BR112021002365A2

BR112021002365A2 - métodos para produzir uma célula cd3-positiva, para prevenção ou tratamento de um tumor e para manter uma célula cd3-positiva como uma célula cd3-positiva cd197-positiva, célula cd3-positiva, método de cultura para expansão de uma célula cd3-positiva, kits para cultura de expansão de uma célula cd3-positiva e para manter uma célula cd3-positiva como uma célula cd3-positiva cd197-positiva, receptor de antígeno quimérico, ácido nucleico, vetor de expressão do receptor de antígeno quimérico, célula expressando o receptor de antígeno quimérico, medicamento, agente para eliminar uma célula, e, uso da célula.

Info

Publication number: BR112021002365A2
Application number: BR112021002365-8A
Authority: BR
Inventors: Shin Kaneko; Yohei Kawai; Suguru Arima; Maiko Takiguchi; Kazuhide Nakayama; Yoshiaki Kassai; Akira Hayashi
Original assignee: Kyoto University; Takeda Pharmaceutical Company Limited
Priority date: 2018-08-10
Filing date: 2019-08-08
Publication date: 2021-05-11
Also published as: CO2021001701A2; IL280323A; AU2019318021A1; EP3835415A1; EP3835415B1; JP2024012413A; WO2020032179A1; CN112567025A; JP7382603B2; TW202016293A; CA3107421A1; SG11202100829SA; MX2021001528A; US20210301260A1; EP3835415A4; EP4455166A2; JPWO2020032179A1; KR20210044231A

Abstract

MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA CÉLULA CD3-POSITIVA, PARAPREVENÇÃO OU TRATAMENTO DE UM TUMOR E PARA MANTER UMA CÉLULA CD3-POSITIVA COMO UMA CÉLULA CD3-POSITIVA CD197-POSITIVA, CÉLULA CD3-POSITIVA, MÉTODO DE CULTURA PARA EXPANSÃO DE UMA CÉLULA CD3-POSITIVA, KITS PARACULTURA DE EXPANSÃO DE UMA CÉLULA CD3-POSITIVA E PARA MANTER UMA CÉLULA CD3-POSITIVA COMO UMA CÉLULA CD3-POSITIVA CD197-POSITIVA, RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO, ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO DO RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO, CÉLULA EXPRESSANDO O RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO, MEDICAMENTO, AGENTE PARA ELIMINAR UMA CÉLULA, E, USO DA CÉLULA Para possibilitar o fornecimento estável de células T diferenciadas, a presente invenção provê um método para a produção, ou um método de cultura para expansão, ou um kit para cultura de expansão e uma célula CD3-positiva na qual um marcador CD3 de células T é expresso na membrana celular.

Description

1 / 105 MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA CÉLULA CD3-POSITIVA, PARA

PREVENÇÃO OU TRATAMENTO DE UM TUMOR E PARA MANTER UMA CÉLULA CD3-POSITIVA COMO UMA CÉLULA CD3-POSITIVA CD197-POSITIVA, CÉLULA CD3-POSITIVA, MÉTODO DE CULTURA PARA EXPANSÃO DE UMA CÉLULA CD3-POSITIVA, KITS PARA CULTURA DE EXPANSÃO DE UMA CÉLULA CD3-POSITIVA E PARA MANTER UMA CÉLULA CD3-POSITIVA COMO UMA CÉLULA CD3- POSITIVA CD197-POSITIVA, RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO, ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO DO RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO, CÉLULA EXPRESSANDO O RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO, MEDICAMENTO, AGENTE PARA ELIMINAR UMA CÉLULA, E, USO DA CÉLULA Campo da invenção

[001] A presente invenção refere-se a um método de produção ou um método de cultura para expansão de células CD3-positivas (ou células CD3-positivas CD197-positivas), incluindo uma etapa de cultivo de células CD3-positivas na presença de um agonista do complexo CD3/TCR, fibronectina ou uma variante dela e um agonista de CD30, e a um kit para cultura de expansão de células CD3-positivas. A presente invenção também se refere a um método para manter células CD3-positivas como células CD3- positivas CD197-positivas, incluindo uma etapa de estimular um sinal de CD30 nas células CD3-positivas e a um kit para manter células CD3-positivas como células CD3-positivas CD197-positivas. Fundamentos da invenção

[002] Foi esclarecido que a imunoterapia mostra como forte efeito prolongar a vida mesmo em tipos de câncer para os quais não são eficazes tratamentos convencionais e está se tornando uma das principais terapias no tratamento contra o câncer. A terapia CART, incluindo a transferência de células T autólogas transfectadas com o gene do receptor de antígeno

2 / 105 quimérico (CAR) anti-CD19, descreve uma alta taxa de remissão completa para neoplasias malignas de células B, e a agência FDA aprovou duas terapias CART para leucemia linfoblástica aguda de células B e linfoma difuso de grandes células B em 2017. Além disso, há muitos estudos clínicos em andamento para terapia do TCR-células T em que um gene do receptor de células T (TCR) que reconhece o antígeno de células cancerígenas é introduzido.

Embora essas terapias com células T geneticamente modificadas, usando células T dos próprios pacientes (próprias) mostrem resultados clínicos extremamente superiores, elas envolvem transporte, modificação gênica, cultura celular e similares de células T.

Tais processos complicados requerem diversas semanas ou mais e dificultam a supressão de custos e o controle de qualidade.

Além do mais, dado que levam à perda de oportunidades de tratamento para paciente com câncer de rápido crescimento, há uma forte demanda pelo desenvolvimento de uma terapia com células T alogênicas off-the-shelf (pronta para uso). Até o momento, foram relatados um método de cultura para expansão de células T coletadas de pacientes, um método para produzir linfócitos Tc1 CD8-positivos ou linfócitos Tc2 CD8- positivos pelo contato de uma população de células T com um anticorpo agonista anti-CD3 e um anticorpo agonista anti-CD30 (Documento de Patente 1), um método de cultura para expansão de células T tumor-específicas obtendo-se uma população de células T de um paciente com câncer e colocando a população de células T em contato com um anticorpo agonista anti-CD3, um anticorpo anti-CD28, um inibidor de VEGF (Documento de Patente 2). No entanto, a capacidade de células T derivadas de doador sadio ou pacientes é limitada, e o número de células T geneticamente modificadas que podem ser produzidas a partir de células T e que podem ser recuperadas por aférese simples é restrito.

Além disso, foi relatado que a cultura de expansão de células T por estimulação de TCR causa um aumento transitório na expressão de CCR7 (CD197), que é um marcador de superfície celular de

3 / 105 células virgens e células T de memória, seguido por desaparecimento dentro de diversas semanas depois (Documento Não de Patente 1). Além disso, foi relatado que uma célula T de memória (“persistência das células T”) é importante para atividade antitumoral in vivo, e que um efeito antitumoral in vivo elevado foi observado aumentando-se o número de células CART a serem administradas, a qual é uma célula T de memória (Documento Não de Patente 2). Portanto, a baixa expressão de CD197 na população de células obtidas pela cultura para expansão de células T não é adequada para o tratamento de câncer.

[003] Por outro lado, dado que células T diferenciadas a partir de células-tronco pluripotentes, tais como célula iPS, célula ES, e similares (células T diferenciadas), são produzidas a partir de células-troncos pluripotentes que, teoricamente, se proliferam infinitamente, em teoria, é possível produzir células T modificadas infinitamente. No entanto, um método de cultura para expansão de células iPS enquanto mantendo a pluripotência requer alto custo e envolve dificuldades técnicas. Portanto, um método para obter células T diferenciadas, especialmente células T CD197- positivas, pela proliferação de um grande número de iPS, tem limitação. Como resultado, tem sido exigida outra abordagem para obter um número grande de células T, especialmente células T CD197-positivas. Lista de documentos Documentos de Patentes

[004] Documento de Patente 1: WO 2003/038062 Documento de Patente 2: US-A-2014/0255368 Documentos Não de Patente

[005] Documento Não de Patente 1: Sallusto et al., Eur. J. Immunol. vol. 29, 2037-2045, 1999 Documento Não de Patente 2: Kaartinen et al., Cytotherapy vol. 19, 689-702, 2017

4 / 105 Sumário da invenção Problema técnico

[006] A presente invenção tem por objetivo suprir células T diferenciadas, especialmente células T CD197-positivas, e provê um método de produção, um método de cultura para expansão e um kit para cultura de expansão de células CD3-positivas com um marcador CD3 de células T expresso em uma membrana celular. Outro objeto da presente invenção é prover um método para manter células T CD197-positivas e um kit para manter células T CD197-positivas. Solução para o problema

[007] Os presentes inventores conduziram estudos intensos tentando atingir os objetos e verificaram que células T CD8-positivas, obtidas de células iPS transfectadas com o gene TCR (células T CD8-positivas derivadas de células iPS) podem se proliferar eficientemente pela cultura das células T em um meio que contém um anticorpo agonista anti-CD30 em um recipiente de cultura no qual o anticorpo agonista anti-CD3 e RetroNectin (marca registrada) são imobilizados. Além disso, confirmaram que a eficiência da proliferação das células T e a atividade citotóxica antígeno-específica não são afetadas, mesmo quando as células T CD8-positivas derivadas de células iPS proliferam-se repetidamente pelo método de cultura. Além disso, verificaram que, quando as células T CD-8 positivas derivadas de células iPS são cultivadas usando um anticorpo agonista anti-CD30, a taxa de expressão de CD197 torna-se alta em comparação a não usar o anticorpo agonista anti- CD30, e as células T proliferadas estão presentes como células T de memória central. De modo semelhante às células T CD8-positivas derivadas de células iPS, além disso, células T CD8-positivas derivadas do sangue periférico humano e células T CD8-positivas derivadas de células iPS, transfectadas com o gene CAR-anti-CD19 (células CART-anti-CD19 derivadas de células iPS), puderam também diferenciar-se eficientemente pela adição de um

5 / 105 anticorpo agonista anti-CD30 ao meio em um recipiente de cultura no qual o anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) são imobilizados. Além disso, verificaram que, quando células T CD8-positivas derivadas do sangue periférico humano ou células CART-anti-CD19 derivadas de células iPS são cultivadas usando um anticorpo agonista anti-CD30, a expressão de CD197 é mantida por um longo prazo e as células T CD8-positivas derivadas do sangue periférico humano podem sobreviver in vivo por um longo prazo em comparação a não utilizar o anticorpo agonista anti-CD30. Com base nos achados acima, eles completaram a presente invenção.

[008] Dessa forma, a presente invenção provê o seguinte:

[1] Um método para produzir uma célula CD3-positiva, o qual compreende a etapa (I) de cultivar a célula CD3-positiva na presença de um agonista do complexo CD3/TCR, fibronectina ou uma variante dela e um agonista de CD30.

[009] [2] O método de [1], compreendendo ainda a etapa (II) de cultivar a célula CD3-positiva cultivada na etapa (I) na ausência de um agonista do complexo CD3/TCR e fibronectina ou uma variante dela, e na presença de um agonista de CD30.

[0010] [3] O método de [1] ou [2], em que a célula CD3-positiva é derivada de uma célula-tronco pluripotente.

[0011] [4] O método de [3], em que a célula-tronco pluripotente é uma célula iPS.

[0012] [5] O método de qualquer um dentre [1] e [4], em que a célula CD3-positiva é uma célula CD3-positiva que expressa receptor quimérico de antígeno.

[0013] [6] O método de qualquer um dentre [1] e [5], em que a célula CD3-positiva é uma célula CD3-positiva CD8-positiva.

[0014] [7] O método de [6], em que a célula CD3-positiva CD8- positiva é uma célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-negativa.

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[0015] [8] O método de qualquer um dentre [1] e [7], em que a célula CD3-positiva é uma célula γTCR-positiva e/ou δTCR-positiva.

[0016] [9] O método de qualquer um dentre [1] e [8], em que o agonista do complexo CD3/TCR é um agonista de CD3 e/ou um agonista de TCR.

[0017] [10] O método de [9], em que o agonista de CD3 é um anticorpo agonista anti-CD3 ou um fragmento de ligação do mesmo.

[0018] [11] O método de [10], em que o anticorpo agonista anti-CD3 ou um fragmento de ligação do mesmo é um anticorpo agonista anti-CD3 ou um fragmento de ligação do mesmo produzido a partir do clone UCHT1.

[0019] [12] O método de [9], em que o agonista de TCR é pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo anti-TCR ou um fragmento de ligação do mesmo, um complexo HLA/peptídeo ou um multímero do mesmo e um complexo HLA/superantígeno ou um multímero do mesmo.

[0020] [13] O método de [10] ou [11], em que o anticorpo agonista anti-CD3 ou um fragmento de ligação do mesmo é imobilizado em um recipiente de cultura.

[0021] [14] O método de [13], em que o anticorpo agonista anti-CD3 ou um fragmento de ligação do mesmo é imobilizado colocando o anticorpo agonista anti-CD3, ou um fragmento de ligação do mesmo, 1 ng/mL-50000 ng/mL em contato com o recipiente de cultura.

[0022] [15] O método de qualquer um dentre [1] a [14], em que a fibronectina ou uma variante dela é RetroNectin (marca registrada).

[0023] [16] O método de [15], em que a RetroNectin (marca registrada) é imobilizada no recipiente de cultura.

[0024] [17] O método de [16], em que a RetroNectin (marca registrada) é imobilizada colocando a RetroNectin (marca registrada), 1-150 μg/mL, em contato com o recipiente de cultura.

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[0025] [18] O método de qualquer um dentre [1] a [17], em que o agonista de CD30 é pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo agonista anti-CD30 ou um fragmento de ligação do mesmo e um ligante de CD30 ou um fragmento de ligação do mesmo.

[0026] [19] O método de [18], em que o anticorpo agonista anti-CD30 ou um fragmento de ligação do mesmo está contido no meio.

[0027] [20] O método de [19], em que uma concentração do anticorpo agonista anti-CD30 ou um fragmento de ligação do mesmo no meio é 1 ng/mL-1000 ng/mL.

[0028] [21] O método de qualquer um dentre [1] a [20], em que o meio compreende pelo menos um selecionado dentre IL-7, IL-15, IL-18 e IL-

21.

[0029] [22] O método de [21], em que o meio compreende IL-7, IL- 15, IL-18 e IL-21.

[0030] [23] O método de [21] ou [22], em que o meio compreende adicionalmente TL1A e/ou IL-12.

[0031] [24] O método de qualquer um dentre [1] a [23], em que a célula CD3-positiva produzida é ainda CD197-positiva.

[0032] [25] Uma célula CD3-positiva obtida pelo método de qualquer um dentre [1] a [24].

[0033] [26] Um método de cultura para expansão de uma célula CD3- positiva, o qual compreende uma etapa de cultivo de a célula CD3-positiva na presença de um agonista do complexo CD3/TCR, fibronectina ou uma variante dela, e um agonista de CD30.

[0034] [27] Um kit para cultura de expansão de uma célula CD3- positiva, o qual compreende os seguintes: (1) um recipiente de cultura no qual um agonista do complexo CD3/TCR e fibronectina ou uma variante dela são imobilizados, e

8 / 105 (2) um meio compreendendo um agonista de CD30.

[0035] [28] Um método para manter uma célula CD3-positiva como uma célula CD3-positiva CD197-positiva, o qual compreende uma etapa de estimular um sinal para CD30 na célula CD3-positiva.

[0036] [29] O método de [28], em que a célula CD3-positiva é uma célula CD3-positiva CD8-positiva.

[0037] [30] O método de [29], em que a célula CD3-positiva CD8- positiva é uma célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-negativa.

[0038] [31] O método de qualquer um dentre [28] a [30], em que o meio usado no meio de estimulação compreende pelo menos um selecionado dentre IL-7, IL-15, IL-18 e IL-21.

[0039] [32] O método de [31], em que o meio usado na etapa de estimulação compreende IL-7, IL-15, IL-18 e IL-21.

[0040] [33] O método de [31] ou [32], em que o meio usado na etapa de estimulação compreende adicionalmente TL1A e/ou IL-12.

[0041] [34] Um kit para manter uma célula CD3-positiva como célula CD3-positiva CD197-positiva, o qual compreende um agonista de CD30.

[0042] [35] Um receptor de antígeno quimérico que compreende um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembrana e um domínio de transdução de sinal intracelular, em que o domínio de transdução de sinal intracelular compreende um domínio de transdução de sinal intracelular de CD30 ou um mutante do mesmo.

[0043] [36] Um ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo que codifica o receptor de antígeno quimérico de [35].

[0044] [37] Um vetor de expressão do receptor de antígeno quimérico que compreende o ácido nucleico de [36].

[0045] [38] Uma célula expressando o receptor de antígeno quimérico que compreende o vetor de expressão do receptor de antígeno quimérico de

[37].

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[0046] [39] A célula de [38], em que a célula expressando o receptor de antígeno quimérico é uma célula CD3-positiva.

[0047] [40] Um medicamento compreendendo a célula de [38] ou

[39].

[0048] [41] O medicamento de [40] para uso na profilaxia ou no tratamento de um tumor expressando um antígeno reconhecido pelo receptor de antígeno quimérico de [35].

[0049] [42] Um agente para eliminar uma célula que expressa um antígeno reconhecido pelo receptor de antígeno quimérico de [35], em que o agente compreende a célula de [38] ou [39].

[0050] [43] A célula de [38] ou [39] para uso na profilaxia ou no tratamento de um tumor que expressa um antígeno reconhecido pelo receptor de antígeno quimérico de [35].

[0051] [44] Uso da célula de [38] ou [39] na produção de um agente para a profilaxia ou o tratamento de um tumor que expressa um antígeno reconhecido pelo receptor de antígeno quimérico de [35].

[0052] [45] Um método para prevenir ou tratar um tumor que expressa um antígeno reconhecido pelo receptor de antígeno quimérico de

[35], o qual compreende administrar a célula de [38] ou [39]. Efeitos vantajosos da invenção

[0053] Células T podem ser produzidas com eficiência ou expandidas em cultura pelo cultivo de células CD3-positivas na presença de um agonista do complexo CD3/TCR, fibronectina ou uma variante dela e um agonista de CD30. Além disso, considerando que as células CD3-positivas produzidas ou expandidas em cultura pela cultura mencionada acima são células CD197- positivas, prevê-se eficácia em longo prazo quando as células forem usadas para terapia com células T geneticamente modificadas. Além disso, células CD3-positivas podem ser mantidas por longo prazo como células CD197- positivas estimulando o sinal de CD30 das células.

10 / 105 Breve descrição dos desenhos

[0054] A Figura 1 mostra concentrações adequadas para imobilizar o anticorpo agonista anti-CD3 e RetroNectin (marca registrada) conforme medidas pelo método ELISA.

[0055] A Figura 2 mostra contagens de células T derivadas de iPSC (medidas pela quantidade de ATP) 12 dias após estimulação com anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados.

[0056] A Figura 3 mostra curvas de proliferação de células T derivadas de iPSC estimuladas com anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) ou anti-CD3/CD28 imobilizados em microesferas. O eixo vertical mostra contagens de células e o eixo horizontal mostra o número de dias transcorridos desde o dia quando a estimulação mencionada acima foi iniciada.

[0057] A Figura 4 mostra curvas de proliferação de células T derivadas de iPSC para cada número de estimulações com anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados.

[0058] A Figura 5 mostra a atividade citotóxica antígeno-específica de células T derivadas de iPSC proliferadas por estimulação com anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados.

[0059] A Figura 6 mostra a proliferação promovida de células T derivadas de iPSC estimuladas com anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados pela adição de um anticorpo agonista anti- CD30. O eixo vertical mostra contagens de células e o eixo horizontal mostra o número de dias transcorridos desde o dia quando a estimulação mencionada acima foi iniciada.

[0060] A Figura 7 mostra as curvas de proliferação de células T derivadas de iPSC que se submeteram a um teste de proliferação no qual as células T derivadas de iPSC foram estimuladas (primeira estimulação) com anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados, ou

11 / 105 anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados e anticorpo agonista anti-CD30 e, a seguir, a mesma estimulação (segunda estimulação) novamente após a conclusão do teste. O eixo vertical mostra contagens de células e o eixo horizontal mostra o número de dias transcorridos desde o dia quando a segunda estimulação mencionada acima foi iniciada.

[0061] A Figura 8 mostra a expressão de CD197 e CD45RA na superfície da membrana celular de células T derivadas de iPSC 7 dias após estimulação com anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados, ou anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados e anticorpo agonista anti-CD30.

[0062] A Figura 9 mostra a atividade citotóxica antígeno-específica de células T derivadas de iPSC proliferadas por estimulação com anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados e anticorpo agonista anti-CD30.

[0063] A Figura 10 mostra curvas de proliferação de células T CD8- positivas derivadas de sangue periférico humano, estimuladas com anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados, ou anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados e anticorpo agonista anti-CD30. O eixo vertical mostra contagens de células e o eixo horizontal mostra o número de dias transcorridos desde o dia quando a estimulação mencionada acima foi iniciada.

[0064] A Figura 11 mostra a expressão de CD197 na superfície da membrana celular de células T CD8-positivas derivadas de sangue periférico humano após estimulação com microesferas de anti-CD3/CD28 contendo várias ILs e anticorpo anti-CD30.

[0065] A Figura 12 mostra o número de células T CD8-positivas humanas que sobreviveram no sangue, baço e medula óssea de camundongos imunodeficientes irradiados 4 semanas depois do transplante intravenoso de

12 / 105 células T CD8-positivas derivadas de sangue periférico humano após estimulação com microesferas de anti-CD3/CD28 contendo várias ILs e anticorpo anti-CD30.

[0066] A Figura 13 mostra curvas de proliferação de células T derivadas de células iPS (iPS-T) e de células CART-anti-CD19 derivadas de células iPS (iPS-CART anti-CD19) estimuladas com anticorpo agonista anti- CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados e anticorpo agonista anti- CD30. O eixo vertical mostra contagens de células e o eixo horizontal mostra o número de dias transcorridos desde o dia quando a estimulação mencionada acima foi iniciada.

[0067] A Figura 14 mostra curvas de proliferação de células CART- anti-CD19 derivadas de células iPS estimuladas com anticorpo agonista anti- CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados, ou anticorpo agonista anti- CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados e anticorpo agonista anti- CD30. O eixo vertical mostra contagens de células e o eixo horizontal mostra o número de dias transcorridos desde o dia quando a estimulação mencionada acima foi iniciada.

[0068] A Figura 15 mostra a expressão de CD197 na superfície da membrana celular de células CART-anti-CD19 derivadas de células iPS estimuladas com anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados, ou anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados e anticorpo agonista anti-CD30.

[0069] A Figura 16 mostra a atividade citotóxica, contra células Raji expressando CD19, de células CART-anti-CD19 derivadas de células iPS estimuladas com anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados pela adição do anticorpo agonista anti-CD30.

[0070] A Figura 17 mostra a atividade citotóxica, contra células Raji expressando CD19, de células CART-anti-CD19 derivadas de células iPS (iCD19-CD30-CART) contendo um domínio intracelular derivado de CD30.

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[0071] A Figura 18 mostra a proliferação celular de células Tγδ (células Tiγδ) diferenciadas de células iPS não derivadas de células T e estimuladas com anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados pela adição de anticorpo agonista anti-CD30. O eixo vertical mostra a razão de proliferação celular, e o eixo horizontal mostra o número de dias transcorridos desde o dia quando a estimulação mencionada acima foi iniciada.

[0072] A Figura 19 mostra a proliferação celular de células anti- CD19-CARTγδ (células iCARTγδ) estimuladas com anticorpo agonista anti- CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados pela adição de anticorpo agonista anti-CD30. O eixo vertical mostra contagens de células e o eixo horizontal mostra o número de dias transcorridos desde o dia quando a estimulação mencionada acima foi iniciada.

[0073] A Figura 20 mostra a atividade citotóxica antígeno-específica de células iCD19CAR/IL-15γδT proliferadas por estimulação com anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados.

[0074] A Figura 21 mostra o efeito de aumentar os dias de sobrevida de camundongos portadores de tumores expressando CD19 humano por células iCD19CAR/IL-15γδT proliferadas por estimulação com anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados.

[0075] A Figura 22 mostra o efeito antitumoral de células iCD19CAR/IL-15αβT proliferadas por estimulação com anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados.

[0076] A Figura 23 mostra a concentração adequada para imobilização de anticorpo agonista anti-CD3 (UCHT1) e RetroNectin (marca registrada) conforme medida pelo método ELISA.

[0077] A Figura 24 mostra a taxa de proliferação de células T derivadas de iPSC 13 dias após estimulação com anticorpo agonista anti-CD3 (UCHT1)/RetroNectin (marca registrada) imobilizados e anticorpo agonista

14 / 105 anti-CD30. Descrição detalhada da invenção

[0078] No presente relatório descritivo, a “expressão do gene” abrange não só a síntese de mRNA a partir de uma sequência de nucleotídeos específica do gene (também referido como transcrição ou expressão de mRNA), mas também a síntese da proteína com base nas informações do mRNA (também referido como tradução ou expressão proteica). A menos que especificado de outra forma, a “expressão do gene” ou “expressão” simples significa a expressão da proteína.

[0079] No presente relatório descritivo, “positiva” que uma proteína ou mRNA é expresso em uma quantidade detectável por um método conhecido na técnica. A proteína pode ser detectada por um ensaio imunológico usando um anticorpo, tal como método ELISA, método de imunocoloração, método de Western blot e citometria de fluxo. Além disso, uma proteína repórter é expressa junto com a proteína, e a proteína alvo pode ser detectada detectando-se a proteína repórter. Além disso, a presença de uma proteína pode ser detectada detectando-se a função da proteína (p. ex., quando a proteína é um fator de transcrição, um gene cuja expressão é controlada pela proteína é detectado, e quando a proteína é uma enzima, um substrato ou proteína catalisado pela proteína é detectado, e similares). mRNA pode ser detectado, por exemplo, pelo método de amplificação de ácidos nucleicos e/ou detecção de ácidos nucleicos tais como RT-PCR, microarranjo, biochip, RNAseq e similares.

[0080] No presente relatório descritivo, “negativa” significa que o nível de expressão da proteína ou mRNA é menor do que o limite inferior de detecção por todos ou qualquer um dos métodos conhecidos mencionados acima. O limite inferior de detecção de expressão da proteína ou mRNA pode variar dependendo de cada método.

[0081] No presente relatório descritivo, a “cultura” refere-se a manter,

15 / 105 proliferar (crescer) e/ou diferenciar células em um ambiente in vitro. “Cultivar” significa manter, proliferar (crescer) e/ou diferenciar células fora do tecido ou ex vivo, por exemplo, em uma placa ou frasco de cultura celular.

[0082] No presente relatório descritivo, a “cultura de expansão” significa cultivar para fins de proliferar uma população celular desejada e aumentar o número de células. O aumento número de células pode ser conseguido aumentando o número de células por proliferação até exceder a diminuição no número por morte, e não requer a proliferação de todas as células na população de células. O aumento no número de células pode ser de 1,1 vezes, 1,2 vezes, 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 300 vezes, 500 vezes, 1.000 vezes, 3.000 vezes, 5.000 vezes, 10.000 vezes, 100.000 vezes ou não menos do que 1.000.000 vezes, quando comparado àquele anterior ao início da cultura de expansão.

[0083] No presente relatório descritivo, “estimulação” significa que certa substância se liga a vários receptores e similares para ativar uma via de sinalização a jusante da mesma.

[0084] No presente relatório descritivo, “enriquecer” refere-se a aumentar a quantidade de um componente constituinte específico em uma composição tal como uma composição celular e semelhantes, e “enriquecido” refere-se a uma população celular na qual, quando usado para explicar uma composição celular, por exemplo, população celular, a quantidade de um componente constituinte específico aumentou em comparação à proporção de tal componente constituinte na população celular antes do enriquecimento. Por exemplo, uma composição, tal como uma população celular e similares, pode ser enriquecida em relação a um tipo de célula alvo e, portanto, a proporção do tipo da célula alvo aumenta quando comparada àquela da célula alvo presente na população celular antes do enriquecimento. A população celular pode também ser enriquecida em relação a um tipo de célula alvo por

16 / 105 seleção de células ou um método de rastreio conhecido na técnica. A população celular pode também ser enriquecida pelo processo de seleção ou rastreio específico descrito no presente relatório descritivo. Em modalidades específicas da presente invenção, pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% da população celular alvo é enriquecida por um método para enriquecimento da população celular alvo.

[0085] No presente relatório descritivo, a “população celular” significa duas ou mais células do mesmo tipo ou de tipos diferentes. A “população celular” também significa uma massa de células do mesmo tipo ou de tipos diferentes.

[0086] A presente invenção provê um método de produção ou um método de cultura para expansão de células CD3-positivas, incluindo uma etapa de cultivo de células CD3-positivas na presença de um agonista do complexo CD3/TCR, fibronectina ou uma variante dela, e um agonista de CD30 (a seguir referido, às vezes, como o método de produção ou método de cultura para expansão da presente invenção).

[0087] O complexo CD3/TCR e CD30 podem ser respectivamente estimulados com um agonista do complexo CD3/TCR e um agonista de CD30.

[0088] No método de produção ou método de cultura para expansão da presente invenção, a célula CD3-positiva a ser cultivada não é especialmente limitada desde que expresse CD3 na membrana celular. De preferência, a célula CD3-positiva é uma célula CD3-positiva CD8-positiva (célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-positiva ou célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-negativa), mais preferivelmente, uma célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-negativa. Outra célula CD3-positiva preferida é, por exemplo, uma célula CD3-positiva CD4-positiva (célula CD3-positiva CD4- positiva CD8-positiva ou uma célula CD3-positiva CD4-positiva CD8- negativa).

17 / 105

[0089] A célula CD3-positiva a ser cultivada pelo método de produção ou método de cultura para expansão da presente invenção pode ser CD30-positiva antes da cultura, ou diferenciada para ser CD30-positiva durante a cultura. Portanto, quando a célula CD3-positiva é CD30-positiva antes da cultura, a célula CD3-positiva é preferivelmente uma célula CD3- positiva CD8-positiva CD30-positiva (célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-positiva CD30-positiva ou célula CD3-positiva CD8-positiva CD4- negativa CD30-positiva), mais preferivelmente, uma célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-negativa CD30-positiva. Outra célula CD3-positiva preferida é, por exemplo, uma célula CD3-positiva CD4-positiva CD30- positiva (célula CD3-positiva CD4-positiva CD8-positiva CD30-positiva ou célula CD3-positiva CD4-positiva CD8-negativa CD30-positiva).

[0090] A célula CD3-positiva obtida por produção ou cultura de expansão pelo método de produção ou método de cultura para expansão da presente invenção não é especialmente limitada desde que expresse CD3 na membrana celular, e pode ser, por exemplo, uma célula semelhante à célula CD3-positiva cultivada no método de produção ou método de cultura para expansão da presente invenção. A célula CD3-positiva após a produção ou cultura de expansão é preferivelmente CD197-positiva. A célula CD3-positiva após a produção ou cultura de expansão é ainda CD197-positiva, a célula é especificamente uma célula CD3-positiva CD8-positiva CD197-positiva (célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-positiva CD197-positiva ou célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-negativa CD197-positiva), mais preferivelmente, uma célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-negativa CD197-positiva. Alternativamente, a célula é uma célula CD3-positiva CD4- positiva CD30-positiva CD197-positiva (célula CD3-positiva CD4-positiva CD8-positiva CD30-positiva CD197-positiva ou célula CD3-positiva CD4- positiva CD8-negativa CD30-positiva CD197-positiva). Entre as células CD3- positivas, por ser classificada em célula T de memória de células-tronco ou

18 / 105 célula T de memória central de acordo com a presença ou ausência da expressão de CD45RA, e por dispor de alta capacidade de autoproliferação podendo fornecer células T efetoras, a célula CD197-positiva é adequada para imunidade antitumoral.

[0091] A célula CD3-positiva depois da produção ou cultura de expansão é ainda preferivelmente CD197-positiva CD45RA-negativa. Quando a célula CD3-positiva depois da produção ou cultura de expansão é ainda CD197-positiva CD45RA-negativa, a célula é especificamente uma célula CD3-positiva CD8-positiva CD197-positiva CD45RA-negativa (célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-positiva CD197-positiva CD45RA-negativa ou célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-negativa CD197-positiva CD45RA-negativa), mais preferivelmente, uma célula CD3-positiva CD8- positiva CD4-negativa CD197-positiva CD45RA-negativa. Alternativamente, a célula é uma CD3-positiva CD4-positiva CD30-positiva CD197-positiva CD45RA-negativa (célula CD3-positiva CD4-positiva CD8-positiva CD30- positiva CD197-positiva CD45RA-negativa ou célula CD3-positiva CD4- positiva CD8-negativa CD30-positiva CD197-positiva CD45RA-negativa). Entre as células CD3-positivas, a célula CD197-positiva CD45RA-negativa é também chamada particularmente célula T de memória central.

[0092] CD3 é uma molécula que é expressa durante o processo de maturação de células T, forma um complexo maior (complexo CD3/TCR) com o receptor de células T (TCR), e é também conhecida como um marcador de células T. É um complexo formado por 4 tipos de polipeptídeos das cadeias γ, δ, ε, e ζ. O TCR que forma um complexo com CD3 é uma molécula que transmite um sinal para células T, e os exemplos incluem um dímero composto por duas dentre a cadeia α (TCRα), cadeia β (TCRβ), cadeia γ (TCRγ) e cadeia δ (TCRδ), um heterodímero (αβTCR) composto por TCRα e TCRβ, um heterodímero (γδTCR) composto por TCRγ e TCRδ e um homodímero compostos das mesmas cadeias que TCR. Do mesmo modo que

19 / 105 CD3, CD8 é expresso in vivo durante o processo de maturação de células T e é expresso junto com CD4 nos estágios iniciais da maturação, mas somente a expressão de CD4 é perdida junto com a diferenciação em células T citotóxicas. CD8 é uma molécula que funciona como um co-receptor do complexo CD3/TCR e reconhece MHC classe I/peptídeo antigênico, e é um homodímero constituído por polipeptídeos de cadeia α ou um heterodímero composto por dois tipos de polipeptídeos de cadeias α e β. CD4 é expresso in vivo junto com CD8 nos estágios iniciais da maturação de células T, mas somente a expressão de CD8 é perdida junto com a diferenciação em células T helper (auxiliares). Do mesmo modo que CD8, CD4 também funciona como um co-receptor do complexo CD3/TCR, mas diferentemente de CD8, é uma molécula que reconhece MHC classe II/peptídeo antigênico. CD30 é conhecido como uma molécula expressa em linfócitos ativados (células T e células B), possui 6 motivos pseudo-repetidos ricos em cisteína como domínios extracelulares e possui, como domínio intracelular, uma sequência de ligação ao fator relacionado ao receptor de TNF (TRAF) que estimula o sinal de NFκB. CD197 e CD45RA são utilizados como moléculas marcadoras para distinguir, em células T, célula T virgem ou célula T de memória de células-tronco (CD197-positiva, CD45RA-positiva), célula T de memória central (CD197-positiva, CD45RA-negativa), célula T de memória efetora (CD197-negativa, CD45RA-negativa) e célula T efetora (CD197-negativa, CD45RA-positiva).

[0093] No método de produção ou método de cultura para expansão da presente invenção, as células CD3-positivas a serem cultivadas podem ser células coletadas de um mamífero ou células obtidas pela diferenciação de células-tronco pluripotentes. São preferidas células obtidas pela diferenciação de células-tronco pluripotentes.

[0094] Quando as células CD3-positivas são coletadas de um mamífero, as células podem ser isoladas e coletadas, por exemplo, coletando

20 / 105 células mononucleares do sangue periférico (PBMC) do mamífero por aférese e, a seguir, usando coluna de anticorpo anti-CD3, método de centrifugação por gradiente de densidade e similares. Os mamíferos para a coleta de células CD3-positivas incluem humanos e animais diferentes de humanos (p. ex., cão, gato, camundongo, rato, hamster, cobaia, coelho, suíno, bovino, cabra, cavalo, ovelha, macaco etc.), e humano é preferível.

[0095] Quando a célula CD3-positiva é uma célula obtida pela diferenciação de células-tronco pluripotentes, as células-tronco pluripotentes incluem célula-tronco embrionária (célula ES), célula-tronco pluripotente induzida (célula iPS), célula de carcinoma embrionário (célula EC) e célula germinativa embrionária (célula EG). É preferida célula ES ou célula iPS (é mais preferida célula iPS humana).

[0096] Quando a célula-tronco pluripotente é uma célula ES, ela pode ser produzida por um método conhecido por si mesmo. Os exemplos do método de produção de célula ES incluem, entre outros, um método de cultivo de massa celular interna no estágio de blastocisto de um mamífero (ver, por exemplo, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994)) e um método de cultivo de embrião em estágio inicial pela transferência nuclear de células somáticas (Wilmut et al., Nature, 385, 810(1997); Cibelli et al., Science, 280, 1256(1998); Akira Iriya et al., Protein Nucleic Acid Enzyme, 44, 892(1999); Baguisi et al., Nature Biotechnology, 17, 456(1999); Wakayama et al., Nature, 394, 369(1998); Wakayama et al., Nature Genetics, 22, 127(1999); Wakayama et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984(1999); RideoutIII et al., Nature Genetics, 24, 109(2000)) e similares. Células ES podem ser obtidas de uma instituição predeterminada, e podem também ser adquiridas como um produto comercial. Por exemplo, as linhagens de células ES humanas H1, H7, H9, H13 e H14 são disponibilizadas pelo WiCell Research Institute nos Estados Unidos, as linhagens de células ES humanas HES1-6 são

21 / 105 disponibilizas pelo ES Cell International na Austrália, as linhagens de células ES humanas SA002, SA181 e SA611 são disponibilizas pela Cellartis AB na Suécia, as linhagens de células ES humanas HUES1-17 são disponibilizas pela HUES Cell Facility nos Estados Unidos, as linhagens de células ES humanas KhES-1 - KhES-5 são disponibilizas pelo Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Universidade de Quioto e as linhagens de células ES humanas SEES1 - SEES7 são disponibilizas pelo National Center for Child Health and Development. Quando a célula ES é produzida por transferência nuclear de células somáticas, o tipo de células somáticas e a fonte para coleta de células somáticas são iguais àqueles na produção de células iPS descrita abaixo.

[0097] Quando a célula-tronco pluripotente é uma célula iPS, a célula iPS pode ser produzida introduzindo uma substância para reprogramação nuclear na célula somática. As células somáticas que podem ser usadas como material de partida para produção de células iPS podem ser qualquer célula que não células germinativas derivadas de mamíferos (p. ex., camundongo ou humano). Os exemplos incluem células epiteliais queratinizantes (p. ex., células queratinizadas), células epiteliais de mucosas (p. ex., célula epitelial na camada superficial da língua), células epiteliais de glândulas exócrinas (p. ex., célula mamária), células secretoras de hormônios (p. ex., célula da medula adrenal), células metabólicas/de armazenamento (p. ex., hepatócito), células epiteliais luminais que constituem a interface (p. ex., célula alveolar tipo I), células epiteliais vasculares luminais (p. ex., célula do endotélio vascular), células ciliadas com capacidade para transporte (p. ex., célula epitelial das vias aéreas), células de secreção da matriz extracelular (p. ex., fibroblasto), células contrácteis (p. ex., célula do músculo liso), células do sangue e sistema imune (p. ex., linfócito T), células relacionadas a sensor (p. ex., bastonete), neurônios do sistema nervoso autônomo (p. ex., neurônio colinérgico), células de apoio a órgãos sensoriais e neurônios periféricos (p.

22 / 105 ex., célula satélite), células nervosas e células gliais do sistema nervoso central (p. ex., célula astroglial), células pigmentares (p. ex., célula epitelial pigmentar da retina) e células progenitoras do mesmo (célula do tecido progenitor) e similares. O grau de diferenciação celular não é especialmente limitado, e ambas, células progenitoras indiferenciadas (incluindo células- tronco somáticas) e células maduras finalmente diferenciadas, podem ser igualmente usadas como a origem da célula somática na presente invenção. Neste relatório descritivo, exemplos da célula progenitora indiferenciada incluem células-tronco de tecidos (células-tronco somáticas) tais como célula do estroma (tronco) derivadas de gordura, célula-tronco nervosa, célula- tronco hematopoiética, célula-tronco mesenquimal, célula-tronco de polpa e similares.

[0098] A substância para reprogramação nuclear a ser introduzida em células somáticas para produzir células iPS inclui combinações de vários genes de reprogramação relatados até o momento (ver, por exemplo, WO 2007/069666, Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008), Cell, 126, 663-676 (2006), Cell, 131, 861-872 (2007), Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009), Nature, 451, 141-146 (2008), Science, 318, 1917-1920 (2007), Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008), Cell Research (2008) 600-603, Nature 454: 646-650 (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528(2008), WO2008/118820, Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009), Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009), Science, 324: 797- 801 (2009)). Além disso, uma proteína codificada pelo gene de reprogramação mencionado acima pode também ser introduzida como uma substância para reprogramação nuclear em uma célula somática (Cell Stem Cell, 4: 381-384(2009), Cell Stem Cell, doi:10.1016/j.stem.2009.05.005 (2009)). Especificamente, é preferível uma combinação dos três fatores Oct3/4, Sox2 e Klf4, considerando que as células iPS obtidas são usadas para fins terapêuticos.

[0099] A colônia de células iPS pode ser selecionada por um método

23 / 105 que usa resistência a fármacos e atividade repórter como índices (Cell, 126, 663-676 (2006), Nature, 448, 313-317 (2007)) ou um método que inclui observação morfológica visual (Cell, 131, 861-872 (2007)). A confirmação da célula iPS pode ser realizada utilizando a expressão de vários genes específicos de células ES e a formação de teratoma como índices.

[00100] Atualmente, há vários tipos da célula iPS (iPSC), e também podem ser utilizadas célula iPS estabelecida por Yamanaka, et al. introduzindo 4 fatores: Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc em fibroblasto de camundongo (Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006) 126: 663-676), iPSC derivada de uma célula humana estabelecida introduzindo 4 fatores semelhantes em fibroblasto humano (Takahashi K, Yamanaka S., et al., Cell, (2007) 131: 861-872.), Nanog-iPSc estabelecida selecionando com a expressão de Nanog como um índice após a introdução dos 4 fatores mencionados acima (Okita, K., Ichisaka, T., e Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.), iPSC produzida por um método sem c-Myc (Nakagawa M, Yamanaka S., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, 101 - 106) e iPSC estabelecida pela introdução de 6 fatores por um método sem vírus (Okita K et al., Nat. Methods 2011 May; 8(5):409-12, Okita K et al., Stem Cells. 31(3):458-66.). Além disso, iPSC estabelecida por Thomson et al. introduzindo 4 fatores: OCT3/4, SOX2, NANOG e LIN28 (Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.), iPSC produzida por Daley et al. (Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451: 141-146), célula-tronco pluripotente induzida produzida por et al. (JP-A-2008-307007) e similares podem igualmente ser utilizadas.

[00101] Além disso, podem ser utilizadas as iPSCs conhecidas na técnica que são descritas em artigos publicados (p. ex., Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol. 3, Issue 5,568-574; Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650; Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, No 7, 795-797), ou patentes (p. ex., JP-A-2008-

24 / 105 307007, JP-A-2008-283972, US2008-2336610, US2009-047263, WO2007/069666, WO2008/118220, WO2008/124133, WO2008/151058, WO2009/006930, WO2009/006997, WO2009/007852).

[00102] Como a linhagem de células-tronco pluripotentes induzidas, várias linhagens de iPSC estabelecidas por NIH, RIKEN, Universidade de Quioto e similares podem ser utilizadas. Os exemplos da linhagem de iPSC humana incluem a cepa HiPS-RIKEN-1A, a cepa HiPS-RIKEN-2A, a cepa HiPS-RIKEN-12A, a cepa Nips-B2 de RIKEN, a cepa 253G1, a cepa 253G4, a cepa 1201C1, a cepa 1205D1, a cepa 1210B2, a cepa 1383D2, a cepa 1383D6, a cepa 201B7, a cepa 409B2, a cepa 454E2, a cepa 606A1, a cepa 610B1, a cepa 648A1, a cepa 1231A31, FfI-01s04 e similares, e a cepa 1231A3 é preferível.

[00103] Quando uma célula CD3-positiva é uma célula obtida pela diferenciação de uma célula-tronco pluripotente, o TCR expresso na célula CD3-positiva inclui um dímero que consiste em dois dentre TCRα, TCRβ, TCRγ e TCRδ, um heterodímero constituído por TCRα e TCRβ (αβTCR), um heterodímero constituído por TCRγ e TCRδ (γδTCR) e um homodímero consistindo na mesma cadeia de TCR. Embora esses TCRs possam ser dímeros endógenos ou dímeros exógenos, é preferível um dímero que contenha TCRα exógeno e TCRβ exógeno.

[00104] No presente relatório descritivo, o “TCR exógeno” refere-se a um heterodímero que consiste em um TCRα exógeno e um TCRβ exógeno, um heterodímero que consiste em um TCRγ exógeno e um TCRδ exógeno e/ou um homodímero que consiste na mesma cadeia de TCR exógeno.

[00105] Quando o TCR é um dímero contendo TCRα endógeno e TCRβ endógeno, a célula-tronco pluripotente pode ser uma célula-tronco pluripotente preparada a partir de uma célula contendo um ácido nucleico incluindo uma sequência de bases que codifica TCRα endógeno e um ácido nucleico contendo uma sequência de bases que codifica TCRβ endógeno. Os

25 / 105 exemplos de tal célula incluem células T (célula CD8-positiva CD4-negativa, célula CD8-negativa CD4-positiva, célula CD4-positiva CD8-positiva e similares). Quando o TCR é um dímero contendo TCRα exógeno e TCRβ exógeno, então a célula-tronco pluripotente pode ser uma célula contendo um ácido nucleico incluindo uma sequência de bases que codifica um TCRα exógeno e um ácido nucleico contendo uma sequência de bases que codifica um TCRβ exógeno.

[00106] No presente relatório descritivo, o “ácido nucleico de TCR exógeno” refere-se a um ácido nucleico contendo uma sequência de bases que codifica um TCRα exógeno, um ácido nucleico contendo uma sequência de bases que codifica um TCRβ exógeno, um ácido nucleico contendo uma sequência de bases que codifica um TCRγ, exógeno e/ou um ácido nucleico contendo uma sequência de bases que codifica um TCRδ exógeno.

[00107] O método para introduzir um ácido nucleico de TCR exógeno (p. ex., ácido nucleico contendo uma sequência de bases que codifica um TCRα exógeno e ácido nucleico contendo uma sequência de bases que codifica um TCRβ exógeno) em uma célula-tronco pluripotente não é especialmente limitado. Por exemplo, o método a seguir pode ser empregado.

[00108] Quando o ácido nucleico do TCR exógeno está na forma de DNA, por exemplo, vetores tais como vírus, plasmídeo, cromossomo artificial e similares podem ser introduzidos em células-tronco pluripotentes por métodos tais como lipofecção, lipossoma, microinjeção e similares. Os exemplos do vetor viral incluem vetor retrovírus, vetor lentivírus, vetor adenovírus, vetor vírus adenoassociado, vetor vírus Sendai e similares. Os exemplos do vetor cromossomo artificial incluem cromossomo humano artificial (HAC), cromossomo de levedura artificial (YAC), cromossomo bacteriano artificial (BAC, PAC) e similares. Como o plasmídeo, o plasmídeo para célula mamífera pode ser utilizado. O vetor pode conter sequências de controle tais como promotor, reforçador (enhancer), sequência de ligação ao

26 / 105 ribossomo, terminador, sítios de poliadenilação e similares para que o TCR exógeno possa ser expresso. Quando necessário, sequências marcadoras de seleção, tais como gene de resistência a fármaco (p. ex., gene de resistência à canamicina, gene de resistência à penicilina, gene de resistência à puromicina e similares), gene de timidina quinase, gene da toxina diftérica e similares, sequências de genes repórteres ais como proteína fluorescente, β glicuronidase (GUS), FLAG e similares, e similares podem estar contidas. Os exemplos do promotor incluem promotor SV40, promotor LTR, promotor CMV (citomegalovírus), promotor RSV (vírus do sarcoma de Rous), promotor LTR do MoMuLV (vírus da leucemia murina de Moloney), promotor HSV-TK (timidina quinase do vírus do herpes simples), promotor EF-α, promotor CAG e promotor responsivo a medicamento. Os exemplos do promotor responsivo a fármaco incluem o promotor TRE (promotor mínimo de CMV tendo uma sequência responsiva a Tet com 7 sequências tetO consecutivas) que expressa um gene na presença do fármaco correspondente. Quando o promotor TRE é utilizado, é preferível usar um modo que induza expressão gênica ao expressar simultaneamente uma proteína de fusão de tetR reverso (rtetR) e VP16AD na mesma célula na presença do fármaco correspondente (p. ex., tetraciclina ou doxiciclina). É ainda preferido um vetor com o promotor TRE e simultaneamente tendo um modo que expressão o gene da fusão de rtetR e VP16AD no mesmo vetor.

[00109] Na presente invenção, um modo de expressão policistrônica pode também ser utilizado para expressar simultaneamente TCRα exógeno e TCRβ exógeno. Para expressão policistrônica, as sequências que codificam os genes podem ser ligadas por um IRES ou região codificadora 2A do vírus da febre aftosa (FMDV).

[00110] Em outra modalidade, o vetor mencionado acima pode ter uma sequência de transposon antes e depois desse cassete de expressão (unidade de expressão do gene contendo um promotor, uma sequência do gene e um

27 / 105 terminador) para excisão, se necessário, da sequência que codifica o TCR exógeno incorporado no cromossomo. A sequência do transposon não é especialmente limitada, e é exemplificada por piggyBac. Em outra modalidade, para remover o cassete de expressão, pode haver a sequência loxP ou a sequência FRT antes e depois do cassete de expressão.

[00111] Quando está na forma de um RNA, o ácido nucleico do TCR exógeno pode ser introduzido em células-tronco pluripotentes por um método tal como eletroporação, lipofecção, microinjeção e similares.

[00112] No método de produção ou método de cultura para expansão da presente invenção, as células CD3-positivas a serem cultivadas podem também ser células que expressam um receptor de antígeno quimérico.

[00113] Na presente invenção, o “receptor de antígeno quimérico (CAR)” significa uma proteína de fusão contendo um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembrana e um domínio de transdução de sinal intracelular. O domínio de ligação ao antígeno de CAR inclui um anticorpo de cadeia curta (scFv) no qual a cadeia leve (VL) e a cadeia pesada (VH) da região variável do anticorpo estão ligadas in tandem por intermédio de um linker (p. ex., linker GS). As células CD3-positivas que expressam CAR reconhecem o antígeno na região scFV e então transduzem o sinal de reconhecimento do mesmo para células T através do domínio de transdução de sinal intracelular. A introdução de CAR nas células CD3-positivas torna possível transmitir especificidade ao antígeno de interesse. Além disso, CAR pode reconhecer diretamente as moléculas do antígeno sem depender de HLA classe I ou classe II, portanto, uma alta resposta imune pode também ser induzida contra células com expressão gênica diminuída de HLA classe I ou classe II.

[00114] Os exemplos do antígeno atingido pelo TCR e CAR mencionados acima incluem, entre outros, antígenos tumorais. The antígeno tumoral pode ser um antígeno tumoral específico (TSA) ou um antígeno

28 / 105 tumoral associado (TAA). Exemplos específicos de tal antígeno tumoral incluem um ou mais tipos de antígenos selecionados a partir do grupo que consiste em antígenos diferenciados tais como MART-1/MelanA (MART-I), gp100 (Pmel 17), tirosinase, TRP-1, TRP-2 e similares, antígenos tumorais específicos de múltiplas linhagens tais como WT1, Glypican-3, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15 e similares, antígenos fetais tais como CEA e similares, genes tumorais superexpressos ou genes supressores de tumores que sofreram mutação tais como p53, Ras, HER-2/neu e similares, antígenos tumorais únicos causados por translocação de cromossomos tais como BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR e similares, e antígenos virais tais como o antígeno EBVA do vírus Epstein Barr, os antígenos E6 e E7 do papilomavírus humano (HPV) e similares. Como outros antígenos tumorais, podem ser mencionados CD19, CD20, EGP2, erB2,3,4, GD2, GD3, Mesotelina, PSMA, 8H9, Lewis-Y, MUC1, TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm- 23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, β- catenina, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, α-fetoproteína, β-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3/CA 27.29/BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68/P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733/EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, proteína de ligação a TA-90/Mac-2/proteína associada à ciclofilina C, TAAL6, TAG72, TLP e TPS.

[00115] Os exemplos do domínio transmembrana de CAR incluem um domínio transmembrana derivado de uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em cadeia α, cadeia β ou cadeia ζ de TCR, CD28, cadeia CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, 4-1BB (CD137) e CD154, e similares. Entre esses, um domínio transmembrana derivado de CD8 é preferível. Além disso, por exemplo, um domínio transmembrana derivado de uma molécula, da qual é

29 / 105 derivado o primeiro domínio de transdução de sinal intracelular ligado a um domínio de ligação ao antígeno, é também preferivelmente usado. Quando, por exemplo, a molécula da qual se deriva o primeiro domínio de transdução de sinal intracelular ligado ao domínio de ligação ao antígeno é CD28, o domínio transmembrana pode também ser derivado de CD28. Alternativamente, pode-se também utilizar um domínio transmembrana projetado artificialmente.

[00116] Os exemplos do domínio de transdução de sinal intracelular de CAR incluem, entre outros, domínios intracelulares derivados de um ou mais tipos de proteínas selecionados a partir do grupo que consiste em cadeia FcRγ, cadeia FcRβ, cadeia CD3γ, cadeia CD3δ, cadeia CD3ε, cadeia CD3ζ, CD5, CD22, CD79a, CD79b e CD66d. Entre esses, um domínio intracelular derivado da cadeia CD3ζ é preferível. Quando a fosforilação da tirosina de ITAM contido no domínio intracelular da cadeia CD3ζ é deflagrada, ocorrem diversas respostas tais como aumento na concentração intracelular de Ca2+, secreção de citocinas, e similares, e, finalmente, ocorre divisão celular e células CD3-positivas mostram atividade citotóxica como CTL. O domínio de transdução de sinal intracelular pode conter ainda um domínio intracelular de uma molécula co-estimuladora. Os exemplos da molécula co-estimuladora incluem, entre outros, domínios intracelulares de um ou mais tipos de proteínas selecionados a partir do grupo que consiste em CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno-1 associado à função linfocitária (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 e CD83. Entre esses, os domínios intracelulares derivados de CD28, 4-1BB (CD137), CD30 são preferíveis. CD28 pode ligar-se para promover a proliferação de células T ao aumentar a produção de IL-2. Além disso, 4-1BB pode promover a diferenciação para células de memória ao suprimir a apoptose causada no estágio final da ativação de células T. CD30 pode ainda melhorar a proliferação de células CD3-positivas com um anticorpo contra CD3 e torna

30 / 105 possível manter as células como células CD197-positivas por um longo período. Com a seleção do tipo e do número de molécula co-estimuladora, a força e duração da atividade do CAR podem ser controladas (p. ex., Mol Ther. 2009; 17:1453-1464). Quando o domínio de transdução de sinal intracelular contém um ou mais tipos de domínios intracelulares, a ordem dos mesmos não é limitada.

[00117] Um espaçador pode ser incorporado entre o domínio de ligação ao antígeno do CAR e o domínio transmembrana, ou entre o domínio de transdução de sinal intracelular do CAR e o domínio transmembrana. Como o espaçador, um peptídeo composto por no máximo 300 aminoácidos, de preferência 10 a 100 aminoácidos e, mais preferivelmente, 25 a 50 aminoácidos, pode ser em geral utilizado. Seus exemplos específicos incluem, entre outros, uma região hinge (dobradiça) derivada de IgG1, um peptídeo contendo uma região CH2CH3 de imunoglobulina e uma parte de CD3, e similares.

[00118] Exemplos específicos de CAR incluem, entre outros, um CAR de primeira geração no qual scFv e cadeia CD3ζ são ligadas por intermédio de um espaçador, um CAR de segunda geração no qual um domínio transmembrana e um domínio intracelular derivados de CD28 são incorporados entre scFv do CAR de primeira geração e a cadeia CD3ζ visando reforçar a capacidade para ativação de células T, e um CAR de terceira geração no qual um domínio intracelular de molécula co-estimuladora (4-1BB ou OX40) diferente de CD28 é incorporado entre o domínio intracelular de CD28 do CAR de segunda geração e a cadeia CD3ζ.

[00119] No método de produção ou método de cultura para expansão da presente invenção, a célula CD3-positiva a ser cultivada pode ser ainda células que co-expressam CAR e uma proteína de fusão de IL-15 e IL-15Rα (IL-15/IL-15Rα). O CAR expresso com IL-15/IL-15Rα pode ser semelhante ao CAR mencionado acima.

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[00120] Na presente invenção, a “IL-15/IL-15Rα” significa uma proteína de fusão contendo IL-15 e IL-15Rα. No sistema de transdução de sinais de IL-15, IL-15Rα expressa em células apresentadoras de antígeno em geral liga-se a IL-15 e IL-15 é apresentada ao receptor de IL-15 que consiste em uma cadeia γ comum (γc) com IL-15Rβ em célula CD8-positiva e CD4- negativa (trans-apresentação), por meio do qual a atividade citotóxica da célula CD8-positiva CD4-negativa é mantida. Portanto, quando a célula CD3- positiva expressando IL-15/IL-15Rα é CD8-positiva CD4-negativa, a célula pode transmitir o sinal de IL-15 para sua própria célula por intermédio do receptor de IL-15. Alternativamente, a célula CD3-positiva expressando IL- 15/IL-15Rα pode transmitir o sinal de IL-15 para outras células CD8- positivas CD4-negativas por intermédio do receptor de IL-15. Como descrito acima, dado que IL-15/IL-15Rα consegue manter a atividade citotóxica da célula CD8-positiva CD4-negativa, prevê-se que venha a mostrar um efeito citotóxico contínuo sobre células atingidas pelo CAR.

[00121] IL-15/IL-15Rα pode ser uma proteína do tipo transmembrana ou uma proteína secretora. Sabe-se que, em IL-15Rα, o domínio de ligação de IL-15 com 1-65 aminoácidos desde o N-terminal da proteína madura é a região responsável pela ligação de IL-15 (Wei X. et al., J. Immunol., 167: 277-282, 2001). Portanto, a proteína do tipo transmembrana pode ser uma proteína que retém o domínio de ligação de IL-15 e retém o domínio transmembrana de IL-15Rα. Por outro lado, a proteína secretora pode ser uma proteína que mantém o domínio de ligação de IL-15 e desprovida do domínio transmembrana de IL-15Rα.

[00122] Um espaçador pode ser incorporado entre IL-15 e IL-15Rα de IL-15/IL-15Rα. Como o espaçador, pode-se utilizar um peptídeo que em geral consiste em no máximo 300 aminoácidos, de preferência, 10-100 aminoácidos, mais preferivelmente, 20-50 aminoácidos. Seus exemplos específicos incluem, entre outros, o linker GS e similares.

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[00123] IL-15/IL-15Rα não é especialmente limitada desde que seja um peptídeo no qual IL-15 e IL-15Rα estejam unidas por intermédio de um espaçador, e exemplos específicos do mesmo incluem um peptídeo que consiste em SEQ ID NO: 8. Embora IL-15/IL-15R não seja especialmente limitada desde que possa se ligar ao receptor de IL-15 e transmitir o sinal de IL-15 para a célula, por exemplo, pode-se mencionar um peptídeo contendo uma sequência de aminoácidos tendo uma homologia não inferior a aproximadamente 90%, de preferência, não inferior a 95%, mais preferivelmente não inferior a aproximadamente 97%, especialmente preferível não inferior a aproximadamente 98% e, o mais preferível, não inferior a aproximadamente 99% com a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 8. Neste relatório descritivo, a “homologia” significa a proporção (%) entre o mesmo aminoácido e resíduo de aminoácido semelhante e todos os resíduos de aminoácidos sobrepostos no alinhamento ótimo quando duas sequências de aminoácidos são alinhadas usando um algoritmo matemático conhecido no campo técnico relevante (de preferência, o algoritmo é tal que um gap (lacuna) pode ser introduzida em uma ou em ambas as sequências para o alinhamento ótimo). O “aminoácido semelhante” significa aminoácidos com propriedades físico-químicas semelhantes e, por exemplo, aminoácidos classificados no mesmo grupo, tais como aminoácidos aromáticos (Phe, Trp, Tyr), aminoácidos alifáticos (Ala, Leu, Ile, Val), aminoácidos polares (Gln, Asn), aminoácidos básicos (Lys, Arg, His), aminoácidos ácidos (Glu, Asp), aminoácidos contendo um grupo hidroxila (Ser, Thr), aminoácidos com uma cadeia lateral pequena (Gly, Ala, Ser, Thr, Met) e similares podem ser mencionados. Prevê-se que a substituição por tais aminoácidos semelhantes não altere o fenótipo da proteína (ou seja, substituição conservadora de aminoácido). Exemplos específicos da substituição conservadora de aminoácido são bem conhecidos no campo técnico e são descritos em vários documentos (p. ex., Bowie et al., Science,

33 / 105 247: 1306-1310 (1990)). A homologia da sequência de aminoácidos no presente relatório descritivo pode ser calculada usando o algoritmo para cálculo de homologia NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool), e sob s seguintes condições (expectativa =10; gap aceito; matriz =BLOSUM62; filtragem =OFF).

[00124] Quando o receptor de antígeno quimérico e/ou IL-15/IL-15Rα são/é expresso(s) na célula CD3-positiva cultivada no método de produção ou método de cultura para expansão da presente invenção, um método para introduzir o ácido nucleico de CAR e/ou o ácido nucleico de IL-15/IL-15Rα nas células (p. ex., célula-tronco pluripotente) não é especialmente limitado e, por exemplo, pode-se empregar o mesmo método usado para introduzir o ácido nucleico de TCR.

[00125] Quando a célula CD3-positiva a ser cultivada no método de produção ou método de cultura para expansão da presente invenção são células obtidas pela diferenciação de células-tronco pluripotentes, as células- tronco pluripotentes podem ser diferenciadas em células CD3-positivas pelo método conhecido por si mesmo. Métodos específicos para diferenciar células-tronco pluripotentes em células CD3-positivas são descritos, por exemplo, em WO 2016/076415 e WO 2017/221975. Um método específico para diferenciar células-tronco pluripotentes em células CD3-positivas pode incluir, por exemplo, (1) um processo para diferenciar células-tronco pluripotentes em células progenitoras hematopoiéticas e (2) um processo para diferenciar as células progenitoras hematopoiéticas em células CD3-positivas. (1) Processo para diferenciar células-tronco pluripotentes induzidas em células progenitoras hematopoiéticas

[00126] Na etapa (1), a célula progenitora hematopoiética (HPC) significa célula CD34-positiva, de preferência, célula CD34-positiva CD43- positiva (DP). Na etapa (1), célula progenitora hematopoiética e célula- progenitora hematopoiética não se distinguem e mostram-se a mesma célula a

34 / 105 menos que especialmente indicado.

[00127] O método para diferenciar células-tronco pluripotentes em células progenitoras hematopoiéticas não é especialmente limitado desde que possa fazer com que células progenitoras hematopoiéticas se diferenciem. Seus exemplos incluem um método em que células-tronco pluripotentes são cultivadas em um meio para indução de células progenitoras hematopoiéticas, como descrito em, por exemplo, WO 2013/075222, WO 2016/076415 e Liu S. et al., Cytotherapy, 17 (2015); 344-358 e similares.

[00128] Na etapa (1), um meio usado para indução em células progenitoras hematopoiéticas não é especialmente limitado. Um meio usado para cultivar células animais pode ser preparado para um meio basal. Os exemplos do meio basal incluem, entre outros, meio de Dulbecco (p. ex., IMDM), meio de Eagle (p. ex., DMEM, EMEM, BME, MEM, αMEM), meio de Ham (p. ex., meio F10, meio F12), meio RPMI (p. ex., meio RPMI-1640, meio RPMI-1630), meio MCDB (p. ex., meio MCDB104, 107, 131, 151, 153), meio de Fischer, meio 199, meio de cultura para célula ES de primatas (meio de cultura para célula ES/iPS de primatas, Reprocell), meio para célula ES de camundongo (meio de cultura TX-WES, Thromb-X), meio livre de soro (mTeSR, Stemcell Technologies), ReproFF, StemSpan (marca registrada) SFEM, StemSpan (marca registrada) H3000, StemlineII, meio ESF-B, meio ESF-C, meio CSTI-7, meio Neurobasal (Life Technologies, Inc.), meio StemPro-34, StemFit (marca registrada) (p. ex., StemFit AK03N, StemFit AK02N) e similares. Além disso, esses meios podem ser misturados, se necessário, e usados e, por exemplo, podem ser mencionados o meio DMEM/F12 e similares. O meio basal usado pode conter um soro ou pode ser livre de soro. O meio basal pode ser adequadamente suplementado com soro 10-20% (soro fetal bovino (FBS), soro humano, soro de cavalo) ou uma reposição de soro (KSR e similares), insulina, várias vitaminas, L-glutamina, vários aminoácidos tais como aminoácidos não essenciais e similares, 2-

35 / 105 mercaptoetanol, várias citocinas (interleucinas (IL-2, IL-7, IL-15 etc.), SCF (fator de célula-tronco), ativina e similares), vários hormônios, vários fatores de crescimento (Fator inibidor de leucemia (LIF), fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), TGF-β etc.), várias matrizes extracelulares, várias moléculas de adesão celular, antibióticos tais como penicilina/estreptomicina, puromicina e similares, indicador de pH tal como vermelho de fenol e similares, e similares. Se necessário, o meio basal pode também conter Vitamina C (p. ex., ácido ascórbico), albumina, insulina, transferrina, composto de selênio (p. ex., selenito de sódio), ácido graxo, elementos traço, 2-mercaptoetanol, tioglicerol (p. ex., α-monotioglicerol (MTG)), lipídios, L- alanil-L-glutamina (p. ex., Glutamax (marca registrada)), fatores de crescimento, compostos de baixo peso molecular, antibióticos, antioxidantes, ácido pirúvico, tampões, sais inorgânicos e similares.

[00129] Na etapa (1), “Vitamina C” significa ácido L-ascórbico e seus derivados, e “derivado do ácido L-ascórbico” significa derivados que se tornam vitamina C por reação enzimática no corpo vivo. Os exemplos dos derivados do ácido L-ascórbico usados na etapa (1) incluem fosfato de vitamina C, glicosídeo de ácido ascórbico, etila ascorbila, éster de vitamina C, tetrahexildecanoato de ascorbila, estearato de ascorbila e 2-fosfato-6- palmitato de ascorbila. Prefere-se fosfato de vitamina C. Os exemplos do fosfato de vitamina C (p. ex., 2-fosfato de ácido ascórbico) incluem sais fosfato do ácido L-ascórbico tal como fosfato Na de ácido L-ascórbico e fosfato Mg de ácido L-ascórbico.

[00130] Quando se usa vitamina C, a vitamina C é adicionada (fornecida) preferivelmente a cada quatro dias, a cada três dias, a cada dois dias ou todos os dias. A vitamina C é mais preferivelmente adicionada todos os dias. Em uma modalidade, a vitamina C é preferivelmente adicionada ao meio em uma quantidade correspondente a entre 5 ng/mL e 500 ng/mL (p. ex., uma quantidade correspondente a 5 ng/mL, 10 ng/mL, 25 ng/mL, 50

36 / 105 ng/mL, 100 ng/mL, 200 ng/mL, 300 ng/mL, 400 ng/mL ou 500 ng/mL). Em outra modalidade, a vitamina C é adicionada ao meio de cultura em uma quantidade correspondente a 5 μg/mL - 500 μg/mL (p. ex., uma quantidade correspondente a 5 μg/mL, 10 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL, 300 μg/mL, 400 μg/mL, 500 μg/mL).

[00131] O meio a ser utilizado na etapa (1) pode ser ainda suplementado com pelo menos um tipo de citocina selecionada a partir do grupo que consiste em BMP4 (proteína óssea morfogenética 4), VEGF (fator de crescimento endotelial vascular), SCF (fator de célula-tronco), TPO (trombopoietina), FLT-3L (ligante Flt3) e bFGF (fator de crescimento de fibroblastos básico). Prefere-se mais uma cultura suplementada com BMP4, VEGF e bFGF, e prefere-se mais ainda uma suplementada com BMP4, VEGF, SCF e bFGF.

[00132] Quando se usa citocina, a sua concentração no meio pode ser, por exemplo, 5 ng/mL-500 ng/mL para BMP4, 5 ng/mL-500 ng/mL para VEGF, 5 ng/mL-500 ng/mL para SCF, 3 ng/mL-300 ng/mL para TPO, 1 ng/mL-100 ng/mL para FLT-3L e 5 ng/mL-500 ng/mL para bFGF.

[00133] O meio pode ser suplementado com um inibidor de TGFβ. O inibidor de TGFβ é um inibidor de pequena molécula que interfere com a transdução de sinais da família de TGFβ e inclui, por exemplo, SB431542, SB202190 (ambos, R.K. Lindemann et al., Mol. Cancer 2:20 (2003)), SB505124 (GlaxoSmithKline), NPC30345, SD093, SD908, SD208 (Scios), LY2109761, LY364947, LY580276 (Lilly Research Laboratories) e similares. Por exemplo, quando o inibidor de TGFβ é SB431542, de preferência, sua concentração no meio é 0,5 μM - 100 μM.

[00134] As células-tronco pluripotentes induzidas podem ser cultivadas por cultura aderente ou cultura em suspensão. Em casos de cultura aderente, o cultivo pode ser realizado em um recipiente de cultura revestido com um componente da matriz extracelular e/ou pode ser co-cultivado com células

37 / 105 alimentadoras. Embora a célula alimentadora não seja especialmente limitada, por exemplo, fibroblastos (fibroblasto embrionário de camundongo (MEF), fibroblasto de camundongo (STO) e similares) podem ser mencionados. As células alimentadoras são preferivelmente inativadas por um método conhecido por si mesmo, por exemplo, radiação (raios gama e similares) irradiação, tratamento com agente antineoplásico (mitomicina C e similares) e similares. Como o componente da matriz extracelular, podem ser mencionados proteínas fibrosas tais como Matrigel (Niwa A, et al., PLoS One. 6(7): e22261, 2011), gelatina, colágeno, elastina e similares, glicosaminoglicano e proteoglicano tais como ácido hialurônico, sulfato de condroitina e similares, proteínas de adesão celular tais como fibronectina, vitronectina, laminina e similares, e similares.

[00135] Cultura em suspensão significa cultivar as células em um estado de não adesão a um recipiente de cultura e não é especialmente limitada. Para melhorar a adesividade às células, pode-se utilizar um recipiente de cultura sem um tratamento artificial (p. ex., tratamento de revestimento com matriz extracelular e similares) ou um recipiente de cultura submetido a um tratamento para suprimir artificialmente a adesão (p. ex., tratamento de revestimento com ácido polihidroxietil metacrílico (poli- HEMA) ou poliol ativo de superfície não iônica (Pluronic F-127 etc.)). Na cultura em suspensão, de preferência, um embrioide (EB) é formado e cultivado.

[00136] A célula progenitora hematopoiética pode também ser preparada a partir de uma estrutura semelhante a saco (também referida como ES-sac ou iPS-sac) obtida pela cultura de células-tronco pluripotentes. Neste relatório descritivo, a “estrutura semelhante a saco” é uma estrutura sacular tridimensional derivada de célula-tronco pluripotente (com espaços dentro), que é formada por uma população de células endoteliais e similares e que contém células progenitoras hematopoiéticas em seu interior.

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[00137] As condições de temperatura na etapa (1) não são especialmente limitadas. A temperatura é, por exemplo, entre aproximadamente 37ºC e 42ºC, de preferência, entre aproximadamente 37ºC e 39ºC. O período de cultura pode ser determinado adequadamente pelos técnicos no assunto, monitorando o número de células progenitoras hematopoiéticas e/ou semelhantes. O número de dias da cultura não é limitado desde que possam ser obtidas células progenitoras hematopoiéticas. Os exemplos do período de cultura incluem pelo menos 6 dias, não menos do que 7 dias, não menos do que 8 dias, não menos do que 9 dias, não menos do que 10 dias, não menos do que 11 dias, não menos do que 12 dias, não menos do que 13 dias e não menos do que 14 dias. De preferência, o período de cultura é de 14 dias. Embora um período de cultura mais longo em geral não represente um problema na produção de células progenitoras hematopoiéticas, de preferência, este não é superior a 35 dias, mais preferivelmente, não é superior a 21 dias. A cultura pode ser realizada sob condições de baixo oxigênio, e a condição de baixo oxigênio, no presente relatório descritivo, significa, por exemplo, concentração de oxigênio igual a 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5% ou menor do que esses valores. (2) Etapa de diferenciação de células progenitoras hematopoiéticas em células CD3-positivas

[00138] Um método para diferenciar células progenitoras hematopoiéticas em células CD3-positivas não é especialmente limitado desde que consiga diferenciar células progenitoras hematopoiéticas em células CD3-positivas. Seus exemplos incluem um método para cultivar células progenitoras hematopoiéticas sob as mesmas condições de cultura que aquelas usadas em um método para induzir células T a partir de células progenitoras hematopoiéticas, como descrito em WO 2016/076415, WO 2017/221975 e similares.

[00139] Na etapa (2), um meio para induzir a diferenciação em célula

39 / 105 T CD3-positiva não é especialmente limitado, e um meio usado para cultivar células animais pode ser preparado para meio basal. Os exemplos do meio basal incluem aqueles semelhantes ao meio basal usado na etapa (1) mencionada acima. O meio pode conter soro ou pode ser livre de soro. Se necessário, o meio basal pode também conter vitamina C (p. ex., ácido ascórbico), albumina, insulina, transferrina, composto de selênio (p. ex., selenito de sódio), ácido graxo, elementos traço, 2-mercaptoetanol, tioglicerol (p. ex., α-monotioglicerol (MTG)), lipídios, aminoácidos, L-glutamina, L- alanil-L-glutamina (p. ex., Glutamax (marca registrada)), aminoácidos não essenciais, vitaminas, fatores de crescimento, compostos de baixo peso molecular, antibióticos (p. ex., penicilina, estreptomicina), antioxidantes, ácido pirúvico, tampões, sais inorgânicos, citocinas e similares.

[00140] Quando se usa vitamina C na etapa (2), a vitamina C pode ser a mesma que aquela descrita na etapa (2-1) e pode ser adicionada de modo semelhante. Em uma modalidade, a concentração de vitamina C no meio ou meio de cultura é preferivelmente 5 μg/mL - 200 μg/mL. Em outra modalidade, a vitamina C é adicionada ao meio de cultura em uma quantidade correspondente a 5 μg/mL - 500 μg/mL (p. ex., quantidade correspondente a 5 μg/mL, 10 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL, 300 μg/mL, 400 μg/mL, 500 μg/mL).

[00141] Na etapa (2), o inibidor de p38 e/ou SDF-1 (fator 1 derivado de célula do estroma) é/são preferível/preferíveis. No presente relatório descritivo, o “inibidor de p38” significa uma substância que inibe as funções da proteína p38 (p38 MAP quinase). Seus exemplos incluem, entre outros, inibidor químico de p38, mutante dominante-negativo de p38 ou ácido nucleico que codifica o mesmo e similares.

[00142] Os exemplos do inibidor químico de p38 a ser utilizado na etapa (2) incluem, entre outros, SB203580 (4-(4-fluorofenil)-2-(4- metilsulfonilfenil)-5-(4-piridil)-1H-imidazol), e um derivado do mesmo,

40 / 105 SB202190 (4-(4-fluorofenil)-2-(4-hidroxifenil)-5-(4-piridil)-1H-imidazol) e um derivado do mesmo, SB239063 (trans-4-[4-(4-fluorofenil)-5-(2-metoxi-4- pirimidinil)-1H-imidazol-1-il]cyclohexanol) e um derivado do mesmo, SB220025 e um derivado do mesmo, PD169316, RPR200765A, AMG-548, BIRB-796, SClO-469, SCIO-323, VX-702 e FR167653. Esses compostos estão disponíveis comercialmente e, por exemplo, SB203580, SB202190, SB239063, SB220025 e PD169316 são disponibilizados pela Calbiochem, e SClO-469 e SCIO-323 são disponibilizados pela Scios e similares. De preferência, o inibidor químico de p38 é SB203580 (4-(4-fluorofenil)-2-(4- metilsulfonilfenil)-5-(4-piridil)-1H-imidazol) ou um derivado do mesmo.

[00143] Os exemplos do mutante dominante-negativo de p38 na etapa (2) incluem p38T180A, obtido por mutação pontual da treonina na posição 180 localizada na região de ligação ao DNA de p38 para alanina, p38Y182F, obtido por mutação pontual da tirosina na posição 182 de p38 em humanos e camundongos para fenilalanina e similares. O inibidor de p38 está contido em um meio a, por exemplo, aproximadamente 1 μM - aproximadamente 50 μM. Quando se usa SB203580 como o inibidor de P38, este pode estar contido em um meio a 1 μM - 50 μM, 5 μM - 30 μM, 10 μM - 20 μM.

[00144] SDF-1 na etapa (2) pode ser não só SDF-1α ou uma forma madura do mesmo, mas também uma isoforma tal como SDF-1β, SDF-1γ, SDF-1δ, SDF-1ε, SDF-1φ e similares ou uma forma madura das mesmas, ou uma mistura dessas em qualquer razão ou semelhante. De preferência, usa-se SDF-1α. SDF-1 é, às vezes, referido como CXCL-12 ou PBSF.

[00145] Na etapa (2), um ou diversos aminoácidos na sequência de aminoácidos de SDF-1 podem ser substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos desde que este tenha a atividade como a quimiocina (SDF-1 com tal substituição, deleção, adição e/ou inserção de aminoácido deverá ser também referido como “SDF-1 mutante”). Do mesmo modo, a cadeia de açúcar pode ser substituída, deletada e/ou adicionada em SDF-1 ou no SDF-1 mutante. Os

41 / 105 exemplos do mutante do SDF-1 mencionado acima incluem aqueles que mantêm pelo menos 4 resíduos de cisteína (Cys30, Cys32, Cys55 e Cys71 no SDF-1α humano) e tendo no mínimo 90% de identidade com a sequência de aminoácidos de uma substância natural, embora a mutação em aminoácido não se limite ao mesmo. SDF-1 pode ser obtido de um mamífero, por exemplo, humano ou mamífero não humano tal como macaco, ovelha, bovino, cavalo, suíno, cão, gato, coelho, rato, camundongo e similares. Por exemplo, podem ser utilizadas a proteína registrada com número de acesso do GenBank: NP_954637 como SDF-1α humano, e a proteína registrada com número de acesso do GenBank: NP_000600 como SDF-1β.

[00146] SDF-1 pode estar disponível comercialmente, ser purificado da natureza ou produzido por síntese peptídica ou técnicas de engenharia genética. SDF-1 está contido em um meio na faixa de, por exemplo, entre aproximadamente 10 ng/mL e 100 ng/mL. Além disso, SDF-1 alternativo com atividade semelhante ao SDF-1 pode também ser utilizado em vez de SDF-1. Os exemplos de tal SDF-1 alternativo incluem agonista de CXCR4, e um composto de baixo peso molecular tendo atividade agonista de CXCR4 e similares podem ser adicionados ao meio em vez de SDF-1.

[00147] O meio de cultura usado na etapa (2) pode ser ainda suplementado com pelo menos um tipo, de preferência todos, de citocina selecionado a partir do grupo que consiste em SCF, TPO (trombopoietina), FLT-3L e IL-7. The concentração desses é, por exemplo, 10 ng/mL a 100 ng/mL para SCF, 10 ng/mL a 200 ng/mL para TPO, 1 ng/mL a 100 ng/mL para IL-7 e 1 ng/mL a 100 ng/mL para FLT-3L.

[00148] Na etapa (2), as células progenitoras hematopoiéticas podem ser cultivadas por cultura aderente ou cultura em suspensão. Em casos de cultura aderente, pode-se utilizar um recipiente de cultura revestido, e/ou as células progenitoras hematopoiéticas podem ser co-cultivadas com células alimentadoras e/ou semelhantes. Os exemplos das células alimentadoras para

42 / 105 a co-cultura incluem uma linhagem celular do estroma da medula óssea, células OP9 (disponibilizadas pelo Riken BioResource Center). De preferência, a célula OP9 é célula OP9-DL4 ou célula OP9-DL1, que expressa constantemente DLL4 ou DLL1 (p. ex., Holmes R I e Zuniga-Pflucker J C., Cold Spring Harb Protoc. 2009(2)). Na etapa (2), em casos em que células OP9 são usadas como as células alimentadoras, DLL1, ou DLL4 ou DLL1 preparados separadamente, ou uma proteína de fusão de DLL4 ou DLL1 e Fc ou similares podem ser adicionados ao meio para realizar a co-cultura. Quando células alimentadoras são utilizadas, de preferência, as células alimentadoras são repostas adequadamente durante a cultura. A reposição das células alimentadoras pode ser realizada transferindo as células em questão que estão sendo cultivadas nas células alimentadoras que são preliminarmente plaqueadas. A reposição pode ser realizada a cada cinco dias, a cada quatro dias, a cada três dias ou a cada dois dias. Quando células progenitoras hematopoiéticas são obtidas por cultura em suspensão de embrioide, é preferível realizar a cultura de adesão após a dissociação em células isoladas. Embora as células possam ser co-cultivadas com células alimentadoras, o cultivo é preferivelmente realizado sem o uso de células alimentadoras.

[00149] No caso de cultura de adesão e quando um recipiente de cultura é revestido, os exemplos do agente de revestimento incluem Matrigel (Niwa A, et al. PLos One, 6(7):e22261, 2011)), colágeno, gelatina, laminina, proteoglicano de ácido sulfúrico de heparan, RetroNectin, proteína de fusão de DLL4 ou DLL1 ou DLL4 ou DLL1 e região Fc de anticorpo (a seguir, às vezes, referido como Fc) e similares (p. ex., quimera DLL4/Fc), entactina e/ou combinação desses, sendo preferível a combinação de RetroNectin e proteína de fusão de DLL4 e Fc etc.

[00150] Na etapa (2), as condições de temperatura da cultura não são limitadas. A temperatura é, por exemplo, entre aproximadamente 37ºC e 42ºC, de preferência entre aproximadamente 37 e 39 C. O período de cultura

43 / 105 pode ser adequadamente determinado pelos técnicos no assunto, monitorando o número de células CD3-positivas e similares. O número de dias da cultura não é limitado desde que células CD3-positivas possam ser obtidas. Os exemplos do período de cultura incluem pelo menos não menos do que 10 dias, não menos do que 12 dias, não menos do que 14 dias, não menos do que 16 dias, não menos do que 18 dias, não menos do que 20 dias, não menos do que 22 dias e não menos do que 23 dias. De preferência, o período de cultura é de 21 dias. Além disso, não mais do que 90 dias é preferível e não mais do que 42 dias é mais preferível.

[00151] As células obtidas pelas etapas acima incluem células CD3- positivas. Um método específico para diferenciar células-tronco pluripotentes em células CD3-positivas pode ainda incluir a etapa (3) a seguir. (3) Etapa de obtenção de célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-negativa (ou célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-negativa CD30-positiva) ou etapa de enriquecimento de célula CD3-positiva

[00152] Os exemplos do método para obter célula CD3-positiva CD8- positiva CD4-negativa (ou célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-negativa CD30-positiva) incluem os métodos descritos em WO 2016/076415, WO 2017/221975 e similares. A célula CD3-positiva pode também ser enriquecida utilizando um método semelhante.

[00153] Na etapa (3), um meio usado para obter célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-negativa (ou célula CD3-positiva CD8-positiva CD4- negativa CD30-positiva) ou enriquecer célula CD3-positiva não é especialmente limitado, e um meio usado para cultivar células animais pode ser preparado para meio basal. Os exemplos do meio basal incluem aqueles semelhantes ao meio basal utilizado na etapa (1) mencionada acima. O meio pode conter soro ou pode ser livre de soro. Se necessário, o meio basal pode também conter vitamina C (p. ex., ácido ascórbico), albumina, insulina, transferrina, composto de selênio (p. ex., selenito de sódio), ácido graxo,

44 / 105 elementos traço, 2-mercaptoetanol, tioglicerol (p. ex., α-monotioglicerol (MTG)), lipídios, aminoácidos, L-glutamina, L-alanil-L-glutamina (p. ex., Glutamax (marca registrada)), aminoácidos não essenciais, vitaminas, fatores de crescimento, compostos de baixo peso molecular, antibióticos (p. ex., penicilina, estreptomicina), antioxidantes, ácido pirúvico, tampões, sais inorgânicos, citocinas, hormônio e similares.

[00154] Quando se usa vitamina C na etapa (3), a vitamina C pode ser semelhante àquelas descritas na etapa (1) e pode ser adicionada do mesmo modo. Em uma modalidade, de preferência, a concentração de vitamina C no meio ou no meio de cultura é 5 μg/mL - 200 μg/mL. Em outra modalidade, a vitamina C é adicionada em uma quantidade correspondente a 5 μg/mL - 500 μg/mL ao meio de cultura (p. ex., quantidade correspondente a 5 μg/mL, 10 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL, 300 μg/mL, 400 μg/mL, 500 μg/mL).

[00155] Quando se usa hormônio na etapa (3), os exemplos do hormônio incluem corticosteroide. Corticosteroide é glicocorticoide ou um derivado do mesmo, e acetato de cortisona, hidrocortisona, acetato de fludrocortisona, predonisolona, triancinolona, metilprednisolona, dexametasona, betametasona e dipropionato de beclometasona são mencionados como exemplos. O preferido é dexametasona. Quando o corticosteroide é dexametasona, sua concentração no meio é 1 nM - 100 nM.

[00156] Na etapa (3), o meio contém um agonista do complexo CD3/TCR. O agonista do complexo CD3/TCR não é especialmente limitado desde que seja uma molécula capaz de transduzir um sinal desde um complexo CD3/TCR até uma célula CD3-positiva ao se ligar especificamente a pelo menos uma parte do complexo CD3/TCR. Os exemplos do agonista do complexo CD3/TCR incluem agonista de CD3 e/ou agonista de TCR. Como o agonista de CD3, pode-se mencionar um anticorpo agonista anti-CD3 ou um fragmento de ligação do mesmo, e como o agonista de TCR, pelo menos um

45 / 105 selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo agonista anti- TCR ou um fragmento de ligação do mesmo, um complexo MHC/peptídeo antigênico ou um multímero do mesmo e um complexo MHC/superantígeno ou um multímero do mesmo podem ser mencionados.

Quando se usa um anticorpo agonista anti-CD3, o anticorpo agonista anti-CD3 inclui tanto um anticorpo policlonal como um anticorpo monoclonal, de preferência um anticorpo monoclonal.

O anticorpo pode pertencer a qualquer classe de imunoglobulina, ou seja, IgG, IgA, IgM, IgD e IgE, de preferência IgG.

Como o anticorpo agonista anti-CD3, pode-se mencionar um anticorpo (OKT3) produzido a partir do clone OKT3, um anticorpo (UCHT1) produzido a partir do clone UCHT1 e similares, e é preferivelmente UCHT1. Quando o anticorpo agonista anti-CD3 é OKT3, OKT3 inclui RYTMH (SEQ ID NO: 9), YINPSRGYTNYNQKFKD (SEQ ID NO: 10) e YYDDHYCLDY (SEQ ID NO: 11), como regiões determinantes de complementaridade 1-3 na região variável da cadeia pesada, e SASSSVSYMN (SEQ ID NO: 12), DTSKLAS (SEQ ID NO: 13) e QQWSSNPFT (SEQ ID NO: 14) como regiões determinantes de complementaridade 1-3 na região variável da cadeia leve.

Além disso, de preferência, OKT3 inclui uma região variável da cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 21 e uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 22. Quando o anticorpo agonista anti-CD3 é UCHT1, UCHT1 inclui GYSFTGYTMN (SEQ ID NO: 15), LINPYKGVST (SEQ ID NO: 16) e SGYYGDSDWYFDV (SEQ ID NO: 17), como regiões determinantes de complementaridade 1-3 na região variável da cadeia pesada, e RASQDIRNYLN (SEQ ID NO: 18), YTSRLHS (SEQ ID NO: 19) e QQGNTLPWT (SEQ ID NO: 20) como regiões determinantes de complementaridade 1-3 na região variável da cadeia leve.

Além disso, de preferência UCHT1 inclui uma região variável da cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 23 e uma região variável

46 / 105 da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 24. A concentração de anticorpo agonista anti-CD3 no meio é, por exemplo, 10 ng/mL – 1000 ng/mL, de preferência 50 ng/mL-800 ng/mL, mais preferivelmente 250 ng/mL-600 ng/mL.

[00157] Quando se usa citocina na etapa (3), IL-2 e IL-7 e similares podem ser mencionadas como a citocina. Quando a citocina é IL-2, a sua concentração no meio é 10 U/mL - 1000 U/mL, e quando é IL-7, a sua concentração no meio é 1 ng/mL-1000 ng/mL.

[00158] Na etapa (3), as condições de temperatura da cultura não são especialmente limitadas. A temperatura é, por exemplo, entre aproximadamente 37ºC e 42ºC, de preferência entre aproximadamente 37ºC é 39ºC. O período de cultura pode ser adequadamente monitorado pelos técnicos no assunto, monitorando o número de células CD3-positivas e similares. O número de dias da cultura não é limitado desde que células CD3- positivas possam ser obtidas. O período de cultura é, por exemplo, pelo menos 1 dia ou mais, 2 dias ou mais, 3 dias ou mais, 4 dias ou mais, 5 dias ou mais e, de preferência, 6 dias. É preferivelmente 28 dias ou menos, mais preferivelmente 14 dias ou menos.

[00159] Como descrito acima, com a diferenciação de células-tronco pluripotentes, podem ser obtidas células CD3-positiva para serem cultivadas pelo método de produção ou método de cultura para expansão da presente invenção.

[00160] O método de produção ou método de cultura para expansão da presente invenção inclui uma etapa de cultivo de células CD3-positivas na presença de um agonista do complexo CD3/TCR, fibronectina ou uma variante dela, e um agonista de CD30 (a seguir a ser referida como etapa (I) da presente invenção).

[00161] Na etapa (I) da presente invenção, o agonista do complexo CD3/TCR pode ser o mesmo usado como o agonista do complexo CD3/TCR

47 / 105 usado na etapa (3).

[00162] Na etapa (I) da presente invenção (ou na etapa (3)), quando o agonista do complexo CD3/TCR a ser usado é um anticorpo agonista anti- CD3 ou um anticorpo anti-TCR, os anticorpos policlonais dos mesmos, por exemplo, podem ser produzidos pelo método a seguir. Por exemplo, no caso de anticorpo policlonal contra CD3, mamíferos, tais como coelho, camundongo, rato, cabra, cobaia, hamster e similares, são imunizados (1 a diversos reforços a cada 1-4 semanas desde a imunização inicial) com uma mistura de um peptídeo parcial (p. ex., cadeia γ, δ, ε, ζη) contendo CD3 ou um epítopo do mesmo e adjuvante completo ou incompleto de Freund (FCA ou FIA) com um antígeno de imunização e, no caso de anticorpo policlonal contra TCR, os mamíferos são imunizados com uma mistura de um peptídeo parcial (p. ex., cadeia α, β, γδ) contendo TCR ou um epítopo do mesmo e adjuvante completo ou incompleto de Freund (FCA ou FIA) com um antígeno de imunização. Entre aproximadamente 3 e 10 dias após cada imunização adicional, o título do anticorpo do soro parcialmente coletado é medido usando uma reação antígeno-anticorpo convencionalmente conhecida, e seu aumento é confirmado. Além disso, aproximadamente 3-10 dias depois da imunização final, coleta-se o sangue total e o antissoro é purificado. O anticorpo policlonal pode também ser purificado como uma classe única de imunoglobulina usando uma técnica convencional de separação tal como salting out (precipitação de proteína em solução por altas concentrações de sais) (p. ex., fracionamento com sulfato de amônio), centrifugação, diálise e cromatografia em coluna.

[00163] Quando o anticorpo agonista anti-CD3 ou anticorpo anti-TCR usado na etapa (I) da presente invenção (ou na etapa (3)) é um anticorpo monoclonal, o anticorpo monoclonal pode ser em geral obtido de hibridomas (células de fusão) produzidos por fusão celular. Ou seja, tal qual como o anticorpo policlonal mencionado acima, ele pode ser produzido isolando

48 / 105 células produtoras de anticorpo de um mamífero imunossensibilizado contra um peptídeo parcial contendo CD3 ou TCR ou um epítopo dos mesmos, fundindo as mesmas com células de mieloma para formar um hibridoma, clonando o hibridoma e selecionado, como um antígeno marcador, um clone que produz um anticorpo que mostra afinidade específica por CD3 ou TCR. Além disso, pode-se também utilizar uma célula produtora de anticorpo, produzida reagindo CD3 com esplenócitos ou linfócitos isolados antes em um meio de cultura. Nesse caso, também podem ser preparadas células produtoras de anticorpos que são derivadas de humanas.

[00164] O hibridoma que secreta anticorpo monoclonal pode ser preparado de acordo com o método de Kohler e Milstein (Nature, Vol. 256, pp. 495-497, 1975) ou uma versão modificada do método. Ou seja, o anticorpo monoclonal é preparado cultivando o hibridoma obtido fundindo-se células produtoras de anticorpos contidas em esplenócitos, timócitos, células de linfonodos, linfócitos periféricos, células de mieloma ou de amigdalas palatinas, de preferência esplenócitos, obtidos de animais imunossensibilizados como descrito acima, com preferivelmente células de mieloma de mamíferos alogênicos, tais como camundongo, rato, cobaia, hamster, coelho ou humano, mais preferivelmente camundongo, rato ou humano. A cultura pode ser realizada in vitro ou in vivo em mamíferos tais como camundongo, rato, cobaia, hamster, coelho, de preferência camundongo ou rato, mais preferivelmente por via intraperitoneal em camundongos, e o anticorpo pode ser obtido do sobrenadante da cultura ou líquido ascítico do mamífero.

[00165] Os exemplos da célula de mieloma usada para fusão celular incluem de mieloma derivado de camundongo (p. ex., P3-NSI-1-Ag4-1, P3- X63-Ag8-U1, P3-X63-Ag8-653, SP2/0-Ag14, BW5147 e similares), mieloma derivado de rato (p. ex., 210RCY3-Ag1.2.3 e similares), mieloma derivado de humano (p. ex., U-266AR1, GML500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR,

49 / 105 D1R11 e CEM-T15 e similares) e similares.

[00166] Um clone de hibridoma que produz o anticorpo monoclonal pode ser rastreado pela cultura do hibridoma em, por exemplo, uma placa de microtitulação, e medindo a reatividade do sobrenadante da cultura no poço, o qual mostra proliferação, contra CD3 por radioimunoensaio, imunoensaio enzimático, imunoensaio por fluorescência e similares.

[00167] O isolamento e purificação do anticorpo monoclonal podem ser realizados submetendo o sobrenadante da cultura ou o líquido ascítico contendo o anticorpo produzido pelo método descrito acima à cromatografia de troca iônica, cromatografia em coluna por afinidade tal como uma coluna anti-imunoglobulina ou coluna de proteína G.

[00168] O anticorpo monoclonal usado na etapa (I) da presente invenção (ou na etapa (3)) da presente invenção não é [sic] pode ser obtido por qualquer método sem limitação ao método de produção. Embora um anticorpo monoclonal tenha em geral uma cadeia de açúcar com uma estrutura diferente de acordo com o tipo de mamífero a ser imunossensibilizado, o anticorpo monoclonal na presente invenção não é limitado pela diferença estrutural da cadeia de açúcar e inclui anticorpos monoclonais derivados de quaisquer mamíferos.

[00169] O anticorpo agonista anti-CD3 ou anticorpo anti-TCR inclui o anticorpo policlonal, anticorpo natural tal como anticorpo monoclonal (mAb), anticorpo quimérico (anticorpo humanizado) que pode ser produzido empregando a tecnologia da recombinação gênica, anticorpo de fita simples e fragmentos de ligação desses anticorpos. O fragmento de ligação de um anticorpo significa uma região de uma parte do anticorpo com atividade de ligação específica e inclui especificamente Fab, Fab’, F(ab’)2, scAb, scFv, scFv-Fc e similares.

[00170] Além disso, os técnicos no assunto podem produzir um anticorpo de fusão de um anticorpo agonista anti-CD3 ou um anticorpo anti-

50 / 105 TCR ou um fragmento de ligação do mesmo com outro peptídeo ou proteína, ou um anticorpo modificado ao qual esteja ligado um agente modificador. Outros peptídeos e proteínas utilizados para fusão são especialmente limitados desde que não reduzam a atividade de ligação do anticorpo. Por exemplo, albumina sérica humana, vários peptídeos tag (etiqueta), peptídeos com motivos artificias na hélice, proteínas de ligação à maltose, glutationa S transferase, várias toxinas, outros peptídeos e proteínas que possam promover a multimerização e similares podem ser mencionados. O agente modificador usado para a modificação não é especialmente limitado desde que não reduza a atividade de ligação do anticorpo, e seus exemplos incluem polietilenoglicol, cadeia de açúcar, fosfolipídio, lipossoma, composto de baixo peso molecular e similares.

[00171] Como o anticorpo agonista anti-CD3, pode-se utilizar também um reagente que pode ser adquirido. O anticorpo agonista anti-CD3 que pode ser adquirido não é especialmente limitado e, por exemplo, um anticorpo (OKT3) produzido a partir de um clone OKT3 (anti-CD3 humano, grau funcional purificado (Clone: OKT3) (eBioscience)), um anticorpo (UCHT1) produzido a partir do clone UCHT1 (anticorpo contra CD3 (Clone: UCHT1) (GeneTex)) e similares podem ser utilizados e, de preferência, pode-se utilizar UCHT1.

[00172] Quando o agonista do complexo CD3/TCR usado na etapa (I) da presente invenção (ou na etapa (3)) é um complexo MHC/peptídeo antigênico, o complexo MHC/peptídeo antigênico não é especialmente limitado desde que seja uma molécula reconhecida especificamente pelo complexo CD3/TCR de células CD3-positivas e que a molécula possa transmitir um sinal para células CD3-positivas.

[00173] O MHC que constitui o complexo MHC/peptídeo antigênico pode ser MHC classe I ou MHC classe II, de preferência MHC classe I.

[00174] Na etapa (I) da presente invenção (ou na etapa (3)), MHC

51 / 105 classe I não é especialmente limitado desde que seja uma molécula que forme um complexo com um peptídeo antigênico, seja reconhecida pelo complexo CD3/TCR e CD8 e transmita um sinal para células CD3-positivas. MHC classe I é, por exemplo, um dímero composto pela cadeia α (HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F ou HLA-G para humano, H-2K, H-2D ou H-2L para camundongo) e microglobulina β2, de preferência, um dímero composto por HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F ou HLA-G e microglobulina β2, mais preferivelmente, um dímero composto por HLA-A, HLA-B ou HLA-C e microglobulina β2. No método de produção ou no método de cultura para expansão da presente invenção, exemplos específicos do MHC classe I incluem, entre outros, HLA-A*02:01, HLA-A*24:02, HLA-A*01:01 e similares. O peptídeo antigênico não é especialmente limitado desde que seja um peptídeo apresentado por MHC classe I. Como o peptídeo antigênico apresentado por MHC classe I, podem ser mencionados, por exemplo, HER- 2/neu, MART-1, NY-ESO-1, Gp-100, MUC-1, p53, antígeno específico da próstata (PSA), hTERT, WT1, survivina, CEA, MAGE-3, peptídeo derivado de proteína derivada de um grupo de vírus fortemente relacionados ao desenvolvimento de tumor maligno e similares, e o peptídeo derivado de WT1-é preferível. Como o peptídeo derivado de WT1 específico, podem ser mencionados RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 1), SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 2), CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3) (peptídeo modificado da mesma CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4)) e similares.

[00175] Na etapa (I) da presente invenção (ou na etapa (3)), MHC classe II não é especialmente limitado desde que seja uma molécula que forme um complexo com um peptídeo antigênico, seja reconhecido pelo complexo CD3/TCR e CD4 e transmita um sinal para células CD3-positivas. MHC classe II é, por exemplo, HLA-DR, HLA-DQ ou HLA-DP para humano e H-2A ou H-2B para camundongo, sendo cada um dos quais um dímero composto por cadeia α e cadeia β (p. ex., HLA-DR é composto por HLA-

52 / 105 DRA, como cadeia α, e HLA-DRB1 como cadeia β), de preferência, HLA- DR, HLA-DQ ou HLA-DP. O peptídeo antigênico não é especialmente limitado desde que seja um peptídeo apresentado por MHC classe II. Como o peptídeo antigênico apresentado por MHC classe II, podem ser mencionados, por exemplo, WT1, PSA, MAGE-3, CEA, survivina, tirosinase, peptídeo derivado de proteína derivada de um grupo de vírus fortemente relacionados ao desenvolvimento de tumor maligno, e o peptídeo derivado de WT1 é preferível.

[00176] MHC e/ou peptídeo antigênico (a seguir a serem indicados como MHC e similares) podem ser uma proteína sintetizada quimicamente ou uma proteína sintetizada biologicamente em um sistema de tradução livre de células. Alternativamente, a proteína pode ser uma proteína recombinante produzida a partir de um transformante incorporando um ácido nucleico com uma sequência de bases que codifica MHC e similares.

[00177] Quando MHC e similares são produzidos de acordo com um método conhecido de síntese peptídica, por exemplo, pode-se utilizar qualquer um dentre um método de síntese em fase sólida e um método de síntese em fase líquida. A proteína desejada pode ser produzida pela condensação de um derivado de aminoácido com um grupo protetor anexado a um grupo carboxi e um grupo funcional de uma cadeia lateral com um aminoácido derivado tendo um grupo amino protegido e um grupo funcional protegido de uma cadeia lateral e a remoção dos grupos protetores.

[00178] A condensação e remoção de grupos protetores são realizadas de acordo com um método conhecido por si mesmo, por exemplo, os métodos descritos em (1)-(5) abaixo.

[00179] (1) M. Bodanszky e M.A. Ondetti: Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966) (2) Schroeder e Luebke: The Peptide, Academic Press, New York (1965)

53 / 105 (3) Nobuo Izumiya, et al.: Peptide Gosei-no-Kiso to Jikken (Fundamentos e experimentos de síntese peptídica), publicado por Maruzen Co. (1975) (4) Haruaki Yajima e Shunpei Sakakibara: Seikagaku Jikken Koza (Experimento Bioquímico) 1, Tanpakushitsu no Kagaku (Química de Proteínas) IV, 205 (1977) (5) Haruaki Yajima, ed.: Zoku Iyakuhin no Kaihatsu (Uma sequência ao Desenvolvimento de Farmacêuticos), Vol. 14, Peptide Synthesis, publicado por Hirokawa Shoten.

[00180] MHC e similares assim obtidos podem ser purificados ou isolados por um método conhecido de purificação. Aqui, como exemplos do método de purificação, podem ser mencionados extração do solvente, destilação, cromatografia em coluna, cromatografia líquida, recristalização, combinações dos mesmos e similares.

[00181] Quando os assim obtidos MHC e similares estão em forma livre, a forma livre pode ser convertida em uma forma de sal adequado por um método conhecido ou um análogo deste e, por outro lado, quando o MHC e similares são obtidos na forma de sal, eles podem ser convertidos na forma livre ou na forma de um sal diferente por um método conhecido ou um análogo deste.

[00182] Além disso, MHC e similares podem também ser produzidos pela cultura de um transformante compreendendo um ácido nucleico que codifica os mesmos, e separando e purificando MHC e similares da cultura obtida. O ácido nucleico que codifica MHC e similares pode ser DNA ou RNA, ou quimera formada por DNA/RNA e, de preferência, DNA. Além disso, o ácido nucleico pode ser de fita dupla ou fita simples. No caso de fitas duplas, pode ser utilizado DNA de fita dupla, RNA de fita dupla ou híbrido DNA:RNA. No caso de uma fita simples, pode ser uma fita sense (ou seja, fita de codificação ou uma fita antisense (ou seja, fita não codificante).

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[00183] Os exemplos do DNA que codifica MHC e similares incluem DNA genômico, cDNA derivado de células de sangue quente (p. ex., humano, bovino, macaco, cavalo, suíno, ovelha, cabra, cão, gato, cobaia, rato, camundongo, coelho, hamster, ave e similares), DNA sintético e similares. O cDNA que codifica MHC e similares pode ser amplificado diretamente por Reação em Cadeia da Polimerase (a seguir abreviado como “método PCR”), usando, como molde, RNA total ou fração do mRNA preparada a partir de qualquer célula dos animais [p. ex., hepatócito, esplenócito, célula nervosa, célula glial, célula β do pâncreas, mielócito, célula mesangial, célula de Langerhans, célula epidérmica, célula epitelial, célula caliciforme, célula endotelial, célula do músculo liso, fibroblasto, fibrócito, miócito, adipócito, imunócito (p. ex., macrófago, célula T, célula B, célula natural killer, mastócito, neutrófilo, basófilo, eosinófilo, monócito), megacariócito, célula sinovial, condrócito, célula óssea, osteoblasto, osteoclasto, célula da glândula mamária, hepatócito, célula intersticial ou uma célula progenitora correspondente, célula-tronco ou célula cancerosa dos mesmos etc.] ou qualquer tecido no qual essas células estejam presentes [p. ex., cérebro ou qualquer parte do cérebro (p. ex., bulbo olfativo, núcleo amigdaloide, gânglio basal, hipocampo, tálamo, hipotálamo, córtex cerebral, medula oblonga, cerebelo), medula espinhal, hipófise, estômago, pâncreas, rim, fígado, gônada, tireoide, vesícula biliar, medula óssea, glândula adrenal, pele, pulmão, trato gastrointestinal (p. ex., intestino grosso e intestino delgado), vaso sanguíneo, coração, timo, baço, glândula submandibular, sangue periférico, próstata, testículo, ovário, placenta, útero, osso, articulação, tecido adiposo (p. ex., tecido adiposo marrom, tecido adiposo branco), músculo esquelético etc.], e por Reação em Cadeia da Polimerase (a seguir abreviada como “método PCR”) e Transcriptase Reversa-PCR (a seguir abreviada como “método RT- PCR”). Alternativamente, o cDNA que codifica MHC e similares podem também ser clonados pelo método de hibridização em colônia ou placa ou

55 / 105 método PCR e similares a partir de uma biblioteca de cDNA preparada pela inserção do RNA total mencionado acima ou um fragmento de mRNA em um vetor adequado. O vetor usado para a biblioteca pode ser qualquer um dentre um bacteriófago, um plasmídeo, um cosmídeo, um fagemídeo e similares.

[00184] Um DNA que codifica MHC e similares pode ser clonado amplificando um primer (iniciador) sintetizado do DNA tendo uma parte de uma sequência de bases que codifica o MHC e similares pelo método PCR, ou hibridizando um DNA incorporado em um vetor de expressão adequado com um fragmento de DNA marcado ou DNA sintético codificador de uma parte ou de toda a região do MHC e similares. A hibridização pode ser realizada por um método conhecido por si mesmo ou um método análogo ao mesmo, por exemplo, pelo método descrito em Molecular Cloning, 2a ed. (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) e similares. Quando se usa uma biblioteca disponível comercialmente, a hibridização pode ser realizada de acordo com o manual de instrução anexado. De preferência, a hibridização pode ser realizada sob condições rigorosas.

[00185] Como exemplos das condições altamente rigorosas, podem ser mencionadas condições de uma reação de hibridização em 6×SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio) a 45ºC seguida por lavagem em 0,2×SSC/SDS 0,1% a 65ºC uma vez ou mais e similares. Os técnicos no assunto são capazes de obter facilmente o rigor desejado mudando a concentração de sal da solução de hibridização, a temperatura da reação de hibridização, a concentração da sonda, o comprimento da sonda, o número de erros de pareamento (mismatches), o tempo da reação de hibridização, a concentração de sal da solução de lavagem, a temperatura da lavagem e similares conforme adequado. Quando se usa uma biblioteca disponível comercialmente, a hibridização pode ser conduzida de acordo com o método descrito no manual de instrução anexado à biblioteca.

[00186] Um vetor de expressão compreendendo DNA que codifica

56 / 105 MHC e similares pode ser produzido, por exemplo, cortando um fragmento desejado de DNA do DNA que codifica MHC e similares e unindo o fragmento de DNA a jusante de um promotor em um vetor de expressão adequado.

[00187] Como vetor de expressão, são utilizados plasmídeos derivados de Escherichia coli (p. ex., pBR322, pBR325, pUC12, pUC13); plasmídeos de expressão em células animais (p. ex., pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo); vetores virais de animais tais como retrovírus, vírus Vaccinia, adenovírus, lentivírus e similares; e similares.

[00188] O promotor pode ser qualquer promotor, desde que seja apropriado para o hospedeiro usado para expressar o gene.

[00189] Por exemplo, quando o hospedeiro é uma célula animal, são usados o promotor SRα, promotor SV40, promotor LTR, promotor CMV (citomegalovírus), promotor RSV (vírus do sarcoma de Rous), promotor LTR de MoMuLV (vírus da leucemia murina de Moloney), promotor HSV-TK (timidina quinase do vírus do herpes simples) e similares. Desses, são preferidos o promotor CMV, o promotor SRα e similares.

[00190] Quando o hospedeiro é uma bactéria do gênero Escherichia, o promotor trp, o promotor lac, o promotor recA, o promotor λPL, o promotor lpp, o promotor T7 e similares são preferidos.

[00191] Os vetores de expressão aqui utilizados incluem além daqueles acima, vetores de expressão que compreendem opcionalmente um reforçador (enhancer), um sinal de splicing, sinal de adição poliA, um marcador de seleção, uma origem de replicação SV40 (a seguir também abreviado como SV40 ori) e similares. Como exemplos dos marcadores de seleção, podem ser mencionados o gene dihidrofolato redutase (a seguir também abreviado como dhfr) [resistência ao metotrexato (MTX)], o gene de resistência á ampicilina (a seguir também abreviado como ampr), o gene de resistência à neomicina (a seguir também abreviado como neor, resistência a G418) e similares. Em

57 / 105 particular, quando uma célula de hamster chinês com gene dhfr defeituoso é utilizada e o gene dhfr é usado como o marcador de seleção, um gene alvo pode também ser selecionado usando um meio sem timidina.

[00192] Quando necessário, uma sequência de bases que codifica uma sequência sinal adequada para um hospedeiro (códon sinal) pode ser adicionada (ou substituída pelo códon sinal nativo) ao lado do terminal 5’ de um DNA que codifica MHC e similares. Por exemplo, quando o hospedeiro é do gênero Escherichia, a sequência sinal PhoA, a sequência sinal OmpA e similares são usadas; quando o hospedeiro é uma célula animal, a sequência sinal de insulina, a sequência sinal de α-interferon, a sequência sinal de uma molécula de anticorpo e similares são usadas.

[00193] MHC e similares podem ser produzidos transformando um hospedeiro com um vetor de expressão contendo o DNA mencionado acima que codifica MHC e similares, e cultivando o transformante obtido.

[00194] Como o hospedeiro, por exemplo, são usados o gênero Escherichia, célula animal e similares.

[00195] Como o gênero Escherichia, por exemplo, K12 DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 60,160(1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, vol. 9, 309(1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology, vol. 120, 517(1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, vol. 41, 459(1969)], C600 [Genetics, vol. 39, 440(1954)] e similares são utilizados.

[00196] Como a célula animal, podem ser utilizadas, por exemplo, célula COS-7 de macaco, célula Vero de macaco, célula do ovário de hamster chinês (a seguir a ser abreviada como célula CHO), célula CHO com gene dhfr defeituoso (a seguir a ser abreviada como célula CHO(dhfr-)), célula L de camundongo, célula AtT-20 de camundongo, célula de mieloma de camundongo, célula GH3 de rato, célula FL humana e similares.

[00197] A transformação pode ser realizada de acordo com o tipo de hospedeiro de acordo com um método conhecido.

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[00198] O gênero Escherichia pode ser transformado, por exemplo, de acordo como os métodos descritos em Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 69, 2110(1972), Genee, vol. 17, 107(1982) e similares.

[00199] As células animais podem ser transformadas de acordo com, por exemplo, o método descrito em Saibo Kogaku, edição extra 8, Shin Saibo Kogaku Jikken Protocol, 263-267 (1995), publicado por Shujunsha, ou Virology, 52, 456 (1973).

[00200] A cultura de um transformante pode ser realizada de acordo com o tipo de hospedeiro de acordo com um método conhecido.

[00201] Como um exemplo do meio usado para cultivar um transformante cujo hospedeiro é uma bactéria do gênero Escherichia, é preferível meio M9 suplementado com glicose e um aminoácido cas [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972]. Se necessário, a fim de aumentar a eficiência do promotor, um agente químico, tal como ácido 3β-indolilacrílico, pode ser adicionado ao meio.

[00202] O cultivo de um transformante wh cujo hospedeiro é uma bactéria do gênero Escherichia é normalmente realizado entre aproximadamente 15ºC e 43ºC por aproximadamente 3 horas a 24 horas. Se necessário, a cultura pode ser aerada ou agitada.

[00203] Como um meio usado quando a cultura é de um transformante cujo hospedeiro é uma célula animal, por exemplo, usa-se meio essencial mínimo (MEM) contendo soro fetal bovino entre aproximadamente 5-20% [Science, vol. 122, 501(1952)], meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) [Virology, vol. 8, 396(1959)], meio RPMI1640 [The Journal of the American Medical Association, vol. 199, 519(1967)], meio 199 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, vol. 73, 1(1950)] ou similares. De preferência, o pH do meio é entre aproximadamente 6 e 8. O cultivo é normalmente realizado entre aproximadamente 30ºC e 40ºC por

59 / 105 aproximadamente 15 a 60 horas. Se necessário, a cultura pode ser aerada ou agitada.

[00204] Como descrito acima, MHC e similares podem ser produzidos em uma célula do transformante ou fora da célula.

[00205] MHC e similares podem ser separados e purificados da cultura obtida cultivando o transformante de acordo com um método conhecido por si mesmo.

[00206] Por exemplo, quando MHC ou similares são extraídos de uma bactéria cultivada ou do citoplasma da célula, usa-se um método, conforme apropriado, em que as bactérias ou células são coletadas da cultura por um meio conhecido, suspensas em uma solução tampão adequada e rompidas por meio de sonicação, lisozima e/ou congelamento/descongelamento e similares, depois do que, um extrato bruto de proteína solúvel é obtido por centrifugação ou filtração. A solução tampão pode compreender um agente desnaturante de proteína, tal como ureia ou cloridrato de guanidina, e um tensoativo tal como Triton X-100TM. Além disso, quando MHC ou similares são secretados fora da bactéria (célula), é usado um método para separar o sobrenadante de uma cultura por centrifugação, filtração ou similares de uma cultura, e similares.

[00207] O isolamento e purificação de MHC e similares contidos na assim obtida fração solúvel e no sobrenadante da cultura podem ser conduzidos de acordo com a método conhecido por si mesmo. Os métodos úteis incluem métodos com base na solubilidade, tal como salting out e precipitação do solvente; métodos que se baseiam principalmente em diferenças no peso molecular, tais como diálise, ultrafiltração, filtração em gel e eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida; métodos que se baseiam em diferenças na carga, ais como cromatografia de troca iônica; métodos que se baseiam em afinidade específica, tais como cromatografia por afinidade; métodos que se baseiam em diferenças na hidrofobicidade, tais como cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa; e métodos que se

60 / 105 baseiam em diferenças no ponto isoelétrico tais como focalização isoelétrica. Esses métodos podem ser combinados conforme adequado.

[00208] O complexo MHC/peptídeo antigênico obtido como descrito acima pode ser um multímero. Com a multimerização do complexo MHC/peptídeo antigênico, pode-se prever um efeito agonista maior em TCR. O método para multimerizar o complexo MHC/peptídeo antigênico da presente invenção é conhecido. Por exemplo, o complexo MHC/peptídeo antigênico modificado com biotina podem ser tetramerizado por intermédio de um tetrâmero de avidina ou estreptavidina. Alternativamente, pode também ser multimerizado pela ligação do complexo MHC/peptídeo antigênico a dextrano.

[00209] Quando o agonista do complexo CD3/TCR usado na etapa (I) da presente invenção (ou na etapa (3)) é um complexo MHC/superantígeno, o complexo MHC/superantígeno é um complexo de MHC classe II e superantígeno. Como o superantígeno, podem ser mencionadas enterotoxina estafilocócica, exotoxina pirogênica estreptocócica, toxina da síndrome do choque tóxico e similares. MHC e superantígeno podem ser produzidos por um método igual ao método descrito para o MHC e similares. O complexo MHC/superantígeno podem ser um multímero tal qual o complexo MHC/peptídeo antigênico. O método para multimerizar o complexo MHC/superantígeno da presente invenção é igual ao método para multimerizar o complexo MHC/peptídeo antigênico.

[00210] O agonista do complexo CD3/TCR usado na etapa (I) da presente invenção pode estar presente em qualquer forma desde que possa entrar em contato com o complexo CD3/TCR na superfície celular CD3- positiva durante a cultura. Por exemplo, ele pode estar contido no meio durante a cultura, ou pode ser imobilizado em um recipiente de cultura e, de preferência, é imobilizado em um recipiente de cultura.

[00211] Quando o agonista do complexo CD3/TCR está contido no

61 / 105 meio, o meio não é especialmente limitado desde que células CD3-positivas possam ser ali cultivadas.

Por exemplo, meio Essencial Mínimo de Glasgow (GMEM), meio IMDM, meio 199, meio Essencial Mínimo de Eagle (EMEM), meio αMEM, meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), meio F12 de Ham, meio RPMI 1640, meio de Fischer, meio Neurobasal (Life Technologies) e meios mistos destes, além de similares estão incluídos.

O meio pode conter um soro ou pode ser livre de soro.

Quando um soro está contido, a concentração do soro (p. ex., soro fetal bovino (FBS), soro humano e similares) é tal que o limite inferior em geral não é menor do que de 1%, de preferência não é menor do que 5%, e o limite superior em geral não é maior do que 20%, de preferência não é maior do que de 15%. Quando necessário, o meio pode conter um ou mais substitutos do soro tais como Knockout Serum Replacement (KSR) (reposição sérica de FBS em células ES em cultura), suplemento N2 (Invitrogen), suplemento B27 (Invitrogen), albumina, insulina, transferrina, compostos de selênio (p. ex., selenito de sódio), vitaminas C (p. ex., ácido ascórbico) apotransferrina, ácido graxo, precursor de colágeno, elemento traço, 2-mercaptoetanol, 3’-tiol-glicerol e similares, e um ou mais substâncias tais como lipídio, aminoácido, L-glutamina, L-alanil- L-glutamina (p. ex., Glutamax (marca registrada)), aminoácido não essencial, vitamina, fator de crescimento, composto de baixo peso molecular, antibiótico (p. ex., penicilina, estreptomicina), antioxidante, ácido pirúvico, agente tamponante, sais inorgânicos, selênio ácido, progesterona, putrescina e similares.

Quando o agonista do complexo CD3/TCR está contido no meio, a concentração do agonista do complexo CD3/TCR pode ser tal que o limite inferior não é menor do que 0,3 ng/mL, de preferência, não menor do que 3 ng/mL, e o limite superior não é maior do que 10000 ng/mL, de preferência, não maior do que 1000 ng/mL.

Especialmente, quando o agonista do complexo CD3/TCR é um anticorpo agonista anti-CD3, a concentração do anticorpo agonista anti-CD3 no meio é, por exemplo, 10 ng/mL-1000 ng/mL.

62 / 105 A cultura pode ser realizada, por exemplo, em uma incubadora de CO2 sob atmosfera com concentração de CO2 entre aproximadamente 1-10%, de preferência, entre aproximadamente 2-5% a aproximadamente 30-40ºC, de preferência, aproximadamente 37ºC. O período de cultura em um meio contendo o agonista do complexo CD3/TCR pode ser adequadamente monitorado pelos técnicos no assunto, monitorando o número de células CD3- positivas e similares. O número de dias não é limitado desde que células CD3- positivas possam ser obtidas. O período de cultura é, por exemplo, pelo menos 6 horas ou mais, 12 horas ou mais, 16 horas ou mais, 24 horas ou mais, 48 horas ou mais, 72 horas ou mais, de preferência 16-72 horas. Além disso, o período preferível é de 14 dias ou mais, e de 7 dias ou mais é mais preferível.

[00212] Quando se usa vitamina C, de preferência, a vitamina C é adicionada (fornecida) a cada quatro dias, a cada três dias, a cada dois dias ou todos os dias. A vitamina C é mais preferivelmente adicionada todos os dias. Em uma modalidade, a vitamina C é preferivelmente adicionada ao meio em uma quantidade correspondente a entre 5 ng/mL e 500 ng/mL (p. ex., uma quantidade correspondente a 5 ng/mL, 10 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 200 ng/mL, 300 ng/mL, 400 ng/mL ou 500 ng/mL). Em outra modalidade, a vitamina C é adicionada ao meio de cultura em uma quantidade correspondente a 5 μg/mL-500 μg/mL (p. ex., uma quantidade correspondente a 5 μg/mL, 10 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL, 300 μg/mL, 400 μg/mL, 500 μg/mL).

[00213] O meio usado na etapa (I) da presente invenção pode conter ainda citocina. A citocina contida no meio não é especialmente limitada e pelo menos uma selecionada dentre IL-7, IL-15, IL-18 e IL-21 pode ser menciona. É preferível que contenha todas, IL-7, IL-15, IL-18 e IL-21. A concentração da citocina é tal que o limite inferior não é menor do que 0,1 ng/mL, de preferência, não menor do que 10 ng/mL, e o limite superior não é maior do que 1000 ng/mL, de preferência, não maior do que 300 ng/mL.

63 / 105 Quando essas citocinas são usadas, a concentração no meio é 1-100 ng/mL para IL-7, 1-100 ng/mL para IL-15, 5-500 ng/mL para IL-18 e 2-200 ng/mL para IL-21.

[00214] O meio usado na etapa (I) da presente invenção pode conter ainda TL1A e/ou IL-12. Nesse caso, a concentração de TL1A no meio é 5- 500 ng/mL, e a concentração de IL-12 no meio é 5-500 ng/mL.

[00215] O meio usado na etapa (I) da presente invenção pode conter uma citocina da família TNF como a citocina. Os exemplos da citocina da família TNF incluem TNF-α, TNF-β, linfotoxina α, ligante de Fas, TRAIL, TWEAK, TL1A, ligante de RANK, ligante de OX40, APRIL, AITRL, BAFF, 4-1BBL e ligante de CD40, e similares, e TL1A é preferível. Quando se usa TL1A, a sua concentração no meio pode ser 5 ng/mL-500 ng/mL.

[00216] Como o inibidor de apoptose usado na etapa (I) da presente invenção, um inibidor de proteases, por exemplo, inibidor de caspases, pode ser mencionado. Como o inibidor de caspases, o inibidor Pan Caspase FMK Z-VAD (N-benziloxicarbonil-Val-Ala-Asp(O-Me) fluorometilcetona) é preferível, e a sua concentração no meio podem ser 1-1000 µM.

[00217] Quando o agonista do complexo CD3/TCR é imobilizado em um recipiente de cultura, o recipiente de cultura não é especialmente limitado desde que células CD3-positivas possam ser ali cultivadas, e vasilha, lâmina, microesfera ou uma combinação dessas podem ser utilizadas. Os exemplos do recipiente de cultura incluem frasco, frasco de cultura de tecido, placa, placa de Petri, placa de cultura de tecido, placa múltipla, microplaca, placa de micropoços, micro lâmina, lâmina com compartimento, placa de Petri, tubo, bandeja, bolsa de cultura, frasco rolante, microesfera e similares.

[00218] O agonista do complexo CD3/TCR pode ser imobilizado em um recipiente de cultura por um meio conhecido. Por exemplo, um agonista do complexo CD3/TCR pode ser imobilizado em um recipiente de cultura dissolvendo o agonista do complexo CD3/TCR em um solvente (p. ex., PBS e

64 / 105 similares), adicionando o mesmo ao recipiente de cultura e deixando em repouso a 4ºC durante a noite.

A concentração da solução do agonista do complexo CD3/TCR para imobilização do agonista do complexo CD3/TCR no recipiente de cultura pode ser adequadamente monitorada pelos técnicos no assunto de acordo com o tipo do agonista do complexo CD3/TCR.

Em uma modalidade da presente invenção, por exemplo, quando o agonista do complexo CD3/TCR é um anticorpo agonista anti-CD3 ou um fragmento de ligação do mesmo, uma solução a 0,3-10000 ng/mL do anticorpo agonista anti-CD3 ou um fragmento de ligação do mesmo pode em geral ser colocada em contato com o recipiente de cultura, e 3-5000 ng/mL é mais preferível, 3- 3000 ng/mL é ainda mais preferível e 3-600 ng/mL é especialmente preferível.

Em outra modalidade da presente invenção, a concentração de um anticorpo agonista anti-CD3 ou um fragmento de ligação do mesmo em uma solução é, por exemplo, 10 ng/mL-10000 ng/mL, de preferência 50 ng/mL- 5000 ng/mL, mais preferivelmente 200 ng/mL-4000 ng/mL.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, a concentração de um anticorpo agonista anti-CD3 ou um fragmento de ligação do mesmo em uma solução é, por exemplo, 1-50000 ng/mL, de preferência 3-30000 ng/mL, mais preferivelmente 30-30000 ng/mL, ainda preferivelmente 300-30000 ng/mL.

Quando o anticorpo agonista anti-CD3 ou um fragmento de ligação do mesmo é um anticorpo (OKT3) ou um fragmento de ligação do mesmo produzido a partir de um clone OKT3, a concentração do mesmo em uma solução é, por exemplo, 1 ng/mL-50000 ng/mL, de preferência 10 ng/mL-10000 ng/mL, mais preferivelmente 50 ng/mL-5000 ng/mL, ainda preferivelmente 200 ng/mL-4000 ng/mL.

Quando o anticorpo agonista anti-CD3 ou um fragmento de ligação do mesmo é um anticorpo (UCHT1) ou um fragmento de ligação do mesmo produzido a partir de um clone UCHT1, a concentração do mesmo em uma solução é, por exemplo, 1 ng/mL-50000 ng/mL, de preferência 3 ng/mL-30000 ng/mL, mais preferivelmente 30 ng/mL-30000 ng/mL, ainda

65 / 105 preferivelmente 300 ng/mL-30000 ng/mL.

[00219] Na etapa (I) da presente invenção, a fibronectina não é especialmente limitada desde que seja uma molécula capaz de ligar-se a células CD3-positivas. A variante de fibronectina não é especialmente limitada desde que seja uma molécula capaz de ligar-se a VLA-5 e VLA-4 na superfície de células CD3-positivas, e os seus exemplos incluem RetroNectin (marca registrada).

[00220] Fibronectina ou uma variante dela a ser usada na etapa (I) da presente invenção pode estar presente em qualquer forma desde que possam entrar em contato com células CD3-positivas durante a cultura, como o agonista do complexo CD3/TCR. Por exemplo, podem estar contidas no meio durante a cultura, ou podem ser imobilizadas em um recipiente de cultura e, de preferência, imobilizadas em um recipiente de cultura.

[00221] Quando fibronectina ou uma variante dela está contida em um meio, o meio pode ser o mesmo que aquele contendo um agonista do complexo CD3/TCR. A presença ou ausência de soro, aditivo e similares pode ser a mesma que aquela no meio contendo um agonista do complexo CD3/TCR. Quando fibronectina ou uma variante dela está contida em um meio, o limite inferior da concentração de fibronectina ou uma variante dela pode ser não menor do que 10 ng/mL, de preferência, não menor do que 100 ng/mL, e o limite superior pode ser não maior do que 10000 μg/mL, de preferência, não maior do que 1000 μg/mL.

[00222] Quando fibronectina ou uma variante dela é imobilizado em um recipiente de cultura, o recipiente de cultura pode ser o mesmo que aquele no qual o agonista do complexo CD3/TCR é imobilizado. Além disso, a imobilização de fibronectina ou de uma variante no recipiente de cultura pode ser igual àquela que imobiliza o agonista do complexo CD3/TCR. A imobilização de fibronectina ou uma variante dela em um recipiente de cultura pode ser igual àquela do agonista do complexo CD3/TCR. A

66 / 105 concentração da solução de fibronectina ou uma variante dela, durante a imobilização de fibronectina ou uma variante dela em um recipiente de cultura, pode ser adequadamente monitorada pelos técnicos no assunto de acordo com a fibronectina ou uma variante dela. Por exemplo, quando a fibronectina ou uma variante dela é RetroNectin (marca registrada), uma solução de 0,1-10000 μg/mL de RetroNectin (marca registrada) é preferivelmente colocada em contato com o recipiente de cultura. Nesse caso, a concentração da solução de RetroNectin é mais preferivelmente 0,1-1000 μg/mL, ainda preferivelmente 1-300 μg/mL, especialmente preferível 1-150 μg/mL.

[00223] Na etapa (I) da presente invenção, o agonista de CD30 não é especialmente limitado desde que seja uma molécula capaz de transduzir um sinal de CD30 para uma célula ao se ligar especificamente a CD30. Os exemplos do agonista de CD30 include pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em anticorpo agonista anti-CD30 ou um fragmento ligado ao mesmo e ligante de CD30 ou um fragmento ligado ao mesmo.

[00224] O tipo, o método de produção e similares do anticorpo agonista anti-CD30 e um fragmento de ligação do mesmo usado na etapa (I) da presente invenção podem ser iguais àqueles do anticorpo agonista anti- CD3 e anticorpo anti-TCR.

[00225] O ligante de CD30 ou um fragmento de ligação do mesmo usado na etapa (I) da presente invenção é, por exemplo, CD153. O ligante de CD30 ou um fragmento de ligação do mesmo pode ser produzido por um método semelhante ao método de produção do MHC e/ou peptídeo antigênico.

[00226] O agonista de CD30 usado na etapa (I) da presente invenção podem estar presente em qualquer forma desde que possa estar presente em contato com CD30 durante a cultura. Por exemplo, pode estar contido no meio durante a cultura, ou pode ser imobilizado em um recipiente de cultura

67 / 105 e, de preferência, está contido no meio.

[00227] Quando um agonista de CD30 está contido em um meio, o meio pode ser o mesmo que aquele contendo um agonista do complexo CD3/TCR. A presença ou ausência de soro, aditivo e similares pode ser igual àquela no meio contendo um agonista do complexo CD3/TCR. Quando um agonista de CD30 está contido em um meio, a concentração do agonista de CD30 no meio pode ser adequadamente monitorada pelos técnicos no assunto de acordo com o tipo do agonista de CD30. Por exemplo, quando o agonista de CD30 é um anticorpo agonista anti-CD30 ou um fragmento de ligação do mesmo, a concentração do anticorpo agonista anti-CD30 ou um fragmento de ligação do mesmo no meio é em geral 1 ng/mL-10000 ng/mL, de preferência 1 ng/mL-1000 ng/mL, mais preferivelmente 3 ng/mL-300 ng/mL, ainda preferivelmente 30 ng/mL-300 ng/mL.

[00228] Quando o agonista de CD30 é imobilizado em um recipiente de cultura, o recipiente de cultura pode ser igual àquele no qual o agonista do complexo CD3/TCR é imobilizado. Além disso, um método para imobilização do agonista de CD30 no recipiente de cultura pode ser igual àquele para imobilização do agonista do complexo CD3/TCR. O limite inferior da concentração de uma solução do agonista de CD30 quando o agonista de CD30 é imobilizado em um recipiente de cultura pode ser não menor do que 0,1 ng/mL, de preferência, não menor do que 1 ng/mL, e o limite superior pode ser não maior do que 10000 ng/mL, de preferência, não maior do que 1000 ng/mL.

[00229] O método de produção ou método de cultura para expansão da presente invenção pode incluir ainda uma etapa de cultivo das células CD3- positivas, que foram cultivadas na etapa (I) da presente invenção, na ausência de um agonista do complexo CD3/TCR e fibronectina, ou uma variante dela, e na presença de um agonista de CD30 (a seguir a ser referida como etapa (II) da presente invenção).

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[00230] Como o meio na etapa (II) da presente invenção, o meio usado na etapa (I) mencionada acima pode ser utilizado. O meio pode conter um soro ou pode ser livre de soro. Quando um soro está contido, a concentração do soro (p. ex., soro fetal bovino (FBS), soro humano e similares) é tal que o limite inferior não é em geral menor do que 1%, de preferência, não menor do que 5%, e o limite superior não é em geral maior do que 20%, de preferência, não maior do que 15%. Quando necessário, o meio pode conter um ou mais substitutos de soro tais como o Knockout Serum Replacement (KSR) (reposição sérica de FBS na cultura de células ES), suplemento N2 (Invitrogen), suplemento B27 (Invitrogen), albumina, insulina, transferrina, composto de selênios (p. ex., selenito de sódio), vitaminas C (p. ex., ácido ascórbico) apotransferrina, ácido graxo, precursor de colágeno, elemento traço, 2-mercaptoetanol, 3’-tiol-glicerol e similares, e uma ou mais substâncias tais como lipídio, aminoácido, L-glutamina, Glutamax (Invitrogen), aminoácido não essencial, vitamina, fator de crescimento, composto de baixo peso molecular, antibiótico, antioxidante, ácido pirúvico, agente tamponante, sais inorgânicos, selênio ácido, progesterona, putrescina e similares. A cultura pode ser realizada, por exemplo, em uma incubadora de CO2 sob atmosfera com concentração de CO2 entre aproximadamente 1-10%, de preferência entre aproximadamente 2-5% a aproximadamente 30-40ºC, de preferência aproximadamente 37ºC. O período de cultura pode ser adequadamente monitorado pelos técnicos no assunto, monitorando o número de células CD3-positivas e similares. O número de dias não é limitado desde que células CD3-positivas possam ser obtidas. O período de cultura é, por exemplo, não menor do que 3 dias, não menor do que 5 dias, não menor do que 7 dias, não menor do que 10 dias, não menor do que 14 dias, não menor do que 21 dias, de preferência, não menor do que 5 dias e não maior do que 15 dias. De preferência, não é maior do que 30 dias, mais preferivelmente não maior do que 21 dias.

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[00231] Quando se usa vitamina C, de preferência, a vitamina C é adicionada (fornecida) a cada quatro dias, a cada três dias, a cada dois dias ou todos os dias. A vitamina C é mais preferivelmente adicionada todos os dias. Em uma modalidade, a vitamina C é adicionada ao meio em uma quantidade correspondente a entre 5 ng/mL e 500 ng/mL (p. ex., uma quantidade correspondente a 5 ng/mL, 10 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 200 ng/mL, 300 ng/mL, 400 ng/mL ou 500 ng/mL). Em outra modalidade, a vitamina C é adicionada ao meio de cultura em uma quantidade correspondente a 5 µg/mL-500 µg/mL (p. ex., uma quantidade correspondente a 5 µg/mL, 10 µg/mL, 25 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL, 300 µg/mL, 400 µg/mL, 500 µg/mL).

[00232] O meio usado na etapa (II) da presente invenção pode conter ainda citocina. A citocina não é especialmente limitada e pelo menos uma selecionada dentre IL-7, IL-15, IL-18 e IL-21 pode ser mencionada. É preferível conter todas, IL-7, IL-15, IL-18 e IL-21. A concentração da citocina pode ser tal que o limite inferior não é menor do que 0,1 ng/mL, de preferência, não menor do que 10 ng/mL, e o limite superior não é maior do que 1000 ng/mL, de preferência, não maior do que 300 ng/mL. Quando essas citocinas são usadas, a concentração no meio pode ser 1 ng/mL-100 ng/mL para IL-7, 1 ng/mL-100 ng/mL para IL-15, 5 ng/mL-500 ng/mL para IL-18 e 2 ng/mL-200 ng/mL para IL-21.

[00233] O meio usado na etapa (II) da presente invenção pode conter ainda TL1A e/ou IL-12. Nesse caso, a concentração de TL1A no meio pode ser 5 ng/mL-500 ng/mL, e a concentração de IL-12 no meio pode ser 5 ng/mL-500 ng/mL.

[00234] O meio usado na etapa (II) da presente invenção pode conter ainda um inibidor de apoptose. Como o inibidor de apoptose, um inibidor de proteases pode ser mencionado, por exemplo, inibidor de caspases. Como o inibidor de caspases, o inibidor Pan Caspase FMK Z-VAD (N-

70 / 105 benziloxicarbonil-Val-Ala-Asp(O-Me) fluorometilcetona) (a seguir, às vezes, referido como “Z-VAD-FMK”) é preferível, e a sua concentração no meio pode ser 1 μM-1000 μM, de preferência 1 μM-500 μM, mais preferivelmente 1 μM-200 μM, especialmente preferível 1 μM-50 μM.

[00235] Em uma modalidade da presente invenção, a etapa (I) e etapa (II) mencionadas acima podem ser repetidas nessa ordem.

[00236] A presente invenção também provê células CD3-positivas obtidas pelo método de produção ou método de cultura para expansão da presente invenção (a seguir a ser referida como a célula CD3-positiva da presente invenção). A célula CD3-positiva da presente invenção é igual à célula CD3-positiva obtida pelo método de produção ou método de cultura para expansão da presente invenção.

[00237] A presente invenção também provê um kit para cultura de expansão de células CD3-positivas contendo o seguinte (a seguir a ser referido como o kit da presente invenção): (1) um recipiente de cultura com um agonista do complexo CD3/TCR e fibronectina ou uma variante dela, imobilizados no mesmo, e (2) um meio contendo um agonista de CD30.

[00238] O agonista do complexo CD3/TCR, fibronectina ou uma variante dela, o agonista de CD30, o recipiente de cultura e o meio contido no kit da presente invenção podem ser iguais àqueles descritos para o método de produção ou método de cultura para expansão da presente invenção.

[00239] A presente invenção também provê um método para manter células CD3-positivas como células CD3-positivas CD197-positivas, incluindo uma etapa de estimulação de um sinal de CD30 nas células CD3- positivas (a seguir a ser referido como o método para manutenção da presente invenção).

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[00240] Em geral, quando células T virgens, derivadas do sangue periférico, são estimuladas com um antígeno apresentado por célula dendrítica, as células T virgens são ativadas por sinais intracelulares, repetem a proliferação e maturação e, em sequência diferenciam-se em células T de memória de célula-tronco, células T de memória central, células T efetoras de memória e células T efetoras. As células T efetoras produzem citocina no caso de células CD3-positivas CD4-positivas CD8-negativas (células T helper), e eliminam células alvo por intermédio de antígeno no caso da célula CD3-positiva CD4-negativa CD8-positiva (célula T citotóxica), mas não conseguem sobrever por um período longo. No entanto, pela estimulação do sinal de CD30 em células T, as células T podem ser mantidas como células T virgens ou células T de memória de célula-tronco (CD197-positiva, CD45RA- positiva) ou células T de memória central (CD197-positiva, CD45RA- negativa) em proliferação que podem se diferenciar em células T efetoras.

[00241] As células CD3-positivas cultivas pelo método para manutenção da presente invenção podem ser iguais às células CD3-positivas cultivadas pelo método de produção ou método de cultura para expansão da presente invenção. De preferência, a célula CD3-positiva é uma célula CD3- positiva CD197-positiva.

[00242] O método para manutenção da presente invenção inclui uma etapa de estimulação do sinal de CD30 nas células CD3-positivas. O método para estimulação do sinal de CD30 nas células CD3-positivas não é especialmente limitado desde que o sinal possa ser transmitido a jusante através de um domínio intracelular de CD30. Os exemplos do método incluem um método que inclui uma etapa de cultivo de células CD3-positivas na presença de um agonista de CD30 (a seguir a ser referido como o método para manutenção (1) da presente invenção). A célula CD3-positiva pode ser mantida como células CD3-positivas CD197-positivas pelo método para manutenção (1) da presente invenção.

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[00243] Em uma modalidade do método para manutenção (1) da presente invenção, células CD3-positivas podem ser mantidas como células CD3-positivas CD197-positivas CD45RA-negativas.

[00244] O agonista de CD30 e as condições de cultura no método para manutenção (1) da presente invenção podem ser iguais àqueles utilizados no método de produção ou método de cultura para expansão da presente invenção.

[00245] A presente invenção também provê um kit contendo um agonista de CD30 para manter células CD3-positivas como células CD3- positivas CD197-positivas (a seguir a ser referido como o kit para manutenção da presente invenção).

[00246] O agonista de CD30 contido no kit para manutenção da presente invenção pode ser igual ao agonista de CD30 usado no método para manutenção (1) da presente invenção.

[00247] No método para manutenção da presente invenção, outro método para estimulação de um sinal de CD30 na célula CD3-positiva é, por exemplo, um método que inclui uma etapa de cultivo de células CD3- positivas que expressam um receptor de antígeno quimérico contendo o domínio intracelular de CD30, na presença de um antígeno que estimula o receptor de antígeno quimérico (a seguir a ser referido como o método para manutenção (2) da presente invenção). O sinal pode ser transmitido a jusante através de um domínio intracelular de CD30 pela estimulação de um receptor de antígeno quimérico contendo o domínio intracelular de CD30, e células CD3-positivas que expressam um receptor de antígeno quimérico contendo o domínio intracelular de CD30 podem ser mantidas como células CD3- positivas CD197-positivas.

[00248] Em uma modalidade do método para manutenção (2) da presente invenção, células CD3-positivas que expressam um receptor de antígeno quimérico contendo o domínio intracelular de CD30 podem ser

73 / 105 mantidas como células CD3-positivas CD197-positivas CD45RA-negativas.

[00249] As condições de cultura utilizadas no método para manutenção (2) da presente invenção podem ser iguais àquelas utilizadas no método de produção ou método de cultura para expansão da presente invenção.

[00250] O antígeno que estimula o receptor de antígeno quimérico usado no método para manutenção (2) da presente invenção não é especialmente limitado desde que um sinal possa ser transmitido a jusante através de um domínio intracelular de CD30 contido no receptor de antígeno quimérico. O antígeno que estimula o receptor de antígeno quimérico pode ser igual ao antígeno atingido pelo receptor de antígeno quimérico da célula CD3-positiva que expressa receptores quiméricos de antígenos cultivada pelo método de produção ou método de cultura para expansão da presente invenção.

[00251] A presente invenção também provê um receptor de antígeno quimérico que contém um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembrana e um domínio de transdução de sinal intracelular, em que o domínio de transdução de sinal intracelular contém um domínio intracelular de CD30 ou um mutante do mesmo (a seguir a ser referido como o receptor de antígeno quimérico da presente invenção).

[00252] O domínio de ligação ao antígeno contido no receptor de antígeno quimérico da presente invenção pode ser igual ao domínio de ligação ao antígeno contido no receptor de antígeno quimérico expresso nas células CD3-positivas cultivadas no método de produção ou método de cultura para expansão da presente invenção.

[00253] O domínio transmembrana contido no receptor de antígeno quimérico da presente invenção pode ser igual ao domínio transmembrana contido em um receptor de antígeno quimérico expresso nas células CD3- positivas cultivadas no método de produção ou método de cultura para expansão da presente invenção.

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[00254] O domínio de transdução de sinal intracelular contido no receptor de antígeno quimérico da presente invenção contém um domínio intracelular de CD30 ou um mutante do mesmo. O domínio intracelular de CD30 não é especialmente limitado desde que o domínio de ligação ao antígeno contido no receptor de antígeno quimérico da presente invenção reconheça um antígeno e retenha a função de transmitir o sinal de reconhecimento do mesmo para células. Por exemplo, pode-se mencionar um peptídeo contendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 6.

[00255] Embora o mutante do domínio intracelular de CD30 não seja especialmente limitado desde que retenha a função mencionada acima, por exemplo, pode-se mencionar um peptídeo que contenha uma sequência de aminoácidos tendo uma homologia não inferior a aproximadamente 90%, de preferência, não inferior a aproximadamente 95%, mais preferivelmente não inferior a aproximadamente 97%, especialmente preferível, não inferior a aproximadamente 98% e, o mais preferível, não inferior a aproximadamente 99% com a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 6. Neste relatório descritivo, a “homologia” pode ser igual àquela na sequência de aminoácidos de “IL-15/IL-15Rα”.

[00256] Além disso, o mutante do domínio intracelular de CD30 também inclui, por exemplo, uma proteína contendo (1) uma sequência de aminoácidos em que um ou mais (de preferência 1 a cerca de 100, preferivelmente 1 a cerca de 50, ainda preferivelmente 1 a cerca de 10, especialmente preferível 1 a diversos (2, 3, 4 ou 5)) aminoácidos na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 6 são deletados, (2) uma sequência de aminoácidos em que um ou mais (de preferência 1 a cerca de 100, preferivelmente 1 a cerca de 50, ainda preferivelmente 1 a cerca de 10, especialmente preferível 1 a diversos (2, 3, 4 ou 5)) aminoácidos são adicionados à sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 6, (3) uma sequência de aminoácidos em que um ou mais (de preferência 1 a cerca de 50,

75 / 105 preferivelmente 1 a cerca de 10, ainda preferivelmente 1 a diversos (2, 3, 4 ou 5)) aminoácidos são inseridos na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 6, (4) uma sequência de aminoácidos em que um ou mais (de preferência 1 a cerca de 50, preferivelmente 1 a cerca de 10, ainda preferivelmente 1 a diversos (2, 3, 4 ou 5)) aminoácidos são substituídos por outros aminoácidos na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 6 ou (5) uma sequência de aminoácidos que é uma combinação dos mesmos e similares. Quando a sequência de aminoácidos é inserida, deletada ou substituída como mencionado acima, a posição da inserção ou deleção ou substituição não é especialmente limitada desde que a função do domínio intracelular de CD30 seja mantida.

[00257] O domínio de transdução de sinal intracelular contido no receptor de antígeno quimérico da presente invenção pode conter um domínio intracelular de CD30 ou um mutante do mesmo, além disso, um domínio intracelular derivado de outra proteína. O domínio intracelular a ser ainda contido pode ser igual ao domínio intracelular contido em um domínio de transdução de sinal intracelular contido no receptor de antígeno quimérico expresso em células CD3-positivas cultivadas no método de produção ou método de cultura para expansão da presente invenção. O domínio intracelular a ser ainda contido não é especialmente limitado, e um domínio intracelular derivado de CD28 ou cadeia CD3ζ é preferível.

[00258] O receptor de antígeno quimérico da presente invenção pode ter um espaçador incorporado entre um domínio de ligação ao antígeno e um domínio transmembrana, ou entre um domínio de transdução de sinal intracelular e um domínio transmembrana. O espaçador pode ser igual ao espaçador contido no receptor de antígeno quimérico expresso em células CD3-positivas cultivadas no método de produção ou método de cultura para expansão da presente invenção.

[00259] Exemplos específicos do receptor de antígeno quimérico da

76 / 105 presente invenção incluem um receptor de antígeno quimérico contendo scFv que reconhece CD19 como um domínio de ligação ao antígeno, o domínio transmembrana de CD8 como um domínio transmembrana, o domínio intracelular derivado de CD28 como um domínio de transdução de sinal intracelular, um domínio intracelular derivado de CD30 e um domínio intracelular derivado da cadeia CD3ζ. A ordem dos domínios intracelulares mencionados acima, contidos no domínio de transdução de sinal intracelular, não é especialmente limitada e, por exemplo, a ordem do domínio intracelular derivados de CD28, o domínio intracelular derivado de CD30 e o domínio intracelular derivado da cadeia CD3ζ é adotada. Mais especificamente, o receptor de antígeno quimérico na presente invenção é composto, por exemplo, pela sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 7.

[00260] O receptor de antígeno quimérico da presente invenção pode ser uma proteína sintetizada quimicamente ou uma proteína sintetizada bioquimicamente em um sistema de tradução livre de células, ou pode ser uma proteína recombinante produzida a partir de um transformante que incorpora um ácido nucleico tendo uma sequência de bases que codifica o receptor de antígeno quimérico da presente invenção. O receptor de antígeno quimérico da presente invenção pode ser produzido de modo semelhante e isolado e purificado de acordo com o método de produção de MHC e/ou peptídeo antigênico usados no método de produção ou método de cultura para expansão da presente invenção.

[00261] A presente invenção também provê um ácido nucleico contendo um polinucleotídeo que codifica receptor de antígeno quimérico da presente invenção (a seguir a ser referida como o ácido nucleico da presente invenção).

[00262] O ácido nucleico da presente invenção pode um DNA ou um RNA ou uma quimera DNA/RNA. É preferível que seja um DNA. Além disso, o ácido nucleico pode de fita dupla ou de fita simples. No caso de fitas

77 / 105 duplas, podem ser utilizados DNA de fita dupla, RNA de fita dupla ou um híbrido DNA:RNA. No caso de fita simples, pode ser uma fita sense (ou seja, fita de codificação) ou uma fita antisense (ou seja, fita de não codificação).

[00263] O ácido nucleico da presente invenção pode ser obtido pela Reação em Cadeia da Polimerase (a seguir abreviada como “método PCR”). Primeiramente, um DNA genômico ou cDNA que codifica cada domínio de um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembrana e um domínio de transdução de sinal intracelular contidos no receptor de antígeno quimérico da presente invenção. O cDNA pode também ser amplificado diretamente pelo método PCR e Reverse Transcriptase-PCR (a seguir a ser abreviado como “método RT-PCR”) utilizando, como mole, um RNA total ou fração de mRNA preparada a partir de células. Usando o DNA genômico obtido ou cDNA como molde, um ácido nucleico que codifica cada domínio de um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembrana e um domínio de transdução de sinal intracelular pode ser amplificado pelo método PCR, utilizando um primer sintético do DNA, composto por uma parte da sequência de bases que codifica cada domínio e uma sequência de bases que codifica um espaçador. O ácido nucleico da presente invenção pode ser obtido repetindo-se o método PCR e usando os respectivos domínios obtidos como moldes e os primers sintéticos do DNA.

[00264] A presente invenção também provê um vetor de transferência gênica do receptor de antígeno quimérico, o qual contém o ácido nucleico da presente invenção (a seguir a ser referido como o vetor transgênico da presente invenção).

[00265] O vetor transgênico da presente invenção pode ser produzido, por exemplo, pela ligação do ácido nucleico da presente invenção a jusante de um promotor em um vetor de transferência gênica adequado. O vetor de transferência gênica, o promotor e outros elementos podem ser iguais ao vetor, promotor e outros elementos usados na introdução de TCR exógeno em

78 / 105 células-tronco pluripotentes no método de produção ou método de cultura para expansão da presente invenção.

[00266] A presente invenção também provê uma célula expressando o receptor de antígeno quimérico que contém o vetor transgênico da presente invenção (a seguir a ser referida como a célula expressando o receptor de antígeno quimérico da presente invenção).

[00267] A célula expressando o receptor de antígeno quimérico da presente invenção pode ser produzida introduzindo-se o vetor transgênico vector da presente invenção em células e cultivando as células. Como a célula na qual o vetor transgênico da presente invenção é introduzido, uma célula CD3-positiva ou uma célula progenitor da mesma (célula-tronco hematopoiética, célula progenitora linfoide comum, linfoblasto e similares), ou uma célula-tronco pluripotente podem ser mencionadas. Como a célula- tronco pluripotente, podem ser mencionadas célula ES, célula iPS, célula EC e célula EG, sendo preferida célula ES ou célula iPS.

[00268] O vetor transgênico da presente invenção pode ser introduzido nas células por métodos tais como lipofecção, lipossomo, microinjeção e similares.

[00269] De preferência, a célula expressando o receptor de antígeno quimérico da presente invenção é uma célula CD3-positiva. De preferência, a célula CD3-positiva é uma célula CD3-positiva CD8-positiva (célula CD3- positiva CD8-positiva CD4-positiva ou célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-negativa), mais preferivelmente uma célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-negativa. Outra célula CD3-positiva preferível mencionada acima é, por exemplo, uma célula CD3-positiva CD4-positiva (célula CD3-positiva CD4- positiva CD8-positiva ou célula CD3-positiva CD4-positiva CD8-negativa).

[00270] Quando a célula expressando o receptor de antígeno quimérico da presente invenção é uma célula produzida introduzindo o vetor transgênico da presente invenção em células-tronco pluripotentes, a célula-tronco

79 / 105 pluripotente pode ser diferenciada em uma célula CD3-positiva de acordo com um método conhecido por si mesmo. Um método específico para diferenciação de uma célula-tronco pluripotente em uma célula CD3-positiva pode ser igual ao método para diferenciação da célula CD3-positiva a ser cultivada em uma célula-tronco pluripotente no método de produção ou método de cultura para expansão da presente invenção.

[00271] A especificidade para o antígeno de interesse é transmitida para a célula expressando o receptor de antígeno quimérico da presente invenção assim obtida pelo receptor de antígeno quimérico, e esta pode mostrar atividade citotóxica contra tumores que expressam o antígeno de interesse. O receptor de antígeno quimérico pode reconhecer diretamente uma molécula do antígeno sem depender de HLA classe I ou classe II. Assim, a célula expressando o receptor de antígeno quimérico da presente invenção pode provocar uma alta resposta imune mesmo para tumores com expressão reduzida do gene de HLA classe I ou classe II.

[00272] Portanto, a presente invenção também provê um medicamento que contém a célula expressando o receptor de antígeno quimérico da presente invenção como um ingrediente ativo (a seguir, referido às vezes como o medicamento da presente invenção). Um medicamento que contém a célula expressando o receptor de antígeno quimérico da presente invenção pode ser utilizado para a profilaxia ou o tratamento de tumores que expressam um antígeno reconhecido pelo receptor de antígeno quimérico da presente invenção, e pode ser administrado, por exemplo, a mamíferos (p. ex., camundongo, rato, hamster, coelho, cão, gato, bovino, ovelha, macaco, humano), de preferência humano. Portanto, em uma modalidade da presente invenção, o medicamento da presente invenção é provido para uso na profilaxia ou tratamento de tumores que expressam um antígeno reconhecido pelo receptor de antígeno quimérico da presente invenção. Além disso, provê- se um método para prevenir ou tratar tumores que expressam um antígeno

80 / 105 reconhecido pelo receptor de antígeno quimérico da presente invenção, o qual inclui administrar a célula expressando o receptor de antígeno quimérico da presente invenção, de preferência, na forma de um medicamento contendo a célula.

[00273] O tumor que pode ser prevenido ou tratado pela célula expressando o receptor de antígeno quimérico da presente invenção não é especialmente limitado desde que expresses um antígeno reconhecido pelo receptor de antígeno quimérico da presente invenção. Tumor é descrito em, por exemplo, “Daniel Baumhoer et al., Am J. Clin Pathol, 2008, 129, 899- 906” e similares. Tumor inclui tumor benigno, tumor maligno (também referido como “câncer”), e tumor que pode ser diagnosticado ou determinado como benigno ou maligno. Exemplos específicos de tumor incluem, entre outros, câncer de fígado (p. ex., hepatoma), câncer de ovário (p. ex., adenocarcinoma de células claras do ovário), câncer infantil, câncer de pulmão (p. ex., carcinoma de células escamosas, câncer de pulmão de pequenas células), câncer de testículo (p. ex., tumor de células germinativas não seminoma), tumor de tecidos moles (p. ex., lipossarcoma, histiocitoma fibroso maligno), câncer de útero (p. ex., tumor intra-epitelial cervical, carcinoma cervical de células escamosas), melanoma, tumor de glândula adrenal (p. ex., adenoma de glândula adrenal), tumor neurótico (p. ex., schwannoma), câncer gástrico (p. ex., adenocarcinoma de estômago), câncer renal (p. ex., tumor de Grawitz), câncer de mama (p. ex., carcinoma lobular invasivo, câncer mucinoso), câncer de tireoide (p. ex., câncer medular), câncer de laringe (p. ex., carcinoma de células escamosas), câncer de bexiga (p. ex., carcinoma invasivo de células transicionais) e similares.

[00274] A célula expressando o receptor de antígeno quimérico da presente invenção pode ser cultivada e/ou estimulada usando um meio adequado e/ou uma molécula estimuladora antes de ser administrada a um indivíduo em teste. Os exemplos da molécula estimuladora incluem, entre

81 / 105 outros, citocinas, proteína adequada, outros componentes e similares. Os exemplos das citocinas incluem IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IFN-γ e similares, e IL-2 pode ser preferivelmente utilizada. Embora a concentração de IL-2 no meio não seja especialmente limitada, por exemplo, de preferência, é 0,01 U/mL - 1×105 U/mL, mais preferivelmente 1 U/mL - 1×104 U/mL. Os exemplos da proteína adequada incluem um antígeno reconhecido pelo receptor de antígeno quimérico, ligante de CD3, ligante de CD28, anticorpo anti-CD3, anticorpo anti-CD30 e anticorpo anti-IL-4. Além desses, um fator estimulador de linfócitos tal como lectina e similares pode também ser adicionado. Além do mais, soro ou plasma pode ser adicionado ao meio. Embora a quantidade adicionada a esses meios não seja especialmente limitada, pode-se mencionar 0% em volume - 20% em volume. Além disso, a quantidade de soro ou plasma a ser utilizada pode ser mudada de acordo com o estágio da cultura. Por exemplo, a concentração de soro ou plasma pode ser reduzida passo a passo. A origem do soro ou plasma pode ser autóloga ou alogênica, e autóloga é preferida do aspecto relacionado à segurança.

[00275] De preferência, o medicamento da presente invenção é usado por administração parenteral ao indivíduo em teste. Os exemplos do método para administração parenteral incluem administração intravenosa, intra- arterial, intramuscular, intraperitoneal e subcutânea e similares. Embora a dose seja adequadamente selecionada de acordo com a condição, peso corporal, idade e similares do indivíduo em teste, o medicamento é em geral administrado tal que o número de células é geralmente 1×106 - 1×1010 células, de preferência 1×107 - 1×109 células, mais preferivelmente 5×107 - 5×108 células, por dose a um indivíduo em teste e com peso corporal de 60 kg. As células T podem ser administradas de uma vez ou em uma pluralidade de porções. O medicamento da presente invenção pode ser formulado em uma forma conhecida adequada para administração parenteral, por exemplo, injeção ou agente injetável. O medicamento da presente invenção pode conter

82 / 105 solução salina, solução salina com tampão fosfato (PBS), meio e similares para manter as células estavelmente. O meio não é especialmente limitado, e seus exemplos incluem, entre outros, meios tais como RPMI, AIM-V, X- VIVO10 e similares. O medicamento pode conter um veículo farmaceuticamente aceitável (p. ex., albumina sérica humana), conservante e similares para fins de estabilização.

[00276] Além disso, dado que a célula expressando o receptor de antígeno quimérico da presente invenção pode eliminar células que expressam um antígeno reconhecido pelo receptor de antígeno quimérico da presente invenção, ela pode ser utilizada como um agente de eliminação para células que expressam o antígeno. Tal agente de eliminação pode ser produzido e utilizado da mesma maneira que o medicamento.

[00277] A presente invenção também inclui modalidades do uso da célula expressando o receptor de antígeno quimérico da presente invenção na produção de agentes profiláticos ou terapêuticos para um tumor que expresse um antígeno reconhecido pelo receptor de antígeno quimérico da presente invenção, de acordo com o medicamento contendo a célula expressando o receptor de antígeno quimérico da presente invenção. Os agentes profiláticos ou terapêuticos para tumor podem ser produzidos por um método conhecido por si mesmo. Por exemplo, podem ser produzidos em uma forma conhecida adequada para administração parenteral, tal como injeção, agente injetável, ou similares, como no método de preparação mencionado acima do medicamento da presente invenção.

[00278] Embora a presente invenção seja explicada mais detalhadamente a seguir, por referência aos Exemplos, estes são meras exemplificações e não limitam a presente invenção. Exemplo Exemplo 1

1. Preparação de célula iPS

83 / 105

[00279] Como a célula iPS, usou-se a cepa Ff-I01s04 fornecida pelo Center for iPS Cell Research and Application (CiRA), Universidade de Quito. A cultura das células iPS foi realizada de acordo com o protocolo distribuído pelo CiRA, “Human iPS cell culture under feeder-free conditions” [Cultura de células iPS humanas sob condições livres de alimentadoras].

2. Introdução de gene do receptor de células T (TCR) em célula iPS

[00280] Como gene TCR, usou-se o gene TCR restrito a HLA- A*24:02 específico para WT1 (WT1-TCR) derivado de TAK1, fornecido pelo Professor Masataka Yasukawa, Graduate School of Medicine, Universidade Ehime. A transferência do gene para células iPS foi realizada pela incorporação no vetor lentiviral CS-UbC-RfA-IRES2-hKO1 fornecido pelo Inst. of Physical and Chemical Research e infectando as células iPS.

3. Diferenciação de células iPS com o gene WT1-TCR introduzido em células T CD8-positivas (CTL)

[00281] A diferenciação de células com o gene WT1-TCR introduzido em células CD8-positivas (CTL) foi realizada de acordo com um método conhecido (WO 2017/221975). As presentes células eram CD3-positivas, CD8-positivas. Em seguida, as células foram usadas como células T derivadas de células iPS.

4. Reagente, anticorpo

[00282] RetroNectin (marca registrada) foi adquirido da Takara Bio Inc. Como o anticorpo agonista anti-CD3, usou-se o anti-CD3 humano funcional grau purificado (Clone: OKT3) adquirido da eBioscience ou anticorpo contra CD3 (Clone: UCHT1) adquirido da GeneTex. A menos que especialmente indicado, OKT3 foi utilizado. Como o anticorpo agonista anti- CD30, usou-se o anticorpo agonista de CD30 adquirido da R&D systems.

5. Imobilização de anticorpo agonista anti-CD3 e RetroNectin (marca registrada) em placa de cultura

[00283] O anticorpo agonista anti-CD3 e RetroNectin (marca

84 / 105 registrada) dissolvidos em PBS até as concentrações necessárias foram adicionados a uma placa de 96 poços a 50 μL/poço, e a placa foi deixada em repouso a 4ºC durante a noite. As células foram lavadas com PBS e submetidas ao teste.

6. ELISA para detecção de anticorpo agonista anti-CD3 imobilizado e RetroNectin (marca registrada) imobilizado

[00284] Para a detecção de anticorpo agonista anti-CD3 imobilizado, usou-se o anticorpo de cabra anti-IgG2a de camundongo conjugado a HRP para detecção, contido no conjunto de quantificação de IgG2a de camundongo por ELISA (Mouse IgG2a ELISA Quantitation Set) adquirido da Betil Laboratories. Para a detecção de RetroNectin (marca registrada) imobilizado, usou-se o anticorpo anti-RetroNectin marcado com peroxidase contido no kit RetroNectin EIA adquirido da Takara Bio Inc. Cada anticorpo de detecção foi adicionado a uma placa imobilizada, a placa foi deixada em repouso por 1 hora à temperatura ambiente. Após lavagem com PBS contendo Tween-20 0,05%, a solução com substrato 1-StepTM Ultra TMB-ELISA Substrate Solution (ThermoFisher) foi adicionada. Após permanecer em repouso por 15 minutos à temperatura ambiente, adicionou-se ácido sulfúrico 1M para descontinuar a reação, e a absorbância a 450 nm foi medida usando um leitor de placas.

7. Teste de proliferação

[00285] Células T derivadas de células iPS, preparadas para 100.000 células/200 μL em um meio preparado adicionando a citocina e similares da Tabela 1 ao meio α-MEM contendo FBS 15%, foram semeadas em uma placa com um anticorpo agonista anti-CD3 (3, 30, 300, 3000 ng/mL) e RetroNectin (marca registrada) (0; 1,85; 2,25; 16,7; 50 e 150 μg/mL) imobilizados na mesma, e cultivadas por 3 dias sob CO2 5%/37ºC.

[00286] No 3o dia de cultura, as células foram coletadas da placa, e o número das células foi medido utilizando TC20 (Bio-Rad). As células foram

85 / 105 suspensas em uma quantidade apropriada de um meio obtido adicionando a citocina e similares na Tabela 2 ao meio α-MEM contendo FBS 15%, adicionadas a uma placa não imobilizada de 96 poços e cultivadas em CO2 5%/37ºC. Depois disso, as células foram coletadas da placa em qualquer um dos dias 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14 e 16, uma vez em cada momento e 4 a 7 vezes, no total, e o número de células foi medido. As células foram suspensas em uma quantidade apropriada, adicionadas a uma placa não imobilizada e cultivadas em CO2 5%/37ºC. Tabela 1 Nome do produto Fabricante Concentração final ITS (100x) Invitrogen 1x (Suplementos de insulina-Transferrina-Selênio) 2-fosfato do ácido ascórbico sigma 50 μg/mL IL-7 Peprotech 10 ng/mL IL-15 Peprotech 10 ng/mL IL-2 Peprotech 10 ng/mL IL-21 Peprotech 20 ng/mL IL-12 Merck 50 ng/mL IL-18 MBL 50 ng/mL Z-VAD-FMK R&D 10 μM Tabela 2 Nome do produto Fabricante Concentração final ITS (100x) Invitrogen 1x (Suplementos de insulina-Transferrina-Selênio) 2-fosfato do ácido ascórbico sigma 50 μg/mL IL-7 Peprotech 10 ng/mL IL-15 Peprotech 10 ng/mL

8. Teste de ATP

[00287] As células no 12o dia de cultura, foram medidas para o teste de proliferação e ATP no sobrenadante da cultura de acordo com o protocolo padrão e usando o ensaio de viabilidade celular CellTiter-Glo(R) Luminescent Cell Viability Assay, adquirido da Promega KK.

9. Medição de atividade citotóxica antígeno-específica para WT1

[00288] Células LCL HLA-A*24:02-positivas foram adquiridas do RIKEN BioResource Center. As células foram cultivadas em meio RPMI1640 contendo FBS 10%. A síntese do peptídeo antigênico WT1 (CMTWNQMNL: SEQ ID NO: 3) foi terceirizada para a Scrum Inc. O teste de citotoxicidade foi avaliado de acordo com o protocolo padrão e usando o imunoensaio DELFIA

86 / 105 adquirido da Perkin Elmer Inc.

10. Teste de proliferação com adição de anticorpo agonista anti-CD30

[00289] Um anticorpo agonista anti-CD30 diluído até uma concentração final de 0, 30, 100, 300 ng/mL foi adicionado ao meio de cultura enquanto as células eram suspensas. O resto foi igual ao realizado no método de “7. Teste de proliferação”.

[00290] No teste de proliferação de células T derivadas de células iPS por múltiplas estimulações com anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados e anticorpo agonista anti-CD30, um anticorpo agonista anti-CD30 diluído até uma concentração final de 100 ng/mL foi adicionado ao meio de cultura enquanto as células eram suspensas. O resto foi igual ao realizado no método de “7. Teste de proliferação”.

11. Detecção de CD197 e CD45RA na superfície da membrana celular

[00291] As células foram coletadas no 7o dia de cultura, coradas com o anticorpo da Tabela 3 e detectadas por citometria de fluxo LSRFortessaTM X- 20 (BD Bioscience). Tabela 3 Alvo Fluorescente clone Fornecedor CD5 APC/Cy7 UCHT2 BioLegend CD8a PerCP/Cy5.5 SK1 BioLegend CD8b PE/Cy7 SID18BEE eBioscience CD197 AF647 G043H7 BioLegend CD45RA FITC HI100 BioLegend Exemplo experimental 1

1. Medição da concentração do anticorpo agonista anti-CD3 e concentração de RetroNectin (marca registrada) adequadas para imobilização em placa de cultura

[00292] A concentração de um anticorpo agonista anti-CD3 e de RetroNectin (marca registrada), adequadas para imobilização em uma placa de cultura, foi medida pelo método ELISA (Figura 1). A imobilização dependente da concentração de um anticorpo agonista anti-CD3 foi confirmada entre 3 ng/mL e 3000 ng/mL. A imobilização dependente da

87 / 105 concentração de RetroNectin (marca registrada) foi confirmada entre 16,7 μg/mL e 150 μg/mL.

2. Verificação da faixa de concentração de anticorpo agonista anti-CD3 e RetroNectin (marca registrada), necessárias para anticorpo agonista anti-CD3 imobilizado e RetroNectin (marca registrada) imobilizado e adequadas para proliferação de células T derivadas de células iPS

[00293] Células T derivadas de células iPS foram estimuladas por 3 dias em uma placa com um anticorpo agonista anti-CD3 (0, 3, 30, 300, 3000 ng/mL) e RetroNectin (marca registrada) (0; 1,85; 5,56; 16,7; 50 e 150 μg/mL) imobilizados e cultivadas em uma placa não imobilizada por 9 dias, e a quantidade de ATP foi medida (Figura 2).

3. Teste de proliferação de células T derivadas de células iPS estimuladas com anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados

[00294] Células T derivadas de células iPS, preparadas para 100.000 células/200 μL, foram estimuladas por 3 dias em uma placa de 96 poços com um anticorpo agonista anti-CD3 (3000 ng/mL) e RetroNectin (marca registrada) (150 μg/mL) imobilizados, ou com microesferas anti-CD3/CD28 (Dynabeads) nas quais a razão entre o número de células T derivadas de células iPS e o número de partículas é 1:1, e o número de células cultivadas sem estimulação foi medida ao longo do tempo (Figura 3). As células T derivadas de células iPS foram proliferadas mais quando estimuladas com o anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados do que com as microesferas anti-CD3/CD28.

4. Teste de proliferação de células T derivadas de células iPS estimuladas múltipla vezes com anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados

[00295] A reação de proliferação celular de células T derivadas de células iPS à estimulação múltiplas vezes com anticorpo agonista anti-

88 / 105 CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados foi confirmada. Um teste de proliferação foi realizado estimulando células T derivadas de células iPS por 3 dias em uma placa imobilizada e cultivando as células por 11-15 dias em uma placa não imobilizada. Depois de concluído o teste, o número de células foi ajustado e submetido ao teste seguinte. As células T derivadas de células iPS responderam à quarta estimulação com anticorpo agonista anti- CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados e proliferaram (Figura 4).

5. Verificação de atividade citotóxica antígeno-específica para WT1 de células T derivadas de células iPS com gene WT1-TCR transferido, proliferadas por estimulação com anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados

[00296] A atividade citotóxica antígeno-específica para WT1 de células T derivadas de células iPS com gene WT1-TCR transferido, proliferadas pela estimulação com anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados, foi avaliada. A atividade citotóxica antígeno- específica para WT1 foi avaliada com base na diferença entre a citotoxicidade contra LCL com o peptídeo antigênico WT1 adicionado e a citotoxicidade contra LCL sem a adição. As células T derivadas de células iPS com gene WT1-TCR transferido pouco apresentaram atividade citotóxica não específica e mostraram apenas atividade citotóxica antígeno-específica para WT1 (Figura 5).

6. Teste de proliferação de células T derivadas de células iPS por estimulação com anticorpo agonista anti-CD30

[00297] Foi verificado se a adição de um anticorpo agonista anti-CD30 (0, 30, 100, 300 ng/mL) durante a estimulação com anticorpo agonista anti- CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados influencia a proliferação de células T derivadas de células iPS. Como a placa imobilizada de 96 poços, usou-se uma na qual um anticorpo agonista anti-CD3 (3000 ng/mL) e RetroNectin (marca registrada) (150 μg/mL) estavam imobilizados. Células T

89 / 105 derivadas de células iPS foram proliferadas mais pela adição de um anticorpo agonista anti-CD30. As células foram proliferadas de maneira dependente da concentração de um anticorpo agonista anti-CD30 (Figura 6).

7. Teste de proliferação de células T derivadas de células iPS por estimulação múltiplas vezes com anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados e anticorpo agonista anti-CD30

[00298] Foi verificado se células T derivadas de células iPS mostram uma reação de proliferação por estimulação múltiplas vezes com anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados e anticorpo agonista anti-CD30. As células foram semeadas em uma placa contendo anticorpo anti-CD3 (3000 ng/mL) e RetroNectin (marca registrada) (150 μg/mL) imobilizados na mesma e cultivadas em CO2 5%/37ºC por 3 dias.

[00299] No 3o dia de cultura, as células foram coletadas da placa e o número das células foi medido com TC20 (Bio-Rad). As células foram suspensas em uma quantidade apropriada de um meio, obtido adicionando a citocina e similares na Tabela 2 ao meio α-MEM contendo FBS 15%, adicionadas a uma placa não imobilizada e cultivadas em CO2 5%/37ºC. Depois disso, as células foram coletadas da placa uma vez cada nos dias 6, 7, 9, 10, 14 e 16, e o número de células foi medido. As células foram suspensas em uma quantidade apropriada, adicionadas a uma placa não imobilizada e cultivadas em CO2 5%/37ºC. Como o meio de cultura, foram usados um meio com um anticorpo agonista anti-CD30 adicionado e diluído até a concentração final de 100 ng/mL e outro sem anticorpo agonista anti-CD30. A estimulação mencionada acima, do Dia 0 ao Dia 16 de cultura, foi repetida duas vezes. Mesmo na segunda estimulação, as células T derivadas de células iPS foram proliferadas pela estimulação com anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados e anticorpo agonista anti-CD30 em comparação à estimulação apenas com anticorpo agonista anti- CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados (Figura 7).

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8. Detecção de CD197 e CD45RA na superfície da membrana de célula T derivada de célula iPS após estimulação com anticorpo agonista anti- CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados e anticorpo agonista anti- CD30

[00300] Após estimulação com anticorpo agonista anti- CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados, ou estimulação com anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados e anticorpo agonista anti-CD30, a expressão de CD197 e CD45RA na superfície da membrana de células T derivadas de células iPS no Dia 7 foi medida por citometria de fluxo. Na população de células estimuladas com anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) e anticorpo agonista anti-CD30, células T derivadas de células iPS do tipo CD197- positivas CD45RA-negativas de memória central eram a maioria (Figura 8).

9. Verificação de atividade citotóxica antígeno-específica para WT1 de células T derivadas de células iPS com gene WT1-TCR transferido proliferaram por estimulação com anticorpo agonista anti-CD3 imobilizado/RetroNectin e anticorpo agonista anti-CD30

[00301] Células T derivadas de células iPS com gene WT1-TCR transferido, proliferadas pela estimulação com anticorpo agonista anti- CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados e anticorpo agonista anti- CD30, foram aplicadas a células LCL HLA-A*24:02-positivas na presença ou ausência do peptídeo antigênico WT1, e a atividade citotóxica antígeno- específica para WT1 foi avaliada. As células T derivadas de células iPS com gene WT1-TCR transferido pouco apresentaram atividade citotóxica não específica e mostraram apenas atividade citotóxica antígeno-específica para WT1 (Figura 9). Exemplo 2

1. Preparação de células T CD8-positivas derivadas de sangue periférico humano

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[00302] Células mononucleares do sangue periférico, derivadas do sangue periférico humano de doador sadio, foram adquiridas da Precision Bioservices. Com o kit de isolamento de células T CD8+ (Milteny), células T CD8-positivas foram isoladas.

2. Teste de proliferação de células T CD8-positivas derivadas de sangue periférico humano

[00303] O teste foi conduzido por um método semelhante àquele no [Exemplo 1] 7. Teste de proliferação.

3. Cultura de células T CD8-positivas derivadas de sangue periférico humano, usadas para teste de enxertia em camundongos

[00304] A células T CD8-positivas derivadas de sangue periférico humano, suspensas em uma concentração final de 100.000 células/mL em 3 tipos de meio, obtidos adicionando os aditivos mostrados na Tabela 4 ao meio α-MEM contendo FBS 15%, adicionou-se o ativador Dynabeads T-Activator CD3/CD28 (gibco), ajustado para uma quantidade 3 vezes maior que o número de células, e as células foram cultivadas em CO2 5%/37ºC por 3 dias. As células foram coletadas da placa no 3o dia de cultura e suspensas em uma quantidade apropriada de um meio, obtido adicionando a citocina e similares mostrados na Tabela 5 ao meio α-MEM contendo FBS 15%, e cultivadas em CO2 5%/37ºC. Depois disso, as células foram coletadas da placa no Dia 10 de cultura, e o número de células foi medido. As células foram suspensas em uma quantidade apropriada e administradas aos camundongos. Nos Dias 6, 10, 13, 17 de cultura, as células foram coletadas da placa, suspensas em uma quantidade apropriada, e submetidas a um experimento de expressão de CD197. Tabela 4 Fabricant Concentração Com Com IL7/IL15/ Ab Nome do produto Com IL7/ IL15 e final IL2 anti-CD30 Suplementos de insulina- Invitroge 1x + + + Transferrina-Selênio n 2-fosfato do ácido sigma 50 μg/mL + + + ascórbico

92 / 105 Fabricant Concentração Com Com IL7/IL15/ Ab Nome do produto Com IL7/ IL15 e final IL2 anti-CD30 Peprotec IL-2 15 ng/mL + h Peprotec IL-7 10 ng/mL + + h Peprotec IL-15 10 ng/mL + + h Peprotec IL-21 20 ng/mL + + h IL-12 Merck 50 ng/mL + + IL-18 MBL 50 ng/mL + + Peprotec TL-1A 50 ng/mL + + h Z-VAD-FMK R&D 10 μM + + Anticorpo contra CD30 R&D 300 ng/mL + humano O aditivo adicionado a cada grupo é mostrado com +.

Tabela 5 Concentração Com IL7/ Com IL7/IL15/ Ab Nome do produto fabricante Com IL2 final IL15 anti-CD30 Suplementos de insulina-Transferrina- Invitrogen 1x + + + Selênio 2-fosfato do ácido sigma 50 μg/mL + + + ascórbico IL-2 Peprotech 15 ng/mL + IL-7 Peprotech 10 ng/mL + + IL-15 Peprotech 10 ng/mL + + Anticorpo contra R&D 300 ng/mL + CD30 humano O aditivo adicionado a cada grupo é mostrado com +.

4. Administração de células T CD8-positivas derivadas de sangue periférico humano a camundongo e recuperação de células enxertadas com as células

[00305] Foram usados camundongos NSG machos de 8-semanas de idade (Japan Charles River), que foram irradiados com 2 Gy de raios gama antes da administração das células no mesmo dia. 5.000.000 células ajustadas em cultura de células T CD8-positivas derivadas de sangue periférico humano, usadas para o teste de enxertia em camundongos no [Exemplo 2] 3., foram administradas por via intravenosa a camundongos, e os camundongos foram criados por 4 semanas. Depois disso, os camundongos foram sacrificados e células da medula óssea, esplenócitos e leucócitos no sangue foram coletados dos camundongos.

5. Detecção de células T CD8-positivas derivadas de sangue periférico humano enxertadas no tecido de camundongos

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[00306] As células coletadas foram coradas com o anticorpo da Tabela 3 e detectadas por citometria de fluxo com LSRFortessaTM X-20 (BD Bioscience). Exemplo experimental 2

1. Teste de proliferação de células T CD8-positivas derivadas de sangue periférico humano por estimulação com anticorpo agonista anti-CD30

[00307] Foi confirmada se a adição de um anticorpo agonista anti- CD30 durante a estimulação com anticorpo anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados influencia a proliferação de células T CD8-positivas derivadas de sangue periférico humano. A adição do anticorpo agonista anti- CD30 promoveu a proliferação de células T CD8-positivas no sangue periférico humano (Figura 10).

2. Detecção de CD197 na superfície da membrana de célula T CD8-positiva do sangue periférico humano após estimulação com microesfera anti- CD3/CD28 e anticorpo agonista anti-CD30

[00308] A expressão de CD197 na superfície da membrana celular de células T CD8-positivas derivadas de sangue periférico humano estimuladas com microesferas anti-CD3/CD28 em meio contendo IL-2 ou meio contendo IL-7/IL-15, meio contendo IL-7/IL-15/anticorpo anti-CD30 nos Dia 6, 10, 13, 17 de cultura foi medida por citômetro de fluxo. No Dia 6, a expressão de CD197 foi confirmada em todos os grupos. No entanto, a expressão de CD197 quase desapareceu no Dia 13 no grupo do meio contendo IL-2 e no Dia 17 grupo do meio contendo IL-7/IL-15, enquanto a expressão de CD197 foi mantida até mesmo no Dia 17 no grupo do meio contendo IL-7/IL- 15/anticorpo anti-CD30 (Figura 11).

3. Avaliação de enxertia de células T CD8-positivas derivadas de sangue periférico humano após estimulação com microesfera anti-CD3/CD28 e anticorpo agonista anti-CD30

[00309] Células T CD8-positivas derivadas de sangue periférico

94 / 105 humano, estimuladas com microesferas anti-CD3/CD28 em meio contendo IL-2 ou meio contendo IL-7/IL-15, meio contendo IL-7/IL-15/anticorpo anti- CD30 no Dia 10 de cultura, foram administradas por via intravenosa a camundongos imunodeficientes e a enxertia no sangue e tecidos imunes foi confirmada. No Dia 28 após a administração, sangue, baço e medula óssea foram coletados dos camundongos, e células T CD8-positivas humanas ali contidas foram detectadas por citometria de fluxo. Quase nenhuma célula T CD8-positiva humana foi detectada no grupo do meio contendo IL-2 em qualquer um dos órgãos, enquanto células T CD8-positivas humanas foram detectadas no grupo do meio contendo IL-7/IL-15 e no grupo do meio contendo IL-7/IL-15/anticorpo anti-CD30. No grupo do meio contendo IL- 7/IL-15/anticorpo anti-CD30, detectou-se um número maior número de células T CD8-positivas humanas. Portanto, foi mostrado que células T CD8- positivas derivadas de sangue periférico humano cultivadas em um meio contendo IL-7/IL-15/anticorpo anti-CD30 não só conseguem manter a expressão de CD197 por um período longo durante a cultura, mas também conseguem sobreviver por um longo tempo in vivo (Figura 12). Exemplo 3

1. Teste de proliferação de células CART-anti-CD19 derivadas de células iPS

[00310] Células CART-anti-CD19 derivadas de células iPS, preparadas para 100.000 células/200 μL em um meio preparado adicionando a citocina e similares da Tabela 1 ao meio α-MEM contendo FBS 15%, foram semeadas em uma placa contendo anticorpo anti-CD3 e RetroNectin imobilizados e cultivadas em CO2 5%/37ºC por 3 dias. As células foram coletadas da placa no 3o dia de cultura e o número das células foi medido com TC20 (Bio-Rad). As células foram suspensas em uma quantidade apropriada de um meio, obtido adicionando a citocina e similares mostrados na Tabela 2 ao meio α- MEM contendo FBS 15%, adicionadas a uma placa não imobilizada e cultivadas em CO2 5%/37ºC. Depois disso, as células foram coletadas da

95 / 105 placa 4 a 7 vezes em qualquer um dos dias 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16 de cultura, e o número de células foi medido. As células foram suspensas em uma quantidade apropriada, adicionadas a uma placa não imobilizada e cultivadas em CO2 5%/37ºC.

2. Gene anti-CD19-CAR

[00311] Com um gene anti-CD19-CAR, foi sintetizado artificialmente um oligo DNA que codifica um polipeptídeo (SEQ ID NO: 5) projetado para alinhar-se na ordem mostrada na Tabela 6 a partir do N-terminal. Tabela 6 Ordem a partir do Número de gene N-terminal aminoácidos 1 Sequência líder da cadeia pesada de imunoglobulina 22 Região variável da cadeia leve do anticorpo anti-CD19 2 104 (FMC60) 3 Linker GGGGS 15 Região variável da cadeia pesada do anticorpo anti-CD19 4 120 (FMC60) Sequência derivada de CD8 (incluindo a região 5 83 transmembrana) 6 Região do domínio intracelular de CD28 41 7 Região do domínio intracelular de 4-1BB 47 8 Região do domínio intracelular de CD3ζ 112

3. Produção de vetor retroviral carregando o gene anti-CD19-CAR

[00312] O oligo DNA artificial sintetizado no [Exemplo 3] 2. foi incorporado no sítio de clonagem múltipla do vetor retroviral pMEI-5. A produção do vetor viral foi terceirizada com a Unitech.

4. Produção de células CART-anti-CD19 derivadas de células iPS

[00313] As células T derivadas de células iPS produzidas no [Exemplo 1] 3. foram infectadas com o vetor retroviral carregando um gene anti-CD19- CAR e produzidas no [Exemplo 3] 3., pelo qual foram produzidas células CART-anti-CD19 derivadas de células iPS. Exemplo experimental 3

1. Teste de proliferação de células CART-anti-CD19 derivadas de células iPS estimuladas com anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados

[00314] As células T derivadas de células iPS produzidas no [Exemplo

96 / 105 1] 3. e as células CART-anti-CD19 derivadas de células iPS produzidas no [Exemplo 3] 4. foram estimuladas por 3 dias com anticorpo anti- CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados, e o número de células cultivadas sem estimulação foi medido ao longo do tempo. As células CART- anti-CD19 derivadas de células iPS foram proliferadas até o mesmo nível que as células T derivadas de células iPS pela estimulação com anticorpo anti- CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados (Figura 13).

2. Teste de proliferação de células CART-anti-CD19 derivadas de células iPS por estimulação com anticorpo agonista anti-CD30

[00315] Foi confirmada se a adição de um anticorpo agonista anti- CD30 durante a estimulação com anticorpo anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados influencia a proliferação de células CART-anti- CD19 derivadas de células iPS. A adição do anticorpo agonista anti-CD30 promoveu a proliferação de células CART-anti-CD19 derivadas de células iPS (Figura 14).

3. Detecção de CD197 na superfície da membrana de célula anti-CD19- CART derivada de células iPS após estimulação com anticorpo agonista anti- CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados e anticorpo agonista anti- CD30

[00316] A expressão de CD197 na superfície da membrana celular de células CART-anti-CD19 derivadas de células iPS nos Dias 3 e 7 após estimulação com anticorpo anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados, ou após estimulação com anticorpo anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados/anticorpo agonista anti-CD30 foi medida por citômetro de fluxo. No Dia 3, a expressão de CD197 foi confirmada em ambos os grupos. No entanto, a expressão de CD197 quase desapareceu no Dia 7 no grupo de estimulação com anticorpo anti-CD3/RetroNectin (marca registrada), mas foi confirmado que a expressão de CD197 foi mantida no grupo de estimulação com anticorpo anti-CD3/RetroNectin (marca

97 / 105 registrada)+anticorpo agonista anti-CD30 (Figura 15).

4. Verificação de atividade citotóxica para Raji de célula anti-CD19-CART derivada de células iPS após estimulação com anticorpo agonista anti- CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados e anticorpo agonista anti- CD30

[00317] A atividade citotóxica de células CART-anti-CD19 derivadas de células iPS, obtidas pela proliferação no [Exemplo experimental 3] 1., contra células cancerosas CD19-positivas foi avaliada pela atividade citotóxica contra células Raji CD19-positivas. As células CART-anti-CD19 derivadas de células iPS mostraram atividade citotóxica contra células Raji expressando CD19 (Figura 16). Exemplo 4

1. Gene anti-CD19-CAR contendo domínio intracelular derivado de CD30

[00318] Como o gene anti-CD19-CAR, foi sintetizado artificialmente um oligo DNA que codifica um polipeptídeo (SEQ ID NO: 7) projetado para alinhar-se na ordem mostrada na Tabela 7 a partir do N-terminal. Tabela 7 Ordem a partir do N- Número de gene terminal aminoácidos 1 Sequência líder da cadeia pesada de imunoglobulina 22 2 Região variável da cadeia leve do anticorpo anti-CD19 104 3 Linker GGGGS 15 Região variável da cadeia pesada do anticorpo anti- 4 120 CD19 (FMC60) Sequência derivada de CD8 (incluindo região 5 83 transmembrana) 6 Região do domínio intracelular de CD28 41 7 Região do domínio intracelular CD30 (SEQ ID NO: 6) 87 8 Região do domínio intracelular de CD3ζ 112

2. Produção de vetor retroviral carregando o gene anti-CD19-CAR contendo domínio intracelular derivado de CD30

[00319] O oligo DNA artificial sintetizado no [Exemplo 4] 1. foi incorporado no sítio de clonagem múltipla do vetor retroviral pMY. Usando células FLYRD18 para produção do vetor retroviral, produziu-se um vetor viral.

98 / 105

3. Produção de células CART-anti-CD19 derivadas de células iPS (iCD19- CD30-CART) contendo domínio intracelular derivado de CD30

[00320] As células T derivadas de células iPS produzidas no [Exemplo 1]3. foram infectadas com o vetor retroviral carregando um gene anti-CD19- CAR e produzidas no [Exemplo 4] 2., pelo qual células CART-anti-CD19 derivadas de células iPS (iCD19-CD30-CART) contendo um domínio intracelular derivado de CD30 foram produzidas. Exemplo experimental 4

[00321] A atividade citotóxica de iCD19-CD30-CART obtidas no [Exemplo 4] 3. contra células cancerosas CD19-positivas foi avaliada pela atividade citotóxica contra células Raji CD19-positivas. As iCD19-CD30- CART mostraram atividade citotóxica contra células Raji expressando CD19 (Figura 17). Exemplo 5

1. Preparação de célula iPS

[00322] De modo semelhante ao [Exemplo 1], como a célula iPS, usou-se a cepa Ff-I01s04, fornecida pelo Center for iPS Cell Research and Application (CiRA), Universidade de Quioto. A cultura de células iPS foi realizada de acordo com o protocolo distribuído pelo CiRA, “Human iPS cell culture under feeder-free conditions”.

2. Diferenciação de células iPS em células T γδTCR-positivas (células γδT)

[00323] A diferenciação de células iPS em células T γδTCR-positivas (células γδT) foi realizada de acordo com um método conhecido (WO 2017/221975) como no [Exemplo 1]. Como o anticorpo anti-CD3 usado na etapa de diferenciação, usou-se UCHT1 3000 ng/mL (fabricado pela GeneTex). As células CD3-positivas eram células γδT (a seguir referidas como “células γδT derivadas de células iPS (células iγδT)”).

3. Cultura de expansão de células γδT derivadas de células iPS

[00324] As células iγδT obtidas no [Exemplo 5] 2. foram suspensas a

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2.000.000 células/mL em um meio obtido adicionando a citocina mostrada na Tabela 8 ao meio α-MEM contendo FBS 15%, e a suspensão foi semeada em uma placa contendo anticorpo anti-CD3 (UCHT1) e RetroNectin (marca registrada) imobilizados e cultivada em CO2 5%/37ºC por 3 dias. As células foram coletadas da placa no 3o dia de cultura e o número das células foi medido usando o NucleoCounter NC-200 (ChemoMetec). As células foram suspensas em uma quantidade apropriada de um meio obtido adicionando a citocina e similares mostrados na Tabela 9 ao meio α-MEM contendo FBS 15%, adicionadas a uma placa não imobilizada G-Rex de 6 poços (WILSONWOLF) e cultivadas em CO2 5%/37ºC. Depois disso, uma parte das células foi coletada da placa 4 a 6 times em qualquer um dos dias 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 14, 17 de cultura, e o número de células foi medido. As células foram imobilizadas na placa de cultura com o anticorpo anti-CD3 e RetroNectin (marca registrada) pelo método a seguir. Um anticorpo anti-CD3 (UCHT1, concentração final 3000 ng/mL) e RetroNectin (concentração final 150 μg/mL) dissolvidos em PBS nas concentrações necessárias foram adicionados à placa, e a placa ficou em repouso durante a noite a 4ºC. A placa foi lavada com PBS e submetida ao teste. Tabela 8 Com Ab anti- Sem Ab anti- nome do produto fabricante Concentração final CD30 CD30 Suplementos de insulina- Invitrogen 1x + + Transferrina-Selênio 2-fosfato do ácido ascórbico sigma 50 μg/mL + + IL-2 Peprotech 15 ng/mL + + IL-7 Peprotech 10 ng/mL + + IL-15 Peprotech 10 ng/mL + + IL-21 Peprotech 20 ng/mL + + IL-12 Merck 50 ng/mL + + IL-18 MBL 50 ng/mL + + TL-1A Peprotech 50 ng/mL + + Z-VAD-FMK R&D 10 μM + + Anticorpo contra CD30 R&D 300 ng/mL + humano Aditivo adicionado a cada grupo é mostrado com “+”.

Tabela 9

100 / 105 com anti- sem anti-CD30 Nome do produto Fabricante Concentração final CD30 Ab Ab Suplementos com insulina- Invitrogen 1x + + transferrina-selênio 2-fosfato do ácido Ascórbico sigma 50 μg/mL + + IL-2 Peprotech 15 ng/mL + + IL-7 Peprotech 10 ng/mL + + IL-15 Peprotech 10 ng/mL + + Anticorpo contra CD30 humano R&D 300 ng/mL + + Aditivo adicionado a cada grupo é mostrado com “+”.

Exemplo experimental 5

1. Teste de proliferação de células γδT derivadas de células iPS por estimulação com anticorpo agonista anti-CD30

[00325] Foi verificado se a adição de um anticorpo agonista anti-CD30 (300 ng/mL) ao método de estimulação usando o anticorpo agonista anti- CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados no [Exemplo 5] 3. influencia a proliferação de células γδT derivadas de células iPS. Células T derivadas de células iPS foram proliferadas pela adição de um anticorpo agonista anti-CD30 (Figura 18). Exemplo 6

1. Gene IL-15Rα/IL-15

[00326] Como o gene IL-15Rα/IL-15, foi sintetizado artificialmente um oligo DNA que codifica um polipeptídeo (SEQ ID NO: 8), projetado para alinhar-se na ordem mostrada na Tabela 10 a partir do N-terminal. Tabela 10 Ordem desde o N- Número de gene terminal aminoácidos 1 Sequência líder de IL-2 humana 23 2 Sequência C-terminal de IL-15 humana 114 3 Linker GGGGS 24 4 Sequência C-terminal de IL-15RA humana 239

2. Produção de vetor retroviral carregando o gene IL-15Rα/IL-15

[00327] O oligo DNA artificial sintetizado no [Exemplo 6] 1. foi incorporado no sítio de clonagem múltipla do vetor retroviral pMY. Com o uso de células FLYRD18 para a produção do vetor retroviral, um vetor viral foi produzido.

3. Produção de células anti-CD19-CAR/IL-15γδT derivadas de células iPS

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[00328] As células γδT derivadas de células iPS (células iγδT) produzidas no [Exemplo 5] 2. foram infectadas com o vetor retroviral carregando o gene anti-CD19-CAR e produzido no [Exemplo 3] 3. e com o vetor retroviral carregando o gene IL-15Rα/IL-15 e produzido no [Exemplo 6] 1., em que células anti-CD19-CAR/IL-15γδT derivadas de células iPS (células iCD19CAR/IL-15γδT) foram produzidas.

4. Cultura de expansão de células anti-CD19-CAR/IL-15γδT derivadas de células iPS

[00329] Seguindo um método semelhante àquele no [Exemplo 5]3., a cultura de expansão de células iCD19CAR/IL-15γδT foi realizada, exceto que IL-2 não foi adicionada. Exemplo experimental 6

1. Teste de proliferação de células anti-CD19-CAR/IL-15γδT derivadas de células iPS por estimulação com anticorpo agonista anti-CD30

[00330] Foi verificado se a adição de um anticorpo agonista anti-CD30 (0, 30, 100, 300 ng/mL) durante a estimulação com anticorpo agonista anti- CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados no [Exemplo 6] 4. influencia a proliferação de células iCD19CAR/IL-15γδT. As células foram proliferadas mais pela adição de um anticorpo agonista anti-CD30 (Figura 19).

2. Estudo da atividade citotóxica da célula anti-CD19-CAR/IL-15γδT derivada de célula iPS após a estimulação com anticorpo agonista anti- CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados e anticorpo agonista anti- CD30

[00331] A atividade citotóxica de células iCD19CAR/IL-15γδT, obtidas no [Exemplo 6] 4., foi avaliada. Utilizando a célula Raji CD19- positiva e a célula CCRF-CEN CD19 negativa como células alvo, células iCD19CAR/IL-15γδT foram misturadas a uma proporção de 0,5; 1; 2; 4; 8 e 16 vezes em relação à célula alvo. A atividade citotóxica de células

102 / 105 iCD19CAR/IL-15γδT foi avaliada com base na morte de células alvo duas horas mais tarde. Foi mostrado que células iCD19CAR/IL-15γδT expandidas em cultura em um meio contendo um anticorpo agonista anti-CD30 têm atividade citotóxica contra célula Raji CD19-positivas, mas não têm atividade citotóxica contra células CCRF-CEN CD19-negativas (Figura 20).

3. Efeito crescente sobre o número de dias de sobrevida de células anti-CD19- CAR/IL-15γδT derivadas de células iPS após a estimulação com anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados e anticorpo agonista anti-CD30

[00332] 5x105 células Nalm6 (ATCC) foram transplantadas em camundongos NOD/Shi-scid, IL-2RγKO (NOG) (Central Institute for Experimental Animals, fêmeas, 7-8 semanas de idade) pela veia do rabo para preparar camundongos com xenoenxerto Nalm6. No 4o dia após o transplante, uma suspensão de células iCD19CAR/IL-15γδT (5x106 (células)), obtidas no [Exemplo 6] 4., em 0,1 mL de tampão HBSS ou uma quantidade igual de tampão HBSS foi administrada pela veia do rabo, e o número de dias de sobrevida foi confirmado. Todos os camundongos transplantados com células cancerosas Nalm6 CD19-positivas através da veia do rabo morrem em 3 semanas no grupo com administração do controle, enquanto todos os camundongos sobreviveram por pelo menos 6 semanas no grupo com administração de células iCD19CAR/IL-15γδT expandidas em cultura em um meio contendo um anticorpo agonista anti-CD30 (Figura 21). Exemplo 7

1. Produção de células anti-CD19-CAR/IL-15αβT derivadas de células iPS

[00333] Células CART-anti-CD19 derivadas de células iPS produzidas pelo método do [Exemplo 3] 4. foram infectadas com o vetor retroviral carregando o gene IL15Rα/IL-15 do produzido no [Exemplo 6] 2. Para produzir células anti-CD19-CAR/IL-15αβT derivadas de células iPS (células iCD19CAR/IL-15αβT).

103 / 105

2. Cultura de expansão de células iCD19CAR/IL-15αβT utilizando anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados

[00334] As células iCD19CAR/IL-15αβT obtidas no [Exemplo 7] 1. foram cultivadas por um método semelhante àquele no [Exemplo 6] 4. até o dia 7. Não foi adicionado anticorpo anti-CD30 humano. Exemplo experimental 7

1. Efeito antitumoral in vivo de células iCD19CAR/IL-15αβT após estimulação com anticorpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca registrada) imobilizados

[00335] 5x105 células Nalm6 expressando luciferase (ATCC) foram transplantadas em camundongos NOD/Shi-scid, IL-2RγKO (NOG) (Central Institute for Experimental Animals, fêmeas, 7-8-semanas de idade) pela veia do rabo para preparar os camundongos com xenoenxerto de Nalm6 expressando luciferase. No 4o dia após o transplante, uma suspensão de células iCD19CAR/IL-15αβT (5x106 células) obtidas no [Exemplo 7] 2. em 0,1 mL de tampão HBSS ou uma quantidade igual de tampão HBSS foi administrada pela veia do rabo. Luciferina foi administrada pela veia do rabo todas as semanas após a administração, e a atividade de luciferase expressa pelas células Nalm6 foi medida utilizando IVIS. No grupo controle, a luminescência derivada de células Nalm6 foi confirmada por todo o corpo 2 semanas após a administração, e todos os camundongos morreram em 3 semanas após a administração, enquanto nenhuma luminescência foi detectada até 6 semanas após a administração no grupo que recebeu as células iCD19CAR/IL-15αβT (Figura 22). Exemplo 8

1. Produção de células γδT derivadas de células iPS

[00336] Da mesma maneira que no [Exemplo 5] 1. e 2., produziram-se células γδT (células iγδT) derivadas de iPS. Exemplo experimental 8

104 / 105

1. Medição da concentração de anticorpo agonista anti-CD3 (UCHT1) adequada para imobilização em placa de cultura e concentração de RetroNectin (marca registrada)

[00337] Um anticorpo agonista anti-CD3 (UCHT1) e RetroNectin (marca registrada) foram misturados e imobilizados em uma placa de cultura da mesma maneira que no [Exemplo 1] 5. Depois disso, a quantidade dos mesmos imobilizados em uma placa de cultura foi medida pelo método ELISA (Figura 23). A imobilização dependente da concentração e um anticorpo agonista anti-CD3 sem mistura com RetroNectin (marca registrada) foi confirmada entre 3 ng/mL e 3000 ng/mL (0,003 μg/mL a 30 μg/mL). No entanto, a quantidade de anticorpo agonista anti-CD3 imobilizado diminuiu à medida que a concentração de RetroNectin (marca registrada) a ser mistura era elevada. Por outro lado, a imobilização dependente da concentração de RetroNectin (marca registrada) foi confirmada entre 16,7 μg/mL e 150 μg/mL.

2. Verificação da faixa de concentração do anticorpo agonista anti-CD3 e RetroNectin (marca registrada) necessária para anticorpo agonista anti-CD3 imobilizado e RetroNectin (marca registrada) imobilizado, adequadas para proliferação de células iγδT derivadas de célula iPS

[00338] Células iγδT ajustadas para 100.000 células/200 μL em um meio obtido adicionando a citocina e similares da Tabela 1, e o anticorpo agonista anti-CD30 diluído até uma concentração final de 0, 3, 30, 300 ng/mL ao meio IMDM contendo FBS 15%, foram semeadas em uma placa com um anticorpo agonista anti-CD3 (0, 300, 3000, 30000 ng/mL (0; 0,3; 3; 30 μg/mL)) e RetroNectin (marca registrada) (0, 2,15, 150 μg/mL) imobilizados na mesma e cultivadas por 3 dias sob CO2 5%/37ºC.

[00339] No 3o dia de cultura, as células foram coletadas da placa, suspensas em uma quantidade apropriada de um meio obtido adicionando a citocina e similares na Tabela 2 ao meio IMDM contendo FBS 15%,

105 / 105 semeadas em uma placa de 96 poços não imobilizados e cultivadas em CO2 5%/37ºC. Depois disso, as células foram coletadas da placa em qualquer um dos dias 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 12, uma vez em cada momento e 4 a 7 vezes, no total, suspensas em uma quantidade apropriada de um meio, semeadas em uma placa não imobilizada e cultivadas em CO2 5%/37ºC. No 13o dia de cultura, as células foram contadas com um hemocitômetro, e a taxa de proliferação foi medida tendo por base a comparação com o número no Dia 0 de cultura (Figura 24). Observou-se indução equivalente da proliferação de células iγδT nas placas nas quais uma mistura de anticorpo agonista anti-CD3 e RetroNectin (marca registrada) estava imobilizada a 0,3 μg/mL e 2 μg/mL, 3 μg/mL e 15 μg/mL, 30 μg/mL e 150 μg/mL, respectivamente. Além disso, confirmou-se também que a proliferação das células era dependente da concentração do anticorpo agonista anti-CD30 adicionado. Aplicabilidade industrial

[00340] Células T podem ser expandidas com eficiência em cultura repetidamente pelo cultivo de células CD3-positivas na presença de um agonista do complexo CD3/TCR, fibronectina, ou uma variante dela, e um agonista de CD30. Quando as células CD3-positivas a serem cultivadas são células CD3-positivas CD8-positivas ou células CD3-positivas CD8-positivas CD30-positivas, a célula produzida ou expandida em cultura muda facilmente para células T efetoras e exibe atividade citotóxica. Portanto, ela pode ser aplicada para terapia com células T.

[00341] Este pedido de patente tem por base os Pedidos de Patente No 2018-151580, depositado no Japão (data de depósito: 10 de agosto de 2018), No 2019-042666 (data de depósito: 8 de março de 2019) e No 2019-117878 (data de depósito: 25 de junho 2019), cujos conteúdos são aqui incorporados em sua totalidade.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para produzir uma célula CD3-positiva, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa (I) de cultivar a célula CD3-positiva na presença de um agonista do complexo CD3/TCR, fibronectina, ou uma variante dela, e um agonista de CD30.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa (II) de cultivar a célula CD3- positiva cultivada na etapa (I) na ausência de um agonista do complexo CD3/TCR e fibronectina, ou uma variante dela, e na presença de um agonista de CD30.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a célula CD3-positiva é derivada de uma célula-tronco pluripotente.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a célula-tronco pluripotente é uma célula iPS.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a célula CD3-positiva é uma célula CD3- positiva que expressa receptor quimérico de antígeno.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a célula CD3-positiva é uma célula CD3- positiva CD8-positiva.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a célula CD3-positiva CD8-positiva é uma célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-negativa.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a célula CD3-positiva é uma célula γTCR- positiva e/ou δTCR-positiva.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o agonista do complexo CD3/TCR é um agonista de CD3 e/ou um agonista de TCR.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o agonista de CD3 é um anticorpo agonista anti-CD3 ou um fragmento de ligação do mesmo.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo agonista anti-CD3 ou um fragmento de ligação do mesmo é um anticorpo agonista anti-CD3 ou um fragmento de ligação do mesmo produzido a partir do clone UCHT1.

12. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o agonista de TCR é pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo anti-TCR ou um fragmento de ligação do mesmo, um complexo HLA/peptídeo ou um multímero do mesmo e um complexo HLA/superantígeno ou um multímero do mesmo.

13. Método de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo agonista anti-CD3 ou um fragmento de ligação do mesmo é imobilizado em um recipiente de cultura.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o anticorpo agonista anti-CD3 ou um fragmento de ligação do mesmo é imobilizado colocando o anticorpo agonista anti-CD3, ou um fragmento de ligação do mesmo, 1 ng/mL-50000 ng/mL, em contato com o recipiente de cultura.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a fibronectina ou uma variante dela é RetroNectin (marca registrada).

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o RetroNectin (marca registrada) é imobilizado no recipiente de cultura.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o RetroNectin (marca registrada) é imobilizado colocando 1-

150 μg/mL do RetroNectin (marca registrada) em contato com o recipiente de cultura.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o agonista de CD30 é pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo agonista anti- CD30 ou um fragmento de ligação do mesmo e um ligante de CD30 ou um fragmento de ligação do mesmo.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o anticorpo agonista anti-CD30 ou um fragmento de ligação do mesmo está contido no meio.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a concentração do anticorpo agonista anti-CD30 ou um fragmento de ligação do mesmo no meio é 1 ng/mL-1000 ng/mL.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o meio compreende pelo menos uma selecionada dentre IL-7, IL-15, IL-18 e IL-21.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o meio compreende IL-7, IL-15, IL-18 e IL-21.

23. Método de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que o meio compreende adicionalmente TL1A e/ou IL-12.

24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que a célula CD3-positiva produzida é ainda CD197-positiva.

25. Célula CD3-positiva, caracterizada pelo fato de que é obtida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a

24.

26. Método de cultura para expansão de uma célula CD3- positiva, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de cultivo da célula CD3-positiva na presença de um agonista do complexo CD3/TCR, fibronectina, ou uma variante dela, e um agonista de CD30.

27. Kit para cultura de expansão de uma célula CD3-positiva, caracterizado pelo fato de que compreende o seguinte: (1) um recipiente de cultura no um agonista do complexo CD3/TCR e fibronectina, ou uma variante dela, são imobilizados e (2) um meio compreendendo um agonista de CD30.

28. Método para manter uma célula CD3-positiva como uma célula CD3-positiva CD197-positiva, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de estimulação de um sinal de CD30 na célula CD3- positiva.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a célula CD3-positiva é uma célula CD3-positiva CD8- positiva.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a célula CD3-positiva CD8-positiva é uma célula CD3- positiva CD8-positiva CD4-negativa.

31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 30, caracterizado pelo fato de que o meio usado na etapa de estimulação compreende pelo menos uma selecionada dentre IL-7, IL-15, IL-18 e IL-21.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o meio usado na etapa de estimulação compreende IL-7, IL- 15, IL-18 e IL-21.

33. Método de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizado pelo fato de que o meio usado na etapa de estimulação compreende adicionalmente TL1A e/ou IL-12.

34. Kit para manter uma célula CD3-positiva como uma célula CD3-positiva CD197-positiva, caracterizado pelo fato de que compreende um agonista de CD30.

35. Receptor de antígeno quimérico, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembrana e um domínio de transdução de sinal intracelular, em que o domínio de transdução de sinal intracelular compreende um domínio de transdução de sinal intracelular de CD30 ou um mutante do mesmo.

36. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que codifica o receptor de antígeno quimérico como definido na reivindicação 35.

37. Vetor de expressão do receptor de antígeno quimérico, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico como definido na reivindicação 36.

38. Célula expressando o receptor de antígeno quimérico, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor de expressão do receptor de antígeno quimérico como definido na reivindicação 37.

39. Célula de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que a célula expressando o receptor de antígeno quimérico é uma célula CD3-positiva.

40. Medicamento, caracterizado pelo fato de que compreende a célula como definida na reivindicação 38 ou 39.

41. Medicamento de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de ser para uso na profilaxia ou tratamento de um tumor que expressa um antígeno reconhecido pelo receptor de antígeno quimérico como definido na reivindicação 35.

42. Agente para eliminar uma célula que expressa um antígeno reconhecido pelo receptor de antígeno quimérico como definido na reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o agente compreende a célula como definida na reivindicação 38 ou 39.

43. Célula de acordo com a reivindicação 38 ou 39, caracterizada pelo fato de ser para uso na profilaxia ou tratamento de um tumor que expressa um antígeno reconhecido pelo receptor de antígeno quimérico como definido na reivindicação 35.

44. Uso da célula como definida na reivindicação 38 ou 39, caracterizado pelo fato de ser na produção de um agente para a profilaxia ou tratamento de um tumor que expressa um antígeno reconhecido pelo receptor de antígeno quimérico definido na reivindicação 35.

45. Método para prevenção ou tratamento de um tumor que expressa um antígeno reconhecido pelo receptor de antígeno quimérico como definido na reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a célula como definida na reivindicação 38 ou 39.