KR20040048381A

KR20040048381A - 신규 갈락토실세라미드 유사체, 이를 사용한β-글루코세레브로시다제 활성화제, 피부 외용제 및β-글루코세레브로시다제 활성화 방법

Info

Publication number: KR20040048381A
Application number: KR10-2003-7016943A
Authority: KR
Inventors: 리에 우에마쯔; 후미오 나까지마; 마사히로 요시다; 교꼬 후꾸나가; 마리꼬 하라; 신따로 이노우에; 신이찌로 니시무라
Original assignee: 가네보 가부시키가이샤
Priority date: 2001-06-28
Filing date: 2002-06-27
Publication date: 2004-06-09
Also published as: WO2003002584A1; JP2003012684A; US7183261B2; EP1408045A4; US20040242499A1; EP1408045A1; TWI322151B; TW201002734A; CN1522263A; HK1067642A1; DE60232449D1; EP1408045B1; KR100739250B1; CN1247605C; US20070111951A1; JP4070966B2

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 갈락토실세라미드 유사체에 관한 것이다. β-글루코세레브로시다제를 활성화시킴으로써 각질층 투과 배리어의 형성이 개선되고, 그 결과로서 거친 피부 개선 효과가 기대되는, 쉽게 입수 가능한 β-글루코세레브로시다제 활성화제, 피부 외용제 및 β-글루코세레브로시다제 활성화 방법을 제공한다.

<화학식 1>

<화학식 2>

식 중, X 및 Y는 각각 S 또는 0이고, R¹및 R²는 각각 탄소수 9 내지 35의 알킬기 또는 알케닐기이며, R³은 탄소수 2 내지 30의 알킬기 또는 알케닐기이다.

Description

신규 갈락토실세라미드 유사체, 이를 사용한 β-글루코세레브로시다제 활성화제, 피부 외용제 및 β-글루코세레브로시다제 활성화 방법 {Novel Galactosylceramide Analogs and β-Glucocerebrosidase Activators, External Skin Preparations and Method of Activating β-Glucocerebrosidase Using the Analogs}

거친 피부(건조 피부)라 함은 일반적으로 각질 세포의 박리 현상이 확인된 건조 상태의 피부를 의미한다. 이러한 거친 피부는 콜레스테롤, 세라마이드, 지방산 등의 각질 세포간 지질의 용출, 및 자외선, 세제 등에 기인하는 각질 세포의 변성이나 표피 세포의 증식ㆍ각질화의 균형 붕괴에 의한 각질층 투과 배리어의 형성 부전 등에 의해서 발생한다. 이 거친 피부를 예방 또는 치유할 목적으로 각질 세포간 지질 성분 또는 그것에 유사한 합성의 각질 세포간 지질을 공급하거나, 표피 증식 인자(EGF; Epidermal Growth Factor) 등의 표피 세포 증식ㆍ각질화 조절 물질 등을 투여하는 등의 연구가 행해지고 있다.

이 각질층 세포간 지질은 유속층과 과립층의 세포로 생합성된 층판 과립이 각질층 바로 아래에서 세포간에 방출되어 신장하고, 층판(라메라) 구조를 취하며, 세포간에 확대된 것이다. 층판 과립은 글루코실세라마이드, 콜레스테롤, 세라마이드, 인지질 등으로 구성되지만, 각질층 세포간 지질에는 글루코실세라마이드는 거의 포함되어 있지 않다. 즉, 층판 과립 중의 글루코실세라마이드는 β-글루코세레브로시다제에 의해서 가수분해를 받아 세라마이드로 변환되고, 이 세라마이드가 라메라 구조를 취한 결과, 각질층 세포간 지질로서 각질층 투과 배리어의 형성을 개선하고, 거친 피부를 방어하기 위한 배리어 기능을 갖는 것으로 생각된다. 예를 들면, β-글루코세레브로시다제가 유전적으로 완전히 결손된 고셔병 유형 2의 질환 환자에서는 병적 거친 피부가 관찰되고, 또한 그의 표피의 조직학적 연구에 의해서 각질층 세포간 지질의 라메라 구조의 이상이 확인되고 있다. 또한, β-글루코세레브로시다제를 인위적으로 결손시킨 트랜스제닉 마우스에서도 각질층 세포간 지질의 라메라 구조의 이상과 거친 피부의 상관성이 확인되고 있다. 또한, 실험적으로도 β-글루코세레브로시다제를 저해한 경우에 거친 피부와 각질층 세포간 지질의 라메라 구조의 이상이 관찰되고 있다. 이러한 제반 사실로부터 정상적인 각질층 투과 배리어의 형성에는 글루코실세라마이드가 β-글루코세레브로시다제에 의해서 세라마이드로 가수분해되는 것이 필요하다고 지적되고 있다. 따라서, β-글루코세레브로시다제를 활성화시킴으로써 각질층 투과 배리어의 형성이 개선되고, 그 결과로서 거친 피부를 개선하는 것이 가능하다고 생각된다.

이러한 배경에서 β-글루코세레브로시다제의 활성화 인자로서 종래부터 몰모트 비장에서 발견된 SAP-2나 인간 고셔병 비장에서 발견된 Ala나 사포신 C가 알려져 있다.

그러나, 이들 활성화 인자는 단백질로서 이들을 외용하여 표피의 β-글루코세레브로시다제를 활성화시키는 것은 경피 흡수성이나 안전성의 측면에서 큰 문제가 있다. 또한, 이러한 단백질을 단리하여 산업상 이용하는 것은 비용면에서 매우 곤란하다.

한편, 단백질 이외의 β-글루코세레브로시다제 활성화 인자로는 β-갈락토실세라미드가 알려져 있다.

그러나, 현실적으로 이용 가능한 β-갈락토실세라미드는 소 뇌추출물 유래이고, 이것을 외용에 사용하는 것은, 안전성의 측면에서 큰 문제가 있다. 또한, β-갈락토실세라미드의 대량 합성은 매우 어렵고 고비용인 것이, 산업상 이용하는 데에 있어서 결점이 되고 있었다.

따라서, 본 발명의 목적은 β-글루코세레브로시다제를 활성화시킴으로써 각질층 투과 배리어의 형성이 개선되어, 그 결과로서 거친 피부의 개선 효과가 기대되며, 쉽게 입수 가능한 β-글루코세레브로시다제 활성화제, 피부 외용제 및 β-글루코세레브로시다제 활성화 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 신규 갈락토실세라미드 유사체, 이를 사용한 β-글루코세레브로시다제 활성화제, 피부 외용제 및 β-글루코세레브로시다제 활성화 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 특정한 갈락토실세라미드 유사체에 의해서 표피 중의 β-글루코세레브로시다제를 활성화하는 β-글루코세레브로시다제 활성화제, 피부 외용제 및 β-글루코세레브로시다제 활성화 방법에 관한 것으로서, 이것들은 거친 피부 및 각종 피부 질환의 개선이 기대된다.

도 1은 표피 세포의 β-글루코세레브로시다제 활성화능 측정 시험(시험예 1)의 결과를 나타낸 도면이다.

도 2는 UVB에 의한 거친 피부에 대한 실시예 4의 화합물 도포의 효과(시험예 2의 결과)를 나타낸 도면이다.

도 3은 UVB에 의한 거친 피부에 대한 실시예 4의 화합물 도포의 효과(시험예 2의 결과)를 나타낸 도면이다.

<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>

본 발명에서 사용되는 갈락토실세라미드 유사체는 상기 화학식 1 또는 2로 표시된다. X, Y는 황 원자 또는 산소 원자이고, 효과의 측면에서는 황 원자인 것이 바람직하다. R¹및 R²는 탄소수 9 내지 35이고, 바람직하게는 14 내지 22이며, 가장 바람직하게는 탄소수 16 내지 20이다. R³은 탄소수 2 내지 30이고, 바람직하게는 탄소수 14 내지 22이며, 가장 적합하게는 탄소수 6 내지 14이다. 또한, R¹, R², R³은 포화이거나 불포화일 수도 있다. 구체적으로는, 하기 화학식 3 내지 6의 화학식으로 표시되는 것을 들 수 있다.

이들 화합물은 공지의 아미드 합성 방법으로 쉽게 제조할 수 있다. 예를 들면, 합성 방법의 개략을 나타낸다고 한다면, 2 라인의 알킬쇄를 갖는 화학식 2로 표시되는 화합물은, 아민, 카르복실산 부분을 보호한 세린 또는 시스테인에 글루코실화 반응에 의해 갈락토스를 도입한 후, 아미노기 부분의 탈보호 및 축합 반응에 의해 알킬기를 도입하고, 계속해서 카르복실산의 보호기를 제거하고, 삼염화인을 작용시켜 산 클로라이드로 한 후, 제1아민과 반응시켜 제조할 수 있다. 또한, 1 라인 쇄의 화합물을 갖는 화학식 1로 표시되는 화합물도 동일하게 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 β-글루코세레브로시다제 활성화제라 함은 거친 피부를 개선하기 위한 유효 성분으로서, 상기 화학식 1 또는 2로 표시되는 갈락토실세라미드 유사체를 1종 또는 2종 이상 함유하는 조성물이다.

본 발명에 따른 β-글루코세레브로시다제 활성화제, 피부 외용제는 연고, 로션, 유액, 밀크, 팩제, 팩, 미스트, 폼, 과립, 분말, 겔 등 여러가지 제형으로 할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 피부 외용제라 함은 두피를 포함하는 신체의 모든 피부를 대상으로 하는 것으로, 입욕제를 포함하는 것이다. 기재는 일반적으로 사용되는 외용 기제이면 특별히 제한되지 않는다. 또한, 최종 형태는 화장료, 의약품, 의약부 외품으로 할 수 있다.

갈락토실세라미드 유사체의 β-글루코세레브로시다제 활성화제, 피부 외용제로의 배합량은 조성물 총량을 기준으로 전체 조성량의 0.005 내지 5.0 질량％가 바람직하고, 0.01 내지 3.0 질량％가 더욱 바람직하다. 0.005 질량％ 미만의 배합량에서는 본 발명의 목적으로 하는 효과가 충분하지 않은 경우가 있고, 한편, 5.0 질량％을 초과해도 그의 증가분에 적당한 효과의 향상은 없는 경우가 있다.

<발명의 개요>

따라서, 본 발명자들은 상기한 사정을 감안하여, 종래의 문제를 해결하는 방법을 예의 연구한 결과, 후술하는 특정한 화합물에 의해서 의외로 표피 중의 β-글루코세레브로시다제를 매우 쉽고, 강하게 활성화할 수 있는 것을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 갈락토실세라미드 유사체, 이를 사용한 β-글루코세레브로시다제 활성화제, 피부 외용제 및 β-글루코세레브로시다제 활성화 방법에 관한 것이다.

단, X, Y는 S 또는 0이고, R¹, R²는 탄소수 9 내지 35의 알킬기 또는 알케닐기이며, R³은 탄소수 2 내지 30의 알킬기 또는 알케닐기이다.

이하, 실시예에 의해 상세하게 설명한다. 또한, 본 발명은 이하의 실시예에의해 한정되는 것이 아니다.

<실시예 1>

N-[2-β-D-갈락토피라노실티오-1-(테트라데실카르바모일)에틸]옥타데카노일아미드[화학식 5의 화합물]의 제조

(1) 1,2,3,4,6-펜타-O-아세틸-β-D-갈락토피라노시드 300 ㎎과 2-(벤질옥시카르보닐아미노)-3-머캅토프로피온산메틸 430 ㎎을 클로로포름 4 ㎖에 용해시키고, 0 ℃까지 냉각시킨 후, 삼불화 붕소디에틸에테르 착체 1.3 ㎖를 가하고 실온에서 20 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합액에 클로로포름을 가하여, 포화 탄산수소나트륨 수용액과 포화 식염수로 세정하였다. 잔류물을 분취 박층 크로마토그래피(용출 용매; n-헥산:아세트산에틸=3:2)로 정제함으로써, 2-(벤질옥시카르보닐아미노)-3-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-갈락토피라노실티오)프로피온산메틸을 370 ㎎ 얻었다.

(2) 2-(벤질옥시카르보닐아미노)-3-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-갈락토피라노실티오)프로피온산메틸 370 ㎎을 1,4-디옥산 5 ㎖와 메탄올 5 ㎖의 혼합 용매에 용해시키고, 20 ％ 수산화팔라듐카본 200 ㎎을 가하여, 수소 기류하에 18 시간 동안 교반하였다. 셀라이트^TM를 사용하여 불용물을 여과 분리한 후, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 DMF 6 ㎖에 녹이고, 스테아르산 193 ㎎, EDC[;1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드] 180 ㎎, HOBt(;1-히드록시벤조트리아졸) 140 ㎎을 가하여, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응 혼합액을 아세트산에틸로 추출하고, 2 ㏖/ℓ염산과 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정한 후, 아세트산에틸층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 계속해서 감압하에 용매를 증류 제거하였다. 마지막으로 얻어진 잔류물을 중압 칼럼 크로마토그래피(용출 용매;n-헥산:아세트산에틸=4:1)로 정제함으로써, 2-(옥타데카노일아미노)-3-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-갈락토피라노실티오)프로피온산메틸을 313 ㎎ 얻었다.

(3) 2-(옥타데카노일아미노)-3-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-갈락토피라노실티오)프로피온산메틸 313 ㎎을 피리딘 6 ㎖에 용해시키고, 요오드화리튬 515 ㎎을 가한 후, 질소 분위기하에 4 시간 가열 환류하였다. 반응 혼합액을 아세트산에틸로 추출하고, 2 ㏖/ℓ 염산으로 세정한 후, 아세트산에틸층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 계속해서 감압하 용매를 증류 제거하였다. 마지막으로 얻어진 잔류물을 중압 칼럼 크로마토그래피(용출 용매; 클로로포름:메탄올=15:1)로 정제함으로써, 2-(옥타데카노일아미노)-3-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-갈락토피라노실티오)프로피온산을 247 ㎎ 얻었다.

(4) 2-(옥타데카노일아미노)-3-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-갈락토피라노실티오)프로피온산 247 ㎎을 DMF 4㎖에 용해시키고, n-테트라데실아민 80 ㎎, EDC 100 ㎎, HOBt 80 ㎎을 가하여, 실온에서 17 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합액을 아세트산에틸로 추출하고, 2 ㏖/ℓ 염산과 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정한 후, 아세트산에틸층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 계속해서 감압하에 용매를 증류 제거하였다. 마지막으로 얻어진 잔류물을 중압 칼럼 크로마토그래피(용출 용매; n-헥산:아세트산에틸=3:1)로 정제함으로써, N-[1-(테트라데실카르바모일)-2-(2,3,4,6-테트라-O-β-D-갈락토피라노실티오)에틸]옥타데카노일아미드를 278 ㎎ 얻었다.

(5) N-[1-(테트라데실카르바모일)-2-(2,3,4,6-테트라-O-β-D-갈락토피라노실티오)에틸]옥타데카노일아미드 278 ㎎을 THF 5㎖와 메탄올 5 ㎖의 혼합 용매에 용해시키고, 28 ％ 나트륨메틸레이트메탄올 용액을 촉매량 가하여, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합액을 양이온 교환 수지(다우엑스^TM50-X8)을 사용하여 중화한 후, 수지를 여과 분리하고, 여과액을 감압 농축하였다. 마지막으로 얻어진 잔류물을 메탄올로 결정화함으로써 N-[2-(β-D-갈락토피라노실티오)-1-(테트라데실카르바모일)에틸]옥타데카노일아미드를 백색 결정으로 202 ㎎ 얻었다.

<실시예 2>

N-[2-(β-D-갈락토피라노실옥시)에틸]옥타데카노일아미드[화학식 4의 화합물]의 제조:

(1) 1,2,3,4,6-펜타-O-아세틸-β-D-갈락토피라노시드 1.8 g과 2-(벤질옥시카르보닐아미노)에탄올 1.2 g을 1,2-디클로로에탄 10 ㎖에 녹이고, 0 ℃까지 냉각시킨 후, 삼불화 붕소디에틸에테르 착체 3.6 ㎖를 가하여 실온에서 17 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합액에 클로로포름을 가하여, 포화 탄산수소나트륨 수용액과 포화 식염수로 세정하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(용출 용매; n-헥산:아세트산에틸=3:1)로 정제함으로써, 2-(2,3,4,6-O-테트라-벤조일-β-D-갈락토피라노실옥시)에틸카르밤산벤질을 1.3 g 얻었다.

(2) 2-(2,3,4,6-O-테트라-벤조일-β-D-갈락토피라노실옥시)에틸카르밤산벤질 250 ㎎을 1,4-디옥산 3 ㎖와 메탄올 3 ㎖의 혼합 용매에 20 ％ 수산화팔라듐카본 170 ㎎을 가하여 수소 기류하에 18 시간 동안 교반하였다. 셀라이트^TM를 사용하여 불용물을 여과 분리한 후, 여과액을 감압 농축했다. 잔류물을 DMF 5 ㎖에 용해시키고, 스테아르산 123 ㎎, EDC 90 ㎎, HOBt 75 ㎎을 가하여, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합액을 아세트산에틸로 추출하고, 2 ㏖/ℓ 염산과 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정한 후, 아세트산에틸층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 계속해서 감압하에 용매를 증류 제거하였다. 마지막으로 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(용출 용매; n-헥산:아세트산에틸=1:1)로 정제함으로써, N-[2-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실옥시)에틸]옥타데카노일아미드를 103 ㎎ 얻었다.

(3) N-[2-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실옥시)에틸]옥타데카노일아미드 103 ㎎을 1,4-디옥산 2 ㎖와 메탄올 2 ㎖의 혼합 용매에 용해시키고, 28 ％ 나트륨메틸레이트메탄올액을 촉매량 가하여, 실온에서 4 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합액을 양이온 교환 수지(다우엑스^TM50-X8)를 사용하여 중화한 후, 수지를 여과 분리하고, 여과액을 감압 농축하였다. 마지막으로 얻어진 잔류물을 메탄올로 결정화함으로써 N-[2-(β-D-갈락토피라노실옥시)에틸]옥타데카노일아미드를 백색의 결정으로 59 ㎎ 얻었다.

<실시예 3>

N-[2-(β-D-갈락토피라노실티오)에틸]옥타데카노일아미드[화학식 3의 화합물]의 제조:

(1) 2-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실티오)에틸카르밤산벤질 1.0 g을 메탄올 10 ㎖와 1,4-디옥산 10 ㎖의 혼합 용매에 용해시키고, 수산화팔라듐 1 g을 가하여, 수소 기류하에 6시간 동안 교반하였다. 셀라이트^TM에서 불용물을 여과 분리한 후, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 DMF 10 ㎖에 용해시키고, 스테아르산 432 ㎎, EDC 364 ㎎, HOBt 257 ㎎을 가하여, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합액을 클로로포름으로 희석하고, 2 ㏖/ℓ 염산과 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정한 후, 클로로포름층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 계속해서 감압하에 용매를 증류 제거하였다. 마지막으로 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(용출 용매; n-헥산:아세트산에틸=3:1)로 정제함으로써, N-[2-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실티오)에틸]옥타데카노일아미드를 442 ㎎ 얻었다.

(2) N-[2-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실티오)에틸]옥타데카노일아미드 440 ㎎을 1,4-디옥산 10 ㎖와 메탄올 15 ㎖의 혼합 용매에 용해시키고, 28 ％ 나트륨메틸레이트메탄올 용액을 촉매량 가하여, 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합액을 양이온 교환 수지(다우엑스^TM50-X8)를 사용하여 중화한 후, 수지를 여과 분리하고, 여과액을 감압 농축하였다. 마지막으로 얻어진 잔류물을 메탄올로 결정화함으로써, N-[2-(β-D-갈락토피라노실티오)에틸]옥타데카노일아미드를 백색의 결정으로 209 ㎎ 얻었다.

<실시예 4>

N-[2-(β-D-갈락토피라노실옥시)-1-(헥실카르바모일)에틸]옥타데카노일아미드[화학식(6)의 화합물]의 제조:

(1) 2-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실티오)에틸카르밤산벤질 2.4 g과 3-히드록시-2-(옥타데카노일아미노)프로피온산메틸 1 g을 클로로포름 35 ㎖에 용해시키고, 0 ℃까지 냉각시킨 후, N-요오도숙신산이미드 1.4 g과 트리플루오로메탄술폰산 0.13 ㎖를 가하여, 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 계속해서, 반응액에 클로로포름을 가하여 포화 탄산수소나트륨 수용액과 10 ％ 티오황산나트륨 수용액으로 세정하였다. 클로로포름층을 황산마그네슘 무수물로 건조시킨 후, 황산마그네슘을 여과 분리하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(용출 용매;n-헥산:아세트산에틸=3:1)로 정제함으로써 2-(옥타데카노일아미노)-3-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실옥시)프로피온산메틸을 1.4 g 얻었다.

(2) 2-(옥타데카노일아미노)-3-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실옥시)프로피온산메틸 1.4 g을 피리딘 26 ㎖에 녹이고, 요오드화리튬 1.7 g을 가한 후, 질소 분위기하에 4 시간 가열 환류시켰다. 반응 혼합액에 클로로포름을 가하여, 2 ㏖/ℓ 염산으로 세정하고, 클로로포름층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 계속해서 감압하 용매를 증류 제거하였다. 마지막으로 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(용출 용매; 클로로포름:메탄올=60:1)로 정제함으로써, 2-(옥타데카노일아미노)-3-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실옥시)프로피온산을 940 ㎎ 얻었다.

(3) 2-(옥타데카노일아미노)-3-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실옥시)프로피온산 940 ㎎을 DMF 10 ㎖에 용해시키고, n-헥실아민 120 ㎎, EDC 285 ㎎, HOBt 201 ㎎을 가하여, 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합액에 클로로포름을 가하여, 2 ㏖/ℓ 염산과 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정한 후, 클로로포름층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 계속해서 감압하에 용매를 증류 제거하였다. 마지막으로 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(용출 용매; n-헥산:아세트산에틸=3:1)로 정제함으로써, N-[1-(헥실카르바모일)-2-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실옥시)에틸]옥타데카노일아미드를 295 ㎎ 얻었다.

(4) N-[1-(헥실카르바모일)-2-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실옥시)에틸]옥타데카노일아미드 290 ㎎을 1,4-디옥산 5 ㎖와 메탄올 5 ㎖의 혼합 용매에 용해시키고, 28 ％ 나트륨메틸레이트메탄올 용액을 촉매량 가하여, 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합액을 양이온 교환 수지(다우엑스^TM50-X8)를 사용하여 중화한 후, 수지를 여과 분리하고 여과액을 감압 농축하였다. 마지막으로 얻어진 잔류물을 증류수로 결정화함으로써 N-[2-(β-D-갈락토피라노실옥시)-1-(헥실카르바모일)에틸]옥타데카노일아미드를 백색의 결정으로 144 ㎎ 얻었다.

<시험예 1> 표피 세포의 β-글루코세레브로시다제 활성화능 측정 시험

(1) 방법

(a) 배양 표피 세포

인간 정상 표피 각질화 세포는 시판되고 있는 것(Epidercell^TM:쿠라보사 제조)를 사용했다.

(b) 세포 배양용 배지

배지로는 Medium 154S(쿠라보사 제조), 또한 증식 인자로서 여기에 첨가되는 첨가제 HKGS(쿠라보사 제조)를 사용했다.

(c) Hepes 완충액의 제조

Hepes 7.15 g, 글루코스 1.8 g, 염화칼륨 0.22 g, 염화나트륨 7.7 g, 인산수소이나트륨ㆍ12수화물 0.27 g을 정제수에 용해시키고, 1 ㏖/ℓ 수산화나트륨 수용액으로 pH 7.4로 조정한 후, 1 ℓ까지 증량하여다.

(d) 세포 배양

인간 정상 표피 세포의 세포수를 Medium 154S로 2.5×10⁴개/㎖로 조정하고, 60 mm 콜라겐 코트 플레이트(팔콘사 제조)에 4 ㎖ 씩 접종하고, 95 ％ 공기(V/V)-5 ％ 탄산 가스(V/V)의 분위기하에 37 ℃에서 4일간 정치 배양하였다.

배양 상청액을 흡인 제거하고, 상기 실시예 1, 2, 4에서 제조된 각 약제의 200 μ㏖/ℓ의 에탄올 용액을 최종 농도 5 μ㏖/ℓ가 되도록 첨가한 Medium 154S를 4 ㎖ 씩 각 디쉬에 가했다. 이 디쉬를 95 ％ 공기(V/V)-5 ％ 탄산 가스(V/V)의 분위기하, 37 ℃에서 4일간 정치 배양하였다. 또한, 갈락토실세라미드 유사체를 함유하지 않는 에탄올만을 비교예 1로 하였다.

(e) 조 효소액의 추출

배양 상청액을 흡인 제거하고, 1 ㎖의 인산 완충 생리 식염수로 2회 세정한 후, 세포를 셀 스크레이퍼(스미토모베이클라이트사 제조)로 디쉬에서 긁어 냈다. 여기에 0.1 m㏖/ℓ 불화페닐메틸술포닐 함유 인산 완충 생리 식염수를 첨가하고, 초음파 처리 장치(소닉 앤드 마테리얼즈사 제조)로 파쇄하고, 원심 상청액을 조 효소액으로서 회수하였다.

(f) β-글루코세레브로시다제 활성 측정

미엘과 판델플루크의 방법 문헌[브리티시ㆍ저어널ㆍ오브ㆍ델마트로지, 95권, 페이지 271-274, 1976년]에 준하여 측정하였다. 즉, 조 효소액 50 ㎕에 100 m㏖/ℓ 시트르산-200 m㏖/ℓ 인산 완충액(pH 5.6) 500 ㎕와, 10 m㏖/ℓ 라울로코르산-100 m㏖/ℓ 시트르산-200 mmol/ℓ인산 완충액(pH 5.6) 500 ㎕를 가하여, 37 ℃에서 10 분간 가온하였다. 계속해서 0.5 mmol/ℓ의 4-메틸움베리펠-β-D-글루코시드(시그마사 제조)를 50 ㎕ 가하여 37 ℃에서 60 분간 가온하였다. 그 후, 200 mmol/ℓ 탄산나트륨-탄산수소나트륨 완충액(pH 10.5)을 가하여, 여기 파장 360 nm, 흡수 파장 450 nm에서 형광 강도를 측정하였다. 표준품의 4-메틸움베리페론(시그마사 제조)의 형광 강도로 제조된 검량선을 바탕으로 효소 활성을 계산하였다.

(2) 결과

도 1에 나타낸 바와 같이, N-[2-(β-D-갈락토피라노실옥시)에틸]옥타데카노일아미드[실시예 2; 화학식 4로 표시되는 화합물], N-[2-β-D-갈락토피라노실티오-1-(테트라데실카르바모일)에틸]옥타데카노일아미드[실시예 1; 화학식 5로 표시되는 화합물], N-[2-(β-D-갈락토피라노실옥시)-1-(헥실카르바모일)에틸]옥타데카노일아미드[실시예 4; 화학식 6으로 표시되는 화합물]은 전부 β-글루코세레브로시다제 활성화 효과가 확인되었다.

<시험예 2> 마우스에 있어서 거친 피부 회복 시험

(1) 방법

(a) 실험 동물

시험 개시시 9 주된 헤어리스마우스 1 군 5 마리를 사용하였다.

(b) 측정 장치 및 조건

경피 수분 증산량(이하, TEWL라고 약기함)은 연속 발한 측정 장치 하이드로그래프 AMU-100(케이앤드에스사 제조)을 사용하여 다음과 같이 측정하였다.

1 ㎠의 캡슐을 피부에 밀착시켜 캡슐내에 질소 가스를 도입(300 ㎖/분)하여 캡슐에 송출하기 전과, 캡슐로부터 회수된 후의 질소 가스 중의 수증기량을 측정하였다. 이 값의 차이로부터 1 분당 피부 1 ㎠로부터 증산되는 수분량(㎎/cm 을 산출하여 TEWL로 하였다.

(b) 시료와 실험 방법

기제(프로필렌글리콜:에탄올=3:7)를 사용하여, 실시예 4의 화합물[화학식 6으로 표시되는 화합물]을 0.1 ％, 1.0 ％의 농도로 제조하였다. 이 제조 후의 시료 0.05 ㎖를 미리 TEWL을 측정한 무모(無毛) 마우스의 배면 피부(직경 2.5 cm)에 1일 1회, 일주일 동안 5회의 빈도로 4주 동안 연속 도포를 하였다. 그 후, 사전 도포의 최종 도포로부터 3일째에 자외선 B 파장(UVB)을 0.15 J/㎠, 1회 조사하였다. UVB 조사 전, 조사 후 3 및 4 일째의 TEWL을 측정하고, 기제 도포 전의 TEWL에 대한 비율로 비교 평가하였다.

(2) 결과

도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, N-[2-(β-D-갈락토피라노실옥시)-1-(헥실카르바모일)에틸]옥타데카노일아미드[실시예 4의 화합물; 화학식 6의 화합물]은 1.0 ％의 농도에서 p<0.01 (Dunnett 다중 검정)의 위험율로 기제만 비교하여 유의하게 TEWL의 값이 감소되고, 거친 피부가 개선되어 있었다.

<실시예 5>

실시예 1 내지 4에서 얻은 갈락토실세라미드 유사체의 10 ％ 에탄올 용액 1O g을 온수욕으로 80 ℃에서 가온하여 혼합된 하기 성분을 가하여 100 g의 4종의 로션을 얻었다.

락트산 0.3 g

시트르산나트륨 0.1 g

글리세린 2.0 g

방부제, 향료 및 계면활성제 적당량

정제수 10O g을 총량으로 하는 잔량

이상에서 기재한 바와 같이, 본 발명은 간편하고 또한 쉽게 합성 가능한 표피의 β-글루코세레브로시다제 활성화제를 제공할 수 있는 것은 분명하다. 또한, 본 발명에 의해서 거친 피부의 예방과 방어 및 각종 피부 질환의 개선이 가능해진다.

Claims

하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 갈락토실세라미드 유사체.

<화학식 1>

<화학식 2>

상기 식에서,

X 및 Y는 S 또는 0이고,

R¹및 R²는 탄소수 9 내지 35의 알킬기 또는 알케닐기이며,

R³은 탄소수 2 내지 30의 알킬기 또는 알케닐기이다.
하기 화학식 3으로 표시되는 갈락토실세라미드 유사체.

<화학식 3>
하기 화학식 4로 표시되는 갈락토실세라미드 유사체.

<화학식 4>
하기 화학식 5로 표시되는 갈락토실세라미드 유사체.

<화학식 5>
하기 화학식 6으로 표시되는 갈락토실세라미드 유사체.

<화학식 6>
제1항에 기재된 갈락토실세라미드 유사체를 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제.
제1항에 기재된 갈락토실세라미드 유사체를 유효 성분으로 하는 β-글루코세레브로시다제 활성화제.
제6항에 있어서, 화학식 1 또는 2로 표시되는 갈락토실세라미드 유사체를 0.005 내지 5.0 질량％ 함유하는 피부 외용제.
제6항에 있어서, 화학식 1 또는 2로 표시되는 갈락토실세라미드 유사체를 0.01 내지 3.0 질량％ 함유하는 피부 외용제.
제7항에 있어서, 화학식 1 또는 2로 표시되는 갈락토실세라미드 유사체를 0.005 내지 5.0 질량％ 함유하는 β-글루코세레브로시다제 활성화제.
제7항에 있어서, 화학식 1 또는 2로 표시되는 갈락토실세라미드 유사체를0.01 내지 3.0 질량％ 함유하는 β-글루코세레브로시다제 활성화제.
화학식 1 또는 2로 표시되는 갈락토실세라미드 유사체를 피부에 적용하여, β-글루코세레브로시다제를 활성화하는 것을 특징으로 하는 β-글루코세레브로시다제 활성화 방법.
제12항에 있어서, 화학식 1 또는 2로 표시되는 갈락토실세라미드 유사체를 0.005 내지 5.0 질량％ 함유하는 조성물을 사용하는 것을 특징으로 하는 β-글루코세레브로시다제 활성화 방법.
제12항에 있어서, 화학식 1 또는 2로 표시되는 갈락토실세라미드 유사체를 0.01 내지 3.0 질량％ 함유하는 조성물을 사용하는 것을 특징으로 하는 β-글루코세레브로시다제 활성화 방법.
β-글루코세레브로시다제를 활성화시킴으로써 피부의 거칠음을 개선하는 방법으로, 화학식 1 또는 2로 표시되는 갈락토실세라미드 유사체를 피부에 적용하는 것을 특징으로 하는 거친 피부 개선 방법.