KR101635186B1 - 활성 소분자 귀경 혼합물 및 그의 제조방법, 그리고 그의 응용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 활성 소분자 귀경 혼합물 및 그 제조방법과 이 혼합물을 함유하는 식품에 관한 것으로, 상기 활성 소분자 귀경 혼합물은 보조재료를 첨가하지 않은 귀경 즙으로 제조되고, 프롤린을 포함하는 복합 프로테아제를 사용하여 귀경 즙에 대하여 효소분해를 진행하여 얻는 것이다. 얻어진 활성 소분자 귀경 혼합물의 중량평균분자량은 580~1,300Da이고, 펩티드는 200~3,000Da로 분포된다. 상기 혼합물은 냉수 중에서 용해속도가 높고, 유리 아미노산 함량이 낮아 귀경 소분자 펩티드류 식품과 건강보조 식품의 제조에 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 활성 소분자 귀경(donkey-hide gelatin, 귀경) 혼합물 및 그 제조방법과 상기 혼합물을 함유하는 식품에 관한 것으로, 특히 귀경 즙을 효소 분해하여 얻어진 활성 소분자 귀경 혼합물 및 그 제조방법과 상기 혼합물을 함유하는 식품에 관한 것이다. 본 발명은 식품 생물 기술분야에 속한다.
귀경은 보혈양기(補血陽氣)에 유용한 약물이다. 동한조(Eastern Han Dynasty) 시기 저명한 의약저작 "신농본초경"중에 “상품”(上品)으로 기재되어 있으며, “장기간 복용하면 기(氣)를 돕고, 몸을 가볍게 한다”고 기재되어 있다. 귀경은 성질이 부드럽고, 맛이 달며, 그 기능은 주요하게 보혈작용을 하고, 영양을 보충하고, 건조함을 습윤시키고, 지혈 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 허혈 위황병(blood defiency chlorosis), 어지럼증(diziness), 심계항진(心悸亢進), 근위축무력증(muscle atrophy and weakness), 흥분(irritability), 불면, 허풍내동(虛風內動), 폐조해수(肺燥咳嗽), 노수로혈(중풍 등으로 목소리가 나오지 않음), 토혈뇨혈(吐血尿血), 변혈붕루(便血崩漏), 임신 낙태 등에 사용된다. 2010년 중국 약전 기재에 의하면, 귀경은 말과 동물 당나귀의 건조 가죽 또는 생가죽을 비등, 농축하여 얻어진 고체 젤라틴이다. 그러나 귀경 중의 콜라겐 분자량은 상당히 커서(수만 내지 수십만), 비위가 허약한 사람들에게는 그의 흡수가 어려워, 귀경의 효능이 충분히 발휘하지 못하게 된다. 또한, 근년 당나귀의 실제 사육되는 두수가 매우 적어짐에 따라 직접적으로 당나귀 가죽의 공급이 부족하게 되고, 귀경의 가격이 매우 높게 상승하게 되어 날로 부족해지는 당나귀 가죽 원료는 이미 시장의 거대한 수요를 만족시킬 수 없다. 그러나 귀경을 효소분해하여 얻어진 소분자 귀경은 제품의 생체이용률을 대폭적으로 향상시킬 수 있어, 귀경 공급 부족에 따른 문제를 완화하는데 양호한 해결방법을 인식되고 있다.
최근, 귀경 효소분해와 관련된 연구는 상당한 발전을 가져오고, 그에 관련된 일부 특허가 개시되었는 바, 그의 주된 개시된 발명으로는 (1) "효소 가수분해법에 의한 액체 귀경의 제조방법"(중국특허공개 CN1237421A), (2) "활성 귀경 콜라겐 펩티드 제품" (중국특허공개 CN1807653A), (3) "저분자량 귀경 가수 분해물의 제조방법"(중국특허공개 CN101269090A)를 들 수 있다. 상기 3개의 발명은 모두 프로테아제를 사용하여 귀경을 효소 분해하여 콜라겐 펩티드를 제조하는 방법을 개시하고 있다.
본 발명은 선행기술을 기초로 하여 귀경 중의 프롤린(proline)과 히드록시프롤린(hydroxyproline)의 함량이 비교적 높은 이점을 이용하여, 최초로 프롤린 프로테아제를 이용하여 효소적으로 소화시킨 결과, 전술한 특허들에 개시된 것보다 현저히 우수하게 가수분화됨을 발견하였다. 전술한 3개의 발명에서, 제조된 제품의 분자량의 대부분은 5,000Da 이하, 많아야 10,000Da 이하의 범위로 분포되었다. 또한, 상기 어떠한 특허도 분자량 분포 및 유리 아미노산 함량에 대하여 모두 정확한 측정을 진행하지 않았지만, 본 발명에서는 제품의 펩티드가 200~3,000Da 범위, 주로 200~1,000Da 범위 내에 분포된다. 또한 특허공개 CN1237421A 및 CN1807653A의 발명에서는 모두 보조 재료를 함유하는 귀경 덩어리를 효소 분해 원료로 사용하였지만, 본 발명에서는 귀경 즙을 효소분해 원료로 사용하여 원가를 절약하고 공법이 단순하며, 제조한 제품의 용해성이 좋고 생체이용률이 높으며, DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼 및 ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)) 라디칼의 제거율이 거의 100%에 접근함을 나타낸다.
많은 국내외 문헌(Adibi A S. America Nutrition, 1984, 25:1114-1122; DBA Silk. Gut, 1974, 15:494-501)에 의하면, 분자량이 200~1,000Da 범위의 펩티드의 흡수 및 효능이 다른 크기의 펩티드와 유리 아미노산과 비교하여 더욱 우수함을 보고하고 있다. 본 발명은 보조재료를 첨가하지 않은 귀경 즙을 원료로 사용하여 제품 중 유리 아미노산 함량과 분자량 분포상황을 정확하게 측정하였고, 또한 제조된 제품은 대부분 분자량이 200~1,000Da 범위의 작은 펩티드이므로 흡수와 효능이 더욱 우수하다.
본 발명의 하나의 목적은 선행기술 중의 문제점을 해결하기 위하여 활성 소분자 귀경 혼합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 활성 소분자 귀경 혼합물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 활성 소분자 귀경 혼합물이 귀경의 소분자 펩티드류 식품과 건강보조 식품을 제조하는데 있어서의 응용을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기와 같은 기술수단을 사용하였다. 즉, 본 발명에 따른 활성 소분자 귀경 혼합물은 제품의 중량평균분자량은 580~1,300Da이고, 펩티드는 200~3,000Da 범위 내에 분포되며, 대부분이 200~1,000Da 범위 내에 분포되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 활성 소분자 귀경 혼합물은 복합 프로테아제를 사용하여 보조재료를 함유하지 않은 귀경 즙을 가수분해하여 제조할 수 있다. 상기 복합 프로테아제는 파파인(papain) 및 프롤린(proline)을 포함하고, 상기 복합 프로테아제는 바람직하기로는 브로멜라인(bromelain), 중성 프로테아제(neutral protease), 펩신(pepsin) 또는 플라보르자임(flavourzyme)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 그 이상을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 활성 소분자 귀경 혼합물은 분말 또는 액체 제제로 가공될 수 있다.
본 발명의 활성 소분자 귀경 혼합물의 특징은 하기와 같다: 즉, (1)분말 또는 액체 제제로 제조되어 경구투여할 수 있고; (2)용해성이 아주 양호하여 냉수 중에서도 아주 높은 용해속도를 가지며; (3)유리 아미노산 함량이 낮고(단지 4%), 분자량이 200~1,000Da 범위 내인 작은 펩티드가 차지하는 비율이 81%이며, 분자량이 1000~3,000Da 범위 내인 펩티드가 차지하는 비율이 14%이며(도 1), 중량평균분자량은 765Da이고; (4)생체이용률 면에 있어서, 소분자 귀경은 일반적인 귀경의 3.5배이고, 생체공학적으로 소화된 귀경의 2.2배이며(도 2); (5)항산화 효능에 있어서, 소분자 귀경은 ABTS와 DPPH를 포함하는 라디칼을 거의 모두 제거하는 효능이 있으며, 10mg/ml 농도의 경우, 제거율이 모두 100%에 접근한다(도3 및 도4).
본 발명은 상기 활성 소분자 귀경 혼합물의 제조방법을 제공하며, 그 방법은 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다: 즉,
(1) 보조재료를 함유하지 않은 귀경 즙을 실온에서 30~55℃ 까지 냉각시킨 후, pH 5~8로 조정하고, 복합 프로테아제를 넣고 0.5~2시간 가수분해 반응시켜 귀경 즙 가수분해액을 얻는 단계;
(2) 상기 (1)단계의 가수분해하여 얻어진 귀경 즙 가수분해액을 10~30분 동안 가열하여 효소를 비활성화시켜서 비활성화 액을 얻는 단계;
(3) 원심분리를 이용하여 비활성화 액의 불순물을 제거하여 활성 소분자 귀경 혼합물 액체 제제를 얻는 단계.
본 발명의 상기 활성 소분자 귀경 혼합물의 제조방법은 활성 소분자 귀경 혼합물 액체 제제를 분무 건조시켜 활성 소분자 귀경 혼합물 분말을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
전술한 보조재료는 황미주(yellow rice wine), 정제 백당 및 대두유와 같은 보조재료를 의미하며; 상기 본 발명에 따른 방법에 있어서는 상기 보조재료를 함유하지 않은 귀경 즙이다.
본 발명에 따른 구체적인 실시예에 있어서, 상기 (1)단계에 따른 귀경 즙의 농도(w/w)는 10~50중량%이다.
본 발명에 따른 구체적인 실시예에 있어서, 상기 복합 프로테아제는 파파인과 프롤린을 포함하고, 상기 복합 프로테아제는 바람직하게 브로멜라인, 중성 프로테아제, 펩신 또는 플라보르자임으로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 2종 이상을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 구체적인 실시예에 있어서, (1)단계에 따른 복합 프로테아제의 첨가량은 귀경 즙 중량의 5‰~3%(w/w)이고, 상기 복합 프로테아제의 첨가 순서는 몇가지 효소를 순서에 따라 일정한 시간을 두고 순차적으로 첨가하거나 효소분해가 시작되는 단계에서 몇 가지 효소를 동시에 첨가하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 구체적인 실시예에 있어서, 상기 복합 프로테아제 중의 각 효소의 중량 대비 첨가비는, 파파인: 프롤린= 2: 1; 또는 파파인: 프롤린: 브로멜라인, 중성 프로테아제, 펩신 또는 플라보르자임 에서 선택된 1종의 프로테아제= 5: 2: 1이다. 기타 비율은 더 이상 상세히 서술하지 않으나, 본 발명의 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 실제 사용상황에 따라 어떠한 진보성 창출을 거치지 않은 전제하에 여러 가지 선택을 진행할 수 있을 것이다.
본 발명은 상기 활성 소분자 귀경 혼합물이 귀경의 소분자 펩티드류 식품 또는 건강보조 식품을 제조하는데 있어서의 응용에 대하여 더 공개하는 바, 흡수가 더욱 잘 되고 용해성이 양호하며, 항산화효능이 아주 우수하여, 분말 또는 경구투여용 액상 식품과 항산화 노화방지 건강보조 식품의 개발에 유리하다.
선행기술과 비교했을 때 본 발명의 장점은 하기와 같다.
1. 어떠한 보조재료도 첨가하지 않은 귀경 즙을 원료로 사용하여 공법이 간단하고, 에너지를 절약하며, 원가가 낮고 가수분해 효율이 높으며 분무조건으로 얻은 제품의 구조와 성능의 안정성의 양호함을 확보한다.
2. 원심분리에 의하여 지방과 불순물을 제거하여 제품의 용해성이 좋고, 지방이 없으며 관련 식품과 건강보조 식품의 개발에 유리하다.
3. 분무건조에 의하여 얻은 분말 상태의 원료는 저장 원가가 낮고 캅셀과 과립 제품의 개발이 용이하다.
4. 제품 검출 기술이 선진적이고, 제품 중의 유리 아미노산의 함량과 펩티드 분포 상황을 정확하게 측정하는 것을 확보한다.
5. 효소분해 공법이 선진적이고, 제품 펩티드가 주로 200~1,000Da 범위 내에 분포되고, 분자량이 종래 공개된 공법에 의하여 제조된 제품보다 더욱 낮으며 흡수효과와 기능효과도 더욱 우수하다.
6. 제품생산 공법이 선진적이고, 실용성이 강하며 소분자 귀경의 수율이 아주 높아 40%의 1L 귀경 즙 원료를, 예를 들어 효소분해와 그에 따른 생산에 의하여 얻어진 분말 상태의 제품은 약 360g으로서 수율이 90%에 달한다.
7. 제조한 원료의 생체이용률과 항산화 효능에 대하여 초보적인 측정을 진행한 결과 효능이 아주 우수하다.
도 1은 아미노산 분석기술을 결합한 고성능 겔 크로마토그래피로 측정한 활성 소분자 귀경 혼합물의 분자량 분포도이다.
도 2는 처리를 거치지 않은 일반적인 귀경 샘플; 생체공학적으로 소화된 귀경; 인체 위장 소화계통을 모방하고 펩신 및 트립신을 사용하여 귀경을 효소분해 시킨 것; 및 본 발명에 따른 활성 소분자 귀경 혼합물을 이용하여, 마우스 위장에 투여하고, 채혈하여 혈중 히드록시프롤린 함량을 측정한 생체이용률의 비교도이다.
도 3은 본 발명의 활성 소분자 귀경 혼합물의 DPPH 라디칼 제거 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 활성 소분자 귀경 혼합물의 ABTS 라디칼 제거실험 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 처리를 거치지 않은 일반적인 귀경 샘플; 생체공학적으로 소화된 귀경; 인체 위장 소화계통을 모방하고 펩신 및 트립신을 사용하여 귀경을 효소분해 시킨 것; 및 본 발명에 따른 활성 소분자 귀경 혼합물을 이용하여, 마우스 위장에 투여하고, 채혈하여 혈중 히드록시프롤린 함량을 측정한 생체이용률의 비교도이다.
도 3은 본 발명의 활성 소분자 귀경 혼합물의 DPPH 라디칼 제거 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 활성 소분자 귀경 혼합물의 ABTS 라디칼 제거실험 결과를 나타낸 도이다.
이하, 구체적인 실시예를 결부시켜 본 발명을 더 상세히 설명하는 바, 본 발명의 이점과 특징은 설명을 참조하면 더욱 명확해질 것이다. 그러나 이 실시예는 단지 예시를 위한 것으로 본 발명의 범위에 대하여 어떠한 한정도 하지 않는다. 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 사상과 범위를 벗어나지 않는 상황하에서 본 발명의 기술적 해결방법의 세부사항과 형식에 대하여 보정 또는 교체를 진행할 수 있지만 이런 보정과 교체는 모두 본 발명의 청구항의 범주 내에 속한다는 것을 이해해야 할 것이다.
본 발명의 구체적인 실시예 중에서 사용된 실험 재료 원료는 하기와 같다.
1. 귀경 즙(황주, 정백당 및 대두유를 함유하지 않음)은 샨동 동에 동키아이드 젤라틴유한회사(Shandong Done -E Donkey-hide gelatin Co., Ltd.)에서 구입하였다.
2. 각종 효소
플라보르자임, 중성 프로테아제, 브로멜라인은 팡보바이오엔지니어링유한회사(Pangbo Bioengineering Co., Ltd., Nanning, China)에서 구입하였고, 파파인 및 펩신은 케이유안인더스리얼유한회사(Keyuan Industrial Co., Ltd.)에서 구입하였고, 프롤린은 상하이유안다비지네스유한회사(Shanghai Yuanda Business Ltd.)에서 구입하였다.
3. ABTS와 DPPH 라디칼은 상해 씨그마 알드리치 유한회사(Sugma Aldrich Co., Ltd.)에서 구입하였다.
실시예 1
1ℓ의 보조재료를 함유하지 않은 귀경 즙(즙 농도(w/w): 40%)을 실온에서 35℃까지 냉각시키고, pH를 6.5로 조정하고, 귀경 즙 중량의 5%(w/w)인 복합 프로테아제(중량비로 파파인:프롤린=2:1)를 넣고, 2시간 가수분해 반응시킨 후, 20분 동안 가열하여 효소를 비활성화시키고, 원심분리하여 불용성 불순물과 지방을 제거하여 활성 소분자 귀경 혼합물 액체 제제를 얻었다. 이를 측정한 바, 제품의 분자량은 대부분 200~3,000Da로 분포되고, 점유비는 83%임을 확인하였다.
실시예 2
1ℓ의 보조재료를 함유하지 않은 귀경 즙(즙의 농도(w/w): 40%)을 실온에서 35℃까지 냉각시키고, pH를 6.5로 조정하고, 귀경 즙 중량의 5%(w/w)인 복합 프로테아제(중량비로 파파인:프롤린=2:1)를 넣고, 2시간 가수분해 반응시킨 후, 20분 동안 가열하여 효소를 비활성화시키고, 원심분리하여 불용성 불순물과 지방을 제거한 후, 마지막으로 분무건조하여 360g의 분말 상태 활성 소분자 귀경 혼합물을 얻었다. 얻어진 혼합물을 측정한 바, 제품의 분자량은 대부분 200~3,000Da로 분포되고, 점유비는 83%임을 확인하였다.
실시예 3
1ℓ의 보조재료를 함유하지 않은 귀경 즙(즙의 농도(w/w): 40%)을 실온에서 40℃까지 냉각시키고, pH를 5.5로 조정하고, 귀경 즙 중량의 1%(w/w)인 복합 프로테아제(중량비로 파파인:프롤린:펩신=5:2:1)를 넣고, 2시간 가수분해 반응시킨 후, 20분 동안 가열하여 효소를 비활성화시키고, 원심분리를 이용하여 불용성 불순물과 지방을 제거한 후, 마지막으로 분무건조하여 360g의 분말 상태 활성 소분자 귀경 혼합물을 얻었다. 이 혼합물을 측정한 바, 제품의 분자량은 대부분 200~3,000Da로 분포되고, 점유비는 86%임을 확인하였다.
실시예 4
1ℓ의 보조재료를 함유하지 않은 귀경 즙(즙의 농도(w/w): 10%)을 실온에서 35℃까지 냉각시키고, pH를 6으로 조정하고, 귀경 즙 중량의 2%(w/w)인 복합 프로테아제(중량비로 파파인:프롤린:펩신: 중성 프로테아제:플라보르자임=6:3:1:1:1)를 넣고, 2시간 가수분해시킨 후, 20분 동안 가열하여 효소를 비활성화시키고, 원심분리를 이용하여 불용성 불순물과 지방을 제거한 후, 마지막으로 분무건조하여 360g의 분말 상태 활성 소분자 귀경 혼합물을 얻었다. 이 혼합물을 측정한 바, 제품의 분자량은 대부분 200~3,000Da로 분포되고, 점유비는 75%임을 확인하였다.
실시예 5
1ℓ의 보조재료를 함유하지 않은 귀경 즙(즙의 농도(w/w): 40%)을 실온에서 50℃까지 냉각시키고, pH를 6.5로 조정하고, 귀경 즙 중량의 3%(w/w)인 복합 프로테아제(중량비로 파파인:프롤린:펩신: 중성 프로테아제:플라보르자임=6:2:2:1:1)를 넣고, 2시간 가수분해시킨 후, 20분 동안 가열하여 효소를 비활성화시키고, 원심분리하여 불용성 불순물과 지방을 제거한 후, 마지막으로 분무건조하여 360g의 분말 상태 활성 소분자 귀경 혼합물을 얻었다. 이 혼합물을 측정한 바, 제품의 분자량은 대부분 200~3,000Da로 분포되고, 점유비는 95%임을 확인하였다.
실시예 6
1ℓ의 보조재료를 함유하지 않은 귀경 즙(즙의 농도(w/w): 40%)을 실온에서 40도까지 냉각시키고, pH를 6.5로 조정하고, 귀경 즙 중량의 3%(w/w)인 복합 프로테아제(중량비로 파파인:프롤린:펩신:중성 프로테아제:플라보르자임=6:2:2:1:1)를 넣고, 0.5시간 가수분해시킨 후, 20분 동안 가열하여 효소를 비활성화시키고, 원심분리하여 불용성 불순물과 지방을 제거한 후, 마지막으로 분무건조하여 360g의 분말 상태 활성 소분자 귀경 혼합물을 얻었다. 이 혼합물을 측정한 바, 제품의 분자량은 대부분 200~3,000Da로 분포되고, 점유비는 83%임을 것을 확인하였다.
실시예 7
1ℓ의 보조재료를 함유하지 않은 귀경 즙(즙의 농도(w/w): 40%)을 실온에서 40℃까지 냉각시키고, pH를 6.5로 조정하고, 귀경 즙 중량의 5%(w/w)인 복합 프로테아제(중량비로 파파인:프롤린:펩신:중성 프로테아제:플라보르자임=6:2:2:1:1)를 넣고, 2시간 가수분해시킨 후, 20분 동안 가열하여 효소를 비활성화시키고, 원심분리하여 불용성 불순물과 지방을 제거한 후, 마지막으로 분무건조하여 360g의 분말 상태 활성 소분자 귀경 혼합물을 얻었다. 얻어진 혼합물을 측정한 바, 제품의 분자량은 대부분 200~3,000Da로 분포되고, 점유비는 71%임을 확인하였다.
실시예 8
1ℓ의 보조재료를 함유하지 않은 귀경 즙(즙의 농도(w/w): 40%)을 실온에서 40℃까지 냉각시키고, pH를 6.5로 조정하고, 귀경 즙 중량의 1.5%(w/w)인 복합 프로테아제(중량비로 파파인:프롤린=2:1)를 넣고, 0.5시간 가수분해시킨 후, 이어서, 5%의 펩신을 넣고, 0.5시간 가수분해시킨 후, 귀경 즙 중량의 5‰(w/w)인 복합 프로테아제(중량비로 계산하면 중성 프로테아제:플라보르자임=1:1)를 넣고, 1시간 가수분해시킨 후, 20분 동안 가열하여 효소를 비활성화시키고, 원심분리하여 불용성 불순물과 지방을 제거한 후, 마지막으로 분무건조여 360g의 분말 상태 활성 소분자 귀경 혼합물을 얻었다. 얻어진 혼합물을 측정한 바, 제품의 분자량은 대부분 200~3,000Da로 분포되고, 점유비는 87%임을 확인하였다.
실시예 9
1ℓ의 보조재료를 함유하지 않은 귀경 즙(즙의 농도(w/w): 40%)을 실온에서 50℃까지 냉각시키고, pH를 6.5로 조정하고, 귀경 즙 중량의 3%(w/w)인 복합 프로테아제(중량비로 파파인:펩신:중성 프로테아제:플라보르자임:브로멜라인=6:2: 2:1:1)를 넣고, 2시간 가수분해시킨 후, 20분 동안 가열하여 효소를 비활성화시키고, 원심분리하여 불용성 불순물과 지방을 제거한 후, 마지막으로 분무 건조하여 360g의 분말 상태 활성 소분자 귀경 혼합물을 얻었다. 얻어진 혼합물을 측정한 바, 제품의 분자량은 대부분 200~3,000Da로 분포되고, 점유비는 65%임을 확인하였다.
실시예 5에서 제조한 분말 상태 귀경 콜라겐 작은 펩티드의 혼합물을 하기의 시험 분석에 사용하였다.
실시예 10 (활성 소분자 귀경 혼합물 펩티드 분포 실험)
1.1 고성능 겔 크로마토그래피 테스트
테스트 기기:
액상 시스템: 애질런트(Agilent) 1100; 고성능 겔 크로마토그래피 컬럼: TSK~G2000 SKwl(300mm*7.8mm, 평균 구경 500Å).
테스트 절차:
1㎖의 효소분해를 거친 샘플을 취하고, 10,000g에서 2분 동안 원심분리하고, 상등액을 취하여 0.45㎛의 일회용 필터를 이용하여 여과시키고, 여과액을 샘플 병에 넣는다. 컬럼의 온도는 27℃이고, 유동상은 0.05mol/ℓ 인산염 버퍼(pH 7.2)이며, 유속은 0.5㎖/min이고, 검출파장은 280nm이며, 샘플 부피는 20㎕이다.
1.2 유리 아미노산 함량 테스트
테스트 기기:
질량 분석기: 3200 Q Trap; 액상 시스템: Shimazu UFLC 시스템; 분석 컬럼: 아미노산 전용 컬럼, AB Sceix; 보호 컬럼: C18(4.0x3.0mm, 5μm ) 페놈넥스(PhenomenexCo).
테스트 절차:
20㎕의 균일하게 혼합한 액체 샘플을 취하고, 5㎕의 침전제를 넣은 후, 균일하게 혼합하고, 10,000g에서 2분 동안 원심분리하여 상등액 5㎕를 취하고, 20㎕의 표지 완충액을 넣고 균일하게 혼합하고, 2.5㎕의 표지 시약을 넣고, 균일하게 혼합한다. 실온에서 30분 반응시키고, 반응 30분 후, 2.5ℓ의 히드록시아민을 넣고 균일하게 혼합하며, 40℃의 질소가스를 불어넣어 건조시키고, 16㎕의 내부 표준액을 넣고, 다시 균일하게 혼합한다. 16㎕를 취하여 샘플 병에 넣고, 5㎕를 샘플링하여 아미노산 농도를 측정한다.
1.3 테스트 결과
실험결과는 도 1에 도시된 바와 같다. 도 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 분자량이 200~1,000Da 범위내인 작은 펩티드 함량이 아주 높고, 81%에 달한다. 분자량이 1000~3,000Da 범위내인 펩티드는 14%를 차지하고, 유리 아미노산 함량은 아주 낮은, 단지 4%이며, 중량평균분자량은 765Da이다. 배경기술에 기재된 내용을 결부시키면, 분자량이 200~1,000Da 범위 내인 펩티드의 흡수 및 효능은 기타 크기의 펩티드와 유리 아미노산보다 더욱 우수하다. 이로써, 본 발명의 제품은 기타 콜라겐 펩티드 제품과 비교했을 때 더욱 빠른 흡수속도와 더욱 좋은 기능효과가 있다고 할 수 있다.
실시예 11: 생체이용률 테스트
테스트재료:
통상적인 귀경: 처리를 거치지 않은 일반적인 귀경 샘플;
생체공학적으로 소화된 귀경: 인체 위장 소화계통을 모방하고 펩신과 트립신을 이용하여 귀경을 효소분해시킨 것;
소분자 귀경: 본 발명에 따른 활성 소분자 귀경 혼합물.
건강한 마우스 24마리를 취하되, 암수는 각각 절반씩이며, 체중은 200~250g 범위내이고, 랜덤으로 A군, B군 및 C군으로 나눈다. 투여 전에 12시간 금식하고, 다음날 아침 A군, B군 및 C군에 각각 귀경, 생체공학적으로 소화된 귀경 및 소분자 귀경(1mg 샘플/10g 몸무게)를 공복상태에 위장내 투여한다. 투여 4시간 후 모두 사료를 투여하고, 투여 0시간, 0.25시간, 0.5시간, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 24시간에 안광에서 채혈한 후, 처리를 거친 후, 아미노산 분석방법을 사용하여 혈중 히드록시프롤린의 함량을 분석함으로써 샘플의 생체이용률을 확정하였다(히드록시플로린은 콜라겐의 특징성 아미노산임).
결과는 도 2에 도시된 바와 같다. 도 2에서 나타난 바와 같이, 생체이용률 면에서, 본 발명의 귀경 콜라겐 작은 펩티드 혼합물은 일반적인 귀경의 3.5배이고, 생체공학적으로 소화된 귀경의 2.2배이다. 이 데이터는 본 발명의 활성 소분자 귀경 혼합물이 분자가 작고 흡수가 빠른 특징을 있음을 증명한다.
실시예 12: 항산화효과 테스트
1.1 DPPH 라디칼 제거효과에 응용한 관찰
테스트절차:
마개가 있는 시험관에 샘플 용액 1.5㎖와 DPPH 용액 1.5㎖를 넣고 잘 교반한 후, 차광상태에서 30분간 반응시킨다. 517nm 파장에서의 흡광도(AS)를 측정하고, 또한 1.5㎖ 0.1mmol/ℓ DPPH 용액과 1.5㎖ 에탄올 혼합액의 흡광도(AC) 및 1.5㎖ 샘플 용액과 1.5㎖ 에탄올 혼합액의 흡광도(AB)를 측정한 후, 하기 식에 따라 계산한다.
1.2 ABTS 라디칼 제거효과에 응용한 관찰
테스트절차:
황산칼륨용액 88㎕와 ABTS 용액 5㎖를 혼합하고, 차광상태에서 16시간 반응시킨 후, 에탄올을 사용하여 ABTS 용액의 흡광도가 0.7±0.002가 될 때까지 희석한다. 200㎕(2㎖) ABTS 용액과 100㎕(1㎖) 샘플을 취하여 96 웰 플레이트에서 10분 동안 반응시킨다. 734nm 에서의 흡광도를 측정한다. 공식은 하기와 같다.
A0은 ABTS+용액의 흡광도이고, A는 샘플 용액을 첨가 후의 ABTS+용액의 흡광도이다.
1.3 테스트결과
실험결과는 도3 및 도4에 도시된 바와 같다. 도3과 도4에서 나타난 바와 krx이, 상이한 농도의 소분자 귀경은 모두 DPPH 와 ABTS 라디칼을 제거하는 효과가 있고, 10mg/㎖ 농도의 소분자 귀경이 2종 라디칼에 대한 제거율은 100%에 접근한다. 이는 본 발명에 따른 제품이 항산화면에서 일정한 작용이 있다는 것을 설명한다.
Claims (11)
- 파파인 프로테아제 및 프롤린 프로테아제를 포함하는 복합 프로테아제를 이용하여 귀경 즙을 효소적 가수분해함을 특징으로 하여 얻어지는 중량평균분자량이 580~1,300Da이고, 혼합물 중의 펩티드의 65%∼95%가 200~3,000Da 범위 내로 분포되는 분자량을 갖는 활성 소분자 귀경 혼합물.
- 제1항에 있어서,
상기 복합 프로테아제는 브로멜라인(bromelain), 중성 프로테아제(neutral protease), 펩신(pepsin) 및 플라보르자임(flavourzyme)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 2종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 활성 소분자 귀경 혼합물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 혼합물이 분말 또는 액체 제제인 활성 소분자 귀경 혼합물. - (1) 귀경 즙을 실온에서 30~55℃까지 냉각시키고, 이 즙의 pH를 5~8로 조정한 후, 여기에 파파인 프로테아제 및 프롤린 프로테아제를 포함하는 복합 프로테아제를 가하고, 0.5~2시간 가수분해시켜 귀경 즙 가수분해액을 얻는 단계;
(2) 상기 (1)단계의 가수분해를 거친 후의 귀경 즙 가수분해액을 10~30분 동안 가열하여 효소를 비활성화시켜 비활성화액을 얻는 단계; 및
(3) 원심분리하여 비활성화액의 불순물을 제거하여 활성 소분자 귀경 혼합물 액체 제제를 얻는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 중량평균분자량이 580~1,300Da이고, 혼합물 중의 펩티드의 65%∼95%가 200~3,000Da 범위 내로 분포되는 분자량을 갖는 활성 소분자 귀경 혼합물의 제조방법. - 제4항에 있어서,
얻어진 액상 제제의 활성 소분자 귀경 혼합물을 분무 건조시켜 활성 소분자 귀경 혼합물 분말을 제조하는 단계를 더 포함하는 활성 소분자 귀경 혼합물의 제조방법. - 제4항에 있어서,
귀경 즙이 황미주, 정제 백당 및 대두유로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 보조재료를 포함하는 것을 특징으로 하는 활성 소분자 귀경 혼합물의 제조방법. - 제4항에 있어서,
전기 (1)단계에서 사용되는 귀경 즙의 농도가 10~50중량%인 것을 특징으로 하는 활성 소분자 귀경 혼합물의 제조방법. - 제4항에 있어서,
상기 복합 프로테아제는 브로멜라인(bromelain), 중성 프로테아제(neutral protease), 펩신(pepsin) 및 플라보르자임(flavourzyme)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 2종 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 활성 소분자 귀경 혼합물의 제조방법. - 제4항에 있어서,
상기 (1)단계에서 복합 프로테아제의 첨가량은 귀경 즙 중량의 5%~3%이고, 상기 복합 프로테아제의 첨가 순서는 첨가되는 효소들을 일정한 시간 간격으로 순차적으로 첨가하거나, 효소분해가 시작되는 단계에서 사용되는 효소 모두를 동시에 첨가하는 것을 특징으로 하는 활성 소분자 귀경 혼합물의 제조방법. - 제4항에 있어서,
상기 복합 프로테아제 중의 각 효소의 중량 대비 첨가비가 파파인: 프롤린= 2:1, 또는 파파인: 프롤린: 브로멜라인, 중성 프로테아제, 펩신 또는 플라보르자임 중의 어느 하나의 프로테아제= 5:2:1인 것을 특징으로 하는 활성 소분자 귀경 혼합물의 제조방법. - 제1항 또는 제2항에 따른 활성 소분자 귀경 혼합물을 함유하는 식품.
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