JPWO2020051453A5

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Publication number: JPWO2020051453A5
Application number: JP2021512433A
Authority: JP
Publication date: 2022-09-14

Description

参考文献

本発明の好ましい態様は、下記の通りである。
〔１〕造血前駆細胞を得るための方法であって、
線維芽細胞増殖因子(FGF)及び血管内皮増殖因子(VEGF)を含む第1の化学的に定義された培養培地に低密度で播種された中胚葉細胞を培養し、それによって血管芽細胞を含む細胞集団を得る工程；及び
(a)インスリン、FGF、VEGF、及びNotchアゴニスト、又は(b)幹細胞因子(SCF)、IL-3、及びトロンボポエチン(TPO)のどちらかを含む第2の化学的に定義された培養培地中で前記血管芽細胞を培養し、それによって造血前駆細胞を含む細胞集団を得る工程
を含む、前記方法。
〔２〕前記中胚葉細胞が、約6×10 ³ 細胞/cm ² ～約6×10 ⁴ 細胞/cm ² の密度で播種される、前記〔1〕に記載の方法。
〔３〕前記造血前駆細胞が、CD34+CD45+造血前駆細胞である、前記〔1〕又は〔2〕に記載の方法。
〔４〕前記中胚葉細胞が、ブラキュリ(T)、EMOS、FOXA2、MIXL1、MSX1、及びMSX2からなる群より選択される1種以上の中胚葉マーカーを発現する、前記〔1〕～〔3〕のいずれか1項に記載の方法。
〔５〕前記第2の化学的に定義された培養培地が、FGF、VEGF、及びNotchアゴニストを含む、前記〔1〕～〔4〕のいずれか1項に記載の方法。
〔６〕前記Notchアゴニストが、レスベラトロール(3,4',5-トリヒドロキシスチルベン)、バルプロ酸、及びスベロイルビスヒドロキサム酸からなる群より選択される、前記〔5〕に記載の方法。
〔７〕前記第2の化学的に定義された培養培地が、SCF、IL-3、及びTPOを含む、前記〔1〕～〔4〕のいずれか1項に記載の方法。
〔８〕前記第1の化学的に定義された培養培地が、Notchアゴニスト、TGFβインヒビター、又はイノシトールモノホスファターゼのインヒビターをさらに含む、前記〔1〕～〔7〕のいずれか1項に記載の方法。
〔９〕前記TGFβインヒビターが、SB431542である、前記〔8〕に記載の方法。
〔１０〕前記イノシトールモノホスファターゼのインヒビターが、L-690,330である、前記〔8〕又は〔9〕に記載の方法。
〔１１〕骨形成タンパク質4(BMP4)、アクチビンA、及びWnt/βカテニンシグナル伝達のアクチベーターを含む無血清のアルブミン非含有の化学的に定義された細胞培養培地中で約2日間にわたってヒト多能性幹細胞を培養して、中胚葉細胞を含む細胞集団を得る工程によって、前記中胚葉細胞が得られる、前記〔1〕～〔10〕のいずれか1項に記載の方法。
〔１２〕前記ヒト多能性幹細胞が、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞からなる群より選択される、前記〔11〕に記載の方法。
〔１３〕前記多能性幹細胞が、約6×10 ³ 細胞/cm ² ～約6×10 ⁴ 細胞/cm ² の密度で播種される、前記〔11〕又は〔12〕に記載の方法。
〔１４〕前記Wnt/βカテニンシグナル伝達のアクチベーターが、Gsk3インヒビターである、前記〔11〕～〔13〕のいずれか1項に記載の方法。
〔１５〕前記Gsk3インヒビターが、CHIR99021、CHIR98014、BIO-アセトキシム、BIO,LiCl、SB216763、SB415286、AR A014418、1-アザケンパウロン、及びビス-7-インドリルマレイミドからなる群より選択される、前記〔14〕に記載の方法。
〔１６〕前記中胚葉細胞を約4日間培養し、前記血管芽細胞を約4日間培養して、造血前駆細胞を含む細胞集団を生成する、前記〔1〕～〔15〕のいずれか1項に記載の方法。
〔１７〕前記〔1〕～〔16〕のいずれか1項に記載の方法に従って得られた造血前駆細胞の実質的に純粋な単離された集団。
〔１８〕少なくともの90%の造血前駆細胞を含む、前記〔15〕に記載の単離された集団。
〔１９〕少なくともの99%の造血前駆細胞を含む、前記〔15〕に記載の単離された集団。
〔２０〕患者における血液疾患の治療方法であって、治療量の前記〔17〕に記載の造血前駆細胞集団を前記患者に投与する工程を含む、前記方法。
〔２１〕前記疾患が、貧血症、サラセミア、赤血球増加症、尿毒症、骨髄線維症、骨髄腫、脊髄形成異常症、白血病、リンパ腫、骨髄異形成症候群、異常ヘモグロビン症、好中球減少症、血小板減少症、フォン・ヴィルブランド病、血友病、原発性血小板血症、後天性血小板機能障害、形質細胞障害、及び固形腫瘍からなる群より選択される、前記〔20〕に記載の方法。
〔２２〕前記造血前駆細胞が、製剤で投与され、前記製剤が、静脈内デリバリー用の形態である、前記〔20〕又は〔21〕に記載の方法。
〔２３〕マクロファージを得るための無フィーダー無血清方法であって、
(i)前記〔1〕～〔16〕のいずれか1項に記載の方法によって生成された造血前駆細胞を、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を含む培地中で約3日間培養する工程；及び
(ii)(i)の培養された前記細胞を、インターロイキン1β(IL-1B)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、及び血清又は血清代替物を含む培地中で培養し、それによってマクロファージを含む細胞集団を得る工程
を含む、前記方法。
〔２４〕前記細胞集団が、少なくとも80%のCD11b ⁺ CD14 ⁺ マクロファージを含む、前記〔23〕に記載の方法。
〔２５〕ナチュラルキラー(NK)細胞を得るための無フィーダー無血清方法であって、
前記〔1〕～〔16〕のいずれか1項に記載の方法によって生成された細胞集団を、ウシ血清アルブミン、インスリン、及びトランスフェリンを含む培地中で約3日間培養して、接着細胞及び浮遊細胞を含む細胞集団を生成する工程；及び
前記浮遊細胞を、インターロイキン7(IL-7)、インターロイキン15(IL-15)、幹細胞因子(SCF)、及びFlt3リガンド(FLT3-L)を含む培地中で培養し、それによってNK細胞を含む細胞集団を生成する工程
を含む、前記方法。
〔２６〕前記細胞集団が、少なくとも60%のCD56 ⁺ CD3 ^- NK細胞を含む、前記〔25〕に記載の方法。
〔２７〕T細胞を得るための無フィーダー無血清方法であって、
前記〔1〕～〔16〕のいずれか1項に記載の方法によって生成された造血前駆細胞を、インターロイキン7(IL-7)、Flt3リガンド(FLT3-L)、幹細胞因子(SCF)、及びRESVを含む培地中で培養して、T細胞を含む細胞集団を生成する工程
を含む、前記方法。
〔２８〕前記細胞集団が、少なくとも約90%のCD3 ⁺ CD4 ⁺ CD8 ⁺ T細胞を含む、前記〔27〕に記載の方法。
〔２９〕造血前駆細胞を得るための方法であって、
骨形成タンパク質4(BMP4)、線維芽細胞増殖因子(FGF)及び血管内皮増殖因子(VEGF)を含む第1の化学的に定義された培養培地に高密度で播種された中胚葉細胞を培養し、それによって血管芽細胞を含む細胞集団を得る工程；及び
前記血管芽細胞を、(a)インスリン、FGF、VEGF、及びNotchアゴニスト、又は(b)幹細胞因子(SCF)、IL-3、及びトロンボポエチン(TPO)のどちらかを含む第2の化学的に定義された培養培地中で培養し、それによって造血前駆細胞を含む細胞集団を得る工程
を含む、前記方法。
〔３０〕前記中胚葉細胞が、約6×10 ⁴ 細胞/cm ² ～約3×10 ⁵ 細胞/cm ² の密度で播種される、前記〔29〕に記載の方法。
〔３１〕前記造血前駆細胞が、CD34+CD45+造血前駆細胞である、前記〔29〕又は〔30〕に記載の方法。
〔３２〕前記中胚葉細胞が、ブラキュリ(T)、EMOS、FOXA2、MIXL1、MSX1、及びMSX2からなる群より選択される1種以上の中胚葉マーカーを発現する、前記〔29〕～〔31〕のいずれか1項に記載の方法。
〔３３〕前記第1の化学的に定義された培養培地が、BMP4、VEGF、FGF2、Notchアゴニスト、TGFβインヒビター、及びイノシトールモノホスファターゼのインヒビターを含む、前記〔29〕～〔32〕のいずれか1項に記載の方法。
〔３４〕前記Notchアゴニストが、レスベラトロール(3,4',5-トリヒドロキシスチルベン)、バルプロ酸、及びスベロイルビスヒドロキサム酸からなる群より選択される、前記〔33〕に記載の方法。
〔３５〕前記TGFβインヒビターが、SB431542であり、かつ前記イノシトールモノホスファターゼのインヒビターが、L-690,330である、前記〔33〕又は〔34〕に記載の方法。
〔３６〕化学的に定義された細胞培養培地であって、
線維芽細胞増殖因子(FGF)；
血管内皮増殖因子(VEGF)；
Notchアゴニスト；
TGFβインヒビター；及び
イノシトールモノホスファターゼのインヒビター
を含む、前記細胞培養培地。
〔３７〕前記FGFが、FGF2である、前記〔36〕に記載の細胞培養培地。
〔３８〕前記VEGFが、VEGF-A及びVEGF-165からなる群より選択される、前記〔36〕～〔37〕のいずれか1項に記載の細胞培養培地。
〔３９〕前記Notchアゴニストが、レスベラトロール(3,4',5-トリヒドロキシスチルベン)、バルプロ酸、及びスベロイルビスヒドロキサム酸からなる群より選択される、前記〔36〕～〔38〕のいずれか1項に記載の細胞培養培地。
〔４０〕前記TGFβインヒビターが、SB431542、SB525334、A83-01、LY2157299、LY210976、GW788388、RepSox、SB-505124、D4476、GW788388、SD208、及びEW-7197からなる群より選択される、前記〔36〕～〔39〕のいずれか1項に記載の細胞培養培地。
〔４１〕前記TGFβインヒビターが、SB431542である、前記〔26〕～〔40〕のいずれか1項に記載の細胞培養培地。
〔４２〕前記イノシトールモノホスファターゼのインヒビターが、ビホスホナートL-690,330([1-(4-ヒドロキシフェノキシ)エチリデン]ビスホスホン酸)、リチウム、ホスホイノシチド3-キナーゼ(PI3K)インヒビターLy294002、ピクチリシブ、HS-173、GSK2636771、デュベリシブ、TG100-115、GSK1059615、PF-04691502、PIK-93、BGT226、AZD6482,SAR245409、BYL719、CUDC-907、IC-87114、TG100713、ゲダトリシブ、CH5132799、PKI-402、BAY 80-6946、XL147、PIK-90、PIK-293、PIK-294、ケルセチン、ウォルトマニン、ZSTK474、AS-252424、AS-604850、及びアピトリシブからなる群より選択される、前記〔26〕～〔41〕のいずれか1項に記載の細胞培養培地。
〔４３〕前記イノシトールモノホスファターゼのインヒビターが、L-690,330である、前記〔26〕～〔42〕のいずれか1項に記載の細胞培養培地。
〔４４〕前記培養培地が、DMEM/F12培養培地、L-アスコルビン酸-2-リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、NaHCO ₃ 、及びトランスフェリンをさらに含む、前記〔26〕～〔43〕のいずれか1項に記載の細胞培養培地。

Claims

造血前駆細胞を得るための方法であって、
線維芽細胞増殖因子(FGF)及び血管内皮増殖因子(VEGF)を含む第1の化学的に定義された培養培地に低密度で播種された中胚葉細胞を培養し、それによって血管芽細胞を含む細胞集団を得る工程；及び
(a)インスリン、FGF、VEGF、及びNotchアゴニスト、又は(b)幹細胞因子(SCF)、IL-3、及びトロンボポエチン(TPO)のどちらかを含む第2の化学的に定義された培養培地中で前記血管芽細胞を培養し、それによって造血前駆細胞を含む細胞集団を得る工程
を含む、前記方法。
前記中胚葉細胞が、約6×10³細胞/cm²～約6×10⁴細胞/cm²の密度で播種される、請求項1に記載の方法。
前記造血前駆細胞が、CD34+CD45+造血前駆細胞である、請求項1又は2に記載の方法。
前記中胚葉細胞が、ブラキュリ(T)、EMOS、FOXA2、MIXL1、MSX1、及びMSX2からなる群より選択される1種以上の中胚葉マーカーを発現する、請求項1～3のいずれか1項に記載の方法。
前記第2の化学的に定義された培養培地が、FGF、VEGF、及びNotchアゴニストを含み、好ましくは、前記Notchアゴニストが、レスベラトロール(3,4',5-トリヒドロキシスチルベン)、バルプロ酸、及びスベロイルビスヒドロキサム酸からなる群より選択される、請求項1～4のいずれか1項に記載の方法。
前記第2の化学的に定義された培養培地が、SCF、IL-3、及びTPOを含む、請求項1～4のいずれか1項に記載の方法。
前記第1の化学的に定義された培養培地が、Notchアゴニスト、TGFβインヒビター、又はイノシトールモノホスファターゼのインヒビターをさらに含み、好ましくは、前記TGFβインヒビターが、SB431542であり、好ましくは、前記イノシトールモノホスファターゼのインヒビターが、L-690,330である、請求項1～6のいずれか1項に記載の方法。
骨形成タンパク質4(BMP4)、アクチビンA、及びWnt/βカテニンシグナル伝達のアクチベーターを含む無血清のアルブミン非含有の化学的に定義された細胞培養培地中で約2日間にわたってヒト多能性幹細胞を培養して、中胚葉細胞を含む細胞集団を得る工程によって、前記中胚葉細胞が得られ、好ましくは、前記ヒト多能性幹細胞が、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞からなる群より選択され、好ましくは、前記多能性幹細胞が、約6×10 ³ 細胞/cm ² ～約6×10 ⁴ 細胞/cm ² の密度で播種され、好ましくは、前記Wnt/βカテニンシグナル伝達のアクチベーターが、Gsk3インヒビターであり、好ましくは、前記Gsk3インヒビターが、CHIR99021、CHIR98014、BIO-アセトキシム、BIO,LiCl、SB216763、SB415286、AR A014418、1-アザケンパウロン、及びビス-7-インドリルマレイミドからなる群より選択される、請求項1～7のいずれか1項に記載の方法。
前記中胚葉細胞を約4日間培養し、前記血管芽細胞を約4日間培養して、造血前駆細胞を含む細胞集団を生成する、請求項1～8のいずれか1項に記載の方法。
請求項1～9のいずれか1項に記載の方法に従って得られた造血前駆細胞の実質的に純粋な単離された集団。
少なくともの90%の造血前駆細胞、好ましくは少なくともの99%の造血前駆細胞を含む、請求項10に記載の単離された集団。
マクロファージを得るための無フィーダー無血清方法であって、
(i)請求項1～9のいずれか1項に記載の方法によって生成された造血前駆細胞を、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を含む培地中で約3日間培養する工程；及び
(ii)(i)の培養された前記細胞を、インターロイキン1β(IL-1B)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、及び血清又は血清代替物を含む培地中で培養し、それによってマクロファージを含む細胞集団を得る工程
を含む、前記方法。
前記細胞集団が、少なくとも80%のCD11b⁺CD14⁺マクロファージを含む、請求項12に記載の方法。
ナチュラルキラー(NK)細胞を得るための無フィーダー無血清方法であって、
請求項1～9のいずれか1項に記載の方法によって生成された細胞集団を、ウシ血清アルブミン、インスリン、及びトランスフェリンを含む培地中で約3日間培養して、接着細胞及び浮遊細胞を含む細胞集団を生成する工程；及び
前記浮遊細胞を、インターロイキン7(IL-7)、インターロイキン15(IL-15)、幹細胞因子(SCF)、及びFlt3リガンド(FLT3-L)を含む培地中で培養し、それによってNK細胞を含む細胞集団を生成する工程
を含む、前記方法。
前記細胞集団が、少なくとも60%のCD56⁺CD3^-NK細胞を含む、請求項14に記載の方法。
T細胞を得るための無フィーダー無血清方法であって、
請求項1～9のいずれか1項に記載の方法によって生成された造血前駆細胞を、インターロイキン7(IL-7)、Flt3リガンド(FLT3-L)、幹細胞因子(SCF)、及びRESVを含む培地中で培養して、T細胞を含む細胞集団を生成する工程
を含む、前記方法。
前記細胞集団が、少なくとも約90%のCD3⁺CD4⁺CD8⁺T細胞を含む、請求項16に記載の方法。
造血前駆細胞を得るための方法であって、
骨形成タンパク質4(BMP4)、線維芽細胞増殖因子(FGF)及び血管内皮増殖因子(VEGF)を含む第1の化学的に定義された培養培地に高密度で播種された中胚葉細胞を培養し、それによって血管芽細胞を含む細胞集団を得る工程；及び
前記血管芽細胞を、(a)インスリン、FGF、VEGF、及びNotchアゴニスト、又は(b)幹細胞因子(SCF)、IL-3、及びトロンボポエチン(TPO)のどちらかを含む第2の化学的に定義された培養培地中で培養し、それによって造血前駆細胞を含む細胞集団を得る工程
を含む、前記方法。
前記中胚葉細胞が、約6×10⁴細胞/cm²～約3×10⁵細胞/cm²の密度で播種される、請求項18に記載の方法。
前記造血前駆細胞が、CD34+CD45+造血前駆細胞である、請求項18又は19に記載の方法。
前記中胚葉細胞が、ブラキュリ(T)、EMOS、FOXA2、MIXL1、MSX1、及びMSX2からなる群より選択される1種以上の中胚葉マーカーを発現する、請求項18～20のいずれか1項に記載の方法。
前記第1の化学的に定義された培養培地が、BMP4、VEGF、FGF2、Notchアゴニスト、TGFβインヒビター、及びイノシトールモノホスファターゼのインヒビターを含み、好ましくは、前記Notchアゴニストが、レスベラトロール(3,4',5-トリヒドロキシスチルベン)、バルプロ酸、及びスベロイルビスヒドロキサム酸からなる群より選択され、好ましくは、前記TGFβインヒビターが、SB431542であり、かつ前記イノシトールモノホスファターゼのインヒビターが、L-690,330である、請求項18～21のいずれか1項に記載の方法。
化学的に定義された細胞培養培地であって、
線維芽細胞増殖因子(FGF)；
血管内皮増殖因子(VEGF)；
Notchアゴニスト；
TGFβインヒビター；及び
イノシトールモノホスファターゼのインヒビター
を含む、前記細胞培養培地。
前記FGFが、FGF2である、請求項23に記載の細胞培養培地。
前記VEGFが、VEGF-A及びVEGF-165からなる群より選択される、請求項23～24のいずれか1項に記載の細胞培養培地。
前記Notchアゴニストが、レスベラトロール(3,4',5-トリヒドロキシスチルベン)、バルプロ酸、及びスベロイルビスヒドロキサム酸からなる群より選択される、請求項23～25のいずれか1項に記載の細胞培養培地。
前記TGFβインヒビターが、SB431542、SB525334、A83-01、LY2157299、LY210976、GW788388、RepSox、SB-505124、D4476、GW788388、SD208、及びEW-7197からなる群より選択され、好ましくは、前記TGFβインヒビターが、SB431542である、請求項23～26のいずれか1項に記載の細胞培養培地。
前記イノシトールモノホスファターゼのインヒビターが、ビホスホナートL-690,330([1-(4-ヒドロキシフェノキシ)エチリデン]ビスホスホン酸)、リチウム、ホスホイノシチド3-キナーゼ(PI3K)インヒビターLy294002、ピクチリシブ、HS-173、GSK2636771、デュベリシブ、TG100-115、GSK1059615、PF-04691502、PIK-93、BGT226、AZD6482、SAR245409、BYL719、CUDC-907、IC-87114、TG100713、ゲダトリシブ、CH5132799、PKI-402、BAY 80-6946、XL147、PIK-90、PIK-293、PIK-294、ケルセチン、ウォルトマニン、ZSTK474、AS-252424、AS-604850、及びアピトリシブからなる群より選択され、好ましくは、前記イノシトールモノホスファターゼのインヒビターが、L-690,330である、請求項23～27のいずれか1項に記載の細胞培養培地。
前記培養培地が、DMEM/F12培養培地、L-アスコルビン酸-2-リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、NaHCO₃、及びトランスフェリンをさらに含む、請求項23～28のいずれか1項に記載の細胞培養培地。