KR20090126303A - 체세포 재프로그래밍 - Google Patents

체세포 재프로그래밍

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KR20090126303A
KR20090126303A KR1020097022090A KR20097022090A KR20090126303A KR 20090126303 A KR20090126303 A KR 20090126303A KR 1020097022090 A KR1020097022090 A KR 1020097022090A KR 20097022090 A KR20097022090 A KR 20097022090A KR 20090126303 A KR20090126303 A KR 20090126303A
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제임스 톰슨
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위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션
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Abstract

본 발명은 1 이상의 또는 복수의 분화능 결정 인자를 체세포에 투여함으로서 체세포를 만능 세포로 재프로그래밍하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 재프로그래밍 방법을 이용하여 얻어지는 만능 세포 군집에 관한 것이다.

Description

체세포 재프로그래밍{SOMATIC CELL REPROGRAMMING}
관련 출원 상호 참조
본 출원은 2007년 3월 23일자 출원된 미국 가특허 출원 60/919,687호, 2007년 9월 25일자 출원된 미국 가특허 출원 60/974,980호, 및 2007년 11월 19일자 출원된 미국 가특허 출원 60/989,058호(이들 출원 각각은 그 전체 내용이 본원에 참고 문헌으로 인용됨)를 우선권으로 주장한다.
연방 정부 지원 연구 또는 개발에 관한 선언
적용 사항 없음
배아 줄기(ES) 세포는 만능분화능을 유지하면서 무한히 성장할 수 있으며 3 배엽 모두의 세포로 분화할 수 있다[Evans & Kaufman, Nature 292: 154-156 (1981)]. 인간 ES 세포는 파킨슨병, 척수 손상 및 당뇨병과 같은 다수의 질환을 치료하는 데 있어 유용할 것이다[Thomson et al, Science 282:1145-1 147 (1998)]. 과학자들은 배반포 세포로부터 ES 세포를 발생시키는 현재의 방법을 회피하고 환자에 이식 후 예상되는 조직 거부 문제를 회피하기 위한 기술적 해결 방안을 모색하여 왔다. 이러한 해결 방안을 달성하기 위한 한 바람직한 방법은 출생 후 개체의 체세포로부터 직접 만능 세포를 발생시키는 것이다.
체세포는 이의 핵 내용물을 난모 세포로 이동시킴으로써[Wilmut et al, Nature 385:810-813(1997)] 또는 ES 세포와의 융합에 의해서[Cowan et al, Science 309: 1369-1373 (2005)] 재프로그래밍될 수 있는데, 이것은 수정되지 않은 난자 및 ES 세포가 체세포에서 다분화능 또는 만능분화능을 부여하는 인자를 함유함을 시시한다.
마찬가지로, Yu 등은 H1 Oct4 녹-인 ES 세포로부터 시험관내 분화에 의하여 유도된 세포는 EGFP를 발현시키지 않았으나, EGFP 발현이 인간 ES 세포를 이용한 세포-세포 융합시에 복구되었음을 보였다[Yu et al, Stem Cells 24:168-176 (2006), 이 전체 내용은 본원에 참고 문헌으로 포함됨]. 따라서, Yu 등은 분화된 세포가 인간 ES 세포를 이용한 세포-세포 융합을 통하여 만능분화능이 될 수 있음을 증명하였다. 분화된 세포 유형과 무관하게, 미분화된 인간 ES 세포와의 융합시, ES 세포 특이 항원 및 마커 유전자가 발현되었고 융합된 하이브리드 세포에서 분화 특이적 항원이 더 이상 검출될 수 없었다. 유리하게도, EGFP 발현이 하이브리드 세포에서 다시 확립되어, 만능 줄기 세포 상태의 재확립을 위한 편리한 마커를 제공하였다. 하이브리드 세포가 배상체(EB)를 형성할 때, 3 배엽 모두 및 배외 조직의 유전자 특성이 상향 조절되어 하이브리드 세포가 다계통으로 분화될 가능성을 가짐을 시사하였다.
만능분화능의 전사적 결정은 완전히 이해되지 않았으나, Oct 3/4[Nichols et al, Cell 95:379-391(1998)], Sox2[Avilion et al, Genes Dev. 17: 126-140 (2003)] 및 Nanog[Chambers et al, Cell 113:643-655(2003)]를 포함하는 몇가지 전사 인자가 ES 세포 만능분화능의 유지에 관여하지만 어느 것도 단독으로는 ES 세포 정체(cell identity)를 특정하는 데 불충분하다.
Chambers & Smith[EP 1 698 639 A2호(2002)]는 분화 억제 인자를 코딩 또는 활성화하는 벡터를 도입함으로서 영양세포층 또는 영양세포 세포 추출물 및 gp130 시토카인 없이 만능 뮤린 세포를 유지하였으나 분화된 세포를 만능분화능 상태로 전환시키지는 않았다.
더 최근에는, Takahashi & Yamanaka가 4 개의 인자(즉, Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 Klf4)를 마우스 ES 세포 배양에 적당한 조건 하에서 배양된 마우스 ES 세포 및 마우스의 성숙한 섬유아세포에 도입하여 유도된 만능 줄기(iPS) 세포를 얻었는데, 이것은 마우스 ES 세포 모폴로지 및 성장 특성을 보였고 마우스 ES 세포 마커 유전자를 발현시켰다[Takahashi & Yamanaka, Cell 126:663-676 (2006)]. 특히, 마우스 섬유아세포에 도입된 외생 Oct-4는 주변 Oct-4만을 발현시켰다. iPS 세포를 누드 마우스에 피하 이식하여 3 배엽 모두로부터 각종 조직을 함유하는 종양을 얻었다. 배반포로 도입 후, iPS 세포는 마우스 배 발생에 기여하였다. 그러나, 만능분화능 유도에 필요했던 c-Myc는 종양 형성 유전자이다. 마찬가지로, Klf4도 종양 형성 유전자이다. 이들 데이터는 레트로 바이러스 형질 도입을 이용하여 단지 소수의 정해진 인자를 첨가함으로써 만능 세포가 마우스 섬유아세포 배양물로부터 직접 발생될 수 있음을 증명한다. 그러나, 이하에 개시되는 바와 같이, 분화된 마우스 세포로부터 iPS 세포를 생성하는데 사용되는 인자 세트는 인간 체세포에 추가의 변화를 도입하지 않고 렌티 바이러스 벡터를 사용하여 인간 체세포를 만능분화능으로 재프로그래밍하는 데 불충분하였다.
마우스 및 인간에서 유래하는 ES 세포는 미분화 상태로 남아 있기 위하여 별개의 인자 세트를 필요로 하여 심지어 포유동물 사이에서도 종 특이적 차이의 유의성을 나타내므로, 인간 체세포를 재프로그래밍할 수 있는 인자는 (마우스를 포함하는) 모델 유기체에서 유래하는 체세포를 재프로그래밍할 수 있는 인자와 상이하다고 가정할 수 있다. 예컨대, 마우스 ES 세포 증식의 열쇠인 백혈병 억제 인자(LIF)/Stat3 경로는 인간 ES 세포 증식을 보조하지 않으며 인간 ES 세포를 보조하는 조건에서 불활성인 것으로 보인다[Daheron L, et al, Stem Cells 22:770-778 (2004); Humphrey R, et al, Stem Cells 22:522-530 (2004); and Matsuda T, et al, EMBO J. 18:4261-4269 (1999)].
유사하게, 골형성 단백질(BMP)은 LIF와 함께 무혈청 배지에서의 클론 밀도에서 마우스 ES 세포 자체 재생을 보조하나[Ying Q, et al, Cell 115:281-292 (2003)], 섬유아세포 상에서의 배양 또는 섬유아세포 조건 배지에서의 배양과 같은 자체 재생을 보조하는 조건에서 신속한 인간 ES 세포 분화를 야기한다[Xu R, et al, Nat. Biotechnol. 20:1261-1264 (2002)]. 실제로, 인간 ES 세포에서 BMP 신호 전달의 억제가 유리하다[Xu R, et al, Nat. Methods 2:185-190 (2005)].
또한, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 신호 전달은 인간 ES 세포의 자체 재생에서는 중요하지만, 마우스에 대해서는 명백하지 않다[Xu et al, (2005), 상기 문헌; 및 Xu C, et al, Stem Cells 23:315-323 (2005)].
따라서, 업계는 만능 세포를 얻기 위하여 적어도 영장류(인간 및 비인간 포함) 체세포를 재프로그래밍하는 방법에 사용하는 데 적합한 분화능 결정 인자 세트를 찾고 있다. 배아 조직에 의존하지 않고 얻어지는 이러한 세포는 기존의 만능 영장류 ES 세포에 대하여 이미 고려된 적용예에 사용하는 데 적합할 것이다.
간단한 개요
본 발명은 분화된 영장류 체세포를 만능 세포, 더 구체적으로 iPS 세포로 재프로그래밍하는 방법에 관한 것으로 넓게 요약된다. 본원에서 사용될 때, "iPS 세포"는 이의 원래의 각 분화 체세포와 실질적으로 유전적으로 동일하고 본원에 개시된 바와 같이 ES 세포와 같이 분화능이 더 높은 세포와 유사한 특성을 보이는 세포를 의미한다. 세포는 여러 분화된 (즉, 비-만능분화능 및 다분화능) 체세포로부터 얻을 수 있다.
iPS 세포는 ES 세포와 유사한 형태적 특성(즉, 둥근 형상, 큰 핵소체 및 빈약한 세포질) 및 성장 특성(즉, 더블링 타임; ES 세포의 더블링 타임은 약 17 내지 18 시간임)을 보인다. 또한, iPS 세포는 만능 세포 특이적 마커(예컨대, Oct-4, SSEA-3, SSEA-4, Tra-1-60, Tra-1-81, 그러나 SSEA-1은 아님)를 발현시킨다. 그러나, iPS 세포는 배아에서 직접 유래하지 않으며 이들이 적어도 만능이 될 때까지 선택된 분화능 결정 인자의 하나 이상의 복제를 일시적으로 또는 안정적으로 발현시킬 수 있다. 본원에서 사용될 때, "배아에서 직접 유래하지 않은"이란 iPS 세포를 생성하기 위한 출발 세포 유형이 다분화능 세포와 같은 비만능 세포 또는 출생 후의 개체에서 얻어지는 체세포와 같은 최종적으로 분화된 세포임을 의미한다.
본원에 개시된 방법에서, 2 이상의 분화능 결정 인자는 분화된 체세포로 도입되어 여기서 발현될 수 있으며, 그 후 상기 체세포는 배양에서 3 배엽층 모두의 특징적인 세포로 분화될 수 있고 출생 후 개체의 체세포의 유전적 보체를 함유하는 인간 ES 세포와 같은 만능 세포의 특징적인 특성을 갖는 세포로 전환된다(즉, 적어도 Oct-4, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 또는 TRA-1-81을 발현시키나 SSEA-1은 발현시키지 않고, 뚜렷한 핵소체 및 세포질에 대하여 높은 핵 비율을 갖는 컴팩트 콜로니로서 나타남). 분화능 결정 인자를 코딩하기 위하여 도입되는 유전 물질은 별문제로 하고, 재프로그래밍된 (즉, 전환된) 세포는 이들이 유래하는 체세포와 실질적으로 유전적으로 동일하다.
본원에서 사용될 때, "분화능 결정 인자"는 체세포가 만능분화능이 되도록 체세포의 분화능을 증가시키기 위하여 사용되는 유전자 또는 다른 핵산 또는 이들의 기능적 단편 그리고 코딩된 인자 또는 이들의 기능적 단편과 같은 인자를 의미한다. 분화능 결정 인자는 임의로 재프로그래밍된 세포 중에 일시적으로만 존재하거나 또는 재프로그래밍된 세포의 게놈 내에 전사적으로 활성 또는 비활성인 상태로 유지될 수 있다. 마찬가지로, 분화능 결정 인자는 재프로그래밍된 세포 내에 1 이상의 복제로서 존재할 수 있는데, 여기서 분화능 결정 인자는 세포의 게놈에 삽입될 수 있거나, 염색체외이거나 둘다일 수 있다. 분화능 결정 인자는 Stella(서열 번호 1); POU5F1(Oct-4; 서열 번호 2), Sox2(서열 번호 3), FoxD3, UTF1 , Rex1, ZNF206, Sox15, Myb12, Lin28(서열 번호 4), Nanog(서열 번호 5), DPPA2, ESG1, Otx2 및 이들의 하위 세트를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서는, 두 분화능 결정 인자, 예컨대 Oct-4 및 Sox2로 충분할 수 있다. 그러나, 재프로그래밍된 세포를 얻는 데 있어서의 효율은 Lin28, Nanog 또는 둘다와 같은 추가의 분화능 결정 인자를 포함시킴으로써 개선될 수 있다.
제1 측면에서, 본 발명은 출생 후의 개체, 특히 살아 있는 개체, 그러나 임의로 죽은 개체에서 얻어지는 만능 세포가 농후한 보충 가능한 군집에 관한 것이다. 농후화된 세포 군집의 세포는 Oct-4, SSEA3, SSEA4, Tra-1-60, Tra-1-81 또는 이들의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는 1 이상의 세포형 특이적 마커를 발현시키며 ES 세포와 같은 만능 세포의 다른 특징을 가진다. 또한, 만능 세포는 알칼리성 인산 분해 효소(ALP)를 발현시킬 수 있다. 또한, 만능 세포는 개체로부터 유래하는 선재하는 분화된 세포의 게놈과 실질적으로 유전적으로 동일한 게놈을 가질 수 있다. 마찬가지로, 만능 세포는 재프로그래밍 후에 전사적으로 활성 또는 비활성일 수 있는 1 이상의 분화능 결정 인자를 코딩하는 게놈을 가질 수 있다. 또한, 분화능 결정 인자는 분화능 결정 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 이종 프로모터에 작동 가능하게 연결된 재프로그래밍 서열의 형태일 수 있다. 본원에서 사용될 때, "이종 프로모터"는 이 프로모터가 정상적으로 전사를 개시하지 않는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 의미한다.
제2 측면에서, 본 발명은 체세포를 만능 세포로 재프로그래밍하는 데 필요한 분화능 결정 인자를 동정하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미이다. 본 발명의 실시 또는 시험을 위한 적당한 방법 및 물질을 이하에 개시하나, 본원에 개시된 것과 유사하거나 동등한 다른 방법 및 물질도 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 목적, 이점 및 특징은 첨부 도면과 함께 개시되는 이하의 명세서로부터 명백해질 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 녹-인 작제물이 도입된 인간 Oct4 프로모터로부터 다운스트림 부위를 도시한다. 녹-인 작제물을 함유하는 세포에서는, Oct4 프로모터가 활성일 때 증대된 녹색 형광 단백질(EGFP) 및 네오마이신 인산 운반 효소(NEO)가 발현된다. 이들 세포를 사용하여 어떤 인자가 체세포를 만능 세포로 재프로그래밍할 수 있는지 평가할 수 있다.
도 2A-B는 인간 H1 ES 세포 분화를 도시한다. 도 2A는 인간 ES 세포로부터 골수 전구체 유도 및 정제의 개략도를 나타낸다. 도 2B는 Percoll® 분리 후 얻어지는 분화된 세포의 표현형 분석을 나타낸다. 회색선: 아이소타입 대조군; 흑색선: 항체 염색. 약어: hESC, 인간 배아 줄기 세포; MPO, 골수과산화효소; pHEMA, 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트).
도 3은 도 1의 녹-인 작제물을 함유하는 Oct-4 영역을 도시한다.
도 4A-C는 체세포의 렌티 바이러스 형질 도입을 도시한다. 도 4A는 렌티 바이러스 작제물의 모형도이다. 도 4B는 여러 MOI에서 Percoll®-정제 세포가 EGFP-발현 렌티 바이러스 벡터로 형질 도입되었음을 나타낸다. EGFP 발현은 약물 선택 없이 형질 도입 후 3일에 유세포 분석으로 분석하였다. 도 4C는 Matrigel®에서 추가로 수일 동안 배양 후 Percoll®-정제된 세포의 렌티 바이러스 형질 도입을 보인다. EGFP 발현은 렌티 바이러스 형질 도입 후 2일에 분석하였다.
도 5는 Matrigel®에서 7일 동안 분화된 세포에서 형질전환 유전자 과다 발현을 도시한다. Nanog 또는 EGFP를 과다 발현시키는 세포(대조군)에서는 모폴로지의 유의적인 변화가 관찰되지 않았다. Oct-4-발현 세포의 모폴로지는 급격하게 변화되며, 이들 세포 중 다수는 네오마이신 선택에서는 살아남지만 이들 세포중 어느 것도 일반적인 인간 ES 세포 모폴로지를 보이지 않아, Oct-4-발현 ES 세포의 약물 선택성 군집은 골수 분화에 필요한 배양 기간을 견디지 못함을 시사한다.
도 6A-B는 14개의 분화능 결정 인자의 도입을 통한 0Ct4KICD45+A 세포의 재프로그래밍을 나타낸다. 도 6A는 확립된 클론이 미분화된 인간 ES 세포 모폴로지를 나타내고 내생 Oct4 프로모터의 지시 하에 EGFP를 발현시킴을 보여준다. 도 6B는 확립된 클론에서 인간 ES 세포 특이적 세포 표면 항원 발현의 유세포 분석을 나타낸다. 회색선: 아이소타입 대조군; 흑색선: 항체 염색.
도 7A-C는 콜로니 형성으로 입증되는 바와 같이 여러 분화능 결정 인자 세트의 도입 후의 재프로그래밍 효율을 도시한다. 또 7A는 14개의 분화능 결정 인자의 동정된 세트를 조합하여(여기서, 각 조합은 14개 인자 중 하나를 제외시킴) 세포로 도입하였음을 나타낸다. 분화능 결정 인자가 시험된 세포를 ES 유사 상태로 재프로그래밍하는 능력을 평가함으로써, 본 발명자들은 제외된 분화능 결정 인자가 재프로그래밍에 필수적인 것인지 여부를 결정하였다. 예컨대, Oct-4가 결핍된 M1이라 지칭되는 분화능 결정 인자 세트(M1-Oct-4로 표시됨)는 유의적인 수의 ES 유사 콜로니를 형성할 수 없었다. 따라서, Oct-4는 체세포 재프로그래밍에 중요하다는 결론이 나왔다. 또 7B는 추가의 시험을 위해 평가된 분화능 결정 인자 세트(도 7A로부터 축소됨)가 14에서 4(M4, 즉 Oct-4, Sox2, Lin28 및 Nanog)로 축소되었음을 나타낸다. 이들 4개의 분화능 결정 인자를 조합에서 4개 중 하나를 차례로 제외시킴으로써 시험하였다. 3개의 분화능 결정 인자의 조합(예컨대, M4-Oct-4)이 시험된 세포를 재프로그래밍하여 유의적인 수의 안정한 ES 유사 콜로니를 형성할 수 없었던 경우, 발명자들은 생략된 유전자가 체세포 재프로그래밍에 중요하다고 결론지었다. 도 7B에서, 밝은 회색 막대는 전형적인 인간 ES 세포 모폴로지를 갖는 형성된 재프로그래밍된 콜로니의 전체 수를 나타내고, 진한 회색 막대는 최소 분화된 대형 콜로니의 수를 나타낸다. 도 7C는 추가의 시험을 위해 평가된 분화능 결정 인자 세트(도 7B로부터 축소됨)가 4에서 2(즉, Oct-4 및 Sox2)로 축소되었음을 나타낸다. Oct-4, Sox2, Lin28 및 Nanog는 조합에서 4개중 2개를 차례로 제외시킴으로써 시험하였다.
도 8A-B는 인간 성인 피부 섬유아세포에서의 재프로그래밍을 도시한다. 도 8A는 인간 성인 피부 세포(p5)(좌) 및 재프로그래밍된 세포(우)의 명시야 상을 나타낸다. 도 8B는 인간 성인 피부 세포(p5)(하) 및 재프로그래밍된 세포(상)에서 인간 ES 세포 특이적 마커의 유세포 분석을 나타낸다. 회색선: 아이소타입 대조군; 흑색선: 항체 염색.
도 9A-B는 Oct-4 및 Sox2의 상태적 발현을 재프로그래밍하는 것에 대한 효과를 나타낸다. 도 9A는 293FT 세포에서 Oct-4 및 Sox2의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다[레인 1, PSin4-EF2-Oct4-IRES1-Sox2(OS-IRES1); 레인 2, PSin4-EF2-Oct4-IRES2-Sox2(OS-IRES2); 레인 3, pSin4-EF2-Oct4-F2A-Sox2(OS-F2A); 레인 4, pSin4-EF2-Oct4-IRES1-puro(O); 레인 5, pSin4-EF2-Sox2-IRES1-puro(S); 레인 6, 플라스미드 없음(대조군)]. 도 9B는 연결된 분화능 결정 인자를 사용하여 OCT4 녹-인 인간 ES 세포에서 유래된 간엽 세포에서의 재프로그래밍을 도시하며, pSin4-EF2-Nanog-IRES1-puro(N) 및 pSin4-EF2-Lin28-IRES1-puro(L)을 첨가하여 유전자 조합은 도 9A와 동일하다.
바람직한 실시양태의 상세한 설명
본 발명자들은 영장류 ES 세포에 존재하는 분화능 결정 인자가 다분화성을 유지하는 데 중요한 역할을 하며 분화된 체세포가 분화능 결정 인자의 발현을 통하여 만능분화능 상태로 재프로그래밍될 수 있다고 가정하였다.
세포 유형은 분화 동안 전분화능, 만능분화능 및 다분화능과 같은 여러 수준의 분화능을 거친다. 본원에서는 특히 만능 세포가 관심의 대상이다.
본원에서 사용될 때, "만능 세포"란 3 배엽층(예컨대, 내배엽, 중배엽 및 외배엽) 모두로 분화될 수 있는 세포 군집을 의미한다. 만능 세포는 각종 만능 세포 특이적 마커를 발현시키고, 미분화된 세포의 특징적인 세포 모폴로지(즉, 컴팩트 콜로니, 세포질에 대하여 높은 핵 비율 및 뚜렷한 핵소체)를 가지며, SCID 마우스와 같은 면역 저하된 동물로 도입될 때 기형종을 형성한다. 기형종은 일반적으로 3 배엽층 모두의 특징적인 세포 또는 조직을 함유한다. 당업자라면 업계에서 통상적으로 사용되는 기술을 이용하여 이들 특성을 분석할 수 있다. 예컨대 상기 Thomson 등의 문헌 참조. 만능 세포는 세포 배양시 증식할 수도 있고 다분화능 특성을 보이는 각종의 계통-제한된 세포 군집으로 분화될 수도 있다. 다분화능 체세포는 만능 세포에 비하여 더 분화된 것이지만 최종적으로 분화된 것은 아니다. 따라서, 만능 세포는 다분화능 세포보다 더 높은 분화능을 가진다. 본원에서 사용될 때, "재프로그래밍된 영장류 만능 줄기 세포" (및 유사 용어)는 체세포 재프로그래밍 방법의 만능분화능 생성물을 의미한다. 이러한 세포는 현재 인간 ES 세포에 대하여 고려되는 연구 및 치료적 용도에서 사용하기 적합하다.
본 발명은 광범위하게는 2 이상의 분화능 결정 인자를 체세포에 투여하여 체세포에서보다 재프로그래밍된 세포에서 더 높은 수준의 분화능을 얻음으로써 분화된 체세포를 만능 세포와 같은 더 높은 분화능의 세포로 재프로그래밍하는 신규한 방법에 관한 것이다. 유리하게도, 본 발명은 체세포에 분화능 결정 인자를 도입하기 위한 세포 표면 수용체를 추가할 필요 없이 체세포로부터 iPS 세포와 같은 만능 세포를 발생시킬 수 있다. 본원에서 사용될 때, "재프로그래밍"은 분화된 체세포가 탈분화된 만능 세포로 전환되므로 이들이 유래하는 세포보다 큰 만능분화능 잠재능을 갖는 유전 과정을 의미한다. 즉, 재프로그래밍된 세포는 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 또는 TRA 1-81과 같은 만능 세포 특이적 마커 중 적어도 하나를 발현한다. 바람직하게는, 재프로그래밍된 세포는 이들 마커 모두를 발현시킨다.
체세포를 재프로그래밍할 수 있는 분화능 결정 인자는 Oct-4, Sox2, FoxD3, UTF1, Stella, Rex1, ZNF206, Sox15, Myb12, Lin28, Nanog, DPPA2, ESG1, Otx2 또는 이의 조합과 같은 인자를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 예에서, 14개의 인자 중 2개의 인자로 된 세트가 시험된 세포의 재프로그래밍에 충분하였으며 이 세트는 Oct-4 및 Sox2를 포함하였다. 그러나, Oct-4 및 Sox2에 다른 분화능 결정 인자를 추가하면 재프로그래밍된 세포를 얻는 효율이 증대되었다. 그러나, c-Myc 및 Klf4는 분화능 결정 인자로서 필수적이지는 않다. 바람직하게는, 분화능 결정 인자는 전사 인자일 수 있다.
적당한 체세포는 임의의 체세포일 수 있으나, 출발 체세포의 더블링 시간이 약 24시간일 경우 더 높은 재프로그래밍 빈도가 관찰된다. 본 발명에 유용한 체세포는 인간을 포함하는 태아, 신생아, 청소년 또는 성인 영장류에서 얻어지는 비배아 세포이다. 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있는 체세포의 예는 골수 세포, 상피 세포, 섬유아세포, 조혈 세포, 간세포, 장 세포, 간엽 세포, 골수 전구체 세포 및 비장 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또다른 유형의 체세포는 기질에 부착된 CD29+, CD44+, CD166+, CD105+, CD73+ 및 CD31- 간엽 세포이다. 대안적으로, 체세포는 스스로 증식하여 혈액 줄기 세포, 근육/뼈 줄기 세포, 뇌 줄기 세포 및 간 줄기 세포를 포함하는 다른 유형의 세포로 분화될 수 있는 세포일 수 있다. 다분화능 조혈 세포, 적합하게는 골수 전구체 세포 또는 간엽 세포는 특히 본 발명 방법에서 사용하기 적당하다고 고려된다.
마찬가지로, 적당한 체세포는 분화능 결정 인자를 코딩하는 유전 물질을 포함하는 분화능 결정 인자의 흡수에 대하여 수용성(受容性)이거나 또는 과학 문헌에 일반적으로 공지된 방법을 사용하여 수용성이 될 수 있다. 흡수 증대 방법은 세포 유형 및 발현 시스템에 따라 달라질 수 있다. 적당한 형질 도입 효율을 갖는 수용성 체세포의 제조에 사용되는 예시적 조건은 업계에 공지이며 이하의 실시예에 개시된다. 세포를 분화능 결정 인자에 대하여 수용성이 되게 하는 한 방법은 전기천공법과 관련하여 이하에 개시된다.
분화능 결정 인자는 체세포가 재프로그래밍된 후 비활성이 될 수 있는 이종 프로모터에 분화능 결정 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 작동 가능하게 연결된 재프로그래밍 서열로서 도입될 수 있다. 이종 프로모터는, 예컨대 Oct4 프로모터와 같이, 체세포에서 분화능 결정 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 유도할 수 있는 임의의 프로모터 서열이다.
분화능 결정 인자의 상대적인 비율을 조절하여 재프로그래밍 효율을 증가시킬 수 있다. 예컨대, 싱글 벡터에서 1:1의 비율로 Oct-4와 Sox2를 연결시키면, 분화능 결정 인자가 별도의 작제물 및 벡터로 세포에 제공되고 단일 세포로의 각 분화능 결정 인자의 흡수 비율이 제어될 수 없는 재프로그래밍 효율에 비하여 4 인자에 의하여 세포에서 재프로그래밍 효율이 증대되었다(도 9A-B). 분화능 결정 인자의 비율은 사용되는 분화능 결정 인자의 세트에 따라 상이할 수 있으나, 당업자라면 본 개시 내용으로부터 분화능 결정 인자의 최적 비율을 용이하게 결정할 수 있다.
만능 세포는 만능 세포의 성장을 보조하기 위하여 사용되는 임의의 배지에서 배양될 수 있다. 일반적인 배양 배지는 TeSR™ (캐나다 벵쿠버 소재 StemCell Technologies, Inc사), mTeSR™(StemCell Technologies, Inc사) 및 StemLine® 무혈청 배지(미국 미주리주 세인트 루이스 소재 Sigma사)와 같은 제한 배지 및 마우스 배아 섬유아세포(MEF)-조건 배지와 같은 조건 배지를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본원에서 사용될 때, "제한 배지"는 생화학적으로 제한된 성분들만으로 구성된 생화학적으로 제한된 제제를 의미한다. 제한 배지는 공지된 화학 조성을 갖는 성분들만을 포함할 수도 있다. 제한 배지는 공지된 공급원에서 유래된 성분들을 더 포함할 수 있다. 본원에서 사용될 때, "조건 배지"는 배지에서 배양된 세포에서 유래하는 가용성 인자가 더 보충된 성장 배지를 의미한다. 대안적으로, 세포는 배양 배지에서 MEF 상에 유지될 수 있다.
본 발명자들은 유전자 발현 연속 분석(SAGE) 라이브러리를 사용하여 ES 세포에 풍부한 유전자의 트랜스크립톰 프로필을 얻었다. 구체적으로, SAGE 라이브러리를 사용하여 ES 세포에서 만능분화능 및 자체 재생을 조절하는 분화능 결정 인자를 동정하였다. SAGE 라이브러리는 당업자에게 널리 공지이며 공개적으로 입수할 수 있거나 또는 특히 Agencourt Bioscience Corp사(미국 매사추세츠주 비버리 소재)와 같은 회사에서 작제될 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 출생 후 개체의 세포와 실질적으로 유전적으로 동일한 만능 세포 농후 군집을 제공한다. 상기 세포는 출생 후 개체로부터 분리된 체세포를 재프로그래밍하여 얻을 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 군집은 정제된 군집으로서, 군집 중에 상기 세포가 적어도 60%, 70%, 80%, 유리하게는 95% 넘게(상기 수치 사이의 임의의 모든 완전 또는 부분 정수 포함) 존재하다. 재프로그래밍된 세포는 정배수체이며, 만능 세포의 특징적인 세포 모폴로지를 보이고, 예컨대 Oct-4, SSEA-3, SSEA-4, Tra-1-60, Tra-1-81 또는 이의 조합과 같은 만능 세포 특이적 마커를 발현시키며, 면역 저하된 동물에 도입될 때 기형종을 형성한다.
또다른 측면은 체세포를 만능 세포로 재프로그래밍하기에 충분한 분화능 결정 인자를 동정하고 사용하는 방법 및 조성물을 제공한다. 본원에 개시된 바와 같이, 재프로그래밍된 만능 세포는 출생 후 개체로부터 얻어지는 체세포의 유전적 보체를 함유하며 상기 체세포와 실질적으로 유전적으로 동일하다. 일반적으로, 분화능 결정 인자를 동정하는 방법은 세포를 덜 분화된 고분화능 상태로 재프로그래밍하는 데 충분한 수준으로 도입된 유전 물질에서 코딩된 인자를 발현시키기에 효과적인 조건 하에서 하나 또는 복수의 추정 분화능 결정 인자를 코딩하는 유전 물질을 상기 유전 물질을 흡수하는 체세포에 도입하는 단계 및 상기 유전 물질의 도입 후 만능 세포 군집을 관찰하는 단계를 포함한다. 만능 세포는 세포 모폴로지, 만능 세포 특이적 마커 또는 둘다를 특징으로 할 수 있다. 유리하게는, 만능 세포는 세포가 만능 상태로 재프로그래밍될 때만 발현되도록 세포에 제공된 마커가 처리된 세포에서 발현되는 것으로 확인될 수 있다. 이러한 방법을 통하여, 체세포를 만능 세포로 재프로그래밍할 수 있는 분화능 결정 인자는 이하의 실시예에 개시된 바와 같이 동정될 수 있다.
분화능 결정 인자를 코딩하는 유전 물질은 삽입성 벡터 또는 비삽입성 벡터와 같은 벡터를 사용하여 체세포로의 형질 도입 또는 형질 감염에 의하여 도입될 수 있다. 본원에서는 레트로 바이러스 벡터가 특히 주목된다. 레트로 바이러스 바이러스, 특히 렌티 바이러스 벡터는 벡터를 세포와의 접촉 전에 비리온으로 포장함으로써 형질 도입된다. 도입 후, 분화능 결정 인자(들)를 코딩하는 DNA 절편(들)은 염색체외에 (예컨대, 에피솜 플라스미드 상에) 위치하거나 또는 세포 염색체(들)로 안정하게 삽입될 수 있다.
바이러스계 유전자 운반 및 발현 벡터는 시험관내에서 또는 생체내에서 비분할 세포 및 형질 감염이 어려운 세포(1차 세포, 혈액 세포, 줄기 세포)를 포함하는 대부분의 세포 유형에 유전 물질을 효율적이고 확실하게 전달할 수 있는 유전자 작제물이다. 게놈 DNA로 삽입되는 바이러스계 작제물은 높은 발현 수준을 보인다. 대상 분화능 결정 인자를 코딩하는 DNA 절편 외에도, 상기 벡터는 전사 프로모터 및 각각 상기 DNA 절편에 업스트림 및 다운스트림으로 작동 가능하게 연결된 폴리아데닐레이션 신호를 포함한다. 상기 벡터는 단일의 분화능 결정 인자를 코딩하는 단일 DNA 절편 또는 복수의 분화능 결정 인자를 코딩하는 DNA 절편들을 포함할 수 있다. 복수의 벡터를 단일의 체세포에 도입할 수 있다. 상기 벡터는 임의로 벡터를 수용하여 발현시키는 세포를 동정하기 위한 선택성 마커를 코딩할 수 있다. 예컨대, 벡터가 세포에 항생제 내성을 부여하는 경우, 벡터가 세포로 성공적으로 도입되었는지 확인하기 위하여 배양 배지에 항생제를 첨가할 수 있다. 실시예에서와 같이 삽입성 벡터를 사용하여 개념 증거를 입증할 수 있다. 레트로 바이러스(예컨대, 렌티 바이러스) 벡터는 삽입성 벡터이나, 비삽입성 벡터도 사용될 수 있다. 이러한 벡터는 필요에 따라 재프로그래밍 후 희석에 의하여 세포로부터 소실될 수 있다. 적당한 비삽입성 벡터는 엡스타인-바 바이러스(EBV) 벡터이다[Ren C, et al, Acta. Biochim. Biophys. Sin. 37:68-73 (2005); 및 Ren C, et al, Stem Cells 24:1338-1347 (2006), 이들 문헌 각각은 그 전체 내용이 본원에 참고 문헌으로 포함됨].
본원에 개시된 벡터는 치료적 사용을 위한 안정성을 증대시키고 적합한 발현 요소 및 치료 유전자를 포함시키기 위한 업계 공지된 기술을 사용하여 작제 및 처리될 수 있다. 본 발명에 사용하기 적당한 발현 벡터의 작제를 위한 표준 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있으며 그 전체 내용이 본원에 참고 문헌으로 인용된 문헌[Sambrook J, et al, "Molecular cloning: a laboratory manual," (3판, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001)]과 같은 공보에서 찾아볼 수 있다.
만능 세포를 동정하고 농후화하는 능력은 체세포가 만능분화능 상태로 전환된 후에만 활성인 프로모터의 제어 하에 녹색 형광 단백질(GFP), 증대된 녹색 형광 단백질(EGFP) 또는 루시퍼라제와 같은 비치사 마커를 체세포에 제공함으로써 촉진될 수 있다. 선택성 마커 유전자는 형광 세포 분류 기술과 같은 가시적 세포 선별 기술에 의하여 마커를 발현시키는 재프로그래밍된 세포를 확인하는 데 사용된다. 대안적으로, 재프로그래밍된 세포는 선택성 마커 없이 생성될 수 있다. 이하의 실시예에서, 마커는 체세포의 게놈에서 Oct-4 발현을 조절하는 프로모터의 다운스트림으로 제공되었다. 내생 Oct4 프로모터는 미분화된 만능 ES 세포에서 활성이다. Oct-4-발현 ES 세포의 약물 선택성 군집은 골수 분화에 필요한 배양 기간을 견디지 못했다. 그러나, 일부 Oct-4 발현은 초기 발현 단계까지 지속될 수 있으므로, 특징적인 ES 세포 모폴로지를 갖는 콜로니를 선택하고 세포를 ES 세포 유지 배양 상태 하에 유지함으로써 군집을 만능 세포로 농후화하는 것이 적절하다. 재프로그래밍된 세포 배양에서 모든 세포가 소정 수준의 분화능을 갖는 것이 의도되지는 않는다. 세포 분류 기술의 비효율성, 유전자 발현 수준 변화 및 다른 생물학적 효과를 고려하여, 농후화된 군집에서 일부 세포는 만능 세포가 아닐 수 있다. 그러나, 실제 수준에서, 체세포에서 유래된 재프로그래밍된 세포 군집은 만능 세포가 농후하다.
비치사 마커는 추후 Cre-매개 부위 특이적 유전자 제거를 통한 제거와 같은 업계 공지된 임의의 각종 기술을 사용하여 제거될 수 있도록 작제될 수 있다. 예컨대, 만능 세포 군집을 얻은 후 마커 유전자를 삭제하여 상기 세포로 실행되는 실험 또는 공정에서 마커 유전자 생성물에 의한 간섭을 회피하는 것이 바람직할 수 있다. 표적화 삭제는 삭제될 준비가 된 마커 유전자 근처에 구조(들)를 제공함으로써 이루어질 수 있다. 즉, Cre/Lox 유전 인자(genetic element)를 사용할 수 있다. Lox 부위는 세포 내로 형성될 수 있다. 만능 세포로부터 마커를 제거하는 것이 바람직한 경우, Cre 제제를 세포에 첨가할 수 있다. 다른 유사한 시스템도 사용할 수 있다. Cre/Lox 제거는 바람직하지 않은 염색체 재배열을 도입하여 제거 후의 잔여 유전 물질을 남길 수 있으므로, 본 발명자들은 비삽입성 에피솜 벡터를 사용하여 분화능 결정 인자를 체세로 도입하고 추후 재프로그래밍 단계 동안 상기 벡터를 유지하는 데 사용된 선택 약물을 배출시킴으로써 (예컨대 세대당 약 5%의 비율로) 상기 에피솜 벡터가 소실된 세포를 얻는 것이 바람직하다고 생각한다.
이하의 실시예는 체세포를 만능 세포로 전환시키기 위한 분화능 결정 유전자 또는 인자를 동정하는 방법의 추가의 비제한적 예로서 제공된다. 일부 실시예에서는, 기질 세포 공동 배양에서 인간 H1 Oct4 녹-인 ES 세포를 분화시켜 재프로그래밍 가능한 체세포로서 사용하기 적당한 세포를 얻었다. 이들 세포는 체세포 재프로그래밍 방법에서 사용하기 위하여 출생 후 개체로부터 분리한 세포 모델이다.
상기 방법을 다른 분화된 세포 유형으로 반복하였다. 하나의 세포 유형은 인간의 태아 폐 섬유아세포, IMR-90이었다. 본원에 참고문헌으로 그 전체 내용이 포함된 문헌[Nichols W, et al, Science 196:60-63(1977)] 참조. IMR-90 세포는 광범위하게 ENCODE Consortium을 특징으로 하며, American Type Culture Collection사(ATCC; 미국 버지니아주 머네서스 소재; 카탈로그 번호 CCL-186)로부터 용이하게 입수 가능하고, 재프로그래밍된 클론의 기원을 독립적으로 확인할 수 있는 공개된 DNA 지문을 가진다. 또한, 이들 세포는 노화 전에 20 계대 이상 동안 이글 최소 필수 배지-10% FBS에서 왕성하게 증식하지만 인간 ES 세포 배양 조건에서는 천천히 성장하는데, 그 차이가 재프로그래밍된 클론에 증식 이점을 제공하고 이들을 모폴로지 기준에 의해서만 선택하는 것을 돕는다. 본 방법에 사용된 다른 분화된 세포 유형은 인간 출생후 포피 섬유아세포(ATCC; 카탈로그 번호 CRL-2097) 및 인간 성인 피부 세포(ATCC; 카탈로그 번호 CRL-2106)였다.
상기 세포는 이하에 개시된 바와 같은 바이러스 발현 시스템에 의한 형질 도입을 수용하도록 제조되었다. 체세포는 만능분화능을 갖고 회합될 것으로 사료되는 분화능 결정 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질도입되어, 만능 세포로 재프로그래밍되었다. 형질 도입 벡터에 제공된 14개의 모든 분화능 결정 인자가 체세포에 수용되어 발현되었는지 여부는 아직 판정되지 았았다. 14개의 분화능 결정 인자 세트 및 14개 인자 중 2 이상으로 된 하위 세트를 체세포 재프로그래밍에 충분한지 확인하여, 본 발명자들은 당업자에게 체세포를 재프로그래밍할 수 있는 하나 이상의 특정한 분화능 결정 인자 하위 세트의 동정 가능성을 제공함으로써 이러한 분화능 결정 인자의 다른 하위 세트의 동정을 촉진한다. 따라서, 이하에 개시된 방법은 체세포를 만능 세포로 재프로그래밍하는 데 관여하는 분화능 결정 인자의 동정을 촉진한다.
특히, 체세포를 재프로그래밍하는 데 충분한 분화능 결정 인자 세트는 체세포의 세포 유형에 따라 달라질 수 있다고 사료된다. 14개의 분화능 결정 인자 세트에의 노출은 지시된 체세포의 배양에서 만능분화능 상태로의 전환을 이루었다. 이하에 나타내는 바와 같이, 14개 인자의 일부 또는 모두 및 다른 분화능 결정 인자를 포함할 수 있는 분화능 결정 인자의 상이한 조합을 사용하여 이하에 개시된 방법을 반복함으로써 다른 세포 유형을 재프로그래밍하는 데 충분한 분화능 결정 인자 세트를 동정할 수 있다. 결과적으로, 선재하는 분화된 체세포와 실질적으로 유전적으로 동일한 만능 세포주/군집을 생성할 수 있다.
이하의 실시에에서, 분화된 세포는 여러가지의 분화능 결정 인자를 코딩한 벡터를 수용하였다. 일부 세포는 만능 세포에서만 활성인, 조절된 Oct4 프로모터로부터 다운스트림에 배치된 EGFP를 코딩하는 마커 유전자를 게놈 내에 함유하였다. 이 유용한 도구의 제조는 분화된 세포가 인간 ES 세포를 이용한 세포-세포 융합에 의하여 만능분화능이 될 수 있음을 입증한 앞의 Yu 등의 문헌에 개시된다.
실시예 1: 렌티 바이러스 벡터 포장 및 제조
형질전환 유전자를 발현시키는 렌티 바이러스 벡터를 293FT 세포주(Invitrogen)에서 제조하였다. 293T는 바이러스 역가를 높이는 데 기여하는 포장 단백질의 고도 발현을 위한 큰 T 항원을 함유하는 형질전환된 293 배아 신장 세포에서 유래된 빨리 성장하고 고도로 운반 가능한 클론 변종이다. 통상적인 유지 및 증식을 위하여, 이들 세포를 500 μg/ml의 제네티신의 존재 하에 293FT 배지(DMEM/10% FBS, 2 mM L-글루타민 및 0.1 mM MEM 비필수 아미노산)에서 배양하였다. 포장을 위하여, 293FT 세포를 트립신 처리하여 수거하였다. 원심분리로 트립신을 제거한 후, 이들 세포를 제네시틴을 포함하지 않는 293FT 배지에서 T75 플라스크(15 x 106 세포/플라스크, 및 작제물당 6 플라스크)로 분주(aliquoting)하였다.
세포 분주 직후 렌티 바이러스 벡터 및 두 헬퍼 플라스미드의 공동 형질 감염을 Superfect® 형질 감염 시약(Qiagen)으로 실시하였다[렌티 바이러스 벡터 : MD.G : pCMVdeltaR8.9 : Superfect® = 실온에서 10분 동안 항온처리한 플라스크당 400 μl의 이스코브 변형 둘베코 배지(IMDM)(1X) 중 5 μg : 5 μg : 10 μg : 40 μl]. 다음날, 형질 감염 혼합물을 함유하는 배양 배지를 1 mM 피루브산나트륨으로 보충된 새로운 293FT 배지(8 ml/플라스크)로 대체하였다. 렌티 바이러스를 함유하는 상청액을 형질 도입 후 약 48 내지 72 시간에 수거하였다(작제물당 약 48 ml). 293FT 세포 찌꺼기를 4℃에서 15분 동안 3000 rpm(1750 g)에서 원심분리로 상청액으로부터 제거하였다. 렌티 바이러스를 농축하기 위하여, 상청액을 0.4 μM 셀룰로오스 아세테이트(CA) 막(Cornington, 115 ml 저단백질 결합)을 통하여 여과하고 4℃에서 2.5시간 동안 33,000 rpm(5O,OOO g)에서 70 ml 살균 병(Beckman, 카탈로그 번호 355622, 45Ti 로터만을 위하여 폴리카르보네이트)에서 초원심분리하였다. 렌티 바이러스는 임의의 잔류하는 세포 찌꺼기와 함께 원심분리관의 바닥에 눈에 보이는 펠릿을 형성하였다. 상청액 제거 후, PBS(각 작제물당 약 300 μl)를 첨가하여 4℃에서 8∼14시간 또는 실온에서 2시간 동안 원심분리관을 흔들어 줌으로써 펠릿을 재현탁시켰다. 잔류하는 세포 찌꺼기를 5분 동안 5000 rpm(2700 g)에서 원심분리하여 제거하고 재현탁시킨 렌티 바이러스를 분주하고 -80℃에서 저장하였다. 얻어지는 역가는 일반적으로 농축후 107∼108 바이러스 입자(vp)/ml였다. Stella(서열 번호 1)를 포함하는 렌티 바이러스 서열(pSIN4-EF2-Stella-puro; 서열 번호 6, Stella 서열 3604 내지 4083 포함)은 서열 목록에 제공된다. Stella 서열(서열 번호 1)을 또다른 분화능 결정 인자의 서열로 대체한 것을 제외하고 동일한 서열을 모든 다른 분화능 결정 인자(예컨대, 서열 번호 2-5)에 사용하였다.
분화능 결정 인자를 골수 세포에 효율적으로 도입하기 위하여, 발명자들은 렌티 바이러스 발현 시스템을 변형하였다(도 4A). 발명자들은 연속 결실 분석을 통하여 이웃하는 5' 및 3' LTR 서열을 제거함으로써 원래의 렌티 바이러스 작제물의 크기를 감소시켰다(>11 kb). 이러한 변형은 포장 효율에 대한 부정적인 효과를 최소화하였다. 통상적으로 얻어지는 역가는 상청액 ml당 105 내지 106 vp 범위, 그리고 (초원심분리에 의한) 농축 후에는 107 내지 108 vp/ml 범위였다. 제한 부위를 주쇄로 도입하여 특정 형질전환 유전자에 대한 코딩 영역을 편리하게 교환하였다.
실시예 2: 렌티 바이러스 형질 도입 및 분화능 결정 인자의 발현 후 골수 전구체 세포의 재프로그래밍
분화된 세포를 다시 만능분화능 상태로 재프로그래밍할 수 있는 유전자를 동정하기 위해서는, 세포의 효율적인 형질 도입이 필요하다. 발명자들은 먼저 인간 H1 Oct4 녹-인 ES 세포의 Pcrcoll® 정제 직후의 렌티 바이러스 형질 도입 효율을 시험하였다(도 2).
H1.1 인간 ES 세포(WiCeIl 리서치 인스티튜트; 미국 위스콘신주 매디슨 소재)를 앞에서 개시한 바와 같이 20% 녹아웃 혈청 대체물, 1% 비필수 아미노산(Gibco), 1 mM L-글루타민, 0.1 mM β-머캅토에탄올(Sigma) 및 4 ng/ml 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)(달리 언급하지 않는 한 이들 모두는 Invitrogen사로부터 입수)가 보충된 80% 둘베코 변형 이글 배지(피루베이트 불포함, 고글루코스 제제; Invitrogen; 미국 캘리포니아주 칼스베드 소재)로 이루어지는 DMEM/F12 배양 배지에서 방사선 조사된 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 상에 유지하였다[Amit et al, Dev Biol. 227:271-278(2000); 및 Thomson et al., Science 282:1145-1147(1998) 참조, 이들 문헌 각각은 그 전체 내용이 본원에 참고문헌으로 포함됨]. 화학적으로 제한된 TeSR™ 배지(StemCell Technologies, Inc사)를 사용한 Matrigel®(BD Biosciences사; 미국 매사추세츠주 베드포드 소재) 상에서의 무영양 배양을 그 전체 내용이 본원에 참고문헌으로 포함된 문헌[Ludwig et al. Ludwig T, et al, Nat. Methods. 3:637-646(2006); 및 Ludwig T, et al, Nat. Biotechnol. 24: 185-187(2006)]에 개시된 바와 같이 실시하였다.
H1 Oct4 녹-인 ES 세포주를 각각 그 전체 내용이 본원에 참고문헌으로 포함된 문헌[Zwaka & Thomson의 미국 특허 공개 2006/0128018호 및 Zwaka T & Thomson J, Nat. Biotechnol. 21:319-321(2003)]에 개시된 방법에 따라 H1.1 인간 ES 세포로부터 발생시켰다. 요약하면, 유전자 표적화 벡터는 카세트, IRES-EGFP, IRES-NEO 및 유사한 바이러스 폴리아데닐레이션 서열[약 3.2 킬로베이스(kb)]을 POU 도메인 클래스 5 전사 인자 1(POU5F1)로도 공지된 인간 Oct-4(옥타머 결합 전사 인자 4) 유전자의 제5 엑손의 3' 미번역 영역으로 삽입함으로써 작제하였다. 이 카세트를 3' 영역에서 6.3 kb 상동성 아암 및 1.6 kb(대안적 표적화 벡터에서는 6.5 kb)의 상동성 아암에 의하여 5' 방향으로 측접시켰다(도 1). 상기 카셋트를 Oct-4 유전자(서열 번호 2)의 31392 위치에서 삽입하였다. 긴 아암은 서열 25054-31392를 함유하였다. 짧은 아암은 서열 31392-32970을 함유하였다. 대안적인 표적화 벡터에서, 상기 짧은 아암은 더 긴 상동성 영역(AC006047에서 31392-32970 및 유전자 기탁 번호 AC004195에서 2387-7337)으로 대체되었다. 동종 유전자형의 상동성 DNA를 긴 거리의 게놈 PCR로 얻고 서브클로닝하였다. 모든 게놈 단편 및 카세트를 클로닝 벡터 pBluescript® SK II(유전자 은행 기탁 번호 X52328; Stratagene사; 미국 캘리포니아주 라졸라 소재)의 다중 클로닝 부위(MCS)로 클로닝하였다.
전기천공을 위하여, 세포를 콜라게나제 IV(1 mg/ml, Invitrogen)로 37℃에서 7분 동안 수집하고, 배지로 세정하고, 0.5 ml 배양 배지(1.5∼3.0 x 107 세포) 내에 재현탁시켰다. 전기천공을 위한 세포를 준비하기 위하여, 40 mg의 선형화된 표적화 벡터 DNA를 함유하는 0.3 ml 인산염 완충 염수(PBS; Invitrogen)에 세포를 첨가하였다. 이후 BioRad Gene Pulser® II(0.4 cm 갭 큐벳)를 사용하여 실온에서 싱글 320 V, 200 μF 펄스에 세포를 노출시켰다. 세포를 실온에서 10분 동안 항온처리하고 Matrigel®에서 고밀도로 플레이팅하였다. G418 선택(50 mg/ml; Invitrogen)은 전기 천공 후 48 시간에 개시하였다. 1 주일 후, G418 농도는 2배가 되었다. 3 주일 후, 각각 3' 상동성 영역의 바로 다운스트림인 POU5F1 유전자 및 NEO 카세트에 대하여 특이적인 프라이머를 사용하여 생존 콜로니를 PCR에 의하여 개별적으로 분석하였다. 표적화 작제물 외부에 프로브 및 BamHI 이화 DNA를 사용하여 PCR-양성 클론을 서던 블롯 분석으로 재스크리닝하였다.
H1 Oct4 녹-인 ES 세포주는 내생 Oct4 프로모터/조절 영역으로부터 EGFP 및 네오마이신 인산 운반 효소(neo)를 이중 내부 리보솜 도입 부위(IRES)를 사용하여 모두 발현시켰다(도 3). H1 Oct4 녹-인 ES 세포에서 EGFP 및 neo의 발현은 활성 내생 Oct4 프로모터/조절 영역을 나타내었다.
H1 Oct4 녹-인 ES 세포는 20% 비-열비활성화 제한 태아 소 혈청(FBS; HyClone Laboratories; 미국 유타주 로간 소재)(10 ml/접시)으로 보충된 DMEM 배지(Invitrogen)로 이루어지는 젤라틴 코딩된 10 cm 플라스틱 접시(BD Biosciences사) 상에 유지된 마우스 OP9 골수 기질 세포와의 공동 배양을 통해 유지되었다(도 2A). OP9 배양물을 1:7의 비율로 4일마다 분할하였다. 인간 ES 세포 분화에서 사용하기 위하여, OP9 세포가 4일째에 콘플루언스(confluence) 상태에 도달한 후, 배지의 절반을 바꾸고 세포를 추가로 4일 동안 배양하였다.
재프로그래밍을 위하여, H1 Oct4 녹-인 ES 세포를 유착 세포(즉, CD29+CD44+CD166+CD105+CD73+CD31-)로 분화시켰다. 요약하면, 인간 H1 Oct4 녹-인 ES 세포(p76 내지 110)를 10%의 FBS(HyClone Laboratories) 및 100 μM의 모노티오글리세롤(MTG; Sigma; 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)을 보충한 20 ml의 DMEM 배지에서 OP9 단층(1.5 x 106/10-cm 접시)에 첨가하였다. 인간 ES/OP9 세포 공동 배양물을 9일간 항온처리하였으며 4, 6 및 8일에 배지의 절반을 바꾸었다. 항온 처리 후, 공동 배양물을 37℃에서 20분 동안 콜라게나제 IV 처리(DMEM 배지 중 1 mg/ml, Invitrogen)한 후 37℃에서 15분 동안 트립신 처리(0.05% 트립신/0.5 mM EDTA, Invitrogen)하여 개개의 세포로 분산시켰다. 세포를 배지로 2회 세정하고 10%의 FBS, 100 μM의 MTG 및 100 ng/ml의 GM-CSF(Leukine; Berlex Laboratories Inc사; 미국 캘리포니아주 리치몬드 소재)를 보충한 DMEM 배지에서 2 x 106/ml로 재현탁시켰다. 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트)(pHEMA; Sigma)로 코딩한 플라스크에서 10일 동안 세포를 더 배양하고 배지의 절반을 3일마다 바꾸었다. 부착-방지 pHEMA 배양 동안, 부착될 세포는 부유 응집체를 형성하였고, 관심 대상 세포는 현탁물 중에 개개의 세포로서 성장하였다. 큰 세포 응집체는 100 μM 세포 염색기(BD Biosciences)를 통하여 여과함으로써 제거된 반면, 작은 응집체 및 죽은 세포는 25% Percoll®(Sigma)을 통한 원심분리로 제거되었다. 세포 펠릿으로부터 회수된 분화된 세포는 골수의 골수성 세포에 특징적인 CD33, MPO, CD11b 및 CD11c 분자를 발현시켰다(도 2B). 발명자들은 1 x 106 H1 ES 세포(인간 H1 Oct4 녹-인 ES 세포)로부터 6∼10 x 106 분화된 세포를 생성하였다. 또한, 문헌[Yu J, et al., Science 318:1917-1920(2007), 월드 와이드 웹 상의 사이언스 웹사이트에서 입수할 수 있는 보충 물질을 포함하며, 본원에 그 전체 내용이 참고 문헌으로 포함됨] 참조.
6 μg/ml의 최종 농도에서 폴리브렌 담체의 첨가 후 분화능 결정 인자를 코딩하는 렌티 바이러스(MOI: 3 내지 10)를 세포 배양물에 첨가하였다(Sigma). 렌티 바이러스를 함유하는 배지를 다음날 새로운 배지로 교체하고 세포를 적절한 배지에서 더 배양하였다. 필요하다면 형질 도입 후 3일째에 약물 선택을 개시하였다. 도 5B에 도시된 바와 같이, 형질 도입 효율은 매우 낮았다(10의 MOI에서 약 18.4%). 또한, EGFP의 발현은 거의 백그라운드를 넘지 못하였다. 유사한 결과가 통상적인 플라스미드 또는 엡스타인-바 바이러스 항원(EBNA) 베이스 플라스미드 형질 감염으로 얻어졌다(데이터는 나타내지 않음).
다른 한편으로는, 형질 도입 효율이 높은 세포를 다음과 같이 제조하였다. Percoll-정제된 H1 Oct4 녹-인 ES 세포를 상기 개시한 바와 같이 Matrigel®에서 GM-CSF의 존재 하에 추가로 7일 동안 간엽 유사 세포로 더 분화시킬 수 있었다. 이 배양 기간 동안 다수의 세포가 플레이트에 부착되었다. 유착 세포(이하 본원에서는 Oct4KICD45+A 세포 또는 간단히 CD45+A 세포로서 언급됨)는 현저히 높은 형질 도입 효율을 보였고(도 4C), 이 재프로그래밍 실험에 사용되었다. 세포가 실험시에 CD45+가 아닐지라도, 세포는 CD45+ 세포로부터 얻어졌다. 본원의 어딘가에 개시한 바와 같이, 유착 세포 상의 세포 표면 마커는 CD29+, CD44+, CD166+, CD105+, CD73+ 및 CD31-로서 특성화되었다.
발명자들은 Oct4KICD45+A 세포에서 분화능 결정 인자를 발현시킴으로써 분화된 세포가 만능분화능 상태로 재프로그래밍될 수 있다는 가설을 시험하였고(도 3), 유망한 결과를 얻었다. Nanog 및 Oct-4가 최상으로 특성화된 분화능 결정 인자이므로, 본 발명자들은 세포에서의 이들의 과다 발현의 효과를 조사하였다.
Oct4KICD45+A 세포는 먼저 트립신을 사용하여 개개의 세포로 분해하고 TeSR™ 배지에서 6웰 플레이의 웰당 약 105 세포로 Matrigel®에서 재플레이팅하였다. 형질전환 유전자를 발현시키는 렌티 바이러스 형질 도입을 다음날 실시하였다. Nanog를 발현시키는 0Ct4KICD45+A 세포는 EGFP 형질 감염된 세포의 모폴로지와 유사한 모폴로지를 보였다(도 5). 그러나, Nanog 과다 발현은 인간 ES 세포에서 관찰되는 것과 유사한 Oct4KICD45+A 세포 증식을 유의적으로 증대시켰다. 활성 내생 Oct4 프로모터/조절 영역에 대한 네오마이신 선택 후, Nanog 형질 감염된 세포 또는 EGFP 형질 감염된 세포는 전혀 생존하지 않았다. 이들 결과는 Oct-4-발현 ES 세포의 약물 선택성 군집이 분화에 필요한 배양 기간을 견디지 못함을 나타낸다는 것이 중요하다. Oct-4 발현으로 극적인 모폴로지 변화가 일어났고(도 5), 이들 세포 중 다수가 네오마이신 선택에서 살아남았다. 그러나, 이들 세포 중 어느 것도 인간 ES 세포의 전형적인 모폴로지를 보이지 않았다. Nanog 및 Oct-4를 공동 발현시키는 Oct4KICD45+A 세포는 Oct-4만을 발현시키는 세포에서 관찰되는 것과 유사한 모폴로지 변화를 보였다. 따라서, 두 주요 분화능 결정 인자인 Nanog 및 Oct-4만으로는 분화된 세포를 만능 세포로 전환시키기에 충분하지 않았던 것으로 사료된다.
체세포를 상기 인자들에 노출시키기 전 및 후에 세포분류(cell-sorting)법을 사용하여 세포를 분석하였다. 부착 세포를 트립신 처리(0.05% 트립신/0.5 mM EDTA, Invitrogen)에 의하여 개개로 나누고 실온에서 20분 동안 2% 파라포름알데히드에서 고정시켰다. 세포를 40-μm 메쉬를 통하여 여과하고 FACS 완충액(0.1% 아지드화나트륨 및 2% FBS를 함유하는 PBS)에 재현탁시켰다. 현탁액에서 성장시킨 세포를 1 mM EDTA 및 1% 마우스 정상 혈청으로 보충한 FACS 완충액(Sigma)에서 염색하였다. 세포간 골수 과산화효소(MPO) 염색을 Fix & Perm® 시약(Caltag Laboratories; 미국 캘리포니아주 벌링암 소재)을 사용하여 실시하였다. 5 x 105 세포를 함유하는 약 100 μl의 세포 현탁물을 각 표지에 사용하였다. 1차 및 2차(적용되는 경우) 항체 항온 처리 모두 실온에서 30분 동안 실시하였다. 대조군 샘플은 아이소타입 매칭 대조군 항체로 염색하였다. 세정 후, 세포를 300∼500 μl의 FACS 완충액에 재현탁시키고 CellQuest™ 포착 및 분석 소프트웨어(BDIS)를 사용하는 FACSCalibur 유세포 분석기(BDIS사; 미국 캘리포니아주 세너제이 소재)에서 분석하였다. 총 20,000개의 이벤트를 얻었다. 유세포 분석기 분석에서 사용된 항체는 모두 표 1에 열거된다. FlowJo 소프트웨어(Tree Star, Inc사; 미국 오레건주 애쉬랜드 소재)를 사용하여 최종 데이터 및 그래프를 분석하고 준비하였다.
이들 세포의 재프로그래밍에 관여하는 분화능 결정 인자를 더 평가하기 위하여, 발명자들은 분화능 결정 인자의 여러 조합으로 농후화된 ES 세포 풀의 형질 도입을 조사하였다. 골수 전구체의 재프로그래밍을 위한 분화능 결정 인자의 예시적 풀은 이하의 표 2에 개시된 14개의 분화능 결정 인자를 포함하였다.
Oct4KICD45+A 세포에서 이들 14개 인자 중 적어도 일부를 발현시켰더니 인간 ES 세포와 같은 만능 세포의 전형적인 모폴로지를 갖는 콜로니가 생성되었다(도 6A - 좌측 사진). 약 105 출발 0Ct4KICD45+A 세포로부터의 네오마이신 선택 후, 뚜렷한 ES 세포 모폴로지를 10개 이상의 콜로니가 처음에 나타났다. 이들 콜로니의 반 이상이 이후 분화되어 소실되었는데, 이것은 하나 이상의 도입된 유전자의 과다 발현이 세포에 부정적인 영향을 미쳤거나 또한 세포가 계속적으로 외부의 형질전환 유전자 및 유전자 침묵 현상(gene silencing)에 의존하였음을 시사한다. 그럼에도 불구하고, 생존 유전자는 내생 Oct4 프로모터에서 유래된 EGFP를 발현시켜(도 7A - 우측 사진), 내생 Oct4 프로모터/조절 영역이 다시 활성화되었음을 나타내었다.
이 실시양태에서, EGFP 발현은 음성 Oct4 프로모터/조절 영역이 활성화될 때 일어난다. 즉, 비분화 세포는 세포가 분화될 때 사라지는 녹색 컬러로 확인된다. 따라서, 영장류 ES 세포에서 내생 Oct-4의 발현은 선택성일 수 있다. 이들 콜로니는 또한 Oct-4, SSEA3, SSEA4, Tra-1-60 및 Tra-1-81 만능 세포 특이적 마커를 발현시켰다(도 6B). 유사한 결과가 화학적으로 제한된 TeSR™ 배지를 사용하여 얻어진 재프로그래밍 콜로니에서 얻어졌다.
발명자들은 ES 세포가 농후한 14개의 분화능 결정 인자로 이루어진 동일한 풀을 갖는 2개의 별도의 형질감염으로부터 6개의 콜로니를 무작위로 취하고 8주 이상 동안 5개의 안정한 콜로니를 증식시켰다. 따라서, 발명자들은 14개의 분화능 결정 인자를 영장류 체세포에 투여함으로써 상기 체세포가 더 높은 분화능 세포가 되도록 재프로그래밍하는 신규한 방법을 확인하였다.
이들 세포를 본원에 개시된 렌티 바이러스 전달 시스템을 사용하여 다른 분화능 결정 인자 조합(즉, Sox2, c-Myc, Oct 3/4 및 Klf4)에 노출시키는 경우, 세포의 재프로그래밍 및 전환이 관찰되지 않았다.
발명자들은 본원에 개시된 기술을 사용하여, 시험된 세포를 재프로그래밍하는 데 충분한 14개의 시험 인자로 이루어진 하위 세트를 스크리닝하였다. 발명자의 상기 14개의 충분 인자 세트는 추후 이들 세포를 재프로그래밍하는 데 충분한 6개, 이후 4개의 유전자 세트로 축소되었다(도 7A-B; 이하에서 더 설명함). 조합시 안정한 만능 세포를 생성하는 데 충분하다고 보여지는 4개의 유전자는 도 7B에 도시된 바와 같이 Oct-4, Nanog, Sox2 및 Lin28이었다.
실시예 3: 렌티 바이러스 형질 도입 후 4개의 분화능 결정 인자의 한정된 세트를 사용한 간엽 유사 세포의 재프로그래밍
분화된 세포를 다시 만능 세포로 재프로그래밍할 수 있는 분화능 결정 인자의 제한된 세트를 더 동정하기 위하여, Pou5F1 (Oct-4), Nanog, Sox2 및 Lin28의 조합을 사용하여 상기 확인된 방법을 반복하였다. 발명자들은 상기 개시된 기술을 사용하여 이들 분화능 결정 인자를 세포 재프로그래밍 능력에 대하여 스크리닝하였다.
본 방법의 유용성을 더 증명하기 위하여 이 실시예에서는 상이한 세포 유형을 사용하였다. 상기 세포 유형은 상기 개시된 바와 같이 인간 H1 Oct4 녹-인 ES 세포로부터 직접 분화된 간엽 유사 클론 세포였다. 본원에서 사용될 때, "클론"은 공통의 조상에서 유래된 (즉, 세포 응집체에서 유래된 것이 아니라 단일 세포에서 유래된) 세포 군집의 특성을 의미한다. 즉, "클론 군집"에서, 세포는 균일한 패턴의 세포 표면 마커 및 모폴로지 특성을 나타내며 실질적으로 유전적으로 동일하다.
요약하면, 인간 H1 Oct4 녹-인 ES 세포(p76 내지 p110)는 마우스 OP9 골수 간엽 줄기 세포와의 공동 배양에서 분화되도록 유도되었다. 본원에 참고 문헌으로 그 전체 내용이 인용된 문헌[Vodyanyk M, et al., Blood 105:617-626 (2005)] 참조. 인간 H1 Oct4 녹-인 ES 세포의 작은 응집체를 10% FCS 및 100 μM MTG로 보충한 알파 MEM(Sigma)에서 OP9 세포에 첨가하였다. 배양 다음날(1일), 배지가 변화되었고 배양물을 이하에 나타낸 날짜에 수확하였다.
공동 배양 2일째에, NimbleGen®(미국 위스콘신주 매디슨) 마이크로어레이를 갖는 중내배엽[GSC, MIXL1 및 T(BRACHYURY)] 및 초기 중배엽(EVX1, LHX1 및 TBX6)에 대한 전사 인자의 최대 발현으로 중배엽 집중(mesodermal commitment)이 검출되었다. 제3일∼제5일 동안, 내배엽 및 중배엽 계통의 특이성이 관찰되었다. 이 단계는 상피-중간엽 이행(EMT; SNAIL 및 SLUG)에 관여하는 유전자의 지속 발현 및 세포 증식(HOXB2-3)을 동반하였다. 이것은 또한 인간 H1 Oct4 녹-인 ES 세포/OP9 공동 배양에서의 최대 세포 증식 속도와 일치하였다.
발달 중인 내배엽(AFP 및 SERPINA1), 간엽(SOX9, RUNX2 및 PPARG1) 및 조혈 내피(CDH5 및 GATA1) 세포의 마커가 검출되었을 때, 특이적 중내배엽 계통의 분화는 공동 배양 5∼7일째에 관찰되었다. 그러나, 7일간의 공동 배양에 걸쳐 근육 유도성 인자(MYOD1, MYF5 및 MYF6)는 발현되지 않았다. 또한, 신경외배엽(SOX1 및 NEFL) 또는 영양막배엽(CGB 및 PLAC) 마커가 검출되지 않아, OP9 세포가 중내배엽 경로로 지향된 hESC 분화를 위한 효율적인 유도 환경을 제공하였음을 나타내었다.
또한, 2일째에, 인간 ES 세포에서 유래된 세포의 단일 세포 현탁물을, 37℃에서 15분 동안 DMEM/F12 배지 및 37℃에서 10분 동안 0.05% 트립신-0.5 mM EDTA(Gibco-Invitrogen)에서 1 mg/ml 콜라게나제 IV(Gibco-Invitrogen)를 사용하여 연속 효소 처리로 수확하였다. 세포를 PBS-5% FBS를 사용하여 3회 세정하고 70 μM 및 30 μM 세포 염색기(BD Labware; 미국 매사추세츠주 베드포드 소재)를 통해 여과하고 항마우스 CD29-PE(AbD Serotec; 미국 노스캐롤라이나주 랠리 소재) 및 항-PE 상자성 단클론 항체(Miltenyi Biotech; 미국 캘리포니아주 오번 소재)로 표지하였다. 세포 현탁물을 Midi-MACS 분리 유닛(Miltenyi Biotech)에 부착된 LD 자기 칼럼에 통과시킴으로써 자기 활성 세포 분류(MAC)로 정제하여 OP9가 결핍된 인간 H1 Oct4 녹-인 ES 세포에서 유래하는 세포의 음성 분획을 얻었다. 인간 H1 Oct4 녹-인 ES 세포에서 유래된 세포의 순도를 팬 항인간 TRA-1-85 단클론 항체(R&D Systems; 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)를 사용하여 확인하였다.
정제된 인간 H1 Oct4 녹-인 ES 세포에서 유래된 세포를, 10∼20 ng/ml의 PDGF-BB(PeproTech)의 존재 또는 부재 하에 5∼100 ng/ml 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF; PeproTech; 미국 뉴저지주 록키힐 소재) 및 1% 메틸셀룰로오즈(StemCell Technologies, Inc사)로 보충된 StemLine™ 무혈청 배지(Sigma)로 구성된 반고체 무혈청 배지에서 2 x 104 세포/ml의 밀도로 플레이팅하였다. PDGF-BB는 간엽 세포의 성장을 개선하였으나 콜로니 형성에 필수적이지는 않았다. 배양 14∼21일 후에 배상체(EB)와 유사한 큰 간엽 컴팩트 콜로니가 형성되었다. 간엽 콜로니는 7일에 검출되었으나, 활동적으로 성장하는 콜로니를 드러내기 위해서는 14∼21일이 필요하였다.
개개의 간엽 콜로니를 5∼100 ng/ml bFGF로 보충된 0.2 ml/웰 StemLine® 무혈청 배지로 미리 채운 콜라겐 또는 피브로넥틴으로 코딩된 96웰 플레이트의 웰로 옮겼다. 배양 3∼4일 후, 개개의 웰로부터 얻은 부착 세포를 트립신 처리하여 수확하고 5∼100 ng/ml bFGF를 포함하는 StemLine® 무혈청 배지에서 콜라겐 또는 피브로넥틴으로 코딩된 접시에서 증식시켰다.
형질전환 유전자를 발현시키는 렌티 바이러스 형질 도입을 상기 개시한 바와 같이 실시하였다. 발명자들은 분화능 결정 인자의 제한된 세트(예컨대, Oct-4, Nanog, Sox2 및 Lin28)를 발현시킴으로써 분화된 간엽 유사 세포가 만능 분화 상태로 재프로그래밍될 수 있다는 가설을 시험하였다. 적어도 이들 4개의 분화능 결정 인자를 발현시켰더니 인간 ES 세포와 같은 만능 세포의 전형적인 모폴로지를 갖는 세포를 포함하는 콜로니가 얻어졌다(도 7B; 진한 회색 막대). 도 7B에 도시된 바와 같이, Oct-4, Nanog, Sox2 및 Lin28의 완전한 보체를 사용하여 만능 세포의 전형적인 모폴로지를 갖는 세포를 포함하는 최대수의 콜로니가 얻어졌다. 그러나, Oct-4, Nanog, Sox2 또는 Lin28 중 하나가 없을 경우, ES 유사 콜로니의 수가 유의적으로 감소하거나(예컨대 Nanog 또는 Lin28) 또는 사라졌다(예컨대, Oct-4 또는 Sox2).
이 실시양태에서, EGFP 발현은 음성 Oct4 프로모터/조절 영역이 활성화될 때 일어났다. 즉, 비분화 세포는 분화된 세포로부터 사라지는 녹색 컬러로 확인되었다. 따라서, 상기 세포에서 내생 Oct-4의 발현은 선택성일 수 있다. 재프로그래밍된 콜로니는 또한 Oct-4, SSEA3, SSEA4, Tra-1-60 및 Tra-1-81 만능 세포 특이적 마커를 발현시켰다(데이터는 나타내지 않음).
발명자들은 ES 세포가 농후한 14개의 분화능 결정 인자로 이루어진 동일한 풀을 갖는 2개의 별도의 형질 감염으로부터 6개의 콜로니를 무작위로 취하고 8주 이상 동안 5개의 안정한 콜로니를 증식시켰다. 따라서, 발명자들은 4개의 분화능 결정 인자를 영장류 체세포에 투여함으로써 상기 체세포가 더 높은 분화능 세포가 되도록 재프로그래밍하는 신규한 방법을 확인하였다.
이들 세포를 본원에 개시된 렌티 바이러스 전달 시스템을 사용하여 다른 분화능 결정 인자 조합(즉, Sox2, c-Myc, Oct 3/4 및 Klf4)에 노출시키는 경우, 세포의 재프로그래밍 및 전환이 관찰되지 않았다.
실시예 4: 렌티 바이러스 형질 도입 후 2개의 분화능 결정 인자의 한정된 세트를 사용한 간엽 유사 세포의 재프로그래밍
분화된 세포를 다시 만능 세포로 재프로그래밍할 수 있는 분화능 결정 인자의 제한된 세트를 더 동정하기 위하여, 4개의 분화능 결정 인자 Oct-4, Nanog, Sox2 및 Lin28 중 2개의 조합을 사용하여 실시예 3의 간엽 유사 세포에서 상기 확인된 방법을 반복하였다. 발명자들은 상기 개시된 기술을 사용하여 이들 분화능 결정 인자를 세포 재프로그래밍 능력에 대하여 스크리닝하였다.
형질전환 유전자를 발현시키는 렌티 바이러스 형질 도입을 상기 개시한 바와 같이 실시하였다. 발명자들은 4개 미만의 분화능 결정 인자를 발현시킴으로써 분화된 간엽 유사 세포가 만능 분화 상태로 재프로그래밍될 수 있다는 가설을 시험하였다. 적어도 Oct-4 및 Sox2(도 7C)를 발현시켰더니 인간 ES 세포와 같은 만능 세포의 전형적인 모폴로지를 갖는 세포를 포함하는 콜로니가 얻어졌다. Nanog 및 Lin28은 단독으로 및 조합으로 인간 ES 세포에서 유래된 간엽 세포에서 만능 상태로의 재프로그래밍 효율을 개선함으로써 클론 회수에서 유리한 효과를 가졌으나 재프로그래밍된 세포의 처음 생성에도 재프로그래밍된 세포의 증식에도 필수적이지 않았다.
실시예 5: 렌티 바이러스 형질 도입 및 4개의 분화능 결정 인자의 발현 후 분화된 세포의 재프로그래밍
분화된 세포를 만능 세포로 다시 재프로그래밍하는 데 있어서의 제한된 세트의 분화능 결정 인자의 유용성을 더 입증하기 위하여, 상기 방법을 인간 태아의 폐 섬유아세포인 ATCC 카탈로그 번호 CCL-186(IMR-90; ATCC)을 사용하여 반복하였다[문헌 Birney E, et al, Nature 447:799-816 (2007) 참조).
형질전환 유전자를 발현시키는 렌티 바이러스 형질 도입을 상기 개시한 바와 같이 실시하였다. 즉, IMR-90 세포(0.9 x 106/웰)를 Oct-4, Sox2, Nanog 및 Lin28의 조합으로 형질 도입하였다. 발명자들은 분화능 결정 인자의 제한된 세트(예컨대, Oct-4, Sox2, Nanog 및 Lin28)를 발현시킴으로써 분화된 섬유아세포가 만능 상태로 재프로그래밍될 수 있다는 가설을 시험하였다. 형질 도입 후, 방사선 조사된 마우스 배아 섬유아세포(MEF)를 파종한 3개의 10-cm 접시로 세포를 옮겼다. 형질 도입 후 12일까지, 인간 ES 세포 모폴로지를 갖는 작은 콜로니가 보였다. 형질 도입 후 20일에, 총 198개의 콜로니가 3개의 플레이트 상에 보였다. 41개의 콜로니를 취하고, 이 중 35개를 추가로 3주 동안 성공적으로 증식시켰다. 이후 이들 콜로니 중 6개를 선택하여 지속적으로 증식 및 분석하고 다른 29개는 냉동하였다.
적어도 Oct-4, Sox2, Nanog 및 Lin28을 도입하여 정상 핵형을 갖는 인간 ES 세포와 같은 만능 세포의 전형적인 모폴로지를 갖는 콜로니를 얻었다. 각 콜로니에서 유래한 세포도 마찬가지로 텔로머라아제 활성을 발현시켰고 인간 ES 세포 특이적 표면 항원(즉, SSEA-3, SSEA-4, Tra-1-60 및 Tral-81)을 발현시켰다. 각 콜로니에 대하여, 내생 OCT4 및 NANOG의 발현은 만능 세포와 유사한 수준이었으나 이들 유전자의 외생 발현은 변화되었다. 또한, EB 및 기형종 형성은 재프로그래밍된 세포가 3개의 1차 배엽층 모두의 분화된 유도체를 발생시키는 발달 가능성을 가짐을 입증하였다.
DNA 지문은 이들 콜로니가 IMR-90 세포로부터 유래되었으며 인간 ES 세포주(예컨대, H1, H7, H9, H13 및 H14)로부터 유래되지 않았음을 확인하였다.
분화된 간엽 세포로 얻은 데이터와 유사하게, Oct-4, Nanog, Sox2 또는 Lin28의 완전 보체를 사용하여 인간 ES 세포와 같은 만능 세포의 일반적인 모폴로지를 갖는 세포를 포함하는 최대수의 콜로니가 얻어졌다. 그러나, Oct-4, Nanog, Sox2 또는 Lin28이 존재하지 않는 경우, ES 유사 콜로니의 수가 유의적으로 감소되거나(예컨대, Nanog 또는 Lin28) 또는 사라졌다(예컨대, Oct-4 또는 Sox2).
재프로그래밍 동안 만능 특이적 유전자의 활성화를 위한 선택은 적용되지 않았으나, 증식 및 자세한 특성화를 위해 선택된 콜로니는 12주 이상 동안 증식하였고 정상 만능 세포의 전형적인 특성을 유지하였다,
재프로그래밍된 세포는 모폴로지(즉, 뚜렷한 핵소체 및 핵 대 원형질 비율이 높은 콤팩트 콜로니를 가짐)만을 기준으로 하여 동정되었다. 재프로그래밍 세포는 또한 Oct-4, SSEA3, SSEA4, Tra-1-60 및 Tra-1-81 만능 세포 특이적 마커를 발현시켰다.
실시예 6: 렌티 바이러스 형질 도입 및 3개의 분화능 결정 인자의 발현 후 분화된 세포의 재프로그래밍
분화된 세포를 다시 만능 세포로 재프로그래밍하는 데 있어 분화능 결정 인자의 제한된 세트의 유용성을 더 입증하기 위하여, 상기 확인된 방법을 상기 개시된 IMR-90 세포를 사용하여 반복하였다. 이 실험 세트에서는, 실시예 5에서보다 적은 분화능 결정 인자가 사용되었다.
형질전환 유전자를 발현시키는 렌티 바이러스 형질 도입을 상기 개시한 바와 같이 실시하였다. IMR-90 세포를 Oct-4, Sox2, Nanog 및 Lin28 중 3개의 조합으로 형질 도입하였다. 발명자들은 분화능 결정 인자의 제한된 세트를 더 많이 발현시킴으로써 분화된 섬유아세포가 만능 상태로 재프로그래밍될 수 있다는 가설을 시험하였다. 적어도 3개 인자의 발현으로 인간 ES 세포와 같은 만능 세포의 전형적인 모폴로지를 갖는 콜로니를 얻었다. 만능 세포의 전형적인 모폴로지를 갖는 세포를 포함한 재프로그래밍된 콜로니는 Lin28의 존재 또는 부재 하에 Oct-4, Sox2 및 Nanog의 완전 보체를 이용하여 얻어졌다. 따라서, Lin28의 존재 또는 부재는 재프로그래밍에 영향을 주지 않았다. 그러나, Oct-4, Nanog 또는 Sox2 중 어느 것이 부재할 경우, 재프로그래밍된 콜로니의 수는 유의적으로 감소하거나 사라졌다.
재프로그래밍된 세포에서 Oct-4, Sox2, Nanog 및 Lin28 프로바이러스의 존재를 조사하기 위하여, 주형으로서 IMR-90 클론에서 유래하는 게놈 DNA를 사용하여 형질전환 유전자 특이적 프라이머 쌍을 사용하는 PCR(표 3 참조; 하나의 유전자 특이적 프라이머 및 하나의 렌티 바이러스 벡터 특이적 프라이머)을 실행하였다. 상기 반응은 pfx DNA 중합 효소(Invitrogen, 증폭 완충액을 2배로 사용하고 증대제 용액을 3배로 사용하였음), 및 이하의 조건(95℃에서 1분 동안 초기 변성; 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 2분, 이어서 68℃에서 7분의 35 사이클)을 사용하였다. 형질전환 유전자에 대한 PCR 분석은 4개의 형질전환 유전자 또는 3개의 형질전환 유전자(즉, Oct-4, Sox2 및 Nanog)가 모두 형질전환 유전자를 발현시키는 렌티 바이러스 벡터에 노출 후 만능 세포로 삽입되었음을 나타내었다.
재프로그래밍된 세포를 모폴로지(즉, 뚜렷한 핵소체 및 원형질에 대하여 높은 핵 비율을 갖는 컴팩트 콜로니를 가짐)만을 기준으로 확인하였다. 재프로그래밍된 세포도 또한 Oct-4, SSEA3, SSEA4, Tra-1-60 및 Tra-1-81 만능 세포 특이적 마커를 발현시켰다.
실시예 7: 렌티 바이러스 형질 도입 및 3개의 분화능 결정 인자의 발현 후 분화된 세포의 재프로그래밍
분화된 세포를 만능 세포로 재프로그래밍하는 데 있어 분화능 결정 인자의 제한된 세트의 유용성을 더 입증하기 위하여, 상기 확인된 방법을 인간의 출생후 포피 섬유아세포인 ATCC 카탈로그 번호 CRL-2097(ATCC)을 사용하여 반복하였다. 이 실험 세트에서는, 실시예 5에서보다 적은 분화능 결정 인자가 사용되었다.
형질전환 유전자를 발현시키는 렌티 바이러스 형질 도입을 상기 개시한 바와 같이 실시하였다. 출생 후 섬유아세포(0.6 x 106/웰)를 Oct-4, Sox2, Nanog 및 Lin28의 조합으로 형질 도입하였다. 발명자들은 분화능 결정 인자의 제한된 세트를 발현시킴으로써 출생 후의 분화된 섬유아세포가 만능 상태로 재프로그래밍될 수 있다는 가설을 시험하여 유망한 결과를 얻었다. 형질 도입 후, 방사선 조사된 MEF를 파종한 3개의 10-cm 접시로 세포를 옮겼다. 형질 도입 후 15일까지, 만능 세포 모폴로지를 갖는 작은 콜로니가 보였다. 형질 도입 후 20일에, 총 57개의 콜로니가 플레이트 상에 보였다. 29개의 콜로니를 취하고, 이 중 27개를 추가로 3주 동안 성공적으로 증식시켰다. 이후 이들 콜로니 중 4개를 선택하여 지속적으로 증식 및 분석하고 다른 23개는 냉동하였다.
Oct-4, Sox2, Nanog 및 Lin28의 발현으로 정상 핵형 및 인간 ES 세포와 같은 만능 세포의 전형적인 모폴로지를 갖는 세포를 포함한 콜로니를 얻었다. 재프로그래밍된 콜로니도 마찬가지로 텔로머라아제 활성을 발현시켰고 만능 세포 특이적 마커(즉, SSEA-3, SSEA-4, Tra-1-60 및 Tral-81)을 발현시켰다. 각각에 대하여, 내생 OCT4 및 NANOG가 인간 만능 세포에서 관찰되는 것과 유사한 수준으로 발현되었으나 이들 유전자의 외생 발현은 변화되었다. 또한, EB 및 기형종 형성은 재프로그래밍된 세포가 3개의 1차 배엽층 모두의 분화된 유도체를 발생시키는 발달 가능성을 가짐을 입증하였다. 그러나, IMR-90 세포에서 얻어지는 iPS 세포와는 대조적으로, CRL-2097 세포에서 유래하는 iPS 세포는 5주에 조사한 기형종에서 명백한 계통 변화를 보였다. iPS 세포 콜로니 중 2개는 중성 분화를 보인 반면 다른 두 콜로니는 원생 외배엽을 연상시키는 원주형 상피 세포의 다중 촛점을 보였다.
DNA 지문 분석은 이들 콜로니가 원래의 세포주로부터 유래되었으며 인간 ES 세포주(예컨대, H1, H7, H9, H13 및 H14)로부터 유래되지 않았음을 확인하였다.
분화된 간엽 세포의 형질 도입 후 얻어진 데이터와 유사하게, Oct-4, Sox2, Nanog 및 Lin28의 완전 보체를 사용하여 인간 만능 세포의 일반적인 모폴로지를 갖는 세포를 포함하는 최대수의 콜로니가 얻어졌다. 흥미롭게도, 하나의 세포주는 Lin28이 결핍되어, Lin28이 체세포 재프로그래밍에 필수적이지 않음을 확인하였다.
재프로그래밍 동안 만능 특이적 유전자의 활성화를 위한 선택은 적용되지 않았으나, 증식 및 자세한 특성화를 위해 선택된 콜로니는 12주 이상 동안 증식하였고 정상적인 인간 만능 세포의 전형적인 특성을 유지하였다,
재프로그래밍된 세포는 모폴로지(즉, 뚜렷한 핵소체 및 핵 대 원형질 비율이 높은 콤팩트 콜로니를 가짐)만을 기준으로 하여 동정되었다. 재프로그래밍 세포는 또한 Oct-4, SSEA3, SSEA4, Tra-1-60 및 Tra-1-81 만능 세포 특이적 마커를 발현시켰다.
이들 세포를 본원에 개시된 렌티 바이러스 전달 시스템을 사용하여 다른 인자 조합(즉, Sox2, c-Myc, Oct 3/4 및 Klf4)에 노출할 경우, 세포의 재프로그래밍 및 전환이 관찰되지 않았다.
실시예 8: 렌티 바이러스 형질 도입 및 4개의 분화능 결정 인자의 발현 후 분화된 세포의 재프로그래밍
분화된 세포를 만능 세포로 재프로그래밍하는 데 있어 분화능 결정 인자의 제한된 세트의 유용성을 더 입증하기 위하여, 상기 확인된 방법을 인간 성인의 피부 세포인 ATCC 카탈로그 번호 CRL-2106(ATCC)을 사용하여 반복하였다.
형질전환 유전자를 발현시키는 렌티 바이러스 형질 도입을 상기 개시한 바와 같이 실시하였다. 즉, 피부 세포(2.0 x 105/웰)를 Oct-4, Sox2, Nanog 및 Lin28의 조합으로 형질 도입하였다. 발명자들은 분화능 결정 인자의 제한된 세트를 발현시킴으로써 성인의 피부 세포가 만능 상태로 재프로그래밍될 수 있다는 가설을 시험하여 유망한 결과를 얻었다. 형질 도입 후, 방사선 조사된 마우스 배아 섬유아세포(MEF)를 파종한 3개의 10-cm 접시로 세포를 옮겼다. 10일 후 인간 ES 세포 배양 배지에서 방사선 조사된 MEF로 조건화된 인간 ES 세포 배양 배지를 사용하여 세포 성장을 촉진하였다. 형질 도입 후 18일까지, 만능 세포 모폴로지를 갖는 작은 콜로니가 보였다.
Oct-4, Sox2, Nanog 및 Lin28의 발현으로 정상 핵형 및 인간 ES 세포와 같은 만능 세포의 전형적인 모폴로지(즉, 뚜렷한 핵소체 및 핵 대 원형질 비율이 높은 콤팩트 콜로니를 가짐)를 갖는 세포를 포함한 콜로니를 얻었다(도 8A 참조). 도 8B에 도시된 바와 같이, 재프로그래밍된 콜로니도 또한 만능 세포의 전형적인 세포 표면 마커를 발현시켰으나 SK46 세포(대조군)는 그렇지 않았다. 그러나, 성인의 피부 세포에서 유래하는 재프로그래밍된 콜로니는 실시예 7의 세포보다 늦게 나타났고 실시예 7의 세포보다 재프로그래밍 효율이 낮았다.
실시예 9: 싱글 작제물에 분화능 결정 인자를 결합하는 것에 의한 재프로그래밍 효율 증가
재프로그래밍 효율을 증가시키기 위하여, 도 4A에 도시된 작제물을 사용하여 상기 동정 방법을 반복하였으나, Oct-4 또는 Sox2를 형질전환 유전자 부분에 삽입하고 Sox2가 임의로 푸로마이신 내성 유전자를 대체하였다. 상기 작제물은 이후 293FT 세포 또는 OCT4 녹-인 인간 H1 ES 세포(p6)에서 발현되었다.
형질전환 유전자 발현 렌티 바이러스 형질 도입을 상기 개시한 바와 같이 실시하였다. 즉, 293FT 세포 또는 간엽 세포(6웰 플레이트의 웰당 ~ 2 x 1O5 세포, 밤새 파종)를 여러 형질전환 유전자 조합으로 형질 도입하였다. 렌티 바이러스로 밤새 항온 처리한 후 세포를 10 cm MEF 접시(6웰 플레이트 중 1웰에서 1 x 10 cm MEF 접시로)에 옮겼다. 활성 내생 OCT4 프로모터에 대한 제네티신 선택(50 μg/ml)을 형질 도입 후 11∼15일에 실시하였다. 16일에 iPS 콜로니를 세었다.
도 9A는 형질 도입 후 293FT 세포에서 발생하는 Oct-4 및 Sox2 발현을 입증한다(예컨대, 레인 1-3 참조). 도 9A-B에서, pSin4-EF2-Oct4-IRES1-Sox2는 OS-IRES1로 약기되고, pSin4-EF2-Oct4-IRES2-Sox2는 OS-IRES2로 약기되며, pSin4- EF2-Oct4-F2A-Sox2는 OS-F2A로 약기되고, pSin4-EF2-Oct4-IRES1-puro는 O로 약기되며, pSin4-EF2-Sox2-IRES1-puro는 S로 약기된다.
도 9B는 Oct-4 및 Sox2가 동일한 작제물에 제공될 경우 OCT4 녹-인 인간 H1 ES 세포에서 유래하는 간엽 세포에서의 재프로그래밍 효율이 증가되었음을 보인다(p6)(IRES1은 매우 저효율의 내부 리보솜 도입 부위인 반면 IRES2는 고효율의 내부 리보솜 도입 부위임). OS-IRES2+N+L(고효율 IRES)은 O+S, O+S+N+L 또는 OS-IRES1(저효율 IRES)+N+L에 비하여 재프로그래밍 효율이 약 4배 증가되었음을 보였다. 따라서, 각각 대략 동일한 발현 수준을 제공하는 한 작제물에 분화능 결정 인자를 제공하면 재프로그래밍 효율이 개선될 수 있다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 특정 적용 형태는 당업자에게 통상적인 최적화의 문제이며 본 발명의 사상 또는 청구범위의 범위에서 일탈하지 않는 한 실시될 수 있다고 이해된다.
상기 명세서에서 언급된 모든 공보 및 특허는 본원에 참고 문헌으로 포함된다. 본 발명의 범위 및 사상에서 일탈하지 않는 한 개시된 본 발명 방법 및 시스템의 각종 변경 및 변형이 당업자에게 명백할 것이다. 그러나, 상기 개시된 본 발명의 실시예 및 실시양태는 예시적이며 본 발명을 한정하려는 의도는 아닌 것으로 이해된다. 본 발명은 이하의 청구범위의 범위 내에 속하는 실시예 및 실시양태의 모든 변형된 형태를 포함한다.
SEQUENCE LISTING <110> Thomson, James Yu, Junying <120> SOMATIC CELL REPROGRAMMING <130> 960296.00652 <150> US 60/919,687 <151> 2007-03-23 <150> US 60/974,980 <151> 2007-09-25 <150> US 60/989,058 <151> 2007-11-19 <160> 13 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 480 <212> DNA <213> Stella <400> 1 atggacccat cacagtttaa tccaacctac atcccagggt ctccacaaat gctcaccgaa 60 gaaaattccc gggacgattc aggggcctct caaatctcct ccgagacgtt gataaagaac 120 cttagtaact tgactatcaa cgctagtagc gaatctgttt cccctctatc ggaagcttta 180 ctccgtcgag agtctgtagg agcagcagtc ctcagggaaa tcgaagatga gtggctttac 240 agcaggagag gagtaagaac attgctgtct gtgcagagag aaaagatggc aagattgaga 300 tacatgttac tcggcggagt tcgtacgcat gaaagaagac caacaaacaa ggagcctaag 360 ggagttaaga aggaatcaag accattcaaa tgtccctgca gtttctgcgt gtctaatgga 420 tgggatcctt ctgagaatgc tagaataggg aatcaagaca ccaagccact tcagccataa 480 <210> 2 <211> 1083 <212> DNA <213> Oct-4 <400> 2 atggcgggac acctggcttc ggatttcgcc ttctcgcccc ctccaggtgg tggaggtgat 60 gggccagggg ggccggagcc 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DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 7 cagtgcccga aacccacac 19 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 8 agaggaactg cttccttcac gaca 24 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 9 cagaaggcct cagcacctac 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 10 tacctcttcc tcccactcca 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 11 aagcgcagat caaaaggaga 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 12 agtttgtgcc agggtttttg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 13 acttcacctt ccctccaacc 20

Claims (27)

  1. 영장류 체세포를 재프로그래밍하는 방법으로서,
    상기 영장류 체세포를 재프로그래밍하기에 충분한 조건 하에서 c-Myc 및 Klf4를 포함하지 않는 복수의 분화능 결정 인자를 상기 세포에 노출시키는 단계, 및
    상기 노출된 세포를 배양하여 상기 영장류 체세포보다 분화능 수준이 더 높은 재프로그래밍된 세포를 얻는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 영장류 체세포는 출생 후의 개체로부터 얻어지는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 재프로그래밍된 세포는 출생 후의 개체와 실질적으로 유전적으로 동일한 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 영장류 체세포는 줄기 세포의 시험관내 분화에 의하여 얻어지는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 노출 단계는 하나 이상의 분화능 결정 인자를 코딩하는 벡터를 영장류 체세포로 도입하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스계 벡터인 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 바이러스계 벡터는 레트로 바이러스 벡터인 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 레트로 바이러스 벡터는 렌티 바이러스 벡터인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 분화능 결정 인자는 상기 분화능 결정 인자를 코딩하는 핵산 서열이 이종 프로모터에 작동 가능하게 연결된 재프로그래밍 서열로서 상기 체세포로 도입되는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 복수의 분화능 결정 인자는 Oct-4, Sox2, Nanog 및 Lin28로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 분화능 결정 인자는 Oct-4, Sox2, 및 Nanog와 Lin28 중 적어도 하나인 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 분화능 결정 인자는 Oct-4 및 Sox2인 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 재프로그래밍된 세포는 만능 세포인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 재프로그래밍된 세포는 (i) Oct-4, SSEA3, SSEA4, Tra-1-60 및 Tra-1-81로 구성된 군에서 선택된 세포 마커를 발현시키고; (ii) 만능 세포의 모폴로지 특성을 보이며; (iii) 면역 저하된 동물로 도입될 때 기형종을 형성하는 것인 방법.
  15. 분화능 결정 인자를 발현시키기에 충분한 조건 하에서 c-Myc 또는 Klf4를 포함하지 않는 복수의 분화능 결정 인자를 영장류 체세포에 도입함으로써 상기 체세포를 재프로그래밍하여 정배수체 영장류 만능 세포를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 따라 생성된 영장류 만능 세포 농후 군집.
  16. 제15항에 있어서, 상기 영장류 만능 세포는 (i) Oct-4, SSEA3, SSEA4, Tra-1-60 및 Tra-1-81로 구성된 군에서 선택된 세포 표면 마커를 발현시키고; (ii) 만능 세포의 모폴로지 특성을 보이며; (iii) 면역 저하된 동물로 도입될 때 기형종을 형성하는 것인 영장류 만능 세포 농후 군집.
  17. 제15항에 있어서, 상기 분화능 결정 인자는 Oct-4, Sox2, 및 Nanog와 Lin28 중 적어도 하나인 것인 영장류 만능 세포 농후 군집.
  18. 제15항에 있어서, 상기 분화능 결정 인자는 Oct-4 및 Sox2인 것인 영장류 만능 세포 농후 군집.
  19. 제15항에 있어서, 상기 영장류 만능 세포가 군집의 60% 이상을 차지하는 것인 영장류 만능 세포 농후 군집.
  20. 제15항에 있어서, 상기 영장류 만능 세포가 군집의 80% 이상을 차지하는 것인 영장류 만능 세포 농후 군집.
  21. 제15항에 있어서, 상기 영장류 만능 세포가 군집의 95% 이상을 차지하는 것인 영장류 만능 세포 농후 군집.
  22. 영장류 개체의 선재하는 분화된 세포의 게놈을 갖는 정배수체 만능 세포를 포함한 세포 배양물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 영장류는 인간인 것인 세포 배양물.
  24. 제22항에 있어서, 상기 세포는 c-Myc 및 Klf4를 포함하지 않는 분화능 결정 인자를 코딩하는 복수의 도입된 폴리누클레오티드를 게놈 내에 더 포함하는 것인 세포 배양물.
  25. 영장류 체세포를 만능 세포로 전환시키기 위한 1 이상의 추정 분화능 결정 인자의 적합성을 분석하는 방법으로서,
    상기 분화능 결정 인자의 흡수를 수용하고 만능 세포에서 활성인 조절된 프로모터의 제어 하에 마커 유전자를 포함하는 영장류 체세포를 상기 1 이상의 추정 분화능 결정 인자에 노출시키는 단계, 및
    상기 1 이상의 인자에 노출 후 마커 유전자가 세포 내에서 발현되는지 여부를 평가하는 단계(상기 발현은 영장류 체세포를 만능 세포로 전환시키기 위한 1 이상의 인자의 적합성을 나타냄)
    를 포함하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 조절된 프로모터는 Oct4 프로모터인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 1 이상의 추정 분화능 결정 인자는 Oct-4, Sox2 및 Nanog와 Lin28 중 적어도 하나인 것인 방법.
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Families Citing this family (233)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ITRM20030376A1 (it) 2003-07-31 2005-02-01 Univ Roma Procedimento per l'isolamento e l'espansione di cellule staminali cardiache da biopsia.
US7682828B2 (en) 2003-11-26 2010-03-23 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods for reprogramming somatic cells
US11660317B2 (en) 2004-11-08 2023-05-30 The Johns Hopkins University Compositions comprising cardiosphere-derived cells for use in cell therapy
US8034613B2 (en) * 2005-06-01 2011-10-11 Wisconsin Alumni Research Foundation Multipotent lymphohematopoietic progenitor cells
AU2006252576B2 (en) * 2005-06-01 2011-01-20 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of forming dendritic cells from embryonic stem cells
US20090227032A1 (en) * 2005-12-13 2009-09-10 Kyoto University Nuclear reprogramming factor and induced pluripotent stem cells
US8278104B2 (en) * 2005-12-13 2012-10-02 Kyoto University Induced pluripotent stem cells produced with Oct3/4, Klf4 and Sox2
US8129187B2 (en) * 2005-12-13 2012-03-06 Kyoto University Somatic cell reprogramming by retroviral vectors encoding Oct3/4. Klf4, c-Myc and Sox2
CN103113463B (zh) 2005-12-13 2015-02-18 国立大学法人京都大学 核重新编程因子
WO2007095064A2 (en) * 2006-02-09 2007-08-23 Wisconsin Alumni Research Foundation ERYTHROID CELLS PRODUCING ADULT-TYPE β-HEMOGLOBIN GENERATED FROM HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS
US8440461B2 (en) * 2007-03-23 2013-05-14 Wisconsin Alumni Research Foundation Reprogramming somatic cells using retroviral vectors comprising Oct-4 and Sox2 genes
JP2010523117A (ja) 2007-04-07 2010-07-15 ホワイトヘッド・インスティテュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ 体細胞の再プログラミング
JP2008307007A (ja) * 2007-06-15 2008-12-25 Bayer Schering Pharma Ag 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞
US9213999B2 (en) * 2007-06-15 2015-12-15 Kyoto University Providing iPSCs to a customer
US20110236971A2 (en) * 2007-09-25 2011-09-29 Maksym Vodyanyk Generation of Clonal Mesenchymal Progenitors and Mesenchymal Stem Cell Lines Under Serum-Free Conditions
WO2009057831A1 (ja) * 2007-10-31 2009-05-07 Kyoto University 核初期化方法
US9683232B2 (en) * 2007-12-10 2017-06-20 Kyoto University Efficient method for nuclear reprogramming
KR101532442B1 (ko) 2007-12-10 2015-06-29 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 효율적인 핵 초기화 방법
EP2268809B1 (en) 2008-05-02 2019-02-06 Kyoto University Method of nuclear reprogramming
EP2297298A4 (en) * 2008-05-09 2011-10-05 Vistagen Therapeutics Inc PANCREATIC ENDOCRINE PROGENITOR CELLS FROM PLURIPOTENT STEM CELLS
EP3112456A1 (en) 2008-06-04 2017-01-04 Cellular Dynamics International, Inc. Methods for the production of ips cells using non-viral approach
EP2300611B1 (en) 2008-06-13 2017-08-09 Whitehead Institute for Biomedical Research Programming and reprogramming of cells
KR101606943B1 (ko) 2008-06-27 2016-03-28 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 유도된 다능성 줄기 세포의 효율적인 확립 방법
JP5562231B2 (ja) * 2008-07-30 2014-07-30 国立大学法人京都大学 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法
US9175268B2 (en) * 2008-08-12 2015-11-03 Cellular Dynamics International, Inc. Methods for the production of iPS cells
US20120021519A1 (en) * 2008-09-19 2012-01-26 Presidents And Fellows Of Harvard College Efficient induction of pluripotent stem cells using small molecule compounds
WO2010042800A1 (en) * 2008-10-10 2010-04-15 Nevada Cancer Institute Methods of reprogramming somatic cells and methods of use for such cells
EP3450545B1 (en) * 2008-10-24 2023-08-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Pluripotent stem cells obtained by non-viral reprogramming
EP2342333A4 (en) * 2008-10-30 2013-05-08 Univ Kyoto METHOD FOR THE PRODUCTION OF INDUCED PLURIPOTENTAL STEM CELLS
US20110318830A1 (en) * 2008-11-12 2011-12-29 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for re-programming and re-differentiating cells
US9045737B2 (en) * 2008-12-13 2015-06-02 Dnamicroarray, Inc. Artificial three-dimensional microenvironment niche culture
US20110300627A1 (en) * 2009-01-20 2011-12-08 Sing George L Dedifferentiation and reprogramming of cells
EP2398897B1 (en) 2009-02-20 2017-06-28 Cellular Dynamics International, Inc. Methods and compositions for the differentiation of stem cells
JP5553289B2 (ja) * 2009-02-27 2014-07-16 国立大学法人京都大学 新規核初期化物質
JP6342115B2 (ja) * 2009-03-20 2018-06-13 メゾブラスト，インコーポレーテッド 再プログラム化多能性細胞の作製
WO2010124142A2 (en) 2009-04-22 2010-10-28 Cythera, Inc. Cell compositions derived from dedifferentiated reprogrammed cells
US9109245B2 (en) 2009-04-22 2015-08-18 Viacyte, Inc. Cell compositions derived from dedifferentiated reprogrammed cells
EP2438159B1 (en) 2009-05-29 2018-10-03 Kyoto University Method for selecting clone of induced pluripotent stem cells
CA2952805C (en) 2009-06-05 2021-06-01 Cellular Dynamics International, Inc. Reprogramming t cells and hematopoietic cells
US20110002897A1 (en) * 2009-06-11 2011-01-06 Burnham Institute For Medical Research Directed differentiation of stem cells
JP5645197B2 (ja) * 2009-06-23 2014-12-24 学校法人日本大学 幹細胞の未分化状態を維持する新規方法
AU2010279913B2 (en) 2009-08-07 2016-04-28 Kyoto University Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
US8709805B2 (en) 2009-08-07 2014-04-29 Kyoto University Canine iPS cells and method of producing same
WO2011021706A1 (ja) 2009-08-19 2011-02-24 国立大学法人東北大学 角膜移植用シート
US8993329B2 (en) 2009-09-24 2015-03-31 Kyoto University Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
GB2474492B (en) * 2009-10-19 2014-05-21 Tristem Trading Cyprus Ltd Treatment using reprogrammed mature adult cells
US20110104805A1 (en) * 2009-10-29 2011-05-05 Centocor Ortho Biotech Inc. Pluripotent Stem Cells
US9340772B2 (en) 2009-10-29 2016-05-17 Mcmaster University Generating induced pluripotent stem cells and progenitor cells from fibroblasts
US9295697B2 (en) 2009-11-04 2016-03-29 Cellular Dynamics International, Inc. Episomal reprogramming with chemicals
WO2011071118A1 (ja) 2009-12-09 2011-06-16 国立大学法人京都大学 ニトロビンを含む多能性幹細胞の心筋細胞への分化促進剤
WO2011074690A1 (en) 2009-12-14 2011-06-23 Kyoto University Pharmaceutical composition for prevention and treatment of amyotrophic lateral sclerosis
EP2526189B1 (en) 2010-01-22 2016-10-12 Kyoto University Method for improving induced pluripotent stem cell generation efficiency
CN102782122B (zh) 2010-02-16 2015-02-25 国立大学法人京都大学 有效建立经诱导的多能干细胞的方法
CN102190731B (zh) * 2010-03-09 2016-01-27 中国科学院上海生命科学研究院 用人工转录因子诱导产生多能干细胞
CA2792696C (en) 2010-03-17 2020-01-07 Association Institut De Myologie Modified u7 snrnas for treatment of neuromuscular diseases
JP5860805B2 (ja) * 2010-03-23 2016-02-16 オリンパス株式会社 幹細胞の分化状態をモニタリングする方法
WO2011133661A2 (en) 2010-04-21 2011-10-27 Research Development Foundation Methods and compositions related to dopaminergic neuronal cells
US9845457B2 (en) 2010-04-30 2017-12-19 Cedars-Sinai Medical Center Maintenance of genomic stability in cultured stem cells
US9249392B2 (en) 2010-04-30 2016-02-02 Cedars-Sinai Medical Center Methods and compositions for maintaining genomic stability in cultured stem cells
CN102892879B (zh) * 2010-05-13 2016-10-12 加州大学董事会 用于诱导人类多能干细胞的方法和组合物
EP3382008A1 (en) 2010-06-15 2018-10-03 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Generation of induced pluripotent stem cells from small volumes of peripheral blood
JP5936134B2 (ja) 2010-06-15 2016-06-15 国立大学法人京都大学 ヒト人工多能性幹細胞の選択方法
JP5892661B2 (ja) 2010-08-13 2016-03-23 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞から生殖細胞への分化誘導方法
EP2609425A1 (en) 2010-08-23 2013-07-03 President and Fellows of Harvard College Optogenetic probes for measuring membrane potential
US9499790B2 (en) 2010-08-26 2016-11-22 Kyoto University Method for promoting differentiation of pluripotent stem cells into cardiac muscle cells
EP2610249B1 (en) 2010-08-26 2017-10-11 Kyoto University Pluripotent stem cell cardiomyocyte differentiation-promoting agent
WO2012029994A1 (en) 2010-09-02 2012-03-08 Kyoto University Pharmaceutical composition for prevention and treatment of amyotrophic lateral sclerosis
JP5794588B2 (ja) 2010-09-14 2015-10-14 国立大学法人京都大学 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法
JP2013545439A (ja) 2010-09-17 2013-12-26 プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ 多能性幹細胞の有用性および安全性の特徴決定を行うための機能的ゲノミクスアッセイ
AU2011316830A1 (en) 2010-10-22 2013-05-02 Biotime Inc. Methods of modifying transcriptional regulatory networks in stem cells
EP2647699B1 (en) 2010-12-03 2020-04-01 Kyoto University Efficient method for establishing induced pluripotent stem cells
EP2665811B1 (en) 2011-01-19 2017-10-18 The Regents of The University of California Somatic cells with innate potential for pluripotency
WO2012098260A1 (en) 2011-01-21 2012-07-26 Axiogenesis Ag A non-viral system for the generation of induced pluripotent stem (ips) cells
JP5761826B2 (ja) 2011-04-08 2015-08-12 国立大学法人大阪大学 改変ラミニンおよびその利用
WO2012141181A1 (ja) * 2011-04-11 2012-10-18 国立大学法人京都大学 核初期化物質
US9133266B2 (en) 2011-05-06 2015-09-15 Wisconsin Alumni Research Foundation Vitronectin-derived cell culture substrate and uses thereof
JP6143265B2 (ja) 2011-07-25 2017-06-07 国立大学法人京都大学 人工多能性幹細胞の選別方法
WO2013028702A1 (en) * 2011-08-22 2013-02-28 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for obtaining induced pluripotent stem cells
AU2012298997B2 (en) 2011-08-23 2018-10-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Angiohematopoietic progenitor cells
US20130274184A1 (en) * 2011-10-11 2013-10-17 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Er stress relievers in beta cell protection
JP6162604B2 (ja) 2011-10-21 2017-07-12 国立大学法人京都大学 層流による多能性維持単一分散細胞培養法
GB2496375A (en) 2011-10-28 2013-05-15 Kymab Ltd A non-human assay vertebrate comprising human antibody loci and human epitope knock-in, and uses thereof
EP2784153B1 (en) 2011-11-25 2018-01-03 Kyoto University Method for culturing pluripotent stem cell
US8450107B1 (en) 2011-11-30 2013-05-28 The Broad Institute Inc. Nucleotide-specific recognition sequences for designer TAL effectors
WO2013082268A1 (en) * 2011-11-30 2013-06-06 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for regulation of cell aging, carcinogenesis, and reprogramming
GB201122047D0 (en) 2011-12-21 2012-02-01 Kymab Ltd Transgenic animals
CN104080482B (zh) 2011-12-05 2015-11-25 菲克特生物科学股份有限公司 用于转染细胞的方法和产品
US8497124B2 (en) 2011-12-05 2013-07-30 Factor Bioscience Inc. Methods and products for reprogramming cells to a less differentiated state
WO2013090919A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Wisconsin Alumni Research Foundation Fgf-2 having enhanced stability
EP2808383B1 (en) 2012-01-27 2018-07-25 Kyoto University Method for inducing cardiac differentiation of pluripotent stem cell
US10519425B2 (en) 2012-05-23 2019-12-31 Kyoto University Highly efficient method for establishing induced pluripotent stem cell
JP2015521054A (ja) 2012-06-05 2015-07-27 カプリコール，インコーポレイテッド 心臓組織から心臓幹細胞を作製するための最適化方法および心臓治療におけるそれらの使用
JP6433896B2 (ja) 2012-08-13 2018-12-05 シーダーズ−サイナイ・メディカル・センターＣｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ 組織再生のためのエキソソームおよびマイクロリボ核酸
US9175263B2 (en) 2012-08-22 2015-11-03 Biotime, Inc. Methods and compositions for targeting progenitor cell lines
JPWO2014057997A1 (ja) 2012-10-09 2016-09-05 仲信 林 初期化ペプチド及びその用途
WO2014065435A1 (en) 2012-10-23 2014-05-01 Kyoto University Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
JP6510416B2 (ja) 2012-11-01 2019-05-08 ファクター バイオサイエンス インコーポレイテッド 細胞中でタンパク質を発現するための方法および生成物
WO2014124087A1 (en) 2013-02-06 2014-08-14 University Of Rochester Induced pluripotent cell-derived oligodendrocyte progenitor cells for the treatment of myelin disorders
EP2955223B1 (en) 2013-02-08 2019-12-18 Kyoto University Production methods for megakaryocytes and platelets
EP2966163B1 (en) 2013-03-06 2018-01-17 Kyoto University Culture system for pluripotent stem cells and method for subculturing pluripotent stem cells
EP2966166B1 (en) 2013-03-08 2019-04-03 Kyoto University Promoter of differentiation of pluripotent stem cell into myocardium, which comprises egf receptor inhibitor
BR112015022770B1 (pt) 2013-03-13 2022-11-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Meio e sistema de cultivo da célula livre de xenógeno, livre de albumina, forma concentrada, métodos de diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas, para a produção de mesenquimoangioblastos e sistema definido de cultivo da célula para diferenciação hematoendotelial das células- tronco pluripotentes humanas
US8859286B2 (en) 2013-03-14 2014-10-14 Viacyte, Inc. In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells
EP2977449B1 (en) 2013-03-21 2020-02-26 Kyoto University Pluripotent stem cell for neuronal differentiation induction
KR102164270B1 (ko) 2013-03-25 2020-10-12 고에키 자이단 호징 고베 이료 산교 도시 스이신 기코 세포의 선별 방법
CA2909230C (en) 2013-04-12 2021-06-15 Kyoto University Method for inducing alveolar epithelial progenitor cells
EP2998391B1 (en) 2013-05-14 2020-02-19 Kyoto University Efficient myocardial cell induction method
KR101870174B1 (ko) 2013-05-31 2018-06-22 아이하트 재팬 가부시키가이샤 하이드로겔을 포함하는 적층화된 세포 시트
JP6529486B2 (ja) 2013-06-05 2019-06-12 バイオタイム インク．Ｂｉｏｔｉｍｅ Ｉｎｃ． 哺乳動物種における誘導組織再生のための組成物および方法
EP3008229B1 (en) 2013-06-10 2020-05-27 President and Fellows of Harvard College Early developmental genomic assay for characterizing pluripotent stem cell utility and safety
TWI629360B (zh) 2013-06-11 2018-07-11 國立大學法人京都大學 腎前驅細胞的製造方法及含有腎前驅細胞之醫藥
US10738323B2 (en) 2013-07-12 2020-08-11 Cedars-Sinai Medical Center Generation of induced pluripotent stem cells from normal human mammary epithelial cells
JP6378183B2 (ja) 2013-08-07 2018-08-22 国立大学法人京都大学 膵ホルモン産生細胞の製造法
CN105849255A (zh) 2013-09-05 2016-08-10 国立大学法人京都大学 新的产多巴胺神经前体细胞诱导方法
CN105849256A (zh) 2013-09-12 2016-08-10 株式会社钟化 诱导多能干细胞的分化诱导方法及筛选方法
WO2015037706A1 (ja) 2013-09-13 2015-03-19 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞の心筋分化を促進する化合物
KR102219743B1 (ko) 2013-11-01 2021-02-23 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 신규 연골 세포 유도 방법
US11767507B2 (en) 2013-11-08 2023-09-26 The Mclean Hospital Corporation Methods for efficient generation of GABAergic interneurons from pluripotent stem cells
US11377639B2 (en) 2013-11-15 2022-07-05 Wisconsin Alumni Research Foundation Lineage reprogramming to induced cardiac progenitor cells (iCPC) by defined factors
AU2014363032A1 (en) 2013-12-11 2016-06-09 Pfizer Limited Method for producing retinal pigment epithelial cells
US9770489B2 (en) 2014-01-31 2017-09-26 Factor Bioscience Inc. Methods and products for nucleic acid production and delivery
US11078462B2 (en) 2014-02-18 2021-08-03 ReCyte Therapeutics, Inc. Perivascular stromal cells from primate pluripotent stem cells
US10233426B2 (en) 2014-05-30 2019-03-19 Kyoto University Method for inducing cardiac differentiation of pluripotent stem cell with low-molecular compounds
US10240127B2 (en) 2014-07-03 2019-03-26 ReCyte Therapeutics, Inc. Exosomes from clonal progenitor cells
EP3929302A1 (en) 2014-07-14 2021-12-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for identifying epitope on protein
CN107075470A (zh) 2014-09-18 2017-08-18 北卡罗来纳大学 哺乳动物肺球体和肺球体细胞及其应用
WO2016054591A1 (en) 2014-10-03 2016-04-07 Cedars-Sinai Medical Center Cardiosphere-derived cells and exosomes secreted by such cells in the treatment of muscular dystrophy
JP6931612B2 (ja) * 2014-10-06 2021-09-08 メモリアル スローン‐ケッターリング キャンサー センター 老齢ドナー由来の誘導多能性幹細胞の発がん性を低下させる方法
PT3233130T (pt) 2014-12-17 2021-06-24 Fundacion Para La Investig Medica Aplicada Construções de ácido nucleico e vetores para terapia génica para usar no tratamento da doença de wilson
PT3233129T (pt) 2014-12-17 2020-04-15 Fundacion Para La Investig Medica Aplicada Construções de ácido nucleico e vetores de terapia génica para utilização no tratamento de doença de wilson e outras condições
JP7253692B2 (ja) 2014-12-26 2023-04-07 国立大学法人京都大学 肝細胞誘導方法
EP3246406B1 (en) 2015-01-16 2022-03-09 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Gene expression system using stealthy rna, and gene introduction/expression vector including said rna
AU2016218977C1 (en) 2015-02-13 2023-03-23 Factor Bioscience Inc. Nucleic acid products and methods of administration thereof
JP2016202172A (ja) 2015-04-16 2016-12-08 国立大学法人京都大学 疑似膵島の製造方法
US9724432B2 (en) 2015-04-30 2017-08-08 University Of Rochester Non-human mammal model of human degenerative disorder, uses thereof, and method of treating human degenerative disorder
JP6983762B2 (ja) 2015-09-08 2021-12-17 ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ 臨床グレードの網膜色素上皮細胞の再現性のある分化のための方法
CA2997763A1 (en) 2015-09-08 2017-03-16 Cellular Dynamics International, Inc. Macs-based purification of stem cell-derived retinal pigment epithelium
WO2017070337A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 Cellular Dynamics International, Inc. Methods for directed differentiation of pluripotent stem cells to immune cells
JP2019500025A (ja) 2015-11-18 2019-01-10 オービス ヘルス ソリューションズ エルエルシー Ｔ７アルファウイルスベクター系
RU2749717C2 (ru) * 2015-11-24 2021-06-16 Глэксосмитклайн Интеллекчуал Проперти Дивелопмент Лимитед Способ временной трансфекции для продуцирования ретровируса
US11253551B2 (en) 2016-01-11 2022-02-22 Cedars-Sinai Medical Center Cardiosphere-derived cells and exosomes secreted by such cells in the treatment of heart failure with preserved ejection fraction
WO2017159862A1 (ja) 2016-03-18 2017-09-21 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体の凍結方法
AU2017248985B2 (en) 2016-04-15 2023-01-12 Kyoto University Method for inducing antigen specific CD8 positive T cells
CA3021628A1 (en) 2016-04-22 2017-10-26 Kyoto University Method for producing dopamine-producing neural precursor cells
US11352605B2 (en) 2016-05-12 2022-06-07 Erasmus University Medical Center Rotterdam Method for culturing myogenic cells, cultures obtained therefrom, screening methods, and cell culture medium
US11351200B2 (en) 2016-06-03 2022-06-07 Cedars-Sinai Medical Center CDC-derived exosomes for treatment of ventricular tachyarrythmias
CN105861447B (zh) * 2016-06-13 2017-12-19 广州市搏克生物技术有限公司 一种非病毒iPSCs诱导组合物及其试剂盒
US11572545B2 (en) 2016-06-16 2023-02-07 Cedars-Sinai Medical Center Efficient method for reprogramming blood to induced pluripotent stem cells
US10221395B2 (en) 2016-06-16 2019-03-05 Cedars-Sinai Medical Center Efficient method for reprogramming blood to induced pluripotent stem cells
CN105936889B (zh) * 2016-06-24 2019-10-18 肇庆大华农生物药品有限公司 一种ad293球形细胞团的培养方法
EP3478325A4 (en) 2016-07-01 2020-01-15 Research Development Foundation REMOVAL OF CELL PROLIFERATIVE CELLS DERIVED FROM STEM CELLS
JP2019528284A (ja) 2016-08-17 2019-10-10 ファクター バイオサイエンス インコーポレイテッド 核酸産物およびその投与方法
US11541078B2 (en) 2016-09-20 2023-01-03 Cedars-Sinai Medical Center Cardiosphere-derived cells and their extracellular vesicles to retard or reverse aging and age-related disorders
JP7248571B2 (ja) 2016-10-05 2023-03-29 フジフィルム セルラー ダイナミクス，インコーポレイテッド ＭｅＣＰ２が破壊された誘導多能性幹細胞からの成熟系列の生成
CA3048379A1 (en) 2016-12-27 2018-07-05 Sumitomo Chemical Company, Limited Evaluation method and selection method for induced pluripotent stem cells, and production method for induced pluripotent stem cells
CN110199017A (zh) 2017-01-20 2019-09-03 国立大学法人京都大学 CD8α+β+细胞毒性T细胞的制备方法
US20210130785A1 (en) 2017-01-26 2021-05-06 Osaka University Medium for inducing differentiation of stem cells into mesodermal cells and method for producing mesodermal cells
WO2018159805A1 (ja) 2017-03-03 2018-09-07 国立大学法人京都大学 膵前駆細胞の製造方法
JP7171055B2 (ja) 2017-03-14 2022-11-15 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞からヘルパーｔ細胞を製造する方法
EP4083063A3 (en) 2017-04-18 2023-01-04 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Antigen-specific immune effector cells
AU2018255346B2 (en) 2017-04-19 2024-05-02 Capricor, Inc. Methods and compositions for treating skeletal muscular dystrophy
CN117802033A (zh) 2017-05-25 2024-04-02 国立大学法人京都大学 由多能干细胞制造中胚层谱系原条细胞的方法
WO2018230588A1 (ja) 2017-06-14 2018-12-20 武田薬品工業株式会社 細胞封入デバイス
JP6758631B2 (ja) 2017-06-19 2020-09-23 国立大学法人大阪大学 角膜内皮細胞マーカー及びその利用
EP3643780A4 (en) 2017-06-19 2021-04-07 Foundation for Biomedical Research and Innovation at Kobe METHOD FOR PREDICTING THE DIFFERENTIATION CAPACITY OF PLURIPOTENT STEM CELLS, AND ASSOCIATED REAGENT
US10760057B2 (en) 2017-07-06 2020-09-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Human pluripotent stem cell-based screening for smooth muscle cell differentiation and disease
US11718829B2 (en) * 2017-07-28 2023-08-08 Breakthrough Tech Llc Methods and compositions for manufacturing extracellular matrix
NL2019517B1 (en) 2017-09-08 2019-03-19 Univ Erasmus Med Ct Rotterdam New therapy for Pompe disease
US20210363496A1 (en) 2017-10-17 2021-11-25 Kyoto University Method for obtaining artificial neuromuscular junction from pluripotent stem cells
US11660355B2 (en) 2017-12-20 2023-05-30 Cedars-Sinai Medical Center Engineered extracellular vesicles for enhanced tissue delivery
EP3770253A4 (en) 2018-03-19 2021-12-29 Kyoto University Hydrogel capsule
TW201945364A (zh) 2018-04-23 2019-12-01 國立大學法人京都大學 增殖抑制劑
CN112566640A (zh) 2018-06-18 2021-03-26 罗切斯特大学 治疗精神分裂症和其他神经精神病症的方法
CA3103675A1 (en) 2018-06-21 2019-12-26 University Of Rochester Methods of treating or inhibiting onset of huntington's disease
SG11202100260QA (en) 2018-07-13 2021-02-25 Univ Kyoto METHOD FOR PRODUCING γδ T CELLS
EP3824912A4 (en) 2018-07-19 2022-04-20 Kyoto University PLATEFORM CARTILAGE DERIVED FROM PLURIPOTENTS STEM CELLS AND METHODS FOR PRODUCTION OF PLATEFORM CARTILAGE
JP7357369B2 (ja) 2018-07-23 2023-10-06 国立大学法人京都大学 新規腎前駆細胞マーカーおよびそれを利用した腎前駆細胞の濃縮方法
KR20210044231A (ko) 2018-08-10 2021-04-22 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 Cd3 양성 세포의 제조 방법
JP2021535747A (ja) 2018-09-07 2021-12-23 ウィスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション ヒト多能性幹細胞からの造血前駆細胞の生成
MX2021004154A (es) 2018-10-12 2021-08-05 Vivet Therapeutics Transgen de codones optimizados para el tratamiento de colestasis intrahepatica familiar progresiva tipo 3 (pfic3).
KR20210091736A (ko) 2018-11-07 2021-07-22 비베트 테라퓨틱스 진행성 가족성 간내 담즙정체 2형(pfic2)의 치료를 위한 코돈-최적화 abcb11 전이유전자
WO2020102715A1 (en) * 2018-11-16 2020-05-22 Rapa Therapeutics, Llc Method for t cell de-differentiation and resulting cells
CA3118936A1 (en) 2018-11-16 2020-05-22 Encoded Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating wilson's disease
JP2022513652A (ja) 2018-11-28 2022-02-09 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 機能および抑制性環境に対する抵抗性を増強するための免疫細胞のマルチプレックスゲノム編集
MX2021006393A (es) 2018-11-29 2021-10-13 Univ Texas Metodos para expansion ex vivo de celulas exterminadoras naturales y uso de las mismas.
JP7016102B2 (ja) 2018-12-06 2022-02-04 キリンホールディングス株式会社 Ｔ細胞又はｎｋ細胞の製造方法、ｔ細胞又はｎｋ細胞の培養用培地、ｔ細胞又はｎｋ細胞の培養方法、未分化ｔ細胞の未分化状態を維持する方法及びｔ細胞又はｎｋ細胞の増殖促進剤
AU2019396450A1 (en) 2018-12-11 2021-06-24 University Of Rochester Methods of treating schizophrenia and other neuropsychiatric disorders
US20220056413A1 (en) 2018-12-21 2022-02-24 Kyoto University Lubricin-localized cartilage-like tissue, method for producing same and composition comprising same for treating articular cartilage damage
EP3903884A4 (en) 2018-12-26 2023-01-25 Kirin Holdings Kabushiki Kaisha MODIFIED TCR AND MANUFACTURING PROCESS THEREOF
US20230057355A1 (en) 2019-02-13 2023-02-23 University Of Rochester Gene networks that mediate remyelination of the human brain
US20220145255A1 (en) 2019-02-26 2022-05-12 Tohoku University Method for producing osteoblast cluster using ips cells
JPWO2020230832A1 (ko) 2019-05-15 2020-11-19
CA3141455A1 (en) 2019-05-20 2020-11-26 Ajinomoto Co., Inc. Expansion culture method for cartilage or bone precursor cells
US10501404B1 (en) 2019-07-30 2019-12-10 Factor Bioscience Inc. Cationic lipids and transfection methods
JP7058431B2 (ja) 2019-12-12 2022-04-22 国立大学法人千葉大学 巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤
TW202146646A (zh) 2020-02-28 2021-12-16 美商千禧製藥公司 用於自富潛能幹細胞生產自然殺手細胞之方法
CN115516084A (zh) 2020-03-31 2022-12-23 国立大学法人京都大学 T细胞祖细胞的制造方法
EP4159846A1 (en) 2020-05-26 2023-04-05 Healios K.K. Hypoimmunogenic cells
EP3922431A1 (en) 2020-06-08 2021-12-15 Erasmus University Medical Center Rotterdam Method of manufacturing microdevices for lab-on-chip applications
CN115885038A (zh) 2020-06-17 2023-03-31 国立大学法人京都大学 表达嵌合抗原受体的免疫活性细胞
JP7429294B2 (ja) 2020-07-13 2024-02-07 国立大学法人京都大学 骨格筋前駆細胞及びその精製方法、筋原性疾患を治療するための組成物、並びに骨格筋前駆細胞を含む細胞群の製造方法
EP4180514A1 (en) 2020-07-20 2023-05-17 Aichi Medical University Composition for undifferentiated maintenance culture of pluripotent cells, medium for undifferentiated maintenance culture of pluripotent cells, maintenance culture method in undifferentiated state of pluripotent cells, and method for producing pluripotent cells
US20230265456A1 (en) 2020-08-10 2023-08-24 Fundacion Para La Investigacion Medica Aplicada Gene therapy vector expressing cyp27a1 for the treatment of cerebrotendinous xanthomatosis
EP4202041A1 (en) 2020-08-18 2023-06-28 Kyoto University Method for maintaining and amplifying human primordial germ cells / human primordial germ cell-like cells
CN116018402A (zh) 2020-09-04 2023-04-25 心脏康复株式会社 iPS细胞的品质改善剂、iPS细胞的制备方法、iPS细胞、及iPS细胞制备用组合物
CN116323941A (zh) 2020-09-29 2023-06-23 吉尼松公司 通过诱导抗肌萎缩蛋白相关蛋白调节元件内的突变增强细胞中抗肌萎缩蛋白相关蛋白表达及其治疗用途
US20230051406A1 (en) 2020-11-13 2023-02-16 Catamaran Bio, Inc. Genetically modified natural killer cells and methods of use thereof
JP2023553701A (ja) 2020-12-16 2023-12-25 ウニベルシタット ポンペウ ファブラ 先天性筋ジストロフィーの処置のための治療用ｌａｍａ２ペイロード
US20240091382A1 (en) 2020-12-23 2024-03-21 Vivet Therapeutics Minimal bile acid inducible promoters for gene therapy
WO2022196714A1 (ja) 2021-03-17 2022-09-22 アステラス製薬株式会社 塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）遺伝子が導入されたペリサイト
AU2022255166A1 (en) 2021-04-07 2023-09-28 Century Therapeutics, Inc. Compositions and methods for generating alpha-beta t cells from induced pluripotent stem cells
IL307358A (en) 2021-04-07 2023-11-01 Century Therapeutics Inc Compounds and methods for generating gamma-delta T cells from induced pluripotent stem cells
CN117597433A (zh) 2021-04-30 2024-02-23 国立研究开发法人理化学研究所 视网膜色素上皮细胞的条状聚集体、用于制造其的装置和制造方法、以及含有该条状聚集体的治疗药物
JPWO2022255489A1 (ko) 2021-06-04 2022-12-08
CA3222761A1 (en) 2021-06-10 2022-12-15 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing mesenchymal stem cells
BR112023026141A2 (pt) 2021-06-15 2024-03-05 Takeda Pharmaceuticals Co Métodos para produzir uma população de células enriquecida em células nk, para produzir células nk derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas, para tratar um sujeito em necessidade de terapia de células e para produzir uma população de células compreendendo células progenitoras hematopoiéticas cd34+, e, populações de células nk e de células não classificadas
EP4372079A1 (en) 2021-07-15 2024-05-22 Astellas Pharma Inc. Pericyte-like cells expressing vascular endothelial growth factor (vegf) at high level
JPWO2023286834A1 (ko) 2021-07-15 2023-01-19
WO2023003025A1 (ja) 2021-07-21 2023-01-26 国立大学法人京都大学 網膜組織の製造方法
JPWO2023017848A1 (ko) 2021-08-11 2023-02-16
CN118159646A (zh) 2021-09-13 2024-06-07 富士胶片细胞动力公司 产生定向心脏祖细胞的方法
CA3232099A1 (en) 2021-09-23 2023-03-30 Adam Ezra Cohen Genetically encoded voltage indicators and uses thereof
WO2023053220A1 (ja) 2021-09-28 2023-04-06 公益財団法人京都大学ｉＰＳ細胞研究財団 多能性幹細胞の製造方法
US20230123017A1 (en) * 2021-10-18 2023-04-20 Wisconsin Alumni Research Foundation Systems and methods for label-free tracking of human somatic cell reprogramming
WO2023069987A1 (en) 2021-10-20 2023-04-27 University Of Rochester Rejuvenation treatment of age-related white matter loss cross reference to related application
AU2022371162A1 (en) 2021-10-20 2024-04-04 University Of Rochester Method for rejuvenating glial progenitor cells and rejuvenated glial progenitor cells per se
WO2023069843A1 (en) 2021-10-20 2023-04-27 University Of Rochester Humanized chimeras for the prospective assessment of cell addition and replacement therapies
CA3236365A1 (en) 2021-11-02 2023-05-11 University Of Rochester Tcf7l2 mediated remyelination in the brain
CA3238206A1 (en) 2021-11-11 2023-05-19 Healios K.K. Gene-modified pluripotent stem cell, immunocompetent cell derived therefrom, method for producing said cells, and use thereof
WO2023150557A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 University Of Rochester Methods of generating a population of neurons from human glial progenitor cells and genetic constructs for carrying out such methods
WO2023215455A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 University Of Rochester Dual macroglial-microglial approach towards therapeutic cell replacement in neurodegenerative and neuropsychiatric disease
WO2023240147A1 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Century Therapeutics, Inc. Genetically engineered cells expressing cd16 variants and nkg2d and uses thereof
US20240139256A1 (en) 2022-09-30 2024-05-02 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Methods for the production of cardiac fibroblasts

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4228457A1 (de) 1992-08-27 1994-04-28 Beiersdorf Ag Herstellung von heterodimerem PDGF-AB mit Hilfe eines bicistronischen Vektorsystems in Säugerzellen
DE4228458A1 (de) 1992-08-27 1994-06-01 Beiersdorf Ag Multicistronische Expressionseinheiten und deren Verwendung
FR2722208B1 (fr) 1994-07-05 1996-10-04 Inst Nat Sante Rech Med Nouveau site interne d'entree des ribosomes, vecteur le contenant et utilisation therapeutique
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
US6667176B1 (en) * 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US20040199935A1 (en) * 1999-06-30 2004-10-07 Chapman Karen B. Cytoplasmic transfer to de-differentiate recipient cells
AU6842001A (en) * 2000-06-15 2001-12-24 Tanja Dominko Pluripotent mammalian cells
US20040235173A1 (en) 2000-07-03 2004-11-25 Gala Design, Inc. Production of host cells containing multiple integrating vectors by serial transduction
US20020136709A1 (en) * 2000-12-12 2002-09-26 Nucleus Remodeling, Inc. In vitro-derived adult pluripotent stem cells and uses therefor
US20030044976A1 (en) * 2001-08-27 2003-03-06 Advanced Cell Technology De-differentiation and re-differentiation of somatic cells and production of cells for cell therapies
JP2004248505A (ja) 2001-09-21 2004-09-09 Norio Nakatsuji 移植抗原の一部または全てを欠除したｅｓ細胞由来の未分化な体細胞融合細胞およびその製造
ITMI20012110A1 (it) 2001-10-12 2003-04-12 Keryos Spa Vettori multi-cistronici utilizzabili in protocolli di trsferimento genico
GB2399819B (en) 2001-12-24 2005-12-28 Es Cell Int Pte Ltd Method and lentiviral vector for transducing human embryonic stem cells
GB0202149D0 (en) * 2002-01-30 2002-03-20 Univ Edinburgh Pluripotency determining factors and uses thereof
GB0206357D0 (en) 2002-03-18 2002-05-01 Univ Bath Cells
DK1572984T3 (en) * 2002-12-16 2016-06-13 Technion Res & Dev Foundation FEEDER CELL-FREE, XENOPHRIC CULTIVATION SYSTEM FOR HUMAN EMBRYONAL STEM CELLS
US20060128018A1 (en) 2003-02-07 2006-06-15 Zwaka Thomas P Directed genetic modifications of human stem cells
US7682828B2 (en) 2003-11-26 2010-03-23 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods for reprogramming somatic cells
JP4901471B2 (ja) * 2004-02-19 2012-03-21 国立大学法人京都大学 体細胞核初期化物質のスクリーニング方法
WO2005086845A2 (en) * 2004-03-10 2005-09-22 Regents Of The University Of California Compositions and methods for growth of embryonic stem cells
KR100484653B1 (ko) 2004-05-06 2005-04-20 주식회사 대웅 원핵세포에서 활성형의 가용성 단백질을 제조하는 방법 및 이를 위한 폴리시스트론 벡터
US7465580B2 (en) 2004-05-19 2008-12-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Non-cytotoxic oriP replicon
US20070232590A1 (en) 2004-06-18 2007-10-04 Glaxo Group Limited 3-Cylcoalkylbenzazepines as Histamine H3 Antagonists
JP2009506769A (ja) 2005-09-02 2009-02-19 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ 間充織幹細胞誘導方法
US20070087437A1 (en) 2005-10-14 2007-04-19 Jifan Hu Methods for rejuvenating cells in vitro and in vivo
CN103113463B (zh) 2005-12-13 2015-02-18 国立大学法人京都大学 核重新编程因子
US8278104B2 (en) 2005-12-13 2012-10-02 Kyoto University Induced pluripotent stem cells produced with Oct3/4, Klf4 and Sox2
JP4803584B2 (ja) 2006-02-08 2011-10-26 独立行政法人産業技術総合研究所 脂質生産性の高い形質転換微生物
US8809045B2 (en) 2006-07-07 2014-08-19 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Human artificial chromosome (HAC) vector and human cell medicine comprising same
US20100137202A1 (en) 2006-07-19 2010-06-03 University Of Florida Research Foundation Compositions for reprogramming a cell and uses therefor
JP2008067693A (ja) 2006-08-15 2008-03-27 Ishihara Sangyo Kaisha Ltd 微生物変異体の新規利用方法
US20110318792A1 (en) 2006-08-15 2011-12-29 Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd. Novel method for utilization of microbial mutant
KR20090043559A (ko) 2006-08-15 2009-05-06 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치 중간엽 줄기세포 조절배지
US20100069251A1 (en) 2006-09-15 2010-03-18 Children's Medical Center Corporation Methods for producing embryonic stem cells from parthenogenetic embryos
US8440461B2 (en) 2007-03-23 2013-05-14 Wisconsin Alumni Research Foundation Reprogramming somatic cells using retroviral vectors comprising Oct-4 and Sox2 genes
EP2164993B1 (en) 2007-05-29 2016-09-21 Christopher B. Reid Methods for production and uses of multipotent cell populations, pluripotent cell populations, differentiated cell populations, and hiv-resistant cell populations
JP2008307007A (ja) * 2007-06-15 2008-12-25 Bayer Schering Pharma Ag 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞
US20120282229A1 (en) 2007-08-01 2012-11-08 Christian Kannemeier Non-viral delivery of transcription factors that reprogram human somatic cells into a stem cell-like state
US9102919B2 (en) 2007-08-31 2015-08-11 Whitehead Institute For Biomedical Research WNT pathway stimulation in reprogramming somatic cells with nuclear reprogramming factors
US7615374B2 (en) 2007-09-25 2009-11-10 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of clonal mesenchymal progenitors and mesenchymal stem cell lines under serum-free conditions
US20110236971A2 (en) 2007-09-25 2011-09-29 Maksym Vodyanyk Generation of Clonal Mesenchymal Progenitors and Mesenchymal Stem Cell Lines Under Serum-Free Conditions
WO2009057831A1 (ja) 2007-10-31 2009-05-07 Kyoto University 核初期化方法
WO2009061442A1 (en) * 2007-11-06 2009-05-14 Children's Medical Center Corporation Method to produce induced pluripotent stem (ips) cells form non-embryonic human cells
WO2009067563A1 (en) 2007-11-19 2009-05-28 The Regents Of The University Of California Generation of pluripotent cells from fibroblasts
EP2072618A1 (en) 2007-12-14 2009-06-24 Johannes Gutenberg-Universität Mainz Use of RNA for reprogramming somatic cells
US9206439B2 (en) 2008-01-14 2015-12-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Efficient oriP/EBNA-1 plasmid vector
WO2009092042A1 (en) 2008-01-18 2009-07-23 Nevada Cancer Institute Reprogramming of differentiated progenitor or somatic cells using homologous recombination
WO2009102983A2 (en) * 2008-02-15 2009-08-20 President And Fellows Of Harvard College Efficient induction of pluripotent stem cells using small molecule compounds
EP2268809B1 (en) 2008-05-02 2019-02-06 Kyoto University Method of nuclear reprogramming
EP3112456A1 (en) 2008-06-04 2017-01-04 Cellular Dynamics International, Inc. Methods for the production of ips cells using non-viral approach
WO2010012077A1 (en) 2008-07-28 2010-02-04 Mount Sinai Hospital Compositions, methods and kits for reprogramming somatic cells
US9175268B2 (en) 2008-08-12 2015-11-03 Cellular Dynamics International, Inc. Methods for the production of iPS cells
WO2010028019A2 (en) 2008-09-03 2010-03-11 The General Hospital Corporation Direct reprogramming of somatic cells using non-integrating vectors
EP3450545B1 (en) 2008-10-24 2023-08-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Pluripotent stem cells obtained by non-viral reprogramming

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