TW202014514A - 細胞製造法 - Google Patents

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Abstract

本發明係以提供可有效率地從多潛能幹細胞誘導、製造胚胎內胚層細胞或產生胰島素的細胞的新穎的手法為目的。
本發明提供一種從多潛能幹細胞製造胚胎內胚層細胞的方法，該方法包含將多潛能幹細胞於胰島素會作用的條件下的分化誘導培養基中進行第1培養，接著，於胰島素不會作用的條件下的分化誘導培養基中進行第2培養。

Description

細胞製造法
本發明係關於可從多潛能幹細胞有效率地誘導、製造出胚胎內胚層細胞或產生胰島素的細胞的多潛能幹細胞的分化誘導方法。
吾人正進行著從誘導性多潛能幹細胞或胚胎幹細胞(ES細胞)等多潛能幹細胞，分化誘導產生胰島素的細胞或稱為胰臟β細胞之胰島素分泌細胞，並且應用於糖尿病治療的研究。已知分化誘導多潛能幹細胞時，根據分化階段出現具有不同特徵的細胞(WO2009/012428、WO2016/021734)。例如，該分化階段依照比較上為未分化的順序，大致分類為多潛能幹細胞、胚胎內胚層細胞、原腸細胞、後方前腸細胞、胰臟前驅細胞、內分泌前區細胞、胰島素產生細胞、胰臟β細胞。
時至今日已有研究、報告將各分化階段的細胞誘導、製造的方法。例如，非專利文獻1揭示關於從多潛能幹細胞分化誘導成為胚胎內胚層細胞，在調查由屬於培養基的血清替代物之B-27補充劑或B-27補充劑(INS(-))的添加、以及屬於磷酸肌醇3-激酶(PI3K)阻礙劑之LY294002的添加所造成的影響時，經添加B-27補充劑(INS(-))的情況可最有效率地誘導胚胎內胚層細胞。
再者，非專利文獻2中，記載關於從多潛能幹細胞分化誘導成為胚胎內胚層細胞，藉由使用包含20μM的LY294002的培養基進行1日培養後，使用包含10μM的LY294002的培養基進行2日培養，胚胎內胚層細胞的標記為高度表現。
進一步，非專利文獻3中，記載關於從ES細胞製造胰臟前驅細胞的方法，其中記載關於從ES細胞分化誘導成為胚胎內胚層細胞，其係使用經添加胰島素-轉鐵蛋白-硒的培養基。
然而，利用以往的方法所製造的胚胎內胚層細胞，其細胞數或純度無法謂之為充分高者，所屬技術領域中依然期望著有效率地從多潛能幹細胞誘導、製造產生胰島素的細胞的方法。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]WO2009/012428
[特許文獻2]WO2016/021734
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Transplanation Proceedings, 44, 1127-1129 (2012)
[非專利文獻2]Nat Commen. 2015 May 22；6：7212
[非專利文獻3]PLoS ONE May 2012, Volume 7, Issue 5, e37004
本發明係以提供可有效率地從多潛能幹細胞誘導、製造胚胎內胚層細胞或產生胰島素的細胞的新穎手法為目的。
本發明者們發現從多潛能幹細胞分化誘導成為胚胎內胚層細胞之際，使胰島素持續地作用時，所獲得的細胞係多數含有胚胎內胚層細胞以外的細胞。另一方面，發現從多潛能幹細胞分化誘導成為胚胎內胚層細胞之際，不使胰島素作用的情況，細胞數不增加，無法獲得充分數量的胚胎內胚層細胞。
本發明者們為了解決該等課題致力研究的結果發現，從多潛能幹細胞分化誘導成為胚胎內胚層細胞之際，藉由於胰島素會作用的條件下的分化誘導培養基中進行第1培養，接著於胰島素會不作用的條件下的分化誘導培養基中進行第2培養，相對於使胰島素持續地作用或使胰島素不作用的情況，能以高純度製造胚胎內胚層細胞，且可增加細胞數。再者，發現從所獲得的胚胎內胚層細胞能以高純度製造進一步的分化細胞。
本發明係以該等新穎發現為基礎者，包含以下的發明。
[1]一種方法，係從多潛能幹細胞製造胚胎內胚層細胞的方法，包含
將多潛能幹細胞於胰島素會作用條件下的分化誘導培養基中進行第1培養，其次於胰島素不會作用條件下的分化誘導培養基中進行第2培養。
[2]如[1]的方法，其中，第1培養係於包含胰島素的分化誘導培養基中進行，
第2培養係於不包含胰島素的分化誘導培養基中進行。
[3]如[1]的方法，其中，第1培養係於包含胰島素且不包含胰島素訊號阻礙劑的分化誘導培養基中進行，
第2培養係於包含胰島素及胰島素訊號阻礙劑的分化誘導培養基中進行。
[4]如[1]至[3]中任一項的方法，其中，於進行第1培養及第2培養的分化誘導培養基中進一步地包含丙酮酸鹽。
[5]如[1]至[4]中任一項的方法，其中，於進行第1培養及第2培養的分化誘導培養基中，進一步包含L-丙胺醯基L-麩醯胺酸。
[6]如[1]至[5]中任一項的方法，其中，於進行第1培養及第2培養的分化誘導培養基中，進一步地包含15mM以上之葡萄糖。
[7]如[1]至[6]中任一項的方法，其中，包含進行6小時至48小時之第1培養。
[8]如[1]至[7]中任一項的方法，其中，包含進行至少6小時之第2培養。
[9]如[1]至[8]中任一項的方法，其係在3次元培養系實施。
[10]如[1]至[8]中任一項的方法，其係在2次元培養系實施。
[10A]如[9]的方法，其中，第1培養的開始時，包含1萬至100萬細胞個/mL之多潛能幹細胞。
[10B]如[9]的方法，其中，第1培養的開始時，包含10萬至50萬細胞個/mL之多潛能幹細胞。
[10C]如[10]的方法，其中，第1培養的開始時，包含5萬至100萬細胞個/cm2之多潛能幹細胞。
[11]如[10]的方法，其中，第1培養的開始時，包含15萬至30萬細胞個/cm2之多潛能幹細胞。
[12]如[1]至[11]中任一項的方法，其中，分化誘導培養基係以DMEM(杜貝可改良伊格培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)為基礎。
[13]如[1]至[12]中任一項的方法，其中，第1培養的分化誘導培養基係包含ROCK阻礙劑及/或GSK3β阻礙劑。
[14]一種產生胰島素的細胞的製造方法，係包含：將藉由將多潛能幹細胞於胰島素會作用條件的分化誘導培養基中進行第1培養，其次，於胰島素不會作用條件下的分化誘導培養基中進行第2培養而製造的胚胎內胚層細胞，進一步進行分化誘導的步驟。
[15]一種產生胰島素的細胞的製造方法，係包含：將藉由將多潛能幹細胞於包含胰島素的分化誘導培養基中進行第1培養，其次於不含胰島素的分化誘導培養基中進行第2培養而製造的胚胎內胚層細胞，進一步進行分化誘導的步驟。
[16]一種產生胰島素的細胞的製造方法，係包含：將藉由將多潛能幹細胞於包含胰島素且不包含胰島素阻礙劑的分化誘導培養基中進行第1培養，其次於包含胰島素及胰島素訊號阻礙劑的分化誘導培養基中進行第2培養而製造的胚胎內胚層細胞，進一步進行分化誘導的步驟。
[17]一種胚胎內胚層細胞，係以[1]的方法所製造者。
[18]一種產生胰島素的細胞，係以[14]至[16]中任一項的方法所製造者。
[19]一種醫藥，係包含[18]的產生胰島素的細胞。
[20]如[1]至[13]中任一項的方法，其中，製造SOX2陽性(SOX2+)細胞的混入率未達5%的胚胎內胚層細胞。
[21]如[1]至[13]、[20]中任一項的方法，其中，所製造的胚胎內胚層細胞的細胞數，成為最初播種的多潛能幹細胞的細胞數的2倍以上。
[22]一種後方前腸細胞的製造方法，包含將藉由[1]至[13]、[20]、[21]中任一項的方法所製造的胚胎內胚層細胞分化誘導成為後方前腸細胞的步驟。
[23]如[22]的方法，其中，所製造的後方前腸細胞包含90%以上的PDX1陽性(PDX1+)細胞。
[24]如[22]或[23]的方法，其中，所製造的後方前腸細胞的細胞數，成為最初播種的多潛能幹細胞的係胞數的2倍以上。
[25]一種胰臟前驅細胞的製造方法，包含將藉由[1]至[13]、[20]、[21]中任一項的方法所製造的胚胎內胚層細胞分化誘導成為胰臟前驅細胞的步驟。
[26]如[25]的方法，其中，所製造的胰臟前驅細胞包含80%以上的PDX1陽性(PDX1+)且NKX6.1陽性(NKX6.1+)細胞。
[27]如[25]或[26]的方法，其中，所製造的胰臟前驅細胞的細胞數，成為最初播種的多潛能幹細胞的細胞數的2倍以上。
[28]一種胚胎內胚層細胞，其係以[1]至[13]、[20]、[21]中任一項的方法所製造之SOX2陽性(SOX2+)細胞的混入率未達5%者。
[29]一種後方前腸細胞，其係包含[22]至[24]中任一項的方法所製造之90%以上的PDX1陽性(PDX1+)細胞。
[30]一種胰臟前驅細胞，其係以[25]至[27]中任一項的方法所製造之包含80%以上的PDX1陽性(PDX1+)且NKX6.1陽性(NKX6.1+)細胞。
本說明書包含本案優先權基礎的日本專利申請案2018-146650號的說明書及/或圖式所記載的內容。
本說明書中所引用的全部文獻、專利及專利申請案係直接以參考方式併入本說明書。
根據本發明，可提供可有效率地從多潛能幹細胞誘導、製造胚胎內胚層細胞或產生胰島素的細胞的新穎手法。
第1圖顯示於從IPS細胞(Ff-I01s04株及Ff-I14s03株)成為胚胎內胚層細胞的分化誘導中，首先於含有胰島素的分化誘導培養基進行培養，接著於不含有胰島素的分化誘導培養基進行培養時(胰島素(+)→(-))，以及僅於含有胰島素的分化誘導培養基培養時(胰島素(+))，所得到細胞中SOX2陽性/陰性及SOX17陽性/陰性的細胞比例藉由流體細胞儀分析的結果。
第2圖顯示於從IPS細胞(Ff-MH15s02株)成為胚胎內胚層細胞的分化誘導中，使用RPMI培養基或DMEM培養基作為分化誘導培養基的基本培養基，於基礎培養基使用RPMI培養基的情況，第0日至第3日於含有胰島素的分化誘導培養基進行培養，於基礎培養基使用DMEM培養基的情況，最初(第0日)於含有胰島素的分化誘導培養基進行培養、其次(第1日至第3日)於不含有胰島素的分化誘導培養基進行培養所獲得的細胞中，藉由流式細胞測量術分析SOX2陽性/陰性、及SOX17陽性/陰性的細胞比例的結果，進一步，將藉由各手法所獲得的細胞進一步地分化誘導所 獲得的細胞(後方前腸細胞及胰臟前驅細胞)中，藉由流式細胞測量術分析PDX1陽性/陰性、及NKX6.1陽性/陰性的細胞比例的結果。
第3圖係顯示於從IPS細胞(Ff-I14s04株)成為胚胎內胚層細胞的分化誘導中，首先於含有胰島素的分化誘導培養基進行3次元培養，其次於不含有胰島素的分化誘導培養基進行3次元培養的情況(胰島素(+)→(-))、以及僅於含有胰島素的分化誘導培養基進行3次元培養的情況(胰島素(+))，所獲得細胞塊中之SOX2陽性/陰性及SOX17陽性/陰性的細胞比例藉由流式細胞測量術分析的結果，進一步，將藉由各手法所獲得的細胞進一步地分化誘導所獲得的細胞(細胞塊(後方前腸細胞)中之PDX1陽性/陰性及NKX6.1陽性/陰性的細胞比例藉由流式細胞測量術分析的結果。
第4圖係顯示於從IPS細胞(Ff-I14s04株)成為胚胎內胚層細胞化誘導中，將首先於含有胰島素的分化誘導培養基進行3次元培養，其次於不含有胰島素的分化誘導培養基進行3次元培養所獲得的細胞塊(INS(+)→INS(-))、以及僅於含有胰島素的分化誘導培養基進行3次元培養所獲得的細胞塊(INS(+))，進一步藉由3次元培養而經分化誘導的情況中，各細胞塊的細胞數的經時變化示意圖。
1.用語
以下，說明本說明書中所記載的用語。
本說明書中，「約」表示相對於基準值，分別以正或負25%、20%、10%、8%、6%、5%、4%、3%、2%或1%為止進行變動的值。較佳 地，「約」或「大約」之用語，顯示相對於基準值，分別為正或負15%、10%、5%、或1%的範圍。
本說明書中，「包含(comprise(s)或comprising)~」意指該語句接續要件的包含但不限定於該等。因此，暗示該語句包含接續要件，但不暗示排除其他任意的要件。
本說明書中，「由~所組成(consist(s)of或consisting of)」意指包含該語句後續所有要件且限定於該等。因此，「由~所組成」之語句顯示所列舉的要件為所要求的或必須的，其他要件實質上不存在。
本說明書中，不「使用餵養細胞」意指基本上不含餵養細胞，不使用經藉由培養餵養細胞進行預處理的培養基等。因此，培養基中不含從餵養細胞所分泌的成長因子及細胞激素等物質。
此外，「餵養細胞」或「餵養體」意指具有與其他種類的細胞共培養，可支持、成長該細胞的環境的細胞。餵養細胞可為源自與該等所支持的細胞同種的細胞，亦可源自不同種。例如，作為人類細胞的餵養體，可使用人類皮膚纖維母細胞或人類胚胎幹細胞，亦可使用小鼠胚胎纖維母細胞的初代培養物及不死化小鼠胚胎纖維母細胞。餵養細胞可藉由放射線照射及絲裂黴素C處理等而不死化。
本說明書中，「接著」意指細胞附著於容器，例如，細胞於適當的培養基存在下附著於滅菌塑膠(或經被覆的塑膠)之細胞培養皿或燒瓶。細胞中，亦有不接著於細胞培養容器則無法於培養物中維持、或無法成長者。相對於此，非接著性細胞即使不接著於容器，於培養物中亦可維持、增殖。
本說明書中，「培養」意指細胞於活體外(in vitro)環境中維持、使其成長及/或使其分化。「進行培養」意味於組織或體外，例如，於細胞培養皿或燒瓶中，使其持續、增殖(使其成長)及/或使其分化。培養包含2次元培養(平面培養)及3次元培養(懸浮培養)。
本說明書中，「進行富集(enrich)」及「富集(enrichment)」意指使細胞的組成物等組成物中的特定構成成分的量增加，「經富集(enriched)」意指細胞的組成物，例如，為了說明而使用細胞集團時，與富集前的細胞集團中之該等構成成分的比例比較時特定構成成分的量為增加的細胞集團。例如，可將細胞集團等組成物針對標的細胞型進行富集，因此，與存在於富集前的細胞集團內的標的細胞的比例比較時為增加。細胞集團亦可藉由所屬技術領域中習知的細胞選擇及選別方法而富集相關標的細胞型。細胞集團亦可藉由本說明書所記載的特定的選別或選擇過程而富集。本發明的特定實施態樣中，藉由富集標的細胞集團，使細胞集團內相關的標的細胞集團至少富集20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%。
本說明書中，「進行耗竭(deplete)」及「耗竭(depletion)」意指使細胞或細胞組成物等組成物中的特定構成成分減少，「經耗竭(depleted)」意指細胞或細胞的組成物，例如，為了說明而使用細胞集團時，與使其耗竭前的細胞集團中該等構成成分的比例相比較，特定構成成分的量為減少的細胞集團。例如，可將細胞集團等組成物針對標的細胞型耗竭，因此，與存在於耗竭前的細胞集團內的比例相比較，標的細胞型的比例為減少。細胞集團可藉由所屬技術領域習知的細胞選擇方法及選別方法，使 標的細胞型耗竭。細胞集團亦可藉由本說明書所記載的特定選別過程或選擇過程使其耗竭。本發明之特定實施態樣中，經由使標的細胞集團耗竭的方法，細胞集團內相關的標的細胞集團至少減少(耗竭)50%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%。
本說明書中，「進行純化(purify)」及「純化(purification)」意指除去細胞的組成物等組成物中的雜質，成為相關特定構成的純粹者，「經純化(purified)」則意指細胞的組成物，例如，為了說明而使用細胞集團時，與使其純化前的細胞集團中該等構成成分的比例相比較，雜質的量為減少，特定構成成分的純度為提升的細胞集團。例如，可將細胞集團等組成物針對標的細胞型純化，與純化前的細胞集團內存在的標的細胞的比例相比較，標的細胞型的比例為增加。細胞集團可藉由所屬技術領域習知的細胞選擇方法及選別方法，使相關標的細胞型純化。細胞集團亦可藉由本說明書所記載得特定選別過程或選擇過程純化。本發明之特定實施態樣中，經由純化標的細胞集團的方法，標的細胞集團的純度至少成為70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%，甚至可成為雜質(包含夾雜細胞)為無法檢出的程度。
本說明書中，「標記」意指「標記蛋白質」、「標記基因」等藉由特定細胞型使其特異性表現的細胞抗原或其基因。較佳地，標記為細胞表面標記，此時，可實施生存細胞的濃縮、單離及/或檢出。標記有陽性選擇標記或陰性選擇標記。
標記蛋白質的檢出，可使用對該標記蛋白質為特異性的抗體的免疫學分析，例如，可利用ELISA、免疫染色、流式細胞測量術進行。 標記基因的檢出，可利用所屬技術領域中習知的核酸增幅方法及/或核酸檢出方法，例如，RT-PCR、微陣列、生物晶片等進行。本說明書中，標記蛋白質為「陽性」意指以流式細胞測量術檢出為陽性，「陰性」意指以流式細胞測量術為檢出界限以下。再者，標記基因為「陽性」時，意指經由RT-PCR被檢出，「陰性」時意指以RT-PCR為檢出界限以下。
本說明書中，「表現(expression)」定義為經由細胞內的啟動子所驅動之特定的核苷酸序列的轉錄及/或轉譯。
本說明書中，「多潛能性(pluripotency)」意指可分化為具有各種不同型態或功能的組織或細胞，亦可分化為三胚層的任何系統的細胞的能力。「多潛能性(pluripotency)」從無法分化為胚盤，因此無形成個體的能力的觀點而言，與包含胚盤，可分化為活體之任何組織的「全能性(totipotency)」有區別。
本說明書中，「多能性(multipotency)」意指可分化成為複數的限定數目的系統的細胞的能力。例如，間葉系幹細胞、造血幹細胞、神經幹細胞為多能性(multipotent)，但非多潛能性(pluripotent)。
本說明書中，「多潛能幹細胞(pluripotent stem cell)」意指細胞潛在地具有與胚胎幹細胞(ES細胞)及與其同等的分化多能性，亦即，分化為活體的各種組織(內胚層、中胚層、外胚層之全部)的能力。與ES細胞具有同等的分化多能性的細胞，可列舉稱為「誘導性多潛能幹細胞」(本說明書中，亦稱為「iPS細胞」)。較佳地，本發明中，多潛能幹細胞為人類多潛能幹細胞。
就「ES細胞」而言，若為小鼠ES細胞，可利用inGenious公司、理研等建立的各種小鼠ES細胞株；若為人類ES細胞，則可利用NIH、理研、京都大學、Cellartis公司建立的各種人類ES細胞株。例如，作為ES細胞株者，可利用NIH的CHB-1至CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1至HUES28株等，WisCell Research的H1株、H9株，理研的KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等。
「誘導性多潛能幹細胞」意指藉由於哺乳體細胞或未分化幹細胞導入特定因子(核再程式化因子)進行再程式化而獲得的細胞。目前，「誘導性多潛能幹細胞」有各種各樣者，除了由山中等人，經由於小鼠纖維母細胞導入Oct3/4‧Sox2‧Klf4‧c-Myc的4因子所建立的iPS細胞(Takahashi K,Yamanaka S.,Cell,(2006)126：663-676)以外，亦可使用於人類纖維母細胞導入同樣的4因子所建立的源自人類細胞的iPS細胞(Takahashi K,Yamanaka S.,et al.Cell,(2007)131：861-872.)；上述4因子導入後，以Nanog的表現作為指標進行選別所建立的Nanog-iPS細胞(Okita,K.,Ichisaka,T.,and Yamanaka,S.(2007).Nature 448,313-317.)；以不包含c-Myc的方法所製作的iPS細胞(Nakagawa M,Yamanaka S.,et al.Nature Biotechnology,(2008)26,101-106))；以無病毒方式導入6因子所建立的iPS細胞(Okita K et al.Nat.Methods 2011 May；8(5)：409-12，Okita K et al.Stem Cells.31(3)：458-66.)。再者，亦可使用由Thomson等人所製作的導入OCT3/4‧SOX2‧NANOG‧LIN28的4因子所建立的誘導性多潛能幹細胞(Yu J.,Thomson JA.et al.,Science(2007)318：1917- 1920.)、由Daley等人所製作的誘導性多潛能幹細胞(Park IH,Daley GQ.et al.,Nature(2007)451：141-146)、由櫻田等人所製作的誘導性多潛能幹細胞(日本特開2008-307007號)等。
此外，亦可使用公開的全部論文(例如，Shi Y.,Ding S.,et al.,Cell Stem Cell,(2008)Vol3,Issue 5,568-574；Kim JB.,Scholer HR.,et al.,Nature,(2008)454,646-650；Huangfu D.,Melton,DA.,et al.,Nature Biotechnology,(2008)26,No 7,795-797)，或專利(例如，日本特開2008-307007號、日本特開2008-283972號、US2008/2336610、US2009/047263、WO2007/069666、WO2008/118220、WO2008/124133、WO2008/151058、WO2009/006930、WO2009/006997、WO2009/007852)所記載之所屬技術領域習知的誘導性多潛能幹細胞之任一者。
誘導性多潛能幹細胞株可利用NIH、理化學研究所(理研)、京都大學等所建立的各種iPS細胞株。例如，若為人類iPS細胞株，可列舉理研的HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株；京都大學的Ff-WJ-18株、Ff-I01s01株、Ff-I01s02株、Ff-I01s04株、Ff-I01s06株、Ff-I14s03株、Ff-I14s04株、QHJI01s01株、QHJI01s04株、QHJI14s03株、QHJI14s04株、RWMH15s02株、Ff-MH15s02株、253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株；CDI公司的MyCell iPS Cells(21525.102.10A)株、MyCell iPS Cells(21526.101.10A)株等。
「胚胎內胚層細胞」意指藉由SOX17、FOXA2、BMP2、CER及CXCR4之至少一種標記的表現而賦予特徵的細胞。
「原腸管細胞」意指藉由HNF1B及HNF4A之至少一種標記的表現而賦予特徵的細胞。
「後方前腸細胞」意指藉由PDX-1、HNF6及HLXB9之至少一種標記的表現而賦予特徵的細胞。
「胰臟前驅細胞」意指藉由PDX-1、NKX6.1、PTF-1α、GATA4及SOX9之至少一種標記的表現而賦予特徵的細胞。
「內分泌前驅細胞」意指藉由Chromogranin A、NeuroD及NGN3知至少一種標記的表現，及胰關聯的荷爾蒙系(例如，胰島素等)的標記未表現而賦予特徵的細胞。內分泌前驅細胞亦可表現PAX-4、NKX2-2、Islet-1、PDX-1、PTF-1α等標記。
「產生胰島素的細胞」意指藉由胰島素的表現而賦予特徵的細胞。「產生胰島素的細胞」較佳為除了胰島素的表現之外，進一步藉由NKX6.1的表現而賦予特徵。亦即，「產生胰島素的細胞」更佳是意指表現胰島素及NKX6.1二者標記的細胞。
「胰臟β細胞」意指經由「產生胰島素的細胞」而成熟的細胞，具體而言，意指表現胰臟β細胞的成熟標記之MAFA、UCN3及IAPP之至少一種標記，或經由葡萄糖刺激藉由胰島素分泌上昇反應而賦予特徵的細胞。
各分化階段之細胞的製造，可經由下文詳述的手法進行。
本說明書中，「細胞」並無特別限定，意指細胞的組成物，亦即，細胞集團。因此，「細胞」不僅為特定的細胞，亦可包含一種或複 數的其他細胞。「細胞」中之特定的細胞，可藉由富集或純化、或藉由耗竭一種或複數的其他細胞而提高。
本說明書中，「具有CDK8/19阻礙活性的因子」意指具有CDK8/19的阻礙活性之所有物質。對照於相同的CDK家族的其他蛋白質，CDK8於細胞增殖為非必須，CDK8的阻礙於通常的條件下無大的效果。CDK19與CDK8類似，CDK8阻礙通常亦伴隨CDK19的阻礙。
「增殖因子」為促成特定的細胞分化及/或增殖的內因性蛋白質。「增殖因子」可列舉例如：上皮成長因子(EGF)、酸性纖維母細胞增殖因子(aFGF)、鹼性纖維母細胞增殖因子(BFGF)、肝細胞增殖因子(HGF)、類胰島素增殖因子1(IGF-1)、類胰島素增殖因子2(IGF-2)、角質形成細胞增殖因子(KGF)、神經增殖因子(NGF)、源自血小板的增殖因子(PDGF)、形質轉換增殖因子β(TGF-β)、血管內皮細胞增殖因子(VEGF)、轉鐵蛋白、各種介白素(例如，IL-1至IL-18)、各種菌落(colony)刺激因子(例如，顆粒球/巨噬細胞菌落刺激因子(GM-CSF))、各種干擾素(例如，IFN-γ等)及對於幹細胞具有效果之其他細胞激素，例如，幹細胞因子(SCF)及促紅血球生成素(Epo)。
本說明書中，「ROCK阻礙劑」意指阻礙Rho激酶(ROCK：Rho-associated,coiled-coil containing protein kinase)的物質，亦可為阻礙ROCK I及ROCK II之任一者的物質。ROCK阻礙劑只要具有上述功能則無特別限定，可列舉例如：N-(4-吡啶基)-4β-[(R)-1-胺基乙基]環己烷-1α-胺甲醯胺(亦稱為Y-27632)、Fasudil(HA1077)、(2S)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-異喹啉基]磺醯基]六氫-1H-1,4-二氮呯(H-1152)、4β-[(1R)-1-胺基乙基]- N-(4-吡啶基)苯-1苯甲醯胺(Wf-536)、N-(1H-氯[2,3-B]吡啶4-基)-4PER(R)-1-胺基乙基]環己烷-1α-甲醯胺(Y-30141)、N-(3-{[2-(4-胺基-1,2,5-噁二唑-3-基)-1-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基]氧基}苯基)-4-{[2-(4-嗎啉基)乙基]-氧基}苯甲醯胺(GSK269962A)、N-(6-氟-1H-吲唑-5-基)-6-甲基-2-氧雜-4-[4-(三氟甲基)苯基]-3,4-二氫-1H-吡啶-5-甲醯胺(GSK429286A)。ROCK阻礙劑不限定為該等，亦可使用針對ROCK的mRNA的反義寡核苷酸或siRNA、與ROCK結合的抗體、顯性負性ROCK變異體等作為ROCK阻礙劑，可商業性取得或根據習知的方法合成。
本說明書中，「GSK3β阻礙劑」係具有對GSK3β(肝醣合成酶激酶3β)的阻礙活性之物質。GSK3(肝醣合成酶激酶3)為絲胺酸/蘇胺酸蛋白質基酶的一種，參與肝醣的產生或細胞凋亡、幹細胞的維持等多數的信號途徑。GSK3係存在α與β之2種同功型。本發明中使用之「GSK3β阻礙劑」，只要具有GSK3β阻礙活性則無特別限定，亦可為兼具有GSK3β阻礙活性組合GSK3α阻礙活性者。
GSK3β阻礙劑可例示：CHIR98014(2-[[2-[(5-硝基-6-胺基吡啶-2-基)胺基]乙基]胺基]-4-(2,4-二氯苯基)-5-(1H-咪唑-1-基)嘧啶)、CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]胺基]乙基]胺基]菸鹼甲腈)、TD Z D-8(4-苄基-2-甲基-1,2,4-噻二唑-3,5-二酮)、SB216763(3-(2,4-氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、TWS-119(3-[6-(3-胺基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基氧基]酚)、肯帕羅酮(Kenpaullone)、1-氮雜肯帕羅酮(Azakenpaullone)、SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、SB415286 (3-[(3-氯-4-羥基苯基)胺基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮)及AR-AO144-18、CT99021、CT20026、BIO、BIO-丙酮肟、吡啶并噠嗪-環戊二烯基釕複合物、OTDZT、α-4-二溴苯乙酮、鋰等。GSK3β不限定為該等者，亦可使用針對GSK3β的mRNA的反義寡核苷酸或SIRNA、與GSK3β結合的抗體、顯性負性ROCK變異體等作為ROCK阻礙劑，可商業性取得或根據習知的方法合成。
本說明書中「血清替代物」可列舉例如：Knockout Serum Replacement(KSR：Invitrogen)、StemSure Serum Replacement(Wako)、B-27補充劑、N2-補充劑、白蛋白(例如，富含脂質的白蛋白)、胰島素、轉鐵蛋白、脂肪酸、膠原蛋白前驅物、微量元素(例如，鋅、硒(例如，亞硒酸鈉))、2-巰基乙醇、3’硫醇基甘油或其等之混合物(例如，ITS-G)。血清替代物較佳為B-27補充劑、KSR、StemSure Serum Replacement、ITS-G。於培養基添加血清替代物時，培養基中的濃度為為0.01至10重量%，較佳為0.1至2重量%。本發明中，較佳為使用「血清替代物」代替血清。又，本說明書中，含有胰島素的B-27補充劑有記載為「B-27補充劑(INS(+))」的情況，不含有胰島素的B-27補充劑有記載為「B-27補充劑(INS(-))」的情況。
2.從多潛能幹細胞製造胚胎內胚層細胞的方法
本發明中，胚胎內胚層細胞可藉由將多潛能幹細胞於胰島素會作用條件下的分化誘導培養基中進行第1培養，接著於胰島素不會作用條件下的分化誘導培養基中進行第2培養而製造。
(1)第1培養
「胰島素會作用的條件」意指藉由胰島素使細胞中的胰島素信號傳達途徑的活化產生的條件。通常，胰島素係與存在於細胞膜表面上的胰島素受體結合，使存在於受體內部的酪胺酸激酶活化，將胰島素受體基質蛋白質家族(IRS：IRS-1、2、3)酪胺酸磷酸化。本說明書中，將藉由胰島素與胰島素受體的結合所開始產生的該等一連串反應稱為「產生胰島素信號傳達途徑的活化」。
胰島素會作用的條件可舉出例如：於分化誘導培養基中包含胰島素。胰島素只要可活化多潛能幹細胞中的胰島素信號傳達途徑者即可，可為以重組法製造而成者，亦可為以固相合成法合成而製造者。胰島素可利用源自人類、非人類靈長類、豬、牛、馬、羊、山羊、駱馬、犬、貓、兔、小鼠、天竺鼠等者，較佳為人類胰島素。又，本說明書中、胰島素有記載為「INS」的情況，再者包含胰島素的情況有記載為「INS(+)」，不含胰島素的情況有記載為「INS(-)」的情況。
本發明中，只要可產生多潛能幹細胞中的胰島素信號傳達途徑的活化，則可使用胰島素變異體、胰島素衍生物或胰島素促效劑作為「胰島素」。「胰島素變異體」可列舉具有包含於胰島素的胺基酸序列中經缺失、取代、加成或插入1至20個，較佳為1至10個，更佳為1至5個胺基酸的胺基酸序列，且可產生胰島素信號傳達途徑的活化的多肽；或包含與胰島素的胺基酸序列具有80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，最佳為99%以上的序列同一性的胺基酸序列，且可產生胰島素信號傳達途徑的活化的多肽。胺基酸序列的比較可藉由習知的手法進行，例如，以BLAST(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information(美國國立生物學資訊中心的基本局部比對檢索工具))等為例，能以預設的設定實施。「胰島素衍生物」意指包含胰島素或胰島素變異體的胺基酸殘基的一部分基經化學性取代(例如，α-甲基化、α-羥基化)、缺失(例如，脫胺基化)、或修飾(例如，N-甲基化)的胺基酸序列，且可產生胰島素信號傳達途徑的活化的多肽或具有同樣作用的物質。「胰島素促效劑」與胰島素的結構無關，意指可與胰島素受體結合而產生胰島素信號傳達途徑的活化的物質或具有同樣作用的物質。
第1培養的分化誘導培養基能以0.01至20μM的量，較佳為0.1至10μM的量，更佳為0.5至5μM的量包含胰島素。分化誘導培養基中的胰島素濃度亦可為所添加之B-27補充劑中含有的胰島素濃度，但不限定為該等。
分化誘導培養基中，除了胰島素以外，可進一步地包含活化素(activing)A。活化素A能以5至200ng/mL的量，較佳為10至150ng/mL的量，更佳為30至120ng/mL的量，特佳為約100ng/mL的量包含於培養基中。就其他態樣而言，活化素A的培養基中的濃度為約0.1至100ng/mL，較佳為約1至50ng/mL，更佳為約3至10ng/mL。
分化誘導培養基中，可進一步地包含ROCK阻礙劑及/或GSK3β阻礙劑。ROCK阻礙劑的培養基中的濃度係根據所使用的ROCK阻礙劑的種類而適當地設定，例如，使用Y-27632作為ROCK阻礙劑時的濃度，通常可為5至20μM，較佳為5至15μM，特佳為約10μM。GSK3β阻礙劑的培養基中的濃度，根據所使用的GSK3β阻礙劑的種類而適當地 設定，例如，使用CHIR99021作為GSK3β阻礙劑時的濃度，通常可為2至5μM，較佳為2至4μM，特佳為約3μM。
分化誘導培養基中，可進一步地包含從丙酮酸鹽(鈉鹽等)、L-丙胺醯基L-麩醯胺酸及葡萄糖所成群組選擇一種以上。丙酮酸鹽能以10至1000mg/L的量，較佳為30至500mg/L的量，更佳為50至200mg/L的量，特佳為約110mg/L的量包含於培養基中。L-丙胺醯基L-麩醯胺酸能以50至2000mg/L的量，較佳為100至1500mg/L的量，更佳為500至1000mg/L的量，特佳為約860mg/L的量包含於培養基中。葡萄糖能以15mM以上的量，較佳為15至30mM的量，更佳為15至25mM的量，特佳為約25mM的量包含於培養基中。分化誘導培養基中的丙酮酸鹽、L-丙胺醯基L-麩醯胺酸及葡萄糖的濃度亦可為DMEM培養基(DMEM，high glucose，GlutaMAXTM，Pyruvate(Thermo Fisher Scientific))或其他DMEM培養基所含有的丙酮酸鹽、L-丙胺醯基L-麩醯胺酸及葡萄糖的濃度，但不限定為該等。
再者，分化誘導培養基中，可進一步地含有二甲基亞碸。
分化誘導培養基可使用哺乳類細胞的培養中所使用的基本培養基作為基礎，並且經添加上述成分之一種以上者。基本培養基可列舉：RPMI培養基、MEM培養基、IMEM培養基、DMEM(杜貝可改良伊格培養基(Dulbecco's Modified Eagle medium))培養基、Improved MEM Zinc Option培養基、Improved MEM/1%B-27補充劑/青黴素鏈黴素培養基、MCDB131/10mM葡萄糖/20mM葡萄糖/NaHCO3/FAF-BSA/ITS-X/Glutamax/抗壞血酸/青黴素鏈黴素培養基等，較佳為DMEM培養基，更 佳為以上述的量包含丙酮酸鹽、L-丙胺醯基L-麩醯胺酸及葡萄糖的DMEM培養基。
第1培養的培養期間可從6小時至48小時，較佳為12至24小時的範圍選擇。培養溫度雖無特別限定，以30至40℃(例如，37℃)進行。再者，培養容器中的二氧化碳濃度為例如5%左右。培養可以2次元培養及3次元培養之任一者進行。培養開始時的細胞數雖無特別限定，若為2次元培養，可為5萬至100萬細胞個/cm2，較佳為15萬至30萬細胞個/cm2，更佳為約20萬細胞個/cm2。再者，培養開始時的細胞數，雖無特別限定，若為3次元培養，可為1萬至100萬細胞個/mL，較佳為10萬至50萬細胞個/mL。
(2)第2培養
「胰島素不會作用的條件」意指不會產生由胰島素所引起的細胞中之胰島素信號傳達途徑的活化的條件。「不會產生細胞中之胰島素信號傳達途徑的活化」不僅意指完全不會產生該胰島素信號傳達途徑的活化，也意指與胰島素不存在下之該胰島素信號傳達途徑的活化相比為無法確認有顯著差異的程度之僅產生少許活化的情況。因此，「胰島素不會作用的條件」可列舉例如：分化誘導培養基中不包含胰島素，或即使於分化誘導培養基中包含胰島素時，其含量為無法確認有前述顯著差異的程度之僅產生少許活化之量的條件。或者是，也意指分化誘導培養基中即使包含胰島素的情況，也因為一同含有胰島素信號阻礙劑，而不會產生前述胰島素信號傳達途徑的活化的情況。「胰島素信號阻礙劑」意指可於任一位置阻斷胰島素信號傳達途徑的成分。如此之胰島素信號阻礙劑可列舉與胰島素、胰島素 受體、作用為信號傳達物質的各種蛋白質等結合或競爭，進而阻礙該等因子所參與的分子間相互作用的多肽或化合物等。例如，如此之胰島素信號阻礙劑可列舉對PI3激酶的觸媒亞單元的ATP結合進行競爭阻礙的LY294002[2-(4-嗎啉基)-8-苯基-4H-1-苯并吡唑-4-酮]等。胰島素信號阻礙劑不是限定為該等者，亦可使用與胰島素、胰島素受體、作用為信號傳達物質的各種蛋白質結合的抗體或其顯性負性型變異體；以及針對胰島素受體或作用為信號傳達物質的各種蛋白質的mRNA之反義寡核苷酸或siRNA等作為胰島素信號阻礙劑。胰島素信號阻礙劑可從商業取得或根據習知的方法合成。
第2培養的分化誘導培養基中可包含活化素A。培養基中的活化素A的量可從上述第1培養中所記載的範圍選擇，可為與第1培養所使用的相同量，亦可為不同。
分化誘導培養基中，可進一步地包含ROCK阻礙劑及/或GSK3β阻礙劑。培養基中的ROCK阻礙劑及/或GSK3β阻礙劑的量可從上述第1培養中所記載的範圍選擇，可為與第1培養所使用的相同量，亦可為不同。
分化誘導培養基中，可進一步地包含從丙酮酸鹽、L-丙胺醯基L-麩醯胺酸及葡萄糖所成群組中選擇一種以上。培養基中的丙酮酸鹽、L-丙胺醯基L-麩醯胺酸及葡萄糖的量可從上述第1培養中所記載的範圍選擇，可為與第1培養所使用的相同量，亦可為不同。
再者，分化誘導培養基中，可進一步地含有二甲基亞碸。
第2培養中使用的分化誘導培養基，可使用哺乳類細胞的培養中所使用的基本培養基作為基礎，並且經添加上述成分之一種以上者。基本培養基可使用上述第1培養中所記載者，可為與第1培養中使用者為相同的基本培養基，亦可為不同者。較佳為DMEM培養基，更佳為以上述的量包含丙酮酸鹽、L-丙胺醯基L-麩醯胺酸、及葡萄糖的DMEM培養基。
第2培養的培養期間可從至少6小時，較佳為6至72小時，再佳24小時至72小時的範圍選擇。培養溫度雖無特別限定，以30至40℃(例如，37℃)進行。培養可以2次元培養及3次元培養之任一者進行。再者，培養容器中的二氧化碳濃度例如為5%左右。
具體而言，本發明方法包含以經添加胰島素、活化素A、ROCK阻礙劑、GSK3β阻礙劑的DMEM培養基培養1日或2日(第1培養)，於經添加活化素A的DMEM培養基進一步培養2日或3日(第2培養)。
根據本發明方法，可製造其純度或細胞數為高的胚胎內胚層細胞。亦即，藉由本發明方法所獲得的胚胎內胚層細胞係殘存的多潛能幹細胞或顯示其他系譜細胞之SOX2陽性(SOX2+)細胞的混入率未達5%，較佳為未達1%，更佳為未達0.1%，以高純度含有胚胎內胚層細胞的細胞集團。再者，相對於最初所播種的多潛能幹細胞的細胞數，藉由本發明方法所製造的胚胎內胚層細胞的細胞數更多，例如，與初所播種的多潛能幹細胞的細胞數相比為2倍以上。
所獲得的胚胎內胚層細胞可提供於進一步的分化誘導步驟中，可使用於原腸管細胞、後方前腸細胞、胰臟前驅細胞、內分泌前驅細胞、或產生胰島素的細胞的製造。
3.各種分化階段的細胞的製造方法
所獲得的胚胎內胚層細胞可使用習知的手法分化誘導成為原腸管細胞、後方前腸細胞、胰臟前驅細胞、內分泌前驅細胞、或產生胰島素的細胞。亦即，利用下列分化誘導步驟歷經分化成各細胞而可獲得產生胰島素的細胞等的各種分化階段的細胞：
步驟1)從胚胎內胚層細胞分化誘導成為原腸管細胞；
步驟2)從原腸管細胞分化誘導成為後方前腸細胞；
步驟3)從後方前腸細胞分化誘導成為胰臟前驅細胞；
步驟4)從胰臟前驅細胞分化誘導成為內分泌前驅細胞；
步驟5)從內分泌前驅細胞分化誘導成為產生胰島素的細胞。
以下，說明各步驟，但成為各細胞的分化誘導不限定為該等手法。
步驟1)分化成原腸管細胞
將歷經第2培養所獲得的胚胎內胚層細胞進一步以包含增殖因子的培養基培養而分化誘導成為原腸管細胞。培養期間為2日至8日，較佳為約4日。
培養溫度雖無特別限定，以30至40℃(例如，37℃)進行。再者，培養容器中的二氧化碳濃度例如為5%左右。培養可以2次元培養及3次元培養之任一者進行。
培養基可使用上述第1培養所記載之哺乳類細胞的培養所使用的基本培養基。培養基中除了增殖因子以外，亦可適當地添加血清替代物、維生素、抗生物質等。
增殖因子較佳為EGF、KGF、FGF10，更佳為EGF及/或KGF。
增殖因子的培養基中的濃度，雖根據所使用的增殖因子的種類而適當地設定，通常為約0.1nM至1000μM，較佳為約0.1nM至100μM。 EGF時，其濃度為約5至2000ng/mL(亦即，約0.8至320nM)，較佳為約5至1000ng/mL(亦即，約0.8至160nM)，更佳為約10至1000ng/mL(亦即，約1.6至160nM)。FGF10時，其濃度為約5至2000ng/mL(亦即，約0.3至116nM)，較佳為約10至1000ng/mL(亦即，約0.6至58nM)，更佳為約10至1000ng/mL(亦即，約0.6至58nM)。例如，使用KGF作為增殖因子時的濃度，通常為5至150ng/mL，較佳為30至100ng/mL，特佳為約50ng/mL。
步驟2)分化成後方前腸細胞
將步驟1)所獲得的原腸管細胞進一步以包含增殖因子、環巴胺(cyclopamine)、諾金(noggin)等的培養基培養，分化誘導成為後方前腸細胞。培養期間為1日至5日，較佳為約2日左右。培養可以2次元培養及3次元培養之任一者進行。
環巴胺可置換為屬於SHH阻礙劑之SANT-1((4-苄基-哌嗪-1-基)-(3,5-4甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-基亞甲基)-胺)或Jervine((3β,23β)-17,23-環氧基-3-羥基貝母新鹼(veratraman)-11-酮)。
再者，屬於BMP-4的拮抗劑之諾金可置換為屬於BMP受體抑制劑的LDN193189(4-[6-(4-哌嗪-1-基-苯基)-吡唑并[1,5-α]嘧啶-3-基]-諾金鹽酸鹽)。
培養溫度雖無特別限定，以30至40℃(例如，37℃)進行。再者，培養容器中的二氧化碳濃度例如為5%左右。
培養基可使用上述第1培養所記載之哺乳類細胞的培養所使用的基本培養基。培養基中除了增殖因子以外，亦可適當地添加血清替代物、維生素、抗生物質等。
增殖因子較佳為EGF、KGF、FGF10，更佳為EGF及/或KGF，再佳為KGF。
增殖因子的培養基中的濃度，根據所使用的增殖因子的種類而適當地設定，通常約0.1nM至1000μM，較佳為約0.1nM至100μM。EGF時，其濃度為約5至2000ng/mL(亦即，約0.8至320nM)，較佳為約5至1000ng/mL(亦即，約0.8至160nM)，更佳為約10至1000ng/mL(亦即，約1.6至160nM)。FGF10時，其濃度為約5至2000ng/mL(亦即，約0.3至116nM)，較佳為約10至1000ng/mL(亦即，約0.6至58nM)，更佳為約10至1000ng/mL(亦即，約0.6至58nM)。例如使用KGF作為增殖因子時的濃度，通常為5至150ng/mL，較佳為30至100ng/mL，特佳為約50ng/mL。
環巴胺的培養基中的濃度，雖無特別限定，通常為0.5至1.5μM，較佳為0.3至1.0μM，特佳為約0.5μM。
諾金的培養基中的濃度，雖無特別限定，通常為10至200ng/mL，較佳為50至150ng/mL，特佳為約100ng/mL。
根據本發明方法，可製造其純度或細胞數為高的後方前腸細胞。亦即，經由藉由本發明方法所製造的胚胎內胚層細胞而製造的後方前腸細胞係以90%以上，較佳為95%以上，更佳為98%以上的比例包含PDX1陽性(PDX1+)細胞，以高純度包含後方前腸細胞的細胞集團。再者，相對於最初所播種的多潛能幹細胞的細胞數，藉由本發明方法所製造的後方前腸細胞的細胞數更多，例如與初所播種的多潛能幹細胞的細胞數相比為2倍或以上。
步驟3)分化成胰臟前驅細胞
將步驟2)所獲得的後方前腸細胞進一步以包含具有CDK8/19阻礙活性的因子的培養基，較佳為包含具有CDK8/19阻礙活性與增殖因子的培養基培養，分化誘導成為胰臟前驅細胞。培養期間為2日至10日，較佳為約5日左右。
培養可以2次元培養及3次元培養之任一者進行。2次元培養時，將步驟2)所獲得的後方前腸細胞根據先前技術(Toyoda et al.,Stem cell Research(2015)14，185-197)，以0.25%胰蛋白酶-EDTA處理後藉由移液(Pipetting)分散，利用離心分離去除0.25%胰蛋白酶-EDTA後，於步驟3)的新培養基中進行懸浮、再播種。
培養基可使用上述第1培養所記載之哺乳類細胞的培養所使用的基本培養基。培養基中除了增殖因子以外，亦可適當地添加血清替代物、維生素、抗生物質等。
具有CDK8/19阻礙活性的因子可使用前述各種化合物或其鹽，根據所使用的化合物或其鹽，適當地決定對培養基的添加量，通常約0.00001μM-5μM，較佳為0.00001μM-1μM。具有CDK8/19阻礙活性的因子的培養基中的濃度，較佳為對於CDK8/19達成50%以上的阻礙活性的濃度。
增殖因子較佳為EGF、KGF、FGF10，更佳為KGF及/或EGF，再佳為KGF及EGF。
增殖因子的培養基中的濃度，根據所使用的增殖因子的種類而適當地設定，通常約0.1nM至1000μM，較佳為約0.1nM至100μM。EGF時，其濃度為約5至2000ng/mL(亦即，約0.8至320nM)，較佳為約5至1000ng/mL(亦即，約0.8至160nM)，更佳為約10至1000ng/mL(亦即，約1.6至160nM)。FGF10時，其濃度為約5至2000ng/mL(亦即，約0.3至116nM)，較佳為約10至1000ng/mL(亦即，約0.6至58nM)，更佳為約10至1000ng/mL(亦即，約0.6至58nM)。例如，使用KGF及EGF作為增殖因子時的濃度，EGF通常為5至150ng/mL，較佳為30至100ng/mL，特佳為約50ng/mL，KGF通常為10至200ng/mL，較佳為50至150ng/mL，特佳為約100ng/mL。
步驟3)中之培養的最初1日係於ROCK阻礙劑的存在下進行，以後亦可以不包含ROCK阻礙劑的培養基培養。
再者，培養基中亦可包含PKC活化劑。PKC活化劑，使用PdBU(PKC activator II)、TPB(PKC activator V)等，但不限定於該等。PKC活化劑的濃度以約0.1至100ng/mL，較佳為約1至50ng/mL，更佳為約 3至10ng/mL添加。再者，培養基中亦可添加二甲基亞碸、活化素(1至50ng/mL)。
任一步驟中，培養基中除了上述成分以外，亦可添加血清替代物。再者，因應所需，亦可添加胺基酸、L-麩醯胺酸、GlutaMAX(製品名)、非必須胺基酸、維生素、菸鹼醯胺、抗生物質(例如，抗生素-抗真菌素(Antibiotic-Antimycotic)(本說明書中，亦有稱為AA的情況)、青黴素、鏈黴素、或該等的混合物)、抗菌劑(例如，兩性黴素B)、抗氧化劑、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類等。培養基中添加抗生物質時，其培養基中的濃度通常為0.01至20重量%，較佳為0.1至10重量%。
再者，細胞培養亦可不使用餵養細胞進行接著培養。培養時，使用培養皿、燒瓶、微孔盤、OptiCell(製品名)(Nunc公司)等的細胞培養片等培養容器。培養容器較佳進行用以提升與細胞的接著性(親水性)的表面處理，或以膠原蛋白、明膠、聚L-離胺酸、聚-D-離胺酸、層黏連蛋白、纖連蛋白、基質膠(例如，BD基質膠(日本Becton Dickinson公司))、波連蛋白等細胞接著用基質被覆。培養容器較佳為經第I型膠原蛋白、基質膠、纖連蛋白、玻連蛋白或聚-D-離胺酸等被覆的培養容器，更佳為經基質膠或聚-D-離胺酸被覆的培養容器。
培養溫度雖無特別限定，以30至40℃(例如，37℃)進行。再者，培養容器中的二氧化碳濃度例如為5%左右。
步驟3)所獲得的胰臟前驅細胞，可利用習知的表面標記之糖蛋白質2(GP2)等進一步地純化。上述純化可使用本身習知的方法，例如，使用固定化有抗GP2抗體的珠粒進行。
根據本發明方法，可製造其純度或細胞數為高的胰臟前驅細胞。亦即，經由藉由本發明方法所製造的胚胎內胚層細胞而製造的胰臟前驅細胞係以80%以上，較佳為85%以上，更佳為90%以上的比例包含PDX1陽性(PDX1+)且NKX6.1陽性(NKX6.1+)的細胞，以高純度包含胰臟前驅細胞的細胞集團。再者，相對於最初所播種的多潛能幹細胞的細胞數，根據本發明方法所製造的胰臟前驅細胞的細胞數更多，例如與最初所播種的多潛能幹細胞的細胞數相比為2倍以上。
步驟4)分化成內分泌前驅細胞
將步驟3)所獲得的胰臟前驅細胞進一步以包含增殖因子的培養基培養而分化誘導成為內分泌前驅細胞。培養可以2次元培養及3次元培養之任一者進行。2次元培養時，步驟3)所獲得的胰臟前驅細胞，以0.25%胰蛋白酶-EDTA處理後經由移液分散，利用離心去除0.25%胰蛋白酶-EDTA後，於步驟4)的新培養基進行懸浮、再播種。培養期間為2日至3日，較佳為約2日。
培養基可使用上述第1培養所記載之哺乳類細胞的培養所使用的基本培養基。培養基亦可根據先前技術(Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133)，添加SANT1、維生素A酸、ALK5抑制劑II、T3、LDN，進一步適當地添加WNt阻礙藥、ROCK阻礙劑、FGF(較佳為FGF2)、血清替代物、維生素、抗生物質等。再者，培養基中亦可添加二甲基亞碸。
再者，細胞培養亦可不使用餵養細胞，進行非接著培養。培養時，使用培養皿、燒瓶、微孔盤、多孔盤(Nunc公司)等或生物反應器。培養容器較佳係進行用以降低與細胞的接著性的表面處理。
培養溫度雖無特別限定，以30至40℃(例如，37℃)進行。再者，培養容器中的二氧化碳濃度例如為5%左右。
步驟5)分化成產生胰島素的細胞
將步驟4)所獲得的內分泌前驅細胞進一步以包含增殖因子的培養基培養而分化誘導成為產生胰島素的細胞。培養期間為10日至30日，較佳為約10至20日。
培養基可使用上述第1培養所記載之哺乳類細胞的培養所使用的基本培養基。培養基中，亦可根據先前技術(Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133)，添加ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶阻礙劑XX、γ-分泌酶阻礙劑RO、N-半胱胺酸、AXL抑制劑、抗壞血酸，進一步適當地添加、WNt阻礙藥、ROCK阻礙劑、FGF(較佳為FGF2)、血清替代物、維生素、抗生物質等。例如，培養基中可添加ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶阻礙劑RO、及抗壞血酸，或亦可添加T3、ALK5抑制劑II、ZnSO4、肝素、N-乙醯基半胱胺酸、Trolox、及R428。
培養可以2次元培養及3次元培養之任一者進行。再者，細胞培養亦可不使用餵養細胞，進行非接著培養。培養時，使用培養皿、燒瓶、微孔盤、多孔盤(Nunc公司)等或生物反應器。培養容器，較佳係進行用以降低與細胞的接著性的表面處理。
培養溫度雖無特別限定，以30至40℃(例如，37℃)進行。再者，培養容器中的二氧化碳濃度例如為5%左右。
4.分化成胰臟β細胞
上述步驟所獲得的產生胰島素的細胞係可藉由移植至動物活體內而分化誘導成為胰臟β細胞。
「動物」較佳為哺乳動物，可列舉例如：人類、非人類靈長類、豬、牛、馬、羊、山羊、駱馬、犬、貓、兔、小鼠、天竺鼠等較佳為人類。
移植較佳係於可將細胞固定於固定位置的活體內區域進行，例如，可於動物的皮下、腹腔內、腹膜上皮、大網膜、脂肪組織、肌肉組織或胰臟、腎臟等各臟器的被膜下等進行。移植的細胞數可根據所移植細胞的分化階段，或移植對象的年齡、體重、移植部位的大小、疾病嚴重度等重要因子而變化，雖無特別限定，例如，可為10×104細胞至10×1011個左右。經移植的細胞可於活體內環境被分化誘導，而分化成為目標細胞，較佳為胰臟β細胞。所獲得的胰臟β細胞，之後可回收，亦可將其直接留置於活體內。
藉由上述手法所獲得的產生胰島素的細胞或胰臟β細胞，以其原樣或進行膠囊化後移植至患部，有用於作為用以治療糖尿病，特別是第I型糖尿病的細胞醫藥。
再者，產生胰島素的細胞或胰臟β細胞亦可為前藥。前藥意指移植於活體內後進行分化，而變化成具有治療疾病功能的細胞。
藉由上述手法所獲得的產生胰島素的細胞或胰臟β細胞係毒性(例如，急性毒性、慢性毒性、遺傳毒性、生殖毒性、心毒性、癌原性)低，藉由直接或與藥理上容許的單體等混合作成醫藥組成物，而可對哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、倉鼠、兔、貓、犬、牛、羊、猴、人類)安全地投予。
以下，藉由實施例說明本發明，但本發明不是限定為該等實施例者。
[實施例]
從多潛能幹細胞成為胚胎內胚層細胞、後方前腸細胞、胰臟前驅細胞等的分化誘導係根據上述第1培養及第2培養，以及先前技術(Stem Cell Research(2015)14、185-197)所記載的方法等實施。
B-27補充劑(INS(+))或B-27補充劑(INS(-))(Thermo Fisher Scientific)的添加量係根據製造商的指示，以最終濃度成為2%的方式進行(第0至3日)。第4日以後使最終濃度成為1%之方式進行。
[I]包含從INS(+)培養基變更為INS(-)培養基之成為胚胎內胚層細胞的分化誘導(2次元培養)
(1)方法
(i)細胞
利用屬於誘導性多潛能幹細胞株之Ff-I01s04株、或Ff-I14s03株作為多潛能幹細胞。
(II)分化誘導培養基與培養排程
於包含100ng/mL的活化素A及3μM的CHIR99021的基本培養基(RPMI培養基(RPMI 1640培養基(Thermo Fisher Scientific)))中，進一步地添加B-27補充劑(INS(+))或B-27補充劑(INS(-))(Thermo Fisher Scientific)作為分化誘導培養基。
將細胞播種(第0日)，使用包含胰島素或不包含胰島素的分化誘導培養基，按照表1記載的排程進行培養，而分化誘導成為胚胎內胚層細胞。
[表1]分化培養基中之胰島素的有無與培養排程
Figure 108127557-A0202-12-0035-1
(2)結果
最初(第0日至第1日)利用含有胰島素的分化誘導培養基進行培養，接著(第2日至第3日)利用不含有胰島素的分化誘導培養基進行的情況(實施例)，與僅利用含有胰島素的分化誘導培養基培養的情況(比較例)相比，確認到SOX2+細胞(殘存未分化細胞或表示其他系譜細胞)的比例減少(Ff-I01s04株：比較例：2.1%，實施例：0.8%；Ff-I14s03株：比較例：2.6%，實施例：0.8%)(第1圖)。
從該結果可知，從多潛能幹細胞成為胚胎內胚層細胞的分化誘導中，藉由將分化誘導培養基從INS(+)培養基變更成INS(-)培養基， 確認可使SOX2+細胞的比例減少，可製造以高純度含有胚胎內胚層細胞的細胞集團。
[II]包含從INS(+)培養基變更成INS(-)培養基之成為胚胎內胚層細胞、後方前腸細胞、及胰臟前驅細胞的分化誘導
(1)方法
上述「I」所記載的培養方法中，使用屬於誘導性多潛能幹細胞株之Ff-MH15s02株作為多潛能幹細胞，使用RPMI培養基或DMEM培養基(DMEM，high glucose，GlutaMAXTM，Pyruvate(Thermo Fisher Scientific))作為基本培養基。於基礎培養基使用RPMI培養基時，第0日至第3日利用含有胰島素的分化誘導培養基進行培養。於基礎培養基使用DMEM培養基時，最初(第0日)利用含有胰島素的分化誘導培養基進行培養，接著(第1日至第3日)利用不含有胰島素的胰島素分化誘導培養基進行培養。多潛能幹細胞係以200×104cells/well(約21萬細胞個/cm2)或250×104cells/well(約26萬細胞個/cm2)的量播種。除此之外，與上述「實施例」同樣的手法進行成為胚胎內胚層細胞的分化誘導。
再者，所獲得的胚胎內胚層細胞進一步進行成為後方前腸細胞、及胰臟前驅細胞的分化誘導。
(2)結果
使用DMEM培養基作為基本培養基，從INS(+)培養基變更成INS(-)培養基的情況，任一者的播種細胞數中，與使用RPMI培養基且含有胰島素進行培養的情況相比，確認SOX2+細胞的比例減少(DMEM培養基：4.8%，3.1%；RPMI培養基：11.7%，5.1%)(第2圖)。然後，所獲得的胚 胎內胚層細胞進一步地分化誘導至後方前腸細胞時，PDX1+細胞的比例超過90%，再者，分化誘導至胰臟前驅細胞時，PDX1+/NKX6.1+細胞得比例超過80%，與第0日至第3日利用含有胰島素的分化誘導培養基進行培養的情況相比，確認可有效率地分化誘導(第2圖)。
從該結果可知，從多潛能幹細胞成為胚胎內胚層細胞的分化誘導中，藉由將DMEM培養基作為基本培養基，從INS(+)培養基變更成INS(-)培養基，可使SOX2+細胞的比例減少，藉由進一步地分化誘導所獲得的胚胎內胚層細胞，確認可製造以高純度包含後方前腸細胞、及胰臟前驅細胞的細胞。再者，Ff-MH15s02株於先前技術(Stem Cell Research(2015)14、185-197)的手法中為分化效率不高的細胞株，確認即使為該等細胞株亦可藉由本手法高效率地分化誘導。
[III]僅使用INS(-)培養基之成為胚胎內胚層細胞的分化誘導
(1)方法
上述「II」記載的培養方法中，除了使用Ff-I01s04株作為多潛能幹細胞，使用任一基本培養基的情況中僅使用加入B-27補充劑(INS(-))的分化誘導培養基的培養進行，以及播種細胞數為70×104cells/well(約7萬細胞個/cm2)以外，以相同手法進行成為胚胎內胚層細胞的分化誘導(亦即，僅以不含有胰島素的分化誘導培養基進行培養)。
再者，所獲得的胚胎內胚層細胞，進一步地分化誘導至後方前腸細胞。
(2)結果
使用RPMI培養基作為基本培養基的情況，所獲得的SOX2+細胞的比例雖為0.6%，但PDX1+細胞的比例顯示17.7%的低值。再者，培養後(第3日時間點)所獲得的細胞數減少至10×104cells/well(約1萬細胞個/cm2)。
再者，使用DMEM培養基作為基本培養基的情況，所獲得的SOX2+細胞的比例顯示6.7%的高值，而PDX1+細胞的比例為67.9%。培養後(第3日時間點)所獲得的細胞數為129×104cells/well(約13萬細胞個/cm2)。
從該結果可知，僅使用不含有胰島素的分化誘導培養基進行成為胚胎內胚層細胞的分化誘導時，根據培養基而有不同結果，但細胞數的增加皆受到抑制，確認為無法獲得充分數目的分化細胞的情況，或者殘存多潛能幹細胞或表示其他系譜細胞的SOX2陽性(SOX2+)細胞的混入率變高。
[IV]包含從INS(+)培養基變更成為INS(-)培養基之成為胚胎內胚層細胞的分化誘導(3次元培養)
關於上述之其效果經確認的包含從INS(+)培養基變更成INS(-)培養基之胚胎內胚層細胞的分化誘導方法，係如下述般確認即使於使用生物反應器的3次元培養法中亦有效。
(1)方法
利用誘導性多潛能幹細胞株之Ff-I14s04株作為多潛能幹細胞。
細胞以10萬細胞個/mL的量播種於經添加Y-27632(10μM)的再生醫療用培養基(StemFIt(註冊商標)(AJINOMOTO HEALTHY SUPPLY公 司))10mL，於30mL反應器內以70rpm的迴轉數培養24小時後，追加StemFit(註冊商標)20mL，進一步地培養48小時。
其次，上述培養後獲得的細胞塊於含有分化誘導培養基(30mL)的30mL反應器內以40rpm的迴轉數培養24小時(第0日)，該分化誘導培養基係於包含100ng/mL的活化素A及3μM的CHIR99021的RPMI培養基或DMEM培養基中進一步加入有B-27補充劑(INS(+))的。
其次，上述培養後獲得的細胞塊於含有包含100ng/mL的活化素A及B-27補充劑(INS(+))的RPMI培養基或包含100ng/mL的活化素A及B-27補充劑(INS(-))的DMEM培養基(分別為30mL)的30mL反應器內以40rpm的迴轉數培養48小時(第1日至第2日)，獲得胚胎內胚層細胞。
再者，針對所獲得的胚胎內胚層細胞，交換分化誘導培養基，藉由3次元培養進一步地進行分化誘導。
(2)結果
關於3次元培養中從多潛能幹細胞成為胚胎內胚層細胞的分化誘導，於僅使用包含胰島素的RPMI培養基進行培養的情況，所獲得的細胞塊的SOX2+細胞的比例顯示為6.5%，與藉由使用最初於包含胰島素的DMEM培養基、之後於不包含胰島素的DMEM培養基培養所獲得的細胞塊的值(0.4%)相比，顯示較高值(第3圖)。
然後，僅使用包含胰島素的RPMI培養基進行培養所獲得的細胞塊經分化誘導至後方前腸細胞的情況，所獲得的細胞塊為PDX1+細胞的比例為20%左右的少，確認係經由細胞塊的崩解造成細胞數的減少(第 4圖)。另一方面，將藉由使用最初於包含胰島素的DMEM培養基、之後於不包含胰島素的DMEM培養基的培養而獲得的細胞塊分化誘導至後方前腸細胞的情況，所獲得的細胞塊為PDX1+細胞的比例為超過90%的高(第3圖)，無法確認細胞數的減少(第4圖)。
從該結果可知，包含從INS(+)培養基變更成INS(-)培養基之胚胎內胚層細胞的分化誘導方法，係在使用生物反應器的3次元培養法中亦有效，表示可以工業規模大量地生產從多潛能幹細胞成為胚胎內胚層細胞或其後的分化細胞。

Claims (16)

  1. 一種從多潛能幹細胞製造胚胎內胚層細胞的方法，該方法包含：
    將多潛能幹細胞於胰島素會作用的條件下的分化誘導培養基中進行第1培養，接著，於胰島素不會作用的條件下的分化誘導培養基中進行第2培養。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，
    第1培養係於包含胰島素的分化誘導培養基中進行，
    第2培養係於不包含胰島素的分化誘導培養基中進行。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，
    第1培養係於包含胰島素且不包含胰島素信號阻礙劑的分化誘導培養基中進行，
    第2培養係於包含胰島素及胰島素信號阻礙劑的分化誘導培養基中進行。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之方法，其中，進行第1培養及第2培養的分化誘導培養基中，進一步地包含丙酮酸鹽。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之方法，其中，進行第1培養及第2培養的分化誘導培養基中，進一步地包含L-丙胺醯基L-麩醯胺酸。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之方法，其中，進行第1培養及第2培養的分化誘導培養基中，進一步地包含15mM以上的葡萄糖。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之方法，其包含進行6小時至48小時的第1培養。
  8. 如申請專利範圍第1至7項中任一項所述之方法，其包含至少進行6小時的第2培養。
  9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項所述之方法，其係於3次元培養系實施。
  10. 如申請專利範圍第1至8項中任一項所述之方法，其係於2次元培養系實施。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中，第1培養的開始時，包含15萬至30萬細胞個/cm2之多潛能幹細胞。
  12. 如申請專利範圍第1至11項中任一項所述之方法，其中，分化誘導培養基係以DMEM(杜貝可改良伊格培養基)為基礎。
  13. 如申請專利範圍第1至12項中任一項所述之方法，其中，第1培養的分化誘導培養基係包含ROCK阻礙劑及/或GSK3β阻礙劑。
  14. 一種產生胰島素的細胞之製造方法，該製造方法包含：將藉由將多潛能幹細胞於胰島素會作用的條件下的分化誘導培養基中進行第1培養，接著，於胰島素不會作用的條件下的分化誘導培養基中進行第2培養而製造的胚胎內胚層細胞，進一步進行分化誘導的步驟。
  15. 一種產生胰島素的細胞之製造方法，該製造方法包含：將藉由將多潛能幹細胞於包含胰島素的分化誘導培養基中進行第1培養，接著，於不包含胰島素的分化誘導培養基中進行第2培養而製造的胚胎內胚層細胞，進一步進行分化誘導的步驟。
  16. 一種產生胰島素的細胞之製造方法，該製造方法包含：將藉由將多潛能幹細胞於包含胰島素且不包含胰島素信號阻礙劑的分化誘導培養基中進行第1培養，接著，於包含胰島素及胰島素信號阻礙劑的分化誘 導培養基中進行第2培養而製造的胚胎內胚層細胞，進一步進行分化誘導的步驟。
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