JP4912708B2 - 新規物質ｔｍｒ - Google Patents

Description

本発明は、抗酸化性を有する新規物質、それを生産する微生物、新規物質の製造方法及びそれを有効成分とする抗酸化剤に関する。

近年、生体内で生成される活性酸素が、不飽和脂肪酸と反応して過酸化脂質を生じ、人体に悪影響を及ぼすことが明らかになってきている。又、化粧品、医薬品、飲食品等においては、油脂類を含有するものが多く、保存中や使用時に活性酸素と反応して過酸化脂質を生成し、これによる品質低下や栄養の低下・人体への毒性の発現が大きな問題になっている。

このため、従来より抗酸化作用を有する物質の探索研究が広く行われている。例えば、合成抗酸化剤 としてＢＨＴ（３，５−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｔｏｌｅｎ）やＢＨＡ（２，（３）−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ−ｈｙｄｒｏｘｙａｎｙｓｏｌ）等があり、天然物抗酸化剤として脂溶性のトコフェロール（ビタミンＥ）や、水溶性のアスコルビン酸（ビタミンＣ）、あるいは茶等の植物から抽出して得られるカテキン類等が挙げられる。

本発明の目的は、これまでに知られていない抗酸化性を有する新規物質、それを生産する微生物、新規物質の製造方法及びそれを有効成分とする抗酸化剤を提供することである。

本発明者らは、カテキン類を基とし、その抗酸化性を向上させるため、あるいは新たな生理活性を見出すため、カテキン類を代謝する微生物をスクリーニングした。得られたカテキン類代謝微生物及びその変異株の変換能力を利用し、その代謝産物の製造を行ったところ、その物質がＴＭＲという新規物質であることを突き止め、さらにその新規物質が基のカテキン類よりも高い抗酸化能を有することを示し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、請求項１記載の本発明は、一般式（１）で表される新規物質ＴＭＲである。

（式中のＲは水素原子又は水酸基を表す。）

請求項２記載の本発明は、請求項１記載の式（１）で表される物質ＴＭＲを有効成分とする抗酸化剤である。

請求項３記載の本発明は、請求項１記載の式（１）で表される物質ＴＭＲの製造方法であって、バークホルデリア属に属する物質ＴＭＲ生産菌をカテキン類と反応させて物質ＴＭＲを生成させ、これを採取する物質ＴＭＲの製造方法である。

請求項４記載の本発明は、請求項１記載の式（１）で表される物質ＴＭＲを生産することができる、バークホルデリア属に属するＭＴ−０７株及び／またはその変異株であるＨＥ−４６株である。

本発明における新規物質ＴＭＲは、抗酸化剤として利用が可能である。また、バークホルデリア属に属するＭＴ−０７株及び／またはその変異株であるＨＥ−４６株は、カテキン類以外のポリフェノール類であっても反応させることによって従来よりも優れた抗酸化能などの機能性を有する物質に変換する可能性がある。

本発明は、下記の一般式（１）で表される新規物質ＴＭＲを提供する。

式中のＲは水素原子又は水酸基を表し、水素原子のものは３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−４−（３’,４’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ） ２−ｂｕｔａｎｏｎｅ（以下、「ＴＭＲ−１」とする）であり、下記の式で表される。

本発明の新規物質ＴＭＲの製造法について説明する。
本発明の物質ＴＭＲは、微生物を用いて製造したものに限定されず合成したものであってもよいが、下記に示す微生物を用いた製造方法の方がより簡便で好ましい。

本発明の新規物質ＴＭＲは、バークホルデリア属に属する物質ＴＭＲ生産菌をカテキン類と共に培養して物質ＴＭＲを生成させ、これを採取することにより、容易に製造することができる。蓄積した物質ＴＭＲを培養物から単離精製するに際しては、通常の微生物代謝生産物を培養物から単離精製する方法が適用される。

物質ＴＭＲの生産菌としては、バークホルデリア属の細菌で、物質ＴＭＲ生産能を有するものであればいずれも使用でき、増殖期、定常期、どちらの菌体でも使用することができる。物質ＴＭＲの生産効率を考慮した場合、通常の菌株よりも遺伝子組換法、紫外線照射、Ｘ線照射あるいは、変異誘導物質による変異処理法などによって変異させた菌株を用いる方が良い。具体的に好適な例としては、関東近縁より採取した土壌より分離されたバークホルデリア属に属する桿菌ＭＴ−０７株、あるいは、その株に変異をかけたもので本発明者らがＨＥ−４６株と番号を付した菌株が挙げられる。

このＭＴ−０７株およびＨＥ−４６株の菌学的性状は次の通りである。
形態的特徴：幅０．８μｍ、長さ１．０〜１．２μｍの桿菌で、芽胞は形成せず、運動性は確認された。グラム染色は陰性であった。
培養的特徴：ＬＢ寒天培地上でのコロニーは０．５〜１．０ｍｍ程度で、形状は円形、色調は黄色を示し、半透明であった。

生理・生化学的特徴：カタラーゼ活性陽性、オキシダーゼ活性陰性、硝酸塩還元活性陽性、インドール産生陰性、ウレアーゼ活性陰性、エスクリン加水分解陰性、ゼラチン加水分解陰性、β−ガラクトシダーゼ活性陽性であった。また、ブドウ糖、Ｌ−アラビノース、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、グルコン酸カリウム、ｎ−カプリン酸、アジピン酸、ｄ１−リンゴ酸、酢酸フェニルを資化した。

遺伝学的手法による相同検索：１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列データを用いて相同検索を行なったところ、バークホルデリア属の一部の種と近い相同性を示した。

以上の菌学的性質から本菌をバークホルデリア属の菌と同定した。本発明者はＭＴ−０７株をバークホリデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）ＭＴ−０７、ＨＥ−４６株をバークホリデリア・エスピーＨＥ−４６として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ)にそれぞれＮＩＴＥ Ｐ−２１２、ＮＩＴＥ Ｐ−１７９の番号で寄託している。

上記微生物の培養に際しては細菌類の培養に用いられる通常の培養方法で差し支えない。用いられる培地は微生物の資化しうる炭素源、窒素源、無機物、微生物の生育および物質ＴＭＲ生成を促進する物質などを程よく含有する培地であれば、合成培地、天然培地いずれでも用いることができる。

炭素源としては、例えば、グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、グルコン酸カリウム、ｎ−カプリン酸、アジピン酸、ｄ１−リンゴ酸、酢酸フェニルなどの物質が単独あるいは組み合わせて用いられる。微生物の資化能によっては炭化水素、アルコール類、有機酸なども用いることができる。

窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、トリプトン、酵素エキスなどが単独あるいは組み合わせて用いられる。

無機物としては、例えば、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、塩化ナトリウムなどが単独あるいは組み合わせて用いられる。
その他、ビタミン類など菌体の増殖を促進する物質を加えることができる。
培地のｐＨは、４．５〜８．０でよい。培養温度は、２０〜４０℃、好ましくは３０℃付近に保つのがよい。培養時間は液体培養の場合、数時間〜１４日間程度とされる。

上述した各種の培養条件は、使用微生物の種類や特性、外部条件などに応じて適宜変更でき、またそれぞれに応じて上記範囲から最適条件を選択することにより調節することが可能である。

本発明に用いられるカテキン類としては、カテキン（Ｃ）、ガロカテキン（ＧＣ）、カテキンガレート（Ｃｇ）、ガロカテキンガレート（ＧＣｇ）、エピカテキン（ＥＣ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、エピカテキンガレート（ＥＣｇ）及びエピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）が挙げられ、これらカテキン類は（＋）−体又は（−）−体のいずれであってもよい。

このようなカテキン類は、主にツバキ科に属する茶樹（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）から得られる葉、茎、木部、樹皮、根、実、種子のいずれか、あるいはこれらの２種類以上の混合物もしくはそれらの粉砕物から、水、熱水、有機溶媒、含水有機溶媒あるいはこれらの混合物などを用いて抽出して得られる抽出物に含まれており、本発明においては、該抽出物自体を茶カテキン類としてそのまま利用することができる。特に、生の茶葉あるいはその乾燥物から、水、熱水、有機溶媒、含水有機溶媒、これらの混合物などを用いて抽出して得られる抽出物を好ましく用いることができる。

また、本発明においては、上記したような茶樹から得られる抽出物の他に、該抽出物をさらに精製して得られる精製物を、カテキン類として利用することもできる。
精製物に関しては、特公平１−４４２３４号公報、同２−１２４７４号公報、同２−２２７５５号公報、特開平４−２０５８９号公報、同５−２６０９０７号公報、同８−１０９１７８号公報などに記載された方法により製造することができ、例えば、茶葉を上記の溶媒で抽出して得られた抽出物を、有機溶媒分画や吸着樹脂などを用いて所望の程度に精製して得ることができる。
そして、本発明で原料に用いるカテキン類は、特に限定されず、上記抽出物、精製物等の液体、固体（粉末を含む）の別を問わず利用することができる。

本発明の物質ＴＭＲは、実施例に示すとおり優れた抗酸化活性を有することから、抗酸化剤として使用することができる。

本発明の抗酸化剤は、飲食品、医薬品、医薬部外品及び化粧品等へ配合した形態で摂取してもよいが、そのまま単独で摂取することもできる。その場合の摂取量は摂取形態、年齢、体重などにより異なり、特に制限されるものではないが、経口的に摂取する場合、体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ〜５０００ｍｇ／回の摂取が好ましく、１ｍｇ〜２５００ｍｇ／回の摂取がより好ましく、５ｍｇ〜５００ｍｇ／回の摂取がさらに好ましく、１０〜１００ｍｇ／回の摂取が最も好ましい。抗酸化剤の使用量が０．１ｍｇより少ないと有効成分である物質ＴＭＲによる抗酸化効果が発現しにくくなるため好ましくなく、５０００ｍｇを越えると量的効果が期待できず経済的に好ましくない。このとき、１日当たりの摂取回数は１回若しくは数回とするのがよい。

本発明の抗酸化剤の摂取方法は特に限定されるものではなく種々の方法で摂取することができる。
本発明の抗酸化剤の利用形態は、特に限定されず、例えば粉末状、顆粒状、錠剤などの固形状であってもよいし、液状や半固形状などであってもよい。
本発明の抗酸化剤は、例えばビタミンＥ等、他の抗酸化剤と併用して用いても何ら問題は生じない。他の抗酸化剤と併用した場合には、より優れた抗酸化効果を期待することができる。

本発明の抗酸化剤を、飲食品、医薬品、医薬部外品及び化粧品等に配合して使用する場合、対象となる物品に対する本発明の抗酸化剤の配合量は、有効量、すなわち、抗酸化効果を発揮する配合量となるように、対象となる物品の形態や種類に応じて適宜設定することが好ましい。一般的には、飲料の場合、最終製品中で０．０００１〜５０重量％であることが好ましく、０．００１〜３０重量％であることがより好ましく、さらに０．０１〜１０重量％が好ましい。

本発明の抗酸化剤を飲料等へ配合させる方法は、特に制限されるものではなく、その配合対象となる物品の調製段階において、この分野で通常知られた慣用的な方法を用いて配合することができる。

本発明の抗酸化剤が配合されうる物品は、抗酸化剤の有効成分となる物質ＴＭＲを配合することができるものであればどのような形態であってもよく、例えば、水溶液や混濁物や乳化物などの液状形態であっても、ゲル状やペースト状の半固形状形態であっても、粉末や顆粒やカプセルやタブレットなどの固形状形態（例えば飲料の場合、販売時には粉末の形態で飲用時に適宜の濃度に水などで溶解して提供されるようなもの）であってもよい。

本発明の抗酸化剤を製剤化する際、或いは飲料等に配合する際は、必要に応じて、増量剤、酸化防止剤、着色剤、香料、矯味剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、糖類、甘味料、酸味料、ビタミン類などの公知の各種添加剤と適宜組み合わせて用いてもよい。

以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。

実施例１：カテキン代謝微生物の採取
関東近縁より採取した土壌約０．１ｍｇをＣＡ液体培地〔硫酸アンモニウム１０ｇ、リン酸一水素カリウム０．５ｇ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ、硫酸マンガン七水和物０．５ｇ、硫酸鉄七水和物０．００５ｇ、（＋）−カテキン０．２５ｇ、塩酸チアミン０．４ｍｇ、リボフラビン０．２ｍｇ、ピリドキシン塩酸塩０．４ｍｇ、ニコチン酸０．４ｍｇ、葉酸０．０１ｍｇ、パントテン酸カルシウム０．４ｍｇ、ビオチン０．００２ｍｇ、イノシトール２ｍｇ、アミノベンゾイック酸０．２ｍｇ／１Ｌ：ｐＨ７．０〕に添加し、２８℃で集積培養した。この培養液をＣＡ寒天培地（ＣＡ液体培地に寒天１５ｇを加えたもの）に塗布し、２８℃で培養してコロニーを形成させた。形成されたコロニーをＣＡ寒天培地を用いて純化し、カテキン代謝株を分離した。

分離したカテキン代謝株をＬＢ液体培地（トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ／１Ｌ：ｐＨ７．０）に接種し、２８℃で培養した。この培養液を０．０２５％（＋）−カテキン含有ＬＢ液体培地に接種し、２８℃で培養した。１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて洗浄した後、ＯＤ６００＝５となるように調整し、（＋）−カテキンを終濃度０．５ｍｇ／ｍＬとなるように加え、２８℃で数時間反応させた。反応液２００μＬを分取し、遠心（１５，０００ｒｐｍ、１分間、４℃）上清中の（＋）−カテキン残存量を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した。

カラムはナカライテスクＣＯＳＭＯＳＩＬ
抽出溶媒はメタノール：０．０２Ｍリン酸（２０：８０）、検出はＵＶ２５４ｎｍ、流速は１ｍＬ／分で行なった。数時間の反応で（＋）−カテキンの減少が約８０％にも及ぶ強い活性を有するＭＴ−０７株を高カテキン代謝株として以降の研究に用いた。

実施例２：カテキン代謝産物蓄積変異株の作製
ＭＴ−０７株をＬＢ 液体培地に接種して２８℃で培養し、前培養液とした。この前培養液が数千分の一量になるようにＬＢ 液体培地に添加し、２８℃でＯＤ６５０＝０．７になるまで培養し、遠心分離（５，０００ｒｐｍ、１０分間）により集菌した。この菌体を１５％グリセロール含有１ｍＭ ＭＯＰＳ溶液１００ｍＬに懸濁させ、遠心分離（５，０００ｒｐｍ、１０分間）により集菌した。この操作を２回繰り返した後、１５％グリセロール含有１ｍＭ ＭＯＰＳ溶液１ｍＬに懸濁させ、変異株作成用の細胞（コンピテントセル）とした。

コンピテントセル４０μＬにＥＺ−Ｔｎ５^ＴＭ ＜ＫＡＮ−２＞Ｔｎｐ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｍｅ^ＴＭ Ｋｉｔｓ (ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ) １μＬを添加し、２．５ｋＶ、２５μＦ、８００Ω、２ｍｍ Ｇａｐでエレクトロポレーションし、２８℃で２時間振盪した。溶液を１０μg／ｍｌとなるようにカナマイシンを添加したＬＢ寒天培地に塗布し、２８℃で数日間培養し、カナマイシン耐性遺伝子が挿入された変異株を得た。

０．０５％グルコース＋０．０２５％（＋）−カテキン含有ＭＭ寒天培地（硫酸アンモニウム１０ｇ、リン酸水素二カリウム０．５ｇ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．５ｇ、硫酸鉄七水和物０．００５ｇ、塩酸チアミン０．４ｍｇ、リボフラビン０．２ｍｇ、ピリドキシン塩酸塩０．４ｍｇ、ニコチン酸０．４ｍｇ、葉酸０．０１ｍｇ、パントテン酸カルシウム０．４ｍｇ、ビオチン０．００２ｍｇ、イノシトール２ｍｇ、アミノベンゾイック酸０．２ｍｇ、寒天１５ｇ／１Ｌ：ｐＨ７．０）に変異株を植菌したものを２枚用意した。

１枚は２８℃で数日間培養し、１％ＦｅＣｌ_３−Ｋ_３［Ｆｅ（ＣＮ_６）］を加え、２分間遮光した後に液を捨て、ハロー形成を確認した。もう１枚は０．１５％グルコース＋０．０１２５％（＋）−カテキン含有ＭＭ液体培地（ＭＭ寒天培地から寒天を抜いたもの）を分注した２４穴マイクロプレートに植菌し、２８℃で２４時間培養した後、色の変化を確認した。これにより、カテキンの代謝活性に変化があった株をカテキン代謝変異株として選択し、高速液体クロマトグラフィー分析を用いた検討で物質ＴＭＲ−１に由来する未知ピークが検出された変異株ＨＥ−４６を分離した。

実施例３：物質ＴＭＲ−１の製造
ＨＥ−４６株をＬＢ液体培地に接種し、２８℃で２４時間培養した。この培養液を０．０２５％（＋）−カテキン含有ＬＢ液体培地に植え継ぎし、２８℃で培養した。１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて洗浄した後、ＯＤ６００＝５となるように調整し、（＋）−カテキンを終濃度３ｍｇ／ｍＬとなるように加え、２８℃で数時間反応させた。遠心分離（７，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）して得られた上清をＯＤＳカラムを用いて分取し、ＴＭＲ−１を得た。物質ＴＭＲ−１の物理化学的性状を下記に示す。
（１）分子式：Ｃ_１０Ｈ_１２Ｏ_５
（２）ＥＳＩマススペクトル（ｍ／ｚ）：２１１［Ｍ−Ｈ］⁻
（３）^１Ｈ ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）図１に示す
（４）^１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）図２に示す

実施例４：物質ＴＭＲ−１の抗酸化活性
０．２ｍＭ ＴＭＲ−１溶液及び比較として０．２ｍＭ（＋）−カテキン溶液を調製し、分析試料とした。４００μＭ １,１−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ、２００ｍＭ ２−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）、１００％ＥｔＯＨを等量混合した溶液０．９ｍＬを試験管に分注した。イオン交換水（３００−ａ）μＬを加え、その後分析試料ａμＬ（ａ＝０、３、６、１５、３０、６０、１２０、１８０μＬ）を加え、ボルテックスで混合した。添加２０分後に５２０ｎｍの吸光度を測定し、ラジカル消去能をみた。
その結果、ＴＭＲ−１は（＋）−カテキンよりも強い抗酸化能を有することが分かった（図３）。なお、（＋）−カテキン以外のカテキン類においても、上記と同様の効果を確認した。

実施例５：緑茶飲料
水９００ｍＬを６０℃まで加熱し、これに緑茶葉３０ｇを加え６分間抽出した。これを３０メッシュのストレーナーで茶殻を除去し、３０℃以下まで冷却した後、濾紙濾過（工業用濾紙Ｎｏ．２６：ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製、捕集粒子径＝３μｍ）により清澄化を行い、抽出液７６０ｍＬを得た。この緑茶抽出液を飲用濃度（カテキン濃度６０ｍｇ％）となるようにイオン交換水で稀釈し、Ｌ−アスコルビン酸を０．０３重量％となるように添加した後、重曹でｐＨ６．１〜６．３の範囲に調整し、調合液とした。この調合液に物質ＴＭＲ−１を０．１重量％添加してよく攪拌した。これらを８０℃以上の温度条件下でホットパック充填を行い、その後、レトルト殺菌にて、１２１℃、１０分間（Ｆ_０＝１０以上）の殺菌を行った。これらを室温に冷却後、緑茶飲料を得た。本品は、抗酸化作用を有する飲用しやすい緑茶飲料であった。

実施例６：錠剤
乳糖７７ｇ、物質ＴＭＲ−１ ２５ｇ、アスパルテーム０．５ｇ、シュガーエステル０．７ｇ、１／５濃縮レモン果汁２ｇ、ビタミンＣ５ｇ、ビタミンＥ粉末０．２ｇ、β―カロテン粉末０．２ｇ及び粉末レモンフレーバー１ｇを均一に混合後、１錠５００ｍｇ、直径１０ｍｍ、錠剤の厚さ３．２ｍｍに打錠した。本品は、抗酸化作用を有する飲み易い錠剤であった。

実施例７：化粧用クリーム
スクワラン２３ｇ、ステアリン酸５ｇ、ベヘニルアルコール０．８ｇ、モノステアリン酸ポリエチレングリコール２ｇ、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン２．５ｇ、酸化チタン２．５ｇ及びパラオキシ安息香酸メチル０．０５ｇを加熱溶解後８０℃とし、これにアラントイン０．１ｇ、１，３−ブチレングリコール２ｇ、パラオキシ安息香酸メチル０．１５ｇ、物質ＴＭＲ−１ １ｇ及び精製水を加熱溶解して８０℃としたものを加え、混合乳化した。よく攪拌しながら３０℃まで冷却後、容器に充填し製品とした。本品は、抗酸化作用を有する化粧用クリームであった。

本発明のＴＭＲは、上記のとおり、抗酸化剤に利用することができる。また、バークホルデリア属に属するＭＴ−０７株及び／またはその変異株は、カテキン類以外のポリフェノール類であっても反応させることによって従来よりも優れた抗酸化能などの機能性を有する物質を得られる可能性がある。

ＴＭＲ−１の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示すグラフである。 ＴＭＲ−１の^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを示すグラフである。 実施例における、ＴＭＲ−１の抗酸化活性を示すグラフである。

Claims (4)

1. 下記の一般式（１）で表される新規物質ＴＭＲ。
   （式中のＲは水素原子又は水酸基を表す。）
   
2. 請求項１記載の式（１）で表される物質ＴＭＲを有効成分とする抗酸化剤。
   
3. 請求項１記載の式（１）で表される物質ＴＭＲの製造方法であって、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属に属するＭＴ−０７株及び／またはその変異株であるＨＥ−４６株をカテキン類と反応させて物質ＴＭＲを生成させ、これを採取する、物質ＴＭＲの製造方法。
   
4. 請求項１記載の式（１）で表される物質ＴＭＲを生産することができる、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属に属するＭＴ−０７株及び／またはその変異株であるＨＥ−４６株。