TW201945364A - 增殖抑制劑 - Google Patents

Abstract

本發明係有關一種Ki67陽性細胞經減低之胰島素產生細胞團或胰島β細胞團之製造方法，該製造方法係包含將內分泌前驅細胞或處於之後的分化階段之細胞團以FGFR1抑制劑處理。

Description

增殖抑制劑

本發明係有關將存在於從多潛能幹細胞分化誘導而得之產胰島素細胞團或胰島β細胞團中的具有高增殖性之Ki67陽性細胞去除之方法。

從iPS細胞(induced pluripotent stem cell，誘導性多潛能幹細胞)或ES細胞(Embryonic stem cell，胚胎幹細胞)等多潛能幹細胞分化誘導出稱為產胰島素細胞或胰島β細胞之胰島素分泌細胞，而應用於治療糖尿病的研究正在進行。

至今為止，開發/報告有從多潛能幹細胞分化誘導為胰島素分泌細胞之各種手法。於非專利文獻1記載有將源自人類iPS細胞之內分泌前驅細胞藉由使用屬於織維母細胞增殖因子受體(FGFR)的一種抑制劑之CAS192705-79-6(1-[2-胺基-6-(3,5-二甲氧基苯基)-吡啶并(2,3-d)嘧啶-7-基]-3-第三丁基脲)進行處理，可促進該細胞之分化。

又，已公知對於阻礙蛋白質酪胺酸激酶為有效的吡啶并(2,3-d)嘧啶及

啶化合物，且報告該化合物係有用於動脈粥樣硬化症、再狹窄(restenosis)及癌細胞增殖疾病的治療(專利文獻1)。

此外，關於CAS192705-79-6，確認到會抑制大鼠肌母細胞(rat myoblast cell)中由於bFGF刺激造成之細胞增殖，而未抑制由PDGE刺激造成之細胞增殖，而且，會抑制於人類胎盤血管中之微小血管伸長，暗示可利用作為將腫瘍增殖或動脈硬化性斑(atherosclerotic plaque)之新血管形成作為標的之抗增殖劑/抗血管形成劑(非專利文獻2)。

另一方面，至今為止對於在將源自多潛能幹細胞之內分泌前驅細胞團或於之後的分化階段之細胞團進一步分化誘導而得之產胰島素細胞團或胰島β細胞團當中，係混雜存在著具有高增殖性之細胞一事係屬未知，而且並未對於去除該等細胞進行檢討。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]WO96/15128

[非專利文獻]

[非專利文獻1]Scientific Reports 6, Article number：35908(2016)

[非專利文獻2]The journal of Pharmacology and Experimental, Therapeutics,July 1998, Vol.286(1), p.569-577

本案之發明人等發現：在從多潛能幹細胞所分化誘導之產胰島素細胞或胰島β細胞之細胞團中，係同時存在著該等胰島素分泌細胞(產胰島素細胞及胰島β細胞)及以Ki67標記陽性為特徵之增殖性高之細胞(以下，記載為「Ki67陽性細胞」)。

當欲將所分化誘導之胰島素分泌細胞應用於治療糖尿病等之情形下，從安全性之觀點來看，嚴密地控制胰島素分泌細胞以外之細胞是極為重要的。又，具有高增殖性的細胞之混入/殘存係有對受體造成不良影響或影響到所移殖之胰島素分泌細胞的長期存活之疑慮，故為不佳。

故而，本發明的目的在於提供去除與經分化誘導之胰島素分泌細胞同時存在的具有高增殖性之Ki67陽性細胞之手法。

本案發明人等係為了解決上述課題而進行深入研究，結果發現：藉由將從多潛能幹細胞分化誘導而得之內分泌前驅細胞團或處於之後的分化階段之細胞團以FGFR1抑制劑進行處理，能夠抑制Ki67陽性細胞的增殖，而獲得Ki67陽性細胞含量減低之產胰島素細胞團或胰島β細胞團。

本發明係以該等新穎知識為基礎者，包含以下之發明。

[1]一種方法，該方法為產胰島素細胞團或胰島β細胞團之製造方法；該方法包含：將產胰島素細胞團或胰島β細胞團以FGFR1抑制劑進行處理之步驟。

[2]如[1]之方法，其中，該方法更包含：使經FGFR1抑制劑處理之產胰島素細胞團進行分化之步驟。

[3]如[1]或[2]之方法，其中，該方法係將產胰島素細胞團或胰島β細胞團以未達5μM之FGFR1抑制劑進行處理。

[4]如[1]至[3]中任一項之方法，其中，該方法所製造之細胞團係含有比例為未達3%之Ki67陽性細胞。

[5]如[1]至[4]中任一項之方法，其中，該FGFR1抑制劑為1-[2-胺基-6-(3,5-二甲氧基苯基)-吡啶并(2,3-d)嘧啶-7-基]-3-第三丁基脲或其鹽。

[5-1]如[1]至[4]中任一項之方法，其中，該FGFR1抑制劑係FGFR1之50%阻礙濃度(IC₅₀)為1μM以下之物質。

[5-2]如[1]至[4]中任一項之方法，其中，該FGFR1抑制劑為1-[2-胺基-6-(3,5-二甲氧基苯基)-吡啶并(2,3-d)嘧啶-7-基]-3-第三丁基脲(CAS No.：192705-79-6)、E-3810(CAS No.：1058137-23-7)、PD-173074(CAS No.：219580-11-7)、FGFR4-IN-1(CAS No.：1708971-72-5)、FGFR-IN-1(CAS No.：1448169-71-8)、FIIN-2(CAS No.：1633044-56-0)、AZD4547(CAS No.：1035270-39-3)、FIIN-3(CAS No.：1637735-84-2)、NVP-BGJ398(CAS No.：1310746-10-1)、NVP-BGJ398(CAS No.：872511-34-7)、CH5183284(CAS No.：1265229-25-1)、Derazantinib(CAS No.：1234356-69-4)、Derazantinib Racemate、Ferulic acid(CAS No.：1135-24-6)、SSR128129E(CAS No.：848318-25-2)、SSR128129E free acid(CAS No.：848463-13-8)、Erdafitinib(CAS No.：1346242-81-6)、BLU9931(CAS No.：1538604- 68-0)、PRN1371(CAS No.：1802929-43-6)、S49076(CAS No.：1265965-22-7)、LY2874455(CAS No.：1254473-64-7)、Linsitinib(CAS No.：867160-71-2)、Dovitinib(CAS No.：405169-16-6)、Anlotinib(CAS No.：1058156-90-3)、Brivanib(CAS No.：649735-46-6)、Derazantinib(CAS No.：1234356-69-4)、Anlotinib Dihydrochloride(CAS No.：1360460-82-7)、ACTB-1003(CAS No.：939805-30-8)、BLU-554(CAS No.：1707289-21-1)、Rogaratinib(CAS No.：1443530-05-9)、BIBF 1120 esylate(CAS No.：656247-18-6)、TG 100572 Hydrochloride(CAS No.：867331-64-4)、ENMD-2076(CAS No.：934353-76-1)、Brivanib alaninate(CAS No.：649735-63-7)、TG 100572(CAS No.：867334-05-2)、BIBF 1120(CAS No.：656247-17-5)、ENMD-2076 Tartrate(CAS No.：1291074-87-7)、TSU-68(CAS No.：252916-29-3)、Ponatinib(CAS No.：943319-70-8)、Sulfatinib(CAS No.：1308672-74-3)、LY2784544(CAS No.：1229236-86-5)、Dovitinib lactate(CAS No.：692737-80-7)、SU 5402(CAS No.：215543-92-3)、FGF-401(CAS No.：1708971-55-4)Tyrosine kinase-IN-1(CAS No.：705946-27-6)、PP58(CAS No.：212391-58-7)、TG 100801 Hydrochloride(CAS No.：1018069-81-2)、Crenolanib(CAS No.：670220-88-9)、TG 100801(CAS No.：867331-82-6)、Pazopanib Hydrochloride(CAS No.：635702-64-6)、Pazopanib(CAS No.：444731-52-6)、PD168393(CAS No.：194423-15-9)、Apatinib(CAS No.：1218779-75-9)、Palbociclib isethionate(CAS No.：827022-33-3)、 Foretinib(CAS No.：849217-64-7)、Lenvatinib(CAS No.：417716-92-8)、Tandutinib(CAS No.：387867-13-2)或該等之鹽。

[6]如[2]至[5]中任一項之方法，其中，使經FGFR1抑制劑處理之產胰島素細胞團進行分化之步驟係藉由移殖至動物而進行。

[7]一種方法，該方法為製造產胰島素細胞團或胰島β細胞團之方法；該方法包含：將內分泌前驅細胞或處於之後的分化階段之細胞團以未達5μM之FGFR1抑制劑進行處理之步驟。

[8]一種方法，該方法為存在於內分泌前驅細胞或處於之後的分化階段之細胞團中之Ki67陽性細胞減少或抑制其增殖之方法；該方法包含：將該細胞團以FGFR1抑制劑進行處理。

[8-1]一種方法，該方法為為抑制存在於內分泌前驅細胞團或處於之後的分化階段之細胞團中之Ki67陽性細胞的增殖之方法；該方法包含：將該細胞團以FGFR1抑制劑進行處理。

[8-2]如[8]之方法，其中，該方法為使存在於前述細胞團中之Ki67陽性細胞之絶對數減少。

[8-3]如[8]、[8-1]、[8-2]中任一項之方法，其中，該方法係不使細胞之數目減少，該細胞係存在於前述細胞團中之內分泌前驅細胞或處於之後的分化階段之細胞，且不為Ki67陽性細胞。

[9]如[8]至[8-3]中任一項之方法，其中，該內分泌前驅細胞或處於之後的分化階段之細胞團為產胰島素細胞團。

[10]如[8]至[9]中任一項之方法，其中，該方法為將內分泌前驅細胞或處於之後的分化階段之細胞團以未達5μM之FGFR1抑制劑進行處理。

[11]如[8]至[10]中任一項之方法，其中，該FGFR1抑制劑為1-[2-胺基-6-(3,5-二甲氧基苯基)-吡啶并(2,3-d)嘧啶-7-基]-3-第三丁基脲或其盬。

[12]一種細胞團，該細胞團係胰前驅細胞或處於之後的分化階段之細胞團，該細胞團含有比例為未達3%之Ki67陽性細胞。

[12-1]一種細胞團，該細胞團係胰前驅細胞或處於之後的分化階段之細胞團，該細胞團含有比例為未達2%之Ki67陽性細胞。

[12-2]一種細胞團，該細胞團係胰前驅細胞或處於之後的分化階段之細胞團，該細胞團含有比例為未達1%之Ki67陽性細胞。

[12A]一種細胞團，該細胞團係內分泌前驅細胞或處於之後的分化階段之細胞團，該細胞團含有比例為未達3%之Ki67陽性細胞。

[12A-1]一種細胞團，該細胞團係內分泌前驅細胞或處於之後的分化階段之細胞團，該細胞團含有比例為未達2%之Ki67陽性細胞。

[12A-2]一種細胞團，該細胞團係內分泌前驅細胞或處於之後的分化階段之細胞團，該細胞團含有比例為未達1%之Ki67陽性細胞。

[13]如[12]至1[12-2]中任一項之細胞團，其中，該細胞團為產胰島素細胞團。

[14]如[12]至[13]之細胞團，該細胞團係使用於移殖用。

[14-1]一種醫藥，該醫藥係含有[12]至[13]之細胞團。

[14-2]一種前驅藥物(prodrug)，該前驅藥物係含有[12]至[13]之細胞團。

[15]一種方法，該方法為產胰島素細胞團或胰島β細胞團之製造方法；該方法包含：(0)包含本說明書中所記載之任一種方法(例如，段落[0058]至[0106]之任一種方法)之步驟、(1)將產胰島素細胞團或胰島β細胞團以FGFR1抑制劑進行處理之步驟、及(2)使經FGFR1抑制劑處理之產胰島素細胞團進行分化之步驟。

[16]一種方法，該方法為產胰島素細胞團或胰島β細胞團之製造方法；該方法包含：(1)將產胰島素細胞團或胰島β細胞團以FGFR1抑制劑進行處理之步驟、及(2)於含有藻酸之凝膠中將產胰島素細胞團包埋之步驟。

[17]一種方法，該方法為產胰島素細胞團或胰島β細胞團之製造方法，該方法包含：(0)藉由將標的細胞團純化之方法將標的細胞團之純度設成至少70%以上之步驟、(1)將產胰島素細胞團或胰島β細胞團以FGFR1抑制劑進行處理之步驟、及(2)使經FGFR1抑制劑處理之產胰島素細胞團進行分化之步驟。

[18]一種糖尿病的治療方法，該方法係包含將經FGFR1抑制劑處理之細胞團進行移殖之步驟。

本說明書包含本案的優先權基礎案之日本專利申請第2018-082606號之說明書及/或圖式所記載之內容。

本說明書中所引用之所有刊物、專利及專利申請案係直接參考並併入本說明書中。

根據本發明，可提供一種將與經分化誘導之胰島素分泌細胞同時存在的具有高增殖性之Ki67陽性細胞予以去除之手法。

第1圖係表示將移殖片的解剖檢查所見及免疫組織染色之結果，該移殖片係將以FGFR1抑制劑處理(或未處理)而得之產胰島素細胞團進行移殖，並於5週後摘出者。黑色箭頭：表示移殖片。

1.用語

以下，對於本說明書記載之用語加以說明。

於本說明書中之「約」，係表示相對於基準值為分別在25%、20%、10%、8%、6%、5%、4%、3%、2%或1%以內正或負地變 動之值。較佳為「約」或「大約」之用語係表示相對於基準值為分別在正或負的15%、10%、5%或1%之範圍。

於本說明書中，「含~(comprise(s)或comprising)」表示包含該語句所接續之要素，惟所指並不限於此。因此，雖暗示包含該語句所接續之要素，但並非暗示排除其它之任意要素。

於本說明書中，「由~構成(consist(s)of或consisting of)」係指包含該語句所接續之所有要素，且只限於包含該等要素。因此，「由~構成」之語句表示要求或必須為所列舉之要素，其它要素則係實質上不存在。

於本說明書中，「未使用餵養細胞」意指基本上不含餵養細胞，不使用因培養餵養細胞而經預處理(preconditioning)的培養基等。因此，在培養基中不含由餵養細胞分泌的成長因子及細胞激素(cytokine)等物質。

又，「餵養細胞(feeder cell)」或「餵養者(feeder)」係指與其它種類之細胞共同培養而支持該細胞，以提供可進行成長的環境之細胞。餵養細胞與該等所支持之細胞可為源自相同物種，亦可為源自不同物種。例如，就人類細胞的餵養者而言，可使用人類皮膚織維母細胞或人類胚胎幹細胞，亦可使用小鼠胚織維母細胞之初代培養物及永生化小鼠胚織維母細胞。餵養細胞可藉由放射線照射或絲裂黴素C(Mitomycin C)處理等而失活化。

於本說明書中，「黏附」係指細胞附著於容器，例如：細胞於適當之培養基存在下附著於滅菌塑膠(或經塗覆之塑膠)的細胞培養皿或燒瓶。細胞中亦有若不使其黏附於細胞培養容器便無法於培養物中維持或無法成長者。相對於此，非黏附性細胞則為不黏附於容器，可於培養物中維持、增殖。

於本說明書中，「培養」係指使細胞於體外環境中維持、成長且/或分化。「進行培養」係意指於組織或體外，例如於細胞培養皿或燒瓶中使細胞存續、增殖且/或分化。培養係包含2維培養(平面培養)或3維培養(浮遊培養)。

於本說明書中，「使富集(enrich)」及「富集(enrichment)」係指使細胞組成物等組成物中的特定構成成分之量增加，「經富集化(enriched)」當用於說明細胞之組成物，例如當用於說明細胞團時，意指將特定構成成分之量與富集化前的細胞團中之該構成成分之比例相比較為有所增加之細胞團。例如可將細胞團等組成物與標的細胞型態關聯地進行富集化，因此，標的細胞型態之比例相較於富集化前之存在於細胞團內之標的細胞之比例為增加。細胞團亦可藉由於所屬技術領域為公知之細胞選擇及篩選方法而對標的細胞型態進行富集化。細胞團亦可藉由本說明書所記載之特定的篩選或選擇工序而富集化。於本發明之特定實施形態中，藉由將標的細胞團富集化之方法，細胞團關於標的細胞團能夠至少被富集化20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%。

於本說明書中，「損耗(deplete)」及「耗竭(depletion)」係指使細胞或細胞組成物等組成物中之特定構成成分之量減少、「耗盡(depleted)」當用於說明細胞或細胞之組成物，例如用於說明細胞團時，係指特定構成成分之量與耗盡前的細胞團中之該等構成成分之比例相比較為有所減少之細胞團。例如，可使細胞團等組成物係關於標的細胞型態為耗盡，因此，標的細胞型態的比例相較於耗盡前存在於細胞團內之標的細胞的比例為減少。細胞團亦可藉由於所屬技術領域為公知之細胞選擇及篩選方法，而使標的細胞型態耗盡。細胞團亦可藉由本說明書所記載之特定篩選或選擇工序而耗盡。於本發明之特定實施形態，係藉由使標的細胞團耗盡之方法，細胞團關於標的細胞團能夠至少減少(耗盡)50%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%。

於本說明書中，「進行純化(purify)」及「純化(purification)」係指將細胞組成物等組成物中之雜質取除，使特定之構成成分成為純粹者，「經純化(purified)」當用於說明細胞之組成物，例如用於說明細胞團時，係指雜質之量相較於經純化前細胞團中的該等構成成分之比例為減少，特定構成成分之純度為提昇之細胞團。例如，可將細胞團等組成物就標的細胞型態進行純化，因此，標的細胞型態之比例相較於存在於純化前的細胞團內之標的細胞的比例為增加。細胞團亦可藉由於所屬技術領域為公知之細胞選擇及篩選方法，而就標的細胞型態進行純化。細胞團亦可藉由本說明書中所記載之特定篩選或選擇工序來進行純化。於本發明之特定實施形態中，藉由將標的細胞團進行純化之方法，能夠使標 的細胞團之純度成為至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%或成為無法檢測出雜質(包含夾雜細胞)之程度。

於本說明書中，「未使細胞數目減少」係意指不因為本發明方法的實施而引起細胞數顯著地減少，而意指實施該方法前的細胞數與實施該方法後的細胞數之間並無顯著差別。惟，可能會產生原因不在於實施本發明方法之細胞數目減少(例如，於以往公知之細胞培養及分化步驟中通常會產生之細胞自然死亡等)。因此，「未使細胞數目減少」亦包括相較於實施本發明方法前的實施後細胞之減少率為30%以下、20%以下、10%以下或5%以下之情況。

於本說明書中，「抑制增殖」係意指以因為實施本發明方法而細胞數未顯著增加，意指在該方法實施前之細胞數與該方法實施後之細胞數之間並無顯著增加。亦包含相較於實施本發明方法之前，實施後之細胞增加率為30%以下、20%以下、10%以下或5%以下之情況。

於本說明書中，「標記」係意指「標記蛋白質」、「標記基因」等因既定之細胞型態而表現特異性之細胞抗原或其基因。較佳之標記為細胞表面標記，於該情況下，使可實施生存細胞之濃縮、分離及/或檢測。標記可為陽性選擇標記或陰性選擇標記。

標記蛋白質之檢測係可利用於該標記蛋白質係採用特異性抗體之免疫學分析，例如：ELISA、免疫染色、流動式細胞測量術(flow cytometry)來進行。標記基因之檢測係可利用於該領域為公知之核酸擴增方法及/或核酸檢測方法，例如可利用RT-PCR、微陣列(Microarray)、生物晶片(Biochip)等進行。於本說明書中，標記蛋白質為「陽性」係指 以流動式細胞測量術檢測出為陽性，「陰性」係指以流動式細胞測量術為檢測極限以下。又，標記基因為「陽性」係指藉由RT-PCR檢測出，「陰性」係指以RT-PCR為檢測極限以下。

於本說明書中，「表現(expression)」係定義為由細胞內之啟動子所驅動之特定的核苷酸序列之轉錄及/或轉譯。

於本說明書中，「具有CDK8/19阻礙活性之因子」係意指具有CDK8/19阻礙活性之所有物質。相對於同一CDK家族之其它蛋白質，CDK8對於細胞增殖來說並非必要，CDK8之阻礙於一般條件下的效果並不大。CDK19與CDK8如上所述而為類似，CDK8阻礙通常亦伴隨CDK19阻礙。

「增殖因子」為促進特定細胞的分化及/或增殖之內源性蛋白質(endogenous protein)。「增殖因子」可列舉例如：上皮成長因子(EGF)、酸性纖維母細胞生長因子(aFGF)、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)、肝細胞生長因子(HGF)、類胰島素生長因子1(IGF-1)、類胰島素生長因子2(IGF-2)、角質細胞生長因子(KGF)、神經生長因子(NGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、乙型轉化生長因子(TGF-β，Transforming Growth Factor-β)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)、運鐵蛋白(transferrin)、各種介白素(interleukin)(例如IL-1至IL-18)、各種群落刺激因子(colony stimulating factor)(例如顆粒球/巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-GSF))、各種干擾素(例如IFN-γ等)及對於幹細胞具有效果之其它細胞激素，例如幹細胞因子(SCF)及紅血球生成素(erythropoietin，Epo)。

於本說明書中，「ROCK抑制劑」係指阻礙Rho激酶(ROCK：Rho相關的卷曲螺旋型蛋白激酶，Rho-associated,coiled-coil containing protein kinase)之物質，可為阻礙ROCK I及ROCK II中之任一者之物質。ROCK抑制劑若是具有上述之功能即無特別限定，可列舉例如：N-(4-吡啶基)-4β-[(R)-1-胺基乙基]環己烷-1α-甲醯胺(本說明書中亦稱為Y-27632)、法舒地爾(Fasudil)(HA1077)、(2S)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-異喹啉基]磺醯基]六氫-1H-1,4-二氮呯(H-1152)、4β-[(1R)-1-胺基乙基]-N-(4-吡啶基)苯-1 α-甲醯胺(4β-[(1R)-1-aminoethyl]-N-(4-pyridyl)benzene-1α-carboxamide)(Wf-536)、N-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4PER(R)-1-胺基乙基]環己烷-1α-甲醯胺(Y-30141)、N-(3-{[2-(4-胺基-1,2,5-

二唑-3-基)-1-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基]氧基}苯基)-4-{[2-(4-嗎啉基)乙基]-氧基}苯甲醯胺(GSK269962A)、N-(6-氟-1H-吲唑-5-基)-6-甲基-2-側氧基-4-[4-(三氟甲基)苯基]-3,4-二氫-1H-吡啶-5-甲醯胺(GSK429286A)。ROCK抑制劑不只限於該等，亦可使用對於ROCK之mRNA為反意寡核苷酸(antisense oligonucleotides)或結合於siRNA、ROCK之抗體、顯性負ROCK突變體等亦可使用作為ROCK抑制劑，係可從商業方式取得，亦可依照公知之方法合成。

於本說明書中，所謂的「GSK3β抑制劑」係對於GSK3β(肝糖合成酶激酶3β，glycogen synthase kinase-3β)具有阻礙活性之物質。GSK3(肝糖合成酶激酶3)為一種絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶(serine-threonine protein kinase)，係參與肝糖之產生和細胞淍亡、幹細胞之維持等有所關聯之多種傳訊路徑。於GSK3存在有α及β這兩種異構 體。本發明所使用之「GSK3β抑制劑」若具有GSK3β阻礙活性即無特別限制，亦可為一併具有GSK3β阻礙活性以及GSK3α阻礙活性之物質。

GSK3β抑制劑可列示：CHIR98014(2-[[2-[(5-硝基-6-胺基吡啶-2-基)胺基]乙基]胺基]-4-(2,4-二氯苯基)-5-(1H-咪唑-1-基)嘧啶)、CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]胺基]乙基]胺基]菸鹼甲腈)、TDZD-8(4-苯甲基-2-甲基-1,2,4-噻二唑啶-3,5-二酮)、SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、TWS-119(3-[6-(3-胺基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基氧基]苯酚)、肯帕羅酮(Kenpaullone)、1-氮雜肯帕羅酮(Azakenpaullone)、SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、SB415286(3-[(3-氯-4-羥基苯基)胺基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮)及AR-AO144-18、CT99021、CT20026、BIO、BIO-丙酮肟、吡啶并咔唑-環戊二烯釕複合體、OTDZT、α-4-二溴苯乙酮、鋰等。GSK3β並不限定於該等，對於GSK3β之mRNA的反意寡核苷酸或siRNA、結合於GSK3β之抗體、顯性負GSK3β突變體等亦可使用作為GSK3β抑制劑，可以商業方式取得或依照公知之方法合成。

於本說明書中，「血清替代物」可列舉例如：Knockout血清替代物(Knockout Serum Replacement，KSR：Invitrogen)、StemSure血清替代物(StemSure Serum Replacement(Wako)、B-27補充劑、N2-補充劑、白蛋白(例如富含脂質的白蛋白(lipid rich albumin))、胰島素、運鐵蛋白、脂肪酸、膠原蛋白前驅物、微量元素(例如鋅、硒(例如亞硒酸鈉))、2-巰基乙醇、3’硫代甘油或該等之混合物(例如ITS-G)。血清替代 物較佳為B-27補充劑、KSR、StemSure Serum Replacement、ITS-G。於培養基中添加血清替代物時，培養基中之濃度為0.01至10重量%，較佳為0.1至2重量%。於本發明中，較佳為使用「血清替代物」來取代血清。

2.Ki67陽性細胞的增殖被抑制之內分泌前驅細胞團或處於之後的分化階段之細胞團

本發明係有關於Ki67陽性細胞增殖被抑制之內分泌前驅細胞團或處於之後的分化階段之細胞團，該等細胞團可藉由以FGFR1抑制劑進行處理而獲得。

於本說明書中，「Ki67陽性細胞」係意指：於從多潛能幹細胞分化為胰島β細胞之過程中，於從多潛能幹細胞所分化誘導之至少為內分泌前驅細胞團或處於之後的分化階段之細胞團中，係與內分泌前驅細胞或處於之後的分化階段之細胞同時存在著以表現Ki67為標記而附予特徵之細胞。

「Ki67」為公知之與細胞周期相關的蛋白質，於增殖中的細胞之G1期、S期、G2期、M期中會確認到表現，而於增殖停止之G0期中則為未確認到表現，因此亦為已知的細胞增殖及細胞周期之標記。

於從多潛能幹細胞分化為胰島β細胞之過程中，已知會出現對應分化階段而具有不同特徵之細胞(WO2009/012428、WO2016/021734)。例如，該分化階段依相對較未分化之順序，可大致分類為：多 潛能幹細胞、胚胎內胚層細胞、原腸管細胞、後前腸(posterior foregut)細胞、胰前驅細胞、內分泌前驅細胞、產胰島素細胞、胰島β細胞大類。

於本說明書中，「多潛能(pluripotency)」意指可分化成具有各種不同的形態或功能之組織或細胞，亦能分化為3胚層之任一系統的細胞之能力。「多潛能(pluripotency)」無法分化為胚盤，因此並無形成個體的能力，就此點而言，係與能夠分化為包含胚盤在內的各種活體組織之「全潛能性(totipotency)」有所區別。

於本說明書中，「多分化能性(multipotency)」係指可以分化為複數種限定數量之系統的細胞之能力。例如：間葉系幹細胞、造血幹細胞、神經幹細胞係屬於多分化能(multipotent)，而非多潛能(pluripotent)。

於本說明書中，「多潛能幹細胞(pluripotent stem cell)」係指胚胎幹細胞(ES細胞)及具有與該細胞相同的分化多潛能性[亦即，具有分化為活體的各種組織(內胚層、中胚層、外胚層之全部)之潛在能力]之細胞。就具有與ES細胞相同的分化多潛能性之細胞而言，可列舉「人造多潛能幹細胞」(於本說明書中亦稱為「iPS細胞」)。於本發明中，較佳之多潛能幹細胞為人類多潛能幹細胞。

「ES細胞」若為小鼠ES細胞，可利用inGenious公司、理研公司等所建立之各種小鼠ES細胞株；若為人類ES細胞，則可利用NIH公司、理研公司、京都大學、Cellartis公司所建立之各種人類ES細胞株。例如，ES細胞株可利用：NIH公司之CHB-1至CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1至HUES28株等，WisCell Researh公司 之H1株、H9株，理研公司之KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等。

「人造多潛能幹細胞」係指藉由於哺乳動物體細胞或未分化幹細胞中導入特定的因子(核初期化因子)並進行重新編程(reprogramming)而獲得之細胞。現今，係有各種的「人造多潛能幹細胞」，除了可以使用由山中等人藉由於小鼠織維母細胞中導入Oct3/4‧Sox2‧Klf4‧c-Myc這四種因子而建立之iPS細胞(Takahashi K,Yamanaka S.,Cell,(2006)126：663-676)之外，亦可使用：於人類織維母細胞中導入相同的四種因子而建立之源自人類細胞之iPS細胞(Takahashi K,Yamanaka S.,et al,Cell,(2007)131：861-872)；於導入上述四種因子後，將Nanog之表現作為指標進行挑選而建立之Nanog-iPS細胞(Okita,K.,Ichisaka,T.,and Yamanaka,S.(2007),Nature 448,313-317.)；以未含有c-Myc之方法所製作之iPS細胞(Nakagawa M,Yamanaka S.,et al,Nature Biotechnology.(2008)26,101-106)；於無病毒(virusfree)下導入六種因子而建立之iPS細胞(Okita K et al,Nat.Methods 2011 May；8(5)：409-12,Okita K et al,Stem Cells,31(3)：458-66.)。此外，亦可使用由湯姆森(Thomson)等人所製作之導入OCT3/4‧SOX2‧NANOG‧LIN28這四種因子而建立之人造多潛能幹細胞(Yu J.,Thomson JA.et al,Science(2007)318：1917-1920.)、由Daley等人所製作之人造多潛能幹細胞(Park IH,Daley GQ.et al,Nature(2007)451：141-146)；由櫻田等人所製作之人造多潛能幹細胞(日本特開2008-307007號)等。

除此之外，亦可利用所有公開之論文(例如Shi Y.,Ding S.,et al,Cell Stem Cell,(2008)Vol 3,Issue 5,568-574；Kim JB.,Scholer HR.,et al,Nature,(2008)454,646-650；Huangfu D.,Melton,DA.,et al,Nature Biotechnology,(2008)26,No 7.795-797)或專利(例如：日本特開2008-307007號、日本特開2008-283972號、US2008/2336610、US2009/047263、WO2007/069666、WO2008/118220、WO2008/124133、WO2008/151058、WO2009/006930、WO2009/006997、WO2009/007852)中記載之於該領域為公知之任何人造多潛能幹細胞。

就人造多潛能細胞株而言，可利用NIH、理化學研究所(理研)、京都大學等所建立之各種iPS細胞株。例如，若為人類iPS細胞株，則可列舉：理研公司之HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株；京都大學之Ff-WJ-18株、Ff-I01s01株、Ff-I01s02株、Ff-I01s04株、Ff-I01s06株、Ff-I14s03株、Ff-I14s04株、QHJI01s01株、QHJI01s04株、QHJI14s03株、QHJI14s04株、253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株；CDI公司之MyCell iPS Cells(21525.102.10A)株、MyCell iPS Cells(21526.101.10A)株等。

於本說明書中，「胰前驅細胞團」係意指藉由胰前驅細胞附予特徵之細胞團。於本說明書中，胰前驅細胞係指藉由PDX-1、NKX6-1、PTF-1α、GATA4及SOX9中之至少一個標記的表現而附予特徵之細胞。

胰前驅細胞團係以30%以上，較佳為50%以上，更佳為70%以上之比例含有胰前驅細胞之細胞團。胰前驅細胞團中除了包含胰前驅細胞之外，亦可包含其它細胞(例如內分泌前驅細胞、產胰島素細胞、Ki67陽性細胞等)。

於本說明書中，所謂之「內分泌前驅細胞團」係意指藉由內分泌前驅細胞而附予特徵之細胞團。

於本說明書中，內分泌前驅細胞係意指特徵在於表現嗜鉻細胞分泌素A(Chromogranin A)、NeuroD及NGN-3中之至少一種標記及未表現胰關連荷爾蒙系(例如胰島素等)的標記之細胞。內分泌前驅細胞亦可表現PAX-4、NKX2-2、Islet-1、PDX-1、PTF-1α等標記。

內分泌前驅細胞團係以30%以上，較佳為50%以上，更佳為70%以上之比例含有內分泌前驅細胞之細胞團。內分泌前驅細胞團中除了含有內分泌前驅細胞之外，亦可含有其它細胞(例如胰前驅細胞、產胰島素細胞、Ki67陽性細胞等)。

細胞團中的特定細胞之比例，可以如流動式細胞測量術般能夠算出細胞數之公知手法為基礎而求得。

「處於之後的分化階段之細胞團」係指藉由就分化階段而言，係相較於分化為內分泌前驅細胞更往分化為胰島β細胞發展的細胞來附予特徵之細胞團。相較於分化為內分泌前驅細胞更往分化為胰島β細胞發展之細胞係以產胰島素細胞或胰島β細胞為較佳。

於本說明書中，「產胰島素細胞」係意指藉由確認到胰島素標記之表現且NGN3表現量為未達於內分泌前驅細胞所確認到之最大 表現時的3分之1比例而附予特徵之細胞。「產胰島素細胞」可表現NKX6.1之標記，較佳為表現胰島素及NKX6.1這兩者之標記，且NGN3表現量為未達於內分泌前驅細胞確認到之最大表現時的3分之1比例之細胞。

NGN3表現量可以定量RT-PCR進行測定。使用從處於既定階段的細胞以Cells-to-CT kit(Thermo Fisher Scientific公司)製作之cDNA，使用TaqMan探針/引子序列組合對NGN3及GAPDH進行測定後，將對於GAPDH的相對表現量設為NGN3之基因表現量。

「產胰島素細胞團」係以5%以上，較佳為15%以上，更佳為30%以上的比例含有產胰島素細胞之細胞團。於該細胞團中，除了含有產胰島素細胞之外，亦可含有其它細胞(例如：內分泌前驅細胞；表現升糖素(glucagon)、體抑素(somatostati)及胰多胜肽中之至少一種標記之其它產胰荷爾蒙細胞；Ki67陽性細胞等)。

產胰島素細胞團還可分為：於從內分泌前驅細胞之分化步驟中在初期階段出現之「前期產胰島素細胞團」及於再進一步分化的階段出現之「後期產胰島素細胞團」，後期產胰島素細胞團尤其可藉由以20%以上之比例含有胰島素陽性/NKX6.1陽性細胞(INS/NKX6.1兩陽性細胞)而附予特徵。

於本說明書中，「胰島β細胞」係指較「產胰島素細胞」更為成熟之細胞，具體而言，係指表現屬於胰島β細胞的成熟標記之MAFA、UCN3及IAPP中之至少一種標記，或因葡萄糖刺激造成胰島素分泌上昇反應而附予特徵之細胞。

「胰島β細胞團」係可藉由使內分泌前驅細胞團或處於之後的分化階段之細胞團分化/成熟而獲得之含有胰島β細胞之細胞團，較佳為可藉由於活體內進行分化/成熟而獲得之含有胰島β細胞之細胞團。該細胞團中除了含有胰島β細胞之外，亦可含有其它細胞(例如產胰島素細胞、Ki67陽性細胞等)。

內分泌前驅細胞團或處於之後的分化階段之細胞團可使用將多潛能幹細胞分化誘導為胰島β細胞之公知手法而獲得。亦即，可利用以下之分化誘導步驟來獲得各目的之細胞團：步驟1)從多潛能幹細胞分化誘導為胚胎內胚層細胞；步驟2)從胚胎內胚層細胞分化誘導為原腸管細胞；步驟3)從原腸管細胞分化誘導為後前腸細胞；步驟4)從後前腸細胞分化誘導為胰前驅細胞；步驟5)從胰前驅細胞分化誘導為內分泌前驅細胞；步驟6)從內分泌前驅細胞分化誘導為產胰島素細胞。

以下係就各步驟加以說明，惟往各種細胞的分化誘導並不只限於此等手法。

步驟1)分化誘導為胚胎內胚層細胞

首先，使多潛能幹細胞分化為胚胎內胚層細胞。從多潛能幹細胞誘導為胚胎內胚層之方法已為公知，可使用公知的任一種方法。多潛能幹細胞較佳為以含有活化素A之培養基進行培養，更佳為以含有活化素A、ROCK抑制劑、GSK3β抑制劑之培養基進行培養，而使其分化為胚胎內 胚層細胞。培養開始時之細胞數並無特別限制，係22000至150000cells/cm²，較佳為22000至100000cells/cm²，更佳為22000至80000cells/cm²。培養期間為1日至4日，較佳為1日至3日，特佳為3日。

培養溫度並無特別限制，係於30至40℃(例如37℃)進行。又，培養容器中的二氧化碳之濃度例如為5%左右。

就本步驟中使用之培養基而言，可使用：RPMI 1640培養基、MEM培養基、iMEM培養基、DMEM/F12培養基、Improved MEM Zinc Option培養基、ImprovedMEM/1%B27/青黴素 鏈黴素培養基、MCDB131/20mM葡萄糖/碳酸氫鈉/FAF-BSA/ITS-X/Glutamax/抗壞血酸/青黴素 鏈黴素培養基等，能夠使用於培養哺乳類細胞之基本培養基。。

活化素A於培養基中之濃度通常為30至200ng/mL，較佳為50至150ng/mL，更佳為70至120ng/mL，特佳為約100ng/mL。

作為另一態樣，於培養基中可以低用量含有活化素A，例如含有：5至100ng/mL，較佳為5至50ng/mL，更佳為5至10ng/mL之量。

作為其它之態樣，活化素A於培養基中之濃度為約0.1至100ng/mL，較佳為約1至50ng/mL，更佳為約3至10ng/mL。

GSK3β抑制劑於培養基中之濃度，係可根據使用的GSK3β抑制劑之種類而適當設定，例如：使用CHIR99021作為GSK3β抑制劑時之濃度通常為2至5μM，較佳為2至4μM，特佳為約3μM。

ROCK抑制劑於培養基中之濃度係根據使用的ROCK抑制劑之種類而適當設定，例如：使用Y27632作為ROCK抑制劑時之濃度通常為5至20μM，較佳為5至15μM，特佳為約10μM。

於培養基中可進一步添加胰島素。胰島素於培養基中係可以0.01至20μM之量含有，較佳為0.1至10μM，更佳為0.5至5μM。培養基中胰島素之濃度可為所添加之B-27補充劑中所含有之胰島素的濃度，惟併不限定於此。

具體而言，以含有活化素A、ROCK抑制劑、GSK3β抑制劑之培養基進行培養1日後，以只含有活化素A之培養基以每1日交換培養基之方式再培養2日。或者，可於低用量之活化素A存在下，將多潛能幹細胞於含有胰島素0.01至20μM之培養基中進行第1培養，接著，於未含有胰島素之培養基中進行第2培養，藉此製造之。

步驟2)分化為原腸管細胞

將於步驟1)獲得之胚胎內胚層細胞再以含有增殖因子之培養基進行培養，分化誘導為原腸管細胞。培養期間為2日至8日，較佳為約4日。

培養溫度並無特別限制，於30至40℃(例如37℃)進行。又，培養容器中的二氧化碳濃度係例如5%左右。培養可以是以2維培養及3維培養中之任一種來進行。

培養基與步驟1)相同，可以使用於培養哺乳類細胞中使用之基本培養基。培養基除了增殖因子之外，亦可適當地添加血清替代物、維生素、抗生物質等。

增殖因子較佳為EGF、KGF、FGF10，更佳為EGF及/或KGF，又更佳為KGF。

增殖因子於培養基中之濃度可依使用之增殖因子的種類而適當設定，通常為約0.1nM至1000μM，較佳為約0.1nM至100μM。為EGF時，其濃度為約5至2000ng/mL(亦即約0.8至320nM)，較佳為約5至1000ng/mL(亦即約0.8至160nM)，更佳為約10至1000ng/mL(亦即約1.6至160nM)。為FGF10時，其濃度為約5至2000ng/mL(亦即約0.3至116nM)，較佳為約10至1000ng/mL(亦即約0.6至58nM)，更佳為約10至1000ng/mL(亦即約0.6至58nM)。例如使用KGF作為增殖因子時之濃度通常為5至150ng/mL，較佳為30至100ng/mL，更佳為約50ng/mL。

步驟3)分化為後前腸細胞

將於步驟2)獲得之原腸管細胞再以含有增殖因子、環巴胺(cyclopamine)、Noggin等之培養基進行培養，分化誘導為後前腸細胞。培養期間為1日至5日，較佳為約2日左右。培養可以是進行2維培養及3維培養中之任一種。

培養溫度並無特別限制，係於30至40℃(例如37℃)進行。又，培養容器中的二氧化碳濃度例如為5%左右。

培養基與步驟1)相同，可使用於哺乳類細胞的培養中使用之基本培養基。培養基除了可添加增殖因子之外，亦可適當地添加血清替代物、維生素、抗生物質等。

增殖因子較佳為EGF、KGF、FGF10，更佳為EGF及/或KGF，又更佳為KGF。

增殖因子於培養基中之濃度可根據使用的增殖因子之種類而適當設定，通常為約0.1nM至1000μM，較佳為約0.1nM至100μM。為EGF時，其濃度為約5至2000ng/mL(亦即約0.8至320nM)，較佳為約5至1000ng/mL(亦即約0.8至160nM)，更佳為約10至1000ng/mL(亦即約1.6至160nM)。為FGF10時，其濃度為約5至2000ng/mL(亦即約0.3至116nM)，較佳為約10至1000ng/mL(亦即約0.6至58nM)，更佳為約10至1000ng/mL(亦即約0.6至58nM)。例如使用KGF作為增殖因子時之濃度通常為5至150ng/mL，較佳為30至100ng/mL，特佳為約50ng/mL。

環巴胺於培養基中之濃度並無特別限制，通常為0.5至1.5μM，較佳為0.3至1.0μM，特佳為約0.5μM。

Noggin於培養基中之濃度並無特別限制，惟通常為10至200ng/mL，較佳為50至150ng/mL，特佳為約100ng/mL。

步驟4)分化為胰前驅細胞

將於步驟3)獲得之後前腸細胞再以含有具有CDK8/19阻礙活性之因子之培養基進行培養，較佳為以含有具有CDK8/19阻礙活性之因子及增殖因子之培養基進行培養，分化誘導為胰前驅細胞。培養期間為2日至10日，較佳為約5日左右。培養可以是進行2維培養及3維培養中之任一種。

為2維培養時，將於步驟3)獲得之後前腸細胞依照過去報告(Toyoda et al,Stem cell Research(2015)14,185-197)，而於以0.25%胰蛋白酶-EDTA處理後藉由進行沖吸(pipetting)而分散，將0.25%胰蛋白酶-EDTA進行離心分離而懸浮後，再播種於步驟4之新的培養基中。

培養基與步驟1)相同，可使用於培養哺乳類細胞中使用之基本培養基。培養基中除了添加增殖因子之外，亦可適當地添加血清替代物、維生素、抗生物質等。

具有CDK8/19阻礙活性之因子可使用前述之各種化合物或其鹽，並對應所使用之化合物或其鹽而適當地決定於培養基中之添加量，惟通常為約0.00001μM至5μM，較佳為0.00001μM至1μM。就具有CDK8/19阻礙活性之因子於培養基中之濃度而言，較佳為對於CDK8/19可達到50%以上的阻礙活性之濃度。

增殖因子較佳為EGF、KGF、FGF10，更佳為KGF及/或EGF，又更佳為KGF及EGF。

增殖因子於培養基中之濃度可根據使用的增殖因子之種類而適當設定，惟通常為約0.1nM至1000μM，較佳為約0.1nM至100μM。為EGF時，其濃度為約5至2000ng/mL(亦即約0.8至320nM)，較佳為約5至1000ng/mL(亦即約0.8至160nM)，更佳為約10至1000ng/mL(亦即約1.6至160nM)。為FGF10時，其濃度為約5至2000ng/mL(亦即約0.3至116nM)，較佳為約10至1000ng/mL(亦即約0.6至58nM)，更佳為約10至1000ng/mL(亦即約0.6至58nM)。例如使用KGF及EGF作為增殖因子時之濃度，EGF通常為5至150ng/ mL，較佳為30至100ng/mL，特佳為約50ng/mL；KGF通常為10至200ng/mL，較佳為50至150ng/mL，特佳為約100ng/mL。

於步驟4)中培養最開始的第1日係於ROCK抑制劑存在下進行，之後亦可以未含ROCK抑制劑之培養基進行培養。

又，培養基中亦可含有PKC活化劑。PKC活化劑可使用PdBU(PKC activator II)、TPB(PKC actovator V)等，惟並不限於此。PKC活化劑之濃度係以約0.1至100ng/ml進行添加，較佳為約1至50ng/ml，更佳為約3至10ng/ml。

又，培養基中亦可添加二甲亞碸、活化素(1至50ng/ml)。

於任何一步驟中，皆可在培養基添加上述成分之外的血清替代物(例如B-27補充劑、ITS-G)。而且，亦可視需要而添加胺基酸、L-麩胺酸、GlutaMAX(商品名)、非必須胺基酸、維生素、菸鹼醯胺、抗生物質(例如Antibiotic-Antimycotic(於本說明書中，有稱為AA之情形)、青黴素、鏈黴素或該等之混合物)、抗菌劑(例如雙性黴素B(Amphotericin B)、抗氧化劑、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類等。於培養基中添加抗生物質時，於該培養基中之濃度通常為0.01至20重量%，較佳為0.1至10重量%。培養可以是進行2維培養及3維培養中之任一種。

又，細胞培養為2維培養時，係不使用餵養細胞，而以黏附培養進行。培養時，能夠使用皿、燒瓶、微量盤、OptiCell(商品名)(Nunc公司製造)等細胞培養片等之培養容器。培養容器較佳為經用以提昇與細胞之黏附性(親水性)的表面處理，或經塗覆膠原蛋白、明膠、聚-L-離胺酸、聚-D-離胺酸、層黏連蛋白(laminin)、纖維接合素、基質膠 (matrigel)(例如：BD Matrigel(日本Becton,Dickinson公司製造))、玻璃黏連蛋白(vitronectin)等細胞黏附用基質。培養容器較佳為經塗覆Type I膠原蛋白、基質膠、纖維接合素、玻璃黏連蛋白或聚-D-離胺酸等之培養容器，更佳為經塗覆基質膠或聚-D-離胺酸塗覆之培養容器。

培養溫度並無特別限制，係於30至40℃(例如37℃)進行。又，培養容器中的二氧化碳濃度係例如為5%左右。

於步驟4)獲得之胰前驅細胞可利用屬於公知之表面標記之糖蛋白質2(GP2)等而再純化。上述純化可使用本身為公知之方法，例如使用固定化有抗GP2抗體之珠粒來進行。

步驟5)分化為內分泌前驅細胞

將於步驟4)獲得之胰前驅細胞再以含有增殖因子之培養基進行培養，分化誘導為內分泌前驅細胞。培養可以是進行2維培養及3維培養中之任一種。於2維培養時，係將於步驟4)獲得之胰前驅細胞以0.25%胰蛋白酶-EDTA處理後藉由進行沖吸(pipetting)而分散，並將0.25%胰蛋白酶-EDTA進行離心分離而懸浮後，再播種於步驟5)之新培養基。培養期間為2日至3日，較佳為約2日。

培養基與步驟1)相同，可使用於培養哺乳類細胞中使用之基本培養基。培養基中可依照過去報告(Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133)而添加SANT1、視網酸(retinoic acid)、ALK5抑制劑II、T3、LDN，再者，亦可適當地添加Wnt阻礙藥、ROCK抑制劑、FGF(較佳為FGF2)、血清替代物、維生素、抗生物質等。

又，培養係不使用餵養細胞，而以非黏附培養進行。於培養時，能夠使用皿、燒瓶、微量盤、多孔盤(Nunc公司製造)等或生物反應器(bioreactor)。培養容器較佳為經過用以使與細胞的黏附性降低之表面處理。

培養溫度並無特別限制，係於30至40℃(例如37℃)進行。又，培養容器中的二氧化碳濃度例如為5%左右。

步驟6)分化為產胰島素細胞

將於步驟5)獲得之內分泌前驅細胞再以含有增殖因子之培養基進行培養，而分化誘導為產胰島素細胞。培養期間為10日至30日，較佳為約10至20日。

培養基與步驟1)相同，可使用於培養哺乳類細胞中使用之基本培養基。培養基可依照過去報告(Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133)而添加ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶(γ-secretase)抑制劑XX、γ-分泌酶抑制劑RO、N-半胱胺酸(N-cysteine)、AXL抑制劑、抗壞血酸，再者，亦可適當地添加Wnt阻礙藥、ROCK抑制劑、FGF(較佳為FGF2)、血清替代物、維生素、抗生物質等。例如於培養基中可添加ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶抑制劑RO及抗壞血酸，或亦可添加T3、ALK5抑制劑II、硫酸鋅、肝素、N-乙醯基半胱胺酸、Trolox及R428。

培養可以是進行2維培養及3維培養中之任一種。培養係不使用餵養細胞，而以非黏附培養進行。於培養時，能夠使用皿、燒瓶、微量盤、多 孔盤(Nunc公司製造)等或生物反應器。培養容器較佳為經過用以使與細胞之黏附性降低之表面處理。

培養溫度並無特別限制，係於30至40℃(例如37℃)進行。又，培養容器中的二氧化碳濃度例如為5%左右。

分化為胰島β細胞

於上述步驟獲得之細胞可分化誘導為胰島β細胞。使分化為胰島β細胞團之步驟可藉由將內分泌前驅細胞團或處於之後的分化階段之細胞團移殖至動物活體內而進行，較佳為將產胰島素細胞團移殖至動物活體內而進行。

「動物」較佳為哺乳動物，可列舉例如：人類、非人類靈長類、豬、牛、馬、綿羊、山羊、駱馬(Lama)、狗、貓、兔子、小鼠、天竺鼠等，較佳為人類。

就移殖而言，較佳為於可將細胞團固定於一定位置之活體內區域進行，例如可於動物之皮下、腹腔內、腹膜上皮、大網膜、脂肪組織、肌肉組織或胰臓、腎臓等各臓器之被膜下等進行。所移殖之細胞數可依據移殖細胞之分化階段、移殖對象之年齡/體重/移殖部位之大小/疾病嚴重度等要因而變化，並無特別限制，惟可設為例如10×10⁴細胞至10×10¹¹個之程度。所移殖之細胞團可於活體內環境中被分化誘導，而分化為目的之細胞團，較佳係分化為胰島β細胞團，之後可回收，亦可以原狀留置在活體內。

移殖時，細胞團可包埋於含有藻酸之凝膠中進行移殖，例如可將包埋於含有藻酸之凝膠中的細胞團封入至膠囊、袋體、腔室等裝置中，而移殖到活體內。

「含有藻酸之凝膠」可以公知之手法(WO2010/032242、WO2011/154941)為基準而製作，可藉由於藻酸鹽或藻酸酯之溶液中添加交聯劑使凝膠化而獲得。

藻酸鹽只要是水溶性之鹽即可，可利用金屬鹽、銨鹽等。例如可適合使用藻酸鈉、藻酸鈣、藻酸銨等。

藻酸酯(亦稱為藻酸丙二醇)為丙二醇酯鍵結於藻酸之羧基之衍生物。

藻酸鹽中所含有之甘露糖醛酸與古洛糖醛酸(guluronic acid)之比例(M/G比)為任意，通常於M>G時，可形成富有柔軟性之凝膠，於M<G時，可形成牢固的凝膠。於本發明中，可利用以10至90%、20至80%、30至70%或40至60%之比例含有古洛糖醛酸者。

於溶劑中，所含藻酸鹽或藻酸酯之量可為0.05至10重量%，較佳為0.1至5重量%，更佳為0.5至3重量%。溶劑若為能夠將藻酸鹽或藻酸酯溶解者即可，可利用水、生理食鹽水等。

交聯劑若為可將藻酸鹽或藻酸酯之溶液進行凝膠化者即可，並無特別限制，可利用多價之金屬陽離子。多價之金屬陽離子較佳為2價之金屬陽離子，更佳為鈣離子、鍶離子、鋇離子。交聯劑可以鹽之形態利用，於本發明中，可利用選自氯化鈣、氯化鍶、氯化鋇之至少一者來作為交聯劑。

含有藻酸之凝膠中亦可含有奈米纖維。奈米纖維為具有奈米領域之直徑的天然或合成之纖維。就天然奈米纖維而言，可列舉含有膠原蛋白、纖維素、絲蛋白(silk fibroin)、角蛋白、明膠、幾丁聚糖等多糖類中之一種或複數種者。合成奈米纖維可列舉：聚乳酸(PLA)、聚己內酯(PCL)、聚胺酯(PU)、聚(乳酸交酯-乙醇酸交酯共聚物)(PLGA)、聚(3-羥基丁酸酯-羥基戊酸酯共聚物)(PHBV)、聚(乙烯-乙酸乙烯酯共聚物)(PEVA)等。於含有藻酸之凝膠中，奈米纖維可為含有未達1重量%，例如0.9重量%、0.8重量%、0.7重量%、0.6重量%、0.5重量%或未達該等之量。於含有藻酸之凝膠中所含有之奈米纖維量的下限並無特別限制，可設成0.05重量%以上，較佳為0.1重量%以上。

於本發明中，「包埋」係指使內分泌前驅細胞團或處於之後的分化階段之細胞團分散存在而收容於含有藻酸之凝膠中。

於含有藻酸之凝膠包埋細胞團一事，可藉由將細胞團混合於藻酸鹽或藻酸酯之溶液中以使凝膠化而進行。

於藻酸鹽或藻酸酯之溶液中，所含之細胞團可為選自1×10⁴細胞至1×10⁹細胞/mL的量，較佳為1×10⁷細胞至1×10⁸細胞/mL的量。

含有細胞團之藻酸鹽或藻酸酯之溶液的凝膠化，可以是於該溶液中添加交聯劑而進行。相對於該溶液，添加之交聯劑之量可為選自0.1至5重量%之量，例如為選自0.1至1重量%之量。凝膠化可以是在具有能夠用於細胞培養或細胞移殖的既定構成及/或形狀之容器內進行，或是在設計成於該容器中可獲得適合之凝膠的鑄模內進行。

或者，亦可以公知之手法(WO2010/010902)為基準而藉由形成含有藻酸之凝膠膠囊而進行。亦即，可對於交聯劑之溶液滴下含有細胞團之藻酸鹽或藻酸酯的溶液而進行。可對應於滴下時噴嘴之形狀或滴下方法來調整液滴的大小，而且可以規定含有藻酸之凝膠膠囊的大小。滴下方法並無特別限制，可藉由空氣噴霧法、無氣噴霧方式、靜電噴霧法等手法進行。含有藻酸之凝膠膠囊的大小並無特別限制，可作成直徑為5mm以下、1mm以下、500μm以下。

交聯劑溶液可含有選自0.1至10重量%的量之交聯劑，例如含有選自0.1至5重量%的量之交聯劑。

於本發明中，「FGFR1抑制劑」為至少對於織維母細胞增殖因子受體(FGFR)1具有阻礙活性之物質。FGFR1作為對於為成長因子之FGF1至FGF17具有高親和性之受體，為四跨膜型酪胺酸激酶家族(FGFR1,2,3,4)的成員之一。FGFR1係參予與中胚層之誘導或形成模式化(patterning)、細胞之增殖或遷移、器官形成、骨骼成長等相關之許多傳訊路徑。於本發明中使用之FGFR1抑制劑若為具有FGFR1阻礙活性者即無特別限制，亦可為與FGFR1阻礙活性同時一併具有其它FGFR阻礙活性之物質。於本發明中，「FGFR1抑制劑」係指含有至少具有FGFR1阻礙活性之物質，較佳係指阻礙50%以上FGFR1之物質，更佳係指FGFR1之50%阻礙濃度(IC₅₀)為1μM以下，又更佳為100nM以下之物質。FGFR1阻礙活性之判定方法可從公知之方法中加以選擇，可列舉例如：使用EnzyChrom Kinase Assay Kit(BioAssay Systems公司製)之判定方法等。於本發明中之「FGFR1抑制劑」能夠利用以往公知者，可見 於專利文獻或非專利文獻中。又，本發明中之「FGFR1抑制劑」若為至少具有FGFR1阻礙活性者即可，亦可對於其它之FGFR具有阻礙活性。例如，本發明之「FGFR1抑制劑」只要具有FGFR1阻礙活性，亦可為FGFR2抑制劑、FGFR3抑制劑、FGFR4抑制劑等。

例如，於本發明中之「FGFRI抑制劑」除了以下表示之化合物(化合物群D)之外，亦可列舉具有以下通式表示之構造式的化合物當中具有FGFR1阻礙活性之化合物(或其鹽)，較佳為具有以下通式表示之構造式之化合物I及化合物II當中，屬於FGFR1之50%阻礙濃度(IC₅₀)為1μM以下、更佳為100nM以下之化合物(或其鹽)。

(化合物I)

化合物I可列舉下述式1所表示之化合物或其鹽：

〔式中，環AB表示具有1個以上取代基之2環式雜環(環AB亦可為具有1個以上取代基之3環式雜環)〕。

較佳為式中之環AB係具有3個取代基之2環式含氮雜環。

取代基可列舉以下表示之取代基或化合物群D所具有之取代基，較佳為化合物群D所具有之取代基。

(化合物II)

化合物II可列舉下述式2表示之化合物或其鹽：

〔式中，環D表示可具有取代基之5至6員單環式含氮雜環；在環D以外，係含有1個以上之含氮雜環〕。

較佳為式中之環D表示可具有取代基的含有1或2個氮之芳香環。

又，較佳的環D以外之1個以上之含氮雜環可以列舉可具有取代基之哌

(piperazine)。

取代基可列舉以下表示之取代基或化合物群D所具有之取代基，較佳為化合物群D所具有之取代基。

於本說明書中，「雜環」可列舉例如：芳族雜環及非芳族雜環，其係除了含有碳原子以外，還分別含有1至4個選自氮原子、硫原子及氧原子之雜原子來作為環構成原子。

本說明書中，「芳族雜環」可列舉例如：5至14員(較佳為5至10員)之芳族雜環，其係除了含有碳原子以外，還含有1至4個選自氮原子、硫原子及氧原子之雜原子來作為環構成原子。該「芳族雜環」之較佳例可列舉：噻吩、呋喃、吡咯、咪唑、吡唑、噻唑、異噻唑、

唑、異

唑、吡啶、吡

、嘧啶、嗒

、1,2,4-

二唑、1,3,4-

二唑、 1,2,4-噻二唑、1,3,4-噻二唑、三唑、四唑、三

等5至6員單環式芳族雜環； 苯并噻吩、苯并呋喃、苯并咪唑、苯并

唑、苯并異

唑、苯并噻唑、苯并異噻唑、苯并三唑、咪唑并吡啶、噻吩并吡啶、呋喃并吡啶、吡咯并吡啶、吡唑并吡啶、

唑并吡啶、噻唑并吡啶、咪唑并吡

、咪唑并嘧啶、噻吩并嘧啶、呋喃并嘧啶、吡咯并嘧啶、吡唑并嘧啶、

唑并嘧啶、噻唑并嘧啶、吡唑并嘧啶、吡唑并三

、萘并[2,3-b]噻吩、啡

噻(phenoxathiin)、吲哚、異吲哚、1H-吲唑、嘌呤、異喹啉、喹啉、呔

、

啶、喹

啉、喹唑啉、

啉、咔唑、β-咔啉、啡啶、吖啶、啡

、啡噻

、啡

等8至14員縮合多環式(較佳為2或3環式)芳族雜環。

於本說明書中，「非芳族雜環」可列舉例如3至14員(較佳為4至10員)之非芳族雜環，其係除了含有碳原子以外，還含有1至4個選自氮原子、硫原子及氧原子之雜原子作為環構成原子者。該「非芳族雜環」之較佳例可列舉：氮丙啶(aziridine)、環氧乙烷(oxirane)、硫環丙烷(thiirane)、氮呾(azetidine)、氧雜環丁烷、硫雜環丁烷(thietane)、四氫噻吩、四氫呋喃、吡咯啉、吡咯啶、咪唑啉、咪唑啶、

唑啉、

唑啶、吡唑啉、吡唑啶、噻唑啉、噻唑啶、四氫異噻唑、四氫

唑、四氫異

唑、哌啶、哌

、四氫吡啶、二氫吡啶、二氫噻喃、四氫嘧啶、四氫嗒

、二氫哌喃、四氫哌喃、四氫噻喃、嗎啉、硫代嗎啉、氮雜環庚烷、二氮雜環庚烷、氮呯(azepine)、氮雜環辛烷(azocane)、二氮雜環辛烷、氧雜環庚烷等3至8員單環式非芳族雜環； 二氫苯并呋喃、二氫苯并咪唑、二氫苯并

唑、二氫苯并噻唑、二氫苯并異噻唑、二氫萘并[2,3-b]噻吩、四氫異喹啉、四氫喹啉、4H-喹

、吲哚啉、異吲哚啉、四氫噻吩并[2,3-c]吡啶、四氫苯并氮呯、四氫喹

啉、四氫啡啶、六氫啡噻

、六氫啡

、四氫呔

、四氫

啶、四氫喹唑啉、四氫

啉、四氫咔唑、四氫-β-咔啉、四氫吖啶、四氫啡

、四氫硫雜蒽、八氫異喹啉等9至14員縮合多環式(較佳為2或3環式)非芳族雜環。

於本說明書中，「含氮雜環」可列舉「雜環」中含有至少1個以上的氮原子作為環構成原子者。

以下，對於本說明書中使用之各取代基之定義加以詳述。除非特別說明，各取代基係具有以下之定義。

於本說明書中，「鹵素原子」可列舉例如氟、氯、溴、碘。

於本說明書中，「C_1-6烷基」可列舉例如：甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、戊基、異戊基、新戊基、1-乙基丙基、己基、異己基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、2-乙基丁基。

於本說明書中，「可經鹵化之C_1-6烷基」可列舉例如可具有1至7個鹵素原子之C_1-6烷基，較佳為可具有1至5個鹵素原子之C_1-6烷基。具體例可列舉：甲基、氯甲基、二氟甲基、三氯甲基、三氟甲基、乙基、2-溴乙基、2,2,2-三氟乙基、四氟乙基、五氟乙基、丙基、2,2-二氟丙基、3,3,3-三氟丙基、異丙基、丁基、4,4,4-三氟丁基、異丁基、第 二丁基、第三丁基、戊基、異戊基、新戊基、5,5,5-三氟戊基、己基、6,6,6-三氟己基。

於本說明書中，「C_2-6烯基」可列舉例如：乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、4-甲基-3-戊烯基、1-己烯基、3-己烯基、5-己烯基。

於本說明書中，「C_2-6炔基」可列舉例如：乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、5-己炔基、4-甲基-2-戊炔基。

於本說明書中，「C_3-10環烷基」可列舉例如：環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、環辛基、二環[2.2.1]庚基、二環[2.2.2]辛基、二環[3.2.1]辛基、金剛烷基。

於本說明書中，「可經鹵化之C_3-10環烷基」可列舉例如：可具有1至7個鹵素原子之C_3-10環烷基，較佳為可具有1至5個鹵素原子之C_3-10環烷基。具體例可列舉：環丙基、2,2-二氟環丙基、2,3-二氟環丙基、環丁基、二氟環丁基、環戊基、環己基、環庚基、環辛基。

於本說明書中，「C_3-10環烯基」可列舉例如：環丙烯基、環丁烯基、環戊烯基、環己烯基、環庚烯基、環辛烯基。

於本說明書中，「C_6-14芳基」可列舉例如：苯基、1-萘基、2-萘基、1-蒽基、2-蒽基、9-蒽基。

於本說明書中，「C_7-16芳烷基」可列舉例如：苯甲基、苯乙基、萘甲基、苯丙基。

於本說明書中，「C_1-6烷氧基」可列舉例如：甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、第二丁氧基、第三丁氧基、戊基氧基、己基氧基。

於本說明書中，「可經鹵化之C_1-6烷氧基」可列舉例如：可具有1至7個鹵素原子之C_1-6烷氧基，較佳為可具有1至5個鹵素原子之C_1-6烷氧基。具體例可列舉：甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、乙氧基、2,2,2-三氟乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、4,4,4-三氟丁氧基、異丁氧基、第二丁氧基、戊基氧基、己基氧基。

於本說明書中，「C_3-10環烷基氧基」可列舉例如：環丙基氧基、環丁基氧基、環戊基氧基、環己基氧基、環庚基氧基、環辛基氧基。

於本說明書中，「C_1-6烷硫基」可列舉例如：甲硫基、乙硫基、丙硫基、異丙硫基、丁硫基、第二丁硫基、第三丁硫基、戊硫基、己硫基。

於本說明書中，「可經鹵化之C_1-6烷硫基」可列舉例如：可具有1至7個鹵素原子之C_1-6烷硫基，較佳為可具有1至5個鹵素原子之C_1-6烷硫基。具體例可列舉：甲硫基、二氟甲硫基、三氟甲硫基、乙硫基、丙硫基、異丙硫基、丁硫基、4,4,4-三氟丁硫基、戊硫基、己硫基。

於本說明書中，「C_1-6烷基-羰基」可列舉例如：乙醯基、丙醯基、丁醯基、2-甲基丙醯基、戊醯基、3-甲基丁醯基、2-甲基丁醯基、2,2-二甲基丙醯基、己醯基、庚醯基。

於本說明書中，「可經鹵化之C_1-6烷基-羰基」可列舉例如：可具有1至7個鹵素原子之C_1-6烷基-羰基，較佳為可具有1至5個鹵素原子之C_1-6烷基-羰基。具體例可列舉：乙醯基、氯乙醯基、三氟乙醯基、三氯乙醯基、丙醯基、丁醯基、戊醯基、己醯基。

於本說明書中，「C_1-6烷氧基-羰基」可列舉例如：甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、異丙氧基羰基、丁氧基羰基、異丁氧基羰基、第二丁氧基羰基、第三丁氧基羰基、戊基氧基羰基、己基氧基羰基。

於本說明書中，「C_6-14芳基-羰基」可列舉例如：苯甲醯基、1-萘甲醯基、2-萘甲醯基。

於本說明書中，「C_7-16芳烷基-羰基」可列舉例如：苯基乙醯基、苯基丙醯基。

於本說明書中，「5至14員芳族雜環羰基」可列舉例如：菸鹼醯基、異菸鹼醯基、噻吩甲醯基(thenoyl)、呋喃甲醯基(furoyl)。

於本說明書中，「3至14員非芳族雜環羰基」可列舉例如：嗎啉基羰基、哌啶基羰基、吡咯啶基羰基。

於本說明書中，「單-或二-C_1-6烷基-胺基甲醯基」可列舉例如：甲基胺基甲醯基、乙基胺基甲醯基、二甲基胺基甲醯基、二乙基胺基甲醯基、N-乙基-N-甲基胺基甲醯基。

於本說明書中，「單-或二-C_7-16芳烷基-胺基甲醯基」可列舉例如：苯甲基胺基甲醯基、苯乙基胺基甲醯基。

於本說明書中，「C_1-6烷基磺醯基」可列舉例如：甲磺醯基、乙磺醯基、丙磺醯基、異丙磺醯基、丁磺醯基、第二丁磺醯基、第三丁磺醯基。

於本說明書中，「可經鹵化之C_1-6烷基磺醯基」可列舉例如：可具有1至7個鹵素原子之C_1-6烷基磺醯基，較佳為可具有1至5個鹵素原子之C_1-6烷基磺醯基。具體例可列舉：甲磺醯基、二氟甲磺醯基、三氟甲磺醯基、乙磺醯基、丙磺醯基、異丙磺醯基、丁磺醯基、4,4,4-三氟丁磺醯基、戊磺醯基、己磺醯基。

於本說明書中，「C_6-14芳基磺醯基」可列舉例如：苯磺醯基、1-萘磺醯基、2-萘磺醯基。

於本說明書中，「取代基」可列舉例如：鹵素原子、氰基、硝基、可經取代之烴基、可經取代之雜環基、醯基、可經取代之胺基、可經取代之胺基甲醯基、可經取代之胺硫甲醯基、可經取代之胺磺醯基、可經取代之羥基、可經取代之氫硫(SH)基、可經取代之矽基。

於本說明書中，「烴基」(包括「可經取代之烴基」中之「烴基」)可列舉例如：C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-10環烷基、C_3-10環烯基、C_6-14芳基、C_7-16芳烷基。

於本說明書中，「可經取代之烴基」可列舉例如：可具有選自下述取代基群A之取代基的烴基。

[取代基群A]

(1)鹵素原子、(2)硝基、(3)氰基、(4)側氧基、(5)羥基、(6)可經鹵化之C_1-6烷氧基、(7)C_6-14芳基氧基(例如：苯氧基、萘氧基)、(8)C_7-16芳烷基氧基(例如：苯甲氧基)、(9)5至14員芳族雜環氧基(例如：吡啶基氧基)、(10)3至14員非芳族雜環氧基(例如：嗎啉基氧基、哌啶基氧基)、(11)C_1-6烷基-羰基氧基(例如：乙醯氧基、丙醯基氧基)、(12)C_6-14芳基-羰基氧基(例如：苯甲醯基氧基、1-萘甲醯基氧基、2-萘甲醯基氧基)、(13)C_1-6烷氧基-羰基氧基(例如：甲氧基羰基氧基、乙氧基羰基氧基、丙氧基羰基氧基、丁氧基羰基氧基)、(14)單-或二-C_1-6烷基-胺基甲醯基氧基(例如：甲基胺基甲醯基氧基、乙基胺基甲醯基氧基、二甲基胺基甲醯基氧基、二乙基胺基甲醯基氧基)、(15)C_6-14芳基-胺基甲醯基氧基(例如：苯基胺基甲醯基氧基、萘基胺基甲醯基氧基)、(16)5至14員芳族雜環羰基氧基(例如：菸鹼醯基氧基)、 (17)3至14員非芳族雜環羰基氧基(例如：嗎啉基羰基氧基、哌啶基羰基氧基)、(18)可經鹵化之C_1-6烷基磺醯氧基(例如：甲基磺醯氧基、三氟甲基磺醯氧基)、(19)可經C_1-6烷基取代之C_6-14芳基磺醯氧基(例如：苯基磺醯氧基、甲苯基磺醯氧基)、(20)可經鹵化之C_1-6烷硫基、(21)5至14員芳族雜環基、(22)3至14員非芳族雜環基、(23)甲醯基、(24)羧基、(25)可經鹵化之C_1-6烷基-羰基、(26)C_6-14芳基-羰基、(27)5至14員芳族雜環羰基、(28)3至14員非芳族雜環羰基、(29)C_1-6烷氧基-羰基、(30)C_6-14芳基氧基-羰基(例如：苯基氧基羰基、1-萘基氧基羰基、2-萘基氧基羰基)、(31)C_7-16芳烷基氧基-羰基(例如：苯甲基氧基羰基、苯乙基氧基羰基)、(32)胺基甲醯基、(33)胺硫甲醯基、 (34)單-或二-C_1-6烷基-胺基甲醯基、(35)C_6-14芳基-胺基甲醯基(例如苯基胺基甲醯基)、(36)5至14員芳族雜環胺基甲醯基(例如：吡啶基胺基甲醯基、噻吩基胺基甲醯基)、(37)3至14員非芳族雜環胺基甲醯基(例如：嗎啉基胺基甲醯基、哌啶基胺基甲醯基)、(38)可經鹵化之C_1-6烷基磺醯基、(39)C_6-14芳基磺醯基、(40)5至14員芳族雜環磺醯基(例如：吡啶基磺醯基、噻吩基磺醯基)、(41)可經鹵化之C_1-6烷基亞磺醯基、(42)C_6-14芳基亞磺醯基(例如：苯基亞磺醯基、1-萘基亞磺醯基、2-萘基亞磺醯基)、(43)5至14員芳族雜環亞磺醯基(例如：吡啶基亞磺醯基、噻吩基亞磺醯基)、(44)胺基、(45)單-或二-C_1-6烷基胺基(例如：甲胺基、乙胺基、丙胺基、異丙胺基、丁胺基、二甲胺基、二乙胺基、二丙胺基、二丁胺基、N-乙基-N-甲胺基)、(46)單-或二-C_6-14芳基胺基(例如：苯胺基)、(47)5至14員芳族雜環胺基(例如：吡啶基胺基)、(48)C_7-16芳烷基胺基(例如：苯甲胺基)、 (49)甲醯胺基、(50)C_1-6烷基-羰基胺基(例如：乙醯胺基、丙醯胺基、丁醯胺基)、(51)(C_1-6烷基)(C_1-6烷基-羰基)胺基(例如：N-乙醯基-N-甲胺基)、(52)C_6-14芳基-羰基胺基(例如：苯基羰基胺基、萘基羰基胺基)、(53)C_1-6烷氧基-羰基胺基(例如：甲氧基羰基胺基、乙氧基羰基胺基、丙氧基羰基胺基、丁氧基羰基胺基、第三丁氧基羰基胺基)、(54)C_7-16芳烷基氧基-羰基胺基(例如：苯甲基氧基羰基胺基)、(55)C_1-6烷基磺醯基胺基(例如：甲基磺醯胺基、乙基磺醯胺基)、(56)可經C_1-6烷基取代之C_6-14芳基磺醯基胺基(例如：苯磺醯胺基、甲苯磺醯胺基)、(57)可經鹵化之C_1-6烷基、(58)C_2-6烯基、(59)C_2-6炔基、(60)C_3-10環烷基、(61)C_3-10環烯基及(62)C_6-14芳基。

「可經取代之烴基」中之上述取代基的數目係例如為1至5個，較佳為1至3個。取代基數為2個以上時，各取代基可為相同，亦可為不同。

於本說明書中，「雜環基」(包括「可經取代之雜環基」中之「雜環基」)可列舉例如：環構成原子係除了碳原子以外分別含有1至 4個選自氮原子、硫原子及氧原子之雜原子之(i)芳族雜環基、(ii)非芳族雜環基及(iii)7至10員交聯雜環基。

於本說明書中，「芳族雜環基」(包括「5至14員芳族雜環基」)可列舉例如：環構成原子係除了碳原子以外分別含有1至4個選自氮原子、硫原子及氧原子之雜原子的5至14員(較佳為5至10員)芳族雜環基。

該「芳族雜環基」之較佳例可列舉：噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、異噻唑基、

唑基、異

唑基、吡啶基、吡

基、嘧啶基、嗒

基、1,2,4-

二唑基、1,3,4-

二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、三唑基、四唑基、三

基等5至6員單環式芳族雜環基；

苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并

唑基、苯并異

唑基、苯并噻唑基、苯并異噻唑基、苯并三唑基、咪唑并吡啶基、噻吩并吡啶基、呋喃并吡啶基、吡咯并吡啶基、吡唑并吡啶基、

唑并吡啶基、噻唑并吡啶基、咪唑并吡

基、咪唑并嘧啶基、噻吩并嘧啶基、呋喃并嘧啶基、吡咯并嘧啶基、吡唑并嘧啶基、

唑并嘧啶基、噻唑并嘧啶基、吡唑并三

基、萘并[2,3-b]噻吩基、啡

噻基、吲哚基、異吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、異喹啉基、喹啉基、呔

基、

啶基、喹

啉基、喹唑啉基、

啉基、咔唑基、β-咔啉基、啡啶基、吖啶基、啡

基、啡噻

基、啡

基等8至14員縮合多環式(較佳為2或3環式)芳族雜環基。

於本說明書中，「非芳族雜環基」(包含「3至14員非芳族雜環基」)可列舉例如：環構成原子係除了碳原子以外含有1至4個選 自氮原子、硫原子及氧原子之雜原子的3至14員(較佳為4至10員)之非芳族雜環基。

該「非芳族雜環基」之較佳例可列舉：氮丙啶基、環氧乙烷基、硫環丙烷基、氮呾基、氧雜環丁烷基、硫雜環丁基、四氫噻吩基、四氫呋喃基、吡咯啉基、吡咯啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、

唑啉基、

唑啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、噻唑啉基、噻唑啶基、四氫異噻唑基、四氫

唑基、四氫異

唑基、哌啶基、哌

基、四氫吡啶基、二氫吡啶基、二氫硫哌喃基、四氫嘧啶基、四氫嗒

基、二氫哌喃基、四氫哌喃基、四氫硫哌喃基、嗎啉基、硫代嗎啉基、氮雜環庚烷基、二氮雜環庚烷基、氮呯基、氧雜環庚烷基、氮雜環辛烷基、二氮雜環辛烷基等3至8員單環式非芳族雜環基；二氫苯并呋喃基、二氫苯并咪唑基、二氫苯并

唑基、二氫苯并噻唑基、二氫苯并異噻唑基、二氫萘并[2,3-b]噻吩基、四氫異喹啉基、四氫喹啉基、4H-喹

基、吲哚啉基、異吲哚啉基、四氫噻吩并[2,3-c]吡啶基、四氫苯并氮呯基、四氫喹

啉基、四氫啡啶基、六氫啡噻

基、六氫啡

基、四氫呔

基、四氫

啶基、四氫喹唑啉基、四氫

啉基、四氫咔唑基、四氫-β-咔啉基、四氫吖啶基、四氫啡

基、四氫硫雜蒽基、八氫異喹啉基等9至14員縮合多環式(較佳為2或3環式)非芳族雜環基。

於本說明書中，「7至10員交聯雜環基」之較佳例可列舉：

啶基、7-氮雜二環[2.2.1]庚烷基。

於本說明書中，「含氮雜環基」可列舉「雜環基」中環構成原子係至少含有1個以上的氮原子者。

於本說明書中，「可經取代之雜環基」可列舉例如：可具有選自前述之取代基群A的取代基之雜環基。

「可經取代之雜環基」中之取代基的數目為例如1至3個。取代基數目為2個以上時，各取代基可為相同，亦可為不同。

於本說明書中，「醯基」可列舉例如：甲醯基、羧基、胺基甲醯基、胺硫甲醯基、亞磺基、磺基、胺磺醯基、膦醯基，該等分別可具有「1至2個選自C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_3-10環烷基、C_3-10環烯基、C_6-14芳基、C_7-16芳烷基、5至14員芳族雜環基及3至14員非芳族雜環基之取代基，該等取代基分別可具有1至3個選自鹵素原子、可經鹵化之C_1-6烷氧基、羥基、硝基、氰基、胺基及胺基甲醯基之取代基」。

又，「醯基」亦可列舉：烴基-磺醯基、雜環-磺醯基、烴基-亞磺醯基、雜環-亞磺醯基。

此處，烴基-磺醯基係指與烴基鍵結之磺醯基，雜環-磺醯基係指與雜環基鍵結之磺醯基、烴基-亞磺醯基係指與烴基鍵結之亞磺醯基，雜環-亞磺醯基係指與雜環基鍵結之亞磺醯基。

「醯基」之較佳例可列舉：甲醯基、羧基、C_1-6烷基-羰基、C_2-6烯基-羰基(例如：巴豆醯基)、C_3-10環烷基-羰基(例如：環丁烷羰基、環戊烷羰基、環己烷羰基、環庚烷羰基)、C_3-10環烯基-羰基(例如：2-環己烯羰基)、C_6-14芳基-羰基、C_7-16芳烷基-羰基、5至14員芳族雜環羰基、3至14員非芳族雜環羰基、C_1-6烷氧基-羰基、C_6-14芳基氧基-羰基(例如：苯基氧基羰基、萘基氧基羰基)、C_7-16芳烷基氧基-羰基(例如：苯甲基氧基羰基、苯乙基氧基羰基)、胺基甲醯基、單-或二-C_1-6烷基-胺基甲醯基、 單-或二-C_2-6烯基-胺基甲醯基(例如：二烯丙基胺基甲醯基)、單-或二-C_3-10環烷基-胺基甲醯基(例如：環丙基胺基甲醯基)、單-或二-C_6-14芳基-胺基甲醯基(例如：苯基胺基甲醯基)、單-或二-C_7-16芳烷基-胺基甲醯基、5至14員芳族雜環胺基甲醯基(例如：吡啶基胺基甲醯基)、胺硫甲醯基、單-或二-C_1-6烷基-胺硫甲醯基(例如甲基胺硫甲醯基、N-乙基-N-甲基胺硫甲醯基)、單-或二-C_2-6烯基-胺硫甲醯基(例如：二烯丙基胺硫甲醯基)、單-或二-C_3-10環烷基-胺硫甲醯基(例如：環丙基胺硫甲醯基、環己基胺硫甲醯基)、單-或二-C_6-14芳基-胺硫甲醯基(例如：苯胺硫甲醯基)、單-或二-C_7-16芳烷基-胺硫甲醯基(例如：苯甲基胺硫甲醯基、苯乙基胺硫甲醯基)、5至14員芳族雜環胺硫甲醯基(例如：吡啶基胺硫甲醯基)、亞磺基、C_1-6烷基亞磺醯基(例如：甲基亞磺醯基、乙基亞磺醯基)、磺基、C_1-6烷基磺醯基、C_6-14芳基磺醯基、膦醯基、單-或二-C_1-6烷基膦醯基(例如：二甲基膦醯基、二乙基膦醯基、二異丙基膦醯基、二丁基膦醯基)。

於本說明書中，「可經取代之胺基」可列舉例如胺基，其可具有「1或2個選自C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_3-10環烷基、C_6-14芳基、C_7-16芳烷基、C_1-6烷基-羰基、C_6-14芳基-羰基、C_7-16芳烷基-羰基、5至14員芳族雜環羰基、3至14員非芳族雜環羰基、C_1-6烷氧基-羰基、5至14員芳族雜環基、胺基甲醯基、單-或二-C_1-6烷基-胺基甲醯基、單-或二-C_7-16芳烷基-胺基甲醯基、C_1-6烷基磺醯基及C_6-14芳基磺醯基之取代基，該取代基分別可具有1至3個選自取代基群A之取代基」。

可經取代之胺基之較佳例可列舉：胺基、單-或二-(可經鹵化之C_1-6烷基)胺基(例如：甲胺基、三氟甲胺基、二甲胺基、乙胺基、三 乙胺基、丙胺基、二丁胺基)、單-或二-C_2-6烯基胺基(例如：二烯丙基胺基)、單-或二-C_3-10環烷基胺基(例如：環丙胺基、環己胺基)、單-或二-C_6-14芳基胺基(例如：苯胺基)、單-或二-C_7-16芳烷基胺基(例如：苯甲胺基、二苯甲胺基)、單-或二-(可經鹵化之C_1-6烷基)-羰基胺基(例如：乙醯胺基、丙醯胺基)、單-或二-C_6-14芳基-羰基胺基(例如：苯甲醯胺基)、單-或二-C_7-16芳烷基-羰基胺基(例如苯甲基羰基胺基)、單-或二-5至14員芳族雜環羰基胺基(例如：菸鹼醯胺基、異菸鹼醯胺基)、單-或二-3至14員非芳族雜環羰基胺基(例如：哌啶基羰基胺基)、單-或二-C_1-6烷氧基-羰基胺基(例如：第三丁氧基羰基胺基)、5至14員芳族雜環胺基(例如：吡啶胺基)、胺基甲醯基胺基、(單-或二-C_1-6烷基-胺基甲醯基)胺基(例如：甲基胺基甲醯胺基)、(單-或二-C_7-16芳烷基-胺基甲醯基)胺基(例如：苯甲基胺基甲醯胺基)、C_1-6烷基磺醯基胺基(例如：甲基磺醯胺基、乙基磺醯胺基)、C_6-14芳基磺醯基胺基(例如苯磺醯胺基)、(C_1-6烷基)(C_1-6烷基-羰基)胺基(例如：N-乙醯基-N-甲胺基)、(C_1-6烷基)(C_6-14芳基-羰基)胺基(例如：N-苯甲醯基-N-甲胺基)。

於本說明書中，「可經取代之胺基甲醯基」可列舉例如：胺基甲醯基，其可具有「1或2個選自C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_3-10環烷基、C_6-14芳基、C_7-16芳烷基、C_1-6烷基-羰基、C_6-14芳基-羰基、C_7-16芳烷基-羰基、5至14員芳族雜環羰基、3至14員非芳族雜環羰基、C_1-6烷氧基-羰基、5至14員芳族雜環基、胺基甲醯基、單-或二-C_1-6烷基-胺基甲醯基及單-或二-C_7-16芳烷基-胺基甲醯基之取代基，該取代基可具有1至3個選自取代基群A之取代基」。

可經取代之胺基甲醯基之較佳例可列舉：胺基甲醯基、單-或二-C_1-6烷基-胺基甲醯基、單-或二-C_2-6烯基-胺基甲醯基(例如：二烯丙基胺基甲醯基)、單-或二-C_3-10環烷基-胺基甲醯基(例如：環丙基胺基甲醯基、環己基胺基甲醯基)、單-或二-C_6-14芳基-胺基甲醯基(例如：苯基胺基甲醯基)、單-或二-C_7-16芳烷基-胺基甲醯基、單-或二-C_1-6烷基-羰基-胺基甲醯基(例如：乙醯基胺基甲醯基、丙醯基胺基甲醯基)、單-或二-C_6-14芳基-羰基-胺基甲醯基(例如：苯甲醯基胺基甲醯基)、5至14員芳族雜環胺基甲醯基(例如：吡啶基胺基甲醯基)。

於本說明書中，「可經取代之胺硫甲醯基」可列舉例如：胺硫甲醯基，其可具有「1或2個選自C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_3-10環烷基、C_6-14芳基、C_7-16芳烷基、C_1-6烷基-羰基、C_6-14芳基-羰基、C_7-16芳烷基-羰基、5至14員芳族雜環羰基、3至14員非芳族雜環羰基、C_1-6烷氧基-羰基、5至14員芳族雜環基、胺基甲醯基、單-或二-C_1-6烷基-胺基甲醯基及單-或二-C_7-16芳烷基-胺基甲醯基之取代基，該取代基分別可具有1至3個選自取代基群A之取代基、」之。

可經取代之胺硫甲醯基之較佳例可列舉：胺硫甲醯基、單-或二-C_1-6烷基-胺硫甲醯基(例如：甲基胺硫甲醯基、乙基胺硫甲醯基、二甲基胺硫甲醯基、二乙基胺硫甲醯基、N-乙基-N-甲基胺硫甲醯基)、單-或二-C_2-6烯基-胺硫甲醯基(例如：二烯丙基胺硫甲醯基)、單-或二-C_3-10環烷基-胺硫甲醯基(例如：環丙基胺硫甲醯基、環己基胺硫甲醯基)、單-或二-C_6-14芳基-胺硫甲醯基(例如：苯胺硫甲醯基)、單-或二-C_7-16芳烷基-胺硫甲醯基(例如：苯甲基胺硫甲醯基、苯乙基胺硫甲醯基)、單-或二-C_{1- 6}烷基-羰基-胺硫甲醯基(例如：乙醯基胺硫甲醯基、丙醯基胺硫甲醯基)、單-或二-C_6-14芳基-羰基-胺硫甲醯基(例如：苯甲醯基胺硫甲醯基)、5至14員芳族雜環胺硫甲醯基(例如：吡啶基胺硫甲醯基)。

於本說明書中，「可經取代之胺磺醯基」可列舉例如：胺磺醯基，其可具有「1或2個選自C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_3-10環烷基、C_6-14芳基、C_7-16芳烷基、C_1-6烷基-羰基、C_6-14芳基-羰基、C_7-16芳烷基-羰基、5至14員芳族雜環羰基、3至14員非芳族雜環羰基、C_1-6烷氧基-羰基、5至14員芳族雜環基、胺基甲醯基、單-或二-C_1-6烷基-胺基甲醯基及單-或二-C_7-16芳烷基-胺基甲醯基之取代基，該取代基分別可具有1至3個選自取代基群A之取代基」。

可經取代之胺磺醯基之較佳例可列舉：胺磺醯基、單-或二-C_1-6烷基-胺磺醯基(例如：甲基胺磺醯基、乙基胺磺醯基、二甲基胺磺醯基、二乙基胺磺醯基、N-乙基-N-甲基胺磺醯基)、單-或二-C_2-6烯基-胺磺醯基(例如：二烯丙基胺磺醯基)、單-或二-C_3-10環烷基-胺磺醯基(例如：環丙基胺磺醯基、環己基胺磺醯基)、單-或二-C_6-14芳基-胺磺醯基(例如：苯基胺磺醯基)、單-或二-C_7-16芳烷基-胺磺醯基(例如：苯甲基胺磺醯基、苯乙基胺磺醯基)、單-或二-C_1-6烷基-羰基-胺磺醯基(例如：乙醯基胺磺醯基、丙醯基胺磺醯基)、單-或二-C_6-14芳基-羰基-胺磺醯基(例如：苯甲醯基胺磺醯基)、5至14員芳族雜環胺磺醯基(例如：吡啶基胺磺醯基)。

於本說明書中，「可經取代之羥基」可列舉例如：羥基，其可具有「選自C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_3-10環烷基、C_6-14芳基、C_7-16芳烷基、C_1-6烷基-羰基、C_6-14芳基-羰基、C_7-16芳烷基-羰基、5至14員芳 族雜環羰基、3至14員非芳族雜環羰基、C_1-6烷氧基-羰基、5至14員芳族雜環基、胺基甲醯基、單-或二-C_1-6烷基-胺基甲醯基、單-或二-C_7-16芳烷基-胺基甲醯基、C_1-6烷基磺醯基及C_6-14芳基磺醯基之取代基，該取代基分別可具有1至3個選自取代基群A之取代基」。

可經取代之羥基之較佳例可列舉：羥基、C_1-6烷氧基、C_2-6烯基氧基(例如：烯丙基氧基、2-丁烯基氧基、2-戊烯基氧基、3-己烯基氧基)、C_3-10環烷基氧基(例如：環己基氧基)、C_6-14芳基氧基(例如：苯氧基、萘氧基)、C_7-16芳烷基氧基(例如：苯甲基氧基、苯乙基氧基)、C_1-6烷基-羰基氧基(例如：乙醯基氧基、丙醯基氧基、丁醯基氧基、異丁醯基氧基、三甲基乙醯基氧基)、C_6-14芳基-羰基氧基(例如：苯甲醯基氧基)、C_7-16芳烷基-羰基氧基(例如：苯甲基羰基氧基)、5至14員芳族雜環羰基氧基(例如：菸鹼醯基氧基)、3至14員非芳族雜環羰基氧基(例如：哌啶基羰基氧基)、C_1-6烷氧基-羰基氧基(例如：第三丁氧基羰基氧基)、5至14員芳族雜環氧基(例如：吡啶基氧基)、胺基甲醯基氧基、C_1-6烷基-胺基甲醯基氧基(例如：甲基胺基甲醯基氧基)、C_7-16芳烷基-胺基甲醯基氧基(例如：苯甲基胺基甲醯基氧基)、C_1-6烷基磺醯氧基(例如：甲基磺醯氧基、乙基磺醯氧基)、C_6-14芳基磺醯氧基(例如：苯基磺醯氧基)。

於本說明書中，「可經取代之氫硫基」可列舉例如：氫硫基、經鹵化之氫硫基，其可具有「選自C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_3-10環烷基、C_6-14芳基、C_7-16芳烷基、C_1-6烷基-羰基、C_6-14芳基-羰基及5至14員芳族雜環基之取代基，該取代基分別可具有1至3個選自取代基群A之取代基」。

可經取代之氫硫基較佳例可列舉：氫硫(-SH)基、C_1-6烷硫基、C_2-6烯硫基(例如：烯丙基硫基、2-丁烯硫基、2-戊烯硫基、3-己烯硫基)、C_3-10環烷硫基(例如：環己硫基)、C_6-14芳基硫基(例如：苯硫基、萘硫基)、C_7-16芳烷基硫基(例如：苯甲硫基、苯乙硫基)、C_1-6烷基-羰基硫基(例如：乙醯硫基、丙醯硫基、丁醯硫基、異丁醯硫基、三甲基乙醯硫基)、C_6-14芳基-羰基硫基(例如：苯甲醯硫基)、5至14員芳族雜環硫基(例如：吡啶基硫基)、鹵化硫基(例如五氟硫基)。

於本說明書中，「可經取代之矽基」可列舉例如：矽基，其可具有「1至3個選自C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_3-10環烷基、C_6-14芳基及C_7-16芳烷基之取代基，該取代基分別可具有1至3個選自取代基群A之取代基」。

可經取代之矽基之較佳例可列舉：三-C_1-6烷基矽基(例如：三甲基矽基、第三丁基(二甲基)矽基)。

更具體而言，於本發明中可利用之FGFR1抑制劑可例示：PD-166866(1-[2-胺基-6-(3,5-二甲氧基苯基)-吡啶并(2,3-d)嘧啶-7-基]-3-第三丁基脲：CAS No.：192705-79-6)(於本說明書中，有將該化合物記載為「CAS192705-79-6」之情況)、E-3810(CAS No.：1058137-23-7)、PD-173074(CAS No.：219580-11-7)、FGFR4-IN-1(CAS No.：1708971-72-5)、FGFR-IN-1(CAS No.：1448169-71-8)、FIIN-2(CAS No.：1633044-56-0)、AZD4547(CAS No.：1035270-39-3)、FIIN-3(CAS No.：1637735-84-2)、NVP-BGJ398(CAS No.：1310746-10-1)、NVP-BGJ398(CAS No.：872511-34-7)、CH5183284(CAS No.：1265229-25- 1)、Derazantinib(CAS No.：1234356-69-4)、Derazantinib Racemate、Ferulic acid(CAS No.：1135-24-6)、SSR128129E(CAS No.：848318-25-2)、SSR128129E free acid(CAS No.：848463-13-8)、Erdafitinib(CAS No.：1346242-81-6)、BLU9931(CAS No.：1538604-68-0)、PRN1371(CAS No.：1802929-43-6)、S49076(CAS No.：1265965-22-7)、LY2874455(CAS No.：1254473-64-7)、Linsitinib(CAS No.：867160-71-2)、Dovitinib(CAS No.：405169-16-6)、Anlotinib(CAS No.：1058156-90-3)、Brivanib(CAS No.：649735-46-6)、Derazantinib(CAS No.：1234356-69-4)、Anlotinib Dihydrochloride(CAS No.：1360460-82-7)、ACTB-1003(CAS No.：939805-30-8)、BLU-554(CAS No.：1707289-21-1)、Rogaratinib(CAS No.：1443530-05-9)、BIBF 1120 esylate(CAS No.：656247-18-6)、TG 100572 Hydrochloride(CAS No.：867331-64-4)、ENMD-2076(CAS No.：934353-76-1)、Brivanib alaninate(CAS No.：649735-63-7)、TG 100572(CAS No.：867334-05-2)、BIBF 1120(GAS No.：656247-17-5)、ENMD-2076 Tartrate(CAS No.：1291074-87-7)、TSU-68(CAS No.：252916-29-3)、Ponatinib(CAS No.：943319-70-8)、Sulfatinib(CAS No.：1308672-74-3)、LY2784544(CAS No.：1229236-86-5)、Dovitinib lactate(CAS No.：692737-80-7)、SU 5402(CAS No.：215543-92-3)、FGF-401(CAS No.：1708971-55-4)、Tyrosine kinase-IN-1(CAS No.：705946-27-6)、PP58(CAS No.：212391-58-7)、TG 100801 Hydrochloride(CAS No.：1018069-81-2)、Crenolanib(CAS No.：670220-88-9)、TG 100801(CAS No.：867331-82-6)、Pazopanib Hydrochloride(CAS No.：635702-64-6)、Pazopanib(CAS No.：444731-52-6)、PD168393(CAS No.：194423-15-9)、Apatinib(CAS No.：1218779-75-9)、Palbociclib isethionate(CAS No.：827022-33-3)、Foretinib(CAS No.：849217-64-7)、Lenvatinib(CAS No.：417716-92-8)、Tandutinib(CAS No.：387867-13-2)等或其鹽(將此等化合物設為化合物群D)。又，此等化合物若是具有FGFR1阻礙活性，較佳係若是FGFR1之50%阻礙濃度(IC₅₀)為100nM以下，即可具有1個或複數個選自上述之取代基。

又，該等化合物若是具有FGFR1阻礙活性，較佳係若是FGFR1之50%阻礙濃度(IC₅₀)為100nM以下，則一部分之局部構造(取代基、環等)可經改換。

於本發明中之FGFR1抑制劑較佳為：CAS192705-79-6(1-[2-胺基-6-(3,5-二甲氧基苯基)-吡啶并(2,3-d)嘧啶-7-基]-3-第三丁基脲：CAS No.：192705-79-6)、E-3810(CAS No.：1058137-23-7)、PD173074(CAS No.：219580-11-7)。

又，藉由以下之試驗明瞭CAS192705-79-6對於FGFR1、FGFR2、FGFR3及FGFR4具有阻礙活性。使與調製作為重組蛋白質之FGFR1、FGFR2、FGFR3及FGFR4結合之螢光探針於CAS192705-79-6存在下或非存在下發揮作用，並以盤式檢測儀(plate reader)檢測出螢光信號。由CAS192705-79-6存在下或非存在下之螢光信號的變動來算出CAS192705-79-6對於各蛋白質之阻礙活性(pIC₅₀)。

FGFR1抑制劑不只限於上述表示之化合物，對於FGFR1之mRNA的反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide)或siRNA、結合於FGFR1之抗體、顯性負FGFR1突變體等亦可使用作為FGFR1抑制劑，係可由商業方式取得或根據公知之方法進行合成。

FGFR1抑制劑可使用前述之各種化合物或其鹽，能夠對應所使用之化合物或其鹽而適當地決定於培養基之添加量，惟通常為約0.00001μM至100μM，較佳為0.01μM至10μM。

藉由FGFR1抑制劑進行之內分泌前驅細胞團或處於之後的分化階段之細胞團的處理，係可藉由使該細胞團與FGFR1抑制劑同時存在而進行。例如，可藉由將該細胞團以添加有FGFR1抑制劑之培養基中培養而進行。FGFR1抑制劑係可以能夠阻礙FGFR1活性之任意量而含有於培養基中，例如：可含有10μM以下或5μM以下之量，較佳為含有未達5μM、未達4μM、未達3μM、未達2μM之量。FGFR1抑制劑的添加量之下限並無特別限制，可為0.1μM以上，較佳為0.5μM以上。FGFR1抑制劑之添加量較佳為未達5μM且0.1μM以上，更佳為未達5μM且0.5μM以上。於FGFR1抑制劑存在下之培養至少可進行12小時，較佳可進行24小時以上、2日以上、4日以上、8日以上、10日以上或15日以上。於FGFR1抑制劑存在下之培養較佳為進行4日以上。於藉由FGFR1抑制劑進行處理之期間亦可交換培養基，可根據培養排程而交換為添加有FGFR1抑制劑之具有與交換前為相同組成之培養基或具有交換前為不同組成之培養基。

於本發明中，於藉由FGFR1抑制劑進行處理之細胞(起始材料之細胞)中的Ki67陽性細胞之比例並無特別限制，可為1%以上、5%以上、10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上。

於本發明中，藉由FGFR1抑制劑進行處理之細胞(起始材料之細胞)中的鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)陽性細胞之比例並無特別限制，惟可為10%以下、5%以下、1%以下、0.5%以下。

內分泌前驅細胞團或處於之後的分化階段之細胞團可於以FGFR1抑制劑進行處理一同，付諸進一步分化為目的細胞團(例如：產胰島素細胞團或胰島β細胞團)之步驟。此處，「於以FGFR1抑制劑處理一同」係包括：同時地進行以FGFR1抑制劑進行處理之步驟、與使分化之步驟的情況；及在以FGFR1抑制劑進行處理之後，付諸分化之步驟的情況；以及在付諸分化步驟之後，以FGFR1抑制劑進行處理之步驟的情況。因此，用於以FGFR1抑制劑進行處理之培養基與用於使細胞團分化之培養基可為不同之培養基，亦可於使分化之步驟所使用的培養基中進一步添加FGFR1抑制劑。

於一態樣中，FGFR1抑制劑可含於使內分泌前驅細胞分化為產胰島素細胞之步驟所使用的培養基中，更佳為可含於使內分泌前驅細胞團分化誘導而得之前期產胰島素細胞或處於之後的分化階段之細胞團的再分化步驟(例如上述步驟6之最後約4至15日，較佳為最後之約4至7日)所使用之培養基中。將內分泌前驅細胞團以FGFR1抑制劑進行處理時，會有目的細胞數量大幅地減少之情況，惟，在將前期產胰島素細胞或 處於之後的分化階段之細胞團以FGFR1抑制劑進行處理時，可避免如所述之目的細胞數量之大幅減少。亦即，將前期產胰島素細胞或處於之後的分化階段之細胞團以FGFR1抑制劑進行處理之情況相較於將內分泌前驅細胞團以FGFR1抑制劑進行處理之情況，可增大所獲得之產胰島素細胞之數量。

藉由將內分泌前驅細胞團或處於之後的分化階段之細胞團以FGFR1抑制劑進行處理，可抑制於該細胞團中的Ki67陽性細胞之增殖。

本手法並非抑制畸胎瘤(teratoma)增殖，而是可以減少或抑制胰系譜中所含之增殖性細胞之殘存數。

本手法並非抑制iPS細胞之增殖(例如：可為不使鹼性磷酸酶陽性細胞之數目減少)，而是可減少或抑制胰系譜中所含之增殖性細胞之殘存數目。

根據本手法，藉由使用FGFR1抑制劑進行處理，可減低內分泌前驅細胞團或處於之後的分化階段之細胞團中的Ki67陽性細胞之絶對數。藉此，可使獲得之細胞團中之Ki67陽性細胞缺失。

亦即，獲得之細胞團中Ki67陽性細胞之比例相較於未以FGFR1抑制劑處理而進行培養及/或分化之情況，係能夠減低，其比例可設成未達10%、未達9%、未達8%、未達7%、未達6%、未達5%、未達4%、未達3%、未達2%或未達1%，較佳可設成未達3%、未達2%或未達1%。

又，根據本手法，藉由使經FGFR1抑制劑處理過之內分泌前驅細胞團或處於之後的分化階段之細胞團分化為產胰島素細胞或胰島β細胞，可獲得Ki67陽性細胞的增殖受到抑制，產胰島素細胞或胰島β細胞經富集化之細胞團。亦即，相較於未以FGFR1抑制劑處理而獲得之情況，於分化誘導後獲得之細胞團中之產胰島素細胞或胰島β細胞之比例係可使增大，該比例可設成40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上或90%以上。

藉由本手法獲得之產胰島素細胞或胰島β細胞，在移殖於動物活體內並使之於動物活體內分化時，可以原狀留置而利用作為胰島素分泌細胞。依據藉由本手法獲得之產胰島素細胞或胰島β細胞，能夠避免Ki67陽性細胞增殖，安全且可達成移殖細胞的長期存活。

依本發明，藉由將經去除具有高增殖性之Ki67陽性細胞之產胰島素細胞團或胰島β細胞團(本發明之細胞團)以原狀或膠囊化移殖於患部，係有用於作為用在治療糖尿病之細胞醫藥，尤其是用在治療I型糖尿病之細胞醫藥。

又，本發明之細胞團可為前驅藥物。前驅藥物係指細胞團，該細胞團係於移殖到活體內後進行分化，而轉變為具有治療疾病的功能之細胞。

本發明之細胞團係毒性(例如急性毒性、慢性毒性、遺傳毒性、生殖毒性、心臟毒性、致癌性)低，可以原狀、或與藥理上容許之載體等混合並作成醫藥組成物，而對於哺乳動物(例如小鼠、大鼠、倉鼠、兔子、貓、狗、牛、羊、猴子、人類)安全地進行投予。

以下，藉由實施例對本發明加以說明，惟本發明並不限定於該等實施例。

[實施例]

從多潛能幹細胞分化誘導為內分泌前驅細胞團係根據上述步驟1)-5)、過去報告(Stem Cell Research(2015)14、185-197)等而實施。

實施例1：減少於將內分泌前驅細胞團以FGF受體1抑制劑進行處理而獲得之細胞團中之非目的細胞(Ki67陽性細胞)

1.方法

(1)製作產胰島素細胞團

從內分泌前驅細胞團分化誘導為產胰島素細胞團係根據上述步驟6)和過去報告(Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133)實施。

將從iPS細胞分化誘導獲得之內分泌前驅細胞團於含有分化因子(ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶抑制劑RO、抗壞血酸)及FGF受體1抑制劑(CAS192705-79-6)之分化誘導培養基(Improved MEM/1%B27/青黴素 鏈黴素)中培養12日，獲得產胰島素細胞團。藉由流動式細胞測量術評估獲得之細胞團中之Ki67陽性細胞數。

(2)FGF受體1抑制劑處理細胞之活體內移殖

以下，以公知之方法為基準進行小鼠之準備或細胞之移殖。

使用藉由鏈黴素(streptomycin)而誘發胰島素缺乏性糖尿病之免疫不全NOD/SCID小鼠，以含有上述(1)獲得之CAS192705-79-6之分化誘導培養基或作為比較例之未含有CAS192705-79-6之分化誘導培養基來進行培養，並將所獲得之產胰島素細胞團移殖於腎囊下。移殖後之追踪觀察係測定血中人類C-胜肽濃度及血糖值，。於移殖5週後之時間點摘出移殖片。

(3)移殖片中非目的細胞之評估

將摘出之移殖片固定、脫水後，製作冷凍切片，為了評估非目的細胞而實施免疫組織染色。於活體內可期待成熟為胰島細胞之目的細胞係以胰島素陽性(且NKX6.1陽性)或升糖素作為指標，有可能對目的細胞之長期存活造成負面影響之非目的細胞係以陽性Ki67陽性作為指標，而進行評估。

2.結果

(1)產胰島素細胞團之製作

進行5次將以含有CAS192705-79-6(1μM)之分化誘導培養基處理12日之實驗，將所獲得之細胞團中Ki67陽性細胞率±標準偏差之結果表示於表1。在將內分泌前驅細胞團以CAS192705-79-6處理12日時，所獲得之細胞團中的Ki67陽性細胞率相較於對照組係顯著較少。此結果表示藉由將內分泌前驅細胞團以CAS192705-79-6進行處理，會使Ki67陽性細胞減少或抑制其增殖。

(2)FGF受體1抑制劑處理細胞之活體內移殖

將移殖後的追踪觀察而測定之血中人類C-胜肽濃度及血糖值之結果表示於表2。以含有CAS192705-79-6(1μM)之分化誘導培養基處理12日而獲得之產胰島素細胞團在移殖4個月後，係於血液中分泌人類C-胜肽，顯示高血糖改善作用，該等之高血糖改善作用水準與經移殖未以CAS192705-79-6處理而獲得之產胰島素細胞團時為同等。

(3)移殖片中非目的細胞之評估

將於移殖後5週摘出之移殖片之免疫組織染色結果表示於第1圖。

將以含有CAS192705-79-6(1μM)之分化誘導培養基處理12日而獲得之產胰島素細胞團移殖於腎囊下之情況與將未以CAS192705-79-6處理而獲得之產胰島素細胞團移殖於腎囊下之情況進行比較，可確認到大幅地抑制了移殖片肥大化。該結果表示藉由將內分泌前驅細胞團以CAS192705-79-6處理，會使屬於非目的細胞之Ki67陽性細胞減少或抑制其增殖。

實施例2：於將產胰島素細胞團以FGF受體1抑制劑處理而獲得之細胞團中之非目的細胞(Ki67陽性細胞)之減少及目的細胞之維持[胰島素陽性 (且NKX6.1陽性)細胞]

1.方法

1)將從iPS細胞分化誘導而獲得之內分泌前驅細胞團於含有分化因子(ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶(γ-secretase)抑制劑RO、抗壞血酸)及FGF受體1抑制劑(CAS192705-79-6)之分化誘導培養基(Improved MEM/1%B27/青黴素 鏈黴素)中培養11日，獲得產胰島素細胞團。

2)將從iPS細胞分化誘導而獲得之內分泌前驅細胞團於含有分化因子(ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶抑制劑RO、抗壞血酸)之分化誘導培養基(Improved MEM/1%B27/青黴素 鏈黴素)中培養4日，分化誘導為產胰島素細胞團。接著，於含有分化因子(ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶抑制劑RO、抗壞血酸)之分化誘導培養基(Improved MEM/1%B27/青黴素 鏈黴素)中添加FGF受體1抑制劑(CAS192705-79-6、1μM)，培養7日。

3)將從iPS細胞分化誘導而獲得之內分泌前驅細胞團於含有分化因子(ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶抑制劑RO、抗壞血酸)之分化誘導培養基(Improved MEM/1%B27/青黴素 鏈黴素)中培養7日，分化誘導為產胰島素細胞團。接著，於含有分化因子(ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶抑制劑RO、抗壞血酸)之分化誘導培養基(Improved MEM/1%B27/青黴素 鏈黴素)中添加FGF受體1抑制劑(CAS192705-79-6、1μM)並培養4日。

4)將從iPS細胞分化誘導而獲得之內分泌前驅細胞團於含有分化因子(ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶抑制劑RO、抗壞血酸)且未含有CAS192705-79-6之分化誘導培養基(Improved MEM/1%B27/青黴素 鏈黴素)中進行培養11日，分化誘導為產胰島素細胞團。

藉由流動式細胞測量術將以上述1)、2)及3)的各方法所獲得之細胞團中之Ki67陽性細胞數進行計數，求出各細胞團中之Ki67陽性細胞率。

又，藉由流動式細胞測量術將以上述1)、2)及3)各方法所獲得之細胞團中之胰島素陽性(且NKX6.1陽性)細胞數進行計數，並將上述4)之方法所獲得之對照細胞團中之胰島素陽性(且NKX6.1陽性)細胞數設為100%而算出於各方法中之胰島素陽性(且NKX6.1陽性)細胞率之相對值。

2.結果

使用各方法，分別重覆操作3次，評估於產胰島素細胞製造步驟中以CAS192705-79-6進行處理之時機之影響。將以各方法獲得之Ki67陽性 細胞率及胰島素陽性(且NKX6.1陽性)細胞率之平均值±標準偏差之結果表示於表3。

獲得之細胞團中之Ki67陽性細胞率，在使用CAS192705-79-6，而於從分化誘導步驟開始之時間點處理之情況、於最後7日處理之情況、於最後4日處理之情況之間，並無明顯的差異，無論是其中何種情況，相較於對照組皆為顯著較少。該結果表示，於製造產胰島素細胞或胰島β細胞過程中藉由進行CAS192705-79-6處理，可使細胞團中之Ki67陽性細胞減少或抑制其增殖。

另一方面，對於胰島素陽性(且NKX6.1陽性)細胞率，於從分化誘導步驟之開始時間點處理之情況與於最後7日或4日處理之情況係確認到顯著的差異。亦即，於分化誘導步驟開始之時間點(內分泌前驅細胞團)以CAS192705-79-6處理時，雖然確認到屬於目的細胞之胰島素陽性(NKX6.1陽性)細胞數目係顯著減少，惟於從分化誘導開始的4日後或7日後之分化進行到某一程度之階段(前期產胰島素細胞或處於之後的分化階段之細胞團)以CAS192705-79-6處理時，確認到屬於目的細胞之胰島素陽性(NKX6.1陽性)細胞數幾乎沒有減少。

實施例3：於以CAS192705-79-6以外之FGFR1抑制劑處理而獲得之細胞團中之非目的細胞(Ki67陽性細胞)的減少

1.方法

將從iPS細胞分化誘導而獲得之內分泌前驅細胞團於含有分化因子(ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶抑制劑RO、抗壞血酸)之分化誘導培養基(Improved MEM/1%B27/青黴素 鏈黴素)中培養8日，接著，於含有分化因子((T3、ALK5抑制劑II、硫酸鋅、肝素、N-乙醯基半胱胺酸、Trolox、R428)之分化誘導培養基((MCDB131/20mM葡萄糖/碳酸氫鈉/FAF-BSA/ITS-X/Glutamax/抗壞血酸/青黴素 鏈黴素)中，將CAS192705-79-6、E-3810或PD173074分別以低、中、高之3種濃度添加之培養基中培養4日。藉由流動式細胞測量術評估獲得之細胞團中之Ki67陽性細胞數。

2.結果

將以CAS192705-79-6或E-3810處理而獲得之細胞團中之Ki67陽性細胞率表示於表4中。又，將以PD173074處理而獲得之細胞團中之Ki67陽性細胞率表示於表5中。

從該結果確認到，不只是CAS192705-79-6，於以其它FGFR1抑制劑處理而獲得之細胞團中，Ki67陽性細胞率相較於對照組亦顯著變少。該結果表示，不限定於以CAS192705-79-6處理，藉由FGFR1之阻礙處理能夠使Ki67陽性細胞減少或抑制其增殖。

從以上之結果可明瞭：藉由將內分泌前驅細胞或處於之後的分化階段之細胞團以FGFR1抑制劑處理，可使存在於該細胞團中之Ki67陽性細胞減少或抑制其增殖，其結果係能夠得到目的細胞經富集化之細胞團。

Claims (14)

1. 一種方法，該方法係產胰島素細胞團或胰島β細胞團之製造方法，前述製造方法包含：將產胰島素細胞團或胰島β細胞團以FGFR1抑制劑進行處理之步驟。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該方法更包含使經FGFR1抑制劑處理之產胰島素細胞團進行分化之步驟。
3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之方法，其中，該方法係將產胰島素細胞團或胰島β細胞團以未達5μM之FGFR1抑制劑進行處理者。
4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之方法，其中，所製造之細胞團係含有比例為未達3%之Ki67陽性細胞。
5. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述之方法，其中，該FGFR1抑制劑為1-[2-胺基-6-(3,5-二甲氧基苯基)-吡啶并(2,3-d)嘧啶-7-基]-3-第三丁基脲或其鹽。
6. 如申請專利範圍第2項至第5項中任一項所述之方法，其中，該使經FGFR1抑制劑處理之產胰島素細胞團進行分化之步驟係藉由移殖至動物而進行。
7. 一種方法，該方法係產胰島素細胞團或胰島β細胞團之製造方法，前述製造方法包含：將內分泌前驅細胞或處於之後的分化階段之細胞團以未達5μM之FGFR1抑制劑進行處理之步驟。
8. 一種方法，該方法係使存在於內分泌前驅細胞或處於之後的分化階段之細胞團中之Ki67陽性細胞減少或抑制其增殖之方法；前述製造方法包含：將該細胞團以FGFR1抑制劑進行處理。
9. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中，該內分泌前驅細胞或處於之後的分化階段之細胞團為產胰島素細胞團。
10. 如申請專利範圍第8項或第9項所述之方法，其中，該方法係將內分泌前驅細胞或處於之後的分化階段之細胞團以未達5μM之FGFR1抑制劑進行處理。
11. 如申請專利範圍第8項至第10項中任一項所述之方法，其中，FGFR1抑制劑為1-[2-胺基-6-(3,5-二甲氧基苯基)-吡啶并(2,3-d)嘧啶-7-基]-3-第三丁基脲或其鹽。
12. 一種胰前驅細胞或處於之後的分化階段之細胞團，係含有比例為未達3%之Ki67陽性細胞者。
13. 如申請專利範圍第12項所述之細胞團，其中，該細胞團為產胰島素細胞團。
14. 如申請專利範圍第12項或第13項所述之細胞團，其中，該細胞團係被使用於移殖用途。