실시예 1 - 보존제 비함유 백신(티메로살-감소된 백신)에 대한 안정화제로서 α-토코페롤 숙시네이트를 사용하여 인플루엔자 바이러스 항원 제조물을 제조하는 방법
하기 공정에 따라 1가 스플릿 백신을 제조하였다.
바이러스 접종원의 제조
자충포장란의 접종일에, 0.5mg/ml의 젠타마이신 술페이트와 25㎍/ml의 히드로코르티손을 함유하는 인산염 완충된 염수와 작업 시드 랏(seed lot)과 혼합하므로써 제조하였다(바이러스 스트레인에 따라). 바이러스 접종원을 2-8℃로 유지시켰다.
자충포장란의 접종
9 내지 11일된 자충포장란을 바이러스 복제에 사용하였다. 껍질의 오염물을 제거하였다. 자충포장란을 0.2ml의 바이러스 접종원으로 접종시켰다. 접종된 란을 (바이러스 스트레인에 따라) 적합한 온도에서 48 내지 96시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 말기에, 냉각시켜 배아를 치사시키고, 란을 2-8℃에서 12-60시간 동안 저장하였다.
채취
냉장된 자충포장란으로부터 알란토인성 유체를 채취하였다. 일반적으로, 1개의 란 당 8 내지 10ml의 미가공 알란토인성 유체를 수집하였다.
알란토인성 유체로부터의 전체 바이러스의 농축물 및 정제
1. 정화
채취된 알란토인성 유체를 완만한 속도의 원심분리에 의해 정화하였다(4000 - 14000g).
2. 흡착 단계
정화된 바이러스 풀중의 CaHPO4겔을 수득하기 위해, 바이러스 스트레인에 따라 0.5mol/L의 Na2HPO4및 0.5mol/L의 CaCl2용액을 첨가하여 CaHOP4의 최종 농도가 1.5g 내지 3.5g CaHPO4/리터가 되게 하였다.
8시간 이상 동안 침전시킨 후, 상청액을 제거하고, 사용되는 CaHPO4의 양에 따라 0.26mol/L EDTA-Na2용액을 인플루엔자 바이러스를 함유하는 침전물에 첨가하므로써 재용해시켰다.
3. 여과
재현탁된 침전물을 6㎛ 필터막으로 여과하였다.
4. 수크로스 구배 원심분리
100㎍/ml 티메로살을 함유하는 선형 구배의 수크로스(0.55%(w/v))로 등밀도 원심분리에 의해 인플루엔자 바이러스를 농축시켰다. 유량은 8-15리터/시간이었다.
원심분리 말기에, 로터 함유물(the content of the rotor)을 4개의 상이한 분획으로 회수하였다(수크로스는 굴절계로 측정됨):
- 분획물 155-52% 수크로스
- 분획물 2약 52-38% 수크로스
- 분획물 338-20% 수크로스*
- 분획물 420-0% 수크로스
* 바이러스 스트레인에 따라:분획물 3의 수크로스는 15% 수크로스로 감소될 수 있다.
추가의 백신 제조를 위해서는, 단지 분획물 2와 3을 사용하였다.
수크로스 함량을 약 6% 미만으로 감소시키기 위해 분획물 3을 인산염 완충액에 의한 정용여과에 의해 세척하였다. 이러한 희석된 분획물에 존재하는 인플루엔자 바이러스를 펠렛화시켜 가용성 오염물을 제거하였다.
펠렛을 재현탁시키고, 완전히 혼합하여 균질의 현탁액을 수득하였다. 분획물 2와 분획물 3의 재현탁된 펠렛을 풀링(pooling)시키고, 인산염 완충액을 첨가하여 약 40리터의 용적을 수득하였다. 이러한 생성물이 1가 전체 바이러스 농축물이다.
5. 나트륨 데옥시콜레이트로의 수크로스 구배 원심분리
1가 전체 인플루엔자 바이러스 농축물을 ENI-Mark Ⅱ 초원심분리기에 가하였다. K3 로터는 선형 구배의 수크로스(0.55%(w/v))를 함유하며, 여기서 나트륨 데옥시콜레이트 구배가 추가적으로 중첩된다. 트윈 80은 스플릿 동안 0.1%(w/v) 이하로 존재하였으며, B형 바이러스에 있어서는, 토코페롤 숙시네이트를 0.5mM 이하로 첨가하였다. 최대 나트륨 데옥시콜레이트 농도는 0.7-1.5%(w/v)이며, 이는 바이러스 스트레인에 의존적이다. 유속은 8-15 리터/시간이다.
원심분리 말기에, 로터 함유물을 3개의 상이한 분획으로 회수하였으며(수크로스는 굴절계에 의해 측정됨), 분획물 2를 추가의 공정에 사용하였다. 분획물의 수크로스 함량 제한(47-18%)은 바이러스 스트레인에 따라 상이하며, 평가후 결정된다.
6. 멸균 여과
스플릿 바이러스 분획물을 말단이 0.2㎛ 막으로 된 필터막으로 여과시켰다. 0.025%(w/v)의 트윈 80 및 (B형 바이러스에 있어서) 0.5mM의 토코페롤 숙시네이트를 함유하는 인산염 완충액을 희석에 사용하였다. 여과된 분획물 2의 최종 용적은 원래의 분획 부패의 5배였다.
7. 불활성화
여과된 1가 물질을 최대 84 시간 동안 22±2℃에서 인큐베이션하였다(바이러스 스트레인에 따라, 인큐베이션 시간이 단축될 수 있음). 총 단백질 함량을 최대 250㎍/ml로 저하시키기 위해 0.025%(w/v)의 트윈 80을 함유하는 인산염 완충액을 첨가하였다. B형 바이러스에 있어서는, 0.025%(w/v)의 트윈 80 및 0.25mM 토코페롤 숙시네이트를 함유하는 인산염 완충된 염수를 가하여 희석시켜 총 단백질 함량을 250㎍/ml까지 저하시켰다. 포름알데히드를 첨가하여 최종 농도가 50㎍/ml가 되게하고, 72시간 이상 동안 20℃±2℃에서 불활성화를 수행하였다.
8. 초여과
불활성화된 스플릿 바이러스 물질을, 20kDa MWCO를 갖는 셀룰로오스 아세테이트 막이 구비된 초여과 장치에서 2배 이상 농축시켰다. 그 후, 물질을 0.025%(w/v)의 트윈 80을 함유하는 인산염 완충액으로 세척하고, 0.01%(w/v)의 트윈을 함유하는 인산염 완충된 염수로 세척하였다. B형 바이러스에 있어서는, 0.01%(w/v)의 트윈 80 및 0.1mM 토코페롤 숙시네이트를 함유하는 인산염 완충된 염수를 사용하여 세척하였다.
9. 최종 멸균 여과
초여과 후에, 물질을 말단이 0.2㎛ 막으로 된 필터막으로 여과시켰다. 필터막을 린스하고, 물질을 필요에 따라 0.01%(w/v)의 트윈 80 및 (B 바이러스에 있어서) 0.1mM의 토코페롤 숙시네이트를 함유하는 인산염 완충된 염수로 희석시켜 단백질 농도가 500㎍/ml를 초과하지 않게 하였다.
10. 저장
1가 최종 벌크를 최대 18달 동안 2-8℃에서 저장하였다.
안정도
표 1. 1가 최종 벌크에서 SRD에 의해 측정된 시간에 따른 HA 함량(㎍/ml) 비교
스트레인 |
안정화제 |
생성 후 |
30℃에서 4주 |
2-8℃에서 6달 |
2-8℃에서 12달 |
B/야마나쉬(Yamanashi)/166/98 |
토코페릴숙시네이트(잔여 수은 3㎍/ml) |
169 |
139(82%) |
172(>100%) |
ND |
B/야마나쉬/166/98 |
티메로살(108㎍/ml) |
192 |
160(83%) |
186(97%) |
178(93%) |
B/야마나쉬/166/98 |
비함유(잔여 수은 3㎍/ml) |
191 |
122(60%) |
175(92%) |
154(81%) |
B/요한스버그(Johannesburg)/5/99 |
토코페릴숙시네이트(잔여 수은 4㎍/ml) |
166 |
183(>100%) |
158(95%) |
179(>100%) |
B/요한스버그/5/99 |
토코페릴숙시네이트(잔여 수은 4㎍/ml) |
167 |
179(>100%) |
158(95%) |
178(>100%) |
B/요한스버그/5/99 |
토코페릴숙시네이트(잔여 수은 3㎍/ml) |
144 |
151(>100%) |
130(90%) |
145(>100%) |
B/요한스버그/5/99* |
티메로살 |
159 |
ND |
172(>100%) |
154(97%) |
B/요한스버그/5/99** |
비함유 |
169 |
107(63%) |
153(90%) |
ON |
*허용된 플루아릭스TM(FLUARIXTM)에 따라 생성됨, **토코페롤숙시네이트 없이 실시예 1에따라 생성됨, ON: 진행중, ND: 측정되지 않음.
실시예 2 - 티메로살-감소된 백신에 대한 안정화제로서 α-토코페롤 숙시네이트를 사용하여 인플루엔자 백신을 제조하는 방법
3 스트레인의 1가 최종 벌크, 즉 A/뉴 칼도니아(New Caldonia)/20/99(H1N1) IVR-116, A/파나마(Panama)/2007/99(H3N2) 레스비르(RESVIR)-17 및 B/야마나쉬/166/98을 실시예 1에 설명된 방법에 따라 생성시켰다.
풀링
적합한 양의 1가 최종 벌크를 풀링시켜, A/뉴 칼도니아/20/99(H1N1) IVR-116 및 A/파나마/2007/99(H3N2) 레스비르-17에 있어서는 각각 최종 HA 농도가 30㎍/ml이 되게 하고, B/야마나쉬/166/98에 있어서는 39㎍/ml이 되게 하였다. 트윈 80 및트리톤 X-100을 각각 580㎍/ml 및 90㎍/ml로 조절하였다. 최종 용적을 인산염 완충된 염수로 3 l로 조절하였다. 3가 풀(pool)을 말단이 0.8㎛인 셀룰로오스 아세테이트 막을 사용하여 여과시켜 3가의 최종 벌크를 수득하였다. 3가 최종 벌크를 각각 0.5mL 이상으로 주사기에 충전시켰다.
표 2. 주사기로부터 회수된 3가 최종 벌크에서 SRD에 의해 측정된 시간에 따른 HA 농도 비교
백신 제형 |
스트레인 |
0 달 |
2 달 |
4 달 |
6 달 |
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안정화제 비함유 인플루엔자 |
A/NCal/20/99 |
33(32-34) |
32(31-33) |
36(34-38) |
31(30-32) |
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A/Pan/2007/99 |
29(27-31) |
31(28-34) |
34(32-36) |
32(31-33) |
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B/Yam/166/98
|
36(34-38)
|
33(32-34)
|
32(30-34)
|
31(29-33)
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알파-토코페롤 숙시네이트 함유 인플루엔자 백신 |
A/NCal/20/99 |
31(30-32) |
32(31-33) |
36(34-38) |
32(31-33) |
|
A/Pan/2007/99 |
33(30-36) |
33(30-36) |
36(35-37) |
33(31-35) |
|
B/Yam/166/98
|
37(35-39)
|
36(34-38)
|
38(35-41)
|
36(33-39)
|
실시예 3 - 헤마글루티닌 함량을 측정하는데 사용된 SRD 방법
유리 플레이트(12.4-10.0cm)를 NIBSC에 의해 제안된 농도의 안티-인플루엔자 HA 혈청을 함유하는 아가로스 겔로 피복하였다. 겔을 셋팅한 후, 72개의 샘플 웰(3mm)을 아가로스에 펀칭시켰다. 10마이크로리터 희석액의 대조군 및 샘플을 웰에 로딩하였다. 플레이트를 수분 챔버에서 실온(20 내지 25℃)하에 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 플레이트를 NaCl-용액으로 밤새 함침시키고, 증류수로 간단히 세척하였다. 그 후, 겔을 압축 건조시켰다. 완전히 건조되면, 플레이트를 10분 동안 코마시에 브릴란트 블루(Coomassie Brillant Blue) 용액을 염색하고, 선명하게 규정된 영역이 가시화될 때 까지 메탄올과 아세트산의 혼합물중에서 2회 탈색시켰다. 플레이트 건조 후, 항원 웰을 둘러싸는 염색된 영역의 직경을 직각으로 두 방향으로 측정하였다. 대안적으로, 표면을 측정하기 위한 장치를 사용하였다. 표면에 때한 항원 희석액의 용량-반응 곡선을 작성하고, 결과를 표준 기울기비 분석법에 따라 계산하였다(Finney, D.J.(1952). Statistical Methods in Biological Assay. London: Griffin, Quoted in: Wood, JM, et al(1977). J.Biol.Standar. 5,237-247).
실시예 4 - α-토코페롤 안정화된 인플루엔자 백신의 임상 실험(감소된 티메로살)
실시예 2에 설명된 바와 같이 수득된 주사기를 임상 실험에 사용하였다.
H3N2: A/파나마/2007/99(H3N2) 레스비르-17
H1N1: A/뉴 칼도니아/20/99(H1N1) IVR-116
B: B/야마나쉬/166/98
표 3
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성인 18-60세
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티오-감소됨
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티오-첨가
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H3N2
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H1N1
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B
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H3N2
|
H1N1
|
B
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백신 처리전
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GMT |
47 |
41 |
111 |
55 |
37 |
102 |
|
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|
역가<10[%] |
10.3% |
13.8% |
1.7% |
5.3% |
12.3% |
8.8% |
|
역가≥40, SPR[%] |
60.3% |
55.2% |
75.9% |
70.2% |
52.6% |
75.4% |
|
|
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백신 처리후
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혈청전환율[%] |
10.3% |
13.8% |
1.7% |
5.3% |
12.3% |
8.8% |
|
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|
항체 역가의 현저한 증가[%] |
58.6% |
74.1% |
58.6% |
63.2% |
73.7% |
52.6% |
|
|
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|
혈청전환율[%] |
58.6%
|
74.1%
|
58.6%
|
63.2%
|
73.7%
|
52.6%
|
|
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|
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|
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GMT |
328 |
525 |
766 |
324 |
359 |
588 |
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GMT 배수 |
7.3 |
13.0 |
6.9 |
5.9 |
9.8 |
5.9 |
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역가≥40, SPR[%] |
100.0%
|
100.0%
|
100.0%
|
100.0%
|
100.0%
|
100.0%
|
n.d. = 비율 p에 대한 C.I. = p*(1-p)*N<9이기 때문에, n/N은 규정되지 않음.
n/N = (하위)집단 시험체 수(N)의 일부로서의 반응자(n), 즉 혈청전환율 또는 현저한 증가, 참조: [CPMAP/BWP/214/96 12 March 1997, p 17ff].
GMT = 기하평균역가, 역수
95% C.I. = 95% 신뢰구간,
SPR = 혈청보호율: 백신접종 전 또는 백신접종 후의 ≥40의 보호 역가를 갖는 시험체의 비율
역가 = HI-항체 역가
혈청전환율 = 백신접종전 <10에서 백신접종 후 ≥40으로 증가된 항체를 갖는 시험체의 비율
GMT 배수 = GMT의 증가 배수
현저한 증가 = 백신접종전 ≥10의 항체역가를 가지나, 백신접종후 4배 증가된 항체를 갖는 시험체의 비율(2단계의 역가)
req. = EU 필요
혈청전환 = 네거티브에서 파지티브로 또는 g.e. 4배(네거티브: 역가<10, 파지티브: 역가≥40) = 혈청전환(<10에서 ≥40) 또는 현저한 증가를 갖는 시험체의 비율
결과는 백신이 보존제로서 티메로살을 함유하는 백신과 동일한 보호유을 제공할 수 있음을 보여준다.
실시예 5a - 티메로살 비함유 백신에 대한 안정화제로서 α-토코페롤 숙시네이트를 사용한 인플루엔자 바이러스 항원 제조물의 제조
1가 스플릿 백신을 하기 공정에 따라 제조하였다.
바이러스 접종원의 제조
자충포장란의 접종일에, 0.5mg/ml의 젠타마이신 술페이트와 25㎍/ml의 히드로코르티손을 함유하는 인산염 완충된 염수와 작업 시드 랏(seed lot)과 혼합하므로써 제조하였다(바이러스 스트레인에 따라). 바이러스 접종원을 2-8℃로 유지시켰다.
자충포장란의 접종
9 내지 11일된 자충포장란을 바이러스 복제에 사용하였다. 껍질의 오염물을 제거하였다. 자충포장란을 0.2ml의 바이러스 접종원으로 접종시켰다. 60,000개의 접종된 란을 (바이르스계에 따라) 적합한 온도에서 48 내지 96시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 말기에, 냉각시켜 배아를 치사시키고, 란을 2-8℃에서 12-60시간 동안 저장하였다.
채취
냉장된 자충포장란으로부터 알란토인성 유체를 채취하였다. 일반적으로, 1개의 란 당 8 내지 10ml의 미가공 알란토인성 유체를 수집하였다.
알란토인성 유체로부터의 전체 바이러스의 농도 및 정제
정화
채취된 알란토인성 유체를 완만한 속도의 원심분리에 의해 정화하였다(4000 - 14000g).
침전 단계
정화된 바이러스 풀중의 최종 암모늄 염 농도가 0.5mol/L이 되도록 포화된 암모늄 술페이트 용액을 첨가하였다. 1시간 이상 동안 침전시킨 후, 침전물을 필터 깊이에 따른 여과에 의해 제거하였다(전형적으로, 0.5㎛).
여과
정화된 미가공 전체 바이러스 벌크를, 말단이 유효한 멸균 막(전형적으로, 0.2㎛)으로 된 필터막으로 여과하였다.
초여과
멸균 여과된 미가공 1가 전체 바이러스 벌크를 1000kDa 엠더블유코 바이오막스(MWCO BIOMAXTM)가 구비된 카세트로 6배 이상 농축시켰다. 농축된 분비폐지물을 1.8배 이상의 인산염 완충된 염수로 세척하였다.
수크로스 구배 원심분리
선형 구배의 수크로스(0.55%(w/v))로 등밀도 원심분리에 의해 인플루엔자 바이러스를 농축시켰다. 유량은 8-15리터/시간이었다.
원심분리 말기에, 로터 함유물을 4개의 상이한 분획으로 회수하였다(수크로스는 굴절계로 측정됨):
- 분획물 155-52% 수크로스
- 분획물 2약 52-38% 수크로스
- 분획물 338-20% 수크로스*
- 분획물 420-0% 수크로스
* 바이러스 스트레인에 따라:분획물 3의 수크로스는 15% 수크로스로 감소될 수 있다.
추가의 백신 제조를 위해서는, 단지 분획물 2를 사용하거나, 분획물 2와 추가로 정제된 분획물 3을 사용하였다.
수크로스 함량을 약 6% 미만으로 감소시키기 위해 분획물 3을 인산염 완충액에 의한 정용여과에 의해 세척하였다. 선택적으로 이러한 단계는 생략될 수 있다. 이러한 희석된 분획물에 존재하는 인플루엔자 바이러스를 펠렛화시켜 가용성 오염물을 제거하였다.
펠렛을 재현탁시키고, 완전히 혼합하여 균질의 현탁액을 수득하였다. 분획물 2와 분획물 3의 재현탁된 펠렛을 풀링시키고, 인산염 완충액을 첨가하여 약 40리터의 용적을 수득하였다. 이러한 생성물이 1가 전체 바이러스 농축물이다.
나트륨 데옥시콜레이트로의 수크로스 구배 원심분리
1가 전체 인플루엔자 바이러스 농축물을 ENI-Mark Ⅱ 초원심분리기에 가하였다. K3 로터는 선형 구배의 수크로스(0.55%(w/v))를 함유하며, 여기서 나트륨 데옥시콜레이트 구배가 추가적으로 중첩된다. 트윈 80은 스플릿 동안 0.1%(w/v)하로 존재하였으며, B형 바이러스에 있어서는, 토코페릴숙시네이트를 0.5mM 이하로 첨가하였다. 최대 나트륨 데옥시콜레이트 농도는 0.7-1.5%(w/v)이며, 이는 바이러스 스트레인에 의존적이다. 유속은 8-15 리터/시간이다.
원심분리 말기에, 로터 함유물을 3개의 상이한 분획으로 회수하였으며(수크로스는 굴절계에 의해 측정됨), 분획물 2를 추가의 공정에 사용하였다. 분획물의 수크로스 함량 제한(47-18%)은 바이러스 스트레인에 따라 상이하며, 평가후 결정된다.
멸균 여과
스플릿 바이러스 분획물을 말단이 0.2㎛ 막으로 된 필터막으로 여과시켰다. 0.025%(w/v)의 트윈 80 및 (B형 바이러스에 있어서) 0.5mM의 토코페릴숙시네이트를 함유하는 인산염 완충액을 희석에 사용하였다. 여과된 분획물 2의 최종 용적은 원래의 분획 부패의 5배였다.
불활성화
여과된 1가 물질을 최대 84 시간 동안 22±2℃에서 인큐베이션하였다(바이러스 스트레인에 따라, 인큐베이션 시간이 단축될 수 있음). 총 단백질 함량을 최대 450㎍/ml로 저하시키기 위해 0.025%(w/v)의 트윈 80을 함유하는 인산염 완충액을 첨가하였다. B형 바이러스에 있어서는, 0.025%(w/v)의 트윈 80 및 0.25mM 토코페릴숙시네이트를 함유하는 인산염 완충된 염수를 가하여 희석시켜 총 단백질 함량을250㎍/ml까지 저하시켰다. 포름알데히드를 첨가하여 최종 농도가 100㎍/ml가 되게하고, 72시간 이상 동안 20℃±2℃에서 불활성화를 수행하였다.
초여과
불활성화된 스플릿 바이러스 물질을, 20kDa MWCO를 갖는 셀룰로오스 아세테이트 막이 구비된 초여과 장치에서 2배 이상 농축시켰다. 그 후, 물질을 0.025%(w/v)의 트윈 80을 함유하는 인산염 완충액으로 세척하고, 0.01%(w/v)의 트윈을 함유하는 인산염 완충된 염수로 세척하였다. B형 바이러스에 있어서는, 0.01%(w/v)의 트윈 80 및 0.1mM 토코페릴숙시네이트를 함유하는 인산염 완충된 염수를 사용하여 세척하였다.
최종 멸균 여과
초여과 후에, 물질을 말단이 0.2㎛ 막으로 된 필터막으로 여과시켰다. 필터막을 린스하고, 물질을 필요에 따라 0.01%(w/v)의 트윈 80 및 (B 바이러스에 있어서) 0.1mM의 토코페릴숙시네이트를 함유하는 인산염 완충된 염수로 희석시켜 단백질 농도가 500㎍/ml를 초과하지 않게 하였다.
저장
1가 최종 벌크를 최대 18달 동안 2-8℃에서 저장하였다.
안정도
표 4. 1가 최종 벌크에서 SRD에 의해 측정된 시간에 따른 HA 함량(㎍/ml) 비교
스트레인 |
안정호제 |
생성 후 |
30℃에서 4주 |
2-8℃에서 6달 |
|
|
|
|
|
B/요한스버그/5/99* |
토코페롤 숙시네이트 |
214 |
196(92%) |
206(96%) |
B/요한스버그/5/99** |
비함유 |
169 |
107(63%) |
153(90%) |
**토코페릴숙시네이트 없이 실시예 1에 따라 생성됨
실시예 5b - 티메로살 비함유 백신에 대한 안정화제로서 α-토코페롤 숙시네이트를 사용한 인플루엔자 바이러스 항원 제조물의 제조
실시예 5a에 기술된 방법의 바람직한 변형은 하기와 같다:
전체 바이러스의 채취 후에 침전 단계(암모늄 술페이트 침전)를 수행하였다. 그 후, 유체를 완만한 속도의 원심분리에 의해 정화하였다(4000 - 14000g). 이렇게 실시예 5a와 비교하여 침전과 여과 단계의 순서를 바꾸었다.
그 후, 실시예 5a와 같이 멸균 여과, 초여과 및 초원심분리(수크로스 구배 원심분리) 단계를 수행하였다. 그러나, 초원심분리 단계로부터 생성된 분획물을 재처리하는 단계를 필요하지 않다.
공정의 잔류 단계는 실시예 5a에 설명되어 있다.
이와 같이, 본 실시예의 공정을 요약하면 하기와 같다:
채취
침전(암모늄 술페이트)
정화
멸균 여과
초여과
초원심분리
스플릿팅(바람직하게는, 나트륨 데옥시콜레이트)
멸균 여과
불활성화
초여과
최종 멸균 여과
실시예 5a의 또 다른 바람직한 변형은 제 1 멸균 여과 전에 사전 여과 단계를 포함하는 것이다. 이러한 단계는 멸균 여과되지는 않지만, 멸균 여과전에 오염물 예컨대, 알부민을 제거할 수 있는 막을 사용하였다. 이는 더욱 양호한 수율을 수득할 수 있게 한다. 사전여과의 적합한 막은 약 0.8㎛ 내지 약 1.8㎛, 예를 들어, 1.2㎛이다. 사전여과 단계는 실시예 5a 또는 실시예 5b에 방법에 이용될 수 있다.
실시예 6 - 티메로살 비함유 백신에 대한 안정화제로서 α-토코페롤 숙시네이트를 사용하여 인플루엔자 백신을 제조하는 방법
3 스트레인의 1가 최종 벌크, 즉 A/뉴 칼도니아/20/99(H1N1) IVR-116, A/파나마/2007/99(H3N2) 레스비르-17 및 B/야마나쉬/166/98을 실시예 5에 설명된 방법에 따라 생성시켰다.
풀링
적합한 양의 1가 최종 벌크를 풀링시켜, A/뉴 칼도니아/20/99(H1N1) IVR-116 및 A/파나마/2007/99(H3N2) 레스비르-17에 있어서는 각각 최종 HA 농도가 30㎍/ml이 되게 하고, B/요한스버그/5/97에 있어서는 36㎍/ml이 되게 하였다. 트윈 80 및 트리톤 X-100을 각각 580㎍/ml 및 90㎍/ml로 조절하였다. 최종 용적을 인산염 완충된 염수로 3 l로 조절하였다. 3가 풀을 말단이 0.8㎛인 셀룰로오스 아세테이트 막을 사용하여 여과시켜 3가의 최종 벌크를 수득하였다. 3가 최종 벌크를 각각 0.5mL 이상으로 주사기에 충전시켰다.
표 5. 3가 최종 벌크에서 SRD에 의해 측정된 시간에 따른 HA 농도 비교
백신 제형 |
스트레인 |
0 달 |
30℃에서 4주 |
2-8℃에서 6달 |
|
|
|
|
|
안정화제 비함유 인플루엔자 |
A/NCal/20/99 |
31 |
32 |
30 |
|
A/Pan/2007/99 |
31 |
34 |
33 |
|
B/Joh/5/99*
|
35
|
25
|
31
|
|
|
|
|
|
알파-토코페롤 숙시네이트 함유 인플루엔자 백신 |
A/NCal/20/99 |
34 |
35 |
34 |
|
A/Pan/2007/99 |
33 |
33 |
34 |
|
B/Joh/5/99**
|
29
|
25
|
28
|
*제형은 39㎍/ml의 표적 농도를 기준으로 한다. **제형은 34㎍/ml의 표적 농도를 기준으로 한다.
실시예 7 - 보존제 비함유 백신에 대한 안정화제로서 나트륨 라우릴 술페이트를 사용하여 인플루엔자 항원 제조물을 제조하는 방법(티메로살 감소된 백신)
실시예 1에 설명된 바와 같이 B/요한스버그/5/99의 1가 전체 바이러스 농축물을 수득하였다.
나트륨 데옥시콜레이트로의 수크로스 구배 원심분리
1가 전체 인플루엔자 바이러스 농축물을 ENI-Mark Ⅱ 초원심분리기에 가하였다. K3 로터는 선형 구배의 수크로스(0.55%(w/v))를 함유하며, 여기서 나트륨 데옥시콜레이트 구배가 추가적으로 중첩된다. 트윈 80은 스플릿 동안 0.1%(w/v) 이하로 존재하였다. 최대 나트륨 데옥시콜레이트 농도는 0.7-1.5%(w/v)이며, 이는 바이러스 스트레인에 의존적이다. 유속은 8-15 리터/시간이다.
원심분리 말기에, 로터 함유물을 3개의 상이한 분획으로 회수하였으며(수크로스는 굴절계에 의해 측정됨), 분획물 2를 추가의 공정에 사용하였다. 분획물의 수크로스 함량 제한(47-18%)은 바이러스 스트레인에 따라 상이하며, 평가후 결정된다.
멸균 여과
10ml의 분획물 2 샘플을 추가의 공정에 사용하였다. 스플릿 바이러스 분획물을 말단이 0.2㎛ 막으로 된 필터막으로 여과시켰다. 0.025%(w/v)의 트윈 80 및 0.5mM의 나트륨 라우릴 술페이트를 함유하는 인산염 완충액을 희석에 사용하였다. 여과된 분획물 2의 최종 용적은 원래의 분획 부패의 5배였다.
불활성화
여과된 1가 물질을 최대 84 시간 동안 22±2℃에서 인큐베이션하였다(바이러스 스트레인에 따라, 인큐베이션 시간이 단축될 수 있음). 총 단백질 함량을 최대 250㎍/ml로 저하시키기 위해 0.025%(w/v)의 트윈 80 및 0.5mM의 나트륨 라우릴술페이트를 함유하는 인산염 완충된 염수를 첨가하였다. 포름알데히드를 첨가하여 최종 농도가 50㎍/ml가 되게하고, 72시간 이상 동안 20℃±2℃에서 불활성화를 수행하였다.
초여과
불활성화된 스플릿 바이러스 물질을, 20kDa MWCO를 갖는 셀룰로오스 아세테이트 막이 구비된 초여과 장치에서 2배 이상 농축시켰다. 그 후, 물질을 0.001%(w/v)의 트윈 80 및 0.5mM 나트륨 라우릴 술페이트를 함유하는 4배 용적의 인산염 완충된 염수로 세척하였다.
최종 멸균 여과
초여과 후에, 물질을 말단이 0.2㎛ 막으로 된 필터막으로 여과시켰다. 필터막을 린스하고, 물질을 필요에 따라 0.01%(w/v)의 트윈 80 및 0.5mM의 나트륨 라우릴 술페이트를 함유하는 인산염 완충된 염수로 희석시켜 단백질 농도가 500㎍/ml를 초과하지 않게 하였다.
저장
1가 최종 벌크를 2-8℃에서 저장하였다.
표 7. 1가 최종 벌크에서 SRD에 의해 측정된 시간에 따른 HA 함량 비교
|
안정화제
|
생성 후
|
30℃에서 4주
|
B/요한스버그/5/99
|
비함유*
|
182
|
139(77%)
|
B/요한스버그/5/99
|
나트륨 라우릴 술페이트
|
288
|
264(92%)
|
* 나트륨 라우릴 술페이트를 첨가하지 않은채 실시예 7에 따라 생성됨
실시예 8 - 보존제 비함유 백신에 대한 안정화제로서 플란타케어 또는 라우레스-9를 사용하여 인플루엔자 바이러스 항원 제조물을 제조하는 방법(티메로살 감소된 백신)
실시예 1에 설명된 바와 같이 B/야마나쉬/166/98의 1가 전체 바이러스 농축물을 수득하였다.
단편화
pH7.4의 인산염 완충된 염수로 1가 전체 인플루엔자 바이러스 농축물을 단백질 농도를 1,000㎍/ml의 농도로 희석하였다. 플란타케어?2000 UP 또는 라우레스-9를 첨가하여 최종 농도가 1%(w/v)가 되게하였다. 물질을 30분 동안 서서히 혼합하였다. 그 후, 물질을 버켓에서 수크로스 쿠션 15%(w/w)상에서 중첩되었다. 벡맨 스위 아웃 로터 SW 28(Beckman swing out rotor SW 28)에서 초여과를 25,000rpm하에서 2h동안 20℃에서 수행하였다.
멸균 여과
상청액을 추가의 공정에 사용하였다. 스플릿 바이러스 분획물을 말단이 0.2㎛ 막으로 된 필터막으로 여과시켰다.
불활성화
총 단백질 함량을 최대 500㎍/ml로 저하시키기 위해 필요에 따라 인산염 완충된 염수를 첨가하였다. 포름알데히드를 첨가하여 최종 농도가 100㎍/ml가 되게하고, 6일 이상 동안 20℃±2℃에서 불활성화를 수행하였다.
초여과
불활성화된 물질중의 트윈 80 및 트리톤 X 100을 각각 0.15% 및 0.02%로 조절하였다. 불활성화된 스플릿 바이러스 물질을, 30kDa MWCO를 갖는 셀룰로오스 아세테이트 막이 구비된 초여과 장치에서 2배 이상 농축시켰다. 그 후, 물질을 4배 용적의 인산염 완충된 염수로 세척하였다.
최종 멸균 여과
초여과 후에, 물질을 말단이 0.2㎛ 막으로 된 필터막으로 여과시켰다. 필터막을 린스하고, 물질을 인산염 완충된 염수로 희석시켜 단백질 농도가 500㎍/ml를 초과하지 않게 하였다.
저장
1가 최종 벌크를 2-8℃에서 저장하였다.
표 8. 1가 최종 벌크에서 SRD에 의해 측정된 시간에 따른 HA 함량 비교
|
안정화제
|
생성 후
|
30℃에서 4주
|
B/야마나쉬/166/98
|
비함유
|
143
|
98(68%)
|
B/야마나쉬/165/98
|
플란타케어
?
2000 UP
|
476
|
477(100%)
|
B/야마나쉬/165/98
|
라우레스-9
|
468
|
494(>100%)
|
실시예 9 - ID 및 IM 투여에 의한 α-토코페롤 안정화된 인플루엔자 백신의 노인을 대상으로 한 임상 실험(감소된 티메로살)
A. 인플루엔자 바이러스 항원 제조물의 제조 방법
1가 스플릿 백신을 하기 공정에 따라 제조하였다.
바이러스 접종원의 제조
자충포장란의 접종일에, 0.5mg/ml의 젠타마이신 술페이트와 25㎍/ml의 히드로코르티손을 함유하는 인산염 완충된 염수와 작업 시드 랏과 혼합하므로써 제조하였다(바이러스 스트레인에 따라). 바이러스 접종원을 2-8℃로 유지시켰다.
자충포장란의 접종
9 내지 11일된 자충포장란을 바이러스 복제에 사용하였다. 껍질의 오염물을 제거하였다. 자충포장란을 0.2ml의 바이러스 접종원으로 접종시켰다. 접종된 란을 (바이르스계에 따라) 적합한 온도에서 48 내지 96시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 말기에, 냉각시켜 배아를 치사시키고, 란을 2-8℃에서 12-60시간 동안 저장하였다.
채취
냉장된 자충포장란으로부터 알란토인성 유체를 채취하였다. 일반적으로, 1개의 란 당 8 내지 10ml의 미가공 알란토인성 유체를 수집하였다.
알란토인성 유체로부터의 전체 바이러스의 농축물 및 정제
1. 정화
채취된 알란토인성 유체를 완만한 속도의 원심분리에 의해 정화하였다(4000 - 14000g).
2. 흡착 단계
정화된 바이러스 풀중의 CaHPO4겔을 수득하기 위해, 바이러스 스트레인에 따라 0.5mol/L의 Na2HPO4및 0.5mol/L의 CaCl2용액을 첨가하여 CaHOP4의 최종 농도가 1.5g 내지 3.5g CaHPO4/리터가 되게 하였다.
8시간 이상 동안 침전시킨 후, 상청액을 제거하고, 사용되는 CaHPO4의 양에 따라 0.26mol/L EDTA-Na2용액을 인플루엔자 바이러스를 함유하는 침전물에 첨가하므로써 재용해시켰다.
3. 여과
재현탁된 침전물을 6㎛ 필터막으로 여과하였다.
4. 수크로스 구배 원심분리
100㎍/ml 티메로살을 함유하는 선형 구배의 수크로스(0.55%(w/v))로 등밀도 원심분리에 의해 인플루엔자 바이러스를 농축시켰다. 유량은 8-15리터/시간이었다.
원심분리 말기에, 로터 함유물을 4개의 상이한 분획으로 회수하였다(수크로스는 굴절계로 측정됨):
- 분획물 155-52% 수크로스
- 분획물 2약 52-38% 수크로스
- 분획물 338-20% 수크로스*
- 분획물 420-0% 수크로스
* 바이러스 스트레인에 따라:분획물 3의 수크로스는 15% 수크로스로 감소될 수 있다.
추가의 백신 제조를 위해서는, 단지 분획물 2와 3을 사용하였다.
수크로스 함량을 약 6% 미만으로 감소시키기 위해 분획물 3을 인산염 완충액에 의한 정용여과에 의해 세척하였다. 이러한 희석된 분획물에 존재하는 인플루엔자 바이러스를 펠렛화시켜 가용성 오염물을 제거하였다.
펠렛을 재현탁시키고, 완전히 혼합하여 균질의 현탁액을 수득하였다. 분획물 2와 분획물 3의 재현탁된 펠렛을 풀링시키고, 인산염 완충액을 첨가하여, 120,000란/배취에 적당한 용적인 약 40리터의 용적을 수득하였다. 이러한 생성물이 1가 전체 바이러스 농축물이다.
5. 나트륨 데옥시콜레이트로의 수크로스 구배 원심분리
1가 전체 인플루엔자 바이러스 농축물을 ENI-Mark Ⅱ 초원심분리기에 가하였다. K3 로터는 선형 구배의 수크로스(0.55%(w/v))를 함유하며, 여기서 나트륨 데옥시콜레이트 구배가 추가적으로 중첩된다. 트윈 80은 스플릿 동안 0.1%(w/v) 이하로 존재하였으며, B형 바이러스에 있어서는, 토코페롤 숙시네이트를 0.5mM 이하로 첨가하였다. 최대 나트륨 데옥시콜레이트 농도는 0.7-1.5%(w/v)이며, 이는 바이러스 스트레인에 의존적이다. 유속은 8-15 리터/시간이다.
원심분리 말기에, 로터 함유물을 3개의 상이한 분획으로 회수하였으며(수크로스는 굴절계에 의해 측정됨), 분획물 2를 추가의 공정에 사용하였다. 분획물의 수크로스 함량 제한(47-18%)은 바이러스 스트레인에 따라 상이하며, 평가후 결정된다.
6. 멸균 여과
스플릿 바이러스 분획물을 말단이 0.2㎛ 막으로 된 필터막으로 여과시켰다. 0.025%(w/v)의 트윈 80 및 (B형 바이러스에 있어서) 0.5mM의 토코페롤 숙시네이트를 함유하는 인산염 완충액을 희석에 사용하였다. 여과된 분획물 2의 최종 용적은 원래의 분획 부패의 5배였다.
7. 불활성화
여과된 1가 물질을 최대 84 시간 동안 22±2℃에서 인큐베이션하였다(바이러스 스트레인에 따라, 인큐베이션 시간이 단축될 수 있음). 총 단백질 함량을 최대250㎍/ml로 저하시키기 위해 0.025%(w/v)의 트윈 80을 함유하는 인산염 완충액을 첨가하였다. B형 바이러스에 있어서는, 0.025%(w/v)의 트윈 80 및 0.25mM 토코페롤 숙시네이트를 함유하는 인산염 완충된 염수를 가하여 희석시켜 총 단백질 함량을 250㎍/ml까지 저하시켰다. 포름알데히드를 첨가하여 최종 농도가 50㎍/ml가 되게하고, 72시간 이상 동안 20℃±2℃에서 불활성화를 수행하였다.
8. 초여과
불활성화된 스플릿 바이러스 물질을, 20kDa MWCO를 갖는 셀룰로오스 아세테이트 막이 구비된 초여과 장치에서 2배 이상 농축시켰다. 그 후, 물질을 0.025%(w/v)의 트윈 80을 함유하는 인산염 완충액으로 세척하고, 0.01%(w/v)의 트윈을 함유하는 인산염 완충된 염수로 세척하였다. B형 바이러스에 있어서는, 0.01%(w/v)의 트윈 80 및 0.1mM 토코페롤 숙시네이트를 함유하는 인산염 완충된 염수를 사용하여 세척하였다.
9. 최종 멸균 여과
초여과 후에, 물질을 말단이 0.2㎛ 막으로 된 필터막으로 여과시켰다. 필터막을 린스하고, 물질을 필요에 따라 0.01%(w/v)의 트윈 80 및 (B 바이러스에 있어서) 0.1mM의 토코페롤 숙시네이트를 함유하는 인산염 완충된 염수로 희석시켜 단백질 농도는 1,000㎍/ml를 초과하지 않게 하고, 헤마글루티닌 농도는 180㎍/ml를 초과하지 않게 하였다.
10. 저장
1가 최종 벌크를 최대 18달 동안 2-8℃에서 저장하였다.
B. 인플루엔자 백신의 제조
3 스트레인의 1가 최종 벌크, 즉 A/뉴 칼도니아/20/99(H1N1) IVR-116, A/파나마/2007/99(H3N2) 레스비르-17 및 B/요한스버그/5/99를 상기 A 파트에 설명된 방법에 따라 생성시켰다.
풀링
적합한 양의 1가 최종 벌크를 풀링시켜, A/뉴 칼도니아/20/99(H1N1) IVR-116 및 A/파나마/2007/99(H3N2) 레스비르-17에 있어서는 각각 최종 HA 농도가 60㎍/ml이 되게 하고, B/요한스버그/5/97에 있어서는 68㎍/ml이 되게 하였다. 트윈 80, 트리톤 X-100 및 토코페롤 숙시네이트를 각각 1,000㎍/ml, 110㎍/ml 및 90㎍/ml로 조절하였다. 최종 용적을 인산염 완충된 염수로 3 l로 조절하였다. 3가 풀을 말단이 0.8㎛인 셀룰로오스 아세테이트 막을 사용하여 여과시켜 3가의 최종 벌크를 수득하였다. 3가 최종 벌크를 각각 0.165mL 이상으로 주사기에 충전시켰다.
백신 투여
백신을 사전 충전된 주사기에 공급하고, 삼각근 영역에서 피내 투여하였다. 피내투여(ID) 니들은 EP 1092444에 기술되어 있으며, 피부 침투 리미터로 적합한 피내 주입이 가능하게 하였다. 주입 부위에서의 발진(구진) 형성으로 ID 투여의 양호함을 확인할 수 있기 때문에, 대상 관찰자는 백신접종 30분 후에 발진의 정확한 크기를 측정하였다.
1회 투여량(100㎕)은 하기 성분들을 함유하였다:
3 인플루엔자 스트레인으로부터의 헤마글루티닌 |
|
|
A/뉴 칼도니아/20/99(H1N1) IVR-116 |
: |
6.0㎍ |
A/파나마/2007/99(H3N2) 레스비르-17 |
: |
6.0㎍ |
B/요한스버그/5/99 |
: |
6.0㎍ |
티메로살 보존제 |
: |
0.4㎍ - 0.8㎍ |
B상기 백신을 표준 3가 스플릿 인플루엔자 백신인 플루아릭스TM와 비교하였다. 플루아릭스 백신을 사전충전된 주사기에 공급하고, 삼각근 영역에서 피내 투여하였다. 2.5cm 이상/1인치 길이(23 표준)의 바늘을 사용하여 적합하게 피내 주입하였다.
1회 투여량(0.5ml)은 하기 성분들을 함유하였다:
3 인플루엔자 스트레인으로부터의 헤마글루티닌 |
|
|
A/뉴 칼도니아/20/99(H1N1) IVR-116 |
: |
15.0㎍ |
A/파나마/2007/99(H3N2) 레스비르-17 |
: |
15.0㎍ |
B/요한스버그/5/99 |
: |
15.0㎍ |
티메로살 보존제 |
: |
50.0㎍ |
결과
백신 투여 시간에서 총 집단의 평균 연령은 70.4±6.2세 표준편차(S.D.)이며, 여성/남성 비는 1.7:1이다.
면역원성 결과: 유래된 면역원성 변수 검정은 하기와 같다: |
변수
|
|
플루-레드 ID(N=65)
|
플루아릭스
TM
IM(N=65)
|
GMT
|
|
GMT
|
LL
|
UL
|
GMT
|
LL
|
UL
|
A/뉴 칼도니아 |
전 |
99.5 |
76.9 |
128.7 |
90.0 |
70.1 |
115.7 |
|
후 |
165.1 |
129.2 |
211.0 |
174.3 |
133.3 |
227.9 |
A/파나마 |
전 |
75.5 |
54.7 |
104.2 |
69.2 |
51.9 |
92.4 |
|
후 |
128.6 |
99.1 |
166.8 |
164.3 |
126.0 |
214.1 |
B/요한스버그 |
전 |
236.0 |
187.7 |
296.8 |
222.6 |
176.9 |
280.2 |
|
후 |
341.2 |
276.0 |
421.7 |
402.4 |
312.1 |
518.9 |
혈청전환율
|
|
%
|
LL
|
UL
|
%
|
LL
|
UL
|
A/뉴 칼도니아 |
|
15.4 |
7.6 |
36.5 |
18.5 |
9.9 |
30.0 |
A/파나마 |
|
20.0 |
11.1 |
31.8 |
29.2 |
18.6 |
41.8 |
B/요한스버그 |
|
9.2 |
3.5 |
19.0 |
16.9 |
8.8 |
28.3 |
전환 인수
|
|
GMR
|
LL
|
UL
|
GMR
|
LL
|
UL
|
A/뉴 칼도니아 |
|
1.7 |
1.4 |
2.0 |
1.9 |
1.6 |
2.3 |
A/파나마 |
|
1.7 |
1.4 |
2.1 |
2.4 |
1.9 |
3.0 |
B/요한스버그 |
|
1.4 |
1.2 |
1.7 |
1.8 |
1.5 |
2.1 |
혈청보호율
|
%
|
LL
|
UL
|
%
|
LL
|
UL
|
A/뉴 칼도니아 |
전 |
87.7 |
77.2 |
94.5 |
90.8 |
81.0 |
96.5 |
|
후 |
92.3 |
83.0 |
97.5 |
96.9 |
89.3 |
99.6 |
A/파나마 |
전 |
75.4 |
63.1 |
85.2 |
81.5 |
70.0 |
90.1 |
|
후 |
90.8 |
81.0 |
96.5 |
93.8 |
85.0 |
98.3 |
B/요한스버그 |
전 |
98.5 |
91.7 |
100.0 |
96.9 |
89.3 |
99.6 |
|
후 |
100.0 |
94.5 |
100.0 |
98.5 |
91.7 |
100.0 |
N:허용가능한 결과를 갖는 대상의 수: %:제공된 파라미터내에 존재하는 시험체의 백분율; LL/UL:95%Cl의 하한값 및 상한값; 전:백신 투여 전; 후:백신 투여하고 21일 후 |
10/65(15.4%) 백신에 의해 보고된 주입 부위 통증은 플루아릭스TM의 IM 투여 후의 가장 일반적인 증상이다. ID 군에서, 통증은 3/65(4.6%) 백신에서 유발되었다. 이러한 차이는 통계학적으로 상당한 값에 해당한다(p=0.038; 피셔 추출 시험). 따라서, 티메로살 감소된 생성물의 ID 전달이 바람직하다.
결론
노인 집단에서 티오-감소된 인플루엔자 백신의 ID 및 IM 투여는 100% 혈청보호율을 나타내었다.
기하평균 역가, 혈청보호율, 혈청전환율 및 전환 인수에 대한 백신접종에 대한 비교가능한 반응을 IM 및 ID 백신접종한 개체에서 확인하였으며, 여기서 ID군에는 2.5배 적은 양의 항원을 처리하였다. 두 처리군에서 백신-관련 유도된/비유도된 전신 증상의 전반적인 발생에 대한 식별가능한 차이는 관찰되지 않았다.
실시예 10 - 티메로살-감소된 인플루엔자 백신의 피내 전달
실시예 9에 설명된 바와 같이 제조된(단 풀링은 독립적으로 수행되며, 백신을 주사기로 충전시키지 않았음) 티메로살 감소된 스플릿 인플루엔자 백신의 면역원성을 표준 니들을 사용하여 기니아 피그에 ID 전달하여 평가하였다.
각 5마리 군을 총 200㎕ 용적중에 각각 5㎍의 HA를 함유하는 불활성화된 3가 전체 인플루엔자 바이러스로 비내로 프라이밍시켰다. 프라이밍시키고 28일 후, 상기 동물들을 피내 또는 근내 경로를 통해 백신접종시켰다. 0.1, 0.3 또는 1.0㎍의 3가 티메로살-감소된 스플릿 인플루엔자를 함유하는 0.1ml의 피내 투여량을 표준 니들을 사용하여 기니아 피그의 등에 투여하였다. 1.0㎍의 3가 티메로살-감소된 스플릿 인플루엔자를 포함하는 0.1ml의 근내 투여량을 기니아 피그의 뒷다리에 투여하였다. 군은 하기와 같다:
ㆍ 군 1 - 0.1㎍의 3가 티메로살-감소된 스플릿 인플루엔자 ID;
ㆍ 군 2 - 0.3㎍의 3가 티메로살-감소된 스플릿 인플루엔자 ID;
ㆍ 군 3 - 1.0㎍의 3가 티메로살-감소된 스플릿 인플루엔자 ID;
ㆍ 군 4 - 1.0㎍의 3가 티메로살-감소된 스플릿 인플루엔자 ID;
백신접종 14일 후에, 동물을 체혈하여, 표준 헤마글루틴화 억제 검정법(HI)을 이용하여 백신접종에 의해 유도된 항체 역가를 평가하였다. 결과는 도 1에 도시되어 있다. 백신접종에 의해 모든 3 스트레인에 대해 강한 HI 반응을 유발시켰다. ID 경로로 투여할 경우, 매우 낮은 용량의 티메로살-감소된 항원이 매우 유효한 HI 항체 반응을 유발할 수 있다는 것을 암시하는 어떤 명백한 반응도 관찰되지 않았다. ID 또는 IM 백신접종에 의해 유도된 HI 역가간의 현저한 차이는 관찰되지 않았다. 따라서, 기니아 피그로부터 수득된 결과는 티어머살-감소된 3가 스플릿 인플루엔자 항원이 IM 경로와 비교하여 ID 경로로 투여될 경우, 동물에서 유사한 수준의 HI 항체를 유도한다는 것을 확인시켜 주었다.
실시예 11 - 티메로살-감소되고, 보조된 인플루엔자 백신의 피내 전달
프로토콜
기니아 피그를 0일째에 200㎕중의 5㎍ 3가 전체 불활성화된 인플루엔자 바이러스로 비내로 프라이밍시켰다.
백신접종 - 28일 - 실시예 9에 설명된 바와 같이(단, 풀링 단계로 실시예 9에서의 60㎍/ml와 비교하여, 100㎕중에 0.1㎍의 용량을 제공하도록 각각 1.0㎍/ml의 항원에 대한 최종 농도를 유도하였다) 스트레인 3가 스플릿 인플루엔자 당 0.1㎍ HA를 함유하는 백신을 제조하였다. 100㎕의 보조되거나 비보조된 최종 3가 제형을 투베르쿨린 주사기를 사용하여 피내 투여하였다.
채혈 - 42일
보조화 효과를 HI 검정에 의해 항체 반응을 측정하므로써 평가하였다(0, 28, 42일).
모든 ID 실험을 표준 니들로 수행하였다.
결과
G1 - G5는 군당 5마리의 기니아 피그의 5군을 의미하다.
G1스플릿 3가 티메로살 감소된 0.1㎍
G2스플릿 3가 티오 레드 0.1㎍ + 3D-MPL 50㎍
G3스플릿 3가 티오 레드 0.1㎍ + 3D-MPL 10㎍
G4스플릿 3가 티오 레드 0.1㎍ + 3D-MPLin 50㎍ + QS21 50㎍
G5스플릿 3가 티오 레드 0.1㎍ + 3D-MPLin 10㎍ + QS21 10㎍
3D-MPLIN + QS21은 콜레스테롤을 포함하며, 디올레오일을 포함하는 리피드 이중층을 갖는 유니라멜라 소포를 포함하는 보조 제형으로서, 여기서 QS21 및 3D-MPL은 리피드 이중층과 관련되거나 이중층내에 포함된다. 이러한 보조제 제형은 본원에 참고문헌으로 인용된 EP 0 822 831 B에 기술되어 있다.
HI 역가 안티-A/뉴 칼도니아/20/99
NC |
사전-면역 |
백신접종 전-상승 |
백신접종 후-상승 |
G1 |
5 |
10 |
92 |
G2 |
5 |
10 |
70 |
G3 |
5 |
11 |
121 |
G4 |
7 |
9 |
368 |
G5 |
5 |
10 |
243 |
HI 역가 안티-A/파나마/2007/99
P |
사전-면역 |
백신접종 전-상승 |
백신접종 후-상승 |
G1 |
5 |
485 |
7760 |
G2 |
5 |
279 |
7760 |
G3 |
5 |
485 |
8914 |
G4 |
7 |
485 |
47051 |
G5 |
5 |
320 |
17829 |
HI 역가 안티-B/요한스버그/5/99
J |
사전-면역 |
백신접종 전-상승 |
백신접종 후-상승 |
G1 |
5 |
23 |
184 |
G2 |
5 |
11 |
121 |
G3 |
5 |
11 |
70 |
G4 |
6 |
15 |
557 |
G5 |
5 |
13 |
320 |
이와 같이, 보조 여부에 상관없이, 티어머살-감소된 3가 스플릿 인플루엔자 항원은 효능있는 면역원이며, ID 또는 IM 경로에 의해 투여될 경우 강한 HI 반응을 유발할 수 있다. 이러한 반응은 표준 플루아릭스 제조물에 의해 유도된 반응 이상으로 효능있는 것으로 보여진다.
실시예 12 - 돼지에서 피내로 전달된 티메로살-함유 백신과 티메로살-비함유 백신의 비교
ID 경로에 의해 투여된 스플릿 인플루엔자 백신(티메로살 함유 및 비함유)의 면역원성을 평가하기 위해, 프라이밍된 돼지 모델을 사용하였다. 집단원의 대부분의 사람은 인플루엔자에 의해 한번 이상은 감염되었기 때문에, 인플루엔자 백신은 이미 존재하는 면역 반응을 상승시킬 수 있을 것이다. 따라서, 사람의 상황을 가장 잘 모방하기 위한 노력으로서 동물은 프라이밍시켰다.
이 실험에서, 4주된 돼지를 비내 경로에 의해 프라이밍시켰다. 6군의 각각의 5마리를 하기와 같이 프라이밍시켰다:
군 1 - 0 및 14일에 3가 전체 불활성화된 바이러스(각각 HA 50㎍)로 2회 프라이밍; 군 2 - 0 및 14일에 3가 전체 불활성화된 바이러스(각각 HA 50㎍)로 2회 프라이밍; 군 3 - 0일에 3가 전체 불활성화된 바이러스(각각 HA 50㎍)로 1회 프라이밍; 군 4 - 0 및 14일에 3가 전체 불활성화된 바이러스(각각 HA 25㎍)로 2회 프라이밍; 군 5 - 0일에 3가 전체 불활성화된 바이러스(각각 HA 25㎍)로 1회 프라이밍; 군 6 - 0 및 14일에 3가 전체 불활성화된 바이러스(각각 HA 12.5㎍)로 2회 프라이밍.
28일에 최종 프라이밍하고, 동물을 ID 경로에 의해 100㎕중의 각각의 3㎍의 HA 3가 스플릿 항원(스트레인 A/뉴 칼도니아 H1N1, A/파나마 H3N 및 B/요한스버그)로 백신접종하였다. 군 1에 백신 항원으로서 티메로살 보존제를 함유하를 표준 플루아릭스TM를 투여하였다. 나머지 모든 군에는 보존제 비함유 항원을 투여하였다.
이러한 실험으로부 수득된 HI 결과는 도 2에 도시하였다(다양한 용량의 항원으로 프라이밍되고, 피내 경로에 의해 티메로살 함유 또는 비함유 3가 인플루엔자 항원 3㎍으로 백신접종한 돼지에서 유도된 안티-인플루엔자 헤마글루틴화 억제 역가).
본 실험에서 B형에 대한 비교적 낮은 HI 역가가 유도되었으며, A/H3N2 스트레인에 대한 상태는 높았다. 백신접종에 있어서의 유리한 효과는 프라이밍 용량이 감소된 경우 관찰되었다. 대부분의 경우, 항원 농도 또는 프라이밍 처리(50㎍으로 2회 프라이밍) 횟수의 감소는 백신접종에 대한 증가된 반응을 유도하였다. 백신접종을 위해 50㎍으로 2회 프라이밍된 군 1 및 2에서 동물의 반응이 분명하지는 않지만, 보존제 비함유 항원(군 2)이 이러한 조건하에서 플루아릭스TM(군 1) 이상으로 작용하는 것이 분명하다. 택일적으로 프라이밍된 동물(군 3-6)에서 ID 경로에 의해 투여된 보존제 비함유 3가 인플루엔자로의 백신접종에 대한 강한 반응이 명백하였으며, HI 역가가 낮게 유지됨에도 불구하고, B형에 있어서도 이러한 반응이 관찰되었다.