TW202104590A - 類生體組織結構體的製造方法 - Google Patents

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持田泰佑
山添則子
山浦順司
豊田太郎
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國立大學法人京都大學
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Abstract

本發明之目的為提供一種包含從多能性幹細胞誘導之分化細胞的類生體組織結構體的新穎製造方法，亦即本發明提供一種藉由將包含被分散配置於生物相容性材料中之源自多能性幹細胞之細胞的組成物移植至生體組織中，而分化誘導細胞，並與源自宿主之血管或結締組織一起形成類生體組織結構體的方法。

Description

類生體組織結構體的製造方法
本發明係關於藉由源自多能性幹細胞之分化細胞所構成的類生體組織結構體，以及其製造法及用途。
從人工多能性細胞或胚性幹細胞(ES細胞)等多能性幹細胞所誘導的功能性分化細胞，可期待作為移植再生醫療之細胞供給源。今日，朝向使用組織工學的移植治療，正嘗試利用此種功能性分化細胞，構築具有與生體器官或組織同等或類似功能的結構體(以下，記載為「類生體組織結構體」)。然而，在欲製作具有厚度之3次元結構體的情況，有時無法充分對全部細胞供給氧或營養分等，維持、管理結構體中之細胞在生體外(in vitro)及生體內(in vivo)之任一者中均非易事。因此，以往之結構體，對其厚度或大小有所限制，在發揮與生體器官或組織同等或類似之功能上有不足的情形。在該領域中，依然企盼能簡便地製作具有厚度之3次元類生體組織結構體的新手法。
從人工多能性細胞或胚性幹細胞等多能性幹細胞分化誘導成進行所謂「胰臟β細胞或胰臟α細胞」之荷爾蒙分泌的內分泌細胞，應 用於糖尿病之治療的研究正進行中。迄今，報導有藉由從多能性幹細胞分化誘導成胰前驅細胞，將其移植至生體內，使其成熟化，製造內分泌細胞的手法。例如，在非專利文獻1中，記載將從多能性幹細胞分化誘導的胰前驅細胞移植至小鼠，使其成熟化，製造包含胰島素陽性細胞及升糖素(glucagon)陽性細胞之內分泌細胞的方法。然而，迄今包含胰島素陽性細胞或升糖素陽性細胞等內分泌細胞，具有厚度，且不含胰管(duct)或囊胞(cyst)的3次元類生體組織結構體尚未被製造。
[先前技術文獻]
[非專利文獻]
[非專利文獻1] Robert T et al, Stem Cell Reports. 2018 Mar 13; 10(3): 739-750.
本發明之目的為提供包含從多能性幹細胞誘導之分化細胞的類生體組織結構體的新穎製造方法。
本發明人等為能解決上述課題，專心檢討的結果，發現藉由將包含被分散配置於生物相容性材料中之源自多能性幹細胞的細胞的組成物，移植至生體組織中，細胞可存活、被分化誘導及成熟，並與源自宿主之血管或結締組織一起構築成類生體組織結構體。
本發明係基於此等見識而產生者，包含以下之發明。
[1]一種組成物，其係在宿主動物之生體組織內製作類生體組織結構體之方法中所使用的組成物，該組成物包含生物相容性材料及源自人類多能性幹細胞的細胞，其中源自人類多能性幹細胞的細胞係被分散配置於生物相容性材料中。
[2]如[1]之組成物，其中生物相容性材料為纖維蛋白凝膠。
[3]如[2]之組成物，其中纖維蛋白凝膠，係在前述組成物即將使用之前，將源自人類多能性幹細胞之細胞及纖維蛋白原(fibrinogen)及凝血酶(thrombin)混合而凝膠化者。
[4]如[1]至[3]中任一項之組成物，其中源自人類多能性幹細胞之細胞，係以複數個球體之型態存在。
[5]如[1]至[4]中任一項之組成物，其中源自人類多能性幹細胞之細胞中的Ki67陽性細胞之比率係未達3%。
[6]如[1]至[5]中任一項之組成物，其中源自人類多能性幹細胞之細胞為胰島素產生細胞。
[7]如[1]至[6]中任一項之組成物，其中前述方法包含將前述組成物移植至宿主動物之生體組織中，並將被分散配置於生物相容性材料中之源自人類多能性幹細胞的細胞分化誘導。
[8]如[7]之組成物，其中宿主動物之生體組織為皮下組織。
[9]如[1]至[8]中任一項之組成物，其中類生體組織結構體包含從源自人類多能性幹細胞之細胞分化誘導所得到之分化細胞構成的複數個簇(cluster)、源自宿主動物之結締組織、以及源自宿主動物之血管，該分化細 胞構成之複數個簇分散存在於類生體組織結構體中，該結締組織圍繞由該分化細胞構成之複數個簇的周圍，該血管侵入由該分化細胞構成的複數個簇。
[10]如[9]之組成物，其中前述分化細胞不含外分泌細胞。
[11]一種類生體組織結構體，其為包含從源自人類多能性幹細胞之細胞分化誘導所得到之分化細胞構成的複數個簇、源自宿主動物之結締組織、以及源自宿主動物之血管的類生體組織結構體，其中該分化細胞構成之複數個簇係分散存在於類生體組織結構體中，該結締組織圍繞由該分化細胞構成之複數個簇的周圍，該血管侵入由該分化細胞構成之複數個簇。
[12]如[11]之類生體組織結構體，其中前述分化細胞包含胰β細胞。
[12-A]如[11]之類生體組織結構體，其中前述分化細胞包含胰β細胞及胰α細胞。
[13]如[11]至[12-A]中任一項之類生體組織結構體，其中前述分化細胞不含外分泌細胞。
[14]如[11]至[13]中任一項之類生體組織結構體，其係被用於將移植有前述類生體組織結構體之受檢體的血糖值調控於正常值。
[15]一種類生體組織結構體之製造方法，其包含：將包含生物相容性材料及源自人類多能性幹細胞之細胞的組成物，移植至宿主動物之生體組織中而進行分化誘導，其中該源自人類多能性幹細胞之細胞係被分散配置於生物相容性材料中。
[16]如[15]之方法，其中生物相容性材料為纖維蛋白凝膠。
[17]如[16]之方法，其中纖維蛋白凝膠係在前述組成物即將使用之前，將源自人類多能性幹細胞之細胞及纖維蛋白原(fibrinogen)及凝血酶(thrombin)混合而凝膠化。
[18]如[15]至[17]中任一項之方法，其中源自人類多能性幹細胞之細胞係以複數個球體之型態存在。
[19]如[15]至[18]中任一項之方法，其中源自人類多能性幹細胞之細胞中的Ki67陽性細胞之比率係未達3%。
[20]如[15]至[19]中任一項之方法，其中源自人類多能性幹細胞之細胞為胰島素產生細胞。
[21]如[15]至[20]中任一項之方法，其中宿主動物之生體組織為皮下組織。
[22]如[15]至[21]中任一項之方法，其中類生體組織結構體包含從分散之源自人類多能性幹細胞之細胞分化誘導所得到之分化細胞構成的複數個簇、源自宿主動物之結締組織、以及源自宿主動物之血管，該分化細胞構成之複數個簇係分散於類生體組織結構體中而存在，該結締組織圍繞該分化細胞構成之複數個簇的周圍，該血管侵入該分化細胞構成之複數個簇中。
[23]如[15]至[22]中任一項之方法，其中前述分化細胞不含外分泌細胞。
本說明書包含為本案優先權之基礎的日本國專利申請2019-075100號之說明書及/或圖式所記載的內容。
茲將本說明書所引用之所有文獻、專利及專利申請原樣作為參考，並彙入本說明書中。
若依照本發明，可提供包含從多能性幹細胞誘導之分化細胞的類生體組織結構體的新穎製造方法。
圖1展示移植前之胰島素產生細胞，藉由流式細胞術(flow cytometry)解析蛋白質表現的結果。
圖2展示經時地測定藉由鏈脲佐菌素(streptozotocin)(STZ)誘發糖尿病之免疫不全NOD/SCID小鼠中之血中人類C-肽濃度(A)及血糖值(B)的結果，其中分散有胰島素產生細胞之纖維蛋白凝膠被移植至該小鼠。
圖3展示藉由鏈脲佐菌素(STZ)誘發糖尿病之免疫不全NOD/SCID小鼠之生體內所形成的源自胰島素產生細胞之類生體組織結構體對葡萄糖負荷之回應的解析結果。其表示經時地測定葡萄糖負荷後之血中人類C-肽濃度(A)及血漿中葡萄糖濃度(B)的結果。
圖4展示移植6個月後從生體內摘出之源自胰島素產生細胞的類生體組織結構體的照片。
圖5展示移植6個月後從生體內摘出之源自胰島素產生細胞的類生體組織結構體的HE染色圖。
圖6展示移植6個月後從生體內摘出之源自胰島素產生細胞的類生體組織結構體的馬森三色法(Masson trichrome)染色圖。
圖7展示移植6個月後從生體內摘出之源自胰島素產生細胞的類生體組織結構體之人類核(HuN)及PDX1的免疫組織染色圖。
圖8展示移植6個月後從生體內摘出之源自胰島素產生細胞的類生體組織結構體之胰島素(INS)及升糖素(GCG)的免疫組織染色圖。
圖9展示移植6個月後從生體內摘出之源自胰島素產生細胞的類生體組織結構體之小鼠CD31(mCD31)及嗜鉻細胞分泌素A(chromogranin A)(CHGA)的免疫組織染色圖。
圖10展示移植6個月後從生體內摘出之源自胰島素產生細胞的類生體組織結構體之人類核(HuN)及Ki67的免疫組織染色圖。箭號：Ki67陽性細胞。
圖11展示對於藉由鏈脲佐菌素(streptozotocin)(STZ)誘發糖尿病的免疫不全NOD/SCID小鼠，移植被分散於纖維蛋白凝膠之胰島素產生細胞，並於移植後經時地測定所得的血中人類C-肽、升糖素及血糖值。
圖12展示對於藉由鏈脲佐菌素(STZ)誘發糖尿病的免疫不全NOD/SCID小鼠及非糖尿病之NOD/SCID小鼠，移植被分散於纖維蛋白凝膠之胰島素產生細胞，於移植28週後，從生體內摘出的源自胰島素產生細胞之類生體組織結構體中的胰島素及升糖素含量之測定結果。上段表示胰島素含量之測定結果，下段表示升糖素含量之測定結果，又，各段中左邊表示各小鼠之胰臟中各荷爾蒙含量的測定結果(對照)，右表示摘出的源自胰島素產生細胞之類生體組織結構體中各荷爾蒙含量的測定結果。
圖13展示對於移植被分散於纖維蛋白凝膠之胰島素產生細胞，高血糖完全改善的具有Akita基因變異之NOD/SCID小鼠，負荷葡萄糖後經時地測定所得的升糖素及類升糖素肽-1。
圖14展示對於移植被分散於纖維蛋白凝膠之胰島素產生細胞，高血糖完全改善的STZ糖尿病NOD/SCID小鼠，在處置升糖素受體拮抗劑MK-0893後負荷葡萄糖，然後經時地測定所得的血糖值及血中人類C-肽濃度。
圖15展示對於移植被分散於纖維蛋白凝膠之胰島素產生細胞，高血糖完全改善的Akita糖尿病NOD/SCID小鼠，處置類升糖素肽-1受體拮抗劑Exendin-9共計3日，在處置前後測得的飽食時血中人類C-肽濃度。
1.術語
在本說明書中，「約」表示相對於基準值變動正或負分別至25%、20%、10%、8%、6%、5%、4%、3%、2%或1%之值。較佳「約」或「大概」之術語，表示相對於基準值為正或負分別15%、10%、5%、或1%之範圍。
在本說明書中，「包含(comprise(s)或comprising)」意指雖表示該語句後述之要素的包含，然而不以此為限。因此，雖暗示該語句後述之要素的包含，然而非暗示其他任何要素之排除。
在本說明書中，「由…構成(consist(s)of或consisting of)」，意指包含該語句後述之所有要素，且以此為限。因此，「由…構成」之語句，表示要求或必須為所列舉的要素，其他要素實質上不存在。
在本說明書中，不「使用餵養細胞(feeder cell)」，意指基本上不包含餵養細胞，不使用藉由培養餵養細胞而進行預先調理(preconditioning)的培養基等。因此，在培養基中不含從餵養細胞分泌之成長因子及細胞激素(cytokine)等物質。
再者，「餵養細胞」或「餵養者」意指與其他種類之細胞共培養，可賦予能支持該細胞成長之環境的細胞。餵養細胞可源自與彼等支持之細胞同種者，亦可為源自與其異種者。例如，就人類細胞之餵養者而言，可使用人類皮膚纖維母細胞或人類胚性幹細胞，亦可使用小鼠胚纖維母細胞之初代培養物，及可使用不死化小鼠胚纖維母細胞。餵養細胞可藉由放射線照射或絲裂黴素C處理等而不活化。
在本說明書中，「貼附」意指細胞附著於容器，例如，細胞於適當之培養基存在下，附著於滅菌塑膠(或經塗覆之塑膠)之細胞培養皿或燒瓶。在細胞之中，亦有不貼附於細胞培養容器，於培養物中無法維持或成長者。與此相對地，非貼附性細胞則可不貼附於容器，於培養物中可維持，及增殖。
在本說明書中，「培養」意指使細胞在生體外環境中維持、使其成長、且/或分化。「進行培養」意指於組織或體外，例如，細胞培養皿或燒瓶中，使細胞持續、增殖(成長)、且/或分化。培養係包含2次元培養(平面培養)或3次元培養(懸浮培養)。
在本說明書中，「進行富集(enrich)」及「富集(enrichment)」意指使細胞之組成物等組成物中的特定構成成分之量增加，「經富集(enriched)」意指細胞之組成物，例如在用於說明細胞集團的情況，係指特 定構成成分之量，與富集前之細胞集團中此種構成成分之比率相較，有所增加的細胞集團。例如，可使細胞集團等組成物，針對標的細胞型進行富集，因此，標的細胞型之比率，與富集前之細胞集團內所存在之標的細胞的比率相較，有所增加。細胞集團亦可藉由該技術領域中周知之細胞選擇及篩選方法，針對標的細胞型進行富集。細胞集團亦可藉由本說明書記載的特定篩選或選擇程序進行富集。本發明之特定實施型態方面，藉由將標的細胞集團富集之方法，細胞集團係使關於標的細胞集團，以至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%進行富集。
在本說明書中，「消減(deplete)或(depletion)」意指使細胞或細胞之組成物等組成物中特定的構成成分之量減少，「經消減(depleted)」意指細胞或細胞之組成物，例如在用於說明細胞集團的情況，係指特定構成成分之量，與經消減前之細胞集團中此種構成成分之比率相較，有所減少的細胞集團。例如，可使細胞集團等組成物，針對標的細胞型進行消減，因此，標的細胞型之比率，與經消減前之細胞集團內所存在之標的細胞的比率相較，有所減少。細胞集團亦可藉由該技術領域中周知之細胞選擇及篩選方法，針對標的細胞型進行消減。細胞集團亦可藉由本說明書中記載的特定篩選或選擇程序進行消減。在本發明之特定實施型態方面，藉由使標的細胞集團消減的方法，細胞集團係將關於標的細胞集團，以至少50%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%進行減少(消減)。
在本說明書中，「純化(purify或purification)」意指將細胞之組成物等組成物中的雜質除去，關於特定之構成成分形成純粹者，「經 純化(purified)」意指細胞之組成物，例如在用於說明細胞集團的情況，係指雜質之量，與經純化前之細胞集團中此種構成成分之比率相較，有所減少，提升特定構成成分之純度的細胞集團。例如，可將細胞集團等組成物，針對標的細胞型進行純化，因此，標的細胞型之比率，與純化前之細胞集團內所存在之標的細胞的比率相較，有所增加。細胞集團亦可藉由該技術領域中周知之細胞選擇及篩選方法，針對標的細胞型進行純化。細胞集團亦可藉由本說明書中記載的特定之篩選或選擇程序進行純化。本發明之特定實施型態中，藉由將標的細胞集團純化的方法，標的細胞集團之純度，成為至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%，或雜質(包含混雜細胞)成為無法測出的程度。
在本說明書中，「具有CDK8/19阻礙活性之因子」意指具有CDK8/19之阻礙活性的所有物質。與同樣CDK家族之其他蛋白質對照而言，CDK8於細胞增殖中未必需要，CDK8之阻礙在通常之條件下無大效果。CDK19與CDK8類似，CDK8阻礙通常亦伴隨CDK19之阻礙。
「增殖因子」為促進特定細胞之分化及/或增殖的內因性蛋白質。就「增殖因子」而言，例如，可列舉上皮成長因子(EGF)、酸性纖維母細胞增殖因子(aFGF)、鹼性纖維母細胞增殖因子(bFGF)、肝細胞增殖因子(HGF)、類胰島素增殖因子1(IGF-1)、類胰島素增殖因子2(IGF-2)、角質形成細胞增殖因子(KGF)、神經增殖因子(NGF)、血小板衍生增殖因子(PDGF)、轉形增殖因子β(TGF-β)、血管內皮細胞增殖因子(VEGF)、運鐵蛋白(transferrin)、各種介白素(interleukin)(例如，IL-1至IL-18)、各種菌落-刺激因子(例如，顆粒球/巨噬細胞菌落-刺激因子(GM-CSF))、各種干擾 素(interferon)(例如，IFN-γ等)及對幹細胞具有效果的其他細胞激素，例如，幹細胞因子(SCF)及紅血球生成素(Erythropoietin)(Epo)。
在本說明書中，「ROCK阻礙劑」意指阻礙Rho激酶(ROCK：Rho-associated，coiled-coil containing protein kinase)的物質，可為阻礙ROCK I及ROCK II之任一者的物質。ROCK阻礙劑只要具有上述之功能，無特別限定，例如，可列舉N-(4-吡啶基)-4 β-[(R)-1-胺基乙基]環己烷-1 α-甲醯胺(亦稱為Y-27632)、Fasudil(HA1077)、(2S)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-異喹啉基]磺醯基]六氫-1H-1,4-二氮呯(H-1152)、4 β-[(1R)-1-胺基乙基]-N-(4-吡啶基)苯-1-甲醯胺(Wf-536)、N-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4PER(R)-1-胺基乙基]環己烷-1 α-甲醯胺(Y-30141)、N-(3-{[2-(4-胺基-1,2,5-
Figure 109111993-A0202-12-0012-18
二唑-3-基)-1-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基]氧基}苯基)-4-{[2-(4-嗎啉基)乙基]-氧基}苯甲醯胺(GSK269962A)、N-(6-氟-1H-吲唑-5-基)-6-甲基-2-側氧基-4-[4-(三氟甲基)苯基]-3,4-二氫-1H-吡啶-5-甲醯胺(GSK429286A)。ROCK阻礙劑不以此等為限，亦可使用針對ROCK之mRNA的反義寡核苷酸或siRNA、結合於ROCK之抗體、顯性負效(dominant negative)ROCK變異體等，作為ROCK阻礙劑，可從商業上取得，亦可依照周知之方法合成。
在本說明書中，「GSK3 β阻礙劑」為具有針對GSK3 β(肝糖合成酶激酶3 β)之阻礙活性的物質。GSK3(肝糖合成酶激酶3)為絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶之一種，參與肝糖之產生、細胞凋亡、幹細胞之維持等多個信號路徑。GSK3中存在α及β之2個同功型(isoform)。本發明中所 用的「GSK3 β阻礙劑」，只要具有GSK3 β阻礙活性，無特別限定，亦可為合併兼具GSK3 β阻礙活性及GSK3 α阻礙活性的物質。
就GSK3 β阻礙劑而言，可例示CHIR98014(2-[[2-[(5-硝基-6-胺基吡啶-2-基)胺基]乙基]胺基]-4-(2,4-二氯苯基)-5-(1H-咪唑-1-基)嘧啶)、CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]胺基]乙基]胺基]菸鹼甲腈)、TDZD-8(4-苄基-2-甲基-1,2,4-噻二唑啶-3,5-二酮)、SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、TWS-119(3-[6-(3-胺基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基氧基]酚)、肯帕羅酮(Kenpaullone)、1-氮雜肯帕羅酮(Azakenpaullone)、SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、SB415286(3-[(3-氯-4-羥基苯基)胺基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮)及AR-AO144-18、CT99021、CT20026、BIO、BIO-乙醯肟、吡啶并咔唑-環戊二烯基釕複合體、OTDZT、α-4-二溴乙醯苯、鋰等。GSK3 β不受此等限定，亦可使用針對GSK3 β之mRNA的反義寡核苷酸或siRNA、結合於GSK3 β之抗體、顯性負效(dominant negative)GSK3 β變異體等作為GSK3 β阻礙劑，可從商業上取得，亦可依照周知之方法合成。
在本說明書中，「血清代替物」可列舉例如，Knockout Serum Replacement(KSR：Invitrogen)、StemSure Serum Replacement(Wako)、B-27補充劑、N2-補充劑、白蛋白(例如，富含脂質的白蛋白)、胰島素、運鐵蛋白(transferrin)、脂肪酸、膠原蛋白前驅體、微量元素(例如鋅、硒(例如，亞硒酸鈉))、2-巰基乙醇、3’硫甘油或此等之混合物(例如，ITS-G)。就血清代替物而言，以B-27補充劑、KSR、StemSure Serum Replacement、 ITS-G為較佳。在培養基中添加血清代替物之情況的培養基中之濃度，為0.01至10重量%，較佳為0.1至2重量%。在本發明中，以使用「血清代替物」代替血清為較佳。
在本說明書中「FGFR1阻礙劑」意指具有針對纖維母細胞增殖因子受體(FGFR)1之阻礙活性的物質。FGFR1就作為對於為成長因子之FGF1至FGF17具有高親和性之受體而言，為4次膜貫通型酪胺酸激酶之家族(FGFR1、2、3、4)的成員。FGFR1阻礙劑只要具有FGFR1阻礙活性，無特別限定，可為兼具與FGFR1阻礙活性合併其他FGFR之阻礙活性的物質。在本說明書中「FGFR1阻礙劑」意指包含即使很少，仍有FGFR1阻礙活性之物質，而較佳意指50%以上阻礙FGFR1之物質，更佳意指FGFR1之50%阻礙濃度(IC50)為1μM以下，進一步更佳意指100nM以下之物質。就FGFR1阻礙活性之判定方法而言，只要從周知之方法選擇即可，可列舉如使用EnzyChrom激酶檢定套組(EnzyChrom Kinase Assay Kit(BioAssay Systems公司))的判定方法等。FGFR1阻礙劑可利用先前周知者，其可從專利文獻或非專利文獻找到。
具體而言，就本發明中可利用的FGFR1阻礙劑言之，可例示PD-166866(1-[2-胺基-6-(3,5-二甲氧基苯基)-吡啶并(2,3-d)嘧啶-7-基]-3-三級丁基脲：CAS No.：192705-79-6)、E-3810(CAS No.：1058137-23-7)、PD-173074(CAS No.：219580-11-7)、FGFR4-IN-1(CAS No.：1708971-72-5)、FGFR-IN-1(CAS No.：1448169-71-8)、FIIN-2(CAS No.：1633044-56-0)、AZD4547(CAS No.：1035270-39-3)、FIIN-3(CAS No.：1637735-84-2)、NVP-BGJ398(CAS No.：1310746-10-1)、NVP-BGJ398(CAS No.： 872511-34-7)、CH5183284(CAS No.：1265229-25-1)、德拉贊替尼(Derazantinib)(CAS No.：1234356-69-4)、德拉贊替尼消旋物(Derazantinib Racemate)、阿魏酸(Ferulic acid)(CAS No.：1135-24-6)、SSR128129E(CAS No.：848318-25-2)、SSR128129E游離酸(CAS No.：848463-13-8)、厄達替尼(Erdafitinib)(CAS No.：1346242-81-6)、BLU9931(CAS No.：1538604-68-0)、PRN1371(CAS No.：1802929-43-6)、S49076(CAS No.：1265965-22-7)、LY2874455(CAS No.：1254473-64-7)、林昔替尼(Linsitinib)(CAS No.：867160-71-2)、多韋替尼(Dovitinib)(CAS No.：405169-16-6)、安羅替尼(Anlotinib)(CAS No.：1058156-90-3)、布立尼布(Brivanib)(CAS No.：649735-46-6)、德拉贊替尼(Derazantinib)(CAS No.：1234356-69-4)、安羅替尼鹽酸鹽(Anlotinib Dihydrochloride)(CAS No.：1360460-82-7)、ACTB-1003(CAS No.：939805-30-8)、BLU-554(CAS No.：1707289-21-1)、羅加拉替尼(Rogaratinib)(CAS No.：1443530-05-9)、BIBF 1120乙磺酸鹽(CAS No.：656247-18-6)、TG 100572鹽酸鹽(CAS No.：867331-64-4)、ENMD-2076(CAS No.：934353-76-1)、布立尼布丙胺酸鹽(Brivanib alaninate)(CAS No.：649735-63-7)、TG 100572(CAS No.：867334-05-2)、BIBF 1120(CAS No.：656247-17-5)、ENMD-2076酒石酸鹽(CAS No.：1291074-87-7)、TSU-68(CAS No.：252916-29-3)、普那替尼(Ponatinib)(CAS No.：943319-70-8)、索凡替尼(Sulfatinib)(CAS No.：1308672-74-3)、LY2784544(CAS No.：1229236-86-5)、多韋替尼乳酸鹽(Dovitinib lactate)(CAS No.：692737-80-7)、SU 5402(CAS No.：215543-92-3)、FGF-401(CAS No.：1708971-55-4)、酪胺酸激酶-IN-1(CAS No.： 705946-27-6)、PP58(CAS No.：212391-58-7)、TG 100801鹽酸鹽(CAS No.：1018069-81-2)、克萊拉尼(Crenolanib)(CAS No.：670220-88-9)、TG 100801(CAS No.：867331-82-6)、帕唑帕尼鹽酸鹽(Pazopanib Hydrochloride)(CAS No.：635702-64-6)、帕唑帕尼(Pazopanib)(CAS No.：444731-52-6)、PD168393(CAS No.：194423-15-9)、阿帕替尼(Apatinib)(CAS No.：1218779-75-9)、帕博西尼羥乙基磺酸鹽(Palbociclib isethionate)(CAS No.：827022-33-3)、福林替尼(Foretinib)(CAS No.：849217-64-7)、樂伐替尼(Lenvatinib)(CAS No.：417716-92-8)、坦度替尼(Tandutinib)(CAS No.：387867-13-2)等或其鹽(將此等化合物稱為化合物群D)。又，此等化合物只要具有FGFR1阻礙活性，較佳只要FGFR1之50%阻礙濃度(IC50)為100nM以下，亦可具有選自上述之一或複數個取代基。
又，此等之化合物，只要具有FGFR1阻礙活性，較佳只要FGFR1之50%阻礙濃度(IC50)為100nM以下，亦可一部分之部分結構(取代基、環等)被變換。
較佳者，在本發明中，FGFR1阻礙劑為CAS192705-79-6(1-[2-胺基-6-(3,5-二甲氧基苯基)-吡啶并(2,3-d)嘧啶-7-基]-3-三級丁基脲：CAS No.：192705-79-6)、E-3810(CAS No.：1058137-23-7)、PD173074(CAS No.：219580-11-7)。
FGFR1阻礙劑不限定於上述所示的化合物，亦可使用針對FGFR1之mRNA的反義寡核苷酸或siRNA、結合於FGFR1之抗體、顯性 負效(dominant negative)FGFR1變異體等，作為FGFR1阻礙劑，可從商業上取得，亦可依照周知之方法合成。
在本說明書中，「標記」意指「標記蛋白質」、「標記基因」等藉由設定之細胞型特異地表現的細胞抗原或其基因。較佳而言，標記為細胞表面標記，其情況、生存細胞之濃縮、單離、及/或檢測變得可實施。標記可為陽性選擇標記、或陰性選擇標記。
標記蛋白質之檢測，可為使用對該標記蛋白質特異之抗體的免疫學的檢定，例如，可利用ELISA、免疫染色、流式細胞術進行。標記基因之檢測，可利用該領域中周知之核酸擴增方法及/或核酸檢測方法，例如，RT-PCR、微陣列、生物晶片等而進行。在本說明書中，標記蛋白質為「陽性」，意指可用流式細胞術驗出為陽性，為「陰性」意指用流式細胞術為檢測限界以下。又，標記基因為「陽性」，意指可藉由RT-PCR驗出，「陰性」意指藉由RT-PCR為檢測限界以下。
在本說明書中，「表現(expression)」定義為細胞內由啟動子驅動的特定核苷酸序列的轉錄及/或轉譯。
在本說明書中，「細胞」只要無特別記載，意指細胞之組成物，亦即細胞集團。因此，「細胞」方面不僅包含特定之細胞，亦可包含一或複數個其他細胞。「細胞」中之特定細胞可藉由富集或純化，或者藉由將一或複數個其他細胞消減而提高。
又，在本說明書中，「細胞」以人類細胞為較佳。
2.包含源自多能性幹細胞之細胞及生物相容性材料的組成物
2-1. 源自多能性幹細胞之細胞
在本說明書中，「多能性(pluripotency)」意指可分化成各種相異之型態或功能的組織或細胞，亦可分化成3胚葉之任何系統之細胞的能力。「多能性(pluripotency)」從無法分化成胎盤，因而無形成個體之能力的觀點而言，與能分化成生體之所有組織，包含胎盤的「全能性(totipotency)」有所區別。
在本說明書中「專能性(multipotency)」意指可分化成複數個限定數目之系統之細胞的能力。例如，間葉系幹細胞、造血幹細胞、神經幹細胞為專能性(multipotency)，而非多能性(pluripotency)。
在本說明書中，「多能性幹細胞(pluripotent stem cell)」意指胚性幹細胞(ES細胞)以及潛在地具有與其同樣之分化多能性，亦即可分化成生體之各種組織(內胚葉、中胚葉、外胚葉之全部)之能力的細胞。就具有與ES細胞同樣之分化多能性的細胞而言，可列舉「人工多能性幹細胞」(本說明書中，亦稱為「iPS細胞」)。較佳而言，在本發明中，多能性幹細胞意指人類多能性幹細胞。
就「ES細胞」而言，若為小鼠ES細胞，可利用inGenious公司、理研等所建立的各種小鼠ES細胞株，若為人類ES細胞，可利用NIH、理研、京都大學、Cellartis公司所建立的各種人類ES細胞株。例如就ES細胞株而言，可利用NIH之CHB-1至CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1至HUES28株等、WisCell Research之H1株、H9株、理研之KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等。
「人工多能性幹細胞」意指藉由對哺乳動物體細胞或未分化幹細胞，導入特定之因子(核初期化因子)，重新編程(programming)所得到的細胞。現今，「人工多能性幹細胞」有各式各樣，除根據山中等人，藉由對小鼠纖維母細胞導入4因子：Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc所建立的iPS細胞(Takahashi K,Yamanaka S.,Cell,(2006)126：663-676)之外，亦可使用將同樣之4因子導入人類纖維母細胞所建立的源自人類細胞之iPS細胞(Takahashi K,Yamanaka S,.et al.Cell,(2007)131：861-872.)，導入上述4因子後，以Nanog之表現作為指標篩選所建立的Nanog-iPS細胞(Okita,K.,Ichisaka,T.,and Yamanaka,S.(2007).Nature 448,313-317.)，以不包含c-Myc之方法所製作的iPS細胞(Nakagawa M,Yamanaka S.,et al.Nature Biotechnology,(2008)26,101-106))，以無病毒方式導入6因子所建立的iPS細胞(Okita K et al.Nat.Methods 2011 May；8(5)：409-12,Okita K et al.Stem Cells.31(3)：458-66.)。又，亦可使用根據Thomson等人所製作的導入OCT3/4、SOX2、NANOG、LIN28之4因子而建立的人工多能性幹細胞(Yu J.,Thomson JA.et al.,Science(2007)318：1917-1920.)，根據Daley等人所製作的人工多能性幹細胞(Park IH,Daley GQ.et al.,Nature(2007)451：141-146)，根據櫻田等人所製作的人工多能性幹細胞日本專利(特開2008-307007號)等。
此外，亦可使用公開之所有論文(例如，Shi Y.,Ding S.,et al.,Cell Stem Cell,(2008)Vol3,Issue 5,568-574；Kim JB.,Scholer HR.,et al.,Nature,(2008)454,646-650；Huangfu D.,Melton,DA.,et al.,Nature Biotechnology,(2008)26,No 7,795-797)，或者專利(例如，日本特 開2008-307007號、日本特開2008-283972號、US2008/2336610、US2009/047263、WO2007/069666、WO2008/118220、WO2008/124133、WO2008/151058、WO2009/006930、WO2009/006997、WO2009/007852)所記載的該領域中周知之人工多能性幹細胞的任一者。
就人工多能性細胞株而言，可利用NIH、理化學研究所(理研)、京都大學等所建立的各種iPS細胞株。例如，若為人類iPS細胞株，可列舉理研之HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株，京都大學之Ff-WJ-18株、Ff-I01s01株、Ff-I01s02株、Ff-I01s04株、Ff-I01s06株、Ff-I14s03株、Ff-I14s04株、QHJI01s01株、QHJI01s04株、QHJI14s03株、QHJI14s04株、RWMH15s02株、Ff-MH15s02株、253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株，CDI公司之MyCell iPS Cells(21525.102.10A)株，MyCell iPS Cells(21526.101.10A)株等。
在本說明書中，「源自多能性幹細胞之細胞」意指藉由多能性幹細胞分化誘導所得到的細胞，就此種細胞而言，可列舉藉由多能性幹細胞分化誘導的外胚葉系統之細胞、中胚葉系統之細胞、或內胚葉系統之細胞、或彼等之組合所構成的細胞。更詳細而言，意指藉由多能性幹細胞分化誘導成的構成表皮、神經、腦、脊髓、食道、胃、小腸、大腸、膀胱、尿道、肺、甲狀腺、胰臟、肝臟、肌肉、骨骼、心臟、血管、脾臟、腎臟等(不以此等為限)之器官或組織的細胞，或具有與其前驅細胞同等或類似之功能的細胞。
在較佳之本發明中，「源自多能性幹細胞之細胞」具有細胞彼此集合、凝集化的細胞集合體之狀態，亦即球體之型態。源自多能性幹細胞之細胞的球體可藉由懸浮培養等先前周知之手法製作，或者亦可使用在培養底面配置有微細空間的球體形成用培養盤(例如，商品名：Elplasia(Kuraray股份有限公司)、商品名：EZSPHERE(AGC Technologies股份有限公司)、商品名：Corning球體微培養盤(Corning International股份有限公司)。球體具有之直徑為約10μm至1000μm，較佳為約50μm至500μm，更佳為約50μm至300μm，進一步更佳為約50μm至200μm程度之大小。以及/或者，球體為由約100至約1000個，較佳為約200至約800個，更佳為約300個至約500個左右之細胞構成。
在本發明之一實施型態中「源自多能性幹細胞之細胞」係在從多能性幹細胞分化成胰β細胞之過程中出現的胚體內胚葉細胞、原腸管細胞、後方前腸細胞、胰前驅細胞、內分泌前驅細胞、胰島素產生細胞，特佳為胰島素產生細胞。
已知在從多能性幹細胞分化成胰β細胞之過程中，隨著分化階段，出現具有不同特徴的細胞(WO2009/012428、WO2016/021734)。例如，此分化階段，依照較未分化的順序，可大致分類為多能性幹細胞、胚體內胚葉細胞、原腸管細胞、後方前腸細胞、胰前驅細胞、內分泌前驅細胞、胰島素產生細胞、胰β細胞。
「胚體內胚葉細胞」意指藉由SOX17、FOXA2、BMP2、CER、及CXCR4之至少一個標記之表現而賦予特徴的細胞。
「原腸管細胞」意指藉由HNF1B、及HNF4A之至少一個標記之表現而賦予特徴的細胞。
「後方前腸細胞」意指藉由PDX-1、HNF6、及HLXB9之至少一個標記之表現而賦予特徴的細胞。
「胰前驅細胞」意指藉由PDX-1、NKX6.1、PTF-1 α、GATA4及SOX9之至少一個標記之表現而賦予特徴的細胞。
「內分泌前驅細胞」意指藉由嗜鉻細胞分泌素A、NeuroD及NGN3之至少一個標記之表現，及胰相關之荷爾蒙系統(例如，胰島素等)之標記未表現而賦予特徴的細胞。內分泌前驅細胞亦可表現PAX-4、NKX2-2、Islet-1、PDX-1、PTF-1 α等標記。
「胰島素產生細胞」意指藉由胰島素之標記之表現而賦予特徴的細胞。更詳細而言，「胰島素產生細胞」係藉由以約30%以上之比率包含表現胰島素及NKX6.1兩者之標記的細胞(亦即，胰島素陽性且NKX6.1陽性之細胞，以下記載為「Ins+NKX+細胞」)，且以超過約15%之比率包含只表現作為標記之胰島素及NKX6.1中之胰島素的細胞(亦即，胰島素陽性且NKX6.1陰性之細胞，以下記載為「Ins+NKX-細胞」)而賦予特徴。胰島素產生細胞中Ins+NKX+細胞之比率的上限無特別限定，較佳可為約50%以下。
胰島素產生細胞中的Ins+NKX-細胞之比率，較佳可為約20%以上，更佳為約25%以上，進一步更佳約30%以上。又，胰島素產生細胞中Ins+NKX-細胞之比率的上限無特別限定，較佳可為約40%以下。
例如，胰島素產生細胞，以約30%以上、約50%以下之比率包含Ins+NKX+細胞，且以超過約15%、約40%以下之比率，較佳為約20%以上、約40%以下之比率，更佳為約25%以上、約40%以下之比率，進一步更佳約30%以上，約40%以下之比率包含Ins+NKX-細胞。
再者，在本說明書中，胰島素產生細胞中的設定之細胞的比率，意指相對於胰島素產生細胞所含之全部細胞數目的比率。又，各細胞之比率，表示被分化誘導成類胰島細胞(亦即被移植至生體內)之胰島素產生細胞的值。
由於Ins+NKX-細胞多見於未成熟(分化階段之早期)胰島素產生細胞，表示Ins+NKX-細胞之比率越高，為越不成熟(分化階段之早期)的胰島素產生細胞。
胰島素產生細胞可進一步藉由選自以下之a.至f.的一個或複數個而賦予特徴：
a.MAFA基因或其蛋白質之表現量低，
b.Ki67陽性細胞之比率低，
c.升糖素陽性且胰島素陰性細胞之比率低，
d.顯示葡萄糖刺激性胰島素分泌回應，
e.嗜鉻細胞分泌素A陽性細胞之比率高，
f.鹼性磷酸酶陽性之多能性幹細胞的比率低。其中「複數」意指2、3、4、5或6。
a.MAFA基因或其基因產物之表現量低
本發明中的胰島素產生細胞，其特徵為MAFA基因或其蛋白質之表現量，比胰島中的MAFA基因或其蛋白質之表現量低。
「胰島」意指分化階段比胰島素產生細胞更進展的細胞，為包含成熟之胰β細胞，且藉由為成熟胰β細胞之標記的MAFA、UCN3、及IAPP之至少一個之表現而賦予特徴的細胞。胰島可使用從健康人單離者。
胰島素產生細胞與胰島間之MAFA基因或其蛋白質之表現量的比較，可使用該領域中周知之手法進行，例如，可藉由使用RT-PCR、微陣列、生物晶片、西方墨點法、ELISA、免疫染色、流式細胞術等手法檢測、定量的MAFA基因或其蛋白質之表現量，用內部標準基因或其蛋白質之表現量校正，得到相對值，然後比較此等相對值而進行。「內部標準基因」無特別限定，例如，可利用GAPDH(甘油醛-3-磷酸酯脫氫酶)(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、β-肌動蛋白、β 2-微球蛋白、HPRT 1(次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶1)(hypoxanthine phosphoribosyl transferase 1)等。
胰島素產生細胞中的MAFA基因或其蛋白質之表現量，為胰島中的MAFA基因或其蛋白質之表現量的約20%以下，較佳為約15%以下，更佳為約10%以下，進一步更佳為約5%以下，特佳為約1%以下。
由於MAFA基因或其蛋白質為成熟的胰β細胞之標記，本特徴表示本發明之胰島素產生細胞係在幾乎不包含或僅以低比率包含成熟胰β細胞之程度的分化階段。
b.Ki67陽性細胞之比率低
本發明中的胰島素產生細胞，其特徵為以小於3%之比率包含Ki67陽性細胞。
「Ki67陽性細胞」意指混雜在從多能性幹細胞分化誘導之胰島素產生細胞中，藉由為標記之Ki67之表現而賦予特徴的增殖性高之細胞。「Ki67」周知係作為細胞周期關連核蛋白質，由於已知其於增殖中細胞的G1期、S期、G2期、M期可見到表現，而在為休止增殖之G0期未見到表現，故其亦作為細胞增殖及細胞周期之標記。
以下，在本說明書中有時將「Ki67陽性」記載為「Ki67+」。又，有時將「Ki67陽性細胞」記載為「Ki67+細胞」。
胰島素產生細胞中的Ki67+細胞之比率，為未達約3%，較佳為未達約1%，更佳為未達約0.8%，進一步更佳為未達約0.5%。
本特徴表示在胰島素產生細胞中，幾乎無Ki67+細胞之混入、殘存，或為低比率。Ki67+細胞，由於其增殖性高，有對最後所得到之類生體組織結構體造成不良影響或影響存活之虞，因此其之混入、殘存有時不佳。
c.升糖素陽性且胰島素陰性細胞之比率低
本發明中的胰島素產生細胞，其特徵為以未達3%之比率包含升糖素陽性且胰島素陰性(Ins-)細胞。以下，在本說明書中有將「升糖素陽性」記載為「Gcg+」的情況。又，有將「升糖素陽性且胰島素陰性細胞」記載為「Gcg+Ins-細胞」的情況。
胰島素產生細胞中的Gcg+Ins-細胞之比率，為約2.5%以下，較佳為約2%以下，更佳為約1%以下，進一步更佳為約0.5%以下。
Gcg+Ins-由於為成熟的胰α細胞之標記，本特徴表示本發明之胰島素產生細胞為幾乎不包含或僅以低比率包含成熟胰α細胞之程度的分化階段。
d.顯示葡萄糖刺激性胰島素分泌回應
本發明中的胰島素產生細胞，顯示葡萄糖刺激性胰島素分泌(GSIS：Glucose Stimulated Insulin Secretion)回應。
胰島素產生細胞中的GSIS回應，可依照先前周知之手法(例如，美國申請案第11/773,944號)為基準進行，例如，可藉由測定分泌於培養基中的C-肽之量而評價。C-肽，為在前胰島素(proinsulin)之成熟化期間，以與胰島素等莫耳之量產生的分解產物。測定C-肽之量，例如，可藉由使用抗C-肽單株抗體的ELISA進行。
e.嗜鉻細胞分泌素A(chromogranin)陽性細胞之比率高
本發明中的胰島素產生細胞，其特徵為以超過約45%之比率包含嗜鉻細胞分泌素A陽性細胞。
以下，在本說明書中有將「嗜鉻細胞分泌素A陽性」記載為「Chga+」的情況。又，有將「嗜鉻細胞分泌素A陽性細胞」記載為「Chga+細胞」的情況。
胰島素產生細胞中的Chga+細胞之比率，較佳可為約50%以上(例如，約55%以上)，更佳為約60%以上，進一步更佳約70%以上，再進一步更佳約80%以上，特佳為約90%以上。胰島素產生細胞中的Chga+細胞之比率的上限無特別限定，然而例如可為約99%以下。
在Chga+細胞中包含分泌胰島素等荷爾蒙之細胞(內分泌細胞)，此亦包含上述Ins+NKX+細胞或Ins+NKX-細胞。因此，本特徴顯示本發明之胰島素產生細胞以高比率包含內分泌細胞。
f.鹼性磷酸酶陽性之多能性幹細胞的比率低
本發明中的胰島素產生細胞，其特徵為以未達約0.01%之比率包含鹼性磷酸酶陽性之多能性幹細胞。
胰島素產生細胞中的鹼性磷酸酶陽性之多能性幹細胞的比率，較佳可為約0.008%以下，更佳為約0.005%以下，進一步更佳為約0.001%以下。
由於鹼性磷酸酶為顯示多能性幹細胞之未分化狀態的標記，本特徴顯示本發明之胰島素產生細胞幾乎不含，或僅以低比率包含未被分化誘導之目的以外的多能性幹細胞。
鹼性磷酸酶陽性之多能性幹細胞，可進一步表現顯示多能性的其他標記。就顯示多能性幹細胞之多能性的其他標記而言，可利用選自NANOG、SOX2、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81等中的至少一個。
從多能性幹細胞向胚體內胚葉細胞、原腸管細胞、後方前腸細胞、胰前驅細胞、內分泌前驅細胞、及胰島素產生細胞之分化誘導，可利用以下之分化誘導步驟進行：
步驟1)從多能性幹細胞分化誘導成胚體內胚葉細胞；
步驟2)從胚體內胚葉細胞分化誘導成原腸管細胞；
步驟3)從原腸管細胞分化誘導成後方前腸細胞；
步驟4)從後方前腸細胞分化誘導成胰前驅細胞；
步驟5)從胰前驅細胞分化誘導成內分泌前驅細胞；
步驟6)從內分泌前驅細胞分化誘導成胰島素產生細胞。
以下，說明各步驟，然而分化誘導成各細胞的手法不限定於此等手法。
步驟1)分化成胚體內胚葉細胞
多能性幹細胞係在包含低用量之激活素A(activin A)的培養基中培養，分化成胚體內胚葉細胞。
就本步驟中所用的培養基而言，可使用RPMI培養基、MEM培養基、iMEM培養基、DMEM(杜爾貝柯改良伊格爾培養基)培養基、改良的MEM鋅選擇培養基(Improved MEM Zinc Option Medium)、改良的MEM/1%B-27補充劑/青黴素-鏈黴素培養基、MCDB131/10mM葡萄糖/20mM葡萄糖/NaHCO3/FAF-BSA/ITS-X/Glutamax/抗壞血酸/青黴素-鏈黴素培養基等使用於哺乳類細胞之培養的基本培養基。
激活素A能以低用量，例如，5至10ng/mL之量，包含於培養基中。
就其他態樣而言，激活素A於培養基中之濃度，為約0.1至100ng/ml，較佳為約1至50ng/ml，更佳為約3至10ng/ml。
培養基中可進一步添加ROCK阻礙劑、GSK3 β阻礙劑。
GSK3 β阻礙劑於培養基中之濃度，可隨所用的GSK3 β阻礙劑之種類而適宜設定，例如就GSK3 β阻礙劑而言，在使用CHIR99021之情況的濃度，通常為2至5μM，較佳為2至4μM，特佳為約3μM。
ROCK阻礙劑於培養基中之濃度，雖可隨所用的ROCK阻礙劑之種類而適宜設定，然而例如就ROCK阻礙劑而言，在使用Y27632之情況的濃度，通常為5至20μM，較佳為5至15μM，特佳為約10μM。
培養基中可進一步添加胰島素。胰島素可以0.01至20μM，較佳0.1至10μM，更佳0.5至5μM之量包含於培養基中。培養基中之胰島素的濃度，亦可為添加之B-27補充劑中所含之胰島素的濃度，然而不以此為限。
培養可藉由2次元培養及3次元培養之任一者進行。培養開始時之細胞數無特別限定，然而若為2次元培養，可調成約5萬至100萬個細胞/cm2，較佳為約10萬至80萬個細胞/cm2，更佳為約10至30萬個細胞/cm2。又，培養開始時之細胞數無特別限定，若為3次元培養，可調成約1萬至100萬個細胞/mL，較佳為約10萬至80萬個細胞/mL，更佳為約30萬至60萬個細胞/mL。培養期間為1日至4日，較佳為1日至3日，特佳為3日。
培養溫度，無特別限定，可於30至40℃(例如，37℃)進行。 又，培養容器中之二氧化碳濃度為例如約5%。
或者，在本發明之胚體內胚葉細胞，可藉由在低用量之激活素A存在下，將多能性幹細胞於胰島素作用之條件下的培養基中進行第1次培養，繼而，於無胰島素作用之條件下的培養基中進行第2次培養而製造。
(1)第1次培養
「胰島素作用之條件」意指藉由胰島素於細胞發生胰島素信號傳達途徑活化的條件。通常，胰島素與細胞膜表面上存在之胰島素受體結合，使受體固有的酪胺酸激酶活化，而將胰島素受體基質蛋白家族(IRS：IRS-1、2、3)酪胺酸磷酸化。在本說明書中，將藉由胰島素與胰島素受體之結合而啟動此等一連串反應之發生，稱為「發生胰島素信號傳達途徑之活化」。
就胰島素作用之條件而言，例如，可列舉培養基中包含胰島素的情況。胰島素只要能將多能性幹細胞中之胰島素信號傳達途徑活化者即可，可為藉由重組法製造者，亦可為藉由固相合成法合成而製造者。胰島素雖可利用源自人類、非人類靈長類、豬、牛、馬、綿羊、山羊、駱馬、狗、貓、兔、小鼠、天竺鼠等者，然而較佳為人類胰島素。
在本發明中，只要能使多能性幹細胞中的胰島素信號傳達途徑活化，亦可使用胰島素變異體、胰島素衍生物或胰島素促效劑作為「胰島素」。「胰島素變異體」可列舉由胰島素之胺基酸序列中，1至20個，較佳1至10個，進一步更佳1至5個胺基酸被刪除、置換、附加或插入而成之胺基酸序列構成，且可發生胰島素信號傳達途徑之活化的多肽，或由與胰島素之胺基酸序列具有80%以上，更佳90%以上，進一步更佳95%以上，最佳99%以上之序列相同性的胺基酸序列構成，且可發生胰島素信號傳達途徑之活化的多肽者。胺基酸序列之比較可藉由周知之手法進行，例如，使用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information(美國國立生物學資料中心之基本原位比對檢索工具))等，例如以預設值之設定而實施。「胰島素衍生物」意指由胰島素或胰島素變異體之胺基酸殘基的一部分基以化學方式置換(例如，α- 甲基化、α-羥基化)、刪除(例如，脫胺基化)、或修飾(例如，N-甲基化)而成之胺基酸序列構成，且具有可發生胰島素信號傳達途徑之活化的多肽或具有同樣作用的物質。「胰島素促效劑」意指與胰島素之結構無關，但可與胰島素受體結合，發生胰島素信號傳達途徑之活化的多肽或具有同樣作用的物質。
第1次培養之培養基中，能以0.01至20μM，較佳0.1至10μM，更佳0.5至5μM之量，包含胰島素。培養基中之胰島素之濃度，可為添加之B-27補充劑中所含的胰島素之濃度，然而不以此為限。
培養基中可進一步包含ROCK阻礙劑、及/或GSK3 β阻礙劑。ROCK阻礙劑之培養基中的濃度，可依據所用的ROCK阻礙劑之種類而適宜設定，然而例如使用Y-27632作為ROCK阻礙劑之情況的濃度，通常可調成5至20μM，較佳5至15μM，特佳約10μM。GSK3 β阻礙劑之培養基中的濃度，可依據所用的GSK3 β阻礙劑之種類而適宜設定，例如使用CHIR99021作為GSK3 β阻礙劑之情況的濃度，通常可調成2至5μM，較佳2至4μM，特佳約3μM。
培養基中可進一步包含選自丙酮酸鹽(鈉鹽等)、L-丙胺醯基L-麩醯胺酸、及葡萄糖構成之群組中的一種以上。丙酮酸鹽能以10至1000mg/L，較佳30至500mg/L，更佳50至200mg/L，特佳約110mg/L之量包含於培養基中。L-丙胺醯基L-麩醯胺酸，能以50至2000mg/L，較佳100至1500mg/L，更佳500至1000mg/L，特佳約860mg/L之量包含於培養基中。葡萄糖能以15mM以上，較佳15至30mM，更佳15至25，特佳約25mM之量包含於培養基中。培養基中之丙酮酸鹽、L-丙胺醯基L- 麩醯胺酸及葡萄糖之濃度，只要為DMEM培養基(DMEM、高葡萄糖、GlutaMAXTM、丙酮酸鹽(Thermo Fisher Scientific))或其他DMEM培養基中所含的丙酮酸鹽、L-丙胺醯基L-麩醯胺酸及葡萄糖之濃度即可，但不以此為限定。
培養基可使用以上述基本培養基作為基礎，並添加一種或一種以上之上述成分者。就基本培養基而言，較佳為DMEM培養基，更佳為以上述之量包含丙酮酸鹽、L-丙胺醯基L-麩醯胺酸、及葡萄糖的DMEM培養基。
第1次培養之培養期間可為選自6小時至48小時，較佳為12至24小時的範圍。培養溫度無特別限定，可於30至40℃(例如，37℃)進行。又，培養容器中之二氧化碳濃度為例如約5%。培養以2次元培養及3次元培養之任一者進行即可。培養開始時之細胞數，無特別限定，若為2次元培養，可調成約5萬至100萬個細胞/cm2，較佳約10萬至80萬個細胞/cm2，更佳約10至30萬個細胞/cm2。又，培養開始時之細胞數，無特別限定，若為3次元培養，可調成約1萬至100萬個細胞/mL，較佳約10萬至80萬個細胞/mL，更佳約30萬至60萬個細胞/mL。
(2)第2次培養
「無胰島素作用之條件」意指無法藉由胰島素而於細胞中發生胰島素信號傳達途徑之活化的條件。「未於細胞發生胰島素信號傳達途徑之活化」不僅意指完全未發生該胰島素信號傳達途徑的活化，亦意指只發生與胰島素不存在下該胰島素信號傳達途徑的活化相比，未見到有顯著差異程度之輕微活化。因此，「無胰島素作用之條件」，例如，可列舉「在培養基中不 含胰島素，或者即使在培養基中包含胰島素之情況，其僅以發生未見前述有顯著差異之程度的輕微活化之量被包含」的條件。或者，亦意指即使在培養基中包含胰島素之情況，藉由同時包含胰島素信號阻礙劑，而未發生前述胰島素信號傳達途徑之活化。「胰島素信號阻礙劑」意指可於任一位置遮斷胰島素信號傳達途徑的成分。就此種胰島素信號阻礙劑而言，可列舉與胰島素、胰島素受體、作為信號傳達物質而作用的各種蛋白質等結合或競爭，因而阻礙此等因子所參與之分子間相互作用的多肽或化合物等。例如，就此種胰島素信號阻礙劑而言，可列舉競爭阻礙ATP與PI3激酶之觸媒亞單元結合的LY294002[2-(4-嗎啉基)-8-苯基-4H-1-苯并哌喃-4-酮]等。胰島素信號阻礙劑不限於此等，亦可使用下列者作為胰島素信號阻礙劑：與胰島素、胰島素受體、作為信號傳達物質而作用之各種蛋白質結合的抗體，或彼等之顯性負效(dominant negative)型變異體；以及針對胰島素受體或作為信號傳達物質而作用之各種蛋白質的mRNA的反義寡核苷酸，或siRNA等。胰島素信號阻礙劑可從商業上取得，亦可依照周知之方法合成。
培養基中可進一步包含ROCK阻礙劑、及/或GSK3 β阻礙劑。培養基中之ROCK阻礙劑、及/或GSK3 β阻礙劑之量，可選自上述第1次培養中所記載的範圍，可為與第1次培養中所用者相同之量，亦可為相異者。
培養基中可進一步包含選自丙酮酸鹽、L-丙胺醯基L-麩醯胺酸、及葡萄糖所構成之群組中的一種以上。培養基中之丙酮酸鹽、L-丙 胺醯基L-麩醯胺酸、及葡萄糖之量，可選自上述第1次培養中所記載的範圍，可為與第1次培養中所用者相同之量，亦可為相異者。
第2次培養中所用的培養基，可使用以哺乳類細胞之培養中所使用的基本培養基作為基礎，並添加上述成分之一種或一種以上者。就基本培養基而言，可使用上述第1次培養中所記載者，可為與第1次培養中所用者相同的基本培養基，亦可為相異者。較佳為DMEM培養基，更佳為以上述之量包含丙酮酸鹽、L-丙胺醯基L-麩醯胺酸、及葡萄糖的DMEM培養基。
第2次培養之培養期間，可為選自至少6小時，較佳為6至72小時、進一步更佳24小時至72小時之範圍。培養溫度無特別限定，可於30至40℃(例如，37℃)進行。培養可藉由2次元培養及3次元培養之任一者進行。又，培養容器中之二氧化碳濃度為例如約5%。
第1次培養及第2次培養之培養基中，可以上述低用量包含激活素A。第1次培養及第2次培養之培養基中所含的激活素A之量，可為相同之量，亦可相異。
第1次培養及第2次培養之培養基中，亦可進一步添加二甲基亞碸。
藉由將多能性幹細胞於低用量之激活素A存在下進行培養，或者藉由將多能性幹細胞於低用量之激活素A存在下，在胰島素作用的條件下之培養基中進行第1次培養，繼而在無胰島素作用的條件下之培養基中進行第2次培養，可在步驟6)以下，提高所得到的內分泌細胞之比率。
步驟2)分化成原腸管細胞
將步驟1)所得到之胚體內胚葉細胞，進一步在包含增殖因子的培養基中培養，可分化誘導成為原腸管細胞。培養期間為2日至8日，較佳為約4日。
培養溫度無特別限定，可於30至40℃(例如，37℃)進行。又，培養容器中之二氧化碳濃度，為例如約5%。培養可藉由2次元培養及3次元培養之任一者進行。
培養基可使用上述步驟1)中所記載的哺乳類細胞之培養中所用的基本培養基。培養基中，除增殖因子之外，亦可適宜添加血清代替物、維生素、抗生素等。
就增殖因子而言，以EGF、KGF、FGF10為較佳，以EGF及/或KGF為更佳，以KGF為進一步更佳。
增殖因子之培養基中的濃度，依據所用的增殖因子之種類而適宜設定，然而通常為約0.1nM至1000μM，較佳為約0.1nM至100μM。在EGF之情況，其濃度為約5至2000ng/ml(亦即，約0.8至320nM)，較佳為約5至1000ng/ml(亦即，約0.8至160nM)，更佳為約10至1000ng/ml(亦即，約1.6至160nM)。在FGF10之情況，其濃度為約5至2000ng/ml(亦即，約0.3至116nM)，較佳為約10至1000ng/ml(亦即，約0.6至58nM)，更佳為約10至1000ng/ml(亦即，約0.6至58nM)。例如在使用KGF作為增殖因子的情況之濃度，通常為5至150ng/mL，較佳為30至100ng/mL，特佳為約50ng/mL。
步驟3)分化成後方前腸細胞
將步驟2)中所得到之原腸管細胞進一步於包含增殖因子、環巴胺(cyclopamine)、頭蛋白(noggin)等的培養基中培養，分化誘導成為後方前腸細胞。培養期間為1日至5日，較佳為約2日。培養可藉由2次元培養及3次元培養之任一者進行。
培養溫度無特別限定，可於30至40℃(例如，37℃)進行。又，培養容器中之二氧化碳濃度為例如約5%。
培養基可使用上述步驟1)中所記載的哺乳類細胞之培養中所用的基本培養基。培養基中，除增殖因子之外，亦可適宜添加血清代替物、維生素、抗生素等。
就增殖因子而言，以EGF、KGF、FGF10為較佳，以EGF及/或KGF為更佳，以KGF為進一步更佳。
增殖因子之培養基中的濃度，雖可隨所用的增殖因子之種類而適宜設定，然而通常為約0.1nM至1000μM，較佳為約0.1nM至100μM。在EGF之情況，其濃度為約5至2000ng/ml(亦即，約0.8至320nM)，較佳為約5至1000ng/ml(亦即，約0.8至160nM)，更佳為約10至1000ng/ml(亦即，約1.6至160nM)。在FGF10之情況，其濃度為約5至2000ng/ml(亦即，約0.3至116nM)，較佳為約10至1000ng/ml(亦即，約0.6至58nM)，更佳為約10至1000ng/ml(亦即，約0.6至58nM)。例如在使用KGF作為增殖因子的情況之濃度，通常為5至150ng/mL，較佳為30至100ng/mL，特佳為約50ng/mL。
環巴胺於培養基中之濃度，無特別限定，而通常為0.5至1.5μM，較佳為0.3至1.0μM，特佳為約0.5μM。
頭蛋白(noggin)於培養基中之濃度，無特別限定，而通常為10至200ng/mL，較佳為50至150ng/mL，特佳為約100ng/mL。
又，培養基亦可添加二甲基亞碸。
步驟4)分化成胰前驅細胞
將步驟3)中所得到之後方前腸細胞進一步於包含具有CDK8/19阻礙活性之因子的培養基，較佳為包含具有CDK8/19阻礙活性之因子及增殖因子的培養基中培養，可分化誘導成胰前驅細胞。培養期間為2日至10日，較佳為約5日。培養可藉由2次元培養及3次元培養之任一者進行。在2次元培養之情況，將步驟3)所得到之後方前腸細胞，依照先前報導(Toyoda et al.,Stem cell Research(2015)14,185-197)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA處理後，藉由吸液(pipetting)分散，將0.25%胰蛋白酶-EDTA離心並懸浮後，再播種於步驟4)之新培養基。
培養基與步驟1)同樣地，可使用哺乳類細胞之培養中所用的基本培養基。培養基中，除增殖因子之外，亦可適宜添加血清代替物、維生素、抗生素等。
就具有CDK8/19阻礙活性之因子而言，可使用前述的各種化合物或其鹽，根據所用之化合物或其鹽，適宜決定對培養基之添加量，然而通常為約0.00001μM-5μM，較佳為0.00001μM-1μM。就具有CDK8/19阻礙活性之因子於培養基中的濃度而言，以對於CDK8/19達到50%以上之阻礙活性的濃度為較佳。
就增殖因子而言，以EGF、KGF、FGF10為較佳，以KGF及/或EGF為更佳，以KGF及EGF為進一步更佳。
增殖因子之培養基中之濃度，可隨所用的增殖因子之種類而適宜設定，然而通常為約0.1nM至1000μM，較佳為約0.1nM至100μM。在EGF之情況，其濃度為約5至2000ng/ml(亦即，約0.8至320nM)，較佳為約5至1000ng/ml(亦即，約0.8至160nM)，更佳為約10至1000ng/ml(亦即，約1.6至160nM)。在FGF10之情況，其濃度為約5至2000ng/ml(亦即，約0.3至116nM)，較佳為約10至1000ng/ml(亦即，約0.6至58nM)，更佳為約10至1000ng/ml(亦即，約0.6至58nM)。例如在使用KGF及EGF作為增殖因子之情況的濃度，EGF通常為5至150ng/mL，較佳為30至100ng/mL，特佳為約50ng/mL，KGF通常為10至200ng/mL，較佳為50至150ng/mL，特佳為約100ng/mL。
步驟4)中的培養之最初1日，係在ROCK阻礙劑存在下進行，然後則可在不含ROCK阻礙劑的培養基中培養。
又，培養基中亦可包含PKC活化劑。就PKC活化劑而言，可使用PdBU(PKC activator II)、TPB(PKC activator V)等，然而不以其為限。PKC活化劑之濃度係以約0.1至100ng/ml，較佳約1至50ng/ml，更佳約3至10ng/ml之量添加。
又，培養基中亦可添加二甲基亞碸、激活素(1至50ng/ml)。
在任一個步驟中，於培養基內，除上述成分之外，均可添加血清代替物(例如，B-27補充劑、ITS-G)。又，視需要亦可添加胺基酸、L-麩醯胺酸、GlutaMAX(製品名)、非必需胺基酸、維生素、煙醯胺、抗生素(例如，抗生素-抗真菌素(Antibiotic-Antimycotic)(本說明書中，有時稱為AA)、青黴素、鏈黴素、或此等之混合物)、抗菌劑(例如，兩性黴素B (amphotericin B))、抗氧化劑、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類等。在培養基中添加抗生素的情況，該培養基中之濃度通常為0.01至20重量%，較佳為0.1至10重量%。
培養可藉由2次元培養及3次元培養之任一者進行。培養溫度無特別限定，可於30至40℃(例如，37℃)進行。又，培養容器中之二氧化碳濃度為例如約5%。
步驟5)分化成內分泌前驅細胞
將步驟4)中所得到之胰前驅細胞進一步於包含增殖因子的培養基中培養，分化誘導成為內分泌前驅細胞。培養可藉由2次元培養及3次元培養之任一者進行。在2次元培養之情況中，將步驟4)中所得到之胰前驅細胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA處理後，藉由吸液(pipetting)分散，將0.25%胰蛋白酶-EDTA離心並懸浮後，於步驟5)之新培養基中再播種。培養期間為2日至3日，較佳為約2日。
培養基可使用上述步驟1)中所記載的哺乳類細胞之培養所用的基本培養基。在培養基中，依照先前報導(Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133)，添加SANT1、視黃酸(retinoic acid)、ALK5抑制劑II、T3、LDN，進一步可適宜地添加Wnt阻礙藥、ROCK阻礙劑、FGF(較佳為FGF2)、血清代替物、維生素、抗生素等。又，培養基中亦可添加二甲基亞碸。
培養係在不使用餵養細胞下，藉由非貼附培養進行。培養時，可使用培養皿、燒瓶、微培養盤、多孔培養盤(Nunc公司)等或生物反應器。培養容器以經過用於降低與細胞之貼附性的表面處理為較佳。
培養溫度無特別限定，於30至40℃(例如，37℃)進行。又，培養容器中之二氧化碳濃度為例如約5%。
步驟6)分化成胰島素產生細胞
將步驟5)中所得到之內分泌前驅細胞進一步於包含FGFR1阻礙劑的培養基中培養，分化誘導成為胰島素產生細胞。培養期間為10日至30日，較佳為約10至20日。
培養基可使用上述步驟1)中所記載之哺乳類細胞之培養所用的基本培養基。培養基中依照已知之報導(Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133)，添加ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶阻礙劑XX、γ-分泌酶阻礙劑RO、N-半胱胺酸、AXL抑制劑、抗壞血酸，亦可進一步適宜添加Wnt阻礙藥、ROCK阻礙劑、FGF(較佳為FGF2)、血清代替物、維生素、抗生素等。例如，培養基中可添加ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶阻礙劑RO、及抗壞血酸，或者可添加T3、ALK5抑制劑II、ZnSO4、肝素、N-乙醯基半胱胺酸、Trolox、及R428。
培養可藉由2次元培養及3次元培養之任一者進行。較佳之培養係在不使用餵養細胞下，藉由非貼附培養進行。培養時，可使用培養皿、燒瓶、微培養盤、多孔培養盤(Nunc公司)等或生物反應器。培養容器以經過用於降低與細胞之貼附性的表面處理為較佳。
培養溫度無特別限定，可於30至40℃(例如，37℃)進行。又，培養容器中之二氧化碳濃度為例如約5%。
培養基中，可藉由能阻礙FGFR1活性之任何量，包含FGFR1阻礙劑，例如，可藉由10μM以下，或5μM以下之量，較佳為藉 由未達5μM、未達4μM、未達3μM、未達2μM之量，包含FGFR1阻礙劑。FGFR1阻礙劑之添加量的下限無特別限定，然而可調成0.1μM以上，較佳為0.5μM以上。FGFR1阻礙劑之添加量，較佳為未達5μM且0.1μM以上，更佳為未達5μM且0.5μM以上。FGFR1阻礙劑存在下的培養，可於至少12小時，較佳24小時以上、2日以上、4日以上、8日以上、10日以上、或15日以上進行。FGFR1阻礙劑存在下的培養，以進行4日以上為較佳。例如，步驟6)之最後約4至15日，較佳最後約4至7日，可進行FGFR1阻礙劑存在下的培養。在藉由FGFR1阻礙劑處理期間中，亦可進行培養基之交換，可依照培養進度，與添加有FGFR1阻礙劑且具有與交換前相同組成的培養基或具有與交換前相異組成的培養基進行交換。
在包含FGFR1阻礙劑之培養基中，藉由培養細胞，可抑制所得到之胰島素產生細胞中Ki67陽性細胞之增殖。
步驟6)中所得到之胰島素產生細胞，可使用胰蛋白酶等酵素解離而回收。所回收的胰島素產生細胞，可凍結保存至使用為止。繼而，將回收之胰島素產生細胞於上述培養基中，以每1培養器或每1孔約50萬至500萬個，較佳約100萬至400萬個，更佳約200萬至300萬個之量播種，進行3次元培養，可得到為球體型態的胰島素產生細胞。各球體係由約100至約1000個，較佳約200至約800個，更佳約300個至約500個的細胞構成。
2-2. 生物相容性材料
在本說明書中「生物相容性材料」意指在移植至生體內，短期或長期留置的情況，不會誘導顯著之免疫回應或有害之生體反應(例如，毒性反應、 凝血等)的任何材料。較佳而言，「生物相容性材料」為移植後，促進宿主之血管新生、結締組織之產生者。又，「生物相容性材料」以生物分解性材料為較佳。就此種材料而言，可列舉聚乳酸(PLA)、聚己內酯(PCL)、聚胺基甲酸酯(PU)、聚乙二醇(PEG)、聚甲基丙烯酸羥基乙酯、聚甘醇酸(PGA)、聚乳酸-共-甘醇酸(PLGA)、聚(3-羥基丁酸酯-共-羥基戊酸酯)(PHBV)、聚(乙烯-共-醋酸乙烯酯)(PEVA)、聚丙烯醯胺、聚環氧乙烷、聚伸乙基胺、聚羥基酪酸、聚(N-乙烯基吡咯啶酮)、聚乙烯醇、聚富馬酸丙二醇酯、聚丙烯酸、聚e-己內酯、聚甲基丙烯酸、聚偏二氟乙烯(PVDF)、果酸、透明質酸、肝素硫酸、軟骨素硫酸、硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)蛋白多糖、肝素、甲殼素、殼聚糖、黃原膠、羧基甲基纖維素、羧基甲基殼聚糖、海藻酸、海藻酸酯、膠原蛋白、纖維素、絲素蛋白、角蛋白、明膠、纖維蛋白、普魯蘭多糖、層黏連蛋白、結冷膠、聚矽氧、胺基甲酸酯、彈性蛋白等及彼等之修飾體、以及彼等之組合。「生物相容性材料」之表面，可視需要施行能進行細胞之接著的表面修飾(例如，藉由細胞接著用基質(膠原蛋白、明膠、聚-L-離胺酸、聚-D-離胺酸、層黏連蛋白、纖連蛋白、基底膠(matrigel)、玻連蛋白等)之塗覆)，或藉由已知控制細胞之增殖、分化或功能之官能基(例如，胺基、羧基、羥基、甲基丙烯酸基、丙烯酸基等)的改變。「生物相容性材料」可具有塊狀、珠粒狀、顆粒狀、球狀、片狀、凝膠狀等任何型態，可形成中實性或多孔性。就「生物相容性材料」之形狀而言，以立體形狀為較佳，例如，可為球體、四面體、六面體等多面體；圓柱、角柱、圓錐、截圓錐體、角錐、截角錐體、環面體、圓盤體、橢圓體或彼等之變形立體等，只要細胞能分散於生物相容性材料內的形狀即可。 「生物相容性材料」只要能進行生體內之移植及留置的大小即可，例如，邊之長度最長(若為圓形則為直徑)可調成約0.1至3.0cm，較佳為約0.5至2.0cm，厚度為約0.1至2.0cm，較佳為約0.3至1.5cm。生物相容性材料中所含的細胞成為約50萬個至500萬個，較佳為約100萬個至300萬個。
就其他態樣而言，例如，「生物相容性材料」之大小，可將邊之長度最長時(若為圓形則其直徑)調至約1至30cm，較佳為約1至15cm，更佳為約2至10cm。
「生物相容性材料」可進行複數移植及留置。
在本發明中，較佳之「生物相容性材料」為凝膠(水凝膠)狀。生物相容性材料之凝膠化，可根據各生物相容性材料，依照周知之手段進行，例如，藉由在生物相容性材料之水溶液中添加交聯劑(例如，鈣離子、鎂離子、鍶離子、鋇離子等金屬陽離子或其鹽型態)，或者藉由在水中使纖維蛋白原(fibrinogen)及凝血酶(thrombin)作用而進行。在本發明中，特佳之「生物相容性材料」為纖維蛋白凝膠。凝膠可在適當溶劑(例如，水、生理食鹽水、培養基等)中，以約0.01至10重量%之任何量包含於生物相容性材料中。
在本發明中，源自多能性幹細胞之細胞係分散配置於生物相容性材料中。「分散配置」意指不使源自多能性幹細胞之細胞局限於任一部位，而廣泛地分布配置於生物相容性材料中。例如，在源自多能性幹細胞之細胞具有球體之型態的情況，意指鄰接之球體夾在生物相容性材料之間而存在。例如，在源自多能性幹細胞之細胞具有球體之型態的情況，意指鄰接之球體被配置成具有約1μm以上，較佳約5μm以上之間隔。
就其他態樣而言，「分散配置」，意指在源自多能性幹細胞之細胞具有球體之型態的情況，生物相容性材料中之球體的一定比率以上(30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上)以互相不接觸的方式配置，較佳為生物相容性材料中之球體的95%以上以互相不接觸的方式配置。
就其他態樣而言，「分散配置」意指在源自多能性幹細胞之細胞具有球體之型態的情況，生物相容性材料中，一定比率以上(30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上)之球體為直徑50至500μm的球體(意指不互相接觸成大球體)，以生物相容性材料中95%以上的球體係直徑50至500μm的球體為較佳。
就其他態樣而言，「分散配置」意指在源自多能性幹細胞之細胞具有球體之型態的情況，生物相容性材料中球體以圓點狀(pin dot)三次元方式配置。「以圓點狀(pin dot)三次元方式配置」，意指不僅各球體與周圍之球體拉開間隔，三次元地存在，亦有與周圍之球體接觸而存在的情況。各球體可分別為相同大小，亦可為不同大小。其中「分散配置」非意指各球體配置於生物相容性材料中後，藉由凝集、融合而形成大球體。
「分散配置」可藉由任何手段而達成，可藉由將源自多能性幹細胞之細胞液充分地攪拌混合，播種於生物相容性材料中，以及/或者，藉由調整播種於生物相容性材料中之源自多能性幹細胞之細胞的濃度，以及/或者，藉由將源自多能性幹細胞之細胞添加在生物相容性材料之溶液並充分地攪拌混合而進行。例如，在生物相容性材料為凝膠狀之情況，藉由在凝膠化前之生物相容性材料的溶液中，將源自多能性幹細胞之細胞，以 每50至200μL，成為100至600萬個細胞，較佳為200至500萬個細胞之量的條件混合、攪拌，於細胞沉降前進行凝膠化，可使源自多能性幹細胞之細胞分散配置於生物相容性材料中。
就其他態樣而言，例如，在生物相容性材料為凝膠狀的情況，可藉由在凝膠化前之生物相容性材料的溶液，將源自多能性幹細胞之細胞，以每15至50mL，成為1×107至1×1010個細胞，較佳為3×108至1×109個細胞之量的條件混合、攪拌，並在細胞沉降前進行凝膠化，可使源自多能性幹細胞之細胞分散配置於生物相容性材料中。
3.類生體組織結構體
在本說明書中「類生體組織結構體」意指具有與表皮、神經、腦、脊髓、食道、胃、小腸、大腸、膀胱、尿道、肺、甲狀腺、胰臟、肝臟、肌肉、骨骼、心臟、血管、脾臟、腎臟等(不以此等為限)之生體器官或組織同等或類似之功能的結構體。類生體組織結構體可藉由將源自多能性幹細胞之細胞分散配置於生物相容性材料中所形成的組成物移植並留置於動物生體內，使源自多能性幹細胞之細胞進行分化誘導而得到。
「動物」以哺乳動物為較佳，例如，可列舉人類、非人類靈長類、豬、牛、馬、綿羊、山羊、駱馬、狗、貓、兔、小鼠、天竺鼠等，然而較佳為人類。
移植以在可將前述組成物固定於一定位置的生體內區域進行為較佳，例如，可於動物之皮下、腹腔內、腹膜上皮、大網膜、脂肪組織、肌肉組織或胰臟、腎臟等各臟器的被膜下等進行。
移植後，組成物內之源自多能性幹細胞的細胞，在生體內環境中被分化誘導乃至分化、成熟，依據所用之「源自多能性幹細胞之細胞」，可得到具有與表皮、神經、腦、脊髓、食道、胃、小腸、大腸、膀胱、尿道、肺、甲狀腺、胰臟、肝臟、肌肉、骨骼、心臟、血管、脾臟、腎臟等(不以此等為限)之器官或組織同等或類似之功能的結構體。
所得到之類生體組織結構體，之後可回收，亦可原樣留置於生體內。
類生體組織結構體，可包含藉由源自多能性幹細胞之細胞分化誘導所得到之分化細胞構成的複數個簇、源自宿主動物之結締組織、以及源自宿主動物之血管。
藉由源自多能性幹細胞之細胞分化誘導所得到的分化細胞，形成複數個簇，分散存在於類生體組織結構體中。各簇具有直徑約10μm至1000μm，較佳約50μm至500μm，更佳約50μm至300μm之大小。以及/或者，各簇係由約100至約1000個，較佳約200至約800個，更佳約300個至約500個之細胞構成。類生體組織結構體中，簇可以約50個至2000個，較佳約100個至500個分散而存在，然而其數可隨分散配置於生物相容性材料中的源自多能性幹細胞的細胞數目而變化。「分散而存在」意指分化細胞之各簇不局限任一部位，而以廣泛分布在類生體組織結構體中之方式存在。又，「分散而存在」意指使鄰接之簇經由源自宿主動物之結締組織而存在。
「源自宿主動物之結締組織」意指源自移植有前述組成物之動物之細胞所產生的細胞外基質，包含彈性蛋白、小纖維蛋白(fibrillin)、 I型膠原蛋白、III型膠原蛋白等。源自宿主動物之結締組織中，分化細胞以圍繞複數個簇之周圍的方式存在，埋藏於類生體組織結構體中的各簇之間。
「源自宿主動物之血管」意指源自移植有前述組成物之動物之細胞所形成的類生體組織結構體外之與宿主動物之血管相連的血管。源自宿主動物之血管侵入類生體組織結構體中的各簇，使血液循環至各簇，進行氧或營養分等之供給，或舊廢物之排出。
就本發明之一實施型態而言，以源自多能性幹細胞之細胞言之，在使用從多能性幹細胞分化為胰β細胞的過程中出現之胚體內胚葉細胞、原腸管細胞、後方前腸細胞、胰前驅細胞、內分泌前驅細胞、或胰島素產生細胞，較佳為胰島素產生細胞的情況，於移植至生體內之前述組成物內，此等細胞被分化誘導而成熟，可得到包含具有與胰島同等或類似之功能之分化細胞(以下，記載為「類胰島細胞」)的類生體組織結構體。
在以此種方式所得到之類生體組織結構體中，類胰島細胞可藉由選自以下之(a)至(g)的一或複數個賦予特徴：
(a)表現MAFA、UCN3、及IAPP之至少一個標記，
(b)嗜鉻細胞分泌素A陽性細胞(Chga+細胞)之比率高，
(c)Ki67陽性細胞(Ki67+細胞)之比率低，
(d)升糖素陽性且胰島素陰性細胞(Gcg+Ins-細胞)之比率高，
(e)具有於低血糖回應的胰島素分泌作用，
(f)不含外分泌細胞，
(g)胰島素陽性且升糖素陰性細胞(Ins+Gcg-細胞)之比率高。
其中「複數」意指2、3、4、5、6或7。
(a)至(g)之特徴之有無，可於分化誘導胰島素產生細胞後(亦即，將前述之組成物移植至生體內後)，4週以後，較佳8週以後進行評價。又，類胰島細胞中的設定之細胞之比率，意指相對於源自移植片之細胞塊之全部細胞數目的比率。
(a)表現MAFA、UCN3、及IAPP之至少一個標記
在類胰島細胞中，包含胰β細胞。胰β細胞表現為成熟標記之MAFA、UCN3、及IAPP中的至少一個標記。又，胰β細胞亦可藉由葡萄糖刺激所造成之胰島素分泌上升反應而賦予特徴。
(b)Chga+細胞之比率高
類胰島細胞之特徵為以約50%以上之比率包含Chga+細胞。較佳類胰島細胞中的Chga+細胞之比率，為約60%以上，更佳為約70%以上，進一步更佳為約90%以上，特佳為約95%以上(例如，約97%以上、約98%以上)。
在Chga+細胞中，包含分泌胰島素或升糖素等荷爾蒙的細胞(內分泌細胞)，本特徴顯示類胰島細胞以高比率包含內分泌細胞。
(c)Ki67+細胞之比率低
類胰島細胞之特徵為以未達約3%之比率包含Ki67陽性細胞。較佳類胰島細胞中的Ki67陽性細胞之比率為未達約1%，更佳為未達約0.8%，進一步更佳為未達約0.5%。
本特徴顯示在類胰島細胞中、其混入、殘存不佳之情況係幾乎無Ki67+細胞，或非常低的比率。
(d)Gcg+Ins-細胞之比率高
類胰島細胞之特徵為以約10%以上之比率包含Gcg+Ins-細胞。較佳類胰島細胞中的Gcg+Ins-細胞之比率為約15%以上，更佳為約20%以上，進一步更佳為約25%以上。類胰島細胞中的Gcg+Ins-細胞之比率的上限無特別限定，例如，可為約50%以下，較佳為約45%以下，更佳為約40%以下。
由於Gcg+Ins-為成熟之胰α細胞的標記，類胰島細胞顯示以比胰島素產生細胞更高的比率包含成熟之胰α細胞。類胰島細胞顯示為比胰島素產生細胞更成熟的分化階段。
(e)具有對低血糖回應之胰島素分泌作用
類胰島細胞之特徵為具有於低血糖回應的胰島素分泌作用。「對低血糖回應之胰島素分泌作用」，意指從低血糖時1小時以內、2小時以內、3小時以內、4小時以內、或5小時以內，胰島素分泌量增加。「低血糖」意指血中或培養基中之葡萄糖濃度為約70mg/dL以下的情況。胰島素分泌量之測定，可藉由先前周知之任何手段進行，無特別限定，可藉由測定血中或培養基中之C-肽量而進行。
通常，在生體內若變成低血糖，則藉由升糖素等之分泌來促進血糖值之上升，同時拮抗升糖素而分泌胰島素，以控制血糖值位準。本發明之類胰島細胞，同樣地為可控制低血糖時之血糖值位準者，在回應低血糖，促進血糖值上升的同時，具有拮抗血糖值上升而分泌胰島素的作用。
(f)不含外分泌細胞
類胰島細胞之特徵為不含外分泌細胞。亦即，在動物生體內之胰島中，類胰島細胞通常不包含構成胰島之大部分(約95%)的外分泌細胞，外分泌 細胞即分泌包含澱粉酶或脂肪酶等消化酵素之胰液的細胞。術語「不含外分泌細胞」，不僅包含類胰島細胞中完全不含外分泌細胞的情況，亦可包含類胰島細胞中以5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、1%以下、或0.5%以下之低比率包含外分泌細胞的情況。
(g)Ins+Gcg-細胞之比率高
類胰島細胞之特徵為Ins+Gcg-細胞之比率高。較佳為類胰島細胞中的Ins+Gcg-細胞之比率為約20%以上，更佳為約30%以上，進一步更佳為約40%以上。類胰島細胞中Ins+Gcg-細胞之比率的上限無特別限定，例如，可為約80%以下，較佳為約70%以下，更佳為約60%以下。
由於Ins+Gcg-為成熟之胰β細胞的標記，顯示類胰島細胞以比胰島素產生細胞更高的比率包含成熟之胰β細胞。類胰島細胞顯示其係在比胰島素產生細胞更成熟的分化階段。
又，在類生體組織結構體包含類胰島細胞的情況，類胰島細胞可被配置成胰島素陽性細胞在內側，升糖素陽性細胞在外側的簇。
5.用途
依照本手法所得到的類生體組織結構體，根據所使用之「源自多能性幹細胞之細胞」，具有與表皮、神經、腦、脊髓、食道、胃、小腸、大腸、膀胱、尿道、肺、甲狀腺、胰臟、肝臟、肌肉、骨骼、心臟、血管、脾臟、腎臟等(不以此等為限)器官或組織同等或類似的功能，可利用於增強或維持此等器官或組織的功能，或者用於輔助或補充因疾病或障礙等原因而減低或消失的此等器官或組織的功能。
就本發明之一實施型態而言，在類生體組織結構體包含前述之類胰島細胞的情況，該類生體組織結構體藉由類胰島細胞所分泌的胰島素或升糖素之作用，可改善及/或維持患者中的血糖值(葡萄糖)位準，可將血糖值控制於正常值。
因此，該類生體組織結構體可使用於治療或預防必須改善及/或維持血糖值之位準的疾病、障礙、或症狀。就此種疾病、障礙、或症狀而言，可列舉糖尿病(1型糖尿病、2型糖尿病)、空腹時及食後葡萄糖濃度之變調、低血糖症(例如，糖尿病患者中的藉由胰島素投與之低血糖症)等，然而不以此等為限。再者，「治療」意指疾病、障礙、或症狀之治療、治癒、防止或寛解之改善，或、疾病、障礙、或症狀之進行速度的減低。又，「預防」意指使疾病、障礙、或症狀之發病的可能性、危險性降低，或使疾病、障礙、或症狀之發病延遲。
患者為哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、倉鼠、兔、貓、狗、牛、綿羊、猴、人類)，較佳為人類。
以下，藉由實施例說明本發明，然而本發明不受此等實施例所限定。
[實施例]
實施例1：胰島素產生細胞之製作、移植、功能及型態評價(STZ-Nod-scid小鼠)
1.方法
(1)胰島素產生細胞之製作
從Ff-I14s04 iPS細胞株分化誘導成胰島素產生細胞，係依照上述步驟1)至6)或已報導者(Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133)，藉由使用生物反應器的3次元培養法而實施。
亦即，將iPS細胞於胰島素作用之條件下，在包含分化誘導因子(GSK3 β阻礙劑、ROCK阻礙劑及低用量之激活素A)的培養基(DMEM/1%B27/青黴素-鏈黴素/二甲基亞碸)中，進行第1次培養，繼而，在無胰島素作用的條件下，於包含分化誘導因子(低用量之激活素A)之培養基(DMEM/1%B27/青黴素-鏈黴素/二甲基亞碸)中，進行第2次培養，得到胚體內胚葉細胞。
將從該胚體內胚葉細胞分化誘導所得到的內分泌前驅細胞集團，於包含分化誘導因子(ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶阻礙劑RO、抗壞血酸)及FGF受體1阻礙劑(PD-166866)的培養基(改良之MEM/1%B27/青黴素-鏈黴素)中培養8日。再者，在包含一部分相異之分化誘導因子(ALK5抑制劑II、T3、ZnSO4、肝素、N-乙醯基半胱胺酸、Trolox、R428、Y-27632)及FGF受體1阻礙劑(PD-166866)的培養基(MCDB/ITS-X/2%BSA/20mM葡萄糖/NaHCO3/Glutamax/青黴素-鏈黴素)中，培養4日，得到為球體型態的胰島素產生細胞。
(2)移植前之胰島素產生細胞之蛋白質表現評價
藉由流式細胞術測定(1)中所製作的胰島素產生細胞之蛋白質表現(胰島素、NKX6.1、嗜鉻細胞分泌素、Ki67)。
(3)胰島素產生細胞於纖維蛋白凝膠中之分散、凝膠化
將纖維蛋白凝膠製作用之纖維蛋白原(fibrinogen)(Merck Millipore，341576-100MG)於事前，以成為10mg/mL之方式溶解於基礎培養基(MCDB)中，並於-80℃保存至使用為止。將凝血酶(thrombin)(Sigma，10602400001)以成為50U/mL之方式溶解於PBS(-)中，並在-80℃保存至使用為止。纖維蛋白原(fibrinogen)溶液及凝血酶(thrombin)溶液，係在即將使用前溶解而使用。
將(1)所製作的胰島素產生細胞之球體(具有直徑約50至500μm之大小，就總數而言，包含300萬個細胞)收集於1.5mL試管中，使其沉降。沉降後，儘可能除去培養液，添加100μL之纖維蛋白原(fibrinogen)溶液，充分攪拌。繼而，為使凝集塊不沉降，添加相對於纖維蛋白原(fibrinogen)溶液之1/2量(50μL)的凝血酶(thrombin)溶液。從添加凝血酶(thrombin)溶液算起，於室溫放置5分鐘以上，使其凝膠化。
(4)胰島素產生細胞移植至生體內，及類生體組織結構體形成過程的功能評價
將(3)所製作之分散有胰島素產生細胞的纖維蛋白凝膠，移植至藉由鏈脲佐菌素(streptozotocin)(STZ)誘發糖尿病的免疫不全NOD/SCID小鼠之皮下(iPIC群)。移植後，測定血液中之人類C-肽(源自胰島素產生細胞的胰島素之指標)的濃度及血糖值，評價胰島素產生細胞之存活及功能。就對照而言，設置非移植個體(虛假(sham)群)及非糖尿病NOD/SCID小鼠(對照群)，測定同樣之指標，進行評價。
(5)源自胰島素產生細胞之類生體組織結構體之對葡萄糖負荷的回應評價
將分散有胰島素產生細胞之纖維蛋白凝膠進行皮下移植，於經過6個月的時點，為使血糖值短暫性地上升，進行葡萄糖強制經口投與，隨後之胰島素產生細胞的回應，藉由測定血漿中葡萄糖濃度及血中人類C-肽濃度來評價。
(6)源自胰島素產生細胞之類生體組織結構體之一般染色及蛋白質表現的評價
將移植6個月後摘出之源自胰島素產生細胞的類生體組織結構體，藉由多聚甲醛(paraformaldehyde)固定。從固定之類生體組織結構體，製作石蠟切片及凍結切片。使用石蠟切片，進行HE染色及馬森三色法(Masson trichrome)染色。又，使用凍結切片，藉由免疫組織染色，評價目標蛋白質表現(人類核(HuN)、PDX1、胰島素(INS)、升糖素(GCG)、小鼠CD31(mCD31)、嗜鉻細胞分泌素A(CHGA)、Ki67)。
2.結果
(1)移植前之胰島素產生細胞的蛋白質表現評價
關於移植前之胰島素產生細胞，將藉由流式細胞術的測定結果示於圖1，又，將胰島素陽性/NKX6.1陽性細胞率、嗜鉻細胞分泌素A陽性細胞率、Ki67陽性細胞率示於表1。移植前之胰島素產生細胞，95%以上為嗜鉻細胞分泌素A陽性之內分泌細胞，移植後，成熟為β細胞之胰島素陽性/NKX6.1陽性細胞為42.6%，成熟為α細胞之胰島素陽性/NKX6.1陰性細胞為30.3%的細胞集團。又，為增殖標記之Ki67陽性細胞非常少，僅0.4%。
[表1]
Figure 109111993-A0202-12-0055-1
(2)移植至生體內之胰島素產生細胞形成類生體組織結構體的過程之功能評價
將移植後之血中人類C-肽濃度及血糖值的測定結果示於圖2及表2。在移植入分散有胰島素產生細胞之纖維蛋白凝膠的動物中，移植3個月後，於血液中驗出高濃度之人類C-肽，伴隨此，高血糖得以改善。血糖值，直至6個月後仍維持正常水準。從以上結果，暗示移植入之分散有胰島素產生細胞的纖維蛋白凝膠，在皮下與宿主細胞混合，同時分化、成熟，形成功能性之類生體組織結構體。
[表2]
Figure 109111993-A0202-12-0056-2
(3)源自胰島素產生細胞之類生體組織結構體之對葡萄糖負荷的回應評價
將葡萄糖負荷後之血中人類C-肽濃度及血漿中葡萄糖濃度示於圖3。藉由移植入分散有胰島素產生細胞之纖維蛋白凝膠而形成的類生體組織結構體，在移植後6個月之時點，顯示敏銳的葡萄糖回應性，即分泌人類C-肽至血中。即使移植部位為皮下亦無妨，附加葡萄糖15分鐘後，可見到明確之血中人類C-肽上升，確認經由豐富血流的媒介，如同實際胰島般的生體回應。又，推測伴隨血糖降低，血中人類C-肽亦降低，低血糖之擔憂亦減少。
(4)源自胰島素產生細胞之類生體組織結構體的一般染色及蛋白質表現之評價
將移植後6個月時點之源自胰島素產生細胞的類生體組織結構體之肉眼所見示於圖4，將摘出之類生體組織結構體的HE染色圖示於圖5，將馬 森三色法(Masson trichrome)染色圖示於圖6，將目標蛋白質表現進行各種免疫組織染色的結果示於圖7至10。
源自胰島素產生細胞的類生體組織結構體之肉眼所見(圖4)，無明顯之肥大，為米粒大的類生體組織結構體可容易地從皮下單離。雖同時期合計解剖4隻，然而全部同樣如肉眼所見。從組織學評價，顯示類生體組織結構體為：1)直徑50至500μm之源自胰島素產生細胞的類胰島細胞簇，2)以圍繞其之方式配置的源自宿主之纖維性組織，3)由源自宿主之血管結構所構成(圖5至10)。
3)之源自宿主之血管結構(=小鼠CD31陽性，圖9)，主要進入1)之內分泌細胞簇，在1)之類胰島細胞簇內，可見到多數之紅血球(圖5、6)。因此，強烈地暗示此類生體組織結構體，與實際之胰島同樣，實現豐富之血流，及經由血流媒介的敏銳生體反應。又，由於包含多量纖維性組織(圖6)，物理性強度亦高。實際上，在嘗試切斷源自胰島素產生細胞之類生體組織結構體時，具有如軟骨之強度，無法輕易地切斷。
HuN陽性之源自胰島素產生細胞的細胞，大部分為類胰島細胞(圖7至10)，亦未見目標外細胞的增殖。為增殖標記之Ki67及HuN雙陽性細胞亦為0.5%以下，屬微量者(圖10)。胰島素陽性細胞分布於1)之類胰島細胞簇之內側，升糖素陽性細胞分布於1)之類胰島細胞簇之外側，此種配置可在出生前之胎兒人類胰臟，或齧齒類之胰島中觀察到。因此，暗示此類生體組織結構體，亦與胎兒人類胰島同樣地，以數十年單位而發揮功能。
從以上之結果，顯示藉由使胰島素產生細胞分散於纖維蛋白凝膠，並移植至生體內，在所謂皮下等血流或營養缺乏的部位可長期存活，再者，在與宿主之細胞混合而成熟，形成新的類生體組織結構體。顯示所形成之皮下類生體組織結構體，實際上與生體內之胰島同樣地，具有伴隨生理性且敏銳的胰島素分泌調節的血糖值控制功能。
實施例2：具有糖尿病病態之生體內的源自胰島素產生細胞之類生體組織結構體的形成及功能評價
1.方法
將上述實施例1之(3)所製作之分散有胰島素產生細胞的纖維蛋白凝膠，分別移植至藉由鏈脲佐菌素(streptozotocin)(STZ)誘發糖尿病之免疫不全NOD/SCID小鼠，或非糖尿病之NOD/SCID小鼠的皮下。至移植28週後為止，測定飽食時之血中人類C-肽、升糖素及血糖值。
28週後，對於全部個體，摘出源自胰島素產生細胞之類生體組織結構體。測定摘出之移植片類生體組織結構體的重量，於破碎、以酸乙醇處理後，測定移植片類生體組織結構體中的胰島素及升糖素含量。就對照而言，採集各移植小鼠之胰臟及非移植之非糖尿病NOD/SCID小鼠的胰臟，同樣地測定荷爾蒙含量。
2.結果
將血液中之人類C-肽及升糖素的濃度及血糖值之推移示於圖11。至分散有胰島素產生細胞之纖維蛋白凝膠之移植28週後為止，持續地檢測出血中人類C-肽。血中升糖素濃度亦上升，與糖尿病及非糖尿病之非移植小鼠相比，為高值。暗示分散有胰島素產生細胞的纖維蛋白凝膠，在皮下環 境中可長期存活，由此形成的類生體組織結構體釋放複數種胰島荷爾蒙。糖尿病小鼠之高血糖在移植12週後獲得改善，至28週後為止，血糖值維持正常區域。若摘出類生體組織結構體，則完全回復移植前之高血糖狀態，因此顯示持續且安定之高血糖改善作用係來自類生體組織結構體。
將移植片類生體組織結構體中及胰臟中之各荷爾蒙含量示於圖12。與胰臟(左)比較，移植片類生體組織結構體(右)每單位重量之胰島素及升糖素的含量較多。顯示移植片類生體組織結構體，如胰臟中之胰島，以高密度地包含胰內分泌細胞。
實施例3：源自胰島素產生細胞之類生體組織結構體的血糖控制功能
1.方法
將上述實施例1之(3)所製作之分散有胰島素產生細胞的纖維蛋白凝膠，移植至藉由STZ誘發糖尿病之免疫不全NOD/SCID小鼠，或具有糖尿病自然發病之Akita基因變異的NOD/SCID小鼠之皮下。移植14週以後，使用高血糖完全改善的小鼠，實施以下之試驗。
試驗(1)：為使血糖值短暫性地上升，進行葡萄糖強制經口投與，隨後測定血中人類C-肽、升糖素及升糖素樣肽-1濃度，評價源自胰島素產生細胞之類生體組織結構體的回應。使用未移植‧非糖尿病NOD/SCID小鼠作為對照，測定內因性之各荷爾蒙的血中濃度。
試驗(2)：為了評價對上述源自胰島素產生細胞之類生體組織結構體的回應之升糖素的參與度，在葡萄糖強制投與前，強制經口投與升糖素受體拮抗劑MK-0893，實施與試驗(1)同樣之試驗。MK-0893對人 類之升糖素受體比對小鼠之升糖素受體顯示較強的拮抗劑活性(J.Med.Chem.2012Jul.12；55(13)：6137-48)。
試驗(3)：為了評價對源自胰島素產生細胞之類生體組織結構體所造成之胰島素釋出之類升糖素肽-1的參與度，使用滲透壓泵浦經由皮下持續投與類升糖素肽-1受體拮抗劑Exendin-9共計3日，測定投與前後之血中人類C-肽濃度。
試驗(4)：為誘發低血糖，經由皮下投與胰島素製劑甘精(glargine)，測定血中人類C-肽，評價隨後之源自胰島素產生細胞之類生體組織結構體的回應。使用未移植、非糖尿病NOD/SCID小鼠作為對照，測定源自內因性胰島之小鼠C-肽的血中濃度。
2.結果
試驗(1)：將葡萄糖負荷後之血中升糖素及類升糖素肽-1濃度示於圖13。藉由葡萄糖負荷，血中人類C-肽及類升糖素肽-1濃度短暫性地上升，血中升糖素濃度顯示降低傾向。移植小鼠方面，與未移植‧非糖尿病小鼠相比，血中類升糖素肽-1及升糖素之血中濃度呈現高值，暗示類生體組織結構體釋出此等荷爾蒙。
試驗(2)：將葡萄糖負荷後之血糖值及血中人類C-肽濃度示於圖14。若以MK-0893進行前處置，則葡萄糖負荷後之短暫性血糖值的上升減弱，血中人類C-肽濃度之上升亦減弱。另一方面，MK-0893在未移植、非糖尿病小鼠中，對於血糖值及內因性小鼠C-肽之血中濃度沒有影響。藉由此等，顯示升糖素有助於藉由類生體組織結構體的血糖控制作用。
試驗(3)：將Exendin-9之3日投與前後的飽食時血中人類C-肽濃度示於圖15。血中人類C-肽濃度隨Exendin-9之持續投與而降低，若停止投與，則回復投與前的水準。顯示由類生體組織結構體所造成的人類C-肽之釋出，受到類升糖素肽-1的控制。
試驗(4)：血中人類C-肽，若藉由投與甘精(glargine)而誘發低血糖，則其濃度大幅度地降低。此變化與未移植‧非糖尿病小鼠中的內因性小鼠C-肽之血中濃度推移相同。顯示誘發低血糖時，類生體組織結構體呈現與內因性胰島類似的胰島素分泌調節功能。
從以上說明，顯示藉由移植分散有胰島素產生細胞之纖維蛋白凝膠而形成的源自胰島素產生細胞之類生體組織結構體，發揮類似於內因性胰島之複數種胰島荷爾蒙所提供的生理性血糖控制功能。

Claims (23)

  1. 一種組成物，其係在宿主動物之生體組織內製作類生體組織結構體之方法中所使用的組成物，該組成物包含生物相容性材料及源自人類多能性幹細胞的細胞，其中源自人類多能性幹細胞的細胞係被分散配置於生物相容性材料中。
  2. 如請求項1所述之組成物，其中該生物相容性材料為纖維蛋白凝膠(fibrin gel)。
  3. 如請求項2所述之組成物，其中該纖維蛋白凝膠係在該組成物即將使用之前，將源自人類多能性幹細胞之細胞、纖維蛋白原(fibrinogen)及凝血酶(thrombin)混合而凝膠化者。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之組成物，其中該源自人類多能性幹細胞之細胞係以複數個球體之型態存在。
  5. 如請求項1至4中任一項所述之組成物，其中該源自人類多能性幹細胞的細胞中，Ki67陽性細胞的比率未達3%。
  6. 如請求項1至5中任一項所述之組成物，其中該源自人類多能性幹細胞的細胞為胰島素產生細胞。
  7. 如請求項1至6中任一項所述之組成物，其中該方法包含將該組成物移植至宿主動物之生體組織中，並分化誘導被分散配置於生物相容性材料中之源自人類多能性幹細胞的細胞。
  8. 如請求項7所述之組成物，其中該宿主動物之生體組織為皮下組織。
  9. 如請求項1至8中任一項所述之組成物，其中該類生體組織結構體包含從源自人類多能性幹細胞之細胞分化誘導所得到之分化細胞構成的複數個簇(cluster)、源自宿主動物之結締組織、以及源自宿主動物之血管，該分化細胞構成之複數個簇分散存在於類生體組織結構體中，該結締組織圍繞由該分化細胞構成之複數個簇的周圍，該血管侵入由該分化細胞構成的複數個簇。
  10. 如請求項9所述之組成物，其中該分化細胞不含外分泌細胞。
  11. 一種類生體組織結構體，其為包含從源自人類多能性幹細胞之細胞分化誘導所得到之分化細胞構成的複數個簇、源自宿主動物之結締組織、以及源自宿主動物之血管的類生體組織結構體，其中該分化細胞構成之複數個簇係分散存在於類生體組織結構體中，該結締組織圍繞由該分化細胞構成之複數個簇的周圍，該血管侵入由該分化細胞構成之複數個簇。
  12. 如請求項11所述之類生體組織結構體，其中該分化細胞包含胰β細胞。
  13. 如請求項11或12所述之類生體組織結構體，其中該分化細胞不含外分泌細胞。
  14. 如請求項11至13中任一項所述之類生體組織結構體，其中該類生體組織結構體係用於將所移植的受檢體之血糖值控制於正常值。
  15. 一種類生體組織結構體之製造方法，其包含：將包含生物相容性材料及源自人類多能性幹細胞之細胞的組成物，移植至宿主動物之生體組織中而進行分化誘導，其中該源自人類多能性幹細胞之細胞係被分散配置於生物相容性材料中。
  16. 如請求項15所述之方法，其中該生物相容性材料為纖維蛋白凝膠。
  17. 如請求項16項所述之方法，其中該纖維蛋白凝膠係於該組成物即將使用之前，與源自人類多能性幹細胞之細胞、纖維蛋白原(fibrinogen)及凝血酶(thrombin)混合而凝膠化。
  18. 如請求項15至17中任一項所述之方法，其中該源自人類多能性幹細胞之細胞係以複數個球體之型態存在。
  19. 如請求項15至18中任一項所述之方法，其中在該源自人類多能性幹細胞之細胞中，Ki67陽性細胞的比率未達3%。
  20. 如請求項15至19中任一項所述之方法，其中該源自人類多能性幹細胞的細胞為胰島素產生細胞。
  21. 如請求項15至20中任一項所述之方法，其中該宿主動物之生體組織為皮下組織。
  22. 如請求項15至21中任一項所述之方法，其中該類生體組織結構體包含從分散之源自人類多能性幹細胞之細胞分化誘導所得到之分化細胞構成的複數個簇、源自宿主動物之結締組織、以及源自宿主動物之血管，該分化細胞構成之複數個簇係分散存在於類生體組織結構體中， 該結締組織係圍繞由該分化細胞構成之複數個簇的周圍，該血管侵入由該分化細胞構成之複數個簇。
  23. 如請求項15至22中任一項所述之方法，其中該分化細胞不含外分泌細胞。
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