JP6779509B2 - 増殖抑制剤 - Google Patents
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Description
[発明の背景]
[1] インスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団の製造方法であって、
インスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団をFGFR1阻害剤で処理する工程、
を含む方法。
[2] さらに、FGFR1阻害剤で処理したインスリン産生細胞集団を分化させる工程、を含む、[1]の方法。
[3] インスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団を5μM未満のFGFR1阻害剤で処理する、[1]又は[2]の方法。
[4] 製造された細胞集団が、Ki67陽性細胞を3%未満の割合で含む、[1]〜[3]のいずれかの方法。
[5] FGFR1阻害剤が1−[2−アミノ−6−(3,5−ジメトキシフェニル)−ピリド(2,3−d)ピリミジン−7−イル]−3−tert−ブチルウレア又はその塩である、[1]〜[4]のいずれかの方法。
[5−1] FGFR1阻害剤が、FGFR1の50%阻害濃度(IC50)が1μM以下である物質である、[1]〜[4]のいずれかの方法。
[5−2] FGFR1阻害剤が、1−[2−アミノ−6−(3,5−ジメトキシフェニル)−ピリド(2,3−d)ピリミジン−7−イル]−3−tert−ブチルウレア(CAS No.:192705−79−6)、E−3810(CAS No.:1058137−23−7)、PD−173074(CAS No.:219580−11−7)、FGFR4−IN−1(CAS No.:1708971−72−5)、FGFR−IN−1(CAS No.:1448169−71−8)、FIIN−2(CAS No.:1633044−56−0)、AZD4547(CAS No.:1035270−39−3)、FIIN−3(CAS No.:1637735−84−2)、NVP−BGJ398(CAS No.:1310746−10−1)、NVP−BGJ398(CAS No.:872511−34−7)、CH5183284(CAS No.:1265229−25−1)、Derazantinib(CAS No.:1234356−69−4)、Derazantinib Racemate、Ferulic acid(CAS No.:1135−24−6)、SSR128129E(CAS No.:848318−25−2)、SSR128129E free acid(CAS No.:848463−13−8)、Erdafitinib(CAS No.:1346242−81−6)、BLU9931(CAS No.:1538604−68−0)、PRN1371(CAS No.:1802929−43−6)、S49076(CAS No.:1265965−22−7)、LY2874455(CAS No.:1254473−64−7)、Linsitinib(CAS No.:867160−71−2)、Dovitinib(CAS No.:405169−16−6)、Anlotinib(CAS No.:1058156−90−3)、Brivanib(CAS No.:649735−46−6)、Derazantinib(CAS No.:1234356−69−4)、Anlotinib Dihydrochloride(CAS No.:1360460−82−7)、ACTB−1003(CAS No.:939805−30−8)、BLU−554(CAS No.:1707289−21−1)、Rogaratinib(CAS No.:1443530−05−9)、BIBF 1120 esylate(CAS No.:656247−18−6)、TG 100572 Hydrochloride(CAS No.:867331−64−4)、ENMD−2076(CAS No.:934353−76−1)、Brivanib alaninate(CAS No.:649735−63−7)、TG 100572(CAS No.:867334−05−2)、BIBF 1120(CAS No.:656247−17−5)、ENMD−2076 Tartrate(CAS No.:1291074−87−7)、TSU−68(CAS No.:252916−29−3)、Ponatinib(CAS No.:943319−70−8)、Sulfatinib(CAS No.:1308672−74−3)、LY2784544(CAS No.:1229236−86−5)、Dovitinib lactate(CAS No.:692737−80−7)、SU 5402(CAS No.:215543−92−3)、FGF−401(CAS No.:1708971−55−4)、Tyrosine kinase−IN−1(CAS No.:705946−27−6)、PP58(CAS No.:212391−58−7)、TG 100801 Hydrochloride(CAS No.:1018069−81−2)、Crenolanib(CAS No.:670220−88−9)、TG 100801(CAS No.:867331−82−6)、Pazopanib Hydrochloride(CAS No.:635702−64−6)、Pazopanib(CAS No.:444731−52−6)、PD168393(CAS No.:194423−15−9)、Apatinib(CAS No.:1218779−75−9)、Palbociclib isethionate(CAS No.:827022−33−3)、Foretinib(CAS No.:849217−64−7)、Lenvatinib(CAS No.:417716−92−8)、Tandutinib(CAS No.:387867−13−2)、又はそれらの塩である、[1]〜[4]のいずれかの方法。
[6] FGFR1阻害剤で処理したインスリン産生細胞集団を分化させる工程が、動物に移植することにより行われる、[2]〜[5]のいずれかの方法。
[7] インスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団の製造方法であって、
内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞の集団を5μM未満のFGFR1阻害剤で処理する工程、
を含む方法。
[8] 内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団中に存在するKi67陽性細胞の減少又は増殖を抑制する方法であって、
該細胞集団をFGFR1阻害剤で処理することを含む、方法。
[8−1] 内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団中に存在するKi67陽性細胞の増殖を抑制する方法であって、
該細胞集団をFGFR1阻害剤で処理することを含む、方法。
[8−2] 前記細胞集団中に存在するKi67陽性細胞の絶対数を減少させる、[8]の方法。
[8−3] 前記細胞集団中に存在する内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞で、且つKi67陽性細胞でない細胞の数を減少させない、[8]、[8−1]、[8−2]のいずれか方法。
[9] 内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団がインスリン産生細胞集団である、[8]〜[8−3]のいずれかの方法。
[10] 内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を5μM未満のFGFR1阻害剤で処理する、[8]〜[9]のいずれかの方法。
[11] FGFR1阻害剤が1−[2−アミノ−6−(3,5−ジメトキシフェニル)−ピリド(2,3−d)ピリミジン−7−イル]−3−tert−ブチルウレア又はその塩である、[8]〜[10]のいずれかの方法。
[12] Ki67陽性細胞を3%未満の割合で含む、膵前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団。
[12−1] Ki67陽性細胞を2%未満の割合で含む、膵前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団。
[12−2] Ki67陽性細胞を1%未満の割合で含む、膵前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団。
[12A] Ki67陽性細胞を3%未満の割合で含む、内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団。
[12A−1] Ki67陽性細胞を2%未満の割合で含む、内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団。
[12A−2] Ki67陽性細胞を1%未満の割合で含む、内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団。
[13] インスリン産生細胞集団である、[12]〜[12−2]のいずれかの細胞集団。
[14] 移植用に使用される、[12]〜[13]の細胞集団。
[14−1] [12]〜[13]の細胞集団を含む医薬。
[14−2] [12]〜[13]の細胞集団を含むプロドラッグ。
[15] インスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団の製造方法であって、
(0)本明細書中に記載されているいずれかの方法(例えば、段落[0058]から[0106]のいずれかの方法)を含む工程、
(1)インスリン産生細胞集団または膵β細胞集団をFGFR1阻害剤で処理する工程、および
(2)FGFR1阻害剤で処理したインスリン産生細胞集団を分化させる工程、
を含む方法。
[16] インスリン産生細胞集団または膵β細胞集団の製造方法であって、
(1)インスリン産生細胞集団または膵β細胞集団をFGFR1阻害剤で処理する工程、ならびに(2)アルギン酸を含むゲル中にインスリン産生細胞集団を包埋する工程、
を含む方法。
[17] インスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団の製造方法であって、
(0)標的細胞集団を純化する方法により、標的細胞集団の純度を少なくとも70%以上にする工程、
(1)インスリン産生細胞集団または膵β細胞集団をFGFR1阻害剤で処理する工程、および
(2)FGFR1阻害剤で処理したインスリン産生細胞集団を分化させる工程、
を含む方法。
[18]FGFR1阻害剤で処理した細胞集団を移植する工程を含む、糖尿病の治療方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2018−082606号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
以下、本明細書において記載される用語について説明する。
本明細書において、「増殖を抑制」とは、本発明方法の実施に起因して細胞数が顕著に増加しないことを意味し、当該方法の実施前の細胞数と当該方法の実施後の細胞数との間に顕著な増加がないことを意味する。本発明方法の実施前と比べた実施後の細胞の増加率が、30%以下、20%以下、10%以下、または5%以下である場合も含まれる。
本発明は、Ki67陽性細胞の増殖が抑制された内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団に関するものであり、これらの細胞集団はFGFR1阻害剤で処理することにより得ることができる。
「Ki67」は細胞周期関連核タンパク質として公知であり、増殖中の細胞のG1期、S期、G2期、M期において発現が認められ、増殖を休止しているG0期においては発現が認められないため、細胞増殖と細胞周期のマーカーとしても知られている。
NGN3発現量は、定量的RT−PCRで測定することができる。所定の段階にある細胞よりCells−to−CT kit(Thermo Fisher Scientific)で作製したcDNAを用いNGN3およびGAPDHに対するTaqManプローブ/プライマー配列セットを用い測定した後、GAPDHに対する相対的発現量をNGN3の遺伝子発現量とする。
インスリン産生細胞集団はさらに、内分泌前駆細胞からの分化工程において初期の段階に現れる「前期インスリン産生細胞集団」と、さらに分化が進んだ段階に現れる「後期インスリン産生細胞集団」に分けることができ、後期インスリン産生細胞集団は特に、インスリン陽性/NKX6.1陽性細胞(INS/NKX6.1両陽性細胞)が20%以上の割合で含まれることにより特徴付けることができる。
工程1)多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞へと分化誘導する;
工程2)胚体内胚葉細胞から原腸管細胞へと分化誘導する;
工程3)原腸管細胞から後方前腸細胞へと分化誘導する;
工程4)後方前腸細胞から膵前駆細胞へと分化誘導する;
工程5)膵前駆細胞から内分泌前駆細胞へと分化誘導する;
工程6)内分泌前駆細胞からインスリン産生細胞へと分化誘導する。
以下、各工程を説明するが、各細胞への分化誘導はこれらの手法に限定されない。
多能性幹細胞は、まず胚体内胚葉細胞に分化させる。多能性幹細胞から胚体内胚葉を誘導する方法は既に公知であり、そのいずれの方法を用いてもよい。好ましくは、多能性幹細胞は、アクチビンAを含む培地、より好ましくはアクチビンA、ROCK阻害剤、GSK3β阻害剤を含む培地で培養して、胚体内胚葉細胞に分化させる。培養開始時の細胞数としては、特に限定されず、22000〜150000cells/cm2、好ましくは22000〜100000cells/cm2、より好ましくは22000〜80000cells/cm2である。培養期間は1日〜4日、好ましくは1日〜3日、特に好ましくは3日である。
別の態様として、アクチビンAは培地中に低用量にて、例えば、5〜100ng/mL、好ましくは5〜50ng/mL、より好ましくは5〜10ng/mLの量にて含めることができる。
別の態様として、アクチビンAの培地中の濃度は、約0.1〜100ng/ml、好ましくは約1〜50ng/ml、より好ましくは約3〜10ng/mlである。
培地にはさらに、インスリンを添加することができる。インスリンは培地中に0.01〜20μM、好ましくは0.1〜10μM、より好ましくは0.5〜5μMの量で含めることができる。培地中のインスリンの濃度は、添加したB−27サプリメントに含まれるインスリンの濃度であってもよいが、これに限定されない。
工程1)で得られた胚体内胚葉細胞を、さらに増殖因子を含む培地で培養して原腸管細胞に分化誘導する。培養期間は2日〜8日、好ましくは約4日である。
工程2)で得られた原腸管細胞を、さらに増殖因子、シクロパミン、ノギン等を含む培地で培養し、後方前腸細胞に分化誘導する。培養期間は1日〜5日、好ましくは約2日程度である。培養は2次元培養及び3次元培養のいずれで行ってもよい。
工程3)で得られた後方前腸細胞を、さらにCDK8/19阻害活性を有する因子を含む培地、好ましくはCDK8/19阻害活性を有する因子と増殖因子を含む培地で培養し、膵前駆細胞に分化誘導する。培養期間は2日〜10日、好ましくは約5日程度である。培養は2次元培養及び3次元培養のいずれで行ってもよい。
また、培地にはジメチルスルホキシド、アクチビン(1〜50ng/ml)を添加してもよい。
いずれの工程においても、培地には、上記した成分のほか、血清代替物(例えば、B−27サプリメント、ITS−G)を添加してもよい。また、必要に応じて、アミノ酸、L−グルタミン、GlutaMAX(製品名)、非必須アミノ酸、ビタミン、ニコチンアミド、抗生物質(例えば、Antibiotic−Antimycotic(本明細書中、AAと称することがある)、ペニシリン、ストレプトマイシン、又はこれらの混合物)、抗菌剤(例えば、アンホテリシンB)、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を添加してもよい。培地に抗生物質を添加する場合には、その培地中の濃度は通常0.01〜20重量%、好ましくは0.1〜10重量%である。培養は2次元培養及び3次元培養のいずれで行ってもよい。
工程4)で得られた膵前駆細胞を、さらに増殖因子を含む培地で培養して内分泌前駆細胞に分化誘導する。培養は2次元培養及び3次元培養のいずれで行ってもよい。2次元培養の場合には、工程4)で得られた膵前駆細胞を、0.25%トリプシン−EDTAで処理後にピペッティングすることにより分散し、0.25%トリプシン−EDTAを遠心分離して懸濁した後、工程5)の新しい培地に再播種する。培養期間は2日〜3日、好ましくは約2日である。
培地は、工程1)と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、既報(Nature Biotechnology 2014;32:1121−1133)に従い、SANT1、レチノイン酸、ALK5インヒビターII、T3、LDNを添加し、さらに、Wnt阻害薬、ROCK阻害剤、FGF(好ましくはFGF2)、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。
培養は、フィーダー細胞を使用せず、非接着培養にて行う。培養時には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、多孔プレート(Nunc社)等あるいはバイオリアクターが使用される。培養容器は、細胞との接着性を低下させるための表面処理されていることが好ましい。
培養温度は、特に限定されないが、30〜40℃(例えば、37℃)で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば5%程度である。
工程5)で得られた内分泌前駆細胞を、さらに増殖因子を含む培地で培養してインスリン産生細胞に分化誘導する。培養期間は10日〜30日、好ましくは約10〜20日である。
培地は、工程1)と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、既報(Nature Biotechnology 2014;32:1121−1133)に従い、ALK5インヒビターII、T3、LDN、γ−secretase阻害剤XX、γ−secretase阻害剤RO、N−システイン、AXLインヒビター、アスコルビン酸を添加し、さらに、Wnt阻害薬、ROCK阻害剤、FGF(好ましくはFGF2)、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。例えば、培地にはALK5インヒビターII、T3、LDN、γ−secretase阻害剤RO、及びアスコルビン酸を添加してもよく、あるいはT3、ALK5インヒビターII、ZnSO4、ヘパリン、N−アセチルシステイン、Trolox、及びR428を添加してもよい。
培養は2次元培養及び3次元培養のいずれで行ってもよい。培養は、フィーダー細胞を使用せず、非接着培養にて行う。培養時には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、多孔プレート(Nunc社)等あるいはバイオリアクターが使用される。培養容器は、細胞との接着性を低下させるための表面処理されていることが好ましい。
培養温度は、特に限定されないが、30〜40℃(例えば、37℃)で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば5%程度である。
上記工程で得られた細胞は、膵β細胞に分化誘導することができる。膵β細胞集団へと分化させる工程は、内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団、好ましくはインスリン産生細胞集団、を動物生体内に移植することによって行うことができる。
架橋剤溶液には、0.1〜10重量%、例えば、0.1〜5重量%、から選択される量の架橋剤を含めることができる。
化合物Iは下記式1:
好ましくは、式中、環ABは、3個の置換基を有する2環式含窒素複素環を示す。
置換基としては、以下で示した置換基もしくは化合物群Dが有している置換基が挙げられ、好ましくは化合物群Dが有している置換基を示す。
化合物IIは下記式2:
環D以外に1以上の含窒素複素環を含むことを示す。〕で表される化合物またはその塩が挙げられる。
好ましくは、式中、環Dは、置換基を有していてもよい、窒素を1または2含む芳香環を示す。
また、好ましくは、環D以外の1以上の含窒素複素環としては、置換基を有していてもよいピペラジンが挙げられる。
置換基としては、以下で示した置換基もしくは化合物群Dが有している置換基が挙げられ、好ましくは化合物群Dが有している置換基を示す。
ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、ベンゾイミダゾール、ベンゾオキサゾール、ベンゾイソオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾイソチアゾール、ベンゾトリアゾール、イミダゾピリジン、チエノピリジン、フロピリジン、ピロロピリジン、ピラゾロピリジン、オキサゾロピリジン、チアゾロピリジン、イミダゾピラジン、イミダゾピリミジン、チエノピリミジン、フロピリミジン、ピロロピリミジン、ピラゾロピリミジン、オキサゾロピリミジン、チアゾロピリミジン、ピラゾロピリミジン、ピラゾロトリアジン、ナフト[2,3−b]チオフェン、フェノキサチイン、インド−ル、イソインドール、1H−インダゾール、プリン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、カルバゾール、β−カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナジン、フェノチアジン、フェノキサジンなどの8ないし14員縮合多環式(好ましくは2または3環式)芳香族複素環が挙げられる。
ジヒドロベンゾフラン、ジヒドロベンゾイミダゾール、ジヒドロベンゾオキサゾール、ジヒドロベンゾチアゾール、ジヒドロベンゾイソチアゾール、ジヒドロナフト[2,3−b]チオフェン、テトラヒドロイソキノリン、テトラヒドロキノリン、4H−キノリジン、インドリン、イソインドリン、テトラヒドロチエノ[2,3−c]ピリジン、テトラヒドロベンゾアゼピン、テトラヒドロキノキサリン、テトラヒドロフェナントリジン、ヘキサヒドロフェノチアジン、ヘキサヒドロフェノキサジン、テトラヒドロフタラジン、テトラヒドロナフチリジン、テトラヒドロキナゾリン、テトラヒドロシンノリン、テトラヒドロカルバゾール、テトラヒドロ−β−カルボリン、テトラヒドロアクリジン、テトラヒドロフェナジン、テトラヒドロチオキサンテン、オクタヒドロイソキノリンなどの9ないし14員縮合多環式(好ましくは2または3環式)非芳香族複素環が挙げられる。
[置換基群A]
(1)ハロゲン原子、
(2)ニトロ基、
(3)シアノ基、
(4)オキソ基、
(5)ヒドロキシ基、
(6)ハロゲン化されていてもよいC1−6アルコキシ基、
(7)C6−14アリールオキシ基(例、フェノキシ、ナフトキシ)、
(8)C7−16アラルキルオキシ基(例、ベンジルオキシ)、
(9)5ないし14員芳香族複素環オキシ基(例、ピリジルオキシ)、
(10)3ないし14員非芳香族複素環オキシ基(例、モルホリニルオキシ、ピペリジニルオキシ)、
(11)C1−6アルキル−カルボニルオキシ基(例、アセトキシ、プロパノイルオキシ)、
(12)C6−14アリール−カルボニルオキシ基(例、ベンゾイルオキシ、1−ナフトイルオキシ、2−ナフトイルオキシ)、
(13)C1−6アルコキシ−カルボニルオキシ基(例、メトキシカルボニルオキシ、エトキシカルボニルオキシ、プロポキシカルボニルオキシ、ブトキシカルボニルオキシ)、
(14)モノ−またはジ−C1−6アルキル−カルバモイルオキシ基(例、メチルカルバモイルオキシ、エチルカルバモイルオキシ、ジメチルカルバモイルオキシ、ジエチルカルバモイルオキシ)、
(15)C6−14アリール−カルバモイルオキシ基(例、フェニルカルバモイルオキシ、ナフチルカルバモイルオキシ)、
(16)5ないし14員芳香族複素環カルボニルオキシ基(例、ニコチノイルオキシ)、
(17)3ないし14員非芳香族複素環カルボニルオキシ基(例、モルホリニルカルボニルオキシ、ピペリジニルカルボニルオキシ)、
(18)ハロゲン化されていてもよいC1−6アルキルスルホニルオキシ基(例、メチルスルホニルオキシ、トリフルオロメチルスルホニルオキシ)、
(19)C1−6アルキル基で置換されていてもよいC6−14アリールスルホニルオキシ基(例、フェニルスルホニルオキシ、トルエンスルホニルオキシ)、
(20)ハロゲン化されていてもよいC1−6アルキルチオ基、
(21)5ないし14員芳香族複素環基、
(22)3ないし14員非芳香族複素環基、
(23)ホルミル基、
(24)カルボキシ基、
(25)ハロゲン化されていてもよいC1−6アルキル−カルボニル基、
(26)C6−14アリール−カルボニル基、
(27)5ないし14員芳香族複素環カルボニル基、
(28)3ないし14員非芳香族複素環カルボニル基、
(29)C1−6アルコキシ−カルボニル基、
(30)C6−14アリールオキシ−カルボニル基(例、フェニルオキシカルボニル、1−ナフチルオキシカルボニル、2−ナフチルオキシカルボニル)、
(31)C7−16アラルキルオキシ−カルボニル基(例、ベンジルオキシカルボニル、フェネチルオキシカルボニル)、
(32)カルバモイル基、
(33)チオカルバモイル基、
(34)モノ−またはジ−C1−6アルキル−カルバモイル基、
(35)C6−14アリール−カルバモイル基(例、フェニルカルバモイル)、
(36)5ないし14員芳香族複素環カルバモイル基(例、ピリジルカルバモイル、チエニルカルバモイル)、
(37)3ないし14員非芳香族複素環カルバモイル基(例、モルホリニルカルバモイル、ピペリジニルカルバモイル)、
(38)ハロゲン化されていてもよいC1−6アルキルスルホニル基、
(39)C6−14アリールスルホニル基、
(40)5ないし14員芳香族複素環スルホニル基(例、ピリジルスルホニル、チエニルスルホニル)、
(41)ハロゲン化されていてもよいC1−6アルキルスルフィニル基、
(42)C6−14アリールスルフィニル基(例、フェニルスルフィニル、1−ナフチルスルフィニル、2−ナフチルスルフィニル)、
(43)5ないし14員芳香族複素環スルフィニル基(例、ピリジルスルフィニル、チエニルスルフィニル)、
(44)アミノ基、
(45)モノ−またはジ−C1−6アルキルアミノ基(例、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、ブチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、ジブチルアミノ、N−エチル−N−メチルアミノ)、
(46)モノ−またはジ−C6−14アリールアミノ基(例、フェニルアミノ)、
(47)5ないし14員芳香族複素環アミノ基(例、ピリジルアミノ)、
(48)C7−16アラルキルアミノ基(例、ベンジルアミノ)、
(49)ホルミルアミノ基、
(50)C1−6アルキル−カルボニルアミノ基(例、アセチルアミノ、プロパノイルアミノ、ブタノイルアミノ)、
(51)(C1−6アルキル)(C1−6アルキル−カルボニル)アミノ基(例、N−アセチル−N−メチルアミノ)、
(52)C6−14アリール−カルボニルアミノ基(例、フェニルカルボニルアミノ、ナフチルカルボニルアミノ)、
(53)C1−6アルコキシ−カルボニルアミノ基(例、メトキシカルボニルアミノ、エトキシカルボニルアミノ、プロポキシカルボニルアミノ、ブトキシカルボニルアミノ、tert−ブトキシカルボニルアミノ)、
(54)C7−16アラルキルオキシ−カルボニルアミノ基(例、ベンジルオキシカルボニルアミノ)、
(55)C1−6アルキルスルホニルアミノ基(例、メチルスルホニルアミノ、エチルスルホニルアミノ)、
(56)C1−6アルキル基で置換されていてもよいC6−14アリールスルホニルアミノ基(例、フェニルスルホニルアミノ、トルエンスルホニルアミノ)、
(57)ハロゲン化されていてもよいC1−6アルキル基、
(58)C2−6アルケニル基、
(59)C2−6アルキニル基、
(60)C3−10シクロアルキル基、
(61)C3−10シクロアルケニル基、及び
(62)C6−14アリール基。
該「芳香族複素環基」の好適な例としては、チエニル、フリル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、1,2,4−オキサジアゾリル、1,3,4−オキサジアゾリル、1,2,4−チアジアゾリル、1,3,4−チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニルなどの5ないし6員単環式芳香族複素環基;
ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾトリアゾリル、イミダゾピリジニル、チエノピリジニル、フロピリジニル、ピロロピリジニル、ピラゾロピリジニル、オキサゾロピリジニル、チアゾロピリジニル、イミダゾピラジニル、イミダゾピリミジニル、チエノピリミジニル、フロピリミジニル、ピロロピリミジニル、ピラゾロピリミジニル、オキサゾロピリミジニル、チアゾロピリミジニル、ピラゾロトリアジニル、ナフト[2,3−b]チエニル、フェノキサチイニル、インドリル、イソインドリル、1H−インダゾリル、プリニル、イソキノリル、キノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、カルバゾリル、β−カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニルなどの8ないし14員縮合多環式(好ましくは2または3環式)芳香族複素環基が挙げられる。
該「非芳香族複素環基」の好適な例としては、アジリジニル、オキシラニル、チイラニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロフラニル、ピロリニル、ピロリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、テトラヒドロイソチアゾリル、テトラヒドロオキサゾリル、テトラヒドロイソオキサゾリル、ピペリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロピリジニル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロピリダジニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、モルホリニル、チオモルホリニル、アゼパニル、ジアゼパニル、アゼピニル、オキセパニル、アゾカニル、ジアゾカニルなどの3ないし8員単環式非芳香族複素環基;
ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾイミダゾリル、ジヒドロベンゾオキサゾリル、ジヒドロベンゾチアゾリル、ジヒドロベンゾイソチアゾリル、ジヒドロナフト[2,3−b]チエニル、テトラヒドロイソキノリル、テトラヒドロキノリル、4H−キノリジニル、インドリニル、イソインドリニル、テトラヒドロチエノ[2,3−c]ピリジニル、テトラヒドロベンゾアゼピニル、テトラヒドロキノキサリニル、テトラヒドロフェナントリジニル、ヘキサヒドロフェノチアジニル、ヘキサヒドロフェノキサジニル、テトラヒドロフタラジニル、テトラヒドロナフチリジニル、テトラヒドロキナゾリニル、テトラヒドロシンノリニル、テトラヒドロカルバゾリル、テトラヒドロ−β−カルボリニル、テトラヒドロアクリジニル、テトラヒドロフェナジニル、テトラヒドロチオキサンテニル、オクタヒドロイソキノリルなどの9ないし14員縮合多環式(好ましくは2または3環式)非芳香族複素環基が挙げられる。
ここで、炭化水素−スルホニル基とは、炭化水素基が結合したスルホニル基を、複素環−スルホニル基とは、複素環基が結合したスルホニル基を、炭化水素−スルフィニル基とは、炭化水素基が結合したスルフィニル基を、複素環−スルフィニル基とは、複素環基が結合したスルフィニル基を、それぞれ意味する。
「アシル基」の好適な例としては、ホルミル基、カルボキシ基、C1−6アルキル−カルボニル基、C2−6アルケニル−カルボニル基(例、クロトノイル)、C3−10シクロアルキル−カルボニル基(例、シクロブタンカルボニル、シクロペンタンカルボニル、シクロヘキサンカルボニル、シクロヘプタンカルボニル)、C3−10シクロアルケニル−カルボニル基(例、2−シクロヘキセンカルボニル)、C6−14アリール−カルボニル基、C7−16アラルキル−カルボニル基、5ないし14員芳香族複素環カルボニル基、3ないし14員非芳香族複素環カルボニル基、C1−6アルコキシ−カルボニル基、C6−14アリールオキシ−カルボニル基(例、フェニルオキシカルボニル、ナフチルオキシカルボニル)、C7−16アラルキルオキシ−カルボニル基(例、ベンジルオキシカルボニル、フェネチルオキシカルボニル)、カルバモイル基、モノ−またはジ−C1−6アルキル−カルバモイル基、モノ−またはジ−C2−6アルケニル−カルバモイル基(例、ジアリルカルバモイル)、モノ−またはジ−C3−10シクロアルキル−カルバモイル基(例、シクロプロピルカルバモイル)、モノ−またはジ−C6−14アリール−カルバモイル基(例、フェニルカルバモイル)、モノ−またはジ−C7−16アラルキル−カルバモイル基、5ないし14員芳香族複素環カルバモイル基(例、ピリジルカルバモイル)、チオカルバモイル基、モノ−またはジ−C1−6アルキル−チオカルバモイル基(例、メチルチオカルバモイル、N−エチル−N−メチルチオカルバモイル)、モノ−またはジ−C2−6アルケニル−チオカルバモイル基(例、ジアリルチオカルバモイル)、モノ−またはジ−C3−10シクロアルキル−チオカルバモイル基(例、シクロプロピルチオカルバモイル、シクロヘキシルチオカルバモイル)、モノ−またはジ−C6−14アリール−チオカルバモイル基(例、フェニルチオカルバモイル)、モノ−またはジ−C7−16アラルキル−チオカルバモイル基(例、ベンジルチオカルバモイル、フェネチルチオカルバモイル)、5ないし14員芳香族複素環チオカルバモイル基(例、ピリジルチオカルバモイル)、スルフィノ基、C1−6アルキルスルフィニル基(例、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル)、スルホ基、C1−6アルキルスルホニル基、C6−14アリールスルホニル基、ホスホノ基、モノ−またはジ−C1−6アルキルホスホノ基(例、ジメチルホスホノ、ジエチルホスホノ、ジイソプロピルホスホノ、ジブチルホスホノ)が挙げられる。
また、これらの化合物は、FGFR1阻害活性を有する限り、好ましくはFGFR1の50%阻害濃度(IC50)が100nM以下である限り、一部の部分構造(置換基、環等)が変換されていてもよい。
なお、以下試験によりCAS192705−79−6はFGFR1、FGFR2、FGFR3及びFGFR4について阻害活性を有することが分かっている。リコンビナントタンパク質として調製したFGFR1、FGFR2、FGFR3及びFGFR4に結合する蛍光プローブを、CAS192705−79−6の存在下又は非存在下で作用させ、蛍光シグナルをプレートリーダーで検出した。CAS192705−79−6の存在下又は非存在下における蛍光シグナルの変動から、CAS192705−79−6の各タンパク質に対する阻害活性(pIC50)を算出した。
本発明において、FGFR1阻害剤により処理される細胞(スターティングマテリアルの細胞)におけるKi67陽性細胞の割合は特に限定されないが、1%以上、5%以上、10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上であってもよい。
本発明において、FGFR1阻害剤により処理される細胞(スターティングマテリアルの細胞)におけるアルカリフォスファターゼ陽性細胞の割合は特に限定されないが、10%以下、5%以下、1%以下、0.5%以下であってもよい。
本手法は、テラトーマの増殖を抑制するのでなく、膵系譜に含まれる増殖性細胞の残存数を減少または抑制することができる。
本手法は、iPS細胞の増殖を抑制するのでなく(例えば、アルカリフォスファターゼ陽性細胞の数を減少させなくてもよい)、膵系譜に含まれる増殖性細胞の残存数を減少または抑制することができる。
1.方法
(1)インスリン産生細胞集団の作製
内分泌前駆細胞集団からインスリン産生細胞集団への分化誘導は、上記工程6)や既報(Nature Biotechnology 2014;32:1121−1133)に従い実施した。
iPS細胞から分化誘導して得られた内分泌前駆細胞集団を分化因子(ALK5インヒビターII、T3、LDN、γ−secretase阻害剤RO、アスコルビン酸)とFGF受容体1阻害剤(CAS192705−79−6)を含む分化誘導培地(Improved MEM/1%B27/Penisilin Streptomycin)で12日間培養して、インスリン産生細胞集団を得た。得られた細胞集団中のKi67陽性細胞数をフローサイトメトリーにより評価した。
以下マウスの準備や細胞の移植は公知の方法に準じて行った。
ストレプトゾトシンによりインスリン欠乏性の糖尿病を誘発させた免疫不全NOD/SCIDマウスを用いて、上記(1)で得られたCAS192705−79−6を含む分化誘導培地、または比較例として含まない分化誘導培地で培養して得られたインスリン産生細胞集団を腎被膜下に移植した。移植後の経過観察は血中ヒトC−ペプチド濃度と血糖値を測定した。移植5週後の時点で移植片を摘出した。
摘出した移植片を固定、脱水後に凍結切片を作製し、目的外細胞について評価するために免疫組織染色を実施した。生体内において膵島細胞への成熟が期待できる目的細胞はインスリン陽性(かつNKX6.1陽性)又はグルカゴン陽性を、目的細胞の長期生着に悪影響を及ぼす可能性がある目的外細胞はKi67陽性を指標として評価した。
(1)インスリン産生細胞集団の作製
CAS192705−79−6(1μM)を含む分化誘導培地で12日間処理する実験を5回行い、得られた細胞集団中のKi67陽性細胞率±標準偏差の結果を表1に示す。内分泌前駆細胞集団をCAS192705−79−6で12日間処理した場合、得られた細胞集団中のKi67陽性細胞率は、対照と比べて顕著に少なかった。この結果は、内分泌前駆細胞集団をCAS192705−79−6で処理することにより、Ki67陽性細胞を減少させる、又はその増殖が抑制されることを示す。
移植後の経過観察として測定した血中ヒトC−ペプチド濃度と血糖値の結果を表2に示す。CAS192705−79−6(1μM)を含む分化誘導培地で12日間処理して得られたインスリン産生細胞集団は、移植4ヵ月後において血液中にヒトC−ペプチドを分泌し、高血糖改善作用を示し、それらのレベルはCAS192705−79−6で処理せず得られたインスリン産生細胞集団を移植した場合と同等であった。
移植後5週間で摘出した移植片の免疫組織染色の結果を図1に示す。
CAS192705−79−6(1μM)を含む分化誘導培地で12日間処理して得られたインスリン産生細胞集団を腎被膜下に移植した場合、CAS192705−79−6で処理せず得られたインスリン産生細胞集団を腎被膜下に移植した場合に比較して、移植片の肥大化の大幅な抑制が認められた。この結果は、内分泌前駆細胞集団をCAS192705−79−6で処理することにより、目的外細胞であるKi67陽性細胞を減少させる、又はその増殖が抑制されることを示す。
1.方法
1) iPS細胞から分化誘導して得られた内分泌前駆細胞集団を分化因子(ALK5インヒビターII、T3、LDN、γ−secretase阻害剤RO、アスコルビン酸)とFGF受容体1阻害剤(CAS192705−79−6)を含む分化誘導培地(Improved MEM/1%B27/Penisilin Streptomycin)で11日間培養して、インスリン産生細胞集団を得た。
2)iPS細胞から分化誘導して得られた内分泌前駆細胞集団を分化因子(ALK5インヒビターII、T3、LDN、γ−secretase阻害剤RO、アスコルビン酸)を含む分化誘導培地(Improved MEM/1%B27/Penisilin Streptomycin)で4日間培養してインスリン産生細胞集団に分化誘導した。次いで、分化因子(ALK5インヒビターII、T3、LDN、γ−secretase阻害剤RO、アスコルビン酸)を含む分化誘導培地(Improved MEM/1%B27/Penisilin Streptomycin)にFGF受容体1阻害剤(CAS192705−79−6、1μM)を添加して7日間培養した。
3)iPS細胞から分化誘導して得られた内分泌前駆細胞集団を分化因子(ALK5インヒビターII、T3、LDN、γ−secretase阻害剤RO、アスコルビン酸)を含む分化誘導培地(Improved MEM/1%B27/Penisilin Streptomycin)で7日間培養してインスリン産生細胞集団に分化誘導した。次いで、分化因子(ALK5インヒビターII、T3、LDN、γ−secretase阻害剤RO、アスコルビン酸)を含む分化誘導培地(Improved MEM/1%B27/Penisilin Streptomycin)にFGF受容体1阻害剤(CAS192705−79−6、1μM)を添加して4日間培養した。
4)iPS細胞から分化誘導して得られた内分泌前駆細胞集団を分化因子(ALK5インヒビターII、T3、LDN、γ−secretase阻害剤RO、アスコルビン酸)を含み、かつCAS192705−79−6を含まない分化誘導培地(Improved MEM/1%B27/Penisilin Streptomycin)で11日間培養してインスリン産生細胞集団に分化誘導した。
また、上記1)、2)、及び3)の各方法で得られた細胞集団中のインスリン陽性(かつNKX6.1陽性)細胞数をフローサイトメトリーにより計数し、各方法におけるインスリン陽性(かつNKX6.1陽性)細胞率を、上記4)の方法で得られた対照細胞集団中におけるインスリン陽性(かつNKX6.1陽性)細胞数を100%とする相対値にて算出した。
各方法を用いてそれぞれ3回繰り返し、インスリン産生細胞製造工程においてCAS192705−79−6で処理するタイミングの影響を評価した。各方法で得られたKi67陽性細胞率及びインスリン陽性(かつNKX6.1陽性)細胞率の平均値±標準偏差の結果を表3に示す。
得られた細胞集団中のKi67陽性細胞率はCAS192705−79−6を用いて、分化誘導工程の開始時点から処理した場合、最後の7日間処理した場合、最後の4日間処理した場合の間で有意な差異は認められず、いずれの場合においても、対照と比べて顕著に少なかった。この結果は、インスリン産生細胞または膵β細胞製造過程でCAS192705−79−6処理を行うことによって、細胞集団中のKi67陽性細胞を減少させる、又はその増殖を抑制できることを示す。
一方、インスリン陽性(かつNKX6.1陽性)細胞率については、分化誘導工程の開始時点から処理した場合と、最後の7日間又は4日間処理した場合とで、顕著な差異が認められた。すなわち、分化誘導工程の開始時点で(内分泌前駆細胞集団を)CAS192705−79−6処理した場合には、目的細胞であるインスリン陽性(NKX6.1陽性)細胞数の顕著な減少が認められるが、分化誘導開始から4日後、又は7日後の分化がある程度進んだ段階で(前期インスリン産生細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を)CAS192705−79−6処理した場合には、目的細胞であるインスリン陽性(NKX6.1陽性)細胞数はほとんど減少しないことが確認された。
1.方法
iPS細胞から分化誘導して得られた内分泌前駆細胞集団を、分化因子(ALK5インヒビターII、T3、LDN、γ−secretase阻害剤RO、アスコルビン酸)を含む分化誘導培地(Improved MEM/1%B27/Penisilin Streptomycin)で8日間培養し、次いで、分化因子(T3、ALK5インヒビターII、ZnSO4、ヘパリン、N−アセチルシステイン、Trolox、R428)を含む分化誘導培地(MCDB131/20mM Glucose/NaHCO3/FAF−BSA/ITS−X/Glutamax/アスコルビン酸/Penisilin Streptomycin)に、CAS192705−79−6、E−3810、又はPD173074を、それぞれ低、中、高の3つの濃度で添加した培地にて4日間培養した。得られた細胞集団中のKi67陽性細胞数をフローサイトメトリーにより評価した。
CAS192705−79−6又はE−3810で処理し、得られた細胞集団中のKi67陽性細胞率を表4に示す。また、又はPD173074で処理し、得られた細胞集団中のKi67陽性細胞率を表5に示す。
この結果より、CAS192705−79−6に限らず、他のFGFR1阻害剤で処理して得られた細胞集団においても、Ki67陽性細胞率は対照と比べて顕著に少なくなることが確認された。この結果は、CAS192705−79−6処理に限定されることなく、FGFR1の阻害処理によってKi67陽性細胞が減少、又はその増殖が抑制されることを示す。
Claims (9)
- インスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団の製造方法であって、
インスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団を処理開始対象として、FGFR1阻害剤でin vitroにて処理する工程、
を含む方法であり、ここでインスリン産生細胞集団が、インスリン産生細胞を5%以上の割合で含み、かつインスリン及びNKX6.1を発現するインスリン産生細胞を含む、方法。 - さらに、FGFR1阻害剤で処理したインスリン産生細胞集団を分化させる工程、を含む、請求項1に記載の方法。
- インスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団を5μM未満のFGFR1阻害剤で処理する、請求項1又は2に記載の方法。
- 製造された細胞集団が、Ki67陽性細胞を3%未満の割合で含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- FGFR1阻害剤が1−[2−アミノ−6−(3,5−ジメトキシフェニル)−ピリド(2,3−d)ピリミジン−7−イル]−3−tert−ブチルウレア又はその塩である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- インスリン産生細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団中に存在するKi67陽性細胞の減少又は増殖を抑制する方法であって、
該細胞集団を処理開始対象として、FGFR1阻害剤でin vitroにて処理することを含み、インスリン産生細胞集団が、インスリン産生細胞を5%以上の割合で含み、かつインスリン及びNKX6.1を発現するインスリン産生細胞を含む、方法。 - インスリン産生細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団がインスリン産生細胞集団
である、請求項6に記載の方法。 - インスリン産生細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を5μM未満のFGFR1阻害剤で処理する、請求項6又は7に記載の方法。
- FGFR1阻害剤が1−[2−アミノ−6−(3,5−ジメトキシフェニル)−ピリド(2,3−d)ピリミジン−7−イル]−3−tert−ブチルウレア又はその塩である、請求項6〜8のいずれか1項に記載の方法。
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