CN102256497B - 天冬酰胺酶的稳定化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及天冬酰胺酶的稳定化。

Description

天冬酰胺酶的稳定化
引用序列表
本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过提述并入本文。
技术领域
本发明涉及天冬酰胺酶的稳定化。
背景技术
公知的是加热食品中丙烯酰胺的形成可通过减少食物材料中天冬酰胺的量而减少，如对食物材料进行天冬酰胺酶的作用(参见例如WO2004/026043(The Procter&Gamble Company))。
对于一些应用，为了适应于特定食品的生产线，天冬酰胺酶处理应优选在相对高的温度进行。然而天冬酰胺酶可能在工业上施用于酶处理的优选温度并不稳定。此外，天冬酰胺酶甚至在较低温度也可能不稳定，例如，当被稀释或持续使用时，如在产生炸马铃薯片或薯条过程中将马铃薯片在天冬酰胺酶溶液中连续或分批浸渍或温育时。
因此，本发明的目的是寻找稳定化天冬酰胺酶的手段，特别是在高温或当被稀释或持续使用时。
发明内容
本发明人令人意想不到地发现天冬酰胺酶在低pH更加稳定。具体而言，天冬酰胺酶在低pH更加热稳定。因此，将酸如酸式焦磷酸钠、磷酸二氢钾或柠檬酸的添加至天冬酰胺酶的水溶液改进了酶的稳定性，如其在高温的稳定性，或当其被稀释时的稳定性。
因此，本发明在一个方面涉及产生经热处理的食品的方法，包括：
a)在至少42℃的温度将所述食品的中间形式与天冬酰胺酶在低于约pH6.5的pH相接触。
b)将所述食品的中间形式温育至少1分钟，和
c)加工所述食品的中间形式以获得经热处理的食品，其中所述加工包括加热。
在一个优选实施方案中，步骤a)中的接触是通过将所述食品的中间形式在包含天冬酰胺酶的溶液中浸渍或温育来进行的。在工业工艺中，此种天冬酰胺酶溶液通常在例如连续工艺中再使用，因此酶稳定性为极端重要的参数。因此，本发明的方法与此类工艺特别相关，因为溶液中天冬酰胺酶活性的衰减目前因为该工业优选的高温而成为问题，该问题可由于将温热中间食品产物连续浸渍/温育，连同该溶液的长期使用时间，以及来自所述中间食品产物如来自马铃薯片或焯烫过的(blanched)马铃薯条可能的物质泄露而进一步加重。在此类应用中，根据本发明方法具有较低pH的天冬酰胺酶溶液具有重大优势，因为其显著地延长了所述天冬酰胺酶的稳定性。
在另一个方面，本发明涉及以至少100 ASNU每克的浓度包含天冬酰胺酶并具有低于约pH6的pH的酶颗粒。
在另一个方面，本发明涉及用于产生包含天冬酰胺酶的酶颗粒的方法，该方法包括：
a)制备包含天冬酰胺酶并具有低于约pH6的pH的水溶液；和
b)将所述水溶液配制为酶颗粒。
在另一个方面，本发明涉及以100-2,000ASNU每克的浓度包含天冬酰胺酶并具有低于约pH6.5的pH的水性储液。
在又一个方面，本发明涉及用于稀释或溶解天冬酰胺酶浓缩组合物以供将其施用于工业工艺的方法，包括：
a)将以至少2,000ASNU每克的浓度包含天冬酰胺酶的浓缩组合物稀释或溶解成与所述浓缩组合物相比包含少于一半的天冬酰胺酶活性每克并具有低于约pH6.5的pH的储液，和
b)将所述储液施用于工业工艺。
本发明的这些和其他方面进一步如下所述。
具体实施方式
天冬酰胺酶
本发明的天冬酰胺酶可为根据标准酶EC分类法定义为EC3.5.1.1并催化下述反应的酶：
L-天冬酰胺+H2O＝L-天冬氨酸+NH4 +
所述天冬酰胺酶可为微生物天冬酰胺酶，例如来源于细菌、古菌(archaeon)或真菌的天冬酰胺酶。所述天冬酰胺酶可为例如来源于古菌(Archaea)、菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemii)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)或橘青霉(Penicillium citrinum)。
在一个优选实施方案中，本发明的天冬酰胺酶来源于曲霉属(Aspergillus)。
本发明的天冬酰胺酶可具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或与SEQID NO：1具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。此种天冬酰胺酶可优选地来源于米曲霉或黑曲霉，最优选来源于米曲霉。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度可使用如EMBOSS包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice et al.，2000，Trends in Genetics 16：276-277)(优选3.0.0或更新版本)中的Needle程序执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)来确定。使用的最佳参数为缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(通过使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性，并如下进行计算：
(相同的残基x100)/(比对长度-比对中缺口总数)
本发明的天冬酰胺酶在其最具活性的形式可为四聚体。
产生食品的方法
如上所述，本发明在一个方面涉及产生经热处理的食品的方法，包括：
a)在至少42℃、优选至少45℃、至少50℃或至少55℃、更优选至少60℃、至少62℃或至少65℃的温度将所述食品的中间形式与天冬酰胺酶在低于约pH6.5的pH相接触，
b)将所述食品的中间形式温育至少1分钟，和
c)加工所述食品的中间形式以获得经热处理的食品，其中所述加工包括加热。
优选地，步骤b)中的温育进行至少5分钟，更优选7-15分钟。
在一个优选实施方案中，所述经热处理的食品是基于植物的(vegetable-based)食品。优选地，此种基于植物的食品来源于植物块茎或根，例如但不限于下组：马铃薯、甘薯(sweet potato)、薯蓣(yam)、豆薯(yam bean)、欧洲防风(parsnip)、欧芹根(parsley root)、菊芋(Jerusalem artichoke)、胡萝卜、小红萝卜(radish)、芜菁(turnip)和木薯(cassava)。通过本发明方法产生的优选食品是马铃薯产品。通过本发明方法产生的更优选的食品是炸薯条(french fries)或炸马铃薯片(sliced potato chips)。通过本发明方法产生的另一种更优选食品是包含马铃薯颗粒或马铃薯小片(potato flake)的食品，如基于马铃薯的零食(snack)。
待通过本发明方法产生的食品的中间形式可为在获得最终经热处理食物之前待施用于热处理的任何中间形式。例如，如果所述经热处理的食品是炸薯条，中间形式可为最终炸制之前任何时点的薯条。或者，如果最终炸制是由消费者进行的，例如在餐馆或家中，通过本发明方法产生的经热处理的食品是部分炸制(par-fried)的炸薯条，而中间形式可为在部分炸制之前任何时点的薯条。如果经热处理的食品是从马铃薯颗粒或马铃薯小片制得的基于马铃薯的零食，所述食品的中间形式可为经烹制的马铃薯泥，其会被加工为马铃薯颗粒或马铃薯小片以用于产生所述零食，或其可为包含马铃薯颗粒或马铃薯小片的生面团或生面团片。如果所述经热处理的食品是基于生面团的烘烤食品，例如面包，或基于生面团的炸制食品，例如玉米片(tortilla chip)，中间形式可为最终烘烤或最终炸制之前任何时点的生面团或生面团片。
在一个优选实施方案中，所述经热处理的食品是经部分炸制的炸薯条，而所述食品的中间形式是在部分炸制之前任何时点的焯烫的薯条。在另一个优选实施方案中，所述经热处理的食品是炸马铃薯片，而所述食品的中间形式是在最终炸制之前任何时点的马铃薯切片。在另一个优选实施方案中，所述经热处理的食品是从马铃薯颗粒或马铃薯小片制得的基于马铃薯的零食，而所述食品的中间形式是经烹制的马铃薯泥，其将被加工为马铃薯颗粒或马铃薯小片以用于产生所述零食。
所述食品的中间形式与天冬酰胺酶在低于约pH6.5的pH相接触可通过将所述食品的中间形式温育或浸渍于包含天冬酰胺酶并具有低于约pH6.5的pH的溶液中来进行。在此情况下，步骤a)中的接触和步骤b)中的温育可作为一个步骤进行，其中将所述食品的中间形式在所述溶液中温育至少1分钟。此种温育可为更长，例如至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟或至少30分钟。
或者，在溶液中浸渍或温育可进行较短时间，之后例如在干燥烤箱中干燥所述食品的中间形式。在此情况下，所述干燥步骤可对于天冬酰胺酶作用为重要的，因此，如果浸渍较短，本发明方法中温育步骤b)可为干燥所述食品的中间形式。此种在溶液中较短的浸渍或温育可为例如2秒至1分钟，如约5秒、约10秒、约30秒或约45秒。或者浸渍可为不进行温育的非常短时间的浸渍。
或者，步骤a)中的接触可通过在至少42℃的温度用包含天冬酰胺酶并具有低于约pH6.5的pH的溶液喷洒所述食品的中间形式，然后例如在干燥烤箱中温育至少1分钟，优选至少5分钟，更优选至少10分钟来进行。
所述干燥可例如在60℃以上，优选70℃以上，且更优选80℃以上的气温，如在约85-90℃的温度进行。或者，干燥可在较低温度进行，例如在40-45℃。干燥还可在任何其他温度进行，例如在45-60℃。干燥可进行例如5至30分钟。干燥可在烤箱中进行，其中温度、湿度和/或气流可调整至所需水平。
如上所述，本发明方法中的温育步骤b)可为干燥所述食品的中间形式。虽然如此，其也可为将所述食品的中间形式在任选地进行干燥之前用酶温育。温育步骤b)可为经热处理的食品制造工艺中天冬酰胺酶具有活性并与所述食品的中间形式相接触的任何步骤。
在一个优选实施方案中，待用于本发明方法的多种实施方案的包含天冬酰胺酶并具有低于约pH6.5的pH的溶液，即所述食品的中间形式浸渍或温育于其中的溶液或喷洒在所述食品中间形式之上的溶液，以1,000-50,000ASNU每升、优选2,000-20,000ASNU每升、更优选3,000-15,000ASNU每升以及最优选4,000-10,000ASNU每升的浓度包含天冬酰胺酶。
天冬酰胺酶单位(ASNU)定义为由在37℃和pH7.0水解天冬酰胺1分钟生成10微摩尔氨所需的酶量。当确定活性时，天冬酰胺的浓度可为9.6mg/ml。
在一个优选实施方案中，待用于本发明方法的多种实施方案的包含天冬酰胺酶并具有低于约pH6.5的pH的溶液，即所述食品的中间形式浸渍或温育于其中的溶液或喷洒在所述食品中间形式之上的溶液，包含至少一种选自下组的酸：酸式焦磷酸钠、磷酸二氢钾、柠檬酸、乳酸、乙酸、抗坏血酸、磷酸二氢钙和酒石酸氢钾。此种或此类酸，任选地与其他酸组合，会以足够量存在于溶液中从而使得所述溶液具有低于约pH6.5的pH。或者，可使用相应的碱，并使用酸和相应盐的相关混合物或另一种酸将pH调整至所需pH。
优选地，所述溶液具有低于pH6.5的pH。在一个优选实施方案中，所述溶液具有低于约pH6的pH，如低于pH6的pH。在另一个优选实施方案中，所述溶液具有低于约pH5.8的pH，如低于pH5.8的pH。在另一个优选实施方案中，所述溶液具有低于约pH5.7的pH，如低于pH5.7的pH。在另一个优选实施方案中，所述溶液具有约pH5.5的pH。
酸式焦磷酸钠(Na2H2P2O7)有时也称作SAPP或焦磷酸二钠。磷酸二氢钾(KH2PO4)有时也称作磷酸二氢钾KDP或单碱磷酸钾MKP。酒石酸氢钾(KC4H5O6)有时也称作酒石酸氢钾或酒石(cream of tartar)。磷酸二氢钙(Ca(H2PO4)2)有时也称作酸式磷酸钙。
如果所述食品的中间形式是生面团，可将所述生面团与天冬酰胺酶在低于约pH6.5的pH相接触，即将天冬酰胺酶和任何适当的酸添加至生面团的液体成分，然后将其混入干成分以形成所述生面团，或所述天冬酰胺酶和适当的酸，任选地为溶液形式，可在将其与液体成分混合之前直接添加至所述生面团的干成分，或所述天冬酰胺酶和适当的酸，任选地为溶液形式，可在干成分或部分干成分已与液体混合之后添加至所述生面团或所述生面团的一些前体形式。所述天冬酰胺酶和所述酸并不需要同时和/或从同一溶液添加至生面团或生面团的成分。然而，优选所述酸在所述天冬酰胺酶之前或同时添加。适当的酸可为例如选自下组的至少一种酸性物质：酸式焦磷酸钠、磷酸二氢钾、柠檬酸、乳酸、乙酸、抗坏血酸、磷酸二氢钙和酒石酸氢钾。步骤b)中的温育可例如在进一步加工所述生面团或在生面团静置(resting)时发生。
在一个优选实施方案中，所述食品的中间形式包含经烹制的马铃薯泥。在一个更优选的实施方案中，所述食品的中间形式是经烹制的马铃薯泥。此类经烹制的马铃薯泥可任选地经冷却。当与天冬酰胺酶在低于约pH6.5的pH相接触时，此类经烹制的马铃薯泥可具有至少42℃，优选至少45℃，至少50℃或至少60℃、更优选至少70℃、至少75℃或至少80℃的温度。
优选地，当步骤a)中的接触是通过将天冬酰胺酶在低于约pH6.5的pH掺入所述食品的中间形式来进行时，所述食品中间产物中的天冬酰胺酶浓度为100-10,000ASNU每kg干物质、更优选250-8,000ASNU每kg干物质、更优选500-7,500ASNU每kg干物质并最优选1,000-5,000ASNU每kg干物质。优选地，当步骤a)中的接触是通过将天冬酰胺酶掺入所述食品的中间形式来进行时，所述食品的中间形式具有低于pH6.5的pH。在一个优选实施方案中，所述中间产物具有低于约pH6的pH，如低于pH6的pH。在另一个优选实施方案中，所述中间产物具有低于约pH5.8的pH，如低于pH5.8的pH。在另一个优选实施方案中，所述中间产物具有低于约pH5.7的pH，如低于pH5.7的pH。在另一个优选实施方案中，所述溶液具有约pH5.5的pH。
在本发明方法中的步骤c)中，加工所述食品的中间形式以获得经热处理的食品，其中所述加工包括加热。优选地，此种加热是通过炸制或烘烤进行的。在一个优选实施方案中，所述经热处理的食品是部分炸制的炸薯条，其中步骤c)中的加热是部分炸制，任选地之后进行冷冻和包装。在此情况下，最终炸制可由消费者进行，例如在餐馆或在家中。
步骤c)的加工还可包括其他步骤。例如，如果所述食品的中间形式是经烹制的马铃薯泥，其将被加工为马铃薯颗粒或马铃薯小片以用于产生例如基于马铃薯的零食，所述经烹制的马铃薯泥可在步骤a)和b)之后进行脱水，例如通过干燥，并进一步加工为颗粒或小片，且所述颗粒或小片可随后应用于产生基于马铃薯的零食。在该实例中，所述经热处理的食品是基于马铃薯的零食，而步骤c)中的加热是将其炸制或烘烤。
在步骤a)中的接触是通过将所述食品的中间形式在包含天冬酰胺酶的溶液中浸渍或温育来进行的优选实施方案中，酶活性是极端重要的参数。在工业工艺中，此种酶溶液会被再使用，即仅很少部分的天冬酰胺酶会在浸渍或温育之后粘附于所述食品的中间形式，而大部分天冬酰胺酶会留在溶液中。因此该酶溶液可在更长时间使用以供浸渍或温育大量中间食品产物，例如马铃薯片或焯烫的薯条，以供产生炸马铃薯片或炸薯条。在此种工艺中，本发明的方法是特别相关的，因为溶液中天冬酰胺酶活性的衰减目前成为问题，这是因为工业上优选的高温连同较长使用时间以及来自中间食品产物(如来自马铃薯片或焯烫的薯条)的可能物质泄露，高温部分地是由避免微生物生长的愿望造成的，且其可通过连续浸渍/温育温热的中间食品产物进一步增加。在此类应用中，根据本发明的方法具有低pH的天冬酰胺酶溶液是巨大的优势，因为它显著地扩展了天冬酰胺酶的稳定性。
因此，在一个更优选的实施方案中，步骤a)中的接触是通过将所述食品的中间形式在包含天冬酰胺酶并具有低于约pH6.5的pH的溶液中浸渍或温育来进行的，且所述食品的中间形式随后基本上从天冬酰胺酶溶液分离。在该语境中，基本上分离意指在浸渍/温育之后所述食品的中间形式保留最多10％，如4-5％(wt./wt.)粘附的水分。即中间食品产物的重量因为在浸渍/温育之后粘附于其的天冬酰胺酶溶液而增加了最多10％，如4-5％。优选地，根据该实施方案，将所述天冬酰胺酶溶液用于连续或分批浸渍或温育。连续或分批浸渍或温育在该语境中意指将该天冬酰胺酶溶液用于浸渍或温育多于一批的以其中间形式存在的食品。优选地，所述食品的中间形式是马铃薯切片或经焯烫的薯条，且将一升天冬酰胺酶溶液用于处理至少2kg的马铃薯物质，更优选至少5kg，且甚至更优选至少10kg。
在另一个更优选的实施方案中，步骤a)中的接触是通过将所述食品的中间形式在包含天冬酰胺酶并具有低于约pH6.5的pH的溶液中浸渍或温育来进行的，且所述天冬酰胺酶溶液经缓冲使得在浸渍或温育每升天冬酰胺酶溶液至少2kg，优选至少5kg，更优选至少10kg以其中间形式存在的食品之后pH维持低于6.5。优选地，在该实施方案中，所述食品的中间形式是马铃薯切片或经焯烫的薯条。
在下文中，包含天冬酰胺酶并具有低于约pH6.5的pH的溶液有时称作酸性天冬酰胺酶溶液。
在炸薯条的典型工业生产中，首先将马铃薯洗涤、分选、蒸汽去皮并切割。在切割之后，将薯条以2至3顺序步骤(通常在65-85℃)焯烫10-30分钟。进行焯烫以灭活马铃薯中的内源酶、部分烹制马铃薯和浸出还原糖以避免终产物的过分焦化。在焯烫之后，薯条可迅速地，例如以30-60秒浸渍于温热磷酸盐溶液例如温热的酸式焦磷酸钠溶液中，以避免终产物而灰化(greying)。将该浸渍任选地与在葡萄糖中的浸渍组合以控制最终颜色。可在干燥器中用热的循环空气在75-95℃干燥马铃薯5-20分钟，导致5-25％的重量丧失。或可将其在较低温度干燥，例如在40-45℃，在此情况下重量丧失会较低。最终，在将薯条快速冻结并包装之前对其进行部分炸制。最终的炸制是在餐馆或由消费者进行的。
根据本发明的炸薯条生产方法可如上所述进行，只是将所述中间形式即薯条，在部分炸制之前的某时点在至少42℃的温度与酸性天冬酰胺酶溶液相接触，并温育至少1分钟，优选至少5分钟，所述溶液如包含天冬酰胺酶和酸的溶液，所述酸优选为酸式焦磷酸钠或磷酸二氢钾。此种接触和温育可例如在焯烫之后进行。即，举例而言在焯烫之后，将薯条在至少42℃的温度与酸性天冬酰胺酶溶液相接触，并温育至少1分钟，优选至少5分钟。薯条与酸性天冬酰胺酶溶液的接触可通过将薯条在包含天冬酰胺酶和例如酸式焦磷酸钠的溶液中在一个浸渍浴中温育或浸渍来进行，而所述至少1分钟，优选至少5分钟的温育可在浸渍浴中或在下述任选地干燥步骤中进行，优选进行7-15分钟。或所述接触可通过用酸性天冬酰胺酶溶液在至少42℃的温度喷洒至薯条，然后在如上所述用于典型的炸薯条工业生产的干燥器中温育来进行。在浸渍/温育于所述酸性天冬酰胺酶溶液或用其喷洒并任选地干燥之后，可如上所述部分炸制薯条，将其迅速冻结和包装。所述薯条可任选地浸渍于葡萄糖溶液，例如在与所述酸性天冬酰胺酶溶液接触并温育之前。或者，可将葡萄糖包含于所述酸性天冬酰胺酶溶液，从而使得薯条与天冬酰胺酶、葡萄糖和酸如酸式焦磷酸钠在同时接触。
在马铃薯小片的典型工业生产中，将经烹制的马铃薯泥在带涂布辊(applicator roll)的鼓式干燥器(drum drier)上干燥。然后将经干燥的薄片(sheet)磨碎为小片，并进行包装。此类小片可应用于产生经热处理的基于马铃薯的食品例如基于马铃薯的零食。为了在该工艺中引入天冬酰胺酶处理，必需将经烹制的泥状物充分冷却以免失活该酶。然而，如果将经烹制的泥状物与所述天冬酰胺酶根据本发明的方法在酸性pH相接触，会稳定化天冬酰胺酶，并在添加酶之前需要较少的冷却。为了适应天冬酰胺酶作用，可在将所述泥状物与天冬酰胺酶在低于约pH6.5的pH接触之后维持5-25分钟的时间。
在马铃薯颗粒的典型工业生产中，将含大约80％水分的经烹制的马铃薯泥与之前经干燥的颗粒(常常被称作回添物(add-back))混合以获得潮湿的混合物，其在维持并干燥之后可粒化为细粉。将具有25-30％左右水分的混合物在25-40℃调理0.3-1小时。然后将其干燥至6-10％水分并进行筛选。移出了10-15％的产品并进行包装。剩余的用作回添物。将调理过程的时间用于进行天冬酰胺酶处理是最佳的。然而，如上所述，经烹制的泥状物必须充分冷却以避免使所述酶失活。在低于约pH6.5的pH进行所述天冬酰胺酶处理会改进酶稳定性并允许在更高温度添加酶。
从与天冬酰胺酶根据本发明的方法在低于约pH6.5的pH接触并温育的经烹制的马铃薯泥制备的，待应用于产生经热处理的食品的马铃薯颗粒或马铃薯小片，在包装时可仍包含活性酶。在此情况下，当例如在生面团中使用此类颗粒或小片时，该天冬酰胺酶在生面团中可仍具活性。因此，除了在干燥之前在经烹制的马铃薯泥中的温育之外，与天冬酰胺酶的进一步温育可在炸制或烘烤以产生基于马铃薯的零食之前发生在生面团中。
在另一个方面，本发明涉及产生经热处理的食品的方法，包括：
a)在至少42℃、优选至少45℃、至少50℃或至少55℃、更优选至少60℃、至少62℃或至少65℃的温度将所述食品的中间形式与天冬酰胺酶在磷酸或焦磷酸的无机盐的存在下相接触，
b)将所述食品的中间形式温育至少1分钟，和
c)加工所述食品的中间形式以获得经热处理的食品，其中所述加工包括加热。
优选地，步骤b)中的温育进行至少5分钟。
在本发明的语境中，磷酸或焦磷酸的无机盐可为任何磷酸或焦磷酸的无机盐包括PO4 3-、HPO4 2-、H2PO4 -和P2O7 4-的任何盐。合适的实例可为例如K3PO4、K2HPO4、KH2PO4、Na3PO4、Na2HPO4、NaH2PO4、(NH4)3PO4、(NH4)2HPO4、(NH4)H2PO4、K4P2O7、K3HP2O7、K2H2P2O7、KH3P2O7、Na4P2O7、Na3HP2O7、Na2H2P2O7、NaH3P2O7、(NH4)4P2O7、(NH4)3HP2O7、(NH4)2H2P2O7和(NH4)H3P2O7。然而，本发明的该方面并不限于本文列出的磷酸或焦磷酸的盐。
在一个优选实施方案中，所述磷酸或焦磷酸的无机盐是酸式盐。
在一个更优选的实施方案中，所述磷酸或焦磷酸的无机盐是酸式焦磷酸钠或磷酸二氢钾。在一个更优选的实施方案中，所述磷酸或焦磷酸的无机盐是酸式焦磷酸钠。
在一个优选实施方案中，所述经热处理的食品是基于植物的食品。优选地，此种基于植物的食品来源于植物块茎或根，例如但不限于下组：马铃薯、甘薯、薯蓣、豆薯、欧洲防风、欧芹根、菊芋、胡萝卜、小红萝卜、芜菁和木薯。通过本发明方法产生的优选食品是马铃薯产品。通过本发明方法产生的更优选的食品是炸薯条或炸马铃薯片。通过本发明方法产生的另一种更优选食品是包含马铃薯颗粒或马铃薯小片的食品，如基于马铃薯的零食。
优选地，所述磷酸或焦磷酸的无机盐以稳定化天冬酰胺酶的浓度存在。更优选地，磷酸或焦磷酸的无机盐以在高温例如42℃、45℃、50℃、55℃、60℃、62℃或65℃稳定化天冬酰胺酶的浓度存在。
“稳定化天冬酰胺酶”在本发明的语境中可意指当存在所述磷酸或焦磷酸的无机盐时，与其不存在时相比所述天冬酰胺酶的半衰期延长至少1.5倍，优选至少2倍，更优选至少3倍，且甚至更优选至少5倍。
在本发明的语境中半衰期是在相关条件下温育时酶活性减少50％的时间。其可如本发明实施例中所述来确定。
在一个优选实施方案中，步骤a)中的接触是通过将包含天冬酰胺酶和磷酸或焦磷酸的无机盐的溶液喷洒在所述食品的中间形式上来进行的。
在另一个优选的实施方案中，步骤a)中的接触是通过将所述食品的中间形式在包含天冬酰胺酶和磷酸或焦磷酸的无机盐的溶液中浸渍或温育来进行的。
在另一个优选的实施方案中，步骤b)中的温育是通过将所述食品的中间形式在50℃以上的气温干燥来进行的。
在另一个优选的实施方案中，步骤a)中的接触和步骤b)中的温育是作为一个步骤来进行的，其中将所述食品的中间形式在包含(i)天冬酰胺酶和(ii)磷酸或焦磷酸的无机盐的溶液中温育至少1分钟。
优选地，此种浸渍和/或温育所述食品的中间形式的溶液，或喷洒在所述食品的中间形式之上的溶液，以1,000-50,000ASNU每升、更优选2,000-20,000ASNU每升、甚至更优选3,000-15,000ASNU每升和最优选4,000-10,000ASNU每升的浓度包含天冬酰胺酶。优选地，此种溶液以0.1-250mM、更优选1-100mM、甚至更优选5-50mM的浓度包含磷酸或焦磷酸的无机盐，优选酸式焦磷酸钠或磷酸二氢钾，更优选酸式焦磷酸钠。
优选地，此种浸渍和/或温育所述食品的中间形式的溶液，或喷洒在所述食品的中间形式之上的溶液，具有低于约pH6.5的pH，如低于pH6.5的pH。在一个优选实施方案中，所述溶液具有低于约pH6的pH，如低于pH6的pH。在另一个优选实施方案中，所述溶液具有低于约pH5.8的pH，如低于pH5.8的pH。在另一个优选实施方案中，所述溶液具有低于约pH5.7的pH，如低于pH5.7的pH。在另一个优选实施方案中，所述溶液具有约pH5.5的pH。
在一个优选实施方案中，所述食品是炸薯条或炸马铃薯片。
在另一个优选的实施方案中，步骤a)中的接触是通过将天冬酰胺酶和磷酸或焦磷酸的无机盐掺入所述食品的中间形式来进行的。优选地，所述食品的中间形式中天冬酰胺酶的浓度是100-10,000ASNU每kg干物质，而磷酸焦磷酸的无机盐的浓度为0.05-5％。
优选地，当步骤a)中的接触是通过将天冬酰胺酶和磷酸或焦磷酸的无机盐掺入所述食品的中间形式来进行时，所述食品的中间形式具有低于约pH6.5的pH，如低于pH6.5的pH。在一个优选实施方案中，所述中间食品产物具有低于约pH6的pH，如低于pH6的pH。在另一个优选实施方案中，所述中间食品产物具有低于约pH5.8的pH，如低于pH5.8的pH。在另一个优选实施方案中，所述中间食品产物具有低于约pH5.7的pH，如低于pH5.7的pH。在另一个优选实施方案中，所述溶液具有约pH5.5的pH。
在一个优选实施方案中，所述食品的中间形式包含经烹制的马铃薯泥。
在一些实施方案中，步骤c)中的加热是通过炸制或部分炸制进行的。在其他实施方案中，步骤c)中的加热是通过烘烤进行的。
在高温的稳定化的天冬酰胺酶组合物
在另一个方面，本发明涉及具有至少42℃、优选至少45℃、至少50℃或至少55℃、更优选至少60℃、至少62℃或至少65℃的温度的水性组合物，其包含(i)天冬酰胺酶和(ii)磷酸或焦磷酸的无机盐。
在一个优选的实施方案中，所述磷酸或焦磷酸的无机盐是焦磷酸的无机盐，优选酸式焦磷酸钠。在另一个优选的实施方案中，所述磷酸或焦磷酸的无机盐是磷酸二氢钾或酸式焦磷酸钠。
优选地，所述水性组合物以稳定化天冬酰胺酶的浓度包含磷酸或焦磷酸的无机盐，优选酸式焦磷酸钠或磷酸二氢钾，更优选酸式焦磷酸钠。更优选地，所述磷酸或焦磷酸的无机盐，优选酸式焦磷酸钠或磷酸二氢钾，更优选酸式焦磷酸钠，以在高温例如42℃、45℃、50℃、55℃、60℃、62℃或65℃稳定化天冬酰胺酶的浓度存在。
在一个优选实施方案中，所述水性组合物以1,000-50,000ASNU每升、优选2,000-20,000ASNU每升、更优选3,000-15,000ASNU每升和最优选4,000-10,000ASNU每升的浓度包含天冬酰胺酶。在另一个优选的实施方案中，所述水性组合物以0.1-250mM、优选1-100mM、更优选5-50mM的浓度包含磷酸或焦磷酸的无机盐，优选酸式焦磷酸钠或磷酸二氢钾，更优选酸式焦磷酸钠。
在另一个方面，本发明涉及制备经加热的水性组合物的方法，其包括：
a)将(i)天冬酰胺酶和(ii)磷酸或焦磷酸的无机盐添加至水，和
b)加热至至少42℃、优选至少45℃、至少50℃或至少55℃、更优选至少60℃、至少62℃或至少65℃的温度，
其中步骤a)是在步骤b)之前、过程中或之后进行的。
应理解的是，此种方法的步骤a)中的“添加至水”并不必须意指添加至纯水。“添加至水”包括添加至自来水，其中包含任何自来水中存在的离子等。其还包括添加至任何种类的经纯化或者以其他方法处理的水，例如去离子水等。其还包括添加至任何水溶液，其在步骤a)之后变为包含天冬酰胺酶和磷酸或焦磷酸的无机盐的水溶液。
步骤b)中的加热可在添加天冬酰胺酶和磷酸或焦磷酸的无机盐之前进行，其可在添加天冬酰胺酶和磷酸或焦磷酸的无机盐过程中进行，其可在添加天冬酰胺酶和磷酸或焦磷酸的无机盐之后进行，其可在添加磷酸或焦磷酸的无机盐之后但在添加天冬酰胺酶之前，或者其可在添加天冬酰胺酶之后但在添加磷酸或焦磷酸的无机盐之前进行，尽管最后的选项较不优选，因为酶可在添加磷酸/焦磷酸之前在经加热的水中失活。水的加热并不需要发生在应用所述天冬酰胺酶和所述磷酸或焦磷酸的无机盐的罐中进行。水可在填充入该罐之前经加热。
天冬酰胺酶可在添加磷酸或焦磷酸的无机盐之前，同时或之后添加。优选地，天冬酰胺酶在添加磷酸或焦磷酸的无机盐之后添加。
在一个优选实施方案中，所述磷酸或焦磷酸的无机盐是焦磷酸的无机盐，优选酸式焦磷酸钠。在另一个优选的实施方案中，所述磷酸或焦磷酸的无机盐是磷酸二氢钾或酸式焦磷酸钠。
优选地，所述磷酸或焦磷酸的无机盐是以稳定化所述天冬酰胺酶的浓度添加的。更优选地，所述磷酸或焦磷酸的无机盐是以在高温例如42℃、45℃、50℃、55℃、60℃、62℃或65℃稳定化天冬酰胺酶的浓度添加的。
优选地，天冬酰胺酶是以1,000-50,000ASNU每升、更优选2,000-20,000ASNU每升、甚至更优选3,000-15,000ASNU每升和最优选4,000-10,000ASNU每升的浓度添加的。优选地，所述磷酸或焦磷酸的无机盐是以0.1-250mM、更优选1-100mM和甚至更优选5-50mM的浓度添加的。
其中天冬酰胺酶用例如磷酸二氢钾或酸式焦磷酸钠，或用另一种酸如例如柠檬酸、乳酸、乙酸、抗坏血酸、磷酸二氢钙或酒石酸氢钾稳定化的经加热的天冬酰胺酶组合物，可用于例如食品工业，在该工业中，由于多种原因，在加热食品之前对其的天冬酰胺酶处理应优选地发生于相对较高的温度以适应于现存的生产线。在此类工艺中，所述天冬酰胺酶可为不稳定的，特别是在连续工艺的起动(start-up)期。当将天冬酰胺酶添加至较纯的、任选经加热自来水，其活性可减少，在此情况下本发明人令人意想不到地发现降低pH稳定化酶，并在水溶液中获得较高活性，特别是在具有高温的水溶液中。
当所述连续工艺或多或少是在稳态下，例如在持续将薯条浸渍于热的天冬酰胺酶溶液中的炸薯条的连续工艺中运行时，从薯条泄露的可溶物可促进天冬酰胺酶的稳定化，并因此尽管可能需要随着连续工艺进一步添加例如酶和水以维持稳态水平，在该阶段可允许酸水平降低至与起动期相比的较低水平。
因此，在一个方面，本发明涉及起动连续工业工艺的方法，其包括：
a)制备具有低于约pH6.5的pH的天冬酰胺酶水溶液，和
b)加热至至少42℃、优选至少45℃、至少50℃或至少55℃、更优选至少60℃、至少62℃或至少65℃的温度，
其中步骤a)在步骤b)之前、过程中或之后进行。
在一个优选实施方案中，所述连续工业工艺是用于产生部分炸制的炸薯条的工艺，其中将薯条连续地浸渍或温育于包含天冬酰胺酶的溶液中。
优选地，同样对于该方面，天冬酰胺酶是以1,000-50,000ASNU每升、更优选2,000-20,000ASNU每升、甚至更优选3,000-15,000ASNU每升和最优选4,000-10,000ASNU每升的浓度添加的。
优选地，同样对于该方面，所述具有低于约pH6.5的pH的天冬酰胺酶水溶液包含至少一种选自下组的酸：酸式焦磷酸钠、磷酸二氢钾、柠檬酸、乳酸、乙酸、抗坏血酸、磷酸二氢钙和酒石酸氢钾。此种或此类酸，任选地与其他酸组合，应以充足量存在于该溶液中从而使得该溶液具有低于约pH6.5的pH。优选地，所述溶液具有低于pH6.5的pH。在一个优选实施方案中，所述溶液具有低于约pH6的pH，如低于pH6的pH。在另一个优选实施方案中，所述溶液具有低于约pH5.8的pH，如低于pH5.8的pH。在另一个优选实施方案中，所述溶液具有低于约pH5.7的pH，如低于pH5.7的pH。在另一个优选实施方案中，所述溶液具有约pH5.5的pH。
浓缩的天冬酰胺酶组合物
在一个方面，本发明涉及浓缩的天冬酰胺酶组合物，包括(i)浓度为至少100ASNU每克的天冬酰胺酶和(ii)浓度为至少0.1mM、优选至少1mM、更优选至少5mM的磷酸或焦磷酸的无机盐。
天冬酰胺酶的稳定化可在其产生阶段已具有优势，即可将磷酸或焦磷酸的无机盐，优选磷酸或焦磷酸的酸式无机盐如酸式焦磷酸钠或磷酸二氢钾，在表达天冬酰胺酶的微生物的发酵过程中添加。或其可在发酵至包含天冬酰胺酶的发酵液之后添加。
任选地，所述天冬酰胺酶可经纯化。在此情况下，在其经纯化之前或之后，可将稳定化化合物如酸例如酸式焦磷酸钠或磷酸二氢钾添加至所述天冬酰胺酶。
如本文中使用的术语“经纯化的”涵盖天冬酰胺酶制备物，其中该制备物富集了天冬酰胺酶。此种富集可例如为：去除产生该天冬酰胺酶的生物的细胞，通过蛋白质特异性沉淀去除非蛋白物质，或使用色谱方法其中选择性吸附天冬酰胺酶并将其从色谱基质上洗脱。所述天冬酰胺酶可经纯化至使得仅存在少数量的其他蛋白的程度。表述“其他蛋白”具体涉及其他酶。
因此，在一个方面，本发明涉及水性组合物，包括(i)浓度为至少100ASNU每克的天冬酰胺酶和(ii)浓度为至少0.1mM、优选至少1mM、更优选至少5mM的磷酸或焦磷酸的无机盐，优选磷酸或焦磷酸的酸式无机盐，如酸式焦磷酸钠或磷酸二氢钾。
此种根据本发明例如用酸式焦磷酸钠或磷酸二氢钾稳定化的天冬酰胺酶的水性组合物包含浓度为至少100ASNU每克、优选至少1000或至少2000ASNU每克、更优选至少3000ASNU每克、如约3500ASNU每克的天冬酰胺酶。
在一个优选实施方案中，此种包含天冬酰胺酶和磷酸或焦磷酸的无机盐的水性组合物配制为进一步稳定化所述天冬酰胺酶。在另一个优选的实施方案中，此种包含天冬酰胺酶和磷酸或焦磷酸的无机盐的水性组合物包含甘油，优选浓度为40-60％。
此种包含天冬酰胺酶和磷酸或焦磷酸的无机盐的水性组合物可作为液体组合物储藏直至该天冬酰胺酶应用于工业，例如用于食品如经热处理的食品的的工业生产。
或者，包含稳定化化合物如酸例如酸式焦磷酸钠或磷酸二氢钾的水性天冬酰胺酶组合物可配制为酶颗粒，例如通过喷雾干燥进行。
因此在一个方面，本发明涉及酶颗粒，包含(i)浓度为至少100ASNU每克的天冬酰胺酶和(ii)浓度为至少0.1mM、优选至少1mM、更优选至少5mM的磷酸或焦磷酸的无机盐如酸式焦磷酸钠或磷酸二氢钾。如本文中使用的术语“酶颗粒”是天冬酰胺酶的颗粒状配制物。该酶颗粒还可包含其他酶。
在另一个方面，本发明涉及包含浓度为至少100ASNU每克的天冬酰胺酶并具有低于约pH6的pH的酶颗粒物。
在本发明的语境中，酶颗粒的pH意指此种酶颗粒在去离子水中的水溶液或浆料的pH。
此种酶颗粒可包含至少一种选自下组的酸：酸式焦磷酸钠、磷酸二氢钾、柠檬酸、乳酸、乙酸、抗坏血酸、磷酸二氢钙和酒石酸氢钾。
本发明的酶颗粒包含浓度为至少100ASNU每克、优选至少1000或至少2000ASNU每克、更优选至少3000ASNU每克，如约3500ASNU每克的天冬酰胺酶。
在一个方面，本发明涉及产生包含天冬酰胺酶的酶颗粒的方法，该方法包括：
a)将磷酸或焦磷酸的无机盐如酸式焦磷酸钠或磷酸二氢钾添加至包含天冬酰胺酶的水溶液，和
b)将所述水溶液配制为酶颗粒。
优选地，将磷酸或焦磷酸的无机盐以至少0.1mM、更优选至少1mM和甚至更优选至少5mM的浓度添加。
在一个方面，本发明涉及产生包含天冬酰胺酶的酶颗粒的方法，该方法包括：
a)制备包含天冬酰胺酶和具有低于约pH6的pH的水溶液，和
b)将所述水溶液配制为酶颗粒。
优选地，所述水溶液具有低于pH6的pH。在一个优选实施方案中，所述溶液具有低于约pH5.8的pH，如低于pH5.8的pH。在另一个优选实施方案中，所述溶液具有低于约pH5.7的pH，如低于pH5.7的pH。在另一个优选实施方案中，所述溶液具有约pH5.5的pH。
优选地，在步骤a)之后，允许天冬酰胺酶在酸性溶液中“陈化(age)”例如0.5至10小时，然后将溶液配制为酶颗粒。不愿拘于任何理论，该酶可能在多聚体形式，例如作为二聚体或四聚体更具活性，而此种陈化可允许装配多聚体，因此使得酶颗粒更具活性并更加稳定。
常常在粒化之前将氯化钠NaCl添加至经纯化的酶液体。然而，NaCl可摧毁天冬酰胺酶的活性。因此，本发明制备经稳定化的天冬酰胺酶颗粒的方法可与天冬酰胺酶颗粒还包含NaCl的情况特别相关。
天冬酰胺酶储液
本发明的天冬酰胺酶的稳定化可在将浓缩的天冬酰胺酶配制组合物应用于工业工艺(例如以供产生经热处理的食品)的阶段中具有优势。在此阶段，在许多情况下工业食品加工者希望制备该酶具有合适浓度的储液以供应用于其生产线。然而，此种天冬酰胺酶的储液在储藏时可丧失其活性，特别是在升高的温度，如在室温或更高。
本发明人令人意想不到地发现降低pH稳定化此种储液中的天冬酰胺酶。
举例而言，在基于生面团的面包/饼干(biscuit)或零食的生产中，通常将天冬酰胺酶与液体一同添加并混合至干成分中，或在混合生面团之前直接添加至干成分。然而，为了便于正确的配量(dosing)，与经配制、浓缩的酶产品相比具有较低活性的酶储液可为最佳的。为了确保该中间储液在潜在地温热的工业设施中的加工过程中的酶稳定性，可根据本发明添加酸。
因此，在一个方面，本发明涉及包含浓度为100-2,000ASNU每克的天冬酰胺酶并具有低于约pH6.5的pH的水性储液。
优选地，所述水性储液具有低于pH6.5的pH。在一个优选实施方案中，所述溶液具有低于约pH6的pH，如低于pH6的pH。在另一个优选实施方案中，所述溶液具有低于约pH5.8的pH，如低于pH5.8的pH。在另一个优选实施方案中，所述溶液具有低于约pH5.7的pH，如低于pH5.7的pH。在另一个优选实施方案中，所述溶液具有约pH5.5的pH。
在另一个方面，本发明涉及将浓缩的天冬酰胺酶组合物稀释或溶解以供施用于工业工艺的方法，其包括：
a)将包含浓度为至少2,000ASNU每克的天冬酰胺酶的浓缩组合物稀释或溶解为包含与浓缩的组合物相比每克具有少于一半的天冬酰胺酶活性，并具有低于约pH6.5的pH的储液，和
b)将该储液应用于工业工艺。
所述包含天冬酰胺酶的浓缩组合物可为水性组合物，在此情况下将其稀释为储液，或其可为酶颗粒，在此情况下将其溶解为储液。
优选地，也在本发明的该方面，水性储液具有低于pH6.5的pH。在一个优选实施方案中，所述溶液具有低于约pH6的pH，如低于pH6的pH。在另一个优选实施方案中，所述溶液具有低于约pH5.8的pH，如低于pH5.8的pH。在另一个优选实施方案中，所述溶液具有低于约pH5.7的pH，如低于pH5.7的pH。在另一个优选实施方案中，所述溶液具有约pH5.5的pH。
在一个优选实施方案中，当应用于工业工艺时，将储液稀释至至少2倍(w/w)。在一个更优选的方面，当应用于工业工艺时，将储液稀释至至少5倍(w/w)，更优选至至少10倍(w/w)。
优选地，在应用于工业工艺之前，将至少部分储液储藏至少6小时。
优选地，在步骤a)中将包含天冬酰胺酶的浓缩组合物稀释或溶解为包含与浓缩组合物相比每克少于20％，更优选少于10％天冬酰胺酶活性的储液。
在又一个方面，本发明涉及将浓缩的天冬酰胺酶组合物稀释或溶解以供将其施用于生面团的方法，其包括：
a)将包含浓度为至少2,000ASNU每克的天冬酰胺酶的浓缩组合物稀释或溶解为包含与浓缩的组合物相比每克具有少于一半的天冬酰胺酶活性，并具有低于约pH 6.5的pH的储液，和
b)将该储液施用于生面团。
优选地，会对所述生面团进行热处理，如通过烘烤或通过炸制。
优选地，也在本发明的该方面，水性储液具有低于pH6.5的pH。在一个优选实施方案中，所述溶液具有低于约pH6的pH，如低于pH6的pH。在另一个优选实施方案中，所述溶液具有低于约pH5.8的pH，如低于pH5.8的pH。在另一个优选实施方案中，所述溶液具有低于约pH5.7的pH，如低于pH5.7的pH。在另一个优选实施方案中，所述溶液具有约pH5.5的pH。
在一个优选实施方案中，当施用于生面团时，将储液稀释至少2倍(w/w)。在一个更优选的方面，当施用于生面团时，将储液稀释至少5倍(w/w)，更优选至少10倍(w/w)。
优选地，在施用于生面团之前，将至少部分储液储藏至少6小时。
优选地，在步骤a)中将包含天冬酰胺酶的浓缩组合物稀释或溶解为包含与浓缩组合物相比每克少于20％，更优选少于10％天冬酰胺酶活性的储液。
在另一个方面，本发明涉及天冬酰胺酶的水性储液，包含(i)浓度为至少100ASNU每克的天冬酰胺酶和(ii)浓度为至少0.1mM的磷酸或焦磷酸的无机盐，优选为酸式焦磷酸钠或磷酸二氢钾。在一个优选的方面，此种储液包含浓度为100-2,000ASNU每克的天冬酰胺酶。在另一个优选的方面，此种储液包含浓度为至少1mM，优选至少5mM的磷酸或焦磷酸的无机盐。
在另一个方面，本发明涉及将浓缩的天冬酰胺酶组合物稀释或溶解以供施用于工业工艺的方法，其包括：
a)将包含浓度为至少2,000ASNU每克的天冬酰胺酶的浓缩组合物稀释或溶解为包含与浓缩的组合物相比每克具有少于一半的天冬酰胺酶活性，并进一步包含至少0.1mM、优选至少1mM、更优选至少5mM的磷酸或焦磷酸的无机盐的储液，和
b)将该储液应用于工业工艺。
在又一个方面，本发明涉及将浓缩的天冬酰胺酶组合物稀释或溶解以供施用于生面团的方法，其包括：
a)将包含浓度为至少2,000ASNU每克的天冬酰胺酶的浓缩组合物稀释或溶解为包含与浓缩的组合物相比每克具有少于一半的天冬酰胺酶活性，并进一步包含至少0.1mM、优选至少1mM、更优选至少5mM的磷酸或焦磷酸的无机盐的储液，和
b)将该储液施用于生面团。
实施例
方法和材料(实施例1-8)
在不同品质的水，在含有SAPP、KH2PO4和葡萄糖的溶液中的酶稳定性
ASNU微滴定测定法(如用于实施例1-8)
酶活性是在缓冲液测定中在37℃，pH 7.0使用天冬酰胺作为底物确定的。1ASNU定义为在上述条件下每分钟从天冬酰胺水解释放一微摩尔铵的酶量。
产生的铵与α-酮戊二酸化合形成谷氨酸，由此将NADH氧化为NAD+。在340nm随时间测量NADH的消耗。相对于已知标样确定活性。
试剂：
MOPS缓冲液：
0.1M MOPS，pH7.00，0.01％Triton X-100
在添加Triton X-100之前使用4M NaOH将pH调整至7.00+/-0.05
试剂A：
MOPS缓冲液中10mg/ml L-天冬酰胺
0.44mg/ml NADH
2.52mg/ml α-酮戊二酸
2.24mg/ml GlDH(＞65单位/ml)
称取L-天冬酰胺，并溶解于MOPS缓冲液。
称取NADH、α-酮戊二酸和GIDH并溶解于MOPS缓冲液。
将两个溶液混合，并使用MOPS缓冲液补满体积。
标样：
0.5-1.0-1.5-1.9-2.5-3.0-3.4ASNU/ml。
样品：
将未知样品在MOPS缓冲液中稀释至大约1-3ASNU/g。
步骤：
使用96孔微滴定板
调整ELISA读数器中的温度使得孔中的液体温度为37℃。
将240μL试剂A添加至每个孔，并将板预热10分钟。
添加10μL样品或标样。
在静置30秒之后，振荡板30秒，并在340nm起始测量。
每10秒记录测量值至6分钟的总时间。(读数在酶添加之后1分钟起始)。盲样(blind sample)使用10μL MOPS缓冲液代替样品运行。
对每个标样和样品描绘吸光度(OD340)对时间的曲线，并基于来自t＝4分钟至t＝6分钟读数的数据计算斜率(衰减)。斜率代表NADH的减少，其与天冬酰胺酶作用产生的NH4 +成正比。
获得了基于计算的斜率的标准曲线，显示斜率对以ASNU/ml表示的酶活性。未知样品中的活性由计算的斜率通过与标准曲线相比较来确定。
热稳定性测定法(如用于实施例1-8)
步骤：
除非另行指明，酶是在相关溶液中以10ASNU/g的剂量，以及25、55和60℃的温度进行温育的。将25℃样品用作对照确保酶活性在测试化合物的存在下并未显著改变。
样品在紧接着酶添加并混合(30秒)之后以及随后30、60、90、120和150分钟之后取出，并置于冰上直至活性分析。
在不同条件下在溶液中测量的酶活性(ASNU/ml)如下述所示。酶稳定性表示为使用计算的最佳拟合指数衰减曲线即E＝E0*exp(-ln(2)/T1/2*t)估计的半衰期，其中E0＝时点0的酶活性，T1/2＝半衰期，等于活性为起始的50％的时间，而t＝时间。
实施例1
去离子水中的稳定性
在去离子水中酶稳定性在55℃非常良好，显示535分钟的估计半衰期。在60℃，稳定性较低，半衰期为70分钟。
实施例2
自来水中的稳定性
在自来水中，酶稳定性非常不良。实际上在55和60℃完全未检测到活性，甚至对于仅0.5分钟之后取出的样品亦如此。在25℃活性显示随时间略微下降。
实施例3
自来水中的稳定性(25℃、40℃和50℃)
在较低温度，自来水中的酶稳定性略微改进。在40℃，可检测出一些酶活性直至60分钟，且估计的半衰期为大约20分钟，而在50℃几乎未检出任何活性。在25℃活性显示随时间略微下降。
实施例4
含22.5mM SAPP(0.5％)的去离子水中的稳定性
将22.5mM酸式焦磷酸钠(SAPP)添加至去离子水显著增加了60℃的酶稳定性。半衰期估计为375分钟，相比较在去离子水中观察为70分钟。在55℃，半衰期亦增加至大约1800分钟。
实施例5
含4.5mM SAPP(0.1％)的去离子水中的稳定性
当使用的SAPP量减少至4.5mM时也观察到稳定性的增加。60℃的半衰期为大约285分钟，而在55℃大约为1520分钟。
实施例6
含22.5mM SAPP(0.5％)的自来水中的稳定性
SAPP的添加也显著地增加了自来水中的酶稳定性。在60℃的半衰期升高至297分钟，相比较在不含SAPP的自来水中无法检测出活性。在55℃，半衰期增加至1735分钟，同样，相比较在自来水中无法检测。
实施例7
含50mM KH2PO4，pH＝5的去离子水中的稳定性
同样磷酸盐(50mM)在60℃显著地稳定化酶。
实施例8
在含1％葡萄糖的去离子水中的稳定性
添加1％葡萄糖形式的其他干物质并不影响去离子水中的酶稳定性。估计的半衰期在55℃为1015分钟，而在60℃为60分钟。
方法和材料(实施例9-11)
在不同pH含有SAPP或柠檬酸的溶液中的酶稳定性
ASNU测定法(如用于实施例9-11)
酶活性是在缓冲液测定法中在37℃，pH7.0使用天冬酰胺作为底物来确定的。1ASNU定义为在上述条件下每分钟从天冬酰胺水解释放一微摩尔铵的酶量。产生的铵使用Nesslers试剂定量。吸光度在436nm测量。相对于已知标样确定活性。
试剂
Tris缓冲液
35mM Tris，pH7.00，0.01％Triton X-100
天冬酰胺
Tris缓冲液中的25mg/ml L-天冬酰胺
TCA
1.5M三氯乙酸
标样
0-2-4-8-10ASNU/ml。
步骤
活性测定法
将3.75ml缓冲液和0.5ml天冬酰胺溶液在玻璃试管中混合，并在水浴中在37℃预热5-10分钟。添加0.5ml标样或样品并在37℃温育10分钟。添加0.25ml TCA以终止反应。
氨测定
取出0.05ml上述溶液，添加0.85ml MQ水，0.1ml Nesslers试剂并混合。在10分钟之后在分光光度计中在436nm读取吸光度。
制成显示吸光度对标样中酶浓度的标准曲线，并由其计算未知样品中的活性。
热稳定性测定法(如用于实施例9-11)
步骤
除非另行指明，将酶在相关溶液中以10ASNU/ml的浓度和25和60℃的温度温育。将25℃样品用作对照确保酶活性在测试化合物的存在下并未显著改变。
为了起始筛选酶稳定性，将样品在酶添加之后5分钟取出，并置于冰上直至活性分析。对于酶半衰期(T1/2)的确定，将样品在5、40、80和120分钟之后取出。
在不同条件下在溶液中测量的酶活性如下述所示。酶稳定性表示为使用计算的最佳拟合指数衰减曲线即E＝E0*exp(-ln(2)/T1/2*t)估计的半衰期，其中E0＝时点0的酶活性，T1/2＝半衰期，等于活性为起始的50％的时间，而t＝时间。
实施例9
在不同pH在去离子水中的0.5％SAPP中维持5分钟之后的活性
  pH   25℃   60℃
  5   9.8   9.0
  6   9.6   7.0
  7   9.4   0.7
  8   8.8   0.7
在60℃在去离子水中的0.5％SAPP中的酶稳定性清楚地取决于pH。在25℃，酶活性在pH＞7维持5分钟之后略微下降，而在60℃在pH＞6维持5分钟之后几乎所有活性丧失。
实施例10
在去离子水中的0.5％SAPP，pH5中的稳定性
当维持在最高60℃的温度和pH5时，酶稳定超过120分钟。估计的半衰期为8小时。在65℃，活性迅速下降，在40分钟之后显示完全无活性。
实施例11
在去离子水中的20mM柠檬酸，pH5中的稳定性
在柠檬酸，pH5的存在下，酶在65℃也是稳定的，具有大约3小时的估计半衰期。

Claims (9)

1.一种产生经热处理的基于植物的食品的方法，包括：
a)在至少42℃的温度将所述食品的中间形式与天冬酰胺酶在低于pH6的pH相接触，
b)将所述食品的中间形式温育至少1分钟，和
c)加工所述食品的中间形式以获得经热处理的食品，其中所述加工包括加热，
其中步骤a)中的接触是：通过将包含天冬酰胺酶并具有低于pH6的pH的溶液喷洒至所述食品的中间形式之上来进行的，或者是通过将所述食品的中间形式在包含天冬酰胺酶并具有低于pH6的pH的溶液中浸渍或温育来进行的，
其中，所述溶液包含柠檬酸。
2.权利要求1的方法，其中所述食品是马铃薯产品。
3.权利要求1或者2的方法，其中步骤b)中的温育是通过将所述产品的中间形式在50℃以上的气温干燥来进行的。
4.权利要求1的方法，其中步骤a)中的接触是通过将所述食品的中间形式在所述溶液中浸渍或温育来进行的，步骤a)中的接触和步骤b)中的温育作为一个步骤进行，其中将所述食品的中间形式在所述溶液中温育至少1分钟。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述溶液包含浓度为1,000-50,000ASNU每升的天冬酰胺酶。
6.权利要求1-4任一项的方法，其中所述食品是炸薯条和炸马铃薯片。
7.权利要求1-4任一项的方法，其中所述食品的中间形式包括经烹制的马铃薯泥。
8.权利要求1-4任一项的方法，其中步骤c)中的加热是通过炸制或部分炸制进行的。
9.权利要求1-4任一项的方法，其中步骤c)中的加热是通过烘烤进行的。
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