CN1247605C - 新型半乳糖苷神经酰胺类似体、使用这些类似体的β－葡糖脑苷酯酶活化剂、皮肤外用药以及β－葡糖脑苷酯酶的活化方法 - Google Patents

新型半乳糖苷神经酰胺类似体、使用这些类似体的β－葡糖脑苷酯酶活化剂、皮肤外用药以及β－葡糖脑苷酯酶的活化方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及如下式(1)或者(2)所示的半乳糖苷神经酰胺类似体。(式中，X、Y为S或者O，R1、R2为碳数9～35的烷基或烯基。R3为碳数2～30的烷基或烯基)。本发明提供一种较容易得到的β-葡糖脑苷酯酶活化剂、皮肤外用药以及β-葡糖脑苷酯酶的活化方法。该活化剂通过活化β-葡糖脑苷酯酶，可改善角质透过屏障的形成，从而有望达到改善粗糙皮肤的效果。

Description

新型半乳糖苷神经酰胺类似体、使用这些类似体的β-葡糖脑苷酯酶 活化剂、皮肤外用药以及β-葡糖脑苷酯酶的活化方法
技术领域
本发明涉及一种新型半乳糖苷神经酰胺类似体、使用这些类似体的β-葡糖脑苷酯酶活化剂、皮肤外用药以及β-葡糖脑苷酯酶的活化方法。具体涉及一种利用特定的半乳糖苷神经酰胺类似体活化表皮中的β-葡糖脑苷酯酶的β-葡糖脑苷酯酶活化剂、皮肤外用药以及β-葡糖脑苷酯酶的活化方法，这些有望改善粗糙皮肤以及各种皮肤病。
背景技术
粗糙皮肤(干燥皮肤)一般是指可以看出角质细胞的剥离现象的干燥状态皮肤。这种粗糙皮肤是由于胆固醇、神经酰胺、脂肪酸等角质细胞间脂质的洗脱以及由紫外线、洗剂等引起的角质细胞的变性或者因表皮细胞生长·角化的平衡遭到破坏所形成的不完整的角质层透过屏障而引起的。围绕预防或者治愈粗糙皮肤，已经进行了一系列的研究，例如通过供给角质细胞间脂质成分或者类似的合成角质细胞间脂质，或者供服表皮生长因子(EGF；Epidermal Growth Factor)等表皮细胞生长·角化的调节物质等。
该角质细胞间脂质是，在有棘层和颗粒层细胞中生物合成的层状颗粒，在角层的正下方被释放到细胞间并伸展成层状结构(lamella)，从而在细胞间扩展开的物质。层状颗粒是由葡糖苷酯酰鞘氨醇、胆固醇、神经酰胺、磷脂等构成的，但在角质细胞间脂质中几乎不含有葡糖苷酯酰鞘氨醇。即层状颗粒中的葡糖苷酯酰鞘氨醇，因β-葡糖脑苷酯酶的作用经水解转变成层状结构的神经酰胺，由此可以作为角质细胞间脂质改善角层透过屏障的形成，起到防护粗糙皮肤的屏障的作用。例如，在遗传上完全缺乏β-葡糖脑苷酯酶的2号型高歇氏病(Gaucher`s disease)患者身上能观察到病态粗糙皮肤，而且通过对其表皮的组织学研究可以发现角质细胞间脂质的层状结构上存在异常。另外，在人为地缺失β-葡糖脑苷酯酶的转基因鼠身上也可以看出角质细胞间脂质的层状结构的异常与皮肤粗糙有关。经进一步的实验也可以看出，当破坏β-葡糖脑苷酯酶时可以观察到粗糙皮肤和角质细胞间脂质层状结构的异常。基于这些事实可以看出，若要形成正常的角层透过屏障，必须使葡糖苷酯酰鞘氨醇被β-葡糖脑苷酯酶水解成神经酰胺。因此，可以确认通过活化β-葡糖脑苷酯酶，可改善角层透过屏障的形成，由此可以改善粗糙的皮肤。
在这种背景下，作为以往的β-葡糖脑苷酯酶的活化因子，已知的有在豚鼠脾脏中发现的SAP-2、在高歇氏病人的脾脏中发现的Ala以及サポシンC。
但是，由于这些活化因子是蛋白质，因此在通过外用这些活化因子来活化表皮的β-葡糖脑苷酯酶时，在皮肤吸收性以及安全性方面存在着较大问题。另外，若要分离这些蛋白质而用在工业上，则在成本上存在非常大的困难。
另一方面，作为蛋白质以外的β-葡糖脑苷酯酶活化因子，已知的有β-半乳糖苷神经酰胺。
但实际可利用的β-半乳糖苷神经酰胺来自于牛脑提取物，外用时同样存在较大的安全性问题。另外，β-半乳糖苷神经酰胺的大量合成非常困难而且成本极高，不利于产业上的应用。
发明内容
本发明的目的就是提供一种容易得到的β-葡糖脑苷酯酶活化剂、皮肤外用药以及β-葡糖脑苷酯酶的活化方法，该活化剂通过活化β-葡糖脑苷酯酶，可以改善角质层透过屏障的形成，由此可达到改善粗糙皮肤的效果。
鉴于上述所存在的问题，本发明人专心研究了可以解决这些问题的方法，结果发现利用后述的特定化合物可以很容易而且较强地活化表皮中的β-葡糖脑苷酯酶，并在此基础上完成了本发明。
即本发明涉及下述通式(1)以及通式(2)所示的半乳糖苷神经酰胺类似体、使用这些类似体的β-葡糖脑苷酯酶活化剂、皮肤外用药以及β-葡糖脑苷酯酶的活化方法。
Figure C0281314800071
(式中，X、Y为S或者O，R1、R2为碳数9～35的烷基或烯基。R3为碳数2～30的烷基或烯基)。
附图说明
图1是表示表皮细胞的β-葡糖脑苷酯酶活化能测定试验(试验例1)结果的图。
图2是在因UVB所形成的粗糙皮肤上涂敷实施例4的化合物的效果(试验例2的结果)图。
图3是在因UVB所形成的粗糙皮肤上涂敷实施例4的化合物的效果(试验例2的结果)图。
具体实施方式
本发明中所用的半乳糖苷神经酰胺类似体，可用上述通式(1)或(2)表示。X、Y为硫原子或者氧原子，从效果上来说优选的是硫原子。R1以及R2的碳数为9～35，优选的是14～22，更为优选的是16～20。R3的碳数为2～30，优选的是14～22，最为优选的是6～14。另外R1、R2、R3可以是饱和，也可以是不饱和的。具体可列举由下述化学式(3)～(6)所示的化合物。
Figure C0281314800081
利用已知的酰胺合成方法可以容易地制得这些化合物。下面简单说明这些合成方法。如具有两个烷基链的通式(2)所示的化合物，可以在已对胺、羧酸部分实施保护的丝氨酸或者半胱氨酸上，通过葡糖化反应引入半乳糖之后，经过氨基脱保护以及缩聚反应引入一个烷基，接着除去羧酸的保护基，在与三氯化磷反应形成酸氯化物之后，再与伯胺进行反应制得。另外也可以利用同样的方法制得具有单链的通式(1)所示的化合物。
作为改善粗糙皮肤的有效成分，本发明的β-葡糖脑苷酯酶活化剂，为含有一种或者两种以上上述通式(1)或者(2)所示半乳糖苷神经酰胺类似体的组合物。
本发明中的β-葡糖脑苷酯酶活化剂、皮肤外用药，可以采用如软膏、洗剂、乳液、奶液、糊剂、包剂(pack)、喷雾剂、泡沫、颗粒、粉末、凝胶等种种剂形。另外，本发明的皮肤外用药，是以包括头皮在内的身体所有皮肤作为对象的，也包括沐浴剂。对基材并无特别限定，可以使用一般的外用基质。另外最终可以制成化妆品、药品、外用医药等形态。
半乳糖苷神经酰胺类似体在β-葡糖脑苷酯酶活化剂、皮肤外用药中的配合量，以组合物总量为基准，优选的是占总量的0.005～5.0重量％，更为优选的是占总量的0.01～3.0重量％。在配合量不足0.005重量％时，不可能很好地达到本发明的效果，另一方面，即使超过5.0重量％也未必能获得与其增加量相应的更好的效果。
实施例
下面利用实施例进行更为详细的说明。但本发明并不仅仅限于如下实施例。
实施例1
N-[2-β-D-吡喃半乳糖基硫代-1-(十四基氨基甲酰基)乙基]十八酰胺[通式(5)的化合物]的制备
(1)将300mg的1，2，3，4，6-五-O-乙酰基-β-D-半乳糖吡喃糖苷以及430mg的2-(苄氧基羰基胺基)-3-巯基丙酸甲酯溶解在4mL的氯仿中，冷却至0C后，加入1.3mL三氟化硼二乙醚配位化合物，在室温下搅拌20小时。在反应混合液中加入氯仿，利用饱和碳酸氢钠水溶液以及饱和食盐水洗净。利用分别取出薄层色谱法(显谱溶剂；正己烷∶醋酸乙酯＝3∶2)精制滤渣，得到370mg的2-(苄氧基羰基胺)-3-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基硫代)丙酸甲酯。
(2)将370mg 2-(苄氧基羰基胺基)-3-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基硫代)丙酸甲酯溶解在5mL 1，4-二噁烷与5mL甲醇的混合溶剂中，加入200mg的20％氢氧化钯-碳，在氢气流下搅拌18小时。利用氟镁石(セライト)TM过滤不溶物之后，减压蒸发滤液。将滤渣溶解在6mL DMF中，加入硬脂酸193mg、EDC[；1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亚胺]180mg、HOBt(；1-羟基苯并三唑)140mg，并在室温下搅拌一晚上。利用醋酸乙酯萃取反应混合液，然后利用2mol/L的盐酸和饱和碳酸氢钠水溶液进行洗涤，再利用无水硫酸镁干燥醋酸乙酯层，接着在减压下蒸馏溶剂。最后利用中压柱层析法精制滤渣(洗提溶剂；正己烷∶醋酸乙酯＝4∶1)，得到313mg的2-(十八酰胺基)-3-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基硫代)丙酸甲酯。
(3)将313mg的2-(十八酰胺基)-3-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基硫代)丙酸甲酯溶解在6mL的吡啶中，加入515mg的碘化锂之后，在氮气环境下加热回流4小时。利用醋酸乙酯萃取反应混合液，并用2mol/L盐酸洗净之后，用无水硫酸镁干燥醋酸乙酯层，接着在减压下蒸馏溶剂。最后利用中压柱层析法(洗提溶剂；氯仿∶甲醇＝15∶1)精制得到的滤渣，得到了247mg的2-(十八酰胺基)-3-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基硫代)丙酸。
(4)将247mg的2-(十八酰胺基)-3-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基硫代)丙酸溶解在4mL的DMF中，加入80mg的正十四胺、100mgEDC、80mg的HOBt，在室温下搅拌17小时。利用醋酸乙酯萃取反应混合液，用2mol/L的盐酸和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤之后，利用无水硫酸镁干燥醋酸乙酯层，接着在减压下蒸馏溶剂。最后利用中压柱层析法(洗提溶剂；正己烷∶醋酸乙酯＝3∶1)精制得到的滤渣，得到278mg的N-[1-(十四基氨基甲酰基)-2-(2，3，4，6-四-O-β-D-吡喃半乳糖基硫代)乙基]十八酰胺。
(5)将278mg的N-[1-(十四基氨基甲酰基)-2-(2，3，4，6-四-O-β-D-吡喃半乳糖基硫代)乙基]十八酰胺溶解在5mL THF和5mL甲醇的混合溶剂中，加入催化剂量的28％甲醇钠的甲醇溶液，在室温下搅拌1小时。反应混合液利用阳离子交换树脂(ダウエツクスTM50-X8)进行中和，之后过滤树脂，减压蒸发滤液。最后利用甲醇使得到的滤渣结晶化，从而得到202mg的N-[2-β-D-吡喃半乳糖基硫代-1-(十四基氨基甲酰基)乙基]十八酰胺的白色结晶。
NMR(DMSO-d6)δ：0.86(t，3H，J＝5.9Hz)，1.24(s，46H)，1.35-1.55(m，4H)，2.15-2.50(m，2H)，3.71(bs，1H)，4.24(dt，1H)，7.71(bt，1H)，7.92(d，1H，J＝7.9Hz).
TOF-MS：m/z 768(M+Na)+，784(M+K)+.
元素分析值(作为C41H80N2O7S·1/10H2O)
计算值(％)C，65.93；H，10.82；N，3.75；S，4.29
实测值(％)C，65.67；H，10.82；N，3.68；S，4.29.
实施例2
N-[2-(β-D-吡喃半乳糖基氧代)乙基]十八酰胺[通式(4)的化合物]的制备
(1)将1.8g的1，2，3，4，6-五-O-乙酰基-β-D-半乳糖吡喃糖苷以及1.2g的2-(苄氧基羰基胺基)乙醇溶解在10mL的1，2-二氯乙烷中，冷却至0℃后，加入3.6mL三氟化硼二乙醚配位化合物，在室温下搅拌17小时。进一步在反应混合液中加入氯仿，用饱和碳酸氢钠水溶液以及饱和食盐水洗净。利用硅胶柱层析法(洗提溶剂：正己烷∶醋酸乙酯＝3∶1)精制滤渣，得到1.3g的2-(2，3，4，6-O-四-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基氧代)乙基氨基甲酸苄酯。
(2)将250mg的2-(2，3，4，6-O-四-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基氧代)乙基氨基甲酸苄酯溶解在3mL1，4-二噁烷与3mL甲醇的混合溶剂中，加入170mg的20％的氢氧化钯-碳，在氢气流下搅拌18小时。利用氟镁石TM过滤不溶物之后，减压浓缩滤液。将滤渣溶解在5mL DMF中，加入123mg硬脂酸、90mgEDC、75mg的HOBt，在室温下搅拌一晚上。利用醋酸乙酯萃取反应混合液，并用2mol/L的盐酸与饱和碳酸氢钠水溶液进行洗净之后，利用无水硫酸镁干燥醋酸乙酯层，接着在减压下蒸馏溶剂。最后利用硅胶柱层析法(洗提溶剂；正己烷∶醋酸乙酯＝1∶1)精制得到的滤渣，得到103mg的N-[2-(2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基氧代)乙基]十八酰胺。
(3)将103mg的N-[2-(2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基氧代)乙基]十八酰胺溶解在2mL 1，4-二噁烷与2mL甲醇的混合溶剂中，加入催化剂量的28％甲醇钠的甲醇溶液，在室温下搅拌4小时。利用阳离子交换树脂(ダウエツクスTM50-X8)中和反应混合液之后，过滤树脂，减压浓缩滤液。最后利用甲醇使得到的滤渣结晶化，从而得到59mg的N-[2-(β-D-吡喃半乳糖基氧代)乙基]十八酰胺的白色结晶。
NMR(DMSO-d6)δ：0.84(t，3H，J＝6.4Hz)，1.26(s，28H)，1.45-1.50(m，2H)，2.04(t，2H，J＝7.5Hz)，3.40-3.50(m，3H)，3.61(bs，1H)，3.68(dt，1H，J＝5.8，10.2Hz)，4.05(d，1H，J＝6.7Hz)，4.32，4.56，4.67，4.81(4bs，4H)，7.72(t，1H，J＝5.6Hz)。
TOF-MS：m/z  512(M+Na)+，528(M+K)+，
元素分析值(作为C26H51NO7·1/5H2O)
计算值(％)C，63.31；H，10.50；N，2.84
实测值(％)C，63.14；H，10.22；N，2.86
实施例3
N-[2-(β-D-吡喃半乳糖基硫代)乙基]十八酰胺[通式(3)的化合物]的制备
(1)将1.0g的2-(2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基硫代)乙基氨基甲酸苄酯溶解在10mL的甲醇与10mL的1，4-二噁烷的混合溶剂中，加入1g氢氧化钯，在氢气流下搅拌6小时。利用氟镁石TM过滤不溶物之后，减压浓缩滤液。将滤渣溶解在10mLDMF中，加入432mg硬脂酸、364mgEDC、257mg的HOBt，在室温下搅拌一晚上。利用氯仿稀释反应混合液，并用2mol/L的盐酸和饱和碳酸氢钠水溶液进行洗净之后，利用无水硫酸镁干燥氯仿层，接着在减压下馏去溶剂。最后利用硅胶柱层析法精制得到的滤渣(洗提溶剂；正己烷∶醋酸乙酯＝3∶1)，得到442mg的N-[2-(2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基硫代)乙基]十八酰胺。
(2)将440mg的N-[2-(2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基硫代)乙基]十八酰胺溶解在10mL二噁烷与15mL甲醇的混合溶剂中，加入催化剂量的28％甲醇钠的甲醇溶液，在室温下搅拌2小时。利用阳离子交换树脂(ダウエツクスTM50-X8)中和反应混合液之后，过滤树脂，减压浓缩滤液。最后利用甲醇使得到的滤渣结晶化，从而得到209mg的N-[2-(β-D-吡喃半乳糖基硫代)乙基]十八酰胺的白色结晶。
NMR(DMSO-d6)δ：0.85(t，3H，J＝6.6Hz)，1.26(s，30H)，1.45-1.50(m，2H)，2.00-2.10(t，2H，J＝7.2Hz)，2.55-2.70(m，2H)，3.20-3.25(m，2H)，3.30-3.40(m，2H)，3.45-3.50(m，2H)，3.68(bs，1H)，4.20(d，1H，J＝9.0Hz)，4.37(d，1H，J＝4.8Hz)，4.55(d，1H，J＝5.4Hz)，4.76(d，1H，J＝5.4Hz)，4.92(d，1H，J＝5.4Hz)，7.84(bt，1H)。
TOF-MS：m/z 528(M+Na)+，544(M+K)+.
元素分析值(作为C26H51NO65)
计算值(％)C，61.75；H，10.16；N，2.77；S，6.34
实测值(％)C，61.65；H，10.10；N，2.77；S，6.35
实施例4
N-[2-(β-D-吡喃半乳糖基氧代)-1-(己基氨基甲酰基)乙基]十八酰胺[通式(6)的化合物]的制备
(1)将2.4g的2-(2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基硫代)乙基氨基甲酸苄酯以及1g的3-羟基-2-(十八酰胺基)丙酸甲酯溶解在35mL的氯仿中，冷却至0℃后，加入1.4g的N-一碘代琥珀酸亚胺与0.13mL的三氟甲磺酸，在室温下搅拌3小时。接着在反应液中加入氯仿，利用饱和碳酸氢钠水溶液以及10％的硫代硫酸钠水溶液洗净。用无水硫酸镁干燥氯仿层之后，过滤无水硫酸镁，减压浓缩滤液。最后利用硅胶柱层析法精制得到的滤渣(洗提溶剂；正己烷∶醋酸乙酯＝3∶1)，得到1.4g的2-(十八酰胺基)-3-(2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基氧代)丙酸甲酯。
(2)将1.4g的2-(十八酰胺基)-3-(2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基氧代)丙酸甲酯溶解在26mL的吡啶中，加入1.7g的碘化锂之后，在氮气环境下加热回流4小时。在反应混合液中加入氯仿，利用2mol/L的盐酸洗净，用无水硫酸镁干燥氯仿层，接着减压馏去溶剂。最后利用硅胶柱层析法精制得到的滤渣(洗提溶剂；氯仿∶甲醇＝60∶1)，从而得到940mg的2-(十八酰胺基)-3-(2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基氧代)丙酸。
(3)将940mg的2-(十八酰胺基)-3-(2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基氧代)丙酸溶解在10mL的DMF中，加入120mL的正己胺、285mg的EDC、201mg的HOBt，在室温下搅拌4小时。反应混合液中加入氯仿，利用2mol/L的盐酸以及饱和碳酸氢钠水溶液洗净之后，利用无水硫酸镁干燥氯仿层，接着在减压下馏去溶剂。最后利用硅胶柱层析法精制得到的滤渣(洗提溶剂；正己烷∶醋酸乙酯＝3∶1)，得到295mg的N-[1-(己基氨基甲酰基)-2-(2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基氧代)乙基]十八酰胺。
(4)将290mg的N-[1-(己基氨基甲酰基)-2-(2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基氧代)乙基]十八酰胺溶解在5mL的1，4-二噁烷与5mL的甲醇的混合溶剂中，加入催化剂量的28％甲醇钠的甲醇溶液，在室温下搅拌3小时。利用阳离子交换树脂(ダウエツクスTM50-X8)中和反应混合液之后，过滤树脂，减压浓缩滤液。最后利用蒸馏水使得到的滤渣结晶化，从而得到144mg的N-[2-(β-D-吡喃半乳糖基氧代)-1-(己基氨基甲酰基)乙基]十八酰胺的白色结晶。
NMR(DMSO-d6)δ：0.85(t，6H，J＝6.0Hz)，1.24(s，34H)，1.30-1.40(m，2H)，1.40-1.50(m，2H)，2.10-2.15(m，2H)，3.00-3.10(m，2H)，3.34(t，1H，J＝6.6Hz)，3.45-3.55(m，3H)，3.62(bs，1H)，3.89(dd，1H，J＝4.8，10.2Hz)，4.07(d，1H，J＝7.2Hz)，4.35(d，1H，J＝4.8Hz)，4.40(dt，1H，J＝5.4，7.8Hz)，4.55(t，1H，J＝5.4Hz)，4.69(d，1H，J＝5.4Hz)，4.85(d，1H，J＝3.6Hz)，7.67(t，1H，J＝5.4Hz)，7.85(d，1H，J＝8.4Hz)。
TOF-MS：m/z 639(M+Na)+，655(M+K)+.
元素分析值(作为C33H64N2O8S)
计算值(％)C，64.25；H，10.46；N，4.54
实测值(％)C，64.02；H，10.32；N，4.55
试验例1表皮细胞的β-葡糖脑苷酯酶的活化能测定试验
(1)方法
(a)培养表皮细胞
使用市售的正常人表皮角质细胞(EpidercellTM：クラボウ社制)。
(b)培养细胞用培养基
培养基使用的是Medium154S(クラボウ社制)，另外作为增长因子使用添加到其中的添加剂HKGS(クラボウ社制)。
(c)配制Hepes缓冲液
将7.15g Hepes、1.8g葡萄糖、0.22g的氯化钾、7.7g的氯化钠、以及0.27g的磷酸氢二钠·12水合物，溶解在纯水中，利用1mol/L的氢氧化钠水溶液调整pH值至7.4后，标定成1L。
(d)培养细胞
利用Medium154S将正常人表皮细胞的细胞数调整为2.5×104个/mL，在60mm涂有胶原的板上(フアルコン社制)以4mL为单位进行播种，然后在95％空气(V/V)-5％二氧化碳(V/V)的环境中，37℃下静置培养4天。
吸去培养液的上清液，将加入上述实施例1、2、4中制备的各药剂的200μmol/L乙醇溶液而把浓度至调制5μmol/L的Medium154S往各盘中各加入4mL。然后将该盘在95％空气(V/V)-5％二氧化碳(V/V)的环境中，37℃下静置培养4天。另外将不含半乳糖苷神经酰胺类似体的乙醇作为比较例。
(e)萃取粗酶液
吸去培养液上清液，利用lmL的磷酸缓冲生理食盐水洗涤2次后，利用细胞刮板(cell scraper)(住友ベ一クライト社制)将细胞从盘上取下来。然后加入0.1mmol/L含氟化苯基甲基磺酰的磷酸缓冲生理食盐水，利用超音波处理装置(ソニックスアンドマテリアルズ社制)进行粉碎，离心回收上层粗酶液。
(f)测定β-葡糖脑苷酯酶的活性
利用ミエル与フアンデルフルク方法(British Journal ofDermatology，95卷，271-274页，1976年)进行测定。即在50μL的粗酶液中，加入500μL的100mmol/L柠檬酸-200mmol/L磷酸缓冲液(pH5.6)、和500μL的10mmol/L牛磺胆酸-100mmol/L柠檬酸缓冲液(pH5.6)，37℃下加热10分钟。接着加入50μL的0.5mmol/L 4-甲基伞形基(umbelliferyl)-β-D葡糖苷(シグマ社制)，在37℃下加热60分钟。然后加入200mmol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH10.5)，在激发波长360nm、吸收波长450nm下测定其荧光强度。以由4-甲基伞形酮标准品(シグマ社制)荧光强度制作的标准曲线为基准计算酶的活性。
(2)结果
如图1所示，N-[2-(β-D-吡喃半乳糖基氧代)乙基]十八酰胺[实施例2；通式(4)的化合物]、N-[2-β-D-吡喃半乳糖基硫代-1-(十四基氨基甲酰基)乙基]十八酰胺[实施例1；通式(5)的化合物]、N-[2-(β-D-吡喃半乳糖基氧代)-1-(己基氨基甲酰基)乙基]十八酰胺[实施例4；通式(6)的化合物]中，全都可以看出β-葡糖脑苷酯酶活化效果。
试验例2对老鼠粗糙皮肤的回复试验
(1)方法
(a)试验动物
利用一组5只的试验开始时9周大的无毛老鼠。
(b)测定装置以及条件
经皮肤的水分蒸发量(以下简称为TEWL)，按如下方法使用连续出汗测定装置自记水位计(hydrograph)AMU-100(ケイアンドエス社制)进行测定。将1平方厘米的囊状器(カプセル)密接在皮肤上，在囊状器内导入氮气(300mL/min)，测定输入囊状器前氮气与从囊状器中回收的氮气中的水蒸气量。利用该值差计算每一分钟从每一平方厘米皮肤所蒸发出来的水分量(mg/cm2)作为TEWL。
(c)试样与试验方法
使用基质(丙二醇∶乙醇＝3∶7)将实施例4的化合物[通式(6)的化合物]调制为0.1％、1.0％的浓度。利用0.05mL调制后的试样，在事先测定了TEWL的无毛老鼠的背部皮肤(直径2.5cm)上一天一次、一周5次连续涂用4周。然后，预涂布的最后涂布后的第三天利用B波长紫外线(UVB)以0.15J/cm2照射一次。测定在照射UVB前、照射后的第3以及4天的TEWL，根据其与涂用基质前TEWL的比进行比较评价。
(2)结果
如图2以及图3所示，N-[2-(β-D-吡喃半乳糖基氧代)-1-(己基氨基甲酰基)乙基]十八酰胺[实施例4的化合物；通式(6)的化合物]，与只用基质时相比时，在1.0％浓度下以p＜0.01(Dunnett多重测定)的临界系数表现出其TEWL值的明显的减少，由此改善了粗糙皮肤。
实施例5
各取10g实施例1～4中得到的半乳糖苷神经酰胺类似体的10％乙醇溶液，用80℃的水浴加热，然后加入经混合的下述成分，得到四种100g洗剂。
乳酸                                    0.3g
柠檬酸钠                                0.1g
甘油                                    2.0g
防腐剂、香料以及表面活性剂              适量
纯水                                    总量为100g时的余量
产业上的利用可能性
如上所述，本发明提供了一种简便而且容易合成的表皮β-葡糖脑苷酯酶的活化剂。另外利用本发明可以预防和防御粗糙皮肤并改善各种皮肤病。

Claims (10)

1、一种半乳糖苷神经酰胺类似体，用下记通式(1)或者(2)表示，
Figure C028131480002C1
其中，X为S，Y为O，R1和R2分别为碳数16～20的烷基，R3为碳数6～14的烷基。
2、根据权利要求1所述的半乳糖苷神经酰胺类似体，用下记通式(3)表示。
Figure C028131480002C2
3.根据权利要求1所述的半乳糖苷神经酰胺类似体，用下记通式(6)
Figure C028131480002C3
表示。
4.含有下记通式(1)或者(2)所示的半乳糖苷神经酰胺类似体的皮肤外用药，
Figure C028131480003C1
其中，X为S，Y为S或者O，R1和R2分别为碳数16～20的烷基，R3为碳数6～14的烷基。
5.如权利要求4所述的皮肤外用药，其中含有0.005～5.0重量％的通式(1)或(2)所示半乳糖苷神经酰胺类似体。
6.如权利要求4所述的皮肤外用药，其中含有0.01～3.0重量％的通式(1)或(2)所示半乳糖苷神经酰胺类似体。
7.以下记通式(1)或者(2)所示的半乳糖苷神经酰胺类似体为有效成分的β-葡糖脑苷酯酶活化剂，
Figure C028131480003C2
其中，X和Y分别为S或者O，R1和R2分别为碳数16～20的烷基，R3为碳数6～14的烷基。
8.如权利要求7所述的β-葡糖脑苷酯酶活化剂，其中含有0.005～5.0重量％的通式(1)或(2)所示半乳糖苷神经酰胺类似体。
9.如权利要求7所述的β-葡糖脑苷酯酶活化剂，其中含有0.01～3.0重量％的通式(1)或(2)所示半乳糖苷神经酰胺类似体。
10.含有下述通式(1)或(2)所述的半乳糖苷神经酰胺类似体的粗糙皮肤改善剂，
其中，X和Y分别为S或者O，R1和R2分别为碳数16～20的烷基，R3为碳数6～14的烷基。
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