CN104146270A - 一种极端耐热l-天冬酰胺酶的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种极端耐热L-天冬酰胺酶的应用，属于热加工食品安全及酶工程技术领域。使用极端耐热L-天冬酰胺酶与传统热烫相结合的方式预处理薯条以降低薯条中丙烯酰胺的含量，具体为将薯条经热烫处理，在热烫处理液中加入极端耐热L-天冬酰胺酶，浓度为1000-20000U/L，热烫温度为80℃，热烫处理时间为1-15min。本发明将传统热烫和用极端耐热L-天冬酰胺酶处理薯条相结合，在较短的时间内达到很好的丙烯酰胺的抑制效果，随着极端耐热L-天冬酰胺酶酶处理时间的延长，丙烯酰胺的含量缓慢减低，与不用极端耐热L-天冬酰胺酶处理相比，丙烯酰胺含量可降低70%-83%。

Description

一种极端耐热L-天冬酰胺酶的应用

技术领域

本发明涉及一种极端耐热L-天冬酰胺酶的应用，具体涉及一种用基因工程菌株来生产所需要的酶，并应用于热加工食品中作为丙烯酰胺的抑制剂，属于热加工食品安全及酶工程技术领域。

背景技术

2002年，人们在富含淀粉类的油炸焙烤食品中检测到相对较高含量的丙烯酰胺。在烘烤或煎炸含淀粉食物的时候，这类食物中天然存在的氨基酸L-天冬酰胺会与还原糖发生美拉德反应，而该反应使得淀粉类食物变脆且呈现出独特的色泽、气味。然而，反应同时还会产生对人类来说是一种“潜在致癌物”的丙烯酰胺(Nature, 2002, 419(6906): 448-449; Nature, 2002, 419(6906): 449-450)。因此食品中出现的这种物质引起了人们关于通过膳食摄入丙烯酰胺这种潜在危害健康的物质的激烈讨论。至今已建立了许多国际研究机构来调查和评估食品中丙烯酰胺的危害。根据已有的研究结果，WHO/FAO 食品添加剂联合专家委员会(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, JECFA)建议食品生产商采取适当的方式来降低食品中丙烯酰胺的含量。

人们对减少食品中丙烯酰胺的含量做了大量的研究，主要可以从以下几个方面入手来减少丙烯酰胺的含量(J Sci Food Agric, 2014, 94(1): 9-20; J Agric Food Chem, 2008, 56(15): 6154-6161;  J Agric Food Chem, 2013, 61 (43), 10209-10214)。首先从食品加工的原料控制丙烯酰胺的形成，通过筛选含有丙烯酰胺形成的主要前体物质L-天冬酰胺和还原糖含量少的原料，可降低或消除产品中丙烯酰胺的含量。第二个方面是从食品加工工艺控制丙烯酰胺的形成，加工温度和时间是影响丙烯酰胺形成的两个重要因素。当加热到120℃以上时往往容易产生丙烯酰胺，而且随着加工温度的升高，丙烯酰胺产生量增加，温度在140-180℃时丙烯酰胺的生成量最大。在加工过程中使用柠檬酸、富马酸、苹果酸、琥珀酸、山梨酸、己二酸、安息香酸等以降低马铃薯的pH值，可减少丙烯酰胺的含量。在食品原料中加入化学抑制剂也可以显著降低食品中的丙烯酰胺的生成。以上方法最主要的缺点就是对食品的产品特性影响较大，如组织结构，口味风味，色泽外观等。L-天冬酰胺是合成丙烯酰胺最重要的前体物质之一，降低原料中的L-天冬酰胺对抑制丙烯酰胺具有非常重要的意义。

目前，有少数学者和研究机构开展了利用L-天冬酰胺酶来控制高温热加工食品中丙烯酰胺形成的研究。Amrein等 (J Agric Food Chem, 2004,52(13): 4282-4288) 研究了L-天冬酰胺酶对姜汁面包中丙烯酰胺形成的影响，结果表明，在面团中添加L-天冬酰胺酶可使丙烯酰胺的含量减少55%，L-天冬酰胺酸降解了75%，该方法对姜汁面包的口味和色泽没有不利影响。Ciesarovà 等 (Mol Nutr Food Res,  2009, 53(12): 1532–1539) 研究了L-天冬酰胺酶对以马铃薯为主要原料的高热加工食品中丙烯酰胺含量的影响，发现在马铃薯干粉中加入L-天冬酰胺酶，可使丙烯酰胺的含量减少约90%-97%。Pedreschi等 (LWT-Food Sci Technol, 2011, 44(6): 1473-1476) 采用热烫和L-天冬酰胺酶浸泡的方式处理马铃薯条，发现油炸后的马铃薯条中丙烯酰胺含量比对照样降低了60%。Kumar等 (Food Bioprocess Technol, 2014, 7:741–748) 用来源于Cladosporiumsp. L-天冬酰胺酶处理小麦基质面团，酶添加量在300 U时，面包芯和面包皮中丙烯酰胺的减少量分别达到73%，97%。在国内于2009年已批准诺维信公司的L-天冬酰胺酶(Acrylaway) 在中国市场使用，通过在面团搅拌时添加Acrylaway，使天冬酰胺转化为天冬氨酸，从根源上抑制丙烯酰胺的形成，而其它的氨基酸和糖则保持原有的活性，仍然参与美拉德反应。试验表明，增加Acrylaway的用量和延长作用时间，能使低糖饼干中丙烯酰胺的含量明显减少。当酶用量为300mg/kg，作用时间为15 分钟时，丙烯酰胺含量减少85%；延长作用时间为30分钟时，低糖饼干中丙烯酰胺含量减少高达93%。而Acrylaway的使用不会影响面团特性、烘焙过程及成品的外观和口感。通过采用顶空气相色谱法对产品挥发性香气成分进行分析，对照样和添加Acrylaway的样本所含香气成分的浓度相同，表明该酶对产品的风味没有改变。

采用生物技术法去除原料中的L-天冬酰胺是目前用于控制高热加工食品中丙烯酰胺含量最有效的方法之一。L-天冬酰胺在L-天冬酰胺酶的作用下可生成L-天冬氨酸和氨，而L-天冬氨酸在美拉德反应中仅生成极微量的丙烯酰胺，因此可以达到抑制丙烯酰胺生成的目的。生物酶法可以从根源上抑制丙烯酰胺的生成，而且操作简单易行，丙烯酰胺降低幅度大，对生产工艺，产品外观，风味口味以及营养等方面没有改变。因此生物酶法是一种值得推广的用于控制食品中丙烯酰胺含量的有效方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种极端耐热L-天冬酰胺酶的应用，抑制薯条中丙烯酰胺的形成。

本发明的技术方案，一种极端耐热L-天冬酰胺酶的应用，作为油炸薯条中丙烯酰胺的抑制剂。使用极端耐热L-天冬酰胺酶与传统热烫相结合的方式预处理薯条以降低薯条中丙烯酰胺的含量。

将薯条经热烫处理，在热烫处理液中加入极端耐热L-天冬酰胺酶，浓度为1000-20000U/L，热烫温度为80℃，热烫处理时间为1-15min。

极端耐热L-天冬酰胺酶的最适温度在80℃以上，可以把传统热烫和用极端耐热L-天冬酰胺酶处理薯条相结合的方法，在较短的时间内达到很好的丙烯酰胺的抑制效果。用三种不同的处理方式对薯条进行预处理，研究其丙烯酰胺含量的变化。当热烫温度为80℃，对薯条进行不同时间的热烫处理，可以发现随着热烫时间的增加丙烯酰胺的含量缓慢降低，与不热烫相比，热烫1-10min，丙烯酰胺含量可以降低17%-39 %。在用极端耐热L-天冬酰胺酶处理的同时进行热烫处理，当热烫温度为80℃处理1 min时，对薯条用不同浓度的极端耐热L-天冬酰胺酶处理发现，随着热烫液中极端耐热L-天冬酰胺酶酶浓度从1000U/L增大到20000U/L时，丙烯酰胺含量迅速降低，与不用极端耐热L-天冬酰胺酶酶处理相比，丙烯酰胺含量可降低28%-73%。在用极端耐热L-天冬酰胺酶处理的同时进行热烫处理，当热烫温度为80℃，极端耐热L-天冬酰胺酶酶浓度为10000 U/L时，随着极端耐热L-天冬酰胺酶酶处理时间的延长丙烯酰胺的含量缓慢减低，与不用极端耐热L-天冬酰胺酶处理相比，丙烯酰胺含量可降低70%-83 %。

本发明的有益效果：本发明将传统热烫和用极端耐热L-天冬酰胺酶处理薯条相结合，在较短的时间内达到很好的丙烯酰胺的抑制效果，随着极端耐热L-天冬酰胺酶酶处理时间的延长，丙烯酰胺的含量缓慢减低，与不用极端耐热L-天冬酰胺酶处理相比，丙烯酰胺含量可降低70%-83%。

附图说明

图1温度和pH对极端耐热L-天冬酰胺酶酶活的影响示意图。

图2温度对极端耐热L-天冬酰胺酶热稳定性的影响示意图。

图3不同的热烫时间对薯条中丙烯酰胺含量的影响示意图。

图4不同极端耐热L-天冬酰胺酶酶浓度处理薯条对其丙烯酰胺含量的影响示意图。

图5极端耐热L-天冬酰胺酶处理不同时间对薯条中丙烯酰胺含量的影响示意图。

具体实施方式

实施例1 极端耐热L-天冬酰胺酶基因的克隆及异源表达

Thermococcus zilligii AN1 TziAN_1中编码极端耐热L-天冬酰胺酶的核苷酸序列已经被解析并且公布在GenBank上，其登录号为WP_010478656.1。首先合成编码极端耐热L-天冬酰胺酶的目的基因，将此目的基因克隆到表达载体pET-22b(+)上，并且在载体DNA序列的C末端融合6个组氨酸标签构成重组质粒。将此重组质粒转化到 Escherichia coli BL21(DE3)表达宿主中进行表达。含有重组质粒的E. coli在含有50μg/mL的氨苄青霉素的LB培养基中发酵培养（摇床转速200 rpm，温度37℃），待菌密度OD₆₀₀达到0.6时加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）在28℃时诱导目的蛋白表达，继续发酵培养6小时离心收菌。

实施例2 极端耐热L-天冬酰胺酶的表达纯化及性质鉴定

收获后的菌体加入悬浮液(50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.5)悬浮，用超声细胞破碎仪破碎，破碎后10000 rpm，4℃离心30 min取上清液用镍亲和层析纯化。先用Binding buffer (50 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 7.5)平衡柱子，上样后用Wash buffer (50 mM Tris, 500 mM NaCl, 50 mM 咪唑, pH 7.5) 洗脱杂蛋白，之后用Elution buffer (50 mM Tris, 500 mM NaCl, 500 mM 咪唑, pH 7.5)洗脱目的蛋白。洗脱下的目的蛋白用透析液(50 mM Tris, pH 7.5)透析过夜，即得极端耐热L-天冬酰胺酶。

对纯化后的重组极端耐热L-天冬酰胺酶进行酶活测定。酶活测定条件如下，在400μL反应体系中含有50 mM Tris (pH 8.5)，20 mM L-天冬酰胺，10 μL 酶液。在90℃进行酶反应，反应2.5 min后加入100 μL 1.5 M三氯乙酸(TCA)终止酶反应。反应完成后10000 rpm 离心5 min。取100 μL反应液，加入1.4 mL去离子水，再加入200 μL Nessler试剂震荡，室温下静置10 min后在450 nm处测量吸光度值。1个酶活单位定义为在标准条件下每分钟释放1 μmol的氨所需要的加酶量。

极端耐热L-天冬酰胺酶的酶学性质：

将酶液分别在40、50、60、70、80、85、90、95℃，pH 8.5的条件下进行酶反应，测定酶活，以最高酶活为100%，得到不同温度下的相对酶活，确定了极端耐热L-天冬酰胺酶的最适温度为90℃ (图1(A))。将酶液分别用不同pH的缓冲液调节至pH 4.0-10.0，在90℃下进行酶反应，测定酶活，以最适pH下的最高酶活为100%，确定极端耐热L-天冬酰胺酶的最适pH为8.5(图1 (B))。将酶液分别在70、80、85、90、95℃下保温2 h，每间隔半小时取样一次，在最适条件下测定残余酶活，不温浴的为空白对照酶活力为100%。在70、80、85℃条件下保温2h，残余酶活均在70 %以上，在90、95℃条件下保温2h，残余酶活也在20%(图2)。

实施例3 极端耐热L-天冬酰胺酶酶法控制薯条中丙烯酰胺

较大个马铃薯(荷兰7号，水分含量：74g/100g)购买于当地大型超市。把马铃薯清洗，去皮，切成8×8mm的长条，立即将此长条浸没在去离子水中1min以除去粘附在薯条表面的淀粉。之后对薯条进行三种不同的处理方式。

（1）不同的热烫时间对薯条中丙烯酰胺含量的影响：将薯条浸没在80℃去离子水中，分别热烫1, 2, 4, 10 min。

（2）不同的极端耐热L-天冬酰胺酶酶浓度对薯条中丙烯酰胺含量的影响：将薯条浸没在80℃极端耐热L-天冬酰胺酶酶液中热烫1 min，酶浓度分别为1000, 2000, 5000, 10000, 20000 U/L。

（3）极端耐热L-天冬酰胺酶酶浓度一定时，研究了极端耐热L-天冬酰胺酶酶处理时间对薯条中丙烯酰胺的影响。固定极端耐热L-天冬酰胺酶酶浓度为10000 U/L，酶处理时间分别为1, 2, 4, 8, 15 min。

所有处理过的样品在85℃下干燥10min以控制水分含量，然后在175℃电炸锅中油炸5min左右，出锅后沥去表面多余油脂，冷却到室温，然后提取丙烯酰胺进行分析。随着热烫时间的延长薯条中丙烯酰胺的含量缓慢下降(图 3)。当热烫温度为80℃，热烫10 min时，与不热烫相比可以把丙烯酰胺的含量从1592 μg/kg降低到967 μg/kg。随着极端耐热L-天冬酰胺酶酶浓度的增加，薯条中丙烯酰胺的含量降低的较快(图 4)。当热烫温度为80℃，极端耐热L-天冬酰胺酶酶浓度为 20000 U/L，处理时间为1 min时，可以把丙烯酰胺的含量从1323 μg/kg降低到353 μg/kg。随着极端耐热L-天冬酰胺酶酶处理时间的延长，薯条中的丙烯酰胺含量减小趋势很慢(图 5)。当热烫温度为80℃，极端耐热L-天冬酰胺酶酶浓度为 10000 U/L，处理时间从1 min增加到15 min时，丙烯酰胺的含量从396 μg/kg降低到232 μg/kg。

Claims (3)

1.一种极端耐热L-天冬酰胺酶的应用，其特征在于：作为油炸薯条中丙烯酰胺的抑制剂。

2.根据权利要求1所述极端耐热L-天冬酰胺酶的应用，其特征在于：使用极端耐热L-天冬酰胺酶与传统热烫相结合的方式预处理薯条以降低薯条中丙烯酰胺的含量。

3.根据权利要求2所述极端耐热L-天冬酰胺酶的应用，其特征在于步骤为：将薯条经热烫处理，在热烫处理液中加入极端耐热L-天冬酰胺酶，浓度为1000 -20000U/L，热烫温度为80℃，热烫处理时间为1-15min。