이하, 실시예에 의해 상세하게 설명한다. 또한, 본 발명은 이하의 실시예에 의해 한정되는 것이 아니다.
<실시예 1>
N-[2-β-D-갈락토피라노실티오-1-(테트라데실카르바모일)에틸]옥타데카노일아미드[화학식 5의 화합물]의 제조
(1) 1,2,3,4,6-펜타-O-아세틸-β-D-갈락토피라노시드 300 ㎎과 2-(벤질옥시카르보닐아미노)-3-머캅토프로피온산메틸 430 ㎎을 클로로포름 4 ㎖에 용해시키고, 0 ℃까지 냉각시킨 후, 삼불화 붕소디에틸에테르 착체 1.3 ㎖를 가하고 실온에서 20 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합액에 클로로포름을 가하여, 포화 탄산수소나트륨 수용액과 포화 식염수로 세정하였다. 잔류물을 분취 박층 크로마토그래피(용출 용매; n-헥산:아세트산에틸=3:2)로 정제함으로써, 2-(벤질옥시카르보닐아미노)-3-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-갈락토피라노실티오)프로피온산메틸을 370 ㎎ 얻었다.
(2) 2-(벤질옥시카르보닐아미노)-3-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-갈락토피라노실티오)프로피온산메틸 370 ㎎을 1,4-디옥산 5 ㎖와 메탄올 5 ㎖의 혼합 용매에 용해시키고, 20 % 수산화팔라듐카본 200 ㎎을 가하여, 수소 기류하에 18 시간 동안 교반하였다. 셀라이트TM를 사용하여 불용물을 여과 분리한 후, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 DMF 6 ㎖에 녹이고, 스테아르산 193 ㎎, EDC[;1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드] 180 ㎎, HOBt(;1-히드록시벤조트리아졸) 140 ㎎을 가하여, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응 혼합액을 아세트산에틸로 추출하 고, 2 ㏖/ℓ염산과 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정한 후, 아세트산에틸층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 계속해서 감압하에 용매를 증류 제거하였다. 마지막으로 얻어진 잔류물을 중압 칼럼 크로마토그래피(용출 용매;n-헥산:아세트산에틸=4:1)로 정제함으로써, 2-(옥타데카노일아미노)-3-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-갈락토피라노실티오)프로피온산메틸을 313 ㎎ 얻었다.
(3) 2-(옥타데카노일아미노)-3-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-갈락토피라노실티오)프로피온산메틸 313 ㎎을 피리딘 6 ㎖에 용해시키고, 요오드화리튬 515 ㎎을 가한 후, 질소 분위기하에 4 시간 가열 환류하였다. 반응 혼합액을 아세트산에틸로 추출하고, 2 ㏖/ℓ 염산으로 세정한 후, 아세트산에틸층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 계속해서 감압하 용매를 증류 제거하였다. 마지막으로 얻어진 잔류물을 중압 칼럼 크로마토그래피(용출 용매; 클로로포름:메탄올=15:1)로 정제함으로써, 2-(옥타데카노일아미노)-3-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-갈락토피라노실티오)프로피온산을 247 ㎎ 얻었다.
(4) 2-(옥타데카노일아미노)-3-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-갈락토피라노실티오)프로피온산 247 ㎎을 DMF 4㎖에 용해시키고, n-테트라데실아민 80 ㎎, EDC 100 ㎎, HOBt 80 ㎎을 가하여, 실온에서 17 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합액을 아세트산에틸로 추출하고, 2 ㏖/ℓ 염산과 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정한 후, 아세트산에틸층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 계속해서 감압하에 용매를 증류 제거하였다. 마지막으로 얻어진 잔류물을 중압 칼럼 크로마토그래피(용출 용매; n-헥산:아세트산에틸=3:1)로 정제함으로써, N-[1-(테트라데실카르바모일)-2- (2,3,4,6-테트라-O-β-D-갈락토피라노실티오)에틸]옥타데카노일아미드를 278 ㎎ 얻었다.
(5) N-[1-(테트라데실카르바모일)-2-(2,3,4,6-테트라-O-β-D-갈락토피라노실티오)에틸]옥타데카노일아미드 278 ㎎을 THF 5㎖와 메탄올 5 ㎖의 혼합 용매에 용해시키고, 28 % 나트륨메틸레이트메탄올 용액을 촉매량 가하여, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합액을 양이온 교환 수지(다우엑스TM 50-X8)을 사용하여 중화한 후, 수지를 여과 분리하고, 여과액을 감압 농축하였다. 마지막으로 얻어진 잔류물을 메탄올로 결정화함으로써 N-[2-(β-D-갈락토피라노실티오)-1-(테트라데실카르바모일)에틸]옥타데카노일아미드를 백색 결정으로 202 ㎎ 얻었다.
<실시예 2>
N-[2-(β-D-갈락토피라노실옥시)에틸]옥타데카노일아미드[화학식 4의 화합물]의 제조:
(1) 1,2,3,4,6-펜타-O-아세틸-β-D-갈락토피라노시드 1.8 g과 2-(벤질옥시카르보닐아미노)에탄올 1.2 g을 1,2-디클로로에탄 10 ㎖에 녹이고, 0 ℃까지 냉각시 킨 후, 삼불화 붕소디에틸에테르 착체 3.6 ㎖를 가하여 실온에서 17 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합액에 클로로포름을 가하여, 포화 탄산수소나트륨 수용액과 포화 식염수로 세정하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(용출 용매; n-헥산:아세트산에틸=3:1)로 정제함으로써, 2-(2,3,4,6-O-테트라-벤조일-β-D-갈락토피라노실옥시)에틸카르밤산벤질을 1.3 g 얻었다.
(2) 2-(2,3,4,6-O-테트라-벤조일-β-D-갈락토피라노실옥시)에틸카르밤산벤질 250 ㎎을 1,4-디옥산 3 ㎖와 메탄올 3 ㎖의 혼합 용매에 20 % 수산화팔라듐카본 170 ㎎을 가하여 수소 기류하에 18 시간 동안 교반하였다. 셀라이트TM를 사용하여 불용물을 여과 분리한 후, 여과액을 감압 농축했다. 잔류물을 DMF 5 ㎖에 용해시키고, 스테아르산 123 ㎎, EDC 90 ㎎, HOBt 75 ㎎을 가하여, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합액을 아세트산에틸로 추출하고, 2 ㏖/ℓ 염산과 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정한 후, 아세트산에틸층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 계속해서 감압하에 용매를 증류 제거하였다. 마지막으로 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(용출 용매; n-헥산:아세트산에틸=1:1)로 정제함으로써, N-[2-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실옥시)에틸]옥타데카노일아미드를 103 ㎎ 얻었다.
(3) N-[2-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실옥시)에틸]옥타데카노일아미드 103 ㎎을 1,4-디옥산 2 ㎖와 메탄올 2 ㎖의 혼합 용매에 용해시키고, 28 % 나트륨메틸레이트메탄올액을 촉매량 가하여, 실온에서 4 시간 동안 교반하였 다. 반응 혼합액을 양이온 교환 수지(다우엑스TM 50-X8)를 사용하여 중화한 후, 수지를 여과 분리하고, 여과액을 감압 농축하였다. 마지막으로 얻어진 잔류물을 메탄올로 결정화함으로써 N-[2-(β-D-갈락토피라노실옥시)에틸]옥타데카노일아미드를 백색의 결정으로 59 ㎎ 얻었다.
<실시예 3>
N-[2-(β-D-갈락토피라노실티오)에틸]옥타데카노일아미드[화학식 3의 화합물]의 제조:
(1) 2-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실티오)에틸카르밤산벤질 1.0 g을 메탄올 10 ㎖와 1,4-디옥산 10 ㎖의 혼합 용매에 용해시키고, 수산화팔라듐 1 g을 가하여, 수소 기류하에 6시간 동안 교반하였다. 셀라이트TM에서 불용물을 여과 분리한 후, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 DMF 10 ㎖에 용해시키고, 스테아르산 432 ㎎, EDC 364 ㎎, HOBt 257 ㎎을 가하여, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합액을 클로로포름으로 희석하고, 2 ㏖/ℓ 염산과 포화 탄산수소나트 륨 수용액으로 세정한 후, 클로로포름층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 계속해서 감압하에 용매를 증류 제거하였다. 마지막으로 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(용출 용매; n-헥산:아세트산에틸=3:1)로 정제함으로써, N-[2-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실티오)에틸]옥타데카노일아미드를 442 ㎎ 얻었다.
(2) N-[2-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실티오)에틸]옥타데카노일아미드 440 ㎎을 1,4-디옥산 10 ㎖와 메탄올 15 ㎖의 혼합 용매에 용해시키고, 28 % 나트륨메틸레이트메탄올 용액을 촉매량 가하여, 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합액을 양이온 교환 수지(다우엑스TM 50-X8)를 사용하여 중화한 후, 수지를 여과 분리하고, 여과액을 감압 농축하였다. 마지막으로 얻어진 잔류물을 메탄올로 결정화함으로써, N-[2-(β-D-갈락토피라노실티오)에틸]옥타데카노일아미드를 백색의 결정으로 209 ㎎ 얻었다.
<실시예 4>
N-[2-(β-D-갈락토피라노실옥시)-1-(헥실카르바모일)에틸]옥타데카노일아미드[화학식(6)의 화합물]의 제조:
(1) 2-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실티오)에틸카르밤산벤질 2.4 g과 3-히드록시-2-(옥타데카노일아미노)프로피온산메틸 1 g을 클로로포름 35 ㎖에 용해시키고, 0 ℃까지 냉각시킨 후, N-요오도숙신산이미드 1.4 g과 트리플루오로메탄술폰산 0.13 ㎖를 가하여, 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 계속해서, 반응액에 클로로포름을 가하여 포화 탄산수소나트륨 수용액과 10 % 티오황산나트륨 수용액으로 세정하였다. 클로로포름층을 황산마그네슘 무수물로 건조시킨 후, 황산마그네슘을 여과 분리하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(용출 용매;n-헥산:아세트산에틸=3:1)로 정제함으로써 2-(옥타데카노일아미노)-3-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실옥시)프로피온산메틸을 1.4 g 얻었다.
(2) 2-(옥타데카노일아미노)-3-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실옥시)프로피온산메틸 1.4 g을 피리딘 26 ㎖에 녹이고, 요오드화리튬 1.7 g을 가한 후, 질소 분위기하에 4 시간 가열 환류시켰다. 반응 혼합액에 클로로포름을 가하여, 2 ㏖/ℓ 염산으로 세정하고, 클로로포름층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 계속해서 감압하 용매를 증류 제거하였다. 마지막으로 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(용출 용매; 클로로포름:메탄올=60:1)로 정제함으로써, 2-(옥타데카노일아미노)-3-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실옥 시)프로피온산을 940 ㎎ 얻었다.
(3) 2-(옥타데카노일아미노)-3-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실옥시)프로피온산 940 ㎎을 DMF 10 ㎖에 용해시키고, n-헥실아민 120 ㎎, EDC 285 ㎎, HOBt 201 ㎎을 가하여, 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합액에 클로로포름을 가하여, 2 ㏖/ℓ 염산과 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정한 후, 클로로포름층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 계속해서 감압하에 용매를 증류 제거하였다. 마지막으로 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(용출 용매; n-헥산:아세트산에틸=3:1)로 정제함으로써, N-[1-(헥실카르바모일)-2-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실옥시)에틸]옥타데카노일아미드를 295 ㎎ 얻었다.
(4) N-[1-(헥실카르바모일)-2-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실옥시)에틸]옥타데카노일아미드 290 ㎎을 1,4-디옥산 5 ㎖와 메탄올 5 ㎖의 혼합 용매에 용해시키고, 28 % 나트륨메틸레이트메탄올 용액을 촉매량 가하여, 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합액을 양이온 교환 수지(다우엑스TM 50-X8)를 사용하여 중화한 후, 수지를 여과 분리하고 여과액을 감압 농축하였다. 마지막으로 얻어진 잔류물을 증류수로 결정화함으로써 N-[2-(β-D-갈락토피라노실옥시)-1-(헥실카르바모일)에틸]옥타데카노일아미드를 백색의 결정으로 144 ㎎ 얻었다.
<시험예 1> 표피 세포의 β-글루코세레브로시다제 활성화능 측정 시험
(1) 방법
(a) 배양 표피 세포
인간 정상 표피 각질화 세포는 시판되고 있는 것(EpidercellTM:쿠라보사 제조)를 사용했다.
(b) 세포 배양용 배지
배지로는 Medium 154S(쿠라보사 제조), 또한 증식 인자로서 여기에 첨가되는 첨가제 HKGS(쿠라보사 제조)를 사용했다.
(c) Hepes 완충액의 제조
Hepes 7.15 g, 글루코스 1.8 g, 염화칼륨 0.22 g, 염화나트륨 7.7 g, 인산수 소이나트륨ㆍ12수화물 0.27 g을 정제수에 용해시키고, 1 ㏖/ℓ 수산화나트륨 수용액으로 pH 7.4로 조정한 후, 1 ℓ까지 증량하여다.
(d) 세포 배양
인간 정상 표피 세포의 세포수를 Medium 154S로 2.5×104 개/㎖로 조정하고, 60 mm 콜라겐 코트 플레이트(팔콘사 제조)에 4 ㎖ 씩 접종하고, 95 % 공기(V/V)-5 % 탄산 가스(V/V)의 분위기하에 37 ℃에서 4일간 정치 배양하였다.
배양 상청액을 흡인 제거하고, 상기 실시예 1, 2, 4에서 제조된 각 약제의 200 μ㏖/ℓ의 에탄올 용액을 최종 농도 5 μ㏖/ℓ가 되도록 첨가한 Medium 154S를 4 ㎖ 씩 각 디쉬에 가했다. 이 디쉬를 95 % 공기(V/V)-5 % 탄산 가스(V/V)의 분위기하, 37 ℃에서 4일간 정치 배양하였다. 또한, 갈락토실세라미드 유사체를 함유하지 않는 에탄올만을 비교예 1로 하였다.
(e) 조 효소액의 추출
배양 상청액을 흡인 제거하고, 1 ㎖의 인산 완충 생리 식염수로 2회 세정한 후, 세포를 셀 스크레이퍼(스미토모베이클라이트사 제조)로 디쉬에서 긁어 냈다. 여기에 0.1 m㏖/ℓ 불화페닐메틸술포닐 함유 인산 완충 생리 식염수를 첨가하고, 초음파 처리 장치(소닉 앤드 마테리얼즈사 제조)로 파쇄하고, 원심 상청액을 조 효소액으로서 회수하였다.
(f) β-글루코세레브로시다제 활성 측정
미엘과 판델플루크의 방법 문헌[브리티시ㆍ저어널ㆍ오브ㆍ델마트로지, 95 권, 페이지 271-274, 1976년]에 준하여 측정하였다. 즉, 조 효소액 50 ㎕에 100 m㏖/ℓ 시트르산-200 m㏖/ℓ 인산 완충액(pH 5.6) 500 ㎕와, 10 m㏖/ℓ 라울로코르산-100 m㏖/ℓ 시트르산-200 mmol/ℓ인산 완충액(pH 5.6) 500 ㎕를 가하여, 37 ℃에서 10 분간 가온하였다. 계속해서 0.5 mmol/ℓ의 4-메틸움베리페릴-β-D-글루코시드(시그마사 제조)를 50 ㎕ 가하여 37 ℃에서 60 분간 가온하였다. 그 후, 200 mmol/ℓ 탄산나트륨-탄산수소나트륨 완충액(pH 10.5)을 가하여, 여기 파장 360 nm, 흡수 파장 450 nm에서 형광 강도를 측정하였다. 표준품의 4-메틸움베리페론(시그마사 제조)의 형광 강도로 제조된 검량선을 바탕으로 효소 활성을 계산하였다.
(2) 결과
도 1에 나타낸 바와 같이, N-[2-(β-D-갈락토피라노실옥시)에틸]옥타데카노일아미드[실시예 2; 화학식 4로 표시되는 화합물], N-[2-β-D-갈락토피라노실티오-1-(테트라데실카르바모일)에틸]옥타데카노일아미드[실시예 1; 화학식 5로 표시되는 화합물], N-[2-(β-D-갈락토피라노실옥시)-1-(헥실카르바모일)에틸]옥타데카노일아미드[실시예 4; 화학식 6으로 표시되는 화합물]은 전부 β-글루코세레브로시다제 활성화 효과가 확인되었다.
<시험예 2> 마우스에 있어서 거친 피부 회복 시험
(1) 방법
(a) 실험 동물
시험 개시시 9 주된 헤어리스마우스 1 군 5 마리를 사용하였다.
(b) 측정 장치 및 조건
경피 수분 증산량(이하, TEWL라고 약기함)은 연속 발한 측정 장치 하이드로그래프 AMU-100(케이앤드에스사 제조)을 사용하여 다음과 같이 측정하였다.
1 ㎠의 캡슐을 피부에 밀착시켜 캡슐내에 질소 가스를 도입(300 ㎖/분)하여 캡슐에 송출하기 전과, 캡슐로부터 회수된 후의 질소 가스 중의 수증기량을 측정하였다. 이 값의 차이로부터 1 분당 피부 1 ㎠로부터 증산되는 수분량(㎎/cm 을 산출하여 TEWL로 하였다.
(c) 시료와 실험 방법
기제(프로필렌글리콜:에탄올=3:7)를 사용하여, 실시예 4의 화합물[화학식 6으로 표시되는 화합물]을 0.1 %, 1.0 %의 농도로 제조하였다. 이 제조 후의 시료 0.05 ㎖를 미리 TEWL을 측정한 무모(無毛) 마우스의 배면 피부(직경 2.5 cm)에 1일 1회, 일주일 동안 5회의 빈도로 4주 동안 연속 도포를 하였다. 그 후, 사전 도포의 최종 도포로부터 3일째에 자외선 B 파장(UVB)을 0.15 J/㎠, 1회 조사하였다. UVB 조사 전, 조사 후 3 및 4 일째의 TEWL을 측정하고, 기제 도포 전의 TEWL에 대한 비율로 비교 평가하였다.
(2) 결과
도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, N-[2-(β-D-갈락토피라노실옥시)-1-(헥실카르바모일)에틸]옥타데카노일아미드[실시예 4의 화합물; 화학식 6의 화합물]은 1.0 %의 농도에서 p<0.01 (Dunnett 다중 검정)의 위험율로 기제만 비교하여 유의하게 TEWL의 값이 감소되고, 거친 피부가 개선되어 있었다.
<실시예 5>
실시예 1 내지 4에서 얻은 갈락토실세라미드 유사체의 10 % 에탄올 용액 1O g을 온수욕으로 80 ℃에서 가온하여 혼합된 하기 성분을 가하여 100 g의 4종의 로션을 얻었다.
락트산 0.3 g
시트르산나트륨 0.1 g
글리세린 2.0 g
방부제, 향료 및 계면활성제 적당량
정제수 10O g을 총량으로 하는 잔량