KR20210044231A - Cd3 양성 세포의 제조 방법 - Google Patents

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KR20210044231A
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agonist
ser
medium
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신 카네코
요헤이 카와이
스구르 아리마
마이코 타키구치
카즈히데 나카야마
요시아키 카사이
아키라 하야시
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고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠
다케다 야쿠힝 고교 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 분화된 T 세포를 안정하게 공급할 수 있게 하기 위해서, T 세포 마커로서 작용하는 CD3가 세포막상에서 발현된 CD3-양성 세포의 제조 또는 확대 배양 방법; 및 CD3-양성 세포의 확대 배양 키트를 제공한다.

Description

CD3 양성 세포의 제조 방법
본 발명은 CD3/TCR 복합체 작용물질(complex agonist), 피브로넥틴 또는 그의 변이체(variant), 및 CD3 작용물질의 존재하에서 CD3 양성 세포를 배양하는 단계를 포함하는, CD3-양성 세포(또는 CD3-양성 CD197-양성 세포)의 제조 방법 또는 확대 배양 방법, 및 CD3-양성 세포의 확대 배양을 위한 키트(kit)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 CD3-양성 세포 중의 CD30 신호를 자극하는 단계를 포함하는, CD3-양성 세포를 CD3-양성 CD197-양성 세포로서 유지하는 방법, 및 CD3-양성 세포를 CD3-양성 CD197-양성 세포로서 유지하기 위한 키트에 관한 것이다.
면역요법은 통상적인 치료가 유효하지 않은 암에 대해서조차 강한 생명-연장 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌으며, 암 치료에 선도 요법이 되고 있다. 항-CD19 키메라 항원 수용체(CAR) 유전자로 형질감염된 자기유래 T 세포의 전달을 포함하는 CART 요법은 B 세포암에 대해 높은 완전 관해율(high complete remission rate)을 보이며, FDA는 2017년에 B-세포 급성 림프모구성 백혈병 및 미만성 큰 B-세포 림프종에 대해 2개의 CART 요법을 승인하였다. 또한, 다수의 임상 시험이, 암세포 항원을 인식하는 T 세포 수용체(TCR) 유전자를 도입하는 TCR-T 세포 요법을 진행하고 있다. 환자 자신(자기)의 T 세포를 사용하는 이러한 유전자-변형된 T 세포 요법은 대단히 우수한 임상 결과를 보이지만, T 세포의 수송, 유전자 변형, 세포 배양 등을 수반한다. 수주일 이상을 요하는 이와 같은 복잡한 공정은 비용 절감 및 품질 관리를 어렵게 한다. 더욱이, 상기 요법은 빠르게 성장하는 암을 갖는 환자의 치료 기회의 상실을 초래하기 때문에, 동종이계 T 세포 요법 기성제품의 개발이 강력히 요구된다. 환자로부터 채취된 T 세포의 확대 배양을 위한 방법으로서, 지금까지, T 세포 집단을 항-CD3 작용물질 항체 및 항-CD30 작용물질 항체와 접촉시킴으로써 CD8-양성 Tc1 림프구 또는 CD8-양성 Tc2 림프구를 생성시키는 방법(특허문헌 1), T 세포 집단을 암 환자로부터 수득하고 상기 T 세포 집단을 항-CD3 작용물질 항체, 항-CD28 항체, 및 VEGF 억제제와 접촉시킴에 의한 종양-특이성 T 세포의 확대 배양 방법(특허문헌 2)이 지금까지 보고되었다. 그러나, 건강한 공여자 또는 환자로부터 유래된 T 세포는 제한된 증식 능력을 가지며, 단일 성분채집술(apheresis)에 의해 회수될 수 있는 T 세포로부터 생성될 수 있는 유전자 변형된 T 세포의 수가 제한된다. 또한, TCR 자극에 의한 T 세포의 확대 배양은 CCR7(CD197)(미경험 세포 및 기억 T 세포의 세포 표면 마커이다)의 발현의 일시적인 증가에 이어서 그 후 수일이내 소실을 야기함이 보고되었다(비-특허문서 1). 또한, 기억 T 세포의 존재("T 세포 지속")가 생체내 항종양 활성에 중요하며 투여되는 CART 세포(기억 T 세포)의 수의 증가에 의해 높은 생체내 항종양 효과가 관찰됨이 보고되었다(비-특허문헌 2). 따라서, T 세포의 확대 배양에 의해 수득된 세포 집단 중 낮은 CD197 발현은 암 치료에 적합하지 않았다.
다른 한편으로, 다능성 줄기세포, 예를 들어 iPS 세포, ES 세포 등으로부터 분화된 T 세포(분화된 T 세포)는 이론상 무한 증식될 수 있는 다능성 줄기세포로부터 제조되기 때문에, 변형된 T 세포는 이론적으로는 무한 생성될 수 있다. 그러나, 다능성을 유지하면서 iPS 세포를 확대 배양하는 방법은 높은 비용을 요하며 기술적 어려움을 수반한다.
따라서, 다수의 iPS 세포를 증식시킴으로써 분화된 T 세포, 특히 CD197-양성 T 세포를 수득하는 방법은 한계가 있다. 결과적으로, 다수의 T 세포, 특히 CD197-양성 T 세포를 수득하기 위한 또 다른 접근법이 요구되었다.
[문헌 목록]
[특허문헌]
특허문헌 1: WO 2003/038062
특허문헌 2: US-A-2014/0255368
[비-특허문헌]
비-특허문헌 1: Sallusto et al., Eur. J. Immunol. vol. 29, 2037-2045, 1999
비-특허문헌 2: Kaartinen et al., Cytotherapy vol. 19, 689-702, 2017
본 발명은 분화된 T 세포, 특히 CD197-양성 T 세포를 안정하게 공급하는 것을 목적으로 하며, T 세포 마커 CD3가 세포막상에 발현된 CD3-양성 세포의 확대 배양을 위한 제조 방법, 확대 배양 방법 및 키트를 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적은 CD197-양성 T 세포의 유지 방법 및 CD197-양성 T 세포의 유지를 위한 키트를 제공하는 것이다.
본 발명자는 상기 목적을 성취하기 위한 시도로 예의 연구를 수행하였으며 TCR 유전자로 형질감염된 iPS 세포로부터 수득된 CD8-양성 T 세포(iPS 세포-유래된 CD8-양성 T 세포)를, 항-CD3 작용물질 항체 및 레트로넥틴(RetroNectin)(등록상표)이 고정화된 배양 용기에서 항-CD30 작용물질 항체를 함유하는 배지 중에서 배양함으로써 효율적으로 증식시킬 수 있음을 발견하였다. 더욱 또한, 본 발명자는 T 세포의 증식 효율 및 항원-특이적인 세포독성 활성이, iPS 세포-유래된 CD8-양성 T 세포를 상기 배양 방법에 의해 반복해서 증식시키는 경우에조차 영향을 받지 않음을 확인하였다. 또한, 본 발명자는 iPS 세포-유래된 CD8-양성 T 세포를 항-CD30 작용물질 항체를 사용하여 배양하는 경우, CD197의 발현율이 항-CD30 작용물질 항체를 사용하지 않은 경우에 비해 높아지며 증식된 T 세포는 중심 기억 T 세포로서 존재함을 발견하였다. 더욱이 상기 iPS 세포-유래된 CD8-양성 T 세포와 유사하게, 항-CD19-CAR 유전자로 형질감염된 인간 말초혈액-유래된 CD8-양성 T 세포 및 iPS 세포-유래된 CD8-양성 T 세포(iPS 세포-유래된 항-CD19-CART 세포)를 또한, 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표)이 고정화된 배양 용기의 상기 배지에 항-CD30 작용물질 항체를 첨가함으로써 효율적으로 증식시킬 수 있었다. 더욱 또한, 본 발명자는 인간 말초혈액-유래된 CD8-양성 T 세포 또는 iPS 세포-유래된 항-CD19-CART 세포를 항-CD30 작용물질 항체를 사용하여 배양하는 경우, CD197의 발현이 장기간 유지되며 인간 말초혈액-유래된 CD8-양성 T 세포가 항-CD30 작용물질 항체를 사용하지 않는 경우에 비해 생체내에서 장기간 생존할 수 있음을 발견하였다. 상기 발견을 토대로, 본 발명이 완성되었다.
상응하게, 본 발명은 하기를 제공한다.
[1] CD3/TCR 복합체 작용물질, 피브로넥틴 또는 그의 변이체, 및 CD30 작용물질의 존재하에서 CD3-양성 세포를 배양하는 단계 I을 포함하는, 상기 CD3-양성 세포의 제조 방법.
[2] CD3/TCR 복합체 작용물질 및 피브로넥틴 또는 그의 변이체의 부재하에서 및 CD30 작용물질의 존재하에서 단계 I에서 배양된 CD3-양성 세포를 배양하는 단계 II를 또한 포함하는 [1]의 방법.
[3] [1] 또는 [2]의 방법에서, CD3-양성 세포가 다능성 줄기세포로부터 유래하는 방법.
[4] [3]의 방법에서, 다능성 줄기세포가 iPS 세포인 방법.
[5] [1] 내지 [4] 중 어느 하나의 방법에서, CD3-양성 세포가 키메라 항원 수용체-발현 CD3-양성 세포인 방법.
[6] [1] 내지 [5] 중 어느 하나의 방법에서, CD3-양성 세포가 CD3-양성 CD8-양성 세포인 방법.
[7] [6]의 방법에서, CD3-양성 CD8-양성 세포가 CD3-양성 CD8-양성 CD4-음성 세포인 방법.
[8] [1] 내지 [7] 중 어느 하나의 방법에서, CD3-양성 세포가 γTCR-양성 및/또는 δTCR-양성 세포인 방법.
[9] [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 방법에서, CD3/TCR 복합체 작용물질이 CDR3 작용물질 및/또는 TCR 작용물질인 방법.
[10] [9]의 방법에서, CD3 작용물질이 항-CD3 작용물질 항체 또는 그의 결합 단편인 방법.
[11] [10]의 방법에서, 항-CD3 작용물질 항체 또는 그의 결합 단편이 UCHT1 클론으로부터 생성된 항-CD3 작용물질 항체 또는 그의 결합 단편인 방법.
[12] [9]의 방법에서, TCR 작용물질이 항-TCR 항체 또는 그의 결합 단편, HLA/펩티드 복합체 또는 그의 다량체, 및 HLA/초항원(superantigen) 복합체 또는 그의 다량체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나인 방법.
[13] [10] 또는 [11]의 방법에서, 항-CD3 작용물질 항체 또는 그의 결합 단편을 배양 용기에 고정화시키는 방법.
[14] [13]의 방법에서, 항-CD3 작용물질 항체 또는 그의 결합 단편을, 1 ng/㎖ 내지 50000 ng/㎖의 상기 항-CD3 작용물질 항체 또는 그의 결합 단편을 배양 용기와 접촉시킴으로써 고정화시키는 방법.
[15] [1] 내지 [14] 중 어느 하나의 방법에서, 피브로넥틴 또는 그의 변이체가 레트로넥틴(등록상표)인 방법.
[16] [15]의 방법에서, 레트로넥틴(등록상표)을 배양 용기에 고정화시키는 방법.
[17] [16]의 방법에서, 레트로넥틴(등록상표)을, 1 내지 150 ㎍/㎖의 상기 레트로넥틴(등록상표)을 배양 용기와 접촉시킴으로써 고정화시키는 방법.
[18] [1] 내지 [17] 중 어느 하나의 방법에서, CD30 작용물질이 항-CD30 작용물질 항체 또는 그의 결합 단편 및 CD30 리간드 또는 그의 결합 단편으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나인 방법.
[19] [18]의 방법에서, 항-CD30 작용물질 항체 또는 그의 결합 단편을 배지 중에 함유하는 방법.
[20] [19]의 방법에서, 배지 중의 항-CD30 작용물질 항체 또는 그의 결합 단편의 농도가 1 ng/㎖ 내지 1000 ng/㎖인 방법.
[21] [1] 내지 [20] 중 어느 하나의 방법에서, 배지가 IL-7, IL-15, IL-18 및 IL-21 중에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 방법.
[22] [21]의 방법에서, 배지가 IL-7, IL-15, IL-18 및 IL-21을 포함하는 방법.
[23] [21] 또는 [22]의 방법에서, 배지가 TL1A 및/또는 IL-12를 또한 포함하는 방법.
[24] [1] 내지 [23] 중 어느 하나의 방법에서, 생성된 CD3-양성 세포가 추가로 CD197-양성인 방법.
[25] [1] 내지 [24] 중 어느 하나의 방법에 의해 수득된 CD3-양성 세포.
[26] CD3/TCR 복합체 작용물질, 피브로넥틴 또는 그의 변이체, 및 CD30 작용물질의 존재하에서 CD3-양성 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 상기 CD3-양성 세포의 확대 배양 방법.
[27] CD-3 양성 세포의 확대 배양을 위한 키트로,
(1) CD3/TCR 복합체 작용물질, 및 피브로넥틴 또는 그의 변이체가 고정화된 배양 용기, 및
(2) CD30 작용물질을 포함하는 배지
를 포함하는 키트.
[28] CD3-양성 세포 중의 CD30 신호를 자극하는 단계를 포함하는, 상기 CD3-양성 세포를 CD3-양성 CD197-양성 세포로서 유지하는 방법.
[29] [28]의 방법에서, CD3-양성 세포가 CD3-양성 CD8-양성 세포인 방법.
[30] [29]의 방법에서, CD3-양성 CD8-양성 세포가 CD3-양성 CD8-양성 CD4-음성 세포인 방법.
[31] [28] 내지 [30] 중 어느 하나의 방법에서, 자극 단계에 사용되는 배지가 IL-7, IL-15, IL-18 및 IL-21 중에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 방법.
[32] [31]의 방법에서, 자극 단계에 사용되는 배지가 IL-7, IL-15, IL-18 및 IL-21을 포함하는 방법.
[33] [31] 또는 [32]의 방법에서, 자극 단계에 사용되는 배지가 TL1A 및/또는 IL-12를 또한 포함하는 방법.
[34] CD30 작용물질을 포함하는, CD3-양성 세포를 CD3-양성 CD197-양성 세포로서 유지하기 위한 키트.
[35] 항원 결합 도메인, 막관통 도메인(transmembrane domain) 및 세포내 신호전달 도메인(intracellular signal transduction domain)을 포함하는 키메라 항원 수용체로서, 상기 세포내 신호전달 도메인이 CD30 세포내 신호전달 도메인 또는 그의 돌연변이체를 포함하는 키메라 항원 수용체.
[36] [35]의 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산.
[37] [36]의 핵산을 포함하는 키메라 항원 수용체 발현 벡터.
[38] [37]의 키메라 항원 수용체 발현 벡터를 포함하는 키메라 항원 수용체-발현 세포.
[39] [38]의 세포에서, 키메라 항원 수용체 발현 세포가 CD3-양성 세포인 세포.
[40] [38] 또는 [39]의 세포를 포함하는 약제.
[41] [35]의 키메라 항원 수용체에 의해 인식된 항원을 발현하는 종양의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 [40]의 약제.
[42] [35]의 키메라 항원 수용체에 의해 인식된 항원을 발현하는 세포의 사멸을 위한 제제(agent)로서, [38] 또는 [39]의 세포를 포함하는 제제.
[43] [35]의 키메라 항원 수용체에 의해 인식된 항원을 발현하는 종양의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 [38] 또는 [39]의 세포.
[44] [35]의 키메라 항원 수용체에 의해 인식된 항원을 발현하는 종양의 예방 또는 치료를 위한 제제의 제조에서 [38] 또는 [39]의 세포의 용도.
[45] [38] 또는 [39]의 세포를 투여함을 포함하는, [35]의 키메라 항원 수용체에 의해 인식된 항원을 발현하는 종양의 예방 또는 치료 방법.
CD3-양성 세포를 CD3/TCR 복합체 작용물질, 피브로넥틴 또는 그의 변이체, 및 CD30 작용물질의 존재하에서 배양함으로써 T 세포를 효율적으로 제조하거나 확대 배양할 수 있다. 또한, 상기 언급된 배양에 의해 제조되거나 또는 확대 배양된 CD3-양성 세포는 CD197-양성 세포이므로, 상기 세포를 유전자 변형된 T 세포 요법에 사용하는 경우 장기적인 효능이 예상된다. 또한, CD3-양성 세포를, 그의 CD30 신호를 자극함으로써 CD197-양성 세포로서 장기간 유지시킬 수 있다.
도 1은 ELISA 방법에 의해 측정된 바와 같은 항-CD3 작용물질 항체 및 레트로넥틴(등록상표)의 고정화에 적합한 농도를 도시한다.
도 2는 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표)으로 자극후 12일째의 iPSC-유래된 T 세포수(ATP량에 의해 측정된)를 도시한다.
도 3은 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표) 또는 항-CD3/CD28 비드로 자극된 iPSC-유래된 T 세포의 증식 곡선을 도시한다. 수직축은 세포수를 도시하고, 수평축은 상기 언급된 자극이 시작된 날로부터 경과된 일수를 도시한다.
도 4는 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표)에 의한 각각의 자극 횟수에 대한 iPSC-유래된 T 세포의 증식 곡선을 도시한다.
도 5는 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표)에 의한 자극에 의해 증식된 iPSC-유래된 T 세포의 항원-특이적인 세포독성 활성을 도시한다.
도 6은 항-CD30 작용물질 항체의 첨가에 의한, 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표)으로 자극된 iPSC-유래된 T 세포의 촉진된 증식을 도시한다. 수직축은 세포수를 도시하고, 수평축은 상기 언급된 자극이 시작된 날로부터 경과된 일수를 도시한다.
도 7은 iPSC-유래된 T 세포를 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표), 또는 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표) 및 항-CD30 작용물질 항체로 자극하는(제1 자극) 증식 시험을 겪고, 이어서 상기 시험의 종료 후에 다시 동일한 자극(제2 자극)을 겪은 iPSC-유래된 T 세포의 증식 곡선을 도시한다. 수직축은 세포수를 도시하고, 수평축은 상기 언급된 제2 자극이 시작된 날로부터 경과된 일수를 도시한다.
도 8은 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표), 또는 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표) 및 항-CD30 작용물질 항체로 자극후 7일째의 iPSC-유래된 T 세포의 세포막 표면상에서 CD197 및 CD45RA의 발현을 도시한다.
도 9는 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표) 및 항-CD30 작용물질 항체에 의한 자극에 의해 증식된 iPSC-유래된 T 세포의 항원-특이적인 세포독성 활성을 도시한다.
도 10은 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표) 또는 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표) 및 항-CD30 작용물질 항체로 자극된 인간 말초혈액-유래된 CD8-양성 T 세포의 증식 곡선을 도시한다. 수직축은 세포수를 도시하고, 수평축은 상기 언급된 자극이 시작된 날로부터 경과된 일수를 도시한다.
도 11은 다양한 IL 및 항-CD30 항체를 함유하는 항-CD3/CD28 비드로 자극후의 인간 말초 혈액-유래된 CD8-양성 T 세포의 세포막 표면상에서 CD197의 발현을 도시한다.
도 12는 다양한 IL 및 항-CD30 항체를 함유하는 항-CD3/CD28 비드로 자극 후의 인간 말초 혈액-유래된 CD8-양성 T 세포의 정맥내 이식후 4주째의 방사선조사된 면역결함 마우스의 혈액, 비장 및 골수 중에 생존하는 인간 CD8-양성 T 세포의 수를 도시한다.
도 13은 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표) 및 항-CD30 작용물질 항체로 자극된 iPS 세포-유래된 T 세포(iPS-T) 및 iPS 세포-유래된 항-CD19-CART 세포(iPS-CART 항-CD19)의 증식 곡선을 도시한다. 수직축은 세포수를 도시하고, 수평축은 상기 언급된 자극이 시작된 날로부터 경과된 일수를 도시한다.
도 14는 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표), 또는 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표) 및 항-CD30 작용물질 항체로 자극된 iPS 세포-유래된 항-CD19-CART 세포의 증식 곡선을 도시한다. 수직축은 세포수를 도시하고, 수평축은 상기 언급된 자극이 시작된 날로부터 경과된 일수를 도시한다.
도 15는 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표), 또는 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표) 및 항-CD30 작용물질 항체로 자극된 iPS 세포-유래된 항-CD19-CART 세포의 세포막 표면상에서 CD197의 발현을 도시한다.
도 16은 항-CD30 작용물질 항체의 첨가에 의한 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표)으로 자극된 iPS 세포-유래된 항-CD19-CART 세포의, CD19-발현 라지(Raji) 세포에 대한 세포독성 활성을 도시한다.
도 17은 CD30-유래된 세포내 도메인을 함유하는 iPS 세포-유래된 항-CD19-CART 세포(iCD19-CD30-CART)의, CD19-발현 라지 세포에 대한 세포독성 활성을 도시한다.
도 18은 항-CD30 작용물질 항체의 첨가에 의한, 비-T 세포-유래된 iPS 세포로부터 분화되고, 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표)으로 자극된 γδT 세포(iγδT 세포)의 세포 증식을 도시한다. 수직축은 세포 증식비를 도시하고, 수평축은 상기 언급된 자극이 시작된 날로부터 경과된 일수를 도시한다.
도 19는 항-CD30 작용물질 항체의 첨가에 의한, 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표)으로 자극된 항-CD19-CARγδT 세포(iCARγδT 세포)의 세포 증식을 도시한다. 수직축은 세포수를 도시하고, 수평축은 상기 언급된 자극이 시작된 날로부터 경과된 일수를 도시한다.
도 20은 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표)에 의한 자극에 의해 증식된 iCD19CAR/IL-15γδT 세포의 항원-특이적인 세포독성 활성을 도시한다.
도 21은 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표)에 의한 자극에 의해 증식된 iCD19CAR/IL-15γδT 세포에 의한 인간 CD19-발현 종양-함유 마우스의 생존 일수 증가 효과를 도시한다.
도 22는 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표)에 의한 자극에 의해 증식된 iCD19CAR/IL-15αβT 세포의 항종양 효과를 도시한다.
도 23은 ELISA 방법에 의해 측정된 바와 같은 항-CD3 작용물질 항체(UCHT1) 및 레트로넥틴(등록상표)의 고정화에 적합한 농도를 도시한다.
도 24는 고정화된 항-CD3 작용물질 항체(UCHT1)/레트로넥틴(등록상표) 및 항-CD30 작용물질 항체로 자극후 13일째의 iPSC-유래된 T 세포의 증식률을 도시한다.
본 명세서에서, "유전자 발현"은 상기 유전자의 특정한 뉴클레오티드 서열로부터 mRNA의 합성(또한 전사 또는 mRNA 발현으로서 지칭된다) 및 상기 mRNA의 정보에 기초한 단백질의 합성(또한 번역 또는 단백질 발현으로서 지칭된다) 모두를 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, "유전자 발현" 또는 단순히 "발현"은 단백질의 발현을 의미한다.
본 명세서에서, "양성"은 단백질 또는 mRNA가 당해 분야에 공지된 방법에 의해 검출될 수 있는 양으로 발현됨을 의미한다. 단백질을, 항체를 사용하는 면역학적 분석, 예를 들어 ELISA 방법, 면역염색 방법, 웨스턴 블럿 방법, 및 유식 세포측정에 의해 검출할 수 있다. 또한, 리포터 단백질은 상기 단백질과 함께 발현되며, 표적 단백질은 상기 리포터 단백질의 검출에 의해 검출될 수 있다. 또한, 단백질의 존재는 상기 단백질의 기능을 검출함으로써 검출될 수 있다(예를 들어 상기 단백질이 전사 인자인 경우, 상기 단백질에 의해 발현이 조절되는 유전자가 검출되고, 상기 단백질이 효소인 경우, 상기 단백질에 의해 촉매화되는 기질 또는 생성물이 검출되는 등이다). mRNA를, 예를 들어 핵산 증폭 방법 및/또는 핵산 검출 방법, 예를 들어 RT-PCR, 미세배열, 바이오칩, RNAseq 등에 의해 검출할 수 있다.
본 명세서에서, "음성"은 단백질 또는 mRNA의 발현 수준이 상기 언급된 공지된 방법 모두 또는 상기 방법 중 어느 하나에 의한 검출 하한 미만임을 의미한다. 상기 단백질 또는 mRNA 발현의 검출 하한은 각각의 방법에 따라 변할 수 있다.
본 명세서에서, "배양"은 시험관내 환경에서 세포의 유지, 증식(성장) 및/또는 분화를 지칭한다. "배양"은 조직외 또는 생체외, 예를 들어 세포 배양 디쉬 또는 플라스크에서 세포의 유지, 증식(성장) 및/또는 분화를 의미한다.
본 명세서에서, "확대 배양"은 목적하는 세포 집단의 증식 및 세포수의 증가를 위한 배양을 의미한다. 세포수의 증가는 증식에 의한 세포의 수가, 사멸에 의한 수의 감소를 초과하도록 증가시킴으로써 성취될 수 있으며, 세포 집단 중의 모든 세포를 증식시킬 필요는 없다. 세포수의 증가는 확대 배양 개시전에 비해 1.1배, 1.2배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 100배, 300배, 500배, 1,000배, 3,000배, 5,000배, 10,000배, 100,000배, 또는 1,000,000배 이상일 수 있다.
본 명세서에서, "자극"은 몇몇 물질이 다양한 수용체 등에 결합하여 그의 하류의 신호 경로를 활성화시킴을 의미한다.
본 명세서에서, "풍부하다"는 조성물, 예를 들어 세포 조성물 등에서 특정한 구성성분의 양을 증가시킴을 지칭하며, "풍부한"은 세포 조성물, 예를 들어 세포 집단을 설명하는데 사용될 때 특정한 구성성분의 양이 풍부화 전의 상기 세포 집단 중의 상기와 같은 구성성분의 비율에 비해 증가된 세포 집단을 지칭한다. 예를 들어, 세포 집단 등과 같은 조성물은 표적 세포 유형에 관하여 풍부화될 수 있으며, 따라서 상기 표적 세포 유형의 비율은 풍부화 전에 상기 세포 집단 중에 존재하는 표적 세포의 비율에 비해 증가한다. 세포 집단은 또한 당해 분야에 공지된 세포 선택 또는 선별 방법에 의해 표적 세포에 관하여 풍부화될 수 있다. 세포 집단은 또한 본 명세서에 기재된 특정한 선택 또는 선별 공정에 의해 풍부화될 수 있다. 본 발명의 특정한 구현예에서, 표적 세포 집단의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99%가 상기 표적 세포 집단의 풍부화 방법에 의해 풍부화된다.
본 명세서에서, "세포 집단"은 동일한 유형 또는 상이한 유형의 2개 이상의 세포를 의미한다. "세포 집단"은 또한 동일한 유형 또는 상이한 유형의 세포의 덩어리를 의미한다.
본 발명은 CD3/TCR 복합체 작용물질, 피브로넥틴 또는 그의 변이체, 및 CD3 작용물질의 존재하에서 CD3 양성 세포를 배양하는 단계를 포함하는, CD3-양성 세포의 제조 방법 또는 확대 배양 방법(본 명세서에서 이후에 때때로 본 발명의 제조 방법 또는 확대 배양 방법으로서 지칭한다)을 제공한다.
CD3/TCR 복합체 및 CD30은 각각 CD3/TCR 복합체 작용물질 및 CD30 작용물질로 자극될 수 있다.
본 발명의 제조 방법 또는 확대 배양 방법에서, 배양되는 CD3-양성 세포는 상기 세포가 세포막상에서 CD3를 발현하는 한 특별히 제한되지 않는다. CD3-양성 세포는 바람직하게는 CD3-양성 CD8-양성 세포(CD3-양성 CD8-양성 CD4-양성 세포 또는 CD3-양성 CD8-양성 CD4-음성 세포), 보다 바람직하게는 CD3-양성 CD8-양성 CD4-음성 세포이다. 또 다른 바람직한 CD3-양성 세포는 예를 들어 CD3-양성 CD4-양성 세포(CD3-양성 CD4-양성 CD8-양성 세포 또는 CD3-양성 CD4-양성 CD8-음성 세포)이다.
본 발명의 제조 방법 또는 확대 배양 방법에 의해 배양되는 CD3-양성 세포는 배양 전에 CD30-양성이거나, 또는 배양 중에 CD30-양성으로 분화될 수 있다. 따라서 CD3-양성 세포가 배양 전에 CD30-양성인 경우, 상기 CD3-양성 세포는 바람직하게는 CD3-양성 CD8-양성 CD30-양성 세포(CD3-양성 CD8-양성 CD4-양성 CD30-양성 세포 또는 CD3-양성 CD8-양성 CD4-음성 CD30-양성 세포), 보다 바람직하게는 CD3-양성 CD8-양성 CD4-음성 CD30-양성 세포이다. 또 다른 바람직한 CD3-양성 세포는 예를 들어 CD3-양성 CD4-양성 CD30-양성 세포(CD3-양성 CD4-양성 CD8-양성 CD30-양성 세포 또는 CD3-양성 CD4-양성 CD8-음성 CD30-양성 세포)이다.
본 발명의 제조 방법 또는 확대 배양 방법에 의한 제조 또는 확대 배양에 의해 수득된 CD3-양성 세포는 상기 세포가 세포막상에서 CD3를 발현하는 한 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 본 발명의 제조 방법 또는 확대 배양 방법에서 배양된 CD3-양성 세포와 유사한 세포일 수 있다. 제조 또는 확대 배양후 CD3-양성 세포는 바람직하게는 CD197-양성이다. 제조 또는 확대 배양후의 CD3-양성 세포는 추가로 CD197-양성이며, 상기 세포는 구체적으로 CD3-양성 CD8-양성 CD197-양성 세포(CD3-양성 CD8-양성 CD4-양성 CD197-양성 세포 또는 CD3-양성 CD8-양성 CD4-음성 CD197-양성 세포), 보다 바람직하게는 CD3-양성 CD8-양성 CD4-음성 CD197-양성 세포이다. 한편으로, 상기 세포는 CD3-양성 CD4-양성 CD30-양성 CD197-양성 세포(CD3-양성 CD4-양성 CD8-양성 CD30-양성 CD197-양성 세포 또는 CD3-양성 CD4-양성 CD8-음성 CD30-양성 CD197-양성 세포)이다. CD3-양성 세포 중에서, CD197-양성 세포는 CD45RA 발현의 존재 또는 부재에 따라 줄기세포 기억 T 세포 또는 중심 기억 T 세포로 분류되고 효과기 T 세포를 공급할 수 있는 높은 자기-증식 능력을 갖기 때문에, 항-종양 면역에 적합하다.
제조 또는 확대 배양후의 CD3-양성 세포는 더욱 바람직하게는 CD197-양성 CD45RA-음성이다. 제조 또는 확대 배양후의 CD3-양성 세포가 추가로 CD197-양성 CD45RA-음성인 경우, 상기 세포는 구체적으로 CD3-양성 CD8-양성 CD197-양성 CD45RA-음성 세포(CD3-양성 CD8-양성 CD4-양성 CD197-양성 CD45RA-음성 세포 또는 CD3-양성 CD8-양성 CD4-음성 CD197-양성 CD45RA-음성 세포), 보다 바람직하게는 CD3-양성 CD8-양성 CD4-음성 CD197-양성 CD45RA-음성 세포이다. 한편으로, 상기 세포는 CD3-양성 CD4-양성 CD30-양성 CD197-양성 CD45RA-음성 세포(CD3-양성 CD4-양성 CD8-양성 CD30-양성 CD197-양성 CD45RA-음성 세포 또는 CD3-양성 CD4-양성 CD8-음성 CD30-양성 CD197-양성 CD45RA-음성 세포)이다. CD3-양성 세포 중에서, CD197-양성 CD45RA-음성 세포는 또한 특별히 중심 기억 T 세포라 지칭된다.
CD3는 T 세포의 성숙화 과정 동안 발현되고, 상기 T 세포 수용체(TCR)와 보다 큰 복합체(CD3/TCR 복합체)를 형성하며, 또한 T 세포 마커로서 공지된 분자이다. 상기는 γ, δ, ε, 및 ζ 쇄의 4가지 유형의 폴리펩티드의 복합체이다. CD3와 복합체를 형성하는 TCR은 T 세포로 신호를 전달하는 분자이며, 예로는 α쇄(TCRα), β쇄(TCRβ), γ쇄(TCRγ) 및 δ쇄(TCRδ) 중 2개로 구성된 이량체, TCRα 및 TCRβ로 구성된 이종이량체(αβTCR), TCRγ 및 TCRδ로 구성된 이종이량체(γδTCR), 및 동일한 TCR쇄로 구성된 동종이량체를 포함한다. CD3와 같이, CD8은 T 세포의 성숙화 과정 동안 생체내에서 발현되고, 성숙화의 초기 단계에서 CD4와 함께 발현되나, 오직 CD4의 발현만이 세포독성 T 세포로의 분화와 함께 상실된다. CD8은 CD3/TCR 복합체의 공-수용체로서 기능하고 I 부류 HMC/항원 펩티드를 인식하며 α-쇄 폴리펩티드로 이루어지는 동종이량체 또는 α- 및 β-쇄의 2가지 유형의 폴리펩티드로 이루어지는 이종이량체인 분자이다. CD4는 생체내에서 T 세포 성숙화의 초기 단계에서 CD8과 함께 발현되지만, 오직 CD8 발현만이 헬퍼 T 세포로의 분화와 함께 상실된다. CD8 처럼, CD4는 CD3/TCR 복합체의 공-수용체로서 기능하지만, CD8과 달리, 상기는 II 부류 HMC/항원 펩티드를 인식하는 분자이다. CD30은 활성화된 림프구(T 세포 및 B 세포)에서 발현된 분자로서 공지되어 있으며, 세포외 도메인으로서 6개의 시스테인-풍부 슈도-반복 동기(pseudo-repeat motif)를 갖고, 세포내 도메인으로서 NFκB 신호를 자극하는 TNF 수용체-관련 인자(TRAF) 결합 서열을 갖는다. CD197 및 CD45RA는 T 세포들 중에서, 미경험 T 세포 또는 줄기세포 기억 T 세포(CD197-양성, CD45RA-양성), 중심 기억 T 세포(CD197-양성, CD45RA-음성), 효과기 기억 T 세포(CD197-음성, CD45RA-음성), 및 효과기 T 세포(CD197-음성, CD45RA-양성)를 구별하기 위한 마커 분자로서 사용된다.
본 발명의 제조 방법 또는 확대 배양 방법에서, 배양되는 CD3-양성 세포는 포유동물로부터 채취된 세포 또는 다능성 줄기세포의 분화에 의해 수득된 세포일 수 있다. 다능성 줄기세포의 분화에 의해 수득된 세포가 바람직하다.
CD3-양성 세포가 포유동물로부터 채취되는 경우, 상기 세포를 예를 들어 상기 포유동물로부터의 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 성분채집술에 의해 채취하고, 이어서 항-CD3 항체 컬럼, 밀도 구배 원심분리 방법 등을 사용하여 단리하고 채취할 수 있다. CD3-양성 세포의 채취를 위한 포유동물은 인간 및 인간 이외의 동물(예를 들어 개, 고양이, 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그, 토끼, 돼지, 소, 염소, 말, 양, 원숭이 등)을 포함하며 인간이 바람직하다.
CD3-양성 세포가 다능성 줄기세포의 분화에 의해 수득된 세포인 경우, 상기 다능성 줄기세포는 배아 줄기세포(ES 세포), 유도만능줄기세포(iPS 세포), 배아 암종세포(EC 세포), 및 배아생식세포(EG 세포)를 포함한다. ES 세포 또는 iPS 세포가 바람직하다(인간 iPS 세포가 보다 바람직하다).
다능성 줄기세포가 ES 세포인 경우, 상기를 그 자체가 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. ES 세포의 제조 방법의 예는 비제한적으로, 내부 세포 덩어리를 포유동물의 배반포 단계에서 배양하는 방법(예를 들어 Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994) 참조), 및 체세포 핵 이식에 의해 제조된 초기 배아의 배양 방법(Wilmut et al., Nature, 385, 810(1997); Cibelli et al., Science, 280, 1256(1998); Akira Iriya et al., Protein Nucleic Acid Enzyme, 44, 892(1999); Baguisi et al., Nature Biotechnology, 17, 456(1999); Wakayama et al., Nature, 394, 369(1998); Wakayama et al., Nature Genetics, 22, 127(1999); Wakayama et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984(1999); RideoutIII et al., Nature Genetics, 24, 109(2000)) 등을 포함한다. ES 세포를 소정의 연구소로부터 수득할 수 있으며, 또한 상업적인 제품으로서 구입할 수 있다. 예를 들어, 인간 ES 세포주 H1, H7, H9, H13 및 H14를 미국 소재의 WiCell Research Institute로부터 입수할 수 있으며, 인간 ES 세포주 HES1-6을 호주 소재의 ES Cell International로부터 입수할 수 있고, 인간 ES 세포주 SA002, SA181 및 SA611을 스웨덴 소재의 Cellartis AB로부터 입수할 수 있으며, 인간 ES 세포주 HUES1-17을 미국 소재의 HUES Cell Facility로부터 입수할 수 있고, 인간 ES 세포주 KhES-1 - KhES-5를 the Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Kyoto University로부터 입수할 수 있으며, 인간 ES 세포주 SEES1 - SEES7을 the National Center for Child Health and Development로부터 입수할 수 있다. ES 세포주를 체세포 핵 이식에 의해 제조하는 경우, 상기 체세포의 유형 및 체세포 채취를 위한 공급원은 하기에 기재된 iPS 세포의 제조의 경우와 동일하다.
다능성 줄기세포가 iPS 세포인 경우, 상기 iPS 세포를 체세포내로의 핵 재프로그램화 물질의 도입에 의해 제조할 수 있다. iPS 세포의 제조를 위한 출발 물질로서 사용될 수 있는 체세포는 포유동물(예를 들어 마우스 또는 인간)로부터 유래된 생식세포 이외의 임의의 세포일 수 있다. 예로는 각질화 상피세포(예를 들어, 각질화된 표피세포), 점막 상피세포(예를 들어 혀 표면층상의 상피세포), 외분비선 상피세포(예를 들어 유선세포), 호르몬 분비 세포(예를 들어 부신수질세포), 대사/저장세포(예를 들어 간세포), 경계면을 구성하는 내강상피세포(예를 들어 I형 폐포세포), 도관의 내강상피세포(예를 들어 혈관내피세포), 운반능을 갖는 섬모가 있는 세포(예를 들어 기도상피세포), 세포외 기질 분비 세포(예를 들어 섬유아세포), 수축성 세포(예를 들어 평활근세포), 혈액 및 면역계 세포(예를 들어 T 림프구), 감각 관련 세포(예를 들어 막대세포), 자율신경계 뉴런(예를 들어 콜린작동성 뉴런), 감각기관 및 말초 뉴런-지지세포(예를 들어 위성세포), 중추신경계의 신경 세포 및 신경교세포(예를 들어 성상신경교 세포), 색소세포(예를 들어 망막 색소 상피세포) 및 그의 전구세포(조직 전구세포) 등을 포함한다. 세포 분화 정도는 특별히 제한되지 않으며, 미분화된 전구세포(체성 줄기세포 포함) 및 최종-분화된 성숙한 세포는 모두 본 발명에서 체세포의 기원으로서 유사하게 사용될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 상기 미분화된 전구세포의 예는 조직 줄기세포(체성 줄기세포), 예를 들어 지방-유래된 기질(줄기) 세포, 신경줄기세포, 조혈줄기세포, 간엽계줄기세포, 치수줄기세포 등을 포함한다.
iPS 세포의 제조를 위해 체세포내로 도입되는 핵 재프로그램화 물질은 지금까지 보고된 다양한 재프로그램화 유전자의 조합을 포함한다(예를 들어, WO 2007/069666, Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008), Cell, 126, 663-676 (2006), Cell, 131, 861-872 (2007), Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009), Nature, 451, 141-146 (2008), Science, 318, 1917-1920 (2007), Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008), Cell Research (2008) 600-603, Nature 454: 646-650 (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528(2008), WO2008/118820, Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009), Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009), Science, 324: 797-801 (2009) 참조). 또한, 상기 언급한 재프로그램화 유전자에 의해 암호화된 단백질을 또한 핵 재프로그램화 물질로서 체세포내에 도입시킬 수 있다(Cell Stem Cell, 4: 381-384(2009), Cell Stem Cell, doi:10.1016/j.stem.2009.05.005 (2009)). 특히, 수득되는 iPS 세포가 치료 목적으로 사용됨을 고려할 때, 3개의 인자 Oct3/4, Sox2 및 Klf4의 조합이 바람직하다.
iPS 세포 콜로니를, 지표로서 약물 내성 및 리포터 활성을 사용하는 방법(Cell, 126, 663-676 (2006), Nature, 448, 313-317 (2007)) 또는 시각적 형태 관찰을 포함하는 방법(Cell, 131, 861-872 (2007))에 의해 선택할 수 있다. iPS 세포의 확인은 다양한 ES 세포-특이성 유전자의 발현 및 기형종 형성을 지표로서 사용하여 수행될 수 있다.
현재, 다양한 유형의 iPS 세포(iPSC)가 존재하며, 마우스 섬유아세포에 Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc의 4개 인자를 도입시킴으로써 야마나카(Yamanaka) 등에 의해 확립된 iPS 세포(Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006) 126: 663-676), 인간 섬유아세포에 유사한 4개 인자를 도입시킴으로써 확립된 인간 세포로부터 유래된 iPSC(Takahashi K, Yamanaka S., et al., Cell, (2007) 131: 861-872.), 상기 언급한 4개 인자의 도입후 Nanog의 발현을 지표로서 선택함으로써 확립된 Nanog-iPSc(Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.), c-Myc가 없는 방법에 의해 제조된 iPSC(Nakagawa M, Yamanaka S., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, 101 - 106), 및 무-바이러스 방법에 의해 6개 인자를 도입시킴으로써 확립된 iPSC(Okita K et al., Nat. Methods 2011 May; 8(5):409-12, Okita K et al., Stem Cells. 31(3):458-66.)를 또한 사용할 수 있다. 또한, OCT3/4, SOX2, NANOG, 및 LIN28의 4개 인자를 도입시킴으로써 톰슨(Thomson) 등에 의해 확립된 iPSC(Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.), 달리(Daley) 등에 의해 제조된 iPSC(Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451: 141-146), 유도만능줄기세포(JP-A-2008-307007) 등을 또한 사용할 수 있다.
또한, 공개된 문헌(예를 들어 Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol3, Issue 5,568-574; Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650; Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, No 7, 795-797), 또는 특허(예를 들어, JP-A-2008-307007, JP-A-2008-283972, US2008-2336610, US2009-047263, WO2007/069666, WO2008/118220, WO2008/124133, WO2008/151058, WO2009/006930, WO2009/006997, WO2009/007852)에 기재된 당해분야에 공지된 iPSC 중 임의의 것들을 사용할 수 있다.
유도만능줄기세포주로서, NIH, RIKEN, 교토 대학 등에 의해 확립된 다양한 iPSC 주를 사용할 수 있다. 인간 iPSC 주의 예는 HiPS-RIKEN-1A 균주, HiPS-RIKEN-2A 균주, HiPS-RIKEN-12A 균주, RIKEN의 Nips-B2 균주, 253G1 균주, 253G4 균주, 1201C1 균주, 1205D1 균주, 1210B2 균주, 1383D2 균주, 1383D6 균주, 201B7 균주, 409B2 균주, 454E2 균주, 606A1 균주, 610B1 균주, 648A1 균주, 1231A31 균주, FfI-01s04 등을 포함하며, 1231A3 균주가 바람직하다.
CD3-양성 세포가 다능성 줄기세포의 분화에 의해 수득된 세포인 경우, 상기 CD3-양성 세포에서 발현된 TCR은 TCRα, TCRβ, TCRγ 및 TCRδ 중 2개로 이루어지는 이량체, TCRα 및 TCRβ로 이루어지는 이종이량체(αβTCR), TCRγ 및 TCRδ로 이루어지는 이종이량체(γδTCR), 및 동일한 TCR 쇄로 이루어지는 동종이량체를 포함한다. 이들 TCR은 내인성 이량체 또는 외인성 이량체일 수 있지만, 외인성 TCRα 및 외인성 TCRβ를 함유하는 이량체가 바람직하다.
본 명세서에서, "외인성 TCR"은 외인성 TCRα 및 외인성 TCRβ로 이루어지는 이종이량체, 외인성 TCRγ 및 외인성 TCRδ로 이루어지는 이종이량체, 및/또는 동일한 외인성 TCR 쇄로 이루어지는 동종이량체를 지칭한다.
TCR이 내인성 TCRα 및 내인성 TCRβ를 함유하는 이량체인 경우, 다능성 줄기세포는 내인성 TCRα를 암호화하는 염기 서열을 함유하는 핵산 및 내인성 TCRβ를 암호화하는 염기 서열을 함유하는 핵산을 함유하는 세포로부터 제조된 다능성 줄기세포일 수 있다. 상기와 같은 세포의 예는 T 세포(CD8-양성 CD4-음성 세포, CD8-음성 CD4-양성 세포, CD4-양성 CD8-양성 세포 등)를 포함한다. TCR이 외인성 TCRα 및 외인성 TCRβ를 함유하는 이량체인 경우, 다능성 줄기세포는 외인성 TCRα를 암호화하는 염기 서열을 함유하는 핵산 및 외인성 TCRβ를 암호화하는 염기 서열을 함유하는 핵산을 함유하는 세포일 수 있다.
본 명세서에서, "외인성 TCR 핵산"은 외인성 TCRα를 암호화하는 염기 서열을 함유하는 핵산, 외인성 TCRβ를 암호화하는 염기 서열을 함유하는 핵산, 외인성 TCRγ를 암호화하는 염기 서열을 함유하는 핵산, 및/또는 외인성 TCRδ를 암호화하는 염기 서열을 함유하는 핵산을 지칭한다.
외인성 TCR 핵산(외인성 TCRα를 암호화하는 염기 서열을 함유하는 핵산 및 외인성 TCRβ를 암호화하는 염기 서열을 함유하는 핵산)을 다능성 줄기세포내에 도입시키는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 하기의 방법을 사용할 수 있다.
외인성 TCR 핵산이 DNA의 형태인 경우, 예를 들어 바이러스, 플라스미드, 인공 염색체 등과 같은 벡터를 리포펙션(lipofection), 리포솜, 미세주입 등과 같은 방법에 의해 다능성 줄기세포내에 도입시킬 수 있다. 바이러스 벡터의 예는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터 등을 포함한다. 인공 염색체 벡터의 예는 인간 인공 염색체(HAC), 효모 인공 염색체(YAC), 세균 인공 염색체(BAC, PAC) 등을 포함한다. 플라스미드로서, 포유동물 세포용 플라스미드를 사용할 수 있다. 상기 벡터는 외인성 TCR의 발현이 가능하도록 하는 조절 서열, 예를 들어 프로모터, 인헨서(enhancer), 리보솜-결합 서열, 종결자, 폴리아데닐화 부위 등을 함유할 수 있다. 필요한 경우, 선택 마커 서열, 예를 들어 내약성 유전자(예를 들어 카나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 퓨로마이신 내성 유전자 등), 티미딘 키나제 유전자, 디프테리아 독소 유전자 등, 리포터 유전자 서열, 예를 들어 형광 단백질, β 글루쿠로니다제(GUS), FLAG 등을 함유할 수 있다. 상기 프로모터의 예는 SV40 프로모터, LTR 프로모터, CMV(거대세포바이러스) 프로모터, RSV(라우스 육종 바이러스) 프로모터, MoMuLV(몰로니 마우스 백혈병 바이러스) LTR, HSV-TK(헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제) 프로모터, EF-α 프로모터, CAG 프로모터 및 약제 반응성 프로모터를 포함한다. 약물 반응성 프로모터의 예는 상응하는 약물의 존재하에서 유전자를 발현하는 TRE 프로모터(7 연속 tetO 서열을 갖는 Tet-반응성 서열을 갖는 CMV 최소 프로모터)를 포함한다. TRE 프로모터가 사용되는 경우, 상응하는 약물(예를 들어 테트라사이클린 또는 독시사이클린)의 존재하에 동일한 세포에서 역 tetR(rtetR) 및 VP16AD의 융합 단백질을 동시에 발현함으로써 유전자 발현을 유도하는 방식을 사용하는 것이 바람직하다. TRE 프로모터를 갖는 동시에, rtetR 및 VP16AD의 융합 유전자를 동일한 벡터에서 발현시키는 방식을 갖는 벡터가 더욱 바람직하다.
본 발명에서, 폴리시스트론 발현 방식을 또한 사용하여 외인성 TCRα 및 외인성 TCRβ를 동시에 발현시킬 수 있다. 폴리시스트론 발현을 위해서, 상기 유전자를 암호화하는 서열들을 IRES 또는 구제역 바이러스(FMDV) 2A 암호화 영역에 의해 결합시킬 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 언급한 벡터는 필요에 따라 염색체내에 통합된 외인성 TCR을 암호화하는 서열을 절제하기 위해서 상기 발현 카세트(프로모터, 유전자 서열 및 종결자를 함유하는 유전자 발현 단위)의 앞뒤에 트랜스포손 서열을 가질 수 있다. 상기 트랜스포손 서열은 특별히 제한되지 않으며, piggyBac으로 예시된다. 또 다른 구현예에서, 상기 발현 카세트를 제거하기 위해서, loxP 서열 또는 FRT 서열을 상기 발현 카세트의 앞뒤에 제공할 수 있다.
외인성 TCR 핵산이 RNA의 형태인 경우, 상기를 일렉트로포레이션, 리포펙션, 미세주입 등과 같은 방법에 의해 다능성 줄기세포내에 도입시킬 수 있다.
본 발명의 제조 방법 또는 확대 배양 방법에서, 배양되는 CD3-양성 세포는 또한 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포일 수 있다.
본 발명에서, "키메라 항원 수용체(CAR)"는 항원-결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 함유하는 융합 단백질을 의미한다. CAR의 항원-결합 도메인은 항체의 가변 영역의 경쇄(VL) 및 중쇄(VH)가 링커(예를 들어 GS 링커)를 통해 직렬로 결합된 단쇄 항체(scFv)를 포함한다. CAR을 발현하는 CD3-양성 세포는 상기 scFV 영역 중의 항원을 인식하고 이어서 그의 인식 신호를 세포내 신호전달 도메인을 통해 T 세포내로 전달한다. CAR의 CD3-양성 세포내로의 도입은 관심 항원에 대해 특이성을 부여할 수 있게 한다. 또한, CAR은 I 부류 또는 II 부류 HLA에 의존하지 않고 항원 분자를 직접 인식할 수 있기 때문에, I 부류 또는 II 부류 HLA 유전자 발현이 감소된 세포에 대해 높은 면역 반응이 또한 유도될 수 있다.
상기 언급한 TCR 및 CAR에 의해 표적화된 항원의 예는 비제한적으로 종양 항원을 포함한다. 상기 종양 항원은 종양-특이성 항원(TSA) 또는 종양-관련 항원(TAA)일 수 있다. 상기와 같은 종양 항원의 구체적인 예는 분화된 항원, 예를 들어 MART-1/MelanA(MART-I), gp100(Pmel 17), 티로시나제, TRP-1, TRP-2 등, 종양-특이성 다계열 항원, 예를 들어 WT1, 글리피칸-3, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15 등, 태아 항원, 예를 들어 CEA 등, 과발현된 종양 유전자 또는 돌연변이된 종양 억제성 유전자, 예를 들어 p53, Ras, HER-2/neu 등, 염색체 전좌에 의해 야기된 특유의 종양 항원, 예를 들어 BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR 등, 및 바이러스 항원, 예를 들어 엡스타인 바 바이러스 항원 EBVA, 인유두종 바이러스(HPV) 항원 E6 및 E7 등으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 한 종류 이상의 항원을 포함한다. 다른 종양 항원으로서, CD19, CD20, EGP2, erB2,3,4, GD2, GD3, 메소텔린, PSMA, 8H9, Lewis-Y, MUC1, TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, β-카테닌, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, α-태아단백질, β-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3/CA 27.29/BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68/P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733/EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90/Mac-2 결합 단백질/사이클로필린 C-관련 단백질, TAAL6, TAG72, TLP 및 TPS를 언급할 수 있다.
CAR의 막관통 도메인의 예는 TCR의 α 쇄, β 쇄 또는 ζ 쇄, CD28, CD3ε 쇄, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, 4-1BB(CD137) 및 CD154 등으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 단백질로부터 유래된 막관통 도메인을 포함한다. 이들 중에서, CD8로부터 유래된 막관통 도메인이 바람직하다. 또한, 예를 들어 항원 결합 도메인에 결합된 제1 세포내 신호전달 도메인이 유래된 분자로부터 유래된 막관통 도메인이 또한 바람직하게 사용된다. 예를 들어, 항원 결합 도메인에 결합된 제1 세포내 신호전달 도메인이 유래된 분자가 CD28인 경우, 상기 막관통 도메인은 또한 CD28로부터 유래될 수 있다. 한편으로, 인위적으로 설계된 막관통 도메인을 또한 사용할 수 있다.
CAR의 세포내 신호전달 도메인의 예는 비제한적으로 FcRγ 쇄, FcRβ 쇄, CD3γ 쇄, CD3δ 쇄, CD3ε 쇄, CD3ζ 쇄, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 한 종류 이상의 단백질로부터 유래된 세포내 도메인을 포함한다. 이들 중에서, CD3ζ 쇄로부터 유래된 세포내 도메인이 바람직하다. CD3ζ 쇄의 세포내 도메인 중에 함유된 ITAM의 티로신 인산화가 촉발되는 경우, 일련의 반응, 예를 들어 세포내 Ca2+ 농도의 증가, 사이토카인 분비 등이 발생하며, 최종적으로 세포분열이 발생하고 CD3-양성 세포는 CTL로서 세포독성 활성을 나타낸다. 세포내 신호전달 도메인은 공-자극 분자의 세포내 도메인을 추가로 함유할 수 있다. 상기 공-자극 분자의 예는 비제한적으로 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 및 CD83으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 한 종류 이상의 단백질의 세포내 도메인을 포함한다. 이들 중에서, CD28, 4-1BB (CD137), CD30으로부터 유래된 세포내 도메인이 바람직하다. CD28은 IL-2 생산을 증가시킴으로써 T 세포 증식을 촉진하도록 결합할 수 있다. 또한, 4-1BB는 T 세포 활성화의 최종 단계에서 야기된 세포사멸을 억제시킴으로써 기억 세포로의 분화를 촉진할 수 있다. CD30은 CD3 항체에 의한 CD3-양성 세포의 증식을 더욱 개선시킬 수 있으며 상기 세포를 장기간 동안 CD197-양성 세포로서 유지될 수 있게 한다. 공-자극 분자의 유형 및 수를 선택함으로써, CAR 활성의 강도 및 지속기간을 조절할 수 있다(예를 들어 Mol Ther. 2009; 17:1453-1464). 세포내 신호전달 도메인이 한 종류 이상의 세포내 도메인을 함유하는 경우, 그의 순서는 제한되지 않는다.
CAR의 항원-결합 도메인과 막관통 도메인 사이, 또는 CAR의 세포내 신호전달 도메인과 막관통 도메인 사이에 이격자(spacer)를 통합시킬 수 있다. 이격자로서, 300 이하의 아미노산, 바람직하게는 10 내지 100 아미노산 및 가장 바람직하게는 25 내지 50 아미노산으로 이루어지는 펩티드가 일반적으로 사용될 수 있다. 그의 구체적인 예는 비제한적으로, IgG1으로부터 유래된 힌지 영역(hinge region), 면역글로불린의 CH2CH3 영역 및 CD3의 일부를 함유하는 펩티드 등을 포함한다.
CAR의 구체적인 예는 비제한적으로, scFv 및 CD3ζ 쇄가 이격자를 통해 결합된 1세대 CAR, CD28로부터 유래된 막관통 도메인 및 세포내 도메인이 상기 1세대 CAR의 scFv와 CD3ζ 쇄 사이에 통합되어 T 세포 활성화 능력을 증대시키는 2세대 CAR, 및 CD28과 상이한 공-자극 분자(4-1BB 또는 OX40)의 세포내 도메인이 2세대 CAR의 CD28의 세포내 도메인과 CD3ζ 쇄사이에 통합된 3세대 CAR을 포함한다.
본 발명의 제조 방법 또는 확대 배양 방법에서, 추가로 배양되는 CD3-양성 세포는 CAR 및 IL-15 및 IL-15α의 융합 단백질(IL-15/IL-15Rα)을 공발현하는 세포일 수 있다. IL-15/IL-15Rα와 발현된 CAR은 상기 언급한 CAR과 유사할 수 있다.
본 발명에서, "IL-15/IL-15Rα"는 IL-15 및 IL-15Rα를 함유하는 융합 단백질을 의미한다. IL-15 신호전달 시스템에서, 항원-제시세포상에서 발현된 IL-15Rα는 일반적으로 IL-15에 결합하고 IL-15는 CD8-양성 및 CD4-음성 세포상의 IL-15Rβ와 공통의 γ 쇄(γc)로 이루어지는 IL-15 수용체에 제시되어(트랜스-제시), CD8-양성 CD4-음성 세포의 세포독성 활성을 유지한다. 따라서, IL-15/IL-15Rα를 발현하는 CD3-양성 세포가 CD8-양성 CD4-음성인 경우, 상기 세포는 IL-15 신호를 IL-15 수용체를 통해 자신의 세포로 전할 수 있다. 한편으로, IL-15/IL-15Rα를 발현하는 CD3-양성 세포는 IL-15 신호를 IL-15 수용체를 통해 다른 CD8-양성 CD4-음성 세포내로 전할 수 있다. 상술한 바와 같이, IL-15/IL-15Rα는 CD8-양성 CD4-음성 세포의 세포독성 활성을 유지할 수 있기 때문에, CAR에 의해 표적화된 세포에 대해 연속적인 세포독성 효과를 나타낼 것으로 예상된다.
IL-15/IL-15Rα는 막관통형 단백질 또는 분비형 단백질일 수 있다. IL-15Rα에서, 성숙한 단백질의 N-말단으로부터 1-65 아미노산의 IL-15 결합 도메인이 IL-15에의 결합을 담당하는 영역임이 공지되어 있다(Wei X. et al., J. Immunol., 167: 277-282, 2001). 따라서, 막관통형 단백질은 IL-15 결합 도메인을 유지하고 IL-15Rα의 막관통 도메인을 유지하는 단백질일 수 있다. 다른 한편으로, 분비형 단백질은 IL-15 결합 단백질을 유지하고 IL-15Rα의 막관통 도메인이 없는 단백질일 수 있다.
이격자를 IL-15/IL-15Rα의 IL-15와 IL-15Rα 사이에 통합시킬 수 있다. 이격자로서, 일반적으로 300 아미노산 이하, 바람직하게는 10 내지 100 아미노산, 가장 바람직하게는 20 내지 50 아미노산으로 이루어지는 펩티드가 사용될 수 있다. 그의 구체적인 예는 비제한적으로, GS 링커 등을 포함한다.
IL-15/IL-15Rα는 IL-15 및 IL-15Rα가 이격자를 통해 결합되는 펩티드인 한 특별히 제한되지 않으며, 그의 구체적인 예는 서열번호 8로 이루어지는 펩티드를 포함한다. IL-15/IL-15R는 상기가 IL-15 수용체에 결합하고 IL-15 신호를 세포내로 전할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 서열번호 8에 나타낸 아미노산과, 예를 들어 약 90% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 97% 이상, 특히 바람직하게는 약 98% 이상, 가장 바람직하게는 약 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 함유하는 펩티드를 언급할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, "상동성"은 2개의 아미노산 서열을 관련 기술 분야에 공지된 수학적 알고리즘을 사용하여 정렬시키는 최적 정렬 중의 모든 중복 아미노산 잔기에 대한 동일한 아미노산 및 유사한 아미노산 잔기의 비율(%)을 의미한다(바람직하게, 상기 알고리즘은 최적의 정렬을 위해 서열 중 하나 또는 둘 모두에 끊김(gap)을 도입시킬 수 있음이 고려된다). "유사한 아미노산"은 유사한 물리화학적 성질을 갖는 아미노산을 의미하며, 예를 들어 방향족 아미노산(Phe, Trp, Tyr), 지방족 아미노산(Ala, Leu, Ile, Val), 극성 아미노산(Gln, Asn), 염기성 아미노산(Lys, Arg, His), 산성 아미노산(Glu, Asp), 하이드록실기를 갖는 아미노산(Ser, Thr), 작은 측쇄를 갖는 아미노산(Gly, Ala, Ser, Thr, Met) 등과 같이 동일 그룹으로 분류되는 아미노산을 언급할 수 있다. 상기와 같은 유사한 아미노산에 의한 치환은 단백질의 표현형을 변화시키지 않는 것으로 예측된다(즉 보존적 아미노산 치환). 보존적 아미노산 치환의 구체적인 예는 기술 분야에 주지되어 있으며 다양한 문헌에 기재되어 있다(Bowie et al., Science, 247: 1306-1310 (1990)). 본 명세서에서 아미노산 서열의 상동성을 상동성 계산 알고리즘 NCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)를 사용하여 하기의 조건(기대값 =10; 끊김 허용; 매트릭스 = BLOSUM62; 필터링 = OFF) 하에서 계산할 수 있다.
키메라 항원 수용체 및/또는 IL-15/IL-15Rα를 본 발명의 제조 방법 또는 확대 배양 방법에서 배양된 CD3-양성 세포에서 발현시키는 경우, CAR 핵산 및/또는 IL-15/IL-15Rα 핵산을 세포(예를 들어 다능성 줄기세포)내에 도입시키는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 TCR 핵산을 도입시키는 방법과 동일한 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 제조 방법 또는 확대 배양 방법에서 배양되는 CD3-양성 세포가 다능성 줄기세포의 분화에 의해 수득되는 세포인 경우, 상기 다능성 줄기세포를 그 자체가 공지된 방법에 의해 CD3-양성 세포로 분화시킬 수 있다. 다능성 줄기세포의 CD3-양성 세포로의 구체적인 분화 방법은 예를 들어 WO 2016/076415 및 WO 2017/221975에 기재되어 있다. 다능성 줄기세포의 CD3-양성 세포로의 구체적인 분화 방법은 예를 들어 (1) 다능성 줄기세포의 조혈 전구세포로의 분화 공정, 및 (2) 조혈 전구세포의 CD3-양성 세포로의 분화 공정을 포함할 수 있다.
(1) 유도만능줄기세포의 조혈 전구세포로의 분화 공정
단계 (1)에서, 조혈 전구세포(HPC)는 CD34-양성 세포, 바람직하게는 CD34 양성 CD43-양성(DP) 세포를 의미한다. 단계 (1)에서, 조혈 전구세포 및 조혈 줄기세포는 구별되지 않으며 특별히 표시되지 않는 한 동일한 세포를 나타낸다.
다능성 줄기세포의 조혈 전구세포로의 분화 방법은 상기가 조혈 전구세포로의 분화를 야기할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 그의 예는, 예를 들어 WO 2013/075222, WO 2016/076415 및 문헌[Liu S. et al., Cytotherapy, 17 (2015); 344-358] 등에 기재된 바와 같은, 다능성 줄기세포를 조혈 전구세포의 유도 배지에서 배양함을 포함하는 방법을 포함한다.
단계 (1)에서, 조혈 전구세포로의 유도에 사용되는 배지는 특별히 제한되지 않는다. 동물 세포의 배양에 사용되는 배지는 기초 배지(basal medium)로 제조될 수 있다. 상기 기초 배지의 예는 비제한적으로, 둘베코 배지(예를 들어 IMDM), 이글 배지(예를 들어 DMEM, EMEM, BME, MEM, αMEM), 햄 배지(예를 들어 F10 배지, F12 배지), RPMI 배지(예를 들어 RPMI-1640 배지, RPMI-1630 배지), MCDB 배지(예를 들어 MCDB104, 107, 131, 151, 153 배지), 피셔 배지, 199 배지, 영장류 ES 세포용 배양 배지(영장류 ES/iPS 세포용 배양 배지, Reprocell), 마우스 ES 세포용 배지(TX-WES 배양 배지, Thromb-X), 무혈청 배지(mTeSR, Stemcell Technologies), ReproFF, StemSpan(등록상표) SFEM, StemSpan(등록상표) H3000, StemlineII, ESF-B 배지, ESF-C 배지, CSTI-7 배지, Neurobasal 배지(Life Technologies, Inc.), StemPro-34 배지, StemFit(등록상표)(예를 들어 StemFit AK03N, StemFit AK02N) 등을 포함한다. 더욱 또한, 이들 배지를 필요에 따라 혼합하여 사용할 수 있으며, 예를 들어 DMEM/F12 배지 등을 언급할 수 있다. 사용되는 기초 배지는 혈청을 함유하거나, 무혈청일 수 있다. 기초 배지에 10 내지 20% 혈청(소 태아 혈청(FBS), 인간 혈청, 말 혈청) 또는 혈청 대체물(KSR 등), 인슐린, 다양한 비타민, L-글루타민, 다양한 아미노산, 예를 들어 불필수 아미노산 등, 2-머캅토에탄올, 다양한 사이토카인(인터류킨(IL-2, IL-7, IL-15 등), SCF(줄기세포 인자), 액티빈 등), 다양한 호르몬, 다양한 성장인자(백혈병 억제 인자(LIF), 염기성 섬유아세포 상장인자(bFGF), TGF-β 등), 다양한 세포외 기질, 다양한 세포부착 분자, 항생제, 예를 들어 페니실린/스트렙토마이신, 퓨로마이신 등, pH 지시약, 예를 들어 페놀 레드 등 등을 적합하게 보충할 수 있다. 필요한 경우, 기초 배지는 비타민 C(예를 들어 아스코르브산), 알부민, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄 화합물(예를 들어 나트륨 셀레나이트), 지방산, 미량 원소, 2-머캅토에탄올, 티오글리세롤(예를 들어 α-모노티오글리세롤(MTG)), 지질, L-알라닐-L-글루타민(예를 들어 Glutamax(등록상표)), 성장인자, 저분자량 화합물, 항생제, 산화방지제, 피루브산, 완충제, 무기염 등을 또한 함유할 수 있다.
단계 (1)에서, "비타민 C"는 L-아스코르브산 및 그의 유도체를 의미하고, "L-아스코르브산 유도체"는 생체내에서 효소 반응에 의해 비타민 C로 되는 유도체를 의미한다. 단계 (1)에 사용되는 L-아스코르브산의 유도체의 예는 비타민 C 포스페이트, 아스코르브산 글루코사이드, 아스코르빌 에틸, 비타민 C 에스테르, 아스코르빌 테트라헥실데카노에이트, 아스코르빌 스테아레이트, 및 아스코르빌 2-포스페이트 6-팔미테이트를 포함한다. 비타민 C 포스페이트가 바람직하다. 비타민 C 포스페이트(예를 들어 아스코르브산 2-포스페이트)의 예는 L-아스코르브산 포스페이트의 염, 예를 들어 L-아스코르브산 포스페이트 Na 및 L-아스코르브산 포스페이트 Mg를 포함한다.
비타민 C가 사용되는 경우, 상기 비타민 C를 바람직하게는 4일마다, 3일마다, 2일마다 또는 매일 첨가한다(공급한다). 비타민 C를 보다 바람직하게는 매일 첨가한다. 하나의 구현예에서, 비타민 C를 바람직하게는 배지에 5 ng/㎖ 내지 500 ng/㎖에 상응하는 양(예를 들어 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 25 ng/㎖, 50 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 400 ng/㎖, 또는 500 ng/㎖에 상응하는 양)으로 첨가한다. 또 다른 구현예에서, 비타민 C를 배양 배지에 5 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖에 상응하는 양(예를 들어 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 300 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖에 상응하는 양)으로 첨가한다.
단계 (1)에서 사용되는 배지에 BMP4(골 형태발생 단백질 4), VEGF(혈관 내피 성장인자), SCF(줄기세포인자), TPO(혈소판자극인자), FLT-3L(Flt3 리간드) 및 bFGF(염기성 섬유아세포 성장인자)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 한 종류의 사이토카인을 추가로 보충할 수 있다. 보다 바람직하게는 배양물에 BMP4, VEGF 및 bFGF를 보충하고, 더욱 바람직하게는 배양물에 BMP4, VEGF, SCF 및 bFGF를 보충한다.
사이토카인이 사용되는 경우, 배지 중 그의 농도는 예를 들어 BMP4의 경우 5 ng/㎖ - 500 ng/㎖, VEGF의 경우 5 ng/㎖ - 500 ng/㎖, SCF의 경우 5 ng/㎖ - 500 ng/㎖, TPO의 경우 3 ng/㎖ - 300 ng/㎖, FLT-3L의 경우 1 ng/㎖ - 100 ng/㎖, 및 bFGF의 경우 5 ng/㎖ - 500 ng/㎖일 수 있다.
배지에 TGFβ 억제제를 보충할 수 있다. 상기 TGFβ 억제제는 TGFβ 패밀리의 신호전달을 방해하는 소분자 억제제이며, 예를 들어 SB431542, SB202190(둘 다 R.K. Lindemann et al., Mol. Cancer 2:20 (2003)), SB505124(GlaxoSmithKline), NPC30345, SD093, SD908, SD208(Scios), LY2109761, LY364947, LY580276(Lilly Research Laboratories) 등을 포함한다. 예를 들어, 상기 TGFβ 억제제가 SB431542인 경우, 배지 중 그의 농도는 바람직하게는 0.5 μM - 100 μM이다.
유도만능줄기세포를 부착 배양 또는 현탁 배양에 의해 배양할 수 있다. 부착 배양의 경우에, 배양을 세포외 기질 성분으로 코팅된 배양 용기에서 수행하고/하거나 피더(feeder) 세포와 공-배양할 수 있다. 상기 피더 세포는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 섬유아세포(마우스 배아 섬유아세포(MEF), 마우스 섬유아세포(STO) 등)를 언급할 수 있다. 피더 세포를 바람직하게는 그 자체가 공지된 방법, 예를 들어 방사선(감마선 등) 조사, 항암제(미토마이신 C 등) 처리 등에 의해 불활성화시킨다. 세포외 기질 성분으로서, 섬유성 단백질, 예를 들어 매트리겔(Niwa A, et al., PLoS One.6(7): e22261, 2011), 젤라틴, 콜라겐, 엘라스틴 등, 글루코스아미노글리칸 및 프로테오글리칸, 예를 들어 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트 등, 세포 부착 단백질, 예를 들어 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌 등 등을 언급할 수 있다.
현탁 배양은 배양 용기에 부착되지 않은 상태의 세포 배양을 의미하며 특별히 제한되지 않는다. 세포에 대한 부착성을 개선시키기 위해서, 인위적인 처리(예를 들어 세포외 기질 등에 의한 코팅 처리)가 없는 배양 용기, 또는 인위적인 부착 억제 처리(예를 들어 폴리하이드록시에틸 메트아크릴산(폴리-HEMA) 또는 비-이온성 표면-활성 폴리올(플루로닉 F-127 등)에 의한 코팅 처리)가 가해진 배양 용기가 사용될 수 있다. 현탁 배양에서, 배양체(EB)가 바람직하게 형성되고 배양된다.
조혈 전구세포를 또한 다능성 줄기세포의 배양에 의해 획득된 낭성 구조(또한 ES-낭 또는 iPS-낭으로서 지칭된다)로부터 제조할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, "낭성 구조"는 내막 세포집단 등에 의해 형성되는 다능성 줄기세포-유래된 3차원 낭상(내부에 공간이 있는) 구조이며, 그의 내부에 조혈 전구세포를 함유한다.
단계 (1)에서 온도 조건은 특별히 제한되지 않는다. 상기 온도는 예를 들어 약 37℃ 내지 약 42℃, 바람직하게는 약 37℃ 내지 약 39℃이다. 배양기간은 조혈 전구세포수 등을 모니터함으로써 당업자에 의해 적합하게 결정될 수 있다. 배양일수는 조혈 전구세포가 수득될 수 있는 한 제한되지 않는다. 배양기간의 예는 적어도 6일, 7일 이상, 8일 이상, 9일 이상, 10일 이상, 11일 이상, 12일 이상, 13일 이상, 및 14일 이상을 포함한다. 배양기간은 바람직하게는 14일이다. 보다 긴 배양기간은 일반적으로 조혈 전구세포의 제조에 문제가 되지 않지만, 바람직하게는 35일 이하, 보다 바람직하게는 21일 이하이다. 배양을 저-산소 조건하에서 수행할 수 있으며, 본 명세서에서 저-산소 조건은 예를 들어 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5% 또는 그 미만의 산소 농도를 의미한다.
(2) 조혈 전구세포의 CD3-양성 세포로의 분화 단계
조혈 전구세포를 CD3-양성 세포로 분화시키는 방법은 상기 방법이 조혈 전구세포를 CD3-양성 세포로 분화시킬 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 그의 예는 조혈 전구세포를 WO 2016/076415, WO 2017/221975 등에 기재된 바와 같이, 조혈 전구세포로부터 T 세포를 유도하는 방법의 경우와 동일한 배양 조건하에서 배양하는 방법을 포함한다.
단계 (2)에서, CD3-양성 T 세포로의 분화 유도 배지는 특별히 제한되지 않으며, 동물 세포의 배양에 사용되는 배지를 기초 배지로 제조할 수 있다. 상기 기초 배지의 예는 상기 언급한 단계 (1)에 사용된 기초 배지와 유사한 것을 포함한다. 상기 배지는 혈청을 함유하거나, 무-혈청일 수 있다. 필요한 경우, 기초 배지는 비타민 C(예를 들어 아스코르브산), 알부민, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄 화합물(예를 들어 나트륨 셀레나이트), 지방산, 미량 원소, 2-머캅토에탄올, 티오글리세롤(예를 들어 α-모노티오글리세롤(MTG)), 지질, 아미노산, L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민(예를 들어 Glutamax(등록상표)), 불필수 아미노산, 비타민, 성장인자, 저분자량 화합물, 항생제(예를 들어 페니실린, 스트렙토마이신), 산화방지제, 피루브산, 완충제, 무기염, 사이토카인 등을 또한 함유할 수 있다.
비타민 C가 단계 (2)에서 사용되는 경우, 상기 비타민 C는 단계 (2-1)에 기재된 바와 동일할 수 있으며 유사하게 첨가될 수 있다. 하나의 구현예에서, 배지 또는 배양 배지 중 비타민 C의 농도는 바람직하게는 5 ㎍/㎖ - 200 ㎍/㎖이다. 또 다른 구현예에서, 비타민 C를 배양 배지에 5 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖에 상응하는 양(예를 들어 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 300 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖에 상응하는 양)으로 첨가한다.
단계 (2)에서, p38 억제제 및/또는 SDF-1(기질 세포-유래된 인자 1)이 바람직하다. 본 명세서에서, "p38 억제제"는 p38 단백질(p38 MAP 키나제)의 기능을 억제하는 물질을 의미한다. 그의 예는 비제한적으로 p38의 화학적 억제제, p38의 우성-음성 돌연변이체 또는 이를 암호화하는 핵산 등을 포함한다.
단계 (2)에 사용되는 p38의 화학적 억제제의 예는 비제한적으로 SB203580(4-(4-플루오로페닐)-2-(4-메틸설포닐페닐)-5-(4-피리딜)-1H-이미다졸) 및 그의 유도체, SB202190(4-(4-플루오로페닐)-2-(4-하이드록시페닐)-5-(4-피리딜)-1H-이미다졸) 및 그의 유도체, SB239063(트랜스-4-[4-(4-플루오로페닐)-5-(2-메톡시-4-피리미디닐)-1H-이미다졸-1-일]사이클로헥사놀) 및 그의 유도체, SB220025 및 그의 유도체, PD169316, RPR200765A, AMG-548, BIRB-796, SClO-469, SCIO-323, VX-702 및 FR167653을 포함한다. 이들 화합물을 상업적으로 입수할 수 있으며, 예를 들어 SB203580, SB202190, SB239063, SB220025 및 PD169316을 Calbiochem으로부터 입수할 수 있고, SClO-469 및 SCIO-323을 Scios 등으로부터 입수할 수 있다. p38의 화학적 억제제는 바람직하게는 SB203580(4-(4-플루오로페닐)-2-(4-메틸설포닐페닐)-5-(4-피리딜)-1H-이미다졸) 또는 그의 유도체이다.
단계 (2)에서 p38의 우성-음성 돌연변이체의 예는 p38의 DNA 결합 영역 중에 위치한 180번 위치 쓰레오닌의 알라닌으로의 점 돌연변이에 의해 수득된 p38T180A, 인간 및 마우스 중의 p38의 182번 위치의 티로신의 페닐알라닌으로의 점 돌연변이에 의해 수득된 p38Y182F 등을 포함한다. 상기 p38 억제제는 배지 중에 예를 들어 약 1 μM - 약 50 μM로 함유된다. SB203580이 P38 억제제로서 사용되는 경우, 상기는 배지 중에 1 μM - 50 μM, 5 μM - 30 μM, 10 μM - 20 μM로 함유될 수 있다.
단계 (2)에서 SDF-1은 SDF-1α 또는 그의 성숙한 형태뿐만 아니라, SDF-1β, SDF-1γ, SDF-1δ, SDF-1ε, SDF-1φ 등과 같은 동형 또는 그의 성숙한 형태, 또는 임의의 비의 이들의 혼합물 등일 수 있다. 바람직하게는 SDF-1α가 사용된다. SDF-1을 때때로 CXCL-12 또는 PBSF라 칭한다.
단계 (2)에서, SDF-1의 아미노산 서열 중 하나 또는 다수의 아미노산을, 상기가 케모카인으로서 활성을 갖는 한 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입할 수 있다(상기와 같은 아미노산의 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입을 갖는 SDF-1을 또한 "SDF-1 돌연변이체"라 칭한다). 유사하게, 당쇄를 SDF-1 또는 SDF-1 돌연변이체에서 치환, 결실 및/또는 첨가할 수 있다. 상기 언급한 SDF-1의 돌연변이체의 예는 적어도 4 시스테인 잔기(인간 SDF-1α에서 Cys30, Cys32, Cys55 및 Cys71)를 유지하고 천연 물질의 아미노산 서열과 90% 이상의 일치성을 갖는 것을 포함하나, 상기 아미노산 돌연변이에 대한 제한은 없다. SDF-1을 포유동물, 예를 들어 인간 또는 비-인간 포유동물, 예를 들어 원숭이, 양, 소, 말, 돼지, 개, 고양이, 토끼, 래트, 마우스 등으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, GenBank 수납 번호:NP_954637로서 등록된 단백질을 인간 SDF-1α로서 사용할 수 있으며 GenBank 수납 번호:NP_000600으로서 등록된 단백질을 SDF-1β로서 사용할 수 있다.
SDF-1을 상업적으로 입수하거나, 자연으로부터 정제하거나 또는 펩티드 합성 또는 유전공학 기법에 의해 제조할 수 있다. SDF-1은 배지 중에, 예를 들어 약 10 ng/㎖ 내지 약 100 ng/㎖의 범위이내로 함유된다. 또한, SDF-1-유사 활성을 갖는 SDF-1 대체물을 또한 SDF-1 대신에 사용할 수 있다. 상기와 같은 SDF-1 대체물의 예는 CXCR4 작용물질을 포함하며, CXCR4 작용물질 활성을 갖는 저분자량 화합물 등을 SDF-1 대신에 배지에 첨가할 수 있다.
단계 (2)에 사용된 배양 배지에 SCF, TPO(혈소판자극인자), FLT-3L 및 IL-7로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 한 종류, 바람직하게는 모든 사이토카인을 추가로 보충한다. 이들의 농도는 예를 들어 SCF의 경우 10 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖, TPO의 경우 10 ng/㎖ 내지 200 ng/㎖, IL-7의 경우 1 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖, 및 FLT-3L의 경우 1 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖이다.
단계 (2)에서, 조혈 전구세포를 부착 배양 또는 현탁 배양에 의해 배양할 수 있다. 부착 배양의 경우에, 코팅된 배양 용기를 사용할 수 있고/있거나 조혈 전구세포를 피더 세포 등과 공-배양할 수 있다. 상기 공-배양을 위한 피더 세포의 예는 골수 기질 세포주, OP9 세포(Riken BioResource Center로부터 입수할 수 있다)를 포함한다. OP9 세포는 바람직하게는, DLL4 또는 DLL1을 꾸준하게 발현하는 OP9-DL4 세포 또는 OP9-DL1 세포이다(예를 들어 Holmes R I and Zuniga-Pflucker J C. Cold Spring Harb Protoc. 2009(2)). 단계 (2)에서, OP9 세포를 피더 세포로서 사용하는 경우에, DLL1 또는 별도로 제조된 DLL4 또는 DLL1, 또는 DLL4 또는 DLL1과 Fc 등의 융합 단백질을 배지에 첨가하여 공-배양을 수행할 수 있다. 피더 세포를 사용하는 경우, 상기 피더 세포를 바람직하게는 배양 중에 적합하게 교환할 수 있다. 상기 피더 세포의 교환은 예비 도말된 피더 세포상에서 배양된 대상 세포를 이입시킴으로써 수행된다. 상기 교환은 5일마다, 4일마다, 3일마다, 또는 2일마다 수행될 수 있다. 조혈 전구세포를 배양체의 현탁 배양에 의해 수득하는 경우, 상기 세포를 단세포로 해리 후에 부착 배양을 수행하는 것이 바람직하다. 상기 세포를 피더 세포와 공-배양할 수 있지만, 배양을 바람직하게는 피더 세포 사용 없이 수행한다.
부착 배양의 경우 및 배양 용기가 코팅되는 경우에, 코팅제의 예는 매트리겔(Niwa A, et al. PLos One, 6(7):e22261, 2011), 콜라겐, 젤라틴, 라미닌, 헤파란 황산 프로테오글리칸, 레트로넥틴, DLL4 또는 DLL1, 또는 DLL4 또는 DLL1, 및 항체의 Fc 영역(이후 때때로 Fc라 칭한다) 등의 융합 단백질(예를 들어 DLL4/Fc 키메라), 엔탁틴 및/또는 이들의 조합, 및 레트로넥틴 및 DLL4 및 Fc 등의 융합 단백질의 조합이 바람직하다.
단계 (2)에서, 배양 온도 조건은 제한되지 않는다. 상기 온도는 예를 들어 약 37℃ 내지 약 42℃, 바람직하게는 약 37℃ 내지 약 39℃이다. 배양 기간은 CD3-양성 세포의 수 등을 모니터함으로써 당업자에 의해 적합하게 결정될 수 있다. 배양일수는 CD3-양성 세포가 수득될 수 있는 한 제한되지 않는다. 배양기간의 예는 적어도 10일 이상, 12일 이상, 14일 이상, 16일 이상, 18일 이상, 20일 이상, 22일 이상, 및 23일 이상을 포함한다. 배양기간은 바람직하게는 21일이다. 또한, 90일 이하가 바람직하며, 42일 이하가 보다 바람직하다.
상기 단계에 의해 수득되는 세포는 CD3-양성 세포를 포함한다. 다능성 줄기세포를 CD3-양성 세포로 분화시키기 위한 구체적인 방법은 하기 단계 (3)을 추가로 포함할 수 있다.
(3) CD3-양성 CD8-양성 CD4-음성 세포(또는 CD3-양성 CD8-양성 CD4-음성 CD30-양성 세포) 수득 단계 또는 CD3-양성 세포 풍부화 단계
CD3-양성 CD8-양성 CD4-음성 세포(또는 CD3-양성 CD8-양성 CD4-음성 CD30-양성 세포)의 수득 방법의 예는 WO 2016/076415, WO 2017/221975 등에 기재된 방법을 포함한다. CD3-양성 세포를 또한 유사한 방법을 사용하여 풍부화할 수 있다.
단계 (3)에서, CD3-양성 CD8-양성 CD4-음성 세포(또는 CD3-양성 CD8-양성 CD4-음성 CD30-양성 세포)의 수득 또는 CD3-양성 세포의 풍부화에 사용되는 배지는 특별히 제한되지 않으며, 동물 세포의 배양에 사용되는 배지를 기초 배지로 제조할 수 있다. 상기 기초 배지의 예는 상기 언급한 단계 (1)에 사용된 기초 배지와 유사한 것을 포함한다. 상기 배지는 혈청을 함유하거나 무혈청일 수 있다. 필요한 경우, 상기 기초 배지는 비타민 C(예를 들어 아스코르브산), 알부민, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄 화합물(예를 들어 나트륨 셀레나이트), 지방산, 미량 원소, 2-머캅토에탄올, 티오글리세롤(예를 들어 α-모노티오글리세롤(MTG)), 지질, 아미노산, L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민(예를 들어 Glutamax(등록상표)), 불필수 아미노산, 비타민, 성장인자, 저분자량 화합물, 항생제(예를 들어 페니실린, 스트렙토마이신), 산화방지제, 피루브산, 완충제, 무기염, 사이토카인, 호르몬 등을 또한 함유할 수 있다.
비타민 C가 단계 (3)에서 사용되는 경우, 상기 비타민 C는 단계 (1)에 기재된 바와 동일할 수 있으며 유사하게 첨가될 수 있다. 하나의 구현예에서, 배지 또는 배양 배지 중 비타민 C의 농도는 바람직하게는 5 ㎍/㎖ - 200 ㎍/㎖이다. 또 다른 구현예에서, 비타민 C를 배양 배지에 5 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖에 상응하는 양(예를 들어 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 300 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖에 상응하는 양)으로 첨가한다.
호르몬을 단계 (3)에 사용하는 경우, 상기 호르몬의 예는 코르티코스테로이드를 포함한다. 코르티코스테로이드는 글루코코르티코이드 또는 그의 유도체이며, 코르티손 아세테이트, 하이드로코르티손, 플루드로코르티손 아세테이트, 프레도니솔론, 트리암시놀론, 메틸프레드니솔론, 덱사메타손, 베타메타손 및 베클로메타손 디프로피오네이트가 예시된다. 덱사메타손이 바람직하다. 코르티코스테로이드가 덱사메타손인 경우, 배지 중 그의 농도는 1 nM - 100 nM이다.
단계 (3)에서, 배지는 CD3/TCR 복합체 작용물질을 함유한다. 상기 CD3/TCR 복합체 작용물질은 상기가 CD3/TCR 복합체의 적어도 일부에 특이적으로 결합함으로써 CD3/TCR 복합체로부터 CD3-양성 세포로 신호를 전달할 수 있는 분자인 한 특별히 제한되지 않는다. CD3/TCR 복합체 작용물질의 예는 CD3 작용물질 및/또는 TCR 작용물질을 포함한다. CD3 작용물질로서, 항-CD3 작용물질 항체 또는 그의 결합 단편을 언급할 수 있으며, TCR 작용물질로서, 항-TCR 작용물질 항체 또는 그의 결합 단편, MHC/항원 펩티드 복합체 또는 그의 다량체, 및 MHC/초항원 복합체 또는 그의 다량체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나를 언급할 수 있다. 항-CD3 작용물질 항체가 사용되는 경우, 상기 항-CD3 작용물질 항체는 다클론 항체 및 단클론 항체를 모두 포함하며, 단클론 항체가 바람직하다. 상기 항체는 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE 중 임의의 면역글로불린 부류에 속할 수 있으며, IgG가 바람직하다. 항-CD3 작용물질 항체로서, OKT3 클론으로부터 생성된 항체(OKT3), UCHT1 클론으로부터 생성된 항체(UCHT1) 등을 언급할 수 있으며, UCHT1이 바람직하다. 상기 항-CD3 작용물질 항체가 OKT3인 경우, OKT3는 중쇄 가변 영역 중의 상보성 결정 영역 1 - 3으로서 RYTMH(서열번호 9), YINPSRGYTNYNQKFKD(서열번호 10), 및 YYDDHYCLDY(서열번호 11), 및 경쇄 가변 영역 중의 상보성 결정 영역 1 - 3으로서 SASSSVSYMN(서열번호 12), DTSKLAS(서열번호 13), 및 QQWSSNPFT(서열번호 14)를 포함한다. 또한, OKT3는 바람직하게는 서열번호 21에 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 22에 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 상기 항-CD3 작용물질 항체가 UCHT1인 경우, UCHT1은 중쇄 가변 영역 중의 상보성 결정 영역 1 - 3으로서 GYSFTGYTMN(서열번호 15), LINPYKGVST(서열번호 16), 및 SGYYGDSDWYFDV(서열번호 17), 및 경쇄 가변 영역 중의 상보성 결정 영역 1 - 3으로서 RASQDIRNYLN(서열번호 18), YTSRLHS(서열번호 19), 및 QQGNTLPWT(서열번호 20)을 포함한다. 또한, UCHT1은 바람직하게는 서열번호 23에 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 24에 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 배지 중 항-CD3 작용물질 항체의 농도는 예를 들어 10 ng/㎖ - 1000 ng/㎖, 바람직하게는 50 ng/㎖ - 800 ng/㎖, 보다 바람직하게는 250 ng/㎖ - 600 ng/㎖이다.
사이토카인이 단계 (3)에 사용되는 경우, IL-2 및 IL-7 등을 사이토카인으로서 언급할 수 있다. 사이토카인이 IL-2인 경우, 배지 중의 그의 농도는 10 U/㎖ - 1000 U/㎖이고, 상기가 IL-7인 경우 배지 중의 그의 농도는 1 ng/㎖ - 1000 ng/㎖이다.
단계 (3)에서, 배양 온도 조건은 특별히 제한되지 않는다. 상기 온도는 예를 들어 약 37℃ 내지 약 42℃, 바람직하게는 약 37℃ 내지 약 39℃이다. 배양 기간은 CD3-양성 세포의 수 등을 모니터함으로써 당업자에 의해 적합하게 결정될 수 있다. 배양일수는 CD3-양성 세포가 수득될 수 있는 한 제한되지 않는다. 배양기간의 예는 예를 들어 적어도 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 및 바람직하게는 6일 이상이다. 상기는 바람직하게는 28일 이하, 보다 바람직하게는 14일 이하이다.
상술한 바와 같이, 다능성 줄기세포를 분화시킴으로써, 본 발명의 제조 방법 또는 확대 배양 방법에 의해 배양되는 CD3-양성 세포를 수득할 수 있다.
본 발명의 제조 방법 또는 확대 배양 방법은 CD3/TCR 복합체 작용물질, 피브로넥틴 또는 그의 변이체, 및 CD30 작용물질의 존재하에서 CD3-양성 세포를 배양하는 단계(이후부터 본 발명의 단계 (I)로서 지칭한다)를 포함한다.
본 발명의 단계 (I)에서, CD3/TCR 복합체 작용물질은 단계 (3)에서 사용된 CD3/TCR 복합체 작용물질과 동일할 수 있다.
본 발명의 단계 (I)(또는 단계 (3))에서, 상기 사용되는 CD3/TCR 복합체 작용물질이 항-CD3 작용물질 항체 또는 항-TCR 항체인 경우, 그의 다클론 항체를 예를 들어 하기의 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, CD3에 대한 다클론 항체의 경우에, 포유동물, 예를 들어 토끼, 마우스, 래트, 염소, 기니피그, 햄스터 등을, 면역화 항원으로서 CD3 또는 그의 에피토프를 함유하는 부분 펩티드(예를 들어 γ, δ, ε, ζη 쇄) 및 완전 또는 불완전 프로인트 항원보강제(FCA 또는 FIA)의 혼합물로 면역시키며(초기 면역화로부터 약 1 내지 4주마다 1 내지 수회 추가면역시킨다), TCR에 대한 다클론 항체의 경우에, 상기 포유동물을, 면역화 항원으로서 TCR 또는 그의 에피토프를 함유하는 부분 펩티드(예를 들어 α, β, γδ 쇄) 및 완전 또는 불완전 프로인트 항원보강제(FCA 또는 FIA)의 혼합물로 면역시킨다. 각각의 추가적인 면역화 후 약 3 내지 10일째에, 부분 채혈된 혈청의 항체 역가를 통상적으로 공지된 항원-항체 반응을 사용하여 측정하고, 그의 증가를 확인한다. 또한, 최종 면역화 후 약 3 내지 10일째에, 전혈을 채혈하고 항혈청을 정제시킨다. 상기 다클론 항체를 또한 통상적인 분리 기법, 예를 들어 염석(예를 들어 황산 암모늄 분획화), 원심분리, 투석 및 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 단일 면역글로불린 부류로서 정제시킬 수 있다.
본 발명의 단계 (I)(또는 단계 (3))에 사용되는 항-CD3 작용물질 항체 또는 항-TCR 항체가 단클론 항체인 경우에, 상기 단클론 항체를 일반적으로는 세포 융합에 의해 제조된 하이브리도마(융합 세포)로부터 수득할 수 있다. 즉, 상기 언급한 다클론 항체에서와 같이, 상기를 CD3 또는 TCR 또는 그의 에피토프를 함유하는 부분 펩티드에 면역감작된 포유동물로부터 항체-생산 세포를 단리하고, 이를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마를 형성시키고, 상기 하이브리도마를 클로닝하고, CD3 또는 TCR에 대해 특이적인 친화성을 나타내는 항체를 생산하는 클론을 마커 항원으로서 선택함으로써 제조할 수 있다. 또한, CD3를 배양 배지 중에서 미리 단리한 비장세포 또는 림프구와 반응시킴으로써 생성된 항체-생산 세포를 또한 사용할 수 있다. 이 경우에, 인간-유래된 항체-생산 세포를 또한 제조할 수 있다.
단클론 항체를 분비하는 하이브리도마를 문헌[Kohler and Milstein, Nature, Vol. 256, pp. 495-497, 1975]의 방법 또는 그의 변형 방법에 따라 제조할 수 있다. 즉, 단클론 항체를, 상술한 바와 같이 면역감작된 동물로부터 수득된 비장세포, 흉선세포, 림프절 세포, 말초 림프구, 골수종 세포 또는 편도세포, 바람직하게는 비장세포 중에 함유된 항체-생산 세포를, 바람직하게는 동종이계 포유동물, 예를 들어 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터, 토끼 또는 인간, 보다 바람직하게는 마우스, 래트 또는 인간의 골수종 세포와 융합시킴으로써 수득된 하이브리도마를 배양함으로써 제조한다. 배양을 시험관내에서 또는 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터, 토끼, 바람직하게는 마우스 또는 래트와 같은 포유동물 중에서, 보다 바람직하게는 마우스의 복강내에서, 생체내에서 수행할 수 있으며, 상기 항체를 배양 상등액 또는 포유동물의 복수로부터 수득할 수 있다.
세포 융합에 사용되는 골수종 세포의 예는 마우스-유래된 골수종(예를 들어 P3-NSI-1-Ag4-1, P3-X63-Ag8-U1, P3-X63-Ag8-653, SP2/0-Ag14, BW5147 등), 래트-유래된 골수종(예를 들어 210RCY3-Ag1.2.3 등), 인간-유래된 골수종(예를 들어 U-266AR1, GML500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11 및 CEM-T15 등) 등을 포함한다.
상기 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 클론을, 예를 들어 미세적정 플레이트에서 하이브리도마를 배양하고 웰 중의 증식을 나타내는 배양 상등액의 CD3에 대한 반응성을 방사성면역분석, 효소 면역분석, 형광 면역분석 등에 의해 측정함으로써 선별할 수 있다.
상기 단클론 항체의 단리 및 정제를, 상술한 방법에 의해 제조된 항체-함유 배양 상등액 또는 복수에 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 컬럼 크로마토그래피, 예를 들어 항-면역글로불린 컬럼 또는 단백질 G 컬럼을 가하여 수행할 수 있다.
본 발명의 단계 (I)(또는 단계 (3))에 사용된 단클론 항체를 상기 제조 방법에 대한 제한 없이는 어떠한 방법으로도 수득할 수 없다. 단클론 항체는 일반적으로 면역감작되는 포유동물의 종류에 따라 상이한 구조를 갖는 당쇄를 갖지만, 본 발명에서 상기 단클론 항체는 상기 당쇄의 구조 차이에 의해 제한되지 않으며 임의의 포유동물로부터 유래된 단클론 항체를 포함한다.
상기 항-CD3 작용물질 항체 또는 항-TCR 항체는 다클론 항체, 천연 항체, 예를 들어 단클론 항체(mAb), 유전자 재조합 기술을 사용하여 제조할 수 있는 키메라 항체(인간화된 항체), 단일가닥 항체, 및 이들 항체의 결합 단편을 포함한다. 항체의 결합 단편은 특이적인 결합 활성을 갖는 항체의 일부 영역을 의미하며, 구체적으로 Fab, Fab', F(ab')2, scAb, scFv, scFv-Fc 등을 포함한다.
또한, 당해 분야의 숙련가는 항-CD3 작용물질 항체 또는 항-TCR 항체 또는 그의 결합 단편과 다른 펩티드 또는 단백질, 또는 변형제가 결합된 변형된 항체와의 융합 항체를 제조할 수 있다. 융합에 사용되는 다른 펩티드 및 단백질은 상기 항체의 결합 활성을 감소시키지 않는 한 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 인간 혈청 알부민, 다양한 태그 펩티드, 인공 나선 동기 펩티드, 말토스 결합 단백질, 글루타치온 S 트랜스퍼라제, 다양한 독소, 기타 다량체화를 촉진할 수 있는 펩티드 또는 단백질 등을 언급할 수 있다. 상기 변형에 사용되는 변형제는 상기 항체의 결합 활성을 감소시키지 않는 한 특별히 제한되지 않으며, 그의 예는 폴리에틸렌 글리콜, 당쇄, 인지질, 리포솜, 저분자량 화합물 등을 포함한다.
항-CD3 작용물질 항체로서, 구입할 수 있는 시약을 또한 사용할 수 있다. 구입할 수 있는 항-CD3 작용물질 항체는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 OKT3 클론으로부터 생성된 항체(OKT3)(정제된 항-인간 CD3 기능성 등급(클론: OKT3)(eBioscience)), UCHT1 클론으로부터 생성된 항체(UCHT1)(CD3 항체(클론: UCHT1)(GeneTex)) 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 UCHT1을 사용할 수 있다.
본 발명의 단계 (I)(또는 단계 (3))에 사용된 CD3/TCR 복합체 작용물질이 MHC/항원 펩티드 복합체인 경우에, 상기 MHC/항원 펩티드 복합체는 CD3-양성 세포의 CD3/TCR 복합체에 의해 특이적으로 인식되는 분자인 한 특별히 제한되지 않으며, 상기 분자는 CD3-양성 세포에 신호를 전할 수 있다.
MHC/항원 펩티드 복합체를 구성하는 MHC는 I 부류 MHC 또는 II 부류 MHC, 바람직하게는 I 부류 MHC일 수 있다.
본 발명의 단계 (I)(또는 단계 (3))에서, I 부류 MHC는 항원 펩티드와 복합체를 형성하고, CD3/TCR 복합체 및 CD8에 의해 인식되며, CD3-양성 세포로 신호를 전하는 분자인 한 특별히 제한되지 않는다. I 부류 MHC는 예를 들어 α 쇄(인간의 경우 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F 또는 HLA-G, 마우스의 경우 H-2K, H-2D 또는 H-2L) 및 β2 미세글로불린으로 구성된 이량체, 바람직하게는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F 또는 HLA-G, 및 β2 미세글로불린으로 구성된 이량체, 보다 바람직하게는 HLA-A, HLA-B 또는 HLA-C, 및 β2 미세글로불린으로 구성된 이량체이다. 본 발명의 제조 방법 또는 확대 배양 방법에서, I 부류 MHC의 구체적인 예는 비제한적으로 HLA-A*02:01, HLA-A*24:02, HLA-A*01:01 등을 포함한다. 항원 펩티드는 I 부류 MHC에 의헤 제시된 펩티드인 한 특별히 제한되지 않는다. I 부류 MHC에 의해 제시된 항원 펩티드로서, 예를 들어 HER-2/neu, MART-1, NY-ESO-1, Gp-100, MUC-1, p53, 전립선-특이 항원(PSA), hTERT, WT1, 설비빈, CEA, MAGE-3, 악성 종양의 발생과 강하게 관련된 바이러스 그룹으로부터 유래된 단백질로부터 유래된 펩티드 등을 언급할 수 있으며, WT1-유래된 펩티드가 바람직하다. 구체적인 WT1-유래된 펩티드로서, RMFPNAPYL(서열번호 1), SLGEQQYSV(서열번호 2), CMTWNQMNL(서열번호 3)(그의 변형된 펩티드 CYTWNQMNL(서열번호 4)) 등을 언급할 수 있다.
본 발명의 단계 (I)(또는 단계 (3))에서, II 부류 MHC는 항원 펩티드와 복합체를 형성하고 CD3/TCR 복합체 및 CD4에 의해 인식되며, CD3-양성 세포로 신호를 전하는 분자인 한 특별히 제한되지 않는다. II 부류 MHC는 예를 들어 인간의 경우 HLA-DR, HLA-DQ 또는 HLA-DP, 및 마우스의 경우 H-2A 또는 H-2B이며, 이들은 각각 α쇄 및 β쇄로 구성된 이량체(예를 들어 HLA-DR은 α쇄로서 HLA-DRA 및 β쇄로서 HLA-DRB1으로 구성된다), 바람직하게는 HLA-DR, HLA-DQ 또는 HLA-DP이다. 상기 항원 펩티드는 II 부류 MHC에 의해 제시된 펩티드인 한 특별히 제한되지 않는다. 상기 II 부류 MHC에 의해 제시된 항원 펩티드로서, 예를 들어 WT1, PSA, MAGE-3, CEA, 설비빈, 티로시나제, 악성 종양의 발생과 강하게 관련된 바이러스 그룹으로부터 유래된 단백질로부터 유래된 펩티드를 언급할 수 있으며, WT1-유래된 펩티드가 바람직하다.
MHC 및/또는 항원 펩티드(이후에 MHC 등으로서 기재된다)는 화학적으로 합성된 단백질 또는 무세포 번역 시스템에서 생화학적으로 합성된 단백질일 수 있다. 한편으로, 상기 단백질은 MHC 등을 암호화하는 염기 서열을 갖는 핵산을 통합하는 형질전환체로부터 생성된 재조합 단백질일 수 있다.
MHC 등이 공지된 펩티드 합성 방법에 따라 제조되는 경우, 예를 들어 고상 합성 방법 및 액상 합성 방법 중 어느 하나를 사용할 수 있다. 카복시기에 부착된 보호기 및 측쇄의 작용기를 갖는 아미노산 유도체, 및 보호된 아미노기 및 측쇄의 보호된 작용기를 갖는 아미노산 유도체를 축합시키고, 상기 보호기를 제거함으로써 목적하는 단백질을 제조할 수 있다.
축합 및 보호기의 제거를 그 자체로서 공지된 방법, 예를 들어 하기 (1) - (5)에 기재된 방법에 따라 수행한다.
(1) M. Bodanszky and M.A. Ondetti: Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
(2) Schroeder and Luebke: The Peptide, Academic Press, New York (1965)
(3) Nobuo Izumiya, et al.: Peptide Gosei-no-Kiso to Jikken (Basics and experiments of peptide synthesis), published by Maruzen Co. (1975)
(4) Haruaki Yajima and Shunpei Sakakibara: Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experiment) 1, Tanpakushitsu no Kagaku (Chemistry of Proteins) IV, 205 (1977)
(5) Haruaki Yajima, ed.: Zoku Iyakuhin no Kaihatsu (A sequel to Development of Pharmaceuticals), Vol. 14, Peptide Synthesis, published by Hirokawa Shoten.
상기와 같이 수득된 MHC 등을 공지된 정제 방법에 의해 정제하거나 단리할 수 있다. 여기에서, 정제 방법의 예로서, 용매 추출, 증류, 컬럼 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 재결정, 이들의 조합 등을 언급할 수 있다.
상기와 같이 수득된 MHC 등이 유리 형태인 경우, 상기 유리 형태를 공지된 방법 또는 이에 준하는 방법에 의해 적합한 염 형태로 전환시킬 수 있으며, 다른 한편으로, 상기 MHC 등이 염의 형태로 수득되는 경우, 상기를 공지된 방법 또는 이에 준하는 방법에 의해 유리 형태 또는 상이한 염의 형태로 전환시킬 수 있다.
더욱 또한, MHC 등을 또한, 암호화 핵산을 포함하는 형질전환체를 배양하고 상기 수득된 배양물로부터 MHC 등을 분리 및 정제함으로써 제조할 수 있다. MHC 등을 암호화하는 핵산은 DNA 또는 RNA, 또는 DNA/RNA 키메라, 및 바람직하게는 DNA일 수 있다. 또한, 상기 핵산은 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 이중 가닥의 경우에, 이중 가닥 DNA, 이중 가닥 RNA 또는 DNA:RNA 하이브리드를 사용할 수 있다. 단일 가닥의 경우에, 상기는 센스 가닥(즉 암호화 가닥) 또는 안티센스 가닥(즉 비-암호화 가닥)일 수 있다.
상기 MHC 등을 암호화하는 DNA의 예는 게놈 DNA, 온혈 동물(예를 들어 인간, 소, 원숭이, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이, 기니피그, 래트, 마우스, 토끼, 햄스터, 새 등)의 세포로부터 유래된 cDNA, 합성 DNA 등을 포함한다. MHC 등을 암호화하는 cDNA를, 주형으로서 상기 동물 중 임의의 세포로부터 제조된 전체 RNA 또는 mRNA 분획[예를 들어 간세포, 비장세포, 신경세포, 신경교세포, 췌장 β 세포, 골수세포, 혈관사이세포, 랑게르한스세포, 표피세포, 상피세포, 배세포, 내피세포, 평활근세포, 섬유아세포, 섬유세포, 근세포, 지방세포, 면역세포(예를 들어 대식세포, T 세포, B 세포, 자연살해세포, 비만세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 단핵구), 거핵구, 활막세포, 연골세포, 골세포, 골아세포, 파골세포, 유선세포, 간세포, 간질세포, 또는 그의 상응하는 전구세포, 줄기세포 또는 암세포 등] 또는 이들 세포가 존재하는 임의의 조직[예를 들어 뇌 또는 뇌의 임의의 부분(예를 들어 후구, 편도핵, 대뇌기저핵, 해마, 시상, 시상하부, 대뇌피질, 연수, 소뇌), 척수, 하수체, 위, 췌장, 신장, 간, 생식샘, 갑상선, 담낭, 골수, 부신, 피부, 폐, 소화관(예를 들어 대장 및 소장), 혈관, 심장, 흉선, 비장, 이하선, 말초혈액, 전립선, 고환, 난소, 태반, 자궁, 골, 관절, 지방조직(예를 들어 갈색 지방조직, 백색 지방조직), 골격근 등]을 사용하는 폴리머라제 쇄 반응(이후에 "PCR 방법"으로서 약기함)에 의해, 및 폴리머라제 쇄 반응(이후에 "PCR 방법"으로서 약기함) 및 역전사효소-PCR(이후에 "RT-PCR 방법"으로서 약기함)에 의해 직접 증폭시킬 수 있다. 한편으로, MHC 등을 암호화하는 cDNA를 또한, 상기 언급한 전체 RNA 또는 mRNA의 단편을 적합한 벡터에 삽입함으로써 제조된 cDNA 라이브러리로부터 콜로니 또는 플라크 하이브리드(plaque hybridization) 방법 또는 PCR 방법 등에 의해 클로닝할 수 있다. 상기 라이브러리에 사용되는 벡터는 박테리오파지, 플라스미드, 코스미드, 파지미드 등 중 어느 하나일 수 있다.
MHC 등을 암호화하는 DNA를, 상기 MHC 등을 암호화하는 염기 서열의 일부를 갖는 합성된 DNA 프라이머를 PCR 방법에 의해 증폭시키거나, 또는 적합한 발현 벡터내에 통합된 DNA를 MHC 등의 일부 또는 전체 영역을 암호화하는 표지된 DNA 단편 또는 합성 DNA와 하이브리드화함으로써 클로닝할 수 있다. 상기 하이브리드화를, 그 자체가 공지된 방법 또는 그에 준하는 방법, 예를 들어 문헌[Molecular Cloning, 2nd ed. (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)] 등에 기재된 방법에 의해 수행할 수 있다. 상업적으로 입수할 수 있는 라이브러리를 사용하는 경우에, 상기 하이브리드화를 첨부된 사용 설명서에 따라 수행할 수 있다. 상기 하이브리드화를 바람직하게는 엄격한 조건하에서 수행할 수 있다.
상기 매우 엄격한 조건의 예로서, 45℃에서 6xSSC(염화 나트륨/나트륨 시트레이트)에서의 하이브리드화 반응에 이어서, 65℃에서 0.2xSSC/0.1% SDS에서 1회 이상 세척 등의 조건을 언급할 수 있다. 당업자는 상기 하이브리드화 용액의 염 농도, 하이브리드화 반응 온도, 탐침 농도, 탐침 길이, 불일치 수, 하이브리드화 반응 시간, 세척액의 염 농도, 세척 온도 등을 적합하게 변화시킴으로써 목적하는 엄격성을 용이하게 조절할 수 있다. 상업적으로 입수할 수 있는 라이브러리를 사용하는 경우, 하이브리드화를 상기 라이브러리에 첨부된 사용 설명서에 기재된 방법에 따라 수행할 수 있다.
MHC 등을 암호화하는 DNA를 포함하는 발현 벡터를, 예를 들어 MHC 등을 암호화하는 DNA로부터 목적하는 DNA 단편을 절단하고 상기 DNA 단편을 적합한 발현 벡터 중의 프로모터의 하류에 연결함으로써 제조할 수 있다.
발현 벡터로서, 에스케리키아 콜라이-유래된 플라스미드(예를 들어 pBR322, pBR325, pUC12, pUC13); 동물 세포 발현 플라스미드(예를 들어 pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo); 동물 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스, 우두 바이러스, 아데노바이러스, 렌티바이러스 등; 등이 사용된다.
상기 프로모터는 유전자를 발현하는데 사용되는 숙주에 적합한 한 임의의 프로모터일 수 있다.
예를 들어, 상기 숙주가 동물 세포인 경우, SRα 프로모터, SV40 프로모터, LTR 프로모터, CMV(거대세포바이러스) 프로모터, RSV(라우스 육종 바이러스) 프로모터, MoMuLV(몰로니 쥐 백혈병 바이러스) LTR, HSV-TK(헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제) 프로모터 등이 사용된다. 이들 중에서, CMV 프로모터, SRα 프로모터 등이 바람직하다.
상기 숙주가 에스케리키아 속의 세균인 경우, trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, λPL 프로모터, lpp 프로모터, T7 프로모터 등이 바람직하다.
본원에 사용되는 발현 벡터는 상기 외에, 인헨서(enhancer), 이어맞추기 신호(splicing signal), 폴리A 부가 신호, 선택 마커, SV40 복제 기원(이후에 또한 SV40 ori로서 약기함) 등을 임의로 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 선택 마커의 예로서, 디하이드로폴레이트 리덕타제 유전자(이후에 또한 dhfr로서 약기함)[메토트렉세이트(MTX) 내성], 암피실린 내성 유전자(이후에 또한 ampr로서 약기함), 네오마이신 내성 유전자(이후에 또한 neor로서 약기함, G418 내성) 등을 언급할 수 있다. 특히, dhfr 유전자 결손 중국 햄스터 세포를 사용하고 상기 dhfr 유전자를 선택 마커로서 사용하는 경우, 표적 유전자를 또한 무-티미딘 배지를 사용하여 선택할 수 있다.
필요한 경우, 숙주에 적합한 신호 서열을 암호화하는 염기 서열(신호 코돈)을 MHC 등을 암호화하는 DNA의 5'-말단부에 부가(또는 고유 신호 코돈에 의해 치환)할 수 있다. 예를 들어, 상기 숙주가 에스케리키아 속인 경우, PhoA 신호 서열, OmpA 신호 서열 등이 사용되며; 상기 숙주가 동물 세포인 경우, 인슐린 신호 서열, α-인터페론 신호 서열, 항체 분자 신호 서열 등이 사용된다.
MHC 등을, 숙주를 MHC 등을 암호화하는 상기 언급한 DNA를 함유하는 발현 벡터로 형질전환시키고 수득된 형질전환체를 배양함으로써 제조할 수 있다.
숙주로서, 예를 들어 에스케리키아 속, 동물 세포 등이 사용된다.
에스케리키아 속으로서, 예를 들어 K12 DH1[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 60,160(1968)], JM103[Nucleic Acids Research, vol. 9, 309(1981)], JA221[Journal of Molecular Biology, vol. 120, 517(1978)], HB101[Journal of Molecular Biology, vol. 41, 459(1969)], C600[Genetics, vol. 39, 440(1954)] 등이 사용된다.
동물 세포로서, 예를 들어 원숭이 COS-7 세포, 원숭이 베로 세포, 중국 햄스터 난소 세포(이후에 CHO 세포로서 약기함), dhfr 유전자 결손 CHO 세포(이후에 CHO(dhfr-) 세포로 약기함), 마우스 L 세포, 마우스 AtT-20 세포, 마우스 골수종 세포, 래트 GH3 세포, 인간 FL 세포 등이 사용될 수 있다.
형질전환을 공지된 방법에 따라 숙주의 종류에 따라 수행할 수 있다.
에스케리키아 속을, 예를 들어 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 69, 2110(1972), Genee, vol. 17, 107(1982)] 등에 기재된 방법에 따라 형질전환시킬 수 있다.
동물 세포를 예를 들어 문헌[Saibo Kogaku, extra issue 8, Shin Saibo Kogaku Jikken Protocol, 263-267 (1995), published by Shujunsha], 또는 문헌[Virology, 52, 456 (1973)]에 기재된 방법에 따라 형질전환시킬 수 있다.
형질전환체의 배양을 공지된 방법에 따라 숙주의 종류에 따라 수행할 수 있다.
숙주가 에스케리키아 속의 세균인 형질전환체의 배양에 사용되는 배지의 예로서, 글루코스 및 cas 아미노산이 보충된 M9 배지(Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972)가 바람직하다. 필요한 경우, 프로모터 효율을 증가시키기 위해서, 3β-인돌릴아크릴산과 같은 화학제를 배지에 가할 수 있다.
숙주가 에스케리키아 속의 세균인 형질전환체의 배양을 통상적으로는 약 3 내지 약 24시간 동안 약 15℃ 내지 약 43℃에서 수행한다. 필요한 경우, 상기 배양물을 통기시키거나 교반할 수 있다.
숙주가 동물 세포인 형질전환체의 배양시 사용되는 배지로서, 예를 들어 약 5 내지 약 20% 소 태아 혈청을 함유하는 최소 필수 배지(MEM)[Science, vol. 122, 501(1952)], 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM)[Virology, vol. 8, 396(1959)], RPMI1640 배지[The Journal of the American Medical Association, vol. 199, 519(1967)], 199 배지[Proceeding of the Society for the Biological Medicine, vol. 73, 1(1950)] 등이 사용된다. 상기 배지의 pH는 바람직하게는 약 6 내지 약 8이다. 배양을 통상적으로 약 15 내지 약 60시간 동안 약 30℃ 내지 약 40℃에서 수행한다. 필요한 경우, 상기 배양물을 통기시키거나 교반할 수 있다.
상술한 바와 같이, MHC 등을 상기 형질전환체의 세포에서 또는 상기 세포 밖에서 제조할 수 있다.
상기 형질전환체를 배양함으로써 수득된 배양물로부터 MHC 등을 그 자체로서 공지된 방법에 따라 분리 및 정제할 수 있다.
예를 들어, MHC 등을 배양된 세균 또는 세포의 세포질로부터 추출하는 경우, 세균 또는 세포를 공지된 수단에 의해 배양물로부터 채집하고, 적합한 완충액에 현탁시키고, 초음파처리, 리소자임 및/또는 동결-해동 등에 의해 파괴하고, 그 후에 원심분리 또는 여과에 의해 가용성 단백질의 조 추출물을 수득하는 방법을 적합하게 사용한다. 상기 완충액은 단백질 변성제, 예를 들어 우레아 또는 구아니딘 하이드로클로라이드 및 계면활성제, 예를 들어 트리톤 X-100TM을 포함할 수 있다. 또한, MHC 등을 세균(세포) 밖으로 분비시키는 경우, 배양물로부터 원심분리, 여과 등에 의해 배양 상등액을 분리시키는 방법이 사용된다.
상기와 같이 수득된 가용성 분획 및 배양 상등액 중에 함유된 MHC 등의 단리 및 정제를 그 자체로서 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다. 유용한 방법은 용해도에 기초한 방법, 예를 들어 염석 및 용매 침전; 주로 분자량 차이에 기초한 방법, 예를 들어 투석, 한외여과, 젤 여과, 및 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동; 전하 차이에 기초한 방법, 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피; 특이적인 친화성에 기초한 방법, 예를 들어 친화성 크로마토그래피; 소수성 차이에 기초한 방법, 예를 들어 역상 고성능 액체 크로마토그래피; 및 등전점 차이에 기초한 방법, 예를 들어 등전점 전기영동을 포함한다. 이들 방법을 적합하게 조합할 수 있다.
상술한 바와 같이 수득된 MHC/항원 펩티드 복합체는 다량체일 수 있다. 상기 MHC/항원 펩티드 복합체를 다량체화함으로써, TCR에 대한 보다 높은 작용물질 효과가 기대될 수 있다. 본 발명의 MHC/항원 펩티드 복합체의 다량체화 방법은 공지되어 있다. 예를 들어, 비오틴-변형된 MHC/항원 펩티드 복합체를 아비딘 또는 스트렙트아비딘의 사량체를 통해 사량체화할 수 있다. 한편으로, 상기를 또한, MHC/항원 펩티드 복합체를 덱스트란에 연결시킴으로써 다량체화할 수 있다.
본 발명의 단계 (I)(또는 단계 (3))에 사용된 CD3/TCR 복합체 작용물질이 MHC/초항원 복합체인 경우, 상기 MHC/초항원 복합체는 II 부류 MHC 및 초항원의 복합체이다. 상기 초항원으로서, 스타필로코커스 내독소, 스트렙토코커스 발열성 외독소, 독성 쇼크 증후군 독소 등을 언급할 수 있다. MHC 및 초항원을 상기 MHC 등에 대해 기재된 방법과 동일한 방법에 의해 제조할 수 있다. 상기 MHC/초항원 복합체는 MHC/항원 펩티드 복합체와 같은 다량체일 수 있다. 본 발명의 MHC/초항원 복합체의 다량체화 방법은 MHC/항원 펩티드 복합체의 다량체화 방법과 동일하다.
본 발명의 단계 (I)에 사용되는 CD3/TCR 복합체 작용물질은 배양 중 CD3-양성 세포 표면상의 CD3/TCR 복합체와 접촉할 수 있는 한 임의의 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어, 상기는 배양 중 배지에 함유되거나, 또는 배양 용기에 고정화될 수 있으며, 바람직하게는 배양 용기에 고정화된다.
상기 CD3/TCR 복합체 작용물질이 배지 중에 함유되는 경우, 상기 배지는 CD3-양성 세포가 상기 중에서 배양될 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 글래스고우 최소 필수 배지(GMEM) 배지, IMDM 배지, 배지 199 배지, 이글의 최소 필수 배지(EMEM) 배지, αMEM 배지, 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM) 배지, 햄의 F12 배지, RPMI 1640 배지, 피셔의 배지, Neurobasal 배지(Life Technologies) 및 이들의 혼합 배지 등이 포함된다. 상기 배지는 혈청을 함유하거나 또는 무혈청일 수 있다. 혈청이 함유되는 경우, 상기 혈청(예를 들어 소 태아 혈청(FBS), 인간 혈청 등)의 농도는 하한이 일반적으로 1% 이상, 바람직하게는 5% 이상이고 상한이 일반적으로 20% 이하, 바람직하게는 15% 이하이도록 한다. 필요한 경우, 상기 배지는 하나 이상의 혈청 대체물, 예를 들어 녹아웃 혈청 대체물(KSR)(ES 세포 배양시 FBS의 혈청 대체물), N2 보충물(Invitrogen), B27 보충물(Invitrogen), 알부민, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄 화합물(예를 들어 나트륨 셀레나이트), 비타민 C(예를 들어 아스코르브산) 아포트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-머캅토에탄올, 3'-티오글리세롤 등, 및 지질, 아미노산, L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민(예를 들어 Glutamax(등록상표)), 불필수 아미노산, 비타민, 성장 인자, 저분자량 화합물, 항생제(예를 들어 페니실린, 스트렙토마이신), 산화방지제, 피루브산, 완충제, 무기염, 셀레늄산, 프로제스테론, 푸트레신 등과 같은 하나 이상의 물질을 함유할 수 있다. 상기 CD3/TCR 복합체 작용물질이 배지 중에 함유되는 경우, 상기 CD3/TCR 복합체 작용물질의 농도는 하한이 0.3 ng/㎖ 이상, 바람직하게는 3 ng/㎖ 이상이고 상한이 10000 ng/㎖ 이하, 바람직하게는 1000 ng/㎖ 이하이도록 할 수 있다. 특히, 상기 CD3/TCR 복합체 작용물질이 항-CD3 작용물질 항체인 경우, 배지 중 상기 항-CD3 작용물질 항체의 농도는 예를 들어 10 ng/㎖ - 1000 ng/㎖이다. 배양을, 예를 들어 약 1 - 약 10%, 바람직하게는 약 2 - 약 5%의 CO2 농도 분위기하의 CO2 배양기에서 약 30 - 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃에서 수행할 수 있다. CD3/TCR 복합체 작용물질을 함유하는 배지에서의 배양기간은 적합하게는 CD3-양성 세포수 등을 모니터함으로써 당업자에 의해 결정될 수 있다. 상기 일수는 CD3-양성 세포가 수득될 수 있는 한 제한되지 않는다. 상기 배양기간은 예를 들어 적어도 6시간 이상, 12시간 이상, 16시간 이상, 24시간 이상, 48시간 이상, 72시간 이상, 바람직하게는 16 - 72시간이다. 또한, 14일 이상이 바람직하며, 7일 이상이 보다 바람직하다.
비타민 C가 사용되는 경우, 상기 비타민 C를 바람직하게는 4일마다, 3일마다, 2일마다 또는 매일 첨가한다(공급한다). 비타민 C를 보다 바람직하게는 매일 첨가한다. 하나의 구현예에서, 비타민 C를 바람직하게는 배지에 5 ng/㎖ 내지 500 ng/㎖에 상응하는 양(예를 들어 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 25 ng/㎖, 50 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 400 ng/㎖, 또는 500 ng/㎖에 상응하는 양)으로 첨가한다. 또 다른 구현예에서, 비타민 C를 배양 배지에 5 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖에 상응하는 양(예를 들어 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 300 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖에 상응하는 양)으로 첨가한다.
본 발명의 단계 (I)에 사용되는 배지는 사이토카인을 추가로 함유할 수 있다. 상기 배지 중에 함유되는 사이토카인은 특별히 제한되지 않으며, IL-7, IL-15, IL-18 및 IL-21 중에서 선택된 적어도 하나를 언급할 수 있다. IL-7, IL-15, IL-18 및 IL-21을 전부 함유하는 것이 바람직하다. 사이토카인의 농도는 하한이 0.1 ng/㎖ 이상, 바람직하게는 10 ng/㎖ 이상이고, 상한이 1000 ng/㎖ 이하, 바람직하게는 300 ng/㎖ 이하이도록 한다. 이들 사이토카인이 사용되는 경우, 배지 중 농도는 IL-7의 경우 1 - 100 ng/㎖, IL-15의 경우 1 - 100 ng/㎖, IL-18의 경우 5 - 500 ng/㎖, 및 IL-21의 경우 2 - 200 ng/㎖이다.
본 발명의 단계 (I)에 사용되는 배지는 TL1A 및/또는 IL-12를 추가로 함유할 수 있다. 이 경우에, 배지 중 TL1A의 농도는 5 - 500 ng/㎖이고, 배지 중 IL-12의 농도는 5 - 500 ng/㎖이다.
본 발명의 단계 (I)에 사용되는 배지는 TNF 패밀리 사이토카인을 사이토카인으로서 함유할 수 있다. TNF 패밀리 사이토카인의 예는 TNF-α, TNF-β, 림포톡신 α, Fas 리간드, TRAIL, TWEAK, TL1A, RANK 리간드, OX40 리간드, APRIL, AITRL, BAFF, 4-1BBL 및 CD40 리간드 등을 포함하며, TL1A가 바람직하다. TL1A가 사용되는 경우, 배지 중 그의 농도는 5 ng/㎖ - 500 ng/㎖일 수 있다.
본 발명의 단계 (I)에 사용되는 세포사멸 억제제로서, 프로테아제 억제제, 예를 들어 카스파제 억제제를 언급할 수 있다. 상기 카스파제 억제제로서, 판 카스파제 FMK 억제제 Z-VAD(N-벤질옥시카보닐-Val-Ala-Asp(O-Me) 플루오로메틸케톤)이 바람직하며, 배지 중 그의 농도는 1 - 1000 μM일 수 있다.
CD3/TCR 복합체 작용물질을 배양 용기에 고정화시키는 경우, 배양 용기는 CD3-양성 세포가 상기 중에서 배양될 수 있는 한 특별히 제한되지 않으며, 용기, 슬라이드, 비드 또는 이들의 조합이 사용될 수 있다. 배양 용기의 예는 플라스크, 조직 배양 플라스크, 디쉬, 페트리 디쉬, 조직 배양 디쉬, 다중디쉬, 미세플레이트, 미세웰 플레이트, 다중플레이트, 다중웰 플레이트, 미세 슬라이드, 챔버 슬라이드, 페트리 디쉬, 튜브, 트레이, 배양 주머니, 롤러 병, 미세 비드 등을 포함한다.
CD3/TCR 복합체 작용물질을 공지된 수단에 의해 배양 용기에 고정화시킬 수 있다. 예를 들어, CD3/TCR 복합체 작용물질을 용매(예를 들어 PBS 등)에 용해시키고, 이를 배양 용기에 가하고, 4℃에서 밤새 정치시킴으로써 상기 CD3/TCR 복합체 작용물질을 상기 배양 용기에 고정화시킬 수 있다. 상기 배양 용기에 CD3/TCR 복합체 작용물질을 고정화시키기 위한 CD3/TCR 복합체 작용물질 용액의 농도는 상기 CD3/TCR 복합체 작용물질의 종류에 따라 당업자에 의해 적합하게 결정될 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 예를 들어 상기 CD3/TCR 복합체 작용물질이 항-CD3 작용물질 항체 또는 그의 결합 단편인 경우, 항-CD3 작용물질 항체 또는 그의 결합 단편의 0.3 - 10000 ng/㎖ 용액을 일반적으로 상기 배양 용기와 접촉시킬 수 있으며, 3 - 5000 ng/㎖이 보다 바람직하고, 3 - 3000 ng/㎖이 보다 바람직하며, 3 - 600 ng/㎖이 특히 바람직하다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 용액 중의 항-CD3 항체 작용물질 또는 그의 결합 단편의 농도는 예를 들어 10 ng/㎖ - 10000 ng/㎖, 바람직하게는 50 ng/㎖ - 5000 ng/㎖, 보다 바람직하게는 200 ng/㎖ - 4000 ng/㎖이다. 본 발명의 더욱 또 다른 구현예에서, 용액 중의 항-CD3 작용물질 항체 또는 그의 결합 단편의 농도는 예를 들어 1 - 50000 ng/㎖, 바람직하게는 3 - 30000 ng/㎖, 보다 바람직하게는 30 - 30000 ng/㎖, 추가로 바람직하게는 300 - 30000 ng/㎖이다. 상기 항-CD3 작용물질 항체 또는 그의 결합 단편이 OKT3 클론으로부터 생성된 항체(OKT3) 또는 그의 결합 단편인 경우, 용액 중 그의 농도는 예를 들어 1 ng/㎖ - 50000 ng/㎖, 바람직하게는 10 ng/㎖ - 10000 ng/㎖, 보다 바람직하게는 50 ng/㎖ - 5000 ng/㎖, 추가로 바람직하게는 200 ng/㎖ - 4000 n/㎖이다. 상기 항-CD3 작용물질 항체 또는 그의 결합 단편이 UCHT1 클론으로부터 생성된 항체(UCHT1) 또는 그의 결합 단편인 경우, 용액 중 그의 농도는 예를 들어 1 ng/㎖ - 50000 ng/㎖, 바람직하게는 3 ng/㎖ - 30000 ng/㎖, 보다 바람직하게는 30 ng/㎖ - 30000 ng/㎖, 추가로 바람직하게는 300 ng/㎖ - 30000 n/㎖이다.
본 발명의 단계 (I)에서, 피브로넥틴은 CD3-양성 세포에 결합할 수 있는 분자인 한 특별히 제한되지 않는다. 피브로넥틴의 변이체는 CD3-양성 세포 표면상의 VLA-5 및 VLA-4에 결합할 수 있는 분자인 한 특별히 제한되지 않으며, 그의 예는 레트로넥틴(등록상표)을 포함한다.
본 발명의 단계 (I)에 사용되는 피브로넥틴 또는 그의 변이체는 CD3/TCR 복합체 작용물질과 같이, 배양 중 CD3-양성 세포와 접촉할 수 있는 한 임의의 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어, 상기는 배양 중에 배지 중에 함유되거나 또는 배양 용기에 고정화될 수 있으며, 바람직하게는 배양 용기에 고정화된다.
피브로넥틴 또는 그의 변이체가 배지 중에 함유되는 경우, 상기 배지는 CD3/TCR 복합체 작용물질을 함유하는 배지와 동일할 수 있다. 혈청, 첨가제 등의 존재 또는 부재는 CD3/TCR 복합체 작용물질을 함유하는 배지에서와 동일할 수 있다. 피브로넥틴 또는 그의 변이체가 배지 중에 함유되는 경우, 피브로넥틴 또는 그의 변이체의 농도의 하한은 10 ng/㎖ 이상, 바람직하게는 100 ng/㎖ 이상일 수 있고, 하한은 10000 ㎍/㎖ 이하, 바람직하게는 1000 ㎍/㎖ 이하일 수 있다.
피브로넥틴 또는 그의 변이체가 배양 용기에 고정화되는 경우, 상기 배양 용기는 CD3/TCR 복합체 작용물질이 고정화되는 용기와 동일할 수 있다. 또한, 배양 용기에 피브로넥틴 또는 그의 변이체의 고정화는 CD3/TCR 복합체 작용물질의 고정화와 동일할 수 있다. 배양 용기의 피브로넥틴 또는 그의 변이체의 고정화는 CD3/TCR 복합체 작용물질의 경우와 동일할 수 있다. 배양 용기에 피브로넥틴 또는 그의 변이체가 고정화될 때 상기 피브로넥틴 또는 그의 변이체의 용액의 농도는 상기 피브로넥틴 또는 그의 변이체에 따라 당업자에 의해 적합하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 피브로넥틴 또는 그의 변이체가 레트로넥틴(등록상표)인 경우, 0.1 - 10000 ㎍/㎖의 레트로넥틴(등록상표)의 용액을 배양 용기와 접촉시키는 것이 바람직하다. 이 경우에, 상기 레트로넥틴 용액의 농도는 보다 바람직하게는 0.1 - 1000 ㎍/㎖, 추가로 바람직하게는 1 - 300 ㎍/㎖, 특히 바람직하게는 1 - 150 ㎍/㎖이다.
본 발명의 단계 (I)에서, CD30 작용물질은 CD30에 특이적으로 결합함으로써 CD30으로부터 신호를 세포내로 전달할 수 있는 분자인 한 특별히 제한되지 않는다. 상기 CD30 작용물질의 예는 항-CD30 작용물질 항체 또는 상기에 결합된 단편 및 CD30 리간드 또는 상기에 결합된 단편으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나를 포함한다.
본 발명의 단계 (I)에 사용되는 항-CD30 작용물질 항체 및 그의 결합 단편의 종류, 제조 방법 등은 항-CD30 작용물질 항체 및 항-TCR 항체의 경우와 동일할 수 있다.
본 발명의 단계 (I)에 사용되는 CD30 리간드 또는 그의 결합 단편은 예를 들어 CD153이다. 상기 CD30 리간드 또는 그의 결합 단편을 MHC 및/또는 항원 펩티드의 제조 방법과 유사한 방법에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 단계 (I)에 사용되는 CD30 작용물질은 배양 중 CD30과 접촉하여 존재할 수 있는 한 임의의 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어, 상기는 배양 중에 배지 중에 함유되거나 또는 배양 용기에 고정화될 수 있으며, 바람직하게는 배지 중에 함유된다.
CD30 작용물질이 배지 중에 함유되는 경우, 상기 배지는 CD3/TCR 복합체 작용물질을 함유하는 배지와 동일할 수 있다. 혈청, 첨가제 등의 존재 또는 부재는 CD3/TCR 복합체 작용물질을 함유하는 배지에서와 동일할 수 있다. CD30 작용물질이 배지 중에 함유되는 경우, 배지 중의 상기 CD30 작용물질의 농도는 상기 CD30 작용물질의 종류에 따라 당업자에 의해 적합하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 상기 CD30 작용물질이 항-CD30 작용물질 항체 또는 그의 결합 단편인 경우, 배지 중의 항-CD30 작용물질 항체 또는 그의 결합 단편의 농도는 일반적으로 1 ng/㎖ - 10000 ng/㎖, 바람직하게는 1 ng/㎖ - 1000 ng/㎖, 보다 바람직하게는 3 ng/㎖ - 300 ng/㎖, 추가로 바람직하게는 30 ng/㎖ - 300 ng/㎖이다.
CD30 작용물질이 배양 용기에 고정화되는 경우, 상기 배양 용기는 CD3/TCR 복합체 작용물질이 고정화되는 용기와 동일할 수 있다. 또한, 배양 용기의 CD30 작용물질의 고정화 방법은 CD3/TCR 복합체 작용물질의 고정화와 동일할 수 있다. CD30 작용물질이 배양 용기에 고정화되는 경우 상기 CD30 작용물질 용액의 농도의 하한은 0.1 ng/㎖ 이상, 바람직하게는 1 ng/㎖ 이상일 수 있고, 상한은 10000 ng/㎖ 이하, 바람직하게는 1000 ng/㎖ 이하일 수 있다.
본 발명의 제조 방법 또는 확대 배양 방법은, 본 발명의 단계 (I)에서 배양된 CD3-양성 세포를 CD3/TCR 복합체 작용물질 및 피브로넥틴 또는 그의 변이체의 부재하에서 및 CD30 작용물질의 존재하에서 배양하는 단계(이후에 본 발명의 단계 II로서 지칭한다)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 단계 II에서 배지로서, 상기 언급한 단계 I에 사용되는 배지를 사용할 수 있다. 상기 배지는 혈청을 함유하거나, 무혈청일 수 있다. 혈청이 함유되는 경우, 상기 혈청(예를 들어 소 태아 혈청(FBS), 인간 혈청 등)의 농도는 하한이 일반적으로 1% 이상, 바람직하게는 5% 이상이고 상한이 일반적으로 20% 이하, 바람직하게는 15% 이하이도록 한다. 필요한 경우, 상기 배지는 하나 이상의 혈청 대체물, 예를 들어 녹아웃 혈청 대체물(KSR)(ES 세포 배양시 FBS의 혈청 대체물), N2 보충물(Invitrogen), B27 보충물(Invitrogen), 알부민, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄 화합물(예를 들어 나트륨 셀레나이트), 비타민 C(예를 들어 아스코르브산) 아포트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-머캅토에탄올, 3'-티오글리세롤 등, 및 지질, 아미노산, L-글루타민, 글루타맥스(Invitrogen), 불필수 아미노산, 비타민, 성장 인자, 저분자량 화합물, 항생제, 산화방지제, 피루브산, 완충제, 무기염, 셀레늄산, 프로제스테론, 푸트레신 등과 같은 하나 이상의 물질을 함유할 수 있다. 배양을, 예를 들어 약 1 - 약 10%, 바람직하게는 약 2 - 약 5%의 CO2 농도 분위기하의 CO2 배양기에서 약 30 - 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃에서 수행할 수 있다. 배양기간은 CD3-양성 세포수 등을 모니터함으로써 당업자에 의해 적합하게 결정될 수 있다. 상기 일수는 CD3-양성 세포가 수득될 수 있는 한 제한되지 않는다. 상기 배양기간은 예를 들어 3일 이상, 5일 이상, 7일 이상, 10일 이상, 14일 이상, 21일 이상, 바람직하게는 5일 이상 및 15일 이하이다. 30일 이하가 바람직하며, 21일 이하가 보다 바람직하다.
비타민 C가 사용되는 경우, 상기 비타민 C를 바람직하게는 4일마다, 3일마다, 2일마다 또는 매일 첨가한다(공급한다). 비타민 C를 보다 바람직하게는 매일 첨가한다. 하나의 구현예에서, 비타민 C를 배지에 5 ng/㎖ 내지 500 ng/㎖에 상응하는 양(예를 들어 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 25 ng/㎖, 50 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 400 ng/㎖, 또는 500 ng/㎖에 상응하는 양)으로 첨가한다. 또 다른 구현예에서, 비타민 C를 배양 배지에 5 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖에 상응하는 양(예를 들어 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 300 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖에 상응하는 양)으로 첨가한다.
본 발명의 단계 (II)에 사용되는 배지는 사이토카인을 추가로 함유할 수 있다. 상기 사이토카인은 특별히 제한되지 않으며, IL-7, IL-15, IL-18 및 IL-21 중에서 선택된 적어도 하나를 언급할 수 있다. IL-7, IL-15, IL-18 및 IL-21을 전부 함유하는 것이 바람직하다. 사이토카인의 농도는 하한이 0.1 ng/㎖ 이상, 바람직하게는 10 ng/㎖ 이상이고, 상한이 1000 ng/㎖ 이하, 바람직하게는 300 ng/㎖ 이하이도록 한다. 이들 사이토카인이 사용되는 경우, 배지 중의 농도는 IL-7의 경우 1 ng/㎖ - 100 ng/㎖, IL-15의 경우 1 ng/㎖ - 100 ng/㎖, IL-18의 경우 5 ng/㎖ - 500 ng/㎖, 및 IL-21의 경우 2 ng/㎖ - 200 ng/㎖이다.
본 발명의 단계 (II)에 사용되는 배지는 TL1A 및/또는 IL-12를 추가로 함유할 수 있다. 이 경우에, 배지 중 TL1A의 농도는 5 ng/㎖ - 500 ng/㎖이고, 배지 중 IL-12의 농도는 5 ng/㎖ - 500 ng/㎖이다.
본 발명의 단계 (II)에 사용되는 배지는 세포사멸 억제제를 추가로 함유할 수 있다. 세포사멸 억제제로서, 프로테아제 억제제, 예를 들어 카스파제 억제제를 언급할 수 있다. 상기 카스파제 억제제로서, 판 카스파제 FMK 억제제 Z-VAD(N-벤질옥시카보닐-Val-Ala-Asp(O-Me) 플루오로메틸케톤)(이후에 때때로 "Z-VAD-FMK"로서 지칭한다)이 바람직하며, 배지 중 그의 농도는 1 μM - 1000 μM, 바람직하게는 1 μM - 500 μM, 보다 바람직하게는 1 μM - 200 μM, 특히 바람직하게는 1 μM - 50 μM일 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 언급한 단계 (I) 및 단계 (II)를 상기 순서로 반복할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 제조 방법 또는 확대 배양 방법에 의해 수득된 CD3-양성 세포(이후에 본 발명의 CD3-양성 세포라 칭한다)를 제공한다. 본 발명의 CD3-양성 세포는 본 발명의 제조 방법 또는 확대 배양 방법에 의해 수득되는 CD3-양성 세포와 동일하다.
본 발명은 또한 하기를 함유하는 CD3-양성 세포의 확대 배양을 위한 키트(이후에 본 발명의 키트라 칭한다)를 제공한다:
(1) CD3/TCR 복합체 작용물질, 및 피브로넥틴 또는 그의 변이체를 갖는 배양 용기, 및
(2) CD30 작용물질을 함유하는 배지.
본 발명의 키트 중에 함유된 CD3/TCR 복합체 작용물질, 피브로넥틴 또는 그의 변이체, CD30 작용물질, 배양 용기 및 배지는 본 발명의 제조 방법 또는 확대 배양 방법에 대해 기재된 것과 동일할 수 있다.
본 발명은 또한 CD3-양성 세포에서 CD30 신호를 자극하는 단계를 포함하는, CD3-양성 세포를 CD3-양성 CD197-양성 세포로서 유지시키는 방법(이후에 본 발명의 유지 방법으로서 지칭한다)을 제공한다.
일반적으로, 말초 혈액-유래된 미경험 T 세포를 수지상 세포에 의해 제시된 항원으로 자극하는 경우, 미경험 T 세포는 세포내 신호에 의해 활성화되고, 증식 및 성숙화를 반복하고, 후속적으로 줄기세포 기억 T 세포, 중심 기억 T 세포, 효과기 기억 T 세포 및 효과기 T 세포로 분화한다. 효과기 T 세포는 CD3-양성 CD4-양성 CD8-음성 세포(헬퍼 T 세포)의 경우에 사이토카인을 생산하고, CD3-양성 CD4-음성 CD8-양성 세포(세포독성 T 세포)의 경우에 항원을 통해 표적 세포를 사멸하지만, 장기간 생존할 수 없다. 그러나, T 세포에서 CD30 신호를 자극함으로써, 상기 T 세포를 효과기 T 세포로 분화할 수 있는 자기-증식 미경험 T 세포 또는 줄기세포 기억 T 세포(CD197-양성, CD45RA-양성) 또는 중심 기억 T 세포(CD197-양성, CD45RA-음성)로서 유지시킬 수 있다.
본 발명의 유지 방법에 의해 배양된 CD3-양성 세포는 본 발명의 제조 방법 또는 확대 배양 방법에 의해 배양된 CD3-양성 세포와 동일할 수 있다. 바람직하게, 상기 CD3-양성 세포는 CD3-양성 CD197-양성 세포이다.
본 발명의 유지 방법은 CD3-양성 세포 중의 CD30 신호를 자극하는 단계를 포함한다. 상기 CD3-양성 세포 중의 CD30 신호를 자극하는 방법은 상기 신호가 CD30의 세포내 도메인을 통해 하류로 전달될 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 상기 방법의 예는 CD3-양성 세포를 CD30 작용물질의 존재하에서 배양하는 단계를 포함하는 방법(이후에 본 발명의 유지 방법 (1)로서 지칭한다)을 포함한다. 상기 CD3-양성 세포를 본 발명의 유지 방법 (1)에 의해 CD3-양성 CD197-양성 세포로서 유지할 수 있다.
본 발명의 유지 방법 (1)의 하나의 구현예에서, CD3-양성 세포를 CD3 양성 CD197-양성 CD45RA-음성 세포로서 유지할 수 있다.
본 발명의 유지 방법 (1)에 사용되는 CD30 작용물질 및 배양 조건은 본 발명의 제조 방법 또는 확대 배양 방법에 사용되는 경우와 동일할 수 있다.
본 발명은 또한 CD3-양성 세포를 CD3-양성 CD197-양성 세포로서 유지하기 위한 CD30 작용물질을 함유하는 키트(이후에 본 발명의 유지 키트로서 지칭한다)를 제공한다.
본 발명의 유지 키트 중에 함유되는 CD30 작용물질은 본 발명의 유지 방법 (1)에 사용되는 CD30 작용물질과 동일할 수 있다.
본 발명의 유지 방법에서, CD3-양성 세포 중의 CD30 신호의 또 다른 자극 방법은 예를 들어 키메라 항원 수용체를 자극하는 항원의 존재하에서 CD30의 세포내 도메인을 함유하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 CD3-양성 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법(이후에 본 발명의 유지 방법 (2)로서 지칭한다)이다. 상기 신호를, CD30의 세포내 도메인을 함유하는 키메라 항원 수용체를 자극함으로써 CD30의 세포내 도메인을 통해 하류로 전달할 수 있으며, CD30의 세포내 도메인을 함유하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 CD3-양성 세포를 CD3-양성 CD197-양성 세포로서 유지시킬 수 있다.
본 발명의 유지 방법 (2)의 하나의 구현예에서, CD30의 세포내 도메인을 함유하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 CD3-양성 세포를 CD3-양성 CD197-양성 CD45RA-음성 세포로서 유지시킬 수 있다.
본 발명의 유지 방법 (2)에 사용되는 배양 조건은 본 발명의 제조 방법 또는 확대 배양 방법에 사용되는 경우와 동일할 수 있다.
본 발명의 유지 방법 (2)에 사용되는 키메라 항원 수용체를 자극하는 항원은 신호가 상기 키메라 항원 수용체 중에 함유된 CD30의 세포내 도메인을 통해 하류로 전달될 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 상기 키메라 항원 수용체를 자극하는 항원은 본 발명의 제조 방법 또는 확대 배양 방법에 의해 배양된 키메라 항원 수용체-발현 CD3-양성 세포의 키메라 항원 수용체에 의해 표적화된 항원과 동일할 수 있다.
본 발명은 또한 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 함유하는 키메라 항원 수용체(여기에서 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD30의 세포내 도메인 또는 그의 돌연변이체를 함유한다)(이후에 본 발명의 키메라 항원 수용체라 지칭한다)를 제공한다.
본 발명의 키메라 항원 수용체 중에 함유된 항원 결합 도메인은 본 발명의 제조 방법 또는 확대 배양 방법에서 배양된 CD3-양성 세포상에서 발현된 키메라 항원 수용체 중에 함유된 항원 결합 도메인과 동일할 수 있다.
본 발명의 키메라 항원 수용체 중에 함유된 막관통 도메인은 본 발명의 제조 방법 또는 확대 배양 방법에서 배양된 CD3-양성 세포상에서 발현된 키메라 항원 수용체 중에 함유된 막관통 도메인과 동일할 수 있다.
본 발명의 키메라 항원 수용체 중에 함유된 세포내 신호전달 도메인은 CD30의 세포내 도메인 또는 그의 돌연변이체를 함유한다. 상기 CD30의 세포내 도메인은 본 발명의 키메라 항원 수용체 중에 함유된 항원 결합 도메인이 항원을 인식하고 그의 인식 신호를 세포로 전달하는 기능을 유지하는 한 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 서열번호 6에 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 펩티드를 언급할 수 있다.
CD30의 세포내 도메인의 돌연변이체는 상기 언급한 기능을 유지할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 서열번호 6에 나타낸 아미노산 서열과 약 90% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 97% 이상, 특히 바람직하게는 약 98% 이상, 가장 바람직하게는 약 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 함유하는 펩티드를 언급할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, "상동성"은 "IL-15/IL-15Rα"의 아미노산 서열에서의 경우와 동일할 수 있다.
또한, CD30의 세포내 도메인의 돌연변이체는 예를 들어 (1) 서열번호 6에 나타낸 아미노산 서열 중 하나 이상(바람직하게는 1 내지 약 100, 바람직하게는 1 내지 약 50, 추가로 바람직하게는 1 내지 약 10, 특히 바람직하게는 1 내지 다수(2, 3, 4 또는 5))의 아미노산이 결실된 아미노산 서열, (2) 하나 이상(바람직하게는 1 내지 약 100, 바람직하게는 1 내지 약 50, 추가로 바람직하게는 1 내지 약 10, 특히 바람직하게는 1 내지 다수(2, 3, 4 또는 5))의 아미노산이 서열번호 6에 나타낸 아미노산 서열에 부가된 아미노산 서열, (3) 하나 이상(바람직하게는 1 내지 약 50, 바람직하게는 1 내지 약 10, 추가로 바람직하게는 1 내지 다수(2, 3, 4 또는 5))의 아미노산이 서열번호 6에 나타낸 아미노산 서열에 삽입된 아미노산 서열, (4) 하나 이상(바람직하게는 1 내지 약 50, 바람직하게는 1 내지 약 10, 추가로 바람직하게는 1 내지 다수(2, 3, 4 또는 5))의 아미노산이 서열번호 6에 나타낸 아미노산 서열 중의 다른 아미노산에 의해 치환된 아미노산 서열, 또는 (5) 이들의 조합인 아미노산 서열 등을 함유하는 단백질을 또한 포함한다. 아미노산 서열이 상기 언급한 바와 같이 삽입, 결실 또는 치환되는 경우, 삽입 또는 결실 또는 치환의 위치는 CD30의 세포내 도메인의 기능이 유지되는 한 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 키메라 항원 수용체 중에 함유된 세포내 신호전달 도메인은 CD30의 세포내 도메인 또는 그의 돌연변이체, 및 추가로 다른 단백질로부터 유래된 세포내 도메인을 함유할 수 있다. 상기 추가로 함유되는 세포내 도메인은 본 발명의 제조 방법 또는 확대 배양 방법에서 배양된 CD3-양성 세포상에서 발현된 키메라 항원 수용체 중에 함유된 세포내 신호전달 도메인 중에 함유된 세포내 도메인과 동일할 수 있다. 상기 추가로 함유되는 세포내 도메인은 특별히 제한되지 않으며, CD28 또는 CD3ζ 쇄로부터 유래된 세포내 도메인이 바람직하다.
본 발명의 키메라 항원 수용체는 항원 결합 도메인과 막관통 도메인 사이, 또는 세포내 신호전달 도메인과 막관통 도메인 사이에 통합된 이격자를 가질 수 있다. 상기 이격자는 본 발명의 제조 방법 또는 확대 배양 방법에서 배양된 CD3-양성 세포상에서 발현된 키메라 항원 수용체 중에 함유된 이격자와 동일할 수 있다.
본 발명의 키메라 항원 수용체의 구체적인 예는 항원 결합 도메인으로서 CD19를 인식하는 scFv, 막관통 도메인으로서 CD8의 막관통 도메인, 세포내 신호전달 도메인으로서 CD28로부터 유래된 세포내 도메인, CD30으로부터 유래된 세포내 도메인, 및 CD3ζ 쇄로부터 유래된 세포내 도메인을 함유하는 키메라 항원 수용체를 포함한다. 상기 세포내 신호전달 도메인 중에 함유된 상기 언급된 세포내 도메인의 순서는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 CD28로부터 유래된 세포내 도메인, CD30으로부터 유래된 세포내 도메인, 및 CD3ζ 쇄로부터 유래된 세포내 도메인의 순서가 채택된다. 보다 구체적으로, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 예를 들어 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열로 구성된다.
본 발명의 키메라 항원 수용체는 화학적으로 합성된 단백질 또는 무세포 번역 시스템에서 생화학적으로 합성된 단백질이거나, 또는 본 발명의 키메라 항원 수용체를 암호화하는 염기 서열을 갖는 핵산을 통합하는 형질전환체로부터 생성된 재조합 단백질일 수 있다. 본 발명의 키메라 항원 수용체를 본 발명의 제조 방법 또는 확대 배양 방법에 사용된 MHC 및/또는 항원 펩티드의 제조 방법에 따라 유사하게 제조하고 단리 및 정제할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 핵산(이후에 본 발명의 핵산으로서 지칭한다)을 제공한다.
본 발명의 핵산은 DNA 또는 RNA, 또는 DNA/RNA 키메라일 수 있다. DNA가 바람직하다. 또한, 핵산은 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 이중 가닥의 경우에, 이중 가닥 DNA, 이중 가닥 RNA 또는 DNA:RNA 하이브리드를 사용할 수 있다. 단일 가닥의 경우에, 상기는 센스 가닥(즉 암호화 가닥) 또는 안티센스 가닥(즉 비-암호화 가닥)일 수 있다.
본 발명의 핵산을 폴리머라제 쇄 반응(이후에 "PCR 방법"으로서 약기한다)에 의해 수득할 수 있다. 먼저, 본 발명의 키메라 항원 수용체 중에 함유된 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인의 각각의 도메인을 암호화하는 게놈 DNA 또는 cDNA를 수득할 수 있다. cDNA를 또한, 세포로부터 제조된 전체 RNA 또는 mRNA 분획을 주형으로서 사용함으로써 PCR 방법 및 역전사효소-PCR(이후에 "RT-PCR 방법"으로서 약기함)에 의해 직접 증폭시킬 수 있다. 상기 수득된 게놈 DNA 또는 cDNA를 주형으로서 사용하여, 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인의 각각의 도메인을 암호화하는 핵산을, 각각의 도메인을 암호화하는 염기 서열의 일부 및 이격자를 암호화하는 염기 서열로 이루어지는 합성 DNA 프라이머를 사용하는 PCR 방법에 의해 증폭시킬 수 있다. 본 발명의 핵산을, 주형으로서 상기 수득된 각각의 도메인, 및 합성 DNA 프라이머를 사용하는 PCR 방법을 반복함으로써 수득할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산을 함유하는 키메라 항원 수용체 유전자 전달 벡터(이후에 본 발명의 트랜스유전자 벡터로서 지칭한다)를 제공한다.
본 발명의 트랜스유전자 벡터를, 예를 들어 본 발명의 핵산을 적합한 유전자 전달 벡터 중의 프로모터의 하류에 연결시킴으로써 제조할 수 있다. 상기 유전자 전달 벡터, 프로모터, 및 다른 요소는 본 발명의 제조 방법 또는 확대 배양 방법에서 외인성 TCR을 다능성 줄기세포내에 도입시킬 때 사용되는 벡터, 프로모터 및 다른 요소와 동일할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 트랜스유전자 벡터를 함유하는 키메라 항원 수용체-발현 세포(이후에 본 발명의 키메라 항원 수용체-발현 세포로서 지칭한다)를 제공한다.
본 발명의 키메라 항원 수용체-발현 세포를, 본 발명의 트랜스유전자 벡터를 세포내에 도입하고 상기 세포를 배양함으로써 제조할 수 있다. 본 발명의 트랜스유전자 벡터가 도입되는 세포로서, CD3-양성 세포 또는 그의 전구세포(조혈 줄기세포, 공통의 림프양 전구세포, 림프아구세포 등), 또는 다능성 줄기세포를 언급할 수 있다. 다능성 줄기세포로서, ES 세포, iPS 세포, EC 세포, 및 EG 세포를 언급할 수 있으며, ES 세포 또는 iPS 세포가 바람직하다.
본 발명의 트랜스유전자 벡터를 리포펙션, 리포솜, 미세주입 등과 같은 방법에 의해 세포내에 도입시킬 수 있다.
본 발명의 키메라 항원 수용체-발현 세포는 바람직하게는 CD3-양성 세포이다. 상기 CD3-양성 세포는 바람직하게는 CD3-양성 CD8-양성 세포(CD3-양성 CD8-양성 CD4-양성 세포 또는 CD3-양성 CD8-양성 CD4-음성 세포), 보다 바람직하게는 CD3-양성 CD8-양성 CD4-음성 세포이다. 상기 언급한 또 다른 바람직한 CD3-양성 세포는 예를 들어 CD3-양성 CD4-양성 세포(CD3-양성 CD4-양성 CD8-양성 세포 또는CD3-양성 CD4-양성 CD8-음성 세포)이다.
본 발명의 키메라 항원 수용체-발현 세포가, 본 발명의 트랜스유전자 벡터를 다능성 줄기세포내에 도입시킴으로써 제조된 세포인 경우, 상기 다능성 줄기세포를 그 자체로서 공지된 방법에 따라 CD3-양성 세포로 분화시킬 수 있다. 다능성 줄기세포의 CD3-양성 세포로의 구체적인 분화 방법은 본 발명의 제조 방법 또는 확대 배양 방법에서 다능성 줄기세포로 배양되는 CD3-양성 세포의 분화 방법과 동일할 수 있다.
본 발명의 상기와 같이 수득된 키메라 항원 수용체-발현 세포는 상기 키메라 항원 수용체에 의해 관심 항원에 대한 특이성이 부여되며, 상기 관심 항원을 발현하는 종양에 대한 세포독성 활성을 나타낼 수 있다. 상기 키메라 항원 수용체는 I 부류 또는 II 부류 HLA에 의존하지 않고 항원 분자를 직접 인식할 수 있다. 따라서 본 발명의 키메라 항원 수용체-발현 세포는 I 부류 또는 II 부류 HLA 유전자의 감소된 발현을 갖는 종양에 대해서조차 높은 면역 반응을 유도할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 키메라 항원 수용체-발현 세포를 활성 성분으로서 함유하는 약제(이후에 본 발명의 약제로서 지칭한다)를 제공한다. 본 발명의 키메라 항원 수용체-발현 세포를 함유하는 약제를 본 발명의 키메라 항원 수용체에 의해 인식되는 항원을 발현하는 종양의 예방 또는 치료에 사용할 수 있으며, 예를 들어 포유동물(예를 들어 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 소, 양, 원숭이, 인간), 바람직하게는 인간에게 투여할 수 있다. 따라서, 본 발명의 하나의 구현예에서, 본 발명의 키메라 항원 수용체에 의해 인식되는 항원을 발현하는 종양의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 약제를 제공한다. 또한, 바람직하게는 본 발명의 키메라 항원 수용체-발현 세포를 함유하는 약제의 형태로 상기 세포를 투여함을 포함하는, 본 발명의 키메라 항원 수용체에 의해 인식되는 항원을 발현하는 종양의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 키메라 항원 수용체 발현 세포에 의해 예방되거나 치료될 수 있는 종양은 본 발명의 키메라 항원 수용체에 의해 인식되는 항원을 발현하는 한 특별히 제한되지 않는다. 종양은 예를 들어 문헌["Daniel Baumhoer et al., Am J. Clin Pathol, 2008, 129, 899-906"] 등에 기재되어 있다. 종양은 양성 종양, 악성 종양(또한 "암"으로서 지칭한다), 및 양성 또는 악성으로 진단되거나 판정될 수 있는 종양을 포함한다. 종양의 구체적인 예는 비제한적으로 간암(예를 들어 간종양), 난소암(예를 들어 난소 투명세포 선암종), 소아암, 폐암(예를 들어 편평상피암, 소세포 폐암), 고환암(예를 들어 비정상피종 생식세포 종양), 연조직 종양(예를 들어 지방육종, 악성 섬유성 조직구증), 자궁암(예를 들어 자궁경부상피내종양, 자궁경부편평상피암), 흑색종, 부신종양(예를 들어 부신의 선종), 신경성종양(예를 들어 슈반종), 위암(예를 들어 위의 선암종), 신장암(예를 들어 그라위츠 종양), 유방암(예를 들어 침습성소엽성암, 점액성암), 갑상선암(예를 들어 수질암), 후두암(예를 들어 편평상피암), 방광암(예를 들어 침습성 이행세포 암종) 등을 포함한다.
본 발명의 키메라 항원 수용체-발현 세포를 피실험자에게 투여전에 적합한 배지 및/또는 자극 분자를 사용하여 배양 및/또는 자극할 수 있다. 상기 자극 분자의 예는 비제한적으로 사이토카인, 적합한 단백질, 다른 성분 등을 포함한다. 사이토카인의 예는 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IFN-γ 등을 포함하며, IL-2가 바람직하게 사용될 수 있다. 배지 중 IL-2의 농도는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 바람직하게는 0.01 U/㎖ - 1Х105 U/㎖, 보다 바람직하게는 1 U/㎖ - 1Х104 U/㎖이다. 적합한 단백질의 예는 키메라 항원 수용체, CD3 리간드, CD28 리간드, 항-CD3 항체, 항-CD30 항체 및 항-IL4 항체에 의해 인식되는 항원을 포함한다. 이들 외에, 렉틴 등과 같은 림프구 자극 인자를 또한 첨가할 수 있다. 더욱 또한, 혈청 또는 혈장을 배지에 첨가할 수 있다. 상기 배지에의 첨가량은 특별히 제한되지 않으며, 0 부피% 내지 20 부피%를 언급할 수 있다. 또한, 사용되는 혈청 또는 혈장의 양을 배양 단계에 따라 변화시킬 수 있다. 예를 들어 혈청 또는 혈장 농도를 단계적으로 감소시킬 수 있다. 혈청 또는 혈장의 기원은 자기유래 또는 동종이계일 수 있으며, 자기유래 기원이 안전성의 관점에서 바람직하다.
본 발명의 약제는 바람직하게는 피실험자에의 비경구 투여에 의해 사용된다. 비경구 투여 방법의 예는 정맥내, 동맥내, 근육내, 복강내 및 피하 투여 등을 포함한다. 용량은 상기 피실험자의 상태, 체중, 연령 등에 따라 적합하게 선택되지만, 약제를 일반적으로는 체중 60 ㎏의 피실험자에게, 용량당 세포수가 1Х106 - 1Х1010 세포, 바람직하게는 1Х107 - 1Х109 세포, 보다 바람직하게는 5Х107 - 5Х108 세포이도록 투여한다. T 세포를 1회 또는 수회 부분으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제를 비경구 투여에 적합한 공지된 형태, 예를 들어 주사 또는 주사제로 제형화할 수 있다. 본 발명의 약제는 세포를 안정하게 유지시키기 위해서 염수, 포스페이트 완충 염수(PBS), 배지 등을 함유할 수 있다. 상기 배지는 특별히 제한되지 않으며, 그의 예는 비제한적으로 RPMI, AIM-V, X-VIVO10 등과 같은 배지를 포함한다. 상기 약제는 안정화를 위해 약학적으로 허용 가능한 담체(예를 들어 인간 혈청 알부민), 보존제 등을 함유할 수 있다.
더욱 또한, 본 발명의 키메라 항원 수용체-발현 세포는 본 발명의 키메라 항원 수용체에 의해 인식되는 항원을 발현하는 세포를 사멸시킬 수 있기 때문에, 상기를 항원을 발현하는 세포의 사멸제로서 사용할 수 있다. 상기와 같은 사멸을 상기 약제와 동일한 방식으로 제조하고 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 키메라 항원 수용체-발현 세포를 함유하는 약제에 따른, 본 발명의 키메라 항원 수용체에 의해 인식되는 항원을 발현하는 종양에 대한 예방제 또는 치료제의 제조에서 본 발명의 키메라 항원 수용체-발현 세포의 용도의 구현예를 포함한다. 종양에 대한 예방제 또는 치료제는 그 자체가 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기를 상기 언급된 본 발명의 약제의 제조 방법에서와 같이, 비경구 투여에 적합한 공지된 형태, 예를 들어 주사, 주사제 등으로 제조할 수 있다.
본 발명을 실시예를 참조하여 하기에 보다 상세히 설명하지만, 이들 실시예는 단지 예시일 뿐이며, 본 발명을 제한하지 않는다.
[실시예 1]
1. iPS 세포의 제조
iPS 세포로서, 교토(Kyoto) 대학의 iPS 세포연구소(CiRA)로부터 제공된 Ff-I01s04 균주를 사용하였다. iPS 세포 배양을 CiRA 의해 배포된 프로토콜 "피더-프리 조건하에서 인간 iPS 세포 배양"에 따라 수행하였다.
2. T 세포 수용체(TCR) 유전자의 iPS 세포내 도입
TCR 유전자로서, 에히메(Ehime) 대학 대학원 의학 연구과의 마사타카 야수카와(Masataka Yasukawa) 교수에 의해 제공된 TAK1-유래된 HLA-A*24:02-제한된 WT1-특이성 TCR(WT1-TCR) 유전자를 사용하였다. iPS 세포로의 유전자 전달을 이화학 연구소에 의해 공급된 CS-UbC-RfA-IRES2-hKO1 렌티바이러스 벡터에의 통합 및 iPS 세포 감염에 의해 수행하였다.
3. WT1-TCR 유전자 도입된 iPS 세포의 CD8-양성 T 세포(CTL)로의 분화
WT1-TCR 유전자 도입된 iPS 세포의 CD8-양성 T 세포(CTL)로의 분화를 공지된 방법(WO 2017/221975)에 따라 수행하였다. 본 세포는 CD3-양성, CD8-양성이었다. 하기에서, 상기 세포를 iPS 세포-유래된 T 세포로서 사용하였다.
4. 시약, 항체
레트로넥틴(등록상표)을 Takara Bio Inc.로부터 구입하였다. 항-CD3 작용물질 항체로서, eBioscience로부터 구입한 정제된 항-인간 CD3 기능성 등급(클론: OKT3) 또는 GeneTex로부터 구입한 CD3 항체(클론: UCHT1)를 사용하였다. 특별히 언급되지 않는 한, OKT3를 사용하였다. 항-CD30 작용물질 항체로서, R&D systems로부터 구입한 CD30 작용물질 항체를 사용하였다.
5. 배양 플레이트상에 항-CD3 작용물질 항체 및 레트로넥틴(등록상표)의 고정화
PBS 중에 필요한 농도로 용해된 항-CD3 작용물질 항체 및 레트로넥틴(등록상표)을 96 웰 플레이트에 50 ㎕/웰로 첨가하고, 상기 플레이트를 4℃에서 밤새 정치시켰다. 상기 세포를 PBS로 세척하고 시험에 제공하였다.
6. 고정화된 항-CD3 작용물질 항체 및 고정화된 레트로넥틴(등록상표)의 검출을 위한 ELISA
고정화된 항-CD3 작용물질 항체의 검출을 위해서, Bethyl Laboratories로부터 구입한 마우스 IgG2a ELISA 정량분석 세트에 함유된 HRP 접합된 염소 항-마우스 IgG2a 검출 항체를 사용하였다. 고정화된 레트로넥틴(등록상표)의 검출을 위해서, Takara Bio Inc.로부터 구입한 레트로넥틴 EIA 키트 중에 함유된 페록시다제-표지된 항-레트로넥틴 항체를 사용하였다. 각각의 검출 항체를 고정화된 플레이트에 첨가하고, 상기 플레이트를 실온에서 1시간 동안 정치되게 하였다. 0.05% Tween-20을 함유하는 PBS로 세척 후에, 1-StepTM Ultra TMB-ELISA 기질 용액(ThermoFisher)을 첨가하였다. 실온에서 15분간 정치 후에, 1M 황산을 첨가하여 상기 반응을 정지시키고, 450 ㎚에서 흡광도를 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다.
7. 증식 시험
표 1의 사이토카인 등을 15% FBS를 함유하는 α-MEM 배지에 첨가하여 제조된 배지 중의 100,000 세포/200 ㎕로 제조된 iPS 세포-유래된 T 세포를, 항-CD3 작용물질 항체(3, 30, 300, 3000 ng/㎖) 및 레트로넥틴(등록상표)(0, 1.85, 2.25, 16.7, 50, 150 ㎍/㎖)이 고정화된 플레이트에 시딩하고, 5% CO2/37℃ 하에서 3일 동안 배양하였다.
배양 3일째에, 상기 플레이트로부터 세포를 수확하고, 세포수를 TC20(Bio-Rad)을 사용하여 측정하였다. 상기 세포를, 표 2의 사이토카인 등을 15% FBS를 함유하는 α-MEM 배지에 첨가하여 수득된 적합한 양의 배지에 현탁하고, 고정화되지 않은 96 웰 플레이트에 첨가하고 5% CO2/37℃에서 배양하였다. 그 후에, 상기 세포를 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14 및 16일째 중 어느 하루에 매번 1회, 총 4 내지 7회 상기 플레이트로부터 회수하고, 세포수를 측정하였다. 상기 세포를 적합한 양으로 현탁하고, 고정화되지 않은 플레이트에 첨가하고 5% CO2/37℃에서 배양하였다.
제품명 제조사 최종 농도
ITS (100x)
(인슐린-트랜스페린-셀레늄 보충물)		 Invitrogen 1 x
아스코르브산 2-포스페이트 sigma 50 ㎍/㎖
IL-7 Peprotech 10 ng/㎖
IL-15 Peprotech 10 ng/㎖
IL-2 Peprotech 10 ng/㎖
IL-21 Peprotech 20 ng/㎖
IL-12 Merck 50 ng/㎖
IL-18 MBL 50 ng/㎖
Z-VAD-FMK R&D 10 μM
제품명 제조사 최종 농도
ITS (100x)
(인슐린-트랜스페린-셀레늄 보충물)		 Invitrogen 1 x
아스코르브산 2-포스페이트 sigma 50 ㎍/㎖
IL-7 Peprotech 10 ng/㎖
IL-15 Peprotech 10 ng/㎖
8. ATP 시험
상기 증식 시험에서 배양 12일째의 세포 및 배양 상등액 중의 ATP를 표준 프로토콜에 따라, Promega KK로부터 구입한 CellTiter-Glo(R) 발광 세포 생육력 분석을 사용하여 측정하였다.
9. WT1 항원-특이성 세포독성 활성의 측정
HLA-A*24:02-양성 LCL 세포를 RIKEN BioResource center로부터 구입하였다. 상기 세포를 10% FBS를 함유하는 RPMI1640 배지에서 배양하였다. WT1 항원 펩티드(CMTWNQMNL: 서열번호 3)의 합성을 Scrum Inc.에 위탁하였다. 세포독성 시험을 표준 프로토콜에 따라, Perkin Elmer Inc.로부터 구입한 DELFIA 면역분석을 사용하여 평가하였다.
10. 항-CD30 작용물질 항체가 첨가된 증식 시험
0, 30, 100, 300 ng/㎖의 최종 농도로 희석된 항-CD30 작용물질 항체를 세포의 현탁 중에 배양 배지에 첨가하였다. 나머지는 "7. 증식 시험"의 방법에서와 동일하였다.
고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표) 및 항-CD30 작용물질 항체에 의한 수회 자극에 의한 iPS 세포-유래된 T 세포의 증식 시험에서, 100 ng/㎖의 최종 농도로 희석된 항-CD30 작용물질 항체를 상기 세포의 현탁 중에 배양 배지에 첨가하였다. 나머지는 "7. 증식 시험"의 방법에서와 동일하였다.
11. 세포막 표면상의 CD197 및 CD45RA의 검출
배양 7일째에 세포를 수확하고, 표 3의 항체로 염색하고, LSRFortessaTM X-20(BD Bioscience) 유식 세포측정을 사용하여 검출하였다.
표적 형광 클론 판매사
CD5 APC/Cy7 UCHT2 BioLegend
CD8a PerCP/Cy5.5 SK1 BioLegend
CD8b PE/Cy7 SID18BEE eBioscience
CD197 AF647 G043H7 BioLegend
CD45RA FITC HI100 BioLegend
[실험 실시예 1]
1. 배양 플레이트상의 고정화에 적합한 항-CD3 작용물질 항체 및 레트로넥틴(등록상표)의 농도 측정
배양 플레이트상의 고정화에 적합한 항-CD3 작용물질 항체 및 레트로넥틴(등록상표)의 농도를 ELISA 방법에 의해 측정하였다(도 1). 항-CD3 작용물질 항체의 농도-의존적인 고정화가 3 ng/㎖ 내지 3000 ng/㎖ 사이에서 확인되었다. 레트로넥틴(등록상표)의 농도-의존적인 고정화가 16.7 ㎍/㎖ 내지 150 ㎍/㎖ 사이에서 확인되었다.
2. iPS 세포-유래된 T 세포의 증식에 적합한 고정화된 항-CD3 작용물질 항체 및 고정화된 레트로넥틴(등록상표)에 필요한 항-CD3 작용물질 항체 및 레트로넥틴(등록상표)의 농도 범위의 검증
iPS 세포-유래된 T 세포를 항-CD3 작용물질 항체(0, 3, 30, 300, 3000 ng/㎖) 및 레트로넥틴(등록상표)(0, 1.85, 5.56, 16.7, 50, 150 ㎍/㎖)이 고정화된 플레이트상에서 3일 동안 자극하고, 고정화되지 않은 플레이트상에서 9일 동안 배양하고, ATP의 양을 측정하였다(도 2).
3. 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표)으로 자극된 iPS 세포-유래된 T 세포의 증식 시험
100,000 세포/200 ㎕로 제조된 iPS 세포-유래된 T 세포를, 항-CD 작용물질 항체(3000 ng/㎖) 및 레트로넥틴(등록상표)(150 ㎍/㎖)이 고정화된 96 웰 플레이트상에서, 또는 iPS 세포-유래된 T 세포의 수 및 비드 입자의 수의 비가 1:1인 항-CD3/CD28 비드(Dynabeads)로 3일 동안 자극하고, 자극 없이 배양된 세포의 수를 시간에 걸쳐 측정하였다(도 3). 상기 iPS 세포-유래된 T 세포는, 항-CD3/CD28 비드보다는 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표)에 의한 자극에 의해 보다 많이 증식되었다.
4. 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표)으로 수회 자극된 iPS 세포-유래된 T 세포의 증식 시험
고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표)에 의한 수회 자극에 대한 iPS 세포-유래된 T 세포의 세포 증식 반응을 확인하였다. 하나의 증식 시험을, 고정화된 플레이트상에서 3일 동안 iPS 세포-유래된 T 세포를 자극하고 고정화되지 않은 플레이트상에서 11-15일 동안 상기 세포를 배양함으로써 수행하였다. 상기 시험의 종료 후에, 세포의 수를 조절하고 다음 시험에 제공하였다. 상기 iPS 세포-유래된 T 세포는 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표)에 의한 네 번째 자극에 반응하고, 증식하였다(도 4).
5. 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표)에 의한 자극에 의해 증식된 WT1-TCR 유전자-전달된 iPS 세포-유래된 T 세포의 WT1 항원-특이성 세포독성 활성의 검증
고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표)에 의한 자극에 의해 증식된 WT1-TCR 유전자-전달된 iPS 세포-유래된 T 세포의 WT1 항원-특이성 세포독성 활성을 평가하였다. 상기 WT1 항원-특이성 세포독성 활성을 WT1 항원 펩티드가 첨가된 LCL에 대한 세포독성과 상기 첨가가 없는 LCL에 대한 세포독성간의 차이에 기초하여 평가하였다. WT1-TCR 유전자-전달된 iPS 세포-유래된 T 세포는 거의 비-특이적인 세포독성 활성을 갖지 않았으며 WT1 항원-특이성 세포독성 활성만을 나타내었다(도 5).
6. 항-CD30 작용물질 항체에 의한 자극에 의한 iPS 세포-유래된 T 세포의 증식 시험
고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표)에 의한 자극 중 항-CD30 작용물질 항체(0, 30, 100, 300 ng/㎖)의 첨가가 iPS 세포-유래된 T 세포의 증식에 영향을 미치는지의 여부를 검증하였다. 상기 고정화된 96 웰 플레이트로서, 항-CD3 작용물질 항체(3000 ng/㎖) 및 레트로넥틴(등록상표)(150 ㎍/㎖)이 고정화된 것을 사용하였다. iPS 세포-유래된 T 세포는 항-CD30 작용물질 항체의 첨가에 의해 보다 많이 증식하였다. 상기 세포는 항-CD30 작용물질 항체 농도 의존적인 방식으로 증식하였다(도 6).
7. 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표) 및 항-CD30 작용물질 항체에 의한 수회의 자극에 의한 iPS 세포-유래된 T 세포의 증식 시험
iPS 세포-유래된 T 세포가 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표) 및 항-CD30 작용물질 항체에 의한 수회의 자극에 의해 증식 반응을 나타내는지의 여부를 검증하였다. 상기 세포를 항-CD3 항체(3000 ng/㎖) 및 레트로넥틴(등록상표)(150 ㎍/㎖)이 고정화된 플레이트에 시딩하고 5% CO2/37℃에서 3일 동안 배양하였다.
배양 3일째에, 세포를 상기 플레이트로부터 수확하고 상기 세포의 수를 TC20(Bio-Rad)을 사용하여 측정하였다. 상기 세포를, 표 2의 사이토카인 등을 15% FBS를 함유하는 α-MEM 배지에 첨가하여 수득된 적합한 양의 배지에 현탁하고, 고정화되지 않은 플레이트에 첨가하고 5% CO2/37℃에서 배양하였다. 그 후에, 상기 세포를 6, 7, 9, 10, 14 및 16일째에 각각 1회 상기 플레이트로부터 회수하고, 세포수를 측정하였다. 상기 세포를 적합한 양으로 현탁하고, 고정화되지 않은 플레이트에 첨가하고 5% CO2/37℃에서 배양하였다. 배양 배지로서, 100 ng/㎖의 최종 농도로 희석된 항-CD30 작용물질 항체가 첨가된 것과, 항-CD30 작용물질 항체가 없는 것을 사용하였다. 상기 언급된 0일 내지 16일의 배양 자극을 2회 반복하였다. 두 번째 자극에 의해서조차, 상기 iPS 세포-유래된 T 세포는 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표) 단독에 의한 자극과 비교하여, 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표) 및 항-CD30 작용물질 항체에 의한 자극에 의해 증식하였다(도 7).
8. 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표) 및 항-CD30 작용물질 항체에 의한 자극후 iPS 세포-유래된 T 세포의 막 표면상의 CD197 및 CD45RA의 검출
고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표)에 의한 자극, 또는 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표) 및 항-CD30 작용물질 항체에 의한 자극후, 7일째에 iPS 세포-유래된 T 세포의 막 표면상의 CD197 및 CD45RA의 발현을 유식 세포계에 의해 측정하였다. 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표) 및 항-CD30 작용물질 항체로 자극된 세포 집단에서, CD197-양성 CD45RA-음성 중심 기억-유사 iPS 세포-유래된 T 세포가 대부분이었다(도 8).
9. 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴 및 항-CD30 작용물질 항체에 의한 자극에 의해 증식된 WT1-TCR 유전자-전달된 iPS 세포-유래된 T 세포의 WT1 항원-특이성 세포독성 활성의 검증
고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표) 및 항-CD30 작용물질 항체에 의한 자극에 의해 증식된 WT1-TCR 유전자-전달된 iPS 세포-유래된 T 세포를 WT1 항원 펩티드의 존재 또는 부재하에서 HLA-A*24:02-양성 LCL 세포에 적용하고, 상기 WT1 항원-특이성 세포독성 활성을 평가하였다. 상기 WT1-TCR 유전자-전달된 iPS 세포-유래된 T 세포는 거의 비특이적인 세포독성 활성을 갖지 않았으며 WT1 항원-특이성 세포독성 활성만을 나타내었다(도 9).
[실시예 2]
1. 인간 말초 혈액-유래된 CD8-양성 T 세포의 제조
인간 말초 혈액은 Precision Bioservices로부터 구입한 건강한 공여자-유래된 말초 혈액 단핵세포였다. CD8+ T 세포 단리 키트를 사용하여, 인간(Milteny), CD8-양성 T 세포를 단리하였다.
2. 인간 말초 혈액-유래된 CD8-양성 T 세포의 증식 시험
[실시예 1] 7. 증식 시험의 방법과 유사한 방법에 의해, 시험을 수행하였다.
3. 마우스 생착 시험에 사용된 인간 말초 혈액-유래된 CD8-양성 T 세포의 배양
표 4에 나타낸 첨가제를 15% FBS를 함유하는 α-MEM 배지에 첨가하여 수득된 3 종류의 배지에 100,000 세포/㎖의 최종 농도로 현탁된 인간 말초 혈액-유래된 CD8-양성 T 세포에, 세포수의 3배량으로 조절된 Dynabeads T-활성제 CD3/CD28(gibco)을 가하고, 상기 세포를 3일 동안 5% CO2/37℃에서 배양하였다. 세포를 배양 3일째에 상기 플레이트로부터 수확하고 표 5에 나타낸 사이토카인 등을 15% FBS를 함유하는 α-MEM 배지에 첨가하여 수득된 적합한 양의 배지에 현탁하고, 5% CO2/37℃에서 배양하였다. 그후에, 세포를 배양 10일째에 상기 플레이트로부터 회수하고 세포수를 측정하였다. 상기 세포를 적합한 양으로 현탁시키고 마우스에게 투여하였다. 배양 6, 10, 13, 17일째에, 세포를 상기 플레이트로부터 회수하고, 적합한 양으로 현탁시키고, CD197 발현 실험에 제공하였다.
제품명 제조사 최종 농도 w IL2 w IL7/
IL15		 w IL7/IL15/
항-CD30Ab
인슐린-트랜스페린-셀레늄 보충물 Invitrogen 1 x + + +
아스코르브산 2-포스페이트 sigma 50 ㎍/㎖ + + +
IL-2 Peprotech 15 ng/㎖ +
IL-7 Peprotech 10 ng/㎖ + +
IL-15 Peprotech 10 ng/㎖ + +
IL-21 Peprotech 20 ng/㎖ + +
IL-12 Merck 50 ng/㎖ + +
IL-18 MBL 50 ng/㎖ + +
TL-1A Peprotech 50 ng/㎖ + +
Z-VAD-FMK R&D 10 μM + +
인간 CD30 항체 R&D 300 ng/㎖ +
w: with(각각의 그룹에 첨가된 첨가제를 +로 표시한다.)
제품명 제조사 최종 농도 w IL2 w IL7/
IL15		 w IL7/IL15/
항-CD30Ab
인슐린-트랜스페린-셀레늄 보충물 Invitrogen 1 x + + +
아스코르브산 2-포스페이트 sigma 50 ㎍/㎖ + + +
IL-2 Peprotech 15 ng/㎖ +
IL-7 Peprotech 10 ng/㎖ + +
IL-15 Peprotech 10 ng/㎖ + +
인간 CD30 항체 R&D 300 ng/㎖ +
w: with(각각의 그룹에 첨가된 첨가제를 +로 표시한다.)
4. 마우스에의 인간 말초 혈액-유래된 CD8-양성 T 세포의 투여 및 세포 생착된 세포의 회수
같은날 세포 투여전에 2 Gy의 감마선을 조사한 8주 된 수컷 NSG 마우스(Japan Charles River)를 사용하였다. [실시예 2] 3.의 마우스 생착 시험에 사용된 인간 말초 혈액-유래된 CD8-양성 T 세포의 배양물 중에서 조절된 5,000,000 세포를 마우스에게 정맥내로 투여하고, 상기 마우스를 4주 동안 사육하였다. 그 후에, 상기 마우스를 안락사시키고 혈액 중 골수세포, 비장세포, 및 백혈구를 상기 마우스로부터 회수하였다.
5. 마우스 조직에 생착된 인간 말초 혈액-유래된 CD8-양성 T 세포의 검출
상기 회수된 세포를 표 3의 항체로 염색하고, LSRFortessaTM X-20(BD Bioscience) 유식 세포 측정을 사용하여 검출하였다.
[실험 실시예 2]
1. 항-CD30 작용물질 항체에 의한 자극에 의한 인간 말초 혈액-유래된 CD8-양성 T 세포의 증식 시험
고정화된 항-CD3 항체/레트로넥틴(등록상표)에 의한 자극 중 항-CD30 작용물질 항체의 첨가가 인간 말초 혈액-유래된 CD8-양성 T 세포의 증식에 영향을 미치는지를 확인하였다. 항-CD30 작용물질 항체의 첨가는 인간 말초 혈액 중 CD8-양성 T 세포의 증식을 촉진하였다(도 10).
2. 항-CD3/CD28 비드 및 항-CD30 작용물질 항체에 의한 자극후 인간 말초 혈액-유래된 CD8-양성 T 세포의 막 표면상의 CD197의 검출
배양 6, 10, 13, 17일째에 IL-2-함유 배지 또는 IL-7/IL-15-함유 배지, IL-7/IL-15/항-CD30 항체-함유 배지 중의 항-CD3/CD28 비드로 자극된 인간 말초 혈액-유래된 CD8-양성 T 세포의 세포막 표면상의 CD197 발현을 유식 세포계에 의해 측정하였다. 6일째에, CD197 발현을 모든 그룹에서 확인하였다. 그러나, CD197 발현은 IL-2-함유 배지 그룹에서 13일째 및 IL-7/IL-15-함유 배지 그룹에서 17일째에 거의 소실된 반면, CD197 발현은 IL-7/IL-15/항-CD30 항체-함유 배지 그룹에서는 17일째에조차 유지되었다(도 11).
3. 항-CD3/CD28 비드 및 항-CD30 작용물질 항체에 의한 자극후 인간 말초 혈액-유래된 CD8-양성 T 세포의 생착 평가
배양 10일째에 IL-2-함유 배지 또는 IL-7/IL-15-함유 배지, IL-7/IL-15/항-CD30 항체-함유 배지 중의 항-CD3/CD28 비드로 자극된 인간 말초 혈액-유래된 CD8-양성 T 세포를 면역결함 마우스에게 정맥내로 투여하고, 혈액 및 면역 조직 중 생착을 확인하였다. 투여후 28일째에, 혈액, 비장 및 골수를 상기 마우스로부터 회수하고, 상기 중에 함유된 인간 CD8-양성 T 세포를 유식 세포측정에 의해 검출하였다. 상기 기관 중 어느 것에서도 IL-2-함유 배지 그룹에서 인간 CD8-양성 T 세포는 거의 검출되지 않은 반면, IL-7/IL-15-함유 배지 그룹 및 IL-7/IL-15/항-CD30 항체 함유 배지 그룹에서는 인간 CD8-양성 T 세포가 검출되었다. IL-7/IL-15/항-CD30 항체 함유 배지 그룹에서, 보다 많은 수의 인간 CD8-양성 T 세포가 검출되었다. 따라서, IL-7/IL-15/항-CD30 항체 함유 배지에서 배양된 인간 말초 혈액-유래된 CD8-양성 T 세포는 CD197의 발현을 배양 중 장기간 유지될 수 있을 뿐만 아니라, 생체내에서 장기간 생존할 수 있음이 입증되었다(도 12).
[실시예 3]
1. iPS 세포-유래된 항-CD19-CART 세포의 증식 시험
표 1의 사이토카인 등을 15% FBS를 함유하는 α-MEM 배지에 첨가하여 제조된 배지에 100,000 세포/200 ㎕로 제조된 iPS 세포-유래된 항-CD19-CART 세포를 항-CD3 항체 및 레트로넥틴이 고정화된 플레이트에 시딩하고, 3일 동안 5% CO2/37℃에서 배양하였다. 세포를 배양 3일째에 상기 플레이트로부터 수확하고 상기 세포의 수를 TC20(Bio-Rad)을 사용하여 측정하였다. 상기 세포를, 표 2에 나타낸 사이토카인 등을 15% FBS를 함유하는 α-MEM 배지에 첨가하여 수득된 적합한 양의 배지에 현탁하고, 고정화되지 않은 플레이트에 첨가하고 5% CO2/37℃에서 배양하였다. 그후에, 세포를 배양 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16일째 중 어느 하루에 4 내지 7회 상기 플레이트로부터 회수하고 세포수를 측정하였다. 상기 세포를 적합한 양으로 현탁하고 고정화되지 않은 플레이트에 첨가하고, 5% CO2/37℃에서 배양하였다.
2. 항-CD19-CAR 유전자
항-CD19-CAR 유전자로서, N-말단에서부터 표 6에 나타낸 순서로 정렬되도록 설계된 폴리펩티드(서열번호 5)를 암호화하는 올리고 DNA를 인위적으로 합성하였다.
N-말단으로부터의 순서 유전자 아미노산 번호
1 면역글로불린 중쇄의 리드 서열 22
2 항-CD19 항체(FMC60) 경쇄의 가변 영역 104
3 GGGGS 링커 15
4 항-CD19 항체(FMC60) 중쇄의 가변 영역 120
5 CD8-유래된 서열(막관통 영역 포함) 83
6 CD28의 세포내 도메인 영역 41
7 4-1BB의 세포내 도메인 영역 47
8 CD3ζ의 세포내 도메인 영역 112
3. 항-CD19-CAR 유전자를 갖는 레트로바이러스 벡터의 제조
[실시예 3] 2.에서 합성된 인위적인 올리고 DNA를 pMEI-5 레트로바이러스 벡터의 다중클로닝 부위에 통합하였다. 상기 바이러스 벡터의 제조를 Unitech에 위탁하였다.
4. iPS 세포-유래된 항-CD19-CART 세포의 제조
[실시예 1] 3.에서 제조된 iPS 세포-유래된 T 세포를 항-CD19-CAR 유전자를 갖는 레트로바이러스 벡터로 감염시키고 [실시예 3] 3.에서 제조하여, iPS 세포-유래된 항-CD19-CART 세포를 제조하였다.
[실험 실시예 3]
1. 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표)으로 자극된 iPS 세포-유래된 항-CD19-CART 세포의 증식 시험
[실시예 1] 3.에서 제조된 iPS 세포-유래된 T 세포 및 [실시예 3] 4.에서 제조된 iPS 세포-유래된 항-CD19-CART 세포를 고정화된 항-CD3 항체/레트로넥틴(등록상표)으로 3일 동안 자극하고, 자극 없이 배양된 세포의 수를 시간에 걸쳐 측정하였다. 상기 iPS 세포-유래된 항-CD19-CART 세포를 고정화된 항-CD3 항체/레트로넥틴(등록상표)에 의한 자극에 의해 iPS 세포-유래된 T 세포와 동일한 수준으로 증식시켰다(도 13).
2. 항-CD30 작용물질 항체에 의한 자극에 의한 iPS 세포-유래된 항-CD19-CART 세포의 증식 시험
고정화된 항-CD3 항체/레트로넥틴(등록상표)에 의한 자극 중 항-CD30 작용물질 항체의 첨가가 iPS 세포-유래된 항-CD19-CART 세포의 증식에 영향을 미치는지를 확인하였다. 항-CD30 작용물질 항체의 첨가는 iPS 세포-유래된 항-CD19-CART 세포의 증식을 촉진하였다(도 14).
3. 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표) 및 항-CD30 작용물질 항체에 의한 자극후 iPS 세포-유래된 항-CD19-CART 세포의 막 표면상의 CD197의 검출
고정화된 항-CD3 항체/레트로넥틴(등록상표)에 의한 자극후, 또는 고정화된 항-CD3 항체/레트로넥틴(등록상표)/항-CD30 작용물질 항체에 의한 자극후 3 및 7일째에 iPS 세포-유래된 항-CD19-CART 세포의 세포막 표면상의 CD197 발현을 유식 세포계에 의해 측정하였다. 3일째에, CD197 발현을 모든 그룹에서 확인하였다. 그러나, CD197 발현은 항-CD3 항체/레트로넥틴(등록상표) 자극 그룹에서 7일째에 거의 소실되었지만, 항-CD3 항체/레트로넥틴(등록상표) + 항-CD30 작용물질 항체 자극 그룹에서는 유지됨이 확인되었다(도 15).
4. 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표) 및 항-CD30 작용물질 항체에 의한 자극후 iPS 세포-유래된 항-CD19-CART 세포의 라지(Raji) 세포독성 활성의 검증
CD19-양성 암세포에 대한 [실험 실시예 3] 1.에서 증식에 의해 수득된 iPS 세포-유래된 항-CD19-CART 세포의 세포독성 활성을 CD19-양성 라지 세포에 대한 세포독성 활성에 의해 평가하였다. 상기 iPS 세포-유래된 항-CD19-CART 세포는 CD19-발현 라지 세포에 대한 세포독성 활성을 나타내었다(도 16).
[실시예 4]
1. CD30-유래된 세포내 도메인을 함유하는 항-CD19-CAR 유전자
항-CD19-CAR 유전자로서, N-말단에서부터 표 7에 나타낸 순서로 정렬되도록 설계된 폴리펩티드(서열번호 7)를 암호화하는 올리고 DNA를 인위적으로 합성하였다.
N-말단으로부터의 순서 유전자 아미노산 번호
1 면역글로불린 중쇄의 리드 서열 22
2 항-CD19 항체(FMC60) 경쇄의 가변 영역 104
3 GGGGS 링커 15
4 항-CD19 항체(FMC60) 중쇄의 가변 영역 120
5 CD8-유래된 서열(막관통 영역 포함) 83
6 CD28의 세포내 도메인 영역 41
7 CD30의 세포내 도메인 영역(서열번호 6) 87
8 CD3ζ의 세포내 도메인 영역 112
2. CD30-유래된 세포내 도메인을 함유하는 항-CD19-CAR 유전자를 갖는 레트로바이러스 벡터의 제조
[실시예 4] 1.에서 합성된 인위적인 올리고 DNA를 pMY 레트로바이러스 벡터의 다중클로닝 부위에 통합하였다. 레트로바이러스 벡터 제조를 위해 FLYRD18 세포를 사용하여, 바이러스 벡터를 제조하였다.
3. CD30-유래된 세포내 도메인을 함유하는 iPS 세포-유래된 항-CD19-CART 세포(iCD19-CD30-CART)의 제조
[실시예 1] 3.에서 제조된 iPS 세포-유래된 T 세포를 항-CD19-CAR 유전자를 갖는 레트로바이러스 벡터로 감염시키고 [실시예 4] 2.에서 제조하여, CD30-유래된 세포내 도메인을 함유하는 iPS 세포-유래된 항-CD19-CART 세포(iCD19-CD30-CART)를 제조하였다.
[실험 실시예 4]
CD19-양성 암세포에 대한 [실시예 4] 3.에서 수득된 iCD19-CD30-CART의 세포독성 활성을 CD19-양성 라지 세포에 대한 세포독성 활성에 의해 평가하였다. 상기 iCD19-CD30-CART는 CD19-발현 라지 세포에 대해 세포독성 활성을 나타내었다(도 17).
[실시예 5]
1. iPS 세포의 제조
[실시예 1]과 유사하게, iPS 세포로서, 교토 대학의 iPS 세포연구소(CiRA)로부터 제공된 Ff-I01s04 균주를 사용하였다. iPS 세포 배양을 CiRA 의해 배포된 프로토콜 "피더-프리 조건하에서 인간 iPS 세포 배양"에 따라 수행하였다.
2. iPS 세포의 γδTCR-양성 T 세포(γδT 세포)로의 분화
iPS 세포의 γδTCR-양성 T 세포(γδT 세포)로의 분화를 [실시예 1]에서와 같이 공지된 방법(WO 2017/221975)에 따라 수행하였다. 상기 분화 단계에 사용된 항-CD3 항체로서, 3000 ng/㎖ UCHT1(GeneTex에 의해 제조됨)을 사용하였다. 상기 수득된 CD3-양성 세포는 γδT 세포(이후에 "iPS 세포-유래된 γδT 세포(iγδT 세포)"로서 지칭한다)이었다.
3. iPS 세포-유래된 γδT 세포의 확대 배양
[실시예 5] 2.에서 수득된 iγδT 세포를 표 8에 나타낸 사이토카인을 15% FBS를 함유하는 α-MEM 배지에 첨가하여 수득된 배지에 2,000,000 세포/㎖로 현탁하고, 상기 현탁액을 항-CD3 항체(UCHT1) 및 레트로넥틴(등록상표)이 고정화된 플레이트에 시딩(seeded)하고, 3일 동안 5% CO2/37℃에서 배양하였다. 세포를 배양 3일째에 상기 플레이트로부터 수확하고 상기 세포의 수를 NucleoCounter NC-200(ChemoMetec)을 사용하여 측정하였다. 상기 세포를, 표 9에 나타낸 사이토카인 등을 15% FBS를 함유하는 α-MEM 배지에 첨가하여 수득된 적합한 양의 배지에 현탁하고, 고정화되지 않은 G-Rex 6-웰 플레이트(WILSONWOLF)에 첨가하고 5% CO2/37℃에서 배양하였다. 그후에, 세포의 일부를 배양 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 14, 17일 중 어느 하루에 4 내지 6회 상기 플레이트로부터 회수하고 세포수를 측정하였다. 상기 세포를 하기의 방법에 의해 항-CD3 항체 및 레트로넥틴(등록상표)과 함께 배양 플레이트상에 고정화시켰다. PBS에 필요한 농도로 용해된 항-CD3 항체(UCHT1, 최종 농도 3000 ng/㎖) 및 레트로넥틴(최종 농도 150 ㎍/㎖)을 상기 플레이트에 가하고 상기 플레이트를 4℃에서 밤새 정치시켰다. 상기 플레이트를 PBS로 세척하고 시험에 제공하였다.
제품명 제조사 최종 농도 w/ 항-CD30 Ab w/o 항-CD30 Ab
인슐린-트랜스페린-셀레늄 보충물 Invitrogen 1 x + +
아스코르브산 2-포스페이트 sigma 50 ㎍/㎖ + +
IL-2 Peprotech 15 ng/㎖ + +
IL-7 Peprotech 10 ng/㎖ + +
IL-15 Peprotech 10 ng/㎖ + +
IL-21 Peprotech 20 ng/㎖ + +
IL-12 Merck 50 ng/㎖ + +
IL-18 MBL 50 ng/㎖ + +
TL-1A Peprotech 50 ng/㎖ + +
Z-VAD-FMK R&D 10 μM + +
인간 CD30 항체 R&D 300 ng/㎖ +
w/: with, w/o without
각 그룹에 첨가된 첨가제를 "+"로 표시한다.
제품명 제조사 최종 농도 w/ 항-CD30 Ab w/o 항-CD30 Ab
인슐린-트랜스페린-셀레늄 보충물 Invitrogen 1 x + +
아스코르브산 2-포스페이트 sigma 50 ㎍/㎖ + +
IL-2 Peprotech 15 ng/㎖ + +
IL-7 Peprotech 10 ng/㎖ + +
IL-15 Peprotech 10 ng/㎖ + +
인간 CD30 항체 R&D 300 ng/㎖ + +
w/: with, w/o without
각 그룹에 첨가된 첨가제를 "+"로 표시한다.
[실험 실시예 5]
1. 항-CD30 작용물질 항체에 의한 자극에 의한 iPS 세포-유래된 γδT 세포의 증식 시험
[실시예 5] 3.에서 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표)을 사용하는 자극 방법에 항-CD30 작용물질 항체(300 ng/㎖)의 첨가가 iPS 세포-유래된 γδT 세포의 증식에 영향을 미치는지를 확인하였다. iPS 세포-유래된 T 세포는 항-CD30 작용물질 항체의 첨가에 의해 증식되었다(도 18).
[실시예 6]
1. IL-15Rα/IL-15 유전자
IL-15Rα/IL-15 유전자로서, N-말단으로부터 표 10에 나타낸 순서로 정렬하도록 설계된 폴리펩티드(서열번호 8)를 암호화하는 올리고 NDA를 인위적으로 합성하였다.
N-말단으로부터의 순서 유전자 아미노산 번호
1 인간 IL-2의 리드 서열 23
2 인간 IL-15의 C-말단 서열 114
3 GGGGS 링커 24
4 인간 IL-15RA의 C-말단 서열 239
2. IL-15Rα/IL-15 유전자를 갖는 레트로바이러스 벡터의 제조
[실시예 6] 1.에서 합성된 인위적인 올리고 DNA를 pMY 레트로바이러스 벡터의 다중클로닝 부위에 통합시켰다. 레트로바이러스 벡터 제조용 FLYRD18 세포를 사용하여, 바이러스 벡터를 제조하였다.
3. iPS 세포-유래된 항-CD19-CAR/IL-15γδT 세포의 제조
[실시예 5] 2.에서 제조된 iPS 세포-유래된 γδT 세포(iγδT 세포)를 항-CD19-CAR 유전자를 갖고 [실시예 3] 3.에서 제조된 레트로바이러스 벡터 및 IL-15Rα/IL-15 유전자를 갖고 [실시예 6] 1.에서 제조된 레트로바이러스 벡터로 감염시켰으며, 이에 의해 iPS 세포-유래된 항-CD19-CAR/IL-15γδT 세포(iCD19CAR/IL-15γδT 세포)가 제조되었다.
4. iPS 세포-유래된 항-CD19-CAR/IL-15γδT 세포의 확대 배양
[실시예 5] 3.의 경우와 유사한 방법에 의해, IL-2를 첨가하지 않음을 제외하고 iCD19CAR/IL-15γδT 세포의 확대 배양을 수행하였다.
[실험 실시예 6]
1. 항-CD30 작용물질 항체에 의한 자극에 의한 iPS 세포-유래된 항-CD19-CAR/IL-15γδT 세포의 증식 시험
[실시예 6] 4.에서 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표)에 의한 자극 동안 항-CD30 작용물질 항체(0, 30, 100, 300 ng/㎖)의 첨가가 iCD19CAR/IL-15γδT 세포의 증식에 영향을 미치는지를 검증하였다. 상기 세포는 항-CD30 작용물질 항체의 첨가에 의해 보다 많이 증식하였다(도 19).
2. 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표) 및 항-CD30 작용물질 항체에 의한 자극후 iPS 세포-유래된 항-CD19-CAR/IL-15γδT 세포의 세포독성 활성의 연구
[실시예 6] 4.에서 수득된 iCD19CAR/IL-15γδT 세포의 세포독성 활성을 평가하였다. 표적 세포로서 CD19-양성 라지 세포 및 CD19 음성 CCRF-CEN 세포를 사용하여, iCD19CAR/IL-15γδT 세포를 상기 표적 세포에 비해 0.5, 1, 2, 4, 8, 16-배의 비율로 혼합하였다. iCD19CAR/IL-15γδT 세포의 세포독성 활성을 2시간 후 표적 세포 사멸에 기초하여 평가하였다. 항-CD30 작용물질 항체를 함유하는 배지에서 배양된 iCD19CAR/IL-15γδT 세포는 CD19-양성 라지 세포에 대해 세포독성 활성을 가지며, CD19-음성 CCRF-CEN 세포에 대해서는 세포독성 활성을 갖지 않음이 입증되었다(도 20).
3. 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표) 및 항-CD30 작용물질 항체에 의한 자극후 iPS 세포-유래된 항-CD19-CAR/IL-15γδT 세포의 생존일수 증가 효과
NOD/Shi scid, IL-2RγKO(NOG) 마우스(실험동물중앙연구소, 암컷, 7-8주령)에 5x105 Nalm6 세포(ATCC)를 꼬리 정맥 이식하여 Nalm6 이종이식 마우스를 제조하였다. 이식후 4일째에, 0.1 ㎖의 HBSS-완충제 중의 [실시예 6] 4.에서 수득된 iCD19CAR/IL-15γδT 세포(5x106(세포))의 현탁액 또는 동량의 HBSS-완충제를 꼬리 정맥 투여하고, 생존일수를 확인하였다. 꼬리 정맥을 통해 CD19-양성 Nalm6 암세포가 이식된 모든 마우스는 대조용 투여군에서 3주 이내에 사망한 반면, 항-CD30 작용물질 항체를 함유하는 배지에서 확대 배양된 iCD19CAR/IL-15γδT 세포 투여군에서는 모든 마우스가 적어도 6주간 생존하였다(도 21).
[실시예 7]
1. iPS 세포-유래된 항-CD19-CAR/IL-15αβT 세포의 제조
[실시예 3] 4.의 방법에 의해 제조된 iPS 세포-유래된 항-CD19-CART 세포를 [실시예 6] 2.에서 제조된 IL15Rα/IL-15 유전자를 갖는 레트로바이러스 벡터로 감염시켜 iPS 세포-유래된 항-CD19-CAR/IL-15αβT 세포(iCD19CAR/IL-15αβT 세포)를 제조하였다.
2. 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표)의 사용에 의한 iCD19CAR/IL-15αβT 세포의 확대 배양
[실시예 7] 1.에서 수득된 iCD19CAR/IL-15αβT 세포를 7일까지 [실시예 6] 4.의 경우와 유사한 방법에 의해 배양하였다. 항-인간 CD30 항체를 첨가하지 않았다.
[실험 실시예 7]
1. 고정화된 항-CD3 작용물질 항체/레트로넥틴(등록상표)에 의한 자극후 iCD19CAR/IL-15αβT 세포의 생체내 항종양 효과
NOD/Shi-scid, IL-2RγKO(NOG) 마우스(실험동물중앙연구소, 암컷, 7-8주령)에 5x105 루시페라제-발현 Nalm6 세포(ATCC)를 꼬리 정맥 이식하여 루시페라제-발현 Nalm6 이종이식 마우스를 제조하였다. 이식후 4일째에, 0.1 ㎖의 HBSS-완충제 중의 [실시예 7] 2.에서 수득된 iCD19CAR/IL-15αβT 세포(5x106 세포)의 현탁액 또는 동량의 HBSS-완충제를 꼬리 정맥 투여하였다. 루시페린을 투여후 매주 상기 꼬리 정맥을 통해 투여하고, Nalm6 세포에 의해 발현된 루시페라제의 활성을 IVIS를 사용하여 측정하였다. 대조용-투여군에서, Nalm6 세포로부터 유래된 발광이 투여후 2주째에 신체 전체를 통해 확인되었으며, 투여후 3주까지 모든 마우스가 죽은 반면, iCD19CAR/IL-15αβT 세포-투여군에서는 투여후 6주까지 발광이 검출되지 않았다(도 22).
[실시예 8]
1. iPS 세포-유래된 γδT 세포의 제조
[실시예 5] 1. 및 2.에서와 동일한 방식에서, iPS 세포-유래된 γδT 세포(iγδT 세포)를 제조하였다.
[실험 실시예 8]
1. 배양 플레이트상의 고정화에 적합한 항-CD3 작용물질 항체(UCHT1)의 농도 및 레트로넥틴(등록상표)의 농도의 측정
항-CD3 작용물질 항체(UCHT1) 및 레트로넥틴(등록상표)을 혼합하고 [실시예 1] 5.에서와 동일한 방식으로 배양 플레이트상에 고정화시켰다. 그 후에, 배양 플레이트상에 고정화된 그의 양을 ELISA 방법을 사용하여 측정하였다(도 23). 레트로넥틴(등록상표)과 혼합이 없는 항-CD3 작용물질 항체의 농도-의존적인 고정화가 3 ng/㎖ 내지 3000 ng/㎖(0.003 ㎍/㎖ 내지 30 ㎍/㎖) 사이에서 확인되었다. 그러나, 혼합되는 레트로넥틴(등록상표)의 농도가 상승함에 따라 고정화된 항-CD3 작용물질 항체의 양이 감소하였다. 다른 한편으로, 레트로넥틴(등록상표)의 농도-의존적인 고정화는 16.7 ㎍/㎖ 내지 150 ㎍/㎖ 사이에서 확인되었다.
2. iPS 세포-유래된 iγδT 세포의 증식에 적합한 고정화된 항-CD3 작용물질 항체 및 고정화된 레트로넥틴(등록상표)에 필요한 항-CD3 작용물질 항체 및 레트로넥틴(등록상표)의 농도 범위의 검증
표 1의 사이토카인 등, 및 0, 3, 30, 300 ng/㎖의 최종 농도로 희석된 항-CD30 작용물질 항체를 15% FBS를 함유하는 IMDM 배지에 첨가하여 수득된 배지 중의 100,000 세포/200 ㎕로 조절된 iγδT 세포를, 항-CD3 작용물질 항체(0, 300, 3000, 30000 ng/㎖(0, 0.3, 3, 30 ㎍/㎖)) 및 레트로넥틴(등록상표)(0, 2, 15, 150 ㎍/㎖)이 고정화된 플레이트에 시딩하고, 5% CO2/37℃에서 3일 동안 배양하였다.
배양 3일째에, 세포를 상기 플레이트로부터 수확하고, 표 2의 사이토카인 등을 15% FBS를 함유하는 IMDM 배지에 첨가하여 수득된 적합한 양의 배지에 현탁하고, 고정화되지 않은 96 웰 플레이트에 시딩하고 5% CO2/37℃에서 배양하였다. 그 후에, 상기 세포를 5, 6, 7, 8, 9, 10, 및 12일째에 매번 1회 총 4 내지 7회 상기 플레이트로부터 회수하고, 적합한 양의 배지에 현탁하고, 고정화되지 않은 플레이트에 시딩하고 5% CO2/37℃에서 배양하였다. 배양 13일째에, 상기 세포를 혈구계(hemocytomer)를 사용하여 카운트하고, 배양 0일째의 수와의 비교에 기초한 증식률을 측정하였다(도 24). 항-CD3 작용물질 항체 및 레트로넥틴(등록상표)의 혼합물을 각각 0.3 ㎍/㎖ 및 2 ㎍/㎖, 3 ㎍/㎖ 및 15 ㎍/㎖, 30 ㎍/㎖ 및 150 ㎍/㎖으로 고정화시킨 플레이트에서 iγδT 세포 증식의 동등한 유도가 관찰되었다. 또한 항-CD30 작용물질 항체 첨가 농도-의존적인 세포 증식이 확인되었다.
[산업상이용가능성]
CD3/TCR 복합체 작용물질, 피브로넥틴 또는 그의 변이체, 및 CD30 작용물질의 존재하에서 CD3-양성 세포를 배양함으로써 T 세포를 효율적으로 반복해서 확대 배양할 수 있다. 상기 배양되는 CD3-양성 세포가 CD3-양성 CD8-양성 세포 또는 CD3-양성 CD8-양성 CD30-양성 세포인 경우, 상기 제조되거나 확대 배양된 세포는 효과기 T 세포로 용이하게 이동하며 세포독성 활성을 나타낸다. 따라서, 이를 T 세포 요법에 적용할 수 있다.
본원은 일본에서 출원된 특허출원 제 2018-151580 호(출원일: 2018년 8월 10일), 제 2019-042666 호(출원일: 2019년 3월 8일) 및 제 2019-117878 호(출원일: 2019년 6월 25일)에 기초하며, 이들의 내용 전체가 본원에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> KYOTO UNIVERSITY TAKEDA PHARMACEUTICAL COMPANY LIMITED <120> A method of producing CD3-positive cells <130> 092932 <150> JP 2018-151580 <151> 2018-08-10 <150> JP 2019-042666 <151> 2019-03-08 <150> JP 2019-117878 <151> 2019-06-25 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu 1 5 <210> 5 <211> 544 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD19-CAR <400> 5 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile 35 40 45 Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn 85 90 95 Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr 100 105 110 Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys 130 135 140 Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser 145 150 155 160 Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser 165 170 175 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile 180 185 190 Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu 195 200 205 Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn 210 215 220 Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr 225 230 235 240 Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 245 250 255 Val Thr Val Ser Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr 260 265 270 Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser 275 280 285 Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly 290 295 300 Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp 305 310 315 320 Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile 325 330 335 Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu 340 345 350 His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg 355 360 365 Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg 370 375 380 Ser Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile 385 390 395 400 Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp 405 410 415 Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 420 425 430 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 435 440 445 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 450 455 460 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 465 470 475 480 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 485 490 495 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 500 505 510 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 515 520 525 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 530 535 540 <210> 6 <211> 87 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile Met Lys Ala Asp Thr 1 5 10 15 Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro Glu Gly Arg Gly Leu 20 25 30 Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu Leu Glu Ala Asp His 35 40 45 Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro Pro Leu Gly Ser Cys 50 55 60 Ser Asp Val Met Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly Lys Glu Asp Pro Leu 65 70 75 80 Pro Thr Ala Ala Ser Gly Lys 85 <210> 7 <211> 965 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD19-CAR(CD8-CD28-CD30-CD3z) <400> 7 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile 35 40 45 Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn 85 90 95 Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr 100 105 110 Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys 130 135 140 Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser 145 150 155 160 Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser 165 170 175 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile 180 185 190 Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu 195 200 205 Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn 210 215 220 Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr 225 230 235 240 Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 245 250 255 Val Thr Val Ser Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr 260 265 270 Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser 275 280 285 Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly 290 295 300 Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp 305 310 315 320 Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile 325 330 335 Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu 340 345 350 His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg 355 360 365 Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg 370 375 380 Ser His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile Met Lys Ala Asp 385 390 395 400 Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro Glu Gly Arg Gly 405 410 415 Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu Leu Glu Ala Asp 420 425 430 His Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro Pro Leu Gly Ser 435 440 445 Cys Ser Asp Val Met Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly Lys Glu Asp Pro 450 455 460 Leu Pro Thr Ala Ala Ser Gly Lys Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala 465 470 475 480 Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu 485 490 495 Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly 500 505 510 Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu 515 520 525 Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser 530 535 540 Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly 545 550 555 560 Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu 565 570 575 His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg 580 585 590 Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg 595 600 605 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 610 615 620 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly 625 630 635 640 Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe 645 650 655 Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala 660 665 670 Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu 675 680 685 Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile 690 695 700 Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu 705 710 715 720 Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala 725 730 735 Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu 740 745 750 Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr 755 760 765 Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys 770 775 780 Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly 785 790 795 800 Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu 805 810 815 Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys 820 825 830 Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu 835 840 845 Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met 850 855 860 Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala 865 870 875 880 His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val 885 890 895 Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His 900 905 910 Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro 915 920 925 Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala 930 935 940 Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly 945 950 955 960 Ile Gly Leu Phe Met 965 <210> 8 <211> 400 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Thr Ser Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu 20 25 30 Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu 35 40 45 Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys 50 55 60 Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala 65 70 75 80 Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser 85 90 95 Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu 100 105 110 Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His 115 120 125 Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Leu Gln Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp 165 170 175 Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys 180 185 190 Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys 195 200 205 Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu 210 215 220 Lys Cys Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro 225 230 235 240 Ser Thr Val Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser 245 250 255 Pro Ser Gly Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr 260 265 270 Ala Ala Thr Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser 275 280 285 Lys Ser Pro Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser 290 295 300 His Gly Thr Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala 305 310 315 320 Ser Ala Ser His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp 325 330 335 Thr Thr Val Ala Ile Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser 340 345 350 Ala Val Ser Leu Leu Ala Cys Tyr Leu Lys Ser Arg Gln Thr Pro Pro 355 360 365 Leu Ala Ser Val Glu Met Glu Ala Met Glu Ala Leu Pro Val Thr Trp 370 375 380 Gly Thr Ser Ser Arg Asp Glu Asp Leu Glu Asn Cys Ser His His Leu 385 390 395 400 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Arg Tyr Thr Met His 1 5 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn 1 5 10 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 1 5 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn 1 5 10 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr 1 5 10 <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 21 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg 100 105 <210> 23 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 24 <211> 109 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 24 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala 100 105

Claims (45)

  1. CD3/TCR 복합체 작용물질(complex agonist), 피브로넥틴 또는 그의 변이체(variant), 및 CD30 작용물질의 존재하에서 CD3-양성 세포를 배양하는 단계 I을 포함하는, CD3-양성 세포의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    CD3/TCR 복합체 작용물질 및 피브로넥틴 또는 그의 변이체의 부재하에서 및 CD30 작용물질의 존재하에서 단계 I에서 배양된 CD3-양성 세포를 배양하는 단계 II를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    CD3-양성 세포가 다능성 줄기세포로부터 유래하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    다능성 줄기세포가 iPS 세포인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    CD3-양성 세포가 키메라 항원 수용체-발현 CD3-양성 세포인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    CD3-양성 세포가 CD3-양성 CD8-양성 세포인 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    CD3-양성 CD8-양성 세포가 CD3-양성 CD8-양성 CD4-음성 세포인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    CD3-양성 세포가 γTCR-양성 및/또는 δTCR-양성 세포인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    CD3/TCR 복합체 작용물질이 CDR3 작용물질 및/또는 TCR 작용물질인 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    CD3 작용물질이 항-CD3 작용물질 항체 또는 그의 결합 단편인 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    항-CD3 작용물질 항체 또는 그의 결합 단편이 UCHT1 클론으로부터 생성된 항-CD3 작용물질 항체 또는 그의 결합 단편인 방법.
  12. 제9항에 있어서,
    TCR 작용물질이 항-TCR 항체 또는 그의 결합 단편, HLA/펩티드 복합체 또는 그의 다량체, 및 HLA/초항원(superantigen) 복합체 또는 그의 다량체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나인 방법.
  13. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    항-CD3 작용물질 항체 또는 그의 결합 단편을 배양 용기에 고정화시키는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    항-CD3 작용물질 항체 또는 그의 결합 단편을, 1 ng/㎖ 내지 50000 ng/㎖의 상기 항-CD3 작용물질 항체 또는 그의 결합 단편을 배양 용기와 접촉시킴으로써 고정화시키는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    피브로넥틴 또는 그의 변이체가 레트로넥틴(RetroNectin)(등록상표)인 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    레트로넥틴(등록상표)을 배양 용기에 고정화시키는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    레트로넥틴(등록상표)을, 1 내지 150 ㎍/㎖의 레트로넥틴(등록상표)을 배양 용기와 접촉시킴으로써 고정화시키는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    CD30 작용물질이 항-CD30 작용물질 항체 또는 그의 결합 단편 및 CD30 리간드 또는 그의 결합 단편으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나인 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    항-CD30 작용물질 항체 또는 그의 결합 단편을 배지 중에 함유하는 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    배지 중의 항-CD30 작용물질 항체 또는 그의 결합 단편의 농도가 1 ng/㎖ 내지 1000 ng/㎖인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    배지가 IL-7, IL-15, IL-18 및 IL-21 중에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    배지가 IL-7, IL-15, IL-18 및 IL-21을 포함하는 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서,
    배지가 TL1A 및/또는 IL-12를 추가로 포함하는 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    생성된 CD3-양성 세포가 추가로 CD197-양성인 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 CD3-양성 세포.
  26. CD3/TCR 복합체 작용물질, 피브로넥틴 또는 그의 변이체, 및 CD30 작용물질의 존재하에서 CD3-양성 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 상기 CD3-양성 세포의 확대 배양 방법.
  27. CD-3 양성 세포의 확대 배양을 위한 키트(kit)로서,
    (1) CD3/TCR 복합체 작용물질, 및 피브로넥틴 또는 그의 변이체가 고정화된 배양 용기, 및
    (2) CD30 작용물질을 포함하는 배지
    를 포함하는 키트.
  28. CD3-양성 세포 중의 CD30 신호를 자극하는 단계를 포함하는, CD3-양성 세포를 CD3-양성 CD197-양성 세포로서 유지하는 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    CD3-양성 세포가 CD3-양성 CD8-양성 세포인 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    CD3-양성 CD8-양성 세포가 CD3-양성 CD8-양성 CD4-음성 세포인 방법.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    자극 단계에 사용되는 배지가 IL-7, IL-15, IL-18 및 IL-21 중에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    자극 단계에 사용되는 배지가 IL-7, IL-15, IL-18 및 IL-21을 포함하는 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서,
    자극 단계에 사용되는 배지가 TL1A 및/또는 IL-12를 추가로 포함하는 방법.
  34. CD30 작용물질을 포함하는, CD3-양성 세포를 CD3-양성 CD197-양성 세포로서 유지하기 위한 키트.
  35. 항원 결합 도메인, 막관통 도메인(transmembrane domain) 및 세포내 신호전달 도메인(intracellular signal transduction domain)을 포함하는 키메라 항원 수용체로서, 세포내 신호전달 도메인이 CD30 세포내 신호전달 도메인 또는 그의 돌연변이체를 포함하는 키메라 항원 수용체.
  36. 제35항에 따른 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산.
  37. 제36항에 따른 핵산을 포함하는 키메라 항원 수용체 발현 벡터.
  38. 제37항에 따른 키메라 항원 수용체 발현 벡터를 포함하는 키메라 항원 수용체-발현 세포.
  39. 제38항에 있어서,
    키메라 항원 수용체 발현 세포가 CD3-양성 세포인 세포.
  40. 제38항 또는 제39항에 따른 세포를 포함하는 약제.
  41. 제40항에 있어서,
    제35항에 따른 키메라 항원 수용체에 의해 인식된 항원을 발현하는 종양의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약제.
  42. 제35항에 따른 키메라 항원 수용체에 의해 인식된 항원을 발현하는 세포의 사멸을 위한 제제(agent)로서, 제38항 또는 제39항에 따른 세포를 포함하는 제제.
  43. 제38항 또는 제39항에 있어서,
    제35항에 따른 키메라 항원 수용체에 의해 인식된 항원을 발현하는 종양의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 세포.
  44. 제35항에 따른 키메라 항원 수용체에 의해 인식된 항원을 발현하는 종양의 예방 또는 치료를 위한 제제의 제조에서 제38항 또는 제39항에 따른 세포의 용도.
  45. 제38항 또는 제39항에 따른 세포를 투여함을 포함하는, 제35항에 따른 키메라 항원 수용체에 의해 인식된 항원을 발현하는 종양의 예방 또는 치료 방법.
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