JP2021535747A - ヒト多能性幹細胞からの造血前駆細胞の生成 - Google Patents

Abstract

造血前駆細胞の生成方法及び使用方法について記載する。【選択図】図１Ａ−１Ｆ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体を参照することにより本明細書に援用する2019年9月7日に提出された米国仮特許出願第62/728,408号に対する優先権を主張する。

背景
造血前駆細胞の生成は、血管障害の治療に有望なアプローチであるが、この目標は困難なままである。2つの最近の研究では、トランスジェニック法を利用して、免疫力が低下したマウスに生着することができる造血細胞を生成した(Lis et al., 2017; Sugimura et al., 2017)。しかしなら、トランスジェニック法は、臨床適用のためにスケールアップすることができない。当技術分野は、動物又はヒト対象に生着することができる造血前駆細胞を生成するための大規模な臨床適用可能な方法を必要としている。

発明の概要
本明細書では、第1の態様において、造血前駆細胞を得るための方法であって、線維芽細胞増殖因子(FGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、並びにNotchアゴニスト、TGFβインヒビター、及びイノシトールモノホスファターゼのインヒビターの少なくとも1種を含む化学的に定義された培養培地(chemically-defined culture medium)に低密度で播種された中胚葉細胞を培養し、それによって血管芽細胞を含む細胞集団を得ること；及びインスリン、FGF、VEGF、及びNotchアゴニストを含む化学的に定義された培養培地内で血管芽細胞を培養し、それによってCD34+CD45+造血前駆細胞を得ること含む方法について記載する。いくつかの実施形態では、中胚葉細胞は、約6×10³細胞/cm²と約6×10⁴細胞/cm²の間の密度で播種される。いくつかの実施形態では、中胚葉細胞は、ブラキュリ(Brachyury)(T)、EMOS、FOXA2、MIXL1、MSX1、及びMSX2からなる群より選択される1種以上の中胚葉マーカーに発現する。いくつかの実施形態では、Notchアゴニストは、レスベラトロール(3,4',5-トリヒドロキシスチルベン)、バルプロ酸、及びスベロイルビスヒドロキサム酸からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、TGFβインヒビターはSB431542である。いくつかの実施形態では、イノシトールモノホスファターゼのインヒビターはL-690,330である。

いくつかの実施形態では、中胚葉細胞は、骨形成タンパク質4(BMP4)、アクチビンA、及びWnt/βカテニンシグナル伝達のアクチベーターを含む無血清でアルブミン非含有の化学的に定義された培養培地中で約2日間にわたってヒト多能性幹細胞を培養して、中胚葉細胞を含む細胞集団を得ることによって得られる。いくつかの実施形態では、ヒト多能性幹細胞は、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、約6×10³細胞/cm²と約6×10⁴個に細胞/cm²の間の密度で播種される。いくつかの実施形態では、Wnt/βカテニンシグナル伝達のアクチベーターは、Gsk3インヒビターである。いくつかの実施形態では、Gsk3インヒビターは、CHIR99021、CHIR98014、BIO-アセトキシム、BIO,LiCl、SB216763、SB415286、AR A014418、1-アザケンパウロン、及びビス-7-インドリルマレイミドからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、中胚葉細胞が約4日間培養された後に血管芽細胞が約4日間培養されて、造血前駆細胞を含む細胞集団を生成する。

本明細書では、第2の態様において、本明細書に記載の方法に従って得られたCD34+CD45+造血前駆細胞の実質的に純粋な単離された集団について述べる。いくつかの実施形態では、単離された集団は、少なくとも90%の造血前駆細胞を含む。いくつかの実施形態では、単離された集団は、少なくとも99%の造血前駆細胞を含む。
本明細書では、第3の態様において、本明細書に記載の方法に従って得られる多能性幹細胞由来CD34+CD45+造血前駆細胞の実質的に純粋な単離された集団について述べる。
本明細書では、第4の態様において、患者の血管疾患の治療方法であって、本明細書に記載の方法に従って得られたCD34+CD45+造血前駆細胞の治療量を患者に投与することを含む方法について述べる。いくつかの実施形態では、疾患は、貧血症、サラセミア、赤血球増加症、尿毒症、骨髄線維症、骨髄腫、脊髄形成異常症、白血病、リンパ腫、骨髄異形成症候群、異常ヘモグロビン症、好中球減少症、血小板減少症、フォン・ヴィルブランド病、血友病、原発性血小板血症、後天性血小板機能障害、形質細胞障害、及び固形腫瘍からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、造血前駆細胞は、製剤で投与され、この製剤は、静脈内デリバリーに適した形態である。

本明細書では、第5の態様において、マクロファージを得る方法であって、(i)本明細書に記載の方法によって生成されたCD34+CD45+造血前駆細胞を、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を含む培地中で約3日間培養すること；及び(ii)(i)の培養された細胞を、インターロイキン1β(IL-1B)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、血清又は血清代替物を含む培地中で培養し、それによってマクロファージを含む細胞集団を得ることを含む方法について述べる。いくつかの実施形態では、細胞集団は少なくとも80%のCD11b⁺CD14⁺マクロファージを含む。
本明細書では、第6の態様において、ナチュラルキラー(NK)細胞を得る方法であって、本明細書に記載の方法によって生成されたCD34+CD45+造血前駆細胞集団を、ウシ血清アルブミン、インスリン、及びトランスフェリンを含む培地中で約3日間培養して、接着細胞及び浮遊細胞を含む細胞集団を生成すること；及び浮遊細胞を、インターロイキン7(IL-7)、インターロイキン15(IL-15)、幹細胞因子(SCF)、及びFlt3リガンド(FLT3-L)を含む培地中で培養し、それによってNK細胞を含む細胞集団を生成すること含む方法について述べる。いくつかの実施形態では、NK細胞を含む細胞集団は、少なくとも60%のCD56⁺CD3^-NK細胞を含む。いくつかの実施形態では、浮遊細胞は、さらに血清又は血清代替物を含む培地中で培養される。

本明細書では、第7の態様において、T細胞を得る方法であって、本明細書に記載の方法で生成されたCD34+ CD45+造血前駆細胞を、インターロイキン7(IL-7)、Flt3リガンド(FLT3-L)、幹細胞因子(SCF)、及びRESVを含む培地中で培養して、T細胞を含む細胞集団を生成することを含む方法について述べる。いくつかの実施形態では、細胞集団は、少なくとも約90%のCD3⁺CD4⁺CD8⁺T細胞を含む。いくつかの実施形態では、この培地は、さらに血清又は血清代替物を含む。

本発明に従う造血細胞分化に関し、多能性細胞の動脈内皮細胞及び造血細胞へのin vitro分化の概略を示し、多能性細胞は高細胞密度又は低細胞密度で播かれる。この図に示す実験の高細胞密度法の細胞は1.1×10⁵細胞/cm²で播かれ、この図に示す実験の低細胞密度法の細胞は1.8×10⁴細胞/cm²で播かれた。 10日目の各培養の細胞の細胞形態を示す写真である。低細胞密度培養法では円形浮遊細胞が観察された。 低細胞密度培養の細胞における0日目及び10日目のCD34及びCD45発現のフローサイトメトリー分析を示す。 低細胞密度(LD)及び高細胞密度(HD)培養のそれぞれの10日目におけるCD144発現のフローサイトメトリー分析を示す。 12ウェルプレートの1ウェル内で10日目に3つの多能性細胞株、すなわち、H1(ES)、H9(ES)、又はPBMC-3-1(iPS)細胞から生成された総造血細胞数(浮遊細胞)を示す。 NUNCのトリプルフラスコ(TripleFlask)1つから生成された総造血細胞数(浮遊細胞)を示す。造血細胞は、10日目に凍結保存することができ(90% FBS＋10% DMSO)、血管芽細胞は、6日目に凍結保存することができる。 低密度及び高密度細胞培養におけるNotch及びYAPシグナル伝達を示し、YAPの免疫染色を示す。 低密度及び高密度細胞培養におけるNotch及びYAPシグナル伝達を示し、NICD1(Notch細胞内ドメイン)の免疫染色を示す。 高密度培養における10日目の細胞の形態を示す。高密度で培養された細胞は、10μMのDAPT(Notchインヒビター)の有り無しで2日目〜10日目まで処理された。 高密度条件下で10μMのDAPTの非存在下又は存在下で2日目〜10日目に生成された総造血細胞数(浮遊細胞)の統計を示す。 低密度及び高密度細胞培養におけるBMP4シグナル伝達を示し、pSMAD1/5/8の免疫染色を示す。 低密度(LD)又は高密度(HD)のどちらかで培養された細胞からのリン酸化SMAD1/5/8(pSMAD1/5/8)、SMAD1/5/8、及びGAPDHのウエスタンブロットを示す。 50ng/mlのBMP4有り無しで高密度にて培養された細胞の10日目の細胞形態の写真を示す。 LDN(BMPシグナル伝達インヒビター)の有り無しで低密度にて培養された細胞の10日目の細胞形態の写真を示す。 総造血細胞数の統計を示す。 コロニー形成単位アッセイの結果を示し、10日目の造血細胞をMethoCult(商標)と混合し、2週間培養した。 造血前駆細胞のマクロファージへの分化を示し、マクロファージ／ミクログリア分化の概略を示す。 ウシ胎仔血清(FBS)又はノックアウト血清代替物(KOSR)の存在下で図5Aに示すように培養された細胞の19日目におけるCD14及びCD11b発現のフローサイトメトリー分析を示す。 13日目にFBS又はKOSRと共に培養し始めた細胞の19日目の細胞形態の写真を示す。 ミクログリア／マクロファージによるファゴサイトーシスを示す。ザイモサンA(出芽酵母)BioParticles(登録商標)(Texas Red(登録商標)抱合体；Life Technologies)はPBS(10mg/ml=2×10⁹粒子/ml)中で調製した。4×10⁵個のマクロファージを含有する2mlのE6M培地に20μlの粒子を添加した。ファゴサイトーシスを経時的に画像化した。 造血前駆細胞のナチュラルキラー(NK)細胞への分化を示し、NK細胞分化の概略を示す。 H1、H9、及びPBMC-3-1細胞株から産生された造血前駆細胞から分化した細胞の27日目におけるCD56及びCD3発現のフローサイトメトリー分析を示す。 NK死滅アッセイの細胞死滅統計を示す。H1-NK細胞：U936/K572＝1:1。生きているU936又はK572細胞を24時間後に分析した。 造血前駆細胞のT細胞への分化を示し、T細胞分化の概略を示す。 34日目のCD3、CD4、及びCD8発現のフローサイトメトリー分析を示す。 造血前駆細胞のin vivo生着を示し、注射8週間後の末梢血液中のヒトCD45(hCD45)及びマウスCD45(mCD45)発現のフローサイトメトリー分析を示す。静脈内注射(後眼窩)はNBSGWマウスに3×10⁵細胞(100ulのHBSS中)／マウスで行なった。注射8週間後に末梢血液を採取した。 マウス末梢血液中に存在するhCD45⁺細胞の統計を示す。 4.5×10⁵細胞(30ulのHBSS中)／マウスの用量でNBSGWマウスの大腿内動脈(intra-femoral artery)に注射したH1(雄性ESC)及びH9(雌性ESC)由来造血前駆細胞の比較を示す。注射12週間後に末梢血液を採取した。「D10」は、10日目に凍結保存された細胞を示す。移植の1日前に、細胞を解凍し、SEFM+100ng/mlのSCF中で24時間培養した。24時間後、浮遊HPCだけを移植用に採取した。「D6」は、6日目に凍結保存された細胞を示す。移植の1日前に、細胞を解凍し、SEFM+100ng/mlのSCF中で24時間培養した。24時間後、浮遊HPCと接着血管芽細胞を両方とも移植用に採取した。hCD45⁺細胞の統計を示した。 造血前駆細胞を生成するための代替方法を示す。ES/iPS細胞をE8BAC培地中で2日間(44時間)培養した(1.1×10⁵細胞/cm²)。この長さに時間後に細胞を凍結保存することができた。さらなる分化のため、細胞をE6T培地(10μMのY-27632添加)で継代し(1:6比)、18時間培養した。次に培地を「5因子」培地に8日目まで変えた。8日目から12日目まで培養をFVR培地中で維持した。12日目に造血細胞を凍結保存することができた。

発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも一部は、アルブミンを含まず、異種物質非含有(「ゼノフリー」)の化学的に定義された条件下でヒト多能性幹細胞を造血前駆細胞(HPC)に分化させるためのプロトコルの発明者らの開発に基づいている。多能性細胞は、ヒト胚性幹細胞(ヒトES細胞又はhES細胞)又はヒト人工多能性幹細胞(ヒトiPS細胞又はhiPS細胞)であり得る。特に、多能性細胞を該培地に低細胞密度で播種すると、CD34⁺/CD45⁺造血前駆細胞の集団を生成することができる。これらの発見に基づいて、本発明は、臨床細胞療法及び組織モデリング用途に使用するために臨床関連ヒト造血前駆細胞を生成して増やすための完全に定義されたゼノフリー方法を提供する。本明細書で使用する場合、用語「造血前駆細胞」は、in vivo及びin vitroで、骨髄又は生成されたリンパ球系細胞中に保持されるマーカーを与えることによって追跡し得る造血によって骨髄細胞及びリンパ球系血液細胞をもたらし、かつ本明細書で提供するin vitro方法に従って得られる細胞を指す。いくつかの天然に存在するHPCは分化系列決定され、1つの細胞型に分化できるだけであるが、本発明のHPCは多能性であり、骨髄とリンパ球系の両方の細胞に分化する能力があると特徴づけられる。本発明のHPCは、CD34及びCD45等の造血前駆細胞マーカーの高レベルの発現を特徴とする。HPCは、マーカーCD34、CD43、CD49f、及びCD90の発現をも特徴とする。HPCは、本明細書に記載のようにin vitro及びin vivoでの細胞の特徴的な発現プロファイル及び機能的属性に基づいて他の細胞型と識別できる。具体的には、本発明のHPCは、移植後に生着することができる。
本発明は、本明細書に記載の方法によって生成された造血前駆細胞からマクロファージ、ナチュラルキラー(NK)細胞、及びT細胞を生成する方法をも提供する。

方法
特定の好ましい実施形態では、HPCは、本明細書に記載どおりに多能性細胞から生成された中胚葉細胞から得られる。HPCは、他の方法を用いて作られた中胚葉細胞から得ることもできるが、該方法は、効率が低く、より少ないHPCが得られる。
本明細書では、第1の態様において、HPCを得る方法を提供する。例示実施形態では、方法は、中胚葉細胞の血管芽細胞への分化を誘導する第1のステップ及び血管芽細胞の造血前駆細胞への分化を誘導する第2のステップを含む。

第1のステップの例示実施形態では、中胚葉細胞は、低密度で培地に播種され、培養されて血管芽細胞を生成する。場合によっては、中胚葉細胞(場合によっては、多能性幹細胞由来中胚葉が含まれる)は、中胚葉細胞の血管芽細胞への分化を誘導するのに有効な量でFGF及びVEGFを含むか、又は本質的にこれらからなる培地中で、該分化を誘導するのに十分な長さの時間培養される。場合によっては、中胚葉細胞(場合によっては、多能性幹細胞由来中胚葉細胞が含まれる)は、中胚葉細胞の血管芽細胞への分化を誘導するのに有効な量でFGF、VEGF、Notchアゴニスト、TGFβ受容体インヒビター、及びイノシトールモノホスファターゼのインヒビター含むか、又は本質的にこれらからなる培地中で、該分化を誘導するのに十分な長さの時間培養される。中胚葉細胞は、培養培地中で約4日(例えば、3日、4日、又は5日)間培養される。いくつかの実施形態では、培養培地は、FGF、VEGF、TGFβシグナル伝達のインヒビター(例えば、SB-431542)、レスベラトロール(RESV)、及びイノシトールモノホスファターゼのインヒビターの1種以上を含むか、又は本質的にこれらから成り、培養は、培養される中胚葉細胞が血管芽細胞に分化するのに十分な長さの時間行なわれる。いくつかの実施形態では、中胚葉細胞を血管芽細胞に分化させるために使用する細胞培養培地は、これらの各成分を含む。いくつかの実施形態では、中胚葉細胞は、DMEM/F12培養培地、L-アスコルビン酸-2-リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、NaHCO₃、ランスフェリン、FGF2、VEGF-A、SB431542、RESV、及びL690,330を含むか又は本質的にこれらからなる化学的に定義された培養培地に低密度で播種され、約4日間培養される。好ましくは、培養培地は、DMEM/F12培地、L-アスコルビン酸-2-リン酸マグネシウム(64ng/ml)、ナトリウムセレン(14ng/ml)、NaHCO₃(543μg/ml)、トランスフェリン(10.7μg/ml)、FGF2(100ng/ml)、VEGF-A(50ng/ml)、SB431542(10μM)、RESV(5μM)、及びL690(10μM)を含むか又は本質的にこれらからなる。培養は、いずれの適切な表面でも(例えば、二次元又は三次元培養で)行なうことができる。

第1のステップのいくつかの実施形態では、中胚葉細胞は、培地に高密度で播種され、培養されて血管芽細胞を生成する。場合によっては、中胚葉細胞(場合によっては、多能性幹細胞由来中胚葉細胞が含まれる)は、中胚葉細胞の血管芽細胞への分化を誘導するのに有効な量で骨形成タンパク質4(BMP4)、FGF、VEGF、Notchアゴニスト、TGFβ受容体インヒビター、及びイノシトールモノホスファターゼのインヒビターを含むか、又は本質的にこれらからなる培地中で、該分化を誘導するのに十分な長さの時間培養される。中胚葉細胞は、培養培地中で約4日(例えば、3日、4日、又は5日)間培養される。いくつかの実施形態では、培養培地は、BMP4、FGF、VEGF、TGFβシグナル伝達のインヒビター(例えば、SB-431542)、レスベラトロール(RESV)、及びイノシトールモノホスファターゼのインヒビターの1種以上を含むか、又は本質的にこれらから成り、培養は、培養される中胚葉細胞が血管芽細胞に分化するのに十分な長さの時間行なわれる。いくつかの実施形態では、中胚葉細胞を血管芽細胞に分化させるために使用する細胞培養培地は、これらの各成分を含む。いくつかの実施形態では、中胚葉細胞は、DMEM/F12培養培地、L-アスコルビン酸-2-リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、NaHCO₃、トランスフェリン、BMP4、FGF2、VEGF-A、SB431542、RESV、及びL690,330を含むか又は本質的にこれらからなる化学的に定義された培養培地に低密度で播種され、約4日間培養される。好ましくは、培養培地は、DMEM/F12培地、L-アスコルビン酸-2-リン酸マグネシウム(64ng/ml)、ナトリウムセレン(14ng/ml)、NaHCO₃(543μg/ml)、トランスフェリン(10.7μg/ml)、BMP4(50ng/ml)、FGF2(100ng/ml)、VEGF-A(50ng/ml)、SB431542(10μM)、RESV(5μM)、及びL690(10μM)を含むか又は本質的にこれらからなる。培養は、いずれの適切な表面でも(例えば、二次元又は三次元培養で)行なうことができる。

中胚葉細胞は、典型的に、インスリン、アルブミン、又は非ヒト動物由来の任意の成分を含まないか、又は実質的に含まないか、又は本質的に含まない(すなわち、異種物質非含有)培養培地で培養される。本明細書で使用する場合、用語「実質的に含まない」は、特定の成分又は試薬を実質的に欠いている細胞培養条件を指す。インスリンを実質的に含まないとは、培地が質量で2×10^-5%未満のインスリンを含有し、好ましくは1×10^-5%未満、0.5×10^-5%未満、0.2×10^-5%未満又は0.1x10^-5%未満のインスリンを含有することを意味する。
本明細書で使用する場合、用語「中胚葉性細胞」及び「中胚葉細胞」を互換的に使用し、該用語は、中胚葉特異的遺伝子発現を有し、かつ中胚葉細胞系譜、例えば骨、筋肉、例えば心筋、骨格筋及び平滑筋(例えば、腸の)等、結合組織、例えば真皮及び軟骨等、腎臓、泌尿生殖器系、血液細胞又は造血細胞、心臓及び血管等に分化する能力がある細胞を指す。中胚葉特異的バイオマーカーには、ブラキュリ(T)、EMOS、FOXA2、MIXL1、MSX1、及びMSX2が含まれる。
本明細書で使用する場合、用語「低密度で播種される」、又は「低密度で培養される」は、約6×10³細胞/cm²と約6×10⁴細胞/cm²の間の密度で播種される細胞培養を指す。いくつかの実施形態では、低播種密度は約1.0×10⁴である。いくつかの実施形態では、低播種密度は約2.0×10⁴である。
本明細書で使用する場合、用語「高密度で播種される」、又は「高密度で培養される」は6×10⁴細胞/cm²より高く、3×10⁵細胞/cm²までの密度で播種される細胞培養を指す。

第2のステップの例示実施形態では、血管芽細胞が培地中で培養されて、造血前駆細胞を含む細胞集団を生成する。第2のステップの適切な培養培地は、血管芽細胞の造血前駆細胞への分化を誘導するのに有効な量でインスリン、FGF、VEGF、及びNotchアゴニストを含むか、又は本質的にこれらから成り、該分化を誘導するのに十分な長さの時間培養される。血管芽細胞は、培養培地中で約4日間培養される。いくつかの実施形態では、血管芽細胞は、DMEM/F12培養培地、L-アスコルビン酸-2-リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、NaHCO₃、トランスフェリン、インスリン、FGF2、VEGF、及びRESVを含むか又は本質的にこれらからなる化学的に定義された培地中で約4日間培養される。いくつかの実施形態では、培養培地は、DMEM/F12培地、L-アスコルビン酸-2-リン酸マグネシウム(64ng/ml)、ナトリウムセレン(14ng/ml)、NaHCO₃(543μg/ml)、トランスフェリン(10.7μg/ml)、インスリン(20μg/ml)、FGF2(100ng/ml)、VEGF-A(50ng/ml)、及びRESV(5μM)を含むか又は本質的にこれらからなる。いくつかの実施形態では、第2のステップの培養培地は、生成されるCD34⁺/CD45⁺細胞集団の純度を高めるためさらに骨形成タンパク質4(BMP4)、WNT3A、又はその組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、約50ng/mlのBMP4、約50ng/mlのWNT3A、又はその組み合わせが培養培地に添加される。培養は、いずれの適切な表面でも(例えば、二次元又は三次元培養で)行なうことができる。記載通りに血管芽細胞を培養することによって生成される細胞の集団は、培養表面に付着する接着細胞及び浮遊造血前駆細胞を含む。浮遊造血前駆細胞は、円形形態を特徴とする。

第2のステップの例示実施形態では、血管芽細胞が培地中で培養されて、造血前駆細胞を含む細胞の集団を生成する。第2のステップの適切な培養培地は、血管芽細胞の造血前駆細胞への分化を誘導するのに有効な量で幹細胞因子(SCF)、IL-3、及びトロンボポエチン(TPO)を含むか、又は本質的にこれらから成り、該分化を誘導するのに十分な時間培養される。血管芽細胞は、培養培地中で約4日間培養される。いくつかの実施形態では、血管芽細胞は、DMEM/F12培養培地、L-アスコルビン酸-2-リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、NaHCO₃、トランスフェリン、インスリン、SCF、IL-3、及びTPOを含むか又は本質的にこれらからなる化学的に定義された培地中で約4日間培養される。いくつかの実施形態では、培養培地は、DMEM/F12培地、L-アスコルビン酸-2-リン酸マグネシウム(64ng/ml)、ナトリウムセレン(14ng/ml)、NaHCO₃(543μg/ml)、トランスフェリン(10.7μg/ml)、インスリン(20μg/ml)、SCF(50ng/ml)、IL-3(50ng/ml)、及びTPO(50ng/ml)を含むか又は本質的にこれらからなる。いくつかの実施形態では、第2のステップの培養培地は、生成されるCD34⁺/CD45⁺細胞集団の純度を高めるためさらに骨形成タンパク質4(BMP4)、WNT3A、又はその組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、約50ng/mlのBMP4、約50ng/mlのWNT3A、又はその組み合わせが培養培地に添加される。培養は、いずれの適切な表面でも(例えば、二次元又は三次元で)行なうことができる。記載どおりに血管芽細胞を培養することによって生成される細胞集団は、培養表面に付着する接着細胞及び浮遊造血前駆細胞を含む。浮遊造血前駆細胞は、円形形態を特徴とする。

場合によっては、第1及び第2の両ステップで用いるFGFはFGF2である。VEGFは、特異的内皮細胞マイトジェンとして作用するヘパリン結合糖タンパク質である。場合によっては、第1及び第2の両ステップで用いるVEGFは、VEGF-A(血管内皮増殖因子A)又はそのイソ型(例えば、VEGF-165)である。例示ヒトVEGF-Aタンパク質配列は、GenBank：AAH65522.2及びGenBank：AAH11177.2を含み、かつVEGF-Aの全て、又は非前駆体部分をコードする核酸が包含される。
本発明の方法で使用するのに適したTGFβ受容体インヒビターとしては、限定するものではないが、SB-431542、SB-525334、A83-01、LY2157299、LY210976、GW788388、RepSox、SB-505124、D4476、GW788388、SD208、及びEW-7197が挙げられる。好ましくは、TGFβシグナル伝達のインヒビターは、SB-431542、内在性アクチビン及びI型受容体(TGFβ受容体I)の小分子インヒビターである(Inman et al., Mol Pharmacol. 62(1):65-74 (2002)。

Notchは、デルタ様及びJaggedファミリーを含む細胞表面リガンドのファミリーに結合するシングルパス細胞表面受容体である。本明細書で使用する場合、用語「Notchアゴニスト」及び「Notchアクチベーター」は、Notch受容体に結合し、Notch活性化と関連するシグナル伝達事象を惹起又は媒介する分子(例えば、生体分子、小分子、化学薬品)を指す。レスベラトロール(3,4',5-トリヒドロキシスチルベン)は、スチルベンと呼ばれるポリフェノール化合物の分類に属し、Notchシグナル伝達のアクチベーター(アゴニスト)である、HPCの分化を促進するために本明細書で提供する方法に従って用いるのに適した他のNotchアゴニストとしては、バルプロ酸及びスベロイルビスヒドロキサム酸がある。さらに、固定化又は多量体化可溶性Notchリガンド、例えば固定化DLL4及び固定化Jagged-1ペプチドもNotchアクチベーターとして使用可能である。

イノシトールモノホスファターゼ(IMPase)は、myo-イノシトールモノホスファートの、ホスホイノシチド細胞シグナル伝達経路に必要とされるmyo-イノシトールへの加水分解を触媒する。場合によっては、IMPaseのインヒビターは、ビホスホナートL-690,330([1-(4-ヒドロキシフェノキシ)エチリデン]ビスホスホン酸)である。リチウムもIMPaseを阻害してホスホイノシチドシグナル伝達を減弱する(Berridge et al., Cell 59:411-419 (1989))。ホスホイノシチドシグナル伝達経路の他のインヒビターとしては、限定するものではないが、ホスホイノシチド3-キナーゼ(PI3K)インヒビターLy294002、ピクチリシブ、HS-173、GSK2636771、デュベリシブ、TG100-115、GSK1059615、PF-04691502、PIK-93、BGT226、AZD6482、SAR245409、BYL719、CUDC-907、IC-87114、TG100713、ゲダトリシブ(Gedatolisib)、CH5132799、PKI-402、BAY 80-6946、XL147、PIK-90、PIK-293、PIK-294、ケルセチン、ウォルトマニン、ZSTK474、AS-252424、AS-604850、及びアピトリシブが挙げられる。
本明細書に記載のもの等の化学的インヒビターに適した作業濃度範囲は、約0.1μM〜約100μM、例えば、約2μM、5μM、7μM、10μM、12μM、15μM、18μM、又は前述の1種以上の化学的インヒビターの別の作業濃度は、約0.1μM〜約100μMである。

本明細書に記載の生物学的マーカーのいくつかに関して、発現はレベルが低いか又は中程度であろう。特定マーカーに対して細胞を「陽性」又は「陰性」と呼ぶことが普通であるが、実際の発現レベルは量的形質である。「陽性」と特徴づけられているにもかかわらず、細胞表面上の分子数は、数対数変動し得る。従って、染色レベルの特徴づけは、細胞集団間の微妙な区別を可能にする。発現レベルは、フローサイトメトリーによって検出及び監視することができる。フローサイトメトリーでは、レーザーが蛍光色素の定量的レベル(抗体によって結合された細胞表面抗原の量に比例する)を検出する。フローサイトメトリー又は蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いて、抗体染色の強度、並びに他のパラメーター、例えば細胞サイズ及び光散乱に基づいて細胞集団を分離することができる。染色の絶対レベルは、個々の蛍光色素及び抗体製剤によって異なり得るが、データをコントロールに対して正規化することができる。

任意の適切な方法を用いて、本明細書に記載の細胞型に特有の生物学的マーカーの発現を検出することができる。例えば、RNAシークエンシング(例えば、RNA-seq)、免疫組織化学的検査、ポリメラーゼ連鎖反応、定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)、又は遺伝子発現を検出若しくは測定する他の技術を利用して、例えば、1種以上の生物学的マーカーの存否を検出することができる。RNA-seqは、器官、組織、又は細胞のRNA含量のゲノムワイド評価を可能にするハイスループットシークエンシング技術である。これとは別に、又はこれに加えて、例えば、蛍光インサイツハイブリダイゼーション法(FISH；1998年10月公開のWO98/45479参照)、サザンブロット法、ノーザンブロット法、又はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術、例えばqRT-PCRを利用して、HPCの1種以上の生物学的マーカーの存否を検出するか、又はそのレベルを測定することができる。例示実施形態では、本明細書で提供する方法に従って得られた細胞集団は、HPCの生物学的マーカー、例えばCD34、CD45、CD43、CD49f、及びCD90の発現(又はその非存在)について評価される。好ましくは、HPCは下記造血前駆細胞マーカーの1種以上を発現する：CD34、CD45、CD43、CD49f、及びCD90。細胞集団のタンパク質レベルでマーカーの発現を評価するための定量的方法は技術上周知である。例えば、フローサイトメトリーは、所与の細胞集団の、興味ある生物学的マーカーを発現するか又は発現しない細胞のフラクションを決定するために利用される。

用語「定義された培養培地」、「定義された培地」等は、本明細書で使用する場合、各培地成分の独自性及び量が知られていることを意味する。本明細書で使用する場合、用語「化学的に定義された培養条件」、「完全に定義された増殖因子非含有培養条件」、及び「完全に定義された条件」は、各培地成分の独自性及び量が知られ、かつ支持表面の独自性及び量が知られていることを意味する。本明細書で使用する場合、用語「アルブミン非含有条件」は、使用する培養培地が、限定するものではないが、ウシ血清アルブミン(BSA)、任意形態の組換えアルブミン、又は任意の他の動物アルブミンを含め、如何なる形態のアルブミンも添加されていないことを意味する。
ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、胚性でも誘導型でも、ヒト発生の最初期段階へのアクセスを可能にし、細胞療法及び組織工学のための多数の造血前駆細胞又は血液細胞をその上に導き出すプラットフォームを提供する。従って、例示実施形態では、本明細書で提供する方法は、中胚葉細胞の造血前駆細胞への分化を促進する条件下でヒト多能性幹細胞を分化させることをさらに含む。造血前駆細胞の生成方法は、中胚葉への分化を促進する無血清でアルブミン非含有の化学的に定義された培養培地中でヒト多能性幹細胞を培養することを含む。このようにして、多能性幹細胞由来中胚葉細胞は、本明細書で提供するHPC分化方法に従って分化され、この結果として多能性幹細胞由来HPCを生成する。例示実施形態では、中胚葉分化を促進する無血清でアルブミン非含有の化学的に定義された培養培地は、アクチビンA、骨形成タンパク質4(BMP4)、FGF2、及びWnt/βカテニンシグナル伝達のアクチベーターを含む。
多能性幹細胞を培養するための本明細書に記載の方法で使用する定義された培地及び基質条件は技術上周知である。本明細書で使用する培地は、それらがアルブミンを含まないという点によってのみ制限される。場合によっては、本明細書で開示する方法に従って分化すべき多能性幹細胞は、無血清でアルブミン非含有培地中で培養される。

当業者には明らかなように、Wnt/βカテニンシグナル伝達は、Wnt/βカテニンシグナル伝達経路に関与する1種以上のタンパク質の機能を調節してβカテニンの発現レベル若しくは活性、TCF及びLEFの発現レベル、又はβカテニン/TCF/LEF誘導転写活性を高めることによって活性化することができる。
いくつかの実施形態では、Wnt/βカテニンシグナル伝達の活性化は、Gsk3ホスホトランスフェラーゼ活性又はGsk3結合相互作用を阻害することによって達成される。理論によって束縛されることを望むものではないが、βカテニンのGsk3リン酸化の阻害は、βカテニンの持続性低下を阻止し、それによってβカテニンのレベル及び活性を高めて、多能性幹細胞の内胚葉／中胚葉細胞系譜への分化を駆り立てることになると考えられる。Gsk3阻害は、限定するものではないが、Gsk3ホスホトランスフェラーゼ活性、Gsk3のRNA妨害ノックダウン、及びGsk3のドミナントネガティブ型の過剰発現を阻害する小分子を提供することを含めた種々の方法で達成可能である。Gsk3のドミナントネガティブ型は、例えば、R96A変異を含むGsk3について記述しているHagen, T. et al. J Biol Chem, 277:23330-5 (2002)に記載されているように技術上周知である。

いくつかの実施形態では、Wnt/βカテニンシグナル伝達経路は、多能性幹細胞を、Gsk3ホスホトランスフェラーゼ(phosophotransferase)活性又はGsk3結合相互作用を阻害する小分子と接触されることにより多能性幹細胞中のGsk3を阻害することによって達成される。適切な小分子Gsk3インヒビターとしては、限定するものではないが、CHIR99021、CHIR98014、BIO-アセトキシム、BIO,LiCl、SB216763、SB415286、AR A014418、1-アザケンパウロン、ビス-7-インドリルマレイミド、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の分化方法で多能性幹細胞中のGsk3を阻害するためにCHIR99021、CHIR98014、及びBIO-アセトキシムのいずれかが用いられる。一実施形態では、使用すべき小分子Gsk3インヒビターは、約1μM〜約9μMの範囲、例えば、約1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μMの濃度のCHIR99021又は約1μM〜約9μMの別の濃度のCHIR99021である。別の実施形態では、使用すべき小分子Gsk3インヒビターは、約0.1μM〜約1μMの範囲、例えば、約0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1.0μMの濃度のCHIR98014又は約0.1μM〜約1μMの別の濃度のCHIR98014である。別の実施形態では、使用すべき小分子Gsk3インヒビターは、約0.1μM〜約1μMの範囲、例えば、約0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1.0μMの濃度のBIO-アセトキシム又は約0.1μM〜約1μMの別の濃度のBIO-アセトキシムである。

他の実施形態では、Gsk3のRNA妨害ノックダウンによってGsk3活性が阻害される。例えば、Gsk3発現レベルは、Gsk3に対する市販のsiRNA、例えば、SignalSilence(登録商標)GSK-3α/β siRNA(カタログ番号6301；Cell Signaling Technology(登録商標), Danvers, MA)、又はレトロウイルスベクターをGsk3用の誘導性発現カセット、例えば、Clontech (Mountain View, CA)から商業的に入手可能なTet誘導性レトロウイルスRNAiシステム(カタログ番号630926)、又はSystems Biosciences, Inc. (Mountain View, CA)のキュメート(cumate)誘導システム、例えば、SparQ(登録商標)システム(カタログ番号QM200PA-2)と共に用いてノックダウン可能である。
他の実施形態では、Wnt/βカテニンシグナル伝達経路は、βカテニン自体、例えば、ヒトβカテニン(GenBank登録番号：X87838及びCAA61107.1、それぞれヌクレオチド及びタンパク質配列用)を過剰発現させることによって活性化される。一実施形態では、βカテニンの過剰発現は、例えば、前述した誘導性発現システムのいずれかを用いて達成される誘導性βカテニン過剰発現である。これとは別に、例えば、Baba, Y. et al. Constitutively active β-catenin confers multi-lineage differentiation potential on lymphoid and myeloid progenitors. Immunity 23:599-609 (2005)に記載されているように、点変異S33A、S37A、T41A、及びS45Aを含有する、βカテニンの恒常的に活性な安定化イソ型が用いられる。

さらに他の実施形態では、多能性幹細胞のWnt/βカテニンシグナル伝達経路活性化は、細胞を、βカテニンの、βカテニン分解複合体の一員であるアキシン(Axin)との相互作用を妨害する薬剤と接触させることによって達成される。アキシン-βカテニン相互作用の妨害は、βカテニン分解複合体による分解からβカテニンが逃れられるようにし、それによってβカテニンの正味のレベルを高めてβカテニンシグナル伝達を駆り立てる。例えば、多能性細胞内のアキシン-βカテニン相互作用は、多能性細胞を、例えば、カタログ番号681667のように、EMD Biosciencesから商業的に入手可能な化合物5-(フラン-2-イル)-N-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-1,2-オキサゾール-3-カルボキサミド(「SKL2001」)と接触させることによって妨害することができる。Wnt/βカテニンシグナル伝達を活性化するために有効なSKL2001の濃度は、約10μM〜約100μMの範囲、例えば、約20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM又は約10μM〜約100μMの別の濃度のSKL2001である。いくつかの実施形態では、Wnt/βカテニンシグナル伝達のアクチベーターは、Gsk3インヒビターである。いくつかの実施形態では、Gsk3インヒビターは、CHIR99021、CHIR98014、BIO-アセトキシム、BIO,LiCl、SB216763、SB415286、AR A014418、1-アザケンパウロン、及びビス-7-インドリルマレイミドからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、Gsk3インヒビターは、培地中約0.1μM〜約10μMの濃度のCHIR99021又はCHIR98014である。一実施形態では、使用すべき小分子Gsk3インヒビターは、約1μM〜約9μMの範囲、例えば、約1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μMの濃度のCHIR99021又は約1μM〜約9μMの別の濃度のCHIR99021である。別の実施形態では、使用すべき小分子Gsk3インヒビターは、約0.1μM〜約1μMの範囲、例えば、約0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1.0μMの濃度のCHIR98014又は約0.1μM〜約1μMの別の濃度のCHIR98014である。

例示実施形態では、多能性幹細胞は、DMEM/F12培養培地、L-アスコルビン酸-2-リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ヒトFGF2、インスリン、NaHCO₃、トランスフェリン、TGFβ1、BMP4、アクチビンA(Activin-A)、及びCHIR99021(「E8BAC培地」)を含むか又は本質的にこれらからなる化学的に定義された培養培地中で2日間培養される。好ましくは、培養培地は、DMEM/F12培地；L-アスコルビン酸-2-リン酸マグネシウム(64mg/l)；ナトリウムセレン(14μg/l)；ヒトFGF2(100μg/l)；インスリン(20mg/l)；NaHCO₃(543mg/l)；トランスフェリン(10.7mg/l)；TGFβ1(2μg/l)；BMP4(5ng/mL)；アクチビンA(25μg/l)；及びCHIR99021(1μM)を含むか又は本質的にこれらからなる。ヒト多能性幹細胞は、培養培地中で約2日間培養される。約2日後、結果として生じる細胞集団の少なくとも約80%(例えば、少なくとも約80%、85%、90%、95%、99%)が中胚葉細胞である。本明細書で使用する場合、用語「中胚葉細胞」は、中胚葉細胞系譜、例えば骨、筋肉、例えば心筋、骨格筋及び平滑筋(例えば、腸の)等、結合組織、例えば真皮及び軟骨等、腎臓、泌尿生殖器系、血液又は造血細胞、心臓及び血管等に分化する能力がある中胚葉特異的遺伝子発現を有する細胞を指す。中胚葉特異的バイオマーカーにはブラキュリ(T)が含まれる。培養は、いずれの適切な表面でも(例えば、二次元又は三次元培養で)行なうことができる。

本明細書で使用する場合、本発明の方法に従って使用するのに適した「多能性幹細胞」は、3つ全ての胚葉の細胞に分化する能力がある細胞である。本明細書での使用に適した多能性細胞としては、ヒト胚性幹細胞(hESC)及びヒト人工多能性幹(iPS)細胞がある。本明細書で使用する場合、「胚性幹細胞」又は「ESC」は、胚盤胞の内部細胞塊由来多能性細胞又は多能性細胞集団を意味する。Thomson et al., Science 282:1145-1147(1998)を参照されたい。これらの細胞は、Oct-4、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60及びTRA-1-81を発現する。多能性幹細胞は、高い核細胞質比及び突出した核小体を有する細胞を含むコンパクトなコロニーとして現れる。ESCは、WiCell Research Institute (Madison、Wis.)等の供給源から市販されている。本明細書で使用する場合、「人工多能性幹細胞」又は「iPS細胞」は、それらの分化した起始体細胞に関して異なることがあり、特定のセットの効力決定因子に関して異なることがあり、かつそれらを単離するために用いられる培養条件に関して異なることがあるが、それにもかかわらず、それらのそれぞれの分化した起始体細胞と実質的に遺伝的に同一であり、より効力の高い細胞、例えば本明細書に記載のESCに類似した特性を示す多能性細胞又は多能性細胞集団を意味する。例えば、Yu et al., Science 318:1917-1920 (2007)を参照されたい。

人工多能性幹細胞は、ESCに類似の形態学的特性(例えば、円形の大きい核小体及びわずかな細胞質)及び増殖特性(例えば、約17〜18時間の倍加時間)を示す。さらに、iPS細胞は、多能性細胞特異的マーカー(例えば、Oct-4、SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60又はTra-1-81)を発現するが、SSEA-1を発現しない。しかしながら、人工多能性幹細胞は、胚から直ちに誘導されるわけではない。本明細書で使用する場合、「胚から直ちに誘導されるわけではない」とは、iPS細胞を生成するための出発細胞型が、非多能性細胞、例えば、出生後個体から得られる体細胞のような複能性(multipotent)細胞又は末端分化細胞であることを意味する。
本明細書に記載の方法に従ってヒトiPS細胞を用いて、特定のヒト対象の遺伝的相補性を有するHPCを得ることができる。例えば、特定の哺乳動物対象の特定の疾患若しくは障害と関連するか又はそれから生じる1種以上の特異的表現型を示すHPCを得るのが有利なことがある。このような場合、iPS細胞は、技術上周知の方法に従って特定のヒト対象の体細胞を初期化することによって得られる。例えば、米国特許公開第2013/0217117号、米国特許公開第2014/0057355号、米国特許第8,268,620号、米国特許第8,440,461号、Yu et al., Science 324(5928):797-801 (2009)；Chen et al., Nat. Methods 8(5):424-9 (2011)；Ebert et al., Nature 457(7227):277-80 (2009)；Howden et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108(16):6537-42 (2011)を参照されたい。人工多能性幹細胞由来HPCは、例えば、特定の疾患を有する個体の血管組織を再現する組織構成物における薬物応答のモデリングを可能にする。最も安全な薬物でさえ、特異的な遺伝的背景又は環境履歴を有する特定個体において有害反応を引き起こすことがある。従って、ヒト対象特有のiPS細胞由来HPCは、可変性薬物応答に寄与する遺伝因子及びエピジェネティック影響の同定に役立つ。

iPS細胞に初期化するための対象特有の体細胞は、興味ある標的組織からバイオプシー又は他の組織サンプリング法によって得るか又は単離することができる。場合によっては、対象特有の細胞は、本発明の三次元のヒドロゲルベースの組織構成物で使用する前に、in vitroで操作される。例えば、対象特有の細胞は、三次元の組織構成物への導入前に拡大、分化、遺伝子修飾、ポリペプチドへ、核酸若しくは他の因子への接触、凍結保存、又は他の方法で修飾され得る。
本明細書に記載の方法で使用する多能性幹細胞を培養するための培地及び基質の条件は技術上周知である。場合によっては、本明細書で開示する方法に従って分化される多能性幹細胞は、mTESR-1(登録商標)培地(StemCell Technologies, Inc., Vancouver, British Columbia.)、E8培地、又はEssential 8(登録商標)培地(Life Technologies, Inc.)中、MATRIGEL(商標)基質(BD Biosciences, NJ)上で製造業者のプロトコルに従って又はCorning(商標)Synthemax(商標)表面上で培養される。

好ましくは、ヒト多能性幹細胞(例えば、ヒトESC又はiPS細胞)は、フィーダー層(例えば、線維芽細胞フィーダー層)、条件培地、又は不十分に定義されたか若しくは未定義成分を含む培養培地の非存在下で培養される。本明細書で使用する場合、用語「化学的に定義された培地」及び「化学的に定義された培養培地」は、完全に開示されているか又は同定可能な成分の製剤を含有し、成分の正確な量は知られているか又は同定可能であり、かつ個々に制御可能である培養培地をも指す。そのようなものとして、培養培地は、(1)全ての培地成分の化学的及び構造的独自性が知られていないか、(2)培地が、未知量の任意成分を含有するか、又は(3)その両方である場合、化学的に定義されていないことになる。化学的に定義された培養培地を用いることによって培養条件を標準化すると、細胞培養中に細胞がさらされる材料のロット間又はバッチ間変動の可能性を最小限にする。従って、種々の分化因子の影響は、化学的に定義された条件下で培養された細胞及び組織に添加されたときには予測可能性が高い。本明細書で使用する場合、用語「無血清」は、血清若しくは血清代替物を含有しないか、又は本質的に血清若しくは血清代替物を含有しない細胞培養材料を指す。例えば、本質的に無血清の培地は、約1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、又は0.1%未満の血清を含有し得る。「無血清」は、動物(例えば、ウシ胎仔)血液又は動物由来材料から得られる血清の培養成分を含まないことをも指し、このことは、異種間ウイルス又はプリオン伝播の可能性を少なくするか又は排除するために重要である。誤解を避けるため、血清含有培地は、化学的に定義されていない。

本明細書で提供する方法は、多能性幹細胞由来HPCの単離された集団を生成し、この単離された集団は、HPCの実質的に純粋な集団である。本明細書で使用する場合、「単離する」及び「単離された」は、周囲の、隣接する、若しくは混入している細胞から又は別の型の細胞から、興味ある細胞型又は細胞亜集団について分離するか、又は選択するか、又は富化することを指す。本明細書で使用する場合、用語「実質的に純粋」は、細胞集団全体を作り上げるHPCに対して少なくとも約80%(例えば、少なくとも約80%、82%、83%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%以上)純粋である細胞集団を指す。換言すれば、用語「実質的に純粋」は、分化を誘導して造血前駆細胞系譜の細胞を得るときに少なくとも約80%(例えば、少なくとも約80%、82%、83%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%以上)のHPCを含有する本発明のHPCの集団を指す。用語「実質的に純粋」は、任意の富化、拡大ステップ、分離又は選択ステップ前の集団中に約20%、約10%、又は約5%未満の非HPCを含有する本発明のHPCの集団をも指す。場合によっては、本明細書で提供する方法に従って生成されたHPCの実質的に純粋な単離された集団は、細胞集団全体を作り上げるHPCに対して少なくとも約95%(例えば、少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%)純粋である。

いくつかの実施形態では、記載方法で得られた細胞集団中の造血前駆細胞の比率は、細胞分離、細胞選別、又は富化方法、例えば、蛍光活性化細胞選別(FACS)、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、電磁ビーズ、磁気活性化細胞選別(MACS)、非内皮細胞のレーザー標的アブレーション、及びこれらの組み合わせを利用して富化される。好ましくは、細胞表面抗原発現に基づいて細胞を同定及び分離するためにFACSが利用される。
本発明の方法は、ヒトHPCのスケーラブルで安価かつ再現性のある生成を提供する。例えば、本明細書に記載の方法に従ってヒトHPCを含む細胞集団を得た後に、例えば、限定するものではないが、E6培地に加えて幹細胞因子(SCF)、又はStemSpan(商標)SFEMに加えてSCFといったヒトHPCの増殖に適した培養培地中でヒトHPC集団を拡大することができる。いくつかの実施形態ではSCFは、培地中に20ng/mlで含められる。

表1. 化学的に定義された培養培地成分

本明細書では、別の態様において、マクロファージを得る方法を提供する。例示実施形態では、造血前駆細胞を含む細胞集団の浮遊細胞が、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を含む培地中で約3日間培養される。細胞は、次にインターロイキン1β(IL-1B)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、及びウシ胎仔血清(FBS)又はノックアウト血清代替物(KOSR)を含む培地中で約6日間培養されて、マクロファージを含む細胞の集団を得る。いくつかの実施形態では、細胞集団は、少なくとも約90%(又は少なくとも約95%)のCD11b⁺CD14⁺マクロファージを含む。
本明細書では、別の態様において、フィーダー細胞を添加する必要なくHPCからナチュラルキラー(NK)細胞を分化させる方法を提供する。NK細胞分化のために当技術分野で記載された以前の方法は、フィーダー細胞を添加した共培養又はウシ血清アルブミンの添加を必要とする(Knorr et al., 2013)。例示実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成された造血前駆細胞を含む細胞集団は、ウシ血清アルブミン(BSA)、インスリン、及びトランスフェリンを含む培地中で約3日間培養されて、接着細胞及び浮遊細胞を含む細胞集団を生成する。いくつかの実施形態では、培地は、BSA、インスリン、及びトランスフェリンを含むE6培地である。浮遊細胞が取り出され、インターロイキン7(IL-7)、インターロイキン15(IL-15)、Flt3リガンド(FLT3-L)、及びSCFを含む培地中で培養されて、NK細胞を含む細胞集団を生成する。いくつかの実施形態では、培地は、さらに血清又は血清代替物、例えばノックアウト血清代替物(KOSR)又はBIT9500血清代替物を含む。いくつかの実施形態では、StemSpan(商標)SFEM培地が使われることがある。いくつかの実施形態では、浮遊細胞は、約2〜3週間培養されてNK細胞を生成する。いくつかの実施形態では細胞集団は、少なくとも約60%(又は少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、又は少なくとも約99%)のCD56⁺CD3^-NK細胞を含む。

本明細書では、別の態様において、本明細書に記載の方法で生成された造血前駆細胞からT細胞を分化させるための無フィーダー方法を提供する。例示実施形態では、造血前駆細胞を含む細胞集団からの浮遊細胞が、インターロイキン7(IL-7)、Flt3リガンド(FLT3-L)、SCF、及びNotchアゴニストを含むT細胞培地中で培養されて、CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺T細胞を含む細胞集団を生成する。いくつかの実施形態では、細胞は、約30日間培養されてT細胞集団を生成する。T細胞は、T細胞受容体γ/δ(TCRγ/δ)を発現することもある。いくつかの実施形態では、T細胞培地は、さらに血清又は血清代替物、例えばノックアウト血清代替物(KOSR)又はBIT9500を含む。いくつかの実施形態では、StemSpan(商標)SFEM培地が使われることがある。いくつかの実施形態では、Notchアゴニストは、RESV、DLL4、JAG1又は本明細書に記載される別のNotchアゴニスト若しくはアクチベーターであり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、約85%と約95%の間(例えば、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、又は95%)のCD3⁺、CD4⁺、CD8⁺T細胞を含む細胞集団を生成する。本明細書に記載の方法によって生成されたT細胞は、同種免疫療法として使用する等の治療方法に用いる治療組成物に使用可能である。

本明細書で使用する場合、「無フィーダー」は、細胞フィーダー層を実質的に含まない培養条件を指す。無フィーダー条件下で育てられる細胞は、化学的に定義された基質等の基質上で育てられ、及び／又は接着培養として育てられることがある。適切な化学的に定義された基質としてはビトロネクチンがある。
本明細書では、別の態様において、本明細書に記載の方法に従って得られたHPC、マクロファージ、NK細胞、及び／又はT細胞を含む治療用組成物及び対象の治療のためのそれらの使用方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のHPCは、癌の免疫療法処置又はキメラ抗原受容体(CAR)T細胞若しくはCAR NK細胞の生成に使用可能である。
キメラT細胞受容体、人工T細胞受容体及びキメラ免疫受容体としても知られるキメラ抗原受容体(CAR)は、遺伝子操作された(engineered)受容体であり、免疫エフェクター細胞上に特異性を移植する。一般に、キメラ抗原受容体は、スぺーサー及び膜貫通ドメインを介してシグナル伝達細胞内ドメインに融合されている標的抗原結合ドメインを有する膜貫通タンパク質である。CARがその標的抗原と結合すると、活性化シグナルがT細胞又はNK細胞に伝達される。一実施形態では、キメラ抗原受容体又は遺伝子操作された受容体がT細胞又はNK細胞に導入される。一実施形態では、キメラ抗原受容体又は遺伝子操作された受容体をコードする核酸ベクターがT細胞又はNK細胞にトランスフェクトされ、それによってT細胞又はNK細胞はキメラ抗原受容体を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかに使用するためにキメラ抗原受容体又は遺伝子操作された受容体をコードする核酸ベクターがヒト多能性幹細胞、中胚葉細胞、血管芽細胞、又は造血前駆細胞にトランスフェクトされてCAR T細胞又はCAR NK細胞を生成する。CAR T細胞及びCAR NK細胞の作製及び使用方法は、当技術分野で記載されている。例えば、June et al. (June, et al., "CAR T cell immunotherapy for human cancer," Science, 359, 1361-1365, 2018)、及びMehta et al. (Mehta et al., "Chimeric antigen receptor expressing natural killer cells for immunotherapy of cancer," Frontiers of Immunology, 9:283, 2018)を参照されたい。

従って、さらなる態様において、本発明は、細胞移植、細胞補充、並びに細胞又は組織置換及び造血増強のための方法及び組成物を提供する。本方法は、本明細書で提供する方法に従って誘導された造血前駆細胞の治療的に有効な量を、それを必要とする対象に与え、それによって造血前駆細胞が対象を治療できるようにすることを含み得る。細胞又は組織置換及び造血の改善を必要とする障害としては、限定するものではないが、血液疾患、例えば、異常ヘモグロビン症、好中球減少症、血小板減少症、貧血症、サラセミア、赤血球増加症、尿毒症、骨髄線維症、骨髄腫、脊髄形成異常症、白血病、リンパ腫、骨髄異形成症候群、フォン・ヴィルブランド病、血友病、原発性血小板血症、後天性血小板機能障害、形質細胞障害、固形腫瘍並びに罹患個体が造血性再生医療又は造血前駆細胞移植から利益を得ることになる任意の他の障害又は疾患が挙げられる。本発明の好ましい個体対象は哺乳動物であり、限定するものではないが、ヒト及び非ヒト霊長類、並びにイヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、及びウシが挙げられる。場合によっては、治療を必要とする対象の多能性細胞(例えば、人工多能性幹細胞)を用いて、造血前駆細胞の実質的に純粋な集団が得られる。しかしながら、造血前駆細胞の実質的に純粋な集団は、好ましくは、同系又は同種ドナーの多能性幹細胞を用いて得ることもできる。異種ドナーの使用は、あまり好ましくない。

本明細書で提供する治療方法のためには任意の適正投与量が使用可能である。細胞用量は、血液障害又は疾患の程度及び重症度によって決まることになるが、適切な範囲は、1用量当たり約1×10⁸細胞/患者〜約1×10¹⁰細胞/患者である。場合によっては、本明細書に記載どおりに得られたHPCは、他の細胞型、例えば、マクロファージ、T細胞、又はNK細胞等と共に対象に同時投与される。
細胞の対象への投与後、所望により、当業者に既知の任意の適正方法を利用して、治療方法の効果を評価し得る。必要又は要求に応じて、治療を繰り返してよい。本明細書で提供する方法に従う治療後に、治療した患者を、治療している血液障害又は疾患の任意陽性又は陰性変化についてモニターすることができる。好ましい実施形態では、血液細胞生成の増加は、前記細胞の投与後のHPCの生着の結果である。

治療的に有効な量のHPCのレシピエント対象への投与は、一般的に技術上周知の方法を用いて行なわれ、通常は、当業者に既知の臨床手段を用いて治療的に有効な量のHPCを対象に直接注射するか又は別の方法で導入することを含む(例えば、米国特許第6,447,765号；第6,383,481号；第6,143,292号；及び第6,326,198号)。例えば、本発明のHPCの導入は、血管内投与、例えば静脈内、筋肉内、又は動脈内投与、腹腔内投与等によって局所又は全身に行なうことができる。無菌シリンジ又は他の無菌移動機構を用いて細胞を輸液バッグ(例えば、Fenwal輸液バッグ(Fenwal, Inc.))に注入することができる。次に細胞をある時間、例えば15分にわたってIV投与により患者へのフリーフローIVラインに即座に注入することができる。いくつかの実施形態では、緩衝液又は塩等の追加試薬がレシピエント対象に細胞と同時に提供される。
例示実施形態では、本発明のHPCは、細胞及び1種以上の医薬的に許容される担体、緩衝液、又は賦形剤を含む医薬組成物として対象に提供される。投与用の医薬組成物は、適切な無菌性及び安定性を与える標準的方法に従って処方、製造、及び貯蔵されなければならない。本発明の医薬組成物は、移植された細胞の生存若しくは生着を促し、血管新生を促進し、細胞外若しくは間質性マトリックスの組成を調節し、及び／又は移植部位に他の細胞型を補充する1種以上の増殖因子又はサイトカイン(例えば、血管新生サイトカイン)を含んでもよい。

組成物
本明細書では、別の態様において、HPCの製剤を提供する。例えば、HPC、HPCの実質的に精製された集団、HPCを含む医薬製剤、及びHPCの凍結保存製剤を提供する。本明細書に記載のHPCは、少なくとも1種のタンパク質、分子、又はその自然環境で見られる他の不純物(例えば、「単離された」)を実質的に非含有であり得る。HPCは、ヒトHPCを含めた哺乳動物のHPCであり得る。本発明は、ヒトHPC、ヒトHPCの実質的に精製された集団、ヒトHPCを含む医薬製剤、及びヒトHPCの凍結保存製剤をも提供する。製剤はヒト胚性幹細胞由来HPC、ヒトiPS細胞由来HPC、及び分化した多能性幹細胞由来HPCを含む実質的に精製された(非HPCに関して)製剤であり得る。
本明細書で提供する細胞製剤は、種々のin vitro及びin vivo用途、例えば造血前駆細胞移植、血液疾患モデリング、及び造血に影響を与える薬物、例えば造血成長因子、赤血球新生因子、及びコロニー刺激因子のスクリーニング等に役立つ。開示方法は、HPC集団の生成及び使用を容易にする。

本明細書では、別の態様において、本明細書に記載の方法によって生成された遺伝子操作されたHPCを提供する。本明細書では、本明細書に記載の方法によって生成されたHPCから分化した遺伝子操作されたT細胞をも提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたT細胞はCAR T細胞である。本明細書では、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法によって生成されたHPCから分化した遺伝子操作されたNK細胞を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたNK細胞はCAR NK細胞である。本明細書では、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法によって生成されたHPCから分化した遺伝子操作されたマクロファージを提供する。
本明細書で使用する場合、用語「遺伝子操作された」及び「遺伝子修飾された」を互換的に使用し、これらは人の手で(例えば、組換えDNA技術を用いて)作り出されたか若しくは修飾された天然に存在しない核酸分子又は該分子から(例えば、転写、翻訳等によって)導き出される天然に存在しない核酸分子を含むように修飾された細胞(例えば、原核又は真核細胞)を指す。外来性の、組換え型の、合成の、及び／又は他の方法で修飾されたポリヌクレオチドを含有するHPC、T細胞、NK細胞、又はマクロファージは、遺伝子修飾された細胞であり、その結果、任意の天然に存在する対応物に対して天然に存在しないと考えられる。場合によっては、遺伝子修飾された細胞は、1つ以上の組換え核酸を含有する。他の場合には、遺伝子修飾された細胞は、1つ以上の合成核酸又は遺伝子操作された核酸(例えば、その天然に存在する対応物に見られる配列と比べて少なくとも1つの人工的に引き起こされた挿入、欠失、反転、又は置換を含む核酸)を含有する。遺伝子操作された細胞の生成手順は、例えば、Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Fourth Edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012)及びDoudna et al, CRISPR-Cas, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2016)に記載されているように、当技術分野で一般的に知られている。

場合によっては、細胞のゲノムは、クラスII又はクラスIとクラスIIの両方の主要組織適合性複合遺伝子によってコードされた機能タンパク質が細胞の表面に現れないように修飾(例えば、操作)される。例えば、Deuse et al. (Deuse et al., "Hypoimmunogenic derivatives of induced pluripotent stem cells evade immune rejection in fully immunocompetent allogenic recipients," Nature Biotechnology, vol. 37, 252-258, 2019)を参照されたい。
このようにして、修飾された細胞は、レシピエントのT細胞による攻撃を逃れる可能性が高い。場合によっては、細胞は、米国特許第6,916,654号に記載されているように遺伝子修飾(操作)される。他の場合には、米国特許公開2014/0134195によって記載されているようにβ2ミクログロブリンを破壊することによってiPS細胞から免疫非応答性細胞を生成するのが有利なことがある。例えば、細胞の内在性β2ミクログロブリン(B2M)遺伝子に遺伝子操作された破損を含むように細胞を修飾することができる。米国特許公開2014/0134195に記載のように、遺伝子操作された破損は、直接又はリンカー配列を介して共有結合しているB2Mタンパク質の少なくとも一部を含む単鎖融合ヒト白血球抗原(HLA)クラスIタンパク質をコードすることができる1つ以上のポリヌクレオチド配列をヒト白血球抗原(HLA)-I鎖の少なくとも一部に導入することを含み得る。しかしながら、「普遍的」ヒトAECを得る方法は、HLAタンパク質の修飾に限定されないことは当然である。他の戦略を利用して細胞を遺伝子修飾して免疫応答を最小限にすることもできる。例えば、Riolobos et al. (Molecular Therapy 2013, 21(6):1232-1241)は、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)媒介遺伝子編集を利用してβ2ミクログロブリン(B2M)遺伝子の両アレルに標的破壊を引き起こすことによって安定したHLA-I陰性ヒト多能性細胞を生成することを記載した。結果として生じるB2M^-/-多能性幹細胞は、本明細書に記載のいずれの方法を用いても分化させることができた。別の例では、細胞表面上のCD58の発現を全体的又は部分的に妨害する遺伝子修飾は、細胞性免疫の両アームによる免疫認識からのエスケープを増やすことが分かった。例えば、Challa-Malladi et al. (Cancer Cell 2011; 20(6):728-740)を参照されたい。また、HLA-E発現多能性幹細胞(Edimer細胞)は、同種応答及びNK細胞による溶解を逃れる(Gornalusse et al., Nat Biotechnol. 2017; 35(8):765-772)。

臨床用途に有用なHPCを含む製剤は、アメリカ食品医薬品局等の政府機関によって課される規制に従って得なければならない。従って、例示実施形態では、本明細書で提供する方法は、優良製造規範(Good Manufacturing Practice)(GMP)、優良組織規範(Good Tissue Practice)(GTP)、及び優良実験室規範(Good Laboratory Practice)(GLP)に従って行われる。動物由来成分を含む試薬は使用されず、全ての試薬は、適正製造基準(GMP-compliant)である供給源から購入される。細胞療法製品、例えばヒト造血前駆細胞のin vitro集団の臨床的製造の状況では、GTPがドナーの同意、トレーサビリティ、及び感染症スクリーニングに適用されるが、一方でGMPは、ヒト使用のための一貫して安全かつ効果的な製品を製造するための施設、プロセス、試験、及び規範に関連する。Lu et al. Stem Cells 27: 2126-2135 (2009)を参照されたい。適切な場合には、インフォームドコンセントが得られ；製品の安全性、生理活性、適正投与量、及び有効性が段階的に研究され；結果が統計的に有意義であり；かつ倫理的ガイドリンに従うことを確実にするために機関及び施設のパネルによる患者プロトコルの監視が想定される。

本明細書では、別の態様において、ヒト多能性幹細胞由来中胚葉細胞を血管芽細胞に分化させるための第1の培養培地（この第1の培養培地は、FGF、VEGF、TGFβシグナル伝達のインヒビター(例えば、SB431542)、Notchアゴニスト(例えば、レスベラトロール(RESV))、及びイノシトールモノホスファターゼのインヒビターを含むか又は本質的にこれらからなる）、及び血管芽細胞をHPCに分化させるための第2の培養培地（この第2の培養培地は、インスリン、FGF、VEGF、及びNotchアゴニストを含むか又は本質的にこれらからなる）を含む培養培地セット又は培養システムを提供する。例示実施形態では、第1の培養培地は、ヒトFGF2(100μg/l)を補充したE5培地、VEGF-165(50μg/l)、SB431542(10μM)、RESV(5μM)、及びL-690,330(10μM)を含むか又は本質的にこれらからなる。例示実施形態では、第2の培養培地は、FGF、VEGF、及びNotchアゴニスト((例えば、レスベラトロール(RESV))を含むか又は本質的にこれらからなる。

いくつかの態様では、培養培地は、FGF、VEGF、TGFβシグナル伝達のインヒビター(例えば、SB431542)、Notchアゴニスト(例えば、レスベラトロール(RESV))、及びイノシトールモノホスファターゼのインヒビターを含むか又は本質的にこれらからなる。FGF(例えば、FGF2)は、培養培地中に約10ng/mlと約200ng/mlの間の濃度(例えば、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、125ng/ml、150ng/ml、175ng/ml、又は200ng/ml)で存在し得る。いくつかの実施形態では、100ng/mlのFGF2が培養培地に含められる。VEGF(例えば、VEGF-A又はイソ型、例えばVEGF-165)は、培養培地中に約1ng/mlと約100ng/mlの間の濃度(例えば、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、75ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、又は100ng/ml)で存在し得る。いくつかの実施形態では、50ng/mlのVEGF-165又はVEGF-Aが培養培地に含められる。TGFβシグナル伝達のインヒビターは、限定するものではないが、SB-431542、SB-525334、A83-01、LY2157299、LY210976、GW788388、RepSox、SB-505124、D4476、GW788388、SD208、及びEW-7197であり得る。TGFβインヒビターは、培養培地中に約5μMと約15μMの間の濃度(例えば、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、又は15μM)で存在し得る。いくつかの実施形態では、培養培地は10μMのSB431542を含む。Notchアゴニストは、限定するものではないが、レスベラトロール(RESV、3,4',5-トリヒドロキシスチルベン)、バルプロ酸、及びスベロイルビスヒドロキサム酸であり得る。Notchアゴニストは、培養培地中に約1μMと約10μMの間の濃度(例えば、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、又は10μM)で存在し得る。いくつかの実施形態では培養培地は5μMのRESVを含む。イノシトールモノホスファターゼのインヒビターは、限定するものではないが、ビホスホナートL-690,330([1-(4-ヒドロキシフェノキシ)エチリデン]ビスホスホン酸)、リチウム、ホスホイノシチド3-キナーゼ(PI3K)インヒビターLy294002、ピクチリシブ、HS-173、GSK2636771、デュベリシブ 、TG100-115、GSK1059615、PF-04691502、PIK-93、BGT226、AZD6482、SAR245409、BYL719、CUDC-907、IC-87114、TG100713、ゲダトリシブ(Gedatolisib)、CH5132799、PKI-402、BAY 80-6946、XL147、PIK-90、PIK-293、PIK-294、ケルセチン、ウォルトマニン、ZSTK474、AS-252424、AS-604850、及びアピトリシブであり得る。イノシトールモノホスファターゼのインヒビターは、培養培地中に約5μMと約15μMの間の濃度(例えば、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、又は15μM)で存在し得る。
いくつかの実施形態では、培養培地は10μMのL-690,330を含む。いくつかの実施形態では、培養培地はさらにDMEM/F12培養培地、L-アスコルビン酸-2-リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、NaHCO₃、及びトランスフェリンを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、DMEM/F12培地、L-アスコルビン酸-2-リン酸マグネシウム(64ng/ml)、ナトリウムセレン(14ng/ml)、NaHCO₃(543μg/ml)、トランスフェリン(10.7μg/ml)、FGF2(100ng/ml)、VEGF-A(50ng/ml)、SB431542(10μM)、RESV(5μM)、及びL-690,330(10μM)を含むか又は本質的にこれらからなる。

製造物品
本発明は、ヒト多能性幹細胞をHPCに分化させるためのキットであって、(i)ヒト多能性幹細胞の中胚葉細胞への分化に適した第1の培養培地；(ii)多能性幹細胞由来中胚葉細胞の血管芽細胞への分化に適した第2の培養培地；(iii)血管芽細胞のHPCへの分化に適した第3の培養培地；及び(iv)第1の培養培地、第2の培養培地、及び第3の培養培地を利用する、ヒト多能性幹細胞をHPCに分化させる方法について記載する使用説明書を含むキットを提供する。
特に定義されていない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者が一般的に理解する意味と同一の意味を有する。本発明の実施及び試験においては、本明細書に記載のものと同様又は等価ないずれの方法及び材料をも使用可能であるが、本明細書には好ましい方法及び材料を記載している。

本明細書及び特許請求の範囲において、用語「including」及び「comprising」は、無制限用語であり、「．．．．を含むが、これに限定されない」という意味に解釈すべきである。これらの用語は、より制限的な用語「から本質的に成る」及び「からなる」を包含する。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「a」、「an」、「the」には、文脈上明白に他の意味に解すべき場合を除き、複数の言及を含む。同様に、用語「a」(又は「an」)、「1つ以上」及び「少なくとも1つ」は、本明細書では互換的に使用可能である。用語「comprising」、「including」、「特徴とする」、「有する」も互換的に使用可能である。
本明細書で使用する場合、「から本質的に成る培地」は、明示成分及び培地の基本特性に実質的な影響を及ぼさない成分を含有する培地を意味する。
本明細書で使用する場合、「有効な量」は、本発明に従って明示細胞の効果を誘発するのに十分な薬剤の量を意味する。
本明細書で使用する場合、「約」は、述べた濃度範囲、密度、温度、又は時間枠の5%以内を意味する。
本発明を1つ以上の好ましい実施形態に関して記載したが、それらの明示的に述べた形態とは別に、多くの等価形態、代替形態、変形形態、及び変更形態が可能であり、それらは本発明の範囲内であることを認めるべきである。

実施例1
ここで記載する実施形態は、造血前駆細胞の大規模生成を実証し、かつ前記細胞のマウスへの生着を実証する。
内皮細胞の造血細胞への移行は、細胞間接触の劇的減少を伴う。しかしながら、造血細胞運命決定における細胞間接触の役割は不明なままである。ここで、我々は、細胞を低密度で播種することによって細胞間接触を妨害した。結果は、高細胞密度で供給されたヒト多能性幹細胞は動脈内皮細胞に分化するが、低細胞密度で供給されたヒト多能性幹細胞は血管芽細胞に分化することを実証した。さらなる調査により、低細胞密度はBMPシグナル伝達経路を活性化してHPC形成を促進することが明らかになった。これらの造血前駆細胞は、無フィーダーかつ無血清条件でマクロファージ、NK(ナチュラルキラー)細胞、及びT細胞にさらに分化されることもあった。我々の研究は、血管内皮から血管芽細胞への移行及び造血前駆細胞生成の効率的プロトコルについての新たな知見を提供する。

細胞間接触は、動脈内皮細胞及び血管芽細胞の運命決定、すなわち血管内皮から造血幹細胞への移行が大動脈・性腺・中腎領域で起こることを制御する。そこで、我々は、ヒト多能性幹細胞由来動脈内皮細胞が初期化されて造血幹細胞になり得るかどうかを調べた。血管内皮から造血幹細胞胞への移行中の細胞間接触低減を模倣するため、我々は、低密度で細胞を播種することによって細胞間接触を妨害した。最初の6日間は「5因子」動脈内皮細胞分化プロトコルを利用した(Zhang et al., 2017、米国特許公開第2016/0244719をも参照)(図1A)。培地をFVRに交換し、さらに3〜4日間培養した。低細胞密度培養では造血細胞が観察されたが、高細胞密度培養では観察されなかった(図1B)。これらの細胞は、造血前駆細胞マーカーCD34及びCD45を発現した(図1C)。対照的に、血管内皮細胞マーカーCD144は減少した(図1D)。結果は、造血前駆細胞の生成を示した。造血前駆細胞は、H9 ES及びPBMC-3-1 iPS細胞株からも生成された(図1E)。最後に、我々は、1つのトリプルフラスコ(TripleFlask)から10日で4×10⁸HPCを生成することができた(図1F)。造血細胞は、10日目に凍結保存することができた(90% FBS+10% DMSO)。結果は、このプロトコルが大規模臨床用途に適していることを示唆した。結果は、凍結保存した中胚葉細胞を用いてHPCを生成可能であることをも実証した(図9)。

低細胞密度での播種が血管内皮から血管芽細胞への移行を促進するBMPシグナル伝達を活性化する−NOTCH及びYAPシグナル伝達は、細胞間接触によって制御される2つの重要な経路である(Bray, 2016; Pan, 2010)。我々の結果は、YAP発現及び核転移は、低細胞密度培養でも高細胞密度培養でも同様であることを実証した(図2A)。興味深いことに、活性化NOTCH1(NICD1)は、高細胞密度に比べて低細胞密度で大きく低下したが(図2B)、NOTCHシグナル伝達の阻害は、高細胞密度において造血系様の細胞形成を促進しなかった(図2C＆2D)。これらの結果は、低細胞密度が他の経路を制御して造血を促したことを示唆している。
造血にはBMP4シグナル伝達が必要とされるので(Goldman et al., 2009; Wang and Nakayama, 2009)、我々はBMP4-SMAD1/5/8経路を調べた。免疫染色でもウエスタンブロットでも実証されたように、低細胞密度ではリン酸化SMA1/5/8が大いに増加した(図3A＆3B)。より重要なことに、BMP4を添加すると高細胞密度における造血を促進したが、LDNによってBMP4シグナル伝達を阻害すると低細胞密度における造血を低減させた(図3C-E)。結果は、細胞間相互作用を少なくするとBMP4シグナル伝達経路を増やして動脈内皮細胞からの造血を誘発することを示した。

造血前駆細胞のマクロファージへの分化−これらの造血細胞の分化の可能性を試験するため、10日目の培養から浮遊細胞を採取した。コロニー形成単位(CFU)アッセイは、GM(顆粒球及び単球／マクロファージ)及びGEMM(顆粒球、赤血球、及び単球／マクロファージ)コロニーの存在を明らかにし(図4)、造血前駆細胞の多能性を示唆している。
次に、我々は、これらの細胞がマクロファージに分化され得るどうか試験した。細胞をE6G培地中で3日間培養してから、E6M培地(10%のFBS又はKOSRを補充した)中でさらに6日間培養した(図5A)。このプロトコルは95%超のCD11b⁺CD14⁺マクロファージを生成した(図5B＆5C)。ファゴサイトーシス分析は、これらのマクロファージが細菌粒子を取り入れることができることを明らかにし(図5D)、これらのマクロファージが機能的であることを実証している。
造血前駆細胞のNK細胞への分化−NK細胞を癌治療に使用した。NK細胞は、GvHD(移植片対宿主病)又は他の同種免疫反応を引き起こさず、同種細胞療法の可能性のある普遍的起源を提供する(Mehta and Rezvani, 2018)。利点を考慮して、種々の癌を治癒するためにキメラ抗原受容体(CAR)操作されたNK細胞が広く研究されてきた。

ヒト多能性幹細胞からNK細胞を生成するための以前のプロトコルは、フィーダー細胞との共培養を必要とした。Kaufmanのグループは、フィーダー細胞を除去したが、分化プロトコルにはまだウシ血清が必要とされた(Knorr et al., 2013)。さらに、NK細胞分化を果たすためにはCD34⁺CD45⁺細胞を選別する必要がある(Knorr et al., 2013)。ここで、我々は、血清を除去し、分化中のCD34⁺CD45⁺細胞の精製ステップを回避することを目標とした。10日目の細胞(接着細胞及び浮遊細胞を含む)をE6BIT培地中にさらに3日間培養した(図6A)。次に浮遊細胞を新しいプレートに移し、NK培地中で2〜3週間培養し(図6A)、3つのES/iPS細胞株にわたって67〜96%のCD56⁺CD3^-NK細胞を得た(図6B)。我々は次に腫瘍細胞に対するH1由来NK細胞媒介細胞溶解活性を調べた。結果は、K562(白血病細胞株)及びU937(リンパ腫患者由来単球)細胞の75%がhESC-NK細胞によって死滅することを実証した(図6C)。

造血前駆細胞のT細胞への分化−免疫療法のためにES/iPS細胞からT細胞を生成することは、血液癌及び非血液癌の有望な新しい治療である。現在は、フィーダー細胞を用いてヒト多能性幹細胞のT細胞への分化を誘導しているが、これは臨床用途に適さない。ここで、我々は、T細胞分化に適した無フィーダーかつ無血清のプロトコルを作成した。浮遊細胞を10日目から採取し、T培地中でさらに30日間培養した(図7A)。フローサイトメトリー分析は、細胞の30〜50%がCD3、CD4、及びCD8を発現することを明らかにし、T細胞の形成を示唆している(図7B)。これらのT細胞は、T細胞受容体γ/δ(TCRγ/δ)をも発現した(図7B)。H1及びH9 ES細胞並びにPBMC-3-1 iPS細胞を含めた3つの異なる細胞株についてプロトコルを行なった(図7B)。
TCRγδT細胞は、同種細胞療法への興味をますます高めている(Handgretinger and Schilbach, 2018; Wu et al., 2017)。TCRαβT細胞は、ヒトに多量にあるため(全てのT細胞の約95%を占める)、癌の免疫療法のために主として使用されている。しかしながら、TCRαβT細胞は、同種療法に適用されるとMHC(主要組織適合性複合体)依存様式で外来性病原特異性リガンド又は内在性ストレス誘発リガンドを認識し、この結果としてGvHDを引き起こすであろう。対照的に、γδT細胞は同種反応性でなく、GvHDを引き起こさない。従って、我々のプロトコルは、大規模同種(「棚から取り出してすぐに使える(off-the shelf)」)免疫療法の可能性のある細胞源を提供する。

造血前駆細胞のIn vivo生着−造血幹／前駆細胞の生成は、血液障害を治療するための有望な手段であるが、この目標は困難なままである。2つの最近の研究はトランスジェニック法を利用して、免疫力が低下したマウスに移植可能な造血細胞を生成した(Lis et al., 2017; Sugimura et al., 2017)。しかしながら、トランスジェニック法は、大規模臨床用途に合わせてスケールアップすることができない。ここで、我々は、1つのトリプルフラスコから10日で4×10⁸造血前駆細胞を生成することができた(図1F)。10日目の造血前駆細胞をNBSGWマウスに静脈内注射した。注射8週間後に末梢血中にヒトCD45⁺細胞が検出された(図8A)。9匹のマウスのうち3匹が1%超のヒトCD45⁺細胞の生着を示した(図8B)。移植の成功に性別が役割を果たすことがあるので、我々は、H1(雄性)及びH9(雌性)ES細胞由来の造血前駆細胞を比較した。結果は、H1由来造血前駆細胞に比べてH9由来造血前駆細胞はずっと高い生着効率を有することを実証した(図8C)。初期段階、例えば6日目に収穫及び凍結保存した細胞を用いると、平均生着効率が6%から10%に改善された(図8C)。我々が知る限りでは、これは、今日までに報告されたES/iPS細胞由来造血前駆細胞の最良生着効率である。
培地成分−この例で用いた培地の成分及び組成の概要を下表に示す。

表2−培地成分

表3−E6G及びE6M培地成分

表4−T培地

表5−E6BIT培地

表6−NK培地

参考文献

Claims (44)

1. 造血前駆細胞を得るための方法であって、
   線維芽細胞増殖因子(FGF)及び血管内皮増殖因子(VEGF)を含む第1の化学的に定義された培養培地に低密度で播種された中胚葉細胞を培養し、それによって血管芽細胞を含む細胞集団を得る工程；及び
   (a)インスリン、FGF、VEGF、及びNotchアゴニスト、又は(b)幹細胞因子(SCF)、IL-3、及びトロンボポエチン(TPO)のどちらかを含む第2の化学的に定義された培養培地中で前記血管芽細胞を培養し、それによって造血前駆細胞を含む細胞集団を得る工程
   を含む、前記方法。
2. 前記中胚葉細胞が、約6×10³細胞/cm²〜約6×10⁴細胞/cm²の密度で播種される、請求項1に記載の方法。
3. 前記造血前駆細胞が、CD34+CD45+造血前駆細胞である、請求項1又は2に記載の方法。
4. 前記中胚葉細胞が、ブラキュリ(T)、EMOS、FOXA2、MIXL1、MSX1、及びMSX2からなる群より選択される1種以上の中胚葉マーカーを発現する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
5. 前記第2の化学的に定義された培養培地が、FGF、VEGF、及びNotchアゴニストを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
6. 前記Notchアゴニストが、レスベラトロール(3,4',5-トリヒドロキシスチルベン)、バルプロ酸、及びスベロイルビスヒドロキサム酸からなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
7. 前記第2の化学的に定義された培養培地が、SCF、IL-3、及びTPOを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
8. 前記第1の化学的に定義された培養培地が、Notchアゴニスト、TGFβインヒビター、又はイノシトールモノホスファターゼのインヒビターをさらに含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
9. 前記TGFβインヒビターが、SB431542である、請求項8に記載の方法。
10. 前記イノシトールモノホスファターゼのインヒビターが、L-690,330である、請求項8又は9に記載の方法。
11. 骨形成タンパク質4(BMP4)、アクチビンA、及びWnt/βカテニンシグナル伝達のアクチベーターを含む無血清のアルブミン非含有の化学的に定義された細胞培養培地中で約2日間にわたってヒト多能性幹細胞を培養して、中胚葉細胞を含む細胞集団を得る工程によって、前記中胚葉細胞が得られる、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
12. 前記ヒト多能性幹細胞が、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞からなる群より選択される、請求項11に記載の方法。
13. 前記多能性幹細胞が、約6×10³細胞/cm²〜約6×10⁴細胞/cm²の密度で播種される、請求項11又は12に記載の方法。
14. 前記Wnt/βカテニンシグナル伝達のアクチベーターが、Gsk3インヒビターである、請求項11〜13のいずれか1項に記載の方法。
15. 前記Gsk3インヒビターが、CHIR99021、CHIR98014、BIO-アセトキシム、BIO,LiCl、SB216763、SB415286、AR A014418、1-アザケンパウロン、及びビス-7-インドリルマレイミドからなる群より選択される、請求項14に記載の方法。
16. 前記中胚葉細胞を約4日間培養し、前記血管芽細胞を約4日間培養して、造血前駆細胞を含む細胞集団を生成する、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
17. 請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法に従って得られた造血前駆細胞の実質的に純粋な単離された集団。
18. 少なくともの90%の造血前駆細胞を含む、請求項15に記載の単離された集団。
19. 少なくともの99%の造血前駆細胞を含む、請求項15に記載の単離された集団。
20. 患者における血液疾患の治療方法であって、治療量の請求項17に記載の造血前駆細胞集団を前記患者に投与する工程を含む、前記方法。
21. 前記疾患が、貧血症、サラセミア、赤血球増加症、尿毒症、骨髄線維症、骨髄腫、脊髄形成異常症、白血病、リンパ腫、骨髄異形成症候群、 異常ヘモグロビン症、好中球減少症、血小板減少症、フォン・ヴィルブランド病、血友病、原発性血小板血症、後天性血小板機能障害、形質細胞障害、及び固形腫瘍からなる群より選択される、請求項20に記載の方法。
22. 前記造血前駆細胞が、製剤で投与され、前記製剤が、静脈内デリバリー用の形態である、請求項20又は21に記載の方法。
23. マクロファージを得るための無フィーダー無血清方法であって、
    (i)請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法によって生成された造血前駆細胞を、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を含む培地中で約3日間培養する工程；及び
    (ii)(i)の培養された前記細胞を、インターロイキン1β(IL-1B)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、及び血清又は血清代替物を含む培地中で培養し、それによってマクロファージを含む細胞集団を得る工程
    を含む、前記方法。
24. 前記細胞集団が、少なくとも80%のCD11b⁺CD14⁺マクロファージを含む、請求項23に記載の方法。
25. ナチュラルキラー(NK)細胞を得るための無フィーダー無血清方法であって、
    請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法によって生成された細胞集団を、ウシ血清アルブミン、インスリン、及びトランスフェリンを含む培地中で約3日間培養して、接着細胞及び浮遊細胞を含む細胞集団を生成する工程；及び
    前記浮遊細胞を、インターロイキン7(IL-7)、インターロイキン15(IL-15)、幹細胞因子(SCF)、及びFlt3リガンド(FLT3-L)を含む培地中で培養し、それによってNK細胞を含む細胞集団を生成する工程
    を含む、前記方法。
26. 前記細胞集団が、少なくとも60%のCD56⁺CD3^-NK細胞を含む、請求項25に記載の方法。
27. T細胞を得るための無フィーダー無血清方法であって、
    請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法によって生成された造血前駆細胞を、インターロイキン7(IL-7)、Flt3リガンド(FLT3-L)、幹細胞因子(SCF)、及びRESVを含む培地中で培養して、T細胞を含む細胞集団を生成する工程
    を含む、前記方法。
28. 前記細胞集団が、少なくとも約90%のCD3⁺CD4⁺CD8⁺T細胞を含む、請求項27に記載の方法。
29. 造血前駆細胞を得るための方法であって、
    骨形成タンパク質4(BMP4)、線維芽細胞増殖因子(FGF)及び血管内皮増殖因子(VEGF)を含む第1の化学的に定義された培養培地に高密度で播種された中胚葉細胞を培養し、それによって血管芽細胞を含む細胞集団を得る工程；及び
    前記血管芽細胞を、(a)インスリン、FGF、VEGF、及びNotchアゴニスト、又は(b)幹細胞因子(SCF)、IL-3、及びトロンボポエチン(TPO)のどちらかを含む第2の化学的に定義された培養培地中で培養し、それによって造血前駆細胞を含む細胞集団を得る工程
    を含む、前記方法。
30. 前記中胚葉細胞が、約6×10⁴細胞/cm²〜約3×10⁵細胞/cm²の密度で播種される、請求項29に記載の方法。
31. 前記造血前駆細胞が、CD34+CD45+造血前駆細胞である、請求項29又は30に記載の方法。
32. 前記中胚葉細胞が、ブラキュリ(T)、EMOS、FOXA2、MIXL1、MSX1、及びMSX2からなる群より選択される1種以上の中胚葉マーカーを発現する、請求項29〜31のいずれか1項に記載の方法。
33. 前記第1の化学的に定義された培養培地が、BMP4、VEGF、FGF2、Notchアゴニスト、TGFβインヒビター、及びイノシトールモノホスファターゼのインヒビターを含む、請求項29〜32のいずれか1項に記載の方法。
34. 前記Notchアゴニストが、レスベラトロール(3,4',5-トリヒドロキシスチルベン)、バルプロ酸、及びスベロイルビスヒドロキサム酸からなる群より選択される、請求項33に記載の方法。
35. 前記TGFβインヒビターが、SB431542であり、かつ前記イノシトールモノホスファターゼのインヒビターが、L-690,330である、請求項33又は34に記載の方法。
36. 化学的に定義された細胞培養培地であって、
    線維芽細胞増殖因子(FGF)；
    血管内皮増殖因子(VEGF)；
    Notchアゴニスト；
    TGFβインヒビター；及び
    イノシトールモノホスファターゼのインヒビター
    を含む、前記細胞培養培地。
37. 前記FGFが、FGF2である、請求項36に記載の細胞培養培地。
38. 前記VEGFが、VEGF-A及びVEGF-165からなる群より選択される、請求項36〜37のいずれか1項に記載の細胞培養培地。
39. 前記Notchアゴニストが、レスベラトロール(3,4',5-トリヒドロキシスチルベン)、バルプロ酸、及びスベロイルビスヒドロキサム酸からなる群より選択される、請求項36〜38のいずれか1項に記載の細胞培養培地。
40. 前記TGFβインヒビターが、SB431542、SB525334、A83-01、LY2157299、LY210976、GW788388、RepSox、SB-505124、D4476、GW788388、SD208、及びEW-7197からなる群より選択される、請求項36〜39のいずれか1項に記載の細胞培養培地。
41. 前記TGFβインヒビターが、SB431542である、請求項26〜40のいずれか1項に記載の細胞培養培地。
42. 前記イノシトールモノホスファターゼのインヒビターが、ビホスホナートL-690,330([1-(4-ヒドロキシフェノキシ)エチリデン]ビスホスホン酸)、リチウム、ホスホイノシチド3-キナーゼ(PI3K)インヒビターLy294002、ピクチリシブ、HS-173、GSK2636771、デュベリシブ 、TG100-115、GSK1059615、PF-04691502、PIK-93、BGT226、AZD6482,SAR245409、BYL719、CUDC-907、IC-87114、TG100713、ゲダトリシブ、CH5132799、PKI-402、BAY 80-6946、XL147、PIK-90、PIK-293、PIK-294、ケルセチン、ウォルトマニン、ZSTK474、AS-252424、AS-604850、及びアピトリシブからなる群より選択される、請求項26〜41のいずれか1項に記載の細胞培養培地。
43. 前記イノシトールモノホスファターゼのインヒビターが、L-690,330である、請求項26〜42のいずれか1項に記載の細胞培養培地。
44. 前記培養培地が、DMEM/F12培養培地、L-アスコルビン酸-2-リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、NaHCO₃、及びトランスフェリンをさらに含む、請求項26〜43のいずれか1項に記載の細胞培養培地。

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