BR112020021802A2

BR112020021802A2 - métodos para produzir uma população de células produtoras de insulina ou uma população de células beta pancreáticas e para diminuir o número ou inibir a proliferação de células positivas para ki67, e, população de células progenitoras pancreáticas ou células em um estágio posterior de diferenciação

Info

Publication number: BR112020021802A2
Application number: BR112020021802-2A
Authority: BR
Inventors: Noriko Yamazoe; Hideyuki Hiyoshi; Taisuke MOCHIDA; Ryo Ito; Taro Toyoda; Azuma KIMURA
Original assignee: Kyoto University; Takeda Pharmaceutical Company Limited
Priority date: 2018-04-23
Filing date: 2019-04-22
Publication date: 2021-02-23
Also published as: MX2020011189A; EP3812456A4; US20210254014A1; CO2020012343A2; SG11202009855WA; WO2019208505A1; CA3097962A1; IL277806A; CN112313327B; TW201945364A; JP6779509B2; CN112313327A; JPWO2019208505A1; EP3812456A1; KR20210005085A; AU2019261083A1

Abstract

MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA POPULAÇÃO DE CÉLULAS PRODUTORAS DE INSULINA OU UMA POPULAÇÃO DE CÉLULAS BETA PANCREÁTICAS E PARA DIMINUIR O NÚMERO OU INIBIR A PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS POSITIVAS PARA KI67, E, POPULAÇÃO DE CÉLULAS PROGENITORAS PANCREÁTICAS OU CÉLULAS EM UM ESTÁGIO POSTERIOR DE DIFERENCIAÇÃO. A presente invenção refere-se a um método para produzir uma população de células produtoras de insulina ou uma população de células ß do pâncreas na qual as células Ki67 positivas são reduzidas, o método compreendendo o tratamento de uma população de células progenitoras endócrinas ou células adicionalmente diferenciadas com um inibidor de FGFR1.

Description

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MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA POPULAÇÃO DE CÉLULAS PRODUTORAS DE INSULINA OU UMA POPULAÇÃO DE CÉLULAS

BETA PANCREÁTICAS E PARA DIMINUIR O NÚMERO OU INIBIR A PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS POSITIVAS PARA KI67, E,

POPULAÇÃO DE CÉLULAS PROGENITORAS PANCREÁTICAS OU

CÉLULAS EM UM ESTÁGIO POSTERIOR DE DIFERENCIAÇÃO Campo Técnico

[001] A presente invenção se refere a um método para remover células positivas para Ki67 altamente proliferativas presentes em uma população de células produtoras de insulina ou uma população de células β pancreáticas obtida pela indução de diferenciação de células-tronco pluripotentes. [Fundamentos da Técnica]

[002] Pesquisas estão em andamento para induzir a diferenciação de células-tronco pluripotentes, como células iPS ou células ES, em células secretoras de insulina, como células produtoras de insulina ou células β pancreáticas, e para aplicar as células obtidas ao tratamento de diabetes mellitus.

[003] Várias abordagens foram desenvolvidas e relatadas até agora, a fim de induzir a diferenciação de células-tronco pluripotentes em células secretoras de insulina. A Literatura Não Patente 1 afirma que a diferenciação de células progenitoras endócrinas derivadas de células iPS humanas pode ser promovida pelo tratamento das células com CAS192705-79-6 (1-[2-amino-6- (3,5-dimetoxifenil)-pirido(2,3-d)pirimidin-7-il]-3-terc-butilureia), um inibidor do receptor do fator de crescimento de fibroblastos (FGFR) 1.

[004] Os compostos de pirido(2,3-d)pirimidina e naftiridina eficazes para a inibição da proteína tirosina quinase são conhecidos. Os compostos são considerados úteis no tratamento de aterosclerose, restenose e doenças proliferativas celulares de cânceres (Literatura de Patente 1).

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[005] CAS192705-79-6 foi adicionalmente confirmado para inibir a proliferação celular causada pela estimulação de bFGF em mioblastos de rato, mas não inibir a proliferação celular causada pela estimulação de PDGE e para inibir o alongamento de microvasos em vasos sanguíneos da placenta humana, sugerindo sua aplicabilidade como um agente antiproliferativo e/ou um agente antiangiogênico que alveja o crescimento do tumor ou a formação de novos vasos sanguíneos de placas ateroscleróticas (Literatura Não Patente 2).

[006] Enquanto isso, não era conhecido anteriormente que uma população de células produtoras de insulina ou uma população de células β pancreáticas obtida por indução adicional de diferenciação de uma população de células progenitoras endócrinas derivadas de células-tronco pluripotentes ou uma população de células em um estágio posterior de diferenciação inclui células altamente proliferativas. Além disso, nenhuma discussão foi feita sobre a remoção de tais células. Lista de Citação Literatura de Patente

[007] Literatura de Patente 1: WO96/15128 Literatura não Patente

[008] Literatura não Patente 1: Scientific Reports 6, Article number:35908 (2016) Literatura não Patente 2: The journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, July 1998, Vol. 286(1), p.569-577 Sumário da Invenção Problema Técnico

[009] Os inventores do presente pedido verificaram que uma população de células obtida pela indução da diferenciação de células-tronco pluripotentes em células produtoras de insulina ou células β pancreáticas inclui células altamente proliferativas distinguidas por serem positivas para o

3 / 74 marcador Ki67 (daqui em diante, chamadas de “células positivas para Ki67”), juntamente com essas células secretoras de insulina (células produtoras de insulina e células β pancreáticas).

[0010] No caso da aplicação de células secretoras de insulina obtidas pela indução da diferenciação ao tratamento da diabetes mellitus, etc., é muito importante do ponto de vista da segurança controlar estritamente outras células que não as células secretoras de insulina. Além disso, as células coexistentes ou remanescentes altamente proliferativas podem afetar adversamente os receptores ou influenciar a sobrevivência a longo prazo do enxerto de células secretoras de insulina e, portanto, não são preferidas.

[0011] Consequentemente, um objeto da presente invenção é prover uma abordagem para remover células positivas para Ki67 altamente proliferativas que coexistem com células secretoras de insulina obtidas pela indução de diferenciação. Solução para o Problema

[0012] Os inventores do presente pedido conduziram estudos diligentes para atingir o objeto e, consequentemente, verificaram que uma população de células progenitoras endócrinas obtida pela indução de diferenciação de células-tronco pluripotentes ou uma população de células em um estágio posterior de diferenciação é tratada com um inibidor de FGFR1, em que a proliferação de células positivas para Ki67 é inibida de modo que uma população de células produtoras de insulina ou uma população de células β pancreáticas com um teor reduzido de células positivas para Ki67 pode ser obtida.

[0013] A presente invenção é baseada nessas novas verificações e engloba as seguintes invenções.

[0014] [1] Um método para produzir uma população de células produtoras de insulina ou uma população de células β pancreáticas, compreendendo a etapa de tratamento de uma população de células

4 / 74 produtoras de insulina ou uma população de células β pancreáticas com um inibidor de FGFR1.

[0015] [2] O método de acordo com [1], compreendendo adicionalmente a etapa de diferenciação da população de células produtoras de insulina tratada com o inibidor de FGFR1.

[0016] [3] O método de acordo com [1] ou [2], em que a população de células produtoras de insulina ou a população de células β pancreáticas é tratada com menos de 5 µM do inibidor de FGFR1.

[0017] [4] O método de acordo com qualquer um de [1] a [3], em que a população de células produzida compreende células positivas para Ki67 em uma proporção menor que 3%.

[0018] [5] O método de acordo com qualquer um de [1] a [4], em que o inibidor de FGFR1 é 1-[2-amino-6-(3,5-dimetoxifenil)-pirido(2,3- d)pirimidin-7-il]-3-terc-butilureia ou um sal do mesmo.

[0019] [5-1] O método de acordo com qualquer um de [1] a [4], em que o inibidor de FGFR1 é uma substância com uma concentração inibitória de 50% (IC50) de 1 µM ou menor contra FGFR1.

[0020] [5-2] O método de acordo com qualquer um de [1] a [4], em que o inibidor de FGFR1 é 1-[2-amino-6-(3,5-dimetoxifenil)-pirido(2,3- d)pirimidin-7-il]-3-terc-butilureia (nº CAS: 192705-79-6), E-3810 (nº CAS: 1058137-23-7), PD-173074 (nº CAS: 219580-11-7), FGFR4-IN-1 (nº CAS: 1708971-72-5), FGFR-IN-1 (nº CAS: 1448169-71-8), FIIN-2 (nº CAS: 1633044-56-0), AZD4547 (nº CAS: 1035270-39-3), FIIN-3 (nº CAS: 1637735-84-2), NVP-BGJ398 (nº CAS: 1310746-10-1), NVP-BGJ398 (nº CAS: 872511-34-7), CH5183284 (nº CAS: 1265229-25-1), Derazantinibe (nº CAS: 1234356-69-4), Racemato de Derazantinibe, ácido ferúlico (nº CAS: 1135-24-6), SSR128129E (nº CAS: 848318-25-2), ácido livre SSR128129E (nº CAS: 848463-13-8), Erdafitinibe (nº CAS: 1346242-81-6), BLU9931 (nº CAS: 1538604-68-0), PRN1371 (nº CAS: 1802929-43-6), S49076 (nº CAS:

5 / 74 1265965-22-7), LY2874455 (nº CAS: 1254473-64-7), Linsitinibe (nº CAS: 867160-71-2), Dovitinibe (nº CAS: 405169-16-6), Anlotinibe (nº CAS: 1058156-90-3), Brivanibe (nº CAS: 649735-46-6), Derazantinibe (nº CAS: 1234356-69-4), Dicloridrato de Anlotinibe (nº CAS: 1360460-82-7), ACTB- 1003 (nº CAS: 939805-30-8), BLU-554 (nº CAS: 1707289-21-1), Rogaratinibe (nº CAS: 1443530-05-9), esilato BIBF 1120 (nº CAS: 656247- 18-6), cloridrato TG 100572 (nº CAS: 867331-64-4), ENMD-2076 (nº CAS: 934353-76-1), Alaninato de Brivanibe (nº CAS: 649735-63-7), TG 100572 (nº CAS: 867334-05-2), BIBF 1120 (nº CAS: 656247-17-5), tartarato ENMD- 2076 (nº CAS: 1291074-87-7), TSU-68 (nº CAS: 252916-29-3), Ponatinibe (nº CAS: 943319-70-8), Sulfatinibe (nº CAS: 1308672-74-3), LY2784544 (nº CAS: 1229236-86-5), Lactato de Dovitinibe (nº CAS: 692737-80-7), SU 5402 (nº CAS: 215543-92-3), FGF-401 (nº CAS: 1708971-55-4), tirosina quinase- IN-1 (nº CAS: 705946-27-6), PP58 (nº CAS: 212391-58-7), cloridrato TG 100801 (nº CAS: 1018069-81-2), Crenolanibe (nº CAS: 670220-88-9), TG 100801 (nº CAS: 867331-82-6), Cloridrato de Pazopanibe (nº CAS: 635702- 64-6), Pazopanibe (nº CAS: 444731-52-6), PD168393 (nº CAS: 194423-15- 9), Apatinibe (nº CAS: 1218779-75-9), Isetionato de Palbociclibe (nº CAS: 827022-33-3), Foretinibe (nº CAS: 849217-64-7), Lenvatinibe (nº CAS: 417716-92-8), Tandutinibe (nº CAS: 387867-13-2), ou um sal do mesmo.

[0021] [6] O método de acordo com qualquer um de [2] a [5], em que a etapa de diferenciação da população de células produtoras de insulina tratada com o inibidor de FGFR1 é realizada por transplante para um animal.

[0022] [7] Um método para produzir uma população de células produtoras de insulina ou uma população de células β pancreáticas, compreendendo a etapa de tratamento de uma população de células progenitoras endócrinas ou células em um estágio posterior de diferenciação com menos de 5 µM de um inibidor de FGFR1.

[0023] [8] Um método para diminuir o número ou inibir a

6 / 74 proliferação de células positivas para Ki67 presentes em uma população de células progenitoras endócrinas ou células em um estágio posterior de diferenciação, compreendendo tratar a população de células com um inibidor de FGFR1.

[0024] [8-1] Um método para inibir a proliferação de células positivas para Ki67 presentes em uma população de células progenitoras endócrinas ou uma população de células em um estágio posterior de diferenciação, compreendendo tratar a população de células com um inibidor de FGFR1.

[0025] [8-2] O método de acordo com [8], em que o número absoluto de células positivas para Ki67 presentes na população de células é diminuído.

[0026] [8-3] O método de acordo com qualquer um de [8], [8-1] e [8- 2], em que o número de células que são células progenitoras endócrinas ou células em um estágio posterior de diferenciação e não são células positivas para Ki67 presentes na população de células não diminui.

[0027] [9] O método de acordo com qualquer um de [8] a [8-3], em que a população de células progenitoras endócrinas ou células em um estágio posterior de diferenciação é uma população de células produtoras de insulina.

[0028] [10] O método de acordo com [8] ou [9], em que a população de células progenitoras endócrinas ou células em um estágio posterior de diferenciação é tratada com menos de 5 µM do inibidor de FGFR1.

[0029] [11] O método de acordo com qualquer um de [8] a [10], em que o inibidor de FGFR1 é 1-[2-amino-6-(3,5-dimetoxifenil)-pirido(2,3- d)pirimidin-7-il]-3-terc-butilureia ou um sal do mesmo.

[0030] [12] Uma população de células progenitoras pancreáticas ou células em um estágio posterior de diferenciação, compreendendo células positivas para Ki67 em uma proporção de menos de 3%.

[0031] [12-1] Uma população de células progenitoras pancreáticas ou células em um estágio posterior de diferenciação, compreendendo células positivas para Ki67 em uma proporção de menos de 2%.

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[0032] [12-2] Uma população de células progenitoras pancreáticas ou células em um estágio posterior de diferenciação, compreendendo células positivas para Ki67 em uma proporção de menos de 1%.

[0033] [12A] Uma população de células progenitoras endócrinas ou células em um estágio posterior de diferenciação, compreendendo células positivas para Ki67 em uma proporção de menos de 3%.

[0034] [12A-1] Uma população de células progenitoras endócrinas ou células em um estágio posterior de diferenciação, compreendendo células positivas para Ki67 em uma proporção de menos de 2%.

[0035] [12A-2] Uma população de células progenitoras endócrinas ou células em um estágio posterior de diferenciação, compreendendo células positivas para Ki67 em uma proporção de menos de 1%.

[0036] [13] A população de células de acordo com qualquer um de

[12] a [12-2], em que a população de células é uma população de células produtoras de insulina.

[0037] [14] A população de células de acordo com [12] ou [13], em que a população de células é usada para transplante.

[0038] [14-1] Um medicamento que compreende uma população de células de acordo com [12] ou [13].

[0039] [14-2] Um pró-fármaco que compreende uma população de células de acordo com [12] ou [13].

[0040] [15] Um método para produzir uma população de células produtoras de insulina ou uma população de células β pancreáticas, compreendendo as etapas de: (0) incluindo qualquer método aqui descrito (por exemplo, qualquer método descrito nos parágrafos [0058] a [0106]); (1) tratamento de uma população de células produtoras de insulina ou uma população de células β pancreáticas com um inibidor de FGFR1; e

8 / 74 (2) diferenciação da população de células produtoras de insulina tratada com o inibidor de FGFR1.

[0041] [16] Um método para produzir uma população de células produtoras de insulina ou uma população de células β pancreáticas, compreendendo as etapas de: (1) tratamento de uma população de células produtoras de insulina ou uma população de células β pancreáticas com um inibidor de FGFR1; e (2) incorporação da população de células produtoras de insulina em um gel contendo ácido algínico.

[0042] [17] Um método para produzir uma população de células produtoras de insulina ou uma população de células β pancreáticas, compreendendo as etapas de: (0) ajuste da pureza de uma população de células alvo em pelo menos 70% ou mais por um método para purificar a população de células alvo; (1) tratamento de uma população de células produtoras de insulina ou uma população de células β pancreáticas com um inibidor de FGFR1; e (2) diferenciação da população de células produtoras de insulina tratada com o inibidor de FGFR1.

[0043] [18] Um método para o tratamento de diabetes mellitus, compreendendo a etapa de transplante de uma população de células tratada com um inibidor de FGFR1.

[0044] O presente relatório descritivo abrange o conteúdo descrito no relatório descritivo e/ou desenhos do Pedido de Patente Japonesa nº 2018- 082606 em que a prioridade do presente pedido se baseia.

[0045] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes citados neste documento são incorporados neste documento por referência em sua

9 / 74 totalidade. Efeitos Vantajosos da Invenção

[0046] A presente invenção pode prover uma abordagem para remover células positivas para Ki67 altamente proliferativas que coexistem com células secretoras de insulina obtidas pela indução de diferenciação. Breve Descrição do Desenho

[0047] [Figura 1] A Figura 1 mostra os resultados das verificações de autópsia e os resultados da coloração imuno-histológica sobre um enxerto excisado 5 semanas após o transplante de uma população de células produtoras de insulina obtida por (ou sem) tratamento com um inibidor de FGFR1. A ponta da seta preta representa o enxerto. Descrição das Modalidades

1. Terminologia

[0048] A seguir, os termos aqui descritos serão descritos.

[0049] Como aqui usado, “cerca de” refere-se a um valor que pode variar até mais ou menos 25%, 20%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% do valor de referência. Preferivelmente, o termo “cerca de” ou “em torno de” refere-se a uma faixa de menos ou mais 15%, 10%, 5% ou 1% do valor de referência.

[0050] Como aqui usado, “compreende(m)” ou “compreendendo” significa inclusão do(s) elemento(s) após a palavra, sem limitação ao(s) mesmo(s). Consequentemente, indica a inclusão do(s) elemento(s) após a palavra, mas não indica a exclusão de qualquer outro elemento.

[0051] Como aqui usado, “consiste(m) em” ou “consistindo em” significa inclusão de todo(s) o(s) elemento(s) após a frase e limitação ao(s) mesmo(s). Consequentemente, a frase “consiste(m) em” ou “consistindo em” indica que o(s) elemento(s) enumerado(s) é (são) necessário(s) ou essencial(is) e substancialmente nenhum outro elemento existe.

[0052] Como aqui usado, “sem o uso de célula(s) alimentadora(s)”

10 / 74 significa basicamente não conter células alimentadoras e não usar nenhum meio pré-condicionado por cultura de células alimentadoras. Consequentemente, o meio não contém nenhuma substância, como um fator de crescimento ou uma citocina, secretada pelas células alimentadoras.

[0053] “Células alimentadoras” ou “alimentador” significa células que são cocultivadas com outro tipo de células, suportam as células e proveem um ambiente que permite que as células cresçam. As células alimentadoras podem ser derivadas da mesma espécie ou de uma espécie diferente das células que elas suportam. Por exemplo, como um alimentador para células humanas, podem ser usados fibroblastos de pele humana ou células-tronco embrionárias humanas ou pode ser usada uma cultura primária de fibroblastos embrionários murinos ou fibroblastos embrionários murinos imortalizados. As células alimentadoras podem ser inativadas por exposição à radiação ou tratamento com mitomicina C.

[0054] Como aqui usado, “aderido (aderente)” refere-se a células que são fixadas a um recipiente, por exemplo, as células são fixadas a uma placa de cultura de células ou um frasco feito de um plástico esterilizado (ou plástico revestido) na presença de um meio apropriado. Algumas células não podem ser mantidas ou crescer em cultura sem aderir ao recipiente de cultura de células. Em contraste, as células não aderentes podem ser mantidas e proliferar em cultura sem aderir ao recipiente.

[0055] Como aqui usado, “cultura” refere-se à manutenção, crescimento e/ou diferenciação de células em ambiente in vitro. “Cultura” significa manter, proliferar e/ou diferenciar células fora do tecido ou do corpo vivo, por exemplo, em uma placa ou frasco de cultura de células. A cultura inclui cultura bidimensional (cultura plana) e cultura tridimensional (cultura em suspensão).

[0056] Como aqui usado, “enriquece(m)” e “enriquecimento” referem-se a aumentar a quantidade de um determinado componente em uma

11 / 74 composição, tal como uma composição de células e “enriquecido” refere-se, quando usado para descrever uma composição de células, por exemplo, uma população de células, a uma população de células aumentada na quantidade de um determinado componente em comparação com a porcentagem de tal componente na população de células antes do enriquecimento. Por exemplo, uma composição como uma população de células pode ser enriquecida para um tipo de célula alvo e, consequentemente, a porcentagem do tipo de célula alvo é aumentada em comparação com a porcentagem de células alvo presentes na população de células antes do enriquecimento. Uma população de células pode ser enriquecida para um tipo de célula alvo por um método de seleção e classificação de células conhecido na técnica. Uma população de células pode ser enriquecida por um processo específico de classificação ou seleção aqui descrito. Em uma determinada modalidade da presente invenção, uma população de células é enriquecida para uma população de células alvo em pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% , 97%, 98% ou 99% por um método de enriquecimento da população de células alvo.

[0057] Como aqui usado, “esgota(m)” e “esgotamento” referem-se a diminuir a quantidade de um determinado componente em células ou uma composição, tal como uma composição de células e “esgotado” refere-se, quando usado para descrever células ou uma composição de células, por exemplo, uma população de células, a uma população de células diminuída na quantidade de um determinado componente em comparação com a porcentagem de tal componente na população de células antes do esgotamento. Por exemplo, uma composição como uma população de células pode ser esgotada para um tipo de célula alvo e, consequentemente, a porcentagem do tipo de célula alvo é diminuída em comparação com a porcentagem de células alvo presentes na população de células antes do esgotamento. Uma população de células pode ser esgotada para um tipo de

12 / 74 célula alvo por um método de seleção e classificação de células conhecido na técnica. Uma população de células pode ser esgotada por um processo específico de classificação ou seleção aqui descrito. Em uma determinada modalidade da presente invenção, uma população de células é reduzida (esgotada) para uma população de células alvo em pelo menos 50%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ou 99% por um método de esgotamento de uma população de células alvo.

[0058] Como aqui usado, “purifica(m)” e “purificação” referem-se à remoção de impurezas em uma composição, tal como uma composição de células e torná-la pura para um determinado componente e “purificada” refere-se, quando usado para descrever uma composição de células, por exemplo, uma população de células, a uma população de células na qual a quantidade de impurezas é diminuída em comparação com a porcentagem de tais componentes na população de células antes da purificação e a pureza de um determinado componente é melhorada. Por exemplo, uma composição como uma população de células pode ser purificada para um tipo de célula alvo e, consequentemente, a porcentagem do tipo de célula alvo é aumentada em comparação com a porcentagem de células alvo presentes na população de células antes da purificação. Uma população de células pode ser purificada para um tipo de célula alvo por um método de seleção e classificação de células conhecido na técnica. Uma população de células pode ser purificada por um processo específico de classificação ou seleção aqui descrito. Em uma certa modalidade da presente invenção, a pureza de uma população de células alvo é trazida por um método de purificação de uma população de células alvo em pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ou 99% ou na medida em que as impurezas (incluindo células contaminantes) são indetectáveis.

[0059] Como aqui usado, “não diminuir o número de células” significa que o número de células não diminui acentuadamente devido à

13 / 74 execução do método da presente invenção e significa que não há diferença acentuada entre o número de células antes da execução do método e o número de células após a execução do método. No entanto, pode ocorrer uma diminuição no número de células que não é causada pela execução do método da presente invenção (por exemplo, morte natural de células que geralmente pode ocorrer em cultura de células convencionalmente conhecidas e etapas de diferenciação). Assim, “não diminuir o número de células” também inclui o caso em que a taxa de diminuição no número de células após a execução do método da presente invenção daquela antes da execução é 30% ou menos, 20% ou menos, 10 % ou menos, ou 5% ou menos.

[0060] Como aqui usado, “suprimir a proliferação” significa que o número de células não é acentuadamente aumentado devido à execução do método da presente invenção e significa que não há aumento acentuado entre o número de células antes da execução do método e o número de células após a execução do método. “Suprimir a proliferação” também inclui o caso em que a taxa de aumento no número de células após a execução do método da presente invenção daquela antes da execução é 30% ou menos, 20% ou menos, 10% ou menos, ou 5% ou menos.

[0061] Como aqui usado, “marcador” significa um antígeno celular ou um gene do mesmo que é especificamente expresso dependendo de um tipo de célula predeterminado, tal como “proteína marcadora” e “gene marcador”. Preferivelmente, um marcador é um marcador da superfície celular e isso permite a concentração, o isolamento e/ou a detecção de células vivas. Um marcador pode ser um marcador de seleção positivo ou um marcador de seleção negativo.

[0062] A detecção de uma proteína marcadora pode ser conduzida por um ensaio imunológico, por exemplo, ELISA, imunocoloração ou citometria de fluxo usando um anticorpo específico para a proteína marcadora. A detecção de um gene marcador pode ser conduzida por um método de

14 / 74 amplificação e/ou detecção de ácido nucleico conhecido na técnica, por exemplo, RT-PCR, microarranjo, biochip ou similares. Como aqui usado, “positivo” para uma proteína marcadora significa ser detectado como positivo por citometria de fluxo e “negativo” portanto significa ser igual ao ou menor que o limite de detecção inferior na citometria de fluxo. Além disso, “positivo” para um gene marcador significa ser detectado por RT-PCR e “negativo” portanto significa ser igual ao ou menor que o limite de detecção inferior em RT-PCR.

[0063] Como aqui usado, “expressão” é definida como a transcrição e/ou tradução de uma determinada sequência de nucleotídeos conduzida por um promotor intracelular.

[0064] Como aqui usado, “fator com atividade inibidora de CDK8/19” significa qualquer substância com atividade inibidora de CDK8/19. O CDK8, ao contrário das outras proteínas da mesma família CDK, não é necessário para a proliferação celular. A inibição de CDK8 não tem grande efeito nas condições usuais. CDK19 e CDK8 são similares entre si, conforme mencionado acima. Normalmente, a inibição de CDK8 também envolve a inibição de CDK19.

[0065] “Fatores de crescimento” são proteínas endógenas que promovem a diferenciação e/ou proliferação de células específicas. Exemplos de “fatores de crescimento” incluem fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento de fibroblastos ácido (aFGF), fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), fator de crescimento de hepatócitos (HGF), fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1), fator de crescimento semelhante à insulina 2 (IGF-2), fator de crescimento de queratinócitos (KGF), fator de crescimento do nervo (NGF), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento de transformação beta (TGF-β), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), transferrina, várias interleucinas (por exemplo, IL-1 a IL-18), vários fatores estimuladores de

15 / 74 colônias (por exemplo, fator estimulador de colônia de granulócitos/macrófagos (GM-CSF)), vários interferons (por exemplo, IFN-γ, e similares), e outras citocinas com efeitos nas células-tronco, por exemplo, fator de células-tronco (SCF) e eritropoietina (Epo).

[0066] Como aqui usado, “inibidores de ROCK” significa substâncias que inibem a Rho quinase (ROCK: associado a Rho, de hélice superenrolada contendo proteína quinase) e podem ser substâncias que inibem ROCK I e ROCK II. Os inibidores de ROCK não são particularmente limitados, desde que tenham a função mencionada acima e os exemplos incluem N-(4- piridinil)-4β-[(R)-1-aminoetil]ciclo-hexano-1α-carboxamida (que pode ser aqui também chamada de I-27632), Fasudil (HA1077), (2S)-2-metil-1-[(4- metil-5-isoquinolinil]sulfonil]hexa-hidro-1H-1,4-diazepina (H-1152), 4β- [(1R)-1-aminoetil]-N-(4-piridil)benzeno-1zencarboxamida (Wf-536), N-(1H- pirrol[2,3-b]piridin-4-il)-4PER(R)-1-aminoetil]ciclo-hexano-1α-carboxamida (Y-30141), N-(3-{[2-(4-amino-1,2,5-oxadiazol-3-il)-1-etil-1H-imidazo[4,5- c]piridin-6-il]oxi}fenil)-4-{[2-(4-morfolinil)etil]-oxi}benzamida (GSK269962A), N-(6-fluoro-1H-indazol-5-il)-6-metil-2-oxo-4-[4- (trifluorometil)fenil]-3,4-di-hidro-1H-piridina-5-carboxamida (GSK429286A). Os inibidores de ROCK não estão limitados a estes e oligonucleotídeos antissentido e siRNA para mRNA de ROCK, anticorpos que se ligam a ROCK e mutantes de ROCK negativos dominantes também podem ser usados, comercialmente disponíveis, ou sintetizados de acordo com um método conhecido como inibidores de ROCK.

[0067] Como aqui usado, “inibidores de GSK3β“ são substâncias com atividade inibidora de GSK3β (glicogênio sintase quinase 3β). GSK3 (glicogênio sintase quinase 3) é uma proteína serina/treonina quinase e está envolvida em muitas vias de sinalização associadas à produção de glicogênio, apoptose, manutenção de células-tronco, etc. GSK3 tem as 2 isoformas α e β. “Inibidores de GSK3β“ usados na presente invenção não são particularmente

16 / 74 limitados, desde que tenham a atividade inibidora de GSK3β e possam ser substâncias com a atividade inibidora de GSK3α e a atividade inibidora de GSK3β.

[0068] Exemplos de inibidores GSK3β incluem CHIR98014 (2-[[2- [(5-nitro-6-aminopiridin-2-il)amino]etil]amino]-4-(2,4-diclorofenil)-5-(1H- imidazol-1-il)pirimidina), CIR99021 (6-[[2-[[4-(2,4-diclorofenil)-5-(4-metil- 1H-imidazol-2-il)-2-pirimidinil]amino]etil]amino]nicotinonitrila), TDZD-8 (4-benzil-2-metil-1,2,4-tiadiazolidina-3,5-diona), SB216763 (3-(2,4- diclorofenil)-4-(1-metil-1H-indol-3-il)-1H-pirrol-2,5-diona), TWS-119 (3-[6- (3-aminofenil)-7H-pirrol[2,3-d]pirimidin-4-iloxi]fenol), kenpaulona, 1- azakenpaulona, SB216763 (3-(2,4-diclorofenil)-4-(1-metil-1H-indol-3-il)-1H- pirrol-2,5-diona), SB415286 (3-[(3-cloro-4-hidroxifenil)amino]-4-(2- nitrofenil)-1H-pirrol-2,5-diona), e AR-AO144-18, CT99021, CT20026, BIO, BIO-acetoxima, complexo de piridocarbazol-rutênio ciclopentadienil, OTDZT, alfa-4-dibromoacetofenona, lítio, e similares. O GSK3β não está limitado a estes e oligonucleotídeos antissentido e siRNA para mRNA de GSK3β, anticorpos que se ligam a GSK3β, mutantes de GSK3β negativos dominantes, e similares também podem ser usados, comercialmente disponíveis, ou sintetizados de acordo com um método conhecido como inibidores de GSK3β.

[0069] Como aqui usado, os exemplos de “substituição de soro” incluem a substituição de soro Knockout (KSR: Invitrogen), substituição de soro StemSure (Wako), suplemento de B-27, suplemento de N2, albumina (por exemplo, albumina rica em lipídios), insulina, transferrina, ácidos graxos, precursores de colágeno, elementos vestigiais (por exemplo, zinco, selênio (para exemplo, selenito de sódio)), 2-mercaptoetanol, 3’-tiolglicerol ou misturas dos mesmos (por exemplo, ITS-G). As substituições de soro preferidas são o suplemento de B-27, KSR, substituição de soro StemSure, ITS-G. A concentração de substituição de soro em um meio quando

17 / 74 adicionado a um meio é de 0,01 a 10% em peso e, preferivelmente, 0,1 a 2% em peso. Na presente invenção, “substituição de soro” é preferivelmente usada em vez de soro.

2. População de células progenitoras endócrinas ou população de células em estágio posterior de diferenciação com proliferação suprimida de células positivas para Ki67

[0070] A presente invenção refere-se a uma população de células progenitoras endócrinas ou uma população de células em um estágio posterior de diferenciação com proliferação suprimida de células positivas para Ki67. Essas populações de células podem ser obtidas por tratamento com um inibidor de FGFR1.

[0071] Como aqui usado, “células positivas para Ki67” significa células que coexistem com células progenitoras endócrinas ou células em um estágio posterior de diferenciação pelo menos em uma população de células progenitoras endócrinas ou uma população de células em um estágio posterior de diferenciação obtida pela indução de diferenciação a partir de células- tronco pluripotentes no processo de diferenciação das células-tronco pluripotentes em células β pancreáticas, e são distinguidas pela expressão de Ki67 como marcador.

[0072] “Ki67” é conhecido como uma nucleoproteína relacionada ao ciclo celular e também é conhecido como um marcador para a proliferação celular e o ciclo celular porque sua expressão é verificada nas fases G1, S, G2 e M das células em proliferação e não é verificada na Fase G0, um estágio quiescente.

[0073] Sabe-se que células com características diferentes dependendo dos estágios de diferenciação aparecem no processo de diferenciação de células-tronco pluripotentes em células β pancreáticas (WO2009/012428 e WO2016/021734). Por exemplo, os estágios de diferenciação podem ser amplamente classificados em células-tronco pluripotentes, células

18 / 74 endodérmicas definitivas, células do tubo digestivo primitivas, células posteriores do intestino anterior, células progenitoras pancreáticas, células progenitoras endócrinas, células produtoras de insulina e células β pancreáticas em ordem de formas relativamente indiferenciadas a formas diferenciadas.

[0074] Como aqui usado, “pluripotência” significa a capacidade de se diferenciar em tecidos e células com vários formatos e funções diferentes e de se diferenciar em células de qualquer linhagem das 3 camadas germinativas. “Pluripotência” é diferente de “totipotência”, que é a capacidade de se diferenciar em qualquer tecido do corpo vivo, incluindo a placenta, em que as células pluripotentes não podem se diferenciar na placenta e, portanto, não têm a capacidade de formar um indivíduo.

[0075] Como aqui usado, “multipotência” significa a capacidade de se diferenciar em números plurais e limitados de linhagens de células. Por exemplo, células-tronco mesenquimais, células-tronco hematopoiéticas e células-tronco neurais são multipotentes, mas não pluripotentes.

[0076] Como aqui usado, “células-tronco pluripotentes” refere-se a células-tronco embrionárias (células ES) e células potencialmente com uma pluripotência similar à das células ES, ou seja, a capacidade de se diferenciar em vários tecidos (todos os tecidos endodérmicos, mesodérmicos, e ectodérmicos) no corpo vivo. Exemplos de células com uma pluripotência similar à das células ES incluem “células-tronco pluripotentes induzidas” (que podem ser aqui também chamadas de “células iPS”). Na presente invenção, preferivelmente, as células-tronco pluripotentes são células-tronco pluripotentes humanas.

[0077] “Células ES” disponíveis incluem células ES de murino, como várias linhagens de células ES de murino estabelecidas por inGenious, RIKEN e similares, e células ES humanas, como várias linhagens de células ES humanas estabelecidas por NIH, RIKEN, Universidade de Kyoto,

19 / 74 Cellartis, e similares. Por exemplo, as linhagens de células ES disponíveis incluem CHB-1 a CHB-12, RUES1, RUES2, HUES1 a HUES28 de NIH e similares; H1 e H9 da WisCell Research; e KhES-1, KhES-2, KhES-3, KhES- 4, KhES-5, SSES1, SSES2, SSES3 de RIKEN e similares.

[0078] “Células-tronco pluripotentes induzidas” refere-se a células que são obtidas por reprogramação de células somáticas de mamíferos ou células-tronco indiferenciadas através da introdução de fatores particulares (fatores de reprogramação nuclear). Atualmente, existem várias “células- tronco pluripotentes induzidas” e células iPS estabelecidas por Yamanaka, et al. introduzindo os 4 fatores Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc em fibroblastos murinos (Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006) 126: 663-676); células iPS derivadas de células humanas, estabelecidas pela introdução de 4 fatores similares em fibroblastos humanos (Takahashi K, Yamanaka S., et al. Cell, (2007) 131: 861-872.); células Nanog-iPS estabelecidas por classificação de células usando a expressão de Nanog como um indicador após a introdução dos 4 fatores (Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.); células iPS produzidas por um método que não usa c-Myc (Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26, 101- 106); e células iPS estabelecidas pela introdução de 6 fatores de uma forma livre de vírus (Okita K et al. Nat. Methods 2011 May; 8(5): 409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31 (3) 458-66) podem também ser usadas. Além disso, células-tronco pluripotentes induzidas estabelecidas pela introdução de 4 fatores OCT3/4, SOX2, NANOG e LIN28 por Thomson et al. (Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.); células-tronco pluripotentes induzidas produzidas por Daley et al. (Park IH, Daley GQ.et al., Nature (2007) 451: 141-146); células-tronco pluripotentes induzidas produzidas por Sakurada et al. (Publicação de Pedido de Patente Japonesa Não Examinada nº 2008-307007) e similares podem ser usadas.

[0079] Além disso, qualquer uma das células-tronco pluripotentes

20 / 74 induzidas conhecidas na técnica descritas em todos os artigos publicados (por exemplo, Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol 3, Issue 5, 568- 574; Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650; Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, No. 7, 795-797) ou patentes (por exemplo, Publicação de Pedido de Patente Japonesa Não Examinada nº 2008-307007, Publicação de Pedido de Patente Japonesa Não Examinada nº 2008-283972, US2008-2336610, US2009-047263, WO2007- 069666, WO2008-118220, WO2008-124133, WO2008-151058, WO2009- 006930, WO2009-006997, WO2009-007852) pode ser usada.

[0080] As linhagens celulares pluripotentes induzidas disponíveis incluem várias linhagens celulares iPS estabelecidas por NIH, Instituto de Pesquisa Física e Química (RIKEN), Universidade de Kyoto e similares. Por exemplo, essas linhagens celulares iPS humanas incluem as linhagens celulares RIKEN HiPS-RIKEN-1A, HiPS-RIKEN-2A, HiPS-RIKEN-12A e Nips-B2 e as linhagens celulares da Universidade de Kyoto, Ff-WJ-18, Ff- I01s01, Ff-I01s02, Ff-I01s04, Ff-I01s06, Ff-I14s03, Ff-I14s04, QHJI01s01, QHJI01s04, QHJI14s03, QHJI14s04, 253G1, 201B7, 409B2, 454E2, 606A1, 610B1, 648A1, linhagens celulares CDI de células iPS MyCell (21525.102.10A), células iPS MyCell (21526.101.10A), e similares.

[0081] Como aqui usado, “população de células progenitoras pancreáticas” significa uma população de células distinguidas por células progenitoras pancreáticas. Como aqui usado, células progenitoras pancreáticas significam células distinguidas pela expressão de pelo menos um dos marcadores PDX-1, NKX6-1, PTF-1α, GATA4 e SOX9.

[0082] A população de células progenitoras pancreáticas é uma população de células que compreende células progenitoras pancreáticas em uma proporção de 30% ou mais, preferivelmente 50% ou mais, mais preferivelmente 70% ou mais. A população de células progenitoras pancreáticas pode incluir outras células (por exemplo, células progenitoras

21 / 74 endócrinas, células produtoras de insulina e células positivas para Ki67), além das células progenitoras pancreáticas.

[0083] Como aqui usado, “população de células progenitoras endócrinas” significa uma população de células distinguidas por células progenitoras endócrinas.

[0084] Como aqui usado, células progenitoras endócrinas significam células distinguidas pela expressão de pelo menos um dos marcadores Cromogranina A, NeuroD e NGN3 e nenhuma expressão de um marcador do sistema hormonal relacionado ao pâncreas (por exemplo, insulina). As células progenitoras endócrinas podem expressar um marcador, como PAX-4, NKX2-2, Islet-1, PDX-1 ou PTF-1α.

[0085] A população de células progenitoras endócrinas é uma população de células que compreende células progenitoras endócrinas em uma proporção de 30% ou mais, preferivelmente 50% ou mais, mais preferivelmente 70% ou mais. A população de células progenitoras endócrinas pode incluir outras células (por exemplo, células progenitoras pancreáticas, células produtoras de insulina e células positivas para Ki67), além das células progenitoras endócrinas.

[0086] A proporção de células específicas em uma população de células pode ser determinada com base em uma abordagem conhecida, capaz de calcular o número de células, como a citometria de fluxo.

[0087] “População de células em um estágio posterior de diferenciação” significa uma população de células distinguidas por células cujo estágio de diferenciação em células β pancreáticas é mais avançado do que o das células progenitoras endócrinas. As células cujo estágio de diferenciação em células β pancreáticas é mais avançado do que as células progenitoras endócrinas são preferivelmente células produtoras de insulina ou células β pancreáticas.

[0088] Como aqui usado, “células produtoras de insulina” significa

22 / 74 células distinguidas pelo fato da expressão de um marcador de insulina ser verificada e o nível de expressão de NGN3 estar em uma proporção de menos de 1/3 da expressão máxima confirmada em células progenitoras endócrinas. “Células produtoras de insulina” são células que podem expressar um marcador de NKX6.1 e preferivelmente expressam ambos os marcadores de insulina e NKX6.1 e têm um nível de expressão de NGN3 em uma proporção de menos de 1/3 da expressão máxima confirmada em células progenitoras endócrinas.

[0089] O nível de expressão de NGN3 pode ser medido por RT-PCR quantitativo. O cDNA preparado a partir de células em um estágio predeterminado usando o kit Cells-to-CT (Thermo Fisher Scientific) é usado na medição usando conjuntos de sequências de sonda/iniciador TaqMan contra NGN3 e GAPDH e, em seguida, um nível de expressão relativa ao nível de expressão de GAPDH é considerado como o nível de expressão gênica de NGN3.

[0090] A “população de células produtoras de insulina” é uma população de células que compreende células produtoras de insulina em uma proporção de 5% ou mais, preferivelmente 15% ou mais, mais preferivelmente 30% ou mais. A população de células pode incluir outras células (por exemplo, células progenitoras endócrinas; outras células produtoras de hormônio pancreático que expressam pelo menos um dos marcadores glucagon, somatostatina e polipeptídeo pancreático; e células positivas para Ki67), além das células produtoras de insulina.

[0091] A população de células produtoras de insulina pode ser dividida em “população de células produtoras de insulina precoce” que aparece em um estágio inicial de um processo de diferenciação das células progenitoras endócrinas e “população de células produtoras de insulina tardia” que aparece em um estágio mais avançado de diferenciação. A população de células produtoras de insulina tardia pode ser distinguida,

23 / 74 particularmente, pela inclusão de células positivas para insulina/positivas para NKX6.1 (células duplamente positivas para INS/NKX6.1) em uma proporção de 20% ou mais.

[0092] Como aqui usado, “células β pancreáticas” significa células mais maduras do que “células produtoras de insulina” e, especificamente, significa células distinguidas por expressar pelo menos um dos marcadores MAFA, UCN3 e IAPP, que são marcadores de maturação de células β pancreáticas, ou por uma reação para aumentar a secreção de insulina por estimulação de glicose.

[0093] “População de células β pancreáticas” é uma população de células que compreende células β pancreáticas que podem ser obtidas pela diferenciação e/ou maturação, preferivelmente a diferenciação e/ou maturação in vivo, de uma população de células progenitoras endócrinas ou uma população de células em um estágio posterior de diferenciação. A população de células pode incluir outras células (por exemplo, células produtoras de insulina e células positivas para Ki67), além das células β pancreáticas.

[0094] A população de células progenitoras endócrinas ou a população de células em um estágio posterior de diferenciação pode ser obtida pelo uso de uma abordagem conhecida de indução da diferenciação de células-tronco pluripotentes em células β pancreáticas. Especificamente, cada população de células de interesse pode ser obtida usando as seguintes etapas de indução de diferenciação: etapa 1) induzir a diferenciação de células-tronco pluripotentes em células endodérmicas definitivas; etapa 2) induzir a diferenciação das células endodérmicas definitivas em células primitivas do tubo digestivo; etapa 3) induzir a diferenciação das células primitivas do tubo digestivo em células posteriores do intestino anterior; etapa 4) induzir a diferenciação das células posteriores do

24 / 74 intestino anterior em células progenitoras pancreáticas; etapa 5) induzir a diferenciação das células progenitoras pancreáticas em células progenitoras endócrinas; e etapa 6) induzir a diferenciação das células progenitoras endócrinas em células produtoras de insulina.

[0095] A seguir, cada etapa será descrita, embora a indução de diferenciação em cada célula não seja limitada por essas abordagens. Etapa 1) Diferenciação em células endodérmicas definitivas

[0096] As células-tronco pluripotentes são primeiro permitidas a se diferenciar em células endodérmicas definitivas. Métodos para induzir o endoderma definitivo a partir de células-tronco pluripotentes já são conhecidos, e qualquer um dos métodos pode ser usado. Preferivelmente, as células-tronco pluripotentes são cultivadas em um meio contendo ativina A, mais preferivelmente um meio contendo ativina A, um inibidor de ROCK e um inibidor de GSK3β, para assim diferenciar em células endodérmicas definitivas. O número de células no início da cultura não é particularmente limitado e é de 22.000 a 150000 células/cm2, preferivelmente de 22.000 a

100.000 células/cm2, mais preferivelmente de 22.000 a 80000 células/cm2. O período de cultura é de 1 dia a 4 dias, preferivelmente 1 dia a 3 dias, particularmente preferivelmente 3 dias.

[0097] A temperatura da cultura não é particularmente limitada e a cultura é realizada de 30 a 40°C (por exemplo, 37°C). A concentração de dióxido de carbono em um recipiente de cultura é da ordem de, por exemplo, 5%.

[0098] O meio usado nessa etapa pode ser um meio basal para uso na cultura de células de mamíferos, tal como meio RPMI 1640, meio MEM, meio iMEM, meio DMEM/F12, meio de opção de zinco MEM melhorado, meio MEM melhorado/1% B27/penicilina-estreptomicina ou meio MCDB131/Glicose 20 mM/NaHCO3/FAF-BSA/ITS-X/Glutamax/ácido

25 / 74 ascórbico/penicilina-estreptomicina.

[0099] A concentração de ativina A no meio é geralmente 30 a 200 ng/mL, preferivelmente 50 a 150 ng/mL, mais preferivelmente 70 a 120 ng/mL, particularmente preferivelmente cerca de 100 ng/mL.

[00100] Em outra modalidade, a ativina A pode estar contida em uma dose baixa, por exemplo, em uma quantidade de 5 a 100 ng/mL, preferivelmente 5 a 50 ng/mL, mais preferivelmente 5 a 10 ng/mL, no meio.

[00101] Em uma modalidade alternativa, a concentração de ativina A no meio é de cerca de 0,1 a 100 ng/mL, preferivelmente cerca de 1 a 50 ng/mL, mais preferivelmente cerca de 3 a 10 ng/mL.

[00102] A concentração do inibidor de GSK3β no meio é apropriadamente definida dependendo do tipo de inibidor de GSK3β usado. Por exemplo, no caso de usar CHIR99021 como o inibidor de GSK3β, sua concentração é geralmente 2 a 5 µM, preferivelmente 2 a 4 µM, particularmente preferivelmente cerca de 3 µM.

[00103] A concentração do inibidor de ROCK no meio é apropriadamente definida dependendo do tipo de inibidor de ROCK usado. Por exemplo, no caso de usar Y27632 como o inibidor de ROCK, sua concentração é geralmente 5 a 20 µM, preferivelmente 5 a 15 µM, particularmente preferivelmente cerca de 10 µM.

[00104] O meio pode ser adicionalmente suplementado com insulina. A insulina pode estar contida em uma quantidade de 0,01 a 20 µM, preferivelmente 0,1 a 10 µM, mais preferivelmente 0,5 a 5 µM, no meio. A concentração da insulina no meio pode ser, mas não está limitada à concentração de insulina contida no suplemento B-27 adicionado.

[00105] Especificamente, as células são cultivadas por 1 dia em um meio contendo ativina A, um inibidor de ROCK e um inibidor de GSK3β e, em seguida, cultivadas por 2 dias em um meio contendo apenas ativina A com o meio substituído por um novo todos os dias. Alternativamente, as células-

26 / 74 tronco pluripotentes podem ser submetidas à primeira cultura em um meio contendo 0,01 a 20 µM de insulina na presença de uma dose baixa de ativina A e subsequentemente submetidas a uma segunda cultura em um meio livre de insulina, para produção. Etapa 2) Diferenciação em células primitivas do tubo digestivo

[00106] As células endodérmicas definitivas obtidas na etapa 1) são adicionalmente cultivadas em um meio contendo um fator de crescimento para induzir sua diferenciação em células primitivas do tubo digestivo. O período de cultura é de 2 dias a 8 dias, preferivelmente cerca de 4 dias.

[00107] A temperatura da cultura não é particularmente limitada e a cultura é realizada de 30 a 40°C (por exemplo, 37°C). A concentração de dióxido de carbono em um recipiente de cultura é da ordem de, por exemplo, 5%. A cultura pode ser realizada por qualquer cultura bidimensional e cultura tridimensional.

[00108] Um meio basal para uso na cultura de células de mamíferos pode ser usado como meio de cultura, como na etapa 1). O meio pode ser adequadamente suplementado com uma reposição de soro, uma vitamina, um antibiótico e similares, além do fator de crescimento.

[00109] O fator de crescimento é preferivelmente EGF, KGF e/ou FGF10, mais preferivelmente EGF e/ou KGF, ainda mais preferivelmente KGF.

[00110] A concentração do fator de crescimento no meio é apropriadamente definida dependendo do tipo de fator de crescimento usado e é geralmente cerca de 0,1 nM a 1000 µM, preferivelmente cerca de 0,1 nM a 100 µM. No caso de EGF, sua concentração é de cerca de 5 a 2000 ng/ml (isto é, cerca de 0,8 a 320 nM), preferivelmente cerca de 5 a 1000 ng/ml (isto é, cerca de 0,8 a 160 nM), mais preferivelmente cerca de 10 a 1000 ng/ml (isto é, cerca de 1,6 a 160 nM). No caso de FGF10, sua concentração é de cerca de 5 a 2000 ng/ml (ou seja, cerca de 0,3 a 116 nM), preferivelmente

27 / 74 cerca de 10 a 1000 ng/ml (ou seja, cerca de 0,6 a 58 nM), mais preferivelmente cerca de 10 a 1000 ng/ml (isto é, cerca de 0,6 a 58 nM). Por exemplo, no caso de usar KGF como fator de crescimento, sua concentração é geralmente de 5 a 150 ng/mL, preferivelmente 30 a 100 ng/mL, particularmente preferivelmente cerca de 50 ng/mL. Etapa 3) Diferenciação em células posteriores do intestino anterior

[00111] As células primitivas do tubo digestivo obtidas na etapa 2) são adicionalmente cultivadas em um meio contendo um fator de crescimento, ciclopamina, noggin e similares para induzir sua diferenciação em células posteriores do intestino anterior. O período de cultura é de 1 dia a 5 dias, preferivelmente cerca de 2 dias. A cultura pode ser realizada por qualquer cultura bidimensional e cultura tridimensional.

[00112] A temperatura da cultura não é particularmente limitada e a cultura é realizada de 30 a 40°C (por exemplo, 37°C). A concentração de dióxido de carbono em um recipiente de cultura é da ordem de, por exemplo, 5%.

[00113] Como na etapa 1), um meio basal para uso na cultura de células de mamíferos pode ser usado como meio de cultura. O meio pode ser adequadamente suplementado com uma reposição de soro, uma vitamina, um antibiótico e similares, além do fator de crescimento.

[00114] O fator de crescimento é preferivelmente EGF, KGF e/ou FGF10, mais preferivelmente EGF e/ou KGF, ainda mais preferivelmente KGF.

[00115] A concentração do fator de crescimento no meio é apropriadamente definida dependendo do tipo de fator de crescimento usado e é geralmente cerca de 0,1 nM a 1000 µM, preferivelmente cerca de 0,1 nM a 100 µM. No caso de EGF, sua concentração é de cerca de 5 a 2000 ng/ml (isto é, cerca de 0,8 a 320 nM), preferivelmente cerca de 5 a 1000 ng/ml (isto é, cerca de 0,8 a 160 nM), mais preferivelmente cerca de 10 a 1000 ng/ml

28 / 74 (isto é, cerca de 1,6 a 160 nM). No caso de FGF10, sua concentração é de cerca de 5 a 2000 ng/ml (ou seja, cerca de 0,3 a 116 nM), preferivelmente cerca de 10 a 1000 ng/ml (ou seja, cerca de 0,6 a 58 nM), mais preferivelmente cerca de 10 a 1000 ng/ml (isto é, cerca de 0,6 a 58 nM). Por exemplo, no caso de usar KGF como fator de crescimento, sua concentração é geralmente de 5 a 150 ng/mL, preferivelmente 30 a 100 ng/mL, particularmente preferivelmente cerca de 50 ng/mL.

[00116] A concentração da ciclopamina no meio não é particularmente limitada e é geralmente 0,5 a 1,5 µM, preferivelmente 0,3 a 1,0 µM, particularmente preferivelmente cerca de 0,5 µM.

[00117] A concentração de noggin no meio não é particularmente limitada e é geralmente de 10 a 200 ng/mL, preferivelmente 50 a 150 ng/mL, particularmente preferivelmente cerca de 100 ng/mL. Etapa 4) Diferenciação em células progenitoras pancreáticas

[00118] As células posteriores do intestino anterior obtidas na etapa 3) são adicionalmente cultivadas em um meio contendo um fator com atividade inibidora de CDK8/19, preferivelmente um meio contendo um fator com atividade inibidora de CDK8/19 e um fator de crescimento, para induzir sua diferenciação em células progenitoras pancreáticas. O período de cultura é de 2 dias a 10 dias, preferivelmente cerca de 5 dias. A cultura pode ser realizada por qualquer cultura bidimensional e cultura tridimensional.

[00119] No caso da cultura bidimensional, de acordo com o relatório anterior (Toyoda et al., Stem cell Research (2015) 14, 185-197), as células posteriores do intestino anterior obtidas na etapa 3) são tratadas e dispersas por pipetagem com 0,25 % de tripsina-EDTA e a dispersão é submetida à separação centrífuga para obter a suspensão de células e, em seguida, a suspensão é semeada novamente em um meio fresco da etapa 4.

[00120] Como na etapa 1), um meio basal para uso na cultura de células de mamíferos pode ser usado como meio de cultura. O meio pode ser

29 / 74 adequadamente suplementado com uma reposição de soro, uma vitamina, um antibiótico e similares, além do fator de crescimento.

[00121] Cada um dos compostos mencionados acima ou seus sais podem ser usados como o fator com atividade inibidora de CDK8/19. A quantidade do fator adicionado ao meio é determinada apropriadamente de acordo com o composto ou o sal do mesmo usado e é geralmente cerca de 0,00001 µM a 5 µM, preferivelmente 0,00001 µM a 1 µM. A concentração do fator com atividade inibidora de CDK8/19 no meio está preferivelmente a uma concentração que atinge atividade inibidora de 50% ou mais para CDK8/19.

[00122] O fator de crescimento é preferivelmente EGF, KGF e/ou FGF10, mais preferivelmente KGF e/ou EGF, ainda mais preferivelmente KGF e EGF.

[00123] A concentração do fator de crescimento no meio é apropriadamente definida dependendo do tipo de fator de crescimento usado e é geralmente cerca de 0,1 nM a 1000 µM, preferivelmente cerca de 0,1 nM a 100 µM. No caso de EGF, sua concentração é de cerca de 5 a 2000 ng/ml (isto é, cerca de 0,8 a 320 nM), preferivelmente cerca de 5 a 1000 ng/ml (isto é, cerca de 0,8 a 160 nM), mais preferivelmente cerca de 10 a 1000 ng/ml (isto é, cerca de 1,6 a 160 nM). No caso de FGF10, sua concentração é de cerca de 5 a 2000 ng/ml (ou seja, cerca de 0,3 a 116 nM), preferivelmente cerca de 10 a 1000 ng/ml (ou seja, cerca de 0,6 a 58 nM), mais preferivelmente cerca de 10 a 1000 ng/ml (isto é, cerca de 0,6 a 58 nM). Por exemplo, no caso de usar KGF e EGF como fator de crescimento, a concentração de EGF é geralmente de 5 a 150 ng/mL, preferivelmente 30 a 100 ng/mL, particularmente preferivelmente cerca de 50 ng/mL, e a concentração de KGF é geralmente de 10 a 200 ng/mL, preferivelmente 50 a 150 ng/mL, particularmente preferivelmente cerca de 100 ng/mL.

[00124] A cultura no primeiro dia na etapa 4) pode ser realizada na

30 / 74 presença de um inibidor de ROCK, e a cultura nos dias seguintes pode ser realizada em um meio sem inibidor de ROCK.

[00125] O meio também pode conter um ativador de PKC. PdBU (ativador de PKC II), TPB (ativador de PKC V), ou similar é usado como o ativador de PKC, embora o ativador de PKC não seja limitado aos mesmos. A concentração do ativador de PKC a ser adicionado é de cerca de 0,1 a 100 ng/ml, preferivelmente cerca de 1 a 50 ng/ml, mais preferivelmente cerca de 3 a 10 ng/ml.

[00126] O meio também pode ser suplementado com dimetilsulfóxido e/ou ativina (1 a 50 ng/ml).

[00127] Em qualquer uma das etapas, o meio pode ser suplementado com uma substituição de soro (por exemplo, suplemento B-27, ITS-G), além dos componentes descritos acima. Além disso, um aminoácido, L-glutamina, GlutaMAX (nome do produto), um aminoácido não essencial, uma vitamina, nicotinamida, um antibiótico (por exemplo, Antibiótico-Antimicótico (também chamado aqui de AA), penicilina, estreptomicina, ou uma mistura dos mesmos), um agente antimicrobiano (por exemplo, anfotericina B), um antioxidante, ácido pirúvico, um tampão, sais inorgânicos e similares podem ser adicionados aos mesmos, se necessário. No caso de adição de um antibiótico ao meio, sua concentração no meio é normalmente de 0,01 a 20% em peso, preferivelmente de 0,1 a 10% em peso. A cultura pode ser realizada por qualquer cultura bidimensional e cultura tridimensional.

[00128] No caso de cultura bidimensional, a cultura de células é realizada por cultura aderente sem o uso de células alimentadoras. Para a cultura, é usado um recipiente de cultura, por exemplo, uma placa, um frasco, uma microplaca ou uma folha de cultura de células, como OptiCell (nome do produto) (Nunc). O recipiente de cultura é preferivelmente tratado na superfície a fim de melhorar a aderência às células (hidrofilicidade), ou revestido com um substrato para adesão celular, como colágeno, gelatina,

31 / 74 poli-L-lisina, poli-D-lisina, laminina, fibronectina, Matrigel (por exemplo, BD Matrigel (Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.)) ou vitronectina. O recipiente de cultura é preferivelmente um recipiente de cultura revestido com colágeno tipo I, Matrigel, fibronectina, vitronectina ou poli-D-lisina, mais preferivelmente um recipiente de cultura revestido com Matrigel ou poli-D- lisina.

[00129] A temperatura da cultura não é particularmente limitada e a cultura é realizada de 30 a 40°C (por exemplo, 37°C). A concentração de dióxido de carbono em um recipiente de cultura é da ordem de, por exemplo, 5%.

[00130] As células progenitoras pancreáticas obtidas na etapa 4) podem ser posteriormente purificadas usando uma glicoproteína 2 (GP2) de marcador de superfície conhecida ou similar. A purificação pode ser realizada por um método conhecido per se, por exemplo, usando grânulos imobilizados com anticorpo anti-GP2. Etapa 5) Diferenciação em células progenitoras endócrinas

[00131] As células progenitoras endócrinas obtidas na etapa 4) são adicionalmente cultivadas em um meio contendo um fator de crescimento para induzir sua diferenciação em células progenitoras endócrinas. A cultura pode ser realizada por qualquer cultura bidimensional e cultura tridimensional. No caso da cultura bidimensional, as células progenitoras pancreáticas obtidas na etapa 4) são tratadas e dispersas por pipetagem com 0,25 % de tripsina-EDTA e a dispersão é submetida à separação centrífuga para obter a suspensão de células e, em seguida, a suspensão é semeada novamente em um meio fresco da etapa 5). O período de cultura é de 2 dias a 3 dias, preferivelmente cerca de 2 dias.

[00132] Como na etapa 1), um meio basal para uso na cultura de células de mamíferos pode ser usado como meio de cultura. O meio é suplementado com SANT1, ácido retinoico, inibidor de ALK5 II, T3 e LDN

32 / 74 de acordo com o relatório anterior (Nature Biotechnology 2014; 32: 1121- 1133) e pode ser apropriadamente suplementado com um inibidor de Wnt, um inibidor de ROCK, FGF (preferivelmente FGF2), um substituto de soro, uma vitamina, um antibiótico e similares.

[00133] A cultura é realizada por cultura não aderente sem o uso de células alimentadoras. Para a cultura, é usada uma placa, um frasco, uma microplaca, uma placa porosa (Nunc), ou similar, ou um biorreator. O recipiente de cultura é preferivelmente tratado na superfície para diminuir a aderência às células.

[00134] A temperatura da cultura não é particularmente limitada e a cultura é realizada de 30 a 40°C (por exemplo, 37°C). A concentração de dióxido de carbono em um recipiente de cultura é da ordem de, por exemplo, 5%. Etapa 6) Diferenciação em células produtoras de insulina

[00135] As células progenitoras endócrinas obtidas na etapa 5) são adicionalmente cultivadas em um meio contendo um fator de crescimento para induzir sua diferenciação em células produtoras de insulina. O período de cultura é de 10 dias a 30 dias, preferivelmente cerca de 10 a 20 dias.

[00136] Como na etapa 1), um meio basal para uso na cultura de células de mamíferos pode ser usado como meio de cultura. O meio é suplementado com inibidor de ALK5 II, T3, LDN, inibidor de γ-secretase XX, inibidor de γ-secretase RO, N-cisteína, um inibidor de AXL e ácido ascórbico de acordo com o relatório anterior (Nature Biotechnology 2014; 32: 1121-1133) e pode ser apropriadamente suplementado com um inibidor de Wnt, um inibidor de ROCK, FGF (preferivelmente FGF2), um substituto de soro, uma vitamina, um antibiótico e similares. Por exemplo, o meio pode ser suplementado com inibidor de ALK5 II, T3, LDN, inibidor de γ-secretase RO e ácido ascórbico ou pode ser suplementado com T3, inibidor de ALK5 II, ZnSO4, heparina, N-acetilcisteína, Trolox e R428.

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[00137] A cultura pode ser realizada por qualquer cultura bidimensional e cultura tridimensional. A cultura é realizada por cultura não aderente sem o uso de células alimentadoras. Para a cultura, é usada uma placa, um frasco, uma microplaca, uma placa porosa (Nunc), ou similar, ou um biorreator. O recipiente de cultura é preferivelmente tratado na superfície para diminuir a aderência às células.

[00138] A temperatura da cultura não é particularmente limitada e a cultura é realizada de 30 a 40°C (por exemplo, 37°C). A concentração de dióxido de carbono em um recipiente de cultura é da ordem de, por exemplo, 5%. Diferenciação em células β pancreáticas

[00139] As células obtidas na etapa anterior podem ser induzidas a se diferenciar em células β pancreáticas. A etapa de diferenciação em uma população de células β pancreáticas pode ser realizada por meio do transplante de uma população de células progenitoras endócrinas ou uma população de células em um estágio posterior de diferenciação, preferivelmente uma população de células produtoras de insulina, em um corpo vivo de um animal.

[00140] “Animal” é preferivelmente um mamífero. Exemplos dos mesmos incluem humanos, primatas não humanos, porcos, gado, cavalos, ovelhas, cabras, lhamas, cães, gatos, coelhos, ratos e porquinhos-da-índia. Um humano é o preferido.

[00141] O transplante é preferivelmente realizado para uma região in vivo onde a população de células pode ser fixada em uma determinada posição, e pode ser realizado, por exemplo, subcutaneamente, intraperitonealmente, para o mesotélio peritoneal, para o omento maior, para um tecido adiposo, para um tecido muscular, ou abaixo da cápsula de cada órgão, como o pâncreas ou o rim, no animal. O número de células a serem transplantadas pode variar dependendo de fatores como o estágio de

34 / 74 diferenciação das células a serem transplantadas, a idade e peso corporal de um receptor, o tamanho de um local de transplante e a gravidade de uma doença e não é particularmente limitado. Por exemplo, o número de células pode ser da ordem de 10 × 104 células a 10 × 1011 células. A população de células transplantadas é induzida a se diferenciar em um ambiente in vivo e pode, assim, se diferenciar na população de células de interesse, preferivelmente uma população de células β pancreáticas, que pode então ser recuperada ou pode ser habitada in vivo como tal.

[00142] Para o transplante, a população de células pode ser incorporada em um gel contendo ácido algínico e depois transplantada. Por exemplo, a população de células incorporada no gel contendo ácido algínico pode ser encerrada em um dispositivo, como uma cápsula, um saco ou uma câmara e transplantada para um corpo vivo.

[00143] “Gel contendo ácido algínico” pode ser preparado de acordo com uma abordagem conhecida (WO2010/032242 e WO2011/154941) e pode ser obtido pela adição de um agente de reticulação a uma solução de alginato ou éster de ácido algínico para gelificação.

[00144] O alginato pode ser um sal solúvel em água e pode ser usado um sal de metal, um sal de amônio ou similar. Por exemplo, alginato de sódio, alginato de cálcio ou alginato de amônio podem ser usados adequadamente.

[00145] O éster de ácido algínico (também chamado de alginato de propilenoglicol) é um derivado no qual o propilenoglicol está ligado ao grupo carboxila do ácido algínico por meio de uma ligação éster.

[00146] A razão de ácido manurônico para ácido gulurônico (razão M/G) contida no alginato é arbitrária. Em geral, no caso de M > G, um gel altamente flexível pode ser formado. No caso de M <G, um gel forte pode ser formado. Na presente invenção, pode ser usado alginato contendo ácido gulurônico em uma proporção de 10 para 90%, 20 para 80%, 30 para 70% ou 40 para 60%.

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[00147] O alginato ou o éster de ácido algínico pode estar contido em uma quantidade de 0,05 a 10% em peso, preferivelmente 0,1 a 5% em peso, mais preferivelmente 0,5 a 3% em peso, em um solvente. O solvente pode ser qualquer solvente capaz de dissolver o alginato ou o éster do ácido algínico, e água, soro fisiológico ou similares podem ser usados.

[00148] O agente de reticulação pode ser qualquer agente de reticulação que pode permitir que uma solução de alginato ou éster de ácido algínico gelifique e não é particularmente limitado. Um cátion de metal polivalente pode ser usado. O cátion de metal polivalente é preferivelmente um cátion de metal divalente, mais preferivelmente um íon de cálcio, um íon de estrôncio ou um íon de bário. O agente de reticulação pode ser usado na forma de um sal. Na presente invenção, pelo menos um membro selecionado dentre cloreto de cálcio, cloreto de estrôncio e cloreto de bário pode ser usado como o agente de reticulação.

[00149] O gel contendo ácido algínico pode conter uma nanofibra. A nanofibra é uma fibra natural ou sintética com um diâmetro da ordem dos nanômetros. Exemplos de nanofibras naturais incluem nanofibras contendo um ou mais de colágeno, celulose, fibroína de seda, queratina, gelatina e polissacarídeos, como quitosana. Exemplos de nanofibras sintéticas incluem ácido polilático (PLA), policaprolactona (PCL), poliuretano (PU), poli(lactídeo-co-glicolídeo) (PLGA), poli(3-hidroxibutirato-co- hidroxivalerato) (PHBV) e poli(etileno-co-vinilacetato) (PEVA). A nanofibra pode estar contida em uma quantidade menor que 1% em peso, por exemplo, 0,9% em peso, 0,8% em peso, 0,7% em peso, 0,6% em peso, 0,5% em peso ou menos do que a quantidade, no gel contendo ácido algínico. O limite inferior da quantidade de nanofibra contida no gel contendo ácido algínico não é particularmente limitado e pode ser 0,05% em peso ou mais, preferivelmente 0,1% em peso ou mais.

[00150] Na presente invenção, “incorporação” significa que uma

36 / 74 população de células progenitoras endócrinas ou uma população de células em um estágio posterior de diferenciação está contida de uma maneira dispersa no gel contendo ácido algínico.

[00151] A incorporação da população de células no gel contendo ácido algínico pode ser realizada misturando a população de células em uma solução de alginato ou éster de ácido algínico e gelificando-a.

[00152] A população de células pode estar contida em uma quantidade selecionada dentre 1 × 104 células a 1 × 109 células/mL, preferivelmente 1 × 107 células a 1 × 108 células/mL, na solução de alginato ou éster de ácido algínico.

[00153] A gelificação da solução de alginato ou éster de ácido algínico contendo a população de células pode ser realizada adicionando um agente de reticulação à solução. A quantidade do agente de reticulação adicionado pode ser uma quantidade selecionada dentre 0,1 a 5% em peso, por exemplo, 0,1 a 1% em peso, em relação à solução. A gelificação pode ser realizada em um recipiente com uma configuração e/ou formato predeterminado para uso em cultura de células ou transplante de células, ou em um molde projetado de modo a obter um gel adaptado ao recipiente.

[00154] Alternativamente, a gelificação pode ser realizada formando uma cápsula de gel contendo ácido algínico de acordo com uma abordagem conhecida (WO2010/010902). Especificamente, a solução de alginato ou éster de ácido algínico contendo a população de células pode ser adicionada gota a gota a uma solução de um agente de reticulação para gelificação. O tamanho das gotículas de líquido pode ser ajustado de acordo com o formato de um bocal para adição gota a gota ou um método de adição gota a gota e, por extensão, o tamanho da cápsula de gel contendo ácido algínico pode ser definido. O método de adição gota a gota não é particularmente limitado e pode ser realizado por uma abordagem como um método de pulverização de ar, um método de pulverização sem ar ou um método de pulverização estática.

37 / 74 O tamanho da cápsula de gel contendo ácido algínico não é particularmente limitado e pode ter um diâmetro de 5 mm ou menor, 1 mm ou menor, ou 500 µm ou menor.

[00155] A solução do agente de reticulação pode conter o agente de reticulação em uma quantidade selecionada dentre 0,1 a 10% em peso, por exemplo, 0,1 a 5% em peso.

[00156] Na presente invenção, “inibidor de FGFR1” é uma substância com atividade inibitória pelo menos para o receptor do fator de crescimento de fibroblastos (FGFR) 1. O FGFR1 é um membro da família de tirosina quinase transmembrana de quatro passagens (FGFR1, FGFR2, FGFR3 e FGFR4), como um receptor com alta afinidade para fatores de crescimento FGF1 a FGF17. O FGFR1 está envolvido em muitas vias de sinalização associadas à indução e formação de padrão do mesoderma, a proliferação e migração de células, organogênese, crescimento ósseo, etc. O inibidor de FGFR1 usado na presente invenção não é particularmente limitado, desde que o inibidor de FGFR1 tem atividade inibidora de FGFR1. O inibidor de FGFR1 pode ser uma substância com atividade inibidora de FGFR1, bem como atividade inibidora de outros FGFRs. Na presente invenção, “inibidor de FGFR1” inclui uma substância com atividade inibidora de FGFR1, mesmo que apenas ligeiramente, e preferivelmente se refere a uma substância que inibe FGFR1 em 50% ou mais, mais preferivelmente uma substância com uma concentração inibitória de 50% (IC50) de 1 µM ou menor, ainda preferivelmente 100 nM ou menor, contra FGFR1. Um método para determinar a atividade inibidora de FGFR1 pode ser selecionado a partir de métodos conhecidos. Os exemplos incluem métodos de determinação usando o kit de teste de quinase EnzyChrom (BioAssay Systems). Na presente invenção, um “inibidor de FGFR1” convencionalmente conhecido pode ser usado e pode ser verificado em literaturas de patentes ou não relacionadas a patentes. Na presente invenção, “inibidor de FGFR1” pode ter pelo menos

38 / 74 atividade inibidora de FGFR1 e pode ter atividade inibidora de outros FGFRs. “Inibidor de FGFR1” da presente invenção pode ser, por exemplo, um inibidor de FGFR2, um inibidor de FGFR3 ou um inibidor de FGFR4, desde que tenha a atividade inibidora de FGFR1.

[00157] Na presente invenção, os exemplos do “inibidor de FGFR1” incluem compostos dados abaixo (grupo de compostos D), bem como compostos com atividade inibidora para FGFR1 (ou sais dos mesmos) entre compostos com fórmulas estruturais representadas pelas fórmulas gerais dadas abaixo. O inibidor de FGFR1 é preferivelmente um composto com uma concentração inibitória de 50% (IC50) de 1 µM ou menor, mais preferivelmente 100 nM ou menor, contra FGFR1 (ou um sal do mesmo) entre o composto I e o composto II com fórmulas estruturais representadas pelas seguintes fórmulas gerais. (Composto I)

[00158] Exemplos do composto I incluem compostos representados pela seguinte fórmula 1: [Fórmula 1] em que o anel AB mostra um heterociclo bicíclico com um ou mais substituinte(s) (o anel AB pode ser um heterociclo tricíclico com um ou mais substituinte(s)) ou sais do mesmo.

[00159] Preferivelmente, na fórmula, o anel AB mostra um heterociclo bicíclico contendo nitrogênio com três substituintes.

[00160] Exemplos dos substituintes incluem substituintes dados abaixo e substituintes do grupo de compostos D. Os substituintes do grupo de

39 / 74 compostos D são preferidos. (Composto II)

[00161] Exemplos do composto II incluem compostos representados pela seguinte fórmula 2: [Fórmula 2] em que o anel D mostra um heterociclo monocíclico de 5 ou 6 membros contendo nitrogênio tendo opcionalmente substituinte(s); e um ou mais heterociclo(s) contendo nitrogênio diferente do anel D está contido ou sais do mesmo.

[00162] Preferivelmente, na fórmula, o anel D mostra um anel aromático contendo um ou dois átomos de nitrogênio e opcionalmente tendo substituinte(s).

[00163] Preferivelmente, os exemplos de um ou mais heterociclo(s) contendo nitrogênio, diferentes do anel D, incluem piperazina opcionalmente tendo substituinte(s).

[00164] Exemplos dos substituintes incluem substituintes dados abaixo e substituintes do grupo de compostos D. Os substituintes do grupo de compostos D são preferidos.

[00165] Como aqui usado, exemplos do “heterociclo” incluem heterociclos aromáticos e heterociclos não aromáticos cada um contendo, como um átomo constituinte do anel além do átomo de carbono, 1 a 4 heteroátomos selecionados dentre um átomo de nitrogênio, um átomo de enxofre e um átomo de oxigênio.

[00166] Como aqui usado, exemplos do “heterociclo aromático”

40 / 74 incluem um heterociclo aromático de 5 a 14 membros (preferivelmente 5 a 10 membros) contendo, como um átomo constituinte do anel além do átomo de carbono, 1 a 4 heteroátomos selecionados dentre um átomo de nitrogênio, um átomo de enxofre e um átomo de oxigênio. Exemplos preferíveis do “heterociclo aromático” incluem heterociclos aromáticos monocíclicos de 5 ou 6 membros tais como tiofeno, furano, pirrol, imidazol, pirazol, tiazol, isotiazol, oxazol, isoxazol, piridina, pirazina, pirimidina, piridazina, 1,2,4- oxadiazol, 1,3,4-oxadiazol, 1,2,4-tiadiazol, 1,3,4-tiadiazol, triazol, tetrazol, e triazina; e heterociclos aromáticos policíclicos (preferivelmente bicíclicos ou tricíclicos) fundidos de 8 a 14 membros tais como benzotiofeno, benzofurano, benzimidazol, benzoxazol, benzisoxazol, benzotiazol, benzisotiazol, benzotriazol, imidazopiridina, tienopiridina, furopiridina, pirrolpiridina, pirazolpiridina, oxazolpiridina, tiazolpiridina, imidazopirazina, imidazopirimidina, tienopirimidina, furopirimidina, pirrolpirimidina, pirazolpirimidina, oxazolpirimidina, tiazolpirimidina, pirazolpirimidina, pirazoltriazina, nafto[2,3-b]tiofeno, fenoxatiina, indol, isoindol, 1H-indazol, purina, isoquinolina, quinolina, ftalazina, naftiridina, quinoxalina, quinazolina, cinolina, carbazol, β-carbolina, fenantridina, acridina, fenazina, fenotiazina, e fenoxazina.

[00167] Como aqui usado, exemplos do “heterociclo não aromático” incluem um heterociclo não aromático de 3 a 14 membros (preferivelmente 4 a 10 membros) contendo, como um átomo constituinte do anel além do átomo de carbono, 1 a 4 heteroátomos selecionados dentre um átomo de nitrogênio, um átomo de enxofre e um átomo de oxigênio. Exemplos preferíveis do “heterociclo não aromático” incluem heterociclos não aromáticos monocíclicos de 3 a 8 membros tais como aziridina, oxirano, tiirano, azetidina, oxetano, tietano, tetra-hidrotiofeno, tetra-hidrofurano, pirrolina, pirrolidina, imidazolina, imidazolidina, oxazolina, oxazolidina, pirazolina, pirazolidina, tiazolina, tiazolidina, tetra-hidroisotiazol, tetra-hidro-oxazol,

41 / 74 tetra-hidroisoxazol, piperidina, piperazina, tetra-hidropiridina, di- hidropiridina, di-hidrotiopirano, tetra-hidropirimidina, tetra-hidropiridazina, di-hidropirano, tetra-hidropirano, tetra-hidrotiopirano, morfolina, tiomorfolina, azepanina, diazepano, azepina, azocano, diazocano, oxepano; e heterociclos não aromáticos policíclicos (preferivelmente bi ou tricíclicos) fundidos de 9 a 14 membros tais como di-hidrobenzofurano, di- hidrobenzimidazol, di-hidrobenzoxazol, di-hidrobenzotiazol, di- hidrobenzisotiazol, di-hidronafto[2,3-b]tiofeno, tetra-hidroisoquinolina, tetra- hidroquinolina, 4H-quinolizina, indolina, isoindolina, tetra-hidrotieno[2,3- c]piridina, tetra-hidrobenzazepina, tetra-hidroquinoxalina, tetra- hidrofenantridina, hexa-hidrofenotiazina, hexa-hidrofenoxazina, tetra- hidroftalazina, tetra-hidronaftiridina, tetra-hidroquinazolina, tetra- hidrocinolina, tetra-hidrocarbazol, tetra-hidro-β-carbolina, tetra-hidroacridina, tetra-hidrofenazina, tetra-hidrotioxanteno, octa-hidroisoquinolina.

[00168] Como aqui usado, exemplos do “heterociclo contendo nitrogênio” incluem “heterociclos” contendo pelo menos um ou mais átomo(s) de nitrogênio como um átomo constituinte do anel.

[00169] A seguir, cada substituinte usado aqui será definido em detalhe. Cada substituinte é como definido abaixo a menos que especificado de outra forma.

[00170] Como aqui usado, exemplos do “átomo de halogênio” incluem flúor, cloreto, bromo e iodo.

[00171] Como aqui usado, exemplos do “grupo C1-6 alquila” incluem metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, sec-butila, tert-butila, pentila, isopentila, neopentila, 1-etilpropila, hexila, iso-hexila, 1,1- dimetilbutila, 2,2-dimetilbutila, 3,3-dimetilbutila e 2-etilbutila.

[00172] Como aqui usado, exemplos do “grupo C1-6 alquila opcionalmente halogenado” incluem um grupo C1-6 alquila com opcionalmente 1 a 7, preferivelmente 1 a 5 átomos de halogênio. Exemplos

42 / 74 específicos do mesmo incluem metila, clorometila, difluorometila, triclorometila, trifluorometila, etila, 2-bromoetila, 2,2,2-trifluoroetila, tetrafluoroetila, pentafluoroetila, propila, 2,2-difluoropropila, 3,3,3- trifluoropropila, isopropila, butila, 4,4,4-trifluorobutila, isobutila, sec-butila, tert-butila, pentila, isopentila, neopentila, 5,5,5-trifluoropentila, hexila e 6,6,6- trifluoro-hexila.

[00173] Como aqui usado, exemplos do “grupo C2-6 alquenila” incluem etenila, 1-propenila, 2-propenila, 2-metil-1-propenila, 1-butenila, 2-butenila, 3-butenila, 3-metil-2-butenila, 1-pentenila, 2-pentenila, 3-pentenila, 4- pentenila, 4-metil-3-pentenila, 1-hexenila, 3-hexenila e 5-hexenila.

[00174] Como aqui usado, exemplos do “grupo C2-6 alquinila” incluem etinila, 1-propinila, 2-propinila, 1-butinila, 2-butinila, 3-butinila, 1-pentinila, 2-pentinila, 3-pentinila, 4-pentinila, 1-hexinila, 2-hexinila, 3-hexinila, 4- hexinila, 5-hexinila e 4-metil-2-pentinila.

[00175] Como aqui usado, exemplos do “grupo C3-10 cicloalquila” incluem ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo-hexila, ciclo-heptila, ciclo-octila, biciclo[2.2.1]heptila, biciclo[2.2.2]octila, biciclo[3.2.1]octila e adamantila.

[00176] Como aqui usado, exemplos do “grupo C3-10 cicloalquila opcionalmente halogenado” incluem um grupo C3-10 cicloalquila com opcionalmente 1 a 7, preferivelmente 1 a 5 átomos de halogênio. Exemplos específicos do mesmo incluem ciclopropila, 2,2-difluorociclopropila, 2,3- difluorociclopropila, ciclobutila, difluorociclobutila, ciclopentila, ciclo-hexila, ciclo-heptila e ciclo-octila.

[00177] Como aqui usado, exemplos do “grupo C3-10 cicloalquenila” incluem ciclopropenila, ciclobutenila, ciclopentenila, ciclo-hexenila, ciclo- heptenila e ciclo-octenila.

[00178] Como aqui usado, exemplos do “grupo C6-14 arila” incluem fenila, 1-naftila, 2-naftila, 1-antrila, 2-antrila e 9-antrila.

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[00179] Como aqui usado, exemplos do “grupo C7-16 aralquila” incluem benzila, fenetila, naftilmetila e fenilpropila.

[00180] Como aqui usado, exemplos do “grupo C1-6 alcóxi” incluem metóxi, etóxi, propóxi, isopropóxi, butóxi, isobutóxi, sec-butóxi, terc-butóxi, pentilóxi e hexilóxi.

[00181] Como aqui usado, exemplos do “grupo C1-6 alcóxi opcionalmente halogenado” incluem um grupo C1-6 alcóxi com opcionalmente 1 a 7, preferivelmente 1 a 5 átomos de halogênio. Exemplos específicos do mesmo incluem metóxi, difluorometóxi, trifluorometóxi, etóxi, 2,2,2- trifluoroetóxi, propóxi, isopropóxi, butóxi, 4,4,4-trifluorobutóxi, isobutóxi, sec-butóxi, pentilóxi e hexilóxi.

[00182] Como aqui usado, exemplos do “grupo C3-10 cicloalquilóxi” incluem ciclopropilóxi, ciclobutilóxi, ciclopentilóxi, ciclo-hexilóxi, ciclo- heptilóxi e ciclo-octilóxi.

[00183] Como aqui usado, exemplos do “grupo C1-6 alquiltio” incluem metiltio, etiltio, propiltio, isopropiltio, butiltio, sec-butiltio, terc-butiltio, pentiltio e hexiltio.

[00184] Como aqui usado, exemplos do “grupo C1-6 alquiltio opcionalmente halogenado” incluem um grupo C1-6 alquiltio com opcionalmente 1 a 7, preferivelmente 1 a 5 átomos de halogênio. Exemplos específicos do mesmo incluem metiltio, difluorometiltio, trifluorometiltio, etiltio, propiltio, isopropiltio, butiltio, 4,4,4-trifluorobutiltio, pentiltio e hexiltio.

[00185] Como aqui usado, exemplos do “grupo C1-6 alquil-carbonila” incluem acetila, propanoíla, butanoíla, 2-metilpropanoíla, pentanoíla, 3- metilbutanoíla, 2-metilbutanoíla, 2,2-dimetilpropanoíla, hexanoíla e heptanoíla.

[00186] Como aqui usado, exemplos do “grupo C1-6 alquil-carbonila opcionalmente halogenado” incluem um grupo C1-6 alquil-carbonila com

44 / 74 opcionalmente 1 a 7, preferivelmente 1 a 5 átomos de halogênio. Exemplos específicos do mesmo incluem acetila, cloroacetila, trifluoroacetila, tricloroacetila, propanoíla, butanoíla, pentanoíla e hexanoíla.

[00187] Como aqui usado, exemplos do “grupo C1-6 alcoxi-carbonila” incluem metoxicarbonila, etoxicarbonila, propoxicarbonila, isopropoxicarbonila, butoxicarbonila, isobutoxicarbonila, sec-butoxicarbonila, terc-butoxicarbonila, pentiloxicarbonila e hexiloxicarbonila.

[00188] Como aqui usado, exemplos do “grupo C6-14 aril-carbonila” incluem benzoíla, 1-naftoíla e 2-naftoíla.

[00189] Como aqui usado, exemplos do “grupo C7-16 aralquil- carbonila” incluem fenilacetila e fenilpropionila.

[00190] Como aqui usado, exemplos do “grupo heterociclilcarbonila aromático de 5 a 14 membros” incluem nicotinoíla, isonicotinoíla, tenoíla e furoíla.

[00191] Como aqui usado, exemplos do “grupo heterociclilcarbonila não aromático de 3 a 14 membros” incluem morfolinilcarbonila, piperidinilcarbonila e pirrolidinilcarbonila.

[00192] Como aqui usado, exemplos do “grupo mono- ou di-C1-6 alquil-carbamoíla” incluem metilcarbamoíla, etilcarbamoíla, dimetilcarbamoíla, dietilcarbamoíla e N-etil-N-metilcarbamoíla.

[00193] Como aqui usado, exemplos do “grupo mono- ou di-C7-16 aralquil-carbonila” incluem benzilcarbamoíla e fenetilcarbamoíla.

[00194] Como aqui usado, exemplos do “grupo C1-6 alquilsulfonila” incluem metilsulfonila, etilsulfonila, propilsulfonila, isopropilsulfonila, butilsulfonila, sec-butilsulfonila e terc-butilsulfonila.

[00195] Como aqui usado, exemplos do “grupo C1-6 alquilsulfonila opcionalmente halogenado” incluem um grupo C1-6 alquilsulfonila com opcionalmente 1 a 7, preferivelmente 1 a 5 átomos de halogênio. Exemplos específicos do mesmo incluem metilsulfonila, difluorometilsulfonila,

45 / 74 trifluorometilsulfonila, etilsulfonila, propilsulfonila, isopropilsulfonila, butilsulfonila, 4,4,4-trifluorobutilsulfonila, pentilsulfonila e hexilsulfonila.

[00196] Como aqui usado, exemplos do “grupo C6-14 arilsulfonila” incluem fenilsulfonila, 1-naftilsulfonila e 2-naftilsulfonila.

[00197] Como aqui usado, exemplos do “substituinte” incluem um átomo de halogênio, um grupo ciano, um grupo nitro, um grupo hidrocarboneto opcionalmente substituído, um grupo heterocíclico opcionalmente substituído, um grupo acila, um grupo amino opcionalmente substituído, um grupo carbamoíla opcionalmente substituído, um grupo tiocarbamoíla opcionalmente substituído, um grupo sulfamoíla opcionalmente substituído, um grupo hidróxi opcionalmente substituído, um grupo sulfanila (SH) opcionalmente substituído e um grupo silila opcionalmente substituído.

[00198] No presente relatório descritivo, exemplos do “grupo hidrocarboneto” (incluindo “grupo hidrocarboneto” do “grupo hidrocarboneto opcionalmente substituído”) incluem um grupo C1-6 alquila, um grupo C2-6 alquenila, um grupo C2-6 alquinila, um grupo C3-10 cicloalquila, um grupo C3-10 cicloalquenila, um grupo C6-14 arila e um grupo C7-16 aralquila.

[00199] No presente relatório descritivo, exemplos do “grupo hidrocarboneto opcionalmente substituído” incluem um grupo hidrocarboneto opcionalmente com substituinte(s) selecionado(s) a partir do seguinte grupo substituinte A. [grupo substituinte A]

[00200] (1) um átomo de halogênio, (2) um grupo nitro, (3) um grupo ciano, (4) um grupo oxo, (5) um grupo hidróxi, (6) um grupo C1-6 alcóxi opcionalmente halogenado, (7) um grupo C6-14 arilóxi (por exemplo, fenóxi, naftóxi),

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(8) um grupo C7-16 aralquilóxi (por exemplo, benzilóxi), (9) um grupo heterociclilóxi aromático de 5 a 14 membros (por exemplo, piridilóxi), (10) um grupo heterociclilóxi não aromático de 3 a 14 membros (por exemplo, morfolinilóxi, piperidinilóxi), (11) um grupo C1-6 alquil-carbonilóxi (por exemplo, acetóxi, propanoilóxi), (12) um grupo C6-14 aril-carbonilóxi (por exemplo, benzoilóxi, 1-naftoilóxi, 2-naftoilóxi), (13) um grupo C1-6 alcoxi-carbonilóxi (por exemplo, metoxicarbonilóxi, etoxicarbonilóxi, propoxicarbonilóxi, butoxicarbonilóxi), (14) um grupo mono- ou di-C1-6 alquil-carbamoilóxi (por exemplo, metilcarbamoilóxi, etilcarbamoilóxi, dimetilcarbamoilóxi, dietilcarbamoilóxi), (15) um grupo C6-14 aril-carbamoilóxi (por exemplo, fenilcarbamoilóxi, naftilcarbamoilóxi), (16) um grupo heterociclilcarbonilóxi aromático de 5 a 14 membros (por exemplo, nicotinoilóxi), (17) um grupo heterociclilcarbonilóxi não aromático de 3 a 14 membros (por exemplo, morfolinilcarbonilóxi, piperidinilcarbonilóxi), (18) um grupo C1-6 alquilsulfonilóxi opcionalmente halogenado (por exemplo, metilsulfonilóxi, trifluorometilsulfonilóxi), (19) um grupo C6-14 arilsulfonilóxi opcionalmente substituído com um grupo C1-6 alquila (por exemplo, fenilsulfonilóxi, toluenosulfonilóxi), (20) um grupo C1-6 alquiltio opcionalmente halogenado, (21) um grupo heterocíclico aromático de 5 a 14 membros, (22) um grupo heterocíclico não aromático de 3 a 14 membros, (23) um grupo formila, (24) um grupo carbóxi,

47 / 74

(25) um grupo C1-6 alquil-carbonila opcionalmente halogenado, (26) um grupo C6-14 aril-carbonila, (27) um grupo heterociclilcarbonila aromático de 5 a 14 membros, (28) um grupo heterociclilcarbonila não aromático de 3 a 14 membros, (29) um grupo C1-6 alcoxi-carbonila, (30) um grupo C6-14 ariloxi-carbonila (por exemplo, feniloxicarbonila, 1-naftiloxicarbonila, 2-naftiloxicarbonila), (31) um grupo C7-16 aralquiloxi-carbonila (por exemplo, benziloxicarbonila, fenetiloxicarbonila), (32) um grupo carbamoíla, (33) um grupo tiocarbamoíla, (34) um grupo mono- ou di-C1-6 alquil-carbamoíla, (35) um grupo C6-14 aril-carbamoíla (por exemplo, fenilcarbamoíla), (36) um grupo heterociclilcarbamoíla aromático de 5 a 14 membros (por exemplo, piridilcarbamoíla, tienilcarbamoíla), (37) um grupo heterociclilcarbamoíla não aromático de 3 a 14 membros (por exemplo, morfolinilcarbamoíla, piperidinilcarbamoíla), (38) um grupo C1-6 alquilsulfonila opcionalmente halogenado, (39) um grupo C6-14 arilsulfonila, (40) um grupo heterociclilsulfonila aromático de 5 a 14 membros (por exemplo, piridilsulfonila, tienilsulfonila), (41) um grupo C1-6 alquilsulfinila opcionalmente halogenado, (42) um grupo C6-14 arilsulfinila (por exemplo, fenilsulfinila, 1- naftilsulfinila, 2-naftilsulfinila), (43) um grupo heterociclilsulfinila aromático de 5 a 14

48 / 74 membros (por exemplo, piridilsulfinila, tienilsulfinila), (44) um grupo amino, (45) um grupo mono- ou di-C1-6 alquilamino (por exemplo, metilamino, etilamino, propilamino, isopropilamino, butilamino, dimetilamino, dietilamino, dipropilamino, dibutilamino, N-etil-N- metilamino), (46) um grupo mono- ou di-C6-14 arilamino (por exemplo, fenilamino), (47) um grupo heterociclilamino aromático de 5 a 14 membros (por exemplo, piridilamino), (48) um grupo C7-16 aralquilamino (por exemplo, benzilamino), (49) um grupo formilamino, (50) um grupo C1-6 alquil-carbonilamino (por exemplo, acetilamino, propanoilamino, butanoilamino), (51) um grupo (C1-6 alquil)(C1-6 alquil-carbonilamino (por exemplo, N-acetil-N-metilamino), (52) um grupo C6-14 aril-carbonilamino (por exemplo, fenilcarbonilamino, naftilcarbonilamino), (53) um grupo C1-6 alcoxi-carbonilamino (por exemplo, metoxicarbonilamino, etoxicarbonilamino, propoxicarbonilamino, butoxicarbonilamino, terc-butoxicarbonilamino), (54) um grupo C7-16 aralquiloxi-carbonilamino (por exemplo, benziloxicarbonilamino), (55) um grupo C1-6 alquilsulfonilamino (por exemplo, metilsulfonilamino, etilsulfonilamino), (56) um grupo C6-14 arilsulfonilamino opcionalmente substituído com um grupo C1-6 alquila (por exemplo, fenilsulfonilamino, toluenossulfonilamino),

49 / 74 (57) um grupo C1-6 alquila opcionalmente halogenado, (58) um grupo C2-6 alquenila, (59) um grupo C2-6 alquinila, (60) um grupo C3-10 cicloalquila, (61) um grupo C3-10 cicloalquenila e (62) um grupo C6-14 arila.

[00201] O número dos substituintes mencionados acima no “grupo hidrocarboneto opcionalmente substituído” é, por exemplo, 1 a 5, preferivelmente 1 a 3. Quando o número dos substituintes é de dois ou mais, os respectivos substituintes podem ser iguais ou diferentes.

[00202] No presente relatório descritivo, exemplos do “grupo heterocíclico” (incluindo “grupo heterocíclico” do “grupo heterocíclico opcionalmente substituído”) incluem (i) um grupo heterocíclico aromático, (ii) um grupo heterocíclico não aromático e (iii) um grupo heterocíclico ligado em ponte de 7 a 10 membros, cada um contendo, como um átomo constituinte do anel além do átomo de carbono, 1 a 4 heteroátomos selecionados dentre um átomo de nitrogênio, um átomo de enxofre e um átomo de oxigênio.

[00203] No presente relatório descritivo, exemplos do “grupo heterocíclico aromático” (incluindo “grupo heterocíclico aromático de 5 a 14 membros”) incluem um grupo heterocíclico aromático de 5 a 14 membros (preferivelmente 5 a 10 membros) contendo, como um átomo constituinte do anel além do átomo de carbono, 1 a 4 heteroátomos selecionados dentre um átomo de nitrogênio, um átomo de enxofre e um átomo de oxigênio.

[00204] Exemplos preferíveis do “grupo heterocíclico aromático” incluem grupos heterocíclicos aromáticos monocíclicos de 5 ou 6 membros tais como tienila, furila, pirrolila, imidazolila, pirazolila, tiazolila, isotiazolila, oxazolila, isoxazolila, piridila, pirazinila, pirimidinila, piridazinila, 1,2,4- oxadiazolila, 1,3,4-oxadiazolila, 1,2,4-tiadiazolila, 1,3,4-tiadiazolila,

50 / 74 triazolila, tetrazolila, triazinila e similares; e grupos heterocíclicos aromáticos policíclicos (preferivelmente bi ou tricíclicos) fundidos de 8 a 14 membros tais como benzotiofenila, benzofuranila, benzimidazolila, benzoxazolila, benzisoxazolila, benzotiazolila, benzisotiazolila, benzotriazolila, imidazopiridinila, tienopiridinila, furopiridinila, pirrolpiridinila, pirazolpiridinila, oxazolpiridinila, tiazolpiridinila, imidazopirazinila, imidazopirimidinila, tienopirimidinila, furopirimidinila, pirrolpirimidinila, pirazolpirimidinila, oxazolpirimidinila, tiazolpirimidinila, pirazoltriazinila, nafto[2,3-b]tienila, fenoxatiinila, indolila, isoindolila, 1H-indazolila, purinila, isoquinolila, quinolila, ftalazinila, naftiridinila, quinoxalinila, quinazolinila, cinolinila, carbazolila, β-carbolinila, fenantridinila, acridinila, fenazinila, fenotiazinila, fenoxazinila e similares.

[00205] No presente relatório descritivo, exemplos do “grupo heterocíclico não aromático” (incluindo “grupo heterocíclico não aromático de 3 a 14 membros”) incluem um grupo heterocíclico não aromático de 3 a 14 membros (preferivelmente 4 a 10 membros) contendo, como um átomo constituinte do anel além do átomo de carbono, 1 a 4 heteroátomos selecionados dentre um átomo de nitrogênio, um átomo de enxofre e um átomo de oxigênio.

[00206] Exemplos preferíveis do “grupo heterocíclico não aromático” incluem grupos heterocíclicos não aromáticos monocíclicos de 3 a 8 membros tais como aziridinila, oxiranila, tiiranila, azetidinila, oxetanila, tietanila, tetra- hidrotienila, tetra-hidrofuranila, pirrolinila, pirrolidinila, imidazolinila, imidazolidinila, oxazolinila, oxazolidinila, pirazolinila, pirazolidinila, tiazolinila, tiazolidinila, tetra-hidroisotiazolila, tetra-hidro-oxazolila, tetra- hidroiso-oxazolila, piperidinila, piperazinila, tetra-hidropiridinila, di- hidropiridinila, di-hidrotiopiranila, tetra-hidropirimidinila, tetra- hidropiridazinila, di-hidropiranila, tetra-hidropiranila, tetra-hidrotiopiranila, morfolinila, tiomorfolinila, azepanila, diazepanila, azepinila, oxepanila,

51 / 74 azocanila, diazocanila e similares; e grupos heterocíclicos não aromáticos policíclicos (preferivelmente bi ou tricíclicos de 9 a 14 membros fundidos tais como di-hidrobenzofuranila, di-hidrobenzimidazolila, di-hidrobenzoxazolila, di-hidrobenzotiazolila, di-hidrobenzisotiazolila, di-hidronafto[2,3-b]tienila, tetra-hidroisoquinolila, tetra-hidroquinolila, 4H-quinolizinila, indolinila, isoindolinila, tetra-hidrotieno[2,3-c]piridinila, tetra-hidrobenzazepinila, tetra- hidroquinoxalinila, tetra-hidrofenantridinila, hexa-hidrofenotiazinila, hexa- hidrofenoxazinila, tetra-hidroftalazinila, tetra-hidronaftiridinila, tetra- hidroquinazolinila, tetra-hidrocinolinila, tetra-hidrocarbazolila, tetra-hidro-β- carbolinila, tetra-hidroacridinila, tetra-hidrofenazinila, tetra-hidrotioxantenila, octa-hidroisoquinolila e similares.

[00207] No presente relatório descritivo, exemplos preferíveis do “grupo heterocíclico em ponte de 7 a 10 membros” incluem quinuclidinila e 7-azabiciclo[2.2.1]heptanila.

[00208] No presente relatório descritivo, exemplos do “grupo heterocíclico contendo nitrogênio” incluem um “grupo heterocíclico” contendo pelo menos um átomo de nitrogênio como um átomo constituinte do anel.

[00209] No presente relatório descritivo, exemplos do “grupo heterocíclico opcionalmente substituído” incluem um grupo heterocíclico com opcionalmente substituinte(s) selecionado(s) a partir do grupo substituinte A anteriormente mencionado.

[00210] O número dos substituintes no “grupo heterocíclico opcionalmente substituído” é, por exemplo, 1 a 3. Quando o número dos substituintes é de dois ou mais, os respectivos substituintes podem ser iguais ou diferentes.

[00211] No presente relatório descritivo, exemplos do “grupo acila” incluem um grupo formila, um grupo carbóxi, um grupo carbamoíla, um grupo tiocarbamoíla, um grupo sulfino, um grupo sulfo, um grupo sulfamoíla

52 / 74 e um grupo fosfono, cada um opcionalmente com “1 ou 2 substituintes selecionados a partir de um grupo C1-6 alquila, um grupo C2-6 alquenila, um grupo C3-10 cicloalquila, um grupo C3-10 cicloalquenila, um grupo C6-14 arila, um grupo C7-16 aralquila, um grupo heterocíclico aromático de 5 a 14 membros e um grupo heterocíclico não aromático de 3 a 14 membros, cada um dos quais opcionalmente tem 1 a 3 substituintes selecionados dentre um átomo de halogênio, um grupo C1-6 alcóxi opcionalmente halogenado, um grupo hidróxi, um grupo nitro, um grupo ciano, um grupo amino e um grupo carbamoíla”.

[00212] Exemplos do “grupo acila” também incluem um grupo hidrocarboneto-sulfonila, um grupo heterociclilsulfonila, um grupo hidrocarboneto-sulfinila e um grupo heterociclilsulfinila.

[00213] Aqui, o grupo hidrocarboneto-sulfonila significa um grupo sulfonila ligado ao grupo hidrocarboneto, o grupo heterociclilsulfonila significa um grupo sulfonila ligado ao grupo heterocíclico, o grupo hidrocarboneto-sulfinila significa um grupo sulfinila ligado ao grupo hidrocarboneto e o grupo heterociclilsulfinila significa um grupo sulfinila ligado ao grupo heterocíclico.

[00214] Exemplos preferíveis do “grupo acila” incluem um grupo formila, um grupo carbóxi, um grupo C1-6 alquil-carbonila, um grupo C2-6 alquenil-carbonila (por exemplo, crotonoíla), um grupo C3-10 cicloalquil- carbonila (por exemplo, ciclobutanocarbonila, ciclopentanocarbonila, ciclo- hexanocarbonila, ciclo-heptanocarbonila), um grupo C3-10 cicloalquenil- carbonila (por exemplo, 2-ciclo-hexenocarbonila), um grupo C6-14 aril- carbonila, um grupo C7-16 aralquil-carbonila, um grupo heterociclilcarbonila aromático de 5 a 14 membros, um grupo heterociclilcarbonila não aromático de 3 a 14 membros, um grupo C1-6 alcoxi-carbonila, um grupo C6-14 ariloxi- carbonila (por exemplo, feniloxicarbonila, naftiloxicarbonila), um grupo C7-16 aralquiloxi-carbonila (por exemplo, benziloxicarbonila, feniletiloxicarbonila),

53 / 74 um grupo carbamoíla, um grupo mono- ou di-C1-6 alquil-carbamoíla, um grupo mono- ou di-C2-6 alquenil-carbamoíla (por exemplo, dialilcarbamoíla), um grupo mono- ou di-C3-10 cicloalquil-carbamoíla (por exemplo, ciclopropilcarbamoíla), um grupo mono- ou di-C6-14 aril-carbamoíla (por exemplo, fenilcarbamoíla), um grupo mono- ou di-C7-16 aralquil-carbamoíla, um grupo heterociclilcarbamoíla aromático de 5 a 14 membros (por exemplo, piridilcarbamoíla), um grupo tiocarbamoíla, um grupo mono- ou di-C1-6 alquil-tiocarbamoíla (por exemplo, metiltiocarbamoíla, N-etil-N- metiltiocarbamoíla), um grupo mono- ou di-C2-6 alquenil-tiocarbamoíla (por exemplo, dialliltiocarbamoíla), um grupo mono- ou di-C3-10 cicloalquil- tiocarbamoíla (por exemplo, ciclopropiltiocarbamoíla, ciclo- hexiltiocarbamoíla), um grupo mono- ou di-C6-14 aril-tiocarbamoíla (por exemplo, feniltiocarbamoíla), um grupo mono- ou di-C7-16 aralquil- tiocarbamoíla (por exemplo, benziltiocarbamoíla, fenetiltiocarbamoíla), um grupo heterocicliltiocarbamoíla aromático de 5 a 14 membros (por exemplo, piridiltiocarbamoíla), um grupo sulfino, um grupo C1-6 alquilsulfinila (por exemplo, metilsulfinila, etilsulfinila), um grupo sulfo, um grupo C1-6 alquilsulfonila, um grupo C6-14 arilsulfonila, um grupo fosfono e um grupo mono- ou di-C1-6 alquilfosfono (por exemplo, dimetilfosfono, dietilfosfono, di-isopropilfosfono, dibutilfosfono).

[00215] No presente relatório descritivo, exemplos do “grupo amino opcionalmente substituído” incluem um grupo amino com opcionalmente “1 ou 2 substituintes selecionados a partir de um grupo C1-6 alquila, um grupo C2- 6 alquenila, um grupo C3-10 cicloalquila, um grupo C6-14 arila, um grupo C7-16 aralquila, um grupo C1-6 alquil-carbonila, um grupo C6-14 aril-carbonila, um grupo C7-16 aralquil-carbonila, um grupo heterociclilcarbonila aromático de 5 a 14 membros, um grupo heterociclilcarbonila não aromático de 3 a 14 membros, um grupo C1-6 alcoxi-carbonila, um grupo heterocíclico aromático de 5 a 14 membros, um grupo carbamoíla, um grupo mono- ou di-C1-6 alquil-

54 / 74 carbamoíla, um grupo mono- ou di-C7-16 aralquil-carbamoíla, um grupo C1-6 alquilsulfonila e um grupo C6-14 arilsulfonila, cada um dos quais opcionalmente tem de 1 a 3 substituintes selecionados a partir do grupo substituinte A”.

[00216] Exemplos preferíveis do grupo amino opcionalmente substituído incluem um grupo amino, um grupo mono- ou di-(C1-6 alquil)amino opcionalmente halogenado (por exemplo, metilamino, trifluorometilamino, dimetilamino, etilamino, dietilamino, propilamino, dibutilamino), um grupo mono- ou di-C2-6 alquenilamino (por exemplo, dialilamino), um grupo mono- ou di-C3-10 cicloalquilamino (por exemplo, ciclopropilamino, ciclo-hexilamino), um grupo mono- ou di-C6-14 arilamino (por exemplo, fenilamino), um grupo mono- ou di-C7-16 aralquilamino (por exemplo, benzilamino, dibenzilamino), um grupo mono- ou di-(C1-6 alquil)- carbonilamino opcionalmente halogenado (por exemplo, acetilamino, propionilamino), um grupo mono- ou di-C6-14 aril-carbonilamino (por exemplo, benzoilamino), um grupo mono- ou di-C7-16 aralquil-carbonilamino (por exemplo, benzilcarbonilamino), um grupo mono- ou di- heterociclilcarbonilamino aromático de 5 a 14 membros (por exemplo, nicotinoilamino, isonicotinoilamino), um grupo mono- ou di- heterociclilcarbonilamino não aromático de 3 a 14 membros (por exemplo, piperidinilcarbonilamino), um grupo mono- ou di-C1-6 alcoxi-carbonilamino (por exemplo, terc-butoxicarbonilamino), um grupo heterociclilamino aromático de 5 a 14 membros (por exemplo, piridilamino), um grupo carbamoilamino, um grupo (mono- ou di-C1-6 alquil-carbamoil)amino (por exemplo, metilcarbamoilamino), um grupo (mono- ou di-C7-16 aralquil- carbamoil)amino (por exemplo, benzilcarbamoilamino), um grupo C1-6 alquilsulfonilamino (por exemplo, metilsulfonilamino, etilsulfonilamino), um grupo C6-14 arilsulfonilamino (por exemplo, fenilsulfonilamino), um grupo (C1-6 alquil)(C1-6 alquil-carbonil)amino (por exemplo, N-acetil-N-metilamino)

55 / 74 e um grupo (C1-6 alquil)(C6-14 aril-carbonil)amino (por exemplo, N-benzoil-N- metilamino).

[00217] No presente relatório descritivo, exemplos do “grupo carbamoíla opcionalmente substituído” incluem um grupo carbamoíla com opcionalmente “1 ou 2 substituintes selecionados a partir de um grupo C1-6 alquila, um grupo C2-6 alquenila, um grupo C3-10 cicloalquila, um grupo C6-14 arila, um grupo C7-16 aralquila, um grupo C1-6 alquil-carbonila, um grupo C6-14 aril-carbonila, um grupo C7-16 aralquil-carbonila, um grupo heterociclilcarbonila aromático de 5 a 14 membros, um grupo heterociclilcarbonila não aromático de 3 a 14 membros, um grupo C1-6 alcoxi- carbonila, um grupo heterocíclico aromático de 5 a 14 membros, um grupo carbamoíla, um grupo mono- ou di-C1-6 alquil-carbamoíla e um grupo mono- ou di-C7-16 aralquil-carbamoíla, cada um dos quais opcionalmente tem de 1 a 3 substituintes selecionados a partir do grupo substituinte A”.

[00218] Exemplos preferíveis do grupo carbamoíla opcionalmente substituído incluem um grupo carbamoíla, um grupo mono- ou di-C1-6 alquil- carbamoíla, um grupo mono- ou di-C2-6 alquenil-carbamoíla (por exemplo, dialilcarbamoíla), um grupo mono- ou di-C3-10 cicloalquil-carbamoíla (por exemplo, ciclopropilcarbamoíla, ciclo-hexilcarbamoíla), um grupo mono- ou di-C6-14 aril-carbamoíla (por exemplo, fenilcarbamoíla), um grupo mono- ou di-C7-16 aralquil-carbamoíla, um grupo mono- ou di-C1-6 alquil-carbonil- carbamoíla (por exemplo, acetilcarbamoíla, propionilcarbamoíla), um grupo mono- ou di-C6-14 aril-carbonil-carbamoíla (por exemplo, benzoilcarbamoíla) e um grupo heterociclilcarbamoíla aromático de 5 a 14 membros (por exemplo, piridilcarbamoíla).

[00219] No presente relatório descritivo, exemplos do “grupo tiocarbamoíla opcionalmente substituído” incluem um grupo tiocarbamoíla com opcionalmente “1 ou 2 substituintes selecionados a partir de um grupo C1-6 alquila, um grupo C2-6 alquenila, um grupo C3-10 cicloalquila, um grupo

56 / 74 C6-14 arila, um grupo C7-16 aralquila, um grupo C1-6 alquil-carbonila, um grupo C6-14 aril-carbonila, um grupo C7-16 aralquil-carbonila, um grupo heterociclilcarbonila aromático de 5 a 14 membros, um grupo heterociclilcarbonila não aromático de 3 a 14 membros, um grupo C1-6 alcoxi- carbonila, um grupo heterocíclico aromático de 5 a 14 membros, um grupo carbamoíla, um grupo mono- ou di-C1-6 alquil-carbamoíla e um grupo mono- ou di-C7-16 aralquil-carbamoíla, cada um dos quais opcionalmente tem de 1 a 3 substituintes selecionados a partir do grupo substituinte A”.

[00220] Exemplos preferíveis do grupo tiocarbamoíla opcionalmente substituído incluem um grupo tiocarbamoíla, um grupo mono- ou di-C1-6 alquil-tiocarbamoíla (por exemplo, metiltiocarbamoíla, etiltiocarbamoíla, dimetiltiocarbamoíla, dietiltiocarbamoíla, N-etil-N-metiltiocarbamoíla), um grupo mono- ou di-C2-6 alquenil-tiocarbamoíla (por exemplo, dialiltiocarbamoíla), um grupo mono- ou di-C3-10 cicloalquil-tiocarbamoíla (por exemplo, ciclopropiltiocarbamoíla, ciclo-hexiltiocarbamoíla), um grupo mono- ou di-C6-14 aril-tiocarbamoíla (por exemplo, feniltiocarbamoíla), um grupo mono- ou di-C7-16 aralquil-tiocarbamoíla (por exemplo, benziltiocarbamoíla, fenetiltiocarbamoíla), um grupo mono- ou di-C1-6 alquil- carbonil-tiocarbamoíla (por exemplo, acetiltiocarbamoíla, propioniltiocarbamoíla), um grupo mono- ou di-C6-14 aril-carbonil- tiocarbamoíla (por exemplo, benzoiltiocarbamoíla) e um grupo heterocicliltiocarbamoíla aromático de 5 a 14 membros (por exemplo, piridiltiocarbamoíla).

[00221] No presente relatório descritivo, exemplos do “grupo sulfamoíla opcionalmente substituído” incluem um grupo sulfamoíla com opcionalmente “1 ou 2 substituintes selecionados a partir de um grupo C1-6 alquila, um grupo C2-6 alquenila, um grupo C3-10 cicloalquila, um grupo C6-14 arila, um grupo C7-16 aralquila, um grupo C1-6 alquil-carbonila, um grupo C6-14 aril-carbonila, um grupo C7-16 aralquil-carbonila, um grupo

57 / 74 heterociclilcarbonila aromático de 5 a 14 membros, um grupo heterociclilcarbonila não aromático de 3 a 14 membros, um grupo C1-6 alcoxi- carbonila, um grupo heterocíclico aromático de 5 a 14 membros, um grupo carbamoíla, um grupo mono- ou di-C1-6 alquil-carbamoíla e um grupo mono- ou di-C7-16 aralquil-carbamoíla, cada um dos quais opcionalmente tem de 1 a 3 substituintes selecionados a partir do grupo substituinte A”.

[00222] Exemplos preferíveis do grupo sulfamoíla opcionalmente substituído incluem um grupo sulfamoíla, um grupo mono- ou di-C1-6 alquil- sulfamoíla (por exemplo, metilsulfamoíla, etilsulfamoíla, dimetilsulfamoíla, dietilsulfamoíla, N-etil-N-metilsulfamoíla), um grupo mono- ou di-C2-6 alquenil-sulfamoíla (por exemplo, dialilsulfamoíla), um grupo mono- ou di- C3-10 cicloalquil-sulfamoíla (por exemplo, ciclopropilsulfamoíla, ciclo- hexilsulfamoíla), um grupo mono- ou di-C6-14 aril-sulfamoíla (por exemplo, fenilsulfamoíla), um grupo mono- ou di-C7-16 aralquil-sulfamoíla (por exemplo, benzilsulfamoíla, fenetilsulfamoíla), um grupo mono- ou di-C1-6 alquil-carbonil-sulfamoíla (por exemplo, acetilsulfamoíla, propionilsulfamoíla), um grupo mono- ou di-C6-14 aril-carbonil-sulfamoíla (por exemplo, benzoilsulfamoíla) e um grupo heterociclilsulfamoíla aromático de 5 a 14 membros (por exemplo, piridilsulfamoíla).

[00223] No presente relatório descritivo, exemplos do “grupo hidróxi opcionalmente substituído” incluem um grupo hidroxila com opcionalmente “um substituinte selecionado a partir de um grupo C1-6 alquila, um grupo C2-6 alquenila, um grupo C3-10 cicloalquila, um grupo C6-14 arila, um grupo C7-16 aralquila, um grupo C1-6 alquil-carbonila, um grupo C6-14 aril-carbonila, um grupo C7-16 aralquil-carbonila, um grupo heterociclilcarbonila aromático de 5 a 14 membros, um grupo heterociclilcarbonila não aromático de 3 a 14 membros, um grupo C1-6 alcoxi-carbonila, um grupo heterocíclico aromático de 5 a 14 membros, um grupo carbamoíla, um grupo mono- ou di-C1-6 alquil- carbamoíla, um grupo mono- ou di-C7-16 aralquil-carbamoíla, um grupo C1-6

58 / 74 alquilsulfonila e um grupo C6-14 arilsulfonila, cada um dos quais opcionalmente tem de 1 a 3 substituintes selecionados a partir do grupo substituinte A”.

[00224] Exemplos preferíveis do grupo hidróxi opcionalmente substituído incluem um grupo hidróxi, um grupo C1-6 alcóxi, um grupo C2-6 alquenilóxi (por exemplo, alilóxi, 2-butenilóxi, 2-pentenilóxi, 3-hexenilóxi), um grupo C3-10 cicloalquilóxi (por exemplo, ciclo-hexilóxi), um grupo C6-14 arilóxi (por exemplo, fenoxi, naftilóxi), um grupo C7-16 aralquilóxi (por exemplo, benzilóxi, fenetilóxi), um grupo C1-6 alquil-carbonilóxi (por exemplo, acetilóxi, propionilóxi, butirilóxi, isobutirilóxi, pivaloilóxi), um grupo C6-14 aril-carbonilóxi (por exemplo, benzoilóxi), um grupo C7-16 aralquil-carbonilóxi (por exemplo, benzilcarbonilóxi), um grupo heterociclilcarbonilóxi aromático de 5 a 14 membros (por exemplo, nicotinoilóxi), um grupo heterociclilcarbonilóxi não aromático de 3 a 14 membros (por exemplo, piperidinilcarbonilóxi), um grupo C1-6 alcoxi- carbonilóxi (por exemplo, terc-butoxicarbonilóxi), um grupo heterociclilóxi aromático de 5 a 14 membros (por exemplo, piridilóxi), um grupo carbamoilóxi, um grupo C1-6 alquil-carbamoilóxi (por exemplo, metilcarbamoilóxi), um grupo C7-16 aralquil-carbamoilóxi (por exemplo, benzilcarbamoilóxi), um grupo C1-6 alquilsulfonilóxi (por exemplo, metilsulfonilóxi, etilsulfonilóxi) e um grupo C6-14 arilsulfonilóxi (por exemplo, fenilsulfonilóxi).

[00225] No presente relatório descritivo, exemplos do “grupo sulfanila opcionalmente substituído” incluem um grupo sulfanila com opcionalmente “um substituinte selecionado a partir de um grupo C1-6 alquila, um grupo C2-6 alquenila, um grupo C3-10 cicloalquila, um grupo C6-14 arila, um grupo C7-16 aralquila, um grupo C1-6 alquil-carbonila, um grupo C6-14 aril-carbonila e um grupo heterocíclico aromático de 5 a 14 membros, cada um dos quais opcionalmente tem de 1 a 3 substituintes selecionados a partir do grupo

59 / 74 substituinte A” e um grupo sulfanila halogenado.

[00226] Exemplos preferíveis do grupo sulfanila opcionalmente substituído incluem um grupo sulfanila (-SH), um grupo C1-6 alquiltio, um grupo C2-6 alqueniltio (por exemplo, aliltio, 2-buteniltio, 2-penteniltio, 3- hexeniltio), um grupo C3-10 cicloalquiltio (por exemplo, ciclo-hexiltio), um grupo C6-14 ariltio (por exemplo, feniltio, naftiltio), um grupo C7-16 aralquiltio (por exemplo, benziltio, fenetiltio), um grupo C1-6 alquil-carboniltio (por exemplo, acetiltio, propioniltio, butiriltio, isobutiriltio, pivaloiltio), um grupo C6-14 aril-carboniltio (por exemplo, benzoiltio), um grupo heterocicliltio aromático de 5 a 14 membros (por exemplo, piridiltio) e um grupo tio halogenado (por exemplo, pentafluorotio).

[00227] No presente relatório descritivo, exemplos do “grupo silila opcionalmente substituído” incluem um grupo silila com opcionalmente “1 a 3 substituintes selecionados a partir de um grupo C1-6 alquila, um grupo C2-6 alquenila, um grupo C3-10 cicloalquila, um grupo C6-14 arila e um grupo C7-16 aralquila, cada um dos quais opcionalmente tem de 1 a 3 substituintes selecionados a partir do grupo substituinte A”.

[00228] Exemplos preferíveis do grupo silila opcionalmente substituído incluem um grupo tri-C1-6 alquilsilila (por exemplo, trimetilsilila, terc-butil(dimetil)silila).

[00229] Mais especificamente, os exemplos do inibidor de FGFR1 que podem ser usados na presente invenção incluem PD-166866 (1-[2-amino-6- (3,5-dimetoxifenil)-pirido(2,3-d)pirimidin-7-il]-3-terc-butilureia: nº CAS: 192705-79-6) (no presente relatório descritivo, esse composto também é chamado de “CAS192705-79-6”), E-3810 (nº CAS: 1058137-23-7), PD- 173074 (nº CAS: 219580-11-7), FGFR4-IN-1 (nº CAS: 1708971-72-5), FGFR-IN-1 (nº CAS: 1448169-71-8), FIIN-2 (nº CAS: 1633044-56-0), AZD4547 (nº CAS: 1035270-39-3), FIIN-3 (nº CAS: 1637735-84-2), NVP- BGJ398 (nº CAS: 1310746-10-1), NVP-BGJ398 (nº CAS: 872511-34-7),

60 / 74

CH5183284 (nº CAS: 1265229-25-1), Derazantinibe (nº CAS: 1234356-69- 4), Racemato de Derazantinibe, ácido ferúlico (nº CAS: 1135-24-6), SSR128129E (nº CAS: 848318-25-2), ácido livre SSR128129E (nº CAS: 848463-13-8), Erdafitinibe (nº CAS: 1346242-81-6), BLU9931 (nº CAS: 1538604-68-0), PRN1371 (nº CAS: 1802929-43-6), S49076 (nº CAS: 1265965-22-7), LY2874455 (nº CAS: 1254473-64-7), Linsitinibe (nº CAS: 867160-71-2), Dovitinibe (nº CAS: 405169-16-6), Anlotinibe (nº CAS: 1058156-90-3), Brivanibe (nº CAS: 649735-46-6), Derazantinibe (nº CAS: 1234356-69-4), Dicloridrato de Anlotinibe (nº CAS: 1360460-82-7), ACTB- 1003 (nº CAS: 939805-30-8), BLU-554 (nº CAS: 1707289-21-1), Rogaratinibe (nº CAS: 1443530-05-9), esilato BIBF 1120 (nº CAS: 656247- 18-6), cloridrato TG 100572 (nº CAS: 867331-64-4), ENMD-2076 (nº CAS: 934353-76-1), Alaninato de Brivanibe (nº CAS: 649735-63-7), TG 100572 (nº CAS: 867334-05-2), BIBF 1120 (nº CAS: 656247-17-5), tartarato ENMD- 2076 (nº CAS: 1291074-87-7), TSU-68 (nº CAS: 252916-29-3), Ponatinibe (nº CAS: 943319-70-8), Sulfatinibe (nº CAS: 1308672-74-3), LY2784544 (nº CAS: 1229236-86-5), Lactato de Dovitinibe (nº CAS: 692737-80-7), SU 5402 (nº CAS: 215543-92-3), FGF-401 (nº CAS: 1708971-55-4), tirosina quinase- IN-1 (nº CAS: 705946-27-6), PP58 (nº CAS: 212391-58-7), cloridrato TG 100801 (nº CAS: 1018069-81-2), Crenolanibe (nº CAS: 670220-88-9), TG 100801 (nº CAS: 867331-82-6), Cloridrato de Pazopanibe (nº CAS: 635702- 64-6), Pazopanibe (nº CAS: 444731-52-6), PD168393 (nº CAS: 194423-15- 9), Apatinibe (nº CAS: 1218779-75-9), Isetionato de Palbociclibe (nº CAS: 827022-33-3), Foretinibe (nº CAS: 849217-64-7), Lenvatinibe (nº CAS: 417716-92-8), Tandutinibe (nº CAS: 387867-13-2), e seus sais (esses compostos são chamados de grupo de compostos D). Cada um desses compostos pode ter um ou mais substituinte(s) selecionado(s) daqueles descritos acima, desde que o composto tenha atividade inibidora de FGFR1, preferivelmente uma concentração inibitória de 50% (IC50) de 100 nM ou

61 / 74 menor contra FGFR1.

[00230] A subestrutura (substituinte, anel, etc.) de cada um desses compostos pode ser parcialmente convertida, desde que o composto tenha atividade inibidora de FGFR1, preferivelmente uma concentração inibitória de 50% (IC50) de 100 nM ou menor contra FGFR1.

[00231] Na presente invenção, o inibidor de FGFR1 é preferivelmente CAS192705-79-6 (1-[2-amino-6-(3,5-dimetoxifenil)-pirido(2,3-d)pirimidin-7- il]-3-terc-butilureia: nº CAS: 192705-79-6), E-3810 (nº CAS: 1058137-23-7), ou PD173074 (nº CAS: 219580-11-7).

[00232] Verificou-se que CAS192705-79-6 tem atividade inibitória para FGFR1, FGFR2, FGFR3 e FGFR4 pelo seguinte teste: sondas fluorescentes de ligação a FGFR1, FGFR2, FGFR3 e FGFR4 preparadas como proteínas recombinantes foram autorizadas a atuar na presença ou ausência de CAS192705-79-6, e os sinais fluorescentes foram detectados usando um leitor de placas. A atividade inibitória de CAS192705-79-6 para cada proteína (pIC50) foi calculada a partir da mudança no sinal fluorescente entre a presença e ausência de CAS192705-79-6.

[00233] O inibidor de FGFR1 não está limitado aos compostos descritos acima, e um oligonucleotídeo antissentido ou siRNA contra mRNA de FGFR1, um anticorpo de ligação a FGFR1, um mutante de FGFR1 dominante negativo ou similares também podem ser usados como o inibidor de FGFR1. Esse inibidor de FGFR1 está disponível comercialmente ou pode ser sintetizado de acordo com um método conhecido.

[00234] Cada composto mencionado acima ou um sal do mesmo pode ser usado como o inibidor de FGFR1. A quantidade de inibidor de EGFR1 adicionada ao meio é determinada apropriadamente de acordo com o composto ou o sal do mesmo usado e é geralmente cerca de 0,00001 µM a 100 µM, preferivelmente 0,01 µM a 10 µM.

[00235] A população de células progenitoras endócrinas ou a

62 / 74 população de células em um estágio posterior de diferenciação pode ser tratada com o inibidor de FGFR1 pela coexistência da população de células com o inibidor de FGFR1. Por exemplo, o tratamento pode ser realizado através da cultura da população de células em um meio suplementado com o inibidor de FGFR1. O inibidor de FGFR1 pode estar contido em qualquer quantidade capaz de inibir a atividade de FGFR1 no meio e pode estar contido em uma quantidade de, por exemplo, 10 µM ou menos ou 5 µM ou menos, preferivelmente em uma quantidade menor que 5 µM, menor que 4 µM, menor que 3 µM ou menor que 2 µM. O limite inferior da quantidade do inibidor de FGFR1 adicionado não é particularmente limitado e pode ser 0,1 µM ou mais, preferivelmente 0,5 µM ou mais. A quantidade de inibidor de FGFR1 adicionada é preferivelmente menor que 5 µM e 0,1 µM ou mais, mais preferivelmente menor que 5 µM e 0,5 µM ou mais. A cultura na presença do inibidor de FGFR1 pode ser realizada por pelo menos 12 horas, preferivelmente 24 horas ou mais, 2 dias ou mais, 4 dias ou mais, 8 dias ou mais, 10 dias ou mais, ou 15 dias ou mais. A cultura na presença do inibidor de FGFR1 é preferivelmente realizada por 4 dias ou mais. O meio pode ser substituído durante o período de tratamento com o inibidor de FGFR1 e pode ser substituído por um meio suplementado com o inibidor de FGFR1, tendo a mesma composição ou uma composição diferente daquela antes da substituição, de acordo com o cronograma de cultura.

[00236] Na presente invenção, a proporção de células positivas para Ki67 nas células a serem tratadas com o inibidor de FGFR1 (células de material de partida) não é particularmente limitada e pode ser 1% ou mais, 5% ou mais, 10% ou mais, 20 % ou mais, 30% ou mais, 40% ou mais, 50% ou mais, 60% ou mais, 70% ou mais, 80% ou mais, ou 90% ou mais.

[00237] Na presente invenção, a proporção de células positivas para fosfatase alcalina nas células a serem tratadas com o inibidor de FGFR1 (células de material de partida) não é particularmente limitada e pode ser de

63 / 74 10% ou menos, 5% ou menos, 1% ou menos, ou 0,5% ou menos.

[00238] A população de células progenitoras endócrinas ou a população de células em um estágio posterior de diferenciação pode ser submetida à etapa de diferenciação adicional na população de células de interesse (por exemplo, uma população de células produtoras de insulina ou uma população de células β pancreáticas), além de ser tratada com o inibidor de FGFR1. Como aqui usado, “além de ser tratada com o inibidor de FGFR1”; inclui o caso de realizar a etapa de tratamento com o inibidor de FGFR1 e a etapa de diferenciação ao mesmo tempo, o caso de tratar a população de células com o inibidor de FGFR1, seguido pela etapa de diferenciação, e o caso de submeter a população de células à etapa de diferenciação, seguido pela etapa de tratamento com o inibidor de FGFR1. Assim, o meio para uso no tratamento com o inibidor de FGFR1 e o meio para uso na diferenciação da população de células podem ser meios separados ou o meio para uso na etapa de diferenciação pode ser adicionalmente suplementado com o inibidor de FGFR1.

[00239] Em uma modalidade, o inibidor de FGFR1 pode estar contido em um meio para uso na etapa de diferenciação de células progenitoras endócrinas em células produtoras de insulina e pode estar mais preferivelmente contido em um meio para uso na etapa de diferenciação adicional (por exemplo, para cerca dos últimos 4 a 15 dias, preferivelmente cerca dos últimos 4 a 7 dias, da etapa 6) de uma população de células produtoras de insulina precoce obtida pela indução da diferenciação de uma população de células progenitoras endócrinas ou células em um estágio posterior de diferenciação. No caso de tratamento de uma população de células progenitoras endócrinas com o inibidor de FGFR1, o número de células de interesse pode ser reduzido drasticamente. No caso de tratamento de uma população de uma célula produtora de insulina precoce ou uma célula em um estágio posterior de diferenciação com o inibidor de FGFR1, tal

64 / 74 diminuição drástica no número de células de interesse pode ser contornada. Especificamente, no caso de tratamento de uma população de uma célula produtora de insulina precoce ou uma célula em um estágio posterior de diferenciação com o inibidor de FGFR1, o número resultante de células produtoras de insulina pode ser aumentado em comparação com o caso de tratamento de uma população de células progenitoras endócrinas com o inibidor de FGFR1.

[00240] O tratamento de uma população de células progenitoras endócrinas ou de uma população de células em um estágio posterior de diferenciação com o inibidor de FGFR1 pode inibir a proliferação de células positivas para Ki67 na população de células.

[00241] Essa abordagem pode diminuir ou suprimir o número de células proliferativas restantes contidas na linhagem pancreática, não inibindo a proliferação de teratoma.

[00242] Essa abordagem pode diminuir ou suprimir o número de células proliferativas restantes contidas na linhagem pancreática, não inibindo a proliferação de células iPS (por exemplo, não tendo que diminuir o número de células positivas para fosfatase alcalina).

[00243] Essa abordagem é capaz de reduzir o número absoluto de células positivas para Ki67 em uma população de células progenitoras endócrinas ou em uma população de células em um estágio posterior de diferenciação por tratamento usando um inibidor de FGFR1. Isso pode esgotar as células positivas para Ki67 na população de células obtida.

[00244] Especificamente, a proporção de células positivas para Ki67 na população de células obtida pode ser reduzida em comparação com o caso de cultura e/ou diferenciação sem tratamento com o inibidor de FGFR1. A proporção pode ser menor que 10%, menor que 9%, menor que 8%, menor que 7%, menor que 6%, menor que 5%, menor que 4%, menor que 3%, menor que 2% ou menor que 1% e pode ser preferivelmente menor que 3%,

65 / 74 menor que 2% ou menor que 1%.

[00245] De acordo com essa abordagem, a população de células progenitoras endócrinas ou a população de células em um estágio posterior de diferenciação tratada com o inibidor de FGFR1 pode ser diferenciada em células produtoras de insulina ou células β pancreáticas para obter uma população de células com crescimento inibido de células positivas para Ki67 e incluindo células produtoras de insulina ou células β pancreáticas enriquecidas. Especificamente, a proporção de células produtoras de insulina ou células β pancreáticas na população de células obtida após a indução da diferenciação pode ser aumentada em comparação com uma população de células obtida sem tratamento com o inibidor de FGFR1. A proporção pode ser 40% ou mais, 50% ou mais, 60% ou mais, 70% ou mais, 80% ou mais, ou 90% ou mais.

[00246] As células produtoras de insulina ou as células β pancreáticas obtidas por essa abordagem podem ser resididas como são e usadas como células secretoras de insulina, quando transplantadas para o corpo vivo de um animal e diferenciadas no corpo vivo do animal. As células produtoras de insulina ou as células β pancreáticas obtidas por essa abordagem podem contornar a proliferação de células positivas para Ki67 e alcançar uma sobrevivência segura e de longo prazo do enxerto de células transplantadas.

[00247] De acordo com a presente invenção, a população de células produtoras de insulina ou a população de células β pancreáticas das quais células positivas para Ki67 altamente proliferativas foram removidas (população de células da presente invenção) é transplantada como está ou em forma de cápsula para uma área afetada e é assim útil como um medicamento celular para o tratamento de diabetes mellitus, particularmente, diabetes mellitus tipo I.

[00248] A população de células da presente invenção pode ser um pró- fármaco. O pró-fármaco se refere a uma população de células que é

66 / 74 diferenciada após o transplante em um corpo vivo e convertida em células com a função de tratar uma doença.

[00249] A população de células da presente invenção tem baixa toxicidade (por exemplo, toxicidade aguda, toxicidade crônica, toxicidade genética, toxicidade reprodutiva, cardiotoxicidade e carcinogenicidade) e pode ser administrada com segurança como é ou na forma de uma composição farmacêutica contendo a população de células misturada com um carreador farmacologicamente aceitável, etc. para um mamífero (por exemplo, um camundongo, um rato, um hamster, um coelho, um gato, um cachorro, gado, ovelha, um macaco e um humano).

[00250] A seguir, a presente invenção será descrita com referência aos Exemplos. No entanto, a presente invenção não é limitada por esses exemplos. Exemplos

[00251] A indução da diferenciação de células-tronco pluripotentes em uma população de células progenitoras endócrinas foi realizada de acordo com as etapas 1) a 5) acima, o relatório anterior (Stem Cell Research (2015) 14, 185-197), etc. Exemplo 1: Diminuição do número de células não intencionais (células positivas para Ki67) na população de células obtida pelo tratamento da população de células progenitoras endócrinas com inibidor do receptor 1 de

FGF

1. Método (1) Preparação da população de células produtoras de insulina

[00252] A indução da diferenciação da população de células progenitoras endócrinas em uma população de células produtoras de insulina foi realizada de acordo com a etapa 6) acima ou o relatório anterior (Nature Biotechnology 2014; 32: 1121-1133).

[00253] A população de células progenitoras endócrinas obtida pela

67 / 74 indução de diferenciação de células iPS foi cultivada por 12 dias em um meio para indução de diferenciação (MEM melhorado/1% B27/Penicilina estreptomicina) contendo fatores de diferenciação (inibidor de ALK5 II, T3, LDN, inibidor da γ-secretase RO e ácido ascórbico) e um inibidor do receptor 1 de FGF (CAS192705-79-6) para obter uma população de células produtoras de insulina. O número de células positivas para Ki67 na população de células obtida foi avaliado por citometria de fluxo. (2) Transplante de células tratadas com inibidor do receptor 1 de FGF em corpo vivo

[00254] Na descrição abaixo, a preparação de camundongos e o transplante de células foram realizados de acordo com métodos conhecidos.

[00255] A população de células produtoras de insulina obtida por cultura no meio para indução de diferenciação contendo CAS192705-79-6 na seção anterior (1) ou uma população de células produtoras de insulina obtida por cultura em um meio para indução de diferenciação livre de CAS192705- 79-6 como um exemplo comparativo foi transplantada sob a cápsula do rim usando camundongos NOD/SCID imunodeficientes com diabetes mellitus com deficiência de insulina induzida por estreptozotocina. Para acompanhamento após o transplante, as concentrações de peptídeo C humano no sangue e os níveis de glicose no sangue foram medidos. Os enxertos foram excisados 5 semanas após o transplante. (3) Avaliação de células não intencionais no enxerto

[00256] Os enxertos excisados foram fixados e desidratados e, em seguida, os cortes congelados foram preparados e submetidos à coloração imuno-histológica para avaliação das células indesejadas. As células de interesse que poderiam amadurecer em células de ilhotas pancreáticas in vivo foram avaliadas usando positividade de insulina (e positividade de NKX6.1) ou positividade de glucagon como um indicador, e células não intencionais com a possibilidade de afetar adversamente a sobrevivência do enxerto a

68 / 74 longo prazo das células de interesse foram avaliadas usando a positividade de Ki67 como indicador.

2. Resultados (1) Preparação da população de células produtoras de insulina

[00257] Um experimento para tratar células por 12 dias com um meio para indução de diferenciação contendo CAS192705-79-6 (1 µM) foi realizado cinco vezes. Os resultados sobre a proporção de desvio padrão de células positivas para Ki67 ± na população de células obtida são mostrados na Tabela 1. No caso de tratamento de uma população de células progenitoras endócrinas com CAS192705-79-6 por 12 dias, a proporção de células positivas para Ki67 na população de células obtida era muito menor do que em um controle. Esses resultados indicam que o tratamento de uma população de células progenitoras endócrinas com CAS192705-79-6 diminui o número de células positivas para Ki67 ou inibe a proliferação das mesmas. [Tabela 1] Tratamento com inibidor do receptor de FGF Ausente Presente (1 µM) Teor percentual de células positivas para Ki67 10,78 ± 4,09% 0,98 ± 0,29% (antes do transplante) (2) Transplante de células tratadas com inibidor do receptor 1 de FGF em corpo vivo

[00258] Os resultados sobre as concentrações de peptídeo C humano no sangue e os níveis de glicose no sangue medidos para acompanhamento após o transplante são mostrados na Tabela 2. A população de células produtoras de insulina obtida por tratamento por 12 dias com um meio para indução de diferenciação contendo CAS192705-79-6 (1 µM) secretou peptídeo C humano no sangue e apresentou um efeito de melhora da glicose sanguínea elevada, 4 meses após o transplante. Seus níveis foram equivalentes aos do caso de transplante de uma população de células produtoras de insulina obtida sem tratamento com CAS192705-79-6. [Tabela 2]

69 / 74 Tratamento com inibidor do receptor de FGF Ausente Presente (1 µM) Concentração de peptídeo C humano no sangue 4 meses após o transplante 1440 ± 573 1486 ± 305 (pM) Nível de glicose no sangue no momento do 516 ± 35 (no momento do 516 ± 33 (no momento do transplante e 4 meses após o transplante transplante) transplante) (mg/dL) 85 ± 16 (4 meses depois) 86 ± 22 (4 meses depois) (3) Avaliação de células não intencionais no enxerto

[00259] Os resultados dos enxertos de coloração imuno-histológica excisados 5 semanas após o transplante são mostrados na Figura 1.

[00260] No caso do transplante, sob a cápsula do rim, uma população de células produtoras de insulina obtida por tratamento por 12 dias com um meio para indução de diferenciação contendo CAS192705-79-6 (1 µM), inibição drástica do inchaço dos enxertos foi verificado em comparação com o caso de transplante, sob a cápsula do rim, uma população de células produtoras de insulina obtida sem tratamento com CAS192705-79-6. Esses resultados indicam que o tratamento de uma população de células progenitoras endócrinas com CAS192705-79-6 diminui o número de células positivas para Ki67, que são células não intencionais, ou inibe a proliferação das mesmas. Exemplo 2: Diminuição do número de células indesejadas (células positivas para Ki67) e manutenção de células de interesse (células positivas para insulina (e positivas para NKX6.1)) na população de células obtida pelo tratamento da população de células produtoras de insulina com inibidor do receptor 1 de FGF

1. Método

[00261] 1) Uma população de células progenitoras endócrinas obtida pela indução de diferenciação de células iPS foi cultivada por 11 dias em um meio para indução de diferenciação (MEM melhorado/1% B27/Penicilina estreptomicina) contendo fatores de diferenciação (inibidor de ALK5 II, T3, LDN, inibidor da γ-secretase RO e ácido ascórbico) e um inibidor do receptor 1 de FGF (CAS192705-79-6) para obter uma população de células produtoras de insulina.

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[00262] 2) Uma população de células progenitoras endócrinas obtida pela indução de diferenciação de células iPS foi cultivada por 4 dias em um meio para indução de diferenciação (MEM melhorado/1% B27/Penicilina estreptomicina) contendo fatores de diferenciação (inibidor de ALK5 II, T3, LDN, inibidor da γ-secretase RO e ácido ascórbico) e assim induzida para diferenciar em uma população de células produtoras de insulina. Subsequentemente, um inibidor do receptor 1 de FGF (CAS192705-79-6, 1 µM) foi adicionado a um meio para indução de diferenciação (MEM melhorado/1% B27/penicilina estreptomicina) contendo fatores de diferenciação (inibidor de ALK5 II, T3, LDN, inibidor de γ-secretase RO e ácido ascórbico), e as células foram cultivadas ali durante 7 dias.

[00263] 3) Uma população de células progenitoras endócrinas obtida pela indução de diferenciação de células iPS foi cultivada por 7 dias em um meio para indução de diferenciação (MEM melhorado/1% B27/Penicilina estreptomicina) contendo fatores de diferenciação (inibidor de ALK5 II, T3, LDN, inibidor da γ-secretase RO e ácido ascórbico) e assim induzida para diferenciar em uma população de células produtoras de insulina. Subsequentemente, um inibidor do receptor 1 de FGF (CAS192705-79-6, 1 µM) foi adicionado a um meio para indução de diferenciação (MEM melhorado/1% B27/penicilina estreptomicina) contendo fatores de diferenciação (inibidor de ALK5 II, T3, LDN, inibidor de γ-secretase RO e ácido ascórbico), e as células foram cultivadas ali durante 4 dias.

[00264] 4) Uma população de células progenitoras endócrinas obtida pela indução de diferenciação de células iPS foi cultivada por 11 dias em um meio para indução de diferenciação (MEM melhorado/1% B27/Penicilina estreptomicina) contendo fatores de diferenciação (inibidor de ALK5 II, T3, LDN, inibidor da γ-secretase RO e ácido ascórbico) e não contendo CAS192705-79-6 e assim induzida para diferenciar em uma população de células produtoras de insulina.

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[00265] O número de células positivas para Ki67 na população de células obtidas por cada um dos métodos 1), 2) e 3) acima foi contado por citometria de fluxo para determinar a proporção de células positivas para Ki67 em cada população de células.

[00266] O número de células positivas para insulina (e positivas para NKX6.1) na população de células obtidas por cada um dos métodos 1), 2) e 3) acima foi contado por citometria de fluxo. A proporção de células positivas para insulina e (positivas para NKX6.1) em cada método foi calculada como um valor relativo quando o número de células positivas para insulina (e positivas para NKX6.1) na população de células de controle obtida pelo método 4) acima foi definido como 100%.

2. Resultados

[00267] Um experimento usando cada método foi repetido três vezes para avaliar a influência do momento do tratamento com CAS192705-79-6 em uma etapa de produção de células produtoras de insulina. Os resultados sobre as proporções médias de células positivas para Ki67 e células positivas para insulina (e positivas para NKX6.1) obtidas em cada desvio padrão ± do método são mostrados na Tabela 3.

[00268] A proporção de células positivas para Ki67 na população de células obtida não diferiu significativamente entre o caso de tratamento de células usando CAS192705-79-6 desde o início da etapa de indução de diferenciação, o caso de tratamento de células nos últimos 7 dias, e o caso do tratamento de células nos últimos 4 dias, sendo muito menor em todos os casos do que o do controle. Esses resultados indicam que o tratamento com CAS192705-79-6 no processo de produção de células produtoras de insulina ou células β pancreáticas pode diminuir o número de células positivas para Ki67 na população de células ou inibir a proliferação das mesmas.

[00269] Por outro lado, a proporção de células positivas para insulina (e positivas para NKX6.1) diferiu acentuadamente entre o caso de tratamento

72 / 74 de células desde o início da etapa de indução de diferenciação e o caso de tratamento de células nos últimos 7 dias ou 4 dias. Especificamente, no caso de tratamento de células (população de células progenitoras endócrinas) com CAS192705-79-6 desde o início da etapa de indução de diferenciação, foi confirmado que o número de células positivas para insulina (e positivas para NKX6.1), que eram as células de interesse, diminuiu acentuadamente. Em contraste, no caso de tratamento de células (população de células produtoras de insulina precoces ou células em um estágio posterior de diferenciação) com CAS192705-79-6 em um estágio em que a diferenciação progrediu até certo ponto 4 dias ou 7 dias após o início de indução de diferenciação, foi confirmado que o número de células positivas para insulina (e positivas para NKX6.1), que eram as células de interesse, raramente diminuía. [Tabela 3] Presente (1 µM) Presente (1 µM) Tratamento com inibidor do Presente (1 µM) Ausente Nos últimos 7 Nos últimos 4 receptor de FGF Desde o início dias dias Proporção de células 7,57 ± 1,05% 0,57 ± 0,35% 0,47 ± 0,15% 0,57 ± 0,15% positivas para Ki67 Proporção de células positivas para insulina e 100 ± 18% 45 ± 15% 88 ± 13% 91 ± 16% (positivas para NKX6.1) Exemplo 3: Diminuição do número de células não intencionais (células positivas para Ki67) na população de células obtida por tratamento com inibidor de FGFR1 diferente de CAS192705-79-6

1. Método

[00270] Uma população de células progenitoras endócrinas obtida pela indução de diferenciação de células iPS foi cultivada por 8 dias em um meio para indução de diferenciação (MEM melhorado/1% B27/Penicilina estreptomicina) contendo fatores de diferenciação (inibidor de ALK5 II, T3, LDN, inibidor da γ-secretase RO e ácido ascórbico). Subsequentemente, CAS192705-79-6, E-3810 ou PD173074 foi adicionado em três concentrações (baixa, média e alta) a um meio para indução de diferenciação (MCDB131/glicose 20 mM/NaHCO3/FAF-BSA/ITS-X/Glutamax/ácido

73 / 74 ascórbico/Penicilina Estreptomicina) contendo fatores de diferenciação (T3, inibidor de ALK5 II, ZnSO4, heparina, N-acetilcisteína, Trolox e R428), e as células foram cultivadas no meio por 4 dias. O número de células positivas para Ki67 na população de células obtida foi avaliado por citometria de fluxo.

2. Resultados

[00271] A proporção de células positivas para Ki67 em uma população de células obtida por tratamento com CAS192705-79-6 ou E-3810 é mostrada na Tabela 4. Além disso, a proporção de células positivas para Ki67 em uma população de células obtida por tratamento com PD173074 é mostrada na Tabela 5.

[00272] A partir desses resultados, foi confirmado que em populações de células obtidas por tratamento não apenas com CAS192705-79-6, mas com outros inibidores de FGFR1, a proporção de células positivas para Ki67 era muito menor do que a do controle. Esses resultados indicam que o tratamento de inibição de FGFR1 sem ser limitado pelo tratamento com CAS192705-79- 6 diminui o número de células positivas para Ki67 ou inibe a proliferação das mesmas. [Tabela 4] Proporção de células positivas para Ki67 (%); Inibidor de FGFR1 Concentração de tratamento (µM) Ausente 4,13% - - 2,15% ; 0,99% ; 0,7% ; CAS192705-79-6 0,1 µM 0,3 µM 1 µM 2,74% ; 1,51% ; 0,67% ; E-3810 0,3 µM 1 µM 10 µM [Tabela 5] Proporção de células Ki67-positivas (%); Inibidor de FGFR1 Concentração de tratamento (µM) Ausente 2,7% - - 0,7% ; 0,7% ; 0,5% ; PD-173074 0,1 µM 1 µM 5 µM

[00273] Os resultados descritos acima demonstraram que o tratamento de uma população de células progenitoras endócrinas ou células em um estágio posterior de diferenciação com um inibidor de FGFR1 é capaz de diminuir o número de células positivas para Ki67 presentes na população de

74 / 74 células ou inibir sua proliferação, e como resultado, pode ser obtida uma população de células enriquecida nas células de interesse.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para produzir uma população de células produtoras de insulina ou uma população de células β pancreáticas, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de tratamento de uma população de células produtoras de insulina ou uma população de células β pancreáticas com um inibidor de FGFR1.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de diferenciação da população de células produtoras de insulina tratada com o inibidor de FGFR1.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a população de células produtoras de insulina ou a população de células β pancreáticas é tratada com menos de 5 µM do inibidor de FGFR1.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a população de células produzida compreende células positivas para Ki67 em uma proporção menor que 3%.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o inibidor de FGFR1 é 1-[2-amino-6-(3,5- dimetoxifenil)-pirido(2,3-d)pirimidin-7-il]-3-terc-butilureia ou um sal do mesmo.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, caracterizado pelo fato de que a etapa de diferenciação da população de células produtoras de insulina tratada com o inibidor de FGFR1 é realizada por transplante para um animal.

7. Método para produzir uma população de células produtoras de insulina ou uma população de células β pancreáticas, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de tratamento de uma população de células progenitoras endócrinas ou células em um estágio posterior de diferenciação com menos de 5 µM de um inibidor de FGFR1.

8. Método para diminuir o número ou inibir a proliferação de células positivas para Ki67 presentes em uma população de células progenitoras endócrinas ou células em um estágio posterior de diferenciação, caracterizado pelo fato de que compreende tratar a população de células com um inibidor de FGFR1.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a população de células progenitoras endócrinas ou células em um estágio posterior de diferenciação é uma população de células produtoras de insulina.

10. Método de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que a população de células progenitoras endócrinas ou células em um estágio posterior de diferenciação é tratada com menos de 5 µM do inibidor de FGFR1.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que o inibidor de FGFR1 é 1-[2-amino-6-(3,5- dimetoxifenil)-pirido(2,3-d)pirimidin-7-il]-3-terc-butilureia ou um sal do mesmo.

12. População de células progenitoras pancreáticas ou células em um estágio posterior de diferenciação, caracterizada pelo fato de que compreende células positivas para Ki67 em uma proporção de menos de 3%.

13. População de células de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a população de células é uma população de células produtoras de insulina.

14. População de células de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizada pelo fato de que a população de células é usada para transplante.