CZ20033253A3 - Nový vakcinační prostředek - Google Patents

Nový vakcinační prostředek Download PDF

Info

Publication number
CZ20033253A3
CZ20033253A3 CZ20033253A CZ20033253A CZ20033253A3 CZ 20033253 A3 CZ20033253 A3 CZ 20033253A3 CZ 20033253 A CZ20033253 A CZ 20033253A CZ 20033253 A CZ20033253 A CZ 20033253A CZ 20033253 A3 CZ20033253 A3 CZ 20033253A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
influenza
vaccine
virus
influenza virus
antigen
Prior art date
Application number
CZ20033253A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ298697B6 (cs
Inventor
Uwe Eichhorn
Original Assignee
Saechsisches Serumwerk Dresden Branch Of Smithklin
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB0113083A external-priority patent/GB0113083D0/en
Priority claimed from GB0204116A external-priority patent/GB0204116D0/en
Application filed by Saechsisches Serumwerk Dresden Branch Of Smithklin filed Critical Saechsisches Serumwerk Dresden Branch Of Smithklin
Publication of CZ20033253A3 publication Critical patent/CZ20033253A3/cs
Publication of CZ298697B6 publication Critical patent/CZ298697B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Oblast techniky
Vynález se týká nových antigenních prostředků viru chřipky, způsobů jejich přípravy a jejich použití při profylaxi nebo terapii. Zvláště se popisují deaktivované vakcinační prostředky viru chřipky, které jsou štěpené, spíše než vakcinační prostředky tvořené celým virem, a které jsou stabilní v nepřítomnosti organohydrargyriových konzervačních látek. Navíc vakcinační prostředky obsahují hemaglutinin, který je v souladu se standardními testy stabilní. Vakcinační prostředky se mohou aplikovat libovolným způsobem, který je vhodný pro takové vakcinační prostředky. Mohou se aplikovat intramuskulárně, subkutánně, intradermálnš nebo mukozálně, například intranasálně.
Dosavadní stav techniky
Virus chřipky je jeden z nejrozšířenějších virů, který se vyskytuje po celém světě a napadá jak člověka tak domácí zvířata. Ekonomický dopad chřipky je podstatný.
Virus chřipky je RNA virus s obalem. Průměr částic je přibližně 125 nm. Částice viru obsahuje vnitřní nukleokapsid nebo jádro tvořené ribonukleovou kyselinou (RNA) spojené s nukleoproteinem, obklopené virovým obalem tvořeným lipidovou dvoj vrstvou strukturou a vnějšími glykoproteiny. Vnitřní vrstva virového obalu se skládá převážně z matricových proteinů a vnější vrstva je tvořena většinou z lipidového materiálu získaného z hostitele. Povrchová glykoproteinová neuraminidáza (NA) a hemaglutinin (HA) tvoří na povrchu virového obalu bodce 10 až 12 nm dlouhé. Povrchové proteiny, zvláště hemaglutinin, determinují antigenní specifitu subtypu viru chřipky.
• · · · · · • · ··· ·· · · · · · • · · · · · 9 9 9 9 999 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 · ·· ·· ······ «· ·
V současné době dostupné vakcinační prostředku proti chřipce jsou buď deaktivované nebo živé atenuované chřipkové vakcinační prostředky. Deaktivované chřipkové vakcinační prostředky obsahují tři možné formy antigenního přípravku:
deaktivovaný celý virus, sub-viriony, kde izolované virové částice jsou porušeny detergenty nebo jinými činidly, aby došlo k rozpuštění lipidového obalu (tzv. „štěpené vakcinační prostředky), nebo poslední formou jsou izolovaný HA a NA (dílčí vakcinační prostředky). Tyto deaktivované vakcinační prostředky se aplikují intramuskulárně (i.m.) nebo intranasálně (i.n.). V současné době neexistuje běžně dostupný živý atenuovaný vakcinační prostředek.
Všechny druhy vakcinačních prostředků jsou obvykle trivalentní vakcinační prostředky. Uvedené vakcinační prostředky běžně obsahují antigeny získané ze dvou kmenů viru influenzy A a jednoho kmene viru influnezy B. Standardní dávka pro zavedení injekcí o objemu 0,5 ml ve většině případů obsahuje 15 pg antigenní složky hemaglutininu z každého kmene, jak se stanovilo radiální imunodifúzí (SRD) (popisuje se v publikaci J.M. Wood et al., An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines. J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247, J. M. Wood et al. , International collaborative study of single radial diffusion and immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemagglutinin antigen of influenzae virus. J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330).
Kmeny viru influenza, které se začleňují do vakcinačního prostředku, jsou každý rok stanoveny WHO ve spolupráci s řídícími orgány státního zdravotnictví a s výrobci vakcinačních prostředků.
• · • · · · • · ··· · · · · · · · · · ······· * · · ·· · · · · ·· · · ·· ·
Typická epidemie chřipky způsobuje zvýšení výskytu zápalu plic a onemocnění dolních cest dýchacích, o čemž svědčí zvýšený výskyt hospitalizací nebo úmrtí. U starých lidí a u těch, kteří trpí chronickým onemocněním, se často vyskytují uvedené komplikace, ale také mladí lidé mohou trpět vážným onemocněním. Proto je nutné zvláště tyto skupiny chránit.
Současné úsilí řídit nemocnost a úmrtnost spojenou s časnými epidemiemi chřipky je založeno na použití intramuskulárně aplikovaných deaktivovaných prostředků proti chřipce. Účinnost takových prostředků při prevenci respiračního onemocnění a komplikací chřipky se pohybuje v rozmezí 75 % u zdravých dospělých a méně než 50 % v případě starých lidí.
vakcinačních vakcinačních
Standardy se aplikují mezinárodně za účelem stanovení účinnosti vakcinačních prostředků proti viru influenzy. Oficiální kritéria evropské unie pro stanovení účinnosti vakcinačního prostředku proti chřipce jsou dány v tabulce dále v textu. Teoreticky, aby se splnily požadavky Evropské unie, vakcinační prostředky proti chřipce musí splňovat pouze kriteria uvedená v tabulce v případě všech kmenů chřipky zahrnutých ve vakcinačním prostředku. Avšak v praxi je nutné, aby alespoň dvě nebo tři kritéria byly splněny pro všechny kmeny, zvláště v případě nových vakcín, které se aplikují odlišným způsobem. Za určitých okolností mohou být dvě kriteria dostatečná. Například může být přijatelné, aby všechny kmeny splňovaly dvě kritéria ze tří, zatímco třetí kritérium splňuje pouze několik kmenů, nikoliv všechny (například dva ze tří kmenů).
Požadavky jsou různé v případě populace dospělých lidí (18 až 60 let) a populace stárých lidí (starší 60 let).
18 až 60 let starší 60 let
• •99
9
9
9 9999 999
9 99 9 9999
9999 9«·· »999
9999 999 99 9
99 99 9999 99 9
stupeň sérokonverze* >40 % >30 %
faktor konverze** >2,5 >2
stupeň ochrany*** >70 % >60 %
*Stupeň sérokonverze se definuje jako procento vakcinovaných jedinců, kteří vykazují alespoň čtyřnásobné zvýšení sérových hemaglutininových inhibičních (HI) titrů po vakcinaci v případě každého vakcinačního kmene.
**Faktor konverze se definuje jako násobek zvýšení geometrického průměru titrů HI v séru (GMT) po vakcinaci v případě každého vakcinačního kmene.
***Stupeň ochrany se definuje jako procento vakcinovaných jedinců, u kterých je titr HI v séru po vakcinaci stejný nebo vyšší než 1:40 (v případě každého kmene) a v normálním případě je tato hodnota přijatelná jako ukazatel ochrany.
V případě nového použitelného chřipkového vakcinačního prostředku není pouze potřeba splňovat uvedené standardy, ale je také nutné, aby nové vakcinační prostředky byly alespoň tak účinné, jako jsou současné vakcinační prostředky, které je možné zavést injekcí. Je také nutné, aby byly obecně realizovatelné, co se týká množství antigenu a počtu nutných aplikací.
V současné době běžně dostupné vakcinační prostředky jsou buď štěpené nebo dílčí vakcinační prostředky, které se zavádějí injekcí. Tyto vakcinační prostředky se připravily poškozením virových částic, v obecném případě organickým rozpouštědlem nebo detergentem a separací nebo izolací virových proteinů do různého stupně. Štěpené vakcinační prostředky se připravily fragmentací celého viru influenzy a to buď infekčního nebo deaktivovaného s rozpouštěcími • · · · · · ·· ·· • · · koncentracemi organických rozpouštědel nebo detergenty a následným odstraněním rozpouštěcího činidla a části nebo většiny virového lipidového materiálu. Štěpené vakcinační prostředky v obecném případě obsahují kontaminující matricový protein a nukleoprotein a v některých případech nukleoprotein a někdy lipid, stejně jako membránové obalové proteiny. Štěpené vakcinační prostředky budou obvykle obsahovat většinu nebo všechny virové strukturní proteiny, ačkoliv nemusí být zastoupeny ve stejném poměru jako se vyskytují v celém viru. Dílčí vakcinační prostředky na druhou stranu v podstatě obsahují vysoce čisté virové povrchové proteiny, hemaglutinin a neuraminidázu, které jsou povrchovými proteiny odpovídajícími za vyvolání požadovaných protilátek neutralizujících virus po vakcinaci.
Řada v současné době dostupných vakcinačních prostředků vyžaduje ochranný prostředek, který brání degeneraci. Často používaným ochranným prostředkem je thiomersal, kterým je sloučenina obsahující rtuť. Účinky sloučenin obsahující rtuť se staly předmětem veřejného zájmu. Neexistuje testovací systém pro stanovení účinků nízkých a středních dávek organohydrargyriových sloučenin na vyvíjející se nervový systém. U speciálních studií, které sledují děti, kterým se aplikovaly vysoké dávky organohydrargyriových sloučenin, zbývá ještě mnoho let do dokončení. Také je zřejmé, že nelze přecházet potencionální nebezpečí aplikace vakcinačních prostředků, které obsahují thiomersal (popisuje se v publikaci Offit, P.A. JAMA Vol. 283, No. 16) . Nicméně bude výhodné najít alternativní metody přípravy vakcinačních prostředků, aby se mohl při ve výrobním postupu thiomersal nahradit. Existuje potřeba vyvinout vakcinační prostředky, které neobsahují thiomersal, zvláště vakcinační prostředky, jako jsou vakcinační prostředky proti chřipce, které se doporučují, alespoň v případě jisté části populace a aplikují se jednou v roce.
• 9 · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9
99 99 9999 99 9
Standardní praxí v současné době je použití ochranných prostředků v případě běžných deaktivovaných vakcinačních prostředků během postupu produkce/čištění a/nebo se přidávají do konečného vakcinačního prostředku. Aby se zabránilo růstu mikroorganizmů v různých fázích izolace, je nutné použít konzervační činidla. V případě vakcinačních prostředků získaných z vajec se thiomersal přidává do surové alantoické tekutiny a může se také přidat podruhé během zpracování viru. Na konci postupu je přítomen zbytkový thiomersal a jeho koncentrace se pak může upravit na požadovanou hodnotu, aby došlo k ochraně konečné. vakcíny, například na koncentraci přibližně 100 pg/ml.
Vedlejším účinkem použití thiomersalu, jako ochranného prostředku ve vakcinačních prostředcích proti chřipce, je stabilizační účinek. Thiomersal v běžných chřipkových vakcinačních prostředcích působí jako stabilizátor složky HA vakcinačního prostředku, zvláště HA kmene influenzy B. Hemaglutininy jistého kmene A, například H3, mohou také vyžadovat stabilizaci. Ačkoliv může být nutné zvažovat odstranění thiomersalu z chřipkových vakcinačních prostředků nebo alespoň snížení jeho koncentrace v konečném vakcinačním prostředku, existuje problém, který se nedá bez thiomersalu obejít, HA nebude dostatečně stabilní.
Zjistilo se, že je možné stabilizovat HA v deaktivovaných chřipkových vakcinačních prostředcích za použití alternativních činidel, které neobsahují organohydrargyriové sloučeniny. HA zůstává stabilizován tak, že je detekovatelný kvantitativními standardními metodami, zvlášrě pomocí SRD ve větším rozsahu než nestabilizovaný antigenní prostředek produkovaný stejnou metodou, ale bez stabilizační pomocné látky. Test SRD se může provést způsobem popsaným shora v textu. Je důležité, že HA zůstává stabilizován až 12 měsíců, ·· ···· ·· ·· ·· · • · · ···· ·«·
-Ί · · · ······* ι · · ·······♦ ··· • · · · ··· · · · • · · · ·· · ··· ·· · což je standardní požadavek v případě konečného chřipkové vakcinačního prostředku.
Vynález popisuje deaktivovaný virus influenzy obsahující hemaglutininový antigen stabilizovaný v nepřítomnosti thiomersalu nebo malým množstvím thiomersalu, kde hemaglutinin se detekoval testem SRD.
Malé množství thiomersalu se definuje jako množství, při kterém je stabilita HA získaného z viru influenzy kmene B snížena tak, že je pro stabilizaci HA nutné stabilizační činidlo. Nízké množství thiomersalu je v obecném případě 5 pg/ml nebo méně.
V obecném případě stabilizovaný HA znamená HA, který je detekovatelný kvantitativními standardními způsoby, zvláště SRD testem, ve větším rozsahu než nestabilizovaný antigenní přípravek produkovaný stejnou metodou, ale bez přítomnosti stabilizační pomocné látky. Stabilizace HA s výhodou udržuje aktivitu HA v podstatě konstantní v období jednoho roku. Stabilizace s výhodou umožňuje vakcíně obsahující HA poskytnout ochranu po dobu 6 měsíců, což je doba uskladnění, výhodněji po dobu jednoho roku.
Je vhodné, aby se stabilizace provedla stabilizační pomocnou látkou, s výhodou s pomocnou látkou upravující micely. Pomocná látka upravující micely je v obecném případě pomocná látka, která může být začleněna do mycel vytvořených detergenty používaných nebo vhodných pro rozpuštění membránového proteinu HA, jako jsou detergenty Tween 80, Triton X100 a deoxycholát. Tyto látky je možné použít jednotlivě nebo v kombinaci.
Věří se, že pomocné látky stabilizují HA v konečném přípravku interakcí mezi lipidy, detergenty a/nebo proteiny. Mohou se tvořit smíchané micely pomocné látky s proteinem a ··
lipidem, jako jsou micely přípravku Tween a deoxycholátu se zbytkovými lipidy a/nebo Tritonem X-100. Uvažuje se, že povrchové proteiny se udržují rozpuštěné pomocí uvedených komplexních mícel. Agregace proteinu je výhodně limitována indukovaným driftem micel, které obsahují vhodné pomocné látky, jako jsou micely obsahující negativně nabité detergenty.
Vhodné pomocné látky upravující micely zahrnují pozitivně, negativně nebo obojetně nabité amfifilické molekuly, jako jsou alkylsulfáty nebo alkylarylsulfáty, neiontové amfifilické molekuly, jako je alkylpolyglykosidy nebo jejich deriváty, jako je přípravek Plantacare® (dostupné u firmy Henkel KGaA) nebo polyalkenetery alkylalkoholu nebo jejich deriváty, jako je Laureth-9.
Výhodné pomocné látky jsou deriváty α-tokoferolu, jako je α-tokoferolsukcinát. Jiné výhodné deriváty tokoferolu vhodné pro použití podle vynálezu zahrnují D-a-tokoferol, D-δtokoferol, D-y-tokoferol a DL-a-tokoferol. Výhodné používané deriváty tokoferolu zahrnují acetáty, sukcináty, estery kyseliny fosforečné, formiáty, propionáty, butyráty, sulfáty a glukonáty. Zvláště výhodný je α-tokoferolsukcinát. Alfatokoferol nebo jeho derivát je přítomen v množství, které je dostatečné ke stabilizaci hemaglutininu.
Jiné vhodné pomocné látky se mohou identifikovat způsoby, které jsou standardní v oboru, a jejich stabilita se testuje například pomocí metody SRD.
Podstata vynálezu
Výhodné provedení vynálezu popisuje antigenní přípravek viru influenzy obsahující alespoň jeden stabilní antigen hemaglutínín kmene influenzy B.
•9 ···· ·* ·· ·« · • · * 9 · · · ··· • · · ·· ····· • · · · · · ·«·· ···· • •99 999 99 9 ·· ·· 99 9999 99 9
Vynález dále popisuje způsob přípravy stabilního antigenu hemaglutinin, který zahrnuje izolaci antigenu v přítomnosti stabilizační pomocné látky upravující micely, s výhodou atokoferolu nebo jeho derivátu, jako je α-tokoferolsukcinát.
Dále vynález popisuje vakcinační prostředky obsahující zde popsané antigenní přípravky a jejich použití pro profylaxi infekce influenzy nebo onemocnění jedince, přičemž uvedená metoda zahrnuje aplikaci vakcinačního prostředku subjektu podle vynálezu.
Vakcinační prostředek se může aplikovat libovolným vhodným způsobem, jako je intradermálně, mukozálně, například intranasálně, orálně, intramuskulárně nebo subkutánně. V oboru jsou známy i jiné způsoby aplikace.
Preferuje se intradermální zavedení. Pro intradermální zavedení se používá libovolné vhodné zařízení, jak se popisuje v patentových dokumentech USA č. 4 886 499, 5 190 521, 5 328
483, 4 270 537, 5 015 235, 5 141 496, 5 417 662. Intradermální vakcinační prostředky se mohou také aplikovat zařízeními, které omezuje účinná penetrační délka jehly při aplikaci do kůže. Tato zařízení se například popisují v patentových dokumentech WO 99/34 850 a EP 1092444 a dále se mohou použít jejich funkční ekvivalenty. Vhodné jsou také vstřikovací zařízení, které zavádějí kapalné vakcinační prostředky do dermisu prostřednictvím vstřikovací trysky nebo prostřednictvím jehly, která proniká stratům corneum a produkuje paprsek, který proniká do oblasti dermisu. Trysková vstřikovací zařízení se popisují například v patentových dokumentech USA 5 480 381, 5 599 302, 5 334 144, 5 993 412, 5
649 912, 5 569 189, 5 704 911, 5 383 851, 5 893 397, 5 466
220, 5 339 163, 5 312 335, 5 503 627, 5 064 413, 5 520 639, 4
596 556, 4 790 824 4 941 880, 4 940 460, WO 97/37 705 a WO
97/13537. Vhodné jsou také balistická zaváděcí zařízení pro • · • · · ···· ··· • · · · · · · · · · • · ··· · · · · · · · · · ···· ··· ·· · • · ·· ·· · · · · · · · prášek/částice, kde se používá stlačený plyn, aby se zrychlil průchod vakcinačního prostředku ve formě prášku přes vnější vrstvy kůže do dermisu. Navíc při klasické metodě intradermální aplikace se mohou použít běžné injekční stříkačky. Avšak použití běžných injekčních stříkaček vyžaduje odborníka a tak jsou výhodnější zařízení, které umožňují přesné zavedení i nezkušenému uživateli.
Vynález dále popisuje způsob profylaxe infekce influenzy nebo onemocnění u subjektu, který zahrnuje intradermální aplikaci subjektu vakcinačního prostředku chřipky podle vynálezu.
Vynález dále popisuje intradermální zařízení v kombinaci s vakcinačním prostředkem podle vynálezu zvláště zařízení popsaná například v patentových dokumentech WO 99/34 850 nebo EP 1092444.
Také se popisuje použití pomocné látku upravující micely při výrobě chřipkového vakcinačního prostředku, s výhodou oítokoferol nebo jeho derivát, jako hemaglutininového stabilizátoru.
Vynález se zvláště aplikuje, ale nikoli pouze, za účelem stabilizace hemaglutininu viru influenzy kmene B.
Stabilizovaný HA je s výhodou stabilní po dobu 6 měsíců, s výhodou po dobu 12 měsíců.
α-tokoferol se vyskytuje s výhodou ve formě esteru, s výhodou ve formě sukcinátu nebo acetátu a nejvýhodnější je sukcinát.
Výhodné koncentrace α-tokoferolu nebo jeho derivátu jsou v rozmezí 1 pg/ml až 10 mg/ml, výhodněji v rozmezí 10 až 500 pg/ml.
• · · · · · • · ·· · · · · · · · · • · · · · · · · · ····· ······· ··· ·· · · ······ ·· ·
Vakcinační prostředek podle vynálezu v obecném případě obsahuje antigeny viru kmene A a B, v typickém případě trivalentní prostředek dvou kmenů A a jednoho kmene B.
Vyloučeny nejsou ani divalentní a monovalentní vakcinační prostředky. Monovalentní vakcinační prostředky mohou být výhodné v případě pandemie, například kde je důležité získat velké množství vakcinačního prostředku a aplikovat ho, tak rychle, jak jen je to možné.
Přípravek antigenu neživého viru chřipky vhodného pro použití podle vynálezu se může vybrat ze skupiny obsahující štěpené virové antigenní přípravky, dílčí antigeny (buď exprimované rekombinantně nebo připravené z celého viru), deaktivovaný celý virus, který se může deaktivovat chemicky například pomocí formaldehydu, β-propiolaktonu nebo se může deaktivovat jiným způsobem, například UV zářením nebo teplem. Antigenní přípravek je s výhodou buď štěpený virový přípravek nebo dílčí antigen připravený z celého viru zvláště postupem štěpení, který následuje po izolaci povrchového antigenu. Nejvýhodnější jsou přípravky štěpeného viru.
Koncentrace antigenu hemaglutínín je v případě každého kmene přípravku viru influenzy 1 až 1 000 pg/ml, s výhodou 3 až 300 pg/ml a nej výhodnější je koncentrace přibližně 30 pg/ml, jak se stanovilo testem SRD.
Vakcinační prostředek podle vynálezu může dále obsahovat adjuvans nebo imunostimulant, který se neomezuje na detoxifikovaný lipid A z libovolného zdroje a netoxické deriváty lipidu A, saponiny a jiná činidla schopná stimulovat odezvu typu TH1.
Dlouho je známo, že enterobakteriální lipopolysacharid (LPS) je silný stimulátor imunitního systému, ačkoli jeho použití v adjuvans je omezeno jeho toxickými účinky. Netoxický derivát LPS, monofosforyllipid A (MPL) produkovaný odstraněním • · · jaderné sacharidové skupiny a fosforečnanu z redukujícího koncového glukozaminu, jak se popisuje v publikaci Ribi et al., 1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenům Publ. Corp., NY, p407-419) má následující strukturu.
Další detoxifikovaná verze MPL vznikla odstraněním acylového řetězce z polohy 3 disacharidové základní struktury a nazývá se 3-0-deacylovaný monofosforyllipid A (3D-MPL). Může se izolovat a připravuje se metodami popsanými v patentovém dokumentu GB 2122204B, která také popisuje přípravu difosforyllipidu A a jeho 3-0-deacylovaných variant.
Výhodná forma 3D-MPL je emulze, která vykazuje malou velikost částic. Průměr částic je menší než 0,2 pm a způsob výroby se popisuje v patentovém dokumentu WO 94/21292. Vodné přípravky obsahující monofosforyllipid A a povrchové aktivní činidlo se popisuje v patentovém dokumentu WO 98/43670A.
• · • · · ···· ··· • · · ·· * ···· • · · · · · · ·· ····· ······· · · · ·· ·· ······ ·· ·
Adjuvans odvozené od bakteriálního lipopolysacharidu se zavedlo do prostředku podle vynálezu a může se izolovat a zpracovávat z bakteriálních zdrojů nebo v jiném případě může být syntetické. Izolovaný monofosforyllipid A se například popisuje v publikaci Ribi et al., 1986, Immunology and
Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenům Publ.
Corp., NY, p407-419) a 3-0-deacylovaný monofosforyllipid A nebo difosforyllipid A získaný z mikroorganizmu Salmonella sp., jak se popisuje v patentovém dokumentu GB 2220211 a USA
č. 4912094. Jiné izolované a syntetické lipopolysacharidy se popisují v publikaci Hilgers et al., 1986, Int. Arch. Allergy.
Immunol., 79(4):392-6, Hilgers et al., 1987, Immunology,
60(1):141-6 a EP 0 549 074 . Bl). Zvláště výhodné bakteriální polysacharidové adjuvans je 3D-MPL.
Používané deriváty LPS podle vynálezu jsou ty imunostimulanty, které jsou podobné strukturou struktuře LPS nebo MPL nebo 3D-MPL. Ve výhodném provedení vynálezu deriváty LPS mohou být acylované monosacharidy, kterou jsou dílčí částí shora uvedené struktury MPL.
Saponiny se popisují v publikaci Lacaille-Dubois, M. and Wagner H. (1996), A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine, vol. 2, pp. 363-386. Saponiny jsou steroidní glykosidy nebo triterpenglykosidy, které se vyskytují v rostlinách a v mořských živočiších. Saponiny se zmiňují v souvislosti s tvorbou koloidních roztoků ve vodě, které při míchání pění, a v souvislosti se srážením cholesterolu. Když se saponiny dostanou do blízkosti membrány tvoří v membráně struktury podobné pórům, které způsobují praskání membrány. Vlastností jistých, ne všech, saponinů je například jev hemolýza erytrocytů.
• · • · · ·· · · · · · • · ··· · · ♦ · · · · · · • · · · · · · · · · ·« ·« ·· *··· ·· ·
Saponiny jsou známy jako adjuvans v případě vakcinačních prostředků vhodných pro systémovou aplikaci. Adjuvantní a hemolytická aktivita jednotlivých saponinů se studuje v oboru (popisuje se v publikaci Lacaille-Dubois, M. and Wagner H.
(1996), A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine, vol. 2, pp. 363-386).
Například přípravek Quil A (získaný z kůry jihoamerického stromu Quillaja Saponaria Molina)' a jeho frakce se popisují v patentovém dokumentu USA č. 5 057 540 a v publikaci „Saponins as vaccine adjuvants. Kensil, C. R., Crit. rev.
Ther. Drug Carrier Syst., 1996, 12 (1-2):1-55 a v patentovém dokumentu EP 0 362 279 Bl. Jisté struktury nazývané imunostimulační komplexy (ISCOMS) obsahující frakce přípravku
Quil A jsou hemolytická a používají se při výrobě vakcinačních prostředků (popisuje se v patentovém dokumentu Morein, B., EP
109 942 Bl, WO 96/11711, WO 96/33739) . Hemolytické saponiny
QS21 a QS17 (frakce Quil A čištěné pomocí HPLC) se popisují jako silná systémová adjuvans a způsob jejich produkce se popisuje v patentovém dokumentu USA č. 5 057 540 a EP 0 362
279. Jiné saponiny, které se používají ve studiích systémové vakcinace, se získaly z jiných druhů rostlin, jako je
Gypsophila a Saponaria (popisuje se v publikaci Bomford et al., Vaccine, 10(9): 572-577, 1992).
Zesílený systém zahrnuje kombinaci netoxického derivátu lipidu A a derivátu saponinů zvláště v kombinaci QS21 a 3DMPL, jak se popisuje v patentovém dokumentu WO 94/0053 nebo méně reaktogenní prostředek, kde QS21 je zhášený cholesterolem, jak se popisuje v patentovém dokumentu WO 96/33739.
Zvláště vhodné adjuvans zahrnující QS21 a 3D-MPL v oleji v vodní emulzi se popisuje v patentovém dokumentu WO 95/17210.
• · · · ··· 9 9 9
9 9 99 9999 9 9 9
V jednom provedení vynálezu se popisuje vakcinační prostředek obsahující antigenní přípravek influenzy podle vynálezu upravený s detoxifikovaným lipidem A nebo netoxickým derivátem lipidu A, s výhodou upravený monofosforyllipidem A nebo jeho derivátem.
Vakcinační prostředek s výhodou obsahuje saponin, výhodněji QS21.
Prostředek s výhodou obsahuje olej ve vodní emulzi. Vynález dále popisuje způsob produkce vakcinačního prostředku obsahujícího směs antigenního přípravku podle vynálezu spolu s farmaceuticky přijatelnou pomocnou látkou, jako je 3D-MPL.
Vakcinační prostředky podle vynálezu mohou dále obsahovat alespoň jednu povrchově aktivní látku. Vhodné neionogenní povrchově aktivní látky se vybraly ze skupiny zahrnující nebo nonylfenoxypolyoxyetanoly oktylfenoxypolyoxyetanoly (například běžně dostupné polyoxyetylensorbitanu (Tween<tm)) estery obecného vzorce I:
jako
Triton (tm) estery a polyoxyetylenestery nebo
HO (CH2CH2O) n-A-R (I) kde symbol n je 1 až 50, symbol A je vazba nebo skupina -C(O), symbol R je alkyl obsahující 1 až 50 atomů uhlíku nebo fenylalkyl, kdy alkyl obsahuje 1 až 50 atomů uhlíku, a kombinace dvou nebo více radikálů.
Výhodné povrchově aktivní činidla obecného vzorce I jsou molekuly, kde symbol n je 4 až 24, výhodněji 6 až 12 a nejvýhodněji 9. Symbol R je C1-50, s výhodou alkyl obsahující 4 až 20 atomů uhlíku a nejvýhodnšji alkyl obsahující 12 atomů uhlíku.
Oktylfenoxypolyoxyetanoly a polyoxyetylensorbitanestery se popisují v publikaci „Surfactant systems Eds: Attwood and
-1 /- ·· ···♦···· · · · ·· ····· • · · · · · · ·· * « · · · ···· ··· · · · ·· ·· ······ ·· ·
Florence (1983, Chapman and Halí). Octylfenoxypolyetanoly (oktoxynoly) zahrnující t-oktylfenoxypolyetoxyetanol (Triton X-100(tm)) se také popisují v publikaci Merck Index Entry 6858 (page 1162), 12th edition, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA, ISBN 0911910-12-3). Estery polyexyetylensorbitanu zahrnující polyoxyetylensorbítanmonooleát (Tween 80(tm)) se popisují v publikaci Merck Index Entry 7742 (page 1308, 12th Edition, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N. J. , USA, ISBN 0911910-2-3). Oba prostředky se mohou vyrobit za použití zde popsaných způsobů nebo je možné je získat z běžných zdrojů, například od firmy Sigma Inc..
Zvláště výhodné neinogenní povrchově aktivní činidla zahrnují Triton X-45, t-oktylfenoxypolyetoxyetanol (Triton X100), Triton X-102, Triton X-114, Triton X-165, Triton X-205, Triton X-305, Triton N-57, Triton N-101, Triton N-128, Breij 35, polyoxyetylen-9-lauryleter (laureth 9) a polyoxyetylen-9stearyleter (steareth 9) . Zvláště se používají triton X-100 a laureth 9. Zvláště výhodný je také polyoxyetylensorbitanester, polyoxyetylensorbitanmonooleát (Tween 80(tm)).
Další vhodné polyoxyetylenetery obecného vzorce I se vybraly ze skupiny obsahující polyoxyetylen-8-stearyleter, polyoxyetylen-4-lauryleter, polyoxyetylen-35-lauryleter a polyoxyetylen-23-lauryleter.
Alternativní termíny a názvy polyoxyetylenlauryleteru se popisují v CAS registru. Číslo polyoxyetylen-9-lauryleteru v CAS registru je 9002-92-0. Polyoxyetylenetery, jako je polyoxyetylenlauryleter se popisuje v publikaci Merck index (12th ed: entry 7717, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA, ISBN 0911910-12-3). Laureth 9 se vytvořil reakcí etylenoxidu s dodecylalkoholem a obsahuje v průměru devět etylenoxidových jednotek.
Dva nebo více neionogenních povrchově aktivních činidel z popsaných odlišných skupin povrchově aktivních činidel může být přítomno ve zde popsaných vakcinačních prostředcích. Zvláště výhodná je kombinace polyoxyetylensorbitanesteru, jako je polyoxyetylensorbitanmonooleát (Tween 80(tm)), a oktoxynolu, jako je t-oktylfenoxypolyetoxyetanol (Triton) X-100(tm> . Jiná zvláště výhodná kombinace neinogenních povrchově aktivních látek zahrnuje laureth 9 a polyoxyetylensorbitanester nebo oktytoxynol nebo obě látky.
Neinogenní povrchově aktivní látky, jako jsou ty popsané shora v textu, vykazují následující výhodnou koncentraci v konečném vakcinačním prostředku: polyoxyetylensorbitanestery, jako je Tween 80(tm) 0,01 až 1%, nejvýhodněji přibližně 0,1 % (hmotnost/objem) , oktylfenoxypolyoxyetanoly nebo nonylfenoxypolyoxyetanoly, jako je triton X-100tm nebo jiné detergenty v sérii tritonů: 0,001 až 0,1 %, nejvýhodněji 0,005 až 0,02 % (hmotnost/objem) , polyoxyetylenetery obecného vzorce I, jako je laureth 9: 0,1 až 20 %, s výhodou 0,1 až 10 % a nej výhodněj i 0,1 až 1 % nebo přibližně 0,5 % (hmotnost/objem).
V případě jistých vakcinačních prostředků mohou být zahrnuty ve vakcinačních prostředcích i jiné vakcinační složky. Jako takové může vakcinační prostředek obsahovat kyselinu žlučovou nebo její derivát, zvláště ve formě sole. Zahrnují například deriváty kyseliny cholové a její sole, zvláště sodné sole kyseliny cholové nebo deriváty kyseliny cholové. Příklady žlučových kyselin a jejich deriváty zahrnují kyselinu cholovou, kyselinu deoxycholovou, chenodeoxycholovou kyselinu, kyselinu lithocholovou, kyselinu ursodeoxycholovou, hyodeoxycholovou a jejich deriváty, jako je glykoderiváty, tauroderiváty, nebo amidopropyl-l-propansulf onové a amidopropyl-2-hydroxy-l-propansulfonové deriváty žlučových kyselin nebo N, N-bis (3D-glukonoamidopropyl) deoxycholamid.
• · 9 · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 · · · »9 9
99 99 9999 99 9
Zvláště výhodným příkladem je deoxycholát sodný (NaDOC), který může být přítomný v dávce vakcinačního prostředku.
Vynález dále popisuje farmaceutické sady obsahující zařízení pro aplikaci vakcinačního prostředku naplněného vakcinačním prostředkem podle vynálezu. Takové aplikační prostředky zahrnují, ale nejsou omezeny na zařízení opatřená jehlou, vstřikovací zařízení vhodná pro kapalinu, zařízení pro aplikaci práškových prostředků a spreje (vhodná pro intranasální použití).
Antigenní prostředky viru influenzy podle vynálezu se mohou získat způsobem oplodnění vajíček nebo libovolnou metodou nové generace za použití tkáňové kultury pro růst viru nebo expresi povrchových antigenu rekombinantního viru influenzy. Vhodné buněčné substráty pro růst viru zahrnují například buňky ledvin psů, jako je MDCK nebo buňky z klonů MDCK, buňky podobné MDCK, buňky opičích ledvin, jako jsou buňky AGMK zahrnující buňky Věro, vhodné prasečí buněčné linie nebo libovolný jiný typ savčích buněk vhodný pro produkci viru influenzy pro účely vakcinace. Vhodné buněčné substráty také zahrnují lidské buňky, například buňky MRC-5. Vhodné buněčné substráty se neomezují na buněčné linie, například primární buňky, jako jsou kuřecí embryonální fibroblasty.
Antigenní prostředek viru influenzy se může připravit libovolným počtem běžně dostupných aplikačních postupů, například postupem štěpení viru influenzy v patentovém dokumentu č. DD 300 833 a DD 211 444 štěpený virus influenzy se rozpouštědla/detergentu, jako je dietyleter v kombinaci s Tween(tm) (známo jako metoda štěpení „Tween-eter). Tento postup se stále používá v některých výrobních zařízení. Jiná používaná štěpící činidla zahrnují detergenty nebo proteolytické enzymy nebo sole žlučových popsaném
Tradičně použitím připravuj e tri-n-butylfosfát nebo kyselin, například deoxycholát sodný, jak se popisuje v patentovém dokumentu č. DD 155 875. Detergenty, které se mohou použít jako štěpící činidla zahrnují kationogenní detergenty, například cetyltrimetylamoniumbromid (CTAB), jiné ionogenní detergenty, jako je například laurylsulfát, taurodeoxycholát nebo neinogenní detergenty, jako jsou ty popsané shora v textu zahrnující Triton X-100 (například způsobem popsaným v publikaci Lina et al., 2000, Biologicals 28, 95-103) a Triton B-101 nebo v kombinaci libovolných dvou detergentů.
Způsob přípravy štěpených vakcinačních prostředků bude zahrnovat řadu různých filtrací a/nebo jiných separačních kroků, jako je ultracentrifugace, ultrafiltrace, zonální centrifugace a chromatografie (například chromatografie s výměnou iontů), v různých kombinacích, a může také zahrnovat krok deaktivace, například teplem, formaldehydem nebo βpropiolaktonem nebo UV zářením. Tento krok deaktivace se může provést před nebo po štěpení. Proces štěpení se může provést jako vsádkový, kontinuální nebo semikontinuální proces.
Výhodné štěpené vakcinační antigenní prostředky viru influenzy podle vynálezu obsahují zbytkové množství přípravku Tween 80 a/nebo Triton X-100 z postupu přípravy, ačkoliv se také mohou přidat nebo jejich koncentrace se může také upravit po přípravě štěpeného antigenu. Je výhodné, aby byl přítomen jak Tween 80 tak Triton X-100. Výhodné rozmezí konečných koncentrací těchto neionogenních povrchově aktivních látek v dávce vakcinačního prostředku je v případě Tween 80 0,01 až 1 % (objem/objem), v případě přípravku Triton X-100 0,001 až 0,1 % (hmotnost/objem) , výhodněji 0,005 až 0,02 % (hmotnost/objem).
V jiném případě antigenní přípravky viru influenzy podle vynálezu se mohou získat ze zdroje jiného než je živý virus
9999 • « 9 9 9 9 9 · 9 9 99 9 * · · 9999
9999 >9999999
9999 999 99 9
99 99 9999 99 9 influenzy, například antigen hemaglutinin se může připravit rekombinantně.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Příprava antigenního prostředku viru influenzy za použití a-tokoferolsukcinátu jako stabilizátoru vakcinačního prostředku, který neobsahuje konzervační činidla (vakcinační prostředek se sníženým obsahem thiomersalu)
Monovalentní štěpený vakcinační prostředek se připravil následujícím postupem.
Příprava virového inokula
V den inokulace vajíček obsahujících embryo se připravilo čerstvé inokulum smícháním pracovní očkovací dávky s fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem obsahujícím sulfát gentamycinu v koncentraci 0,5 mg/ml a hydrokortizonu v koncentraci 25 pg/ml (v závislosti na kmenu viru). Vírové inokulum se udržovalo při teplotě 2 až 8 °C.
Inokulace vajíček obsahujících embrya
V případě replikace viru se použily devět až jedenáct dnů staré vajíčka s embryem. Skořápky jsou dekontaminovány. Vajíčka se inokulovala inokulem viru o objemu 0,2 ml. Inokulovaná vajíčka se inkubovala při vhodné teplotě (závislé na virovém kmenu) po dobu 48 až 96 hodin. Nakonec inkubační doby se embrya usmrtila ochlazením a vajíčka se uchovávala po dobu 12 až 60 hodin při teplotě 2 až 8°C.
Sklizeň
Z ochlazených vajíček s embryi se shromáždila alantaoická tekutina. Z jednoho vejce se shromáždí 8 až 10 ml surové alantoické tekutiny.
• · · · · · « • · · · · · · · * ♦ • · · » · · · · · · • · · ♦ · ' · · · · ··»· ······· · · · ·· ·· ·· 9999 99 9
Koncentrace a čištění celého viru z alantoické tekutiny
1. Čištění
Shromážděná alantoická tekutina se čistila centrifugací při mírné rychlosti (rozmezí 4 000 až 14 000 g) .
2. Adsorpce
Aby se vytvořil gel CaHPO4 v čištěném shromážděném viru, přidal se 0,5 mol/1 Na2HPO4 a 0,5 mol/1 CaCl2 tak, aby se dosáhlo konečné koncentrace CaHPO4 1,5 g až 3,5 g CaHPO4 na jeden litr v závislosti na kmenu viru.
Po sedimentaci trvající alespoň 8 hodin se odstranil supernatant a sediment obsahující virus influenzy se rozpustil přidáním roztoku EDTA-Na2 v koncentraci 0,26 mol/1 v závislosti na používaném množství CaHPO4.
3. Filtrace
Resuspendovaný sediment se filtroval přes filtrační membránu 6 μπι.
4. Centrifugace v sacharidovém gradientu
Koncentrace viru influenzy se zvýšila izopyknickou centrifugací v lineárním sacharózovém gradientu (0,55% (hmotnost/objem) ) obsahujícím 100 pg/ml thiomersalu. Průtoková rychlost je 8 až 15 litrů/hodinu.
Na konci centrifugace se obsah rotoru rozdělil do čtyř různých frakcí (sacharóza se měří refraktometrem):
- frakce 1
- frakce 2 až 52 % sacharóza přibližně 52 až 38 % sacharóza frakce 3 až 20 % sacharóza* frakce 4 až 0 sacharóza
9 9 9
9 9
9 9 9
9 · ·· ♦
9 9 9·
9999 * závisí na virovém, kmenu: frakce 3 se může redukovat na 15 % sacharózu.
V případě další přípravy vakcinačního prostředku se použily frakce 2 a 3.
Frakce 3 se promyla diafiltrací s fosforečnanovým pufrem za účelem redukovat obsah sacharózy na přibližně 6 %. Virus influenzy přítomný v této ředěné frakci se shromáždil do peletu, aby se odstranily rozpuštěné nečistoty.
Pelet se resuspendoval a dobře se promíchal za účelem získání homogenní suspenze. Frakce 2 a resuspendovaný pelet frakce 3 se shromáždily a přidal se fosforečnanový pufr, aby se dosáhlo konečného objemu 40 litrů. Tento produkt je koncentrát monovalentního celého viru.
5. Centrifugace v sacharidovém gradientu s deoxycholátem sodným
Monovalentní koncentrát celého viru influenzy se aplikoval do ultracentrifugy ENI-MARK II. Rotor K3 obsahuje lineární sacharidový gradient (0,55 % (hmotnost/objem)), který se přelije gradientem deoxycholátu sodného. Během štěpení je přítomen přípravek Tween 80 až do koncentrace 0,1 % (hmotnost/objem) a v případě virů kmene B se přidá tokoferolsukcinát až do koncentrace 0,5 mM. Maximální koncentrace deoxycholátu sodného je 0,7 až 1,5 % (hmotnost/objem) a je závislá na kmenu. Průtoková rychlost je 8 až 15 litrů za hodinu.
Na konec centrifugace se obsah rotoru rozdělil do třech různých frakcí (sacharóza se měří refraktometrem). Frakce 2 se použije pro další zpracování. Obsah sacharózy v případě limitu • ♦ · · • · « · · • * · · · · • * · · · · ·· ·· ·· ·♦ ·· · • · · · • · · · · • · · · ··· φ · φ ·
MM ·· · u jednotlivých frakcí kolísá v rozmezí 47 až 18 % podle kmenů a po zhodnocení je konstantní.
6. Sterilní filtrace
Oddělená virová frakce se filtrovala přes filtrační membrány končící membránou s velikostí pórů 0,2 pm. V případě ředění se použil fosforečnanový pufr obsahující 0,025 % (hmotnost/objem) přípravku Tween 20 a (v případě virů kmene B) a (v případě virů kmene B) 0,5 mM tokoferolsukcinát. Konečný objem filtrované frakce 2 je 5-ti násobek počátečního objemu frakce.
. Deaktivace
Filtrovaný monovalentní materiál se inkuboval při teplotě 22±2°C po maximální dobu 84 hodin (v závislosti na virových kmenech, tuto inkubaci je možné zkrátit). Pak se přidá fosforečnanový pufr obsahující 0,025 % (hmotnost/objem) přípravku Tween 80 za účelem redukovat celkový obsah proteinu na maximální koncentraci 250 pg/ml. V případě virů kmenů B se aplikoval za účelem ředění fyziologický roztok upravený fosforečnanovým pufrem obsahujícím 0,025 % (hmotnost/objem) přípravku Tween 80 a 0,25 mM tokoferolusukcinát, přičemž se obsah celkového proteinu sníží na 250 pg/ml. Přidá se formaldehyd tak, aby konečná koncentrace byla 50 pg/ml a deaktivace probíhá při teplotě 20±2°C po dobu alespoň 72 hodin.
Koncentrace deaktivovaného materiálu štěpeného viru se zvýšila alespoň dvakrát v ultrafiltrační jednotce vybavené membránami acetátu celulózy s hodnotou MWCO 20 000. Materiál se následně promyl fosforečnanovým pufrem, který obsahuje 0,025 % (hmotnost/objem) přípravku Tween 80 a pak fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem, který obsahuje 0,01 % (hmotnost/objem) přípravku Tween. V případě ·· 4444 •4 4 4 4 4 4 • 4 · 4 4 4 • · 4 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 4 ·· 44 44 4444 • 4 4
4 4 4
4 4 4444 • 4 4 • 4 4 viru kmene B se při promývání používá fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem obsahujícím 0,01 % (hmotnost/objem) přípravku Tween 80 a 0,01 mM tokoferolsukcinát.
9. Konečná sterilní filtrace
Materiál po ultrafiltraci se filtroval přes filtrační membrány, které končí membránou s póry 0,2 pm. Filtrační membrány se promyly a materiál se ředil tak, aby koncentrace proteinu nepřekročila 500 pg/ml, za použití fyziologického roztoku pufrovaného fosforečnanem, který obsahuje 0,01 % (hmotnost/objem) přípravek Tween 80 a (v případě viru kmene B) 0,1 mM tokoferolsukcinát.
10.Uchovávání
Monovalentní konečná dávka se uchovávala při teplotě 2 až 8°C po maximální dobu 18 měsíců.
Stabilita
Tabulka č. 1: Porovnání obsahu HA v závislosti na čase (pg/ml) stanoveném SRD v monovalentních konečných dávkách.
Kmen Stabilizát or Po produkci 4 týdny při teplotě 30 °C 6 měsíců při teplotě 2 až 8°C 12 měsíců při teplotě 2 až 8°C
B/Yamanas tokoferols 169 139 172 ND
hi/166/98 ukcinát (zbytková rtuť 3pg/ml) (82%) (>100%)
B/Yamanas thiomersal 192 160 186 178
hi/166/98 (108pg/ml) (83%) (97%) (93%)
• « · φ φ · • · φ φ φ φ ·Φ·Φ φ φ φ • φ φ φ φ φ φ · φ φ ·« ·ΦΦ« φφ φ
B/Yamanas hi/166/98 žádná zbytková rtuť 3pg/ml) 191 122 (60%) 175 (92%) 154 (81%)
B/Johanne tokoferols 166 183 158 179
sburg/5/9 9 ukcinát (zbytková rtuť 4pg/ml) (>100%) (95%) (>100%)
B/Johanne tokoferols 167 179 158 178
sburg/5/9 9 ukcinát (zbytková rtuť 4pg/ml) (>100%) (95%) (>100%)
B/Johanne tokoferols 144 151 130 145
sburg/5/9 9 ukcinát (zbytková rtuť 3pg/ml) (>100%) (90%) (>100%)
B/Johanne thiomersal 159 ND 172 154
sburg/5/9 g * (>100%) (97%)
B/Johanne žádný 169 107 153 ON
sburg/5/9 g * * (63%) (90%)
^připravovaný podle přípravku FLUARIX(tm)z licencí, **připravovaný podle příkladu 1 bez tokoferylsukcinátu ON probíhající
ND nestanováno
9 9 9 99 • · 9 9 9 9 9
9 9 · · · · · ♦ 9
9 9 9 · · 9 9 9 9 • · 9 9* ♦ ♦ * · 9 ····
9 9 9 9 9 9 9 9 9
99 *· »999 99 9
Příklad 2: Příprava vakcinačního prostředku influenzy za použití α-tokoferolsukcinátu jako stabilizátoru pro vakcinační prostředek se sníženým obsahem thiomersalu
Monovalentní konečné Caldonia/20/99 (H1N1)IVR-116, 17 a B/Yamanashi/166/98 se v příkladu 1.
dávky třech kmenů A/New
A/Panama/2007/99 (H3N2) Resvirpřipravovaly způsobem popsaným
Hromadění
Shromáždilo se vhodné množství monovalentních konečných dávek tak, aby konečná koncentrace HA byla 30 pg/ml v případě A/New Caldonia/20/99(H1N1)IVR-116 respektive A/Panama/2007/ 99(H3N2)Resvir-17 a 39 pg/ml v případě B/Yamanashi/166/98. Přípravky Tween 80 a Tween X-100 se upravily tak, aby jejich koncentrace byla 580 pg/ml respektive 90 pg/ml. Konečný objem se upravil na 3 1 fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem. Trivalentní produkt se filtroval nakonec přes membránu tvořenou acetátem celulózy s velikostí pórů 0,8 pm za účelem získání trivalentní konečné dávky. Do každé stříkačky se naplnilo alespoň 0,5 ml trivalentní konečné dávky.
Tabulka č. 2: Porovnání obsahu HA závislém na čase, jak se
stanovilo pomocí SRD v trivalentních konečných
dávkách, které se získaly z injekčních
stříkaček.
Vakcinační prostředek kmen 0 měsíců 2 měsíce 4 měsíce 6 měsíců
chřipkový vakcinační prostředek bez stabilizátoru A/NCal/20/99 33 (32- 34) 32(31- 33) 36(34- 38) 31(30- 32)
·· ··«· «· ·* *· · • B · ···· · · · • · * · · · · · * · • · ·«·· * · · · ···· • · · » « · · ·»· ·« ·» ·· ·»·· ·« ·
A/Pan/2007/99 29 (27- 31) 31 (28- 34) 34 (32- 36) 32(31- 33)
B/Yam/166/98 36(34- 38) 33 (32- 34) 32 (30- 34) 31 (29- 33)
chřipkový vakcinační prostředek obsahuj ící stabilizátoru A/NCal/20/99 31(30- 32) 32 (31- 33) 36(34- 38) 32(31- 35)
oí- tokoferolsukci nát A/Pan/2007/99 33(30- 36) 33(30- 36) 36(35- 37) 33(31- 35)
B/Yam/166/98 37 (35- 39) 36(34- 38) 38(35- 41) 36 (33- 39)
Příklad 3: Způsob SRD používaný k měření obsahu hemaglutininu
Skleněné plotny (12,4 až 10,0 cm) jsou potažené agarózovým gelem obsahujícím koncentraci séra proti HA influenzy, která je doporučena NIBSC. Po vytvoření gelu se vytvoří do agarózy 72 prohlubní určených pro vzorky (průměr prohlubně je 3 mm) . Do každé prohlubně se nanese 10 mikrolitrů vhodného ředění referenčního vzorku a ostatních vzorků. Plotny se pak nechají inkubovat po dobu 24 hodin při teplotě místnosti (20 až 25°C) ve vlhké buňce. Pak se plotny nechají přes noc nasáknout roztokem chloridu sodného a krátce se promyjí destilovanou vodou. Gel se pak stlačí a vysuší. Když se gel úplně vysuší, destičky se barví v roztoku briliantové modře podle Coomassie po dobu 10 minut a dvakrát se odbarvují ve směsi metanolu a kyseliny octové až jasně definované obarvené zóny se stanou ·· ···· ·· ·· ·· · • · · ···· · · · • · · · · · · · · · · · · · · · · · · ···· ·«··«·· ♦ · · ·· ·· ·· ···· ·· * viditelné. Po vysušení ploten se měří průměr obarvených zón obklopujících prohlubeň s antigenem ve dvou směrech, které svírají pravý úhel. V jiném případě je možné použít zařízení, které měří povrch. Zkonstruovaly se křivky závislé na dávce, kdy se vyneslo ředění antigenu proti povrchu zón a výsledky se počítaly podle standardních metod popsaných v publikaci
Finney, D.J. (1952). Statistical Methods in Biological Assay.
London: Griffin, Quoted in: Wood, JM, et al (1977). J. Biol.
Standard. 5. 237-247) .
Příklad 4: Klinické testy chřipkového vakcinačního prostředku stabilizovaného α-tokoferolem (omezený obsah thiomersalu)
V případě klinického testování se používají injekční stříkačky získané způsobem popsaným v příkladu 2.
H3N2: A/Panama/2007/99 RESVIR-17
H1N1: A/New Caledonia/20/99 (H1N1)IVR-116
B: B/Yamanashi/166/98
Tabulka č. 3
dospělí 18 až 60 let
thio- red. thio- plus
H3N2 H1N1 B H3N2 H1N1 B
pre- vakc. GMT 47 41 111 55 37 102
titr<10( %) 10,3% 13,8 % 1,7 % 5,3 % 12,3% 8,8 %
«· · · · · ···· ·· ·
titr ^40,SPR (%) 60,3% 55,2 % 75,9 % 70,2 % 52, 6 % 75,4 %
post- vakc. stupeň sérokon verze 10,3% 13,8 % 1,7 % 5,3 % 12,3 % 8,8 %
podst. zvýšení titru protilát ky 58,6% 74,1 % 58,6 % 63,2 % 73,7 % 52,6 %
sérokonv erze (%) 58,6% 74,1 % 58,6 % 63,2 % 73,7 % 52,6%
GMT 328 525 766 324 359 588
násobek GMT 7,3 13, 0 6,9 5,9 9,8 5,9
titr^40, SPR (%) 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 %
n.d. = C.I. pro poměr p=n/N není definován, protože p*(lp)*N<9 n/N = respondéři (n) jako část počtu subjektů (sub)populace (N) , to je sérokonverze nebo podstatné zvýšení, také se popisuje v CPMAP/BWP/214/96 12.3.1997, p.l7ff.
GMT = geometrický průměr hodnoty titru, převrácená hodnota % C.I. = 95 % interval spolehlivosti
SPR = stupeň ochrany sérem: podíl subjektů s ochranným titrem před vakcinací nebo po vakcinaci ^40 • · · · · « ···· ·*♦· ···· · · · · · · • · ·· ·· ···· ·· · titr = titr HI-protilátek stupeň sérokonverze = podíl subjektů se zvýšením množství protilátek z hodnoty <10 před vakcinací na hodnotu h40 po vakcinaci násobek GMT = násobek zvýšení GMT podstatné zvýšení = podíl subjektů s titrem protilátky h 10 před vakcinací a 4 násobné zvýšení množství protilátek po vakcinaci req.= požadavky EU
Sérokonverze = negativní nebo pozitivní nebo například 4 násobné (negativní: titr <10, pozitivní: titr ^40) = podíl subjektů, kteří vykazují sérokonverzi (<10 až h40) nebo podstatné zvýšení.
Výsledky ukazují, že použitím vakcinačního prostředku je možné dosáhnout ekvivalentní ochrany jako v případě vakcinačního prostředku, který obsahuje thiomersal, jako konzervační činidlo.
Příklad 5a: Příprava antigenního přípravku viru influenzy za použití a-tokoferolsukcinátu, jako stabilizačního činidla v případě vakcinačního prostředku, který neobsahuje thiomersal
Monovalentní štěpený vakcínační prostředek se připravil podle následujícího prostupu.
Příprava virového inokula
V den inokulace vajíček obsahujících embryo se připravilo čerstvé inokulum smícháním pracovní očkovací dávky s fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem obsahujícím gentamycinsulfát v koncentraci 0,5 mg/ml a hydrokortizon • · • · v koncentraci 25 pg/ml (v závislosti na kmenu viru). Virové inokulum se udržovalo při teplotě 2 až 8 °C.
Inokulace vajíček obsahujících embrya
V případě replikace viru se použily devět až jedenáct dnů stará vajíčka s embryem. Skořápky jsou dekontaminovány. Vajíčka se inokulovala inokulem víru o objemu 0,2 ml. 60 000 inokulovaných vajíček se inkubovalo při vhodné teplotě (závislé na virovém kmenu) po dobu 48 až 96 hodin. Nakonec inkubační doby se embrya usmrtila ochlazením a vajíčka se uchovávala po dobu 12 až 60 hodin při teplotě 2 až 8°C.
Hromadění
Z ochlazených vajíček s embryi se shromáždila alantaoická tekutina. Z jednoho vejce se získá 8 až 10 ml surové alantoické tekutiny.
Zvýšení koncentrace a čištění celého viru z alantoické tekutiny
Číření
Shromážděná alantoická tekutina se čistila centrifugací při mírné rychlosti (rozmezí 4 000 až 14 000 g) .
Srážení
Saturovaný roztok síranu amonného se přidal do vyčiřeného produktu, aby se dosáhlo konečné koncentrace síranu amonného 0,5 mol/1. Po sedimentaci po dobu alespoň jedné hodiny se odstranila sraženina filtrací na filtrech, jejichž velikost pórů je v typickém případě 0,5 pm.
Filtrace
CO 9 9 · ·······
JZ · · · ·· ····· « · · · · · · · · 9999
9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 99 9 9 9 9 9
Vyčiřený surový celý virus se filtroval přes filtrační membrány končící osvědčenou sterilní membránou s velikostí pórů 0,2 pm.
Ultrafiltrace
Sterilní filtrovaný surový monovalentní celý virus se koncentroval na kazetě vybavené membránou BIOMAX(tm) s hodnotou MWCO 1 000 000 alespoň šestkrát. Koncentrovaný roztok se promyl fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem alespoň 1,8 krát.
Centrifugace v sacharidovém gradientu
Koncentrace viru influenzy se zvýšila izopyknickou centrifugací v lineárním sacharózovém gradientu (0,55% (hmotnost/objem) ) . Průtoková rychlost je 8 až 15 litrů/hodinu.
Na konci centrifugace se obsah rotoru rozdělil do čtyř různých frakcí (sacharóza se měří refraktometrem) :
- frakce 1 55 až 52 % sacharóza
- frakce 2
- frakce 3
- frakce 4 *závisí na virovém sacharózu.
přibližně 52 až 38 % sacharóza až 20 % sacharóza* až 0 % sacharóza kmenu: frakce 3 může být redukována na %
V případě další přípravy vakcinačního prostředku se použila buď pouze frakce 2 nebo frakce 2 spolu s dále čištěnou frakcí 3.
Frakce 3 se promyla diafiltrací fosforečnanovým pufrem za účelem redukovat obsah sacharózy pod 6 %. Tento krok se může • · • · ··· * · · · · ·· · · ······· ···
9 9 9 99 99 99 99 9 vypustit. Virus influenzy přítomný v této ředěné frakci se shromáždil do peletu, aby se odstranily rozpuštěné nečistoty.
Pelet se resuspendoval a dobře se promíchal za účelem získání homogenní suspenze. Shromáždily se frakce 2 a resuspendovaný pelet frakce 3 a přidal se fosforečnanový pufr, aby se dosáhlo konečného objemu 40 litrů. Tento produkt je monovalentní koncentrát celého viru.
Centrifugace v sacharidovém gradientu s deoxycholátem sodným
Koncentrát monovalentního celého viru influenzy se vnesl do ultracentrifugy ENI-MARK II. Rotor K3 obsahuje lineární sacharidový gradient (0,55 % (hmotnost/objem)), který se přelije gradientem deoxycholátu sodného. Během štěpení je přítomen přípravek Tween 80 až do koncentrace 0,1 % (hmotnost/objem) a v případě virů kmene B se přidá tokoferolsukcinát až do koncentrace 0,5 mM. Maximální koncentrace deoxycholátu sodného je 0,7 až 1,5 % (hmotnost/objem) a je závislá na kmenu. Průtoková rychlost je 8 až 15 litrů za hodinu.
Na konci centrifugace se obsah rotoru rozdělil do třech různých frakcí (sacharóza se měří refraktometrem) . Frakce 2 se použije pro další zpracování. Obsah sacharózy v případě limitu u jednotlivých frakcí kolísá v rozmezí 47 až 18 % podle kmenů a po zhodnocení je konstantní.
Sterilní filtrace
Frakce štěpeného viru se filtrovala na filtračních membránách končících membránou s velikostí pórů 0,2 pm.
V případě ředění se použil fosforečnanový pufr obsahující 0,025 % (hmotnost/objem) přípravku Tween 80 a (v případě virů kmene B) se používá 0,5 mM tokoferylsukcinát. Konečný objem filtrované frakce 2 je 5-ti násobek původního objemu frakce.
• · • 9 · 9 • 9 · · · · · · * · · 9 9 · 9 9 9 9 9 • · 9 · 9 9 9 99 9999
9999 · 9 9 99 9
99 99 9999 99 9
Deaktivace
Filtrovaný monovalentní materiál se inkuboval při teplotě 22±2°C po maximální dobu 84 hodin (v závislosti na virových kmenech, tuto inkubaci je možné zkrátit) . Pak se přidá fosforečnanový pufr obsahující 0,025 % (hmotnost/objem) přípravku Tween 80 za účelem redukovat celkový obsah proteinu na maximální koncentraci 450 pg/ml. V případě virů kmenů B se aplikoval za účelem ředění fyziologický roztok upravený fosforečnanovým pufrem obsahující 0,025 % (hmotnost/objem) přípravku Tween 80 a 0,25 mM tokoferolusukcinát, přičemž se obsah celkového proteinu sníží na 450 pg/ml. Přidá se formaldehyd tak, aby konečná koncentrace byla 100 pg/ml, a deaktivace probíhá při teplotě 20±2°C po dobu alespoň 72 hodin.
Ultrafiltrace
Koncentrace deaktivovaného štěpeného virového materiálu se zvýšila dvakrát v ultrafiltrační jednotce vybavené membránami z acetátu celulózy s hodnotou MWCO 20 000. Materiál se následně promyje fosforečnanovým pufrem obsahujícím 0,025 % (hmotnost/objem) přípravku Tween 80 a pak fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem obsahujícím 0,01 % (hmotnost/objem) přípravku Tween. V případě vírů kmenen B se za účelem promývání použil fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem obsahující 0,01 % (hmotnost/objem) přípravku
Tween 80 a 0,1 mM tokoferylsukcinát.
Konečná sterilní filtrace
Materiál po ultrafiltraci se filtroval přes filtrační membrány, které končí membránou s póry 0,2 μπι. Filtrační membrány se promyly a materiál se ředil tak, aby koncentrace proteinu nepřekročila 500 pg/ml, roztoku pufrovaného fosforečnanem, za použití fyziologického který obsahuje 0,01 % • · · · • · · · · · · · · ···· • · · · · · · · · · «· · · ·· ···· · · · (hmotnost/objem) přípravek Tween 80 a specificky v případě viru kmene B 0,1 mM tokoferylsukcinát.
Uchovávání
Monovalentní konečná dávka se uchovávala při teplotě 2 až 8°C po dobu maximálně 18 měsíců.
Stabilita
Tabulka č. 4: Porovnání obsahu HA (pg/ml) v závislosti na čase
stanoveném SRD v monovalentních konečných
dávkách.
Kmen Stabilizátor Po produkci 4 týdny při teplotě 30 °C 6 týdnů při teplotě 2 až 8°C
B/Johannes tokcferolsuk 214 196 206
burg/5/99 cinát (92%) (96%)
B/Johannes žádný 169 107 153
burg/5/99* * (63%) (90%)
**připravovaný podle příkladu 1 bez tokoferylsukcinátu
Příklad 5b: Příprava antígenního prostředku viru influenzy za použití α-tokoferolsukcinátu jako stabilizátoru v případě vakcínačního prostředku, který neobsahuje thiomersal
Výhodná odchylka způsobu popsaného v příkladu 5a je následující:
Po shromáždění celého viru následuje srážení (srážení síranem amonným). Pak následuje krok čiření, kde tekutina se čiří centrifugací při mírné rychlosti (v rozmezí 4 000 až 14 ·· · · ·· * · ·· ·· · o z- · · · ··♦····
JO ♦ · · ··«···· • · · · · · · ·· ····· • · · · · · · ··· ·· ·· ·· ···· ·« ·
000 g) . Pořadí kroku srážení a čiření je opačné ve srovnání s příkladem 5a.
Následují kroky sterilní filtrace, ultrafiltrace a ultracentrifugace (centrifugace v sacharózovém gradientu) jako v příkladu 5a. Není nutné opět zpracovávat frakce, které jsou výsledkem kroku ultracentrifugace.
Zbývající kroky postupu se popisují v příkladu 5a.
Pak postup shrnutý v tomto příkladu je následující:
hromadění srážení (síranem amonným) čiření sterilní filtrace ultrafiltrace ultracentrifugace štěpení (s výhodou deoxycholátem sodným) sterilní filtrace deaktivace ultrafiltrace konečná sterilní filtrace
Jiná výhodná verze příkladu 5a zahrnuje krok pre-fíltrace před první sterilní filtrací. V tomto případě se použije membrána, která není sterilním filtrem, ale která umožňuje odstranění nečistot, například albuminu, před sterilní filtrací. Tento krok umožňuje dosažení lepšího výtěžku. Vhodná membrána pro pre-filtraci je přibližně ta s velikostí pórů 0,8 pm až přibližně 1,8 pm, například 1,2 pm. Pre-filtrace se může použít ve schématu příkladu 5a nebo příkladu 5b.
Příklad 6: Příprava vakcinačního prostředku influenzy za použití α-tokoferolsukcinátu jako stabilizátoru v případě vakcinačního prostředku, který neobsahuje thiomersal • · · ·
• · • · ·
Monovalentní konečné dávky tří kmenů A/New Caldonia/20/99 (H1N1) IVR-116, A/Panama/2007/99 (H3N2) Resvir-17 a B/Yamanashi/166/98 se připravovaly způsobem popsaným v příkladu 5.
Hromadění
Vhodné množství monovalentních konečných dávek se shromáždilo tak, aby konečná koncentrace HA byla 30 pg/ml v případě A/New Caldonia/20/99(H1N1)IVR-116, A/Panama/ 2007/99(H3N2)Resvir-17 a respektive 36 pg/ml v případě B/Johannesburg/5/97. Koncentrace přípravku Tween 80 a Triton X-100 se upravila na hodnotu 580 pg/ml respektive 90 pg/ml. Konečný objem se upravil na 3 1 fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem. Trivalentní produkt se filtroval přes membrány končící membránou z acetát celulózy s velikostí pórů 0,8 pm za účelem získání trivalentní konečné dávky. Trivalentní konečná dávka se naplnila do injekčních stříkaček, kdy každá obsahuje alespoň objem 0,5 mi.
Tabulka č. 5: Porovnání obsahu HA (pg/ml) v závislosti na čase stanoveném SRD v trivalentních konečných dávkách.
vakcinační prostředek kmen 0 měsíců 4 týdny pří teplotě 30°C 6 měsíců při teplotě 2 až 8 °C
vakcinační prostředek influenzy bez stabilizátoru A/NCal/20/99 31 32 30
A/Pan/2007/99 31 34 33
B/Joh/5/99* 35 25 31
vakcinační prostředek A/NCal/20/99 34 35 34
• · · • ·
influenzy obsahující a-tokoferolsukcinát
A/Pan/2007/99 33 33 34
B/Joh/5/99** 29 25 28
*Prostředek je založen na cílové koncentraci 39 pg/ml. **Prostředek je založen na cílové koncentraci 34 pg/ml.
Příklad 7: Příprava antigenního přípravku viru influenzy za použití laurylsulfátu sodného jako stabilizátoru pro vakcinační prostředek bez konzervačních činidel (vakcinační prostředek s omezeným množstvím thiomersalu)
Monovalentní koncentrát celého viru kmene B/Johannesburg/5/99 se získal způsobem popsaným v příkladu 1
Centrifugace v sacharidovém gradientu s deoxycholátem sodným
Koncentrát monovalentního celého viru influenzy se aplikoval do ultracentrifugy ENI-MARK II. Rotor K3 obsahuje lineární sacharidový gradient (0,55 % (hmotnost/objem)), který se přelije gradientem deoxycholátu sodného. Během štěpení je přítomen přípravek Tween 80 až do koncentrace 0,1 % (hmotnost/objem). Maximální koncentrace deoxycholátu sodného je 0,7 až 1,5 % (hmotnost/objem) a je závislá na kmenu. Průtoková rychlost je 8 až 15 litrů za hodinu.
Na konec centrifugace se obsah rotoru rozdělil do třech různých frakcí (sacharóza se měří refraktometrem). Frakce 2 se použije pro další zpracování. Obsah sacharózy v případě limitu u jednotlivých frakcí kolísá v rozmezí 47 až 18 % podle kmenů a po zhodnocení je konstantní.
Sterilní filtrace »· ··· ·
Vzorky frakce 2 o objemu 10 ml se použily pro další zpracování. Oddělená virová frakce se filtrovala na filtračních membránách končících membránou s velikostí pórů 0,2 pm. V případě ředění se použil fosforečnanový pufr obsahující 0,025 % (hmotnost/objem) přípravku Tween 80 a 0,5 mM laurylsulfát sodný. Konečný objem filtrované frakce 2 je 5ti násobek počátečního objemu frakce.
Deaktivace
Filtrovaný monovalentní materiál se inkuboval při teplotě 22±2°C po maximální dobu 84 hodin (v závislosti na virových kmenech, tuto inkubaci je možné zkrátit) . Pak se přidá fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem obsahující 0,025 % (hmotnost/objem) přípravku Tween 80 a pak 0,5 mM laurylsulfát sodný za účelem redukovat celkový obsah proteinu na maximální koncentraci 250 pg/ml. Přidá se formaldehyd tak, aby konečná koncentrace byla 50 pg/ml a deaktivace probíhá při teplotě 20±2°C po dobu alespoň 72 hodin.
Ultracentrifugace
Koncentrace deaktivovaného štěpeného virového materiálu se zvýšila alespoň dvakrát v ultrafiltrační jednotce vybavené membránami acetát celulózy s hodnotou MWCO 20 000. Materiál se následně promyl 4 objemy fyziologického roztoku upraveného fosforečnanem, který obsahuje 0,01 % (hmotnost/objem) přípravku Tween a 0,5 mM laurylsulfát sodný.
Konečná sterilní filtrace
Materiál po ultrafiltraci se filtroval přes filtrační membrány, které končí membránou s póry 0,2 pm. Filtrační membrány se promyly a materiál se ředil tak, aby koncentrace proteinu nepřekročila 500 pg/ml, za použití fyziologického roztoku pufrovaného fosforečnanem, který obsahuje 0,01 % ·· ·♦·· • » • 9 9 9 99 9
9 · 9 9 9 9 9 9 ·
9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 99
9 9 9 9 9 9 9 9 9
99 99 9999 99 9 (hmotnost/objem) přípravek Tween 80 a 0,5 mM laurylsulfát sodný.
Uchovávání
Monovalentní konečná dávka se uchovávala při teplotě 2 až
8°C.
Tabulka č. 7: Porovnání obsahu HA v závislosti na čase (pg/ml) stanoveném SRD v monovalentních konečných dávkách.
stabilizátor po produkci 4 týdny při teplotě 30 °C
B/Johannesburg/5/99 žádný* 182 139(77%)
B/Johannesburg/5/99 laurylsulfát sodný 288 264(92%)
*připravený podle příkladu 7 bez přidání laurylsulfátu sodného
Příklad 8: Příprava antigenního prostředku viru influenzy za použití přípravku Plantacare nebo Laureth-9 jako stabilizátoru v případě vakcinačního prostředku bez konzervačních činidel (vakcinační prostředek s omezeným obsahem thiomersalu)
Monovalentní koncentrát celého viru kmene B/Yamanashi/
166/98 se získal jak se popisuje v příkladu 1.
Fragmentace
Monovalentní koncentrát celého viru influenzy se ředil tak, aby koncentrace proteinu byla 1 000 pg/ml pomocí fyziologického roztoku upraveného fosforečnanem s hodnotou pH 7,4. Přidal se přípravek Plantacare® 2000 UP nebo Laureth-9 v konečné koncentraci 1 % (hmotnost/objem). Materiál se lehce míchal po dobu 30 minut. Pak se materiál nalil na 15 % (hmotnostní) sacharózový polštář. Ultracentrifugace ·· ··· · ·« ·* ·· · • « · · » · · · · · • · « · · ····· « · « · · · · · · · ···· «··· · · · ♦ · ♦ • · ·· *· ·· ·· ·· · v Beckmanově rotoru SW 28 se provedla po dobu 2 hodiny při 25
000 ot./min. a při teplotě 20 °C.
Sterilní filtrace
Supernatant se odebral pro další zpracování. Frakce štěpeného viru se filtrovala na filtračních membránách končících membránou o velikosti pórů 0,2 pm.
Deaktivace
Za účelem snížit celkový obsah proteinu na maximální hodnotu 500 pg/ml se přidal fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem. Formaldehyd se přidal v konečné koncentraci 100 pg/ml a deaktivace probíhá při teplotě 20°C+2°C alespoň po dobu 6 dní.
Ultrafiltrace
Koncentrace přípravku Tween 80 a Triton X 100 se upravila v deaktivovaném materiálu na hodnotu 0,15 % respektive 0,02 %. Koncentrace deaktivovaného štěpeného virového materiálu se zvýšila alespoň dvakrát v ultrafiltrační jednotce vybavené acetát celulózovou membránou s hodnotou MWCO 30 000. Materiál se následně promyl 4 objemy fyziologického roztoku pufrovaného fosforečnanem.
Konečná sterilní filtrace
Materiál po ultrafiltraci se filtroval přes filtrační membrány, které končí membránou s póry o velikosti 0,2 pm. Filtrační membrány se promyly a materiál se ředil tak, aby koncentrace proteinu nepřekročila 500 pg/ml, fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem.
Uchovávání ·»·· • · • · · • ·· ··
Monovalentní konečná dávka se uchovávala při teplotě 2 až
8°C.
Tabulka č. 8: Porovnání obsahu HA v závislosti na čase (pg/ml) stanoveném SRD v monovalentních konečných dávkách.
stabilizátor po produkci 4 týdny při teplotě 30°C
B/Yamanashi/166 /98 žádný 143 98(68%)
B/Yamanashi/166 /98 Plantacare® 2000 UP 476 477 (100 %)
B/Yamanashi/166 /98 Laureth-9 468 494 (>100%)
Příklad 9: Klinické testování vakcinačního prostředku influenzy stabilizovaného α-tokoferolem (snížený obsah thiomersalu) u starých lidí prostřednictvím ID a IM aplikace
A. Příprava antigenního přípravku viru influenzy
Monovalentní štěpený vakcinační prostředek se připravil následujícím postupem.
Příprava virového inokula
V den inokulace vajíček obsahujících embryo se připravilo čerstvé inokulum smícháním pracovní očkovací dávky s fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem obsahujícím sulfát gentamycinu v koncentraci 0,5 mg/ml a hydrokortizon v koncentraci 25 pg/ml (v závislosti na kmenu viru). Virové inokulum se udržovalo při teplotě 2 až 8 °C.
Inokulace vajíček obsahujících embrya ·· φφφφ φφ φ φφφφ · φ φφφ φφ φφφ φφ φφφφ φφφφ φφφφ φφφ φφφ φφ φφ φφ φφφφ φφ φ
V případě replikace viru se použily devět až jedenáct dnů staré vajíčka s embryem. Skořápky jsou dekontaminovány. Vajíčka se inokulovala inokulem viru o objemu 0,2 ml. Inokulovaná vajíčka se inkubovala při vhodné teplotě (závislé na virovém kmenu) po dobu 48 až 96 hodin. Nakonec inkubační doby se embrya usmrtila ochlazením a vajíčka se uchovávala po dobu 12 až 60 hodin při teplotě 2 až 8°C.
Hromadění
Z ochlazených vajíček s embryi se shromáždila alantaoická • φ φφ φ φ
tekutina. Z jednoho vejce se shromáždí surové alantoické tekutiny. obvykle 8 až 10 ml
Zvýšení koncentrace a čištění celého tekutiny viru z alantoické
1. Čiření
Shromážděná alantoická tekutina se čistila centrifugací
při mírné rychlosti (rozmezí 4 000 až 14 000 g) .
2. Adsorpce
Aby se vytvořil gel CaHPO4 v čištěném shromážděném viru, přidal se 0,5 mol/1 Na2HPO4 a 0,5 mol/1 roztok CaCl2 tak, aby se dosáhlo konečné koncentrace CaHPO4 1,5 g až 3,5 g CaHPO4 na jeden litr v závislosti na kmenu viru.
Po sedimentaci trvající alespoň 8 hodin se odstranil supernatant a sediment obsahující virus influenzy se rozpustil přidáním roztoku EDTA-Na2 v koncentraci 0,26 mol/1 v závislosti na používaném množství CaHPO4.
3. Filtrace
Resuspendovaný sediment se filtroval přes filtrační membránu s velikostí pórů 6 pm.
•4 4«··
4 • 44 • 4444
4 4444 4
4 4 4 4 4 4
4 4 · 4 4«4
4 4 4 444 4·4 ·4 44 4·44 44 4
4. Centrifugace v sacharidovém gradientu
Koncentrace viru influenzy se zvýšila izopyknickou centrifugaci v lineárním sacharózovém gradientu (0,55% (hmotnost/objem)) obsahujícím 100 pg/ml thiomersalu. Průtoková rychlost je 8 až 15 litrů/hodinu.
Na konci centrifugace se obsah rotoru rozdělil do čtyř různých frakcí (sacharóza se měří refraktometrem):
- frakce 1 55 až 52 % sacharóza
- frakce 2 přibližně 52 až 38 % sacharóza
- frakce 3 38 až 20 % sacharóza *
- frakce 4 20 až 0 % sacharóza
*závisí na virovém kmenu: Frakce 3 může být redukována
sacharózu.
V případě další přípravy vakcinačního prostředku se použily pouze frakce 2 a 3.
Frakce 3 se promyla diafiltrací s fosforečnanovým pufrem za účelem redukovat obsah sacharózy pod hodntou přibližně 6 %. Virus influenzy přítomný v této ředěné frakci se shromáždil do peletu, aby se odstranily rozpuštěné nečistoty.
Pelet se resuspendoval a dobře se promíchal za účelem získání homogenní suspenze. Shromáždily se frakce 2 a resuspendovaný pelet frakce 3 a přidal se fosforečnanový pufr, aby se dosáhlo konečného objemu 40 litrů. Objem odpovídá 120 000 vajec v sádce. Tento produkt je monovalentní koncentrát celého viru.
5. Centrifugace v sacharidovém gradientu s deoxycholátem sodným ·· ·«·· ·· 9· ·· ·· · · · » · · • · · · » · · ·· · * · · · « « ······· · · · ·· ·· ······ ·· ♦
Monovalentního koncentrát celého viru influenzy se aplikoval do ultracentrifugy ENI-MARK II. Rotor K3 obsahuje lineární sacharidový gradient (0,55 % (hmotnost/objem)), který se přelije gradientem deoxycholátu sodného. Během štěpení je přítomen přípravek Tween 80 až do koncentrace 0,1 % (hmotnost/objem) a v případě virů kmene B se přidá tokoferolsukcinát až do koncentrace 0,5 mM. Maximální koncentrace deoxycholátu sodného je 0,7 až 1,5 % (hmotnost/objem) a je závislá na kmenu. Průtoková rychlost je až 15 litrů za hodinu.
Na konci centrifugace se obsah rotoru rozdělil do třech různých frakcí (sacharóza se měří refraktometrem). Frakce 2 se použije pro další zpracování. Obsah sacharózy v případě limitu u jednotlivých frakcí kolísá v rozmezí 47 až 18 % podle kmenů a po zhodnocení je konstantní.
6. Sterilní filtrace
Frakce štěpeného viru se filtrovala na filtračních membránách končících membránou s velikostí pórů 0,2 pm.
V případě ředění se použil fosforečnanový pufr obsahující 0,025 % (hmotnost/objem) přípravku Tween 80 a (v případě virů kmene B) 0,5 mM tokoferolsukcinát. Konečný objem filtrované frakce 2 je 5-ti násobek počátečního objemu frakce.
9. Deaktivace
Filtrovaný monovalentní materiál se inkuboval při teplotě 22+2°C po maximální dobu 84 hodin (v závislosti na virových kmenech, tuto inkubaci je možné zkrátit). Pak se přidá fosforečnanový pufr obsahující 0,025 % (hmotnost/objem) přípravku Tween 80 za účelem redukovat celkový obsah proteinu na maximální koncentraci 250 pg/ml. V případě virů kmene B se aplikoval za účelem ředění fyzilologický roztok upravený fosforečnanem obsahující 0,025 % (hmotnost/objem) přípravku • · · • ·· ·· ·· ·« • · • · • · « · · • · « ·· ···· • · • · · • ·· · ·
Tween 80 a 0,25 mM tokoferolsukcinát, přičemž se obsah celkového proteinu sníží na 250 pg/ml. Přidá se formaidehyd tak, aby konečná koncentrace byla 50 pg/ml a deaktivace probíhá při teplotě 20±2°C po dobu alespoň 72 hodin.
8. Ultrafiltrace
Koncentrace deaktivovaného materiálu štěpeného viru se zvýšila alespoň dvakrát v ultrafiltrační jednotce vybavené membránami acetátu celulózy s hodnotou MWCO 20 000. Materiál se následně promyl fosforečnanovým pufrem, který obsahuje 0,025 % (hmotnost/objem) přípravku Tween 80 a pak fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem, který obsahuje 0,01 % (hmotnost/objem) přípravku Tween. V případě viru kmene B se při promývání používá fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem obsahujícím 0,01 % (hmotnost/objem) přípravku Tween 80 a 0,01 mM tokoferolsukcinát.
9. Konečná sterilní filtrace
Materiál po ultrafiltraci se filtroval přes filtrační membrány, které končí membránou s póry 0,2 pm. Filtrační membrány se promyly a materiál se ředil tak, aby koncentrace proteinu nepřekročila 1 000 pg/ml, ale koncentrace hemaglutininu převyšuje koncentraci 180 pg/ml, za použití fyziologického roztoku pufrovaného fosforečnanem, který obsahuje 0,01 % (hmotnost/objem) přípravek Tween 80 a (v případě viru kmene B) 0,1 mM tokoferolsukcinát.
10. Uchovávání
Monovalentní koncová dávka se uchovávala při teplotě 2 až 8°C po dobu maximálně 18 měsíců.
B. Příprava vakcinačního prostředku viru influenzy ··«· »· φ · · · • φ φ · • · φ • * · · φ · φ · φ φ · φ · φ φφ φ φ ·· ·· · φ ·# ·
Monovalentní konečné dávky třech kmenů A/New Caldonia/20/99(H1N1)IVR-116, A/Panama/2007/99 (H3N2) Resvir-17 a B/Johannesburg/5/99 se připravily způsobem popsaným v části A shora v textu.
Hromadění • · • · · • ·· ·
Shromáždilo se vhodné množství monovalentních konečných dávek tak, aby konečná koncentrace HA byla 60 pg/ml v případě kmenů A/New Caldonia/20/99(H1N1)IVR-116 respektive A/Panama/2007/99(H3N2)Resvir-17 a 68 pg/ml v případě B/Johannesburg/5/99. Přípravky Tween 80, Tween X-100 tokoferolsukcinát se upravily tak, aby jejich koncentrace byla 1 000 pg/ml, 110 pg/ml respektive 160 pg/ml. Konečný objem se upravil na 3 1 fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem. Trivalentní produkt se filtroval nakonec přes membránu tvořenou acetátem celulózy s velikostí pórů 0,8 pm za účelem získání trivalentní konečné dávky. Do každé injekční stříkačky se naplnilo alespoň 0,5 ml trivalentní konečné dávky.
Aplikace vakcinačního prostředku
Vakcinačný prostředek je dostupný v předem naplněné injekční stříkačce a aplikoval se intradermálně do deltové oblasti. Používá se intradermální jehla (ID) popsaná v patentovém dokumentu EP 1092444 s penetračním omezovačem, který zaručuje správnou intradermální aplikaci. Protože tvorba boule v místě aplikace injekce demonstruje správnou aplikaci ID, pak je možné 30 minut po aplikaci měřit skutečnou velikost uvedené boule.
Jedna dávka o objemu 100 pl obsahovala následující složky:
hemaglutinin ze tří kmenů influenzy
A/New Caledonia/20/99 6,0 pg
·· ··♦· ·« ·· ·♦ · • « · · · · · · · · • « · · · 9 ···· • · · · t · · ·· · *· · · ······· ·«· ·« 99 ·· ···· ·» ·
A/Panama/2007/99 6, 0 pg
B/Johannesburg 5/99 6,0 pg
konzervační činidlo thiomersal 0,4 pg-0,8 pg
Shora uvedený vakcinační prostředek se porovnával se standardním trivalentním štěpeným vakcinačním prostředkem influenzy Fluarixítm) . Vakcinační prostředek Fluarix se dodává v předem naplněných injekčních stříkačkách a aplikoval se intramuskulárně do deltového svalu. Použila se jehla o délce alespoň 2,5 cm (23 gauge), aby se zaručila správná intramuskulární aplikace.
Jedna dávka (0,5 ml) obsahovala následující složky:
hemaglutinin ze tří kmenů influenzy
A/New Caledonia/20/99 15,0 pg
A/Panama/2007/99 15,0 pg
B/Johannesburg 5/99 15,0 pg
konzervační činidlo thiomersal 50,0 pg
Výsledky
Průměrný věk celkové kohorty v době aplikace vakcinačního prostředku byl 70,4±6,2 let. Poměr žen k mužům byl 1,7:1.
Výsledky imunogennosti: Analýza proměnných imunogennosti byla následuj ící:
proměnné Flu-red ID (N=65) Fluarix(tm) IM (N=65)
GMT GMT LL UL GMT LL UL
A/New Caledonia před 99,5 76, 9 128,7 90,0 70, 1 115,7
9« ··«« ·· ·· 9
9« · «999 999 * 99 9 9999 ·« 9999 9999 9999
9999 999 99 9 ·9 99 99 99 99 9
PO 165,1 129,2 211,0 174,3 133,3 227,9
A/Panama před 75,5 54,7 104,2 69,2 51, 9 92,4
po 128,6 99,1 166,8 164,3 126, 0 214,1
B/Johannesburg před 236,0 187,7 296,8 222,6 176, 9 280,2
PO 341,2 276,0 421,7 402,4 312,1 518,9
stupeň sérokonverze O, *0 LL UL O, *o LL UL
A/New Caledonia 15, 4 7,6 26, 5 18,5 9,9 30,0
A/Panama 20,0 11,1 31,8 29,2 18, 6 41,8
B/Johannesburg 9,2 3,5 19,0 16, 9 8,8 28,3
Faktor konverze GMR LL UL GMR LL UL
A/New Caledonia 1,7 1,4 2,0 1,9 1,6 2,3
A/Panama 1,7 1,4 2,1 2,4 1,9 3,0
B/Johannesburg 1,4 1,2 1,7 1,8 1,5 2,1
stupeň ochrany sérem Q. o LL UL O. Ό LL UL
A/New Caledonia před 87,7 77,2 94,5 90,8 81,0 96, 5
po 92,3 83,0 97,5 96, 9 89, 3 99, 6
A/Panama před 75,4 63, 1 85,2 81,5 70,0 90,1
po 90,8 81,0 96, 5 93,8 85,0 98,3
B/Johannesburg před 98,5 91,7 100,0 96, 9 89,3 99,6
PO 100,0 94,5 100, 0 98,5 91,7 100,0
·· ···· •· ·· ·· · • · · · · · · · · · ··· · · · · · · · • · ···· · · · · ···* ···· ··· ·· ·
N: počet subjektů s dostupnými výsledky, %: procento subjektů s daným parametrem, LL/UL: nižší a vyšší limit 95% Cl, Před: v čase aplikace vakcinačního prostředku, po: 21 dní po vakcinační dávce
Bolest v místě aplikace, zaznamenalo 10 ze 65 (15,4%) subjektů, byl nejběžnější symptom po IM aplikaci prostředku Fluarix(tm). V ID skupině bolest zaznamenaly 3 z 65 (4,6%) subjektů. Tento rozdíl byl statisticky podstatný (p=0,038, Fišerův exaktní test). Výhodné je ID zavedení produktu s omezeným obsahem thiomersalu.
Závěry
100 % ochrany sérem u starých lidí se může dosáhnout jak ID tak IM aplikací vakcinačního prostředku influenzy s redukovaným obsahem thiomersalu.
U jedinců vakcinovaných IM a ID, kde skupině ID se aplikovalo 2,5 krát méně antigenu, se dosáhlo porovnatelné odezvy na vakcinaci, co se týče hodnot geometrického průměru titrů, stupně ochrany sérem, stupně sérokonverze a konverzních faktorů. Neexistuje rozlišitelný rozdíl ve všech výskytech symptomů spojených s vakcinaci v obou skupinách.
Příklad 10: Intradermální zavedení vakcinačního prostředku influenzy s omezeným obsahem thiomersalu
Imunogennost vakcinačního prostředku štěpeného viru influenzy s redukovaným obsahem thiomersalu připraveného způsobem popsaným v příkladu 9 (s tou výjimkou, že hromadění se provedlo nezávisle a vakcinační prostředek se neplnil do injekčních stříkaček) se hodnotila ID zavedením do morčat za použití standardní jehly.
• · · · ·· · • · · · • · ··· · · · ···· • · ··· · · ·· ···· ······· ·· · • · ·· ······ · · ·
Každá skupina obsahující 5 zvířat se primárně imunizovala celým deaktivovaným trivalentním virem influenzy obsahující 5 pg každého HA v celkovém objemu 200 pl. Dvacet osm dní po primární imunizaci se zvířata vakcinovala buď intradermálně nebo intramuskulárně. Intradermální dávky obsahující 0,1, 0,3 nebo 1,0 pg trivalentního štěpeného viru influenzy s redukovaným obsahem thiomersalu v 0,1 ml se aplikovaly do zad morčat za použití standardní jehly. Intramuskulární dávka obsahující 1,0 pg trivalentního štěpeného viru influenzy s omezeným obsahem thiomersalu se aplikovala do zadní nohy morčete v objemu 0,1 ml. Skupiny byly následující.
Skupina 1: 0,1 pg influenzy s trivalentního ID redukovaným obsahem štěpeného thiomersalu viru
Skupina 2: 0,3 pg trivalentního ID štěpeného viru
influenzy s redukovaným obsahem thiomersalu
Skupina 3: 1,0 pg trivalentního ID štěpeného viru
influenzy s redukovaným obsahem thiomersalu
Skupina 4: 1,0 pg trivalentního IM štěpeného viru
influenzy s redukovaným obsahem thiomersalu
Čtrnáct dní po vakcinaci se zvířata nechala vykrvácet a titry protilátek vyvolaných vakcinaci se hodnotily za použití standardního hemaglutinačního inhibičního testu (HI). Výsledky jsou zobrazeny na obrázku č. 1. Vakcinaci se vyvolaly silné HI odezvy na všechny tři kmeny. Není jasná odezva na dávku, což naznačuje, že velmi nízké dávky antigenu s redukovaným množstvím thiomersalu mohou stále vyvolat velmi silnou HI protilátkovou odezvu, když se aplikují ID způsobem. Neexistuje podstatný rozdíl mezi HI titry vyvolanými ID nebo IM vakcinaci. Pak výsledky získané v případě morčat potvrzují, že antigeny trivalentních štěpených virů influenzy s redukovaným obsahem thiomersalu vyvolávají podobný stupeň HI protilátek u • · · ·
zvířat, když se zavádějí ID způsobem ve srovnání s IM způsobem.
Příklad 11: Intradermální zavedení vakcinačního prostředku influenzy upraveného pomocnou látkou obsahujícího redukované množství thiomersalu
Protokol
Morčata se primárně intranasálně imunizovala v den 0 pěti mikrogramy trivalentního celého deaktivovaného viru influenzy v objemu 200 pl.
Vakcinace proběhla v den 28 vakcinačním prostředkem obsahujícím 0,1 pg HA jednoho kmene trivalentního štěpeného viru influenzy připraveného způsobem popsaným v příkladu 9 (konečná koncentrace každého antigenu v dané dávce 0,1 pg ve 100 pl je 1,0 pg/ml ve srovnání s 60 pg/ml uvedenými v příkladu 9). Konečný trivalentní prostředek se aplikoval intradermálně za použití tuberkulínových injekčních stříkaček v objemu 100 pl. Vakcinační prostředek je buď upraven adjuvans nebo není upraven adjuvans.
Vykrvácení zvířat - den 42.
Účinek úpravy adjuvans se hodnotil měřením protilátkových odezev HI testem (den 0, 28, 42).
Všechny ID experimenty se provedly za použití standardní jehly.
Výsledky
G1 až G5 odpovídá 5-ti skupinám morčat, kdy každá skupina obsahuje 5 zvířat.
G1 štěpený trivalentní vakcinační prostředek s redukovaným množstvím thiomersalu 0,1 pg.
• · · · · · • · ·
G2
G3
G4
G5 • · · · · · · ·· ····· ···· ··· ·· · ·· · · · · ···· ·· · štěpený trivalentní vakcinační prostředek s redukovaným množstvím thiomersalu 0,1 pg + 3D-MPL 50 pg.
štěpený trivalentní vakcinační prostředek s redukovaným množstvím thiomersalu 0,1 pg + 3D-MPL 10 pg.
štěpený trivalentní vakcinační prostředek s redukovaným množstvím thiomersalu 0,1 pg + 3D-MPLin 50 pg + QS21 50 pg.
štěpený trivalentní vakcinační prostředek s redukovaným množstvím thiomersalu 0,1 pg + 3D-MPLin 10 pg + QS21 10 pg.
Poznámka 3D-MPLin+QS21 znamená adjuvantní prostředek, který obsahuje unilamelární vesikuly obsahující cholesterol, které mají lipidovou dioleoylfosfatidylcholin, kde s lipidovou dvojvrstvou nebo dvojvrstvu QS21 a 3D-MPL obsahuj ící je spojen jsou v ní uloženy. Takové adjuvantní prostředky se popisují v patentovém dokumentu EP 0 822 831 B.
HI titry proti kmenu A/New Caledonia/20/99
NC Pre-imunizace pre-vakcinace post-vakcinace
G1 5 10 92
G2 5 10 70
G3 5 11 121
G4 7 9 368
G5 5 10 243
HI titry proti kmenu A/Panama/2007/99 • · · · · · • · ·
P pre-imunizace pre-vakcinace pre-vakcinace
G1 5 485 7760
G2 5 279 7760
G3 5 485 8914
G4 7 485 47051
G5 5 320 17829
HI titry proti kmenu B/Johannesburg/5/99
J pre-imunizace post-vakcinace post-vakcinace
G1 5 23 184
G2 5 11 121
G3 5 11 70
G4 6 15 557
G5 5 13 320
Pak upravený i neupravený trivalentní štěpený vakcinační prostředek influenzy s redukovaným obsahem thiomersalu je silný imunogen a je schopný vyvolat silné HI odezvy, když se aplikuje ID nebo IM způsobem. Tyto odezvy se jeví být alespoň tak silné, jako jsou odezvy vyvolané standardním vakcinačním prostředkem Fluarix.
Příklad 12: Porovnání vakcinačních prostředků, které obsahují a neobsahují thiomersal, zavedených intradermálně prasatům • · · · • · ·· ·
Za účelem hodnocení imunogennosti štěpeného vakcinačního prostředku influenzy (obsahující a neobsahující thiomersal) aplikovaného ID způsobem se použil model primárně imunizovaných prasat. Velká většina populace už měla zkušenosti alespoň s infekcí viru influenzy, proto vakcinační prostředek musí být schopný zesílit už existující imunitní odezvu. Zvířata jsou proto primárně imunizována, aby se co nejlépe simulovala situace u člověka.
V tomto imunizovala obsahuje 5 způsobem.
experimentu intranasální zvířat, se se 4 týdny stará selata primárně cestou. Šest skupin, kdy každá primárně imunizavalo následujícím
Skupina 1 se primárně imunizovala dvakrát v den 0 a 14 trivalentním celým deaktivovaným virem (50 pg každého HA).
Skupina 2 se primárně imunizovala dvakrát v den 0 a 14 trivalentním celým deaktivovaným virem (50 pg každého HA) .
Skupina 3 se primárně imunizovala jednou v den 0 trivalentním celým deaktivovaným virem (50 pg každého HA) . Skupina 4 se primárně imunizovala dvakrát v den 0 a 14 trivalentním celým deaktivovaným virem (50 pg každého HA).
dní po konečné primární imunizaci se zvířatům intradermálně aplikoval vakcinační prostředek obsahující 3 pg každého HA trivalentního štěpeného antigenního prostředku (kmeny A/New Caledonia H1N1, A/Panama H3N2 a B/Johannesburg) ve 100 pl, prostředek thiomersal.
Skupině 1 se aplikoval standardní vakcinační Fluarix(tm) obsahující konzervační činidlo
Všem ostatním skupinám se aplikoval antigenní prostředek, který neobsahuje konzervační činidlo.
HI výsledky získané v tomto experimentu jsou zobrazeny na Obr. 2 (ínhibiční titry proti hemaglutininu viru influenzy vyvolané u prasat primárně imunizovaných různými dávkami antígenu a vakcinované 3 pg trivalentním antigenním
9999 • · · ·· ·9 • · · · 1 • · · 9 * · · · · · · · V ···· 9 9 9 9 9 9 » 9·· prostředkem influenzy obsahujícím nebo neobsahujícím thiomersal intradermálním způsobem).
HI titry vyvolané v tomto experimentu proti kmenu B jsou relativně nízké a pozadí proti kmenu A/H3N2 je vysoké. Výhodný účinek, co se týká odezvy na vakcinaci, se pozoroval po snížení dávky primární imunizace. Skoro ve všech případech snížení koncentrace antigenu nebo počtu dávek primární imunizace (ze dvou primárních imunizací 50 pg) vede k zesílení odezvy na vakcinaci. Zatímco odezva zvířat ve skupinách 1 a 2, která se primárně imunizovaly dvakrát dávkou 50 pg, na vakcinaci není tak evidentní, zdá se, že antigenní prostředek neobsahující konzervační činidlo (skupina 2) funguje za uvedených podmínek alespoň stejně dobře jako standardní vakcinační prostředek Fluarix(tm) (skupina 1) . Silná odezva na vakcinaci trivalentním antigenním prostředkem influenzy, který neobsahuje konzervační činidlo, aplikovaný ID způsobem u zvířat, která jsou alternativně primárně imunizovány (skupina 3 až 6), je zřejmý a tuto odezvu je možné pozorovat dokonce v případě kmene B, ačkoliv HI titry zůstávají nízké.

Claims (13)

  1. PATENTOVÉ
    NÁROKY
    32<s
    1. Prostředek deaktivovaného viru influenzy, vyznačující se tím, že obsahuje antigen hemaglutinin stabilizovaný v nepřítomnosti thiomersalu nebo v přítomnosti jeho malého množství, kde hemaglutinin se detekuje SRD testem, přičemž prostředek obsahuje množství α-tokoferolsukcinátu, které je dostatečné pro stabilizaci HA.
  2. 2. Prostředek deaktivovaného viru influenzy podle nároku 1, vyznačující se tím, že a-tokoferolsukcinát je přítomen v koncentraci 1 pg/ml až 10 mg/ml.
  3. 3. Prostředek deaktivovaného viru influenzy podle nároku 2, vyznačující se tím, že a-tokoferolsukcinát je přítomen v koncentraci 10 až 500 pg/ml.
  4. 4. Prostředek deaktivovaného viru influenzy podle libovolného z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že antigenní prostředek viru influenzy se vybral ze skupiny zahrnující štěpené virové antigenní prostředky, dílčí antigeny, chemicky nebo jinak deaktivovaný celý virus.
  5. 5. Prostředek deaktivovaného viru influenzy podle nároku 4, vyznačující se tím, že antigenní prostředek influenzy je štěpený virový antigenní prostředek.
  6. 6. Prostředek deaktivovaného viru influenzy podle libovolného z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že obsahuje hemaglutinin kmene A a B.
    99 9999
    9 9 9 9 9 9 9 9 9
    9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9999 9999 999
    9 9 9 9 9 9 9 9 9
    9 9 9 9 99 9999 9 9 9
    Ί. Prostředek deaktivovaného viru influenzy podle nároku 6, vyznačující se tím, že je trivalentním prostředkem viru chřipky.
  7. 8. Prostředek deaktivovaného viru influenzy podle libovolného z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že obsahuje stabilizovaný HA viru influenzy kmene B.
  8. 9. Vakcína proti chřipce, vyznačující se tím, ž e obsahuje prostředek viru influenzy podle libovolného z nároků 1 až 8.
  9. 10. Vakcína proti chřipce podle nároku 9, vyznačuj ící setím, že koncentrace antigenu hemaglutinin v případě jednoho kmene influenzy nebo každého kmene influenzy je 1 až 1 000 pg/ml, jak se stanovilo SRD testem.
  10. 11. Vakcína proti chřipce podle nároku 9 nebo 10, vyznačující se tím, že navíc obsahuje adj uvans.
  11. 12. Způsob přípravy stabilního antigenu hemaglutinin, vyznačující se tím, že zahrnuje čištění antigenu v přítomnosti α-tokoferolu nebo jeho derivátu, jako je α-tokoferolsukcinát.
    Způsob profylaxe chřipkové infekce nebo subjektu, vyznačující se tím, aplikaci vakcíny subjektu podle libovolného onemocnění u ž e zahrnuje z nároků 9 až
    11.
  12. 14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, ž e zavedení vakcíny je intradermální, intranasální, intramuskulární, orální nebo subkutánní.
  13. 15. Použití α-tokoferolu nebo sukcinátu jako stabilizátoru hemaglutininu při výrobě vakcíny proti chřipce.
CZ20033253A 2001-05-30 2002-05-29 Prostredek deaktivovaného viru influenzy a vakcína s jeho obsahem CZ298697B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0113083A GB0113083D0 (en) 2001-05-30 2001-05-30 Novel compounds
GB0204116A GB0204116D0 (en) 2002-02-21 2002-02-21 Novel vaccine composition

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20033253A3 true CZ20033253A3 (cs) 2004-04-14
CZ298697B6 CZ298697B6 (cs) 2007-12-27

Family

ID=30445235

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20033253A CZ298697B6 (cs) 2001-05-30 2002-05-29 Prostredek deaktivovaného viru influenzy a vakcína s jeho obsahem

Country Status (30)

Country Link
US (2) US7316813B2 (cs)
EP (3) EP2495314A1 (cs)
JP (1) JP4074582B2 (cs)
KR (1) KR100871021B1 (cs)
CN (2) CN1279165C (cs)
AR (1) AR036039A1 (cs)
AT (1) ATE420159T1 (cs)
AU (2) AU2006200742C9 (cs)
BR (1) BRPI0210076B8 (cs)
CA (1) CA2448208C (cs)
CO (1) CO5540349A2 (cs)
CY (1) CY1108930T1 (cs)
CZ (1) CZ298697B6 (cs)
DE (1) DE60230760D1 (cs)
DK (1) DK1407008T3 (cs)
ES (1) ES2318020T3 (cs)
FR (1) FR13C0072I1 (cs)
HK (1) HK1067891A1 (cs)
HU (1) HU229368B1 (cs)
IL (2) IL158931A (cs)
MX (1) MXPA03010944A (cs)
MY (1) MY134424A (cs)
NO (1) NO335212B1 (cs)
NZ (1) NZ529755A (cs)
PL (1) PL206435B1 (cs)
PT (1) PT1407008E (cs)
SI (1) SI1407008T1 (cs)
TW (1) TWI228420B (cs)
WO (1) WO2002097072A2 (cs)
ZA (1) ZA200309250B (cs)

Families Citing this family (111)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2383105C (en) * 1999-09-24 2010-01-26 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Intranasal influenza virus vaccine
GB9923176D0 (en) 1999-09-30 1999-12-01 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
US20100221284A1 (en) * 2001-05-30 2010-09-02 Saech-Sisches Serumwerk Dresden Novel vaccine composition
MY134424A (en) * 2001-05-30 2007-12-31 Saechsisches Serumwerk Stable influenza virus preparations with low or no amount of thiomersal
JP4617300B2 (ja) 2003-02-25 2011-01-19 メディミューン，エルエルシー インフルエンザワクチン組成物を生成する方法
US20060110406A1 (en) 2003-02-25 2006-05-25 Medimmune Vaccines, Inc. Refrigerator-temperature stable influenza vaccine compositions
ES2386272T3 (es) 2004-09-09 2012-08-16 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh Reducción de riesgos iatrogénicos potenciales asociados a las vacunas antigripales
EP2769735B1 (en) * 2004-10-06 2017-04-19 MedImmune, LLC Refrigerator-temperature stable influenza vaccine compositions
AU2005314563B2 (en) 2004-11-03 2011-06-30 Seqirus UK Limited Influenza vaccination
US9161905B2 (en) * 2005-01-12 2015-10-20 Ocular Research Of Boston, Inc. Dry eye treatment
KR20070116650A (ko) * 2005-03-23 2007-12-10 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 조성물
NZ565512A (en) * 2005-08-02 2011-08-26 Novartis Vaccines & Diagnostic Reducing interference between oil-containing adjuvants and surfactant-containing antigens
ATE494906T1 (de) 2005-11-01 2011-01-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Von zellen stammende virale impfstoffe mit geringen mengen an rest-zell-dna
US11707520B2 (en) 2005-11-03 2023-07-25 Seqirus UK Limited Adjuvanted vaccines with non-virion antigens prepared from influenza viruses grown in cell culture
AU2006310163B2 (en) 2005-11-04 2011-09-15 Seqirus UK Limited Influenza vaccine with reduced amount of oil-in-water emulsion as adjuvant
JP2009514838A (ja) 2005-11-04 2009-04-09 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル 細胞培養物において増殖されたインフルエンザウイルスから調製された非ビリオン抗原を含むアジュバントワクチン
DE202006021242U1 (de) * 2005-11-04 2014-01-29 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Emulsionen mit freiem wässrigen Phasen Tensid als Adjuvans für Spalt-Grippeimpfstoffe
CN102755645A (zh) 2005-11-04 2012-10-31 诺华疫苗和诊断有限公司 佐剂配制的包含细胞因子诱导剂的流感疫苗
ES2377884T3 (es) 2005-11-04 2012-04-02 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Vacunas contra la gripe que incluyen combinaciones de adyuvantes particulados e inmunopotenciadores
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
DK2478916T3 (da) 2006-01-27 2020-06-15 Seqirus Uk Ltd Influenzavacciner indeholdende hæmagglutinin og matrixproteiner
CA2646349A1 (en) * 2006-03-24 2007-10-04 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co Kg Storage of influenza vaccines without refrigeration
US20100015168A1 (en) 2006-06-09 2010-01-21 Novartis Ag Immunogenic compositions for streptococcus agalactiae
SI2422810T1 (sl) 2006-07-17 2015-01-30 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Influenčno cepivo
WO2008009309A1 (en) 2006-07-17 2008-01-24 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Influenza vaccine
GB0614460D0 (en) 2006-07-20 2006-08-30 Novartis Ag Vaccines
ES2694805T7 (es) 2006-09-11 2021-10-21 Seqirus Uk Ltd Fabricación de vacunas contra virus de la gripe sin usar huevos
US9481912B2 (en) 2006-09-12 2016-11-01 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences in biological samples
US8080645B2 (en) 2007-10-01 2011-12-20 Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc Biological specimen collection/transport compositions and methods
US8652782B2 (en) 2006-09-12 2014-02-18 Longhorn Vaccines & Diagnostics, Llc Compositions and methods for detecting, identifying and quantitating mycobacterial-specific nucleic acids
US8097419B2 (en) 2006-09-12 2012-01-17 Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc Compositions and method for rapid, real-time detection of influenza A virus (H1N1) swine 2009
SI2086582T1 (sl) 2006-10-12 2013-02-28 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Cepivo, ki obsega emulzijo olja v vodi kot adjuvans
SG177141A1 (en) 2006-12-06 2012-01-30 Novartis Ag Vaccines including antigen from four strains of influenza virus
PE20090146A1 (es) 2007-04-20 2009-03-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicion inmunogenica contra el virus influenza
EP2185191B1 (en) 2007-06-27 2012-09-12 Novartis AG Low-additive influenza vaccines
US9683256B2 (en) 2007-10-01 2017-06-20 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Biological specimen collection and transport system
US11041215B2 (en) 2007-08-24 2021-06-22 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc PCR ready compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences
US10004799B2 (en) 2007-08-27 2018-06-26 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Composite antigenic sequences and vaccines
AU2008293504B2 (en) 2007-08-27 2012-04-12 Longhorn Vaccines & Diagnostics, Llc Immunogenic compositions and methods
RU2496519C2 (ru) * 2007-08-28 2013-10-27 Бакстер Интернэшнл Инк. Способ получения препарата, содержащего вирусные антигены, и применение препарата
US11041216B2 (en) 2007-10-01 2021-06-22 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Compositions and methods for detecting and quantifying nucleic acid sequences in blood samples
DK2535428T3 (en) 2007-10-01 2015-11-23 Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc Biological prøvesamlings- and transport system, and methods of using
GB0810305D0 (en) 2008-06-05 2008-07-09 Novartis Ag Influenza vaccination
GB0818453D0 (en) 2008-10-08 2008-11-12 Novartis Ag Fermentation processes for cultivating streptococci and purification processes for obtaining cps therefrom
WO2009081172A1 (en) * 2007-12-24 2009-07-02 Novartis Ag Assays for adsorbed influenza vaccines
US8506966B2 (en) 2008-02-22 2013-08-13 Novartis Ag Adjuvanted influenza vaccines for pediatric use
CN101998990B (zh) 2008-03-18 2013-11-27 诺华股份有限公司 流感病毒疫苗抗原制备方法的改进
HUE026586T2 (hu) 2008-04-16 2016-06-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vakcina
EP2361304A2 (en) 2008-11-05 2011-08-31 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Novel method
EA201171032A1 (ru) 2009-02-10 2012-02-28 Новартис Аг Схемы лечения с помощью вакцины против гриппа, связанного с пандемическими штаммами
US20120093860A1 (en) * 2009-02-10 2012-04-19 Novartis Ag Influenza vaccines with increased amounts of h3 antigen
JP5642712B2 (ja) 2009-02-10 2014-12-17 ノバルティス アーゲー 少ない量のスクアレンを含むインフルエンザワクチン
USH2284H1 (en) 2009-04-27 2013-09-03 Novartis Ag Vaccines for protecting against influenza
KR101800245B1 (ko) 2009-05-21 2017-11-22 노파르티스 아게 비-내인성 ｐｏｌ ｉ 프로모터를 사용하는 역 유전학
AU2010270722B2 (en) 2009-07-06 2015-06-04 Variation Biotechnologies, Inc. Methods for preparing vesicles and formulations produced therefrom
CA2803282C (en) 2009-07-06 2018-05-01 David E. Anderson Methods for preparing vesicles and formulations produced therefrom
WO2011012999A1 (en) 2009-07-31 2011-02-03 Novartis Ag Reverse genetics systems
KR20120081587A (ko) 2009-09-10 2012-07-19 노파르티스 아게 기도 질병에 대한 조합 백신
EP2491117B2 (en) 2009-10-20 2017-06-28 Novartis AG Improved reverse genetics methods for virus rescue
GB0918830D0 (en) * 2009-10-27 2009-12-09 Glaxosmithkline Biolog Niederl Process
GB0919117D0 (en) 2009-10-30 2009-12-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Process
DE102009056871A1 (de) 2009-12-03 2011-06-22 Novartis AG, 4056 Impfstoff-Adjuvantien und verbesserte Verfahren zur Herstellung derselben
DE102009056883B4 (de) 2009-12-03 2012-08-16 Novartis Ag Impfstoff-Adjuvantien und verbesserte Verfahren zur Herstellung derselben
CN102740832B (zh) 2009-12-03 2016-01-13 诺华股份有限公司 就微流化排列交互作用和背压室
EA025622B1 (ru) 2009-12-03 2017-01-30 Новартис Аг Способ получения содержащей сквален эмульсии масла
DE102009056884B4 (de) 2009-12-03 2021-03-18 Novartis Ag Impfstoff-Adjuvantien und verbesserte Verfahren zur Herstellung derselben
CA2782511C (en) 2009-12-03 2013-11-12 Novartis Ag Circulation of components during homogenization of emulsions
AU2011224245B2 (en) 2010-03-11 2014-12-04 Immune Design Corp. Vaccines for influenza
EP2566323A2 (en) 2010-05-06 2013-03-13 Novartis AG Organic peroxide compounds for microorganism inactivation
ES2597158T5 (es) 2010-05-12 2020-03-26 Novartis Ag Procedimientos mejorados para preparar escualeno
CA2800150C (en) 2010-05-21 2018-09-04 Novartis Ag Influenza virus reassortment method
CA2801151A1 (en) 2010-06-01 2011-12-08 Novartis Ag Concentration of vaccine antigens with lyophilization
KR20220163497A (ko) 2010-06-01 2022-12-09 노파르티스 아게 동결건조하지 않는 인플루엔자 백신 항원의 농축
WO2011154976A2 (en) 2010-06-08 2011-12-15 Panacea Biotec Limited Improved influenza vaccine
EP2590674B1 (en) 2010-07-06 2017-02-22 Variation Biotechnologies Inc. Compositions and methods for treating influenza
US9517205B2 (en) 2010-08-20 2016-12-13 Seqirus UK Limited Soluble needle arrays for delivery of influenza vaccines
EP3012330A1 (en) 2010-09-07 2016-04-27 Novartis AG Generic assays for detection of mammalian reovirus
BR112013010338A2 (pt) 2010-10-27 2016-08-02 Glaxosmithkline Biolog Sa composição, métodos para preparar uma composição imunogênica, para adjuvantar uma resposta imune, para eliciar uma resposta imune contra um agente infeccioso, para evitar e/ou reduzir a deposição de amilóide ou doença de alzheimer em um indivíduo, e para tratar/reduzir/melhorar a infecção por uma agente infeccioso, uso de uma proteína, e, kit
AU2012205315B2 (en) 2011-01-13 2017-05-04 Variation Biotechnologies, Inc. Methods for preparing vesicles and formulations produced therefrom
EP2663327A4 (en) 2011-01-13 2015-12-02 Variation Biotechnologies Inc COMPOSITIONS AND METHOD FOR THE TREATMENT OF VIRUS INFECTIONS
JP5798356B2 (ja) * 2011-04-06 2015-10-21 一般財団法人化学及血清療法研究所 新規インフルエンザワクチン安定化剤
GB201216121D0 (en) 2012-09-10 2012-10-24 Novartis Ag Sample quantification by disc centrifugation
WO2013057715A1 (en) 2011-10-20 2013-04-25 Novartis Ag Adjuvanted influenza b virus vaccines for pediatric priming
EP2780350B1 (en) 2011-11-18 2019-03-06 Variation Biotechnologies Inc. Synthetic derivatives of mpl and uses thereof
CN104302323A (zh) 2012-01-12 2015-01-21 变异生物技术公司 用于治疗病毒感染的组合物和方法
CN104203272A (zh) 2012-01-26 2014-12-10 长角牛疫苗和诊断有限责任公司 复合抗原序列及疫苗
AU2013213345A1 (en) 2012-01-27 2014-08-28 Variation Biotechnologies, Inc. Methods and compositions for therapeutic agents
JP6054883B2 (ja) 2012-03-02 2016-12-27 ノバルティス アーゲー インフルエンザウイルスの再集合
GB201205189D0 (en) 2012-03-23 2012-05-09 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel medical use
US20130315955A1 (en) * 2012-04-13 2013-11-28 Protein Sciences Corporation Stability and potency of hemagglutinin
EP2855701A1 (en) 2012-06-04 2015-04-08 Novartis AG Improved safety testing
GB201218195D0 (en) 2012-10-10 2012-11-21 Istituto Zooprofilattico Sperimentale Delle Venezie Composition
AU2013354219A1 (en) 2012-12-03 2015-07-02 Novartis Ag Reassortant influenza a viren
AU2014204826A1 (en) 2013-01-10 2015-07-09 Seqirus UK Limited Influenza virus immunogenic compositions and uses thereof
AU2014229255B2 (en) 2013-03-13 2018-12-13 Novartis Ag Influenza B virus reassortment
JP2016521282A (ja) 2013-05-10 2016-07-21 ノバルティス アーゲー インフルエンザワクチンにおけるナルコレプシーのリスクの回避
DE202013005130U1 (de) 2013-06-05 2013-09-10 Novartis Ag Influenza Virus Reassortierung
DE202013005100U1 (de) 2013-06-05 2013-08-26 Novartis Ag Influenza Virus Reassortierung
CA2914604A1 (en) 2013-06-06 2014-12-11 Novartis Ag Influenza virus reassortment
CN104436157A (zh) 2013-09-23 2015-03-25 恩金生物有限公司 流感疫苗和治疗
WO2015079952A1 (ja) * 2013-11-29 2015-06-04 テルモ株式会社 アジュバント組成物およびこれを含むワクチン組成物、並びにこれらの製造方法
EP3511020B1 (en) 2014-12-02 2021-01-20 Novartis AG Manufacture of surfactant-containing compositions
CA2985652C (en) 2015-05-14 2020-03-10 Gerald W. FISHER Rapid methods for the extraction of nucleic acids from biological samples
KR20180035807A (ko) 2015-06-26 2018-04-06 세퀴러스 유케이 리미티드 항원적으로 매치된 인플루엔자 백신
BR112018000296A2 (pt) 2015-07-07 2018-09-04 Seqirus UK Limited ensaios de potência de influenza
WO2017167768A1 (en) 2016-03-28 2017-10-05 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Novel vaccine composition
GB201614799D0 (en) * 2016-09-01 2016-10-19 Glaxosmithkline Biologicals Sa Compositions
CN113993542A (zh) 2019-01-30 2022-01-28 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 用于自乳化的油/表面活性剂混合物
JP2023502650A (ja) 2019-11-18 2023-01-25 セキラス ピーティーワイ リミテッド 遺伝子再集合インフルエンザウイルスを産生するための方法
RU2754398C1 (ru) * 2020-06-25 2021-09-01 Общество с ограниченной ответственностью «ФОРТ» Способ получения четырехвалентной вакцины для профилактики гриппа
US20230218526A1 (en) 2020-06-30 2023-07-13 Seqirus UK Limited Cold filtration of oil-in-water emulsion adjuvants

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US639A (en) 1838-03-17 of boston
US5520A (en) 1848-04-18 Oegan-pipb
US4270537A (en) 1979-11-19 1981-06-02 Romaine Richard A Automatic hypodermic syringe
DD155875A1 (de) 1980-12-31 1982-07-14 Willy Nordheim Verfahren zur herstellung eines ballaststoffarmen inaktivierten influenzaimpfstoffes
US4436727A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
DD211444A3 (de) 1982-08-19 1984-07-11 Saechsisches Serumwerk Verfahren zur herstellung von influenza-impfstoffen
SE8205892D0 (sv) 1982-10-18 1982-10-18 Bror Morein Immunogent membranproteinkomplex, sett for framstellning och anvendning derav som immunstimulerande medel och sasom vaccin
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
DD300833A7 (de) 1985-10-28 1992-08-13 Saechsische Landesgewerbefoerd Verfahren zur herstellung von inaktivierten influenza-vollvirusimpfstoffen
CA1283827C (en) 1986-12-18 1991-05-07 Giorgio Cirelli Appliance for injection of liquid formulations
GB8704027D0 (en) 1987-02-20 1987-03-25 Owen Mumford Ltd Syringe needle combination
CA1331443C (en) 1987-05-29 1994-08-16 Charlotte A. Kensil Saponin adjuvant
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4940460A (en) 1987-06-19 1990-07-10 Bioject, Inc. Patient-fillable and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US5339163A (en) 1988-03-16 1994-08-16 Canon Kabushiki Kaisha Automatic exposure control device using plural image plane detection areas
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
FR2638359A1 (fr) 1988-11-03 1990-05-04 Tino Dalto Guide de seringue avec reglage de la profondeur de penetration de l'aiguille dans la peau
AU626049B2 (en) 1989-05-29 1992-07-23 Lion Corporation Method for preparing vaccine for dental caries and vaccinal compositions for dental caries used as nasal drop
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5190521A (en) 1990-08-22 1993-03-02 Tecnol Medical Products, Inc. Apparatus and method for raising a skin wheal and anesthetizing skin
US5527288A (en) 1990-12-13 1996-06-18 Elan Medical Technologies Limited Intradermal drug delivery device and method for intradermal delivery of drugs
GB9118204D0 (en) 1991-08-23 1991-10-09 Weston Terence E Needle-less injector
SE9102652D0 (sv) 1991-09-13 1991-09-13 Kabi Pharmacia Ab Injection needle arrangement
JP3723231B2 (ja) 1991-12-23 2005-12-07 ディミナコ アクチェンゲゼルシャフト アジュバント
IL101007A (en) * 1992-02-18 1997-08-14 Pharmos Ltd Dry stable compositions prepared by lyophilization
US5328483A (en) 1992-02-27 1994-07-12 Jacoby Richard M Intradermal injection device with medication and needle guard
JP3755890B2 (ja) 1992-06-25 2006-03-15 スミスクライン・ビーチャム・バイオロジカルス（ソシエテ・アノニム） アジュバント含有ワクチン組成物
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5569189A (en) 1992-09-28 1996-10-29 Equidyne Systems, Inc. hypodermic jet injector
US5334144A (en) 1992-10-30 1994-08-02 Becton, Dickinson And Company Single use disposable needleless injector
CN1087176C (zh) 1993-03-23 2002-07-10 史密斯克莱·比奇曼生物公司 含有3－o脱酰基单磷酰脂a的疫苗制剂
WO1995011700A1 (en) * 1993-10-29 1995-05-04 Pharmos Corp. Submicron emulsions as vaccine adjuvants
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
WO1995024176A1 (en) 1994-03-07 1995-09-14 Bioject, Inc. Ampule filling device
US5466220A (en) 1994-03-08 1995-11-14 Bioject, Inc. Drug vial mixing and transfer device
US5616487A (en) * 1994-09-15 1997-04-01 Aastrom Biosciences, Inc. Stabilized retrovirus compositions
AUPM873294A0 (en) 1994-10-12 1994-11-03 Csl Limited Saponin preparations and use thereof in iscoms
US5599302A (en) 1995-01-09 1997-02-04 Medi-Ject Corporation Medical injection system and method, gas spring thereof and launching device using gas spring
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
EP0750907B1 (en) * 1995-06-30 2002-03-20 American Cyanamid Company Stable macrolide and macrolide vaccine compositions
US20020165168A1 (en) 1995-12-16 2002-11-07 Joachim Bunger Use of sugar derivatives as antimicrobial, antimycotic and/or antiviral active substances
US5893397A (en) 1996-01-12 1999-04-13 Bioject Inc. Medication vial/syringe liquid-transfer apparatus
GB9607549D0 (en) 1996-04-11 1996-06-12 Weston Medical Ltd Spring-powered dispensing device
US5919480A (en) * 1996-06-24 1999-07-06 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Liposomal influenza vaccine composition and method
US6403098B1 (en) * 1996-09-26 2002-06-11 Merck & Co., Inc. Rotavirus vaccine formulations
DE19649895A1 (de) 1996-12-02 1998-06-04 Henkel Kgaa Schäumende Körperreinigungsmittel
EP1007077B1 (en) * 1997-01-13 2009-10-07 Emory University Glutathione for the treatment of influenza infection
GB9705740D0 (en) 1997-03-20 1997-05-07 Medeva Europ Ltd A method of preservation
CN1326564C (zh) 1997-04-01 2007-07-18 科里克萨有限公司 单磷酰基脂质a的水性免疫佐剂组合物
US5993412A (en) 1997-05-19 1999-11-30 Bioject, Inc. Injection apparatus
GB9711990D0 (en) * 1997-06-11 1997-08-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
ES2298316T3 (es) * 1997-09-05 2008-05-16 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Emulsiones de aceite en agua que contienen saponinas.
IT1298087B1 (it) 1998-01-08 1999-12-20 Fiderm S R L Dispositivo per il controllo della profondita' di penetrazione di un ago, in particolare applicabile ad una siringa per iniezioni
PL354714A1 (en) 1998-04-09 2004-02-09 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Adjuvant compositions
FR2780278B1 (fr) * 1998-06-24 2001-01-19 Oreal Composition conditionnante et detergente et utilisation
DE19841796A1 (de) 1998-09-12 2000-03-16 Beiersdorf Ag Kombinationen von Antiadhäsiva (Kohlenhydrate) und Mikrobiziden
KR100922031B1 (ko) * 1999-04-19 2009-10-19 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 백신
AUPQ233799A0 (en) 1999-08-19 1999-09-09 Minister For Agriculture, Minister For Land And Water Conservation For And On Behalf Of The State Of New South Wales Recombinant sub-unit vaccine
CA2383105C (en) * 1999-09-24 2010-01-26 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Intranasal influenza virus vaccine
EP1221971A2 (en) * 1999-09-24 2002-07-17 SmithKline Beecham Biologics SA Use of the combination of polyoxyethylene sorbitan ester and octoxynol as adjuvant and its use in vaccines
BR0014285A (pt) * 1999-09-24 2002-05-21 Smithkline Beecham Biolog Adjuvantes compreendendo um éster ou éter de alquila de polioxietileno e pelo menos um tensoativo não-iÈnico
US6494865B1 (en) 1999-10-14 2002-12-17 Becton Dickinson And Company Intradermal delivery device including a needle assembly
CN1379667A (zh) * 1999-10-19 2002-11-13 宝洁公司 预防和治疗感冒和流感样症状的组合物和它们的使用方法
CA2423610A1 (en) 2000-10-02 2002-04-11 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Split enveloped virus preparation
JP2004536785A (ja) * 2001-02-23 2004-12-09 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 新規なワクチン
MY134424A (en) * 2001-05-30 2007-12-31 Saechsisches Serumwerk Stable influenza virus preparations with low or no amount of thiomersal
US9856414B2 (en) 2013-06-10 2018-01-02 Dober Chemical Corp. Compositions, systems and methods of making coated additive components

Also Published As

Publication number Publication date
PT1407008E (pt) 2009-02-26
US7316813B2 (en) 2008-01-08
IL188834A (en) 2011-01-31
AR036039A1 (es) 2004-08-04
WO2002097072A3 (en) 2003-04-24
SI1407008T1 (sl) 2009-06-30
EP2495314A1 (en) 2012-09-05
AU2006200742A1 (en) 2006-03-16
HUP0400445A3 (en) 2011-06-28
MY134424A (en) 2007-12-31
CY1108930T1 (el) 2014-07-02
ATE420159T1 (de) 2009-01-15
KR100871021B1 (ko) 2008-11-27
JP2004527264A (ja) 2004-09-09
TWI228420B (en) 2005-03-01
WO2002097072A8 (en) 2004-02-19
BRPI0210076B8 (pt) 2021-05-25
CN1279165C (zh) 2006-10-11
NO20035208D0 (no) 2003-11-24
MXPA03010944A (es) 2005-04-08
CO5540349A2 (es) 2005-07-29
JP4074582B2 (ja) 2008-04-09
CN1533434A (zh) 2004-09-29
CA2448208C (en) 2011-11-29
EP2039761A1 (en) 2009-03-25
BR0210076A (pt) 2004-06-22
CN101069744B (zh) 2012-04-25
BRPI0210076A8 (pt) 2017-05-23
CZ298697B6 (cs) 2007-12-27
PL366990A1 (en) 2005-02-07
US20080181914A1 (en) 2008-07-31
AU2006200742C9 (en) 2015-03-26
DE60230760D1 (de) 2009-02-26
WO2002097072A2 (en) 2002-12-05
ES2318020T3 (es) 2009-05-01
AU2006200742C1 (en) 2014-10-16
AU2006200742B2 (en) 2010-05-27
CA2448208A1 (en) 2002-12-05
EP1407008A2 (en) 2004-04-14
AU2002344182C1 (en) 2014-11-06
HUP0400445A2 (hu) 2004-07-28
NZ529755A (en) 2005-11-25
FR13C0072I1 (fr) 2014-01-31
ZA200309250B (en) 2005-05-25
US20040241187A1 (en) 2004-12-02
BRPI0210076B1 (pt) 2020-01-07
IL158931A (en) 2008-04-13
HU229368B1 (en) 2013-11-28
DK1407008T3 (da) 2009-04-27
EP1407008B1 (en) 2009-01-07
NO335212B1 (no) 2014-10-20
IL188834A0 (en) 2009-02-11
AU2002344182B2 (en) 2006-01-05
KR20040025682A (ko) 2004-03-24
PL206435B1 (pl) 2010-08-31
HK1067891A1 (en) 2005-04-22
CN101069744A (zh) 2007-11-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2448208C (en) Influenza vaccine composition
JP6211555B2 (ja) 新規なワクチン
AU2002344182A1 (en) Influenza vaccine composition
US20140302090A1 (en) Novel vaccine
JP5813645B2 (ja) インフルエンザに対する新規ワクチン組成物