WO2010021034A1 - 皮膚外用剤 - Google Patents

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dimethoxy
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skin
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二郎 高田
菜美 赤穂
和久 松永
善晴 加留部
学 中島
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昭和電工株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to an improvement of a skin external preparation, particularly a skin external preparation containing a ubiquinone analog.
  • skin external preparations such as emulsions, creams, lotions, packs, cleaning agents, dispersions, ointments, detergents, aerosols, patches, poultices, liniments, etc. have the purpose of imparting a prescribed medicinal effect to them.
  • Various medicinal ingredients are added.
  • ubiquinone-10 The most common 2,3-dimethoxy-5-methyl-1,4-benzoquinone compound in mammals is ubiquinone-10, which has a 50-carbon decaisoprenyl group on the side chain of the benzene ring. It is a compound that has very high fat solubility and does not dissolve in water at all. Due to the poor water solubility of ubiquinone-10, there are restrictions on the formulation of ubiquinone-10, for example, the dosage forms that can be formulated in skin external preparations are limited.
  • ubiquinone-10 is widely distributed in the cell membrane, the abundance of ubiquinol-10, which is a highly useful reductant of ubiquinol-10, which has a strong antioxidant activity, is 1/0 compared to ⁇ -tocopherol. It is about 10 and few.
  • the supply of the reductant depends on the ability of the reductase in the body.
  • Formulas using lipids such as emulsions, liposomes, microparticles, and nanoparticles as an aqueous dispersion of ubiquinone-10 are known (Patent Document 1, Patent Document 2, Patent Document 3, and Patent Document 4). Also, a prescription patent (Patent Document 5) using a high concentration surfactant, lipid and polyethylene glycol, a prescription patent consisting of medium chain fatty acid monoglyceride and vegetable oil (Patent Document 6), a mixture of ubiquinone and phospholipid (Patent Reference 7) is cited as a prior art.
  • Patent Document 8 describes that this derivative releases 2,3-dimethoxy-5-methyl-1,4-dihydroxybenzene (reduced form) in vivo. Is not described at all, and there is no description as to whether or not this compound exhibits a medicinal effect as an active ingredient of an external preparation for skin.
  • the present invention has been made in view of the above prior art, and has a specific structure that is highly soluble in water and can release 2,3-dimethoxy-5-methyl-1,4-dihydroxybenzene (reduced form). It aims at providing skin external preparations, such as a whitening agent containing the compound which has, and a hair growth promoter.
  • the present invention relates to the following [1] to [4], for example.
  • OR 1 and OR 2 are each independently a hydroxyl group, A group formed by an esterification reaction between a hydroxyl group and a carboxyl group or carboxylate group of an amino acid, N-acylamino acid, N-alkylamino acid, N, N-dialkylamino acid, pyridinecarboxylic acid or a salt thereof. Yes, OR 1 and OR 2 are not both hydroxyl groups, R 3 is a group represented by the following formula (A);
  • n is an integer of 1 to 10.
  • the 2,3-dimethoxy-5-methyl-1,4-dihydroxybenzenecarboxylic acid ester derivative represented by the above general formula (I) or a salt thereof has high water solubility, and also has a melanin production inhibitory effect and a hair growth promoting effect. Therefore, it is useful as a whitening component and a hair growth promoting component that can be incorporated into a wide range of preparations such as cosmetics, quasi drugs, and pharmaceuticals. Moreover, the skin external preparation of this invention containing this is excellent in the whitening effect and the hair growth promotion effect.
  • FIG. 1 shows the evaluation results of the melanocyte dendrite production inhibitory effect of Example 1.
  • FIG. 1 shows the evaluation results of the melanocyte dendrite production inhibitory effect of Example 1.
  • FIG. 2 shows the evaluation results of the melanin synthesis inhibitory effect of Example 2.
  • UqH-4-DMG represents compound 5 in Table 1
  • UqH-1,4-DMG represents compound 4 in Table 1.
  • FIG. 3 shows the evaluation results of the mouse hair growth promoting effect of Example 3.
  • UqH-4-DMG represents compound 5 in Table 1
  • UqH-1,4-DMG represents compound 4 in Table 1.
  • the skin external preparation of the present invention is characterized by containing a 2,3-dimethoxy-5-methyl-1,4-dihydroxybenzenecarboxylic acid ester derivative represented by the following general formula (I) or a salt thereof.
  • OR 1 and OR 2 are each independently a hydroxyl group or a hydroxyl group and an amino acid, N-acylamino acid, N-alkylamino acid, N, N-dialkylamino acid, pyridinecarboxylic acid or a salt thereof.
  • a carboxyl group or a carboxylate group is a group formed by an esterification reaction, and neither OR 1 nor OR 2 is a hydroxyl group.
  • an amino acid refers to an organic compound having in the molecule at least one unsubstituted amino group and at least one unsubstituted carboxyl group.
  • the amino group and the carboxyl group are preferably bonded with a linear, branched or cyclic alkylene group having 1 to 7 carbon atoms.
  • the branched alkylene group means an alkylene group derived from an alkyl group such as isopropyl, isobutyl, 1-ethylpropyl and the like.
  • the cyclic alkylene group means an alkylene group containing a cyclopentane ring, a cyclohexane ring, a methylcyclohexane ring or the like in the structure. Particularly preferred as the alkylene group are a methylene group and an ethylene group.
  • amino acids examples include glycine from the viewpoint of biocompatibility and water solubility of 2,3-dimethoxy-5-methyl-1,4-dihydroxybenzenecarboxylic acid ester derivatives or salts thereof contained in the external preparation for skin of the present invention.
  • glycine is preferred, and glycine is more preferred.
  • the N-acyl amino acid is an N-acyl form of the amino acid.
  • the acyl group in the N-acyl amino acid include linear or branched acyl groups having 2 to 6 carbon atoms. Examples of such an acyl group include an acetyl group, an n-propanoyl group, an n-butanoyl group, and a tert-butoxycarbonyl group.
  • an acetyl group is preferable from the viewpoint of water solubility of the 2,3-dimethoxy-5-methyl-1,4-dihydroxybenzenecarboxylic acid ester derivative or a salt thereof contained in the external preparation for skin of the present invention.
  • the N-acylamino acid may not have an unsubstituted amino group.
  • the N-alkyl amino acid and the N, N-dialkyl amino acid are an N-alkyl form and an N, N-dialkyl form of the amino acid, respectively.
  • alkyl group in these include linear or branched alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms.
  • alkyl groups include methyl, ethyl, n-propyl, n-butyl, n-pentyl, n-hexyl, isopropyl, isobutyl, 1-methylpropyl, tert- Examples thereof include a butyl group, a 1-ethylpropyl group, and an isoamyl group.
  • 2,3-dimethoxy-5-methyl-1,4-dihydroxybenzenecarboxylic acid ester derivatives or salts thereof containing 3 or less alkyl groups contained in the skin external preparation of the present invention are preferable.
  • a methyl group and an ethyl group are particularly preferable.
  • N-alkyl amino acids and N, N-dialkyl amino acids may not have an unsubstituted amino group.
  • the salt of the amino acid, N-acyl amino acid, N-alkyl amino acid, N, N-dialkyl amino acid, or pyridinecarboxylic acid is preferably a hydrogen halide salt or an alkyl sulfonate salt.
  • OR 1 and OR 2 are groups formed by an esterification reaction between a hydroxyl group and a carboxylate group of a hydrogen halide salt such as an amino acid, 2,3 represented by the above general formula (I) -Dimethoxy-5-methyl-1,4-dihydroxybenzenecarboxylic acid ester derivatives are also present in the form of salts.
  • the salt often has a higher melting point than the original quinone compound, and has the advantage that it is easy to handle during formulation.
  • the hydrogen halide salt hydrochloride, hydrobromide and the like are preferable.
  • alkyl sulfonate include methane sulfonate.
  • R 3 is a group represented by the following formula (A).
  • n is an integer of 1 to 10, preferably an integer of 6 to 10.
  • R 3 is the same as R 3 in the general formula (I).
  • the reducing agent used here include sodium borohydride, sodium hydrosulfite, tri-n-butylphosphine, zinc chloride, and stannous chloride.
  • the compound represented by the general formula (I) can be produced by an esterification reaction with a functional acid derivative by a conventional method.
  • the amino group of the amino acid, the secondary amino group or the side chain of the amino acid Each functional group present is tert-butoxycarbonyl group (hereinafter abbreviated as “t-BOC group”), benzyloxycarbonyl group (hereinafter abbreviated as “Z group”), 9-fluorenylmethoxycarbonyl group (hereinafter “ Protected with a suitable protecting group such as “FMOC group”), dicyclohexylcarbodiimide (hereinafter abbreviated as “DCC”), 1-methyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride (hereinafter “EDC”)
  • an active esterification reagent such as N, N-disuccinimid oxalate
  • N, N-dialkylamino acid or pyridinecarboxylic acid gives a preferable result by using the hydrogen halide salt thereof and carrying out the esterification reaction in the presence of an active esterification reagent such as DCC, EDC, or DSO.
  • an active esterification reagent such as DCC, EDC, or DSO.
  • pyridine is preferred as the reaction solvent.
  • a carboxyl group or a carboxylate group of the amino acid or the like is activated with an acid halogenite, particularly an acid chloride, and the esterification reaction (the 2,3-dimethoxy-5-methyl-1 is performed). , Reaction with 4-dihydroxybenzene compound) gives favorable results.
  • the solvent is preferably an anhydrous benzene / anhydrous pyridine mixture.
  • the 2,3-dimethoxy-5-methyl-1,4-dihydroxybenzenecarboxylic acid ester derivative hydrogen halide salt and alkyl sulfonate salt contained in the external preparation for skin of the present invention can be released by the conventional method. It can be produced by reacting 3-dimethoxy-5-methyl-1,4-dihydroxybenzenecarboxylic acid ester derivative with hydrogen halide or alkylsulfonic acid.
  • the 2,3-dimethoxy-5-methyl-1,4-dihydroxybenzenecarboxylic acid ester derivative is produced by introducing a protecting group into an amino acid or the like, the halogenated by a conventional method after producing the compound. Upon deprotection with hydroacid, the compound is deprotected and simultaneously becomes a hydrohalide salt.
  • the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof is a compound having a whitening effect, which exhibits a remarkable inhibitory action in a melanocyte growth and melanin production inhibition test using a human skin three-dimensional culture model.
  • the compound represented by the above general formula (I) or a salt thereof is a compound having a hair growth promoting effect that exhibits a remarkable hair growth promoting effect in a hair growth promoting effect test using C3H mice.
  • the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof has high water solubility and can be easily blended into an aqueous skin external preparation. As a result, it is not necessary to separately add an additive such as a surfactant to solubilize the compound and its salt, and the compound is advantageous in terms of formulation and safety.
  • the “whitening effect” does not only refer to the inhibitory effect on melanin production, but includes, for example, suppression of pigmentation, skin dullness, prevention and improvement of skin darkening due to sunburn, etc. Including the effect, it should be interpreted in the broadest sense.
  • the skin external preparation of the present invention contains a 2,3-dimethoxy-5-methyl-1,4-dihydroxybenzenecarboxylic acid ester derivative represented by the above general formula (I) or a salt thereof.
  • the content thereof is preferably 0.00001 to 6% by mass, more preferably 0.01 to 1% by mass, based on the entire external preparation for skin (100% by mass).
  • the compound can be stably blended into a skin external preparation, and the skin external preparation having such a blend can exhibit excellent medicinal effects.
  • the preparation form of the external preparation for skin of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include emulsions, creams, lotions, packs, cleaning agents, dispersions, ointments, detergents, aerosols, patches, poultices, liniments and the like.
  • the external preparation for skin of the present invention may be any of the above-described cosmetics or external medicines.
  • components that are usually used in preparations such as cosmetics, quasi-drugs, and external medicines, that is, water, alcohol, Oil agent, surfactant, metal soap, gelling agent, powder, alcohol, water-soluble polymer, film forming agent, resin, UV protection agent, inclusion compound, antibacterial agent, fragrance, deodorant, salt, pH Conditioner, refresher, animal / microbe-derived extract, plant extract, blood circulation promoter, astringent, antiseborrheic agent, whitening agent, anti-inflammatory agent, active oxygen scavenger, cell activator, moisturizer, chelating agent , Keratolytic agents, rinse agents, enzymes, hormone agents, vitamins, and the like.
  • Dioxane was distilled off under reduced pressure, and 50 ml of an aqueous sodium hydrogen carbonate solution (0.5 ⁇ M) was added, followed by washing with 100 ml of ethyl acetate.
  • the ethyl acetate layer was washed with 50 ml of aqueous sodium bicarbonate solution, and the aqueous layers were combined and made acidic (pH 3) by adding aqueous citric acid solution (0.5M) under ice cooling. After saturating sodium chloride, ethyl acetate was added. (100 ml100x 3).
  • 2,3-dimethoxy-5-methyl-6-decaisoprenyl-1,4-dihydroxybenzene was added with 2.8 mmol of Nt-BOC amino acid, 2.8 mmol of DCC, and 30 ml of anhydrous pyridine, and the atmosphere was replaced with argon gas. Thereafter, the mixture is stirred at room temperature for 24 hours.
  • 2,3-Dimethoxy-5-methyl-6-decaisoprenylbenzene 1,4-bis-Nt-BOC-amino acid ester is dissolved in a small amount of acetone, and hydrochloric acid-dioxane (3.5 N) is dissolved in the amount of ester bond. Deprotection is performed by adding an amount corresponding to about 20 times the amount of hydrochloric acid. After completion of the reaction, the solvent is distilled off under reduced pressure, and the residue is recrystallized with acetone to obtain 2,3-dimethoxy-5-methyl-6-decaisoprenylbenzene 1,4-bisamino acid ester hydrochloride.
  • Manufacturing method B 1.16 mmol of 2,3-dimethoxy-5-methyl-6-decaisoprenyl-1,4-benzoquinone (ubiquinone-10) is dissolved in 100 ml of isopropyl ether, and 2.8 mmol of sodium borohydride is dissolved in 15 ml of methanol. Suspended in water and stirred at room temperature until the yellow solution is colorless.
  • ubiquinone-10 2,3-dimethoxy-5-methyl-6-decaisoprenyl-1,4-benzoquinone
  • 2,3-dimethoxy-5-methyl-6-decaisoprenyl-4-hydroxybenzene 1-Nt-BOC-amino acid ester, or 2,3-dimethoxy-5-methyl-6-decaisoprenyl-1- Hydroxybenzene 4-Nt-BOC-amino acid ester is dissolved in a small amount of acetone, and hydrochloric acid-dioxane (3.5 N) is added in an amount corresponding to the amount of hydrochloric acid about 20 times the amount of ester bond to perform deprotection. .
  • 2,3-Dimethoxy-5-methyl-6-decaisoprenyl-1,4-dihydroxybenzene was added with 2.8 mmol of N, N-dialkylamino acid hydrochloride, 2.8 mmol of DCC, and 30 ml of anhydrous pyridine, and the atmosphere was replaced with argon gas. And stirred for 24 hours at room temperature.
  • 2,3-dimethoxy-5-methyl-6-decaisoprenylbenzene 1,4-bis-N, N-dialkylamino acid ester is dissolved in a small amount of n-hexane, 2-fold molar amount of hydrochloric acid-dioxane is added, and the solvent is reduced in pressure. The residue is recrystallized with acetone to obtain hydrochloride of 2,4-dimethoxy-5-methyl-6-decaisoprenylbenzene 1,4-bis-N, N-dialkylamino acid ester.
  • 2,3-Dimethoxy-5-methyl-6-decaisoprenyl-1,4-dihydroxybenzene was added with 2.8 mmol of N, N-dialkylamino acid hydrochloride, 2.8 mmol of DCC, and 30 ml of anhydrous pyridine, and the atmosphere was replaced with argon gas. And stirred for 24 hours at room temperature.
  • the solvent is distilled off under reduced pressure, the residue is suspended in distilled water, sodium bicarbonate is added to adjust the pH to 7 to 8, and then the soluble fraction is extracted with ethyl acetate (100 ml ⁇ 3 times). The extract was dehydrated with anhydrous sodium sulfate and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • N-alkylamino acids are used instead of amino acids (the protected product obtained by reacting N-alkylamino acids with di-tertbutyldicarbonate is N -Alkyl-Nt-BOC amino acid), or by using N-alkyl-Nt-BOC amino acid in place of Nt-BOC amino acid in production method B, 2,3-dimethoxy-5- Methyl-6-decaisoprenylbenzene 1,4-bis-N-alkylamino acid ester hydrochloride, 2,3-dimethoxy-5-methyl-6-decaisoprenyl-4-hydroxybenzene 1-N-alkylamino acid ester And hydrochloride of 2,3-dimethoxy-5-methyl-6-decaisoprenyl-1-hydroxybenzene 4-N-alkylamino acid ester can be obtained. it can.
  • Tables 1 and 3 below show specific chemical formulas, physical properties, and production methods of the compounds according to the present invention.
  • Table 2 shows mass spectrometry (m / z, FAB-MS) and nuclear magnetic resonance spectrum ( 1 H-NMR, ⁇ (ppm, internal standard TMS)) for the compounds of compound numbers 1 to 6.
  • Example 1 ⁇ Inhibition of melanocyte dendrite formation> Using the MEL-300 human skin three-dimensional model (normal human skin keratinocytes including normal human epidermal melanocytes), the melanin production inhibitory effect of compounds 4 and 5 shown in Table 1 was evaluated.
  • the MEL-300 skin model cup was transferred to a 6-well plate containing 0.9 ml of EPI-100-LLMM maintenance medium and preincubated for 1 hour at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the maintenance medium was removed by aspiration and replaced with 5 ml of a new maintenance medium, and 0.1 ml of a 30 mmol / l solution of Compound 4 or Compound 5 was added to the MEL-300 skin model cup and cultured. 0.1 ml of 0.2% ethanol solution was added to the control group.
  • the maintenance medium and the test substance were changed every 2 days and cultured for 7 days. After 7 days of culturing, a cell photograph inside the three-dimensional human skin model cup was taken, and the ratio (%) of melanocyte area was calculated by image analysis.
  • Example 2 ⁇ Melanin synthesis inhibition test> Using the MEL-300 human skin three-dimensional model (normal human skin keratinocytes including normal human epidermal melanocytes), the melanin production inhibitory effect of Compound 4 or Compound 5 shown in Table 1 was evaluated.
  • the MEL-300 skin model cup was transferred to a 6-well plate containing 0.9 ml of EPI-100-LLMM maintenance medium and preincubated for 1 hour at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the maintenance medium was removed by aspiration and replaced with 5 ml of a new maintenance medium, and 0.1 ml of a 30 mmol / l solution of Compound 4 and Compound 5 was added to the MEL-300 skin model cup and cultured. 0.1 ml of 0.2% ethanol solution was added to the control group. 0.1 ml of a 30 mmol / l kojic acid solution was added to the positive control group.
  • the maintenance medium and the test substance were changed every 2 days and cultured for 14 days. After 14 days of culture, remove the cultured skin pieces from the MEL-300 skin model cup, immerse in 0.2 ml of 1% SDS solution containing 0.05 mM EDTA and 1% Tris-HCl solution, and add 0.02 ml of 5 mg / mL proteinase K solution. , Reacted at 37 ° C. overnight.
  • reaction solution was thoroughly stirred to completely break the cultured skin pieces.
  • Add 0.025 ml of 500 mM sodium carbonate solution and 0.005 ml of 30% hydrogen peroxide solution to the reaction solution, heat at 80 ° C. for 30 minutes, cool and then add 0.1 ml of chloroform / methanol solution (2: 1 (vol / vol)). In addition, it was centrifuged. The absorbance at 405 nm of the obtained supernatant was measured.
  • a calibration curve was prepared from the absorbance of each concentration of melanin solution treated in the same manner, and the amount of melanin in the cultured skin pieces was quantified.
  • Example 3 ⁇ Mouse hair growth promotion effect> Seven-week-old male C3H / HeN, which is the resting period of the hair cycle, was used.
  • the back of the mouse is shaved with an electric hair clipper (0.05 mm blade) and an electric shaver, and 0.1 ml each of 50 ⁇ mol / g salmon ointment of Compound 4 or Compound 5 once a day from the day after shaving to the shaved site.
  • an electric hair clipper 0.05 mm blade
  • an electric shaver 0.1 ml each of 50 ⁇ mol / g salmon ointment of Compound 4 or Compound 5 once a day from the day after shaving to the shaved site.
  • a corn large stick was used for application, and only the application stimulus by the corn large stick was given to the control group.
  • the image of the back of the mouse on the 18th day from the start of application was taken, the ratio of the hair regeneration area to the total shaved area was calculated by image analysis, and the obtained value was defined as the hair regeneration rate (%).
  • the significance test was performed by the Post-hoc test (Scheffe method), and the significance level was 5%.

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Abstract

　本発明は、水への溶解性が高く、且つ2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ジヒドロキシベンゼン（還元型）を放出できる特定の構造を有する化合物を含有する美白剤および発毛促進剤などの皮膚外用剤を提供することを目的とする。 　本発明の皮膚外用剤は、下記一般式（I）で表される2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ジヒドロキシベンゼンカルボン酸エステル誘導体またはその塩を含有することを特徴とする。 （上記式（I）中Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は特定の基である。）

Description

皮膚外用剤
　本発明は皮膚外用剤、特にユビキノン類縁体を含有する皮膚外用剤の改良に関する。
　従来、乳液、クリーム、化粧水、パック、洗浄料、分散液、軟膏、洗剤、エアゾール、貼付剤、パップ剤、リニメント剤等の皮膚外用剤には、これらに所定の薬効を付与することを目的として種々の薬効成分が加えられている。
　哺乳動物に最も多く存在する2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ベンゾキノン化合物はユビキノン-10であり、ユビキノン-10はベンゼン環の側鎖に炭素50個からなるデカイソプレニル基を有するため脂溶性が非常に高く、水に全く溶けない化合物である。このユビキノン-10の水難溶性により、皮膚外用剤において配合可能な剤形が限定されるなど、ユビキノン-10には配合上の制約がある。
　一方、ユビキノン-10は細胞膜中に広く分布するが、抗酸化作用が強く非常に有用なユビキノン-10の還元体であるユビキノール-10の細胞膜中存在量は、α-トコフェロールに比較して１／１０程度であり少ない。2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ジヒドロキシベンゼン化合物（還元型）の抗酸化作用を効率よく発揮させるためには効率的な還元体の供給が望まれる。しかしながら、還元体の供給は体内の還元酵素の能力に依存しているのが現状である。
　ユビキノン-10の水分散系としてエマルジョン、リポソーム、ミクロ粒子、ナノ粒子などの脂質を用いる処方が公知である（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４）。また、高濃度の界面活性剤と脂質とポリエチレングリコールとを使用する処方特許（特許文献５）、中鎖脂肪酸モノグリセリドと植物油からなる処方特許（特許文献６）、ユビキノンとリン脂質との混合物（特許文献７）が従来技術として挙げられる。
　これらの文献に記載の技術は、いずれも酸化型の2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ベンゾキノン化合物の水分散系を作ることによってユビキノン-10の難溶性の問題を解決するものであり、還元体である2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ジヒドロキシベンゼン化合物のバイオアベイラビリティの確保のための問題は解決できていなかった。
　そこで、2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ベンゾキノン化合物の水難溶性に起因する薬物送達上の問題と、その2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ジヒドロキシベンゼン（還元型）への還元過程による薬物送達上の問題を同時に解決できる2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ジヒドロキシベンゼン化合物の誘導体が提案されている（特許文献８）。
　しかし、特許文献８には、この誘導体が生体内で2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ジヒドロキシベンゼン（還元型）を放出することが記載されているが、この化合物が示す薬効については何ら記載されておらず、この化合物が皮膚外用剤の有効成分としての薬効を示すか否かについては全く記載がない。
WO 95/05164 米国特許No. 4,824,669 米国特許No. 4,636,381 米国特許No. 4,483,873 WO 86/04503 特開昭６３－１８８６２３ 米国特許No. 4,684,520 特開２００３－１０４９４５
　本発明は上記従来技術に鑑みてなされたもので、水への溶解性が高く、且つ2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ジヒドロキシベンゼン（還元型）を放出できる特定の構造を有する化合物を含有する美白剤および発毛促進剤などの皮膚外用剤を提供することを目的とする。
　本発明者らは前記課題を解決するため鋭意検討した結果、2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ジヒドロキシベンゼンカルボン酸エステル誘導体またはその塩が上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させるにいたった。
　本発明は、たとえば以下の［１］～［４］に関する。
　［１］下記一般式（I）で表される2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ジヒドロキシベンゼンカルボン酸エステル誘導体またはその塩を含有する皮膚外用剤：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
（上記式（I）中ＯＲ1およびＯＲ2はそれぞれ独立にヒドロキシル基あるいは、
ヒドロキシル基と、アミノ酸、Ｎ-アシルアミノ酸、Ｎ-アルキルアミノ酸、Ｎ，Ｎ-ジアルキルアミノ酸、ピリジンカルボン酸またはそれらの塩のカルボキシル基もしくはカルボキシレート基とがエステル化反応することにより形成された基であり、
　ＯＲ1およびＯＲ2がともにヒドロキシル基であることはなく、
　R3は下記式（Ａ）で表される基である；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
上記式（Ａ）において、ｎは１～１０の整数である。）。
　［２］美白剤として使用されることを特徴とする上記［１］に記載の皮膚外用剤。
　［３］発毛促進剤として使用されることを特徴とする上記［１］に記載の皮膚外用剤。
　［４］抗酸化剤として使用されることを特徴とする上記［１］に記載の皮膚外用剤。
　前記一般式（Ｉ）で表される2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ジヒドロキシベンゼンカルボン酸エステル誘導体またはその塩は、水溶性が高く、しかもメラニン生成抑制効果および発毛促進効果を示すことから、化粧料、医薬部外品、医薬品等の幅広い製剤への配合が可能な美白成分および発毛促進成分として有用である。また、これを含有する本発明の皮膚外用剤は、美白効果及び発毛促進効果に優れている。
図１は、実施例１のメラノサイト樹状突起生成抑制効果の評価結果を示す。図１において、UqH-4-DMGは表１の化合物５を、UqH-1,4-DMGは表１の化合物４を示す。 図２は、実施例２のメラニン合成抑制効果の評価結果を示す。図２において、UqH-4-DMGは表１の化合物５を、UqH-1,4-DMGは表１の化合物４を示す。 図３は、実施例３のマウス体毛成長促進効果の評価結果を示す。図３において、UqH-4-DMGは表１の化合物５を、UqH-1,4-DMGは表１の化合物４を示す。
　以下、本発明の好適な実施形態について説明する。
　本発明の皮膚外用剤は、下記一般式（I）で表される2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ジヒドロキシベンゼンカルボン酸エステル誘導体またはその塩を含有することを特徴としている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
上記式（I）において、ＯＲ1およびＯＲ2はそれぞれ独立にヒドロキシル基あるいは、ヒドロキシル基と、アミノ酸、Ｎ-アシルアミノ酸、Ｎ-アルキルアミノ酸、Ｎ，Ｎ-ジアルキルアミノ酸、ピリジンカルボン酸またはそれらの塩のカルボキシル基もしくはカルボキシレート基とがエステル化反応することにより形成された基であり、ＯＲ1およびＯＲ2がともにヒドロキシル基であることはない。
　本明細書においてアミノ酸は、少なくとも一つの置換されていないアミノ基と、少なくとも一つの置換されていないカルボキシル基とを分子内に有する有機化合物を指す。なお、本明細書においては、前記アミノ基にはイミノ基（＝ＮＲまたは－ＮＲ－で表される二価の基、Ｒは水素または置換基を示す。）が含まれるものとする。
　前記アミノ酸において、アミノ基とカルボキシル基との間は、好ましくは炭素数１～７の直鎖、分岐または環状のアルキレン基で結合される。分岐状のアルキレン基とは、例えばイソプロピル、イソブチル、１-エチルプロピルなどのアルキル基から誘導されたアルキレン基を意味する。環状アルキレン基とは、シクロペンタン環、シクロヘキサン環、あるいはメチルシクロヘキサン環などを構造中に含むアルキレン基を意味する。アルキレン基として特に好ましいのは、メチレン基およびエチレン基である。
　前記アミノ酸としては、本発明の皮膚外用剤に含有される2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ジヒドロキシベンゼンカルボン酸エステル誘導体またはその塩の生体親和性および水溶性の点から、グリシンおよびアラニンが好ましく、グリシンがより好ましい。
　前記Ｎ－アシルアミノ酸は、前記アミノ酸のＮ－アシル体である。Ｎ－アシルアミノ酸におけるアシル基としては、直鎖または分岐を有する炭素数２～６のアシル基が挙げられる。このようなアシル基の例としては、アセチル基、ｎ－プロパノイル基、ｎ－ブタノイル基、tert-ブトキシカルボニル基が挙げられる。アシル基としては、本発明の皮膚外用剤に含有される2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ジヒドロキシベンゼンカルボン酸エステル誘導体またはその塩の水溶性の点から、アセチル基が好ましい。なお、Ｎ－アシルアミノ酸は、置換されていないアミノ基を有していなくてもよい。
　前記Ｎ-アルキルアミノ酸およびＮ，Ｎ-ジアルキルアミノ酸は、それぞれ前記アミノ酸のＮ－アルキル体およびＮ，Ｎ－ジアルキル体である。これらにおけるアルキル基としては、たとえば直鎖または分岐を有する炭素数１～６のアルキル基が挙げられる。このようなアルキル基の例としては、メチル基、エチル基、ｎ-プロピル基、ｎ-ブチル基、ｎ-ペンチル基、ｎ-ヘキシル基、イソプロピル基、イソブチル基、１-メチルプロピル基、tert-ブチル基、１-エチルプロピル基、イソアミル基などが挙げられる。これらの中でも、本発明の皮膚外用剤に含有される2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ジヒドロキシベンゼンカルボン酸エステル誘導体またはその塩の水溶性の点から炭素数３以下のアルキル基が好ましく、特にメチル基およびエチル基が好ましい。なお、Ｎ-アルキルアミノ酸およびＮ，Ｎ-ジアルキルアミノ酸は、置換されていないアミノ基を有していなくてもよい。
　また前記アミノ酸、Ｎ-アシルアミノ酸、Ｎ-アルキルアミノ酸、Ｎ，Ｎ-ジアルキルアミノ酸、ピリジンカルボン酸の塩は、ハロゲン化水素塩またはアルキルスルフォン酸塩であることが好ましい。前記ＯＲ1およびＯＲ2がヒドロキシル基とアミノ酸などのハロゲン化水素塩のカルボキシレート基とがエステル化反応することにより形成された基であると、上記一般式（I）で表される2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ジヒドロキシベンゼンカルボン酸エステル誘導体も塩の状態で存在する。塩は融点が原体のキノン化合物よりも高い場合が多く、製剤化にあたっての取り扱いが容易であるという利点がある。ハロゲン化水素塩としては、塩酸塩、臭化水素塩などが好ましい。また、前記アルキルスルフォン酸塩としては、メタンスルフォン酸塩などが例示される。
　上記一般式（I）において、R3は下記式（Ａ）で表される基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
上記式（Ａ）において、ｎは１～１０の整数であり、好ましくは６～１０の整数である。
　前記一般式（I）で表される化合物の製造方法は種々考えられるが、代表的な方法を述べれば以下の通りである。下記一般式（II）で表される2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ベンゾキノン化合物を還元剤で還元し、下記一般式（III）で表される2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ジヒドロキシベンゼン化合物とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
一般式（II）および（III）において、Ｒ3は上記一般式（I）におけるＲ3と同じである。ここで用いる還元剤としては、水素化ホウ素ナトリウム、ハイドロサルファイトナトリウム、トリーｎ-ブチルフォスフィン、塩化亜鉛、塩化第１スズなどを挙げることができる。
　この2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ジヒドロキシベンゼン化合物と、アミノ酸、Ｎ-アシルアミノ酸、Ｎ-アルキルアミノ酸、Ｎ，Ｎ-ジアルキルアミノ酸、ピリジンカルボン酸もしくはそれらの塩またはそれらの反応性酸誘導体とを常法によりエステル化反応させることにより、前記一般式（Ｉ）で表される化合物を製造することができる。
　本発明の皮膚外用剤に含有される2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ジヒドロキシベンゼンカルボン酸エステル誘導体の製造に際しては、アミノ酸のアミノ基、２級アミノ基あるいはアミノ酸の側鎖に存在する各官能基をtert-ブトキシカルボニル基（以下「t-BOC基」と略記。）、ベンジルオキシカルボニル基（以下「Z基」と略記。）、９-フルオレニルメトキシカルボニル基（以下「FMOC基」と略記。）などの適切な保護基で保護し、ジシクロヘキシルカルボジイミド（以下「DCC」と略記。）、塩酸１-メチル-３-（３-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド（以下「EDC」と略記。）、Ｎ，Ｎ-ジサクシニミドオギザレート（以下「DSO」と略記。）などの活性エステル化試薬の存在下に前記エステル化反応を行うことが好ましい結果を与える。
　またＮ，Ｎ-ジアルキルアミノ酸またはピリジンカルボン酸はそのハロゲン化水素塩を用いて、前記DCC、EDC、DSOなどの活性エステル化試薬の存在下に前記エステル化反応を行うことが好ましい結果を与える。この際反応溶媒としてはピリジンが好ましい。
　また、前記反応性酸誘導体を用いる方法では、前記アミノ酸等のカルボキシル基もしくはカルボキシレート基を酸ハロゲナイトとりわけ酸クロリドで活性化して、前記エステル化反応（前記2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ジヒドロキシベンゼン化合物との反応）を行う方法が好ましい結果を与える。この際溶媒としては無水ベンゼン－無水ピリジン混合物が好ましい。
　本発明の皮膚外用剤に含有される2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ジヒドロキシベンゼンカルボン酸エステル誘導体のハロゲン化水素塩およびアルキルスルフォン酸塩は、常法により遊離の前記2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ジヒドロキシベンゼンカルボン酸エステル誘導体とハロゲン化水素またはアルキルスルフォン酸とを反応させて製造することができる。
　なお、アミノ酸等に保護基を導入して前記2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ジヒドロキシベンゼンカルボン酸エステル誘導体を製造した場合は、該化合物を製造した後、常法によりハロゲン化水素酸で脱保護すると、前記化合物は脱保護されると同時にハロゲン化水素酸塩となる。
　前記一般式（I）で表される化合物又はその塩は、ヒト皮膚三次元培養モデルを用いたメラノサイトの成長およびメラニン生成抑制試験において顕著な抑制作用を示す、美白効果を持つ化合物である。
　また、前記一般式（I）で表される化合物又はその塩は、C3Hマウスを用いた体毛成長促進効果試験において顕著な体毛成長促進効果を示す、発毛促進作用を持つ化合物である。
　さらに、前記一般式（I）で表される化合物又はその塩は、水溶性が高く、水性皮膚外用剤への配合が容易である。その結果、前記化合物及びその塩の可溶化のために界面活性剤等の添加剤を別途添加する必要がなく、前記化合物は配合上及び安全性上有利である。
　なお、本明細書において、「美白効果」とは、メラニン生成に対する抑制効果のみをいうのではなく、例えば、色素沈着の抑制、肌のくすみ、日焼け等による皮膚の黒化の防止及び改善等の効果を含み、最も広義に解釈されるべきである。
　本発明の皮膚外用剤は、上記一般式（I）で表される2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ジヒドロキシベンゼンカルボン酸エステル誘導体又はその塩を含有する。その含有量は、皮膚外用剤全体（100質量％）に対して好ましくは0.00001～6質量％、より好ましくは0.01～1質量％である。この範囲内であると、前記化合物を安定に皮膚外用剤に配合することができ、そのような配合がなされた皮膚外用剤は、優れた薬効を発揮できる。
　本発明の皮膚外用剤の製剤形態は特に限定されず、例えば、乳液、クリーム、化粧水、パック、洗浄料、分散液、軟膏、洗剤、エアゾール、貼付剤、パップ剤、リニメント剤等が挙げられる。本発明の皮膚外用剤は上記のいずれの形態の化粧料であっても外用医薬品であってもよい。
　本発明の皮膚外用剤には、必要に応じて本発明の効果を損なわない範囲で、通常、化粧料や医薬部外品、外用医薬品等の製剤に使用される成分、すなわち、水、アルコール、油剤、界面活性剤、金属石けん、ゲル化剤、粉体、アルコール類、水溶性高分子、皮膜形成剤、樹脂、紫外線防御剤、包接化合物、抗菌剤、香料、消臭剤、塩類、pH調整剤、清涼剤、動物・微生物由来抽出物、植物抽出物、血行促進剤、収斂剤、抗脂漏剤、美白剤、抗炎症剤、活性酸素消去剤、細胞賦活剤、保湿剤、キレート剤、角質溶解剤、リンス剤、酵素、ホルモン剤、ビタミン類等を含有させることができる。
　以下に実施例を挙げて本発明をさらに説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　[合成例]
　下記製造方法A～Dに示す方法により表１および３に示す2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ジヒドロキシベンゼン誘導体またはその塩を製造した。
　製造方法Ａ
　アミノ酸０．１molを蒸留水-ジオキサン（１：１，v/v）１００mlに溶解し、トリエチルアミン３０mlを加え、ジ-tert-ブチルジカルボネートを徐々に加え３０分間室温で撹拌する。
　減圧下ジオキサンを留去し、炭酸水素ナトリウム水溶液（０．５ M）５０mlを加え酢酸エチル１００mlで洗う。酢酸エチル層を５０mlの炭酸水素ナトリウム水溶液で洗い、水層を合わせて氷冷下でクエン酸水溶液（０．５ M）を加えて酸性（pH３）とし、塩化ナトリウムを飽和させた後、酢酸エチルで抽出する（１００ml x ３）。
　抽出液を無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧下溶媒を留去し、油状残渣にイソプロピルエーテルを加えるか、または冷却して結晶化させて、Ｎ-t-BOC-アミノ酸を得る。
　２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニル-１，４-ベンゾキノン（ユビキノン-１０）１．１６ mmolをイソプロピルエーテル１００ mlに溶解し、水素化ホウ素ナトリウム２．８ mmolをメタノール１５mlに懸濁させて加え、黄色の溶液が無色になるまで室温で撹拌する。
　反応液にアルゴンガスを飽和させた蒸留水１００mlを加えイソプロピルエーテル層を洗う。分液後イソプロピルエーテル層を無水硫酸ナトリウムで脱水し減圧下溶媒を留去し２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニル-１，４-ジヒドロキシベンゼン（ユビキノール-１０）を得る。
　２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニル-１，４-ジヒドロキシベンゼンにＮ-t-BOCアミノ酸２．８mmol、DCC ２．８mmol、無水ピリジン３０mlを加え雰囲気をアルゴンガスに置換した後、室温で２４時間撹拌する。
　溶媒を減圧下留去し、残渣に酢酸エチルを加えて可溶性画分を抽出する（１００ml x ２回）。抽出液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（溶離溶媒；ｎ-ヘキサン：酢酸エチル＝８５：１５）で分離精製し、２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニル-ベンゼン　１，４-ビスーＮ-ｔ-BOC-アミノ酸エステルを得る。
　２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニルベンゼン　１，４-ビスーＮ-ｔ-BOC-アミノ酸エステルを少量のアセトンに溶解し、塩酸-ジオキサン（３．５Ｎ）をエステル結合量の約２０倍量の塩酸量に相当する量加え、脱保護を行う。反応終了後溶媒を減圧留去し、残渣をアセトンで再結晶して２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニルベンゼン　１，４-ビスアミノ酸エステルの塩酸塩を得る。
　製造方法Ｂ
　２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニル-１，４-ベンゾキノン（ユビキノン-１０）１．１６ mmolをイソプロピルエーテル１００ mlに溶解し、水素化ホウ素ナトリウム２．８ mmolをメタノール１５mlに懸濁させて加え、黄色の溶液が無色になるまで室温で撹拌する。
　反応液にアルゴンガスを飽和させた蒸留水１００mlを加えイソプロピルエーテル層を洗う。分液後イソプロピルエーテル層を無水硫酸ナトリウムで脱水し減圧下溶媒を留去し２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニル-１，４-ジヒドロキシベンゼン（ユビキノール-１０）を得る。
　２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニル-１，４-ジヒドロキシベンゼンに、製造方法Ａで合成したＮ-t-BOCアミノ酸１．４mmol、DCC １．４mmol、無水ピリジン３０mlを加え雰囲気をアルゴンガスに置換した後、室温で２４時間撹拌する。溶媒を減圧下留去し、残渣に酢酸エチルを加えて可溶性画分を抽出する（１００ml x ２回）。
　抽出液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（溶離溶媒；ｎ-ヘキサン：酢酸エチル＝８５：１５）で分離精製し、２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニル-４-ヒドロキシベンゼン　１-Ｎ-ｔ-BOC-アミノ酸エステルと２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニル-１-ヒドロキシベンゼン　４-Ｎ-ｔ-BOC-アミノ酸エステルを得る。
　２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニル-４-ヒドロキシベンゼン　１-Ｎ-ｔ-BOC-アミノ酸エステル、若しくは２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニル-１-ヒドロキシベンゼン　４-Ｎ-ｔ-BOC-アミノ酸エステルを少量のアセトンに溶解し、塩酸-ジオキサン（３．５Ｎ）をエステル結合量の約２０倍量の塩酸量に相当する量加え、脱保護を行う。
　反応終了後溶媒を減圧留去し、残渣をアセトンで再結晶して２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニル-４-ヒドロキシベンゼン　１-アミノ酸エステルの塩酸塩、および２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニル-１-ヒドロキシベンゼン　４-アミノ酸エステルの塩酸塩を得る。
　製造方法Ｃ
　２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニル-１，４-ベンゾキノン（ユビキノン-１０）１．１６ mmolをイソプロピルエーテル１００ mlに溶解し、水素化ホウ素ナトリウム２．８ mmolをメタノール１５mlに懸濁させて加え、黄色の溶液が無色になるまで室温で撹拌する。
　反応液にアルゴンガスを飽和させた蒸留水１００mlを加えイソプロピルエーテル層を洗う。分液後イソプロピルエーテル層を無水硫酸ナトリウムで脱水し減圧下溶媒を留去し２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニル-１，４-ジヒドロキシベンゼン（ユビキノール-１０）を得る。
　２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニル-１，４-ジヒドロキシベンゼンに塩酸Ｎ，Ｎ-ジアルキルアミノ酸２．８mmol、DCC ２．８mmol、無水ピリジン３０mlを加え雰囲気をアルゴンガスに置換した後、室温で２４時間撹拌する。
　溶媒を減圧下留去し、残渣を蒸留水に懸濁させ炭酸水素ナトリウムを加えてpH７～８にした後に酢酸エチルで可溶性画分を抽出する（１００ml x ３回）。抽出液を無水硫酸ナトリウムで脱水後減圧下溶媒を留去し，残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（溶離溶媒；ｎ-ヘキサン：酢酸エチル＝８５：１５）で分離精製し、２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニルベンゼン　１，４-ビスーＮ，Ｎ-ジアルキルアミノ酸エステルを得る。
　２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニルベンゼン　１，４-ビスーＮ，Ｎ-ジアルキルアミノ酸エステルを少量のｎ-ヘキサンに溶解し２倍モル量の塩酸-ジオキサンを加え溶媒を減圧下留去し、残渣をアセトンで再結晶して２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニルベンゼン　１，４-ビスーＮ，Ｎ-ジアルキルアミノ酸エステルの塩酸塩を得る。
　製造方法Ｄ
　２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニル-１，４-ベンゾキノン（ユビキノン-１０）１．１６ mmolをイソプロピルエーテル１００ mlに溶解し、水素化ホウ素ナトリウム２．８ mmolをメタノール１５mlに懸濁させて加え、黄色の溶液が無色になるまで室温で撹拌する。
　反応液にアルゴンガスを飽和させた蒸留水１００mlを加えイソプロピルエーテル層を洗う。分液後イソプロピルエーテル層を無水硫酸ナトリウムで脱水し減圧下溶媒を留去し２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニル-１，４-ジヒドロキシベンゼン（ユビキノール-１０）を得る。
　２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニル-１，４-ジヒドロキシベンゼンに塩酸Ｎ，Ｎ-ジアルキルアミノ酸２．８mmol、DCC ２．８mmol、無水ピリジン３０mlを加え雰囲気をアルゴンガスに置換した後、室温で２４時間撹拌する。溶媒を減圧下留去し、残渣を蒸留水に懸濁させ炭酸水素ナトリウムを加えてpH７～８にした後に酢酸エチルで可溶性画分を抽出する（１００ml x ３回）。抽出液を無水硫酸ナトリウムで脱水後減圧下溶媒を留去し，２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニル-４-ヒドロキシベンゼン　１-Ｎ，Ｎ-ジアルキルアミノ酸エステルと２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニル-１-ヒドロキシベンゼン　４-Ｎ，Ｎ-ジアルキルアミノ酸エステルを得る。
　２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニル-４-ヒドロキシベンゼン　１-Ｎ，Ｎ-ジアルキルアミノ酸エステル、若しくは２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニル-１-ヒドロキシベンゼン　４-Ｎ，Ｎ-ジアルキルアミノ酸エステルを少量のｎ-ヘキサンに溶解し、２倍モル量の塩酸-ジオキサンを加え、溶媒を減圧下留去し、残渣をアセトンで再結晶して２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニル-４-ヒドロキシベンゼン　１-Ｎ，Ｎ-ジアルキルアミノ酸エステルと、２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニル-１-ヒドロキシベンゼン　４-Ｎ，Ｎ-ジアルキルアミノ酸エステルの塩酸塩を得る。
　なお、製造方法ＡおよびＢに準じて、すなわち製造方法Ａにおいてアミノ酸の代わりにＮ－アルキルアミノ酸を使用するか（Ｎ－アルキルアミノ酸にジ‐tertブチルジカルボネートを反応させて得られる保護体をＮ－アルキル－Ｎ－ｔ-BOCアミノ酸という）、または製造方法ＢにおいてＮ-t-BOCアミノ酸のかわりにＮ－アルキル－Ｎ－ｔ-BOCアミノ酸を使用することにより、２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニルベンゼン　１，４-ビス‐Ｎ-アルキルアミノ酸エステルの塩酸塩、２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニル-４-ヒドロキシベンゼン　１-Ｎ-アルキルアミノ酸エステルの塩酸塩および２，３-ジメトキシ-５-メチル-６-デカイソプレニル-１-ヒドロキシベンゼン　４-Ｎ-アルキルアミノ酸エステルの塩酸塩を得ることができる。
　以下、本発明にかかる化合物の具体的化学式およびその物性、製造方法について、表１および３に示す。なお、化合物番号１～６の化合物については、質量分析（m/z，FAB-MS）および核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ-ＮＭＲ，δ（ｐｐｍ，内部標準ＴＭＳ））を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　［実施例１］
　＜メラノサイト樹状突起生成抑制効果＞
　MEL-300ヒト皮膚３次元モデル（正常ヒト表皮メラニン細胞を含む正常ヒト皮膚角化細胞）を用いて，表１に示された化合物４および化合物５のメラニン生成抑制効果を評価した。MEL-300皮膚モデルカップを、EPI-100-LLMM維持培地を0.9 mlずつ入れた６ウェルプレートに移し、１時間、３７℃、5% CO2にてプリインキュベートした。
　維持培地を吸引除去し、新しい維持培地５mlに交換後、MEL-300皮膚モデルカップ内に化合物４または化合物５の30 mmol/l溶液を0.1ml添加し培養した。対照群には0.2%エタノール溶液を0.1ml添加した。
　２日ごとに維持培地および被検物質を交換し，7日間培養した。培養7日後にヒト皮膚3次元モデルカップ内側の細胞写真を撮影し、画像解析によりメラノサイトの面積の割合(%)を算出した。有意差検定はPost-hoc テスト(Scheffe法)により行い、有意水準は5%とした。図１に結果を示すが、図１から明らかな様に、化合物４及び化合物５は有意にメラノサイト樹状突起生成を抑制した。なお、本実験はn=３で行った。
　［実施例２］
　＜メラニン合成抑制試験＞
　MEL-300ヒト皮膚３次元モデル（正常ヒト表皮メラニン細胞を含む正常ヒト皮膚角化細胞）を用いて，表１に示された化合物４または化合物５のメラニン生成抑制効果を評価した。MEL-300皮膚モデルカップを、EPI-100-LLMM維持培地を0.9 mlずつ入れた６ウェルプレートに移し、１時間、３７℃、5% CO2にてプリインキュベートした。
　維持培地を吸引除去し、新しい維持培地５mlに交換後、MEL-300皮膚モデルカップ内に化合物４および化合物５の30 mmol/l溶液を0.1ml添加し培養した。対照群には0.2%エタノール溶液を0.1ml添加した。陽性対照群には30 mmol/lコウジ酸溶液を0.1ml添加した。
　２日ごとに維持培地および被検物質を交換し，１４日間培養した。培養１４日後に、MEL-300皮膚モデルカップより培養皮膚片を取り出し、０．０５mM EDTAおよび１％トリス塩酸溶液を含む１％SDS水溶液0.2mlに浸漬し、５mg／mLプロティナーゼK溶液を0.02ml加え、３７℃で一晩反応させた。
　反応後反応液をよく撹拌し、培養皮膚片を完全に破砕した。反応液に５００mM炭酸ナトリウム溶液0.025mlおよび３０％過酸化水素水0.005mlを加え、８０℃で３０分加温し、冷却後、クロロホルム／メタノール溶液（２：１(vol/vol)）を0.1ml加え、遠心分離した。得られた上清の４０５nmの吸光度を測定した。同様に処理した各濃度のメラニン溶液の吸光度より検量線を作成し、培養皮膚片のメラニン量を定量した。
　有意差検定はPost-hoc テスト(Scheffe法)により行い、有意水準は1%とした。ヒト皮膚３次元モデルに化合物４または化合物５を添加することにより，メラニンの生成量が有意に減少した（図２参照）。このことから、化合物４および化合物５がメラニン生成抑制作用を有し、美白剤として機能することが明らかになった。なお、本実験はn=３で行った。
　［実施例３］
　＜マウス体毛成長促進効果＞
　毛周期の休止期にあたる７週齢の雄性C3H/HeNを使用した。
　マウスの背部被毛を電気バリカン（０．０５mm刃）および電気シェーバーで剃毛し、剃毛翌日から剃毛部位に一日一回、化合物４または化合物５の５０μmol/g 軟膏を０．１mlずつ塗布した。塗布にはコーンラージ棒を用い，対照群にはコーンラージ棒による塗布刺激のみを与えた。
　塗布開始から１８日目のマウス背部画像を撮影し、画像解析により剃毛部総面積に対する被毛再生面積の割合を算出し，得られた数値を毛再生率（％）とした。有意差検定はPost-hoc テスト(Scheffe法)により行い、有意水準は5%とした。
　化合物４または化合物５を含有する軟膏を塗布することにより、毛再生率（％）が有意に増加した（図３参照）。この結果より、化合物４および化合物５が体毛成長促進効果を有することが明らかになった。なお、本実験はn=６、対照群はn＝７で行った。

Claims (4)

  1. 　下記一般式（I）で表される2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ジヒドロキシベンゼンカルボン酸エステル誘導体またはその塩を含有する皮膚外用剤：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （上記式（I）中ＯＲ1およびＯＲ2はそれぞれ独立にヒドロキシル基あるいは、
    ヒドロキシル基と、アミノ酸、Ｎ-アシルアミノ酸、Ｎ-アルキルアミノ酸、Ｎ，Ｎ-ジアルキルアミノ酸、ピリジンカルボン酸またはそれらの塩のカルボキシル基もしくはカルボキシレート基とがエステル化反応することにより形成された基であり、
    　ＯＲ1およびＯＲ2がともにヒドロキシル基であることはなく、
    　R3は下記式（Ａ）で表される基である；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     上記式（Ａ）において、ｎは１～１０の整数である。）。
  2. 　美白剤として使用されることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤。
  3. 　発毛促進剤として使用されることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤。
  4. 　抗酸化剤として使用されることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤。
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