EA014853B1 - Амидаза из aspergillus niger и применение амидазы для получения пищевого продукта с пониженным содержанием акриламида - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и пищевой промышленности и обеспечивает способ получения пищевого продукта или продукта питания с пониженным содержанием акриламида, включающий стадию тепловой обработки с последующим добавлением фермента - амидазы к промежуточной форме пищевого продукта или продукта питания. Изобретение также относится к пищевым продуктам или продуктам питания с пониженным содержанием акриламида, полученным способом по изобретению. Изобретение также относится к изолированным амидазам из Aspergillus niger и рекомбинантным амидазам, кодирующим их полинуклеотидам, векторам и рекомбинантным клеткам-хозяевам. Применение амидазы позволяет снизить уровень акриламида в пищевом продукте или продукте питания.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам получения пищевого продукта, корма для домашних животных или кормового продукта, включающим по меньшей мере одну стадию тепловой обработки, и к пищевому продукту, корму для домашних животных или кормовым продуктам, полученным такими способами. Кроме того, настоящее изобретение относится к новым ферментам, подходящим для способа по изобретению.

Сведения о предшествующем уровне техники

Акриламид получают коммерчески в течение ряда лет. Поэтому его токсикологический статус вполне установлен. Акриламид используют, главным образом, для получения полиакриламида и последнее соединение используют для различных применений, таких как получение питьевой воды, закрепление почвы, обработка промышленных сточных вод, добыча нефти и лабораторные применения.

Акриламид считается возможным канцерогеном для животных и людей. В 1991 г. в 8с1еп!Шс СоттШее οη Рооб проведены исследования мономерного акриламида в контакте с пищевыми материалами и сделан вывод, что акриламид является генотоксичным канцерогеном. Ветдтатк е! а1. (Сйет. Век. Тох1со1., 10: 78-84, 1997) показали, что акриламид является компонентом табачного дыма. Это стало первым связующим звеном между образованием акриламида и нагреванием биологического материла. Недавно сделано сообщение о появлении акриламида в ряде жареных и полученных в печи пищевых продуктах (Тагеке е! а1., Сйет. Век. Тох1со1., 13: 517-522, 2000), что вызвало беспокойство во всем мире. Другое исследование показало, что значительные количества акриламида обнаруживаются в ряде печеных, жареных и полученных в печи обычных пищевых продуктов, и показано, что появление акриламида в пищевом продукте было результатом процесса тепловой обработки.

Официальный предел акриламидного загрязнения в пищевых продуктах в ИК установлен в 10 ч./млрд (10 мкг/кг). Величины, приведенные в литературе, превышали указанную величину во многих продуктах, например крупах, хлебопродуктах, кофе, картофельных чипсах (замороженном картофеле, жаренном кусочками) и хрустящем картофеле.

Соотношение между вводимой дозой акриламида и частотой появления опухолей установили в испытаниях, в которых крысам, за которыми наблюдали в течение 2 лет, скармливали акриламид с питьевой водой (Рпебтап е! а1., Рипбат. Арр1. Рйагтасо1., 85: 154-168, 1986; 1ойпкоп е! а1., Тох1со1. Арр1. Рйаттасо1., 85: 154-168, 1986). Тагеке е! а1. исследовали гемоглобинсвязанный акриламид у крыс - как Н-(2-карбамоилэтил)валин - в связи с пищевым рационом, содержащим акриламид. Путем объединения полученных результатов вычислено, что ежедневное потребление акриламида в 1,6 мг/кг соответствует риску появления рака 7-10^-3 для людей при воздействии на протяжении жизни.

Предположен путь образования акриламида из аминокислот и восстанавливающих сахаров (Мойтат е! а1., На!иге, 419: 448, 2002). Согласно такой гипотезе акриламид образуется во время реакции Мейлларда. Во время запекания, жарения и обжаривания реакции Мейлларда вносят существенный вклад в цвет, запах и вкус продукта. С реакциями Мейлларда ассоциируется расщепление аминокислот по Штреккеру и предлагается путь к акриламиду. Образование акриламида становится заметным, когда температура превышает 120°С, и наивысшую скорость образования наблюдают примерно при 170°С. Когда присутствуют как аспарагин, так и глюкоза, наблюдали наивысшие количества акриламида, в то время как глутамин и аспарагиновая кислота дают появление только следовых количеств.

В интересах общественного здравоохранения существует острая потребность в пищевых продуктах, которые имеют существенно более низкие уровни акриламида или предпочтительно лишены его. В первую очередь инициирована исследовательская деятельность для того, чтобы разгадать механизм образования акриламида в пищевых продуктах. До настоящего времени результаты не привели к удовлетворительному решению проблемы. В настоящее время пищевые компании исследуют возможности избежать образования акриламида за счет снижения температуры тепловой обработки в печи и в процессах обжарки. Однако такие адаптации, по существу, приведут к пищевым продуктам с изменившимися вкусовыми свойствами (меньше продуктов Мейлларда) или изменившимся составом (более высокое содержание жиров).

Заявки на патент И8 2004/0058046 и И8 2004/0058054 относятся к способам предотвращения образования акриламида путем обработки промежуточной формы пищевого продукта ферментом, который разрушает аминокислоты, участвующие в образовании акриламида, в частности аспарагин. Модификация аминокислот может быть нежелательной с точки зрения качества продукта, например когда релевантные аминокислоты представляют существенную фракцию массы продукта. Примером является случай с картофелем, в котором присутствует примерно 0,1 мас.% аспарагина относительно сухой массы картофеля. Акриламид, образовавшийся в картофельных чипсах, составляет примерно 100 ч./млрд, что указывает, что только небольшая часть аспарагина, присутствующего в картофеле, переходит в акриламид. Однако применение способов по вышеуказанным заявкам на патент может привести к необходимости модифицировать весь или по меньшей мере большую часть присутствующей питательной релевантной аминокислоты аспарагина.

- 1 014853

Кроме того, в некоторых случаях данный способ трудно применить, например, когда ни одна из промежуточных форм пищевого продукта, которые имеют место перед стадией тепловой обработки, не содержит достаточно влаги для того, чтобы действовал фермент, добавленный извне. Наконец, акриламид может образовываться, несмотря на все меры, принятые для того, чтобы этого избежать.

Сущность изобретения

Целью настоящего изобретения является новый способ получения пищевого продукта, способный снизить уровень акриламида в пищевом продукте, причем способ подходит для применения к пищевому продукту или его промежуточной форме или исходным материалам, причем в то же время сохраняется высокий уровень питательных релевантных аминокислот.

Цель настоящего изобретения достигается способом получения пищевого продукта, включающим следующие стадии:

тепловая обработка пищевого продукта до температуры, при которой образуется акриламид; и последующее добавление фермента, причем указанный фермент способен модифицировать акриламид.

Неожиданно, можно применить фермент, способный модифицировать акриламид, к пищевому продукту и получить нужные низкие уровни акриламида, причем в то же время сохраняется высокий уровень питательных релевантных аминокислот, например аспарагина.

Таким образом, в своем первом аспекте настоящее изобретение относится к изолированной амидазе, которую можно получить из ЛкрегдШик гиде г, с аминокислотной последовательностью 5>ЕО ГО N0: 23? или ее функциональным эквивалентам, обладающим по меньшей мере 70% или большей гомологией с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0: 23.

Настоящее изобретение во втором своем аспекте относится к изолированной амидазе, которую можно получить из ЛкрегдШик шдег, с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0: 32, или ее функциональным эквивалентам, обладающим по меньшей мере 70% или большей гомологией с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0: 32.

В своем третьем аспекте изобретение относится к изолированному полинуклеотиду, выбранному из:

(a) изолированного полинуклеотида, кодирующего амидазу, которую можно получить из ЛкрегдШик шдег, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 23, или ее функциональные эквиваленты, обладающие по меньшей мере 70% или большей гомологией с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0: 23;

(b) изолированного полинуклеотида, кодирующего по меньшей мере один функциональный домен амидазы, которую можно получить из ЛкрегдШик шдег, содержащей аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 23, или его функциональных эквивалентов, обладающих по меньшей мере 70% или большей гомологией с нуклеотидной последовательностью 8Е0 ГО N0: 1 или 8Е0 ГО N0: 12;

(c) изолированного полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность 8Е0 ГО N0: 1 или 8Е0 ГО N0: 12, или его функциональных эквивалентов, обладающих по меньшей мере 70% или большей гомологией с нуклеотидной последовательностью 8Е0 ГО N0: 1 или 8Е0 ГО N0: 12.

В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к изолированному полинуклеотиду, выбранному из:

(a) изолированного полинуклеотида, кодирующего амидазу, которую можно получить из ЛкрегдШик И1дег, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 32, или его функциональные эквиваленты, обладающие по меньшей мере 70% или большей гомологией с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0: 32;

(b) изолированного полинуклеотида, кодирующего по меньшей мере один функциональный домен амидазы, которую можно получить из ЛкрегдШик шдег, содержащей аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 23, или его функциональных эквивалентов, обладающих по меньшей мере 70% или большей гомологией с нуклеотидной последовательностью 8Е0 ГО N0: 10 или 8Е0 ГО N0: 21;

(c) изолированного полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность 8Е0 ГО N0: 10 или 8Е0 ГО N0: 21, или его функциональных эквивалентов, обладающих по меньшей мере 70% или большей гомологией с нуклеотидной последовательностью 8Е0 ГО N0: 10 или 8Е0 ГО N0: 21.

Изобретение в своем пятом аспекте относится к вектору, содержащему полинуклеотидную последовательность, относящуюся к третьему и четвертому аспектам настоящего изобретения.

В своем шестом аспекте изобретение относится к изолированной амидазе, которую можно получить экспрессией полинуклеотида, относящегося к третьему и четвертому аспектам настоящего изобретения, или вектора, относящегося к пятому аспекту, в соответствующей клетке-хозяине, например ЛкрегдШик И1дег.

В своем седьмом аспекте изобретение относится к рекомбинантной амидазе, содержащей функциональный домен любой из амидаз, относящихся к аспектам 1, 2 или 6 настоящего изобретения.

- 2 014853

В восьмом аспекте изобретение касается рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей полинуклеотид, относящийся к третьему и четвертому аспектам настоящего изобретения, или вектор, относящийся к пятому аспекту.

В своем девятом аспекте изобретение касается рекомбинантной клетки-хозяина, экспрессирующей полипептид, относящийся к любому из аспектов 1, 2 или 6, 7 настоящего изобретения.

В своем десятом аспекте изобретение относится к способу получения амидазы по любому из аспектов 1, 2, 6, 7, включающему стадии трансформации подходящей клетки-хозяина изолированным полинуклеотидом по любому из аспектов 3, 4 или вектором, относящимся к аспекту 5, культивирования указанной клетки в условиях, допускающих экспрессию указанного полинуклеотида, и, при необходимости, очистки кодируемого полипептида из указанной клетки или культуральной среды.

В своем одиннадцатом аспекте изобретение относится к способу продуцирования полинуклеотида по любому из аспектов 3, 4, включающему стадии культивирования клетки-хозяина, трансформированной указанным полинуклеотидом, и выделения указанного полинуклеотида из указанной клетки-хозяина.

Изобретение в своем двенадцатом аспекте относится к способу продуцирования вектора, относящегося к аспекту 5 настоящего изобретения, включающему стадии культивирования клетки-хозяина, трансформированной указанным вектором, и выделения указанного вектора из указанной клетки-хозяина.

В своем тринадцатом аспекте изобретение относится к способу получения пищевого продукта с пониженным содержанием акриламида, включающему обжарку пищевого продукта при температуре, при которой образуется акриламид, с получением обжаренного пищевого продукта с последующим приведением обжаренного пищевого продукта и/или порошков, смесей и/или экстрактов, полученных из обжаренного пищевого продукта, в контакт с ферментом амидазой в водных условиях с получением ферментативно обработанного пищевого продукта, причем указанный фермент способен модифицировать акриламид.

В одном из воплощений способа фермент добавляют в количестве, достаточном для уменьшения количества акриламида на 50%, предпочтительно на 70%, предпочтительнее на 80% и наиболее предпочтительно на 90% по сравнению с количеством в пищевом продукте, к которому фермент не был добавлен.

В еще одном из воплощений способа водные условия получают посредством добавления воды или пасты, содержащей воду, к обжаренному пищевому продукту и/или порошкам, смесям и/или экстрактам, полученным из обжаренного пищевого продукта, и ферментативно обработанный пищевой продукт содержит по меньшей мере 15 мас.% воды.

В еще одном из воплощений способа пищевой продукт представляет собой кофейный продукт, предпочтительно обжаренные кофейные зерна либо части или экстракты обжаренных кофейных зерен, молотый кофе, растворимый кофе, жидкие кофейные напитки, кофейные экстракты и декофеинированный вариант кофейных продуктов.

В следующем из воплощений способа обжаренный пищевой продукт представляет собой обжаренные зерна какао или обжаренные орехи.

В еще одном из воплощений способа ферментативно обработанный пищевой продукт представляет собой сваренный кофе, жидкий кофейный напиток, кофейный экстракт или декофеинированный вариант этих кофейных продуктов, напиток какао или шоколадный напиток.

В еще одном из воплощений способа ферментативно обработанный пищевой продукт высушивают или частично высушивают с получением концентрированного кофейного экстракта быстрорастворимого кофе, или декофеинированного варианта этих кофейных продуктов, или быстрорастворимого шоколадного напитка, или быстрорастворимого напитка какао.

В еще одном из воплощений способа фермент способен гидролизовать короткоцепочечные нециклические амиды.

В своем следующем аспекте изобретение относится к применению амидазы по любому из аспектов 1, 2, 6, 7 в способе получения пищевого продукта, относящемся к аспекту 13 и его предпочтительным воплощениям.

Наконец, еще в одном аспекте изобретение относится к пищевому продукту с пониженным содержанием акриламида, который можно получить способом, относящимся к аспекту 13 и его предпочтительным воплощениям.

- 3 014853

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Термин пищевой продукт в данном месте описания и далее включает как продукты питания для потребления людьми, так и корма для потребления животными, включая корм для домашних животных и корма, если в описании четко не указано иное. Пищевой продукт включает напитки. Кроме того, термин пищевой продукт охватывает исходный материал, промежуточные пищевые продукты и пищевые продукты, готовые к употреблению, если в описании четко не указано иное. Настоящее изобретение относится к способу получения пищевого продукта, включающему по меньшей мере одну стадию тепловой обработки, включая добавление фермента, способного модифицировать акриламид, после указанной стадии тепловой обработки. Форма пищевого продукта, к которой применяют фермент, не должна быть только конечным продуктом - могут иметь место дополнительные стадии переработки после добавления фермента. Предпочтительными пищевыми продуктами являются пищевые продукты, которые подвергают тепловой обработке в сухом состоянии и, следовательно, содержат количество акриламида, сниженное до более низких уровней. Сухое состояние означает содержание влаги менее 20 мас.%, предпочтительно менее 15 мас.%. Кофейные зерна, порошкообразный кофе, кофейные напитки или напиток, содержащий кофе, являются наиболее предпочтительными продуктами для обработки. Кофейные зерна обжаривают в сухом состоянии для получения их аромата. Во время такой обжарки или тепловой обработки будет образовываться акриламид.

Такие зерна весьма затруднительно обрабатывать предварительно, например, аспарагиназой для предотвращения образования акриламида. В \УО 2004/037007 раскрывается такая предварительная обработка.

В \УО 2004/037007 образующийся акриламид пытаются растворять путем приведения добавляемого извне фермента в контакт с соединением внутри более или менее твердой матрицы.

Способы по \¥О 2004/037007 требуют дополнительной существенной переработки, включая сушку, гидратацию, уменьшение размера частиц и т.д., перед стадией обжарки.

Это в целом несовместимо с обработкой кофе.

Используемые способы являются достаточно трудоемкими и занимающими длительное время, а снижение по акриламиду является скромным.

Кроме того, также эффективно замачивание неактивированным ферментом (см. пример 3 в \УО 2004/037007), так как, по меньшей мере, частично эффект имеет место просто из-за водной экстракции аспарагина из кофейных зерен, а не из-за активности фермента. При такой экстракции также будут теряться ценные для кофейного аромата соединения.

В способе по изобретению стадии тепловой обработки являются стадиями, на которых часть промежуточного пищевого продукта подвергается воздействию температур, при которых образование акриламида ускоряется, например, при 105°С или выше, 120°С или выше. Как правило, температура на стадии тепловой обработки в общем процессе получения составляет максимально 250°С, чаще до 220 или 200°С. Стадию тепловой обработки в способе по изобретению можно осуществлять в сушильных печах, например, при температуре 150-250°С, таких как для выпечки хлеба и других печеных продуктов; в масле, таком как для обжаривания замороженного картофеля кусочками, картофельных чипсов или соевого пирога, например, при 150-200°С; на плитах, или на, или под нагретым грилем.

Предпочтительными стадиями нагревания являются обжарка или обработка на гриле.

Пищевой продукт можно получить по меньшей мере из одного сырья, которое имеет растительное происхождение, например клубнеплодов, таких как картофель, сладкий картофель или кассава; бобовых, таких как горох или соевые бобы; ароматных растений, таких как табак, кофе или какао; орехов или зерновых, таких как пшеница, рожь, кукуруза, маис, ячмень, крупяные, гречиха, рис или овес. В объем данного изобретения также входят пищевые продукты, полученные из нескольких видов сырья, например пищевые продукты, содержащие как кукурузу, так и картофель.

Пищевой продукт также может содержать по меньшей мере один вид сырья, имеющего животное происхождение.

Пищевой продукт также может содержать по меньшей мере один вид сырья, имеющего источником грибы, такой как сырье, полученное из грибов или белка грибов.

Примером пищевых продуктов, для которых можно применить способ по изобретению, являются обжаренные продукты и/или порошки, смеси и/или экстракты, полученные из обжаренных продуктов. Примерами обжаренных продуктов являются кофейные зерна или какао-бобы; орехи, такие как арахис, миндаль, грецкие орехи, орехи пекан, фундук; крупы, такие как обжаренная кукуруза; корни, такие как цикорий; отдельные вещества, такие как сахар, используемый для карамельного кулера. Способ по изобретению особенно подходит для кофейных зерен или какао-бобов.

Настоящее изобретение также относится к продуктам, полученным из обжаренных материалов. Примерами продуктов, полученных из обжаренных материалов, являются заваренный кофе, кофейный экстракт, кофейный концентрат, растворимый кофе, жидкие кофейные напитки, молотый кофе, декофеинированные варианты таких кофейных продуктов, какао-порошок, шоколад, растворимый шоколадный напиток, тертый орех, пиво, виски, солод, экстракт солода, соевый соус.

- 4 014853

Настоящее изобретение исключительно подходит для обжаренных пищевых продуктов, так как при получении таких продуктов, как правило, не включается стадия с включением влаги, достаточной для действия фермента на промежуточные продукты, перед стадией тепловой обработки.

Особенно предпочтительными способами являются способы, которые включают воздействие жидкой или влажной окружающей среды после стадии тепловой обработки, как, например, жидкостная экстракция обжаренных или термообработанных материалов или смешивание молотых обжаренных или термообработанных материалов с другим влажным материалом или с водой. Примерами продуктов, полученных такими способами, являются кофе, какао-напиток, шоколад, миндальная приправа, соевый соус и карамельный кулер.

Без предвзятого отношения к способам, описанным выше, способ по изобретению также можно использовать для других пищевых продуктов, содержащих акриламид.

Акриламид образуется в пищевом продукте за счет взаимодействия аспарагина и глюкозы, когда пищевой продукт нагревают при температурах 100-120°С и выше. Образование акриламида будет усиливаться с повышением температуры. Некоторые пищевые продукты обрабатывают при температурах, при которых будет образовываться акриламид, как, например, при выпечке хлеба в печи при 225°С, жарении замороженного картофеля кусочками в масле примерно при 160-180°С или обжаривании кофейных зерен при температурах 180°С и выше.

В некоторых заявках на патент описывается возможность предотвращения образования акриламида. Примером является ферментативная обработка аспарагина с использованием аспарагиназы. Показано, что такая обработка является весьма успешной. Например, в хлебе, замороженном картофеле, жаренном кусочками, и чипсах количество образовавшегося акриламида существенно снизилось. В таких случаях фермент добавляют к пищевому продукту перед термической обработкой. Фермент добавляли в тесто перед выпечкой. Замороженный картофель, который жарят кусочками, или чипсы можно сбрызнуть раствором фермента. В случае замороженного картофеля, жаренного кусочками, и хлеба только поверхность пищевого продукта будет подвергаться воздействию температуры выше 100°С. В хлебе внутренняя часть не будет нагреваться выше 80 или 90°С из-за присутствия воды. Также внутренняя часть замороженного картофеля, который жарят кусочками, не будет нагреваться выше температуры кипения воды, и во внутренней части акриламид, по существу, не будет образовываться, и, таким образом, ферментативной обработки только наружной поверхности замороженного картофеля, который жарят кусочками, достаточно для предотвращения образования акриламида.

Авторы обнаружили, что применение такой аспарагиназы менее эффективно в пищевых продуктах, которые будут подвергаться термической обработке таким образом, что весь пищевой продукт будет иметь температуру выше 120°С, и для такого случая не существует способов включения фермента во весь пищевой продукт коммерчески привлекательным способом. Как правило, такие пищевые продукты являются твердыми и не перемешиваются (не уподобляются тесту), имеют толщину по меньшей мере 3 мм и содержат только незначительные количества воды, как правило менее 20 мас.%, предпочтительно менее 12 мас.% воды. Хорошим примером таких продуктов являются кофейные зерна. Такие зерна обжаривают для получения кофейных зерен, подходящих для приготовления кофе. Во время обжарки все зерно будет иметь температуру свыше 150°С. Акриламид будет образовываться не только в наружном слое, как в случае замороженного картофеля, жаренного кусочками, но также будет образовываться во всем объеме зерна.

В самом распространенном способе кофейные зерна снимают, отшелушивают, выдерживают для дозревания (ферментируют), промывают и сушат (или в сушильной печи или потоком горячего воздуха). Указанные стадии приняты поставщиками кофе (в странах-поставщиках). Полученный продукт представляет собой зеленые кофейные зерна с содержанием влаги 9,8-12,5% (рекомендацией являются 11-12%). На данной стадии зерно может хорошо храниться.

Для обычного кофе зерна просто обжаривают. Мелкомасштабное оборудование работает примерно при 160°С (температура внутри становится выше 200°С). На промышленном оборудовании, вероятно, используют более высокие температуры воздуха (но более короткое время обжарки).

Поэтому настоящее изобретение предпочтительно используется в способе получения пищевого продукта, который представляет собой кофейный продукт, предпочтительно кофейные зерна, молотый кофе, растворимый кофе, жидкие кофейные напитки, кофейные экстракты или декофеинированные варианты кофейных продуктов.

Для декофеинирования существует по меньшей мере 4 способа (все осуществляются на зеленых кофейных зернах).

1. Сверхкритическая экстракция СО₂. В данном случае фермент не может действовать.

2. Экстракция метиленхлоридом. В данном случае зерна сначала обрабатывают водяным паром.

3. Экстракция этилацетатом. В данном случае кофеин экстрагируют из зерен водой (вместе с рядом других (ароматических) соединений), затем кофеин извлекают этилацетатом и добавляют снова промывку зерен водой для возвращения запаха.

4. Швейцарский способ с водой. Имеет сходство со способом 3, но применяют поглощение активированным углем вместо этилацетата.

- 5 014853

Хотя настоящее изобретение можно применять во всех способах декофеинирования, способ настоящего изобретения наиболее выгодно применять при получении обычных кофейных продуктов.

Авторы неожиданно обнаружили, что количество акриламида можно уменьшить в кофе, обрабатывая не кофейные зерна, а экстракты, полученные из указанных кофейных зерен.

Поэтому настоящее изобретение относится к способу уменьшения содержания акриламида в пищевом продукте путем обработки пищевого продукта, который обработан при температурах выше 100°С, предпочтительно выше 120°С и наиболее предпочтительно выше 150°С и затем приведен в контакт в водной среде с ферментом амидазой.

Предпочтительно водную среду получают добавлением жидкости или пасты, содержащей воду. Жидкость или паста может содержать фермент, но жидкость или паста также может добавляться отдельно от фермента. После добавления жидкости или пасты пищевой продукт может находиться в водном состоянии (например, кофейный экстракт, или шоколад, или какао-напиток), в пастообразном состоянии (например, ореховое масло или миндальная приправа), в форме эмульсии (например, ореховое масло) до тех пор, пока ферментативно обработанный пищевой продукт содержит по меньшей мере 15 мас.%, предпочтительно по меньшей мере 25 мас.%, предпочтительнее по меньшей мере 40 мас.% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 60 мас.% воды. Пищевой продукт по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой заваренный кофе, жидкие кофейные напитки, кофейные экстракты, какао-напитки или шоколадные напитки. После ферментативной обработки пищевой продукт можно высушить или частично высушить. Поэтому концентрированный кофейный экстракт, растворимый кофе, растворимый шоколадный напиток или растворимые напитки-какао, ферментативно обработанные амидазой, также являются частью настоящего изобретения.

При необходимости амидазу можно инактивировать. Это можно осуществить, например, кратковременной термической обработкой при подходящей температуре, например при 90°С.

Авторы стали первыми, кто сумел получить кофе из кофейных зерен или кофейного порошка, содержащий менее 50 ч./млрд, предпочтительно менее 30 ч./млрд и наиболее предпочтительно менее 10 ч./млрд акриламида (мкг акриламида / кг сухого кофе) в промышленном масштабе.

Поэтому настоящее изобретение относится к обжаренным кофейным зернам, кофейным напиткам, заваренному кофе, содержащим менее 50 ч./млрд, предпочтительно менее 30 ч./млрд и наиболее предпочтительно менее 10 ч./млрд акриламида относительно сухого вещества кофе.

Настоящее изобретение также относится к упаковкам, таким как герметичные упаковки из фольги, необязательно, вакуумные герметизированные банки или горшки, изготовленные из металла, стекла или полимеров, и подобные упаковки, содержащим по меньшей мере 50 г, предпочтительно по меньшей мере 100 г обжаренных кофейных зерен, кофейных экстрактов, концентрированных кофейных напитков, кофейных напитков, заваренного кофе, содержащих менее 50 ч./млрд, предпочтительно менее 30 ч./млрд и наиболее предпочтительно менее 10 ч./млрд акриламида относительно сухого вещества кофе.

Как правило, такие упаковки будут содержать менее 1000 кг, предпочтительно менее 100 кг, предпочтительнее менее 10 кг и наиболее предпочтительно менее 1 кг обжаренных кофейных зерен, кофейных экстрактов, концентрированных кофейных напитков, кофейных напитков, заваренного кофе, содержащих менее 50 ч./млрд, предпочтительно менее 30 ч./млрд и наиболее предпочтительно менее 10 ч./млрд акриламида относительно сухого вещества кофе.

Фермент, используемый в способе по изобретению, представляет собой фермент, способный модифицировать акриламид. Термин фермент обозначает один фермент, а также сочетание нескольких ферментов. Предпочтительно фермент способен модифицировать короткоцепные нециклические амиды. Как правило, короткоцепные нециклические амиды содержат самое большее 6 атомов С в своей алифатической цепи, предпочтительнее самое большее 5, даже предпочтительнее самое большее 4 и наиболее предпочтительно самое большее 3 атома С. Алифатическая цепь может быть линейной или разветвленной. Предпочтительнее фермент способен модифицировать акриламид, ацетамид и/или пропионамид. Предпочтительной модификацией акриламида является модификация под действием амидазы.

Предпочтительно препарат фермента, используемый в способе по изобретению, происходит от микроорганизмов, и его получают способами ферментации, известными в технике. Микроорганизмы могут представлять собой бактерии, грибы или дрожжи.

Фермент можно получить из различных источников, таких как, например, растения, животные и микроорганизмы, такие как, например, виды А1са1щепек. Аг(ПгоЬас1ег. Втеу1Ьас1егшт, ЕксйепсЫа, К1еЬк1е11а. МусоЬас1егшт, 81тер1отусек, 8ассйатотусек, Ркеиботопак, Вйобососсик, Хапбютопак. Акретд11ик и ВасШик, предпочтительно АкретдШик, ВасШик или 8ассйатотусек, предпочтительнее АкретдШик. Примером подходящего штамма ЕксйепсШа является ЕксйепсШа сой. Примером подходящего штамма Кйобососсик является Кйобососсик гйобосйтоик. Примерами подходящих штаммов Ркеиботопак являются Р.аетидпока, Р.серааа и Р.сЫотоарЬ. Примером подходящего штамма 8бер1отусек является 81гер1отусек Шзбапк. Примерами подходящих штаммов 8ассйатотусек являются, например, 8ассйатотусек сетеу1кае, 8ассйатотусек иуатит, 8ассйатотусек Ьауапик, 8ассйатотусек ракЮпапик или 8ассйатотусек рагабохик. Примерами подходящих штаммов АкретдШик являются АкретдШик огухае. АкретдШик шби1аик (Етепсе11а шби1аик) или АкретдШик шдег. Примерами подходящих

- 6 014853 штаммов ВасШик являются ВасШик а1ка1орЫ1ик. ВасШик ату1о1к|исГас1СП5. ВасШик Ьге\зк. ВасШик с1тси1апк. ВасШик соади1апк. ВасШик 1аШик. ВасШик 1еп1ик. ВасШик ПсНешГопшк. ВасШик тсдаЮпит. ВасШик к!еагоШегторЫ1ик. ВасШик киЫШк или ВасШик Шшгпфепкщ.

Предпочтительно фермент получают из пищевых микроорганизмов. например АкретдШик шдет. Зассйатотусек сетеу1кае или ВасШик киЫШк. наиболее предпочтительно из АкретдШик шдег.

Предпочтительно фермент предоставляют в устойчивой форме, как правило жидкой форме. форме порошка. гранул или инкапсулированной форме. Независимо от композиции фермента можно применять любые добавки и стабилизаторы. известные в технике как применяемые для улучшения и/или поддержания активности ферментов. Когда фермент входит в состав жидкой формы. его можно применять к продукту любым возможным способом. например пропитыванием. опрыскиванием или смешиванием. Фермент также можно. например. добавлять в жидкий экстракт. эмульсию или суспензию продукта. промежуточного для пищевого продукта. С другой стороны. фермент можно получать ш кйи с помощью микроорганизма. способного продуцировать указанный фермент.

Фермент можно добавлять в количестве примерно 100-0.1 Е/л. предпочтительнее менее 50 Е/л. даже предпочтительнее самое большее 10 Е/л или от 5 до 1 Е/л (где 1 Е определяется как гидролиз 1 мкмоль амида в минуту). см. пример 8.

Амидазы (или амидогидролазы) представляют собой ферменты. которые гидролизуют химическую связь С-Ν амида. причем посредством этого образуются аммиак и уксусная кислота. и акриламидаза превращает акриламид в аммиак и акриловую кислоту (пропеновую кислоту).

Амидазы являются хорошо исследованным классом ферментов. классифицированным как ферменты. гидролизующие углерод-азотные связи. иные. чем пептидные связи (ЕС 3.5). Особый интерес представляет группа. действующая на линейные амиды (3.5.1). Другой группой ферментов. которые катализируют подобную реакцию. являются бета-лактамацилазы (ЕС 3.5.1.11). где С и N также оба являются замещенными. например глутарилацилаза. где С является частью глутаровой кислоты и Ν частью беталактамового цикла. Другими ферментами. которые действуют подобным образом. являются аспарагиназа (3.5.1.1). глутаминаза (3.5.1.2). гидролаза циклического димера 6-аминогексаноата (ЕС 3.5.2.12). гидролаза амидов жирных кислот. хитиндеацетилаза (3.5.1.41). глутамил-тРНК(С1п)-амидотрансфераза. Реакция гидролиза. которую указанные соединения могут катализировать. подобна реакции для пептидаз (ЕС 3.4). но в случае пептидаз как С. так и N гидролизуемой связи содержатся в аминокислотах.

Следует отметить. что применение амидаз по изобретению для модификации акриламида. как только он образуется. существенно отличается от применения. например. аспарагиназы для разрушения аминокислот с целью предотвращения образования акриламида. как описано на известном уровне техники. например в И8 2004/0058046 или И8 2004/0058054.

Многие. но не все. из указанных ферментов имеют общий структурный мотив - консервативную область. богатую остатками глицина. серина и аланина. Сообщается. что существует три основных семейства амидаз: группа собственно амидаз (примеры А.огухае. 8.1урЫтигшт); группа нитрилаз (примеры Р.аетидтока. В.етуШторойк. Н.ру1ог1. В.к!еагоШегторЫ1ик); группа уреаз (пример М.ктедтабк) (№го е! а1.. ВюсНет. 1.. 365: 731-738. 2002). Субстраты для амидаз включают ацетамид. индолацетамид. фенилацетамид. паранитрофенилацетамид. паранитроацетанилид. хлорацетамид. пропионамид. бутирамид. изобутирамид. сукцинамид. акриламид. метакриламид. бензамид и никотинамид.

Имеются сообщения в уровне техники о применении амидаз из различных источников для гидролиза акриламида для удаления мономерного акриламида из полиакриламидных продуктов для возможности безопасного применения полимера. Например. в патенте США 4925797 описывается применение для такой цели амидазы из МеШу1орЫ1ик теШу1о1торйик. Авторы указанного патента обращаются к вопросу присутствия акриламида в полимерах. которые могут контактировать с пищевым продуктом. и предлагают способ удаления акриламида из полимера для того. чтобы избежать загрязнения пищевого продукта. В патенте США 5962284 амидазу из вида КНобососсик используют для снижения уровней акриламида в полиакриламидных гелях. В патенте США 6248551 описывается акриламидаза из НейсоЬасЮг рутой. Другие авторы используют иммобилизованные клетки для того. чтобы добиться разрушения акриламида. например в патенте США 6146861. где для такой цели используют клетки КНобососсик гНобосНгоик.

Указанные применения не направлены на сам содержащийся акриламид. не указывают применение таких амидаз для самих пищевых продуктов для снижения уровней акриламида. а только указывают на пригодность амидаз для применений к пищевым продуктам.

Вышеуказанные применения также относятся к использованию бактериальных амидаз. Однако также известны гидролизующие действия амидаз из грибов. Ацетамидазу из Етепсе11а применяют в области молекулярной генетики как селектированный маркер для генетически трансформированных клеток грибов. Однако по сравнению со знаниями о возможных субстратах. специфичности и возможностях бактериальных амидаз о свойствах ферментов грибов известно немногое. Также амидазы из грибов не используют для эффективного удаления акриламида. Более того. успешное применение гидролизующих акриламид ферментов для пищевых продуктов - успешное в смысле того. что количество акриламида снижается до приемлемых уровней - пока не достигалось. Это не является незначительным моментом. так как уровни. которых необходимо достигнуть и. следовательно. концентрация субстрата фермента

- 7 014853 являются исключительно низкими, находясь в таких низких интервалах, в ч./млрд, как 200 ч./млрд, предпочтительнее менее 100 ч./млрд, даже предпочтительнее менее 50 ч./млрд и наиболее предпочтительно менее 20 ч./млрд.

Неожиданно авторы обнаружили, что мицелиальный гриб АкретдШик П1дсг содержит несколько генов, кодирующих ферменты, которые способны гидролизовать акриламид. Более того, обнаружено, что некоторые из таких ферментов секретированы в культуральную жидкость, что облегчает их получение и извлечение. Более того, обнаружено, что некоторые из таких ферментов способны эффективно удалять акриламид из продуктов питания, в частности из продуктов питания, в которых акриламид образуется во время стадии термической обработки.

В другом аспекте изобретение относится к новым идентифицированным полинуклеотидным последовательностям, содержащим гены, кодирующие новые амидазы, которые, например, можно получить из АкретдШик шдег. Новые амидазы можно использовать в способе получения пищевых продуктов по настоящему изобретению, например при получении кофейного экстракта.

Полинуклеотиды.

Изобретение также относится к новым полинуклеотидам, кодирующим новые ферменты амидазы. Настоящее изобретение относится к новым полинуклеотидам, кодирующим амидазу, в рабочем порядке названным АМГО01, АМП102. АМГО03, АМГО04, ΑΜΙΌ05, АМГО06, АМГО07, АМГО08, АМГО09, АМШ10 и АМШ11 (далее в данном описании называемые АМШ01-11), имеющим аминокислотную последовательность, выбранную из группы, соответственно состоящей из БЕС ΙΌ N0: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 и 33 (далее в данном описании называемых БЕС Ш N0: 23-33) или функциональных эквивалентов любой из них. Последовательность генов, кодирующих АМШ01-11, определяли секвенированием геномного клона, полученного из АкретдШик шдег. Изобретение относится к полинуклеотидным последовательностям, содержащим ген, кодирующий амидазу АМШ01-11, а также к его полной последовательности кДНК и его кодирующей последовательности. Соответственно изобретение относится к изолированному полинуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из БЕС ΙΌ N0: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 (далее в данном описании называемых БЕС ΙΌ N0: 1-11), или выбранную из группы, состоящей из БЕС ΙΌ N0: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 (далее в данном описании называемых БЕС ΙΌ N0: 12-22), или функциональных эквивалентов любой из них.

Конкретнее, изобретение относится к изолированному полинуклеотиду, способному к гибридизации предпочтительно в строгих условиях, предпочтительнее в весьма строгих условиях, с полинуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из БЕС ΙΌ N0: 1-11, или выбранного из группы, состоящей из БЕС ΙΌ N0: 12-22. Преимущественно такие полинуклеотиды можно получить из мицелиальных грибов, в частности из АкретдШик шдег. Конкретнее, изобретение относится к изолированному полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из БЕС ΙΌ N0: 1-11, или выбранной из группы, состоящей из БЕС ΙΌ N0: 12-22.

Изобретение также относится к изолированному полинуклеотиду, кодирующему по меньшей мере один функциональный домен полипептида, выбранного из группы, состоящей из БЕС ΙΌ N0: 23-33, или функциональных эквивалентов любой из них.

Используемые в данном описании термины ген и рекомбинантный ген относятся к молекулам нуклеиновой кислоты, которые можно выделить из хромосомной ДНК, включающим открытую рамку считывания, кодирующую белок, например аспарагиназу из А.шдет. Ген может включать кодирующие последовательности, некодирующие последовательности, интроны и регуляторные последовательности. Более того, ген относится к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, имеющей определение, приведенное в данном описании.

Молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, такую как молекула нуклеиновой кислоты, имеющая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из БЕС ΙΌ N0: 111, или выбранную из группы, состоящей из БЕС ΙΌ N0: 12-22, или функциональных эквивалентов любой из них, можно выделить с использованием стандартных методов молекулярной биологии и сведений о последовательностях, приведенных в данном описании. Например, с использованием в качестве зонда для гибридизации всей или части нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из БЕС ΙΌ N0: 1-11, или выбранной из группы, состоящей из БЕС ΙΌ N0: 12-22, молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению можно выделить с использованием стандартных методов гибридизации и клонирования (например, описанных в БашЬтоок 1., Ртйкй Е.Р. апй Машайк Т., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬота1огу Мапиа1, 2'¹ ей., Со1й Бргйщ НагЬог ЬаЬота1огу, Со1й Бргйщ НагЬог ЬаЬота1огу Ргекк, ИУ, 1989).

Кроме того, молекулу нуклеиновой кислоты, включающую всю или часть нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из БЕС ΙΌ N0: 1-11, или выбранной из группы, состоящей из БЕС ΙΌ N0: 12-22, можно выделить полимеразой цепной реакцией (ПЦР) с использованием синтетических олигонуклеотидных праймеров, созданных на основе сведений о последовательности, относящейся к последовательности, выбранной из группы, состоящей из БЕС ΙΌ N0: 1-11, или выбранной из группы, состоящей из БЕС ΙΌ N0: 12-22.

- 8 014853

Нуклеиновую кислоту по изобретению можно амплифицировать с использованием кДНК, мРНК или, с другой стороны, геномной ДНК в качестве матрицы и соответствующих олигонуклеотидных праймеров согласно стандартным методам ПЦР-амплификации. Амплифицированную таким образом нуклеиновую кислоту можно клонировать в соответствующий вектор и охарактеризовать анализом последовательности ДНК.

Кроме того, олигонуклеотиды, соответствующие или способные к гибридизации с нуклеотидными последовательностями по изобретению, можно получить стандартными методами синтеза, например с использованием автоматизированного синтезатора ДНК.

В предпочтительном воплощении изолированная молекула нуклеиновой кислоты по изобретению содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ N0: 12-22. Последовательность, выбранная из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 12-22, соответствует соответственно кодирующей области кДНК А.шдег ΑΜΙΌ01-11. Данная кДНК содержит последовательности, кодирующие соответственно полипептид А.шдег ΑΜΙΌ01-11, соответствующий 8Е0 ΙΌ N0: 23-33.

В другом предпочтительном воплощении изолированная молекула нуклеиновой кислоты по изобретению содержит молекулу нуклеиновой кислоты, комплементарную нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 Ш N0: 1-11, или выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 12-22, или функционального эквивалента любой из указанных нуклеотидных последовательностей.

Молекула нуклеиновой кислоты, комплементарная другой нуклеотидной последовательности, представляет собой молекулу, которая достаточно комплементарна другой нуклеотидной последовательности, такой, которая может гибридизировать с другой нуклеотидной последовательностью, причем посредством этого образуется устойчивый дуплекс.

Один аспект изобретения относится к изолированным молекулам нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептид по изобретению или его функциональный эквивалент, такой как биологически активный фрагмент или домен, а также молекулам нуклеиновой кислоты, достаточным для применения в качестве зондов для гибридизации для идентификации молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих полипептид по изобретению, и фрагментам таких молекул нуклеиновой кислоты, подходящим для применения в качестве праймеров ПЦР для амплификации или мутации молекул нуклеиновой кислоты.

Изолированный полинуклеотид или изолированная нуклеиновая кислота представляют собой ДНК или РНК, которая не прилегает непосредственно к обеим кодирующим последовательностям, к которым она непосредственно прилегает (одна с 5'-конца и одна с З'-конца) во встречающемся в природе геноме микроорганизма, от которого они происходят. Таким образом, в одном воплощении изолированная нуклеиновая кислота включает некоторые или все 5'-некодирующие (например, промоторные) последовательности, которые непосредственно прилегают к кодирующей последовательности. Поэтому термин включает, например, рекомбинантную ДНК, которая включена в вектор, в автономно реплицирующую плазмиду или вирус или в геномную ДНК прокариота или эукариота или которая существует в виде отдельной молекулы (например, кДНК или фрагмента геномной ДНК, полученного ПЦР или обработкой рестриктазой) независимо от других последовательностей. Он также включает рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего другой полипептид, который, по существу, свободен от клеточного вещества, вирусного вещества или культуральной среды (при получении методами рекомбинантных ДНК), или химические предшественники, или другие химические вещества (синтезированные химически). Кроме того, изолированный фрагмент нуклеиновой кислоты представляет собой фрагмент нуклеиновой кислоты, который не встречается в природе как фрагмент и его нельзя обнаружить в естественном состоянии.

Предполагается, что используемые в данном описании термины полинуклеотид или молекула нуклеиновой кислоты включают молекулы ДНК (например, кДНК или геномной ДНК) и молекулы РНК (например, мРНК) и аналоги ДНК или РНК, полученные с использованием нуклеотидных аналогов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но, вероятно, представляет собой двухцепочечную ДНК. Нуклеиновую кислоту можно синтезировать с использованием аналогов или производных олигонуклеотидов (например, инозин- или фосфоротиоатнуклеотидов). Такие олигонуклеотиды можно использовать, например, для получения нуклеиновых кислот, которые имеют измененную способность к образованию пар оснований или повышенную устойчивость к нуклеазам.

Другое воплощение изобретения относится к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, которая является антисмысловой по меньшей мере для одной из молекул нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из ΑΜΙΌ01-11, например ее кодирующей цепи. В объем изобретения также входят комплементарные цепи молекул нуклеиновой кислоты, описанные в данном описании.

Ошибки секвенирования.

Сведения о последовательностях, приведенные в данном описании, не следует так точно истолковывать, как требование включения ошибочно идентифицированных оснований. Конкретные последовательности, описанные в данном описании, можно легко использовать для выделения полного гена из мицелиальных грибов, в частности А.шдег, который, в свою очередь, можно легко подвергнуть дальнейшему секвенированию, причем посредством этого идентифицируются ошибки секвенирования.

- 9 014853

Если не указано иное, все нуклеотидные последовательности, определенные секвенированием молекулы ДНК в данном описании, определены с использованием автоматизированного секвенатора ДНК и все аминокислотные последовательности полипептидов, кодированных молекулами ДНК, определенными в данном описании, предсказаны трансляцией последовательности ДНК, определенной так, как указано выше. Следовательно, как известно в технике для любой последовательности ДНК, определенной с применением автоматизированных средств, любая нуклеотидная последовательность, определенная в данном случае, может содержать некоторые ошибки. Нуклеотидные последовательности, определенные с применением автоматизированных средств, типично по меньшей мере примерно на 90%, типичнее от по меньшей мере примерно на 95% до по меньшей мере примерно на 99,9% идентичны фактической нуклеотидной последовательности секвенированной молекулы ДНК. Фактическую последовательность можно точнее определить с применением других подходов, включая методы ручного секвенирования ДНК, хорошо известные в данной области техники. Как также известно в технике, отдельная вставка или делеция в определенной нуклеотидной последовательности, по сравнению с фактической последовательностью, может вызвать сдвиг рамки считывания при трансляции нуклеотидной последовательности, так что предсказанная аминокислотная последовательность, кодированная определенной нуклеотидной последовательностью, начиная с точки такой вставки или делеции, будет полностью отличаться от аминокислотной последовательности, действительно кодированной секвенированной молекулой ДНК.

Специалист в данной области техники может установить такие ошибочно идентифицированные основания и знает, как исправить такие ошибки.

Фрагменты нуклеиновой кислоты, зонды и праймеры.

Молекула нуклеиновой кислоты по изобретению может содержать только часть или фрагмент нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из ЗЕО Ш N0: 1-11, или выбранной из группы, состоящей из 8Е0 Ш N0: 12-22, например фрагмент, который можно использовать в качестве зонда или праймера, или фрагмент, кодирующий часть белка АМШ01-11. Нуклеотидная последовательность, определенная из клонирования гена ЛМШ01-11 и кДНК, допускает получение зондов и праймеров, создаваемых для применения при идентификации и/или клонировании других членов семейства ЛМШ01-11, а также гомологов ЛМШ01-11 из других видов. Зонд/праймер типично содержит, по существу, очищенный олигонуклеотид, который типично содержит участок нуклеотидной последовательности, который гибридизирует, предпочтительно в строгих условиях, по меньшей мере примерно с 12 или 15, предпочтительно примерно 18 или 20, предпочтительно примерно 22 или 25, предпочтительнее примерно 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 или 75 или большим числом последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из ЗЕО Ш N0: 1-11, или выбранной из группы, состоящей из ЗЕО Ш N0: 12-22, или функционального эквивалента любой из них.

Зонды на основе нуклеотидных последовательностей ЛМШ01-11 можно использовать для детекции транскриптов геномных последовательностей ЛМШ01-11, кодирующих такие же или гомологичные белки, например, в других микроорганизмах. В предпочтительных воплощениях зонд также содержит присоединенную к нему группу-метку, например группу-метку, которая может представлять собой радиоизотоп, флуоресцентное соединение, фермент или кофактор фермента. Такие зонды также можно использовать как часть диагностического набора для идентификации клеток, которые экспрессируют белок АМГО01-11.

Идентичность и гомология.

Термины гомология или процент идентичности в данном описании используются как взаимозаменяемые. Для цели данного изобретения определено, что для того, чтобы определить процент идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеотидных последовательностей, последовательности выравнивают для целей оптимального сравнения (например, можно включить бреши в последовательность в первую аминокислотную или нуклеотидную последовательность для оптимального выравнивания со второй аминокислотной или нуклеотидной последовательностью). Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих позициях аминокислот или позициях нуклеотидов. Когда позиция в первой последовательности занята тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующая позиция во второй последовательности, тогда молекулы являются идентичными в данной позиции. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией числа идентичных позиций, общих для последовательностей (т.е. % идентичности = число идентичных позиций/общее число позиций (т.е. перекрывающихся позиций) х 100). Предпочтительно обе последовательности имеют одну и ту же длину.

Специалист в данной области техники будет осознавать тот факт, что несколько различных компьютерных программ доступны для определения гомологии между двумя последовательностями. Например, сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями можно выполнить с использованием математического алгоритма. В предпочтительном воплощении процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями определяют с использованием алгоритма №с!с1тап ап! Аииксй (1. Мо1. ΒίοΙ. (48): 444-453 (1970)), который включен в программу САР в пакете программ ОСС (доступны на Ь11р://тетете.дсд.сот), с использованием или матрицы В1о55ош 62, или матрицы РАМ250, и штрафом за брешь 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и штрафом за уд

- 10 014853 линение бреши 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Специалисту следует иметь в виду, что все такие различные параметры будут давать несколько различные результаты, но что общая процентная идентичность двух последовательностей существенно не изменяется с использованием различных алгоритмов.

В еще одном воплощении процентную идентичность между двумя нуклеотидными последовательностями определяют с использованием программы САР в пакете программ ССС (доступны на й!!р://^тете.дсд.сот), с использованием матрицы Ы^Здарбпа.СМР и штрафом за брешь 40, 50, 60, 70 или 80 и штрафом за удлинение бреши 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В другом воплощении процентную идентичность двух аминокислотных или нуклеотидных последовательностей определяют с использованием алгоритма Е. Меуегк апб ^. МШег (САВ1О8, 4: 11-17 (1989)), включенного в программу АЫСЫ (версия 2.0) (доступна на ййр://уеда.1дй.спгк.£г/Ь1п/а11дп-диекк/сд1), с таблицы остатков массы РАМ120, штраф за удлинение бреши 12 и штраф за удлинение бреши 4.

Нуклеотидные и белковые последовательности по настоящему изобретению также можно использовать в качестве последовательности запроса для осуществления поиска относительно публичных баз данных в отношении, например, идентичности других членов семейства или родственных последовательностей. Такой поиск можно выполнить с использованием программ ΝΒΕΑ8Τ и ХВЬА8Т (версия 2.0), А1!ксйи1 е! а1. (1990), 1. Мо1. Вю1., 215: 403-10. Поиски нуклеотидов ВЬА8Т можно выполнить с помощью программы NΒ^Α8Τ, оценка = 100, длина слова = 12, и получить нуклеотидные последовательности, гомологичные молекулам нуклеиновой кислоты АМЮ01-11 по изобретению. Поиски белка ВЬА8Т можно выполнить с помощью программы ХВЬА8Т, оценка = 50, длина слова = 3, и получить аминокислотные последовательности, гомологичные молекулам белка АМШ01-11 по изобретению. Для того чтобы получить выравнивания с брешами для целей сравнения, можно использовать Сарреб ВЬА8Т, как описано в А1!ксйи1 е! а1. (1997), ШсШс Ас1бк Век., 25(17): 3389-3402. При использовании программ ВЬА8Т и Сарреб ВЬА8Т можно использовать параметры по умолчанию соответствующих программ (например, ХВЬА8Т и №ЬА8Т. См. 1Шр://\\л\лу.псЫ.п1т.ш11.доу.).

Гибридизация.

Используемый в данном описании термин гибридизация предназначен для описания условий гибридизации и промывки, при которых нуклеотидные последовательности, по меньшей мере на примерно 50%, по меньшей мере на примерно 60%, по меньшей мере на примерно 70%, предпочтительнее по меньшей мере на примерно 80%, даже предпочтительнее по меньшей мере на примерно 85-90%, предпочтительнее по меньшей мере на примерно 95% гомологичные друг другу, типично остаются гибридизованными друг с другом.

Предпочтительным неограничительным примером таких условий гибридизации является гибридизация в 6Х смеси хлорид натрия/цитрат натрия (88С) примерно при 45°С с последующими одной или несколькими промывками в 1Х 88С, 0,1% 8Ό8 при 50°С, предпочтительно при 55°С, предпочтительно при 60°С и даже предпочтительнее при 65°С.

Очень строгие условия включают, например, гибридизацию при 68°С в 5Х 88С/5Х растворе Денхардта/1,0% 8Ό8 и промывку в 0,2Х 88С/0,1% 8Ό8 при комнатной температуре. С другой стороны, промывку можно осуществлять при 42°С.

Специалисту в данной области техники будет известно, какие условия применить в случае строгих и очень строгих условий гибридизации. Другие указания, касающиеся таких условий, легко доступны в технике, например в 8атЬгоок е! а1., 1989, Мо1еси1аг С1ошпд, А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог Ргекк, Ν.Υ. и в АикиЬе1 е! а1. (ебк.), 1995, Сиггеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду (1ойп \УПеу & 8опк, Ν.Υ.).

Конечно, полинуклеотид, который гибридизирует только с поли-А-последовательностью (такой как 3'-концевой участок поли(А) мРНК) или с комплементарным участком остатков Т (или и), не включается в полинуклеотид по изобретению, используемый для специфической гибридизации с частью нуклеиновой кислоты по изобретению, так как такой полинуклеотид может гибридизировать с любой молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей участок поли(А) или его комплемент (например, практически любой клон двухцепочечной кДНК).

Получение полноразмерной ДНК из других организмов.

При типичном подходе можно подвергать скринингу библиотеки кДНК, сконструированные из других микроорганизмов, например мицелиальных грибов, в частности, из вида АкрегдШик.

Например, штаммы АкрегдШик можно подвергать скринингу на гомологичные полинуклеотиды АМГО01-11 методом нозерн-блоттинга. После детекции транскриптов, гомологичных полинуклеотидам по изобретению, библиотеки кДНК можно конструировать из РНК, выделенной из соответствующего штамма, с использованием стандартных методов, хорошо известных специалистам в данной области техники. С другой стороны, полную библиотеку геномных ДНК можно подвергать скринингу с использованием зонда, способного к гибридизации с полинуклеотидом АМШ01-11 по изобретению.

Гомологичные последовательности генов можно выделить, например, осуществляя ПЦР с использованием двух наборов вырожденных олигонуклеотидных праймеров, созданных на основе нуклеотидных последовательностей, описанных в данном описании.

- 11 014853

Матрица для реакции может представлять собой кДНК, полученную обратной транскрипцией мРНК, полученной из штаммов, о которых известно или предполагается, что они экспрессируют полинуклеотид по изобретению. Продукт ПЦР можно субклонировать и секвенировать для того, чтобы гарантировать, что амплифицированные последовательности представляют последовательности новой нуклеотидной последовательности ΑΜΙΌ01-11 или ее функционального эквивалента.

Затем фрагмент ПЦР можно использовать для выделения клона полноразмерной кДНК различными известными способами. Например, амплифицированный фрагмент можно пометить и использовать для скрининга бактериофаговой или космидной библиотеки кДНК. С другой стороны, меченый фрагмент можно использовать для скрининга геномной библиотеки.

Технологию ПЦР также можно использовать для выделения последовательностей полноразмерных кДНК из других микроорганизмов. Например, РНК можно выделить, следуя стандартным процедурам, из соответствующего источника клеток или ткани. Реакцию обратной транскрипции можно осуществить на РНК с использованием олигонуклеотидного праймера, специфичного для наибольшего 5'-конца амплифицированного фрагмента для премирования синтеза первой цепи.

Затем полученный гибрид РНК/ДНК можно нарастить (1аПеб) (например, гуанинами) с использованием стандартной реакции с терминальной трансферазой, гибрид можно расщепить РНКазой Н и затем можно начать синтез второй цепи с помощью затравки (например, поли-С-праймером). Таким образом, можно легко выделить последовательности кДНК в обратном направлении от амплифицированного фрагмента. Для общего представления о применимых стратегиях клонирования см., например, 8атЬтоок е! а1., цит. выше; и Ли8иЬе1 е! а1., цит. выше.

Кодирует или нет гомологичный фрагмент ДНК функциональный белок ΆΜΙΌ01-11 можно легко проверить способами, известными в технике.

Векторы.

Другой аспект изобретения относится к векторам, предпочтительно экспрессирующим векторам, содержащим нуклеотидную последовательность, описанную выше, кодирующую белок ΆΜΙΌ01-11 или его функциональный эквивалент. Используемый в данном описании термин вектор относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединена. Одним типом вектора является плазмида, которая относится к кольцеобразной петле двухцепочечной ДНК, в которую могут быть легированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, где дополнительные сегменты ДНК могут быть легированы в геном вируса. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный ориджин репликации, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) интегрируют в геном клетки-хозяина после введения в клетку-хозяина и посредством этого реплицируют вместе с геномом хозяина. Кроме того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они оперативно соединены. Такие векторы в данном описании отнесены к экспрессирующим векторам. Вообще, экспрессирующие векторы для применения в методах рекомбинантных ДНК часто находятся в форме плазмид. Термины плазмида и вектор в данном описании можно использовать как взаимозаменяемые, так как плазмида является наиболее часто используемой формой вектора. Однако предполагается, что изобретение включает также другие формы экспрессирующих векторов, такие как вирусные векторы (например, ретровирусы с нарушенной репликацией, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые служат эквивалентным функциям.

Рекомбинантные экспрессирующие векторы по изобретению могут содержать нуклеиновую кислоту по изобретению в форме, подходящей для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Рекомбинантный экспрессирующий вектор может, например, включать одну или несколько регуляторных последовательностей, выбранных на основе клеток-хозяев, используемых для экспрессии, которые оперативно соединены с экспрессируемой нуклеотидной последовательностью. Вектор по изобретению предпочтительно содержит последовательность полинуклеотида по изобретению, оперативно соединенную с регуляторными последовательностями, подходящими для экспрессии указанной последовательности полинуклеотида в подходящей клетке-хозяине. Для рекомбинантного экспрессирующего вектора оперативно соединенный означает, что представляющая интерес нуклеотидная последовательность соединена с регуляторной(ыми) последовательностью(ями) способом, который допускает экспрессию нуклеотидной последовательности (например, в системе транскрипция/трансляция ίη νίΐτο или в клетке-хозяине, когда вектор введен в клетку-хозяина). Предполагается, что термин регуляторная последовательность включает промоторы, энхансеры и другие регулирующие элементы экспрессии (например, сигнал полиаденилирования). Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Соеббе1; Оепе Ехртекыоп Тее11по1оду: МеЙюЛ ίη Епхуто1оду. 185, Леабет1е Рге§8, 8ап О1едо, СА (1990). Регуляторные последовательности включают последовательности, которые управляют конститутивной экспрессией нуклеотидной последовательности во многих типах клеток-хозяев, и последовательности, которые управляют экспрессией нуклеотидной последовательности только в определенной клетке-хозяине (например, тканеспецифические регуляторные последовательности). Специалистам в данной области техники следует иметь в виду, что конструкция экспрессирующего вектора может зависеть от таких факто

- 12 014853 ров, как выбор клетки-хозяина, которую трансформируют, желательный уровень экспрессии белка и т.д. Экспрессирующие векторы по изобретению можно вводить в клетки-хозяев для получения посредством этого белков или пептидов, кодированных нуклеиновыми кислотами, описанными в данном описании (например, белков ΑΜΙΌ01-11, мутантных форм белков ΑΜΙΌ01-11, их фрагментов, вариантов или функциональных эквивалентов и т.д.).

Рекомбинантные экспрессирующие векторы по изобретению можно конструировать для экспрессии белков ΆΜΙΌ01-11 в клетках прокариотов или эукариотов. Например, белки ΆΜΙΌ01-11 можно экспрессировать в бактериальных клетках, таких как клетки Е.соН, клетках насекомых (с использованием бакуловирусных экспрессирующих векторов), дрожжевых клетках, клетках грибов или клетках млекопитающих. Подходящие клетки-хозяева также описаны в Сосббс1. Сепе ЕхргекДоп Тсе1то1оду: МеШойк ίη Епхуто1оду. 185, Асайетк Ргекк, Зап О1едо, СА (1990). С другой стороны, рекомбинантный экспрессирующий вектор можно транскрибировать и транслировать ίη уйго, например, с использованием промоторных регуляторных последовательностей Т7 и Т7-полимеразы.

Экспрессирующие векторы, применимые в настоящем изобретении, включают векторы, имеющие хромосомное, эписомное и вирусное происхождение, например векторы, полученные из бактериальных плазмид, бактериофагов, мицелиальных грибов, дрожжевой эписомы, хромосомных элементов дрожжей, вирусов, таких как бакуловирусы, папиловирусы, вирусы осповакцины, аденовирусы, вирусы оспы птиц, вирусы псевдобешенства и ретровирусы, и векторы, полученные их сочетанием, такие как векторы, полученные из плазмиды и генетических элементов бактериофагов, такие как космиды и фагемиды.

Вставка ДНК должна быть оперативно соединена с соответствующим промотором, таким как фаговый промотор лямбда-РЬ, Е.соН 1ас, промоторы Стр и 1ас, ранний и поздний промоторы ЗУ40 и промоторы ретровирусных ЬТВ нескольких названий. Другие подходящие промоторы будут известны специалистам. В специфическом воплощении предпочтительными являются промоторы, которые способны управлять высоким уровнем экспрессии аспарагиназ в мицелиальных грибах. Такие промоторы известны в технике. Экспрессирующие конструкции могут содержать сайты инициации транскрипции, терминации и в транскрибируемой области - сайт связывания рибосом для трансляции. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессированных конструкциями, будет включать инициирующий трансляцию АИС в начале и терминирующий кодон соответственно, расположенный в конце транслируемого полипептида.

Векторную ДНК можно ввести в прокариотные и эукариотные клетки обычными методами трансформации или трансфекции. Предполагается, что используемые в данном описании термины трансформация и трансфекция относятся к разнообразным известным в технике методам введения чужеродной нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетку-хозяина, включая копреципитацию фосфатом кальция или хлоридом кальция, трансфекцию, опосредуемую ΌΕΑΕ-декстраном, трансдукцию, заражение, липофекцию, катионную липид-опосредованную трансфекцию или электропорацию. Подходящие способы трансформации или трансфекции клеток-хозяев можно найти в ЗатЬгоок е1 а1. (Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, 2'¹ ей., Со1й Зрппд НагЬог ЬаЬога1огу, Со1й Зрппд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк, Со1й Зрппд НагЬог, ΝΥ, 1989); ЭауЕ е1 а1., ВаДс МеИойк т Мо1еси1аг Вю1оду (1986) и других лабораторных руководствах.

В случае устойчивой трансфекции клеток млекопитающих известно, что в зависимости от экспрессирующего вектора и используемого метода трансфекции только небольшую часть чужеродной ДНК можно интегрировать в их геном. Для того чтобы идентифицировать и выбрать указанные компоненты, как правило, в клетку-хозяина вместе с геном, представляющим интерес, вводят ген, который кодирует селективный маркер (например, устойчивость к антибиотикам). Предпочтительные селективные маркеры включают маркеры, которые придают устойчивость к лекарственным средствам, таким как С418, гигромицин и метотрексат. Нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер, можно ввести в клеткухозяина с тем же вектором, который кодирует белок ΑΜΙΌ01-11, или можно ввести с отдельным вектором. Клетки, устойчиво трансфицированные введенной нуклеиновой кислотой, можно идентифицировать путем отбора на лекарственное средство (например, клетки, которые имеют введенный ген селективного маркера, будут выживать, в то время как другие клетки погибают).

Экспрессию белков в прокариотах часто осуществляют в векторах Е.соН, содержащих конститутивные или индуцибельные промоторы, управляющие экспрессией белков.

Как указывалось, экспрессирующие векторы будут предпочтительно содержать селективные маркеры. Такие маркеры включают устойчивость к дигидрофолатредуктазе или неомицину в случае эукариотной клеточной культуры и устойчивость к тетрациклину или ампициллину в случае культивирования Е.сой и других бактерий. Характерные примеры соответствующего хозяина включают бактериальные клетки, такие как клетки Е.соН, ЗйерЮтусек и За1топе11а (урЫпшпит; клетки грибов, таких как дрожжи; клетки насекомых, таких как З2 дрозофилы и З19 совки; клетки животных, такие как СНО, СОЗ и меланомы Вотек; и растительные клетки. Соответствующие среды и условия культивирования вышеописанных клеток-хозяев известны в технике.

- 13 014853

К числу векторов, предпочтительных для применения в бактериях, относятся рОЕ70, рОЕ60 и РОЕ-9, доступные от О1адеп; векторы рВЗ, векторы Рйадекспр!, векторы В1ие8спр!, ρΝΗ8Α, ρΝΗ16Α, ρΝΗ18Α, ρΝΗ46Α, доступные от З!га!адепе; и р!гс99а, рКК223-3, рКК233-3, ρΌΚ.540, рВ1Т5, доступные от РНагтааа. К числу предпочтительных эукариотических векторов относятся ΡΧΥΕΝΕΘ, ρδν2ΟΑΤ, ρΟΟ44, ρΖΤ1 и рЗО, доступные от З!га!адепе; и рЗУКЗ, ρΒΡν, рМЗО и рЗУЪ, доступные от РНагтааа. Другие подходящие векторы будут явно очевидны для специалиста.

К числу известных бактериальных промоторов для применения в настоящем изобретении относятся промоторы 1ас1 и ΕκΖ Е.сой, промоторы Т3 и Т7, промотор др!, промоторы лямбда-РВ, РЬ и промотор !тр, промотор тимидинкиназы Η3ν, ранний и поздний промоторы 3ν40, промоторы ретровирусных ЬТВ, таких как ЬТВ вируса саркомы Рауса (ВЗУ'), и металлотионеиновые промоторы, такие как промотор мышиного металлотионеина-1.

Транскрипцию ДНК, кодирующей полипептиды по настоящему изобретению, высшими эукариотами можно усилить встраиванием в вектор энхансерной последовательности. Энхансеры представляют собой цис-действующие элементы ДНК, как правило примерно от 10 до 300 п.о., которые действуют, усиливая транскрипционную активность промотора в клетке-хозяине данного типа. Примеры энхансеров включают энхансер ЗУ40, который располагается на поздней стороне ориджина репликации в п.о. 100270, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на поздней стороне ориджина репликации и аденовирусные энхансеры.

Для секреции транслированного белка в просвет эндоплазматического ретикулума, в периплазматическое пространство или во внеклеточную среду в экспрессируемый полипептид можно ввести соответствующий сигнал секреции. Сигналы могут быть эндогенными для полипептида или они могут являться гетерологичными сигналами.

Полипептид можно экспрессировать в модифицированной форме и можно включать не только сигналы секреции, но также другие гетерологичные функциональные области. Так, например, область других аминокислот, в частности заряженных аминокислот, можно присоединить к Ν-концу полипептида для улучшения устойчивости и персистенции в клетке-хозяине во время очистки или во время последующей работы и хранения. Также к полипептиду можно присоединить пептидные группы для облегчения очистки.

Полипептиды по изобретению.

Изобретение относится к изолированному полипептиду с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей согласно ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 23-33, аминокислотной последовательности, которую можно получить экспрессией соответственно полинуклеотида ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 1-11 в соответствующем хозяине или получить экспрессией соответственно полинуклеотида ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 12-22 в соответствующем хозяине. Также пептид или полипептид, содержащий функциональный эквивалент вышеуказанных полипептидов, является составной частью настоящего изобретения. Все вышеуказанные полипептиды охватываются термином полипептиды по изобретению.

Термины пептид и олигопептид считаются синонимами (как общепринято), и каждый термин можно использовать как взаимозаменяемый, когда в контексте требуется указать цепь по меньшей мере из двух аминокислот, соединенных пептидными связями. Слово полипептид используется в данном описании в случае цепей, содержащих больше семи аминокислотных остатков. Все формулы или последовательности олигопептидов и полипептидов в данном описании пишутся слева направо и в направлении от аминоконца к карбоксиконцу. Однобуквенный код аминокислот, используемый в данном описании, широко известен в технике, и его можно найти в ЗатЬтоок е! а1. (Мо1еси1аг С1ошпд: Α ЬаЬота!огу Мапиа1, 2'¹ ей., Со1й Зрттд НагЬог ЬаЬота!оту, Со1й Зрттд НагЬог ЬаЬота!оту Ргекк, Со1й Зрттд НагЬог, ΝΥ, 1989).

Под изолированным полипептидом или белком предполагается полипептид или белок, удаленный из его естественного окружения. Например, рекомбинантно полученные полипептиды и белки, экспрессированные в клетках-хозяевах, считаются изолированными для цели изобретения, так как являются нативными или рекомбинантными полипептидами, которые, по существу, очищены любым подходящим методом, таким как, например, метод одностадийной очистки, описанный в 3ιηί11ι апй 1ойп8оп, Оепе, 67: 31-40 (1988).

Амидазу ΑΜΙΌ01-11 по изобретению можно извлечь и очистить из рекомбинантных клеточных культур хорошо известными способами, включая осаждение сульфатом аммония или этанолом, кислотную экстракцию, анион- или катионобменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксилапатите и хроматографию на лектине. Наиболее предпочтительно использовать для очистки высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ).

Полипептиды по настоящему изобретению включают очищенные продукты природного происхождения, продукты процедур химического синтеза и продукты, полученные рекомбинантными методами из прокариотного или эукариотного хозяина, включая, например, бактериальные, дрожжевые клетки, клетки высших растений, насекомых и млекопитающих. В зависимости от хозяина, использованного в рекомбинантной процедуре получения, полипептиды по настоящему изобретению могут быть гликозили

- 14 014853 рованными или могут быть негликозилированными. Кроме того, полипептиды по изобретению в некоторых случаях также могут включать начальный модифицированный метиониновый остаток в результате процессов, опосредуемых хозяином.

Фрагменты белков.

Изобретение также относится к биологически активным фрагментам полипептидов по изобретению.

Биологически активные фрагменты полипептидов по изобретению включают полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности, достаточно идентичные или образованные от аминокислотной последовательности белка АМГО01-11 (например, аминокислотной последовательности, соответственно выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ГО ЫО:23-33), которые включают меньше аминокислот, чем полноразмерный белок, и обнаруживают по меньшей мере одну биологическую активность соответствующего полноразмерного белка. Типично биологически активные фрагменты содержат домен или мотив по меньшей мере с одной активностью белка ЛМГО01-11.

Биологически активный фрагмент белка по изобретению может представлять собой полипептид, который, например, имеет 10, 25, 50, 100 или больше аминокислот в длину. Кроме того, можно получить рекомбинантными методами другие биологически активные белки, в которых делетированы другие области, и они эквивалентны одной или нескольким биологическим активностям нативной формы полипептида по изобретению.

Изобретение также относится к фрагментам нуклеиновой кислоты, которые кодируют вышеуказанные биологически активные фрагменты белка ЛМГО01-11.

Функциональные эквиваленты.

Термины функциональные эквиваленты и функциональные варианты используются в данном описании как взаимозаменяемые. Функциональные эквиваленты ДНК ЛМГО01-11 представляют собой фрагменты ДНК, кодирующие полипептид, который обнаруживает отдельную функцию амидазы ЛМГО01-11 А. гиде г, определенной в данном описании. Функциональный эквивалент полипептида АМГО01-11 по изобретению представляет собой полипептид, который обнаруживает отдельную функцию амидазы АМГО01-11 А.шдег, определенной в данном описании. Его функциональные эквиваленты также включают биологически активные фрагменты.

Функциональные эквиваленты белка или полипептида могут содержать только консервативные замены одной или нескольких аминокислот, выбранных из группы, состоящей из 8ЕО ГО ЫО: 23-33, или замены, вставки или делеции несущественных аминокислот. Соответственно несущественной аминокислотой является остаток, который можно заменить в аминокислоте, выбранной из группы, состоящей из 5>ЕО ГО ЫО: 23-33, без существенного изменения биологической функции. Например, предсказывают аминокислотные остатки, которые являются консервативными в белках АМГО01-11 по настоящему изобретению, особенно не поддающиеся изменению. Более того, аминокислотные остатки, консервативные в белках АМГО01-11 по настоящему изобретению и других амидазах, вероятно, не подлежат изменению.

Термин консервативная замена предназначен для обозначения замены, при которой аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток со схожей боковой цепью. Такие семейства известны в технике и включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин и гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагины, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), боковыми бета-ответвлениями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).

Функциональные эквиваленты нуклеиновых кислот типично могут содержать молчащие мутации или мутации, которые не изменяют биологической функции кодированного полипептида. Соответственно изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим белки АМГО01-11, содержащим изменения в аминокислотных остатках, которые несущественны для определенной биологической активности. Такие белки АМГО01-11 различаются в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕО ГО ЫО: 23-33, все еще сохраняют по меньшей мере одну биологическую активность. В одном воплощении изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, где белок содержит, по существу, гомологичную аминокислотную последовательность, по меньшей мере примерно на 40, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8ЕО ГО ЫО: 23-33.

Например, руководство, касающееся того, как осуществить фенотипически молчащие аминокислотные замены, приводится в Во\\зе ЕЙ. е! а1., 8с1епсе, 247: 1306-1310 (1990), где авторы указывают, что существует два основных подхода для исследования толерантности аминокислотной последовательности к замене. Первый способ основан на процессе эволюции, при котором мутации или принимаются, или отторгаются естественным отбором. Во втором подходе используют генную инженерию для внедрения аминокислотных замен в определенные позиции клонированного гена и отбор или скрининг для идентификации последовательностей, которые сохраняют функциональность. Как утверждают авторы, такие

- 15 014853 исследования показывают, что белки являются неожиданно толерантными в отношении замен аминокислот. Авторы также показывают, что, вероятно, замены разрешаются в определенной позиции белка. Например, наиболее погруженные аминокислотные остатки требуют неполярные боковые цепи, в то время как некоторые особенности поверхностных боковых цепей, как правило, имеют консервативный характер. Другие такие фенотипически молчащие замены описаны в Βο\νίο с1 а1., цит. выше, и ссылках, цитированных в указанной работе.

Изолированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок ΆΜΙΌ01-11, гомологичный белку, соответствующему любому белку, выбранному из группы, состоящей из 8ЕО Ш N0: 23-33, можно создать введением одной или нескольких нуклеотидных замен, добавлений или делеций в кодирующие нуклеотидные последовательности, выбранные из группы, состоящей из 8Е0 Ш N0: 1-11, или выбранные из группы, состоящей из 8Е0 Ш N0: 12-22, таких, что одна или несколько аминокислотных замен, делеций или вставок вводятся в кодированный белок. Такие мутации можно вводить стандартными методами, такими как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез.

Термин функциональные эквиваленты также охватывает ортологи белка ΛΜΙΌ01-11 А.шдег. Ортологи белка ЛМШ01-11 А.шдег представляют собой белки, которые можно выделить из других штаммов или видов и которые обладают подобной или идентичной биологической активностью. Такие ортологи можно легко идентифицировать как содержащие аминокислотную последовательность, которая, по существу, гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕО ГО N0: 23-33.

Как определено в данном описании, термин по существу, гомологичная относится к первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности, которая содержит достаточное или минимальное число аминокислот или нуклеотидов, идентичных или эквивалентных (например, с подобными боковыми цепями) второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности, так что первая и вторая аминокислотные или нуклеотидные последовательности имеют общий домен. Например, аминокислотные или нуклеотидные последовательности, содержащие общий домен, имеющие примерно 40%, предпочтительно 65%, предпочтительнее 70%, еще предпочтительнее 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность или более, в данном описании определяются как, по существу, идентичные.

Также нуклеиновые кислоты, кодирующие членов семейства АМГО01-11, которые, таким образом, имеют нуклеотидную последовательность, отличающуюся от группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 1-11, или группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 12-22, входят в объем изобретения. Кроме того, нуклеиновые кислоты, кодирующие белки АМГО01-11 из различных видов, которые, таким образом, имеют нуклеотидную последовательность, отличающуюся от группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 1-11, или группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 12-22, входят в объем изобретения.

Молекулы нуклеиновой кислоты, соответствующие вариантам (например, природным аллельным вариантам) и гомологам ДНК АМГО01-11 по изобретению, можно выделить на основе их гомологии с нуклеиновыми кислотами АМГО01-11, раскрытыми в данном описании, с использованием кДНК, раскрытых в данном описании, или их подходящих фрагментов в качестве зонда гибридизации согласно стандартным методам гибридизации, предпочтительно в очень строгих условиях гибридизации.

Кроме встречающихся в природе аллельных вариантов последовательности АМГО01-11, специалисту будет известно, что мутацией можно ввести замены в нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 1-11, или из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0: 12-22, что приводит к заменам в аминокислотной последовательности белка АМГО01-11, по существу, без изменения функции белка АМГО01-11.

В другом аспекте изобретение относится к улучшенным белкам АМГО01-11. Улучшенные белки АМГО01-11 представляют собой белки, в которых по меньшей мере одна биологическая активность улучшена. Такие белки можно получить произвольным введением мутаций во всю колирующую последовательность АМГО01-11 или ее часть, например насыщающим мутагенезом, и полученные мутанты можно рекомбинантно экспрессировать и скринировать на биологическую активность. Например, в технике имеются стандартные анализы для измерения ферментативной активности амидаз, и таким образом можно легко отобрать улучшенные белки.

В предпочтительном воплощении белок АМГО01-11 имеет аминокислотную последовательность, соответствующую 8Е0 ГО N0: 3. В другом воплощении полипептид АМГО01-11, по существу, гомологичен аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 1-11, или из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 23-33, и сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность полипептида, выбранного из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 23-33, хотя отличается по аминокислотной последовательности из-за природной вариации или мутагенеза, описанных выше.

В другом предпочтительном воплощении белок АМГО01-11 имеет аминокислотную последовательность, кодированную фрагментом выделенной нуклеиновой кислоты, способным к гибридизации с нуклеиновой кислотой, выбранной соответственно из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 1-11, или из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 12-22, предпочтительно в очень строгих условиях гибридизации.

- 16 014853

Соответственно белок АМГО01-11 представляет собой белок, содержащий аминокислотную последовательность, на 40, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, выбранной соответственно из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ N0: 23-33, и сохраняет по меньшей мере одну функциональную активность полипептида, выбранного из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ N0: 23-33.

Функциональные эквиваленты белка по изобретению также можно идентифицировать, например, скринингом комбинаторных библиотек мутантов, например укороченных мутантов, белка по изобретению на аспарагиназную активность. В одном воплощении смешанную библиотеку вариантов получают комбинаторным мутагенезом на уровне нуклеиновой кислоты. Смешанную библиотеку вариантов можно получить, например, ферментативным легированием смеси синтетических олигонуклеотидов в последовательности генов, так что вырожденный набор потенциальных последовательностей белка можно экспрессировать в виде отдельных полипептидов. Существует множество способов, которые можно использовать для получения библиотек потенциальных вариантов полипептидов по изобретению из вырожденной олигонуклеотидной последовательности. Способы синтеза вырожденных олигонуклеотидов известны в технике (см., например, №1гапд (1983), Те1гайебгои, 39: 3; Иакига е1 а1. (1984), Лили. Кеу. Вюсйет., 53: 323; Пакига е1 а1. (1984), 8с1еисе, 198: 1056; 1ке е1 а1. (1983), №с1ек Аск1 Кез., 11: 477).

Кроме того, можно использовать библиотеки фрагментов кодирующей последовательности полипептида по изобретению для получения мозаичной популяции полипептидов для скрининга и последующего отбора вариантов. Например, библиотеку фрагментов кодирующей последовательности можно получить обработкой двухцепочечного фрагмента ПЦР кодирующей последовательности, представляющей интерес, нуклеазой в условиях, в которых однонитевой разрыв имеет место только примерно один раз на молекулу, денатурацией двухцепочечной ДНК, ренатурацией ДНК с образованием двухцепочечной ДНК, которая может включать смысловые/антисмысловые пары из различных продуктов разрыва, удалением одноцепочечных частей из реформированных дуплексов обработкой нуклеазой 81 и легированием полученной библиотеки фрагментов в экспрессирующий вектор. Таким способом можно получить экспрессирующую библиотеку, которая кодирует различные размеры ^концевые и внутренние фрагменты белка, представляющего интерес.

В технике известны некоторые методы скрининга генных продуктов комбинаторных библиотек, полученных точечными мутациями отсечения, и скрининга библиотек кДНК на генные продукты с выбранным свойством. Наиболее широко используемые методы скрининга больших библиотек генов, которые соответствуют высокопроизводительному анализу, включают клонирование библиотеки генов в реплицируемые экспрессирующие векторы, трансформацию соответствующих клеток полученной библиотекой векторов и экспрессию комбинаторных генов в условиях, в которых детекция нужной активности облегчает выделение вектора, кодирующего ген, продукт которого детектирован. В сочетании со скрининг-анализами для идентификации вариантов белка по изобретению можно использовать рекурсивный множественный мутагенез (Кесилауе еизетЫе ти1адеие818, КЕМ) - метод, который усиливает частоту появления функциональных мутантов в библиотеках (Агкт аиб Уошуаи (1992), Ргос. №6. Асаб. 8ск И8А, 89: 7811-7815; Ие1дгауе е1 а1. (1993), Рго!еш Еидшеегтд, 6(3): 327-331).

Кроме последовательности гена АМГО01-11, соответственно представленной в 8Е0 ΙΌ N0: 1-11, для специалиста в данной области техники будет очевидно, что в данной популяции могут существовать полиморфизмы последовательности ДНК, которые могут привести к изменениям в аминокислотной последовательности белка АМГО01-11. Такие геномные полиморфизмы могут существовать в клетках из различных популяций или внутри популяции из-за природной аллельной вариации. Аллельные варианты также могут включать функциональные эквиваленты.

Фрагменты полинуклеотида по изобретению также могут содержать полинуклеотиды, некодирующие функциональные полипептиды. Такие полинуклеотиды могут функционировать как зонды или праймеры для ПЦР-реакции.

Нуклеиновые кислоты по изобретению, независимо от того, кодируют ли они функциональные или нефункциональные полипептиды, можно использовать в качестве зондов гибридизации или праймеров полимеразной цепной реакции (ПЦР). Применения молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, которые не кодируют полипептид с активностью АМГО01-11, включают, среди прочего, (1) выделение гена, кодирующего белок АМГО01-11, или его аллельных вариантов из библиотеки кДНК, например, из иных, чем А.шдег, организмов; (2) гибридизацию ίη 41и (например, ΕΙ8Η) с метафазными хромосомными пластинками для получения точного местоположения в хромосоме гена АМГО01-11, как описано в Уегта е1 а1., Нитаи Сйготозотез: а Маииа1 о£ Ва4с Тесйшдцез, Регдатои Ргезз, №\ν Уогк (1988); (3) нозерн блотт-анализ для детекции экспрессии мРНК АМГО01-11 в определенных тканях и/или клетках и (4) зонды и праймеры, которые можно использовать в качестве диагностического инструмента для анализа наличия нуклеиновой кислоты, поддающейся гибридизации с зондом АМГО01-11 в данном биологическом образце (например, ткани).

- 17 014853

Изобретение также охватывает способ получения функционального эквивалента гена или кДНК ΆΜΙΌ01-11. Такой способ влечет за собой получение меченого зонда, который включает изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую всю последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕР ΙΌ N0: 23-33, или ее часть, или ее вариант; скрининг библиотеки фрагментов нуклеиновой кислоты меченым зондом в условиях, которые допускают гибридизацию зонда с фрагментами нуклеиновой кислоты в библиотеке, причем посредством этого образуются дуплексы нуклеиновой кислоты, и получение полноразмерной последовательности гена из фрагментов нуклеиновой кислоты в любом меченом дуплексе с получением гена, родственного гену ΆΜΙΌ01-11.

В одном воплощении нуклеиновая кислота ΆΜΙΌ01-11 по изобретению по меньшей мере на 40, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологична нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8 Ер ΙΌ N0: 1-11, или из группы, состоящей из 8ЕР ΙΌ N0: 12-22, или комплемента любой из них.

В другом предпочтительном воплощении полипептид ΆΜΙΌ01-11 по изобретению по меньшей мере на 40, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичен аминокислотной последовательности, показанной в последовательности пептида, выбранной из группы, состоящей из 8Ер ΙΌ N0: 23-33.

Клетки-хозяева.

В другом воплощении изобретение относится к клеткам, например трансформированным клеткамхозяевам или рекомбинантным клеткам-хозяевам, которые содержат нуклеиновую кислоту по изобретению. Трансформированная клетка или рекомбинантная клетка представляет собой клетку, в которую (или в предшественника которой) методами рекомбинантных ДНК введена нуклеиновая кислота по изобретению. Включены как прокариотические, так и эукариотические клетки, например, бактерий, грибов, дрожжей и т.п., особенно предпочтительными являются клетки из мицелиальных грибов, в частности ЛкрегдШш шдег.

Можно выбрать клетку-хозяина, которая модулирует экспрессию представляющих интерес последовательностей или модифицирует и процессирует продукт гена специфичным желательным образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессинг (например, расщепление) белковых продуктов могут облегчить оптимальное функционирование белка.

Различные клетки-хозяева имеют характерные и специфические механизмы для посттрансляционного процессинга и модификации белков и продуктов генов. Соответствующие клеточные линии или хозяйские системы, известные специалистам в области молекулярной биологии и/или микробиологии, можно выбрать для того, чтобы гарантировать желательную и правильную модификацию и процессинг чужеродного экспрессируемого белка. С этой целью можно использовать эукариотические клеткихозяева, которые обладают клеточным механизмом для надлежащего процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования продукта гена. Такие клетки-хозяева хорошо известны в технике.

Клетки-хозяева также включают клеточные линии млекопитающих, такие как СНО, УЕК0, ВНК, НеЬа, С08, ΜΌ0Κ, 293, 3Т3, ^Ι38 и другие, и клеточные линии сосудистого сплетения.

При необходимости полипептиды по изобретению можно получить с помощью устойчиво трансфицированной клеточной линии. Ряд векторов, подходящих для устойчивой трансфекции клеток млекопитающих, широко доступен, способы конструирования таких клеточных линий также широко известны, например, из Ли8иЬе1 е1 а1. (цит. выше).

В другом аспекте изобретение относится к пищевым продуктам, которые можно получить способом по изобретению, описанным в данном описании ранее, или с применением новой аспарагиназы, описанной в данном описании, для получения пищевых продуктов. Такие пищевые продукты характеризуются существенно пониженными уровнями акриламида по сравнению с пищевыми продуктами, полученными способами получения, которые не включают добавление одного или нескольких ферментов в количестве, которое эффективно для снижения уровня аминокислот, которые участвуют в образовании акриламида во время стадии термической обработки. Способ по изобретению можно использовать для достижения уменьшения содержания акриламида в полученном пищевом продукте предпочтительно более чем на 50%, предпочтительнее более чем на 75%, даже предпочтительнее более чем на 80% и наиболее предпочтительно более чем на 90% по сравнению с пищевым продуктом, полученным обычным способом.

Пример 1. Клонирование ферментов амидаз.

Используют два типа конструкций. Первый тип содержит стандартный селективный маркер атб8, который допускает прямую селекцию трансформированных штаммов на селективном субстрате ацетамиде. Это вполне подходит для секретируемых амидаз, но в случае внутриклеточных ферментов такой тип имеет такой недостаток, что будет иметься фоновая активность маркерной ацетамидазы. Поэтому для ряда амидаз, которые, как предполагается, являются внутриклеточными, применяют второй тип конструкции с использованием безмаркерной конструкции, вводимой котрансформацией со вторым вектором, содержащим маркер устойчивости к флеомицину.

- 18 014853

Выделение генов.

1. Пустая кассета как фон/отрицательный контроль.

2. Ацетамидаза атб8 А шдег (8Е0 Ш N0: 11).

3. Ацетамидаза ат48 Е.шби1апк.

4. Новые амидазы, см. табл. 1.

Таблица 1

Новые амидазы по изобретению из АкрегдШик шдег

Код фермента в описании	Код фермента в примерах	8Ε<2 ГО ДНК	8Εζ> ГО кДНК	8Ε0 ГО белка
АМГО01	ΖΟΚ	1	12	23
АМГО02	ААО	2	13	24
АМГООЗ	ААА	3	14	25
АМГО04	7.ΠΝ	4	15	26
АМГО05	ЛАЕ	5	16	27
АМЮ06	ΖϋΜ	6	17	28
АМГО07	ΖϋΕ	7	18	29
АМГО08	ΖΠ1	8	19	30
АМШ09	ААС	9	20	31
АМШ10	7.00	10	21	32
АМГО11	Ατηάδ	11	22	33

ДНК и предсказанные аминокислотные последовательности указанных генов приводятся в перечне последовательностей в конце данного документа и обозначаются, как указано выше.

Олигонуклеотидные праймеры создают для амплификации гена, кодирующего ген, представляющий интерес, из генома А.шдег СВ8513.88. Как указано ранее, праймеры, подходящие для поиска генов по изобретению, можно получить так, как известно специалисту в данной области техники. Табл. 2 показывает нуклеотидные последовательности олигонуклеотидных праймеров, которые используют для амплификации некоторых генов амидаз по изобретению.

Таблица 2

Последовательности праймеров

Ген	Верхний праймер	Нижний праймер
ΖΓλΤ	5 ’СССТТААТТААСТС АТАО6САТС АТООАСОА СААОССТСА6ТТСТТЗ' (8Е0 ГО N0: 34)	5'ТТАО(ЗСОСОССААТТАСА(ЗТОАС САСАААТСССЗ' (8Е0 ГО N0: 35)
ΖΙ)ί	5'СССТТААТТААСТСАТАСОСАТСАТООСТСОТ АТСОАТТТСТССЗ' (8ЕО Ш N0: 36)	5'ТТАООСОСОССОАОАССОАСТАО СССОТОААЗ' (8ЕО ГО ΝΟ: 37)
7Г)М	5 'СССТТААТТААСТС АТАСЮСАТС АТОТСООТА ТТОТТСАСТТСТАТЗ' (8Е0 ГО ΝΟ: 38)	5ТТАООСОСОССОСАТОССОТССА АОТТАСССЗ' ГЗЕр ГО N0:39)
ΖΟΟ	5'СССТТААТТААСТСАТАСССАТСАТССТС СССОСТАСССААСТЗ' (8Е0 Ю ΝΟ: 40)	5ТТАООСОСОСССОТСАААТАССА АТСОТАТОТСЗ' (ЗЕО ГО N0: 41)

Структура указанных олигонуклеотидных праймеров схожа для всех генов, которые амплифицировали.

В 5'-конце верхнего праймера располагается сайт рестрикции Рас1 для облегчения процедуры клонирования. В середине к стартовому кодону добавляют линкер. Конец 3' верхнего праймера комплементарен 5'-концу гена, представляющего интерес, включая стартовый кодон АТС. Структура всех верхних праймеров 5'-СССТТААТТААСТСАТАСССАТСАТС-ген-специфическая последовательность-3', где стартовый кодон АТС подчеркнут.

В 5'-конце нижнего праймера располагается сайт рестрикции Акс1 для облегчения процедуры клонирования. Конец 3' нижнего праймера комплементарен перевернутой последовательности 3'-конца гена, представляющего интерес, находящейся приблизительно на 100 пар оснований по ходу транскрипции от стоп-кодона. Структура всех нижних праймеров 5'-ТТАСССССССС-ген-специфическая последовательность-3'.

Длина ген-специфической последовательности в праймерах составляет 20-25 нуклеотидов, в зависимости от содержания СС комплементарной части праймера.

Геномную ДНК выделяют из СВ8513.88 А.шдег согласно стандартной процедуре и используют в реакции ПЦР как с верхними, так и с нижними праймерами для амплификации гена, кодирующего амидазу, представляющую интерес. Специалисту в данной области техники будет известно, как оптимизировать условия ПЦР для каждого сочетания гена и праймера.

Фрагменты ПЦР клонируют в вектор рСВ2.1 (1пуйгодеп) и амплифицируют в Е.со11. После расщепления плазмиды Рас1 и Акс1 гены амидазы субклонируют в экспрессирующем векторе АкрегдШик.

Для генов ΖΌΚ и ΖΌΝ процедура отличается. Указанные гены выделяют из библиотеки кДНК АкрегдШик шдег, конструируют согласно методам, описанным в Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 8атЬгоок е! а1., Νον Уогк: Со1б 8рппд НагЬоиг Ргекк, 1989. После высокопроизводительного секвенирования 20000 клонов идентифицировали указанные гены как гомологи амидазы и отобрали их для экспрессии в А.шдег снова субклонированием в один из экспрессирующих векторов, описанных далее.

- 19 014853

В случаях, когда используют селективный маркер атб8, экспрессирующим вектором является рСВЕШ5 (\У0 9932617). Экспрессирующий вектор также расщепляют Рас1 и Азс1. Правильную ориентацию вставки в полученных плазмидах проверяют расщеплением подходящими рестриктазами и анализом последовательностей встроенного гена. Такая процедура клонирования размещает ген амидазы в прямом направлении промотора д1аА АзрегдШиз шдег и обратном направлении терминатора д1аА. Кроме того, в плазмиде присутствует ген атб8 АзрегдШиз шби1апз для удобного отбора в А.шдег (\У0 9846772). Структура таких экспрессирующих плазмид отображена на фиг. 1.

В случаях, когда используют маркер отбора по флеомицину, экспрессирующим вектором является рСВРЕЫСРР-2 (фиг. 2). Экспрессирующий вектор также расщепляют Рас1 и Азс1. Правильную ориентацию вставки в полученных плазмидах проверяют расщеплением подходящими рестриктазами и анализом последовательностей встроенного гена. Такая процедура клонирования заменяет ген СЕР в векторе рСВРЕЫСРР-2 на ген, представляющий интерес, и размещает ген амидазы в прямом направлении промотора §1аА АзрегдШиз шдег и обратном направлении терминатора §1аА, что приводит к рСВРЕЫААА-1 (фиг. 3). Кроме того, в данной плазмиде присутствует ген устойчивости к флеомицину для удобного отбора в А.шдег.

Сверхэкспрессия в АзрегдШиз шдег.

СВ8513.88 А.шдег используют в качестве хозяина для сверхэкспрессии гена аспартатпротеазы. Поэтому экспрессирующие векторы трансформируют в указанный гриб. Процедура трансформации подробно описана в \У0 9846772. Там также описано, как отбирать трансформанты и направленные многокопийные компоненты. Предпочтительно для получения материала образца отбирают трансформанты А.шдег, содержащие множество копий экспрессирующей кассеты.

Штаммы А.шдег, содержащие множество копий экспрессирующей кассеты, используют для получения материала образца культивированием штаммов в культурах в колбах при встряхивании. Применимый способ культивирования штаммов А.шдег и отделения мицелия от культуральной жидкости описан в \У0 9846772. Затем культуральную жидкость используют для очистки амидазы и измерения амидазной активности.

Пример 2. Ферментация АзрегдШиз шдег и получение экстрактов культур.

Ферменты амидазы получают выращиванием трансформированных штаммов А.шдег следующим способом.

Свежие споры (106-107) штаммов А.шдег инокулируют в 20 мл среды С8Ь (100-мл колба, мешалка) и выращивают в течение 20-24 ч при 34°С и 170 об/мин. После инокуляции 5-10 мл С8Ь предварительно культивируют в 100 мл среды, содержащей 150 г/л мальтозы, 60 г/л Ьас1о зоу!опе, 1 г/л NаΗ₂Р0₄, 15 г/л (ЯН₄)₂80₄, 1 г/л Мд80₄-4Н₂0, 0,08 г/л твина-80, 0,02 г/л базидона, 20 г/л морфолиноэтансульфоновой кислоты (МЕ8), 1 г/л Ь-аргинина, в 500-миллилитровых колбах, встряхиваемых для перемешивания, при 30°С и 250 об/мин в течение 5 суток.

Биомассу собирают центрифугированием в 50-миллилитровые пробирки Грейнера (30 мин, 5000 об/мин, 4°С). Все последующие стадии осуществляют на льду. Для выделения и определения внутриклеточных ферментов получают бесклеточные экстракты, измельчая биомассу в осевшей фракции до порошка в жидком азоте. Для выделения и определения секретированных ферментов получают бесклеточные супернатанты сначала фильтрацией через стекломикроволоконный фильтр СР/А \У11а1тап (150 мм АЕ) для удаления более крупных частиц и затем доведением величины рН до 5 4н. К0Н (при необходимости) и стерильной фильтрацией через фильтр 0,2 мкм (насадка на флакон) с отсосом для удаления грибного материала. Супернатантные фракции хранят при 4°С (или -20°С).

Пример 3. Детекция амидазной активности методом ЯМР.

Порошок клеточного экстракта (полученный так, как описано выше) сушат вымораживанием и снова растворяют в забуференной фосфатом Э₂0 (рЭ=7,0) в концентрации 50 мг/мл. После центрифугирования супернатант смешивают (1:1, об./об.) с амидазным субстратом (10 мг/мл в Э₂0) и инкубируют при 37°С. По прошествии достаточного времени инкубации (см. примеры далее) инкубированные смеси центрифугируют (конечная концентрация 5 мг/мл субстрата и 25 мг/мл экстракта). Измерение ацетамидазной активности осуществляют методом ядерного магнитного резонанса так, как описано в рекомендациях изготовителя. Спектры ¹Н ЯМР регистрируют на приборе Вгикег ЭРХ-600. работающем при частоте для протонов 600 МГц при температуре зонда 300 К (27°С). Используют 5-миллиметровый зонд тройного резонанса с градиентами самоэкранирования. Получают спектры ¹Н ЯМР стандартных соединений для того, чтобы показать, что все включенные соединения имеют уникальные сигналы ЯМР, на основании которых их можно идентифицировать и определить количественно (не показано). Для того чтобы получить спектры каждого стандартного соответствующего соединения, получают исходный раствор каждого соединения в Э20 (СатЬпбде ЬоЮре ЬаЬога&пез). Исходные растворы получают в концентрациях 10 мг/мл, взвешивая субстрат стандартного соединения и добавляя Ό20. Из полученных исходных растворов 500 мкл смешивают с 500 мкл 0,5 М фосфатного буфера, рН 6,96 (КН2Р04/К2НР04). Затем получают спектры ¹Н ЯМР каждого соединения, т.е. акриламида, акриловой кислоты, ацетамида, уксусной кислоты, пропионамида и пропионовой кислоты, при 600 МГц в Ό20 при 27°С (конечная концентрация 5 мг/мл субстрата или стандартного соединения в Э₂0). Идентифицируют для каждого соединения уни

- 20 014853 кальные химические сдвиги, которые не перекрываются другими сигналами, вызванными другими соединениями. Кроме того, контролируют чистоту каждого стандарта и подтверждают отсутствие возможных загрязнений.

Соединения имеют характеристические сигналы, указанные далее.

Акриламид (каталожный номер 8.00830, партия 4202056, Мегск N1, И8А): 5,82 (дд, НЬ, 1=10,3 Гц, 1,2 Гц), 6,22 (дд, Нс, 1=17,2 Гц, 1,2 Гц), 6,28 (д, На, 1=10,3 Гц), 6,31 (д, На, 1=10,3 Гц): м.д.

Акриловая кислота (каталожный номер 14723-0, партия 817163-034, А1бпс11. VI, И8А): 5,65 (дд, НЬ, 1=10,4 Гц, 1,6 Гц), 6,01 (дд, Нс, 1=17,4 Гц, 1,6 Гц), 6,11 (д, СН₂=СН, 31=10,3 Гц), 6,14 (д, СН₂=СН, 31=10,3 Гц).

Ацетамид (каталожный номер 12263-7, партия 16813ВА-453, А1бпск XVI И8А): 1,99 (с, СН₃): м.д.

Уксусная кислота (каталожный номер 1.00063, партия К31668363, Мегск N1, И8А): 1,90 (с, СН₃): м.д.

Пропионамид (каталожный номер 14393-6, партия 250091В-413, АИпсй, VI, И8А): 1,10 (т, СН₃), 2,27 (к, СН₂): м.д.

Пропионовая кислота (каталожный номер Р-1386, партия 083 К3404, 81дта, 8ΐ Ьошк, Мо, И8А): 1,09 (т, СН₃), 2,37 (к, СН₂): м.д.

Пример 4. Детекция амидазной активности колориметрическим определением.

Определение активности выполняют согласно 8кои1оиЬг18 е! а1. [Мо1. МюгоЬю1., 40: 596-609, 2001]. Реакция протекает в буферном растворе (РЕВ), содержащем 1 мМ фосфата (рН 7,4) и 10 мМ ЭДТА. Получают 100-мМ раствор амидного субстрата в РЕВ. Смешивают 200 мл полученного раствора субстрата с 50 мл клеточного экстракта и смесь инкубируют в течение 30 мин при 30-37°С. Активность фермента оценивают количественно, определяя количество выделившегося аммиака. Для этой цели добавляют 400 мл фенолнитропруссида и 400 мл щелочного гипохлорита и смесь инкубируют еще в течение 6-10 мин при 50-55°С. Поглощение измеряют при 625 нм и количество образовавшегося аммиака вычисляют из калибровочной кривой с использованием 0-25 мл 5-мМ раствора (ΝΠ₄)₂8Θ₄, доведенного до 50 мл РЕВ. Одну единицу амидазы определяют как количество фермента, требуемое для гидролиза 1 мкмоль амида/мин/мг общего белка.

Обнаружено, что на результаты колориметрического анализа влияет количество клеточного экстракта, используемое при инкубации. Если добавляют возрастающие количества экстракта А.шдет до наивысшей концентрации на калибровочной кривой (25 мл 5 мМ (N^^80/0, поглощение света уменьшается от 0,44 до 0 (фиг. 4).

Следовательно, калибровочные кривые необходимо получать в присутствии соответствующего количества клеточного экстракта. Более того, обнаружено, что может влиять природа клеточного экстракта. Если калибровочные кривые получают или с 20 мл экстракта А.шдет, или 20 мл экстракта К.1ас!18, первая линия имеет существенно меньший угол наклона (фиг. 5).

Пример 5. Амидаза от 8щта.

Амидазу из Ркеиботопак аегцдтока закупают у 81дта (8ΐ. Бонк, МО, И8А, фермент продуцирован в Е.со11, каталожный номер А-6691). Для того чтобы определить активность фермента в отношении различных амидных субстратов в высококонцентрированной форме, 10 мкл раствора фермента (содержащего 0,47 мг белка) смешивают с 500 мкл фосфатного буфера в Ό₂0 (0,5 М, ρΌ=6,96) и затем добавляют 500 мкл раствора амидного субстрата (10 мг/мл в Ό₂0). Конечная концентрация амидных субстратов составляет 5 мг/мл, что соответствует 70 мМ для акриламида, 85 мМ для ацетамида и 68 мМ для пропионамида. Осуществляют дополнительные инкубации со 100- и 1000-кратными разведениями фермента.

После получения точки для образца для !=0 реакционную смесь инкубируют при комнатной температуре в случае инкубации с концентрированным ферментом и при 37°С в случае инкубации с разведенным ферментом. Табл. 3 показывает процент конверсии амидных субстратов в указанные моменты времени.

Результаты показывают, что фермент из Р.аетцдшока способен гидролизовать все три субстрата, но что активность в отношении акриламида является значительно меньшей, чем в отношении двух других субстратов. Результаты для акриламида наводят на мысль, что начальная скорость конверсии достаточно высокая, но через некоторое время конверсия прекращается.

- 21 014853

Таблица 3

Конверсия, в процентах, после инкубации с амидазой Р.аегидтока

Субстрат	Неразведенный	Т(час)	100кратное разведение	1(час)	1000кратное разведение	1 (час)
Акриламид	100%	0,2	1,6% 8,8% 8,8%	0,3 19,8 43,3	0,2% 0,5% 0,5%	0,5 20,0 43,4
Ацетамид	87% 100%	0,4 0,5	1,8% 56% 100%	0,6 3.5 22.5	0,3% 9,8% 18% 26% 46%	0,7 22,6 45,4 69,6 168,0
Пропионами	78%	0,1	2,5%	0,3	1,2%	0,5
д	100%	0,2	100%	20,1	20% 27,6% 30,9% 32,3%	20,2 43,8 68,2 168,0

Пример 6. Детекция и частичная очистка внеклеточных амидаз АкрегдШик шдег.

Внеклеточные амидазы ΖΌΚ и ΖΌ0 выделяют в частично очищенном виде хроматографией в несколько стадий из супернатанта, полученного так, как описано ранее.

Супернатант сначала концентрируют в 5-7 раз ультрафильтрацией с использованием мембраны В1отах-10 и доводят рН до величины буфера на первой стадии хроматографии. После каждой стадии хроматографии собранные фракции (включая несвязанную фракцию сквозного потока) анализируют на наличие нужного белка методом электрофореза ДДС-Иа-ПААГ (Όδ-РАбЕ), фракции, содержащие нужный белок, собирают и снова концентрируют ультрафильтрацией и их рН доводят до рН на последующей стадии хроматографии.

Сначала колонки уравновешивают 5 объемами от объема колонки определенных буферов. Затем в колонку загружают образец и колонку промывают еще 3 объемами от объема колонки буфера для уравновешивания. Затем образцы элюируют из колонки с градиентом №С1, переходя от буфера для уравновешивания к той же буферной системе с добавленным к ней 1 М №1С1 в количестве 20 объемов колонки.

Таблица 4 Все стадии хроматографии

Стадия	Колонка	Смола
1	НгГгар ОЕАЕ	ϋΕΑΕ-сефароза
2	ИТгар 8Р ВР	8Р-сефароза
3	Н1Тгар 9 РР	Ц-сефароза
4	ХК 16/20	Гидроксиапатит

Таблица 5

Сводка условий хроматографии

Белок	Стадия	Буфер	рН
ΖΟΚ	1	ЫаР1, 50 мМ	6,0
	2	МаАс, 50 мМ	4,0
	4	ΝπΡί, ЮмМ	6,8
ΖϋΟ	1	Трис-НС1,25 мМ	7,0
	2	КаАс, 25 мМ	4,0
	3	Трис-НС1,25 мМ	7,0
	4	ΝαΡί. 10 мМ	6,8

Стадия 3 в случае очистки ΖΌΚ исключается.

Согласно анализу методом δΌδ-РАСЕ ΖΌΚ в конечном препарате имеет чистоту примерно 90%, в то время как подобный препарат амидазы ΖΌ0 показывает несколько дополнительных полос белка (фиг. 6). Общая концентрация белка в обоих образцах составляет примерно 0,5 мг/мл.

Пример 7. Определение внутриклеточных амидаз АкрегдШик шдег в бесклеточном экстракте.

Бесклеточные экстракты получают так, как описано ранее. Такие экстракты используют для определения активности внутриклеточных амидаз, экспрессированных в А.шдег, методом ЯМР, описанным в примере 3. Сначала контролируют условия анализа с использованием известных амидаз ат!8 из Е.ш!и1аи8 и гомологов из А.шдег (8ЕЦ Ш N0: 11).

- 22 014853

Таблица 6

Проценты конверсии амидных субстратов после 4-суточной инкубации

Трансформант	Акриламид	Ацетамид	Пропионамид
Ьо-508	0,3%	1,5%	1,8%
атбЗ Е. шби1апз	19,7%	100,0%	100,0%
атб 8 А. тдег	0,3%	11%	7,5%

Ясно, что холостой штамм-хозяин показывает очень низкие исходные активности на всех субстратах. Также ясно, что акриламид для указанных ферментов является более бедным субстратом, чем два других амида, и что трансформант, экспрессирующий атб8 А.шдет, обладает значительно большей активностью, чем трансформанты, экспрессирующие фермент Е.шби1апк.

Таблица 7

Проценты конверсии амидных субстратов после

4-суточной инкубации

	Акриламид	Ацетамид	Пропионамид
ААЛ	0,1%	<0,5%	<0,5%
ААС	0,6%	0,7%	<0,5%
ААЕ	0,9%	1,5%	2,2%
ААС	0,2%	<0,5%	<0,5%

Ясно, что абсолютные активности указанных трансформантов значительно меньшие, чем трансформантов в табл. 6. Однако это может иметь место из-за неоптимизированных генных конструкций, используемых для получения экспериментальных ферментов. Но также ясно, что относительная активность указанных ферментов в отношении акриламида по сравнению с ацетамидом и пропионамидом значительно большая, чем для известных ферментов атб8.

Пример 8. Определение амидаз АкретдШик шдет в культуральном супернатанте.

Активность препаратов секретированных амидаз, которые также используют для анализа δΌδ-РАСЕ в примере 6, определяют колориметрическим методом.

Таблица 8

Высвобождение ΝΗ₃ секретированными амидазами из амидных субстратов при рН 7,5

Можно видеть, что амидаза ΖΌΟ оказывает предпочтение пропионамиду как субстрату. Относительная активность в отношении акриламида сравнима с активностью амидаз атб8.

Явное отсутствие активности в случае фермента ΖΌΚ вынуждает контролировать оптимальный рН для указанных ферментов с пропионамидом как субстратом с использованием следующих буферных систем (концентрация 100 мМ): цитрат №1 для рН 3,0-5,5; фосфат №1 для рН 6,0-7,0; трис-НС1 для рН 7,58,9. Результаты приводятся на фиг. 7 и 8.

Ясно, что неудача в выявлении активности ΖΌΚ при рН 7,5 имеет место из-за узкого оптимума рН данного фермента в кислой среде. Напротив, ΖΌΟ показывает широкий и биполярный оптимум. Это можно соотнести с наличием двух различных белков в препаратах ΖΌΟ.

Активность ферментов в отношении различных субстратов проверяют при оптимальной величине рН (определенной с пропионамидом в качестве субстрата). Результаты приводятся в табл. 9.

Таблица 9

Величины оптической плотности при анализе ΝΗ₃ при оптимальном рН

Амидаза	Время	ОО (625 нм), пропионами д	Οϋ (625 нм), ацетамид	ОО (625 нм), акриламид	ОО (625 нм), мочевина
ΖϋΟ (рН 7,4)	2ч	0	0	0	0
24 ч	0,230	0,140	0,023	0
ΖΏΚ (рН 6,0)	2 ч	0	0	0	0
24 ч	0,600	0,026	0,034	0

Оба фермента из числа испытываемых субстратов предпочитают пропионамид. Однако в случае ΖΌΟ следует помнить, что такое предпочтение определено только при одном из двух оптимумов рН. Если биполярное соотношение рН-активность в самом деле имеет место из-за присутствия двух различных ферментов или двух форм одного и того же фермента, предпочтение субстрата при другом оптимуме может быть иным.

- 23 014853

Из величин 0Ό можно оценить специфическую активность с использованием калибровочной кривой для N4-, и установленного содержания белка. Для ΖΌΚ и ΖΌ0 вычислены специфические активности 0,7 и 0,2 ммоль-мин^-1-мг^-1 соответственно.

Пример 9. Амидазы в АкрегдШик шдег и других микроорганизмах.

Известную последовательность таких новых амидаз используют в качестве зонда для поиска других амидаз в геномах других микроорганизмов. Ряд других гомологичных ферментов идентифицирован в грибах и бактериях.

Пример 10. Определение акриламида в образцах пищевых продуктов.

Предварительная обработка образцов.

Высушенный и гомогенизированный образец (600 мг) экстрагируют с использованием 5 мл воды милли-О. К экстракту добавляют 1 мкг внутреннего стандарта акриламида 13С3 в растворе (СШ). После 10-минутного центрифугирования (6000 об/мин) в колонку Ех1ге1ии1-3ВТ (Мегск) вносят 3 мл верхнего слоя. С использованием 15 мл этилацетата акриламид элюируют из колонки. Этилацетат выпаривают в слабом потоке азота для уменьшения объема до приблизительно 0,5 мл.

Условия хроматографии.

Раствор этилацетата анализируют с использованием газовой хроматографии. Разделение получают с использованием колонки С'Р-\Уах 57 (Уапап) (длина 25 м, внутренний диаметр 0,32 мм, пленка 1,2 мкм) и гелия в качестве газа-носителя с постоянной скоростью потока 5,4 мл/мин. Осуществляют безразрывное впрыскивание 3 мкл. Поддерживают температуру печи 50°С в течение 1 мин, после чего температуру повышают со скоростью 30°С/мин до 220°С. После 12-минутной выдержки при постоянной температуре (220°С) печь охлаждают и стабилизируют перед следующим впрыскиванием.

Детекцию выполняют с использованием подключенной масс-спектрометрии с химической ионизацией по типу положительных ионов с метаном в качестве ионизационного газа. Для количественного определения контролируют характеристические ионы т/ζ 72 (акриламид) и т/ζ 75 (13С3 акриламид).

Используемое оборудование.

ГХ НР 6890 (11ех\1е1 Раскагй).

МБЭ (масс-селективный детектор) НР5973 (Не\\'1е1 Раскагй).

Препарат кофе.

Концентрированные растворы ферментов ΖΌΚ и ΖΌ0 получают ультрафильтрацией и затем стабилизируют, добавляя 50% (мас./об.) (конечный объем) глицерина, 0,02% (мас./об.) СаС1₂, 0,1% (мас./об.) метионина и 0,1% (мас./об.) бензоата натрия. Показано, что такие концентрированные стабилизированные растворы имеют амидазную активность 0,087 Е/мл для ΖΌΚ и 18,5 Е/мл для ΖΌ0, измеренную в мкмоль аммиака, высвобождаемого в минуту из 100 мМ пропионамида.

Свежезаваренный кофе разделяют на порции по 6 мл и инкубируют при 30°С. Затем добавляют 0,3 мл раствора амидазы и продолжают инкубацию при 30°С. Инкубацию, при которой добавляют 0,3 мл воды вместо раствора фермента, используют в качестве контроля.

Образцы сушат вымораживанием и анализируют на акриламид согласно способу, описанному выше.

Образец	Акриламид (ч/млрд.)	Уменьшение, процент	Уменьшение, процент, на Е фермента
Пустой контроль	18,8	0
Ат<18	16,4	12,6
ΖϋΚ	16,3	12,9	48,5
ΖϋΟ	14,4	23,3	4,2

- 24 014853

Перечень последовательностей <110> ΙΡ А££е15 Β.ν.

<120> ΝΟΫΕί Εοοσ ΡΚΟϋυΟΤΙΟΝ РКОСЕ55 <130> 24543ШО <160> 41 <170> Ратепттп уеГ21оп 3.1 <210> 1 <211> 1861 <212> ОНА <213> А5регдт11ιΐ5 ытдег

<400> 1 аТдссТбссТ	ГХдссТсттд	дстссгсасс	тссдддгтдд	ссдссдт:ддс	садсдссатс	60
ассдссаатд	асадссгсдт	ддсссддсад	аТТдаТассс	аассХГЕссс	сСаТдасггс	120
ссссадгтдд	дсдТсааТдд	ТбссдагсТс	тбГсссаГдс	дддасгдсса	гддсПсасс	180
Иддаддадд	ссадсатсда	ТдадаГссад	дсдсадсбда	аддссддгсд	сгтсассддс	240
ТсссадсТдс	гдсадгдста	ссТсдадсдс	аТсТассадд	ГссадсссГа	сассаадГаа	300
дтедсссетс	ТТсГсасааа	аатдсддттс	дстдатгстд	дгдггссадг	дсддтдс1дс	360
адСГсаассс	сдасдссагд	дссаИдссд	аддсдпдда	Тдссдаасдс	аадсадддба	420
ссдгдсдсдд	ГссссТдсас	ддсатсссст	ТссГддГсаа	ддасаасагс	дссадгаадд	480
асаадатдда	дассассдсд	ддсадстддд	сссгсдтсдд	сТссдТсдГс	ссГсдсдаТТ	540
сюасдтсдг	дсагсдгстд	сдссаддсдд	дгдсддгссг	дстдддсаад	дссасасбса	600
дидадтдддс	ддасаТдсдс	гссаасдасг	асгссдаддд	сгасгсдддс	сдгддтддсс	660
адгдссдсаа	ссссгасаас	ГТсассдТса	ассссддТдд	садТадс1сс	ддТГссддТд	720
ГддсТдТсас	дадсаассад	дтдссгтгтд	сГседддГас	сдадасддаГ	ддТадТддТа	780
адгггддсад	ассаааааса	Тда^дасаса	аабагдсТаа	Тдеддаддас	садТдагсаа	840
сссддссдад	сдтгсдаасд	тддтсддгаг	саадсссасс	дТдддгсгда	ссссссдддс	900
дддТдТсаТс	сссдадтссс	Тдсассадда	сасддТсддс	ассТГГддса	адасддГдсд	960
сдабдссдсс	ТаТдсдсГдд	а!дссаТсТа	сддсаТТдас	ссссдсдаса	асдадассТа	1020

- 25 014853

Хдсссадсад	ддсаадассс	сддсдддсдд	дхасдсссад	ххссхдасса	ассадасддс	1080
дсХдаадддд	дсддХдХХсд	дхсхссссхд	дХХдХссХХс	ХддсадХаса	асдасдссдс	1140
асадаасдсс	садсхдахдд	аасхдсхддс	дсхдахсдад	дсддсддддд	ссассахсах	1200
саасддсасд	дадсХдссдс	асхасаадда	даХХдХддаХ	ссдХссддсХ	ддаасхддда	1260
схасддсасс	асдсдсддсХ	ассссаасса	дХссдадХас	ХсдХасдХса	аддХддаХХХ	1320
схасаасаас	аХссдддасХ	ассХддсдда	дсХсаасаас	ассаасаХдс	ддХсдсХдда	1380
ддаХсхддХд	садхасаасс	хсдасаахдс	дддсадхдад	ддсддддгдс	сдддсдхсаа	1440
сссддсдххх	дссхсаддсс	аадасддахх	ссхддссхсд	схддссасса	адддсдадах	1500
даасдадасс	ХасХддсадд	сдсХддадХа	ХХдссассдс	асдХсХсддд	аддадддда!	1560
сдаХдсддсс	схдсасхасс	адддхсддаа	ссХсасддсд	сХдсХддХдс	сХссддасХХ	1620
хдсссссхсд	ахсдадаххд	ссдсдсаддс	дддххасссд	дхддХдасдс	хдсссдсадд	1680
хахсаассад	дасхсдсаха	хдсссхасдд	асхддсдсхд	ахдддсасдд	сдххсхссда	1740
ддссасдсхд	ахсаадхахд	ссадсдссах	сдаддассхд	садехдхедх	ссаасасдсс	1800
дХддаадсдс	адссхддсса	сдХддадсдд	сгассХддас	сдааасаХХс	сддХдаасХа	1860
а						1861

<210> 2

-П 11. 1 ЛАЛ <212> ОНА <213> А5регдП1и5 гпдег

<400> 2 ахдасхахсс	саассхддаа	аХсаассдХд	сасаадаадс	дсдсадсхса	дсХддссдсс	60
аххссассхд	аххддсдхсх	сссддадхсс	ахсасхдссд	ахссдссасх	саахдсхсхх	120
даддсааХсс	дсХсХХдХда	хаххсхсасд	дадааададс	аддаахддас	ддадаххаах	180
даХадХасХд	хдсхдсхххс	сахдсХддсд	аассдхдада	ххадсхссдх	ХсадсХХасд	240
асддсдххсх	дхаадсдсдс	ддссдхсдсс	садсадсхха	ссаадхдсхх	дасддадахх	300
ххсххсдаха	дддсдсхадс	асдддсхаад	дадсхсдахд	ахаххххдда	ааадасадда	360
ааддХдасдд	ддссдХХдса	ХдддсХдссд	дХХХсааХХа	аддаХсддХХ	ХдаХдХсдад	420
ддахахдаха	саассдххдд	ХхсдХахсса	хдххсхадса	ХсасхдсХдс	Хдддададда	480
дссххддсха	асхадхддха	хдхаддсхдд	дххдддсхад	хдддсааасс	сдсдсааадс	540
хссадсадха	ххдссххдхс	дххддадхса	ахдддсдсад	хаххдхахдх	саадасдаах	600
дхассасадх	сХХХдаХддХ	аХдсааХсас	ссХХХХасаХ	ХХсдсаХдах	дддадаХХсХ	660
даХХаадХса	дахдхсхдах	ХссХасаасс	ахдхдххсдд	асаахссахс	ааХдссХХса	720
асааасаасх	сахсхссддх	дддадххссд	дсддсдаадд	сдсссхсахх	ддсасдддхд	780

- 26 014853

дсадГдГсдГ	ХддХаХаддд	асадаХаХсд	ддддсХсдаХ	хсдхахсссд	дссаахххдс	840
адддГГХаОа	сХсааХсХдГ	ссХасТасад	дХсдадХдсс	аХддаасХдс	ХсдХХдХасд	900
одоссаосос	хахсхасгда	ххсхадасса	хадсхдасса	хасссадсах	дсассадсас	960
сасстхдхтс	сгссадгсдс	аддасссагд	дсссдсадхс	хххссадсах	хдаасахххс	1020
агдсаагссс	хссхсдасгс	саагссХХдд	аахаххдахс	сдддсхдсах	сссааххссс	1080
Гддадааадд	аасХГдсадс	даадсссасХ	ддхааасхас	дасХсддаах	ХдХсХасдас	1140
дасддсдТдд	Гаааассаса	дсссссаа-сс	дссадддсаа	£дсдсдаадХ	Хдсааадааа	1200
сСсааадаад	сИддссаГда	аддХдГдГас	асаахсхаса	ахсхсссхсх	ХассХсаХса	1260
агсадссггс	асхдасхада	саадгсххсд	аахдддасас	схсссхссас	ассасаддсс	1320
аааассСсГд	дасаааадсс	аГссТсдссд	асддаддсса	асасХдХсдс	хахсхахдсд	1380
асаГТдГГдд	ададссасХд	ахадааддда	ХддХХдХадд	дасадааааа	даХдадсХда	1440
ссабсбсада	асдсдаадад	дхсддхссса	хасссхаахс	ххсхассхсх	ссаахдсхха	1500
6а61аа1аса	аасаХаХадс	Хсдаададас	саааХдддсс	Хассааасса	дсххссхсса	1560
дсааГддаса	Хсаадсааса	хсдасдсссх	ссХсаХдссс	дХсасдсссХ	дддхсддсха	1620
ссддссаааа	хссхдддхсд	ХсадсХссса	дхддсхсддс	хасасддсхс	хсхддаасхх	1680
дсЕсаасГас	дсддсхдхха	схдххссддх	ддсХааадХд	даХддадсас	ххдахсадсс	1740
ддагсаддад	гддхгддадс	агдгдсстад	даахдасхсд	дахсддххха	аххдддааса	1800
дгдгабдсаг	асХсХссХХХ	ссаХасаТас	ддХХаХсддд	дахаахадсх	аасссХаХса	1860
Сба1да1с1а	дахда1сссд	ассхддхсаа	адасахдссс	ахсасхдхас	аааХсдХсдд	1920
аддссдсШ.	ддсдаадааа	аддссдХХХс	ддХадссаад	дХадХадаХд	аддХХХХдса	1980
ддадсссгад						1990
<210> 3
<211> 1760
<212> Ο’ΊΑ
<213> АгрегдШиз птдег

<400> 3 а^ддсдааса	саасдхддда	дсагададсс	аададсаадс	аадсХсадас	ддсадсадсд	60
аххссассад	аахддасххх	ассадссда!	ахасххсхсд	асхссхсддс	даахдхссхс	120
дахдхдссса	ддассхдхдд	дсгссбдасс	дааададааа	хссахаххас	сдаадасхах	180
дахдссасад	саХХасХХда	ааадббддс!	ассддададХ	ХсадсХсасХ	сдаддхсасд	240
асадсаххсх	дсаадсдддс	ОдсааНОдсд	садсадХХда	ссхдсхдсхх	дасддааахс	300
ХХсХХсдаса	аадсасхадс	сададсааад	садсЁсдасд	аааХХсСддс	ХсааасХддд	360
дхаасаассд	ддссасхдса	гддссгдссс	ахаадхахса	аддадхсдГГ	саахдхсссх	420

- 27 014853

ддадххссда	с!асас!ддд	дХХсдХсдда	ХХХсХсдаХс	дддссссддс	дхссахдадх	480
гссдсссхдд	ххдадахссх	даасаасхдх	ддддсХдХгс	ХаХаХдХсаа	дассааХдХс	540
ссссадасаа	хдахдасхсс	ддасХсссаХ	аасаахдхсх	хсддхсдхдх	дсХсаасссд	600
сасддасдда	дссТдассдс	Хддаддсадс	адхддсддад	адддадсаХХ	ддХддсдаХд	660
аддддсХсад	ХссХсддсдХ	ддддасадах	ахсдссддсх	ссаХХсдсаХ	ссссдсссХс	720
ХдсХдХддХд	ХХХХХддХХХ	сааасссасд	дсХХдссдХа	хсссахахдс	аддхсааасд	780
ссхдссдддс	дхссдддхах	дасдддсахс	схдссдхссд	ссдддсссах	дхдссаххсх	840
ахссдсдахд	садаасХсХХ	ХсХсааадХХ	дХссХсаасХ	сдаддссхдс	сдахстддаг	900
дасхахдсас	ХсдасаХХСС	ахддхссссх	дсхссдсааа	аддададдсх	хасхаххддд	960
схссХдсссд	аддасссдхс	дххсссдсхх	сахссассда	ХдсдасдХас	ссХдаасдсс	1020
дсадХдаадд	сдсХдасХас	адссддасас	сдддхсахсд	ассХсХсадд	асаддсХссд	1080
ХссХХсХсса	ахдсахдххс	хсхддсаххд	сдахахххсд	дссХддассс	ддахсдаасх	1140
дсасхдсдсс	асаХаасдса	ддсдддсдаа	ссхххсаххс	сххсдсхсаа	аххсассхах	1200
даХСХсааХд	адссдасасд	хдадсссасс	ххдададахс	хаххсдаахс	даахдхсдсс	1260
сдхадхсадс	Хсдсаассса	ддсасдааад	схсххсдххд	аХааХсадсХ	хдахсхдххс	1320
схдддсдсдд	сххахсааад	сасахсддхх	ссссахдаха	ссхасддхах	хссддхатах	1380
ассдтдсххх	ддаассхдах	хаахдхдддх	ахсссасасх	дссХХХсХХд	ххххсххххх	1440
сххххххдхх	ХСССССССХХ	схххсхдсхс	сааХхдсаХд	дддхдхсхдс	Гаахдахдса	1500
сХадХаХссд	дсдХдсдХХа	хсссахххдд	дсаддссаас	ааддХададд	асдсадсдХа	1560
хаассдсдас	дхсхсххахд	хдссадасхд	хаадххдсдс	сссХсааХХд	дхсхсдсхса	1620
дхсхасхаас	ХасХдХадаТ	сддссадаад	аааХХдаадд	сдсассдХдХ	сасаХссаХс	1680
ХдаХаддсад	ассдаХддсд	дасдааааах	ХддХХсадда	ХдсдаадасХ	аХаХдсассд	1740
хаахдадхда	хдхсхсххда					1760

<210> 4 <211> 1875 <212> ΟΝΛ <213> А5регдт1145 птдег

<400> 4 аХддсадХсд аасадХддда	дасдаххдхд саааадааас аддссдасдс адссдсхаад	60
аххссссадд сахддсддсх	ассддсхдаа ХХсасддсдс ахдхдхссда аасадссхсх	120
асхаахдхдс хсдахдхдсс	хсдсаадхдх ддсххдхХдХ сХдсХаадса аХХддаааХХ	180
асхдадаахх ахдасдссас	ддссХХдсХс дадсадахсс аХХссддааа дХХдасХдсХ	240
дххдаадхсд ссдаадсаХХ	ХХдссХХсдд дсддссаХсд сасадсаадх ддХдддаХад	300

- 28 014853

хаасхсасха	аахдассахд	аХсдхсааас	Хаасддхсхд	ахахадасдс	дсХдХсХдас	360
ХдадасаХХХ	ХХХдаХсХХд	сХХХададсд	адсаааддад	схддасдадх	аХХХХсадХс	420
хассддааад	дХссдддддс	сдсхдсасдд	дсхдсссахс	адХсХсаадд	хаддсаххдс	480
адссасдадд	ХаХааддаса	ХддаХаХХда	ХдИаХсадд	асхдсххсаэ	ХдХсдсХддХ	540
дХХссаааса	сааххддсхх	сасхдссххс	ахсдсссасд	дхсссдххаа	даасаасхсс	600
хсхдхсдхсс	адахссхссх	ХдассХдддс	дсддХХсХсХ	аХдХсаадас	саасаХХссс	660
садасаахда	хддхахахсс	сссххсххах	аххасадсхд	ссдаахдсхс	ахсахдасха	720
ддссдссдас	Хсссасаасх	асдхсхххдд	ХсдсасссХс	аассссаасс	даассааасХ	780
садсдссддс	ддсхссхсад	дхддсдаадд	сдсссхдахх	дссахдсдсд	дахсаахссх	840
дддхдхаддс	ассдасаххд	саддсхссах	ссдсаХсссс	дддахсхххд	асддаасаха	900
хдсссхасдс	ссдхсхахсс	ахсдсаххсс	схасддаддс	садасаддаХ	ссддссдсаа	960
дддХсХадсд	ддсаХссдас	ссХдХдссдд	сссасхадсс	асХХСсдХдс	дадассхсдд	1020
хсхаххсахд	аааасадхсд	хадасахсда	ссссхддсаа	хасдасхссх	сдассахсхх	1080
садсассхдд	сдаассдссс	схссдааада	дасссхссда	схсддсххса	хссхсдаада	1140
сссссахХХс	сссдхасасс	сХсссаХХсХ	саасасдсХд	асссдсдсад	ХсдаХдсссХ	1200
сааадссдсс	ддссасдаад	хсахсаассх	аассасссса	ХссаХсадад	асдсссхссх	1260
ес1сддсИс	сдаассХХсд	ссаХддассс	ддсасдаасс	дсаХХсадсс	асаХсасХаа	1320
дадсддсдад	ссасдсаХсс	схдсхсхдад	аасХассдаХ	сХдссааасд	садахххдсс	1380
аХХХдааХдд	дссссдсаХа	сссХсдадХс	ссхххахдах	схдаахдхдс	адсдддадас	1440
дсхдхдсдад	садххссдас	адпдаХсд 1	ссадаасаад	аХХдасдсда	ХсаХХаХдсс	1500
ддддХаХсад	ддсасадсдд	ХддсасаХда	ХсаддХсдда	ХдддХдссдХ	ахасхдхххх	1560
ддсХааГдХХ	ххддахдхах	дссаасхсас	сссхддахса	хдххаадхсд	асХдасаадХ	1620
дхадхахссд	дсхасдахха	ХХсссХасад	аааддсддах	ааддсХдаХд	асдссаадХа	1680
ХдХсадддаХ	дХдасХХасс	дассдссХХд	хаадххаххс	ХсаХдХаХас	хсхсххаада	1740
схдххсхдас	дсхххдсада	хдххдсддас	дасдХддадд	дсдсдссдХд	сХдхдХдсад	1800
сххахдддаа	даасаахдса	сдаддаддад	схссхдсддд	ахасхдсдах	сдехдссадд	1860
дХсХХдддда	ааХда					1875

<210>5 <211>1954 <212> ΟΝΑ <213> АзрегдтПиз птдег <400>5 ахдсххсссс ссхххдахха схххасдхах сдХсдсаХсс ддХаддХХас сссдхдхдсс 60

- 29 014853

ттсасдсадс	аасттаадса	дЕссЕасаса	дсссасаЕдс	аастгадссд	асддсЕсасС	120
дассаттсас	адддассЕса	ададдаддда	асдддсддсЕ	сдагТТдсаг	сдстатсгсс	180
сдатгаЕсаТ	дсдсссТЕСТ	сддсЕаЕсда	садддЕЕаЕс	аЕЕаасаадс	сЕаЕссадда	240
сТТддЕаЕаг	даддтссада	аЕдаЕЕссЕЕ	ддсассЕГЕа	дагдЕссЕас	дсасатасдд	300
сааддЕЕдса	дтсааддстс	асдаааадас	сааЕЕдсдЕд	асгдадсЕЕс	ГаЕЕдссЕда	360
ддсадааЕса	гдддстсадт	ссдаадЕааа	ссЕааааддЕ	ссссгддсдд	дЕдЕдссЕаГ	420
сЕсЕИдааа	дасЕсддЕдс	аадЕсааадд	аЕЕсдагаЕЕ	асгсгддддг	атассаадтг	480
сдсдТдЕааа	ссдтатаадд	аддагддЕсс	ааЕддсааад	сЕдЕЕдаадд	атдстддтад	540
дЕдассЕдЕд	ссдсдаааса	Есасадааад	ЕаЕсссЕдсд	сЕааЕдаЕда	асЕссаЕсад	600
дЕдсддЕссс	агатдсдааа	асддсдсгдс	ссдгдасдсЕ	ЕсгдЕсдЕЕс	даатсадсаа	660
асдсЕСЕЕЕд	дддтсасгдс	сЕЕаасссас	аЕдЕсссдда	аЕасЕсЕссЕ	ддсддсгсда	720
сдддЕддЕда	аддЕдсЕсТд	СЕддсЕсЕЕд	дЕддЕсдсаЕ	сддЕаЕсддд	ЕсддаЕдЕсд	780
сЕддсТсддТ	ТсдсдИссс	дсЕдссЕдда	дсддсатсЕа	сЕсссЕссдс	ЕдЕадЕасгд	840
дссдсТддсс	тааддгсдда	дгсаасасса	дсатддсЕдд	ссаддааддт	дтгдссадтд	900
ТсТТсадТсс	ЕаГддсссдТ	асЕЕГдаасд	аЕсЕсассЕа	ЕГЕсассааа	дсЕаЕЕдЕсд	960
даатдаадсс	ТЕддаасТас	дассаЕассд	ЕссасссЕаЕ	сЕссЕддада	даадагдадд	1020
аааттдаадс	ссаааасааа	аддЕЕдадда	ЕсддссЕсаЕ	дадсаасдаЕ	ддЕаадЕЕсс	1080
аададсдддд	асаЕсаадда	сасЕасЕЕдд	дссЕЕЕсЕда	ссасЕЕдсад	дЕдгсдЕЕсс	1140
сссаасдссд	дссаТЕдаас	дЕдсШНс	сассасадЕа	дссдсссгса	ссдссдстдд	1200
дсагасгдта	ТстдадаГса	сассссссдс	Едсддсгдас	астгЕЕасЕд	дЕсЕсЕсссЕ	1260
сдссТсдсад	сЕдсТсаасТ	сЕдаЕдддЕд	сдЕсасдЕЕЕ	аасЕсдсаЕс	ЕдсасадсЕЕ	1320
Едадссатсс	дасссгддгд	садаЕсадст	дасдсддаЕа	ЕдсаатсЕдс	сссдЕссЕсг	1380
асдПгаЕсТс	тасЕассЕЕЕ	дддЕЕсддЕа	саЕссдасдд	даЕдадаадЕ	дддсдасдсЕ	1440
даТссдсддд	Егтдссссса	адЕсгдсддс	ддадсЕЕЕдд	аадстсасгд	сссадсддда	1500
адсЕЕТссдд	дсдассЕддс	асадсЕддЕд	ддаЕдссдад	асдсадсадЕ	асдаЕЕЕсаг	1560
сстстдсссс	дтсаагдсда	сдссддсЕсЕ	дссссасааа	дссаЕдсасд	агдсддгагс	1620
сЕсатдсдда	ЕасасдЕЕсс	ЕсЕддаассЕ	дсЕддасгас	асадссддЕд	ЕсдЕдссЕдЕ	1680
сТсдсасдЕд	дасдсдаада	аддаГдсЕсЕ	дЕсЕддЕссд	Гасаадаадд	гдсЕдаааса	1740
дстдддадсс	адсаасдсдд	ЕддссЕасдд	ЕдссЕддаад	сасЕасдасд	сддсдаадаЕ	1800
ддсдддамд	ссЕасЕдсад	ЕдсаддЕддЕ	дддасдсада	Еддсаддаад	адааддЕдсЕ	1860
ТддаТасаЕд	дсддсадЕЕд	аддаддссЕЕ	ддадсадтаг	саддасссдд	ЕаасЕддада	1920
аддддддааа	ЕасссаЕЕда	ЕЕдадсЕЕда	стад			1954

<210> б <211> 1720

- 30 014853 <212> ΟΝΑ <213> АБрегдтПиз гпдег <400> 6

агдтсддхаг	тдхтсасгсс	гатггсдссд	1агд1ассда	дгссгсдагт	сатдпагсс	60
ссд11дгс1с	сиссасдааг	гтдаассига	садагсагсд	асадддасаа	сссддгсаад	120
адддаадагд	сддссгссст	гсгдсдсааг	гхддатсгсс	асапдасса	адаадахдад	180
даадаггсис	агасссисс!	ддсадссдТс	са1дасгдсд	ссдааассдг	ддсдаассгд	240
ссадасгатс	адссадхссс	сдатсгадат	сдагассстс	дасатаатд!:	тсассдхсса	300
гссисададд	аасаадгаи	Гдддсаддсс	гдддсгсаса	адшсгдаг	саадддсааг	360
ссддадддад	ддсгагтдас	ддддаадасд	атсадсдгда	аддаттдса.т	тдссдгсдса	420
ддгдгассас	адИдсИдд	аадгдатагс	а«сссгс«	ддасассаат	Гасадатдсд	480
асддггдтда	сссдадгссх	сдагдстддг	дстдатагтс	атддтасгис	дастхдтдаа	540
аас1ас1дсс	аИссасддс	д-ссигсасд	адГдсИсаад	даассдГдда	даасссШс	600
дсдассддаг	астсадстдд	сддаадсасс	гсаддадддд	садссггддг	гдсадстддг	660
ггддггдаса	ГРасдсТсдд	Гддадассад	ддгддаадса	ПсдддПсс	сгссдсдш	720
гдсддгсдта	ддтагстсдд	атааахтддс	Шсадааас	аТддсТдасс	дтдгсаастс	780
аддгдгсддс	ПдаадссГа	саТаИдддсГ	ддтдссгггс	адсддГаГТд	сгадсддада	840
гдсгагхдаг	дассасасдд	дсссдсидс	тсдтаахдхт	аисдасдПд	сс1сгхдс«	900
адасдсРаГс	дссддсГаТд	агддсаТада	сдагсдагдс	сГддддадТс	стааасасдд	960
сгссасстсд	исдссаадг	сдсггсаадс	ддасдстасд	аддсссдасд	дсПсааааг	1020
аддадгсИд	ааддаадда!	Идадсасас	1дс1дГддас	сссдсадГса	аададтсддт	1080
сагддсддсс	асссадааа!	грдсддадсг	Тддсдсааса	дТсдаддадд	1а1с1с«сс	1140
адассасРас	сагдддссГд	сТаГаГддас	сап сад сад	сдидгагсад	дсГсспдас	1200
дсгдсггдда	саддсасаТд	дсадаадддд	дсГсГасаТд	асддадагдд	адсдТдадад	1260
асгдссдгдд	асдааддаад	дсШсааад	адсспссса	дссасдаада	асдиахааг	1320
сааГддссГс	1а1с11асс1	сдсдспгсс	1дасПд1ас	дддаааНсад	ГдааТаГсдд	1380
ссдааддсГС	сдддассГсТ	асдаддаРСТ	дсхссаддад	ТасдаГдГдд	т-сдтаатдсс	1440
аассасТсс!	дггдндсас	саадасагдд	тдсасдаддс	сгассдд1сд	ад1с1с!даа	1500
дссгадсатд	ддсПдасаа	Хсаасасадс	ааПХПда!	дПасдддас	асссадсда!	1560
дадсагасса	д1дддд1асд	сГссддссаа	ддардаТссс	саадГсаадс	ТсссддТсдд	1620
ЕаТдсадаи	дгсддадддг	Гдтддсадда	дШаадд!а	стсааадсдд	дататдсахд	1680
ддадааааас	гасдаггдда	аададдтддс	дадгсаигда			1720

<210> 7

- 31 014853 <211> 1428 <212> ΡΝΑ <213> АзрегдтПиз т'дег <400> 7

агддсгсдга	исдашдгс	сдадидас!	агсдссааад	Гдсасасддс	аггссдссдс	60
ддадасгаса	дтдссдрдда	Гстддтссаа	дсиаШда	дасдсагсда	ссаддгдаас	120
ссдсддсгса	аХдссагсс!	ддссагсаас	ссдаагдсдд	Хссаадаадс	ГсаадсссСд	180
дасдаГдссГ	1ссдадс11с	ссдсасаиа	сдсссасгсс	а1ддддгдсс	адгдсТддгд	240
ааддасаага	ссисассас	сдсдагдссд	ас1ас11ард	диссаадд!	сдссдсдгсд	300
сдсссадгаг	хассссгсда	сдагдсссад	дгда!сааас	адсГдсаадд	сдссддддсс	360
агсаисгдд	сдаадассас	гсгдссддаг	гдддсдассд	аснспсад	сдссгсдасГ	420
д1сРсдасд1	ддасссадаа	сссс1а1дас	Иддсссдад	асссдддсдд	1гссадсадс	480
ддсассдссд	сддддагсдс	адссаасс1д	дсШддгсд	дсдгдддгас	ддасасдддд	540
ддсРсса1сс	ддстдсссгс	стсдиссдг	адсгтддхсд	дсагдсддсс	сассдтсддс	600
сгдассадсс	гддагддсдг	дгсссссЧ ΐ	дтдддсгдсс	аадагассдг	аддассдагд	660
ГдГсдсассд	Гсассдасдс	сдсдсдсРГа	сРсдасасдс	гсдтссгдсс	сассадсссд	720
саагсссгдд	стсссадсдд	аддсгссгас	дсддсдсагс	1сс1дссада	садссгсссд	780
ддгсссд-сиг	д!стдддсса	истдссасад	сидддгдсдд	аддаддсддс	сдгддаддса	840
сГсГГсасГс	аддтссрсас	ссдгсгдсдс	ддасатдсгг	сддгсассдг	ссдддассис	900
датаггссда	д1с1сгссрс	сасдсисдса	дсадсс1ста	1са1дсРсад	ссдгддссаа	960
сатдаРсгсд	асдасргсгг	дсддассасд	дгддддасса	д1с1даадас	даисгаРсдд	1020
датсасдсс!	асссдсссас	саас1Гсдда	агассддддд	Хадсаасдса	гдсТРсдасс	1080
сгдасддасс	дсгссасддс	сиссаасдсс	сдсдагдссс	Рсдассдсаг	аатаасадсс	1140
са!с1дддсс	аддсдддддр	сдаадТасГс	д1дГ«ГГда	ссдсаддасд	ддсадсХссд	1200
сдссаддадд	а1агсасссс	ддадасддда	дгдассисс	ссдтдсагдс	сагдсгддсс	1260
адсасдсгдс	адгддссадс	саГсСсадГд	ссаагсдддг	«асадсдас	сддссгдссс	1320
дгдддасгдд	адагсс1сдд	саддссдс1с	адсдассаас	дсгтдтг.эда	адгддссгги	1380
дггаРсдадс	адаггдггса	дддасдссдс	ссссссассд	Тадаггда		1428

<210> 8 <211> 1961 <212> ϋΝΑ <213> АзрегдтПиЕ птдег

- 32 014853

<400> 8 агддасдада	адссисадгг	сигссадгаг	ссададдссс	дассдддтсс	сдстдгдссд	60
Гасаадаасд	аддадсаддт	дагссссдгс	атссдгддст	ИсссИддс	ссгсддсдсс	120
асгсгдтаад	ГссХсстдгс	гдасдтсстд	сасгтсасгс	«сисгсгс	гсддссдсад	180
стдсстаатс	ассагссгсг	атадгдтгса	ааататсддс	игагссада	дссатсгсгд	240
ддддассасб	ддстгсдагд	гсагссдсаа	сс1ссс1сСс	дассаагас!	ссдсссдсба	300
гдатссдасс	дгдагссссд	Тадссадасс	Тдагдсхгсд	дсгдссдасг	тдссадттсс	360
сасдсаааад	сдасааадса	атдсаддага	сгасас-сгсг	дссдасгагд	СадсТсдсГа	420
тасигсдддс	дадгтдасгс	сссидссдб	сдгсдадасс	стдсгссстс	фдатссдссд	480
сдабдссааа	ссасссддса	адсасГсдаг	сдсхШсГб	даагсдсаад	тсдасаадах	540
Тсдсдссдса	дсададдсгг	стасасадад	агасааадаг	ддсаадссас	ИдддТссааТ	600
ддагддсахс	сссдбсдсаа	гтааддагда	адгасатагд	дааддагасс	дасддасссг	660
дддсадсааа	стсдаспса	ссддсдади	Тададдсасс	СсТйддТдгд	1даадсаагд	720
ддаддаадсс	ддгдссаггд	Тсаггддсаа	аассагсагд	сасдадбтдд	дГсГаддТда	780
дгадгдсаас	1сссааса1а	ссссагссда	ассаасгаас	сассас111с	асссссссад	840
асассасааа	саасаассса	аабг-Ьсддба	сссссадааа	сссссаГаас	сссдасФагг	900
асгдтддсдд	стссгстдда	ддсгсгддст	асдстдтсдд	сдсаддссга	диссстатсд	960
сгсгаддсдс	сдасддсдда	ддсгсаатсс	дсагсссддс	стссггсгдс	ддсдгсгддд	1020
дасгдаадсс	сТсссаГддс	сдадрдадсд	дстстсссас	сд!сГсас1д	дсатссасса	1080
ссддсдгста	сддссссста	дссиссадса	СсдасдассФ	адсссбсдсс	Рассдаагса	1140
Гддссасдсс	ддссссадаа	ТссТсадасс	сссгатсадс	адссггсссс	гсассссгсс	1200
дсасссгссс	сессссаасс	аасаасассс	саадаассат	сддсагсдга	сдсдасГдда	1260
Гсдассдсдс	стсдсстсса	дхссдсдссд	гсггсаасдс	сассстсдас	сасТассдса	1320
сдсггаадаа	сгасассага	атсдасатса	сдагсссста	сстссссдад	дддсааааад	1380
сдсасдсбс!	аассагсста	бссдаадТда	сстсдбсссг	сассссетса	садабсбссс	1440
адстсасдсс	сдссаасааа	агсаГддсФГ	саагдддсаФ	дгддсааагс	аааддссадд	1500
антхсстсдс	сдсдсаасдг	сгссдтаагг	дхсгсатдаг	дсатстддсг	саспдггсс	1560
адааасассс	гддсИдатд	агсдбсасдс	сдасдасдсс	багсссдддд	гддаадагсд	1620
адддсддсда	ддсддагси	аадсдсддсд	Фдтсддатдд	дааГасдасс	дтгаддааха	1680
1ддад1а1д1	сгддгтддсд	аагтгсасдд	д«дгссддс	даПадИдГ	сс1дс1ддд1:	1740
а1да1ди«	ддагддгддд	ФсдадддГдс	сддтдддддг	Тагддсдагд	ддададгддд	1800
ддадгдадда	ддад11да«	дсдтгсдсда	дддатдддда	дддГдтшд	дагдддасгд	1860
стдстдсгда	ТддГаГддад	сададстсдд	ддндасддг	ТссГсддддд	дааадддсдд	1920
сидддадда	сдггаггдсг	ааадстдддд	ададаадагд	а		1961

- 33 014853

<210>	9
<211>	1788
<212>	ΡΝΑ
<213>	АзрегдШиз птдег

<400> 9 аТдСсдс1сс	Тдсдддаадс	сдадаадтдс	ггддсгаагс	адддсгсгса	ТдсддсгсГа	60
ааТдсдс1аа	ГГассасссг	асатсадгса	ддасаагддт	1ддаасд±д1	дадада1дсд	120
дагдсдсддс	дсасссдддд	1дад1аГдаа	ддсГдсаИд	ааассаагсс	гсдсгхгам	180
сададсгдас	саасТсдсТГ	сдссааагад	ддасдсс(аа	аИсГдадаГа	даГддссддТ	240
гддтгдссд!	сааддасааг	атдгдсасас	дсдассисс	аасаасабдс	дссгсааасд	300
сГсбддасаа	аТГсдГсадГ	ссдСТТаасд	сдасадгсдг	тсаасааггд	даддагдсад	360
дсдсТдСсдГ	ддссдддааа	дсРааГсГсд	асдааг11дд	аагдддсгсс	сасЬсСаргс	420
аИсааасгг	тддссстдтс	адаадсгсдс	дссдтддсса	ддатдсадаа	ГассТсТсад	480
ссдд1ддбад	ИсдддГдда	адгдсддНд	«дггдсдас	адсссаардт	гасдсдгаГд	540
1аастс1сса	дагеадсси	даагсагасд	асдадраасд	дИАддсГСа	асаргдсСдд	600
аасаИСаса	дадсдГГддд	аасрдатаса	ддсддсГссд	(дсдагтасс	сдсадсагат	660
асдддаасад	ГсддсРГсаа	дссгхсиаг	дддстддгс!	сРсдсГдддд	адиддШдсд	720
Тасдсгаахг	сасгддаРас	адгсддгдга	сТдддааддд	асдрддссад	сдттсдсса!	780
дгспсддта	тдгсггдаП	агдгсддаа!	НсИгГсдГс	ТсТПдсдИс	ГсдасИсасг	840
аасгсдгдгг	сдааасатад	дсдгсдрдаа	ссадсагда!	ГсасдсдаГс	ссастаасст	900
ггсгсссгсс	адтсддгсас	ддагадасгс	асатсттааа	атдтстдсхг	гддсаисгсд	960
дасаадГГсТ	ссгсггадда	ГаддадТссс	гсгсдадгас	аасагагсад	адггдюгсс	1020
аТсгдсдсда	саСдсдГддГ	сТсдсИсгсТ	ддссгатггд	саасдасадд	дссатадсаг	1080
ссааасддИд	гсссггссаа	сдассааасг	сдссхгатсд	дсатаиасд	гасгсдсдсс	1140
гдсТдаддса	ТссГсааасс	Гддссаадга	гдагддсдтс	аддгасддаа	дссдссссда	1200
адсассадас	ддааа1дса1	саГсадааад	дхахсгага!	дсдаааасас	даддгдагдд	1260
дГХсддсТсс	даадгсаааа	дасдаат1Т	дстсддддса	тадссбаа	дсдсгдасдс	1320
Га1дда1аас	1асГ1саггс	аадсасадсд	ддггсдссдс	сТТдГссаас	агдасггсаа	1380
сдссдсдтгг	адддсагдсс	адссаггдат	ггссИсдсаа	сггддагсаа	адтсдддттс	1440
Тдсадасасс	ддГдГадаТд	ггстсатгтд	сссдасадсд	ссаГсаГсас	сассасдса!	1500
ТИсаадссгг	аГаддассТд	абдсдасаас	ГТсдссШд	даддсаИаГа	сдааХдагдг	1560
аггтасГдГд	ссгдстадΐΐ	тддсаддгст	тссддстага	гсбд1дссдд	1сас±асада	1620
ааатдстдаг	ддсдссдадд	агддадатст	ддстддаагс	саадгааггд	дссааГасдд	1680

- 34 014853

гдаТдакдад	сккдкдккаа	аддккдссда	дскдсксдад	ддсаддсасс	какдаааакк	1740
«кддккссс	акааасдсдд	акассссада	ссссдаккак	адакдкск		1783
<210> 10
<211> 1963
<212> ϋΝΑ
<213> АБрегдтПиз птдег
<400> 10 акддгдсдсд	скасссааск	ддскдкддсд	дссскддддс	кдсккддкдс	адсддссдск	60
сааскддкдк	саасаддсак	дкскдксасд	сксдассада	ксдаккаскк	сдксксксса	120
касссадсдд	дааакдкдас	ддкдкссдсд	дсскссскда	садакакссс	садкдксаас	180
ддсккскакс	ссдкдаскдк	кдкксаадад	дадасддскд	дддкаксакс	аскдксакск	240
сгтггсгсга	сдкддасдда	кдкддакдак	дкдкккасдс	ссдсскксск	дддкдсддкс	300
ккддкссдкд	дскасааасс	сдасаакдкс	аскдсаасск	кккксаасад	кксдсдсксс	360
адсдккскса	дсссдккада	дкссадддкк	дккссдксад	дсссакаскк	ссксдаасад	420
дссаскддаа	акскскаксс	ддкскассдд	скскасадсд	аскакдсадд	сдсскксаса	480
садссаскас	касаааадсс	адакддсаса	ккссадссдк	кдксддсаса	адкддссддк	540
ккддксксак	ссаскаксдд	кдкдссскск	сдсакскаск	акассссаад	сдакдадааа	600
ссдскддссд	дкдсксдкдк	кддсдккаад	дасакккаса	дксксдскдд	сдкдсддсад	660
адсаакддаа	ассдддсакд	дкасаакскк	касддадада	асаакдксас	кддсаскдсс	720
дкаксдсдсс	кдаккдакдс	аддсдссакс	аккдксддас	кдсадаадсс	сксасадккк	780
дсдаасддад	ааасддскас	адскдаскдд	дксдассккс	асксдссскк	саасссасдк	840
ддадакддск	ассаддассс	ккСккССкСС	ксдксаддсд	сдддддсккс	саксддскск	900
касдаакддс	кддасскддс	кскдддкадк	дасассддсд	дскскакссд	сааксссдса	960
даадкссадд	дадкскасдд	кксссдксса	ксссасддкс	ксдккдааск	кдассакдкс	1020
акдкссакдк	сдсскдкдкк	ддасаскдсд	ддадкдскда	саадддаксс	ккакскккдд	1080
дассдддсса	ассаадсскк	дкакадсасс	ааскасасск	сдккссакдд	саааксадкс	1140
сдскасссса	дсаадскдка	сассаксдас	кксссаасаа	ссаакдаскс	кдсддсадас	1200
дскскдскдд	скддакккса	ааадсдсскд	дссдсдккск	кдаакасдас	аассассссд	1260
скддакскак	скдасдаскд	дксдксдсак	ссдссаксса	дсдсксссдс	саакдксксд	1320
сккдадасгк	кдсккаасск	дасскассса	акдскдакса	ссаадсадса	дакссскска	1330
дккадддакс	скккскасдс	сдаскакдск	ддкасдкскд	дсскаадсск	кссакакаса	1440
дсакссдаск	дасакакаса	садскаааса	сдасддссда	дСссссИсд	ксдассссдк	1500
кссксксксс	сддкддааск	ддкссакддс	дкассскдас	кскдсаскдд	акдаадссак	1560

- 35 014853

ссасаасаад	асдсгстгса	1ддас1дда1	сдсддадаа!	ГаТсГсасТс	сдаИсТссда	1620
1сс1дадсад	1дс1сс1сд1	саснаид!	сгасд1дддс	ассдагддсг	сссадададс	1680
дсдГааНдХс	1а1сд11сдс	Хссссддсдс	асссТсдддс	тасадсааа!	1сс1са1с1с	1740
саагаиддсд	адгдгдссдд	ас1С1д1са1	1сс1д1ддда	дадаПдадд	ссТасадсас	1800
саГсасдсад	сассаддада	ад!Г1сс1д1:	сдссаИда!	д!Г11ддс1д	сГааддддГд	1860
1дасдда11д	сТадГсаддс	ТддсТсадда	пгаггсдад	дсГддсаИа	ГГааГдсасс	1920
диддсддд!	дддасдс!да	с!дд!дддсс	ад 1_ст1а 1с1	Тда		1963

<210> 11 <211> 1980 <212> ΟΝΑ <213> АзрегдтПиз

<400> 11 аГддсссгса	саГссГддда	асааассдса	дсддссааас	дссаагссдт	ссгсаасдсс	60
аТссссдада	аагддсдсаг	саадддТсс!	а!ссссдсас	сдГсддадса	дсдсдасдХа	120
асаддсссс!	аса!ссадса	дПсстагсс	ссасдсдадд	ггдааагсас	сдааасадас	180
дссдТаддда	Тсасададсд	аастасаасд	ддссадтдда	садсГд1дда	ддТдассдад	240
дсдггстдсс	атсдсдсадс	агсддсдсат	саастсдтас	агтссссагс	сасааддадг	300
дсгадгсгдс	дсшасгаа	тсдадааааа	дд1ааассдс	ггдсагдааа	гссгспсда	360
ГдссдсдсТГ	дааассдссс	дсаисгада	сдассастас	ассаадассд	дсаадссасг	420
сддиссссгг	сасддссГсс	сТдгсадгс!	дааддагсаа	«ссасдТса	адддсдТада	480
аасаассагд	ддихасдгсд	дсЕддагааа	сассггссаа	ддсаадасса	аТдасссдсд	540
С1а1хи.аса	сасдааадсд	аас1сд11аа	адаасгссдс	дссдсдддад	ссдгсс1сга	600
стдсаадасг	адсдгсссса	сдасдттда!	дгсаддгдаа	ассардааса	агагсагаас	660
Иасасаса!	аасссдаада	асаддсгтс!	садГГСГдда	ддТадггссд	ддддсдаадд	720
адсасгдагс	дсдггдсддд	датсассадс	сддднгдд!	асддагагсд	ддддгадгаг	780
ссдТдИсс!	дсдГсдТТса	агддасгдта	ГдддаГасдд	ссдГсТдТдд	ддадааГдсс	840
д1асдадддд	дсддссаан	сдддсдагдд	асадаагас!	д1:дйд|;сдд	ПдТддддсс	900
д11д1с1сс1	1сддсдадад	дд11да1а1;Т	дсгдисаад	асддТдИдд	дддсаа1дсс	960
д^ддиддда	да1сс1дд1д	1д11ддада1	1ссс1ддадд	даддааагсд	1ададдадас	1020
дадаааатта	дГдсадддаа	адссададдд	дсГадсГГИ	ддааТаГГсГ	асдагдатдд	1080
ТсаддТааад	ссдсадссас	сдд1сдадад	адсдаХдсдд	а11дс1дсад	адасдаЮаа	1140
дсдТсТадда	сагааддТда	д1дссс1ссс	Тсгссггдсд	асасТдсТаа	сапсатссс	1200
адсгсатсаа	ггдддаассс	сссСсТсасс	Таасадссдс	сГсссТсдса	дхаадТсссс	1260

- 36 014853 саиссаассс астасассас аасссссгаа саагааасса асссссадаа ссдсдссГас1320 аасатддасд дсддсдссда сдГасИссаа аасНсдссс ЕдГссаасда адссаИссас1380 ассгссдиад 1аа1сдасдс агсаддагсс ссссаааада ссдсасгада дагсдссдсд1440 сгааасдгсд адаадсдсда агассадааа саагассг 1_д ас1ас1ддаа садсасддсд1500 сааггдасад ддасгддасд асссдтсдас дсддгсаш дгссад1ддс дссдсагдсд1560 дсдгдсаИс сддддаадга Хдсдасдагс дддгагасдд сдгггаигаа гдгдпдда!1620

ТаГасдадГд сддтгдтдсс ддиасдад! дс1:да1адда дддбддагд! гдгадддаад1680 дааддааддд адгагиггдд ддадПддаГ аддаадассд адддддад1д ГаадИсИс1740 ссшиш спсШсП ггсатгдадс га1ссаа1Т1 ддттддаддГ С11дтд1д1:11800

1д111д11сд дадад1ддтд аХддддГСаХ д1дс1дас1д да!дсЕ1.с1а 1с1адасдат1860 дсддагдгдг гГдагддддс дссддсгддд аисадсгсг ГСддаадасд дсПсаддад1920 дадаадапс 1дд1ас1ддс ТдадХаГсМ ддсдаддаат тсаадааддс Гад1дс11да1980 <210> 12 <211>1752 <212> ОНА <213> АгрегдтПиз гпдег <400> 12

агдсстссс!	«дссссигд	дспсстсасс	ЕссдддЕЕдд	ссдссд1ддс	садсдссаис	60
асгдссаатд	асадсс1сд1:	ддсссддсад	аИдагассс	аассгиссс	сгагдаспс	120
ссссадгтдд	дсдисаагдд	ггссдагсгс	хгтсссагдс	дддасгдсса	ГддсТГсасс	180
сгддаддадд	ссадсагсда	1дада1ссад	дсдсадсгда	аддссдд1сд	спсассддс	240
гсссадсГдс	гдсадгдсТа	ссЕсдадсдс	аТсгассадд	ГссадсссГа	сассаагдсд	300
дтдсгдсад!	Ссаассссда	сдссагддсс	аИдссдадд	сд11дда1дс	сдаасдсаад	360
садддГассд	Гдсдсддссс	сстдсасддс	агсссстгсс	ГддИсаадда	саасагсдсс	420
адгааддаса	адаеддадас	сассдсдддс	адсгдддссс	1сд1сддс1с	сдтсдтссст	480
сдсдатгсгс	асдГсдТдса	ГсдТсГдсдс	саддсдддГд	сддтссгдс!	дддсааддсс	540
асастсадгд	ад1дддсдда	сагдсдстсс	аасдасЕасЕ	ссдадддсга	сгсдддссд!	600
ддгддссад!	дссдсаассс	сгасааспс	ассдисаасс	ссддгддсад	тадсгссддг	660
иссддгдгдд	сгдгсасдад	саассаддгд	сс1111дс1с	тдддгассда	дасдда1дд1	720
адтдтдагса	асссддссда	дсдизсдаас	дгдд1сдд1а	Ссаадсссас	сдгдддгсгд	780
ассЕсссддд	сдддгдгсаг	ссссдадгсс	сГдсассадд	асасддГсдд	сассЕЕСддс	840
аадасддтдс	дсдагдссдс	с1а1дсдсгд	даСдссаГс!	асддсаида	сссссдсдас	900
аасдадассг	а1дсссадса	дддсаадасс	ссддсдддсд	дд!асдссса	дггссгдасс	960

- 37 014853

аассадасдд	сдсрдааддд	ддсддрдррс	ддрсрсссср	ддррдрссрр	срддсадрас	1020
аасдасдссд	сасадаасдс	ссадстдард	даасрдсрдд	сдсгдарсда	ддсддсдддд	1080
дссассаРса	Рсаасддсас	ддадсрдссд	сасрасаадд	адаррдрдда	Рссдрссддс	1140
гддаасРддд	асрасддсас	сасдсдсддс	Рассссаасс	адРссдадРа	сРсдрасдРс	1200
ааддрддарр	рсрасаасаа	сарссдддас	РассРддсдд	адсрсаасаа	сассаасаРд	1260
сддрсдсрдд	аддарсрддр	дсадРасаас	сРсдасааРд	сдддсадрда	дддсддддрд	1320
ссдддсдгса	асссддсдрр	гдссРсаддс	саадасддар	рссгддссрс	дсрддссасс	1380
аадддсдада	рдаасдадас	сРасРддсад	дсдсРддадР	агрдссассд	сасдрсрсдд	1440
даддадддда	РсдаРдсддс	ссрдсасРас	садддгсдда	ассрсасддс	дсрдсрддрд	1500
ссРссддасР	ррдсссссрс	даРсдадаРР	дссдсдсадд	сдддРРассс	ддрддрдасд	1560
срдсссдсад	дРаРсаасса	ддасРсдсаР	ардсссрасд	дасрддсдср	даРдддсасд	1620
дсдррсрссд	аддссасдсР	дагсаадрар	дссадсдсса	РсдаддассР	дсадсрдрсд	1680
Рссаасасдс	сдрддаадсд	садссрддсс	асдрддадсд	дсРассРдда	ссдааасаЕР	1740
ссддрдааср	аа					1752

<210> 13 <211> 1494 <212> ΟΝΑ <213> АзрегдтПиэ птдег

<400> 13 аРдасРагсс саассрддаа арсаассдгд сасаадаадс дсдсадсРса дсрддссдсс	60
аРРссассРд аррддсдрср сссддадрсс аРсасРдссд аРссдссасР сааРдсРсРР	120
даддсааРсс дсРсРРдРда РаРРсРсасд дадааададс аддаарддас ддадарраар	180
дарадгасрд рдсрдсрггс сардсрддсд аассдрдада РРадсЕссдР РсадсРРасд	240
асддсдррср драадсдсдс ддссдрсдсс садсадсгра ссаадгдсрр дасддадарр	300
РРсРРсдаРа дддсдсРадс асдддсРаад дадсРсдаРд аРаРРРРдда ааадасадда	360
ааддрдасдд ддссдррдса рдддсгдссд дрррсаарра аддаРсддгР гдагдгсдад	420
ддагардаса саассдррдд срдддррддд срадрдддса аасссдсдса аадсРссадс	480
адРаРРдсср рдрсдррдда дгсаардддс дсадраррдр ардрсаадас даардрасса	540
садгсрррда рдардрсрда ррссрасаас сагдрдррсд дасаарссар саардссррс	600
аасааасаас РсаРсРссдд рдддадррсс ддсддсдаад дсдсссрсар рддсасдддр	660
ддсадрдрсд ррддрарадд дасадаРагс дддддсрсда РРсдРаРссс ддссааРРРд	720
садддрррар асРсааРсРд Рссрасраса ддгсдадрдс саРддаасРд сРсдРРсаРд	780
сассадсасР ассррдррсс РссадРсдса ддасссардд сссдсадрср РРссадсаРР	840

- 38 014853

даасаигса	1дсаа1ссс1	ссгсдасгсс	аа1сс11дда	аНаГГдаТсс	дддсгдсатх	900
ссаансссг	ддадааадда	аспдсадсд	аадсссасгд	дгааасгасд	ас1сддаа11	960
дгсгасдасд	асддсдГдд!	аааассасад	сссссаагсд	ссадддсааг	дсдсдаадГГ	1020
дсааадааас	Тсааадаадс	1ддсса1даа	дддасадааа	аадаТдадс!	дассаТсТса	1080
даасдсдаад	адсгсдаада	дассааагдд	дсстассааа	ссадстгссг	ссадсаагдд	1140
асаТсаадса	асабсдасдс	сс1ссбса1д	сссдТсасдс	сс!ддд!сдд	с!ассддсса	1200
ааагссгддд	1сд1садс1с	ссад1ддс1с	ддсгасасдд	с1с1с1ддаа	с11дс1саас	1260
гасдсддсгд	гсасгдггсс	ддгддсгааа	диддагддад	сасидагса	дссддагсад	1320
дад1дд«дд	адса1д1дсс	1аддааГдас	1сдда1сддГ	ггааИддда	асадбабда!	1380
сссдассГдд	ГсааадасаГ	дсссаГсас!	д!асааа!сд	Гсддаддссд	сГГГддсдаа	1440
дааааддссд	ГТГсддГадс	сааддгадга	дагдаддпт	гдсаддадсс	с1ад	1494

<210> 14 <211> 1611 <212> ОНА <213> АэрегдтПиг птдег

<400> 14 а1ддсдааса	саасдгддда	дсаТададсс	аададсаадс	аадстсадас	ддсадсадсд	60
аиссассад	аагддасш	ассадссдаг	атасггсгсд	асгссгсддс	даагдтсстс	120
да1д1дссса	ддасстдгдд	дс1сс!дасс	дааададааа	1сса1аР1ас	сдаадас±а!	180
датдссасад	саиасида	ааадссддсг	ассддададх	1садс1сас1:	сдаддгсасд	240
асадсаГГсГ	дсаадсдддс	гдсааггдсд	садсадшда	ссбдссдси	дасддааабс	300
ПсИсдаса	аадсасГадс	сададсааад	садсГсдасд	аааГГсГддс	ГсааасГддд	360
дгаасаассд	ддссасгдса	гддссСдссс	а1аад1а!са	аддадИсдИ	саа1д1ссс!	420
ддадиссда	с1асас1ддд	д«сдрсдда	иг с г сдан с	дддссссддс	д1сса1дад1	480
1ссдссс1дд	пдадаиссг	даасаасгд!	ддддссдис	1а1а1д1саа	дассаатд1с	540
ссссадасаа	Рда1дас1сс	ддасхссса!	аасаа1д1с1	1сдд1сд1д1	дспсаасссд	600
сасддасдда	дссгдассдс	гддаддсадс	адрддсддад	адддадсаи	ддрддсдагд	660
аддддсТсад	ГссГсддсдг	ддддасадаГ	аГсдссддсГ	ссаГГсдсаГ	ссссдсссСс	720
ГдсбдГддГд	ИИГддИ!	сааасссасд	дс11дссд!а	Гссса1а1дс	аддГсааасд	780
гсгдссдддс	дгссдддга!	дасдддсагс	сТдссдгссд	ссдддссса!	дгдссаггсг	840
а1ссдсда1д	садаасиси	1с1сааад11	д!сс1саас!	сдаддссгдс	сдагс1дда1	900
дассагдсас	гсдасаигсс	агдд1сссс1	дссссдсааа	аддададдс!	гасиаггддд	960
с1сс1дсссд	аддасссдтх	дР1сссдс!Р	са!ссассда	ГдсдасдГас	ссгдаасдсс	1020

- 39 014853

дсадтдаадд	сдсгдастас	адссддасас	сдддтсатсд	асстстсадд	асаддсгссд	1080
ссссгсгсса	агдсагдгсс	тсгддсатгд	сдасаы 1сд	дссгддассс	ддахсдаасг	1140
дсасТдсдсс	асаГаасдса	ддсдддсдаа	ссГГГсаггс	сггсдсгсаа	а£1сасс1ат	1200
дагстсаагд	адссдасасд	тдадсссасс	ГТдададаГс	ТаГГсдааГс	даатдтсдсс	1260
сдгадгсадс	Ссдсаассса	ддсасдааад	с1с11сд11:д	агаагсадс!	гдахсгдггс	1320
сгдддсдсдд	сбгаисааад	саса^сдди:	ссссагдаиа	ссгасддгаг	гссддиагаг	1380
ассдтдсггг	ддаассГдаГ	ГааГГаТссд	дсдЕдсдГГа	СсссаГГГдд	дсаддссаас	1440
ааддгададд	асдсадсдГа	1:аассдсдас	дгс-ЬсИаид	1:дссадасГа	1:сддссадаа	1500
даааГГдаад	дсдсассдГд	гсасагсса!:	сХдаГаддса	дассдаГддс	ддасдааааа	1560
ггддггсадд	аГдсдаадас	гагатдсасс	дГааГдадгд	аГдГсГсГТд	а	1611

<210> 15 <211> 1623 <212> ϋΝΑ <213> АзрегдтПиа гпдег <400> 15

аГддсадГсд	аасадгддда	дасдаГТдГд	саааадааас	аддссдасдс	адссдсГаад	60
аггссссадд	саСддсддсе	ассддсГдаа	ггсасддсдс	аГдГдГссда	аасадссГсС	120
асгаандгдс	бсдагдгдсс	ГсдсаадГд!:	ддсидгсдг	сгдсгаадса	аГГддаааГГ	180
асГдадааГТ	агдасдссас	ддссидскс	дадсадабсс	а1±ссддааа	дсСдаскдсС	240
дггдаадгсд	ссдаадсаГГ	ГСдссГТсдд	дсддссаГсд	сасадсаадг	дасдсдсгдг	300
с1дасгдада	сагмхггда	гсггдсигга	дадсдадсаа	аддадсгдда	сдадгагиг	360
сад1с1ассд	даааддгссд	ддддссдсГд	сасдддсСдс	ссагсадгсг	сааддасСдс	420
гесаагдгсд	сГддГдИГСС	ааасасаа!ΐ	ддсггсасгд	ссггсагсдс	ссасдд1ссс	480
дГЕаадааса	асСссГсГдС	сдГссадаГс	сГссГГдасс	ГдддсдсддГ	ХсТсГаГдГс	540
аадассааса	ГГссссадас	ааТдаТддсс	дссдасГссс	асаасГасдГ	сГГГддГсдс	600
асссГсаасс	ссаассдаас	сааасисадс	дссддсддсГ	ссгсаддгдд	сдааддсдсс	660
сгдаидсса	Гдсдсддагс	аагссгдддх	дИаддсассд	асагедсадд	сГссаТхсдс	720
агссссддда	гсгндасдд	ааса1а1дсс	сгасдсссд!	сгагссагсд	саггссссас	780
ддаддссада	саддаИссдд	ссдсаадддИ	сСадсдддса	ГссдасссГд	Хдссддссса	840
сгадссаси!:	ссдЕдсдада	ссХсддСсГа	ггсагдаааа	садгсдеада	саСсдасссс	900
ЕддсааГасд	асгссгсдас	сагсЕЕсадс	ассГддсдаа	ссдссссгсс	дааададасс	960
сГссдасСсд	дсИсаГсст	сдаадасссс	саИГссссд	ГасасссГсс	саГГсСсаас	1020
асдсгдассс	дсдсадгсда	ГдсссГсааа	дссдссддсс	асдаадгса!	саассгаасс	1080

- 40 014853

ассссахсса	Хсададасдс	ССХССХХСХС	ддсххссдаа	ссххсдссах	ддасссддса	1140
сдаассдсах	хсадссасах	сасХаададс	ддсдадссас	дсахсссхдс	ХсХдадаасг	1200
ассдахсхдс	сааасдсада	ХХХдссаХХГ	даахдддссс	сдсахасссх	сдадхсссхх	1260
ХахдаГсХда	ахдхдсадсд	ддадасдсХд	хдсдадсадх	хссдасадхх	даХсдХссад	1320
аасаадаххд	асдсдахсах	хахдссдддд	ХаХсадддса	садсддхддс	асахдахсад	1380
дхсддахддд	хдссдхахас	хдххххддсх	аагдХХХХдд	аххатссддс	Сасдаххахх	1440
сссхасадаа	аддсддахаа	ддсхдахдас	дссаадхахд	ХсадддаХдХ	дасххассда	1500
ссдссххахд	ХХдсддасда	сдхддадддс	дсдссдхдсх	дхдхдсадсх	Хахдддаада	1560
асаахдсасд	аддаддадсх	ссХдсдддаХ	асхдсдахсд	ххдссадддх	сХХддддааа	1620
хда						1623

<210> 16 <211> 1740 <212> ϋΝΑ <213> АзрегдтПиз п1дег

<400> 16 ахдсххсссс	ссхххдахха	схххасдхах	сдХсдсахсс	дддассХсаа	даддадддаа	60
сдддсддсХс	дахххдсахс	дсхахсхссс	даххахсахд	сдсссххсхс	ддсхахсдас	120
адддххахса	ХХаасаадсс	ХаХссаддас	ххддхахахд	аддХссадаа	хдаххссххд	180
дсассхххад	ахдхссхасд	сасахасддс	ааддххдсад	Хсааддссса	сдаааадасс	240
ааХХдсдХда	схдадсххсх	аххдссхдад	дсадаахсах	дддсхсадхс	сдаадхааас	300
схааааддхс	сссхддсддд	хдхдссхахс	хсхххдааад	асхсддхдса	адхсааадда	360
ххсдахахха	схсхддддха	хассаадХХс	дсдхдхааас	сдхахаадда	ддахддхсса	420
аХддсааадс	ХдХХдаадда	хдсхддхдсд	дхсссахахд	сдаааасддс	дсхдсссдхд	480
асдсХХсХдХ	сдххсдаахс	адсааасдсх	схххддддхс	асхдссххаа	сссасахдхс	540
ссддааХасг	схссхддсдд	схсдасдддх	ддХдааддХд	схсхдсхддс	ХсХХддХддХ	600
сдсахсддха	хсдддхсдда	ХдХсдсХддс	ХсддХХсдсд	ххсссдсхдс	схддадсддс	660
ахсхасхссс	Хссдсхдгад	хасхддссдс	Хддссгаадд	Хсддадхсаа	сассадсахд	720
дсхддссадд	ааддхдххдс	садхдхсххс	адХссХаХдд	сссдхасххх	даасдаХсХс	780
ассхахххса	ссааадсхах	хдхсддаахд	аадссххдда	асхасдасса	ХассдХссас	840
ссхахсхссх	ддададаада	ХдаддаааХХ	даадсссааа	асааааддхх	даддахсддс	900
схсахдадса	асдахддхдх	сдххссссса	асдссддсса	ххдаасдхдс	ХаХХХссасс	960
асадхадссд	сссхсассдс	сдсхдддсах	асхдхахсхд	адахсасасс	ссссдсхдсд	1020
дсхдасасхх	ХХасХддХсХ	сХсссХсдсс	ХсдсадсХдс	ХсаасХсХда	хдддхдсдхс	1080

- 41 014853 асдГХхаасХ сдсахсхдса садсХХХдад ссахссдасс сГддхдсада Хсадсгдасд1140 сддахахдса ахсхдссссд Сссхсхасдх хахсхсхасх ассхххдддх хсддхасахс1200 сдасдддахд адаадхдддс дасдсхдахс сдсдддхххд сссссаадхс хдсддсддад1260 схххддаадс ХсасХдссса дсдддаадсх ххссдддсда ссхддсасад схддхдддах1320 дссдадасдс адсадХасда хххсахссхс хдссссдхса ахдсдасдсс ддсхсхдссс1380 сасааадсса хдсасдахдс ддхахссхса ХдсддаХаса сдххссхсхд даассхдсхд1440 дасхасасад ссддхдхсдх дссхдхсхсд сасдХддасд сдаадаадда хдсхсхдхсх1500 ддХссдХаса адааддХдсХ дааасадсХд ддадссадса асдсддХддс сХасддХдсс1560 хддаадсасх асдасдсддс даадахддсд ддаххдссха схдсадхдса ддхддхддда1620 сдсадаХддс аддаададаа ддхдсххдда хасаСддсдд садххдадда ддссххддад1680 садхахсадд асссддхаас хддадааддд дддааахасс саххдаххда дсххдасхад1740 <210>17 <211>1590 <212> ΟΝΑ <213> АэрегдтПиэ гпдег

1 1 './уу,· 4-/ ахдхсддхах	хдххсасххс	хахххсдссд	дасаасссдд	Хсаададдда	адахдсддсс	60
Ссссххсхдс	дсааххтдда	хсхссахахх	дассаадаад	ахдаддаада	ххххсахасс	120
схссхддсад	ссдхссахда	схдсдссдаа	ассдхддсда	ассхдссада	схахсадсса	180
дхссссдахс	хадахсдаха	сссхсдасах	аахдтхсасс	дхссахссхс	ададдаасаа	240
дхахххдддс	аддссхдддс	хсасаадххх	схдахсаадд	дсаахссдда	дддадддсха	300
ХХдасдддда	адасдаХсад	сдХдааддаХ	ХдсаХХдссд	ХХдсаддХдХ	ассасадХХд	360
сххддаадхд	ахахсаххсс	схсххддаса	ссааххасад	ахдсдасддх	хдхдасссда	420
дХХСХСдаХд	схддхдсхда	хаххсахддх	асххсдасхх	дхдаааасха	схдссаххсс	480
асддсдхсхх	ХсасдадХдс	хсааддаасс	дхддадаасс	схххсдсдас	сддахасхса	540
дсхддсддаа	дсассхсадд	аддддсадсс	ххддххдсад	схддхххддх	хдасахХасд	600
схсддхддад	ассадддхдд	аадсахгсдд	дххсссхссд	сдхххтдсдд	ХХдХдХсддс	660
ххдаадссха	сахахдддсх	ддхдссхххс	адсддхаххд	схадсддада	хдстахтдах	720
дассасасдд	дсссдсххдс	Гсдхаахдхх	аХсдасдгХд	ссхсххдсхх	адасдсхаХс	780
дссддсхахд	ахддсахада	сдахсдахдс	схддддадхс	схааасасдд	схсхассхсд	840
ХХсдссаадХ	сдсххсаадс	ддасдсХасд	аддсХсдасд	дсххсаааах	аддадХсХХд	900
ааддааддах	ххдадсасас	Хдсхдхддас	сссдсадхса	аададхсддх	сахддсддсс	960
асссадааах	ххдсддадсх	Хддсдсааса	дхсдаддадд	хахсхсххсс	адассасхас	1020

- 42 014853

сардддссрд	сраратддас	саррсадсад	сдРдРаРсад	дсрссррдас	дсРдсРРдда	1080
саддсасард	дсадаадддд	дсРсРасаРд	асддадардд	адсдрдадад	асрдссдрдд	1140
асдааддаад	дсРРРсааад	адссРРссса	дссасдаада	асдррараар	саарддссрс	1200
рарсррасср	сдсдсрррсс	рдасррдрас	дддаааРсад	рдааРаРсдд	ссдааддсРР	1260
сдддассрср	асдаддаРсР	дсрссаддад	расдардрдд	ррдраардсс	аассасессР	1320
дррдррдсас	саадасардд	рдсасдаддс	сРассддРсд	адрсрсрдаа	дссРадсаРд	1380
ддсррдасаа	Рсаасасадс	аарррррдар	дррасдддас	асссадсдаг	дадсаРасса	1440
дрддддрасд	сРссддссаа	ддаРдаРссс	саадрсаадс	рсссддрсдд	рардсадарр	1500
дрсддадддр	РдРддсадда	дрррааддра	сРсааадсдд	дарардсард	ддадааааас	1560
РасдаРРдда	аададдрддс	дадрсаррда				1590

<210> 18 <211> 1428 <212> ОМА <213> АзрегдтПиз птдег <400> 18

аРддсРсдРа	рсдарррдрс	сдадррдаср	аРсдссааад	рдсасасддс	аРРссдссдс	60
ддадасраса	дрдссдрдда	рсрддрссаа	дсграрррда	дасдсарсда	ссаддрдаас	120
ссдсддсРса	ардссарсср	ддссаРсаас	ссдаардсдд	Рссаадаадс	Рсаадсссрд	180
дасдардсср	рссдадсррс	ссдсасарра	сдсссасРсс	а1ддддрдсс	адрдсрддрд	240
ааддасааРа	РсРРсассас	сдсдардссд	асРасРРаРд	дррссааддр	сдссдсдРсд	300
сдсссадрар	РассссРсда	сдардсссад	дрдарсааас	адсрдсаадд	сдссддддсс	360
аРсаРРсРдд	сдаадассас	РсРдссддаР	рдддсдассд	асррсррсад	сдссРсдасР	420
дрсрсдасдр	ддасссадаа	ссссрардас	ррддсрсдад	асссдддсдд	ррссадсадс	480
ддсассдссд	сддддаРсдс	адссаассрд	дсРРРддРсд	дсдрдддрас	ддасасдддд	540
ддсрссаРсс	ддсрдсссрс	срсдррсрдр	адсррддрсд	дсардсддсс	сассдрсддс	600
срдассадсс	рддарддсдр	дрсссссррр	дрдддсрдсс	аадарассдр	аддассдард	660
рдрсдсассд	Рсассдасдс	сдсдсдсрра	срсдасасдс	рсдрссрдсс	сассадсссд	720
саарсссрдд	срсссадсдд	аддсрссрас	дсддсдсарс	рссрдссада	садссрсссд	780
ддрсссдррр	дрсрдддсса	РсРдссасад	срдддрдсдд	аддаддсддс	сдрддаддса	840
срсррсасрс	аддрссрсас	ссдрсрдсдс	ддасаРдсРР	сддрсассдр	ссдддасррс	900
даРаРРссда	десРсРссРс	сасдсРсдса	дсадссРсРа	РсаРдсРсад	ссдрддссаа	960
саРдаРсРсд	асдасррсрр	дсддассасд	дрддддасса	дрсрдаадас	дарсраРедд	1020
даРсасдссР	асссдсссас	саасРРсдда	арассддддд	Радсаасдса	рдсррсдасс	1080

- 43 014853 сгдасддасс дсгссасддс сгссаасдсс сдсдаТдссс гсдассдсаг аа£аасадсс

1140 сагсгдддсс аддсдддддг сдаад1ас1с дгдишда ссдсаддасд ддсадс1ссд

1200 сдссаддадд агагсасссс ддадагддда дГдассггсс ссдгдсагдс сагдстддсс

1260 адсасдсгдс адгддссадс сагсгсадгд ссаагсдддг игасадсдас сддссгдссс

1320 дхдддастдд ада1сс1сдд саддссдсгс адсдассаас дсхгдиада адгддссш

1380 дддасдссдс ссссссассд гадаггда

1428 дграгсдадс адаггдИса

<210>	19
<211>	1818
<212>	ΟΝΑ
<213>	А5регдт11и5 птдег

<4ОО> 19 агддасдада	адссХсадгт	сггссадтаи	ссададдссс	дассдддгсс	сдсгдгдссд	60
гасаадаасд	аддадсаддг	да1ссссд!с	агссд1ддс!	ПсссИддс	ссТсддсдсс	120
аСЕСТТдГЕс	аааатагсдд	стттагссад	адссаГсгс!	дддддассас	гддсггсдаг	180
дгсатссдса	асс1ссс1сТ	сдассаагас	Уссдсссдсг	а1да1ссдас	сд1дагсссс	240
дгадссадас	сгда1дс1гс	ддсгдссдас	ИдссадИс	ссасдсаааа	дсдасааадс	300
аардсаддат	ас!асасггс	тдссдасГа!	дгадстсдс!	агаспсддд	сдадидаср	360
ссссхтдссд	гсдгсдадас	ссгдсУссс!	сгдагссдсс	дсдагдссаа	ассасссддс	420
аадсасгсда	тсдсстсг	гдааГсдсаа	дХсдасаада	ггсдсдссдс	адсададдсг	480
гстасасада	дагасааада	гддсаадсса	сгдддгссаа	гддахддса!	ссссдтсдса	540
аиааддатд	аадтасага!	ддааддатас	сдасддассс	Тдддсадсаа	асгсдасис	600
ассддсдадг	Пададдсас	ссстгддгд!	дТдаадсаа!	дддаддаадс	сдд1дсса«	660
д1саТ1ддса	ааассагсаг	дсасдадигд	ддгсУадаса	ссасааасаа	саасссаааг	720
Исддгассс	ссадааассс	ссаТаасссс	дас1а11ас1	дГддсддсИс	сТсТддаддс	780
ГсРддсРасд	срдгсддсдс	аддссгадгс	сссаГсдсСс	гаддсдссда	сддсддаддс	840
1саа1ссдса	1сссддсс1с	с11с1дсддс	дТсЕддддас	гдаадсссГс	ссатддссда	900
дгдадсддсг	сгсссассдг	сгсасУддса	гссассассд	дсдгсгасдд	сссссгадсс	960
ГссадсаГсд	асдассгадс	сстсдсстас	сдаагсагдд	ссасдссддс	сссадаатсс	1020
1садассссс	гагсадсадс	сггссссгса	ссссГссдса	сссгссссгс	сссаассаас	1080
аасассссаа	даассагсдд	сатсдгасдс	дасгддагсд	ассдсдссРс	дссгссадгс	1140
сдсдссдТс!	Гсаасдссас	ссТсдассас	Тассдсасдс	рТаадаасТа	сассаТааТс	1200
дасагсасда	1сссс1асс1	ссссдадддд	сааааадсдс	асдсгсгаас	са1сс1а1сс	1260
даад!дасс!	сд1гссс1сас	ссспсасад	агсгсссадс	гсасдсссдс	саасаааатс	1320

- 44 014853 агддсггсаа гдддсагдчд дсааахсааа ддссаддаи гссгсдссдс дсаасдгстс1380 сдгаандбс гсахдасдса гсгддсбсас 11д11ссада аасасссбдд с11да1да1с1440 дбсасдссда сдасдссса! сссдддд!дд аадабсдадд дсддсдаддс ддаИсИаад1500 сдсддсдтд! сдда1дддаа 1асдассд11 аддааСаСдд адга1д1с1д дИддсдаа!1560

НсасдддИ дчхсддсда! 1ад1ГдГсс1 дс!ддд1аГд абдИНдда ГддГдддГсд1620 адддбдссдд 1ддддд11а1 ддсда!ддда дадбддддда дГдаддадда дИдаИдсд1680

Исдсдаддд агддддаддд гдтгпддаг дддасгдсгд сгдсгдахдд га1ддадсад1740 адс1сдддд1 1дасдд11сс 1сддддддаа адддсддси дддаддабд! 1а11дс1ааа 1800 дсбддддада даадагда1818 <210> 20 <211>1515 <212> ΟΝΑ <213> АьрегдтПиз гпдег

<400> 20 ахдхсдсхсс	1дсдддаадс	сдадаад1дс	иддсгаагс	адддс1с1са	1дсддс1с1а	60
ааХдсдсХаа	Нассассс!	аса!сад1са	ддасаа1дд!	1ддаасд1д1	дадада!дсд	120
дахдсдсддс	дсасссдддд	дасдсс!ааа	1с1дада1ад	а!ддссдд11	ддИдссдЮ	180
ааддасааха	1д1дсасасд	сдассСГсса	асааса!дсд	сисааасдс	ГсСддасааа	240
ххсдхсадгс	сднгаасдс	дасад!сд11	саасааНдд	аддасдсадд	сдс!д1сд1д	300
дссдддааад	с1аа1сгсда	сдаангдда	агдддс1ссс	асгсгаигса	ггсааэсттт.	360
ддсссХдХса	даадсСсдсд	ссдбддссад	датдсадаа!	асс1с1садс	сддгддсад!	420
гсдддхддаа	дгдсддИдс	1д!1дсдаса	дсссаа!д11	асдсадсдИ	дддаасбда!	480
асаддсддсХ	ссдтдсдаИ	асссдсадса	1а1асдддаа	сад1сддсгг	саадсс1Сс1	540
хахдддсхдд	1с1с1сдс1д	дддад!дд11	дсдбасдсга	аИсасГдда	1асад1сдд1	600
дхасхдддаа	дддасдгддс	садсдПсдс	сагд1с11сд	дсд-Есдгдаа	ссадсагда!	660
хсасдсдахс	ссасгаассг	1ГС1ССС1СС	адгсддбсас	дда!адас1с	асабсИааа	720
агдхсгдсгг	тддсагсгсд	дасаадпсг	ссгсггадда	гаддадгссс	гсгсдадгас	780
аасахахсад	адн.дгсссс	агсбдсдсда	са1дсд1дд1	с1сдс1с1с1	ддссбашд	840
саасдасадд	дссабадса!	ссааасдд!д	1ссс11ссаа	сдассааас!	сдсс11а1сд	900
дсахаххасд	1ас1сдсдсс	1дс1даддса	1сс1сааасс	1ддссаад1а	гдасддсдис	960
аддХасддаа	дссдссссда	адсассадас	ддааа!дса!	са!садааад	д1а1с1а1а!	1020
дсдаааасас	дадд!да!дд	дИсддггсс	даадИсаааа	дасдааПИ	дсгсддддса	1080
хххадссХаа	дсдстдасдс	1агдда1аас	1ас1!сатгс	аадсасадсд	ддггсдссдс	1140

- 45 014853

сккдкссаас	акдаскксаа	сдссдсдккк	адддсакдсс	адссаккдак	ккссксдсаа	1200
сккддаксаа	адксдддккс	кдсадасасс	ддкдкадакд	кксксакккд	сссдасадсд	1260
ссаксаксас	сассасдсак	кксаадсскк	акаддасскд	акдсдасаас	кксдсскккд	1320
даддсакака	сдаакдакдк	акккаскдкд	сскдскадкк	кддсаддкск	кссддскака	1380
кскдкдссдд	ксаскасада	ааакдскдаг	ддсдссдадд	акддадакск	ддсгддаакс	1440
саадкааккд	дссаакасдд	кдакдакдад	сккдкдккаа	аддккдссда	дскдсксдад	1500
ддсаддсасс	какда					1515

<210> 21 <211> 1911 <212> ЭМА <213> АзрегдтП115 птдег

<400> 21 акддкдсдсд	скасссааск	ддскдкддсд	дссскддддс	кдсккддкдс	адсддссдск	60
сааскддкдк	саасаддсак	дкскдксасд	сксдассада	ксдаккаскк	сдксксксса	120
касссадсдд	дааакдкдас	ддкдкссдсд	дсскссскда	садакакссс	садкдксаас	180
ддсккскакс	ссдкдаскдк	кдкксаадад	дадасддскд	дддкаксакс	аскдксакск	240
сккккскска	сдкддасдда	кдкддакдак	дкдкккасдс	ссдсскксск	дддкдсддкс	300
ккддкссдкд	дскасааасс	сдасаакдкс	аскдсаасск	кккксаасад	кксдсдсксс	360
адсдккскса	дсссдккада	дкссадддкк	дккссдксад	дсссакаскк	ссксдаасад	420
дссаскддаа	акскскаксс	ддкскассдд	скскасадсд	аскакдсадд	сдсскксаса	480
садссаскас	гасаааадсс	адакддсаса	ккссадссдк	кдксддсаса	адкддссддк	540
ккддксксак	ссаскаксдд	кдкдссскск	сдсакскаск	акассссаад	сдакдадааа	600
ссдскддссд	дкдсксдкдк	кддсдккаад	дасакккаса	дксксдскдд	сдкдсддсад	660
адсаакддаа	ассдддсакд	дкасаакскк	касддадада	асаакдксас	кддсаскдсс	720
дкаксдсдсс	кдаккдакдс	аддсдссакс	аккдксддас	кдсадаадсс	сксасадккк	780
дсдаасддад	ааасддскас	адскдаскдд	дксдассккс	асксдссскк	саасссасдк	840
ддадакддск	ассаддассс	кксккссксс	ксдксаддсд	сдддддсккс	саксддскск	900
касдаакддс	кддасскддс	кскдддкадк	дасассддсд	дскскакссд	сааксссдса	960
даадкссадд	дадкскасдд	кксссдксса	ксссасддкс	ксдккдааск	кдассакдкс	1020
акдкссакдк	сдсскдкдкк	ддасаскдсд	ддадкдскда	саадддаксс	ккагскккдд	1080
дассдддсса	ассаадсскк	дкакадсасс	ааскасасск	сдккссакдд	саааксадкс	1140
сдскасссса	дсаадскдка	сассаксдас	кксссаасаа	ссаакдаскс	кдсддсадас	1200
дскскдскдд	скддакккса	ааадсдсскд	дссдсдккск	кдаакасдас	аассассссд	1260

- 46 014853

сРддаРсРаР	сРдасдасРд	дРсдРсдсаР	ссдссаРсса	дсдсрсссдс	сааРдРсРсд	1320
сррдадасрр	рдсрраасср	дассрассса	ардсрдарса	ссаадсадса	даРсссРсРа	1380
дррадддарс	сРРРсРасдс	сдасРаРдсР	дсРааасасд	асддссдадр	ссссРРсдРс	1440
дассссдррс	срсрсрсссд	дрддаасрдд	РссаРддсдр	асссрдасрс	рдсасрддар	1500
даадссаРсс	асаасаадас	дсРсРРсаРд	дасрддаРсд	сддадаарра	рсрсасрссд	1560
арсрссдарс	срдадсадрд	срссрсдрса	срраррдрср	асдрдддсас	сдаРддсРсс	1620
садададсдс	драардрсра	рсдррсдсрс	сссддсдсас	ссРсдддсРа	садсаааррс	1680
срсарсрсса	аРаРддсдад	рдрдссддас	рррдрсаррс	срдрдддада	даРРдаддсс	1740
Расадсасса	Рсасдсадса	ссаддадаад	РРРссРдРсд	ссаррдардр	рррддсрдср	1800
ааддддрдрд	асддаРРдсР	адрсаддсрд	дсрсаддарр	РаРРсдаддс	рддсаррарр	1860
аардсассдр	рддсдддрдд	дасдсрдаср	ддрдддссад	рсррарсррд	а	1911

<210> 22 <211> 1695 <212> ϋΝΑ <213> АзрегдтПиз птдег <400> 22

аРддсссРса	сарссрддда	асааассдса	дсддссааас	дссаарссдр	ссрсаасдсс	60
аРссссдада	аарддсдсар	саадддрсср	аРссссдсас	сдрсддадса	дсдсдасдра	120
асаддсссср	асарссадса	дррссрарсс	ссасдсдадд	РРдаааРсас	сдааасадас	180
дссдраддда	Рсасададсд	аасРасаасд	ддссадрдда	садсрдрдда	ддрдассдад	240
дсдррсрдсс	аРсдсдсадс	аРРддсдсаР	саасРсдРаа	асРдсРРдса	рдаааРсРРс	300
РРсдаРдссд	сдсРРдааас	сдсссдсаРР	срадасдасс	асРасассаа	дассддсаад	360
ссасРсддРс	сссррсасдд	ссрсссрдрс	адрсрдаадд	аРсааРРсса	сдрсаадддс	420
драдааасаа	ссардддрра	сдрсддсрдд	арааасасср	Рссааддсаа	дассаардас	480
ссдсдсрарс	РРасасасда	аадсдаасрс	дррааадаас	Рссдсдссдс	дддадссдрс	540
срсрасрдса	адасРадсдр	ссссардасд	ррдардрсад	дрдааассар	даасаарарс	600
аРаасРРаса	сасаРаассс	даадаасадд	сррсрсадрр	срддаддрад	РРссдддддс	660
дааддадсас	рдарсдсдрр	дсддддаРса	ссадссдддр	ррддрасдда	РаРсдддддР	720
адрарссдрд	РРСсРдсдРС	дррсаардда	срдрарддда	РасддссдРс	рдрддддада	780
ардссдрасд	адддддсддс	сааррсдддс	дарддасада	арасрдрдрр	дрсддррдрд	840
дддссдррдр	срссррсддс	дададддррд	аРаРРдсРдР	РсаадасддР	дррдддддса	900
ардссдрддр	рдддадарсс	рддрдрдррд	дадаРРсссР	ддадддадда	ааРсдРадад	960
дадасдадаа	ааррадрдса	дддааадсса	даддддсРад	сррррддаар	аррсрасдар	1020

- 47 014853

даТддТсадд	Тааадссдса	дссассддСс дадададсда	гдсддаггдс	Тдсададасд	1080
аТсаадсдТс	ТаддасаТаа	дстса1саат	Гдддаасссс	сстстсасст	аасадссдсс	1140
ТсссТсдсаа	ассдсдсста	саасатддас	ддсддсдссд	асдТасГсса	ааасгтсдсс	1200
стдтссаасд	аадссаГсса	сассгссдга	дгаатсдасд	сатсаддатс	сссссаааад	1260
ассдсастад	адатсдссдс	дстааасдтс	дадаадсдсд	аатассадаа	асаатасстт	1320
дастастдда	асадсасддс	дсааттдаса	дддастддас	дасссдТсда	сдсддтсасг	1380
гдтссадтдд	сдссдсатдс	ддсдтдсатт	ссддддаадг	аТдсдасдаТ	сдддсатасд	1440
дсднтана	аТд1д1Тдда	ЕСаСасдадг	дсддгсдгдс	сддТТасдад	Тдстдагадд	1500
адддгддакд	стдтадддаа	ддааддаадд	дадтаттнд	дддадттдда	1аддаадасс	1560
дадддддадт	асдатдсдда	тдтднтдат	ддддсдссдд	стдддатгса	дсгснтдда	1620
адасддсИс	аддаддадаа	дагтссддга	стддстдадт	аГсНддгда	ддаансаад	1680
ааддстадТд	сида					1695

<210>	23
<211>	583
<212>	РКТ
<213>	АзрегдШиз м'дег

<400> 23

мет 1

Рго Зег

РНе

А1а Зег тгр 5

|_еи 1_еи тНг Зег С1у 10

1_еи

А1а

А1а 15

Уа1

А1а

Зег

А1а

Не

ТНг

А1а

АЗЛ

Азр

Зег

1_еи

νβΐ

А1а

Агд

61 η

11е

АЗр

20

25

30

ТНг

61 η

Рго

РНе

Рго

Туг

Азр

РНе

Рго

61η

1_еи

61 у

уа1

АЗ П

61 у

Зег

35

40

45

Азр

|_еи

рНе

Рго

МеТ

Агд

Азр

Суз

Н1 5

б1у

РНе

тНг

1_еи

61υ

С1и

А1а

50

55

60

Зег

11е

лар

61 и

И е

61 η

А1а

61η

1_еи

ьуз

А1а

61 у

Агд

РНе

тНг

б1у

65

70

75

80

Зег

61η

|_еи

1_еи

61 п

Суз

Туг

кеи

61 и

Агд

11 е

Туг

61 п

уа!

61п

РГО

85

90

95

туг

тЬ г

АЗП

л!а

Уа1

ьеи

61 η

РНе

Аз η

Рго

АЗр

А1а

мет

А1а

Не

А1а

100

105

110

01 и

А1а

!_еи

АЗр

А1а

61 и

Агд

1-У5

61 η

б!у

ТНг

Уа1

Агд

61 у

РГО

|_еи

115

120

125

- 48 014853

нтз

<31 у

И е

Рго

РНе

:_еи

Уа1

1_у5

Азр

А5П

11е

А1а

зег

|_уз

Азр

Ьуз

130

135

140

Мес

<Ли

ТНг

ТНг

А1а

61 у

Зег

тгр

А1а

1еи

Уа1

61 у

зег

Уа1

Уа1

Рго

145

150

155

160

Агд

А5р

Зег

НТЗ

7а1

Уа1

нт 5

Агд

|_еи

Агд

61η

А1а

61 у

А1а

Уа1

Ьеи

165

170

175

1_еи

61у

Ьуз

А1а

ТНг

1_еи

зег

61 и

тгр

А1а

Азр

меС

Дгд

Зег

АЗП

Агр

180

185

190

туг

зег

61 и

61 у

туг

зег

61 у

Агд

61 у

61 у

с1п

Суз

Агд

АЗП

Рго

Туг

195

200

205

Α5Π

РНе

ТНг

Уа1

А5П

Рго

61 у

С1у

5ег

зег

зег

61 у

5ег

б1у

Уа1

А1а

210

215

220

Уа1

тНг

Зег

АЗ η

61 η

Уа1

Рго

РНе

А1 а

1_еи

61 у

ТНг

61 и

ТНг

Азр

61 у

225

230

235

240

зег

Уа1

Не

АЗ П

Рго

А1а

61 и

Агд

Зег

Абп

Уа1

Уа1

б!у

11е

ьуз

Рго

245

2 50

255

ТНг

Уа1

б1у

|_еи

ТНг

Зег

Агд

А1а

61у

Уа1

Не

РГО

61 и

Зег

1_еи

НТ 5

260

265

270

61 η

Азр

ТНг

Уа1

61у

ТНг

РНе

С1у

[_уз

тНг

уа!

Агд

Азр

А1а

А1а

туг

275

280

285

д!а

Сей

АЗр

А1а

11е

туг

61 у

11 е

Азр

рго

дгд

Азр

Азп

61и

ТНг

Туг

290

295

300

д'] а

61η

61 п

б1у

1_уз

ТНг

РГО

А1а

б!у

61у

Туг

А1а

61 η

РНе

1_еи

ТНг

305

310

315

320

АБП

61 л

тНг

А1а

1_еи

ьуг

61 у

А1а

Уа1

РНе

61у

!_еи

РГО

Тгр

1_еи

Зег

325

330

335

РНе

тгр

61 п

Туг

А5П

А5р

А1а

А1а

б1п

Абл

А1а

61 η

Ьеи

мес

61 и

Ьеи

340

345

350

1_еи

А1а

1_еи

Не

С1и

А1а

А1 а

61 у

А1а

ТНг

Не

Не

АЗП

б1у

ТНг

61 и

355

360

365

1_еи

рго

НТ 5

Туг

ьуз

61 и

11 е

уа!

АЗр

Рго

Зег

61у

Тгр

АЗП

Тгр

Азр

370

375

380

Туг

61 у

ТНг

Тб г

дгд

61 у

туг

Рго

АБП

61 η

Зег

61и

туг

зег

Туг

Уа1

385

390

395

400

- 49 014853

гуз

Уа1

АЗр

рНе Туг 405

А5П АзП

11 е

Агд

Азр Туг Геи 410

А1а

61 и

геи 415

Азл

А5П

тНг

АЗЛ

меЕ

дгд

Зег

геи

61 и

Азр

Ьеи

Уа1

61 η

туг

Азл

геи

Азр

420

425

430

АЗЛ

А1а

61 у

Зег

01и

61у 61У

Уа1

Рго

61 у

Уа1

АЗЛ

РГО

А1а

РНе

А1а

435

440

445

Бег

б1у

61л

Авр

61 у

рНе

Ьеи

А1а

5ег

Геи

А1а

ТНг

Гуз

61 у

61 и

МеЕ

450

455

460

А5П

С1и

тНг

туг

Тгр

61л

А1 а

Ьеи

е!и

Туг

суз

НТ 5

Агд

тНг

Зег

Агд

465

470

475

480

61 и

61 и

61у

11е

АЗр

А1а

А1а

ьеи

Н1з

Туг

61п

С1у

Агд

АЗП

Геи

ТНг

485

490

495

А1а

1_еи

Геи

Уа1

Рго

Рго

Азр

РНе

А1а

Рго

Зег

Не

61 и

11 е

А1а

А1а

500

505

510

б1п

А1а

61у

туг

РГО

Уа1

Уа1

ТНг

Геи

РГО

А1а

61у

11е

АЗЛ

61 η

Азр

515

520

525

Зег

НТ 5

мет

РГО

туг

61 у

1_еи

А1а

Ьеи

мет

61у

ТНг

А1а

РНе

Зег

61 и

530

535

540

А1а

ТНг

Геи

11 е

гуз

Туг

А1а

Зег

А1а

11е

61 и

Азр

Геи

61 η

Геи

Зег

545

550

555

560

Зег

АЗЛ

тН г

РГО

тгр

1_уз

лгд

Зег

геи

А1а

ТНг

Тгр

Зег

61 у

туг

Геи

565

570

575

Азр

Агд

АЗЛ

11 е

Рго

Уа1

АЗЛ

	580
<210>	24
<211>	497
<212>	ΡΚΤ
<213>	АэрегдтПиэ птдег
<400>	24

МеЕ 1

тНг

11е

РГО

ТНг 5

тгр

ьуз

Зег

ТНг

Уа1 10

НТ 5

Гуз

1_у$

Агд

А1а 15

А1а

61л

Геи

А1а

А1а 20

11е

рго

Рго

Азр

тгр 25

Агд

геи

Рго

61 и

Зег 30

11е

ТНг

- 50 014853

А1а АЗр Рго

Рго Хеи

АЗП

А1а

хеи 40

61 и А1а Не Агд

Зег 45

суз

Азр

Не

35

Хеи

ТНг

61и

|_уз

61 и

61 п

61 и

тгр

т!гг

61 и

11е

АЗП

АЗр

зег

ТНг

Уа!

50

55

60

Хеи

|_еи

Зег

мег

Хеи

А1а

Азп

Агд

61 и

11е

Зег

Зег

Уа1

61 п

Хеи

ТЬг

65

70

75

80

ТЬг

А1а

РЬе

Суз

Ьуз

Агд

А1а

А1а

Уа1

А1а

с1п

61 п

Хеи

тКг

хуз

суз

85

90

95

1.еи

тИг

61 и

11е

рЬе

рКе

АЗр

Агд

а! а

Геи

А1а

Агд

А1а

ЬУ5

С1и

Хеи

100

105

110

Азр

Азр

11 е

1_еи

61 и

хуз

Тпг

61 у

1_уз

Уа1

ТНг

61 у

рго

Хеи

Н15

61 у

115

120

125

1_еи

Рго

Уа1

5ег

11 е

Ьуз

Азр

Агд

Р(1е

Азр

Уа1

61 и

б1у

Туг

А5р

тНг

130

135

140

тНг

Уа1

б1у

Тгр

Уа1

61 у

Хеи

Уа1

61 у

|_уз

Рго

А1а

61 π

зег

Зег

зег

145

150

155

160

5ег

11е

А1а

Хеи

Зег

Хеи

61 и

5ег

мех

61 у

А1а

Уа1

Хеи

туг

Уа1

хуз

165

170

175

тЬг

Азп

Уа1

Рго

61 п

Зег

хеи

мех

мех

5ег

Азр

Зег

Туг

А5П

НТ 5

Уа1

180

185

190

рЬе

61 у

61 η

Зег

11 е

Азп

А1а

рНе

Азп

ьуз

61η

ьеи

11 е

Зег

61 у

61у

195

200

205

Зег

Зег

61 у

61 у

61 и

61 у

А1а

хеи

11е

61у

тЬг

61у

61у

Зег

Уа!

Уа!

210

215

220

61 у

11е

б!у

тКг

Азр

11е

б!у

61 у

вег

Не

Агд

11е

РГО

А1а

АЗП

Хеи

225

230

235

240

61η

б!у

Хеи

туг

Зег

11е

Суз

Рго

тНг

тКг

б1у

Агд

уа!

РГО

тгр

А5П

245

250

255

Суз

5ег

рЬе

мег

НТ5

<31 π

НТЗ

Туг

хеи

Уа1

Рго

Рго

Уа1

А1а

б1у

Рго

260

265

270

мег

А1а

Агд

Зег

Хеи

Зег

5ег

11е

б1и

НТ 5

РНе

Мех

61 п

Зег

Хеи

Хеи

275

280

285

Азр

зег

Азп

Рго

тгр

Азп

11 е

Аэр

РГО

61 у

суз

11е

Рго

11е

РГО

тгр

290

295

300

- 51 014853

Агд 305

Руз 61 и

реи А1а А1а 310

Руз

рго тНг

61 у

Руз 315

реи Агд

Реи

61 у

Не 320

Уа1

Туг

АЗр

АЗр

61 у

Уа1

Уа!

руз

РГО

61 η

Рго

РГО

Не

А1а

Агд

А1а

325

330

335

мег

Агд

61 и

Уа1

А1а

ьуз

руз

реи

руз

61 и

А1а

С1у

Н15

б1и

61 у

ТЬг

340

345

350

б1и

туз

Азр

61и

Реи

тйг

Не

5ег

61 и

Агд

61 и

б1и

реи

61и

С1и

ΤίΐΓ

355

360

365

Руз

тгр

А1а

Туг

61 п

тНг

Зег

рйе

Реи

б!п

61 п

Тгр

тКг

Зег

Зег

АЗП

370

375

380

Не

Азр

А1а

Реи

Реи

мер

Рго

Уа!

ТНг

Рго

тгр

Уа1

С1у

туг

Агд

РГО

385

390

395

400

1_У5

Зег

Тгр

Уа1

Уа1

$ег

Зег

61 η

Тгр

Реи

С1у

туг

ТНг

А1а

Реи

тгр

405

410

415

А5П

ьеи

Реи

АЗП

туг

А1а

А1а

Уа!

ТНг

Уа!

Рго

уа!

А1а

руз

Уа1

А5р

420

425

430

61у

А1а

Реи

Азр

61 η

РГО

Азр

61 η

С1и

тгр

Реи

61 и

Н15

Уа1

Рго

Агд

435

440

445

А5П

Акр

5ег

Азр

Агд

РН е

А5П

тгр

О1и

61 η

Туг

Азр

Рго

Азр

Реи

Уа!

450

455

460

1_уз

Азр

мер

Рго

11е

ТНг

Уа1

61 п

11е

Уа1

61 у

61 у

Агд

РНе

б!у

б1и

465

470

475

480

61 и

РуЗ

А1а

Уа1

Зег

Уа1

А1а

руз

Уа!

Уа1

Азр

б1и

Уа1

Реи

61 η

б!и

485

490

495

Рго

<210>	25
<211>	536
<212>	ΡΚΤ
<213>	АзрегдтНиз гпдег

<400> 25 мег А1а Азп тЬг тНг Тгр б!и нтз Агд А1а 1_уз 5ег Руз 61η А1а б!п

10 15

- 52 014853

Тбг

А1а А1а А1а 20

11 е

рго Рго 61 и тгр 25

тб г

беи рго

А1а

Азр 30

11 е

беи

беи

АЗр

Зег

Зег

А1а

Азп

Уа1

ьеи

А5р

Уа1

Рго

Агд

Тбг

Суз

61 у

беи

35

40

45

беи

тбг

61 и

Агд

61 и

11 е

НПЗ

Не

Тб г

б1и

Азр

Туг

Азр

А1а

тбг

А1а

50

55

60

бец

беи

б1и

буЗ

беи

А1а

Тб г

б1у

б1и

Рбе

Зег

Зег

беи

б1и

Уа1

Тбг

65

70

75

80

Тбг

А1 а

Рбе

Суз

буз

Агд

А1а

А1а

Не

А1а

61 п

61 η

беи

тбг

Суз

Суз

85

90

95

беи

тбг

61и

Не

Рбе

Рбе

Азр

буз

А1а

беи

А1а

Агд

А1а

буз

61 η

беи

100

105

110

А5р

61 и

11е

беи

А1а

61п

Тб г

61у

Уа1

тбг

Тбг

61 у

Рго

беи

Нпз

61 у

115

120

125

беи

Рго

Не

Зег

Не

буз

61и

Зег

Рбе

Азп

Уа1

рго

б1у

Уа1

Рго

Тбг

130

135

140

тб г

беи

61 у

рбе

уа1

61у

рбе

беи

АЗр

Агд

А1а

РГО

А1а

Зег

ме-ь

Зег

145

150

155

160

Зег

А1а

беи

Уа1

61 и

Не

беи

А5П

А5П

Суз

61у

А1а

Уа1

беи

туг

Уа1

165

170

175

буз

тб г

А5П

Уа1

рго

61п

Тб г

мет

мет

Тбг

Рго

Аэр

5ег

Нпз

Азп

Азп

180

185

190

Уа1

Рбе

С1у

Агд

Уа1

беи

АЗП

РГО

нпз

61 у

Агд

Зег

беи

тбг

А1а

61 у

195

200

205

б1у

5ег

Зег

61 у

61 у

61 и

61 у

А1а

беи

Уа1

А1а

Мет

Агд

61 у

Зег

Уа1

210

215

220

беи

С1у

Уа1

61 у

тб г

Азр

Не

А1а

61 у

Зег

Не

АГд

11е

Рго

А1а

беи

225

230

235

240

СУ 5

СуЗ

61 у

Уа1

Рбе

61У

Рбе

буз

Рго

Тбг

А1а

Суз

Агд

Не

Рго

Туг

245

250

255

А1а

61 у

61 η

Тб г

Зег

А1а

С1у

Агд

Рго

61у

МеТ

тбг

61 у

Не

беи

Рго

260

265

270

Зег

А1а

б1у

Рго

мет

Суз

НПЗ

5ег

11 е

Агд

Азр

А1а

б1и

беи

Рбе

беи

275

280

285

- 53 014853

1_уз Уа1

Уа1

хеи АЗП

Бег

Агд Рго А1а Азр ьеи 295

Азр 300

АЗр

Туг

А1а

ьеи

290

АЗр

11 е

РГО

тгр

Бег

Рго

А1а

Рго

61 η

хуз

б1и

Агд

Хеи

тЬг

11 е

б1у

305

310

315

320

Хеи

Хеи

Рго

61 и

Азр

Рго

Бег

РНе

РГО

Хеи

нт 5

РГО

Рго

мех

Агд

Агд

325

330

335

ТЬг

1_еи

АЗП

А1а

А1а

Уа1

1_уз

А1а

Хеи

тЬг

ТНг

А1а

61у

Нт 5

Агд

Уа!

340

345

350

Не

А5р

Ьеи

Бег

61 у

61п

А1а

Рго

Бег

РНе

Бег

Α5Π

А1а

Суз

Бег

Ьеи

355

360

365

А1 а

Хеи

Агд

Туг

рНе

61 у

Ьеи

Азр

Рго

Агр

Агд

ТНг

А1а

Хеи

Агд

Нт 5

370

375

380

11 е

тНг

61 η

А1а

<31 у

61 и

Рго

рНе

11 е

РГО

Бег

Ьеи

1_уз

РНе

тНг

Туг

385

390

395

400

Азр

|_еи

АЗП

61 и

Рго

ТНг

Агд

61 и

Рго

ТНг

1_еи

Агд

Азр

Хеи

РНе

61и

405

410

415

Бег

АЗП

Уа1

А1 а

Агд

Бег

61п

Ьеи

А1а

ТНг

61п

А1 а

Агд

Хуз

Ьеи

рНе

420

425

430

Уа1

АЗр

АЗП

61 η

Хеи

Азр

ьеи

РНе

Хеи

61у

А1а

а! а

Туг

61 п

Бег

тНг

435

440

445

Бег

Уа1

Рго

НТЗ

Азр

ТНг

Туг

61 у

11 е

Рго

Уа1

Туг

ТНг

Уа1

Ьеи

Тгр

450

455

460

АЗП

хеи

11е

АЗП

Туг

Рго

А1 а

Суз

уа1

11 е

РГО

РНе

61 у

61 η

А1 а

АЗП

465

470

475

480

ьуз

Уа1

61 и

АЗр

А1а

А1а

Туг

АЗП

Агд

АЗр

7а1

Бег

Туг

Уа1

РГО

А5р

485

490

495

туг

Агд

РГО

61и

61 и

11 е

61 и

61 у

А1а

РГО

Суз

Нтз

11е

Нт 5

Хеи

11 е

500

505

510

С1у

Агд

РГО

мех

А1а

АЗр

61 и

ьуз

Хеи

уа!

61п

Азр

А1а

Хуз

тНг

11 е

515

520

525

Суз тНг Уа1 мех Бег Азр Уа1 Бег

530 535 <210> 26 <211> 540

- 54 014853 <212> РКТ <213> АзрегдтПиз птдег <400> 26

мег А1а 1

Уа1

б!и

С1п 5

тгр

61 и

тКг 11 е Уа1 10

61 п

ьуз ьуз

61 п

А1а 15

Азр

А1а

А1 а

А1а

куа

11е

рго

б1п

А1а

тгр

Агд

1_еи

рго

А1а

61 и

Рве

Твг

20

25

30

А1а

Н1 £

Уа1 35

Зег

С1и

тЬг

А1а

Зег 40

Твг

А5П

Уа1

|_еи

Азр 45

Уа1

Рго

Агд

1уз

су 5

<51 у

1_еи

1_еи

Зег

А1а

1_уз

61 п

1_еи

61 и

11е

Твг

61 и

Азп

Туг

50

55

60

Азр

А1а

тНг

А1 а

1_еи

[_еи

61 и

61 п

11 е

Нт з

Зег

О1у

ЬУЗ

1_еи

твг

А1а

65

70

75

80

Уа1

С1и

уа!

А1а

61 и

А1а

Р1те

Суз

1_еи

Агд

А1а

А1а

11е

А1а

61 п

61 п

85

90

95

Уа1

тКг

Агд

Суз

1_еи

тКг

61 и

тНг

Рве

Рве

Азр

|_еи

А1а

сей

61 и

Агд

100

105

110

А1 а

ьуз

61 и

1.еи

Азр

61 и

Туг

рве

61 п

Зег

Твг

61 у

ьуз

Уа1

Агд

61 у

115

120

125

Рго

1_еи

НТ5

61 у

!_еи

Рго

11 е

Зег

1_еи

1У5

Аэр

Суз

Рве

А5П

Уа1

А1а

130

135

140

61у

Уа1

Рго

Азп

тНг

11 е

61 у

Рве

Твг

А1а

Рве

11е

А1а

НТ 5

61у

Рго

145

150

155

160

Уа1

1_уз

А5П

Азп

Зег

Зег

Уа1

Уа1

61 п

11 е

1_еи

1_еи

Азр

1_еи

б1у

А1а

165

170

175

Уа1

|_еи

Туг

Уа1

ьуз

тБг

Азп

Не

Рго

61 п

ТвГ

Мет

мет

А1а

А1а

Азр

180

185

190

Зег

НТ 5

АЗ П

Туг

Уа1

рве

61 у

Агд

ТЬ Г

Реи

АЗП

РГО

Азп

Агд

Твг

ьуз

195

200

205

1_еи

Зег

А1а

б1у

С1у

Зег

Зег

61 у

61 у

61 и

61 у

А1а

1_еи

11 е

А1а

мет

210

215

220

Агд

61у

Зег

11е

1_еи

б1у

Уа1

61 у

Τή г

Азр

Не

А1а

61 у

Зег

11 е

Агд

225

230

235

240

- 55 014853

11 е Рго 61у 11 е Рбе Азр б!у Тбг Туг А1а

ίου

Агд

Рго

5ег

11 е 255

НТ 5

245

250

Агд

11 е

Рго

Туг

С1у

б!у

61 η

Тбг

С1у

5ег

б1у

Агд

ьуз

б!у

Геи

А1а

260

265

270

61 у

11 е

Агд

РГО

Суз

А1а

61 у

Рго

Геи

А1а

тбг

Зег

Уа1

Агд

Азр

геи

275

280

285

С1у

геи

Рбе

мег

ЬУ5

тбг

Уа1

Уа1

Азр

11 е

Азр

Рго

тгр

61 п

туг

Азр

290

295

300

Зег

зег

тбг

11е

Рбе

5ег

тбг

Тгр

Агд

тбг

А1а

Рго

Рго

гуз

61 и

Тб г

305

310

315

320

геи

Агд

геи

<31у

Рбе

Не

1еи

<31и

Азр

РГО

НТВ

Рбе

Рго

Уа1

НТВ

РГО

325

330

335

Рго

11е

Геи

АЗП

Тбг

Геи

Тбг

Агд

А1а

Уа1

Азр

А1а

Геи

ГУ 5

А1а

А1а

340

345

350

61 у

НТ 3

б1и

Уа1

11 е

АЗП

Геи

тбг

Тбг

Рго

5ег

11 е

Агд

Азр

А1а

Геи

355

360

365

геи

геи

<31 у

Рбе

Агд

тбг

Рбе

А1а

Мег

А5р

рго

А1а

Агд

Тб Г

А1а

Рбе

370

375

380

5ег

НТЗ

11е

Тбг

гуз

5ег

б1у

61 и

Рго

Агд

11 е

рго

А1а

Геи

Агд

тб г

385

390

395

400

Тбг

Азр

Геи

Рго

АЗП

А1а

Азр

|_еи

Рго

Рбе

61 и

тгр

А1а

Рго

НТ 5

тб г

405

410

415

геи

61и

зег

геи

Туг

Азр

геи

АЗП

Уа1

61 η

Агд

61 и

тбг

Геи

Суз

61 и

420

425

430

61 η

Рбе

Агд

<31 η

Геи

11е

Уа1

61 η

АЗП

Гу 5

11е

АЗр

А1 а

11 е

11 е

мет

435

440

445

Рго

б1у

туг

<31 η

<з1у

Тбг

А1а

Уа1

А1а

Ηί 5

Аэр

61 п

Уа1

61 у

тгр

Уа1

450

455

460

Рго

туг

тбг

Уа1

Геи

А1а

Азп

Уа1

!_еи

АЗР

Туг

рго

А1а

тбг

11 е

11е

465

470

475

480

РГО

Туг

Агд

ьуз

А1а

Азр

1_уЗ

А1а

Азр

Азр

А1а

гув

Туг

Уа1

Агд

АВр

485

490

495

Уа1

Тбг

туг

Агд

Рго

РГО

туг

Уа1

А1а

Азр

Азр

Уа1

б!и

61 у

А1а

РГО

500

505

510

- 56 014853

Суз Суз \/а1 61η 1_еи мек б1у

515

Агд

520

ΤίΐΓ мек

НТ 5 и

С1и

525 и

1_еи

1_еи

Агд Азр

530 тЬг А1а 11 е Уа1 А1а

535

Агд

Уа1

Ьеи у

ьуз

540

<210>	27
<211>	579
<212>	РКТ
<213>	АзрегдтПиз птдег

<400> 27

мек 1

|_еи

РГО РГО

рВе А5р Туг РВе ТВг Туг

Агд Агд

11е

Агд

Азр 15

1_еи

5

10

ьуз

Агд

Агд

61и 20

Агд

А1а

А1а

Агд

РВе 25

А1а

Зег

ьеи

Зег

Рго 30

АЗр

Туг

Н1 5

А1 а

Рго

Р1те

Зег

А1а

11е

Аэр

Агд

Уа1

11е

11 е

А5П

1_уз

Рго

11 е

35

40

45

61 п

А5р

1_еи

Уа1

Туг

61 и

Уа1

61 η

АЗП

А5р

зег

|_еи

А1а

рго

|_еи

Азр

50

55

60

Уа1

1_еи

Агд

ТВ г

туг

б!у

|_уз

уа!

А1 а

Уа1

Ьуз

А1а

Нт 3

61 и

ьуз

ТНг

65

70

75

80

АЗП

Суз

Уа1

тВг

б!и

1_еи

|_еи

кеи

РГО

б1и

А1а

61и

Зег

тгр

А1а

61 п

85

90

95

бег

61 и

Уа1

Азп

1_еи

ьуз

61у

Рго

|_еи

А1а

61 у

Уа1

Рго

11е

Зег

1_еи

100

105

110

ьуз

А5р

Зег

Уа1

61 η

Уа1

куз

б1у

Рке

Азр

11е

тВг

|_еи

61 у

Туг

тВг

115

120

125

1_У 5

рИе

А1а

Суз

1_уз

РГО

туг

куз

61 и

Азр

61 у

Рго

мек

А1а

1_уз

1_еи

130

135

140

1_еи

куз

Азр

А1а

61 у

А1а

Уа1

РГО

Туг

А1а

куз

ТВ г

А1а

|_еи

РГО

Уа1

145

150

155

160

тНг

|_еи

|_еи

Зег

РВе

61р

5ег

А1а

Азп

А1а

|_еи

тгр

61 у

Нтз

суз

1_еи

165

170

175

А5П

Рго

Нтз

Уа1

рго

61 и

Туг

Зег

рго

61 у

61 у

Зег

ТВ г

61 у

61 у

61 и

180

185

190

- 57 014853

61 у А1а геи

|_еи

А1 а

геи 01у С1у Агд 200

11 е о! у 11 е

О1у 205

Зег

Азр

Уа1

195

ΑΊ а

01у

Бег

Уа1

Агд

Уа1

Рго

А1а

А1 а

Тгр

Зе ι-

01 у

Не

Туг

Зег

Геи

210

215

220

Агд

Суз

Бег

тЬг

01 у

Агд

Тгр

рго

ьуз

Уа1

οί у

Уа1

А5П

тЬг

зег

Мег

225

230

235

240

А1а

01 у

С1 η

01 и

01у

Уа1

А1а

Зег

Уа1

РЬе

Зег

РГО

мет

А1а

Агд

тЬг

245

250

255

Геи

АЗП

АЗр

Геи

ТНг

туг

рКе

ТЬг

гуз

А1 а

Не

уа!

61у

мег

гуз

Рго

260

265

270

Тгр

АЗП

туг

Азр

Н1 5

тЬг

Уа1

Нтэ

рго

11е

зег

тгр

Агд

б1и

А5р

61 и

275

280

285

б!и

11 е

01 и

А1а

01 η

АЗП

|_уз

дгд

1_еи

Агд

11 е

61 у

Геи

мег

Зег

АЗП

290

295

300

Азр

01 у

Уа1

Уа1

РГО

Рго

ТНг

РГО

А1а

Не

01 и

Агд

А1а

Не

Зег

тЬг

305

310

315

320

ТЬг

Уа1

А1 а

А1 а

1.еи

ТЬг

Д1 а

Д1а.

01 у

Нт 5

тЬг

Уа1

зег

61и

Не

ТЬг

325

330

335

РГО

РГО

А1а

А1а

А1а

АЗр

ТЬг

рЬе

ТЬг

01у

Геи

Зег

Геи

А1а

зег

61 η

340

345

350

ьеи

Геи

АЗП

зег

Азр

01 у

Суз

Уа1

ТЙГ

РЬе

АЗП

Зег

нт 3

геи

нтз

Зег

355

360

365

РЬе

С1и

РГО

Зег

Азр

Рго

61у

А1а

Азр

01п

геи

ТЬг

Агд

Не

Суз

А5П

370

375

380

1_еи

РГО

Агд

РГО

геи

Агд

туг

Геи

туг

туг

Геи

тгр

Уа1

Агд

Туг

Не

385

390

395

400

Агд

Агд

Азр

01и

ьуз

тгр

А1а

ТЬг

ьеи

11 е

Агд

о! у

рЬе

А1а

Рго

Гуз

405

410

415

Зег

А1а

А1а

О1и

Геи

Тгр

Гуз

геи

ТЬг

А1а

6ΐη

Агд

61 и

А1а

РЬе

Агд

420

425

430

А1а

тЬг

тгр

Н1 5

Зег

тгр

тгр

Азр

А1а

01 и

тЬг

01 η

61 η

Туг

Аэр

РЬе

435

440

445

11е

ьеи

Суз

РГО

Уа1

А5П

А1а

ТЬг

РГО

А1а

геи

РГО

Нт 5

ГУ5

А1а

мег

450

455

460

- 58 014853

НТЗ 465	АЗр	А1а	Уа1	зег	Зег 470	суз	61 у
А5р	туг	ТНг	А1а	61 у 485	уа!	уа1	Рго
Азр	А1а	Реи	5ег 500	61 у	РГО	туг	1уз
5ег	АЗП	А1а 515	Уа1	А1а	туг	61 у	А1а 520
мег	А1а 530	61 у	1еи	рго	Т1т г	А1а 535	Уа!
61и 545	<51 и	ьуз	Уа1	1_ец	61у 550	Туг	мет
61η	туг	6ΐη	Азр	Рго 565	Уа!	тНг	61 у
С1и	ьеи	Азр

Туг	тЬг	РНе	ьеи	тгр	А5П	Реи	реи
	475				480
Уа!	Зег	НТ5	Уа!	Азр	А! а	Руз	ьуз
	490					495
ίΥ5	Уа1	Реи	ί-УЗ	61 η	Реи	61 у	А1а
505				510
тгр	ьуз	Нтз	туг	АЗр 525	А1а	А1а	руз
61 η	Уа1	Уа1	61 у	Агд	Агд	Тгр	61 η
			540
А1а	А1а	Уа!	61 и	61 и	А1а	Реи	б1и
		555					560
61 и	б1у	61 у	Ьуз	Туг	РГО	Реи	11е
	570					575

<210>	28
<211>	529
<212>	РКТ
<213>	АзрегдтИиз птдег
<400>	28

Мет 5ег 1

Уа1

Реи РНе 5

тНг

Зег 11е

Зег

Рго Азр Азп 10

Рго

уа1

Руз Агд 15

б!и

АЗр

А1а

А1а

Зег

реи

Реи

Агд

Азп

Реи

А5р

Ьеи

нтз

11 е

А5р

61 п

20

25

30

б!и

Азр

б1и

б!и

Азр

РНе

Нтз

тНг

Реи

Реи

А1а

А1а

Уа1

нтз

АЗр

Суз

35

40

45

А1а

б!и

ТНг

Уа1

А1а

Азп

Реи

Рго

Азр

Туг

61 п

Рго

Уа!

РГО

А5р

Реи

50

55

60

Азр

Агд

туг

Рго

Агд

нт 5

Азп

Уа1

нтз

Агд

Рго

Зег

Зег

б1и

С1и

61 п

65

70

75

80

Уа!

РНе

01У

61 η

А1а

Тгр

А1а

Нтз

ЬУЗ

РНе

Реи

11е

Руз

61 у

Азп

Рго

90 95

- 59 014853

61 и

61 у 61 у Ьеи Реи 100

Т1п г

б1у Ьуз ТНг 11 е зег 105

Уа!

1_уэ

А5р 110

суз

11 е

А1а

Уа1

А1 а

61у

Уа1

РГО

61 η

ьеи

Реи

61 у

Зег

лэр

Не

Не

Рго

Зег

115

120

125

тгр

тНг

рго

11е

тЬг

Азр

А1а

тНг

Уа!

Уа1

ТНг

Агд

Уа1

Реи

Азр

А1а

130

135

140

61 у

А1а

Азр

Не

НТ 5

61 у

ТНг

Зег

ТНг

Суз

С1и

АЗП

Туг

Суз

НТ 5

Зег

145

150

155

160

тНг

А1а

Зег

РНе

тНг

Зег

А1а

61п

С1у

ТНг

Уа1

61 и

АЗП

Рго

РНе

А1а

165

170

175

ТНг

С1У

туг

Зег

А1а

С1у

61 у

Зег

ТНг

Зег

61 у

61 у

А1а

А1а

ьеи

Уа1

180

185

190

А1а

А1а

61 у

Реи

уа!

АЗр

П е

тпг

Ьеи

61 у

61 у

Азр

61 п

61у

61 у

Зег

195

200

205

11 е

Агд

Уа1

РГО

Зег

А1а

РЬе

Суз

С1у

суз

Уа1

61 у

ьеи

1_уз

Рго

тНг

210

215

220

Τντ

61у

ьеи

Уа1

РГО

рИр

50 Г

б1у

11 е

А1а

Зег

61 у

А5П

А1а

11 е

Азо

225

230

235

240

А5р

НТЗ

тНг

б1у

РГО

ьеи

А1а

Агд

АЗП

уа1

11е

Азр

Уа1

А1а

Зег

Суз

245

250

255

Реи

Азр

А1а

Не

А1а

б!у

Туг

Азр

б!у

Не

Азр

Азр

Агд

Суз

1_еи

61у

260

265

270

5ег

Рго

ьуз

НТЗ

61 у

зег

тНг

зег

Р1те

А1а

ьуз

Зег

|_еи

61 η

А1а

АЗр

275

280

285

А1а

ТНг

Агд

Реи

Азр

61у

РНе

ьуз

11е

61 у

Уа1

1_еи

БУ 5

61 и

61 у

РНе

290

295

300

61 и

НТ 5

ТНг

А1а

Уа1

АЗр

Рго

А1а

Уа1

1_уз

С1и

зег

уа!

Мер

А1а

А1а

305

310

315

320

тНг

61 η

ьуз

РНе

А1а

61и

ьеи

01 у

А1а

ТНг

Уа!

61 и

61и

Уа!

Зег

ьеи

325

330

335

Рго

Аар

Нт 5

Туг

НТЗ

61у

РГО

А1а

Не

Тгр

ТНг

Не

61п

61п

Агд

Уа1

340

345

350

Зег

61у

Зег

ьеи

ТНг

Ьеи

Ьеи

61 у

С1п

А1а

нтз

61 у

Агд

Агд

61 у

Реи

355

360

365

- 60 014853

туг мет тНг

61 и

МеТ

61и Агд 61и 375

Агд

Геи Рго

Тгр 380

тНг

туз

61 и

61 у

370

РНе

61 п

Агд

А1а

РНе

Рго

А1 а

ТНг

Туз

АЗП

Уа1

11 е

Не

АЗП

61 у

Геи

385

390

395

400

туг

Теи

ТНг

5ег

Агд

РНе

Рго

Азр

геи

туг

61у

Туз

зег

уа1

АЗП

Не

405

410

415

61 у

Агд

Агд

(_еи

Агд

Азр

Теи

Туг

61 и

Азр

Теи

геи

61 η

61 и

Туг

Азр

420

425

430

Уа1

Уа1

Уа1

МеТ

Рго

тНг

ТНг

Рго

Уа!

Уа1

А1а

РГО

Агд

НТ 5

61 у

А1а

435

440

445

Агд

61 у

Теи

Рго

Уа1

61 и

Зег

Теи

ίΥ5

РГО

Зег

мет

61у

геи

ТНг

Не

450

455

460

АЗП

тНг

А1а

11е

РНе

Азр

Уа1

ТНг

61 у

Нт 5

рго

А1а

Мет

5ег

Не

рго

465

470

475

480

Уа1

61 у

Туг

А1а

РГО

А1 а

туз

Азр

Азр

Рго

О1п

Уа1

ЬУ5

теи

Рго

Уа1

485

490

495

61 у

Мет

61 η

Не

уа!

61 у

61 у

теи

Тгр

6ΐη

б1и

РНе

ьуз

Уа1

Теи

ьуз

500

505

510

А1а

61 у

Туг

А1а

ТГр

61 и

туз

АЗП

Туг

Азр

тгр

туз

61 и

Уа1

Д1 а

Зег

515

520

525

Н1 5

<210>29 <211>475 <212> РКТ <213> АзрегдтПиз птдег <400>29

мет

А1а

Агд

11е

Азр

Теи

Зег

61 и

теи

тНг

Не

А1а

туз

Уа1

нт 3

тНг

1

5

10

15

А1а

РНе

Агд

Агд

61у

Азр

Туг

зег

А1а

уа!

Азр

ьеи

Уа1

61 п

А1а

Туг

20

25

30

Теи

Агд

Агд

Не

Азр

61 п

Уа1

АЗП

Рго

дгд

Теи

АЗП

А1а

Не

теи

А1а

35

40

45

- 61 014853

11е Азп Рго

А5П А1а Т/а1

61 η 61 и А1а 61 η А1а Геи

Азр

Азр

А1а

РЬе

50

55

60

Ага

А1а

Зег

Агд

ТНг

|_еи

Агд

Рго

кеи

Нт 5

61 у

Уа1

Рго

Уа1

Геи

Уа1

65

70

75

80

ЬУ5

АЗр

АЗЛ

11 е

рНе

тНг

тНг

А1а

мег

РГО

ТИг

тНг

Туг

61 у

Зег

гуз

85

90

95

Уа1

А1а

А1а

Зег

Агд

РГО

Уа1

Геи

Рго

Геи

Азр

Аэр

А1а

61л

Уа1

Не

100

105

110

ьуз

61 η

Геи

61 η

61у

А1а

61у

А1а

И е

Не

геи

А1а

Гуз

Тпг

ΤίΐΓ

геи

115

120

125

Рго

дзр

Тгр

А1а

тНг

Азр

рНе

рЬе

Зег

А1а

Зег

ТНг

Уа1

Зег

тНг

Тгр

130

135

140

ткг

61 п

АЗ П

Рго

Туг

Азр

Геи

А1а

Агд

Азр

РГО

61 у

С1у

Зег

Зег

Зег

145

150

155

160

С1у

тНг

А1а

А1а

61 у

11е

А1а

А1а

Аз η

Геи

А1а

геи

Уа1

61 у

Уа1

61у

165

170

175

ТНг

Азр

ТНг

б1у

61 у

Зег

И е

Агд

Геи

Рго

5ег

зег

РНе

Су5

Зег

Геи

180

185

190

Уа1

61 у

Μθΐ

Агд

Рго

тНг

Уа1

61 у

Геи

тЬг

Зег

геи

АЗр

61 у

Уа1

Зег

195

200

205

Рго

РЬе

Уа1

б1у

Суз

61л

АЗр

Τή г

Уа1

61 у

РГО

Мет

су 5

Агд

ТНг

Уа1

210

215

220

тНг

Азр

А1а

А1а

Агд

Геи

геи

Азр

ТНг

Геи

Уа1

Геи

Рго

тЬг

5ег

Рго

225

230

235

240

61 η

Зег

1_еи

А1а

Рго

зег

61 у

б1у

Зег

Туг

А1а

А1а

НТ 5

Геи

Геи

Рго

245

250

255

Азр

Зег

геи

РГО

61 у

РГО

Уа1

Суз

геи

б1у

НТ 5

Геи

РГО

61л

Геи

61 у

260

265

270

А1а

61 и

61 и

А1а

А1а

Уа1

б!и

А1 а

Геи

рНе

тЬг

61 η

Уа1

Геи

тНг

Агд

275

280

285

Геи

Агд

61 у

НТЗ

А1а

Зег

ν»1

тНг

Уа1

Агд

Азр

Геи

Азр

Не

Рго

5ег

290

295

300

Геи

Бег

Зег

тКг

Геи

А1а

А1а

А1а

Зег

11е

мег

Геи

Зег

Агд

С1у

61л

305

310

315

320

- 62 014853

НТ 5

Азр

Геи

Азр

Азр 325

РНе 1_еи Агд тНг тНг Уа1 330

б!у

тНг

Зег

Ееи 335

Еуз

Тб Г

Т1е

Туг

Агд

Азр

Нтз

А1а

Туг

Рго

РГО

ТНг

АЗП

РНе

61 у

11 е

Рго

340

34 5

350

61 у

Уа1

А1а

ТНг

Нт 5

А1а

Зег

тНг

кеи

тНг

Азр

Агд

Зег

ТЬг

А1а

5ег

355

360

365

А5П

А1а

Агд

Азр

А1а

Ееи

А5р

Агд

Не

11 е

тНг

А1а

Нт 5

Ьеи

61 у

61 η

370

375

380

д!а

б!у

Уа1

с!и

Уа1

Ееи

Уа1

РНе

Ееи

тНг

А1а

б1у

Агд

А1а

А1а

Рго

385

390

395

400

Агд

61 η

С1и

Азр

11е

тНг

РГО

61 и

МеЕ

61 у

Уа1

ТНг

РНе

Рго

Уа1

НТ 5

405

410

415

А1а

МеЕ

1_еи

А1а

Зег

тНг

Ееи

61 η

Тгр

Рго

А1а

Не

Зег

Уа1

РГО

11 е

420

425

430

61 у

РЬе

ТНг

А1а

ТНг

б1у

1_еи

Рго

Уа1

61 у

Ьеи

61 и

Т1е

Ееи

61у

Агд

435

440

445

РГО

геи

Зег

Азр

61 η

Агд

|_еи

сеи

61 и

Уа1

А1а

рНе

уа!

Не

61 и

61 η

450

455

460

11 е

Уа1

с1п

С1у

Агд

Агд

Рго

Рго

тНг

Уа1

АЗр

465 470 475 <210> 30 <211> 605

<212>

РКТ

<213>

АзрегдтПиз ι

птдег

<400>

30

мег

Азр

61 и

кУ5

РГО

61 п

рНе

рбе

61 п

Туг

Рго

б1и

А1а

Агд

РГО

61 у

1

5

10

15

Рго

А1 а

Уа1

Рго

Туг

ьуз

Азл

61 и

61 и

61л

Уа1

11е

Рго

ν^Ι

11е

Агд

20

25

30

61 у

РНе

РГО

Ееи

А1а

Ьеи

61 у

А1 а

тНг

Ееи

Уа1

61л

Азл

11е

61 у

РНе

35

40

45

Не

61л

Зег

НТ 5

Ееи

Тгр

61 у

тНг

тЬг

б!у

РЬе

Азр

Уа1

11 е

Агд

Азл

50

55

60

- 63 014853

ьеи Рго 65

геи Азр 61 п туг 70

зег А1а дгд

туг

АЗр 75

рго ТЫ

уа1

Т1е

Рго 80

Уа1

А1а

Агд

Рго

АЗр

А1а

Бег

А1а

А1а

Азр

теи

Рго

Уа1

Рго

тЫ

61 η

85

90

95

ьуз

Агд

61η

Бег

Аз П

А1а

61 у

туг

Туг

тЫ

Зег

А1 а

Азр

Туг

Уа1

А1а

100

105

110

Агд

Туг

тЫ

Бег

61 у

61 и

теи

тНг

РГО

Теи

А1а

Уа1

Уа1

61 и

ТЫ

Ьеи

115

120

125

теи

Рго

Ьеи

11е

Агд

Агд

Азр

Д1 а

туз

Рго

Рго

С1у

Туз

нт 5

Зег

11 е

130

135

140

А1а

рНе

Теи

б!и

5ег

61 п

Уа1

Азр

Туз

11е

Агд

А1а

А1а

А1а

б1и

А1а

145

150

155

160

Бег

ТНг

6ΐη

Агд

Туг

1-У5

Азр

61 у

ьуз

РГО

теи

61 у

Рго

МеЕ

Азр

61 у

165

170

175

11 е

Рго

Уа1

А1а

11 е

Ьуз

АЗр

61 и

Уа1

нтз

мег

61 и

б1у

туг

Агд

Агд

180

185

190

ТНг

1_еи

о! у

Зег

ьуз

1_еи

АЗр

РНе

ТЫ

61у

61 и

РНе

Агд

61 у

ТЫ

Бег

195

200

205

тгр

Суз

Уа1

1уз

61 п

тгр

61 и

61 и

А1а

С1у

А1а

11 е

Уа1

11 е

61 у

туз

210

215

220

ТНг

Не

Мег

НТ 5

61и

1_еи

61 у

Теи

Азр

тЫ

ТЫ

АЗП

АЗП

А5П

Рго

АЗП

225

230

235

240

РНе

61 у

ТЫ

Рго

Агд

АЗП

РГО

Н15

АЗП

РГО

А5р

Туг

Туг

Суз

61 у

61 у

245

250

255

Бег

Бег

б1у

61 у

Бег

61 у

Туг

А1 а

Уа1

61 у

А1а

61 у

Теи

Уа1

Рго

11 е

260

265

270

А1а

1_еи

61 у

А1а

Азр

61 у

61 у

61 у

зег

11 е

Агд

Не

РГО

А1 а

Зег

РЬе

275

280

285

Суз

61у

Уа1

тгр

61 у

Теи

ьуз

РГО

зег

Н1 5

61 у

Агд

Уа1

зег

б!у

Бег

290

295

300

РГО

ты

Уа1

Бег

Теи

А1а

зег

тЫ

тНг

61у

уа!

Туг

61у

РГО

Теи

А1а

305

310

315

320

5ег

Зег

И е

А5р

Азр

Теи

А1 а

теи

А1 а

Туг

Агд

11е

меЕ

А1а

ТНг

Рго

325

330

335

- 64 014853

А1а Рго б!и 5ег

£ег Азр

Рго ьеи

зег А1а А1а Рбе рго Бег

РГО

ьеи

340

345

350

Агд

тНг

1_еи

РГО

Бег

Рго

тНг

Азп

Азп

ТНг

Рго

Агд

тНг

11е

б1у

Не

355

360

365

Уа1

Агд

Азр

Тгр

Не

Азр

Агд

А1а

Бег

РГО

Рго

Уа1

Агд

А1 а

Уа1

РНе

370

375

380

А5П

А1а

ТНг

ьеи

Азр

Нт 5

Туг

Агд

тНг

хеи

Хуз

Азп

Туг

ТНг

Не

Не

385

390

395

400

Азр

Не

Тб г

Не

РГО

Туг

Хеи

Рго

61 и

61у

б1п

хуз

А1а

НТ 3

л1а

хеи

405

410

415

тНг

Не

Ьеи

Бег

61 и

Уа1

тНг

Бег

Бег

Ьеи

тНг

Рго

Бег

61η

11е

Бег

420

425

430

61п

ьеи

тНг

Рго

А1а

АЗП

Хуз

Не

мех

А1а

Бег

Мех

61 у

Мех

Тгр

61п

435

440

445

Не

ьуз

61 у

61п

Азр

РНе

Хеи

А1а

А1а

61п

Агд

Хеи

Агд

АЗП

Суз

Хеи

450

455

460

Мех

Мех

НТЗ

кеи

А1а

НТЗ

Хеи

РНе

61п

хуз

НТЗ

РГО

б1у

1_еи

мех

11е

465

470

475

480

УаТ

тНг

Рго

ТНг

ТНг

РГО

11 е

РГО

61у

тгр

хуз

11 е

61и

61 у

61у

61 и

485

490

495

αΊ а

Азр

Ьеи

ХУ5

Агд

б!у

уа!

Бег

Азр

61 у

АЗП

тНг

тНг

Уа1

Агд

АЗП

500

505

510

Мех

61и

Туг

Уа1

Тгр

хеи

А1а

АЗП

РНе

ТНг

61у

Суз

РГО

А1а

11е

Бег

515

520

525

су 5

РГО

А1а

61у

туг

Азр

Уа1

Хеи

Азр

61у 61у

Бег

Агд

Уа1

РГО

Уа1

530

535

540

61у

Уа1

А1а

Мех

61 у

61и

Тгр

б1у

Бег

61и

б1и

61и

Хеи

Не

А1а

545

550

555

560

РНе

А1а

Агд

Азр

61 у

61 и

61у

Уа1

Хеи

Азр

61у

ТНг

А1а

А1а

А1а

АЗр

565

570

575

61 у

мех

61и

61п

Бег

Бег

61у

ίευ

ТНг

Уа1

РГО

Агд

б1у

61 и

дгд

А1а

580

585

590

А1а

тгр

61 и

А5р

Уа1

Не

А1а

хуэ

А1а

б!у

61 и

Агд

Агд

595

600

605

- 65 014853

<210>	31
<211>	504
<212>	РКТ
<213>	АзрегдтПиз птдег
<400>	31

мет

Зег

ьеи

Ьеи

Агд

61 и

А1а

61 и

ьуз

су 5

|_еи

А1а

АЗП

61п

С1у

Зег

1

5

10

15

НТ 5

А1а

А1а

Теи

АЗП

А1а

Теи

Не

ТНг

ТНг

Теи

НТЗ

61П

Зег

б1у

61 η

20

25

30

тгр

Теи

б!и

Агд

Уа1

Агд

АЗр

А1а

А5р

А1а

Агд

дгд

ТНг

Агд

О1у

тНг

35

40

45

РГО

ЬУ5

Зег

61 и

Не

АЗр

61 у

Агд

Ьеи

Уа1

Д1а

Уа1

туз

АЗр

АЗП

мет

50

55

60

Суз

ТНг

Агд

Азр

теи

РГО

ТНг

ТНг

Суз

А1а

Зег

Азп

А1а

теи

Азр

ьуз

65

70

75

80

РНе

Уа1

Зег

Рго

РНе

АЗП

А1а

тНг

Уа1

Уа1

61п

61 п

Теи

61и

Азр

А1а

85

90

95

61 у

А1а

Уа1

Уа1

А1а

61 у

ьуз

А1а

Азп

Теи

АЗр

61 и

РНе

<51у

МеТ

61 у

100

105

110

Зег

НТ 3

Зег

Не

нт'з

зег

АЗП

рНе

61 у

Рго

Уа1

Агд

Зег

5ег

Агд

Агд

115

120

125

61 у

61п

Азр

А1а

61 и

Туг

|_еи

Зег

А1а

б1у

61 у

зег

Зег

б1у

61 у

5ег

130

135

140

А1а

Уа!

А1а

Уа1

А1а

ТНг

А1а

61п

Суз

туг

А1а

А1а

|_еи

б!у

ТНг

Азр

145

150

155

160

тНг

С1у

61 у

Зег

Уа1

Агд

Ьеи

Рго

А1а

А1а

Туг

тНг

61у

ТНг

Уа1

61 у

165

170

175

РНе

туз

Рго

Зег

Туг

61 у

Теи

Уа!

Зег

Агд

тгр

61 у

уа!

Уа1

А1а

Туг

180

185

190

А1а

АЗП

зег

Теи

Азр

тНг

Уа1

С1у

Уа1

1_еи

61 у

Агд

Азр

Уа1

А1а

5ег

195

200

205

Уа1

Агд

Нт 5

Уа1

РНе

б!у

Уа1

Уа1

АЭП

61п

Нт 3

Азр

5ег

Агд

АЗр

Рго

210

215

220

- 66 014853

Тбг 225

Аэп беи

Зег Рго Зег 230

Зег Агд Зег Агд

11е Азр 235

Зег нпз

беи

буз 240

Мет

Зег

А1а

беи

А1а

Зег

Агд

Тбг

Зег

Зег

Рго

беи

Агд

11е

61 у

Уа1

245

250

255

РГО

беи

61 и

туг

АЗП

11е

зег

61и

беи

Зег

Рго

Зег

А1а

Агд

Нпз

А1а

260

265

270

тгр

Зег

Агд

5ег

беи

А1а

туг

беи

61п

Агд

61η

61 у

НП 5

Зег

11 е

61 η

275

280

285

тбг

Уа1

Зег

беи

РГО

тбг

тбг

буз

беи

А1а

беи

зег

А1 а

туг

Туг

Уа1

290

295

300

беи

А1а

РГО

А1а

61 и

А1а

зег

зег

А5П

беи

А1а

буз

Туг

Азр

61 у

Уа1

305

310

315

320

Агд

Туг

61 у

Зег

Агд

Рго

бТи

А1а

Рго

А5р

61 у

АЗП

А1 а

5ег

Зег

61 и

325

330

335

Агд

Туг

беи

Туг

А1а

буз

Тбг

Агд

б!у

Азр

61 у

Рбе

б!у

зег

61 и

Уа1

340

345

350

буз

Агд

Агд

Не

беи

беи

С1у

А1а

Рбе

5ег

беи

Зег

а! а

АЗр

А1а

мет

355

360

365

Азр

Азп

Туг

Рбе

Не

61 п

А1а

б1п

Агд

Уа!

Агд

Агд

беи

Уа!

61 η

НП 5

370

375

380

Азр

Рбе

Азп

А1а

А1а

Рбе

Агд

А1а

Суз

61η

Рго

беи

11 е

Зег

Зег

61 η

385

390

395

400

беи

б1у

Зег

буз

Зег

61 у

Зег

А1а

АЗр

Тбг

61 у

Уа!

АЗр

Уа1

беи

Не

405

410

415

Суз

РГО

тбг

А1а

Рго

Зег

Зег

рго

Рго

Агд

Не

Зег

Зег

беи

11 е

61 у

420

425

430

Рго

Азр

А1а

Тбг

тбг

5ег

Рго

беи

б1и

А1а

туг

тбг

АЗП

А5р

Уа1

рбе

435

440

445

тбг

Уа1

РГО

А1а

Зег

беи

А1а

61у

беи

Рго

А1а

Не

зег

Уа1

Рго

Уа1

450

455

460

Тбг

Тбг

61 и

Азп

А1а

А5Р

61 у

А1а

61и

Азр

61у

Азр

беи

А1а

61 у

11е

465

470

475

480

61 η

уа!

11 е

61 у

61 п

туг

61 у

АЗр

Азр

61 и

беи

Уа1

беи

буз

Уа1

А1а

485

490

495

- 67 014853 б!и ьеи ьеи 61и б!у Агд нтз ьеи

	500
<210>	32
<211>	636
<212>	ΡΚΤ
<213>	АзрегдтПиз птдег
<400>	32

мет 1

Уа1

Агд А1а тНг 5

61 η

Ьеи А1а Уа1

А1а А1а 10

Ьеи С1у

ьеи

ьеи 15

61 у

А1а

А1а

А1а

А1а

61 η

ьеи

Уа1

Зег

тНг

61 у

МеЬ

Зег

Уа1

тб г

Ьеи

Азр

20

25

30

61 η

11е

Азр

Туг

РНе

Уа1

Зег

Рго

Туг

Рго

А1а

61у

Азп

Уа1

ТНг

Уа1

35

40

45

5ег

А1а

А1а

зег

Ьеи

тНг

Аэр

11е

Рго

Зег

Уа1

Азп

61 у

РНе

туг

РГО

50

55

60

Уа1

Тб г

Уа1

Уа1

61 η

б1и

61 и

тНг

А1а

61 у

Уа1

Зег

Зег

Ьеи

Зег

зег

65

70

75

80

ьеи

РНе

Зег

Тб г

тгр

ТНг

АЗр

Уа1

АЗр

Азр

Уа1

РНе

ТНг

РГО

А1 а

РНе

85

90

95

Ьеи

б1у

А1а

Уа1

Ьеи

Уа1

Агд

б1у

туг

ьуз

РГО

АЗр

АЗП

Уа1

Тб г

А1а

100

105

110

Тб г

РНе

Рбе

АЗП

Зег

Зег

Агд

зег

Зег

уа1

Ьеи

зег

Рго

Ьеи

61 и

зег

115

120

125

Агд

Уа1

Уа1

Рго

Зег

б1у

Рго

туг

РНе

Ьеи

61 и

61 п

А1а

ТНг

61 у

Азп

130

135

140

Ьеи

туг

Рго

Уа1

туг

Агд

Ьеи

туг

Зег

Азр

Туг

А1а

61 у

А1а

Рбе

тб г

145

150

155

160

61 η

Рго

Ьеи

ьеи

61 η

ьуз

РГО

Азр

б1у

ТНг

РНе

61 η

рго

Ьеи

5ег

А1а

165

170

175

61 η

Уа1

А1а

61 у

ьеи

Уа1

Зег

Зег

ТНг

Пе

б!у

Уа1

РГО

зег

Агд

Пе

180

185

190

туг

туг

ТНг

Рго

зег

Азр

б!и

ьуз

Рго

Ьеи

А1а

61 у

А1а

дгд

уа!

61 у

195

200

205

- 68 014853

Уа1

1-У5 210

Азр

Г1е Туг

Зег

кеи А1а б!у 215

Уа1

Агд 61п 220

Зег

Азп

61 у

А5П

Агд

А1а

Тгр

Туг

АЗП

кеи

туг

61 у

б!и

АЗП

АЗП

Уа1

тВг

61 у

ТВ г

Д') а

225

230

235

240

Уа1

Зег

Агд

1_еи

11 е

Азр

А1а

61у

А1а

Не

Пе

Уа1

61 у

кеи

61 п

куз

245

250

255

Рго

Зег

61п

РВе

А1а

А5П

б!у

б!и

тВг

А1а

тВг

А1а

АЗр

тгр

Уа1

АЗр

260

265

270

кеи

НТ 5

Зег

РГО

РВе

АЗП

РГО

Агд

61 у

АЗр

61 у

туг

61 п

Азр

Рго

Зег

275

280

285

Зег

Зег

Зег

зег

01у

А1а

б!у

А1а

зег

11 е

61 у

зег

туг

61 и

тгр

кеи

290

295

300

АЗр

кеи

А1а

кеи

61 у

зег

АЗр

тВг

61у

61 у

Зег

11е

Агд

АЗП

РГО

А1а

305

310

315

320

61 и

Уа1

61 η

61 у

уа!

туг

61 у

Зег

Агд

РГО

Зег

НТ5

61 у

кеи

Уа1

61 и

325

330

335

кеи

Азр

НТЗ

Уа1

Мег

Зег

Мек

зег

Рго

Уа1

кеи

Азр

тВг

А1а

61 у

Уа1

340

345

350

кеи

тВг

Агд

АЗр

Рго

туг

кем

тгр

Азр

Агд

А1а

Азп

61 п

А1а

кеи

Туг

355

360

365

Зег

ТВг

Азп

Туг

тВг

Зег

РВе

НТ 3

б1у

ЬУ5

Зег

Уа1

Агд

туг

РГО

Зег

370

375

380

|_у з

кеи

туг

ТВ г

11е

Азр

РВе

Рго

ТВ г

ТВ г

Азп

Азр

Зег

А1а

А1а

Азр

385

390

395

400

А1а

кеи

кеи

а! а

б1у

РВе

61 п

куз

Агд

кеи

А1а

А1а

РВе

кеи

Азп

тВг

405

410

415

тВг

ТВ г

ТВ г

РГО

кеи

Азр

кеи

Зег

Азр

Азр

тгр

зег

зег

Нтз

РГО

РГО

420

425

430

Зег

Зег

А1а

РГО

А1а

АЗП

Уа1

Зег

кеи

С1и

ТВг

кеи

кеи

Азп

кеи

ТВ г

435

440

445

Туг

РГО

Мег

геи

11е

тВг

куз

61 п

61 п

11е

Рго

кеи

νβΐ

Агд

Азр

Рго

450

455

460

РВе

туг

А1а

АЗр

Туг

А1а

А1а

куз

Нтз

Азр

61 у

Агд

Уа1

Рго

РВе

\/а1

465

470

475

480

- 69 014853

Азр

Рго Уа!

Рго

Реи Зег Агд 485

Тгр

Азп Тгр Зег 490

Мер

а!а туг

РГО 495

А5р

Зег

А1а

Реи

Азр

б!и

А1а

Не

Ηί 5

А5П

руз

ТНг

Реи

РНе

мет

Азр

Тгр

500

505

510

11е

А! а

61 и

Азп

Туг

Реи

тНг

Рго

Не

Зег

АЗр

РГО

С1и

61 п

Суз

зег

515

520

525

Зег

Зег

|_еи

11е

Уа!

туг

Уа!

61 у

тНг

Азр

61 у

Зег

61 п

Агд

А1а

Агд

5 30

535

540

Азп

Уа1

туг

Агд

Зег

Реи

Рго

61 у

А1а

Рго

Зег

61 у

туг

5ег

Руз

РНе

545

550

555

560

Реи

Не

Зег

Азп

Мер

а! а

5ег

Уа1

Рго

Азр

РНе

Уа!

11е

Рго

Уа1

С1у

565

570

575

61 и

Не

61и

А1а

Туг

Зег

тНг

11е

ТНг

61п

ΗΊ5

61 п

С1и

Руз

РНе

РГО

580

585

590

Уа1

А1а

11е

А£Р

уа!

Реи

А1а

А1 а

Руз

С1у

суз

Азр

61у

Ьеи

Реи

Уа1

595

600

605

Ага

1 ри

Д1 А

61 п

ляп

1 ри

рИр

61 и

А1а

61ν

ιΙθ

11 е

А5П

а! а

Рго

|_еи

610

615

620

А1а

61у б!у

ТНг

Реи

тНг

61 у

61 у

Рго

Уа!

Реи

Зег

625 630 635 <210> 33 <211> 564 <212> РКТ <213> Азрегд111из гпдег <400> 33

мер 1

а!а Реи

тНг

Зег 5

Тгр

С1и

61 п

ТНг

А1а А1а А1а Ру5 Агд 61 п

5ег

10

15

Уа!

реи

Азп

А! а

Не

РГО

б!и

Руз

Тгр

Агд

11е

Руз

61 у

Рго

11е

РГО

20

25

30

А1 а

Рго

Зег

61 и

61 π

Агд

АЗР

уа!

тНг

с1у

Рго

туг

Не

61 п

61п

рЬе

35

40

45

Реи

Зег

Рго

Агд

61 и

Уа!

61 и

Не

ТНг

61 и

тНг

АЗР

А1а

Уа!

61у

Не

55 60

- 70 014853

тКг б!и 65

Агд ТКг

тКг

ТКг 61у 61п Тгр тКг 70

А1а 75

Уа!

61 и

Уа1

тКг

61 и 80

А1а

РКе

суз

Нт 5

Агд

А1а

А1а

хеи

А1а

нтз

61 п

Хеи

Уа1

Азп

суз

хеи

85

90

95

Ηΐ 5

б1и

11е

РКе

РКе

Азр

А1а

А1а

ьеи

61 и

тКг

А1а

Агд

11е

Хеи

Азр

100

105

110

Азр

НТ 5

Туг

тКг

Хуз

ТНг

61 у

хуз

рго

Хеи

61 у

рго

Хеи

НТ5

01 у

Хеи

115

120

125

Рго

уа1

Зег

Хеи

Ьуз

Азр

61 η

РКе

нтз

Уа!

ьуз

61 у

Уа1

б1и

тКг

тКг

130

135

140

Мех

61 у

туг

Уа1

61 у

тгр

Не

Азп

тКг

РКе

61 п

61у

хуз

тКг

Азп

Азр

145

150

155

160

рго

Агд

Туг

Хеи

тНг

Нтз

61и

Зег

61 и

Хеи

Уа1

хуз

61 и

Хеи

Агд

А1а

165

170

175

А1 а

61 у

А1а

Уа1

Хеи

Туг

Суз

хуз

тКг

5ег

Уа1

Рго

мех

тКг

Хеи

мех

180

185

190

Зег

61 у

61 и

тКг

Мех

Азп

АЗП

Не

11 е

тКг

туг

ТНг

Н1 5

АЗП

Рго

хуз

195

200

205

АЗП

Агд

Хеи

ьеи

Зег

Зег

61 у

С1у

5ег

Зег

61 у

б1у

61 и

С1у

А1а

Хеи

210

215

220

Не

л1а

Хеи

Агд

С1у

Зег

рго

А1а

Е1у

РКе

61 у

тКг

Азр

Не

61 у

61 у

225

230

235

240

5ег

Не

Агд

Уа1

Рго

А1а

Зег

РКе

Азп

61у

хеи

туг

61 у

11е

Агд

Рго

245

250

255

Зег

Уа1

61 у

Агд

Мех

Рго

туг

б!и

61 у

А1а

А1а

Азп

Зег

б1у

Азр

б1у

260

265

270

С1п

АЗП

ТКг

Уа1

хеи

Зег

Уа1

Уа1

61у

РГО

хеи

Зег

Рго

Зег

А1а

Агд

275

280

285

С1у

хеи

11е

Хеи

хеи

РКе

хуз

тКг

Уа1

хеи

С1у

А1а

мех

Рго

Тгр

хеи

290

295

300

б1у

Азр

Рго

61 у

Уа!

хеи

С1и

11е

РГО

тгр

Агд

61 и

61 и

Не

Уа!

б1и

305

310

315

320

61 и

тКг

Агд

Хуз

хеи

Уа!

61п

С1у

хуз

Рго

61 и

61 у

Хеи

А1а

РКе

61 у

325

330

335

- 71 014853

11е Рве Туг Азр Азр

61у 61 η Уа1

1_У Ξ 345

РГО С1п РГО

РГО

Уа1 350

61ιι

Агд

340

А1 а

мег

Агд

11 е

А1а

А1а

61 и

твг

11е

ьуз

Агд

Ьеи

б1у

НТ 3

ьуз

Ьеи

355

360

365

11 е

Азп

тгр

61 и

Рго

Рго

5ег

Н15

Ьеи

Твг

А1 а

А1а

Зег

ьеи

А1а

Азп

370

375

380

Агд

А1а

Туг

Азп

мет

Агр

61 у

61 у

А1а

Азр

Уа1

1_еи

61η

АЗП

рве

А1 а

385

390

395

400

|_еи

Зег

АЗП

61 и

А1а

11е

НТ 5

твг

Зег

Уа1

Уа1

11е

Азр

А1а

Зег

61 у

405

410

415

Зег

Рго

61 η

Ьуз

твг

А1а

|_еи

61 и

11 е

А1а

А1 а

ьеи

АЗП

Уа1

61 и

ьуз

420

425

430

Агд

б!и

Туг

61 η

!-У5

61п

туг

Ьеи

Азр

туг

тгр

Азп

Зег

твг

А1а

61 п

435

440

445

Ьеи

Твг

61 у

твг

61 у

Агд

РГО

Уа1

Азр

А1а

Уа1

11 е

Суз

Рго

Уа1

А1 а

450

455

460

Рго

Н1 5

А1а

А1а

Суз

11е

Рго

61 у

|_уз

туг

А1а

твг

11е

С1у

Туг

Твг

465

470

475

480

А1а

Рве

11 е

А5П

Уа1

1_еи

Азр

Туг

Твг

Зег

А1 а

уа!

Уа1

Рго

Уа1

Твг

485

490

495

Зег

А1а

Азр

Агд

Агд

Уа1

Азр

Уа1

Уа1

61у

ьуз

61 и

б1у

Агд

61 и

Туг

500

505

510

РНе

С1у

61 и

Ьеи

АЗр

Агд

1-У5

твг

61 и

61у

61и

туг

АЗр

А1а

Азр

Уа!

515

520

525

Рве

АЗр

61 у

А1а

РГО

А1а

б1у

11 е

61 η

ьеи

Рве

61 у

Агд

Агд

ьеи

61η

530

535

540

61 и

61 и

ЬУ5

11е

Ьеи

Уа1

ьеи

А1а

61 и

Туг

ьеи

61 у

61и

61 и

рве

1-У5

545

550

555

560

ЬУЗ

А1а

Зег

А1а

<210>	34
<211>	46
<212>	ΟΝΑ
<213>	ргттег

- 72 014853

<400> 34 сссХХааХХа асХсаХаддс	аХсаХддасд	адаадссхса	дХХСХХ	46
<210>	35
<211>	33
<212>	ΟΝΑ
<213>	ргттег
<400> 35 ХХаддсдсдс сааххададх	дассасааах	ссс		33
<210>	36
<211>	44
<212>	ΟΝΑ
<213>	ргптег
<400> 36 сссххаахха асхсахаддс	аХсаХддсХс	дхахсдахгч:	дХсс	44
<210>	37
<211>	31
<212>	ϋΝΑ
<213>	ргттег
<400> 37 ХХаддсдсдс сдадассдас	Хадсссдгда	а		31
<210>	38
<211>	46
<212>	ΟΝΑ
<213>	рптег
<400> 38 сссххаахха асхсахаддс	ахсахдхсдд	гаххдгхсас	ХХсХаХ	46
<210>	39
<211>	31
<212>	ϋΝΑ

- 73 014853 <213> рпгпег <400> 39

ххаддсдсдс сдсахдссдг	ссаадТТасс	с	31
<210>	40
<211>	43
<212>	ΡΝΑ
<213>	рНтег
<400> 40 сссттаатта астсатаддс	аТсаТддТдс	дсдсТассса асТ	43
<210>	41
<211>	33
<212>	ΟΝΑ
<213>	ргттег
<400> 41 ттаддсдсдс ссдтсааата	ссаагсдтат	дТд	33

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (22)

1. Изолированная амидаза, которая может быть получена из АзрегдШиз шдег с аминокислотной последовательностью 8ЕО ΙΌ ЫО: 23, или ее функциональные эквиваленты, обладающие по меньшей мере 70% или большей гомологией с аминокислотной последовательностью 8ЕО ΙΌ ЫО: 23.

2. Изолированная амидаза, которая может быть получена из АзрегдШиз шдег с аминокислотной последовательностью 8ЕО ΙΌ ЫО: 32, или ее функциональные эквиваленты, обладающие по меньшей мере 70% или большей гомологией с аминокислотной последовательностью 8ЕО ΙΌ ЫО: 32.

3. Изолированный полинуклеотид, выбранный из:

(a) изолированного полинуклеотида, кодирующего амидазу, которая может быть получена из АзрегдШиз шдег, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ ЫО: 23, или ее функциональные эквиваленты, обладающие по меньшей мере 70% или большей гомологией с аминокислотной последовательностью 8ЕО ΙΌ ЫО: 23;

(b) изолированного полинуклеотида, кодирующего по меньшей мере один функциональный домен амидазы, которая может быть получена из АзрегдШиз шдег, содержащей аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ ЫО: 23, или его функциональных эквивалентов, обладающих по меньшей мере 70% или большей гомологией с нуклеотидной последовательностью 8ЕО ΙΌ ЫО: 1 или 8ЕО ΙΌ ЫО: 12;

(c) изолированного полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность 8ЕО ΙΌ ЫО: 1 или 8ЕО ΙΌ ЫО: 12, или его функциональных эквивалентов, обладающих по меньшей мере 70% или большей гомологией с нуклеотидной последовательностью 8ЕО ΙΌ ЫО: 1 или 8ЕО ΙΌ ЫО: 12.

4. Изолированный полинуклеотид, выбранный из:

(a) изолированного полинуклеотида, кодирующего амидазу, которая может быть получена из АзрегдШиз шдег, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ ЫО: 32, или ее функциональные эквиваленты, обладающие по меньшей мере 70% или большей гомологией с аминокислотной последовательностью 8ЕО ΙΌ ЫО: 32;

(b) изолированного полинуклеотида, кодирующего по меньшей мере один функциональный домен амидазы, которая может быть получена из АзрегдШиз шдег, содержащей аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ ЫО: 23, или его функциональных эквивалентов, обладающих по меньшей мере 70% или большей гомологией с нуклеотидной последовательностью 8ЕО ΙΌ ЫО: 10 или 8ЕО ΙΌ ЫО: 21;

(c) изолированного полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность 5>ЕО ΙΌ ЫО: 10 или 8ЕО ΙΌ ЫО: 21, или его функциональных эквивалентов, обладающих по меньшей мере 70% или большей гомологией с нуклеотидной последовательностью 8ЕО ΙΌ ЫО: 10 или 8ЕО ΙΌ ЫО: 21.

5. Вектор, содержащий полинуклеотид по п.3 или 4.

6. Изолированная амидаза, которая может быть получена экспрессией полинуклеотида по любому из пп.3, 4 или вектора по п.5 в соответствующей клетке-хозяине, например АзрегдШиз шдег.

7. Рекомбинантная амидаза, содержащая функциональный домен любой амидазы по любому из пп.1, 2 или 6.

8. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по любому из пп.3, 4 или вектор по

- 74 014853

п.5.

9. Рекомбинантная клетка-хозяин, экспрессирующая амидазу по любому из пп.1, 2 или 6, 7.

10. Способ получения амидазы по любому из пп.1, 2, 6, 7, включающий стадии трансформации подходящей клетки-хозяина изолированным полинуклеотидом по любому из пп. 3, 4 или вектором по п.5; культивирования указанной клетки в условиях, допускающих экспрессию указанной амидазы; и, при необходимости, ее очистки из указанной клетки или культуральной среды.

11. Способ продуцирования полинуклеотида по любому из пп.3, 4, включающий стадии культивирования клетки-хозяина, трансформированной указанным полинуклеотидом; и выделения указанного полинуклеотида из указанной клетки-хозяина.

12. Способ продуцирования вектора по п.5, включающий стадии культивирования клетки-хозяина, трансформированной указанным вектором; и выделения указанного вектора из указанной клеткихозяина.

13. Способ получения пищевого продукта с пониженным содержанием акриламида, включающий обжарку пищевого продукта при температуре, при которой образуется акриламид, с получением обжаренного пищевого продукта с последующим приведением обжаренного пищевого продукта и/или порошков, смесей и/или экстрактов, полученных из обжаренного пищевого продукта, в контакт с ферментом амидазой в водных условиях с получением ферментативно обработанного пищевого продукта, причем указанный фермент способен модифицировать акриламид.

14. Способ по п.13, где фермент добавляют в количестве, достаточном для уменьшения количества акриламида на 50%, предпочтительно на 70%, предпочтительнее на 80% и наиболее предпочтительно на 90% по сравнению с количеством в пищевом продукте, к которому фермент не был добавлен.

15. Способ по п.13 или 14, в котором водные условия получают посредством добавления воды или пасты, содержащей воду, к обжаренному пищевому продукту и/или порошкам, смесям и/или экстрактам, полученным из обжаренного пищевого продукта, и ферментативно обработанный пищевой продукт содержит по меньшей мере 15 мас.% воды.

16. Способ по любому из пп.13-15, где пищевой продукт представляет собой кофейный продукт, предпочтительно обжаренные кофейные зерна, или части, или экстракты обжаренных кофейных зерен, молотый кофе, растворимый кофе, жидкие кофейные напитки, кофейные экстракты и декофеинированный вариант кофейных продуктов.

17. Способ по любому из пп.13-15, где обжаренный пищевой продукт представляет собой обжаренные зерна какао или обжаренные орехи.

18. Способ по любому из пп.13-17, где ферментативно обработанный пищевой продукт представляет собой сваренный кофе, жидкий кофейный напиток, кофейный экстракт или декофеинированный вариант этих кофейных продуктов, напиток какао или шоколадный напиток.

19. Способ по любому из пп.13-18, где ферментативно обработанный пищевой продукт высушивают или частично высушивают с получением концентрированного кофейного экстракта, быстрорастворимого кофе или декофеинированного варианта этих кофейных продуктов, или быстрорастворимого шоколадного напитка, или быстрорастворимого напитка какао.

20. Способ по любому из пп.13-19, где фермент способен гидролизовать короткоцепочечные нециклические амиды.

21. Применение амидазы по любому из пп.1, 2, 6, 7 в способе получения пищевого продукта по любому из пп.13-20.

22. Пищевой продукт с пониженным содержанием акриламида, который может быть получен способом по любому из пп.13-20.