자체 수도 지구로부터 플라노(Plano, TX USA)에 공급되는 식수였다. 각 용액에서 사용된 물 형태(water type)는 다음의 표 1a에 기술되어 있다.
[표 1a]
Figure pct00001
잔류 효소 활성의 비교를 위하여 대조군으로써 용액 제 1번을 사용하여 효소 활성 및 pH 측정 전에 각 용액 제 2번 내지 제 4번을 약 35 ℃에서 약 40분간 가열하였다. 용액 제 1번을 약 10 ℃ 온도에서 약 40분간 냉장하였다.
측정된 값은 하기 표 1b에 나타나있다:
[표 1b]
Figure pct00002
효소 활성 및 잔류 효소 활성의 실험 결과는 본 발명의 말미에 기술되어 있는 실험 방법을 사용하여 행하여졌음을 밝힌다. 용액 제 1번 (대조군)과 비교하여, 용액 제 2번은 효소 활성을 전혀 상실하지 않았다. 용액 제 3번은 약간 염기성화되어 약 8.22의 pH를 갖고, 아스파라기나아제 효소는 약 35 ℃에서 약 40분 후 활성의 약 62 %를 상실하였다. 식수에 묽은 염산의 첨가는 (용액 제 4번) pH를 약 7.55로 낮추었고, 아스파라기나아제는 약 35 ℃에서 약 40분간 가열 후 활성의 약 48 %를 상실하였다. 그 결과, 용액 제 3번의 알칼리도는 효소 활성의 감소에 책임이 있는 것으로 밝혀졌다. 일반적으로 pH는 아스파라기나아제 활성에 영향이 있고 아스파라기나아제 활성은 pH가 약 4와 약 7 사이일 때 더 높은 것으로 인식된다.
<실시예 2>
동일한 초기 아스파라기나아제 (노보자임 A/S) 활성을 가지고, 각 용액이 약 50 ml의 총 부피를 갖도록 탈이온수 또는 식수로 희석된 각 분취액으로부터 네 개의 용액을 형성하였다. 각 용액에서 사용된 물 형태는 다음의 표 3에 기술되어 있다:
[표 2a]
Figure pct00003
각 용액 제 2번 내지 4번을 염소 수준, 경도, pH, 및 효소 활성 측정 전에 약 35 ℃에서 약 40분간 가열하였다. 대조군은 가열하지 않았다. 측정된 값은 하기 표 2b에 나타나있다.
[표 2b]
Figure pct00004
상기 데이터는 염소가 잔류 효소 활성에 미치는 부정적 영향을 잘 입증한다. 예를 들어, 용액 제 1번 (대조군)은 염소를 가지고 있지 않고 가장 높은 잔류 효소 활성을 가진다. 용액 제 2번은 가장 낮은 잔류 효소 활성을 가지고 가장 높은 자유 염소 수준 및 총 경도를 가진다.
용액 제 3번은 80 % 이상의 잔류 활성과 함께 상대적으로 낮은 자유 염소 농도 및 양호한 경도 수준을 가진다. 용액 제 4번은 용액 제 3번과 비슷한 자유 염소 농도, 및 더 낮은 경도 수준을 가지며, 결과적으로 약간 더 높은 잔류 활성을 가진다. 표 2b는 아스파라기나아제의 잔류 효소 활성은 염소 수준에 반비례한다는 것을 입증한다.
<실시예 3>
동일한 초기 아스파라기나아제 (노보자임 A/S) 활성을 가지고, 각 용액이 약 50 ml의 총 부피를 갖도록 탈이온수 또는 식수로 희석된 각 분취액으로부터 네 개의 용액을 형성하였다. 각 샘플에서 사용된 물 형태는 다음의 표 3a에 나열되어 있다.
[표 3a]
Figure pct00005
각 용액 제 2번 내지 4번을 자유 염소, 총 경도, pH, 및 잔류 효소 활성 측정 전에 약 35 ℃에서 40분간 가열하였다.
측정된 값은 하기 표 3b에 나타나있다:
[표 3b]
Figure pct00006
상기 표 3b와 같이, 용액 2에서 보여진 바와 같이 탈이온수에 염소를 첨가하거나 또는 용액 3에서 보여진 바와 같이 식수에 염소가 존재하면 아스파라기나아제 효소의 잔류 활성을 분명히 낮춘다. 더구나, 용액 1의 탈이온수 내의 효소의 잔류 활성 수준 및 용액 4의 브리타 여과수 내의 잔류 효소 활성에 의하여 증명되듯이 염소의 제거 또는 부재는 효소의 활성 증가라는 분명한 결과를 발생시킨다. 용액 2의 염소 수준은 차아염소산나트륨 형태의 염소가 용액에 더하여졌기 때문에 측정되지 않았다. 또한, 식수가 있었기 때문에, 용액 3 내의 상대적인 염소 수준은 식수 수준을 모방한 것임을 알게 되었다.
<실시예 4>
본 실험의 목적은 아스파라기나아제 활성에 염소가 미치는 영향을 알아내기 위하여 식수에서 발견되는 염소의 양을 염소가 없는 탈이온수에 첨가함으로써 염소가 효소 활성에 미치는 영향을 분석하는 것이다.
동일한 초기 아스파라기나아제 (노보자임 A/S) 활성을 가지고, 각 용액이 약 50 ml의 총 부피를 갖도록 탈이온수 또는 식수로 희석된 각 분취액으로부터 네 개의 용액을 형성하였다. 각 샘플에서 사용된 물 형태는 하기 표 4a에 나열되어 있다.
[표 4a]
Figure pct00007
각 용액 제 2번 내지 4번을 염소, pH, 및 잔류 효소 활성 측정 전에 약 35 ℃에서 40분간 가열하였다. 용액 1은 가열하지 않았다. 측정된 값은 하기 표 4b에 나타나있다:
[표 4b]
Figure pct00008
상기 표 4b의 데이터는 염소 단독으로 물에 첨가될 때 잔류 아스파라기나아제 활성은 상당히 낮아진다는 것을 입증한다. 그러나, 상대적으로 낮은 수준에서, 염소는 잔류 효소 활성에 영향을 덜 미친다.
<실시예 5>
식수 변형이 아스파라기나아제의 잔류 활성에 미치는 잠재적 영향을 확인하기 위하여 다섯 개의 용액을 준비하였다. 동일한 초기 아스파라기나아제 (노보자임 A/S) 활성을 가지고, 각 용액이 약 50 ml의 총 부피를 갖도록 탈이온수 또는 식수로 희석된 각 분취액으로부터 각 용액을 형성하였다. 용액을 약산성으로 만들기 위하여 구연산을 첨가하였다. 각 용액에서 사용된 물 형태는 하기 표 5a에 기술되어 있다:
[표 5a]
Figure pct00009
각 용액 제 2번 내지 5번을 자유 염소, 총 염소, pH, 및 잔류 효소 활성 측정 전에 약 35 ℃에서 40분간 가열하였다. 용액 1은 가열하지 않았다. 측정된 값은 하기 표 5b에 나타나있다:
[표 5b]
Figure pct00010
도 1a는 식수의 다양한 처리 후 잔류 효소 활성의 도표이다. 효소 활성은 막대 그래프에서 막대로 나타나고 총 염소 농도는 선 (150)으로 나타난다. 데이터에 의하여 입증되듯, 티오황산염 (식수 내 염소 농도에 비하여 약 5배 큰 정도로 첨가)은 염소 농도를 감소시키고 효소 활성을 86 %까지 증가시켰다 (140). 1.2 ppm의 총 염소를 가지고 있는 식수는 단지 12 %의 비교적 낮은 잔류 활성을 가졌다 (110). 구연산은 식수 내 염소 수준을 감소시키고 효소 활성을 32 %까지 증가시켰다 (120).
EDTA를 갖는 식수 내 효소 활성 (130)은 탈이온수의 효소 활성 (100)과 동일하나, EDTA가 총 염소를 단지 약간 감소시켰다. 이론에 구속될 것 없이, 출원인들은 EDTA가 효소를 덮을 것이고 따라서 염소로부터 보호할 것이라고 믿고 있거나, EDTA가 염소를 붙잡고 있을 것이라고 믿고 있다. 예를 들어, 염소는 실험 중 여전히 나타나나, EDTA와 염소 사이의 가역 반응이 염소를 산화 또는 그렇지 않으면 아스파라기나아제와의 반응으로부터 보호할 것이다. 따라서, EDTA는 염소를 불활성화시키는 것으로 보인다. 결과적으로, 일 실시예에서, 염소가 아스파라기나아제의 활성을 감소시키지 못하게 하고/하거나 염소를 불활성화시키는 첨가제가 첨가될 수 있다.
<실시예 6>
식수에서 흔히 발견되는 경수 성분의 잠재적 영향을 확인하기 위하여 다섯 개의 용액을 준비하였다. 각 용액은 동일한 초기 아스파라기나아제 (노보자임 A/S) 활성을 가지고, 각 용액이 약 50 ml의 총 부피를 갖도록 탈이온수 또는 식수로 희석된 각 분취액으로부터 형성되었다. 각 염 용액은 대략 플라노로부터 온 식수에서 발견되는 탄산 칼슘 농도의 두 배인 5 mM (5 밀리몰)의 염 농도를 달성하기 위하여 염을 첨가하였다. 예를 들어, 상기 표 3b에 나타나듯, 용액 제 3번 (플라노 식수)의 총 경도는 약 2.28 mM에 대응되는 228 mg/L이다. 각 용액에서 사용된 다양한 염 유형은 하기 표 6a에 기술되어 있다:
[표 6a]
Figure pct00011
각 용액 제 2번 내지 제 5번을 잔류 효소 활성 측정 전에 약 35 ℃에서 40분간 가열하였다. 측정된 값은 하기 표 6b에 나타나있다:
[표 6b]
Figure pct00012
도 1b는 다양한 염수 혼합물의 잔류 효소 활성의 도표이고 상기 표 6b의 결과를 도표로 보여준다. 첨가된 염은 효소 안정성에 미치는 명확한 효과가 없었다. 결과적으로, 염소는 아스파라기나아제 활성 감소의 대부분에 책임이 있다고 믿어진다.
<실시예 7>
동일한 초기 아스파라기나아제 활성을 가진 두 분취액을 제1 아스파라기나아제 용액 및 제2 아스파라기나아제 용액을 만들기 위해 탈이온수 (셀 (Cell) 1) 및 수돗물 (셀 2)로 동일하게 희석하였다. 각 용액을 실온에서 30분간 유지하였고 그 후 각 아스파라기나아제 용액을 옥수수 마사에 첨가하였다. 마사 내의 아스파라긴은 효소가 마사에 첨가된 뒤 5분 및 10분에 측정하였고 그 값은 하기 표 7에 나타내었다.
[표 7]
Figure pct00013
상기 표 7에 나타나있는 옥수수 마사 내 아스파라긴 수준은 아스파라긴의 결과적 수준이 근본적인 희석된 아스파라기나아제 용액에 강하게 의존한다는 것을 입증한다. 상기 실시예에서, 수준 차이는 식수에 비해 탈이온수에 의한 처리 후에 옥수수 마사 내 아스파라긴의 수준의 약 한 자릿수의 크기였다.
상기 데이터는 아스파라기나아제의 잔류 활성을 극대화하기 위하여 활성 염소 수준이 낮아져야 한다는 것을 분명히 입증한다. 탈이온수 및 증류수는 값비싸기 때문에, 본 발명은 식수 또는 다른 수원으로부터 염소를 선택적으로 제거 및/또는 불활성화 함으로써 잔류 효소 활성을 극대화하는 방법을 제공한다.
활성 탄소, 공기 스트리퍼(air stripper) (염소를 증발시키기 위하여), 역삼투 시스템, 및/또한 이온 교환 수지를 통한 식수의 여과에 의한 활성 감소 성분의 농도를 줄이기 위한 식수 처리를 포함하나 이에 제한되지 않는, 식수에서 효소 활성 감소 성분의 농도를 감소시킬 수 있는 임의의 선행 기술 방법이 사용될 수 있다. 또한 안정한 효소 용액의 제조를 위해 활성 감소 성분의 농도를 낮추기에 충분한 양의 탈이온수 또는 증류수와 식수를 혼합함으로써 식수를 처리할 수 있다.
여기에서 사용된 "제거제"는 염소와 반응하여 효소 활성을 보존하는 모든 첨가제를 의미한다. 결과적으로, 효소 감소 성분의 제거제가 식수에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 일 실시예로, 염소 제거제인 티오황산염이 식수에 첨가된다. 추가로, 염소를 불활성화시키기 위해 다른 첨가제들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 염소는 강한 산화제이기 때문에, 염소와 반응하도록 식수에 또한 환원제가 첨가될 수 있다. 환원제는 산화-환원 화학에서 전자 공여체 화합물이라고 알려져 있고, 산화제는 전자 수용체라고 알려져 있다. 결과적으로, 일 실시예로, 하나 이상의 환원제 (예를 들어 전자 공여체)가 염소를 불활성화 또는 중성화시키기 위하여 식수원에 첨가될 수 있다. 환원제의 예는, 염화제1주석 이수화물, 아황산 나트륨, 메타-중아황산 나트륨, 아스코르브산, 아스코르브산 유도체, 이소아스코르브산 (에리토르브산), 아스코르브산 유도체의 염, 철, 아연, 철 이온, 및 이들의 조합물을 포함하나 이들로 제한되지는 않는다.
일 실시예로, 본 발명은 총 염소 농도를 약 0 내지 약 0.5 ppm 미만 정도 및 바람직하게는 0 내지 약 0.1 ppm으로 줄인다.
일 실시예로, 아스파라기나아제는 그 후 안정한 아스파라기나아제 용액을 제조하기 위해 처리된 식수와 혼합될 수 있고, 아스파라기나아제 용액은 그 후 식품과 혼합될 수 있다. 일 실시예로, 처리된 식수에 효소가 첨가된 뒤 30분 이상, 더욱 바람직하게는 약 4시간 이상 동안 잔류 효소 활성이 약 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 90 % 이상일 때 식수가 충분히 처리되고 안정한 효소 또는 아스파라기나아제 용액이 생성된다. 일 실시예로, 아스파라기나아제 용액이 도우 내에 혼합되게 하는데 요구되는 시간 동안 잔류 효소 활성이 약 90 % 이상이다.
본 발명의 도움으로, 당업자는 원하는 잔류 효소 활성을 야기하는데 필요한 물 조성물을 알아내고, 제공할 수 있을 것이다.
아스파라기나아제 용액이 첨가될 수 있는 식품에는, 도우, 반죽(slurries), 및 아크릴아미드 수준을 낮추는 것이 바람직한 모든 다른 소비품이 포함되지만 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 일 실시예로, 아스파라기나아제 용액은 감자 플레이크로부터 제조된 감자 반죽에 첨가된다. 일 실시예로, 감자 반죽은 감자 플레이크에 아스파라기나아제 용액을 첨가함으로써 만들어진다. 일 실시예로, 아스파라기나아제 용액은 첨가되는 물에 사용되고 가루 조성물에 첨가하여 도우를 제조한다. 일 실시예로, 아스파라기나아제 용액은 옥수수 마사에 첨가된다.
일 실시예로, 본 발명은 아스파라긴을 갖는 식품 성분에 첨가될 수 있는 아스파라기나아제의 안정한 용액을 제공하기 위한 시스템을 포함한다. 일 실시예로, 본 시스템은 물 처리를 위한 처리 시스템을 포함한다. 처리 시스템은 활성 탄소 또는 상기에서 열거된 다른 제거 방법을 통하여 염소 같은 성분을 제거할 수 있고/있거나 처리 시스템은, 첨가제가 첨가되지 않은 경우보다 더 높은 정도로 아스파라기나아제의 활성을 증가시키는 환원제, 염소 제거제, 또는 EDTA를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 첨가제를 제공할 수 있다. 처리된 식수는 그 후 안정한 아스파라기나아제 용액을 만들기 위해 아스파라기나아제가 그 안에서 희석될 수 있는 혼합 탱크로 보내질 수 있다. 아스파라기나아제 용액은 그 후 제조 식품을 만드는데 사용되는 도우에 계량 투여되거나 또는 다르게 첨가될 수 있거나, 또는 상기 언급된 대로 열 가공될 수 있다. 도우는 선행 기술에서 잘 알려진 대로 그 후 추가로 가공될 수 있다 (예를 들어, 압출 및 시트화에 의해 성형되고 열 가공됨). 당업자는 본 발명의 도움으로, 식품 내 아크릴아미드의 수준을 감소시키기 위해 아스파라기나아제 용액이 필요한 곳 어디든지 본 발명이 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
일 실시예로, 본 발명은 식수원 및 아스파라기나아제원, 처리된 식수 내 아스파라기나아제의 활성을 처리가 되지 않은 경우보다 더 높은 정도로 증가시키도록 작동될 수 있는 처리 시스템, 및 처리된 식수 및 아스파라기나아제를 혼합하도록 작동될 수 있는 전달 시스템을 포함하는 시스템을 포함한다. 일 실시예로, 전달 시스템은 처리 시스템으로부터 처리된 식수 및 아스파라기나아제를 받는 혼합 탱크를 포함한다.
본 출원의 실시예에서 아스파라기나아제 활성의 측정에 사용된 실험 방법은 다음과 같다:
I. 배경: 아스파라기나아제 활성을 위한 시그마 방법 (The SIGMA procedure)에서는 pH 8.6의 트리스(Tris) 완충제를 사용하였다 (시그마 카탈로그 A 4887). 식품 등급 아스파라기나아제가 pH 8.6에서 낮은 활성을 가지기 때문에, 분석법에서는 MOPS (3-모르폴리노프로판술폰산)으로 pH 7.0으로 변경하였다.
II. 이론:
L-아스파라긴 + H2O 아스파라기나아제 > L-아스파르테이트 + NH3
III. 조건: 온도 = 37 ℃, pH = 7.0, A436, 광 경로 = 1 cm
IV. 방법: 분광 광도식 중단 속도 결정법
V. 시약
a. 100 mM MOPS 나트륨염 (3-모르폴리노프로판술폰산). MOPS (시그마 M5162) 2.09 g을 칭량한다. 실온에서 약 60 ml의 탈이온수에 용해한다. pH를 7.0으로 맞추기 위하여 수산화 나트륨을 첨가한다. 탈이온수로 100 ml를 만든다. 사용하지 않을 시에는 냉장고에 보관한다.
b. 189 mM의 L-아스파라긴 용액. L-아스파라긴 무수물 0.25 g을 칭량하고, 10 ml의 탈이온수에 용해한다. 사용하지 않을 시에는 냉장고에 보관한다. 냉장 후에는, 사용 전 아스파라긴 결정을 용해하기 위하여 초음파 처리한다.
c. 6 mM의 황산 암모늄 기준 용액 ((NH4)2SO4 기준). 분석용 저울에서 황산 암모늄 0.079 g을 칭량하고, 중량 0.0001 g까지 기록한다. 탈이온수로 용해하고 100 ml 부피를 만든다. 사용하지 않을 시에는 냉장고에 보관한다.
d. 1.5 M 트리클로로아세트산 (TCA). 트리클로로아세트산 2.45 g을 칭량한다. 탈이온수에 녹이고 10 ml를 만든다.
e. 암모니아 색 시약: 암모니아 질소 하이, 네슬러리제이션용 테스트 키트 (Test kit for Ammonia Nitrogen High, Nesslerization), 라모떼 코드(LaMotte Code) 3642-SC, VWR 카탈로그 번호 34186-914. 시약 #2는 수은을 포함하고 있다.
f. 아스파라기나아제 효소 용액: 사용 직전에, 실온의 탈이온수에서 아스파라기나아제 2.0 - 4.0 단위/ml를 포함하는 용액을 준비한다. 만약 효소가 얼었다면, 희석용 분취액의 채취 전 미지근한 물에서 완벽하게 해동한다. 일반적인 효소 농도의 경우, 효소 용액 0.1 ml는 50 ml로 희석될 수 있다.
VI. 과정:
a. 바이알용 가열 블록(block)을 37 ℃로 맞춘다.
b. 다음의 시약들을 적절한 마이크로피펫을 사용하여 바이알 (ml)로 옮긴다:
Figure pct00014
c. 바이알 뚜껑을 닫고, 37 ℃의 가열 블록에 놓아둔다. 가열 블록의 교반을 시작한다.
d. 30분 후 가열 블록에서 바이알을 제거한다. 바이알 뚜껑을 열고, 즉시 TCA 시약을 첨가하고, 혼합한다. 그 후 시약 F (효소 용액)을 효소 블랭크에 첨가한다. 효소 실험 용액의 경우, 가열 블록으로부터 바이알의 제거와 TCA의 첨가 사이의 시간은 가능한 짧아야 한다. TCA가 첨가된 후, 암모니아 측정 전 시간은 크게 중요하지 않다. 블랭크 및 표준의 경우, 가열 블록으로부터 제거와 TCA 첨가 사이의 시간은 크게 중요하지 않다.
Figure pct00015
e. 각 용액 0.20 ml를 피펫으로 시험관 또는 바이알에 옮긴다. 탈이온수 4.30 ml, 라모떼 시약 #1 4 방울 및 라모떼 #2 0.50 ml를 첨가한다. 용액을 혼합하고 1 cm 셀 내 436 nm에서 흡광도를 읽기 전 실온에서 10-20 분간 놔둔다. 탈이온수로 분광광도계를 0으로 맞춘다.
VII. 결과 계산
f. 효소 활성은 암모니아의 검정 곡선으로부터 계산된다 (umole/0.2 ml).
g. 계산 과정의 설명
i. 황산 암모늄 표준 용액 농도의 계산:
mM = (0.0809 g)*(1000 mM/M)*(2 NH3/NH4SO4)/((132.14 g/mole)*(0.1 L))
= 12.24 mM = mmole/L = umole/ml
상기 식에서 0.0809 g은 표준으로써 황산 암모늄의 중량이다.
ii. 2.2 ml 표준 내 NH3 umole의 계산:
2.2 mL 내 NH3 umole = (NH3 umole/mL 표준 용액)*(표준의 mL)
iii. NH3 umole/0.2 mL의 계산:
NH3 umole/0.2 mL = (2.2 ml 내 NH3의 umole)*(0.2 mL)/(2.2 mL)
iv. 회귀곡선의 계산
x = A436
y = NH3 umole/0.2 mL
v. 검정 곡선으로부터, NH3 umole/0.2 ml이 계산된다:
NH3 umole/0.2 mL = (기울기)*(A436) + 절편
vi. 희석된 효소 용액의 활성은 다음의 식으로 계산된다:
단위/ml 효소 = (유리된 NH3의 umole)*(2.20)/(0.2*30*0.l), 이때
2.20 ml = 단계 1의 부피 (단계 1은 효소 검정 용액이다.)
0.2 ml = 단계 2에서 쓰인 단계 1의 부피 (단계 2는 발색 현상이다.)
30분 = 분 단위 검정 시간
0.1 ml = 사용된 효소의 부피
vii. 희석 비율은 50 mL를 50 mL로 희석된 농축 효소의 부피로 나눈 것이다.
viii. 희석 전 효소 용액의 농도 =
= (단위/ml 희석된 용액)*(희석 비율)
본 발명은 특별히 몇몇 실시예들을 참고로 보여주고 기술하였지만, 본 발명의 사상과 범위로부터 벗어남 없이 용액 내 잔류 아스파라기나아제 활성 보존에 대한 다양한 다른 접근이 가능할 것임을 당업자들은 이해할 수 있을 것이다.

Claims (20)

  1. a) 약 0.5 ppm 미만의 염소 농도를 추가로 포함하는 처리된 식수를 제조하도록 식수를 처리하는 단계; 및
    b) 상기 처리된 식수와 아스파라기나아제를 혼합하여 아스파라기나아제 용액을 제조하는 단계
    를 포함하는 용액 내 아스파라기나아제 활성 증가 방법.
  2. 제1항에 있어서, 산으로 식수를 처리하는 것을 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 활성 탄소를 사용하여 식수를 처리하는 것을 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단계 a)의 처리된 식수가 이온 교환 수지를 사용하여 처리된 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단계 a)의 처리된 식수가 역삼투를 사용하여 처리된 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 처리된 식수가 공기 스트리핑에 의하여 처리된 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 아스파라기나아제 용액이 약 80 % 이상의 잔류 활성을 포함하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 처리된 식수가 환원제로 처리된 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 환원제는 염화제1주석 이수화물, 아황산 나트륨, 메타-중아황산 나트륨, 아스코르브산, 아스코르브산 유도체, 이소아스코르브산 (에리토르브산), 아스코르브산 유도체의 염, 철, 아연, 철 이온, 및 이들의 조합물로부터 선택된 하나 이상의 시약을 포함하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 처리된 식수가 약 8.0 미만의 pH를 포함하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 식수가 염소의 최종 수준을 첨가제가 첨가되지 않은 경우보다 더 낮은 수준으로 감소시키기에 충분한 첨가제로 처리된 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 처리된 식수가 염소 제거제로 처리된 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 첨가제가 티오황산염을 포함하는 방법.
  14. 효소가 식수에 첨가된 뒤 약 30분 이상 동안 약 이상의 잔류 효소 활성을 제공하는데 충분한 양으로 식수로부터 하나 이상의 활성 감소 성분을 불활성화함으로써 식수로부터 안정한 효소 용액을 제조하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 활성 감소 성분이 염소를 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 식수를 활성 탄소를 통하여 보내는 방법에 의해 상기 염소가 제거되는 방법.
  17. 제14항에 있어서, EDTA가 상기 식수에 첨가되는 방법.
  18. 식수원;
    아스파라기나아제원;
    아스파라기나아제와 혼합 전 식수를 처리하도록 작동될 수 있는 처리 시스템; 및
    처리된 식수 및 아스파라기나아제를 혼합하도록 작동될 수 있는 전달 시스템
    을 포함하는 시스템.
  19. 제18항에 있어서, 상기 처리 시스템이 염소를 제거하는 시스템.
  20. 제18항에 있어서, 상기 처리 시스템이 염소를 불활성화하는 시스템.
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