JPWO2020027316A1 - 細胞製造法 - Google Patents

Abstract

本発明は、多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞や、インスリン産生細胞を効率的に誘導・製造することを可能とする新たな手法を提供することを目的とする。多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞を製造する方法であって、多能性幹細胞を、インスリンが作用する条件下の分化誘導培地中で第１の培養を行い、続いて、インスリンが作用しない条件下の分化誘導培地中で第２の培養を行うことを含む方法。

Description

本発明は、多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞や、インスリン産生細胞を効率的に誘導・製造することを可能とする、多能性幹細胞の分化誘導方法に関する。
［発明の背景］

人工多能性細胞や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の多能性幹細胞から、インスリン産生細胞や膵β細胞といったインスリン分泌細胞を分化誘導し、糖尿病の治療に応用する研究が進められている。多能性幹細胞を分化誘導すると、分化段階に応じて異なる特徴を有する細胞が出現することが知られている（ＷＯ２００９／０１２４２８、ＷＯ２０１６／０２１７３４）。例えば、この分化段階は比較的未分化な順に、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、後方前腸細胞、膵前駆細胞、内分泌前駆細胞、インスリン産生細胞、膵β細胞に大きく分類することができる。

これまでに各分化段階にある細胞を誘導・製造する方法が研究され、報告されている。例えば、非特許文献１には、多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞への分化誘導に関し、培養培地への血清代替物であるＢ−２７サプリメント又はＢ−２７サプリメント（ＩＮＳ（−））の添加、ならびにホスホイノシタイド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤であるＬＹ２９４００２の添加による影響を調べたところ、Ｂ−２７サプリメント（ＩＮＳ（−））を添加した場合に胚体内胚葉細胞を最も効率的に誘導できたことが記載されている。

また、非特許文献２には、多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞への分化誘導に関し、ＬＹ２９４００２を２０μＭで含む培養培地を用いて１日培養を行った後、ＬＹ２９４００２を１０μＭで含む培養培地を用いて２日培養を行うことによって、胚体内胚葉細胞のマーカーが高発現したことが記載されている。

さらに、非特許文献３には、ＥＳ細胞から膵前駆細胞を製造する方法について記載され、その中でＥＳ細胞から胚体内胚葉細胞への分化誘導に関し、インスリン−トランスフェリン−セレニウムを添加した培養培地を用いたことが記載されている。

しかしながら、従来の方法で製造された胚体内胚葉細胞は、その細胞数や純度が充分に高いものであるとはいえず、当該分野においては依然として、多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞や、インスリン産生細胞を効率的に誘導・製造する方法が切望されていた。

ＷＯ２００９／０１２４２８ ＷＯ２０１６／０２１７３４

Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，４４，１１２７−１１２９（２０１２） Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１５ Ｍａｙ ２２；６：７２１２ ＰＬｏＳ ＯＮＥ Ｍａｙ ２０１２，Ｖｏｌｕｍｅ ７，Ｉｓｓｕｅ ５，ｅ３７００４

本発明は、多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞や、インスリン産生細胞を効率的に誘導・製造することを可能とする新たな手法を提供することを目的とする。

本発明者らは、多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞へと分化誘導する際に、インスリンを継続的に作用させると、得られた細胞には胚体内胚葉細胞以外の細胞が多く含まれることを見出した。一方、多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞へと分化誘導する際に、インスリンを作用させない場合には、細胞数が増加せず、十分な数の胚体内胚葉細胞を得ることができないことを見出した。

本発明者らは、これらの課題を解決すべく鋭意検討した結果、多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞へと分化誘導する際に、インスリンが作用する条件下の分化誘導培地中で第１の培養を行い、続いて、インスリンが作用しない条件下の分化誘導培地中で第２の培養を行うことにより、インスリンを継続的に作用させる又はインスリンを作用させない場合と比べて、胚体内胚葉細胞を高い純度で製造することができ、かつ細胞数を増加させることが可能であることを見出した。また、得られた胚体内胚葉細胞からは、高い純度でさらなる分化細胞を製造できることを見出した。

本発明は、これらの新規知見に基づくものであり、以下の発明を包含する。
［１］ 多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞を製造する方法であって、
多能性幹細胞を、インスリンが作用する条件下の分化誘導培地中で第１の培養を行い、続いて、インスリンが作用しない条件下の分化誘導培地中で第２の培養を行うこと
を含む方法。
［２］ 第１の培養がインスリンを含む分化誘導培地中で行われ、
第２の培養がインスリンを含まない分化誘導培地中で行われる、［１］の方法。
［３］ 第１の培養がインスリンを含み、かつインスリンシグナル阻害剤は含まない分化誘導培地中で行われ、
第２の培養がインスリン及びインスリンシグナル阻害剤を含む分化誘導培地中で行われる、［１］の方法。
［４］ 第１の培養および第２の培養を行う分化誘導培地中に、さらに、ピルビン酸塩を含む、［１］〜［３］のいずれかの方法。
［５］ 第１の培養および第２の培養を行う分化誘導培地中に、さらに、Ｌ−アラニルＬ−グルタミンを含む、［１］〜［４］のいずれかの方法。
［６］ 第１の培養および第２の培養を行う分化誘導培地中に、さらに、１５ｍＭ以上のグルコースを含む、［１］〜［５］のいずれかの方法。
［７］ 第１の培養を６時間〜４８時間行うことを含む、［１］〜［６］のいずれかの方法。
［８］ 第２の培養を少なくとも６時間行うことを含む、［１］〜［７］のいずれかの方法。
［９］ ３次元培養系にて実施する、［１］〜［８］のいずれかの方法。
［１０］ ２次元培養系にて実施する、［１］〜［８］のいずれかの方法。
［１０Ａ］第１の培養の開始時において、多能性幹細胞が１万〜１００万細胞個／ｍＬ含まれる、［９］の方法。
［１０Ｂ］ 第１の培養の開始時において、多能性幹細胞が１０万〜５０万細胞個／ｍＬ含まれる、［９］の方法。
［１０Ｃ］ 第１の培養の開始時において、多能性幹細胞が５万〜１００万細胞個／ｃｍ^２含まれる、［１０］の方法。
［１１］ 第１の培養の開始時において、多能性幹細胞が１５万〜３０万細胞個／ｃｍ^２含まれる、［１０］の方法。
［１２］ 分化誘導培地が、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）をベースとする、［１］〜［１１］のいずれかの方法。
［１３］ 第１の培養の分化誘導培地がＲＯＣＫ阻害剤及び／又はＧＳＫ３β阻害剤を含む、［１］〜［１２］のいずれかの方法。
［１４］ 多能性幹細胞をインスリンが作用する条件下の分化誘導培地中で第１の培養を行い、続いて、インスリンが作用しない条件下の分化誘導培地中で第２の培養を行うことにより製造された胚体内胚葉細胞を、さらに分化誘導する工程を含む、インスリン産生細胞の製造方法。
［１５］ 多能性幹細胞をインスリンを含む分化誘導培地中で第１の培養を行い、続いて、インスリンを含まない分化誘導培地中で第２の培養を行うことにより製造された胚体内胚葉細胞を、さらに分化誘導する工程を含む、インスリン産生細胞の製造方法。
［１６］ 多能性幹細胞をインスリンを含み、かつインスリンシグナル阻害剤を含まない分化誘導培地中で第１の培養を行い、続いて、インスリン及びインスリンシグナル阻害剤を含む分化誘導培地中で第２の培養を行うことにより製造された胚体内胚葉細胞を、さらに分化誘導する工程を含む、インスリン産生細胞の製造方法。
［１７］［１］の方法で製造される、胚体内胚葉細胞。
［１８］［１４］〜［１６］のいずれかの方法で製造される、インスリン産生細胞。
［１９］［１８］のインスリン産生細胞を含む医薬。
［２０］ＳＯＸ２陽性（ＳＯＸ２＋）細胞の混入率が５％未満の胚体内胚葉細胞を製造する、［１］〜［１３］のいずれかの方法。
［２１］製造された胚体内胚葉細胞の細胞数が、最初に播種された多能性幹細胞の細胞数よりも２倍以上となる、［１］〜［１３］、［２０］のいずれかの方法。
［２２］ ［１］〜［１３］、［２０］、［２１］のいずれかの方法により製造された胚体内胚葉細胞を、後方前腸細胞へと分化誘導する工程を含む、後方前腸細胞の製造方法。
［２３］ 製造された後方前腸細胞が、９０％以上のＰＤＸ１陽性（ＰＤＸ１＋）細胞を含む、［２２］の方法。
［２４］ 製造された後方前腸細胞の細胞数が、最初に播種された多能性幹細胞の細胞数よりも２倍以上となる、［２２］又は［２３］の方法。
［２５］ ［１］〜［１３］、［２０］、［２１］のいずれかの方法により製造された胚体内胚葉細胞を、膵前駆細胞へと分化誘導する工程を含む、膵前駆細胞の製造方法。
［２６］ 製造された膵前駆細胞が、８０％以上のＰＤＸ１陽性（ＰＤＸ１＋）かつＮＫＸ６．１陽性（ＮＫＸ６．１＋）細胞を含む、［２５］の方法。
［２７］ 製造された膵前駆細胞の細胞数が、最初に播種された多能性幹細胞の細胞数よりも２倍以上となる、［２５］又は［２６］の方法。
［２８］［１］〜［１３］、［２０］、［２１］のいずれかの方法で製造される、ＳＯＸ２陽性（ＳＯＸ２＋）細胞の混入率が５％未満の胚体内胚葉細胞。
［２９］ ［２２］〜［２４］のいずれかの方法で製造される、９０％以上のＰＤＸ１陽性（ＰＤＸ１＋）細胞を含む後方前腸細胞。
［３０］［２５］〜［２７］のいずれかの方法で製造される、８０％以上のＰＤＸ１陽性（ＰＤＸ１＋）かつＮＫＸ６．１陽性（ＮＫＸ６．１＋）細胞を含む膵前駆細胞。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１８−１４６６５０号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

本発明によれば、多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞や、インスリン産生細胞を効率的に誘導・製造することを可能とする新たな手法を提供することができる。

図１は、ｉＰＳ細胞（Ｆｆ−Ｉ０１ｓ０４株及びＦｆ−Ｉ１４ｓ０３株）から胚体内胚葉細胞への分化誘導において、まずインスリンを含有する分化誘導培地にて培養を行い、続いてインスリンを含有しない分化誘導培地にて培養を行った場合（インスリン（＋）→（−））と、インスリンを含有する分化誘導培地のみで培養した場合（インスリン（＋））に、得られた細胞におけるＳＯＸ２陽性／陰性、及びＳＯＸ１７陽性／陰性の細胞の割合をフローサイトメーターにより分析した結果を示す。 図２は、ｉＰＳ細胞（Ｆｆ−ＭＨ１５ｓ０２株）から胚体内胚葉細胞への分化誘導において、ＲＰＭＩ培地又はＤＭＥＭ培地を分化誘導培地の基本培地として使用し、基礎培地にＲＰＭＩ培地を使用した場合、ｄａｙ０−ｄａｙ３を通してインスリンを含有する分化誘導培地にて培養し、基礎培地にＤＭＥＭ培地を使用した場合は、最初に（ｄａｙ０）インスリンを含有する分化誘導培地にて培養を行い、続いて（ｄａｙ１−ｄａｙ３）インスリンを含有しない分化誘導培地にて培養を行って得られた細胞におけるＳＯＸ２陽性／陰性、及びＳＯＸ１７陽性／陰性の細胞の割合をフローサイトメーターにより分析した結果、さらに各手法により得られた細胞をさらに分化誘導して得られた細胞（後方前腸細胞及び膵前駆細胞）におけるＰＤＸ１陽性／陰性、及びＮＫＸ６．１陽性／陰性の細胞の割合をフローサイトメーターにより分析した結果を示す。 図３は、ｉＰＳ細胞（Ｆｆ−Ｉ１４ｓ０４株）から胚体内胚葉細胞への分化誘導において、まずインスリンを含有する分化誘導培地にて３次元培養を行い、続いてインスリンを含有しない分化誘導培地にて３次元培養を行った場合（インスリン（＋）→（−））と、インスリンを含有する分化誘導培地のみで３次元培養した場合（インスリン（＋））に、得られた細胞塊におけるＳＯＸ２陽性／陰性、及びＳＯＸ１７陽性／陰性の細胞の割合をフローサイトメーターにより分析した結果、さらに各手法により得られた細胞塊を３次元培養によりさらに分化誘導して得られた細胞塊（後方前腸細胞）におけるＰＤＸ１陽性／陰性、及びＮＫＸ６．１陽性／陰性の細胞の割合をフローサイトメーターにより分析した結果を示す。 図４は、ｉＰＳ細胞（Ｆｆ−Ｉ１４ｓ０４株）から胚体内胚葉細胞への分化誘導において、まずインスリンを含有する分化誘導培地にて３次元培養を行い、続いてインスリンを含有しない分化誘導培地にて３次元培養を行って得られた細胞塊（ＩＮＳ（＋）→ＩＮＳ（−））と、インスリンを含有する分化誘導培地のみで３次元培養を行って得られた細胞塊（ＩＮＳ（＋））とを、さらに３次元培養により分化誘導した場合における、各細胞塊の細胞数の経時変化を示すグラフ図である。

１．用語
以下、本明細書において記載される用語について説明する。

本明細書において、「約」とは、基準値に対してプラス又はマイナスそれぞれ２５％、２０％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％まで変動する値を示す。好ましくは、「約」又は「およそ」という用語は、基準値に対してプラス又はマイナスそれぞれ１５％、１０％、５％、又は１％の範囲を示す。

本明細書において、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ）又はｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、その語句に続く要素の包含を示すがこれに限定されないことを意味する。したがって、その語句に続く要素の包含は示唆するが、他の任意の要素の除外は示唆しない。

本明細書において、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ（ｓ） ｏｆ又はｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」とは、その語句に続くあらゆる要素を包含し、かつ、これに限定されることを意味する。したがって、「〜からなる」という語句は、列挙された要素が要求されるか又は必須であり、他の要素は実質的に存在しないことを示す。

本明細書において、「フィーダー細胞を使用」しないとは、基本的にフィーダー細胞を含まないこと、フィーダー細胞を培養することによってプレコンディショニングした培地などを使用しないことを意味する。したがって、培地中にはフィーダー細胞から分泌される成長因子及びサイトカインなどの物質は含まれない。

なお、「フィーダー細胞」又は「フィーダー」とは、別な種類の細胞と共培養され、その細胞を支持し、成長することができる環境をもたらす細胞を意味する。フィーダー細胞は、それらが支持する細胞とは同じ種由来であっても、異なる種由来であってもよい。例えば、ヒト細胞のフィーダーとして、ヒト皮膚線維芽細胞又はヒト胚性幹細胞を使用してもよいし、マウス胚線維芽細胞の初代培養物、及び不死化マウス胚線維芽細胞を使用してもよい。フィーダー細胞は、放射線照射又はマイトマイシンＣ処理などによって不活性化することができる。

本明細書において、「接着」とは、細胞が容器に付着していること、例えば、細胞が適切な培地の存在下で滅菌プラスチック（又はコーティングされたプラスチック）の細胞培養ディッシュ又はフラスコに付着していることを指す。細胞のなかには、細胞培養容器に接着させなければ培養物中で維持できない、あるいは成長しないものもある。これに対し、非接着性細胞は、容器に接着させることなく培養物中で維持され、増殖できる。

本明細書において、「培養」とは、細胞をインビトロ環境において維持し、成長させ、かつ／又は分化させることを指す。「培養する」とは、組織又は体外で、例えば、細胞培養ディッシュ又はフラスコ中で細胞を持続させ、増殖させ（成長させ）、かつ／又は分化させることを意味する。培養には２次元培養（平面培養）や、３次元培養（浮遊培養）が含まれる。

本明細書において、「富化する（ｅｎｒｉｃｈ）」及び「富化すること（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）」とは、細胞の組成物などの組成物中の特定の構成成分の量を増加させることを指し、「富化された（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）」とは、細胞の組成物、例えば、細胞集団を説明するために使用される場合、特定の構成成分の量が、富化される前の細胞集団におけるそのような構成成分の割合と比較して増加している細胞集団を指す。例えば、細胞集団などの組成物を、標的細胞型に関して富化することができ、したがって、標的細胞型の割合は、富化される前の細胞集団内に存在する標的細胞の割合と比較して増加する。細胞集団は、当技術分野で公知の細胞選択及び選別方法によって、標的細胞型について富化することもできる。細胞集団は、本明細書に記載した特定の選別又は選択プロセスによって富化することもできる。本発明の特定の実施形態では、標的細胞集団を富化する方法により、細胞集団が標的細胞集団に関して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％富化される。

本明細書において、「枯渇する（ｄｅｐｌｅｔｅ）」及び「枯渇すること（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）」とは、細胞もしくは細胞の組成物などの組成物中の特定の構成成分の量を減少させることを指し、「枯渇された（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）」とは、細胞もしくは細胞の組成物、例えば、細胞集団を説明するために使用される場合、特定の構成成分の量が、枯渇される前の細胞集団におけるそのような構成成分の割合と比較して減少している細胞集団を指す。例えば、細胞集団などの組成物を、標的細胞型に関して枯渇させることができ、したがって、標的細胞型の割合は、枯渇される前の細胞集団内に存在する標的細胞の割合と比較して減少する。細胞集団は、当技術分野で公知の細胞選択及び選別方法によって、標的細胞型について枯渇させることもできる。細胞集団は、本明細書に記載した特定の選別又は選択プロセスによって枯渇させることもできる。本発明の特定の実施形態では、標的細胞集団を枯渇させる方法により、細胞集団は標的細胞集団に関して少なくとも５０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％減少（枯渇）している。

本明細書において、「純化する（ｐｕｒｉｆｙ）」及び「純化すること（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、細胞の組成物などの組成物中の不純物を取り除き、特定の構成成分について純粋なものにすることを指し、「純化された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」とは、細胞の組成物、例えば、細胞集団を説明するために使用される場合、不純物の量が、純化される前の細胞集団におけるそのような構成成分の割合と比較して減少し、特定の構成成分の純度が向上している細胞集団を指す。例えば、細胞集団などの組成物を、標的細胞型に関して純化することができ、したがって、標的細胞型の割合は、純化する前の細胞集団内に存在する標的細胞の割合と比較して増加する。細胞集団は、当技術分野で公知の細胞選択及び選別方法によって、標的細胞型について純化させることもできる。細胞集団は、本明細書に記載した特定の選別又は選択プロセスによって純化することもできる。本発明の特定の実施形態では、標的細胞集団を純化する方法により、標的細胞集団の純度は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％になるか、不純物（夾雑細胞を含む）は検出できない程度になりうる。

本明細書において、「マーカー」とは、「マーカータンパク質」、「マーカー遺伝子」など、所定の細胞型により特異的に発現される細胞抗原又はその遺伝子を意味する。好ましくは、マーカーは細胞表面マーカーであり、その場合、生存細胞の濃縮、単離、及び／又は検出が実施可能となる。マーカーは、陽性選択マーカー或いは陰性選択マーカーでありうる。

マーカータンパク質の検出は、当該マーカータンパク質に特異的な抗体を用いた免疫学的アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫染色、フローサイトメトリーを利用して行うことができる。マーカー遺伝子の検出は、当該分野で公知の核酸増幅方法及び／又は核酸検出方法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、バイオチップ等を利用して行うことができる。本明細書中において、マーカータンパク質が「陽性」であるとは、フローサイトメトリーで陽性と検出されることを意味し、「陰性」とは、フローサイトメトリーで検出限界以下であることを意味する。また、マーカー遺伝子が「陽性」であるとは、ＲＴ−ＰＣＲにより検出されることを意味し、「陰性」とはＲＴ−ＰＣＲで検出限界以下であることを意味する。

本明細書において、「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」とは、細胞内のプロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳として定義される。

本明細書において、「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）」とは、種々の異なった形態や機能を持つ組織や細胞に分化でき、３胚葉のどの系統の細胞にも分化し得る能力を意味する。「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）」は、胚盤には分化できず、したがって個体を形成する能力はないという点で、胚盤を含めて、生体のあらゆる組織に分化しうる「全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）」とは区別される。

本明細書において「多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）」とは、複数の限定的な数の系統の細胞へと分化できる能力を意味する。例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞はｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔだが、ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔではない。

本明細書において、「多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」とは、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及びこれと同様の分化多能性、すなわち生体の様々な組織（内胚葉、中胚葉、外胚葉の全て）に分化する能力を潜在的に有する細胞を指す。ＥＳ細胞と同様の分化多能性を有する細胞としては、「人工多能性幹細胞」（本明細書中、「ｉＰＳ細胞」と称することもある）が挙げられる。好ましくは、本発明において、多能性幹細胞とはヒト多能性幹細胞である。

「ＥＳ細胞」としては、マウスＥＳ細胞であれば、ｉｎＧｅｎｉｏｕｓ社、理研等が樹立した各種マウスＥＳ細胞株が利用可能であり、ヒトＥＳ細胞であれば、ＮＩＨ、理研、京都大学、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ社が樹立した各種ヒトＥＳ細胞株が利用可能である。たとえばＥＳ細胞株としては、ＮＩＨのＣＨＢ−１〜ＣＨＢ−１２株、ＲＵＥＳ１株、ＲＵＥＳ２株、ＨＵＥＳ１〜ＨＵＥＳ２８株等、ＷｉｓＣｅｌｌ ＲｅｓｅａｒｃｈのＨ１株、Ｈ９株、理研のＫｈＥＳ−１株、ＫｈＥＳ−２株、ＫｈＥＳ−３株、ＫｈＥＳ−４株、ＫｈＥＳ−５株、ＳＳＥＳ１株、ＳＳＥＳ２株、ＳＳＥＳ３株等を利用することができる。

「人工多能性幹細胞」とは、哺乳動物体細胞又は未分化幹細胞に、特定の因子（核初期化因子）を導入して再プログラミングすることにより得られる細胞を指す。現在、「人工多能性幹細胞」にはさまざまなものがあり、山中らにより、マウス線維芽細胞にＯｃｔ３／４・Ｓｏｘ２・Ｋｌｆ４・ｃ−Ｍｙｃの４因子を導入することにより、樹立されたｉＰＳ細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ．，Ｃｅｌｌ，（２００６）１２６：６６３−６７６）のほか、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入して樹立されたヒト細胞由来のｉＰＳ細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ，（２００７）１３１：８６１−８７２．）、上記４因子導入後、Ｎａｎｏｇの発現を指標として選別し、樹立したＮａｎｏｇ−ｉＰＳ細胞（Ｏｋｉｔａ，Ｋ．，Ｉｃｈｉｓａｋａ，Ｔ．， ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２００７）．Ｎａｔｕｒｅ ４４８，３１３−３１７．）、ｃ−Ｍｙｃを含まない方法で作製されたｉＰＳ細胞（Ｎａｋａｇａｗａ Ｍ，Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，１０１−１０６））、ウイルスフリーで６因子を導入して樹立されたｉＰＳ細胞（Ｏｋｉｔａ Ｋ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１１ Ｍａｙ；８（５）：４０９−１２，Ｏｋｉｔａ Ｋ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．３１（３）：４５８−６６．）も用いることができる。また、Ｔｈｏｍｓｏｎらにより作製されたＯＣＴ３／４・ＳＯＸ２・ＮＡＮＯＧ・ＬＩＮ２８の４因子を導入して樹立された人工多能性幹細胞（Ｙｕ Ｊ．，Ｔｈｏｍｓｏｎ ＪＡ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）３１８：１９１７−１９２０．）、Ｄａｌｅｙらにより作製された人工多能性幹細胞（Ｐａｒｋ ＩＨ，Ｄａｌｅｙ ＧＱ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００７）４５１：１４１−１４６）、桜田らにより作製された人工多能性幹細胞（特開２００８−３０７００７号）等も用いることができる。

このほか、公開されているすべての論文（例えば、Ｓｈｉ Ｙ．，Ｄｉｎｇ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，（２００８）Ｖｏｌ３，Ｉｓｓｕｅ ５，５６８−５７４；、Ｋｉｍ ＪＢ．，Ｓｃｈｏｌｅｒ ＨＲ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（２００８）４５４，６４６−６５０；Ｈｕａｎｇｆｕ Ｄ．，Ｍｅｌｔｏｎ，ＤＡ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，Ｎｏ ７，７９５−７９７）、あるいは特許（例えば、特開２００８−３０７００７号、特開２００８−２８３９７２号、ＵＳ２００８／２３３６６１０、ＵＳ２００９／０４７２６３、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８２２０、ＷＯ２００８／１２４１３３、ＷＯ２００８／１５１０５８、ＷＯ２００９／００６９３０、ＷＯ２００９／００６９９７、ＷＯ２００９／００７８５２）に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。

人工多能性細胞株としては、ＮＩＨ、理化学研究所（理研）、京都大学等が樹立した各種ｉＰＳ細胞株が利用可能である。例えば、ヒトｉＰＳ細胞株であれば、理研のＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−１Ａ株、ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−２Ａ株、ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−１２Ａ株、Ｎｉｐｓ−Ｂ２株、京都大学のＦｆ−ＷＪ−１８株、Ｆｆ−Ｉ０１ｓ０１株、Ｆｆ−Ｉ０１ｓ０２株、Ｆｆ−Ｉ０１ｓ０４株、Ｆｆ−Ｉ０１ｓ０６株、Ｆｆ−Ｉ１４ｓ０３株、Ｆｆ−Ｉ１４ｓ０４株、ＱＨＪＩ０１ｓ０１株、ＱＨＪＩ０１ｓ０４株、ＱＨＪＩ１４ｓ０３株、ＱＨＪＩ１４ｓ０４株、ＲＷＭＨ１５ｓ０２株、Ｆｆ−ＭＨ１５ｓ０２株、２５３Ｇ１株、２０１Ｂ７株、４０９Ｂ２株、４５４Ｅ２株、６０６Ａ１株、６１０Ｂ１株、６４８Ａ１株、ＣＤＩ社のＭｙＣｅｌｌ ｉＰＳ Ｃｅｌｌｓ（２１５２５．１０２．１０Ａ）株、ＭｙＣｅｌｌ ｉＰＳ Ｃｅｌｌｓ（２１５２６．１０１．１０Ａ）株、等が挙げられる。

「胚体内胚葉細胞」は、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＢＭＰ２、ＣＥＲ、及びＣＸＣＲ４の少なくとも一つのマーカーの発現によって特徴付けられる細胞を意味する。

「原腸管細胞」は、ＨＮＦ１Ｂ、及びＨＮＦ４Ａの少なくとも一つのマーカーの発現によって特徴付けられる細胞を意味する。

「後方前腸細胞」は、ＰＤＸ−１、ＨＮＦ６、及びＨＬＸＢ９の少なくとも一つのマーカーの発現によって特徴付けられる細胞を意味する。

「膵前駆細胞」は、ＰＤＸ−１、ＮＫＸ６．１、ＰＴＦ−１α、ＧＡＴＡ４及びＳＯＸ９の少なくとも一つのマーカーの発現によって特徴付けられる細胞を意味する。

「内分泌前駆細胞」は、Ｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ Ａ、ＮｅｕｒｏＤ及びＮＧＮ３の少なくとも一つのマーカーの発現、及び膵関連のホルモン系（例えば、インスリン等）のマーカーが発現していないことによって特徴付けられる細胞を意味する。内分泌前駆細胞は、ＰＡＸ−４、ＮＫＸ２−２、Ｉｓｌｅｔ−１、ＰＤＸ−１、ＰＴＦ−１αなどのマーカーが発現していてもよい。

「インスリン産生細胞」とは、インスリンの発現によって特徴付けられる細胞を意味する。「インスリン産生細胞」は、好ましくはインスリンの発現に加えて、さらにＮＫＸ６．１の発現によって特徴付けることができる。すなわち、「インスリン産生細胞」とはより好ましくは、インスリン及びＮＫＸ６．１の両方のマーカーが発現している細胞を意味する。

「膵β細胞」は、「インスリン産生細胞」より成熟した細胞を意味しており、具体的には、膵β細胞の成熟マーカーであるＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＩＡＰＰの少なくとも一つのマーカーを発現する、あるいはグルコース刺激によるインスリン分泌上昇反応によって特徴付けられる細胞を意味する。

各分化段階にある細胞の製造は、下に詳述する手法により行うことができる。

本明細書において、「細胞」とは特記しない限り、細胞の組成物、すなわち細胞集団を意味する。したがって、「細胞」には特定の細胞だけでなく、一又は複数の別の細胞も含まれ得る。「細胞」における特定の細胞は、富化又は純化することによって、あるいは一又は複数の別の細胞を枯渇することによって高めることができる。

本明細書において、「ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子」とは、ＣＤＫ８／１９の阻害活性を有するあらゆる物質を意味する。同じＣＤＫファミリーの他のタンパク質とは対照的に、ＣＤＫ８は、細胞増殖には必要とされず、ＣＤＫ８の阻害は、通常の条件下では大きな効果はない。ＣＤＫ１９とＣＤＫ８は類似しており、ＣＤＫ８阻害は通常ＣＤＫ１９の阻害も伴う。

「増殖因子」は特定の細胞の分化及び／又は増殖を促す内因性タンパク質である。「増殖因子」としては、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ−２）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフェリン、種々のインターロイキン（例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１８）、種々のコロニー−刺激因子（例えば、顆粒球／マクロファージコロニー−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））、種々のインターフェロン（例えば、ＩＦＮ−γなど）及び幹細胞に対する効果を有する他のサイトカイン、例えば、幹細胞因子（ＳＣＦ）及びエリスロポエチン（Ｅｐｏ）が挙げられる。

本明細書において、「ＲＯＣＫ阻害剤」とは、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ：Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）を阻害する物質を意味し、ＲＯＣＫ ＩとＲＯＣＫ ＩＩのいずれを阻害する物質であってもよい。ＲＯＣＫ阻害剤は、上記の機能を有する限り特に限定されず、例えば、Ｎ−（４−ピリジニル）−４β−［（Ｒ）−１−アミノエチル］シクロヘキサン−１α−カルボアミド（Ｙ−２７６３２と称することもある）、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）、（２Ｓ）−２−メチル−１−［（４−メチル−５−イソキノリニル］スルホニル］ヘキサヒドロ−１Ｈ−１，４−ジアゼピン（Ｈ−１１５２）、４β−［（１Ｒ）−１−アミノエチル］−Ｎ−（４−ピリジル）ベンゼン−１ゼンカルボアミド（Ｗｆ−５３６）、Ｎ−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）−４ＰＥＲ（Ｒ）−１−アミノエチル］シクロヘキサン−１α−カルボアミド（Ｙ−３０１４１）、Ｎ−（３−｛［２−（４−アミノ−１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）−１−エチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−６−イル］オキシ｝フェニル）−４−｛［２−（４−モルホリニル）エチル］−オキシ｝ベンズアミド（ＧＳＫ２６９９６２Ａ）、Ｎ−（６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−６−メチル−２−オキソ−４−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−ピリジン−５−カルボキサミド（ＧＳＫ４２９２８６Ａ）を挙げることができる。ＲＯＣＫ阻害剤はこれらに限定されるものではなく、ＲＯＣＫのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ、ＲＯＣＫに結合する抗体、ドミナントネガティブＲＯＣＫ変異体等もＲＯＣＫ阻害剤として使用することができ、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。

本明細書において、「ＧＳＫ３β阻害剤」とは、ＧＳＫ３β（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β）に対する阻害活性を有する物質である。ＧＳＫ３（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３）は、セリン／スレオニンプロテインキナーゼの一種であり、グリコーゲンの産生やアポトーシス、幹細胞の維持などにかかわる多くのシグナル経路に関与する。ＧＳＫ３にはαとβの２つのアイソフォームが存在する。本発明で用いられる「ＧＳＫ３β阻害剤」は、ＧＳＫ３β阻害活性を有すれば特に限定されず、ＧＳＫ３β阻害活性と合わせてＧＳＫ３α阻害活性を併せ持つ物質であってもよい。

ＧＳＫ３β阻害剤としては、ＣＨＩＲ９８０１４（２−［［２−［（５−ニトロ−６−アミノピリジン−２−イル）アミノ］エチル］アミノ］−４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）ピリミジン）、ＣＨＩＲ９９０２１（６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリル）、ＴＤＺＤ−８（４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン）、ＳＢ２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、ＴＷＳ−１１９（３−［６−（３−アミノフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ］フェノール）、ケンパウロン（Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、１−アザケンパウロン（Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、ＳＢ２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、ＳＢ４１５２８６（３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン） 及びＡＲ−ＡＯ１４４−１８、ＣＴ９９０２１、ＣＴ２００２６、ＢＩＯ、ＢＩＯ−アセトキシム、ピリドカルバゾール−シクロペンタジエニルルテニウム複合体、ＯＴＤＺＴ、アルファ−４−ジブロモアセトフェノン、リチウム等が例示される。ＧＳＫ３βはこれらに限定されるものではなく、ＧＳＫ３βのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ、ＧＳＫ３βに結合する抗体、ドミナントネガティブＧＳＫ３β変異体等もＧＳＫ３β阻害剤として使用することができ、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。

本明細書において「血清代替物」とは、例えば、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｗａｋｏ）、Ｂ−２７サプリメント、Ｎ２−サプリメント、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、インスリン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン（例えば、亜セレン酸ナトリウム））、２−メルカプトエタノール、３’チオールグリセロール又はこれらの混合物（例えば、ＩＴＳ−Ｇ）が挙げられる。血清代替物としては、Ｂ−２７サプリメント、ＫＳＲ、ＳｔｅｍＳｕｒｅ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、ＩＴＳ−Ｇが好ましい。培地に血清代替物を添加する場合の培地中の濃度は０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜２重量％である。本発明においては、血清に代えて「血清代替物」を使用することが好ましい。なお、本明細書において、インスリンを含有するＢ−２７サプリメントを「Ｂ−２７サプリメント（ＩＮＳ（＋））」、またインスリンを含有しないＢ−２７サプリメントを「Ｂ−２７サプリメント（ＩＮＳ（−））」と記載する場合がある。

２．多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞を製造する方法
本発明において胚体内胚葉細胞は、多能性幹細胞を、インスリンが作用する条件下の分化誘導培地中で第１の培養を行い、続いて、インスリンが作用しない条件下の分化誘導培地中で第２の培養を行うことにより製造することができる。

（１）第１の培養
「インスリンが作用する条件」とは、インスリンによって細胞におけるインスリンシグナル伝達経路の活性化を生じる条件を意味する。通常、インスリンは、細胞膜表面上に存在するインスリンレセプターと結合し、レセプターに内在するチロシンキナーゼを活性化させ、インスリンレセプター基質タンパクファミリー（ＩＲＳ：ＩＲＳ−１，２，３）をチロシンリン酸化する。本明細書においては、インスリンとインスリンレセプターとの結合により開始されるこれら一連の反応が生じることを、「インスリンシグナル伝達経路の活性化を生じる」という。

インスリンが作用する条件としては、例えば、分化誘導培地中にインスリンを含む場合が挙げられる。インスリンは、多能性幹細胞におけるインスリンシグナル伝達経路を活性化できるものであればよく、組換え法で製造したものであっても、固相合成法で合成して製造したものであってもよい。インスリンは、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、モルモット等に由来するものを利用することができるが、好ましくはヒトインスリンである。なお、本明細書中、インスリンを「ＩＮＳ」と記載する場合があり、またインスリンが含まれる場合を「ＩＮＳ（＋）」、インスリンが含まれない場合を「ＩＮＳ（−）」と記載する場合がある。

本発明においては、多能性幹細胞におけるインスリンシグナル伝達経路の活性化を生じる限り、インスリン変異体、インスリン誘導体又はインスリンアゴニストも、「インスリン」として用いることができる。「インスリン変異体」とは、インスリンのアミノ酸配列において１〜２０個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつインスリンシグナル伝達経路の活性化を生じることが可能なポリペプチドや、インスリンのアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリンシグナル伝達経路の活性化を生じることが可能なポリペプチドを有するものが挙げられる。アミノ酸配列の比較は公知の手法によって行うことができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等を例えば、デフォルトの設定で用いて実施できる。「インスリン誘導体」とは、インスリン又はインスリン変異体のアミノ酸残基の一部の基が化学的に置換（例えば、α−メチル化、α−ヒドロキシル化）、欠失（例えば、脱アミノ化）、又は修飾（例えば、Ｎ−メチル化）されたアミノ酸配列からなり、かつインスリンシグナル伝達経路の活性化を生じることが可能なポリペプチドまたは同様の作用を有する物質を意味する。「インスリンアゴニスト」とは、インスリンの構造に関係なく、インスリンレセプターと結合してインスリンシグナル伝達経路の活性化を生じることが可能なポリペプチドまたは同様の作用を有する物質を意味する。

第１の培養の分化誘導培地には、インスリンを０．０１〜２０μＭ、好ましくは０．１〜１０μＭ、より好ましくは０．５〜５μＭの量で含めることができる。分化誘導倍地中のインスリンの濃度は、添加したＢ−２７サプリメントに含まれるインスリンの濃度であってもよいが、これに限定されない。

分化誘導培地には、インスリンに加えてさらに、アクチビンＡを含めることができる。アクチビンＡは培地中に、５〜２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０〜１５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３０〜１２０ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬの量で含めることができる。別の態様として、アクチビンＡの培地中の濃度は、約０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１〜５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約３〜１０ｎｇ／ｍｌである。

分化誘導培地にはさらに、ＲＯＣＫ阻害剤、及び／又はＧＳＫ３β阻害剤を含めることができる。ＲＯＣＫ阻害剤の培地中の濃度は、用いるＲＯＣＫ阻害剤の種類によって適宜設定されるが、例えばＲＯＣＫ阻害剤としてＹ−２７６３２を使用する場合の濃度は、通常５〜２０μＭ、好ましくは５〜１５μＭ、特に好ましくは約１０μＭとすることができる。ＧＳＫ３β阻害剤の培地中の濃度は、用いるＧＳＫ３β阻害剤の種類によって適宜設定され、例えばＧＳＫ３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を使用する場合の濃度は、通常２〜５μＭ、好ましくは２〜４μＭ、特に好ましくは約３μＭとすることができる。

分化誘導培地にはさらに、ピルビン酸塩（ナトリウム塩等）、Ｌ−アラニルＬ−グルタミン、及びグルコースからなる群から選択される一以上を含めることができる。ピルビン酸塩は培地中に、１０〜１０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは３０〜５００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５０〜２００ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは約１１０ｍｇ／Ｌの量で含めることができる。Ｌ−アラニルＬ−グルタミンは培地中に、５０〜２０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１００〜１５００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５００〜１０００ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは約８６０ｍｇ／Ｌの量で含めることができる。グルコースは培地中に、１５ｍＭ以上、好ましくは１５〜３０ｍＭ、より好ましくは１５〜２５ｍＭ、特に好ましくは約２５ｍＭの量で含めることができる。分化誘導倍地中のピルビン酸塩、Ｌ−アラニルＬ−グルタミン及びグルコースの濃度は、ＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ，ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ，ＧｌｕｔａＭＡＸ^ＴＭ，ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））またはその他のＤＭＥＭ培地に含まれるピルビン酸塩、Ｌ−アラニルＬ−グルタミン及びグルコースの濃度であってもよいが、これに限定されない。
また、分化誘導培地にはさらに、ジメチルスルホキシドを含めることができる。

分化誘導培地は、哺乳類細胞の培養に使用される基本培地をベースとし上記成分の一又はそれ以上を添加したものを用いることができる。基本培地としては、ＲＰＭＩ培地、ＭＥＭ培地、ｉＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ／１％Ｂ−２７サプリメント／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地、ＭＣＤＢ１３１／１０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ／２０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ／ＮａＨＣＯ_３／ＦＡＦ−ＢＳＡ／ＩＴＳ−Ｘ／Ｇｌｕｔａｍａｘ／アスコルビン酸／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地等を挙げることができるが、好ましくはＤＭＥＭ培地であり、より好ましくはピルビン酸塩、Ｌ−アラニルＬ−グルタミン、及びグルコースを上記の量で含むＤＭＥＭ培地である。

第１の培養の培養期間は６時間〜４８時間、好ましくは１２〜２４時間より選択される範囲とすることができる。培養温度は、特に限定されないが、３０〜４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。培養開始時の細胞数は、特に限定されないが、２次元培養であれば、５万〜１００万細胞個／ｃｍ^２、好ましくは１５万〜３０万細胞個／ｃｍ^２、より好ましくは約２０万細胞個／ｃｍ^２とすることができる。また、培養開始時の細胞数は、特に限定されないが、３次元培養であれば、1万〜１００万細胞個／ｍＬ、好ましくは１０万〜５０万細胞個／ｍＬとすることができる。

（２）第２の培養
「インスリンが作用しない条件」とは、インスリンによる細胞におけるインスリンシグナル伝達経路の活性化が生じない条件を意味する。「細胞におけるインスリンシグナル伝達経路の活性化を生じない」とは、当該インスリンシグナル伝達経路の活性化が全く生じないことを意味するだけでなく、インスリン非存在下における当該インスリンシグナル伝達経路の活性化と比べて有意な差が認められない程度のわずかな活性化しか生じない場合も意味するものである。したがって、「インスリンが作用しない条件」とは、例えば、分化誘導培地中にインスリンが含まれないこと、あるいは、分化誘導培地中にインスリンが含まれる場合であっても、その量が前記有意な差が認められない程度のわずかな活性化しか生じない量で含まれる条件が挙げられる。あるいは、分化誘導培地中にインスリンが含まれる場合であっても、一緒にインスリンシグナル阻害剤を含むことによって、前記インスリンシグナル伝達経路の活性化が生じない場合も意味する。「インスリンシグナル阻害剤」は、インスリンシグナル伝達経路をいずれかの位置で遮断することが可能な成分を意味する。このようなインスリンシグナル阻害剤としては、インスリン、インスリンレセプター、シグナル伝達物質として作用する各種タンパク質等に結合して又は競合し、これら因子が関与する分子間の相互作用を阻害するポリペプチドや化合物等が挙げられる。例えば、このようなインスリンシグナル阻害剤としては、ＰＩ３キナーゼの触媒サブユニットへのＡＴＰ結合を競合阻害するＬＹ２９４００２［２−（４−モルホリニル）−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン］等が挙げられる。インスリンシグナル阻害剤はこれらに限定されるものではなく、インスリン、インスリンレセプター、シグナル伝達物質として作用する各種タンパク質に結合する抗体やそれらのドミナントネガティブ型変異体、ならびにインスリンレセプターやシグナル伝達物質として作用する各種タンパク質のｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ等もインスリンシグナル阻害剤として使用することができる。インスリンシグナル阻害剤は、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。

第２の培養の分化誘導培地には、アクチビンＡを含めることができる。培地中のアクチビンＡの量は上記第１の培養において記載した範囲より選択することができ、第１の培養にて用いられるのと同じ量であってもよいし、異なっていてもよい。

分化誘導培地にはさらに、ＲＯＣＫ阻害剤、及び／又はＧＳＫ３β阻害剤を含めることができる。培地中のＲＯＣＫ阻害剤、及び／又はＧＳＫ３β阻害剤の量は上記第１の培養において記載した範囲より選択することができ、第１の培養にて用いられるのと同じ量であってもよいし、異なっていてもよい。

分化誘導培地にはさらに、ピルビン酸塩、Ｌ−アラニルＬ−グルタミン、及びグルコースからなる群から選択される一以上を含めることができる。培地中のピルビン酸塩、Ｌ−アラニルＬ−グルタミン、及びグルコースの量は上記第１の培養において記載した範囲より選択することができ、第１の培養にて用いられるのと同じ量であってもよいし、異なっていてもよい。
また、分化誘導培地にはさらに、ジメチルスルホキシドを含めることができる。

第２の培養で用いる分化誘導培地培地は、哺乳類細胞の培養に使用される基本培地をベースとし上記成分の一又はそれ以上を添加したものを用いることができる。基本培地としては、上記第１の培養において記載したものを用いることができ、第１の培養にて用いられるものと同じ基本培地であってもよいし、異なっていてもよい。好ましくは、ＤＭＥＭ培地であり、より好ましくはピルビン酸塩、Ｌ−アラニルＬ−グルタミン、及びグルコースを上記の量で含むＤＭＥＭ培地である。

第２の培養の培養期間は少なくとも６時間、好ましくは６〜７２時間、さらに好ましくは２４時間〜７２時間より選択される範囲とすることができる。培養温度は、特に限定されないが、３０〜４０℃（例えば、３７℃）で行う。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。

具体的には本発明方法は、インスリン、アクチビンＡ、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤を添加したＤＭＥＭ培地で１日間又は２日間培養し（第１の培養）、アクチビンＡを添加したＤＭＥＭ培地でさらに２日間又は３日間培養する（第２の培養）ことを含む。

本発明方法よれば、その純度や細胞数が高い胚体内胚葉細胞を製造することができる。すなわち、本発明方法により得られた胚体内胚葉細胞は、残存する多能性幹細胞や他系譜細胞を示すＳＯＸ２陽性（ＳＯＸ２＋）細胞の混入率が５％未満、好ましくは１％未満、より好ましくは０．１％未満であり、胚体内胚葉細胞が高い純度で含まれる細胞集団である。また、本発明方法により製造された胚体内胚葉細胞の細胞数は、最初に播種された多能性幹細胞の細胞数よりも多く、例えば最初に播種された多能性幹細胞の細胞数と比べて２倍、又はそれ以上である。

得られた胚体内胚葉細胞はさらなる分化誘導工程に供することができ、原腸管細胞、後方前腸細胞、膵前駆細胞、内分泌前駆細胞、又はインスリン産生細胞の製造に用いることができる。

３．各種分化段階の細胞の製造方法
得られた胚体内胚葉細胞は、公知の手法を用いて原腸管細胞、後方前腸細胞、膵前駆細胞、内分泌前駆細胞、又はインスリン産生細胞へと分化誘導することができる。すなわち、以下の分化誘導工程を利用して各細胞への分化を経てインスリン産生細胞等の各種分化段階の細胞を得ることができる：
工程１）胚体内胚葉細胞から原腸管細胞へと分化誘導する；
工程２）原腸管細胞から後方前腸細胞へと分化誘導する；
工程３）後方前腸細胞から膵前駆細胞へと分化誘導する；
工程４）膵前駆細胞から内分泌前駆細胞へと分化誘導する；
工程５）内分泌前駆細胞からインスリン産生細胞へと分化誘導する。
以下、各工程を説明するが、各細胞への分化誘導はこれらの手法に限定されない。

工程１）原腸管細胞への分化
第２の培養を経て得られた胚体内胚葉細胞を、さらに増殖因子を含む培地で培養して原腸管細胞に分化誘導する。培養期間は２日〜８日、好ましくは約４日である。

培養温度は、特に限定されないが、３０〜４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。

培地は、上記第１の培養にて記載される、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、増殖因子のほか、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。

増殖因子としては、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ１０が好ましく、ＥＧＦ及び／又はＫＧＦがより好ましく、ＫＧＦがさらに好ましい。

増殖因子の培地中の濃度は、用いる増殖因子の種類によって適宜設定されるが、通常約０．１ｎＭ〜１０００μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ〜１００μＭである。ＥＧＦの場合、その濃度は、約５〜２０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．８〜３２０ｎＭ）、好ましくは約５〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．８〜１６０ｎＭ）、より好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約１．６〜１６０ｎＭ）である。ＦＧＦ１０の場合、その濃度は、約５〜２０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．３〜１１６ｎＭ）、好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．６〜５８ｎＭ）、より好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．６〜５８ｎＭ）である。例えば増殖因子としてＫＧＦを使用する場合の濃度は、通常５〜１５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは３０〜１００ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。

工程２）後方前腸細胞への分化
工程１）で得られた原腸管細胞を、さらに増殖因子、シクロパミン、ノギン等を含む培地で培養し、後方前腸細胞に分化誘導する。培養期間は１日〜５日、好ましくは約２日程度である。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。

シクロパミンはＳＨＨ阻害剤であるＳＡＮＴ−１（（４−ベンジル−ピペラジン−１−イル）−（３，５−ジメチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イルメチレン）−アミン）やＪｅｒｖｉｎｅ（（３β，２３β）−１７，２３−エポキシ−３−ヒドロキシベラトラマン−１１−オン）に置き換えることが可能である。

また、ＢＭＰ−４のアンタゴニストであるノギンはＢＭＰレセプターインヒビターであるＬＤＮ１９３１８９（４−［６−（４−ピペラジン−１−イル−フェニル）−ピラゾロ［１，５−α］ピリミジン−３−イル］−キノリン ハイドロクロライド）に置き換えることが可能である。

培養温度は、特に限定されないが、３０〜４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。

培地は、上記第１の培養にて記載される、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、増殖因子のほか、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。

増殖因子としては、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ１０が好ましく、ＥＧＦ及び／又はＫＧＦがより好ましく、ＫＧＦがさらに好ましい。

増殖因子の培地中の濃度は、用いる増殖因子の種類によって適宜設定されるが、通常約０．１ｎＭ〜１０００μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ〜１００μＭである。ＥＧＦの場合、その濃度は、約５〜２０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．８〜３２０ｎＭ）、好ましくは約５〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．８〜１６０ｎＭ）、より好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約１．６〜１６０ｎＭ）である。ＦＧＦ１０の場合、その濃度は、約５〜２０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．３〜１１６ｎＭ）、好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．６〜５８ｎＭ）、より好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．６〜５８ｎＭ）である。例えば増殖因子としてＫＧＦを使用する場合の濃度は、通常５〜１５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは３０〜１００ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。

シクロパミンの培地中の濃度は、特に限定するものではないが、通常０．５〜１．５μＭ、好ましくは０．３〜１．０μＭ、特に好ましくは約０．５μＭである。

ノギンの培地中の濃度は、特に限定するものではないが、通常１０〜２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０〜１５０ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。

本発明方法よれば、その純度や細胞数が高い後方前腸細胞を製造することができる。すなわち、本発明方法により製造された胚体内胚葉細胞を経て製造された後方前腸細胞は、ＰＤＸ１陽性（ＰＤＸ１＋）細胞を９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の割合で含み、後方前腸細胞が高い純度で含まれる細胞集団である。また、本発明方法により製造された後方前腸細胞の細胞数は、最初に播種された多能性幹細胞の細胞数よりも多く、例えば最初に播種された多能性幹細胞の細胞数と比べて２倍、又はそれ以上である。

工程３）膵前駆細胞への分化
工程２）で得られた後方前腸細胞を、さらにＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子を含む培地、好ましくはＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子と増殖因子を含む培地で培養し、膵前駆細胞に分化誘導する。培養期間は２日〜１０日、好ましくは約５日程度である。

培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。２次元培養の場合には、工程２）で得られた後方前腸細胞を、既報（Ｔｏｙｏｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）１４，１８５−１９７）に従い、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで処理後にピペッティングすることにより分散し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを遠心分離にて除去後、工程３）の新しい培地にて懸濁し、再播種する。

培地は、上記第１の培養にて記載される、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、増殖因子のほか、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。

ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子としては、前述した各種化合物又はその塩を用いることができ、用いる化合物又はその塩に応じて、培地への添加量は適宜決定されるが、通常約０．００００１μＭ−５μＭ、好ましくは０．００００１μＭ−１μＭである。ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子の培地中の濃度としては、ＣＤＫ８／１９に対して５０％以上の阻害活性に達する濃度が好ましい。

増殖因子としては、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ１０が好ましく、ＫＧＦ及び／又はＥＧＦがより好ましく、ＫＧＦ及びＥＧＦがさらに好ましい。

増殖因子の培地中の濃度は、用いる増殖因子の種類によって適宜設定されるが、通常約０．１ｎＭ〜１０００μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ〜１００μＭである。ＥＧＦの場合、その濃度は、約５〜２０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．８〜３２０ｎＭ）、好ましくは約５〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．８〜１６０ｎＭ）、より好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約１．６〜１６０ｎＭ）である。ＦＧＦ１０の場合、その濃度は、約５〜２０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．３〜１１６ｎＭ）、好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．６〜５８ｎＭ）、より好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．６〜５８ｎＭ）である。例えば増殖因子としてＫＧＦ及びＥＧＦを使用する場合の濃度は、ＥＧＦは通常通常５〜１５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは３０〜１００ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬ、ＫＧＦは通常１０〜２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０〜１５０ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。

工程３）における培養の最初の１日はＲＯＣＫ阻害剤の存在下で行い、以後はＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地で培養してもよい。

また、培地にはＰＫＣ活性化剤を含めてもよい。ＰＫＣ活性化剤としては、ＰｄＢＵ（ＰＫＣ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＩＩ）、ＴＰＢ（ＰＫＣ ａｃｔｏｖａｔｏｒ Ｖ）などを使用するが、その限りでない。ＰＫＣ活性化剤の濃度は約０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１〜５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約３〜１０ｎｇ／ｍｌで添加する。また、培地にはジメチルスルホキシド、アクチビン（１〜５０ｎｇ／ｍｌ）を添加してもよい。

いずれの工程においても、培地には、上記した成分のほか、血清代替物を添加してもよい。また、必要に応じて、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ（製品名）、非必須アミノ酸、ビタミン、ニコチンアミド、抗生物質（例えば、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（本明細書中、ＡＡと称することがある）、ペニシリン、ストレプトマイシン、又はこれらの混合物）、抗菌剤（例えば、アンホテリシンＢ）、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を添加してもよい。培地に抗生物質を添加する場合には、その培地中の濃度は通常０．０１〜２０重量％、好ましくは０．１〜１０重量％である。

また細胞培養は、フィーダー細胞を使用せず、接着培養にて行ってもよい。培養時には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、ＯｐｔｉＣｅｌｌ（製品名）（Ｎｕｎｃ社）等の細胞培養シートなどの培養容器が使用される。培養容器は、細胞との接着性（親水性）を向上させるための表面処理や、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル（例：ＢＤマトリゲル（日本ベクトン・デッキンソン社））、ビトロネクチンなどの細胞接着用基質でコーティングされていることが好ましい。培養容器としては、Ｔｙｐｅ Ｉ−ｃｏｌｌａｇｅｎ、マトリゲル、フィブロネクチン、ビトロネクチン又はポリ−Ｄ−リジンなどでコートされた培養容器が好ましく、マトリゲル又はポリ−Ｄ−リジンでコートされた培養容器がより好ましい。

培養温度は、特に限定されないが、３０〜４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。

工程３）で得られた膵前駆細胞は公知の表面マーカーである糖タンパク質２（ＧＰ２）などを利用して、さらに純化することができる。上記純化は自体公知の方法、例えば、抗ＧＰ２抗体を固定化したビーズを用いて行うことができる。

本発明方法よれば、その純度や細胞数が高い膵前駆細胞を製造することができる。すなわち、本発明方法により製造された胚体内胚葉細胞を経て製造された膵前駆細胞は、ＰＤＸ１陽性（ＰＤＸ１＋）でありかつＮＫＸ６．１陽性（ＮＫＸ６．１＋）である細胞を８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上の割合で含み、膵前駆細胞が高い純度で含まれる細胞集団である。また、本発明方法により製造された膵前駆細胞の細胞数は、最初に播種された多能性幹細胞の細胞数よりも多く、例えば最初に播種された多能性幹細胞の細胞数と比べて２倍、又はそれ以上である。

工程４）内分泌前駆細胞への分化
工程３）で得られた膵前駆細胞を、さらに増殖因子を含む培地で培養して内分泌前駆細胞に分化誘導する。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。２次元培養の場合には、工程３）で得られた膵前駆細胞を、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで処理後にピペッティングすることにより分散し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを遠心分離にて除去後、工程４）の新しい培地にて懸濁し、再播種する。培養期間は２日〜３日、好ましくは約２日である。

培地は、上記第１の培養にて記載される、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、既報（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１４；３２：１１２１−１１３３）に従い、ＳＡＮＴ１、レチノイン酸、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮを添加し、さらに、Ｗｎｔ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ（好ましくはＦＧＦ２）、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。また、培地にはジメチルスルホキシドを添加してもよい。

また細胞培養は、フィーダー細胞を使用せず、非接着培養にて行ってもよい。培養時には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、多孔プレート（Ｎｕｎｃ社）等あるいはバイオリアクターが使用される。培養容器は、細胞との接着性を低下させるための表面処理されていることが好ましい。

培養温度は、特に限定されないが、３０〜４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。

工程５）インスリン産生細胞への分化
工程４）で得られた内分泌前駆細胞を、さらに増殖因子を含む培地で培養してインスリン産生細胞に分化誘導する。培養期間は１０日〜３０日、好ましくは約１０〜２０日である。

培地は、上記第１の培養にて記載される、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、既報（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１４；３２：１１２１−１１３３）に従い、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＸＸ、γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、Ｎ−システイン、ＡＸＬインヒビター、アスコルビン酸を添加し、さらに、Ｗｎｔ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ（好ましくはＦＧＦ２）、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。例えば、培地にはＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、及びアスコルビン酸を添加してもよく、あるいはＴ３、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、ＺｎＳＯ_４、ヘパリン、Ｎ−アセチルシステイン、Ｔｒｏｌｏｘ、及びＲ４２８を添加してもよい。

培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。細胞培養は、フィーダー細胞を使用せず、非接着培養にて行ってもよい。培養時には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、多孔プレート（Ｎｕｎｃ社）等あるいはバイオリアクターが使用される。培養容器は、細胞との接着性を低下させるための表面処理されていることが好ましい。

培養温度は、特に限定されないが、３０〜４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。

４．膵β細胞への分化
上記工程で得られたインスリン産生細胞は、動物生体内に移植することによって膵β細胞に分化誘導することができる。

「動物」は哺乳動物が好ましく、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、モルモット等が挙げられるが、好ましくはヒトである。

移植は、細胞を一定の位置で固定できる生体内領域に行うことが好ましく、例えば、動物の皮下、腹腔内、腹膜上皮、大網、脂肪組織、筋肉組織や膵臓、腎臓等の各臓器の被膜下などに行うことできる。移植される細胞数は、移植される細胞の分化段階や、移植対象の、年齢、体重、移植部位の大きさ、疾患の重篤度等の要因により変化し得、特に限定されないが、例えば、１０×１０^４細胞〜１０×１０^１１個程度とすることができる。移植された細胞は、生体内環境において分化誘導され、目的の細胞、好ましくは膵β細胞へと分化することができる。得られた膵β細胞は、その後、回収されてもよいし、そのまま生体内に留置してもよい。

上記手法により得られたインスリン産生細胞又は膵β細胞は、そのままあるいはカプセル化して患部に移植することで、糖尿病、特にＩ型糖尿病を治療するための細胞医薬として有用である。

また、インスリン産生細胞又は膵β細胞は、プロドラッグであってもよい。プロドラッグとは、生体内に移植した後に分化し、疾患を治療する機能を有する細胞に変化する細胞をいう。

上記手法により得られたインスリン産生細胞又は膵β細胞は、毒性（例、急性毒性、慢性毒性、遺伝毒性、生殖毒性、心毒性、癌原性）が低く、そのまま、または薬理学的に許容される担体等と混合して医薬組成物とすることにより、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒト）に対して、安全に投与することができる。

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞、後方前腸細胞、膵前駆細胞等への分化誘導は、上記第１の培養及び第２の培養、ならびに既報（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）１４、１８５−１９７）に記載の方法等に準じて、実施した。
Ｂ−２７サプリメント（ＩＮＳ（＋））又はＢ−２７サプリメント（ＩＮＳ（−））（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の添加量は、製造元の指示に従い、終濃度を２％となるようにした（ｄａｙ０−３）。（ｄａｙ４以降は終濃度が１％となるようにした。）

［Ｉ］ＩＮＳ（＋）培地からＩＮＳ（−）培地への変更を含む胚体内胚葉細胞への分化誘導（２次元培養）
（１）方法
（ｉ）細胞
人工多能性細胞株であるＦｆ−Ｉ０１ｓ０４株、又はＦｆ−Ｉ１４ｓ０３株を多能性幹細胞として利用した。

（ｉｉ）分化誘導培地と培養スケジュール
１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ及び３μＭのＣＨＩＲ９９０２１を含む基本培地（ＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）））に、さらにＢ−２７サプリメント（ＩＮＳ（＋））又はＢ−２７サプリメント（ＩＮＳ（−））（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えて分化誘導培地とした。

細胞を播種し（ｄａｙ０）、インスリンを含む、又は含まない分化誘導培地を用いて、表１に記載のスケジュールにて培養を行い、胚体内胚葉細胞へと分化誘導した。

（２）結果
最初に（ｄａｙ０−ｄａｙ１）インスリンを含有する分化誘導培地にて培養を行い、続いて（ｄａｙ２−ｄａｙ３）インスリンを含有しない分化誘導培地にて培養を行った場合（実施例）、インスリンを含有する分化誘導培地のみで培養した場合（比較例）と比べて、ＳＯＸ２＋細胞（残存未分化細胞や他系譜細胞を示す）の割合が減少することが確認された（Ｆｆ−Ｉ０１ｓ０４株：比較例：２．１％、実施例：０．８％；Ｆｆ−Ｉ１４ｓ０３株：比較例：２．６％、実施例：０．８％）（図１）。

この結果より、多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞への分化誘導において、分化誘導培地をＩＮＳ（＋）培地からＩＮＳ（−）培地へと変更することによって、ＳＯＸ２＋細胞の割合を減少させることができ、胚体内胚葉細胞を高い純度で含んだ細胞集団を製造できることが確認された。

［ＩＩ］ＩＮＳ（＋）培地からＩＮＳ（−）培地への変更を含む胚体内胚葉細胞、後方前腸細胞、及び膵前駆細胞への分化誘導
（１）方法
上記「Ｉ」に記載の培養方法において、人工多能性細胞株であるＦｆ−ＭＨ１５ｓ０２株を多能性幹細胞として使用し、基本培地としてＲＰＭＩ培地又はＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ，ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ，ＧｌｕｔａＭＡＸ^ＴＭ，ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を使用した。基礎培地にＲＰＭＩ培地を使用した場合、ｄａｙ０−ｄａｙ３を通してインスリンを含有する分化誘導培地にて培養した。基礎培地にＤＭＥＭ培地を使用した場合は、最初に（ｄａｙ０）インスリンを含有する分化誘導培地にて培養を行い、続いて（ｄａｙ１−ｄａｙ３）インスリンを含有しない分化誘導培地にて培養を行った。多能性幹細胞は、２００×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（約２１万細胞個／ｃｍ^２）又は２５０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（約２６万細胞個／ｃｍ^２）の量で播種した。その他は、上記「実施例」と同じ手法にて胚体内胚葉細胞へと分化誘導を行った。
また、得られた胚体内胚葉細胞はさらに、後方前腸細胞、及び膵前駆細胞へと分化誘導を行った。

（２）結果
基本培地としてＤＭＥＭ培地を用い、ＩＮＳ（＋）培地からＩＮＳ（−）培地へと変更した場合、いずれの播種細胞数においても、ＲＰＭＩ培地を用い、インスリンを含有して培養した場合と比べて、ＳＯＸ２＋細胞の割合が減少することが確認された（ＤＭＥＭ培地：４．８％，３．１％；ＲＰＭＩ培地：１１．７％，５．１％）（図２）。そして、得られた胚体内胚葉細胞をさらに後方前腸細胞まで分化誘導したところ、ＰＤＸ１＋細胞の割合は９０％を超え、また膵前駆細胞まで分化誘導したところ、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋細胞の割合は８０％を超え、ｄａｙ０−ｄａｙ３を通してインスリンを含有する分化誘導培地にて培養した場合と比べて効率的に分化誘導できることが確認された（図２）。

この結果より、多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞への分化誘導において、ＤＭＥＭ培地を基本培地として、ＩＮＳ（＋）培地からＩＮＳ（−）培地へと変更することによって、ＳＯＸ２＋細胞の割合を減少させることができ、さらに得られた胚体内胚葉細胞を分化誘導することにより、後方前腸細胞、及び膵前駆細胞を高い純度で含む細胞を製造できることが確認された。また、Ｆｆ−ＭＨ１５ｓ０２株は既報（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）１４、１８５−１９７）の手法において分化効率が高くない細胞株であるが、そのような細胞株であっても本手法によれば高効率に分化誘導できることが確認された。

［ＩＩＩ］ＩＮＳ（−）培地のみを用いた胚体内胚葉細胞への分化誘導
（１）方法
上記「ＩＩ」に記載の培養方法において、Ｆｆ−Ｉ０１ｓ０４株を多能性幹細胞として使用し、いずれの基本培地を用いた場合にもＢ−２７サプリメント（ＩＮＳ（−））を加えた分化誘導培地のみを用いて培養を行い、ならびに、播種細胞数を７０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（約７万細胞個／ｃｍ^２）とした以外は、同じ手法にて胚体内胚葉細胞へと分化誘導を行った（すなわち、インスリンを含有しない分化誘導培地のみで培養を行った）。
また、得られた胚体内胚葉細胞をさらに、後方前腸細胞まで分化誘導した。

（２）結果
基本培地としてＲＰＭＩ培地を用いた場合、得られたＳＯＸ２＋細胞の割合は０．６％であったものの、ＰＤＸ１＋細胞の割合は１７．７％と低い値を示した。また、培養後（ｄａｙ３時点）に得られた細胞数は、１０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（約１万細胞個／ｃｍ^２）まで減少した。

また、基本培地としてＤＭＥＭ培地を用いた場合、得られたＳＯＸ２＋細胞の割合は６．７％と高い値を示し、またＰＤＸ１＋細胞の割合は６７．９％であった。培養後（ｄａｙ３時点）に得られた細胞数は、１２９×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（約１３万細胞個／ｃｍ^２）であった。

この結果より、インスリンを含有しない分化誘導培地のみを用いて胚体内胚葉細胞へと分化誘導を行った場合、培地によって結果は異なるが、細胞数の増加が抑えられ、十分な数の分化細胞を得ることができない場合や、残存する多能性幹細胞や他系譜細胞を示すＳＯＸ２陽性（ＳＯＸ２＋）細胞の混入率が高くなることが確認された。

［ＩＶ］ＩＮＳ（＋）培地からＩＮＳ（−）培地への変更を含む胚体内胚葉細胞への分化誘導（３次元培養）
上記にてその効果が確認されたＩＮＳ（＋）培地からＩＮＳ（−）培地への変更を含む胚体内胚葉細胞の分化誘導方法について、バイオリアクターを用いた３次元培養法においても有効であることを以下のとおり確認した。

（１）方法
人工多能性細胞株であるＦｆ−Ｉ１４ｓ０４株を多能性幹細胞として利用した。
細胞を１０万細胞個／ｍＬの量にて、Ｙ−２７６３２を添加した（１０μＭ）再生医療用培地（ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）（味の素ヘルシーサプライ））１０ｍＬに播種し、３０ｍＬ Ｒｅａｃｔｏｒ内で７０ｒｐｍの回転数にて２４時間培養した後、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）を２０ｍＬ追加し、さらに４８時間培養した。

次いで、上記培養後に得られた細胞塊を１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ及び３μＭのＣＨＩＲ９９０２１を含むＲＰＭＩ培地又はＤＭＥＭ培地に、さらにＢ−２７サプリメント（ＩＮＳ（＋））を加えた分化誘導培地（３０ｍＬ）を含む３０ｍＬ Ｒｅａｃｔｏｒ内で４０ｒｐｍの回転数にて２４時間培養した（ｄａｙ０）。

次いで、上記培養後に得られた細胞塊を１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ及びＢ−２７サプリメント（ＩＮＳ（＋））を含むＲＰＭＩ培地又は１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ及びＢ−２７サプリメント（ＩＮＳ（−））を含むＤＭＥＭ培地（それぞれ３０ｍＬ）を含む３０ｍＬ Ｒｅａｃｔｏｒ内で４０ｒｐｍの回転数にて４８時間培養して（ｄａｙ１−２）、胚体内胚葉細胞を得た。

また、得られた胚体内胚葉細胞について、分化誘導培地を交換して、３次元培養によりさらに分化誘導を行った。

（２）結果
３次元培養における多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞への分化誘導に関し、インスリンを含むＲＰＭＩ培地のみを用いて培養を行った場合、得られた細胞塊のＳＯＸ２＋細胞の割合は６．５％を示し、最初にインスリンを含むＤＭＥＭ培地、その後インスリンを含まないＤＭＥＭ培地を用いた培養により得られた細胞塊のそれ（０．４％）と比べて、高い値を示した（図３）。

そして、インスリンを含むＲＰＭＩ培地のみを用いて培養を行って得られた細胞塊を後方前腸細胞まで分化誘導した場合、得られた細胞塊はＰＤＸ１＋細胞の割合が２０％程度と少なく、細胞塊の崩壊により細胞数の減少が認められた（図４）。一方、最初にインスリンを含むＤＭＥＭ培地、その後インスリンを含まないＤＭＥＭ培地を用いた培養により得られた細胞塊を後方前腸細胞まで分化誘導した場合、得られた細胞塊はＰＤＸ１＋細胞の割合が９０％超えと高く（図３）、また細胞数の減少は認められなかった（図４）。

この結果より、ＩＮＳ（＋）培地からＩＮＳ（−）培地への変更を含む胚体内胚葉細胞の分化誘導方法は、バイオリアクターを用いた３次元培養法においても有効であり、多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞やその後の分化細胞を、工業規模で大量に生産可能であることが示された。

Claims (16)

1. 多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞を製造する方法であって、
   多能性幹細胞を、インスリンが作用する条件下の分化誘導培地中で第１の培養を行い、続いて、インスリンが作用しない条件下の分化誘導培地中で第２の培養を行うこと
   を含む方法。
2. 第１の培養がインスリンを含む分化誘導培地中で行われ、
   第２の培養がインスリンを含まない分化誘導培地中で行われる、請求項１の方法。
3. 第１の培養がインスリンを含み、かつインスリンシグナル阻害剤は含まない分化誘導培地中で行われ、
   第２の培養がインスリン及びインスリンシグナル阻害剤を含む分化誘導培地中で行われる、請求項１の方法。
4. 第１の培養および第２の培養を行う分化誘導培地中に、さらに、ピルビン酸塩を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 第１の培養および第２の培養を行う分化誘導培地中に、さらに、Ｌ−アラニルＬ−グルタミンを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 第１の培養および第２の培養を行う分化誘導培地中に、さらに、１５ｍＭ以上のグルコースを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 第１の培養を６時間〜４８時間行うことを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 第２の培養を少なくとも６時間行うことを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. ３次元培養系にて実施する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. ２次元培養系にて実施する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
11. 第１の培養の開始時において、多能性幹細胞が１５万〜３０万細胞個／ｃｍ^２含まれる、請求項１０に記載の方法。
12. 分化誘導培地が、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）をベースとする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 第１の培養の分化誘導培地がＲＯＣＫ阻害剤及び／又はＧＳＫ３β阻害剤を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 多能性幹細胞をインスリンが作用する条件下の分化誘導培地中で第１の培養を行い、続いて、インスリンが作用しない条件下の分化誘導培地中で第２の培養を行うことにより製造された胚体内胚葉細胞を、さらに分化誘導する工程を含む、インスリン産生細胞の製造方法。
15. 多能性幹細胞をインスリンを含む分化誘導培地中で第１の培養を行い、続いて、インスリンを含まない分化誘導培地中で第２の培養を行うことにより製造された胚体内胚葉細胞を、さらに分化誘導する工程を含む、インスリン産生細胞の製造方法。
16. 多能性幹細胞をインスリンを含み、かつインスリンシグナル阻害剤を含まない分化誘導培地中で第１の培養を行い、続いて、インスリン及びインスリンシグナル阻害剤を含む分化誘導培地中で第２の培養を行うことにより製造された胚体内胚葉細胞を、さらに分化誘導する工程を含む、インスリン産生細胞の製造方法。
    
    

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