CN112912490A - 细胞制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种能够由多能干细胞高效地诱导制造胚体内胚层细胞以及胰岛素产生细胞的新方法。一种由多能干细胞制造胚体内胚层细胞的方法，包括：将多能干细胞在作用胰岛素的条件下的分化诱导培养基中进行第一培养，然后在未作用胰岛素的条件下的分化诱导培养基中进行第二培养的步骤。

Description

细胞制造方法
技术领域
本发明涉及一种多能干细胞的分化诱导方法，能够由多能干细胞高效地诱导制造胚体内胚层细胞以及胰岛素产生细胞。
背景技术
由人工多能细胞、胚胎干细胞(ES细胞)等多能干细胞分化诱导为胰岛素分泌细胞(胰岛素产生细胞、胰岛β细胞)，并应用于糖尿病治疗的研究正在发展。已知在多能干细胞的分化诱导时，在不同的分化阶段会出现具有不同特征的细胞(WO 2009/012428、WO 2016/021734)。例如，该分化阶段按照分化程度由低到高，可以大致分类为多能干细胞、胚体内胚层细胞、原肠管细胞、后前肠细胞、胰腺前体细胞、内分泌前体细胞、胰岛素产生细胞、胰岛β细胞。
目前，研究并报道了对处于各个分化阶段的细胞进行诱导制造的方法。例如，非专利文献1记载了有关由多能干细胞向胚体内胚层细胞的诱导，在调查了培养基中血清替代物即B-27补充剂或B-27补充剂(INS(-))的添加、以及培养基中磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)抑制剂即LY294002的添加的影响后，发现在添加了B-27补充剂(INS(-))的情况下，能够最高效地诱导胚体内胚层细胞。
此外，非专利文献2记载了有关由多能干细胞向胚体内胚层细胞的分化诱导，通过在使用含有20μM的LY294002的培养基培养1天后，使用含有10μM的LY294002的培养基培养2天，胚体内胚层细胞的标记发生高表达。
而且，非专利文献3中记载了由ES细胞制造胰腺前体细胞的方法，其中，记载了有关由ES细胞向胚体内胚层细胞的分化诱导，使用添加了胰岛素-转铁蛋白-硒的培养基。
然而，通过以往的方法制造的胚体内胚层细胞，其细胞数量和纯度不够高，在该领域中仍然企望由多能干细胞高效地诱导制造胚体内胚层细胞以及胰岛素产生细胞的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO 2009/012428
专利文献2：WO 2016/021734
非专利文献
非专利文献1:Transplantation Proceedings,44,1127-1129(2012)
非专利文献2:Nat Commun.2015May 22；6：7212
非专利文献3:PLoS ONE May 2012,Volume 7,Issue 5,e37004
发明内容
发明要解决的课题
本发明的目的在于提供一种能够由多能干细胞高效地诱导制造胚体内胚层细胞以及胰岛素产生细胞的新方法。
用于解决课题的手段
本发明人等发现，在进行由多能干细胞向胚体内胚层细胞的分化诱导时，若使胰岛素持续地发挥作用，则所获得的细胞中含有较多的胚体内胚层细胞以外的细胞。另一方面，在进行由多能干细胞向胚体内胚层细胞的分化诱导时，未作用胰岛素的情况下，细胞数量未增加，无法获得充分数量的胚体内胚层细胞。
本发明人等为了解决这些问题而进行了深入研究，结果发现，在进行由多能干细胞向胚体内胚层细胞的分化诱导时，与使胰岛素持续地发挥作用或者未作用胰岛素的情况相比，通过在作用胰岛素的条件下的分化诱导培养基中进行第一培养，然后在未作用胰岛素的条件下的分化诱导培养基中进行第二培养，能够制造高纯度的胚体内胚层细胞，且能够使细胞数量增加。还发现能够由所获得的胚体内胚层细胞制造高纯度的进一步分化的细胞。
本发明是基于这些新认知而完成的，包括以下技术方案。
[1]一种由多能干细胞制造胚体内胚层细胞的方法，所述方法包括
将多能干细胞在作用胰岛素的条件下的分化诱导培养基中进行第一培养，然后在未作用胰岛素的条件下的分化诱导培养基中进行第二培养的步骤。
[2]根据[1]所述的方法，其中，
在含有胰岛素的分化诱导培养基中进行第一培养，在不含有胰岛素的分化诱导培养基中进行第二培养。
[3]根据[1]所述的方法，其中，
在含有胰岛素且不含有胰岛素信号抑制剂的分化诱导培养基中进行第一培养，在含有胰岛素和胰岛素信号抑制剂的分化诱导培养基中进行第二培养。
[4]根据[1]至[3]中任一项所述的方法，其中，
进行第一培养和第二培养的分化诱导培养基中还含有丙酮酸盐。
[5]根据[1]至[4]中任一项所述的方法，其中，
进行第一培养和第二培养的分化诱导培养基中还含有L-亮氨酰-L-亮氨酸。
[6]根据[1]至[5]中任一项所述的方法，其中，
进行第一培养和第二培养的分化诱导培养基中还含有15mM以上的葡萄糖。
[7]根据[1]至[6]中任一项所述的方法，其中，
所述方法包括进行6小时至48小时的第一培养的步骤。
[8]根据[1]至[7]中任一项所述的方法，其中，
所述方法包括进行至少6小时的第二培养的步骤。
[9]根据[1]至[8]中任一项所述的方法，其中，
在三维培养体系中实施所述方法。
[10]根据[1]至[8]中任一项所述的方法，其中，
在二维培养体系中实施所述方法。
[10A]根据[9]所述的方法，其中，
在第一培养开始时，含有1万至100万个细胞/mL的多能干细胞。
[10B]根据[9]所述的方法，其中，
在第一培养开始时，含有10万至50万个细胞/mL的多能干细胞。
[10C]根据[10]所述的方法，其中，
在第一培养开始时，含有5万至100万个细胞/cm2的多能干细胞。
[11]根据[10]所述的方法，其中，
在第一培养开始时，含有15万至30万个细胞/cm2的多能干细胞。
[12]根据[1]至[11]中任一项所述的方法，其中，
分化诱导培养基以DMEM，即Dulbecco改良Eagle培养基为基础。
[13]根据[1]至[12]中任一项所述的方法，其中，
第一培养的分化诱导培养基含有ROCK抑制剂和/或GSK3β抑制剂。
[14]一种胰岛素分泌细胞的制造方法，包括：
进一步对通过将多能干细胞在作用胰岛素的条件下的分化诱导培养基中进行第一培养，然后在未作用胰岛素的条件下的分化诱导培养基中进行第二培养而制造的胚体内胚层细胞进行分化诱导的步骤。
[15]一种胰岛素分泌细胞的制造方法，包括：
进一步对通过在含有胰岛素的分化诱导培养基中对多能干细胞进行第一培养，然后在不含有胰岛素的分化诱导培养基中进行第二培养而制造的胚体内胚层细胞进行分化诱导的步骤。
[16]一种胰岛素分泌细胞的制造方法，包括：
进一步对通过在含有胰岛素且不含有胰岛素信号抑制剂的分化诱导培养基中对多能干细胞进行第一培养，然后在含有胰岛素和胰岛素信号抑制剂的分化诱导培养基中进行第二培养而制造的胚体内胚层细胞进行分化诱导的步骤。
[17]一种通过[1]的方法制造的胚体内胚层细胞。
[18]一种通过[14]至[16]中任一项所述的方法制造的胰岛素产生细胞。
[19]一种包含[18]所述的胰岛素产生细胞的药品。
[20]根据[1]至[13]中任一项所述的方法，其是制造SOX2阳性(SOX2+)细胞的混入率小于5％的胚体内胚层细胞的方法。
[21]根据[1]至[13]、[20]中任一项所述的方法，其中，
制得的胚体内胚层细胞的细胞数量为最初接种的多能干细胞的细胞数量的2倍以上。
[22]一种后前肠细胞的制造方法，包括：
将通过[1]至[13]、[20]、[21]中任一项所述的方法制得的胚体内胚层细胞分化诱导为后前肠细胞的步骤。
[23]根据[22]所述的方法，其中，
制得的后前肠细胞包含90％以上的PDX1阳性(PDX1+)细胞。
[24]根据[22]或[23]所述的方法，其中，
制得的后前肠细胞的细胞数量为最初接种的多能干细胞的细胞数量的2倍以上。
[25]一种胰腺前体细胞的制造方法，包括：
将通过[1]至[13]、[20]、[21]中任一项所述的方法制得的胚体内胚层细胞分化诱导为胰腺前体细胞的步骤。
[26]根据[25]所述的方法，其中，
制得的胰腺前体细胞中PDX1阳性(PDX1+)且NKX6.1阳性(NKX6.1+)细胞的含量为80％以上。
[27]根据[25]或[26]所述的方法，其中，
制得的胰腺前体细胞的细胞数量为最初接种的多能干细胞的细胞数量的2倍以上。
[28]一种SOX2阳性(SOX2+)细胞的混入率小于5％的胚体内胚层细胞，其通过[1]至[13]、[20]、[21]中任一项所述的方法制造。
[29]一种PDX1阳性(PDX1+)细胞含量为90％以上的后前肠细胞，其通过[22]至[24]中任一项所述的方法制造。
[30]一种DX1阳性(PDX1+)且NKX6.1阳性(NKX6.1+)细胞含量为80％以上的胰腺前体细胞，其通过[25]至[27]中任一项所述的方法制造。
本说明书涵盖作为本申请的优先权基础的日本专利申请第2018-146650号的说明书和/或说明书附图中记载的内容。
本说明书中引用的所有刊物、专利以及专利申请直接作为参考并入本说明书中。
发明的效果
根据本发明，能够提供一种能够由多能干细胞高效地诱导制造胚体内胚层细胞和胰岛素分泌细胞的新方法。
附图说明
图1示出了在由iPS细胞(Ff-I01s04株和Ff-I14s03株)至胚体内胚层细胞的分化诱导中，首先在含有胰岛素的分化诱导培养基中进行培养，然后在不含有胰岛素的分化诱导培养基中进行培养的情况下(胰岛素(+)→(-))、以及仅在含有胰岛素的分化诱导培养基中进行培养的情况下(胰岛素(+))，通过流式细胞术对所获得的细胞中的SOX2阳性/阴性以及SOX17阳性/阴性的细胞的比例进行分析得到的结果。
图2示出了在由iPS细胞(Ff-MH15s02株)至胚体内胚层细胞的分化诱导中，使用RPMI培养基或DMEM培养基作为分化诱导培养基的基础培养基，在使用RPMI培养基作为基础培养基的情况下，第0天至第3天在含有胰岛素的分化诱导培养基中培养，而在使用DMEM培养基作为基础培养基的情况下，最初(第0天)在含有胰岛素的分化诱导培养基中进行培养，然后(第1天至第3天)在不含有胰岛素的分化诱导培养基中进行培养并通过流式细胞术对所获得的细胞中的SOX2阳性/阴性以及SOX17阳性/阴性的细胞的比例进行分析而得的结果、进一步通过各种方法对所获得的细胞进一步进行分化诱导并通过流式细胞术对所获得的细胞(后前肠细胞和胰腺前体细胞)中的PDX1阳性/阴性以及NKX6.1阳性/阴性的细胞的比例进行分析而得的结果。
图3示出了在由iPS细胞(Ff-I14s04株)至胚体内胚层细胞的分化诱导中，首先在含有胰岛素的分化诱导培养基中进行三维培养，然后在不含有胰岛素的分化诱导培养基中进行三维培养的情况下(胰岛素(+)→(-))、以及仅在含有胰岛素的分化诱导培养基中进行三维培养的情况下(胰岛素(+))，通过流式细胞术对所获得的细胞块中的SOX2阳性/阴性以及SOX17阳性/阴性的细胞的比例进行分析而得的结果、进一步通过各种方法对所获得的细胞块进行三维培养从而进一步进行分化诱导并通过流式细胞术对所获得的细胞块(后前肠细胞)中的PDX1阳性/阴性以及NKX6.1阳性/阴性的细胞的比例进行分析而得的结果。
图4是示出在由iPS细胞(Ff-I14s04株)至胚体内胚层细胞的分化诱导中，将首先在含有胰岛素的分化诱导培养基中进行三维培养，然后在不含有胰岛素的分化诱导培养基中进行三维培养而获得的细胞块(INS(+)→INS(-))、以及仅在含有胰岛素的分化诱导培养基中进行三维培养而获得的细胞块(INS(+))进一步通过三维培养进行分化诱导的情况下的、各种细胞块的细胞数量的经时变化的曲线图。
具体实施方式
1.术语
以下，对本说明书中记载的术语进行说明。
本说明书中，“约”表示相对于基准值分别在正或负25％、20％、10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％内波动的值。优选的是，术语“约”或“大致”表示相对于基准值分别为正或负15％、10％、5％或1％的范围。
本说明书中，“包括/包含(comprise(s)或comprising)……”是指包括/包含但不限于该短语之后的要素。因此，建议包括/包含该短语之后要素，但不建议排除任何其他要素。
本说明书中，“由……组成(consist(s)of或consisting of)”是指包括且限于该短语之后的任何要素。因此，短语“由……组成”表示所列举的要素是所要求的或是必需的，而其他要素实质上是不存在的。
本说明书中，不“使用饲养细胞”是指基本上不包含饲养细胞，不使用通过对饲养细胞进行培养来预调理的培养基等。因此，培养基中不包含饲养细胞分泌的生长因子及细胞因子等物质。
另外，“饲养细胞”或“饲养”是指与其它种类的细胞进行共培养以支持该细胞并提供可成长的环境的细胞。饲养细胞可以与它们支持的细胞衍生自相同或不同的物种。例如，作为人细胞的饲养细胞，可以使用人皮肤成纤维细胞或人胚胎干细胞，也可以使用小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养物及永生化小鼠胚胎成纤维细胞。饲养细胞可以通过辐射或丝裂霉素C处理等而失活。
本说明书中，“粘附”是指细胞粘附于容器，例如细胞在合适的培养基存在下粘附于无菌塑料(或涂覆的塑料)细胞培养钵或烧瓶。细胞之中，也存在不粘附于细胞培养容器就无法在培养物中维持、或者不成长的细胞。与此相对地，非粘附细胞可以在不粘附于容器的情况下在培养物中维持、增殖。
本说明书中，“培养”是指在体外环境中维持细胞、使其成长和/或使其分化。“进行培养”是指在组织或体外，例如在细胞培养钵或烧瓶中使细胞维持、增殖(成长)和/或分化。培养包括二维培养(平面培养)、三维培养(悬浮培养)。
本说明书中，“富集(enrich)”以及“富集(enrichment)”是指增加细胞组合物等组合物中特定组分的量，“富集了(enriched)”是指细胞组合物，例如，如果用于说明细胞群的话，是指特定组分的量与在富集之前的细胞群中的该组分的比例相比增加的细胞群。例如，可以针对靶细胞类型富集细胞群等组合物，使得靶细胞类型的比例与在富集之前细胞群内存在的靶细胞的比例相比增加。还可以通过本领域已知的细胞选择和分选方法来就靶细胞类型富集细胞群。也可以通过本说明书所描述的特定分选或选择过程来富集细胞群。在本发明的特定的实施方式中，通过靶细胞群的富集方法，细胞群相对于靶细胞群为至少富集20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％。
本说明书中，“耗尽(deplete)”以及“耗尽(depletion)”是指减少细胞或细胞组合物等组合物中特定成分的量，“耗尽的(depleted)”是指细胞或细胞组合物，例如，如果用于说明细胞群的话，是指特定组分的量与在耗尽之前的细胞群中的该组分的比例相比减少的细胞群。例如，可以针对靶细胞类型耗尽细胞群等组合物，使得靶细胞类型的比例与在耗尽之前细胞群内存在的靶细胞的比例相比减少。还可以通过本领域已知的细胞选择和分选方法来就靶细胞类型耗尽细胞群。也可以通过本说明书所描述的特定分选或选择过程来耗尽细胞群。在本发明的特定实施方式中，通过耗尽靶细胞群的方法，使细胞群相对于靶细胞群减少(耗尽)至少50％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％。
本说明书中，“纯化(purify)”以及“纯化(purification)”是指去除细胞组合物等组合物中的杂质，使特定的组分变得纯净，“纯化后的(purified)”是指细胞组合物，例如，如果用于说明细胞群的话，是指杂质的量与在纯化之前的细胞群内的该组分的比例相比减少的细胞群。例如，可以针对靶细胞类型纯化细胞群等组合物，使得靶细胞类型的比例与在纯化之前的细胞群内存在的靶细胞的比例相比增加。还可以通过该技术领域已知的细胞选择和分选方法来就靶细胞类型纯化细胞群。也可以通过本说明书所描述的特定分选或选择过程纯化细胞群。在本发明的特定的实施方式中，通过纯化靶细胞群的方法，使靶细胞群的纯度至少为70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％，可达到检测不出杂质(包括夹杂细胞)的程度。
本说明书中，“标记”是指“标记蛋白”、“标记基因”等通过特定的细胞型特异性表达的细胞抗原或其基因。优选的是，标记为细胞表面标记，此时，可实施活细胞的浓缩、分离和/或检测。标记可以是阳性选择标记或阴性选择标记。
标记蛋白的检测可以利用对该标记蛋白具有特异性抗体的免疫学分析来进行，所述免疫学分析例如为ELISA、免疫染色、流式细胞术。标记基因的检测可利用该领域公知的核酸扩增方法和/或核酸检测方法来实施，所述方法例如为RT-PCR、微阵列、生物芯片等。本说明书中，标记蛋白为“阳性”是指利用流式细胞术检测为阳性，“阴性”是指在流式细胞术的检测限界以下。此外，标记基因为“阳性”是指利用RT-PCR进行检测，“阴性”是指在RT-PCR的检测限界以下。
本说明书中，“表达(expression)”定义为由细胞内的启动子驱动特定的核苷酸序列的转录和/或翻译。
本说明书中，“多能(pluripotency)”是指可分化为具备各种不同形态或功能的组织、细胞，且可分化为任何层的三胚层细胞的能力。“多能(pluripotency)”无法分化为胚盘，因此不具有形成个体的能力，就这一点而言，“多能”与可分化为包括胚盘在内的生物体的任何组织的“全能(totipotency)”有所区别。
“多潜能(multipotency)”是指可分化为多个限定数量的系统的细胞的能力。例如，间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞是多潜能(multipotency)的，但不是多能(pluripotency)的。
本说明书中，“多能干细胞(pluripotent stem cell)”是指胚胎干细胞(ES细胞)及与之具有相同的分化多能性，即潜在地具有分化为生物体的多种组织(内胚层、中胚层、外胚层)的能力的细胞。作为具有与ES细胞相同分化多能性的细胞，可例举出“诱导性多能干细胞”(本说明书中，有时也称为“iPS细胞”)。优选的是，在本发明中，多能干细胞是指人多能干细胞。
若是小鼠ES细胞作为“ES细胞”，可以使用inGenious公司、理研等建立的各种小鼠ES细胞株，若是人ES细胞作为“ES细胞”，可以使用NIH、理研、京都大学、Cellartis公司建立的各种人ES细胞株。例如，可以使用NIH的CHB-1-CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1-HUES28株等，WisCell Research的H1株、H9株；理研的KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等，作为ES细胞株。
“诱导性多能干细胞”是指通过将特定的因子(核重编程因子)导入哺乳动物体细胞或未分化干细胞内进行重编程而获得的细胞。目前，“诱导性多能干细胞”有许多种类，除了山中等通过将Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc四种因子导入小鼠成纤维细胞内，从而建立的iPS细胞(Takahashi K，Yamanaka S.，Cell，(2006)126：663-676)之外，还可以使用将同样的四种因子导入人成纤维细胞内而建立的人细胞衍生的iPS细胞(Takahashi K，YamanakaS.等人，Cell，(2007)131：861-872.)、在导入上述四种因子后，以Nanog的表达作为指标进行分选而建立的Nanog-iPS细胞(Okita，K.，Ichisaka，T.，and Yamanaka，S.(2007).Nature448，313-317.)、通过不包括c-Myc的方法制作的iPS细胞(Nakagawa M，Yamanaka S.等人，Nature Biotechnology，(2008)26，101-106))、通过无病毒导入了六种因子而建立的iPS细胞(Okita K等人，Nat.Methods 2011May；8(5)：409-12，Okita K等人，Stem Cells.31(3)：458-66.)。此外，还可以使用Thomson等制作的、导入了OCT3/4、SOX2、NANOG、LIN28四种因子而建立的诱导性多能干细胞(Yu J.,Thomson JA.等人，Science(2007)318：1917-1920.)、Daley等制作的诱导性多能干细胞(Park IH,Daley GQ.等人，Nature(2007)451：141-146)、樱田等制作的诱导性多能干细胞(日本特开第2008-307007号)等。
此外，还可以使用已公开的所有论文(例如，Shi Y.，Ding S.等人，Cell StemCell，(2008)Vol3，Issue 5，568-574；、Kim JB.，Scholer HR.等人，Nature，(2008)454，646-650；Huangfu D.，Melton，DA.等人，N ature Biotechnology，(2008)26，No 7，795-797)、或者日本专利(例如日本特开第2008-307007号、日本特开第2008-283972号、US2008/2336610、US 2009/047263、WO 2007/069666、WO 2008/118220、WO 2008/124133、WO2008/151058、WO 2009/006930、WO 2009/006997、WO 2009/007852)中记载的该领域公知的诱导性多能干细胞中的任一种。
可以使用NIH、理化学研究所(理研)、京都大学等建立的各种iPS细胞株作为诱导性多能细胞株。例如，若是人iPS细胞株，可以例举出理研的HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、京都大学的Ff-WJ-18株、Ff-I01s01株、Ff-I01s02株、Ff-I01s04株、Ff-I01s06株、Ff-I14s03株、Ff-I14s04株、QHJI01s01株、QHJI01s04株、QHJI14s03株、QHJI14s04株、RWMH15s02株、Ff-MH15s02株、253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株、CDI公司的MyCell iPS Cells(21525.102.10A)株、MyCell iPS Cells(21526.101.10A)株等。
“胚体内胚层细胞”是指通过SOX17、FOXA2、BMP2、CER以及CXCR4中的至少一种标记的表达而表征的细胞。
“原肠管细胞”是指通过HNF1B以及HNF4A中的至少一种标记的表达而表征的细胞。
“后前肠细胞”是指通过PDX-1、HNF6以及HLXB9中的至少一种标记的表达而表征的细胞。
“胰腺前体细胞”是指通过PDX-1、NKX6.1、PTF-1α、GATA4以及SOX9中的至少一种标记的表达而表征的细胞。
“内分泌前体细胞”是指通过Chromogranin A、NeuroD以及NGN3中至少一个标记的表达、以及胰腺相关的激素系统(例如胰岛素等)的标记不表达而表征的细胞。内分泌前体细胞也可以由PAX-4、NKX2-2、Islet-1、PDX-1、PTF-1α等标记表达(而表征)。
“胰岛素产生细胞”是指通过胰岛素的表达而表征的细胞。“胰岛素产生细胞”优选为除了胰岛素的表达之外，还可以通过NKX6.1的表达而表征。即，更优选的是，“胰岛素产生细胞”是指胰岛素和NKX6.1两者的标记的表达(而表征)的细胞。
“胰岛β细胞”是指比“胰岛素产生细胞”更成熟的细胞，具体而言，是指对作为胰岛β细胞的成熟标记的MAFA、UCN3和IAPP中至少一种标记进行表达的细胞、或者通过由葡萄糖刺激引起的胰岛素分泌升高反应进行表征的细胞。
处于各个分化阶段的细胞的制造可以通过以下详细描述的方法进行。
本说明书中，若无特别记载，“细胞”是指细胞组合物，即细胞群。因此，“细胞”不仅包括特定细胞，还可包括一种或多种其他细胞。可以通过富集或纯化，或者通过耗尽一种或多种其他细胞的方式提高“细胞”中的特定细胞。
本说明书中，“具有CDK8/19抑制活性的因子”是指具有CDK8/19抑制活性的任何物质。与同一CDK家族的其它蛋白质相比，CDK8对细胞增殖来说不是必要的，并且在通常情况下，对CDK8的抑制对细胞增殖的效果的影响不明显。CCDK19和CDK8与上述类似，并且CDK8的抑制通常伴随CDK19的抑制。
“生长因子”是促进特定细胞的分化和/或增殖的内源蛋白。“生长因子”例如，表皮生长因子(EGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、胰岛素样生长因子2(IGF-2)、角质细胞生长因子(KGF)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、运铁蛋白、各种白细胞介素(例如IL-1至IL-18)、各种集落刺激因子(例如粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))、各种干扰素(例如，IFN-γ等)及对干细胞有影响的其他细胞因子，例如，可以例举出干细胞因子(SCF)及促红细胞生成素(Epo)。
本说明书中，“ROCK抑制剂”是指抑制Rho激酶的物质(ROCK：Rho相关联、包含卷曲螺旋的蛋白激酶)，也可以是抑制ROCK I和ROCK II中任意一种的物质。ROCK抑制剂只要具有上述功能就没有特别限制，例如，可以例举出N-(4-吡啶基)-4β-[(R)-1-氨基乙基]环己烷-1α-羧酰胺(有时也称为Y-27632)、法舒地尔(HA1077)、(2S)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基]磺酰基]六氢-1H-1,4-二氮杂(H-1152)、4β-[(1R)-1-氨基乙基]-N-(4-吡啶基)苯并-1甲酰胺(Wf-536)，N-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4PER(R)-1-氨基乙基]环己烷-1α-羧酰胺(Y-30141)，N-(3-{[2-(4-氨基-1,2,5-噁二唑-3-基)-1-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶基-6-基]氧基}苯基)-4-{[2-(4-吗啉基)乙基]-氧基}苯甲酰胺(GSK269962A)、N-(6-氟-1H-吲唑-5-基)-6-甲基-2-氧基-4-[4-(三氟甲基)苯基]-3,4-二氢-1H-吡啶-5-甲酰胺(GSK429286A)。ROCK抑制剂不仅限于以上这些，也可以将针对ROCK的mRNA的反义寡核苷酸、siRNA、与ROCK结合的抗体、显性负ROCK突变体等用作ROCK抑制剂，其可商购或可根据已知方法合成。
本说明书中，“GSK3β抑制剂”是对GSK3β(糖原合酶激酶3β)具有抑制活性的物质。GSK3(糖原合酶激酶3)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，并参与许多与糖原产生、细胞凋亡、干细胞维持等有关的信号通路。GSK3具有α和β两个同种型。本发明中使用的“GSK3β抑制剂”只要具有GSK3β抑制活性就没有特别限制，可以是兼具GSK3β抑制活性和GSK3α抑制活性的物质。
作为GSK3β抑制剂，例示了CHIR 98014(2-[[2-[(5-硝基-6-氨基吡啶-2-基)氨基]乙基]氨基)-4-(2,4-二氯苯基)-5-(1H-咪唑-1-基)嘧啶)、CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑基-2-基)-2-嘧啶基)-氨基]乙基]氨基)尼古丁腈)、TDZD-8(4-苄基-2-甲基-1,2,4-噻二唑烷-3,5-二酮，SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚基-3-基)-1H-吡咯并-2,5-二酮)，TWS-119(3-[6-(3-氨基苯基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氧基)酚)、坎帕罗酮(Kenpaullone)、1-氮杂坎帕罗酮(Azakenpaullone)、SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚基-3-基)-1H-吡咯并-2,5-二酮)、SB415286(3-[(3-氯-4-羟基苯基)氨基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯并-2,5-二酮)及AR-AO144-18、CT99021、CT20026、BIO、BIO-丙酮肟、吡啶并咔唑-环戊二烯基钌复合物、OTDZT、α-4-二溴苯乙酮、锂等。GSK3β不限于以上这些，也可以将针对GSK3β的mRNA的反义寡核苷酸、siRNA、与GSK3β结合的抗体、显性负GSK3β突变体等用作GSK3β抑制剂，其可商购或可根据已知方法合成。
本说明书中，“血清替代物”是指例如，可以例举出Knockout血清替代物(KSR：Invitrogen)，StemSure血清替代物(Wako)、B-27补充剂、N2补充剂、白蛋白(例如，富含脂质的白蛋白)、胰岛素、运铁蛋白、脂肪酸、胶原蛋白前体、痕量元素(例如锌、硒(例如，亚硒酸钠))、2-巯基乙醇、3'硫醇甘油或其混合物(例如，ITS-G)。优选B-27补充剂、KSR、StemSure血清替代物、ITS-G作为血清替代物。将血清替代物添加到培养基中时，培养基中的浓度为0.01重量％-10重量％、优选为0.1重量％-2重量％。在本发明中，优选地使用“血清替代物”来代替血清。另外，在本说明书中，有时也将含有胰岛素的B-27补充剂记载为“B-27补充剂(INS(+))”、将不含有胰岛素的B-27补充剂记载为“B-27补充剂(INS(-))”。
2.由多能干细胞制造胚体内胚层细胞的方法
本发明中，可以通过将多能干细胞在作用胰岛素的条件下的分化诱导培养基中进行第一培养，然后在未作用胰岛素的条件下的分化诱导培养基中进行第二培养的方式来制造胚体内胚层细胞。
(1)第一培养
“作用胰岛素的条件”是指通过胰岛素激活细胞中胰岛素信号传导通路的条件。通常，胰岛素与存在于细胞膜表面上的胰岛素受体结合，激活存在于受体内部的酪氨酸激酶，使胰岛素受体基质蛋白质家族(IRS：IRS-1，2，3)酪氨酸磷酸化。本说明书中，将由胰岛素与胰岛素受体结合而引发的这些一连串的反应称为“激活胰岛素信号传导通路”。
作为作用胰岛素的条件，例如，可例举分化诱导培养基中含有胰岛素的情况。胰岛素只要是能够激活多能干细胞中胰岛素信号传导通路的物质即可，可以通过修饰法来制造，也可以通过固相合成法进行合成来制造。胰岛素可以使用衍生自人、非人灵长类、猪、牛、马、羊、山羊、美洲驼、狗、猫、兔、小鼠、豚鼠等的物质，优选为人胰岛素。另外，本说明书中，有时将胰岛素记载为“INS”，此外，有时将含有胰岛素的情况记载为“INS(+)”，将不含有胰岛素的情况记载为“INS(-)”。
本发明中，只要是发生多能干细胞中胰岛素信号传导通路的激活，也可以使用胰岛素变体、胰岛素衍生物或胰岛素激动剂作为“胰岛素”。“胰岛素变体”是指在胰岛素的氨基酸序列中删除、取代、加成或者插入了1个至20个、优选为1个至10个、进一步优选为1个至5个氨基酸的氨基酸序列而构成且具有能够激活胰岛素信号传导通路的多肽，或者由与胰岛素的氨基酸序列的序列同一性为80％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上、最优选为99％以上的氨基酸序列组成且具有能够激活胰岛素信号传导通路的多肽的物质。氨基酸序列的比较可以通过公知的方法来进行，按照例如默认设定使用例如BLAST(美国国家生物信息中心的基于局部比对算法的搜索工具(Basic Local Alignment Search Toolat the National Center for Biological Information))等实施。“胰岛素衍生物”是指由胰岛素或胰岛素变体的氨基酸残基的部分基团被化学取代(例如α-甲基化、α-羟基化)、删除(例如脱氨基化)、或者修饰(例如N-甲基化)后的氨基酸序列组成且具有能够激活胰岛素信号传导通路的多肽或者具有相同作用的物质。“胰岛素激动剂”是指能够与胰岛素的结构无关地与胰岛素受体结合并激活胰岛素信号传导通路的多肽或者具有相同作用的物质。
第一培养的分化诱导培养基中胰岛素的含量可以为0.0120μM至20μM、优选为0.120μM至10μM、更优选为0.520μM至5μM。分化诱导培养基中胰岛素的浓度可以为所添加的B-27补充剂中含有的胰岛素的浓度，但不限于此。
分化诱导培养基中除了胰岛素之外，还可以含有激活素A。培养基中激活素A的含量为5ng/mL至200ng/mL、优选为10ng/mL至150ng/mL、更优选为30n g/mL至120ng/mL、特别优选为约100ng/mL。作为另一个方式，培养基中激活素A的浓度为约0.1ng/mL至100ng/ml、优选为约1ng/mL至50ng/ml、更优选为约3ng/mL至10ng/ml。
分化诱导培养基中还可以含有ROCK抑制剂和/或GSK3β抑制剂。培养基中ROCK抑制剂的浓度可根据ROCK抑制剂种类适当地设定，例如使用Y-27632作为ROCK抑制剂时的浓度，通常情况下，可以为5μM至20μM、优选为5μM至15μM、特别优选为约10μM。培养基中GSK3β抑制剂的浓度可根据所使用的GSK3β抑制剂种类适当地设定，例如使用CHIR99021作为GSK3β抑制剂时的浓度，通常情况下，可以设2μM至5μM、优选为2μM至4μM、特别优选为约3μM。
分化诱导培养基中还可以包含选自丙酮酸盐(钠盐等)、L-亮氨酰-L-亮氨酸以及葡萄糖中的一种或多种。培养基中丙酮酸盐的含量可以为10mg/L至1000mg/L、优选为30mg/L至500mg/L、更优选为50mg/L至200mg/L、特别优选为约110mg/L。培养基中L-亮氨酰-L-亮氨酸的含量可以为50mg/L至2000mg/L、优选为100mg/L至1500mg/L、更优选为500mg/L至1000mg/L、特别优选为约860mg/L。培养基中葡萄糖的含量可以为15mM以上、优选为15mM至30mM、更优选为15mM至25mM、特别优选为约25mM。分化诱导培养基中的丙酮酸盐、L-亮氨酰-L-亮氨酸以及葡萄糖的浓度可以为DMEM培养基(DMEM，高浓度葡萄糖，GlutaMAXTM，丙酮酸钠(Thermo Fisher Scientific))或者其他DMEM培养基中含有的丙酮酸盐、L-亮氨酰-L-亮氨酸以及葡萄糖的浓度，但不限于此。
此外，分化诱导培养基中还可以含有二甲基亚砜。
分化诱导培养基可以使用以用于哺乳类细胞培养的基础培养基为基础并添加了上述成分中的一种或多种的培养基。作为基础培养基，可以例举出RPMI培养基、MEM培养基、iMEM培养基、DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基)培养基、改良MEM锌选择性培养基、改良MEM/1％B-27补充剂/青霉素链霉素培养基、MCDB131/10mM葡萄糖/20mM葡萄糖/NaHCO3/FAF-BSA/ITS-X/Glutamax/抗坏血酸/青霉素链霉素培养基等，优选为DMEM培养基、更优选为以上述的量含有丙酮酸盐、L-亮氨酰-L-亮氨酸以及葡萄糖的DMEM培养基。
第一培养的培养时间段可以为选自6小时至48小时、优选为12小时至24小时的范围。对于培养温度没有特别限制，在30℃至40℃(例如37℃)下进行。此外，培养容器中的二氧化碳浓度为例如5％左右。可以通过二维培养和三维培养中的任一种来进行培养。对于培养开始时的细胞数量没有特别限定，若是二维培养，则可以为5万至100万个细胞/cm2、优选为15万至30万个细胞/cm2、更优选为约20万个细胞/cm2。此外，对于培养开始时的细胞数量没有特别限定，若是三维培养，则可以为1万至100万个细胞/mL、优选为10万至50万个细胞/mL。
(2)第二培养
“未作用胰岛素的条件”是指不通过胰岛素激活细胞中胰岛素信号传导通路的条件。“不激活细胞中胰岛素信号传导通路”不仅是指完全不激活该胰岛素信号传导通路，也指仅发生了与不存在胰岛素时的该胰岛素信号传导通路的激活相比没有显著差异的程度的轻微激活的情况。因此，作为“未作用胰岛素的条件”，可例举出例如分化诱导培养基中不含有胰岛素、或者即使在分化诱导培养基中含有胰岛素的情况下，胰岛素的量为仅发生上述没有显著差异的程度的轻微激活的量的条件。或者，也指即使分化诱导培养基中含有胰岛素，由于同时含有胰岛素信号抑制剂，因此不发生上述胰岛素信号传导通路的激活的情况。“胰岛素信号抑制剂”是指能够在任意位置阻断胰岛素信号传导通路的成分。可例举出与胰岛素、胰岛素受体、作为信号传导物质发挥作用的各种蛋白质等结合或竞争，并抑制这些因子所参与的分子间的相互作用的多肽或化合物等，作为这种胰岛素信号抑制剂。例如，可例举出与PI3激酶的催化亚单位的ATP结合(具有)竞争性抑制的LY294002(2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮)等，作为这种胰岛素信号抑制剂。胰岛素信号抑制剂不限于这些，也可以使用与胰岛素、胰岛素受体、作为信号传导物质发挥作用的各种蛋白质结合的抗体或它们的显性负型变体、以及与胰岛素受体或作为信号传导物质发挥作用的各种蛋白质的mRNA相对的反义寡核苷酸或siRNA等，作为胰岛素信号抑制剂。胰岛素信号抑制剂可以从市场上购得，也可以按照公知的方法合成。
第二培养的分化诱导培养基中可以含有激活素A。培养基中的激活素A的量可以选自上述第一培养中记载的范围，可以与第一培养中使用的量相同，也可以不同。
分化诱导培养基中还可以含有ROCK抑制剂和/或GSK3β抑制剂。培养基中的ROCK抑制剂和/或GSK3β抑制剂的量可以选自上述第一培养中记载的范围，可以与第一培养中使用的量相同，也可以不同。
分化诱导培养基还可以包含选自丙酮酸盐、L-亮氨酰-L-亮氨酸以及葡萄糖中的一种或多种。培养基中的丙酮酸盐、L-亮氨酰-L-亮氨酸以及葡萄糖的量可以选自上述第一培养中记载的范围，可以与第一培养中使用的量相同，也可以不同。
此外，分化诱导培养基中还可以含有二甲基亚砜。
可以使用以用于哺乳类细胞培养的基础培养基为基础并添加了上述成分中的一种或多种作为第二培养使用的分化诱导培养基。作为基础培养基，可以使用上述第一培养中记载的基础培养基，可以与在第一培养中使用的基础培养基相同，也可以不同。优选为DMEM培养基、更优选以上述的量含有丙酮酸盐、L-亮氨酰-L-亮氨酸以及葡萄糖的DMEM培养基。
第二培养的培养时间段为至少6小时、优选为选自6小时至72小时、进一步优选为24小时至72小时的范围。对于培养温度没有特别限制，在30℃至40℃(例如37℃)下进行。可以通过二维培养和三维培养中的任一种来进行培养。此外，培养容器中的二氧化碳浓度为例如5％左右。
具体而言，本发明的方法包括在添加了胰岛素、激活素A、ROCK抑制剂、GSK3β抑制剂的DMEM培养基中培养1天或2天(第一培养)，并在添加了激活素A的DMEM培养基进一步培养2天或3天(第二培养)的步骤。
根据本发明的方法，能够制造纯度和细胞数量较高的胚体内胚层细胞。即，通过本发明的方法获得的胚体内胚层细胞中，残存多能干细胞或其它谱系细胞的SOX2阳性(SOX2+)细胞的混入率小于5％、优选为小于1％、更优选为小于0.1％，为包含高纯度胚体内胚层细胞的细胞群。此外，通过本发明的方法制造的胚体内胚层细胞的细胞数量多于最初接种的多能干细胞的细胞数量，例如是最初接种的多能干细胞的细胞数量的2倍或2倍以上。
能够将所获得的胚体内胚层细胞提供给进一步的分化诱导步骤，能够用于原肠管细胞、后前肠细胞、胰腺前体细胞、内分泌前体细胞或者胰岛素产生细胞的制造。
3.各种分化阶段的细胞的制造方法
能够使用公知的方法将所获得的胚体内胚层细胞分化诱导为原肠管细胞、后前肠细胞、胰腺前体细胞、内分泌前体细胞或者胰岛素产生细胞。即，可以利用以下的分化诱导步骤分化为各种细胞从而获得胰岛素产生细胞等各种分化阶段的细胞：
步骤1)由胚体内胚层细胞分化诱导为原肠管细胞；
步骤2)由原肠管细胞分化诱导为后前肠细胞；
步骤3)由后前肠细胞分化诱导为胰腺前体细胞；
步骤4)由胰腺前体细胞分化诱导为内分泌前体细胞；
步骤5)由内分泌前体细胞分化诱导为胰岛素产生细胞。
以下，对各个步骤进行说明，但各种细胞的分化诱导不限于这些方法。
步骤1)分化为原肠管细胞
将经过第二培养而获得的胚体内胚层细胞在含有生长因子的培养基中进一步培养,分化诱导为原肠管细胞。培养时间段为2天至8天、优选为约4天。
对于培养温度没有特别限制，在30℃至40℃(例如37℃)下进行。此外，培养容器中的二氧化碳浓度为例如5％左右。可以通过二维培养和三维培养中的任一种来进行培养。
可以使用上述第一培养中记载的用于哺乳类细胞培养的基础培养基作为培养基。除了生长因子之外，也可以向培养基中适当添加血清替代物、维生素、抗生素等。
优选EGF、KGF、FGF10、更优选EGF和/或KGF、进一步优选KGF作为生长因子。
培养基中生长因子的浓度可根据所使用的生长因子的种类适当地设定，通常为约0.1nM至1000μM、优选为约0.1nM至100μM。(在使用)EGF的情况下，其浓度为约5ng/ml至2000ng/ml(即，约0.8nM至320nM)、优选为约5ng/ml至1000ng/ml(即，约0.8nM至160nM)、更优选为约10ng/ml至1000ng/ml(即，约1.6nM至160nM)。(在使用)FGF10的情况下，其浓度为约5ng/ml至2000ng/ml(即，约0.3nM至116nM)、优选为约10ng/ml至1000ng/ml(即，约0.6nM至58nM)、更优选为约10ng/ml至1000ng/ml(即，约0.6nM至58nM)。例如使用KGF作为生长因子时的浓度通常为5ng/ml至150ng/mL、优选为30ng/ml至100ng/mL、特别优选为约50ng/mL。
步骤2)分化为后前肠细胞
将步骤1)中获得的原肠管细胞在含有生长因子、环杷明、Noggin等的培养基中进一步培养，分化诱导为后前肠细胞。培养时间段为1天至5天、优选为约2天左右。可以通过二维培养和三维培养中的任一种来进行培养。
可以将环杷明替换为SHH抑制剂，即SANT-1((E)-N-(4-苄基-1-哌嗪基)-1-(3,5-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-基)甲亚胺)或蒜黎芦碱(Jervine，(3β，23β)-17，23-环氧-3-羟基藜芦烷-11-酮(17,23β-Epoxy-3-hydroxyveratraman-11-one)。
此外，可以将BMP-4的拮抗剂即Noggin替换为BMP受体抑制因子，即LDN193189(4-[6-(4-(哌嗪-1-基)苯基]吡唑并[1,5-α]嘧啶-3-基)喹啉)。
对于培养温度没有特别限制，在30℃至40℃(例如37℃)下进行。此外，培养容器中的二氧化碳浓度为例如5％左右。
可以使用上述第一培养中记载的用于哺乳类细胞培养的基础培养基作为培养基。除了生长因子之外，也可以向培养基中适当添加血清替代物、维生素、抗生素等。
优选EGF、KGF、FGF10、更优选EGF和/或KGF、进一步优选KGF作为生长因子。
培养基中生长因子的浓度可根据所使用的生长因子的种类适当地设定，通常为约0.1nM至1000μM、优选为约0.1nM至100μM。(在使用)EGF的情况下，其浓度为约5ng/ml至2000ng/ml(即，约0.8nM至320nM)、优选为约5ng/ml至1000ng/ml(即，约0.8nM至160nM)、更优选为约10ng/ml至1000ng/ml(即，约1.6nM至160nM)。(在使用)FGF10的情况下，其浓度为约5ng/ml至2000ng/ml(即，约0.3nM至116nM)、优选为约10ng/ml至1000ng/ml(即，约0.6nM至58nM)、更优选为约10ng/ml至1000ng/ml(即，约0.6nM至58nM)。例如使用KGF作为生长因子时的浓度通常为5ng/ml至150ng/mL、优选为30ng/ml至100ng/mL、特别优选为约50ng/mL。
对于培养基中环杷明的浓度没有特别限定，通常为0.5μM至1.5μM、优选为0.3μM至1.0μM、特别优选为约0.5μM。
对于培养基中Noggin的浓度没有特别限制，通常为10ng/mL至200ng/mL、优选为50ng/mL至150ng/mL、特别优选为约100ng/mL。
根据本发明的方法，能够制造纯度和细胞数量较高的后前肠细胞。即，经过通过本发明的方法制造的胚体内胚层细胞而制造的后前肠细胞以90％以上、优选为95％以上、更优选为98％以上的比例包含PDX1阳性(PDX1+)细胞，是包含高纯度的后前肠细胞的细胞群。此外，通过本发明的方法制造的后前肠细胞的细胞数量多于最初接种的多能干细胞的细胞数量，例如是最初接种的多能干细胞的细胞数量的2倍或2倍以上。
步骤3)分化为胰腺前体细胞
将步骤2)中获得的后前肠细胞在包含具有CDK8/19抑制活性的因子的培养基、优选为包含具有CDK8/19抑制活性的因子和生长因子的培养基中进一步培养，分化诱导为胰腺前体细胞。培养时间段为2天至10天、优选为约5天左右。
可以通过二维培养和三维培养中的任一种来进行培养。二维培养的情况下，按照以往的报道(Toyoda et al.，Stem cell Research(2015)14，185-197)，通过用0.25％胰蛋白酶-EDTA对步骤2)中获得的后前肠细胞进行处理后移液从而使其分散，并通过离心分离去除0.25％胰蛋白酶-EDTA，然后在悬浮步骤3)的新培养基中并重新接种。
可以使用上述第一培养中记载的用于哺乳类细胞培养的基础培养基作为培养基。除了生长因子之外，也可以向培养基中适当添加血清替代物、维生素、抗生素等。
可以使用上述的各种化合物或其盐作为具有CDK8/19抑制活性的因子，根据所使用的化合物或其盐，适当地决定培养基中的添加量，通常为约0.00001μM至5μM、优选为0.00001μM至1μM。作为培养基中的具有CDK8/19抑制活性的因子的浓度，优选为对CDK8/19的抑制活性达到50％以上的浓度。
作为生长因子，优选EGF、KGF、FGF10，更优选KGF和/或EGF，进一步优选KGF和EGF。
培养基中生长因子的浓度可根据所使用的生长因子的种类适当地设定，通常为约0.1nM至1000μM、优选为约0.1nM至100μM。(在使用)EGF的情况下，其浓度为约5ng/ml至2000ng/ml(即，约0.8nM至320nM)、优选为约5ng/ml至1000ng/ml(即，约0.8nM至160nM)、更优选为约10ng/ml至1000ng/ml(即，约1.6nM至160nM)。(在使用)FGF10的情况下，其浓度为约5ng/ml至2000ng/ml(即，约0.3nM至116nM)、优选为约10ng/ml至1000ng/ml(即，约0.6nM至58nM)、更优选为约10ng/ml至1000ng/ml(即，约0.6nM至58nM)。例如对于使用KGF和EGF作为生长因子时的浓度，(在使用)EGF的情况下通常为5ng/mL至150ng/mL、优选为30ng/mL至100ng/mL、特别优选为约50ng/mL，(在使用)KGF的情况下通常为10ng/mL至200ng/mL、优选为50ng/mL至150ng/mL、特别优选为约100ng/mL。
步骤3)中的培养的第1天是在ROCK抑制剂的存在下进行的，之后也可以在不含有ROCK抑制剂的培养基中培养。
此外，培养基中也可以含有PKC活化剂。使用PdBU(PKC activator II)、TPB(PKCactovator V)等作为PKC活化剂，但不限于此。所添加的PKC活化剂的浓度为约0.1ng/ml至100ng/ml、优选为约1ng/ml至50ng/ml、更优选为约3ng/ml至10ng/ml。此外，也可以向培养基中添加二甲亚砜、激活素(1ng/ml至50ng/ml)。
除了上述成分之外，在所有步骤中均可以向培养基中添加血清替代物。此外，根据需要，也可以添加氨基酸、L-谷氨酸、GlutaMAX(产品名称)、非必须氨基酸、维生素、烟酰胺、抗生素(例如抗生素-抗真菌素(Antibiotic-Antimycotic(本说明书中，有时称为AA)、青霉素、链霉素或它们的混合物)、抗菌剂(例如两性霉素B)、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等。向培养基中添加抗生素的情况下，其在培养基中的浓度通常为0.01重量％至20重量％、优选为0.1重量％至10重量％。
此外，也可以不使用饲养细胞而是通过粘附培养来进行细胞培养。在培养时，使用钵、烧瓶、微孔板、OptiCell(产品名称)(Nunc公司)等细胞培养片之类的培养容器。优选对培养容器进行用于提高与细胞之间的粘附性(亲水性)的表面处理、或利用胶原、明胶、多聚-L-赖氨酸、多聚-D-赖氨酸、层粘联蛋白、纤维连接蛋白、基质胶(例:BD基质胶(日本碧迪公司))、玻连蛋白等细胞粘附用基质进行涂覆。作为培养容器，优选为用I-型胶原、基质胶、纤维连接蛋白、玻连蛋白或多聚-D-赖氨酸等涂覆的培养容器，更优选为用基质胶或多聚-D-赖氨酸涂覆的培养容器。
对于培养温度没有特别限制，在30℃至40℃(例如37℃)下进行。此外，培养容器中的二氧化碳浓度为例如5％左右。
可以利用公知的作为表面标记的糖蛋白2(GP2)等进一步纯化步骤3)中获得的胰腺前体细胞。可以使用本身已知的方法，例如使用固定有抗GP2抗体的玻璃珠来进行上述纯化。
根据本发明的方法，能够制造纯度和细胞数量较高的胰腺前体细胞。即，通过由本发明的方法制造的胚体内胚层细胞而制造的胰腺前体细胞以80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上的比例包含PDX1阳性(PDX1+)且NKX6.1阳性(NKX6.1+)的细胞，是包含高纯度的胰腺前体细胞的细胞群。此外，通过本发明的方法制造的胰腺前体细胞的细胞数量多于最初接种的多能干细胞的细胞数量，例如是最初接种的多能干细胞的细胞数量的2倍或2倍以上。
步骤4)分化为内分泌前体细胞
将步骤3)中获得的胰腺前体细胞在含有生长因子的培养基中进一步培养并分化诱导为内分泌前体细胞。可以通过二维培养和三维培养中的任一种来进行培养。二维培养的情况下，通过用0.25％胰蛋白酶-EDTA对步骤3)中获得的胰腺前体细胞进行处理后进行移液从而使其分散，并通过离心分离去除0.25％胰蛋白酶-EDTA，然后在步骤4)的新培养基中悬浮并重新接种。培养时间段为2天至3天、优选为约2天。
可以使用上述第一培养中记载的用于哺乳类细胞培养的基础培养基作为培养基。按照以往的报道(Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133)，向培养基中添加SANT1、维甲酸、ALK5抑制因子II、T3、LDN，也可以进一步适当地添加Wnt阻滞剂、ROCK抑制剂、FGF(优选为FGF2)、血清替代物、维生素、抗生素等。此外，培养基中也可以添加二甲基亚砜。
此外，也可以不使用饲养细胞，而是通过非粘附培养来进行细胞培养。培养时，使用皿、烧瓶、微孔板、多孔板(Nunc社)等或者生物反应器。优选对培养容器进行用于降低与细胞之间的粘附性的表面处理。
对于培养温度没有特别限制，在30℃至40℃(例如37℃)下进行。此外，培养容器中的二氧化碳浓度为例如5％左右。
步骤5)分化为胰岛素产生细胞
将步骤4)中获得的内分泌前体细胞进一步在含有生长因子的培养基中培养，分化诱导为胰岛素产生细胞。培养时间段为10天至30天、优选为约10至20天。
可以使用上述第一培养中记载的用于哺乳类细胞培养的基础培养基作为培养基。按照以往的报道(Nature Biotechnology 2014；32:1121-1133)，向培养基中添加ALK5抑制因子II、T3、LDN、γ-分泌酶抑制剂XX、γ-分泌酶抑制剂RO、N-半胱氨酸、AXL抑制因子、抗坏血酸，也可以进一步适当地添加Wnt抑制剂、ROCK抑制剂、FGF(优选为FGF2)、血清替代物、维生素、抗生素等。例如，可以向培养基中添加ALK5抑制因子II、T3、LDN、γ-分泌酶抑制剂RO和抗坏血酸，或者也可以添加T3、ALK5抑制因子II、ZnSO4、肝素、N-乙酰半胱氨酸、Trolox和R428。
可以通过二维培养和三维培养中的任一种来进行培养。也可以不使用饲养细胞，而是通过非粘附培养来进行细胞培养。培养时，使用皿、烧瓶、微孔板、多孔板(Nunc社)等或者生物反应器。优选对培养容器进行用于降低与细胞之间的粘附性的表面处理。
对于培养温度没有特别限制，在30℃至40℃(例如37℃)下进行。此外，培养容器中的二氧化碳浓度为例如5％左右。
4.分化为胰岛β细胞
通过将上述步骤中获得的胰岛素产生细胞移植至动物体内，能够分化诱导为胰岛β细胞。
“动物”优选为哺乳动物，例如可例举出人、非人灵长类、猪、牛、马、绵羊、山羊、美洲驼、狗、猫、兔、小鼠、豚鼠等，优选为人。
优选在能够将细胞固定于一定位置的体内区域进行移植，例如可以在动物的皮下、腹腔内、腹膜上皮、大网膜、脂肪组织、肌肉组织或胰脏、肾脏等各个器官的包膜下等进行移植。被移植的细胞数量可根据被移植的细胞的分化阶段、移植对象的年龄、体重、移植部位的大小、疾病的严重程度等因素而变化，对此没有特别限制，例如可以为10×104个细胞至10×1011个细胞左右。被移植的细胞在生物体内环境中被分化诱导，能够分化为靶细胞、优选为胰岛β细胞。然后，所获得的胰岛β细胞可以回收，也可以直接留置在生物体内。
通过将利用上述方法获得的胰岛素产生细胞或胰岛β细胞直接移植或者胶囊化后移植至患部，可用作用于治疗糖尿病特别是I型糖尿病的细胞药物。
此外，胰岛素产生细胞或胰岛β细胞也可以是前体药物。前体药物是指移植至体内后分化并转变为具有治疗疾病功能的细胞的细胞。
通过上述方法获得的胰岛素产生细胞或胰岛β细胞的毒性(例如急性毒性、慢性毒性、遗传毒性、生殖毒性、心脏毒性、致癌性)较低，能够直接或通过与药理学上容许的载体等混合作为药物组合物，对哺乳动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、牛、山羊、猴、人)安全地进行给药。
以下，通过实施例对本发明进行说明，但本发明不限于这些的实施例。
实施例
由多能干细胞向胚体内胚层细胞、后前肠细胞、胰腺前体细胞等的分化诱导依照上述第一培养和第二培养以及以往的报道(Stem Cell Research(2015)14、185-197)的方法等实施。
按照制造商的指示以使最终浓度达到2％(0天至3天)的方式设置B-27补充剂(INS(+))或B-27补充剂(INS(-))(Thermo Fisher Scientific)的添加量。(第4天以后的最终浓度达到1％。)
[I]包括由INS(+)培养基变更为INS(-)培养基的向胚体内胚层细胞的分化诱导(二维培养)
(1)方法
(i)细胞
使用了人工多能细胞株即Ff-I01s04株或者Ff-I14s03株作为多能干细胞。
(ii)分化诱导培养基和培养时间表
向包含100ng/mL的激活素A以及3μM的CHIR99021的基础培养基(RPMI培养基(RPMI1640培养基(Thermo Fisher Scientific)))中，进一步添加B-27补充剂(INS(+))或B-27补充剂(INS(-))(Thermo Fisher ScientificThermo Fisher Scientific)作为分化诱导培养基。
接种细胞(第0天)，使用含有或者不含有胰岛素的分化诱导培养基，按照表1中记载的时间表进行培养，分化诱导为胚体内胚层细胞。
【表1】
分化诱导培养基中的胰岛素的有无以及培养时间表
第0天 第1天 第2天 第3天
实施例 INS(+) INS(+) INS(-) INS(-)
比较例 INS(+) INS(+) INS(+) INS(+)
(2)结果
证实了与仅在含有胰岛素的分化诱导培养基中进行培养的情况下(比较例)相比，最初(第0天至第1天)在含有胰岛素的分化诱导培养基中进行培养，然后(第2天至第3天)在不含有胰岛素的分化诱导培养基中进行培养的情况下(实施例)，减少了SOX2+细胞(表示残存未分化细胞或其它谱系细胞)的比例(Ff-I01s04株：比较例为2.1％、实施例为0.8％；Ff-I14s03株：比较例为2.6％、实施例为0.8％)(图1)。
该结果证实了在由多能干细胞向胚体内胚层细胞的分化诱导中，通过将分化诱导培养基由INS(+)培养基变更为INS(-)培养基，能够减少SOX2+细胞的比例，能够制造包含高纯度胚体内胚层细胞的细胞群。
[II]包括由INS(+)培养基变更为INS(-)培养基的向胚体内胚层细胞、后前肠细胞以及胰腺前体细胞的分化诱导
(1)方法
在上述“I”中记载的培养方法中，使用人工多能细胞株即Ff-MH15s02株作为多能干细胞，并使用了RPMI培养基或DMEM培养基(DMEM，高浓度葡萄糖，GlutaMAXTM，丙酮酸钠(Thermo Fisher Scientific))作为基础培养基。在使用RPMI培养基作为基础培养基的情况下，第0天至第3天在含有胰岛素的分化诱导培养基中培养。在使用DMEM培养基作为基础培养基的情况下，最初(第0天)在含有胰岛素的分化诱导培养基中进行培养，然后(第1天至第3天)在不含有胰岛素的分化诱导培养基中进行培养。多能干细胞的接种量为200×104细胞/孔(约21万个细胞/cm2)或250×104细胞/孔(约26万个细胞/cm2)。除此之外，通过与上述“实施例”相同的方法分化诱导为胚体内胚层细胞。
此外，将获得的胚体内胚层细胞进一步分化诱导为后前肠细胞以及胰腺前体细胞。
(2)结果
证实了与使用RPMI培养基且含有胰岛素进行培养的情况相比，在使用DMEM培养基作为基础培养基，且由INS(+)培养基变更为INS(-)培养基的情况下，在任意接种细胞数量下，均减少了SOX2+细胞的比例(DMEM培养基：4.8％，3.1％；RPMI培养基：11.7％，5.1％)(图2)。而且，证实了与第0天至第3天在含有胰岛素的分化诱导培养基中培养的情况相比，将获得的胚体内胚层细胞进一步分化诱导为后前肠细胞的情况下，PDX1+细胞的比例超过90％，进一步分化诱导为胰腺前体细胞的情况下，PDX1+/NKX6.1+细胞的比例超过80％，能够高效地进行分化诱导(图2)。
该结果证实了在由多能干细胞向胚体内胚层细胞的分化诱导中，通过使用DMEM培养基作为基础培养基，且由INS(+)培养基变更为INS(-)培养基，能够减少SOX2+细胞的比例，通过进一步对获得的胚体内胚层细胞进行分化诱导，能够制造含有高浓度的后前肠细胞以及胰腺前体细胞的细胞。此外，证实了在以往的报道(Stem Cell Research(2015)14、185-197)的方法中，Ff-MH15s02株是分化效率不高的细胞株，但是通过本方法也能够高效率地对这样的细胞株进行分化诱导。
[III]仅使用了INS(-)培养基的向胚体内胚层细胞的分化诱导
(1)方法
除了在上述“II”记载的培养方法中，使用Ff-I01s04株作为多能干细胞，不论在使用何种基础培养基的情况下均仅使用添加了B-27补充剂(INS(-))的分化诱导培养基进行培养，以及将接种细胞数量设为70×104细胞/孔(约7万个细胞/cm2)之外，以同样的方法进行胚体内胚层细胞的分化诱导(即，仅在不含有胰岛素的分化诱导培养基中进行了培养)。
此外，将获得的胚体内胚层细胞进一步分化诱导为后前肠细胞。
(2)结果
在使用RPMI培养基作为基础培养基的情况下，所获得的SOX2+细胞的比例为0.6％，但PDX1+细胞的比例为17.7％，显示出较低的值。此外，培养后(第3天)获得的细胞数量减少至10×104细胞/孔(约1万个细胞/cm2)。
此外，在使用DMEM培养基作为基础培养基的情况下，所获得的SOX2+细胞的比例为6.7％，显示出较高的值，并且PDX1+细胞的比例为67.9％。培养后(第3天)获得的细胞数量为129×104细胞/孔(约13万个细胞/cm2)。
该结果证实了在使用不含有胰岛素的分化诱导培养基进行向胚体内胚层细胞的分化诱导的情况下，根据培养基不同而结果不同，但细胞数量的增加被抑制，存在无法获得充分数量的分化细胞的情况、或存在残存的多能干细胞或其它谱系细胞的SOX2阳性(SOX2+)细胞的混入率变高的情况。
包括由[IV]INS(+)培养基变更为INS(-)培养基的向胚体内胚层细胞的分化诱导(三维培养)
对于在上文中证实了其效果的包括由INS(+)培养基变更为INS(-)培养基的向胚体内胚层细胞的分化诱导方法，如下所述，证实了其在使用了生物反应器的三维培养法中也有效。
(1)方法
使用人工多能细胞株即Ff-I14s04株作为多能干细胞。
将细胞以10万个细胞/mL的量接种至添加了Y-27632(10μM)的再生医疗用培养基(StemFit(注册商标)(味之素健康供应))10mL中，在30mL反应器内以70rpm的转速培养24小时后，追加20mL的StemFit(注册商标)，进一步培养48小时。
接着，将上述培养后获得的细胞块在含有向包含100ng/mL的激活素A以及3μM的CHIR99021的RPMI培养基或DMEM培养基中进一步添加了B-27补充剂(INS(+))而得到的分化诱导培养基(30mL)的30mL反应器内以40rpm的转速培养24小时(第0天)。
接着，将上述培养后获得的细胞块在含有包含100ng/mL的激活素A以及B-27补充剂(INS(+))的RPMI培养基或者包含100ng/mL的激活素A以及B-27补充剂(INS(-))的DMEM培养基(分别为30mL)的30mL反应器内，以40rpm的转速培养48小时(第1天至第2天)，获得胚体内胚层细胞。
此外，对于所获得的胚体内胚层细胞，更换分化诱导培养基，通过三维培养进一步进行分化诱导。
(2)结果
关于三维培养中的由多能干细胞向胚体内胚层细胞的分化诱导，与最初使用含有胰岛素的DMEM培养基、之后使用不含有胰岛素的DMEM培养基进行培养而获得的细胞块的SOX2+细胞的比例(0.4％)相比，仅使用含有胰岛素的RPMI培养基进行培养的情况下，所获得的细胞块的SOX2+细胞的比例为6.5％，显示出较高的值(图3)。
然后，在将仅使用含有胰岛素的RPMI培养基进行培养而获得的细胞块分化诱导为后前肠细胞的情况下，所获得的细胞块中PDX1+细胞的比例较低，为20％左右，观察到细胞数量由于细胞块的崩解而减少(图4)。另一方面，在将通过使用最初含有胰岛素的DMEM培养基、之后使用不含有胰岛素的DMEM培养基的培养而获得的细胞块分化诱导为后前肠细胞的情况下，所获得的细胞块中PDX1+细胞的比例较高，大于90％(图3)，并且未观察到细胞数量的减少(图4)。
该结果显示，包括由INS(+)培养基变更为INS(-)培养基的向胚体内胚层细胞的分化诱导方法在使用了生物反应器的三维培养法中也有效，能够以工业规模大量地由多能干细胞生产胚体内胚层细胞或其后的分化细胞。

Claims (16)

1.一种由多能干细胞制造胚体内胚层细胞的方法，所述方法包括：
将多能干细胞在作用胰岛素的条件下的分化诱导培养基中进行第一培养，然后在未作用胰岛素的条件下的分化诱导培养基中进行第二培养的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，
在含有胰岛素的分化诱导培养基中进行第一培养，在不含有胰岛素的分化诱导培养基中进行第二培养。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，
在含有胰岛素且不含有胰岛素信号抑制剂的分化诱导培养基中进行第一培养，在含有胰岛素和胰岛素信号抑制剂的分化诱导培养基中进行第二培养。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，
进行第一培养和第二培养的分化诱导培养基中还含有丙酮酸盐。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，
进行第一培养和第二培养的分化诱导培养基中还含有L-亮氨酰-L-亮氨酸。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，
进行第一培养和第二培养的分化诱导培养基中还含有15mM以上的葡萄糖。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，
所述方法包括进行6小时至48小时的第一培养的步骤。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，
所述方法包括进行至少6小时的第二培养的步骤。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，
在三维培养体系中实施所述方法。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，
在二维培养体系中实施所述方法。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，
在第一培养开始时，含有15万至30万个细胞/cm2的多能干细胞。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，
分化诱导培养基以DMEM，即Dulbecco改良Eagle培养基为基础。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，
第一培养的分化诱导培养基含有ROCK抑制剂和/或GSK3β抑制剂。
14.一种胰岛素产生细胞的制造方法，包括：
进一步对通过将多能干细胞在作用胰岛素的条件下的分化诱导培养基中进行第一培养，然后在未作用胰岛素的条件下的分化诱导培养基中进行第二培养而制造的胚体内胚层细胞进行分化诱导的步骤。
15.一种胰岛素分泌细胞的制造方法，包括：
进一步对通过在含有胰岛素的分化诱导培养基中对多能干细胞进行第一培养，然后在不含有胰岛素的分化诱导培养基中进行第二培养而制造的胚体内胚层细胞进行分化诱导的步骤。
16.一种胰岛素分泌细胞的制造方法，包括：
进一步对通过在含有胰岛素且不含有胰岛素信号抑制剂的分化诱导培养基中对多能干细胞进行第一培养，然后在含有胰岛素和胰岛素信号抑制剂的分化诱导培养基中进行第二培养而制造的胚体内胚层细胞进行分化诱导的步骤。
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