KR100711537B1 - 치료제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신경성장인자 생성증강 활성을 갖는 특정한 화합물 또는 그 염을 유효성분으로서 함유하는 신경성장인자 생성증강을 필요로 하는 질환의 치료제 또는 예방제, 신경성장인자 생성증강제, 또는 신경성장인자 생성증강용 식품, 음료 또는 사료 ; 상기 화합물 또는 그 염을 포유동물에게 투여하는 신경성장인자 생성의 증강방법 ; 및 신경성장인자 생성증강을 필요로 하는 질환의 치료제 또는 예방제, 신경성장인자 생성증강제, 또는 신경성장인자 생성증강용 식품, 음료 또는 사료의 제조에서의 상기 화합물 또는 그 염의 사용을 제공한다. 또한, 신경성장인자 생성증강 활성을 가진 신규 화합물을 제공한다.

Description

치료제{REMEDIES}
본 발명은 신경성장인자 생성증강 작용을 갖는 의약, 시약, 식품, 음료, 또는 사료에 관한 것이다.
인간의 지적기능, 기억, 감정, 행동 등의 정신활동을 유지하기 위해서는 신경 세포가 주요한 역할을 담당하고 있다. 이들 정신활동의 기초가 되는 신경 세포의 분화, 생존, 기능발현에는 각각의 신경 세포에 특이적인 신경영양인자가 필요하다고 생각되고 있다. 신경영양인자 중 최초로 그 존재 및 기능이 밝혀진 것이 신경성장인자(Nerve Growth Factor, 이하 NGF 라 함)이고, 현재에는 뇌유래 신경영양인자(Brain-derived-neurotrophic Factor), 뉴로트로핀(Neurotrophin)-3, 뉴로트로핀-4/5 등이 발견되고 있다.
NGF 는 전뇌 기저부의 대세포성 콜린 작동성 신경 세포의 신경영양인자이므로, 알츠하이머형 치매증과의 관련이 주목되고 있다〔파르마시아, Vol.22, No.2, 147∼151(1986), 노년정신의학, Vol.3, No.6, 751∼758(1986)〕.
알츠하이머형 치매증이란 발육 장애, 병소증상, 하지의 강직구련, 간질양 발작 등의 임상을 수반하며, 노인성 반점, 알츠하이머원 선유 변화 등의 병리학적 소견을 볼 수 있는 질환이며, 노인성치매의 한 병형이다. 최근의 고령화 사회에서 증가하는 경향이 보여 중대한 사회적 관심이 되고 있지만, 이렇다 할 증상의 개선법, 치료법이 발견되고 있지 않다.
알츠하이머형 치매증 환자 뇌에는 마이넬트 기저핵을 중심으로 하는 전뇌 기저부에 현저한 변성, 콜린아세틸기 전위효소(CAT) 활성의 현저한 저하가 인정되고 있다〔Annu.Rev.Neurosci., Vol.3, 77(1980)〕. 1985년에 래트 뇌를 사용한 연구에서 NGF 가 뇌의 이 부위에서의 신경영양인자인 것이 분명해져〔EMBO J., Vol.4, 1389(1985)〕 NGF 와 본 질환과의 관련이 주목되었다. 또한 헌팅턴 무도 질환자의 뇌의 선조체에서는 GABA 작동성 신경 세포의 탈락과 함께 콜린 작동성 신경 세포의 탈락이 현저하여 NGF 가 선조체의 내재성 콜린 작동성 신경 세포에도 작용하는 것이 분명해져〔Science, Vol.234, 1341(1986)〕 본 질환이 NGF 와 관련되어 있을 가능성이 지적되고 있다. 각종 신경질환의 모델이 될 수 있는 래트 등의 동물로 NGF 의 효과가 연구되어, 래트에서는 신경 세포의 변성이 현저해지기 이전에 NGF 를 뇌내에 투여하면 변성을 막을 수 있으며, CAT 활성의 저하도 막을 수 있다고 보고되어 있다〔J.Neurosci., Vol.6, 2155(1986), Brain Res., Vol.293, 305(1985), Science, Vol.235, 214(1986), Proc.Natl.Acad.Sci.USA, Vol.83, 9231(1986)〕. 말초의 교감 신경지배조직 및 뇌에서 NGF 가 생합성되고 있는 것, 이 NGF 의 생합성에 말초조직 또는 뇌조직의 간질 세포인 선유아세포 또는 아스트로글리아 세포가 각각 중요한 역할을 하고 있는 것도 증명되어 있다 〔J.Bol.Chem., Vol.259, 1259(1984), Biochem.Biophys.Res.Co㎜un., Vol.136, 57(1986)〕. 또한, 이 선유아세포 또는 아스트로글리아 세포가 생성하는 NGF 의 항원성, 분자량, 등전점, 생 물활성은 종래 자주 연구되던 악하선 NGF 와 동일한 것이 분명해짐과 동시에 선유아세포(L-M 세포) 및 아스트로글리아 세포의 배양액에 여러 가지 신경 전달물질을 가하는 실험에 의해 카테콜아민류(노르에피네프린, 에피네프린, 도파민)가 NGF 생성증강 작용을 나타낸다는 것이 발견되었다〔J.Biol.Chem., Vol.201, 6039(1986)〕.
NGF 는, NGF 가 신경영양인자로서 작용하는 부위가 변성하는 신경질환에 있어서 변성을 막는 치료약으로서 사용할 수 있는 것은 아닌지 기대된다. 또한, 뇌혈관장애, 뇌종양, 뇌첨, 두부 외상 변성 질환, 마취약물 중독 등 뇌신경세포가 일단 변성에 빠지면 평생 회복되는 일이 없고, 그 결과 지적기능 저하, 기억장애 뿐만 아니라 감정 장애, 행동 이상 등 여러 가지 장애를 일으키지만, 신경선유에는 가소성이 있어 손상을 받으면 그 부근의 정상적인 선유로부터 발아가 일어나 상해된 시냅스로 변하여 새로운 시냅스가 형성되기 때문에, 이 때 NGF 를 신경기능의 수복재생을 촉진하는 치료제로서 사용할 수 있는 것은 아닌지 기대된다.
그러나, NGF 를 각종 신경질환의 치료에 응용하고자 한 경우, NGF 는 NGF 를 필요로 하는 신경 세포의 아주 가까이에 도달해 있어야 하며, 중추신경질환의 경우도 뇌세포의 환부에 NGF 를 공급해야 하지만, 혈관계를 통해 NGF 를 뇌내로 공급하는 것은 불가능하다. 그 이유는, 뇌내의 혈관내피세포는 서로 밀착결합으로 결합되어 있어(뇌혈액 관문이라 함), 물, 가스, 지용성 물질 이외의 물질인 혈액으로부터 뇌조직으로의 이행은 제한을 받고 있기 때문이며, 고분자물질인 단백질(NGF 도 포함)은 완전히 뇌혈관 관문을 지나는 것이 불가능하기 때문이다. 이 NGF 를 직접 뇌내에 외과적 수법을 사용하여 투입하는 것은 현재의 기술로도 위험이 너무 크다.
한편, 직접 NGF 를 투여하는 것이 아니라 NGF 의 생성을 증강하는 물질의 개발도 행해지고 있다. NGF 생성증강 작용을 나타내는 물질로는 상기 카테콜아민류 이외에도 카페인산이나 4 위에 치환기가 도입된 카테콜류, 예컨대 대표적인 화합물로서 4-메틸카테콜이 알려져 있고(일본 특허공고 평5-29207호), 그 외에 일본 공개특허공보 평2-104568호, 일본 특허 제2719042호 명세서, 일본 공개특허공보 평8-27086호 및 일본 특허공고 평7-110812호에 NGF 생성증강 활성을 갖는 화합물이 개시되어 있다. 그러나, 그 대부분은 급성독성을 나타내는 등 강한 독성을 갖는 물질, 독성이 나타나는 농도와 유효한 농도가 매우 접근한 물질, 또는 신경흥분작용 등 신경계에 대하여 중대한 부작용을 발생시키는 물질(예컨대, 상기 카테콜아민류는 대표적인 아드레날린 작동약으로 알려져 있다)이고, 또한 NGF 생성증강 활성을 나타내는 유효한 농도범위가 좁고 투여량의 컨트롤도 어려운 점 등 많은 문제점을 안고 있다. 예컨대, 일본 특허공고 평7-110812호에 개시된 물질에 관해서는 NGF 생성증강 활성과 화합물 농도 사이에는 이형성(二型性)의 관계가 나타나 있고, 의약으로서 사용하기 위해서는 투여량의 컨트롤이 어렵다. 또, 일본 공개특허공보 평2-104568호, 일본 특허 제2719042호 명세서, 일본 공개특허공보 평8-27086호에 개시된 화합물의 NGF 생성증강 활성이 확인된 농도는 각각 1 점뿐이며, 활성을 나타내는 유효 농도범위에 관해서는 불명이다. 이와 같이 여러 가지 문제가 존재하고 있어 NGF 생성증강 작용을 나타내는 물질은 아직 실용화에는 이르지 못하고 있다.
본 발명자들은 예의 검토한 결과 하기 화학식 (1)로 표시되는 화합물이 공지된 NGF 생성증강 작용을 갖는 화합물보다 1) 저농도이며 보다 강한 증강 활성을 나타내고, 2) 증강 활성을 나타내는 농도영역이 넓으며, 및/또는 3) 저독성이라는 특징을 가진다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명을 개략적으로 설명하면, 본 발명은
〔1〕하기 화학식 (1)로 표시되는 화합물 :
Figure 112002023999255-pct00001
〔식 중, R1, R2, R3, R4 및 R5 는 각각 동일하거나 상이해도 되며, 수소원자, 수산기, 알콕시기 또는 아실옥시기이고 ;
X 는 하기 화학식 (2) :
Figure 112002023999255-pct00002
(식 중, Z 는 수소원자 또는 특성기가 도입되어 있어도 되는 지방족기, 방향족기 또는 방향지방족기이고, Y 는 수소원자 또는 수산기이며, m 및 n 은 각각 0 또는 1 이다.),
하기 화학식 (3) :
Figure 112002023999255-pct00003
(식 중, Z' 는 수소원자 또는 특성기가 도입되어 있어도 되는 지방족기, 방향족기 또는 방향지방족기이고, Y' 는 수소원자 또는 수산기이며, m 및 n 은 각각 0 또는 1 이다.),
또는 하기 화학식 (4) :
Figure 112002023999255-pct00004
(식 중, R6 및 R7 은 각각 동일하거나 상이해도 되며, 수소원자, 당 잔기, 또는 특성기가 도입되어 있어도 되는 지방족기, 방향족기 또는 방향지방족기이다.)
로 표시된다. 단, 상기 화학식 (1)에 있어서, R1, R4 및 R5 가 함께 수소원자, R2 및 R3 가 함께 수산기, X 가 상기 화학식 (2)이고, 또한 그 화학식 (2)에 있어서 n 이 1, m 이 0, Z 및 Y 가 수소원자인 경우를 제외한다.〕
및 약리학적으로 허용되는 그들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 신경성장인자 생성증강을 필요로 하는 질환의 치료제 또는 예방제,
〔2〕상기 〔1〕에 기재된 화학식 (1)로 표시되는 화합물 및 약리학적으로 허용되는 그들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 신경성장인자 생성증강제,
〔3〕상기 〔1〕에 기재된 화학식 (1)로 표시되는 화합물 및 약리학적으로 허용되는 그들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물을 동물에게 투여하는 것을 특징으로 하는 신경성장인자 생성의 증강방법,
〔4〕상기 〔1〕에 기재된 화학식 (1)로 표시되는 화합물 및 그들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 신경성장인자 생성증강용 식품, 음료 또는 사료,
〔5〕신경성장인자 생성증강을 필요로 하는 질환의 치료제 또는 예방제, 신경성장인자 생성증강제, 또는 신경성장인자 생성증강용 식품, 음료 또는 사료의 제조에서의 상기 〔1〕에 기재된 화학식 (1)로 표시되는 화합물 및 그들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물의 사용, 및
〔6〕하기 화학식 (5)∼(12)로 나타내는 화합물으로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물에 관한 것이다 :
Figure 112002023999255-pct00005
Figure 112002023999255-pct00006
Figure 112002023999255-pct00007
Figure 112002023999255-pct00008
Figure 112002023999255-pct00009
Figure 112002023999255-pct00010
Figure 112002023999255-pct00011
Figure 112002023999255-pct00012
도 1 은 화합물(5)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도이다.
도 2 는 화합물(6)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도이다.
도 3 은 화합물(7)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도이다.
도 4 는 화합물(8)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도이다.
도 5 는 화합물(9)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도이다.
도 6 은 화합물(10)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도이다.
도 7 은 화합물(11)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도이다.
도 8 은 화합물(12)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도이다.
도 9 는 화합물(27)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도이다.
발명을 실시하기 위한 최량의 형태
본 발명에서 유효성분으로서 사용되는 화합물은 상기 화학식 (1)으로 표시되는 화합물 및 그들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물이고, NGF 생성증강 작용을 가지고 있다면 특별히 한정되지 않는다. 이러한 염으로는 약리학적으로 허용되는 염이 바람직하다. 또한, 후술하는 바와 같이 프로드러그로서 기능할 수 있는 해당 화합물의 유도체일 수도 있다. 따라서, 본 발명에 관한 유효성분이란, 상기 화학식 (1)로 나타내는 화합물 및 그들의 염 및 본 발명의 원하는 효과를 얻을 수 있는 한 상기 화학식 (1)로 나타내는 화합물의 유도체 및 그들의 염도 포함하는 것이다.
또, 본 명세서에 있어서 「NGF 생성증강 활성」 및 「NGF 생성증강 작용」 은 각각 NGF 생성을 증강시키는 기능 및 NGF 생성증강을 가져오는 것을 말하지만, 그 의미에서 특별히 엄밀하게 구별하는 것은 아니다. 또한, 「증강」에는 본 발명에 관한 유효성분의 작용전에 비하여 작용후에 목적물질의 양이 증가한다는 태양과 함께 본 발명에 관한 유효성분을 작용시킴으로써 목적물질을 생기시킨다는 태양(유도)을 포함한다.
유효성분으로서 사용되는 상기 화학식 (1)로 나타내는 화합물의 바람직한 예 로는, 3-페닐-2-프로펜-1-온 골격을 갖는 화합물, 3-페닐프로판-1-온 골격을 갖는 화합물, 4-페닐-3-부텐-1-온 골격을 갖는 화합물 및 4-페닐부탄-1-온 골격을 갖는 화합물 등을 들 수 있다. 또 본 명세서에서는 3-페닐-2-프로펜-1-온 골격 또는 4-페닐-3-부텐-1-온 골격을 갖는 화합물, 예컨대 상기 화학식 (5) 또는 화학식 (11)에 기재된 화합물의 구조를, 그 이중 결합부위의 입체배치를 트랜스체로 하여 나타내고 있지만, 본 발명에 있어서 사용되는 화합물은 특별히 트랜스체에 한정되지 않고, NGF 생성증강 활성을 가지고 있다면 시스체일 수도 있다. 또한, NGF 생성증강 활성을 갖는 한 그 밖의 상기 화학식 (1)로 나타내는 화합물의 광학이성체, 케토-에놀 호변이성체, 기하이성체 등의 각종 이성체도 모두 본 발명에서 사용할 수 있으며, 또한 각 이성체가 단리된 것일 수도 있고 그 혼합물일 수도 있다.
상기 화학식 (1)∼(4)에서의 각 치환기에 관하여 설명한다. 본 명세서에 있어서, 알콕시기는 RiO- 로 나타낼 수 있다. 여기서, 해당 Ri 로는 메틸기, 에틸기, n-프로필기 등의 탄소수 1∼30 의 직쇄상 알킬기, 이소프로필기, 이소부틸기, sec-부틸기, tert-부틸기, 이소펜틸기, 네오펜틸기, tert-펜틸기 등의 분지상 알킬기, 에테닐기, 알릴기, 트랜스-1-프로페닐기, 시스-1-프로페닐기, 시스-8-헵타데세닐기, 시스-8-시스-11-헵타데카디에닐기, 시스-8-시스-11-시스-14-헵타데카트리에닐기, 시스-5-시스-8-시스-11-헵타데카트리에닐기, 시스-4-시스-7-시스-10-노나데카트리에닐기, 시스-4-시스-7-시스-10-시스-13-노나데카테트라에닐기, 시스-4-시스-7-시스-10-시스-13-시스-16-노나데카헵타에닐기, 시스-12-헨이코세닐기, 시스-3-시 스-6-시스-9-시스-12-시스-15-시스-18-헨이코헥사에닐기 등의 직쇄상 알케닐기, 이소프로페닐기, 시스-1-메틸-1-프로페닐기, 트랜스-1-메틸-1-프로페닐기, 트랜스-1-메틸-1-프로페닐기, 트랜스-1-에틸-1-프로페닐기 등의 분지상 알케닐기, 후술하는 방향족기 등을 들 수 있다. 본 발명의 원하는 효과의 발현이라는 관점에서 이러한 알콕시기의 바람직한 예로는 메톡시기, 에톡시기, 알릴옥시기, 페녹시기 등을 들 수 있다.
또한, 본 명세서에 있어서 아실옥시기는 RiiCOO- 로 나타낼 수 있다. 여기서 해당 Rii 로는 상기 Ri 로서 예시한 기를 들 수 있다. 이러한 아실옥시기의 바람직한 예로는 아세톡시기, 프로피오닐옥시기, 벤조일옥시기 등이 예시된다.
본 명세서에 있어서 지방족기의 바람직한 예로는 상기 Ri 로서 예시한 기를 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 방향족기의 바람직한 예로는, 예컨대 페닐기, 나프틸기, 비페닐기 외에 피롤릴기, 피리딜기, 인돌릴기, 이미다졸릴기, 트릴기, 자일릴기 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 방향지방족기의 바람직한 예로는, 예컨대 알킬기의 탄소수가 1∼15 인 페닐알킬기(예, 벤질기, 페네틸기), 스티릴기, 신나밀기 등을 들 수 있다.
또, NGF 생성증강 활성을 가지고 있다면 상기 지방족기, 방향족기, 방향지방족기에는 수산기, 티올기, 옥소기, 티옥소기, 아미노기, 니트로기, 황산기, 인산 기, 알콕시기, 할로겐원자, 아실옥시기, 아실티옥시기 등의 특성기가 도입되어 있더라도 상관없다.
그리고, 본 명세서에 있어서 당 잔기로는 당의 수산기를 1 개 제거한 구조식으로 나타낼 수 있는 기를 들 수 있다. 해당 당으로 바람직하게는 단당인 것 외에 예컨대 2∼20 잔기의 단당으로 이루어지는 올리고당 또는 21 잔기 이상의 단당으로 이루어지는 당쇄이어도 상관없다. 또한, 당을 구성하는 단당 성분에 한정은 없으며, 예컨대 D-글루코스, D-프룩토스, L-람노스, 갈락토스, 만노스 외에 D-갈락토사민, 2-데옥시-D-리보스 등을 들 수 있다. 또, 당을 구성하는 단당 성분에 있어서 D 체, L 체 등의 입체구조에 의한 한정은 특별히 없다.
본 발명에서 사용되는 화합물은 상기 화학식 (1)로 나타낼 수 있지만, 바람직하게는 표 1 및 표 2 에 나타내는 화합물 및 식 26으로 나타내는 잔토휴몰, 식 27 로 나타내는 사플로민(Safflomin) A 가 예시된다. 이러한 표에 있어서 예시되는 화합물은 상기 화학식 (1)에 있어서 X 가 상기 화학식 (2) 또는 (3)인 화합물이다. 또, 표 1 및 표 2 중의 Rl, R2, R3, R4, R5 및 X 는 상기 화학식 (1)에 대응하는 것이다. 또한, 식(N)의 화합물을 화합물(N) 이라 한다. 예컨대, 표 1 에 있어서 식(5)의 화합물은 화합물(5)라고 한다.
Figure 112004050649721-pct00039
Figure 112004050649721-pct00040
또한, 본 발명에서 유효성분으로서 사용되는 바람직한 화합물로는, 상기 화학식 (1)에 있어서 X 가 상기 화학식 (4)인, 그 구조 중에 플라보놀(flavonol) 골격을 가진 화합물을 들 수 있다. 이러한 화합물로는, 예컨대 상기 화학식 (1)에 있어서 R1, R4, R5 및 R7 이 모두 수소, R2 및 R 3 이 모두 수산기, 그리고 R6 이 α-L-람노스 잔기로 나타내는 쿠에르시트린(Quercitrin), R1, R4, R5, R6 및 R7 이 모두 수소, 및 R2 및 R3 가 모두 수산기로 나타내는 쿠에르세틴(Quercetin : 3,3',4',5,7-펜타히드록시플라본이라고도 함), R1, R5, R6 및 R7 이 모두 수소, 그리고 R2, R3 및 R4 가 모두 수산기로 나타내는 미리세틴(Myricetin : 3,3',4',5,5',7-헥사히드록시플라본이라고도 함), R1, R5 및 R7 이 모두 수소, R2 , R3 및 R4 가 모두 수산기 및 R6 가 α-L-람노스 잔기로 나타내는 미리시트린(Myricitrin)을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 사용되는 화합물은 시판하는 화합물을 이용할 수 있는 것 외에도 칼콘류, 벤즈알데히드, 벤젠고리 상의 치환기로서 수산기를 갖는 벤즈알데히드(예컨대 2,5-디히드록시벤즈알데히드) 등의 벤즈알데히드류, 크로만류, 계피산, 계피알데히드 또는 카페인산 등을 출발원료로 하여 공지된 방법에 의해 적절히 합성할 수 있다. 또한, 천연물로서 존재하는 경우는 예컨대 식물(예컨대, 신선초, 홍화, 홉 등) 등으로부터 통상적인 방법에 의해 추출하여 정제함으로써 얻을 수 있다.
특히, 상기 표 1 및 표 2 에 나타낸 화합물 중 화합물(5), 화합물(6), 화합물(7), 화합물(8), 화합물(9), 화합물(10), 화합물(11), 화합물(12)는 본 발명에서 새롭게 합성된 신규 화합물이다. 즉, 본 발명은 NGF 생성증강 활성을 갖는 이들의 신규 화합물도 제공하는 것이다. 이들 화합물은 상기한 바와 같이 모두 공지된 방법에 의해 합성할 수 있다.
화합물(6), (7), (8), (9)의 합성법으로는 특별히 한정은 없지만, 예컨대 일본 특허 제2913706호 명세서에 기재된 공지의 방법을 사용할 수 있다. 즉, 수산화바륨 등의 염기존재하, 수산기를 테트라히드로피라닐옥시기로 보호한 히드록시벤즈알데히드와 메틸케톤기를 갖는 화합물을 클라이젠(Claisen) 축합반응에 의해 축합하고, 얻어진 축합체의 테트라히드로피라닐옥시기를 산촉매 존재하 탈보호함으로써 얻을 수 있다. 또, 클라이젠 축합반응시에는 테트라히드로피라닐옥시기에 의한 보호기의 도입은 하지 않아도 된다. 또한, 클라이젠 축합반응의 촉매로는 염기 이외에 염화수소 등의 산을 사용할 수도 있다.
화합물(12)의 합성법으로는 특별히 한정은 없지만, 메틸케톤 화합물을 리튬디이소프로필아미드 존재하, 저온에서 알데히드 화합물과 알돌 축합시키는 방법을 사용할 수 있다. 또한, 화합물(12)의 β위의 수산기에 적절한 탈리기를 도입한 후 염기 등에 의해 탈리반응시킴으로써 화합물(11)을 합성할 수 있다. 또한, 상기에 나타낸 바와 같이 화합물(12)을 거쳐 화합물(11)을 합성하는 방법과 동일한 방법으로 화합물(6), (7), (8), (9)에 관해서도 합성할 수 있다.
화합물(5)의 합성법으로는 특별히 한정은 없지만 화합물(13)을 아세틸화함으 로써 합성할 수 있어, 예컨대 화합물(13)과 무수아세트산을 알칼리 존재하에서 반응시킴으로써 얻을 수 있다. 또한, 이 때의 아세틸기의 공여체로는 아세트산클로라이드 등의 아세트산의 할로겐화물이어도 된다.
화합물(10)의 합성법으로는 특별히 한정은 없지만, 예컨대 팔라듐 등의 촉매 존재하 화합물(13)을 함유하는 메탄올 등의 용매에 수소가스를 첨가함으로써 합성할 수 있다.
상기 화학식 (1)으로 나타내는 화합물의 염으로는, 예컨대 알칼리 금속염, 알칼리토류 금속염, 유기염기와의 염 등이 예시된다. 이러한 염으로는 약리학적으로 허용되는 염이 바람직하다. 또, 본 발명에 있어서 사용되는 약리학적으로 허용되는 염이란 생물에 대하여 실질적으로 무독성이며 또한 NGF 생성증강 활성을 갖는 화합물의 염을 의미한다. 해당 염으로는, 예컨대 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄 또는 프로톤화된 벤자틴(N,N'-디-벤질에틸렌디아민), 콜린, 에탄올아민, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 메그라민(N-메틸글루카민), 베네타민(N-벤질페네틸아민), 피페라진 또는 트로메타민(2-아미노-2-히드록시메틸-1,3-프로판디올)과의 염을 들 수 있다. 이들 염은 예컨대 상기 화학식 (1)로 표시되는 화합물에 있어서 X 가 상기 화학식 (2) 또는 (3)이고, n 이 1, m이 0, Z 또는 Z' 이 수소원자, Y 또는 Y' 이 수소원자로 표시되는 카르복실산을 공지의 방법에 의해 변환함으로써 얻어진다. 또한, 예컨대 상기 화학식 (1)로 나타내는 화합물에 있어서 X 가 상기 화학식 (4)인 경우에는, 해당 화합물 중의 페놀성수산기를 공지된 방법에 의해 염으로 변환함으로써 얻어진다.
그리고 본 발명에 있어서 사용되는 상기 화학식 (1)로 나타내는 화합물은, 예컨대 에스테르로 할 수 있는 등 체내에서 용이하게 가수분해되어 원하는 효과를 발휘할 수 있는 유도체(프로드러그)를 형성할 수 있다. 이러한 프로드러그의 조제는 공지된 방법을 따라 행하면 된다. 또, 이러한 유도체는 그들의 염일 수도 있다.
본 발명에서 유효성분으로서 사용되는 상기 화학식 (1)로 나타내는 화합물 및 그들의 염은, 상기한 바와 같이 모두 NGF 생성증강 활성을 갖는 것이다. 해당 활성은 예컨대 후술하는 참고예 1 에 나타내는 방법에 준하여 평가할 수 있다. 또한, 후술하는 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, 유효성분으로서의 화합물은 공지의 NGF 생성증강 활성을 갖는 화합물보다 1) 저농도이고 보다 강한 증강 활성을 나타내고, 2) 증강 활성을 나타내는 농도영역이 넓으며, 및/또는 3) 저독성이라는 특징을 가지고 있다. 본 발명에서 유효성분으로서 사용하는 화합물에 의하면, 그 NGF 생성증강 활성에 의해 예컨대 후술할 실시예 18 에 있어서 알 수 있는 바와 같이 NGF 생성증강을 통하여 신경돌기의 신장을 재촉한다는 효과를 얻을 있으며, 그 외에 활성산소나 영양기아 또는 물리적손상 등에 의해 야기되는 신경 세포사를 억제한다는 효과가 있다. 그러므로, 예컨대 후술하는 바와 같은 NGF 생성증강을 필요로 하는 질환의 치료 또는 예방에 유용하다고 생각된다.
본 발명에 있어서 유효성분으로서 사용되는 상기 화학식 (1)로 나타내는 화합물은 후술하는 참고예 1 로서 나타내는 방법에 준하는 스크리닝의 결과로부터 알아낸 것이며, 그러므로 본 발명의 1 태양으로는 NGF 생성증강 활성을 갖는 화합물 의 스크리닝 방법도 제공한다.
본 발명에 있어서 유효성분으로 사용되는 화합물 및 그들의 염은 그 NGF 생성증강 활성에서의 유효량을 생체에 투여하더라도 독성은 확인되지 않는다. 예컨대, 경구투여의 경우 예컨대 칼콘 골격을 갖는 화합물인 부테인〔화합물(13)〕 또는 약리학적으로 허용되는 그 염중 어느 하나를 1000㎎/㎏ 으로 마우스에게 단회 투여하더라도 사망예는 확인되지 않는다. 또한, 플라보놀 골격을 갖는 화합물인 미리세틴 또는 약리학적으로 허용되는 그 염 중 어느 하나를 150㎎/㎏ 으로 마우스에게 단회 투여하더라도 사망예는 확인되지 않는다.
본 발명의 제 1 태양인 NGF 생성증강을 필요로 하는 질환의 치료제 또는 예방제로는, 본 발명에 관한 상기 유효성분을 공지의 의약용 담체와 조합하여 제제화한 것을 들 수 있다. 본 발명의 태양에서는 유효성분으로서의 염은 약리학적으로 허용되는 염이 사용된다.
또, 본 명세서에 있어서 NGF 생성증강을 필요로 하는 질환이란 예컨대 치매증, 신경장애, 말초신경통, 뇌허혈, 당뇨병성 뉴로퍼시 등을 들 수 있다.
본 발명의 치료제 또는 예방제의 제조는, 통상 상기 유효성분을 약리학적으로 허용된 액상 또는 고체상의 담체와 배합함으로써 행해지며, 원하는 바에 따라 용제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제 등을 가하여 정제, 과립제, 산제, 분말제, 캡슐제 등의 고형제, 통상 액제, 현탁제, 유제 등의 액제로 할 수 있다. 또한 사용전에 적당한 담체의 첨가에 의해 액상으로 할 수 있는 건조품이나 기타 외용제로 할 수도 있다.
의약용 담체는 치료제 또는 예방제의 투여형태 및 제형에 따라 선택할 수 있다. 고체 조성물로 이루어지는 경구제로 하는 경우는, 정제, 환제, 캡슐제, 산제, 세립제, 과립제 등으로 할 수 있어, 예컨대 전분, 유당, 백당, 만니트, 카르복시메틸셀룰로스, 콘스타치, 무기염 등이 이용된다. 또한 경구제의 조제에 있어서는, 추가로 결합제, 붕괴제, 계면활성제, 윤택제, 유동성촉진제, 교미(嬌味)제, 착색제, 향료 등을 배합할 수도 있다. 예컨대, 정제 또는 환제로 하는 경우는 원하는 바에 따라 자당, 젤라틴, 히드록시프로필셀룰로스 등의 당의 또는 위용성 또는 장용성 물질의 필름으로 피복해도 된다. 액체조성물로 이루어지는 경구제로 하는 경우는 약리학적으로 허용되는 유탁제, 용액제, 현탁제, 시럽제 등으로 할 수 있어, 예컨대 정제수, 에탄올 등이 담체로서 이용된다. 또한, 원하는 바에 따라 습윤제, 현탁제와 같은 보조제, 감미제, 풍미제, 방부제 등을 첨가해도 된다.
한편, 비경구제로 하는 경우는, 통상의 방법에 따라 본 발명의 상기 유효성분을 희석제로서의 주사용 증류수, 생리식염수, 포도당 수용액, 주사용 식물유, 참기름, 낙화생유, 대두유, 옥수수유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등에 용해 내지 현탁시키고, 필요에 따라 살균제, 안정제 등 장화제, 무통화제 등을 가함으로써 조제된다. 또한, 고체조성물을 제조하여 사용전에 무균수 또는 무균 주사용 용매에 용해하여 사용할 수도 있다.
외용제로는 경피투여용 또는 경점막(구강내, 비강내) 투여용 고체 내지 반고체상, 반고체 또는 액상의 제제가 포함된다. 또한 좌제 등도 포함된다. 예컨대, 유제, 로션제 등의 유탁제, 외용 팅크제, 경점막 투여용액제 등의 액상 제제, 유성 연고, 친수성 연고 등의 연고제, 필름제, 테이프제, 파프제 등의 경피투여용 또는 경점막 투여용 첨부제 등으로 할 수 있다.
이상의 각종 제제는 각각 공지된 의약용 담체 등을 이용하여 적절히 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다. 또한, 이러한 제제에서의 유효성분의 함유량은 그 투여형태, 투여방법 등을 고려하여 바람직하게는 후술하는 투여량 범위로 해당 유효성분을 투여할 수 있는 양이면 특별히 한정되는 것이 아니다.
본 발명의 치료제 및 예방제는 그 제형에 해당하는 적당한 투여경로로 투여할 수 있다. 투여방법에는 특별히 한정은 없고, 내용, 외용 및 주사에 의한 것이 가능하다. 주사제는, 예컨대 정맥내, 근육내, 피하, 피내 등에 투여할 수 있으며, 외용제로는 예컨대 좌제를 그 알맞은 투여방법에 의해 투여하면 된다.
본 발명의 치료제 또는 예방제의 투여량은 그 제형, 투여방법, 사용목적 및 해당 치료제 또는 예방제의 투여대상인 동물(예컨대, 환자)의 연령, 체중, 증상에 따라 적절히 설정되며 일정하지는 않다. 예컨대, 인간의 경우 일반적으로는 제제중에 함유되는 상기 유효성분의 투여량이 바람직하게는 성인 1일당 0.1㎍∼200㎎/㎏ 가 되는 양이다. 물론 투여량은 여러 가지 조건에 의해 변동하기 때문에, 상기 투여량보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 또는 범위를 넘어 필요한 경우도 있다. 투여는 원하는 투여량 범위내에서 1일안에 단회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.
NGF 는 신경 세포에 작용하며, 신경돌기의 신장, 신경돌기 세포의 유지를 담당한다. 따라서, 본 발명에서 사용되는 유효성분에 의해 NGF 의 생성증강을 행함 으로써 생체의 신경계 유지와 활성화를 가져올 수 있다. 그러므로, 본 발명의 치료제 또는 예방제는 상기 각종 질환의 치료 또는 예방에 유용하다.
본 발명의 제 2 태양인 본 발명에 관한 상기 유효성분을 함유하는 NGF 생성증강제는 상기 유효성분 그 자체일 수도 있고 또한 상기 유효성분을 함유하는 조성물일 수도 있다. 본 발명의 태양에 있어서는, 유효성분으로서의 염은 약리학적으로 허용되는 염이 사용된다. NGF 생성증강제는, 예컨대 상기 유효성분을 해당 유효성분과 동일한 용도로 사용할 수 있는 다른 성분 등과 배합하여 상기 치료제 또는 예방제의 제조방법에 준하여 통상 사용되는 시약의 형태로 제조하면 된다. 이러한 증강제에서의 상기 유효성분의 함유량은 증강제의 투여방법, 사용목적 등을 고려하여 본 발명의 원하는 효과의 발현을 얻을 수 있는 양이면 되며, 특별히 한정되는 것은 아니다. 또한 그 증강제의 사용량도 본 발명의 원하는 효과의 발현을 얻을 수 있는 것이라면 특별히 한정되는 것은 아니다. 특히 생체에 투여하여 사용하는 경우, 바람직하게는 상기 치료제 또는 예방제에서의 유효성분의 투여량 범위내에서 유효성분을 투여할 수 있는 양으로 그 증강제를 사용하면 된다.
본 발명의 NGF 생성증강제는 신경세포 활성화(예컨대, 학습기억능력의 향상 등) 에 사용할 수 있다. 또한 그 증강제를 사용하여 후술하는 NGF 생성증강 방법에 의해 신경 세포 기구에 관한 생화학적 연구나 치매증, 신경장애약의 스크리닝을 할 수도 있다.
본 발명의 제 3 태양으로서, 본 발명에 관한 상기 유효성분을 동물에게 투여하는 NGF 생성의 증강방법을 제공한다. 본 발명의 태양에 있어서는, 유효성분으로 서의 염은 약리학적으로 허용되는 염이 사용된다. 이러한 방법은 NGF 생성의 증강이 필요하다고 예상되거나, 또는 그 필요가 있는 동물에 대하여 상기 유효성분을 바람직하게는 본 발명의 NGF 생성증강제로서 투여함으로써 행할 수 있으며, 이러한 투여에 의해 NGF 의 생성을 증강시킨다. 유효성분의 투여방법, 투여량 등은 바람직하게는 상기 NGF 생성증강제에 준하면 된다. 또, 본 발명의 치료제 또는 예방제, 후술할 식품, 음료 또는 사료를 NGF 생성증강제와 마찬가지로 하여 사용할 수도 있다.
이러한 NGF 생성증강방법에 의하면, 예컨대 해당 방법에 의해 신경 세포를 활성화시켜 세포 내외 관련인자의 동향을 해석함으로써 신경 세포 기구에 관한 생화학적 연구를 할 수 있다. 또, 이러한 NGF 생성증강 방법에 의해 치매증, 신경장애약 등의 스크리닝을 할 수 있다.
본 발명의 제 4 태양으로서, NGF 생성증강용 식품, 음료 또는 사료를 제공한다. 이러한 식품, 음료 또는 사료는 본 발명에 관한 상기 유효성분을 함유하여 이루어지는 것이다. 본 발명의 태양에서는, 유효성분으로서의 염에 약리학적으로 허용되는 염, 또는 그것과 동등한 안전성을 갖는 염을 바람직하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품, 음료 또는 사료는 그 NGF 생성증강 작용에 의해 해당 유효성분에 감수성을 나타내는 상기한 바와 같은 NGF 생성증강을 요하는 각종 질환의 증상개선, 예방에 매우 유용하다.
또, 본 발명의 식품, 음료 또는 사료에서 말하는 「함유」라는 말은 함유, 첨가, 희석의 의미를 포함하는 것으로, 함유란 식품, 음료 또는 사료 중에 본 발명 에서 사용되는 유효성분이 함유된다는 태양을, 첨가란 식품, 음료 또는 사료의 원료에 본 발명에서 사용되는 유효성분을 첨가한다는 태양을, 희석이란 본 발명에서 사용되는 유효성분에 식품, 음료 또는 사료의 원료를 첨가한다는 태양을 말하는 것이다.
본 발명의 식품, 음료 또는 사료의 제조법에 특별히 한정은 없다. 예컨대 배합, 조리, 가공 등은 일반적인 식품, 음료 또는 사료에 따르면 되고 이러한 식품, 음료 또는 사료의 제조법에 의해 제조할 수 있어, 얻어진 식품, 음료 또는 사료에 NGF 생성증강 작용을 갖는 본 발명에 관한 유효성분이 함유되어 있으면 된다.
본 발명의 식품 또는 음료는 특별히 한정은 없지만, 예컨대 본 발명에 관한 상기 유효성분이 함유되어 이루어지는 곡물 가공품(밀가루 가공품, 전분류 가공품, 프리믹스 가공품, 국수류, 마카로니류, 빵류, 팥소류, 메밀국수류, 밀기울, 쌀국수, 당면, 포장떡 등), 유지가공품(가소성 유지, 튀김기름, 샐러드유, 마요네즈류, 드레싱 등), 대두 가공품(두부류, 된장, 낫토 등), 식육가공품(햄, 베이컨, 압축햄, 소시지 등), 수산제품(냉동 다진 어육, 가마보코, 관 모양 어묵, 다진 어육, 기름에 튀긴 어육, 어육 볼, 시뉴(sinew), 어육 햄, 소시지, 가다랭이포, 어란 가공품, 수산통조림, 해산물 간장조림(츠쿠다니) 등), 유제품(원유, 크림, 요구르트, 버터, 치즈, 연유, 분유, 아이스크림 등), 야채·과일 가공품(페이스트류, 잼류, 절임류, 과일음료, 야채음료, 믹스음료 등), 과자류(초컬릿, 비스킷류, 과자빵류, 케이크, 떡과자, 미과류 등), 알콜음료(일본술, 중국술, 와인, 위스키, 소주, 보드카, 브랜디, 진, 럼주, 맥주, 청량알콜음료, 과일주, 리큐어 등), 기호음료(녹차, 홍차, 우롱차, 커피, 청량음료, 유산음료 등), 조미료(간장, 소스, 식초, 미림 등), 통조림·병조림·레토르트식품(쇠고기 야채 덮밥, 쇠고기 야채 솥밥, 팥밥, 카레, 기타 각종 완전조리식품), 반건조 또는 농축 식품(리버 페이스트, 기타 스프레드, 메밀국수·우동의 국물, 농축 스프 류), 건조식품(즉석국수류, 즉석카레, 인스턴트 커피, 분말주스, 분말스프, 즉석된장국(미소), 완전조리식품, 완전조리음료, 완전조리스프 등), 냉동식품(스키야키, 차완무시(일식 달걀찜), 장어구이, 햄버그 스테이크, 슈마이, 교자(만두), 각종 스틱, 후루츠칵테일 등), 고형식품, 액체식품(스프 등), 향신료류 등의 농산·임산가공품, 축산가공품, 수산가공품 등을 들 수 있다.
본 발명의 식품 또는 음료 중의 상기 유효성분의 함유량은 특별히 한정되지 않으며, 그 관능과 활성발현의 관점에서 적절히 선택할 수 있지만, 예컨대 식품 100 중량부당 바람직하게는 0.0001 중량부 이상, 보다 바람직하게는 0.001∼10 중량부이고, 예컨대 음료 100 중량부당 바람직하게는 0.0001 중량부 이상, 보다 바람직하게는 0.001∼10 중량부이다. 또한, 본 발명의 식품 또는 음료는 바람직하게는 그들에 함유되는 유효성분이 예컨대 성인 1 일당 0.01∼100 ㎎/㎏ 이 되도록 섭취하면 된다.
또한, 본 발명에 의해 NGF 생성증강 활성을 갖는 본 발명에 관한 상기 유효성분을 함유하여 이루어지는 생물용 사료가 제공된다. 또한 본 발명의 별도의 1 태양으로서, 상기 유효성분을 생물에 투여하는 것을 특징으로 하는 생물의 사육방법이 제공된다. 게다가, 본 발명의 별도의 1 태양으로서 상기 유효성분을 함유하는 것을 특징으로 하는 생물 사육용제가 제공된다.
이들 발명에 있어서 생물이란 예컨대 양식동물, 애완동물 등이고, 양식동물로는 가축, 실험동물, 가금류, 어류, 갑각류 또는 조개류가 예시된다. 사료로는 몸 상태의 유지 및/또는 개선용 사료가 예시된다. 생물 사육용제로는 침지용제, 사료첨가제, 음료용 첨가제가 예시된다.
이들 발명에 의하면, 그들을 적용하는 상기 예시한 바와 같은 생물에 있어서, 본 발명에 사용되는 상기 유효성분의 NGF 생성증강 활성에 근거하여 본 발명의 상기 치료제 또는 예방제에 의한 것과 동일한 효과의 발현을 기대할 수 있다. 즉, 해당 생물에서의 치매증, 신경장애의 치료 또는 예방효과의 발현을 기대할 수 있다.
본 발명에 사용되는 상기 유효성분은 통상 대상생물의 체중 1㎏, 1 일당 바람직하게는 0.01∼2000㎎ 투여된다. 투여는, 예컨대 해당 유효성분을 대상생물에 제공하는 인공 배합사료의 원료중에 첨가 혼합해 두거나 인공 배합사료의 분말원료와 혼합한 후 기타 원료에 더 첨가 혼합함으로써 행할 수 있다. 또한, 상기 유효성분의 사료중 함유량은 특별히 한정되는 것은 아니며, 목적에 따라 적절히 설정하면 되지만 0.001∼15중량% 의 비율이 적당하다.
인공 배합사료로는, 어분, 카세인, 오징어 내장 등의 동물성 원료, 콩깻묵, 밀가루, 전분 등의 식물성 원료, 사료용 효모 등의 미생물 원료, 대구간유, 오징어 간유 등의 동물성 유지, 대두유, 채종유 등의 식물성 유지, 비타민류, 미네랄류, 아미노산, 항산화제 등을 원료로 하는 인공 배합사료를 들 수 있다. 또한 어육간 것 등의 어류용 사료를 들 수 있다.
본 발명의 사료의 제조방법에 특별히 한정은 없고, 또한 배합도 일반 사료에 준하는 것이면 되고, 제조된 사료 중에 NGF 생성증강 활성을 갖는 본 발명에 관한 유효성분이 함유되어 있으면 된다.
또, NGF 생성증강 활성을 갖는 본 발명에 관한 상기 유효성분을 풀(pool), 수조, 유지탱크 또는 사육영역의 물, 바닷물 등에 직접 첨가하여 대상생물을 침지함으로써 투여할 수도 있다. 이 침지방법은 대상생물의 사료섭취량이 저하하였을 때 특히 유효하다. 물 또는 바닷물 중의 NGF 생성증강 작용을 갖는 본 발명에 관한 유효성분의 농도는 특별히 한정은 없고 목적에 따라 사용하면 되지만, 바람직하게는 0.00001∼1 중량% 의 비율이 적당하다.
또한, NGF 생성증강 활성을 갖는 본 발명에 관한 상기 유효성분을 함유하는 음료를 사육용 음료로서 대상생물에 섭취시켜도 된다. 그 음료 중의 NGF 생성증강 작용을 갖는 본 발명에 사용되는 유효성분의 농도는 특별히 한정은 없고 목적에 따라 사용하면 되지만, 0.0001∼1 중량%의 비율이 적당하다.
NGF 생성증강 작용을 갖는 본 발명에 관한 상기 유효성분을 함유하는 생물사육용제, 예컨대 침지용제, 사료첨가제, 음료용 첨가제는 그 자체 공지의 배합 및 제조방법으로 제작하면 된다. 그 생물사육용제에서의 유효성분의 함유량은 본 발명의 원하는 효과를 얻을 수 있는 한 특별히 한정되는 것이 아니다.
본 발명을 적용할 수 있는 생물로는 한정은 없지만, 양식동물로는 말, 소, 돼지, 양, 염소, 낙타, 라마 등의 가축, 마우스, 래트, 몰모트, 토끼 등의 실험동물, 닭, 오리, 칠면조, 타조 등 가금류, 참돔, 돌돔, 넙치, 가자미, 방어, 양식방 어, 부시리, 다랑어, 줄전갱이, 은어, 연어·송어류, 호하돈, 장어, 미꾸라지, 메기 등의 어류, 보리새우, 타이거 왕새우, 왕새우, 꽃게 등의 갑각류 등, 전복, 소라, 가리비, 굴 등의 조개류, 애완동물로는 개, 고양이 등을 들 수 있으며, 육상·수중동물에 널리 적용할 수 있다.
NGF 생성증강 작용을 갖는 본 발명에 사용되는 상기 유효성분을 함유하는 사료를 섭취시키거나 또는 NGF 생성증강 작용을 갖는 본 발명에 사용되는 상기 유효성분의 함유액에 대상생물을 침지함으로써 가축, 실험동물, 가금류, 어류, 갑각류, 조개류, 애완동물 등의 몸 상태를 양호하게 유지하거나 또는 개선시킬 수 있다.
본 발명의 식품, 음료 또는 사료에는 본 발명에 관한 상기 유효성분이 함유되어 있고, 그 NGF 생성증강 활성을 발현하기 위한 필요량이 함유되어 있으면 특별히 그 형상에 한정은 없다. 예컨대, 타블렛형, 과립형, 캡슐형 등의 형상을 한 경구적 섭취가 가능한 형상물도 포함된다.
또한, 본 발명의 제 5 태양으로서, NGF 생성증강을 필요로 하는 질환의 치료제 또는 예방제, NGF 생성증강제, 또는 NGF 생성증강용 식품, 음료 또는 사료의 제조에서의 본 발명에 관한 상기 유효성분의 사용을 제공한다. 이러한 사용의 태양으로는, 본 발명의 상기 치료제 또는 예방제, NGF 생성증강제, 또는 NGF 생성증강용 식품, 음료 또는 사료의 제조에서의 상기 유효성분의 사용의 태양을 들 수 있다. 예컨대, NGF 생성증강을 필요로 하는 질환의 치료제 또는 예방제, 또는 NGF 생성증강제의 제조에서의 상기 유효성분의 사용으로는, 상기한 바와 같은 정제, 과립제, 산제, 분말제, 캡슐제 등의 고형제, 통상 액제, 현탁제, 유제 등의 액제, 또 한 사용 전에 적당한 담체의 첨가에 의해 액상으로 할 수 있는 건조품의 제조에서의 사용이 예시된다.
본 발명에 관한 유효성분은, 후술하는 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이 공지의 NGF 생성증강 활성을 갖는 화합물과 비교하여 1) 보다 저농도이며 보다 강한 증강 활성을 나타내고, 2) 증강 활성을 나타내는 농도영역이 넓으며, 및/또는 3) 저독성이라는 특징을 갖는 것이다. 따라서, 해당 유효성분을 함유하여 이루어지는 본 발명의 치료제 또는 예방제 또는 식품, 음료 또는 사료는 NGF 생성증강을 필요로 하는 질환의 치료 또는 예방에 유용하다. 또한, 상기 유효성분을 함유하여 이루어지는 NGF 생성증강제는 신경 세포 기구에 관한 생화학적 연구나 치매증, 신경장애약 등의 스크리닝에 유용하다.
실시예
이하, 제조예, 실시예 등을 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 전혀 한정되지 않는다. 또, 제조예, 실시예 등에 있어서 % 는 특별한 사정이 없는 한 중량%를 의미한다.
제조예 1
부테인(Butein)〔화합물(13)〕의 합성
2',4'-디히드록시아세토페논(2',4'-Dihydroxy acetophenone ; 도쿄가세이 제조) 1g(6.6㎜ol), 3,4-디히드록시벤즈알데히드(3,4-Dihydroxy benzaldehyde ; 도쿄가세이 제조) 912㎎(6.6㎜ol) 및 피리디늄 p-톨루엔술포네이트(Pyridinium p- toluensulfonate ; 도쿄가세이 제조) 80㎎(0.32㎜ol)을 디클로로메탄 26㎖ 에 용해하여 실온에서 30분간 교반한 후, 3,4-디히드로-2H-피란(3,4-Dihydro-2H-pyrane ; 도쿄가세이 제조) 10㎖ 을 첨가하여 실온에서 3 시간 더 교반하였다. 반응액을 물로 2 회 세정하여 감압농축한 후, 얻어진 유상물질을 메탄올 26㎖ 에 용해하고 수산화바륨 8수화물 2.15g 을 첨가하여 40℃ 에서 약 20 시간 교반하였다. 반응액을 메탄올 26㎖ 으로 희석한 후 1 규정의 염산으로 pH 를 중성 부근으로 하였다. 반응액을 아세트산에틸로 추출하여 얻어진 유기층을 포화중조수, 10% 시트르산수, 포화염화나트륨 수용액으로 순서대로 세정한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조하여 감압농축하였다. 농축물을 헥산 : 아세트산에틸(용량비) = 5 : 1 를 전개용매로 한 실리카 겔계 칼럼(후지실리시아가가쿠(주) 제조)을 사용한 크로마토그래피(이하, 실리카크로마토그래피라 함) 에 제공함으로써 화합물(13)의 테트라히드록시피란(THP)화체를 얻었다. 화합물(13)의 THP 화체를 메탄올 26㎖에 용해하고 술포살리실산 무수물(Sulfosalicylic acid dehydrate) 67㎎(0.264㎜ol)을 첨가하여 실온에서 3 시간 교반하였다. 반응액을 아세트산에틸로 희석한 후, 포화염화나트륨 수용액으로 세정, 무수 황산마그네슘으로 건조하여 감압 농축하였다. 농축물로부터 헥산과 아세트산에틸에 의해 화합물(13) 1g(수율 56%)을 재결정하였다. 화합물(13)의 핵자기공명(NMR) 스펙트럼, 질량 스펙트럼을 각각 JNM-A500(닛폰덴시사 제조), MS(DX302) 질량분석계(닛폰덴시사 제조) 로 분석하여 그 구조를 결정하였다. NMR 스펙트럼, 질량 스펙트럼의 측정 결과를 이하에 나타낸다.
1H NMR : δ6.26 (1H, d, J3', 5' 2Hz, H-3'), 6.38 (1H, dd, J5', 6' 9Hz, H-5'), 6.80 (1H, d, J5, 6 8Hz, H-5), 7.19 (1H, dd, J2, 6 2Hz, H-6), 7.26 (1H, d, H-2), 7.64 (2H, m, H-α, β), 8.12 (1H, d, H-6')
단, 샘플은 중디메틸술폭시드에 용해하고, 잔류 디메틸술폭시드의 화학 시프트값을 2.49ppm 으로 나타내었다.
FAB-MS : m/z 273 (M+H)+ (단, 글리세롤을 매트릭스로 사용하였다.)
제조예 2
3,4,5,2',4'-펜타히드록시칼콘(3,4,5,2',4'-Pentahydroxy chalcone)〔화합물(17)〕의 합성
2',4'-디히드록시아세토페논 0.5g(2.9㎜ol)과 3,4-디히드록시벤즈알데히드 0.4g(2.9㎜ol)을 출발재료로 하여 제조예 1 과 동일한 방법에 의해 화합물(17) 600㎎(수율 72%)을 얻었다. NMR 스펙트럼, 질량 스펙트럼의 측정 결과를 이하에 나타낸다.
1H NMR : 6.23 (1H, d, J3', 5' 2Hz, H-3'), 6.36 (1H, dd, J5', 6' 9Hz, H-5'), 6.78 (2H, s, H-2, 6), 7.54 (2H, m, H-α, β), 8.07 (1H, d, H-6')
단, 샘플은 중디메틸술폭시드에 용해하고, 잔류 디메틸술폭시드의 화학 시프트값을 2.49ppm 으로 나타내었다.
FAB-MS : m/z 289 (M+H)+ (단, 글리세롤을 매트릭스로 사용하였다.)
제조예 3
3,4,2',5'-테트라히드록시칼콘(3,4,2',5'-Tetrahydroxy chalcone)〔화합물(18)〕의 합성
2',5'-디히드록시아세토페논(2',5'-Dihydroxy acetophenone : 도쿄가세이 제조) 497㎎(3.3㎜ol)과, 3,4-디히드록시벤즈알데히드 451㎎(3.3㎜ol)을 출발재료로 하여 제조예 1 과 같은 방법에 의해 화합물(18) 760㎎(수율 85%)을 얻었다. NMR 스펙트럼, 질량 스펙트럼의 측정 결과를 이하에 나타낸다.
1H NMR : δ6.79 (1H, d, J5, 6 8Hz, H-5), 6.81 (1H, d, J3', 4' 9Hz, H-3'), 6.00 (1H, dd, J4', 6' 3Hz, H-4'), 7.17 (1H, dd, J2, 6 2Hz, H-6), 7.23 (1H, d, H-2), 7.44 (1H, d, H-6'), 7.55 (1H, d, Jα, β 15Hz, H-α), 7.66 (1H, d, H-β)
단, 샘플은 중디메틸술폭시드에 용해하고, 잔류 디메틸술폭시드의 화학 시프트값을 2.49ppm 으로 나타내었다.
FAB-MS : m/z 273 (M+H)+ (단, 글리세롤을 매트릭스로 사용하였다.)
제조예 4
3,4,3',4'-테트라히드록시칼콘(3,4,3',4'-Tetrahydroxy chalcone)〔화합물(19)〕의 합성
3',4'-디히드록시아세토페논(3',4'-Dihydroxy acetophenone ; 도쿄가세이 제 조) 515㎎(3.4㎜ol)과, 3,4-디히드록시벤즈알데히드 468㎎(3.4 ㎜ol)을 출발재료로 하여 제조예 1 과 같은 방법에 의해 화합물(19) 272㎎(수율 30%)을 얻었다. NMR 스펙트럼, 질량 스펙트럼의 측정 결과를 이하에 나타낸다.
1H NMR : δ6.78 (1H, d, J5, 6 8Hz, H-5), 6.83 (1H, dd, J5', 6' 8Hz, H-5'), 7.11 (1H, dd, J2, 6 2Hz, H-6), 7.18 (1H, d, H-2), 7.46 (1H, d, J2', 6' 2Hz, H-2'), 7.48 (2H, m, H-α,β), 7.54 (1H, dd, H-6')
단, 샘플은 중디메틸술폭시드에 용해하고, 잔류 디메틸술폭시드의 화학 시프트값을 2.49ppm 으로 나타내었다.
FAB-MS : m/z 273 (M+H)+ (단, 글리세롤을 매트릭스로 사용하였다.)
제조예 5
3,4,3',5'-테트라히드록시칼콘(3,4,3',5'-Tetrahydroxy chalcone)〔화합물(20)〕의 합성
3',5'-디히드록시아세토페논(3',5'-Dihydroxy acetophenone ; 도쿄가세이 제조) 816㎎(5.4㎜ol)과, 3,4-디히드록시벤즈알데히드 741㎎(5.4 ㎜ol)을 출발재료로 하여 제조예 1 과 같은 방법에 의해 화합물(20) 605㎎(수율 41%)을 얻었다. NMR 스펙트럼, 질량 스펙트럼의 측정 결과를 이하에 나타낸다.
1H-NMR : δ6.45 (1H, dd, J2', 4' 2, J4', 6' 2Hz, H-4'), 6.77 (1H, d, J5, 6 8Hz, H-5), 6.87 (2H, d, H-2', 6'), 7.11 (1H, dd, J2, 6 2Hz, H-6), 7.18 (1H, d, H-2), 7.35 (1H, d, Jα, β 16Hz, H-α), 7.51 (1H, d, H-β)
단, 샘플은 중디메틸술폭시드에 용해하고, 잔류 디메틸술폭시드의 화학 시프트값을 2.49ppm 으로 나타내었다.
FAB-MS : m/z 272 (M+H)+ (단, 글리세롤을 매트릭스로 사용하였다.)
제조예 6
3,4,2'-트리히드록시칼콘(3,4,2'-Trihydroxy chalcone)〔화합물(21)〕의 합성
2'-히드록시아세토페논(2'-Hydroxy acetophenone ; 도쿄가세이 제조) 890g(6.5㎜ol)과, 3,4-디히드록시벤즈알데히드 902㎎(6.5㎜ol)을 출발재료로 하여 제조예 1 과 같은 방법에 의해 화합물(21) 715㎎(수율 43%)을 얻었다. NMR 스펙트럼, 질량 스펙트럼의 측정 결과를 이하에 나타낸다.
1H-NMR : δ6.81 (1H, d, J5, 6 8Hz, H-5), 6.98 (2H, m, H-3', 5'), 7.22 (1H, dd, J2, 6 8Hz, H-6), 7.29 (1H, d, H-2), 7.53 (1H, J3', 4' 8, J4', 5' 8, J4', 6' 2Hz, td, H-4'), 7.71 (2H, m, H-α, β), 8.21 (1H, dd, J5', 6' 8Hz, H-β)
단, 샘플은 중디메틸술폭시드에 용해하고, 디메틸술폭시드의 화학 시프트값을 2.49ppm 으로 나타내었다.
FAB-MS : m/z 257 (M+H)+ (단, 글리세롤을 매트릭스로 사용하였다.)
제조예 7
3,4,2',3',4'-펜타히드록시칼콘(3,4,2',3',4'-Pentahydroxy chalcone)〔화합물(22)〕의 합성
2',3',4'-트리히드록시아세토페논(2',3',4'-Trihydroxy acetophenone : 도쿄가세이 제조) 605㎎(3.6㎜ol)과, 3,4-디히드록시벤즈알데히드 500㎎(3.6 ㎜ol)을 출발재료로 하여 제조예 1 과 같은 방법에 의해 화합물(22) 622㎎(수율 60%)을 얻었다. NMR 스펙트럼, 질량 스펙트럼의 측정 결과를 이하에 나타낸다.
1H-NMR : δ6.41 (1H, d, J5', 6' 9Hz, H-5'), 6.80 (1H, d, J5, 6 8Hz, H-5), 7.19 (1H, dd, J2, 6 2Hz, H-6), 7.26 (1H, d, H-2), 7.64 (2H, m, H-α, β), 7.68 (1H, d, H-6')
단, 샘플은 중디메틸술폭시드에 용해하고, 잔류 디메틸술폭시드의 화학 시프트값을 2.49ppm 으로 나타내었다.
FAB-MS : m/z 289 (M+H)+ (단, 글리세롤을 매트릭스로 사용하였다.)
제조예 8
잔토안겔롤(Xanthoangelol)〔화합물(24)〕의 조제
신선초 건조품(사카모토 한방당(漢方堂)) 480g 을 푸드 프로세서로 분쇄하여 아세트산에틸 약 1ℓ로 2 회 추출하여 얻어진 유기층 획분을 감압농축한 후, 농축물을 실리카크로마토에 제공하였다. 이어서, 클로로포름 : 메탄올 = 100 : 1(600㎖), 12 : 1(600㎖)를 순서대로 사용하여 흡착물을 단계적으로 용출해서 1 프랙션 에 8㎖ 씩 분리채취하였다. 얻어진 프랙션의 프랙션 번호 76 이하를 모아 감압 농축하고, 농축물을 헥산 : 아세트산에틸 = 1.8 : 1 을 전개용매로 한 실리카크로마토에 제공함으로써 프랙션 번호 25∼50 에 화합물(24)을 고농도로 함유하는 획분을 얻었다. 이 획분으로부터 아세트산에틸과 헥산으로 재결정함으로써 고순도의 화합물(24) 약 200㎎ 을 얻었다. NMR 스펙트럼의 측정 결과를 이하에 나타낸다.
1H-NMR : δ1.58 (3H, s, -Me), 1.66 (3H, s, -Me), 1.81 (3H, s, -Me), 2.08 (4H, m), 3.48 (2H, d, J 7Hz), 5.04 (1H, m), 5.29 (1H, m), 6.40 (1H, d J5', 6' 9Hz, H-5'), 6.86 (2H, d, J5, 6 9, J2, 3 9Hz, H-2,6), 7.45 (1H, d, Jα, β 15Hz, H-α), 7.54 (2H, d, H-3,5), 7.71 (1H, d, H-6'), 7.82 (1H, d, H-β)
단, 샘플은 중클로로포름에 용해하고, 잔류 클로로포름의 화학 시프트값을 7.24ppm 으로 나타내었다.
제조예 9
α-히드록시부테인(α-Hydroxybutein)〔화합물(25)〕의 합성
후술할 실시예 1 에서 합성한 화합물(5) 200㎎(0.455㎜ol)을 10 mM 탄산나트륨 완충액 455㎖에 용해하여 실온에서 5 시간 반응시켰다. 반응액을 농축하여 역상계 칼럼을 사용한 크로마토그래피(이하, 역상 크로마토라 함) 에 제공하였다. 칼럼은 TSK gel ODS-80Ts(직경 21.5㎜ ×길이 30㎝ : 도소사 제조)를 사용하였다. 용매 A (0.1% 트리플루오로아세트산 수용액)과 용매 B (증류수와 아세토니트릴을 용량비 1 : 1 로 혼합한 것으로 0.1% 트리플루오로아세트산을 함유한다)의 용출비는 0 분에서 120 분에 걸쳐 용매 B 비를 직선적으로 0% 에서 100% 로, 계속되는 20 분간은 용매 B 비를 100% 로 유지하였다. 용출속도는 5 ㎖/min, 검출은 215㎚ 으로 행하였다.
유지시간 66.0 분의 피크를 포함하는 프랙션을 채취하여 농축 건고함으로써 화합물(25) 5.0㎎(수율 2.5%)을 얻었다. NMR 스펙트럼, 질량 스펙트럼의 측정 결과를 이하에 나타낸다.
1H-NMR : δ6.59 (1H, s, -H-β), 6.72 (1H, dd, J3', 5' 1.5, J5', 6' 8.5Hz, H-5'), 6.85 (1H, d, H-3'), 6.87 (1H, d, J5, 6 8.5Hz, H-5), 7.20 (1H, dd, J2, 6 2.0Hz, H-6), 7.46 (1H, d, H-2), 7.54 (1H, d, H-6')
단, 샘플은 중디메틸술폭시드에 용해하고, 잔류 디메틸술폭시드의 화학 시프트값을 2.49ppm 으로 나타내었다.
FAB-MS : m/z 271(M-H2 O+H)+ (단, 글리세롤을 매트릭스로 사용하였다.)
제조예 10
잔토휴몰(Xanthohumol)의 조제
잔토휴몰의 정제를 목적으로 하여 홉 유래 잔토휴몰 프랙션(홉스타이너사 제조) 1.9㎎ 을 역상크로마토에 제공하였다. 칼럼은 TSK gel ODS-80TsQA(직경 4.6 ㎜ ×길이 25㎝ : 도소사 제조)를 사용하였다. 용매 A (증류수와 아세토니트릴을 용량비 3 : 1 로 혼합한 것으로 0.1% 트리플루오로아세트산을 함유한다)와 용매 B (증류수와 아세토니트릴을 용량비 1 : 3 으로 혼합한 것으로 0.1% 트리플루오로아세트산을 함유한다)의 용출비는 0 분에서 20 분에 걸쳐 용매 B 비를 직선적으로 50%에서 100% 로, 계속되는 5 분간은 용매 B 비를 100% 로 유지하고, 마지막에 용매 B 비를 50% 로 하여 5 분간 유지하였다. 용출속도는 1㎖/min, 검출은 215㎚ 으로 행하였다. 유지시간 12.8 분의 피크를 포함하는 프랙션을 채취하여 농축 건고함으로써 약 0.3㎎의 화합물을 얻었다. 얻어진 화합물을 NMR 에 의해 해석하여 화합물이 식(26)에 나타내는 잔토휴몰인 것을 확인하였다.
Figure 112002023999255-pct00015
NMR 스펙트럼, 질량 스펙트럼의 측정 결과를 이하에 나타낸다.
1H-NMR : δ1.60 (3H, s, -Me), 1.69 (3H, s, -Me), 3.12 (2H, d, 7Hz, H-1'' a . b), 3.86 (3H, s, -OMe), 5.13 (1H, s, H-2''), 6.07 (1H, s, H-5'), 6.83 (2H, d, J2, 3 9Hz, J5, 6 9Hz, H-2,6), 7.56 (2H, d, H-3,5), 7.66 (1H, d, Ja, b 16Hz), 7.75 (1H, d), 10.05 (1H, s, OH-4), 10.55 (1H, s, OH-4'), 14.63 (1H, s, OH-2')
단, 샘플은 중디메틸술폭시드에 용해하고, 잔류 디메틸술폭시드의 화학 시프트값을 2.49ppm 으로 나타내었다. 도 9 에 얻어진 잔토휴몰의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 9 에 있어서 가로축은 화학 시프트값(ppm), 세로축은 시그널의 강도를 나타낸다.
FAB-MS : m/z 355 (M+H)+ (단, 글리세롤을 매트릭스로 사용하였다.)
실시예 1
3,4,2',4'-테트라아세틸부테인(3,4,2',4'-Tetraacetyl butein)〔화합물(5)〕의 합성
제조예 1 에서 합성한 화합물(13) 1g(3.7㎜ol)을 디클로로메탄 50㎖ 에 용해하여 빙냉하 무수아세트산(18.5㎜ol), 트리에틸아민(18.5 ㎜ol), 디메틸아미노피리딘(1.8mmol)을 첨가하여 실온에서 1 시간 교반하였다. 반응액을 포화중조수, 10% 시트르산 수용액, 포화염화나트륨 수용액으로 순서대로 세정한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조하여 감압농축하였다. 농축물로부터 헥산과 클로로포름으로 화합물(5)(1.5g, 수율 90%)을 재결정하였다. NMR 스펙트럼, 질량 스펙트럼의 측정 결과를 이하에 나타낸다.
1H-NMR : δ2.23 (3H, s, -OAc), 2.29 (3H, s, -OAc), 2.30 (3H, s, -OAc), 2.31 (3H, s, -OAc), 7.00 (1H, d, J3', 6' 2, H-3'), 7.09 (1H, d, Jα, β 16Hz, H-α), 7.12 (1H, dd, J5', 6' 8Hz, H-5'), 7.23 (1H, d, J5, 6 8Hz, H-5), 7.41 (1H, d, J2, 6 2Hz, H-2), 7.44 (1H, dd, H-6), 7.52 (1H, d, H-β), 7.71 (1H, d, H-6')
단, 샘플은 중클로로포름에 용해하고, 잔류 클로로포름의 화학 시프트값을 7.24ppm 으로 나타내었다. 도 1 에 화합물(5)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 1 에 있어서, 가로축은 화학 시프트값(ppm), 세로축은 시그널의 강도를 나타낸다.
FAB-MS : m/z 441 (M+H)+ (단, 글리세롤을 매트릭스로 사용하였다.)
실시예 2
3,4-디히드록시-2',4'-디클로로칼콘(3,4-Dihydroxy-2',4'-dichlorochalcone) 〔화합물(6)〕의 합성
2',4'-디클로로아세토페논(2',4'-Dichloroacetophenone ; 시그마사 제조) 680㎎(3.6mmol)과, 3,4-디히드록시벤즈알데히드 500㎎(3.6mmol)을 출발재료로 하여 제조예 1 과 같은 방법에 의해 화합물(6) 320㎎(수율 29%)을 얻었다. NMR 스펙트럼, 질량 스펙트럼의 측정 결과를 이하에 나타낸다.
1H-NMR : δ6.76 (1H, d, J5, 6 8Hz, H-5), 6.88 (1H, d, Jα, β 16Hz, H-α), 7.04 (1H, dd, J2, 6 2Hz, H-6), 7.11 (1H, d, H-2), 7.23 (1H, d, H-β), 7.55 (2H, m, H-5', 6'), 7.74 (1H, s, H-3')
단, 샘플은 중디메틸술폭시드에 용해하고, 잔류 디메틸술폭시드의 화학 시프트값을 2.49ppm 으로 나타내었다. 도 2 에 화합물(6)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 2 에 있어서, 가로축은 화학 시프트값(ppm), 세로축은 시그널의 강도를 나타낸다.
FAB-MS : m/z 309 (M+H)+ (단, 글리세롤을 매트릭스로 사용하였다.)
실시예 3
3,4-디히드록시-2',4'-디메톡시칼콘(3,4-Dihydroxy-2',4'-dimethoxy chalcone)〔화합물(7)〕의 합성
2',4'-디메톡시아세토페논(2',4'-Dimethoxy acetophenone ; 도쿄가세이 제조) 648㎎(3.6㎜ol)과, 3,4-디히드록시벤즈알데히드 500㎎(3.6㎜ol)을 출발재료로 하여 제조예 1 과 같은 방법에 의해 화합물(7) 600㎎(수율 56%)을 얻었다. NMR 스펙트럼, 질량 스펙트럼의 측정 결과를 이하에 나타낸다.
1H-NMR : δ4.10 (3H, s, -OMe), 4.40 (3H, s, -OMe), 6.62 (1H, dd, J3', 6' 2, J5', 6' 9Hz, H-5'), 6.67 (1H, d, H-3'), 6.77 (1H, d, J5, 6 8Hz, H-5), 6.99 (1H, dd, J2, 6 2Hz, H-6), 7.08 (1H, d, H-2), 7.25 (1H, d, Jα, β 16Hz, H-α), 7.39 (1H, d, H-β), 7.67 (1H, d, H-6')
단, 샘플은 중디메틸술폭시드에 용해하고, 잔류 디메틸술폭시드의 화학 시프트값을 2.49ppm 으로 나타내었다. 도 3 에 화합물(7)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 3 에 있어서 가로축은 화학 시프트값(ppm), 세로축은 시그널의 강도를 나타낸다.
FAB-MS : m/z 301 (M+H)+ (단, 글리세롤을 매트릭스로 사용하였다.)
실시예 4
4-(3,4-디히드록시페닐)-3-부텐-2-온〔4-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3-butene-2-one〕〔화합물(8)〕의 합성
아세톤(나카라이테스크사 제조) 1㎖ 와, 3,4-디히드록시벤즈알데히드 1g(7.2mmol)을 출발재료로 하여 제조예 1 과 같은 방법에 의해 화합물(8) 180㎎(수율 14%)을 얻었다. NMR 스펙트럼, 질량 스펙트럼의 측정 결과를 이하에 나타낸다.
1H-NMR : δ2.26 (3H, s, -Me), 6.47 (1H, d, Jα, β 16Hz, H-α), 6.76 (1H, d, J5, 6 8Hz, H-5), 7.00 (1H, dd, J2, 6 2Hz, H-6), 7.05 (1H, d, H-2), 7.43 (1H, d, H-β)
단, 샘플은 중디메틸술폭시드에 용해하고, 잔류 디메틸술폭시드의 화학 시프트값을 2.49ppm 으로 나타내었다. 도 4 에 화합물(8)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 4 에 있어서 가로축은 화학 시프트값(ppm), 세로축은 시그널의 강도를 나타낸다.
FAB-MS : m/z 179 (M+H)+ (단, 글리세롤을 매트릭스로 사용하였다.)
실시예 5
1-아다만틸-3-(3,4-디히드록시페닐)-2-프로펜-1-온
〔1-Adamantyl-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-propen-1-one〕〔화합물(9)〕의 합성
1-아다만틸메틸케톤(1-Adamantyl methyl ketone : 시그마사 제조) 640㎎(3.6mmol)과, 3,4-디히드록시벤즈알데히드 500g(3.6mmol)을 출발재료로 하여 제조예 1 과 같은 방법에 의해 화합물(9) 500㎎(수율 46%)을 얻었다. NMR 스펙트럼, 질량 스펙트럼의 측정 결과를 이하에 나타낸다.
1H-NMR : δ1.65-2.04 (15H, m, -아다만틸), 6.74 (1H, d, J5, 6 8Hz, H-5), 7.00 (1H, dd, J2, 6 2Hz, H-6), 7.11 (1H, d, Jα, β 16Hz, H-α), 7.13 (1H, d, H-2), 7.36 (1H, d, H-β)
단, 샘플은 중디메틸술폭시드에 용해하고, 잔류 디메틸술폭시드의 화학 시프트값을 2.49ppm 으로 나타내었다. 도 5 에 화합물(9)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 5 에 있어서 가로축은 화학 시프트값(ppm), 세로축은 시그널의 강도를 나타낸다.
FAB-MS : m/z 299 (M+H)+ (단, 글리세롤을 매트릭스로 사용하였다.)
실시예 6
디히드로부테인(Dihydrobutein)〔화합물(10)〕의 합성
제조예 1 에서 합성한 화합물(13) 200㎎(0.74 mmol)을 메탄올 15㎖ 에 용해하여 팔라듐(나카라이테스크사 제조) 200㎎ 존재하 수소가스를 통과시키면서 실온에서 1.5 시간 교반하였다. 반응액을 여과하여 감압농축한 후, 클로로포름 : 메탄올 = 15 : 1 을 전개용매로 한 실리카크로마토에 제공함으로써 화합물(10) 130㎎( 수율 65%)을 얻었다. NMR 스펙트럼, 질량 스펙트럼의 측정 결과를 이하에 나타낸다.
1H-NMR : δ2.74 (1H, t, Jα, β 7.5Hz, H-β), 3.16 (1H, t, H-α), 6.23 (1H, d, J3', 5' 2.5Hz, H-3'), 6.34 (1H, dd, J5', 6' 9Hz, H-5'), 6.48 (1H, dd, J5, 6 9, J2, 6 2Hz, H-6), 6.60 (1H, d, H-5), 6.61 (1H, d, H-2), 7.77 (1H, d, H-6')
단, 샘플은 중디메틸술폭시드에 용해하고, 잔류 디메틸술폭시드의 화학 시프트값을 2.49ppm 으로 나타내었다. 도 6 에 화합물(10)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내낸다. 도 6 에 있어서 가로축은 화학 시프트값(ppm), 세로축은 시그널의 강도를 나타낸다.
FAB-MS : m/z 275 (M+H)+ (단, 글리세롤을 매트릭스로 사용하였다.)
실시예 7
1-아다만틸-4-(3,4-디히드록시페닐)-3-부텐-1-온〔1-Adamantyl-4-(3,4-dihydroxyphenyl)-3-butene-1-one〕〔화합물(11)〕의 합성
후술할 실시예 8 에서 합성한 화합물(12) 900 ㎎(1.8mmol)을 실시예 1〔화합물(5)의 합성〕과 같은 방법으로 아세틸화한 후, 디클로로메탄 40㎖에 용해하고, 1,8-디아자비시클로(5,4,0)-7-운데센〔1.8-Diazabicyclo(5,4,0)-7-undecene : DBU〕4mmol 을 가하여 실온에서 2 시간 반응시켰다. 반응액을 10% 시트르산 수용액으로 세정, 건조한 후 농축 건고하여 농축물을 헥산 : 아세트산에틸 = 5 : 1 을 전개 용매로 한 실리카크로마토에 제공함으로써 화합물(11)의 THP 화체를 얻었다. 화합물(11)의 THP 화체를 메탄올 10㎖ 에 용해하고 술포살리실산 무수물 40g(0.157mol)을 첨가하여 실온에서 3 시간 교반하였다. 반응액을 아세트산에틸로 희석한 후, 포화염화나트륨 수용액으로 세정, 무수 황산마그네슘으로 건조하여 감압농축하였다. 농축물로부터 헥산과 아세트산에틸로 재결정하여 화합물(11) 220㎎(수율 44%)을 얻었다. NMR 스펙트럼, 질량 스펙트럼의 측정 결과를 이하에 나타낸다.
1H-NMR : δ1.66-2.00 (15H, m, -아다만틸), 3.37 (1H, dd, Jα, α', 7, Jα, β 1Hz, H-α), 5.93 (1H, dt, Jβ, δ 11Hz, H-β), 6.22 (1H, d, H-δ), 6.59 (1H, dd, J2, 6 2, J5, 6 8Hz, H-6), 6.63 (1H, d, H-5), 6.75 (1H, d, H-2)
단, 샘플은 중디메틸술폭시드에 용해하고, 잔류 디메틸술폭시드의 화학 시프트값을 2.49ppm 으로 나타내었다. 도 7 에 화합물(11)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 7 에 있어서 가로축은 화학 시프트값(ppm), 세로축은 시그널의 강도를 나타낸다.
FAB-MS : m/z 313 (M+H)+ (단, 글리세롤을 매트릭스로 사용하였다.)
실시예 8
1-아다만틸-3-히드록시-4-(3,4-디히드록시페닐)부탄-1-온〔1-Adamantyl-3-hydroxy-4-(3,4-dihydroxyphenyl)butane-1-one〕〔화합물(12)〕의 합성
빙냉, 아르곤기류하, 테트라히드로푸란(THF) 2㎖ 속에서 디이소프로필아민(Diisopropylamine ; 와코쥰야쿠 제조) 224㎕(1.6mmol) 에 1.6M 부틸리튬(Butyl lithium)헥산 용액(나카라이테스크사 제조) 1㎖ 을 서서히 첨가하여 30 분간 교반하였다. 반응액을 메탄올/드라이아이스로 -70℃ 로 냉각하고 1-아다만틸메틸케톤 285㎎(1.6mmol)/500㎕ THF 용액을 첨가하여 30 분간 교반하였다. 이 반응액에 3',4'-디히드록시페닐아세트산(3',4'-Dihydroxyphenyl acetic acid ; 나카라이테스크사 제조)를 완전 THP 화한 후, 1M DIBAL 헥산용액(나카라이테스크사 제조) 로 환원함으로써 얻어진 3',4'-디히드록시페닐 아세트알데히드(3',4'-Dihydroxyphenyl acetaldehyde)의 THP 화체 500㎎(1.6mmol)/THF 500㎕ 을 서서히 첨가하여 -70℃ 에서 10 분간 교반하였다. 반응액에 포화염화암모늄 수용액을 첨가하고 이어서 에테르추출에 의해 얻어진 유기층 획분을 헥산 : 아세트산에틸 = 4 : 1 을 전개용매로 한 실리카크로마토에 제공함으로써 화합물(12)의 THP 화체를 얻었다. 화합물(12)의 THP 화체를 메탄올 10㎖ 에 용해하고 술포살리실산 무수물 40㎎(0.157mmol)을 첨가하여 실온에서 3 시간 교반하였다. 반응액을 아세트산에틸로 희석한 후, 포화염화나트륨 수용액으로 세정, 무수 황산마그네슘으로 건조하여 감압 농축하였다. 농축물로부터 헥산과 아세트산에틸로 재결정하여 화합물(12) 260㎎(수율 57%)을 얻었다. NMR 스펙트럼, 질량 스펙트럼의 측정 결과를 이하에 나타낸다.
1H-NMR : δ1.58-1.98 (15H, m, -아다만틸), 2.25 (1H, dd, Jα, β 4.5, Jα, α', 16.5Hz, H-α), 2.41 (1H, dd, Jβ, δ 6.0, Jδ, δ' 13.5Hz, H-δ), 2.61 (1H, dd, Jα', β 4.5Hz, H-α'), 3.99 (1H, m, H-β), 6.38 (1H, dd, J2, 6 2, J5, 6 8Hz, H-6), 6.55 (1H, d, H-2), 6.57 (1H, d, H-2)
단, 샘플은 중디메틸술폭시드에 용해하고, 잔류 디메틸술폭시드의 화학 시프트값을 2.49ppm 으로 나타내었다. 도 8 에 화합물(12)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 8 에 있어서, 가로축은 화학 시프트값(ppm), 세로축은 시그널의 강도를 나타낸다.
FAB-MS : m/z 331 (M+H)+ (단, 글리세롤을 매트릭스로 사용하였다.)
참고예 1
카페인산을 사용한 NGF 생성증강 활성 측정방법의 검토
마우스 선유아세포 L-M 세포(ATCC CCL-1.2)를 0.5% 의 박토펩톤(기브코사 제조)을 함유하는 M199 배지(ICN 사 제조)에서 1.5 ×105 세포/㎖ 가 되도록 현탁하고 96 홀 플레이트에 0.1㎖ 씩 심어 무균적으로 배양하였다. 3 일간 배양한 후 배지를 제거하고 0.5% 의 소혈청 알부민(시그마사 제조)을 함유하는 M199 배지로 치환하였다. 세포가 들어있는 각 웰에 대하여 NGF 생성증강 활성을 갖는 공지의 물질인 카페인산〔Caffeic Acid : 시그마사 제조, 디메틸술폭시드(DMSO) 용액〕 을 최종농도가 0, 50, 100, 200 μM 가 되도록 첨가하여 24 시간 배양하였다. 또 카페인산 농도가 0 μM 인 것을 음성대조로 하였다. 또, 각 웰의 DMSO 의 최종농도는 0.1% 이 되도록 하였다. 배양종료후, 배양액 중의 NGF 농도를 효소 면역 측정법(NGF Emax I㎜uno Assay System : 프로메가사 제조) 로 측정하였다. 각 첨가량에서의 카페인산의 NGF 생성증강 정도는, 각 첨가량에서의 세포배양액 중 NGF 농도를, 음성대조의 세포배양액 중 NGF 농도를 100% 로 하여 백분율에 의해 증강율(%) 로서 나타내었다. 그 결과를 표 3 에 나타낸다. 실험은 2 계통으로 행하여 그 평균값을 채용하였다. 본 방법에 의해 카페인산의 NGF 생성증강 활성을 측정할 수 있다는 것이 분명해졌다. 또한 본 참고예에 의해 카페인산은 그 농도의존적으로 NGF 생성을 증강시키는 것도 분명해졌다.
첨가량(μM) 0 50 100 200
증강율(%) 100 89.7 150 349
단, 음성대조의 NGF 농도는 0.14278 ng/㎖ 였다.
실시예 9
화합물(13)에 의한 NGF 생성의 증강
참고예 1 과 같은 방법으로 화합물(l3)(후나코시사 제조)의 NGF 생성증강 활성을 측정하였다. 화합물(13)은 최종농도가 0, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 50μM 이 되도록 첨가하였다. 그 결과를 표 4 에 나타낸다. 화합물(13)은 농도의존적으로 L-M 세포의 NGF 생성을 증강하여 높은 NGF 생성증강 활성을 나타냄과 동시에 또 그 작용 유효농도영역이 넓은 것이 분명해졌다.
첨가량(μM) 0 0.5 1 2 5 10 20 50
증강율(%) 100 120 462 1107 2100 3686 3927 1743
단, 음성대조의 NGF 농도는 0.07091 ng/㎖ 이었다.
실시예 10
화합물(14)에 의한 NGF 생성의 증강
참고예 1 과 같은 방법으로 화합물(14)(시그마사 제조)의 NGF 생성증강 활성을 측정하였다. 화합물(14)은 최종농도가 0, 50, 100, 200 μM 이 되도록 첨가하였다. 그 결과를 표 5 에 나타낸다. 화합물(14)은 농도의존적으로 L-M 세포의 NGF 생성을 증강하여 높은 NGF 생성증강 활성을 나타냄과 동시에 그 작용 유효농도영역이 넓은 것이 분명해졌다.
첨가량(μM) 0 50 100 200
증강율(%) 100 310 550 1884
단, 음성대조의 NGF 농도는 0.07091 ng/㎖ 였다.
실시예 11
화합물(15)에 의한 NGF 생성의 증강
참고예 1 과 같은 방법으로 화합물(15)(시그마사 제조)의 NGF 생성증강 활성을 측정하였다. 화합물(15)은 최종농도가 0, 12.5, 25, 50 μM 이 되도록 첨가하였다. 그 결과를 표 6 에 나타낸다. 화합물(15)은 농도의존적으로 L-M 세포의 NGF 생성을 증강하여 높은 NGF 생성증강 활성을 나타냄과 동시에 또 그 작용 유효농도영역이 넓은 것이 분명해졌다.
첨가량(μM) 0 12.5 25 50
증강율(%) 100 236 263 320
단, 음성대조의 NGF 농도는 0.14278 ng/㎖ 였다.
실시예 12
화합물(16)에 의한 NGF 생성의 증강
참고예 1 과 같은 방법으로 화합물(16)(와코쥰야쿠사 제조)의 NGF 생성증강 활성을 측정하였다. 화합물(16)은 최종농도가 0, 25, 50, 100 μM 이 되도록 첨가하였다. 그 결과를 표 7 에 나타낸다. 화합물(16)은 농도의존적으로 L-M 세포의 NGF 생성을 증강하여 높은 NGF 생성증강 활성을 나타냄과 동시에 또 그 작용 유효농도영역이 넓은 것이 분명해졌다.
첨가량(μM) 0 25 50 100
증강율(%) 100 114 116 261
단, 음성대조의 NGF 농도는 0.14278 ng/㎖ 였다.
실시예 13
화합물(5)∼(12) 및 (17)∼(25)에 의한 NGF 생성의 증강
참고예 1 과 같은 방법으로 제조예 2∼9 및 실시예 1∼8 에서 합성한 화합물(5)∼(12), (17)∼(22), (24) 및 (25), 화합물(23)(로스마린산 : 후나코시사 제조) 또는 종래부터 NGF 생성증강물질로서 알려져 있는 카페인산(CA), 4-메틸카테콜(4MC) 및 에피네프린(EN)의 NGF 생성증강 활성을 측정하였다. 각 화합물은 표 8∼10 에 나타내는 최종농도가 되도록 첨가하였다. 또한, 화합물 첨가후의 세포배양시간은 20 시간으로 하였다. 이들 결과를 표 8∼10 에 나타낸다. 각 화합물의 시험별로 음성대조를 형성하고 각각 실험은 2 계통으로 행하여 그 평균값을 채용하였다.
Figure 112002023999255-pct00016
NC (ng/㎖) 첨가량(μM)
0 0.781 1.563
증강율(%)
화합물(11) 0.181 100 775.2 865.8
NC (ng/㎖) 첨가량(μM)
0 31.25 62.5 125 250
증강율(%)
화합물(25) 0.325 100 160.6 183.6 273.6 495.3
또, 표 중의 NC 는 음성대조의 NGF 농도를 나타낸다. 또한, N.T. 는 시험하지 않은 것을 나타낸다.
이들 결과로부터 본 발명에 사용되는 화합물(5)∼(12) 및 (17)∼(25)는 종래부터 NGF 생성증강물질로서 알려져 있는 카페인산, 4-메틸카테콜 및 에피네프린보 다도 NGF 생성증강 활성의 강도, 또는 NGF 생성증강 활성을 나타내는 농도영역이 광역이라는 점에서 높은 유용성을 가진다고 나타나 있다.
실시예 14
(1) 마우스 선유아세포 L-M 세포(ATCC CCL-1.2)를 0.5%의 박토펩톤(기브코사 제조)을 함유하는 M199 배지(ICN 사 제조)에 1.5 ×105 세포/㎖ 에 현탁하고 96 웰 플레이트에 0.1㎖ 씩 심어 무균적으로 배양하였다. 3 일간 배양한 후 배지를 제거하고 0.5%의 소혈청 알부민(시그마사 제조)을 함유하는 M199 배지로 치환하였다. 여기에 국화과 홍화(Carthamus tinctorius LINNE)의 꽃에서 추출하여 얻은 황색 색소(분말 선옐로 No.2, 산에이겐 F·F·I 사 제조)를 시료로 하여 최종농도가 0, 1.25, 2.5, 5 ㎎/㎖ 가 되도록 첨가하여 20 시간 배양하였다. 배양종료후 배양액 중의 NGF의 농도를 효소 면역 측정법(NGF Emax I㎜uno Asay System : 프로메가사 제조)으로 측정하였다. NGF 생성증강의 정도를, 음성대조로서의, 시료를 첨가하지 않은 세포배양액 중의 NGF 농도를 100% 로 하여 백분율에 의해 증강율(%)로서 나타내었다. 실험은 2 계통으로 행하여 그 평균값을 채용하였다. 그 결과, 홍화의 황색 색소는 농도의존적으로 L-M 세포의 NGF 생성을 증강하였다. 그 결과를 표 11 에 나타낸다.
첨가량(mg/㎖) 증가율(%)
0 100
1.25 277.6
2.5 441.3
5 808.4
단, 음성대조의 NGF 농도는 0.507 ng/㎖ 이었다.
(2) 실시예14-(1) 에 기재된 홍화 황색 색소 중의 활성성분을 역상크로마토를 사용하여 정제단리하였다. 이하에 그 조건에 관하여 나타낸다. 칼럼은 TSK gel ODS-80Ts(직경 21.5 ㎜ ×길이 30 ㎝ : 도소사 제조)를 사용하였다. 용매 A (0.1% 트리플루오로아세트산 수용액)과 용매 B (증류수와 아세토니트릴을 용량비 1 : 1 로 혼합한 것으로 0.1% 트리플루오로아세트산을 함유한다)의 용출비는 0 분에서 50 분에 걸쳐 용매 B 비를 직선적으로 0%에서 100% 로, 계속되는 15분간은 용매 B 비를 100% 로 유지하고, 마지막에 용매 B 비를 0% 로 하여 15 분간 유지하였다. 용출속도는 5㎖/min, 검출은 215㎚ 으로 행하였다. 3 분마다 프랙션을 채취하여 각 프랙션의 NGF 생성증강 활성을 실시예 13 과 같은 방법으로 측정하였다. 그 결과, 유지시간 32.5 분과 41.8 분의 검출 피크를 포함하는 프랙션에 활성이 있다는 것이 분명해졌다. 유지시간 32.5 분의 프랙션에 관해서 질량 스펙트럼 해석을 한 결과, 분자량이 613 인 시그널이 검출되었다. 그리고, 1H-NMR 스펙트럼(도 9), 13C-NMR 스펙트럼 해석의 결과, 활성성분은 식(27)에 나타내는 화합물(27)의 새플로민 A (분자량 612.53) 인 것을 확정하였다.
Figure 112002023999255-pct00017
이렇게 하여 얻어진 정제 새플로민 A 의 NGF 생성증강 활성을 실시예 13 과 같은 방법으로 측정하였다. 정제 새플로민 A 는 최종농도가 0, 2.5㎎/㎖ 이 되도록 첨가하였다. 그 결과, 정제한 새플로민 A 는 L-M 세포의 NGF 생성을 증강하였다. 새플로민 A 의 결과에 대해서는 표 12 에, 유지시간 41.8 분의 프랙션 중에 함유된 물질에 관한 결과에 대해서는 표 13 에 나타낸다(그 물질의 첨가량은 표 13 에 나타낸다).
첨가량(㎎/㎖) 증가율(%)
0 100
2.5 130.7
단, 음성대조의 NGF 농도는 0.739 ng/㎖ 이었다.
첨가량(㎎/㎖) 증가율(%)
0 100
1.25 350.7
2.5 643.4
단, 음성대조의 NGF 농도는 0.736 ng/㎖ 이었다.
실시예 15
잔토휴몰에 의한 NGF 생성의 증강
실시예 13 과 같은 방법으로 제조예 10 에서 조제한 잔토휴몰의 NGF 생성증강 활성을 측정하였다. 잔토휴몰은 최종농도가 0, 15.6, 31.3, 62.5, 125 μM 이 되도록 첨가하였다. 그 결과를 표 14 에 나타낸다. 잔토휴몰은 농도의존적으로 L-M 세포의 NGF 생성을 증강시켜 높은 NGF 생성증강 활성을 나타냄과 동시에 그 작용 유효농도영역이 넓은 것이 분명해졌다.
첨가량(μM) 증가율(%)
0 100
15.6 160.3
31.3 212.1
62.5 473.2
125 897.1
단, 음성대조의 NGF 농도는 0.0575 ng/㎖ 이었다.
실시예 16
(1) 미리세틴에 의한 NGF 생성의 증강
래트 선유아 L-M 세포(ATCC CCL-1.2)를 0.5%의 박토펩톤(기브코사 제조)을 함유하는 M199 배지(ICN 사 제조)에서 1.5 ×105 세포/㎖ 로 현탁하고 96 웰 플레이트에 0.1 ㎖ 씩 심어 무균적으로 배양하였다. 3 일간 배양한 후 배지를 제거하고 0.5% 의 소혈청 알부민(시그마사 제조)을 함유하는 M199 배지로 치환하였다.
세포가 들어있는 각 웰에 대하여 미리세틴(시그마사 제조)을 최종농도가 0, 31.3, 62.5, 125, 250 μM 이 되도록 첨가하여 24 시간 배양하였다. 음성대조로서 증류수를 첨가한 것을 사용하였다. 배양종료후, 배양액 중의 NGF의 농도를 효소 면역 측정법(NGF Emax Immuno Assay System : 프로메가사 제조)으로 측정하였다. 각 첨가량에서의 NGF 생성증강의 정도는, 각 첨가량에서의 세포배양액 중 NGF 농도를 음성대조의 세포배양액 중 NGF 농도를 100% 로 하여 백분율에 의해 증강율(%)로서 나타내었다. 그 결과를 표 15 에 나타내었다. 실험은 2 계통으로 행하여 그 평균값을 채용하였다. 미리세틴은 농도의존적으로 L-M 세포의 NGF 생성을 증강하였다.
첨가량(μM) 0 31.3 62.5 125 250
증강율(%) 100 111 137 307 397
단, 음성대조의 NGF 농도는 0.038 ng/㎖ 이었다.
(2) 쿠에르세틴에 의한 NGF 생성의 증강
실시예 16-(1)과 같은 방법으로 쿠에르세틴(시그마사 제조)의 NGF 생성증강 활성을 측정하였다. 쿠에르세틴은 최종농도가 0, 31.3, 62.5, 125, 250 μM 이 되도록 첨가하였다. 그 결과를 표 16 에 나타낸다. 쿠에르세틴은 농도의존적으로 L-M 세포의 NGF 생성을 증강하였다.
첨가량(μM) 0 31.3 62.5 125 250
증강율(%) 100 122 108 173 219
단, 음성대조의 NGF 농도는 0.053 ng/㎖ 이었다.
(3) 미리시트린에 의한 NGF 생성의 증강
실시예 16-(1)과 같은 방법으로 미리시트린(후나코시사 제조)의 NGF 생성증강 활성을 측정하였다. 미리시트린은 최종농도가 0, 31.3, 62.5, 125, 250 μM 이 되도록 첨가하였다. 그 결과를 표 17 에 나타내었다. 미리시트린은 농도의존적으로 L-M 세포의 NGF 생성을 증강하였다.
첨가량(μM) 0 31.3 62.5 125 250
증강율(%) 100 105 159 294 304
단, 음성대조의 NGF 농도는 0.053 ng/㎖ 이었다.
(4) 쿠에르시트린에 의한 NGF 생성의 증강
실시예 16-(1)과 같은 방법으로 쿠에르시트린(시그마사 제조)의 NGF 생성증강 활성을 측정하였다. 쿠에르시트린은 최종농도가 0, 31.3, 62.5, 125, 250 μM 이 되도록 첨가하였다. 그 결과를 표 18 에 나타내었다. 쿠에르시트린은 농도의존적으로 L-M 세포의 NGF 생성을 증강하였다.
첨가량(μM) 0 31.3 62.5 125 250
증강율(%) 100 122 140 193 207
단, 음성대조의 NGF 농도는 0.053 ng/㎖ 이었다.
실시예 17
웅성 SD 래트를 일본 SLC 사에서 구입하여 예비사육한 후 5 주령부터 실험에 사용하였다. 스트렙토조토신(나카라이테스크사 제조)를 체중 1㎏ 당 100㎎ 복강 내에 투여하여 당뇨병을 야기시켰다. 스트렙토조토신 투여 5일 후의 혈당치에 의해 그룹을 나누었다. 이어서, 부테인〔화합물(13)〕을 생리식염수에 용해하여 체중 1㎏ 당 100㎍ 의 비율로 복강 내에 투여하였다. 대조군에는 생리식염수만 동일하게 투여하였다. 매일 투여하여 투여개시로부터 4 주후에 좌골신경(약 35㎎)을 적출하였다. 적출한 신경을 호모디나이즈하여 NGF 를 추출하고, 함유량을 효소 면역 측정법(NGF Emax I㎜uno Assay System : 프로메가사 제조)로 측정하였다.
그 결과를 표 19 에 나타낸다. 표 중 숫자는 6 예의 평균값 ±표준오차를 나타낸다. 또한 * 표는 Student의 t 검정에 의해 대조군에 대하여 5% 이하의 위험율로 의미가 있는 차를 갖는 것을 의미한다. 즉, 대조군에 대하여 부테인 투여군에서는 신경중의 NGF 함유량이 증가하였다. 이와 같이, 부테인을 생체에 투여함으로써 NGF 생성이 증강된다는 것이 분명해졌다.
NGF 함유량(pg/좌골신경)
부테인투여군(N=6) 대조군(N=6) 187.7±26.4* 119.2±11.7
평균값 ±표준오차
실시예 18
(1) 마우스 선유아세포 L-M 세포(ATCC CCL-1.2)를 0.5%의 박토펩톤(기브코사 제조)을 함유하는 M199 배지(ICN 사 제조)에서 2.5 ×105 세포/㎖ 로 현탁하여 6 웰 플레이트에 2㎖ 씩 심어 무균적으로 배양하였다. 3 일간 배양한 후 배지를 제거하고 0.5%의 소혈청 알부민(시그마사 제조)를 함유하는 M199 배지 1㎖ 로 치환하였다. 여기에 디메틸술폭시드에 용해한 부테인〔화합물(13)〕을 최종농도가 20μM (DMSO 의 최종농도 0.1%) 가 되도록 첨가하여 20 시간 배양하였다. 배양종료후 배양 상등액을 채취하여 20% 의 소태아 혈청(JRH 바이오사이언스사 제조)을 함유한 DME 배지(바이오위타카사 제조)를 등용량 첨가하고 0.22㎛ 의 멸균필터에 통과시켜 부테인처리 조제 배지를 얻었다. 또한, 부테인 대신에 DMSO 만 최종농도 0.1% 가 되도록 첨가한 배양 상청액에 관해서도 마찬가지 조작을 하여 대조 제조 배지를 얻었다.
(2) 실시예 18-(1) 에서 조제한 부테인처리 조제 배지 및 대조 조제 배지 중에 함유되는 NGF의 생화학적인 활성의 평가를 이하의 방법으로 조사하였다.
먼저, 미리 래트 부신 갈색세포종 PC-12세포(ATCC CRL-l721)를 10%의 소태아 혈청을 함유하는 DME 배지에서 2.0 ×104세포/㎖ 로 현탁하여 콜라겐코팅한 96 웰 플레이트에 0.1㎖ 씩 심어 무균적으로 24 시간 배양해 두었다. 다음으로, 0.5% 의 소혈청 알부민을 함유하는 M199 배지와 20%의 소태아 혈청을 함유하는 DME 배지를 등량씩 혼합한 배지(이하, 아세이용 배지)를 사용하여 부테인 처리 조제 배지 및 대조 조제 배지에 관해 2 배 희석계열(원액, 1/2 희석액, 1/4 희석액, 1/8 희석액, 1/16 희석액, 1/32 희석액)을 조제하였다. 배양해 둔 PC-12 세포로부터 배지를 제거하고 부테인 처리 조제 배지 및 대조 조제 배지의 상기 단계 희석액을 100㎕ 첨가하여 무균적으로 48 시간 배양하였다. 또, 비교로서 조제 배지 대신에 아세이용 배지만 100㎕ 첨가하여 무균적으로 48 시간 배양하였다. 배양종료후 현미경(올림푸스사 제조) 관찰하에서 무작위로 시야를 선택해 세포의 사진(배율 : 100배)을 찍었다. 사진중 300∼500개의 세포를 대상으로 신경돌기 신장 양성인 PC-12세포의 수를 세어 아래 식으로 신경돌기 신장율(%)을 산출하였다.
신경돌기신장율(%) = 신경돌기 양성인 세포수(개) ÷총세포수(개)×100
그리고, 신경돌기의 길이가 세포의 긴 지름보다도 긴 것을 신경돌기 신장 양성으로 하였다. 부테인 처리 조제 배지 및 대조 조제 배지에 관하여 구한 신경돌기 신장율(%)의 결과를 표 20 에 나타낸다. 실험은 3 연으로 행하여 그 평균값을 채용하였다. 부테인 처리 조제 배지는 대조 조제 배지에 비하여 강한 신경돌기 신장 활성을 나타내었다.
희석액 신경돌기신장율(%)
부테인 처리 조제 배지 대조 조제 배지
원액 64.1 33.5
1/2 희석액 60.1 21.7
1/4 희석액 42.8 11.6
1/8 희석액 38.3 10.6
1/16 희석액 27.7 8.87
1/32 희석액 21.2 4.02
아세이용 배지만 첨가한 경우의 신경돌기 신장율은 3.66% 이었다.
실시예 19
치료제의 제조 1
주사제
Ⅰ. 생리식염수에 부테인〔화합물(13)〕을 1% 농도로 가하여 주사제를 제작하였다.
Ⅱ. 생리식염수에 부테인〔화합물(13)〕 및 글리실리틴산을 각각 0.5% 및 0.1% 농도로 가하여 주사제를 제작하였다.
또한, 화합물(5)∼(12), (14)∼(25)에 관해서도 상기 Ⅰ, Ⅱ 와 같은 방법으로 주사제를 제작하였다.
정제
Ⅲ. 부테인〔화합물(l3)〕 100㎎과 미결정성 셀룰로스의 적량을 함유하는 정제를 조제하고 당의를 입혀 각 정제를 제작하였다.
Ⅳ. 부테인〔화합물(13)〕 0.1㎎, 글리실리틴산 디칼륨 10㎎ 및 미결정 셀룰로스의 적량을 함유하는 정제를 조제하고 당의를 입혀 정제를 제작하였다.
또, 화합물(5)∼(12), (14)∼(27)에 관해서도 상기 Ⅲ, Ⅳ 와 같은 방법으로 정제를 제작하였다.
실시예 20
치료제의 제조 2
주사제
Ⅰ. 생리식염액에 미리세틴을 1% 농도로 가하여 주사제를 제작하였다.
Ⅱ. 생리식염수에 미리세틴 및 글리실리틴산을 각각 0.5% 및 0.1% 농도로 가하여 주사제를 제작하였다.
정제
Ⅰ. 미리세틴 100㎎ 과 미결정성 셀룰로스의 적량을 함유하는 정제를 조제하고 당의를 입혀 각 정제를 제작하였다.
Ⅱ. 미리세틴 0.1㎎, 글리실리틴산 디칼륨 10㎎ 및 미결정 셀룰로스의 적량을 함유하는 정제를 조제하고 당의를 입혀 정제를 제작하였다.
시험예 1
독성시험
웅성 SD 래트를 일본 SLC 사에서 구입하여 예비사육한 후 6 주령부터 실험에 사용하였다. 부테인〔화합물(13)〕을 생리식염수에 용해하여 복강내 투여 또는 0.5% 카르복시메틸셀룰로스에 현탁하여 강제 경구투여하였다. 투여농도는 복강내 투여의 경우는 체중 1㎏ 당 300㎎(N=3), 10㎎(N=3), 1㎎(N=3), 0.1㎎(N=3)로 하고, 강제 경구투여의 경우는 체중 1㎏ 당 1g(N=2), 0.1g(N=3)으로 하였다. 대조군에는 각각의 용매만 동일하게 투여하였다. 투여후 어느 투여군에서도 사망예, 일반증상의 변화, 체중증가의 억제, 해부시의 이상 소견은 인정되지 않았다.
또한, 본 발명에서 유효성분으로서 사용하는 화합물을 CDF1 마우스(웅성, 7 주령, 일본 SLC 사)에 경구투여하여 마찬가지로 시험한 결과, 독성이 없거나 또는 저독성인 것이 확인되었다.
시험예 2
독성시험
실시예 16 에서 사용한 각 화합물을 상기에 서술한 시험예 1 과 마찬가지로 마우스에게 경구 투여한 결과, 저독성인 것이 확인되었다.
본 발명에 의해 NGF 생성증강 활성을 갖는 상기 유효성분을 함유하는 의약이 제공된다. 이러한 의약은 NGF 생성증강을 요하는 질환의 치료제 또는 예방제로서 생체의 항상성 유지에 유용한 것이다. 또한 본 발명에서는 상기 유효성분을 함유하는 NGF 생성증강제가 제공된다. 이러한 증강제는 신경 세포 기구에 관한 생화학 적 연구나 치매증, 신경장애약 등의 스크리닝에 유용하다. 게다가 본 발명에서는 NGF 생성증강용 식품, 음료 또는 사료도 제공된다. 이들 식품, 음료 또는 사료는 본 발명에 사용되는 유효성분에 감수성을 나타내는 NGF 생성증강을 요하는 질환의 증상개선, 예방에 매우 유용하다. 또한, 본 발명에 있어서는 NGF 생성증강 작용을 갖는 신규 화합물에 관해서도 제공된다.

Claims (6)

  1. 하기 화학식 (1)로 표시되는 화합물 :
    [화학식 1]
    Figure 112006059130480-pct00018
    〔식 중, R1, R2, R3, R4 및 R5 는 각각 동일하거나 상이해도 되며, 수소원자, 수산기, 알콕시기 또는 아실옥시기이고 ;
    X 는 하기 화학식 (2) :
    [화학식 2]
    Figure 112006059130480-pct00019
    (식 중, Z 는 수소원자, 또는 수산기, 티올기, 옥소기, 티옥소기, 아미노기, 니트로기, 황산기, 인산기, 알콕시기, 할로겐 원자, 아실옥시기 및 아실티옥시기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 특성기가 도입될 수 있는 지방족기, 방향족기 또는 방향지방족기이고, Y 는 수소원자 또는 수산기이며, m 및 n 은 각각 0 또는 1 이다.), 또는 하기 화학식 (3) :
    [화학식 3]
    Figure 112006059130480-pct00020
    (식 중, Z' 은 수소원자, 또는 수산기, 티올기, 옥소기, 티옥소기, 아미노기, 니트로기, 황산기, 인산기, 알콕시기, 할로겐 원자, 아실옥시기 및 아실티옥시기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 특성기가 도입될 수 있는 지방족기, 방향족기 또는 방향지방족기이고, Y' 는 수소원자 또는 수산기이며, m 및 n 은 각각 0 또는 1 이다.)
    로 표시된다. 단, 상기 화학식 (1)에 있어서, R1, R4 및 R5 가 함께 수소원자, R2 및 R3 가 함께 수산기, X 가 상기 화학식 (2)이고, 또한 그 화학식 (2)에 있어서 n 이 1, m 이 0, Z 및 Y 가 수소원자인 경우를 제외한다.〕
    및 약리학적으로 허용되는 그들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상의 화합물을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 치매증, 신경장애, 말초신경통, 뇌허혈 또는 당뇨병성 뉴로퍼시의 치료제 또는 예방제.
  2. 제 1 항에 기재된 화학식 (1)로 표시되는 화합물 및 약리학적으로 허용되는 그들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상의 화합물을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 학습기억능력의 향상, 신경세포 기구에 관한 생화학적 연구, 또는 치매증 또는 신경장애약의 스크리닝을 위한 신경생성인자 생성증강제.
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 기재된 화학식 (1)로 표시되는 화합물 및 그들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상의 화합물을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 신경성장인자 생성증강용 식품, 음료 또는 사료.
  5. 학습기억능력의 향상, 신경세포 기구에 관한 생화학적 연구, 또는 치매증 또는 신경장애약의 스크리닝을 위한 신경성장인자 생성증강제, 또는 신경성장인자 생성증강용 식품, 음료 또는 사료의 제조를 위해, 제 1 항에 기재된 화학식 (1)로 표시되는 화합물 및 그들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상의 화합물을 사용하는 방법.
  6. 하기 화학식 5, 6, 8, 9, 11 및 12로 나타내는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물:
    [화학식 5]
    Figure 112006092664838-pct00022
    [화학식 6]
    Figure 112006092664838-pct00023
    [화학식 8]
    Figure 112006092664838-pct00025
    [화학식 9]
    Figure 112006092664838-pct00026
    [화학식 11]
    Figure 112006092664838-pct00028
    [화학식 12]
    Figure 112006092664838-pct00029
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