CN106795487B - 胰腺祖细胞的增殖方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及以ES细胞、iPS细胞等多功能性干细胞为来源，诱导分化胰腺祖细胞，并对其进行培养增殖从而制备高纯度的胰腺祖细胞的方法。具体涉及胰腺祖细胞的增殖方法，其包括将胰腺祖细胞用含有(i)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和(ii)ROCK抑制剂的培养基培养的工序。

Description

胰腺祖细胞的增殖方法
相关申请
本申请基于日本专利申请2014-158470号(2014年8月4日提出申请)要求优先权并将其内容通过参考并入本文。
技术领域
本发明涉及胰腺祖细胞(pancreatic progenitor cell)的增殖方法、以及胰腺祖细胞增殖用试剂和试剂盒。更具体而言，涉及一种包括将胰腺祖细胞用含有EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和ROCK抑制剂的培养基培养为特征的胰腺祖细胞的增殖方法、以及用于上述方法的试剂及试剂盒。
背景技术
胰脏具有内分泌腺(内分泌细胞)和外分泌腺(外分泌细胞)，由作为内分泌细胞的胰腺α细胞、胰腺β细胞、胰腺δ细胞和PP细胞分别分泌称为胰高血糖素、胰岛素、促生长素抑制素、胰多肽的胰腺激素，而由外分泌细胞分泌消化酶如胰脂肪酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶和胰淀粉酶等。
糖尿病大体分类为I型糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)和II型糖尿病(非胰岛素依赖性糖尿病)这2种，其中，I型糖尿病是由于产生胰岛素的胰腺β细胞的破坏导致胰岛素的分泌受损而发生的。作为近年来尝试的对于I型糖尿病的治疗方法，除了使源自患者的胰腺β细胞再生并进行移植的方法、将由ES细胞或者iPS细胞诱导分化成的胰腺β细胞进行移植的方法以外，还已知有移植胰腺祖细胞而减弱糖尿病的方法。
与上述治疗法相关，已有关于内胚层细胞的增殖方法、由得到的内胚层细胞得到β细胞的诱导方法(专利文献1)、由人多功能性干细胞得到增殖性内胚层细胞的诱导方法(非专利文献1)、由人多功能性干细胞得到增殖性前肠内胚层细胞的诱导方法(非专利文献2)的报告。
虽然也有关于使由胰腺祖细胞分化而成的胰腺内分泌祖细胞增殖的方法(非专利文献3)的报告，但预计由于将胰腺内分泌祖细胞与间充质细胞进行共培养，因此得到的胰腺内分泌祖细胞的纯度不会非常高。另外，在该报告中对于胰腺祖细胞的增殖方法没有记载。
虽然有关于使用人ES细胞的NKX6.1阳性胰腺祖细胞的诱导方法，及利用NKX6.1高表达胰腺祖细胞来治疗糖尿病(非专利文献4)的报告，但对于胰腺祖细胞的增殖方法没有记载。另外，也有对由人ES细胞、人iPS细胞诱导分化胰岛素产生细胞，并移植至小鼠对糖尿病治疗的应用进行研究的报告，但对于胰腺祖细胞的增殖方法没有记载(非专利文献6及7)。
从活体分离的胰腺祖细胞经常在传代培养时停止增殖，难以在活体外有效地增殖胰腺祖细胞。Sui等报告了关于将源自ES细胞的胰腺祖细胞用含有B-27(注册商标)补充剂(supplement)、FGF10、EGF、SB431542(TGFβ抑制剂)的DMEM/F12培养基进行增殖的方法(非专利文献5)。但是，该方法的增殖速度为10周约30倍，得到的胰腺祖细胞的纯度为约50％，还不够充分。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：US2010/0041150
非专利文献
非专利文献1：Xin Cheng et al.,Cell Stem Cell 10(2012),371-384
非专利文献2：Hannan et.al.,Stem Cell Reports 1(2013),293-306
非专利文献3：Sneddon et.al.,Nature 491(2012),765-770
非专利文献4：Rezania et.al.,Stem Cells 31(2013),2432-2442
非专利文献5：Lina Sui et.al.,Stem Cell Revand Rep 9(2013),569-577
非专利文献6：Rezania et al.Nature Biotechnology 32(2014),1121-1133
非专利文献7：Pagliuca et al.,Cell 159(2)(2014),428-439
发明内容
发明要解决的问题
本发明的课题在于，使胰腺祖细胞以保持其功能的状态在活体外有效地增殖。尤其是，提供以ES细胞、iPS细胞等多功能性干细胞为来源(source)，诱导分化胰腺祖细胞，对其进行培养和增殖，从而制备高纯度胰腺祖细胞的方法。
解决问题的方法
发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现：通过将胰腺祖细胞用含有EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和ROCK抑制剂的培养基培养，可高效率地得到高纯度的胰腺祖细胞，进而完成了本发明。
即，本发明涉及以下[1]～[8]。
[1]胰腺祖细胞的增殖方法(在本说明书中，有时简称为本发明的增殖方法)，其中，对胰腺祖细胞进行以下工序(1)：
(1)用含有(i)EGF信号转导激活因子(EGF signal transduction activator)和/或FGF信号转导激活因子(FGF signal transduction activator)、和(ii)ROCK抑制剂的培养基培养的工序；
[2]根据上述[1]所述的增殖方法，其中，培养基进一步含有(iii)Wnt信号抑制剂；
[3]根据上述[1]或[2]所述的增殖方法，其中，所述胰腺祖细胞为通过将PDX1阳性细胞用含有(a)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和(b)Wnt信号抑制剂的培养基培养而诱导的胰腺祖细胞；
[4]胰腺祖细胞的增殖用试剂，其含有(i)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和(ii)ROCK抑制剂；
[5]胰腺祖细胞的增殖用试剂盒，其含有(i)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和(ii)ROCK抑制剂；
[6](i)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和(ii)ROCK抑制剂的用途，其用于增殖胰腺祖细胞；
[7]胰腺祖细胞的制备方法，其包括将胰腺祖细胞用含有(i)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和(ii)ROCK抑制剂的培养基培养并进行增殖的工序，和从培养物中提取胰腺祖细胞的工序；
[8]根据上述[7]记载的制备方法,其包括将PDX1阳性细胞用含有(a)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和(b)Wnt信号抑制剂的培养基培养，并诱导分化成胰腺祖细胞的工序。
需要说明的是，在上述[1]～[8]中，所述胰腺祖细胞及PDX1阳性细胞优选为人胰腺祖细胞及人PDX1阳性细胞。
发明的效果
根据本发明，可以高效率且高纯度的制备难以在活体外增殖的胰腺祖细胞。本发明的方法除了源自活体的胰腺祖细胞以外，也可以适用于由ES细胞及iPS细胞等多功能性干细胞而诱导分化的胰腺祖细胞。得到的胰腺祖细胞可以直接或者诱导分化成胰腺β细胞等而利用于糖尿病的治疗、糖尿病治疗药的试验方法等。
附图说明
[图1]实施例1中诱导的胰腺祖细胞的染色图像。(i)对照、(ii)XAV939、(iii)添加bFGF、(iv)XAV939+bFGF。NKX6.1阳性细胞由于Alexa568而呈现红色，PDX1阳性细胞由于Alexa488而呈现绿色，细胞的核由于Hoechst33342而呈现蓝色。在组合添加XAV939和bFGF的情况下，PDX1阳性且NKX6.1阳性细胞的比例最高。
[图2]实施例2中诱导的胰腺祖细胞的染色图像。(i)XAV939、(ii)XAV939+EGF、(iii)XAV939+Betacellulin、(iv)XAV939+bFGF。NKX6.1阳性细胞由于Alexa568而呈现红色，PDX1阳性细胞由于Alexa488而呈现绿色，细胞的核由于Hoechst33342而呈现蓝色。除了组合添加bFGF和XAV939的情况以外，还在组合添加EGF和XAV939的情况下、组合添加Betacellulin和XAV939的情况下，PDX1阳性且NKX6.1阳性细胞的比例较高。
[图3]实施例3中由297L细胞诱导的胰腺祖细胞的染色图像。NKX6.1阳性细胞由于Alexa568而呈现红色，PDX1阳性细胞由于Alexa488而呈现绿色，细胞的核由于Hoechst33342而呈现蓝色。在使用297L1细胞株的情况下，也可以通过组合添加XAV939和bFGF而将大部分细胞诱导成PDX1阳性且NKX6.1阳性的细胞。
[图4](A)显示传代1天后(左)和传代4天后(右)的细胞的照片。从培养容器剥离胰腺祖细胞(源自297L1，传代数：4)后，将细胞的一部分在另外的培养容器中传代并进行培养。虽然在培养的第1天中，细胞密度为较低的状态，但在培养的第4天，细胞密度升高。(B)显示传代数与细胞量的关系。使胰腺祖细胞增殖后，将一部分的细胞进行传代或增殖，并将此操作连续进行21次。通过测定各传代时的细胞量，算出1个细胞通过传代数重复而增殖为几倍的细胞数。通过以稳定的速度使细胞进行增殖并重复21次传代，明确了以1个细胞增加到1×1018的细胞的速度进行增殖。
[图5]对进行了5次传代的胰腺祖细胞(左)和进行了66次传代的胰腺祖细胞(右)进行使用抗PDX1抗体和抗NKX6.1抗体的免疫荧光染色。NKX6.1阳性细胞由于Alexa568而呈现红色，PDX1阳性细胞由于Alexa488而呈现绿色，细胞的核由于Hoechst33342而呈现蓝色。可知，在经5次传代的细胞中和经66次传代的细胞中，均为大部分的细胞为PDX1阳性且NKX6.1阳性。
[图6]显示了对重复传代28次后的胰腺祖细胞进行Carnoy固定后，实施基于Q-band的核型分析的结果。可知全部的染色体正常具备。
[图7]显示将传代数44的胰腺祖细胞制成单个细胞状态后，接种于含有图中的因子的培养液中培养2天，然后进行使用抗PDX1抗体和抗NKX6.1抗体的免疫荧光染色的结果。(i)对照、(ii)Y27632、(iii)bFGF、(iv)XAV939、(v)bFGF+Y27632、(vi)Y27632+XAV939、(vii)bFGF+XAV939、(viii)bFGF+Y27632+XAV939。NKX6.1阳性细胞由于Alexa568而呈现红色，PDX1阳性细胞由于Alexa488而呈现绿色，细胞的核由于Hoechst33342而呈现蓝色。除了组合添加bFGF和Y27632和XAV939的情况以外，还在组合添加Y27632和bFGF的情况下、组合bFGF和XAV939的情况下，均观察了PDX1阳性且NKX6.1阳性的细胞增殖的状况。
[图8]实施例6中的由NTE-1-7(左)、NTE-1-8(中)、NTE-1-9(右)的各iPS细胞株诱导的胰腺祖细胞的染色图像。NKX6.1阳性细胞由于Alexa568而呈现红色，PDX1阳性细胞由于Alexa488而呈现绿色，细胞的核由于Hoechst33342而呈现蓝色。可知，在由任一的人iPS细胞诱导分化并进行2次传代的情况下，均为大部分的细胞为PDX1阳性且NKX6.1阳性。
[图9]参考例3中诱导成的INSULIN阳性细胞的染色图像。对照(左)，用含有Alk5抑制剂II的培养基培养的细胞(右)。INSULIN阳性细胞由于Alexa568而呈现红色，NKX6.1阳性细胞由于Alexa488而呈现绿色，细胞的核由于Hoechst33342而呈现蓝色。可知通过使用含有作为分化诱导因子的Alk5抑制剂II的培养基培养，由胰腺祖细胞诱导分化了INSULIN阳性细胞。
具体实施方式
1.术语的说明
以下对本发明及本说明书中使用的术语进行说明。
本发明所述的“胰腺祖细胞”是指：能分化为胰内分泌细胞及胰外分泌细胞的内胚层类细胞，其根据PDX1阳性、NKX6.1阳性、及INS(INSULIN)阴性而赋予特征。本发明所述的“胰腺祖细胞”只要是源自哺乳动物即可，没有特别限定，优选为人胰腺祖细胞。
对胰腺祖细胞而言，可以通过以适当的条件进行培养而诱导分化为具有胰岛素产生能力的“胰腺β细胞(在本说明书中与“胰岛素分泌细胞”同义)”。“胰腺β细胞”根据PDX1阳性、NKX6.1阳性、及INS阳性而赋予特征。
就本发明所述的“PDX1阳性细胞”而言，其根据PDX1阳性、NKX6.1阴性、及INS阴性而赋予特征。就“PDX1阳性细胞”而言，例如可以通过由ES细胞(胚胎干细胞)、iPS细胞等多功能性干细胞，经过内胚层细胞而诱导分化。“内胚层细胞”是指能分化成构成内胚层系组织的细胞的细胞，其根据作为内胚层标记的SOX17及FOXA2阳性而赋予特征。本发明所述的“PDX1阳性细胞”只要是源自哺乳动物即可，没有特别限定，优选为人PDX1阳性细胞。
“多功能性干细胞”是指潜在具有与ES细胞相同的分化多能性，即分化为活体的各种组织(内胚层、中胚层、外胚层中的全部)的能力的细胞，其特征在于是作为在多功能性细胞中特异性表达的转录因子Oct3/4阳性及Nanog阳性。
尤其是，将向哺乳动物体细胞或未分化干细胞导入特定的因子(核重编程因子)，进行重编程使得其具有与ES细胞相同的分化多能性的细胞称为“人工多功能性干细胞”。
目前，存在各种各样的“人工多功能性干细胞”，除了由Yamanaka等通过向小鼠成纤维细胞导入Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc 4种因子而最初建立的iPS细胞(Takahashi K,Yamanaka S.,Cell,(2006)126：663-676)以外，也可以使用将相同的4种因子导入人成纤维细胞而建立的人iPS细胞(Takahashi K,Yamanaka S.,et al.Cell,(2007)131：861-872.)、在导入上述4种因子后以Nanog的表达作为指标进行筛选而建立的Nanog-iPS细胞(Okita,K.,Ichisaka,T.,and Yamanaka,S.(2007).Nature 448，313-317.)、利用不含有c-Myc的方法制备的iPS细胞(Nakagawa M,Yamanaka S.,et al.Nature Biotechnology,(2008)26，101-106)。
另外，也可以使用由威斯康星大学的Thomson等制作的人工多功能性干细胞(YuJ.,Thomson JA.et al.,Science(2007)318:1917-1920.)，由哈佛大学的Daley等制作的人工多功能性干细胞(Park IH,Daley GQ.et al.,Nature(2007)451:141-146)，由Sakurada等制作的人工多功能性干细胞(日本特开2008-307007号)等。
除此以外，也可以使用在已公开的所有论文(例如：Shi Y.,Ding S.,et al.,CellStem Cell,(2008)Vol3,Issue 5,568-574；，Kim JB.,Scholer HR.,et al.,Nature,(2008)454,646-650；Huangfu D.,Melton,DA.,et al.,Nature Biotechnology,(2008)26,No7,795-797)，或者专利(例如：日本特开2008-307007号、日本特开2008-283972号、US2008-2336610、US2009-047263、WO2007-069666、WO2008-118220、WO2008-124133、WO2008-151058、WO2009-006930、WO2009-006997、WO2009-007852)中记载的本领域知晓的人工多功能性干细胞。
人工多功能性干细胞可以优选作为本发明所述的PDX1阳性细胞的来源使用。对PDX1阳性细胞而言，可以通过按照例如WO2011-081222中记载的方法，由人工多功能性干细胞进行诱导分化而获得。本发明使用的“多功能性干细胞”及“人工多功能性干细胞”只要是源自哺乳动物即可，没有特别限定，优选为人多功能性干细胞及人人工多功能性干细胞。
本发明所述的细胞，其特征在于若干标记的表达。
其中，“PDX1(pancreatic-duodenal homeobox1)”也称为insulin promoterfactor 1，是在胰脏的发育及β细胞分化中具有重要的功能并且也参与保持活体内的胰腺β细胞的功能的转录因子。“NKX6.1”与PDX1相同，也是在β细胞分化中具有重要的功能、并且也参与保持活体内的胰腺β细胞的功能的转录因子。另一方面，“INS(INSULIN)”表示细胞内胰岛素，随着由胰腺祖细胞向胰腺β细胞(胰岛素生成细胞)的分化而表达升高。
上述标记的表达可以利用使用抗体的免疫染色、RT-PCR等进行定量检测。
对本发明所述的“EGF信号转导激活因子”而言，包括激活EGF(上皮细胞生长因子)受体家族介导的信号转导通路的所有物质，可列举例如：EGF(特别是人EGF)、其功能类似物、TGFα、HB-EGF、双调蛋白(Amphiregulin)、Betacellulin、Epiregulin。优选EGF信号转导激活因子为EGF(特别是人EGF)或Betacellulin。
对本发明所述的“FGF信号转导激活因子”而言，包括激活FGF(成纤维细胞生长因子)受体家族介导的信号转导通路的所有物质，可列举例如：aFGF(FGF1)、bFGF(FGF2)、FGF3～23、及它们的功能类似物等。优选FGF信号转导激活因子为bFGF，特别是人bFGF。
本发明所述的“ROCK抑制剂”是指，抑制Rho激酶(ROCK：Rho-associated,coiled-coil containing protein kinase)的物质，可以为抑制ROCK I和ROCK II中任一种的物质。对ROCK抑制剂而言，只要是具有上述的功能即可，没有特别限定，例如：N-(4-吡啶基)-4β-[(R)-1-氨基乙基]环己烷-1α-羧酰胺(在本说明书中，也称为Y-27632)、Fasudil(HA1077)、(2S)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]六氢-1H-1,4-二氮杂环庚三烯(即，H-1152)、4β-[(1R)-1-氨基乙基]-N-(4-吡啶基)苯-1α-羧酰胺(即，Wf-536)、N-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4PER(R)-1-氨基乙基]环己烷-1α羧酰胺(即，Y-30141)、N-(3-{[2-(4-氨基-1,2,5-噁二唑-3-基)-1-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基]氧基}苯基)-4-{[2-(4-吗啉基)乙基]-氧基}苯甲酰胺(即，GSK269962A)、N-(6-氟-1H-咪唑-5-基)-6-甲基-2-氧代-4-[4-(三氟甲基)苯基]-3,4-二氢-1H-吡啶-5-羧酰胺(即，GSK429286A)；针对ROCK的抗体(包含功能性片段)、反义核酸、及siRNA；ROCK的拮抗剂、显性阴性形式(dominant negative forms)；可以利用其它的公知的ROCK抑制剂(例如参照：US2005-0209261、US2005-0192304、US2004-0014755、US2004-0002508、US2004-0002507、US2003-0125344、WO2003/082808、US2003-0087919、WO2005/035506、WO2005/074643、WO2004/039796、WO2003/062227、WO2003/062225、WO2003/059913、WO2002/076976、WO2002/076977、WO01/17562、WO00/78351、WO98/06433)。优选ROCK抑制剂为N-(4-吡啶)-4β-[(R)-1-氨基乙基]环己烷-1α-羧酰胺(即，Y-27632)。
本发明所述的“Wnt信号抑制剂”是指抑制Wnt介导的信号转导通路的物质，可列举例如：IWP2、IWP3、IWP4、2-(4-三氟甲基苯基)-7,8-二氢-5H-噻喃并[4,3-d]嘧啶-4(3H)-酮(在本说明书中，也称为XAV939)、IWR1、g-CSF、IGFBP4、Dkk1、Cerberus、抗Wnt抗体、Wnt激动剂(Wnt受体抑制剂)、可溶型Wnt受体蛋白(Frzb-1等)、显性阴性体等。优选Wnt信号抑制剂为2-(4-三氟甲基苯基)-7,8-二氢-5H-噻喃并[4,3-d]嘧啶-4(3H)-酮(即，XAV939)。
2.胰腺祖细胞的增殖方法
本发明的胰腺祖细胞的增殖方法，其特征在于，用含有(i)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和(ii)ROCK抑制剂的培养基培养胰腺祖细胞。需要说明的是，在本说明书中，将利用上述增殖方法使胰腺祖细胞增殖的工序称为增殖工序。
增殖工序中使用的“培养基”只要是用于干细胞的培养的即可，没有特别限定。作为基础培养基，可列举例如：BME培养基、BGJb培养基、CMRL1066培养基、Glasgow MEM培养基、Improved MEM ZincOption培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、无血清DMEM/F12培养基、Ham's培养基、RPMI 1640培养基、Fischer's培养基、及它们的混合培养基。基础培养基优选为无血清DMEM/F12培养基、RPMI1640培养基、Improved MEM Zinc Option培养基，特别优选为Improved MEM Zinc Option培养基。
对培养基而言，优选实质上不含血清和/或血清提取物的培养基，更优选无血清培养基。“实质上不含”是指，以血清的含量计，低于约1容量％，优选为低于约0.1容量％，进一步优选为低于约0.01容量％。“无血清培养基”是指不含有无调整或未纯化的血清的培养基，而混入有经纯化的源自血液的成分、源自动物组织的成分(例如：生长因子)的培养基属于无血清培养基。
培养基也可以包含“血清替代物”。作为血清替代物，可列举例如：白蛋白(例如：富脂白蛋白(lipid-rich albumin))、转铁蛋白、脂肪酸、胶原前体、微量元素(例如锌、硒)、B-27(注册商标)补充剂、N2补充剂、Knockout Serum Replacement(Invitrogen公司制)、2-巯基乙醇、3’硫醇丙三醇等。对培养基中的浓度而言，在血清替代物为B-27(注册商标)补充剂的情况下为0.01～10重量％，优选为0.1～2重量％。
培养基含有(i)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和(ii)ROCK抑制剂。
对培养基中的EGF信号转导激活因子的浓度而言，根据使用的物质(因子)的种类而适当设定，通常为约0.01nM～1000μM，优选为约0.1nM～100μM。在为EGF的情况下，其在培养基中的浓度为约0.005～2.0μg/ml(即，约0.8～320nM)，优选为约0.005～1.0μg/ml(即，约0.8～160nM)，更优选为约0.01～1.0μg/ml(即，约1.6～160nM)。
作为培养基中含有的FGF信号转导激活因子的例子，可列举之前示例的“FGF信号转导激活因子”，优选为bFGF(特别是人bFGF)。对培养基中的FGF信号转导激活因子的浓度而言，根据使用的物质(因子)的种类而适当设定，通常为约0.01nM～1000μM，优选为约0.1nM～100μM。在为FGF的情况下，其在培养基中的浓度为约0.005～2.0μg/ml(即，约0.3～116nM)，优选为约0.005～1.0μg/ml(即，约0.3～58nM)，更优选为约0.01～1.0μg/ml(即，约0.6～58nM)。需要说明的是，在组合使用EGF信号转导激活因子和FGF信号转导激活因子时，在上述浓度范围基础上对各因子进行适当增减而使用。
作为培养基中含有的ROCK抑制剂的例子，可列举前面示例的“ROCK抑制剂”，优选为N-(4-吡啶基)-4β-[(R)-1-氨基乙基]环己烷-1α-羧酰胺(即，Y-27632)。
虽然培养基中的ROCK抑制剂的浓度根据用的物质(因子)的种类不同而适当设定，但通常约0.01nM～1000μM，优选为约0.1nM～100μM。在为Y-27632的情况下，其在培养基中的浓度为约0.1～100μM，优选为约1.0～30μM，更优选为约2.0～20μM。
培养基也可以进一步含有Wnt信号抑制剂。
作为培养基中含有的Wnt信号抑制剂的例子，可列举前面示例的“Wnt信号抑制剂”，优选为2-(4-三氟甲基苯基)-7,8-二氢-5H-噻喃并[4,3-d]嘧啶-4(3H)-酮(即，XAV939)。
虽然培养基中Wnt信号抑制剂的浓度根据用的物质(因子)的种类不同而适当设定，但通常约0.01nM～1000μm，优选为约0.1nM～100μm。在为XAV939的情况下，其在培养基中的浓度为约0.1μM以上，优选为约0.1～10μM，更优选为约0.2～5μm。
作为培养基使用的物质(因子)，优选FGF信号转导激活因子为bFGF(特别是人bFGF)，ROCK抑制剂为N-(4-吡啶)-4β-[(R)-1-氨基乙基]环己烷-1α-羧酰胺(即，Y-27632)。
培养基也可以进一步含有Wnt信号抑制剂，在这种情况下，优选Wnt信号抑制剂为2-(4-三氟甲基苯基)-7,8-二氢-5H-噻喃并[4,3-d]嘧啶-4(3H)-酮(即，XAV939)。
对EGF信号转导激活因子、FGF信号转导激活因子、ROCK抑制剂、Wnt信号抑制剂而言，均在多种组合使用时，在上述浓度范围基础上对各因子/抑制剂进行适当增减而使用。
在上述增殖工序中的细胞培养中，优选实质上不含饲养细胞(feeder cell)和/或饲养细胞的提取物。“实质上不含”是指，饲养细胞和/或饲养细胞提取物在培养基中的含量低于约5容量％，优选低于约1容量％，进一步优选低于约0.01容量％。由此，可以防止混入源自饲养细胞的异物，避免排斥反应的风险。
就上述增殖工序中使用的容器而言，只要能够培养胰腺祖细胞即可，没有特别限定。作为容器，可列举烧瓶、组织培养烧瓶、平皿、皮氏培养皿、组织培养皿、多重皿(multidish)、微量滴定板(Microplate、Microtiter plate)、微孔板、多重板(Multiplate)、多孔板、载玻片、腔室玻片、培养皿、管、托盘(tray)、培养袋及转瓶。在悬浮培养的情况下，对容器而言，优选使用疏水性的材质的容器，或涂布有水凝胶、类脂质等防止细胞、蛋白质进行吸附的材料的容器。为了有效地形成细胞凝集块，优选容器具有U字或者V字形状的底面。另一方面，在贴壁培养的情况下，如后所述，优选容器为细胞粘附性。
在本发明的增殖方法中，胰腺祖细胞可利用贴壁培养或悬浮培养进行诱导。在贴壁培养的情况下，可使用平皿、烧瓶、微量滴定板、OptiCell(注册商标)(Nunc公司)等的细胞培养片等，但容器优选为经过用于提高与细胞的粘附性(亲水性)的表面处理、或涂布有胶原蛋白、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白等细胞支持底物。特别优选使用Type I-collagen、BD Matrigel(日本Becton Dickinson公司)、纤维粘连蛋白、玻连蛋白等。
对培养温度没有特别的限定，可为约30～40℃，优选为约37℃。CO2浓度可为约1～10％，优选为约3～8％。氧分压为1～10％即可。
可以通过使用免疫染色等检测上述PDX1和NKX6.1的表达，来确认增殖的细胞是胰腺祖细胞。
需要说明的是，在增殖工序中，即使在将培养基中的ROCK抑制剂替换为Wnt信号抑制剂的情况下，也可以使胰腺祖细胞增殖。
3.由PDX1阳性细胞的胰腺祖细胞的诱导
作为胰腺祖细胞，可以使用将PDX1阳性细胞用含有(a)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和(b)Wnt信号抑制剂的培养基培养而诱导成的胰腺祖细胞。需要说明的是，在本说明书中，有时将通过用上述培养基培养PDX1阳性细胞而诱导胰腺祖细胞的工序，称为胰腺祖细胞的诱导分化工序。
在胰腺祖细胞的诱导分化工序中使用的培养基(本说明书中，有时称为诱导培养基)只要是用于干细胞培养的即可，没有特别限定。作为基础培养基，可列举例如：BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、Glasgow MEM培养基、Improved MEM ZincOption培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、无血清DMEM/F12培养基、Ham's培养基、RPMI 1640培养基、Fischer’s培养基及它们的混合培养基。优选基础培养基为无血清DMEM/F12培养基、RPMI1640培养基、Improved MEM Zinc Option培养基，特别优选Improved MEM Zinc Option培养基。
对诱导培养基而言，优选实质上不含血清和/或血清提取物的培养基，更优选无血清培养基。“实质上不含”是指，以血清的含量计，低于约1容量％，优选为低于约0.1容量％，进一步优选为低于约0.01容量％。“无血清培养基”是指不含有无调整或未纯化的血清的培养基，而混入有经纯化的源自血液的成分、源自动物组织的成分(例如：生长因子)的培养基属于无血清培养基。
诱导培养基可以包含“血清替代物”。作为血清替代物，可列举例如：白蛋白(例如：富脂白蛋白)、转铁蛋白、脂肪酸、胶原前体、微量元素(例如，锌、硒)、B-27(注册商标)补充剂、N2补充剂、Knockout Serum Replacement(Invitrogen公司制)、2-巯基乙醇、3’硫醇丙三醇等。对培养基中的浓度而言，在血清替代物为B-27(注册商标)补充剂的情况下为0.01～10重量％，优选为0.1～2重量％。
诱导培养基含有(a)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和(b)Wnt信号抑制剂。
作为诱导培养基中的EGF信号转导激活因子的例子，可列举之前示例的“EGF信号转导激活因子”，优选为EGF(特别是人EGF)及Betacellulin。
对诱导培养基中的EGF信号转导激活因子的浓度而言，根据使用的物质(因子)的种类而适当设定，通常为约0.01nM～1000μM，优选为约0.1nM～100μM。在为EGF的情况下，其在诱导培养基中的浓度为约0.005～2.0μg/ml(即，约0.8～320nM)，优选为约0.005～1.0μg/ml(即，约0.8～160nM)，更优选为约0.01～1.0μg/ml(即，约1.6～160nM)。
作为诱导培养基中的FGF信号转导激活因子的例子，可列举之前示例的“FGF信号转导激活因子”，优选为bFGF(特别是人bFGF)。
对诱导培养基中FGF信号转导激活因子的浓度而言，根据使用的物质(因子)的种类、PDX1阳性细胞的类型而适当设定，通常为约0.01nM～1000μM，优选为约0.1nM～100μM。在为FGF的情况下，其在诱导培养基中的浓度为约0.005～2.0μg/ml(即，约0.3～116nM)，优选为约0.005～1.0μg/ml(即，约0.3～58nM)，更优选为约0.01～1.0μg/ml(即，约0.6～58nM)。。需要说明的是，在组合使用EGF信号转导激活因子和FGF信号转导激活因子时，在上述浓度范围基础上对各因子进行适当增减而使用。
作为诱导培养基中的Wnt信号抑制剂的例子，可列举前面示例的“Wnt信号抑制剂”，优选为2-(4-三氟甲基苯基)-7,8-二氢-5H-噻喃并[4,3-d]嘧啶-4(3H)-酮(即，XAV939)。
诱导培养基中的Wnt信号抑制剂的浓度根据使用的物质(因子)的种类、PDX1阳性细胞的类型而适当设定，通常为约0.01nM～1000μM，优选为约0.1nM～100μM。在为XAV939的情况下，其在诱导培养基中的浓度为约0.01μM以上，优选为约0.01～10μM，更优选为约0.2～5μM。
作为诱导培养基使用的物质(因子)，优选EGF信号转导激活因子为EGF(特别是人EGF)或Betacellulin，FGF信号转导激活因子为bFGF(特别是人bFGF)，Wnt信号抑制剂为2-(4-三氟甲基苯基)-7,8-二氢-5H-噻喃并[4,3-d]嘧啶-4(3H)-酮(即，XAV939)。
对EGF信号转导激活因子、FGF信号转导激活因子、Wnt信号抑制剂而言，均在多种组合使用时，在上述浓度范围基础上对各因子/抑制剂进行适当增减而使用。
对胰腺祖细胞的诱导分化工序中的细胞培养而言，与增殖工序相同地，优选实质上不使用饲养细胞和/或饲养细胞提取物。另外，在细胞培养中使用的容器，也可以使用增殖工序中记载的容器。
在胰腺祖细胞的诱导分化工序中，PDX1阳性细胞可利用贴壁培养或悬浮培养进行诱导。在贴壁培养的情况下，可使用平皿、烧瓶、微量滴定板、OptiCell(注册商标)(Nunc公司)等的细胞培养片等，且容器优选经过用于提高与细胞的粘附性(亲水性)的表面处理，或涂布有胶原蛋白、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白等细胞支持底物。特别优选使用Type I-collagen、BD Matrigel(日本Becton Dickinson公司)、纤维粘连蛋白、玻连蛋白等。
对培养温度没有特别的限定，可为约30～40℃，优选为约37℃。CO2浓度可为约1～10％，优选为约3～8％。氧分压可为1～10％。
可以通过使用免疫染色等检测上述PDX1和NKX6.1的表达，来确认诱导分化成的细胞是胰腺祖细胞。
4.胰腺祖细胞的增殖用试剂、试剂盒
本发明提供胰腺祖细胞的增殖用试剂或者试剂盒，其含有(i)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和(ii)ROCK抑制剂。
对本发明的试剂而言，能够以预先混合的方式含有上述(i)和(ii)，也能够以使得用时可以制备的分别包装的状态含有上述(i)和(ii)。本发明的试剂可以进一步含有(iii)Wnt信号抑制剂。另外，根据需要还可以包含使用说明书。
本发明的试剂盒含有包括上述(i)及(ii)的试剂作为必要的组分。对本发明的试剂盒而言，优选以使得用时可以制备的分别状态含有上述(i)及(ii)，但也能够以预先混合的状态含有上述(i)及(ii)。
本发明的试剂盒除了上述(i)及(ii)以外，也可以进一步含有(iii)Wnt信号抑制剂。进一步，也可以根据需要包含培养用容器、培养用容器的涂布剂、培养基、培养基添加成分、其它器具、确认胰腺祖细胞用的试剂(抗PDX1抗体、抗NKX6.1抗体等)、使用说明书等。
对作为本发明的试剂及试剂盒的对象的胰腺祖细胞而言，可以是源自患者的细胞或者由源自患者的细胞而再生成的胰腺祖细胞，也可以是由ES细胞、iPS细胞等多功能性干细胞而诱导成的胰腺祖细胞。
5.用于增殖胰腺祖细胞的用途
本发明也提供(i)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和(ii)ROCK抑制剂的用途，其用于增殖胰腺祖细胞。
上述用途的特征在于，组合使用(i)和(ii)用于使胰腺祖细胞增殖。另外，对上述用途而言，也可以在(i)和(ii)的基础上进一步组合Wnt信号抑制剂。对使用的胰腺祖细胞没有特别限定，可以是源自患者的细胞或者由源自患者的细胞再生成的胰腺祖细胞，也可以是由ES细胞、iPS细胞等多功能性干细胞诱导成的胰腺祖细胞。
6.胰腺祖细胞的制备方法
本发明提供胰腺祖细胞的制备方法，其包括将胰腺祖细胞用含有(i)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和(ii)ROCK抑制剂的培养基培养并进行增殖的工序，和从培养物中提取胰腺祖细胞的工序。
对胰腺祖细胞的培养、增殖工序而言，可以按照上述“2.胰腺祖细胞的增殖方法”中的记载进行实施。因而，培养基也可以进一步含有Wnt信号抑制剂。
就胰腺祖细胞从培养物中的提取(回收)而言，根据用于培养的容器，按照通常的方法进行实施。例如，将培养物中的胰腺祖细胞利用PBS等缓冲液洗涤，然后加入用于剥离细胞的酶液(胰蛋白酶溶液、Accutase溶液等)并反应一定时间。在上述反应后添加培养液等，然后通过多次吹打培养液，使胰腺祖细胞从培养容器剥离并回收。
本发明的制备方法也可以进一步包括：在上述增殖工序前，用含有(a)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、以及(b)Wnt信号抑制剂的培养基培养PDX1阳性细胞，并诱导分化胰腺祖细胞的工序。由PDX1阳性细胞向胰腺祖细胞的诱导分化，可以按照上述“3.由PDX1阳性细胞向胰腺祖细胞的诱导方法”的记载进行实施。
7.胰腺祖细胞的利用
根据本发明的增殖方法或者制备方法得到的胰腺祖细胞，其增殖能力高、功能也得以保持，纯度也高。另外，在不与饲养细胞、其它细胞共培养，并使用实质上不含血清、血清提取物的培养基进行培养的情况下，可得到不含有杂质、安全性高的胰腺祖细胞。
当本发明的胰腺祖细胞为由利用伴随向基因组进行基因插入的方法制备的人工多功能性干细胞所诱导成的细胞的情况下，该胰腺祖细胞虽然从保持源自人工多功能性干细胞的核重编程因子的方面来说，与天然的胰腺祖细胞有区别，但其功能与自然的胰腺祖细胞没有变化。
根据如上特性，本发明的方法得到的胰腺祖细胞对于糖尿病的细胞疗法有用。例如，可以通过将胰腺祖细胞给予糖尿病患者来减弱糖尿病(Stem Cells.2013Nov；31(11):2432-42)。
另外，根据本发明的方法制备的胰腺祖细胞，可以使用以往公知的方法(StemCell Research 2012 8,274-284)诱导分化成INS阳性的胰岛素生成细胞(胰腺β细胞)，通过将得到的胰腺β细胞给予糖尿病患者，可以治疗糖尿病。这样的包含本发明的胰腺祖细胞、由本发明的胰腺祖细胞诱导成的胰腺β细胞的医药(用于糖尿病治疗的细胞制剂)，也包括在本发明的范围内。
进一步，由于利用本发明的方法得到的胰腺祖细胞、由胰腺祖细胞诱导成的胰腺β细胞保持了类似于活体内的细胞的功能，因此，在糖尿病治疗药的筛选、评价体系中也有用。
例如，在存在及不存在试验化合物的情况下培养本发明的胰腺祖细胞或由胰腺祖细胞诱导成的胰腺β细胞，并测定上述细胞内的胰岛素或者其mRNA的表达量或向细胞外的胰岛素分泌量，当上述表达量或分泌量在存在试验化合物时，比不存在试验化合物时显著增加的情况下，可以选择(筛选)该试验化合物作为糖尿病治疗药的候选。这样的筛选方法、评价体系也包括在本发明的范围内。
另外，作为筛选的另一个例子，可列举以下方法等：使由本发明的胰腺祖细胞诱导成的胰腺β细胞负载模拟糖尿病状态的应激，来评价试验化合物对作为β细胞的功能降低的状态的效果。在此，在使β细胞的功能恢复的情况下，或者在与β细胞的功能恢复有相关性的标记的表达发生变化的情况下，可以选择(筛选)该试验化合物作为糖尿病治疗药的候选。这样的筛选方法、评价体系也包括在本发明的范围内。
实施例
以下，虽然基于参考例和实施例对本发明进行更详细地说明，但本发明并不受这些实施例限定。
(参考例1)使用了人iPS细胞253G1细胞的PDX1阳性细胞的诱导
对人iPS细胞而言，使用了253G1细胞(利用逆转录病毒表达OCT4/SOX2/KLF4而制备的iPS细胞株；Nature Biotechnology26,101-106)。
对人iPS细胞的培养而言，使用Essential 8培养基(Life Technologies)，在涂布了玻连蛋白(Life Technologies)的6-cm皿或10-cm皿(在本说明书中，有时称为玻连蛋白涂布皿)上进行。在传代时，利用0.5mM EDTA/PBS处理人iPS细胞，使其分散成较小的细胞团块的状态，并接种于玻连蛋白涂布皿。传代的比例依赖于细胞的状态，以1:5～1:100的比例进行实施，仅在刚刚传代后使用了向Essential 8培养基中添加了10μM Y27632(和光纯药)的培养基。培养第2天后，仅使用Essential 8培养基进行每天培养基的替换，每3～7天进行传代。
在进行诱导分化时，首先将未分化的iPS细胞接种至96孔板。利用EDTA溶液处理保持细胞团块的状态的iPS细胞，使其分离至成为单个细胞为止。接下来，将分散在培养基中的iPS细胞以每1孔2×104个的密度，接种至实施了Matrigel涂布处理的96孔板，于37℃，5％CO2下进行培养。作为接种时的培养液，使用了添加有10μM的Y27632的Essential 8培养基。在接种1天后，换成仅为Essential 8的培养基，继续培养1天直至成为汇合(confluent)状态。
接下来，由iPS细胞诱导向内胚层细胞的分化。首先，利用RPMI培养基(LifeTechnologies)洗涤已形成汇合的细胞后，添加含有激活素A(100ng/ml)(PeproTech)、作为GSK3β抑制剂的CHIR99021(3μM)(Axon)、1％的不含胰岛素的B-27(注册商标)(LifeTechnologies)的RPMI培养基，培养4天。
接下来，进行由内胚层细胞向PDX1阳性细胞的诱导分化。将进行了向内胚层细胞的诱导分化的细胞利用Improved MEM Zinc Option培养基(Life Technologies)(在本说明书中，有时称为IMEM-option Zn++培养基)洗涤后，换成向含有1％的B-27(注册商标)的IMEM-option Zn++培养基中添加了dorsomorphin(1μM)(Calbiochem)、视黄酸(2μM)(Sigma)及SB431542(10μM)(和光纯药)的培养基。上述替换后，在第3或第4天用相同培养基进行培养基替换，在总计7天期间进行了由内胚层细胞向PDX1阳性细胞的诱导分化。
(实施例1)使用了PDX1阳性细胞的胰腺祖细胞的诱导1
将按照参考例1而在Matrigel皿上诱导分化的PDX1阳性细胞，利用IMEM-optionZn++培养基洗涤后，利用向含有1％的B-27(注册商标)的IMEM-option Zn++培养基中添加了XAV939(1μM)和/或bFGF(100ng/ml)(PeproTech)而成的培养基，进一步培养了7天。
为了检查培养后的细胞中的PDX1和NKX6.1蛋白质的表达，实施了使用抗PDX1抗体和抗NKX6.1抗体的免疫荧光染色。具体而言，针对培养后的细胞添加4％多聚甲醛(paraformaldehyde)的磷酸缓冲液(4％PFA)(和光纯药)，并于室温进行30分钟细胞固定。随后，使其与作为第一抗体的抗PDX1抗体(AF2419，R&D公司)和抗NKX6.1抗体(55F55A12-c，Developmental Studies Hybridoma Bank)反应，并进一步与作为第二抗体的Alexa488标记的第二抗体或者Alexa568标记的第二抗体(均为Life Technologies)依次进行反应后，利用荧光显微镜进行观察。将结果示于图1。
在组合添加了作为诱导分化因子的XAV939和bFGF的情况下(图1(iv))，观察到以下情况：大部分的细胞表达了PDX1和NKX6.1。另一方面，在单独添加了XAV939的情况(图1(ii))、单独添加了bFGF的情况下(图1(iii))，同时表达PDX1和NKX6.1的细胞较少。
根据以上的研究可知，通过利用添加了XAV939和bFGF的培养基进行培养，可以有效地诱导胰腺祖细胞。
(实施例2)使用了PDX1阳性细胞的胰腺祖细胞的诱导2
在将按照参考例1而在Matrigel皿上诱导分化的PDX1阳性细胞利用IMEM-optionZn++培养基洗涤后，换成向含有1％的B-27(注册商标)和1μM的XAV939的IMEM-option Zn++培养基中添加了EGF(500ng/ml)、Betacellulin(40ng/ml)或bFGF(100ng/ml)而成的培养基，培养了8天。培养后进行实施例1中记载的免疫荧光染色，利用荧光显微镜进行观察。将结果示于图2。
与组合添加了bFGF和XAV939的情况下(图2(iv))相同，组合添加了EGF和XAV939(图2(ii))或者组合添加了Betacellulin和XAV939(图2(iii))的情况下，也诱导了较多的胰腺祖细胞。
根据这些结果可知，通过使用添加了EGF信号活化促进剂或FGF信号活化促进剂和XAV939等Wnt信号抑制剂而成的培养基，可以有效地诱导胰腺祖细胞。
(实施例3)使用了人iPS细胞297L1细胞的胰腺祖细胞的诱导
使用297L1细胞(NHDF-iPS，使新生儿男性的皮肤成纤维细胞(dermalfibroblasts)表达OCT4/SOX2/KLF4/c-MYC而制备的人iPS细胞株)(参照PLoS ONE2009；4(12),p.e8067)，按照参考例1诱导了PDX1阳性细胞。将PDX1阳性细胞利用IMEM-option Zn++培养基洗涤后，利用向含有1％的B-27(注册商标)的IMEM-option Zn++培养基中添加了XAV939(1μM)和bFGF(50ng/ml)而成的培养基，进一步培养了7天。培养后进行实施例1中记载的免疫荧光染色，利用荧光显微镜进行观察。将结果示于图3。
确认了在使用297L1细胞的情况下，也可以按照参考例1、实施例1及实施例2中记载的方法，有效地诱导胰腺祖细胞。
(实施例4)胰腺祖细胞的传代
将实施例3中诱导的胰腺祖细胞，按照以下步骤进行传代。即，用PBS洗涤后，添加Accutase(Innovative Cell Technologies)培养4分钟，进一步通过吹打(pipetting)而制成单个细胞状态。用IMEM-option Zn++培养基洗涤细胞后，以传代前的1/4～1/10的细胞浓度接种至新的培养容器。需要说明的是，作为培养基，使用了向含有1％的B-27(注册商标)的IMEM-option Zn++培养基中添加了Y27632(10μM)、XAV939(1μM)、及bFGF(50ng/ml)而成的培养基，作为培养容器，使用实施了Matrigel涂布处理的培养容器。在上述接种后，每天进行培养基替换。
在上述接种后3～6天期间，细胞达到80～90％汇合。在细胞达到了80～90％汇合的阶段，再次重复上述的步骤进行传代。将传代数为4的阶段的传代后第1天的细胞的情况、和传代后第4天的细胞的情况示于图4A。可知以下情况：虽然在传代第1天的细胞密度较低，但到传代第4天时，细胞密度升高。明确了在如上所述地重复进行传代时，经过21次的传代，1个细胞增殖至1×1018个细胞(图4B)。
根据该结果可明确，即使传代数多于20，胰腺祖细胞也保持了高增殖能力。
为了观察在重复传代的细胞中是否保持了PDX1及NKX6.1的表达，对传代数5或者传代数66的细胞进行实施例1中记载的免疫荧光染色，并利用荧光显微镜进行观察。将结果示于图5。
传代数5的细胞以及传代数66的细胞均大部分为PDX1阳性且NKX6.1阳性。
根据以上的结果可知，通过使用本发明的方法，可以保持PDX1阳性且NKX6.1阳性的胰腺祖细胞的状态使其增殖，并进一步进行传代。
(参考例2)增殖的胰腺祖细胞的核型分析(Karyotyping)
对重复传代的增殖胰腺祖细胞是否保持了正常的核型进行了分析。对传代28次的胰腺祖细胞进行Carnoy固定后，实施了简易核型分析(Q-Band)(chromocenter株式会社)。将该结果示于图6。其结果明确了胰腺祖细胞保持着正常的核型，即使进行长期培养并重复传代也保持着正常的核型。
(实施例5)胰腺祖细胞的增殖中的添加因子的参与
如实施例4所示，通过用添加有Y27632、XAV939、bFGF的培养基培养，使胰腺祖细胞稳定地增殖是可能的。因此，研究了这些因子中哪些因子的组合在胰腺祖细胞的增殖中是必要的。
将制成单个细胞状态的传代数44的胰腺祖细胞接种至实施了Matrigel涂布处理的板，利用向含有1％的B-27(注册商标)的IMEM-option Zn++培养基中组合添加了各因子(bFGF(50ng/ml)、XAV939(1μM)、Y27632(10μM))而成的培养基，培养了2天。培养开始后，每天进行培养基替换。培养后进行实施例1中记载的免疫荧光染色，利用荧光显微镜进行观察。将该结果示于图7。
除了组合添加了bFGF、XAV939、Y27632的情况(图7(viii))以外，还在组合添加Y27632和bFGF的情况(图7(v))、组合了bFGF和XAV939的情况下(图7(vii))也观察到了PDX1阳性且NKX6.1阳性的细胞增殖的情况。
(实施例6)使用了其它人iPS细胞株的能够增殖的胰腺祖细胞的诱导
研究了是否也能由其它人iPS细胞诱导能够增殖的胰腺祖细胞。首先，利用以下方法制备了新的人iPS细胞。将采血至含有肝素钠的采血管(Terumo)中的血液利用PBS稀释2倍后，叠层于Ficoll-Paque PREMIUM(GE healthcare)，于20℃、400g离心30分钟，分离了外周血单核细胞(peripheral blood mononucleated cells,PBMC)。Ficoll与稀释血液以3:4的比例进行使用。回收的PBMC利用PBS进行离心洗涤后，再悬浮于StemSpan H3000(STEMCELLTechnologies)中。或使用Cell Banker 3(日本全药工业)进行冷冻保存。接下来，将PBMC以3×106细胞/孔的浓度接种于6孔板，添加10ng/ml IL-3(PeproTech)、100ng/ml IL-6(PeproTech)、300ng/ml SCF(PeproTech)、300ng/ml TPO(PeproTech)、300ng/mlFit3ligand(PeproTech)(以下，称为non-T cell用培养基)，进行6天培养。回收培养后增殖的non-T cell(约1.3×106细胞/孔)，使用Human CD34Cell Nucleofector(注册商标)试剂盒(Lonza)，导入了Plasmids Epi5TM Episomal iPSC Reprogramming试剂盒(LifeTechnologies)的episomal载体。作为载体量，每1.3×106细胞使用Reprogramming kit内的Epi5TMReprogramming Vectors及Epi5TMp53&EBNA Vectors各1.5μg(计3μg)，而Nucleofector(Lonza)的导入程序使用了U-008。导入后，将细胞再悬浮于non-T cell用培养基中，接种至涂布有Geltrex(Life Technologies)的10-cm dish(培养基量10ml)并培养24小时。次日(Day1)，以5ml/10-cm dish(计15ml)添加含有1％N2(和光纯药)、2％B-27(注册商标)、1x GlutaMaxI(Life Technologies)、1x NEAA(Life Technologies)及100ng/mlbFGF的DMEM/F12(和光纯药)培养基，随后的5天期间，每天用相同的培养基替换一半量的培养基。在Day9全量置换为Essential 8培养基，随后，每隔1天用相同培养基进行培养基替换。观察iPS细胞的集落后，适当选取(pick up)，继续进行培养并建立iPS细胞株。
对建立的3种人iPS细胞株(NTE-1-7、NTE-1-8、NTE-1-9)进行参考例1所示的方法，诱导了PDX1阳性细胞。通过将诱导后的细胞利用IMEM-option Zn++培养基洗涤，然后使用向含有1％的B-27(注册商标)的IMEM-option Zn++培养基中添加XAV939(1μM)和bFGF(50ng/ml)而成的培养基进一步培养7天，从而诱导PDX1阳性且NKX6.1阳性的胰腺祖细胞。将像这样诱导得到的细胞利用PBS洗涤后，添加Accutase培养4分钟，然后通过吹打而制成单个细胞状态。用IMEM-option Zn++培养基洗涤细胞后，以传代前的1/4～1/10的细胞浓度，接种于实施了Matrigel涂布处理的新培养容器。对培养基而言，使用了含有1％的B-27(注册商标)、Y27632(10μM)、XAV939(1μM)、bFGF(50ng/ml)的IMEM-option Zn++培养基。传代后，每天进行培养基替换。针对已重复2次传代的细胞，进行实施例1中记载的免疫荧光染色，利用荧光显微镜进行观察。将该结果示于图8。
在使用任意细胞株的情况下，传代后的细胞也大部分为PDX1阳性且NKX6.1阳性的胰腺祖细胞，由此可知，本发明的方法的效果在除了297L1细胞以外的细胞株也可以观察到。
(参考例3)由增殖的胰腺祖细胞向INSULIN产生细胞的诱导分化
研究了经增殖并重复传代的胰腺祖细胞是否具有向INSULIN产生细胞的分化能力。作为细胞，使用了源自297L1细胞的胰腺祖细胞(传代数7)。将用Accutase制成单个细胞状态的胰腺祖细胞，以6×104细胞/孔接种至实施了Matrigel涂布处理的96孔板。就培养液而言，使用了向含有1％的B-27(注册商标)的IMEM-option Zn++培养基中添加了XAV939(1μM)、Y27632(10μM)、bFGF(50ng/ml)而成的培养基。通过培养细胞2天而使细胞密度达到汇合。随后，将细胞利用IMEM-option Zn++培养基洗涤后，使用向含有1％的B-27(注册商标)的IMEM-option Zn++培养基中添加了Alk5抑制剂II而成的培养基，培养9天。已知Alk5抑制剂II诱导INSULIN阳性细胞(Stem Cell Research 20128,274-284)。针对培养后的细胞添加4％PFA，并于室温进行30分钟固定。并且，使其与作为第一抗体的抗NKX6.1抗体和抗INSULIN抗体(DAKO，A0564)反应，并进一步与作为第二抗体的Alexa488标记的第二抗体或者Alexa568标记的第二抗体依次进行反应后，利用荧光显微镜进行观察。将该结果示于图9。观察了通过添加Alk5抑制剂II进行培养，INSULIN阳性细胞出现的情况。根据这些结果确认了，增殖的胰腺祖细胞是具有向INSULIN阳性细胞的分化能力的细胞。
工业实用性
本发明可以使胰腺祖细胞以保持其功能的状态高效率且高纯度地增殖。本发明的方法除了源自活体的胰腺祖细胞以外，也可以适用于由ES细胞及iPS细胞等多功能性干细胞诱导分化的胰腺祖细胞。得到的胰腺祖细胞功能高、高纯度且安全性高，可以直接或者诱导分化成胰腺β细胞等而利用于糖尿病的治疗、糖尿病治疗药的试验方法等。
本说明书中引用的全部出版物、日本专利及专利申请整体作为参考并入本说明书中。

Claims (7)

1.胰腺祖细胞的增殖方法，其中，对胰腺祖细胞进行以下工序(1)：
(1)用仅添加了(i)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和(ii)ROCK抑制剂的基础培养基对胰腺祖细胞进行传代培养的工序，其中ROCK抑制剂选自：N-(4-吡啶基)-4β-[(R)-1-氨基乙基]环己烷-1α-羧酰胺、Fasudil、(2S)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]六氢-1H-1,4-二氮杂环庚三烯、4β-[(1R)-1-氨基乙基]-N-(4-吡啶基)苯-1α-羧酰胺、N-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4PER(R)-1-氨基乙基]环己烷-1α羧酰胺、N-(3-{[2-(4-氨基-1,2,5-噁二唑-3-基)-1-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基]氧基}苯基)-4-{[2-(4-吗啉基)乙基]-氧基}苯甲酰胺、N-(6-氟-1H-咪唑-5-基)-6-甲基-2-氧代-4-[4-(三氟甲基)苯基]-3,4-二氢-1H-吡啶-5-羧酰胺；针对ROCK的抗体、反义核酸、及siRNA；以及ROCK的拮抗剂和显性阴性形式。
2.胰腺祖细胞的增殖方法，其中，对胰腺祖细胞进行以下工序(1)：
(1)用仅添加了(i)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、 (ii)ROCK抑制剂和(iii)Wnt信号抑制剂的基础培养基对胰腺祖细胞进行传代培养的工序，其中ROCK抑制剂选自：N-(4-吡啶基)-4β-[(R)-1-氨基乙基]环己烷-1α-羧酰胺、Fasudil、(2S)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]六氢-1H-1,4-二氮杂环庚三烯、4β-[(1R)-1-氨基乙基]-N-(4-吡啶基)苯-1α-羧酰胺、N-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4PER(R)-1-氨基乙基]环己烷-1α羧酰胺、N-(3-{[2-(4-氨基-1,2,5-噁二唑-3-基)-1-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基]氧基}苯基)-4-{[2-(4-吗啉基)乙基]-氧基}苯甲酰胺、N-(6-氟-1H-咪唑-5-基)-6-甲基-2-氧代-4-[4-(三氟甲基)苯基]-3,4-二氢-1H-吡啶-5-羧酰胺；针对ROCK的抗体、反义核酸、及siRNA；以及ROCK的拮抗剂和显性阴性形式。
3.根据权利要求1或2所述的增殖方法，其中，胰腺祖细胞为通过将PDX1阳性细胞用含有(a)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和(b)Wnt信号抑制剂的培养基培养而诱导的胰腺祖细胞，其中PDX1阳性细胞以PDX1阳性、NKX6.1阴性、及INS阴性为特征。
4.仅添加了(i)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和(ii)ROCK抑制剂的基础培养基用于增殖胰腺祖细胞的用途，其中ROCK抑制剂选自：N-(4-吡啶基)-4β-[(R)-1-氨基乙基]环己烷-1α-羧酰胺、Fasudil、(2S)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]六氢-1H-1,4-二氮杂环庚三烯、4β-[(1R)-1-氨基乙基]-N-(4-吡啶基)苯-1α-羧酰胺、N-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4PER(R)-1-氨基乙基]环己烷-1α羧酰胺、N-(3-{[2-(4-氨基-1,2,5-噁二唑-3-基)-1-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基]氧基}苯基)-4-{[2-(4-吗啉基)乙基]-氧基}苯甲酰胺、N-(6-氟-1H-咪唑-5-基)-6-甲基-2-氧代-4-[4-(三氟甲基)苯基]-3,4-二氢-1H-吡啶-5-羧酰胺；针对ROCK的抗体、反义核酸、及siRNA；以及ROCK的拮抗剂和显性阴性形式。
5.仅添加了(i)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、(ii)ROCK抑制剂和(iii)Wnt信号抑制剂的基础培养基用于增殖胰腺祖细胞的用途，其中ROCK抑制剂选自：N-(4-吡啶基)-4β-[(R)-1-氨基乙基]环己烷-1α-羧酰胺、Fasudil、(2S)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]六氢-1H-1,4-二氮杂环庚三烯、4β-[(1R)-1-氨基乙基]-N-(4-吡啶基)苯-1α-羧酰胺、N-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4PER(R)-1-氨基乙基]环己烷-1α羧酰胺、N-(3-{[2-(4-氨基-1,2,5-噁二唑-3-基)-1-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基]氧基}苯基)-4-{[2-(4-吗啉基)乙基]-氧基}苯甲酰胺、N-(6-氟-1H-咪唑-5-基)-6-甲基-2-氧代-4-[4-(三氟甲基)苯基]-3,4-二氢-1H-吡啶-5-羧酰胺；针对ROCK的抗体、反义核酸、及siRNA；以及ROCK的拮抗剂和显性阴性形式。
6.胰腺祖细胞的制备方法，其包括将胰腺祖细胞用仅添加了(i)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和(ii)ROCK抑制剂的基础培养基培养并进行增殖的工序，和从培养物中提取胰腺祖细胞的工序，其中ROCK抑制剂选自：N-(4-吡啶基)-4β-[(R)-1-氨基乙基]环己烷-1α-羧酰胺、Fasudil、(2S)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]六氢-1H-1,4-二氮杂环庚三烯、4β-[(1R)-1-氨基乙基]-N-(4-吡啶基)苯-1α-羧酰胺、N-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4PER(R)-1-氨基乙基]环己烷-1α羧酰胺、N-(3-{[2-(4-氨基-1,2,5-噁二唑-3-基)-1-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基]氧基}苯基)-4-{[2-(4-吗啉基)乙基]-氧基}苯甲酰胺、N-(6-氟-1H-咪唑-5-基)-6-甲基-2-氧代-4-[4-(三氟甲基)苯基]-3,4-二氢-1H-吡啶-5-羧酰胺；针对ROCK的抗体、反义核酸、及siRNA；以及ROCK的拮抗剂和显性阴性形式，其中胰腺祖细胞为通过将PDX1阳性细胞培养而诱导的胰腺祖细胞，其中PDX1阳性细胞以PDX1阳性、NKX6.1阴性、及INS阴性为特征。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其包括将PDX1阳性细胞用含有(a)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和(b)Wnt信号抑制剂的培养基培养，诱导分化胰腺祖细胞的工序。
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