JPWO2011149040A1

JPWO2011149040A1 - リパーゼによる高度不飽和脂肪酸含有油脂の製造方法

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Publication number: JPWO2011149040A1
Application number: JP2012517322A
Authority: JP
Inventors: 英生池本; 信滋土居崎; 泰男梅原
Original assignee: Nippon Suisan Kaisha Ltd
Current assignee: Nissui Corp
Priority date: 2010-05-28
Filing date: 2011-05-27
Publication date: 2013-07-25
Anticipated expiration: 2031-05-27
Also published as: KR101943661B1; KR20130111233A; CN102959083B; US10138502B2; EP2578691A4; CN102959083A; WO2011149040A1; EP2578691A1; CA2800674A1; US20160230199A1; US20130123525A1; JP5905821B2

Abstract

【課題】より飽和脂肪酸の含有率の低い高度不飽和脂肪酸含有油脂を提供すること。【解決手段】高度不飽和脂肪酸含有グリセリドに高度不飽和脂肪酸に対して反応性の低いリパーゼを作用させて高度不飽和脂肪酸を濃縮する方法において、リパーゼ反応を２５℃以下の温度で行うことを特徴とする飽和脂肪酸含有率を低減させる方法である。リパーゼは、カンジダ属、アルカリゲネス属、バークホリデリア属、シュードモナス属、サーモマイセス属、リゾムコール属に属する微生物由来のリパーゼが好ましい。また、この方法によって得ることができるグリセリドであって、グリセリド中のドコサヘキサエン酸の含有量が４０面積％以上であり、かつ、飽和脂肪酸の含有量が１２面積％以下であるグリセリドである【選択図】図１

Description

本発明はリパーゼ反応を利用した高度不飽和脂肪酸含有油脂の製造方法に関する。

高度不飽和脂肪酸はヒトを含む脊椎動物の成長に必須の栄養素であるばかりでなく、近年、心血管系疾患、炎症性疾患への関与について多く報告されている。特にドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸のようなn-3系の高度不飽和脂肪酸の摂取はヒトの健康に有用であるとの知見が多く報告されている。n-3系の高度不飽和脂肪酸の摂取量とn-6系高度不飽和脂肪酸の摂取量と比率が重要であるという報告もある。工業化社会では、エネルギー摂取量、飽和脂肪酸摂取量及びn-6系高度不飽和脂肪酸摂取量の増加傾向とn-3系高度不飽和脂肪酸摂取量の減少傾向という特徴があり、それが各種成人病などと関係していると考えられてきた。
魚油はn-3系高度不飽和脂肪酸を豊富に含む油脂であり、それらの摂取が広く推奨されるとともに、より効率よくn-3系高度不飽和脂肪酸を摂取するために、魚油中のn-3系高度不飽和脂肪酸を濃縮する工夫がされている。リパーゼ反応を用いる高度不飽和脂肪酸の濃縮はそのひとつである。

リパーゼは油脂を遊離脂肪酸とグリセリンに加水分解する反応を触媒する酵素で、種々の動植物や微生物がリパーゼを有していることが知られている。ある種のリパーゼは全ての脂肪酸に同じように作用するわけではなく、グリセリド中の結合位置や脂肪酸の炭素鎖長、二重結合数などによって反応性が異なる。したがって、このようなリパーゼを用いて脂肪酸を選択的に加水分解することが可能で、その結果、グリセリド画分中に特定の脂肪酸を濃縮することが可能である。例えばある種のカンディダ（Candida）属が産生するリパーゼを用いると、魚油の加水分解反応によってドコサヘキサエン酸などの高度不飽和脂肪酸が未分解のグリセリド画分中に濃縮されることが知られている（特許文献１）。

このようにリパーゼによる加水分解反応は高度不飽和脂肪酸の濃縮に有効な方法である。目的の高度不飽和脂肪酸以外の脂肪酸に対する加水分解が進行するほどグリセリド画分中の高度不飽和脂肪酸の濃縮も進行する。しかし、実際には高度不飽和脂肪酸のグリセリド画分中への濃縮が進むにつれ加水分解反応は鈍くなり、さらに高度に加水分解反応を進めるためには過剰の酵素を付加する必要がある。過剰の酵素を付加した場合、加水分解反応はさらに進行するが、今度は目的の高度不飽和脂肪酸にまで加水分解反応がおよび、加水分解の増加に伴う濃縮の効果が減少してしまうとともに収率も低下することになる。また、リパーゼは加水分解反応の時間の経過とともに徐々に失活するため活性の減少した酵素を除き、新しい酵素を用いて再反応することでさらに加水分解を進めることができる。しかし、この場合にも加水分解の程度が進みすぎると収率の低下が著しく、目的とする高度不飽和脂肪酸の濃縮効果も現れなくなる。

魚油をカンディダシリンドラセ (Candida cylindracea)由来のリパーゼで加水分解する場合にはリパーゼの使用量を増加させたり、反応時間を長くしたり、あるいは、リパーゼによる加水分解を繰り返し行なうことによって、分解油の酸価を上げることが可能で、目的高度不飽和脂肪酸の濃縮が進められるが、酸価が１６０を越える付近から逆に高度不飽和脂肪酸の濃縮度が減少することが報告されている（特許文献１）。すなわち過剰な加水分解反応によって目的高度不飽和脂肪酸の濃縮を進めたときには、目的とする高度不飽和脂肪酸の加水分解の頻度が高くなることを意味しており、濃縮率の向上とともに目的とする高度不飽和脂肪酸の損失の割合も上昇し、ある点を境に濃縮率は向上しなくなり損失ばかりになってしまうということである。もちろん加水分解を進めるということはグリセリドの収量を減少させることでもあり、従って、このリパーゼの加水分解を利用した高度不飽和脂肪酸の濃縮には限界点が生じ、得られる油脂製品の歩留りと目的脂肪酸の濃縮効率の両者のバランスで酵素の添加量、反応時間等を設定せざるを得ない。

酵素反応の温度については、それぞれの酵素によって至適温度が知られており、その範囲内で反応が行われるが、リパーゼの場合、リパーゼ反応の対象となる油脂が低温では粘度が高くなってしまい、酵素を含む水との撹拌効率が悪くなることから、通常30-40℃で行われている。例えば、高度不飽和脂肪酸を濃縮する際にカンディダシリンドラセ (Candida cylindracea)由来のリパーゼを用いる場合の反応温度は、特許文献１（1982年出願）の実施例では室温、それ以降の特許文献２−７（それぞれ1988、1993、1994、1995、1996、1999年出願）の実施例ではそれぞれ37、37、37、30、35、35℃とされている。

特公平４‐１６５１９号特開平１‐２６９４９６号特開平７‐５１０７５号特開平７‐２６８３８２号特開平８‐２１４８９２号ＷＯ９８／１８９５２特開２００１−５４３９６号

上述のとおり、リパーゼ反応を用いて高度不飽和脂肪酸を含有する油脂を製造する方法は種々に検討されているが、本発明は高度不飽和脂肪酸含有油脂に含まれる飽和脂肪酸に着目した発明である。高度不飽和脂肪酸が濃縮された油脂は、ドコサヘキサエン酸（以下、「ＤＨＡ」とも略す。）やエイコサペンタエン酸（以下、「ＥＰＡ」とも略す。）などの有用成分を摂取する目的で使用される。その際、その目的に無関係、あるいはむしろ好ましくない飽和脂肪酸の含有量は少ないほど好ましいと考えられる。本発明は、より飽和脂肪酸の含有率の低い高度不飽和脂肪酸含有油脂を提供することを課題とする。

本発明者らは、リパーゼ反応の収率、組成などについてさらに改良を図る余地がないか検討するなかで、製造条件のうち、３０〜４０℃が至適温度であるとの認識が固定しており、誰も注目しなかった反応温度を調節することにより、予想外の効果が得られることを見出し、本発明を完成させた。
本発明は、下記（１）、（２）の飽和脂肪酸含有率を低減させる方法、（３）〜（１４）の飽和脂肪酸含有率の低いグリセリドを要旨とする。
（１）高度不飽和脂肪酸含有グリセリドに高度不飽和脂肪酸に対して反応性の低いリパーゼを作用させて高度不飽和脂肪酸を濃縮する方法において、リパーゼ反応を２５℃以下の温度で行うことを特徴とする飽和脂肪酸含有率を低減させる方法。
（２）リパーゼが、カンジダ属、アルカリゲネス属、バークホリデリア属、シュードモナス属、サーモマイセス属、リゾムコール属のいずれかに属する微生物由来のリパーゼである（１）の方法。

（３）高度不飽和脂肪酸含有グリセリドに高度不飽和脂肪酸に対して反応性の低いリパーゼを作用させて高度不飽和脂肪酸を濃縮する方法において、リパーゼ反応を２５℃以下の温度で行うことにより製造したグリセリド中の飽和脂肪酸の割合が１２面積％以下の高度不飽和脂肪酸含有グリセリド。
（４）リパーゼが、カンジダ属、アルカリゲネス属、バークホリデリア属、シュードモナス属、サーモマイセス属、リゾムコール属のいずれかに属する微生物由来のリパーゼである（３）の高度不飽和脂肪酸含有グリセリド。
（５）リパーゼ反応によって高度不飽和脂肪酸を濃縮したグリセリドであって、グリセリド中のドコサヘキサエン酸の含有量が４６面積％以上であり、かつ、飽和脂肪酸の含有量が１２面積％以下であるグリセリド。
（６）グリセリド中のドコサヘキサエン酸の含有量が４６面積％以上である（５）のグリセリド。
（７）飽和脂肪酸の含有量が１０面積％以下である（５）又は（６）のグリセリド。
（８）パルミチン酸の含有量が８面積％以下である（５）ないし（７）いずれかのグリセリド。
（９）パルミチン酸の含有量が６面積％以下である（８）のグリセリド。
（１０）グリセリド中のトリグリセリドの割合が８０面積％以上である（５）ないし（９）いずれかのグリセリド。
（１１）グリセリド中のトリグリセリドの割合が８５面積％以上である（１０）のグリセリド。

（１２）リパーゼ反応によって高度不飽和脂肪酸を濃縮したグリセリドであって、グリセリド中のエイコサペンタエン酸の含有量が２５面積％以上であり、かつ、飽和脂肪酸の含有量が２０面積％以下であるグリセリド。
（１３）グリセリド中のエイコサペンタエン酸の含有量が２８面積％以上である（１２）のグリセリド。
（１４）飽和脂肪酸の含有量が１７面積％以下である（１２）又は（１３）のグリセリド。

本発明において、面積％とは、各種脂肪酸を構成成分とするグリセリドの混合物をガスクロマトグラフィーや薄層クロマトグラフィー／水素炎イオン化検出器（ＴＬＣ／ＦＩＤ）を用いて分析したチャートのそれぞれの成分のピーク面積の全ピーク面積に対する割合で、そのピークの成分の含有比率を示すものである。脂肪酸組成については実施例に示す方法によるガスクロマトグラフィーにより、脂質組成については、ＴＬＣ／ＦＩＤを用いた。

本発明の方法によれば、EPAやDHAなどの高度不飽和脂肪酸が濃縮され、かつ、飽和脂肪酸含有率が少ないグリセリドを製造することができる。健康に好ましいとされる高度不飽和脂肪酸を摂取する際に、余分な飽和脂肪酸の摂取量を低減することができる。

図１は実施例１において各反応温度でリパーゼ処理した際のグリセリド画分に含まれる飽和脂肪酸とＥＰＡ+ＤＨＡの比率を４０℃での反応の結果を１００として表した図である。図２は実施例２において各反応温度でリパーゼ処理した際のグリセリド画分に含まれる飽和脂肪酸とＥＰＡ+ＤＨＡの比率を４０℃での反応の結果を１００として表した図である。図３は実施例３のリパーゼ反応における飽和脂肪酸、ＥＰＡ、ＤＨＡ量の経時変化を示す図である（２０℃、６００ｕｎｉｔ／ｍＬ油）。図４は実施例３のリパーゼ反応における飽和脂肪酸、ＥＰＡ、ＤＨＡ量の経時変化を示す図である（２０℃、３００ｕｎｉｔ／ｍＬ油）。図５は比較例１のリパーゼ反応における飽和脂肪酸、ＥＰＡ、ＤＨＡ量の経時変化を示す図である（４０℃、６００ｕｎｉｔ／ｍＬ油）。図６は実施例４（２０℃）、比較例２（４０℃）のリパーゼ反応における飽和脂肪酸、ＥＰＡ、ＤＨＡ量の比較を示す図である。大きいスケールで反応した実施例５の結果を示す図である。図８は実施例７のリパーゼ反応における飽和脂肪酸、ＥＰＡ、ＤＨＡ量の経時変化を示す図である。

以下、本発明を詳細に説明する。本発明において、高度不飽和脂肪酸とは、炭素数１８以上、二重結合数３以上の脂肪酸であり、より好ましくは炭素数２０以上、二重結合数３以上の脂肪酸である。具体的にはα‐リノレン酸（１８：３，ｎ‐３）、γ‐リノレン酸（１８：３，ｎ‐６）、アラキドン酸（２０：４，ｎ‐６）、ジホモ-γ-リノレン酸（２０：３，ｎ‐６）、エイコサペンタエン酸（２０：５，ｎ‐３）、ドコサペンタエン酸（２２：５，ｎ‐６）、ドコサヘキサエン酸（２２：６，ｎ‐３）などが例示される。これらはある種の微生物油、植物油や海産動物油などに多く含まれることが知られている。具体的には、イワシ、マグロ、カツオなどの魚類やオキアミなどの甲殻類の海産動物油、エゴマ、アマ、大豆、菜種などの植物油、モルティエレラ（Mortierella）属、ペニシリューム（Penicillium）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、ロードトルラ（Rhodotorula）属、フザリューム（Fusarium）属に属するの微生物が産生する油脂などが例示される。
本発明において、飽和脂肪酸とは、炭素数１４，１６，１８の飽和脂肪酸である。これらは、エネルギー源としては重要な栄養素であるが、現代の食生活では通常の食事で必要以上に摂取されることが多く、過剰に摂取すべきではない脂肪酸と考えられている。

本発明において、高度不飽和脂肪酸含有グリセリドとは、上記の高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として含有するトリグリセリド、ジグリセリド、およびモノグリセリドである。上記の微生物油、植物油、海産動物油は高度不飽和脂肪酸を含有するトリグリセリドである。
本発明において用いるリパーゼは、高度不飽和脂肪酸に対して作用しにくく、加水分解反応で未分解のグリセリド画分中に高度不飽和脂肪酸を濃縮する性質を持てば、どのようなリパーゼでも良い。例えばカンディダシリンドラセ（Candida cylindracea）、カンジダルゴサ（Candida rugosa）由来のリパーゼはＤＨＡ、アラキドン酸、γリノレン酸を濃縮する。リゾムコールミエヘイ（Rhizomucor miehei）由来のリパーゼもＤＨＡ濃縮能を有する。アルカリゲネスエスピー（Alcaligenes sp.）、シュードモナスエスピー（Pseudomonas sp.）由来のリパーゼはＥＰＡ濃縮能を有する。これらはいずれも市販されており容易に入手できる。これらは必要に応じて固定化して使用することもできる。例示すれば、カンディダ属由来のリパーゼである、カンディダシリンドラセ（Candida cylindracea）由来のリパーゼを用いることができる。カンディダシリンドラセ（Candida cylindracea）由来のリパーゼとしては、名糖産業株式会社製リパーゼOFが例示される。あるいは、アルカリゲネスエスピー（Alcaligenes sp.）に属する微生物から得られるリパーゼ（リパーゼQLM、リパーゼQLC、リパーゼPL、いずれも名糖産業(株)製）、バークホリデリアセパシア（Burkholderia cepacia）に属する微生物から得られるリパーゼ（リパーゼPS、天野エンザイム(株)製）、シュードモナスフルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）に属する微生物から得られるリパーゼ（リパーゼAK、天野エンザイム(株)製）、サーモマイセスラヌギノサス（Thermomyces lanuginosa）に属する微生物から得られるリパーゼ（リポザイムTLIM、ノボザイム社製）などが挙げられる。
リパーゼの使用量は、通常トリグリセリド１ｇに対して１０〜２０００ユニット、好ましくは２００〜７００ユニットとするのが望ましい。なお１ユニットは１分間に１マイクロモルの脂肪酸を遊離する酵素量である。リパーゼによる加水分解反応は、リパーゼの加水分解活性が発現するのに十分な量の水の存在下に行う必要がある。水の存在量としては、トリグリセリドに対して１０〜２００重量％、好ましくは５０〜１５０重量％とするのが望ましい。

また加水分解は、脂肪酸の劣化、酵素の失活などを抑制するため、乾燥窒素等の不活性ガス雰囲気下で行うことが好ましい。またトコフェロール、アスコルビン酸、ｔ−ブチルハイドロキノンなどの抗酸化剤を併用しても良い。
加水分解反応は２５℃以下、好ましくは１０〜２５℃、さらに好ましくは１５〜２０℃で行う。低温であるほど、飽和脂肪酸の含有率を低下させるのには好ましいが、１０℃以下では酵素反応の速度自体が遅くなりすぎる点や油脂の粘度が高くなる点に配慮すると、１５〜２０℃前後が最も好ましい。大量反応の場合、反応相を平均１５〜２０℃になるよう設定し、±５℃程度の範囲に保持しながら反応を行えばよい。加水分解反応は撹拌や不活性ガス等の吹込による流動などによって行う。
加水分解は、構成脂肪酸中に占めるドコサヘキサエン酸の割合が目的濃度になるまで反応を行う。条件は原料油脂により異なるが、例えばマグロ油（DHA２３％程度含有）などを原料とする場合、反応時間は7時間以上が好ましく、通常５〜２４時間加水分解することにより、1回のリパーゼ反応で、ドコサヘキサエン酸の割合は４６面積％以上になる。さらに長い時間反応させてもかまわない。実施例に示すように６５時間反応しても悪影響はなかった。また酸価を加水分解の程度を示す指標とすることもでき、通常酸価が１４０以上になればドコサヘキサエン酸の割合は４６面積％以上になる。

このようにして加水分解を行うことにより、未反応のトリグリセリドおよび加水分解物の混合物が反応液として得られる。高度布飽和脂肪酸に対して反応性が低いリパーゼはによる加水分解が進行するに従って、反応液中の未反応のトリグリセリドおよび部分グリセリドにおける構成脂肪酸中に占めるドコサヘキサエン酸やエイコサペンタエン酸などの高度布飽和脂肪酸の割合は高くなり、加水分解終了時にはドコサヘキサエン酸の濃度が４０面積％以上になるまで濃縮される。一方、遊離脂肪酸は大部分が高度不飽和脂肪酸以外の脂肪酸で占められる。

加水分終了後は、遠心分離などによりリパーゼおよびグリセリンなどを含む水層を除去して油層の反応液を得た後、遊離脂肪酸を除去する。遊離脂肪酸の分離除去方法としては、アルカリ塩として除去する方法、液体クロマトグラフィー装置を用いる方法、分別留分法、結晶分別法など、公知の方法が採用できるが、分子蒸留、水蒸気蒸留が好ましい。
遊離脂肪酸を除去することにより、高濃度でドコサヘキサエン酸を含有するトリグリセリドおよび部分グリセリドのグリセリド混合物が得られる。

本発明の低温反応でドコサヘキサエン酸が４０面積％以上、さらには４６面積％以上に濃縮され、かつ、炭素数１４，１６，１８の飽和脂肪酸量の合計が１２面積％以下、好ましくは、１０面積％以下のグリセリドを得ることができる。特に飽和脂肪酸の中でも含有量が多いパルミチン酸（炭素数１６）の含有量が８面積％以下、好ましくは６面積％以下であるものが好ましい。また、低温でリパーゼ反応すると、得られる反応油中のグリセリドの脂質組成がトリグリセリドの比率の高いものとなった。実施例に示したマグロ精製魚油やカツオ精製魚油のようなドコサヘキサエン酸を多く含有する油脂を原料とした場合、４０℃ではトリグリセリドの比率が７０面積％代程度であるが、低温反応では８０面積％以上のものが得られた。
本発明のリパーゼ反応油脂について、脱酸、脱色、脱臭処理を行うことによって、高度不飽和脂肪酸が濃縮され、かつ、飽和脂肪酸含有量が低減されたグリセリドを得ることができる。脱酸、脱色、脱臭はどのような方法で行ってもよいが、脱酸処理は蒸留処理により、脱色処理は活性白土、活性炭などによる処理により、脱臭処理は水蒸気蒸留などにより行う。
脱酸処理を蒸留で行うと、同時にモノグリセリドも除去されるので、得られる油脂のトリグリセリド比率をさらに高めることができる。トリグリセリドが85面積％以上、好ましくは90面積％以上のものを得ることもできる。

以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。

各実施例において、脂肪酸組成、酸価の測定は以下の方法で行った。
脂肪酸組成の測定
原料に用いた魚油の脂肪酸組成は、魚油をエチルエステル化してガスクロマトグラフィーにて測定した。すなわち、魚油４０μＬに１Ｎナトリウムエチラート／エタノール溶液１ｍＬを加え、約３０秒間撹拌した。その後、１Ｎ塩酸を１ｍＬ加えて中和し、ヘキサン２ｍＬ、飽和硫酸アンモニア水溶液３ｍＬを加え、撹拌、静置後、上層をガスクロマトグラフィーにて測定した。

酵素反応を行った油のグリセリド画分脂肪酸組成はグリセリド画分をエチルエステル化してから、酵素反応の副生成物である遊離脂肪酸を除去し、ガスクロマトグラフィーにて測定した。すなわち、反応油７０μＬに１Ｎナトリウムエチラート/エタノール溶液１ｍＬを加え、約３０秒間撹拌した。その後、１Ｎ塩酸を１ｍＬ加えて中和後、ヘキサン７００μＬおよび飽和硫酸アンモニア水溶液３ｍＬを加え撹拌、静置後、エチルエステルと遊離脂肪酸を含有する上層を回収した。得られた上層から遊離脂肪酸を除去する操作を以下の通りに行った。回収した上層であるエチルエステルと遊離脂肪酸が溶解したヘキサン溶液７００μＬにトリエチルアミンを１０〜２０μL加えて振り混ぜてから、固相抽出カートリッジ（Ｖａｒｉａｎ社、ＢＯＮＤＥＬＵＴＳＩ、１００ｍｇ、１ｍＬ）に全量を負荷し、ヘキサンと酢酸エチルの混合溶液（ヘキサン：酢酸エチル＝５０：１容積比）１ｍＬにてエチルエステルを溶出させて遊離脂肪酸を除去した。これをガスクロマトグラフィーにて測定した。

ガスクロマトグラフィー分析条件
機種；Ａｇｉｌｅｎｔ６８５０ＧＣｓｙｓｔｅｍ (Ａｇｉｌｅｎｔ社)
カラム；ＤＢ−ＷＡＸＪ＆Ｗ１２２−７０３２
カラム温度；２００℃
注入温度；３００℃
注入方法；スプリット
スプリット比；５０：１
検出器温度：３００℃
検出器：ＦＩＤ
キャリアーガス：ヘリウム (２．９ｍＬ／ｍｉｎ、コンスタントフロー)

酸価（ＡＶ）の測定
本発明の実施例において、酸価（AV）の測定は基準油脂分析試験法（2003年度版）（社団法人日本油化学会編）に準じて行った。
油約０．５ｇをエタノールに溶解し、フェノールフタレイン１滴を加え、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で中和滴定を行い、下式により算出した。
ＡＶ＝滴定量（ｍＬ）×５６．１１／サンプル重量（ｇ）

脂質組成の測定
脂質組成は薄層クロマトグラフィー／水素炎イオン化検出器（ＴＬＣ／ＦＩＤ，イアトロスキャン、三菱化学ヤトロン株式会社）にて行った。油２０μＬをヘキサン１ｍＬに溶解し、クロマロッドに０．５μＬを負荷した。ヘキサン、ジエチルエーテル、酢酸の混合溶液（ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸＝７０：３０：０．１容積比）を展開溶媒として用い、３５分間展開した。これをイアトロスキャンにて分析した。

［実施例１］
精製魚油１（脱酸マグロ油、日本水産株式会社）３ｍＬに水１．５ｍＬとリパーゼＯＦ５ｍｇ（名糖産業株式会社、６００ｕｎｉｔ／ｍＬ油）を加えて、１０〜６０℃の恒温槽内でマグネチックスターラーにて１４時間撹拌した。１４時間撹拌後、反応油約２ｍＬをサンプリングし、８０℃で１０分間加熱してリパーゼを失活させ、その後遠心分離機（４０℃、１８００ｇ、１０分）にて油層と水層とを分離し反応油を得た。
得られた反応油のグリセリド画分の脂肪酸組成（面積％）及び酸価と精製魚油１の脂肪酸組成（面積％）を表１に示した。また、ガスクロマトグラフィーで得られたグリセリド画分中のミリスチン酸（Ｃ１４：０）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）含量（面積％）の合計を飽和脂肪酸含量として示した（以下、実施例中で「飽和脂肪酸含量」と記載するときは同じ意味で用いる）。

反応温度３０〜６０℃では飽和脂肪酸含量が１５％程度なのに対して、２５℃では１１．４０％、２０℃では９．３６％、１５℃では７．７４％、１０℃では８．４２％と低温で反応すると大幅に減少した。１０〜２５℃で飽和脂肪酸含量が大幅に減少した。また、１０℃では他の温度条件より反応速度が劣り、酸価（ＡＶ）が１１３．９と低い結果であったが、そのような条件においても飽和脂肪酸含量は８．４２％と低く、酸価（ＡＶ）が１２５．１と加水分解反応がより進行した４０℃条件よりも大幅に低減された。

リパーゼ加水分解反応で一般的に実施される温度帯（４０℃付近）と飽和脂肪酸低減効果を比較するために、４０℃でのＤＨＡとＥＰＡ含量の合計、及び飽和脂肪酸含量を１００としたときのそれぞれの温度での該当脂肪酸含量の割合をプロットし図１に示した。この図から、１０〜２５℃の条件でＥＰＡ、ＤＨＡ含量は高いままで飽和脂肪酸含量が大幅に低減していることが分かる。

［実施例２］
精製魚油２（脱酸マグロ油、日本水産株式会社）２００ｇに水１００ｇとリパーゼＯＦ３２０ｍｇ（名糖産業株式会社、６４０ｕｎｉｔ／ｍｌ油）を加えて、１０〜４０℃にて撹拌羽にて２０時間撹拌した。２０時間撹拌後、反応油を８０℃で１５分間加熱してリパーゼを失活させ、その後上層の反応油を得た。
得られた反応油のグリセリド画分の脂肪酸組成（面積％）及び酸価と精製魚油２の脂肪酸組成（面積％）を表２に示した（脂肪酸組成については代表的な脂肪酸のみ）。ここでグリセリド含量は酸価からオレイン酸相当として遊離脂肪酸含量を算出し、反応油全体から差し引いて算出した。また、ガスクロマトグラフィーで得られたグリセリド画分中のミリスチン酸（Ｃ１４：０）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）含量（面積％）の合計を飽和脂肪酸含量として示した。
３５、４０℃に比べ１０〜２５℃では飽和脂肪酸含量が大幅に低減された。

上記結果を図１同様に４０℃反応油の結果を１００としたときの各温度条件でのグリセリド画分中ＥＰＡとＤＨＡ含量、飽和脂肪酸含量を図２に示した。この図から、１０〜２５℃の条件でＥＰＡ、ＤＨＡは高いままで飽和脂肪酸が大幅に低減していることが分かる。

［実施例３］
８ｍＬの精製魚油１に水４ｍＬとリパーゼＯＦ１３．３ｍｇ（６００ｕｎｉｔ／ｍＬ油）または６．７ｍｇ（３００ｕｎｉｔ／ｍＬ油）を加えて、撹拌羽で撹拌した。反応温度は２０℃とした。２、５、８、１４、２０時間後に約１〜２ｇをサンプリングし、８０℃で１０分間加熱してリパーゼを失活させ、その後遠心分離機（４０℃、１８００ｇ、１０分）にて油層と水層とを分離し反応油を得た。
時間ごとの飽和脂肪酸含量（面積％）、ＥＰＡとＤＨＡ含量（面積％）を図３、４に示した。反応時間とともに飽和脂肪酸含量は大幅に低減し、ＥＰＡとＤＨＡ含量は増加した。

［比較例１］
反応温度を４０℃にする以外は、実施例３のリパーゼを６００ｕｎｉｔ／ｍＬ用いた場合と同じ条件、操作で反応を行った。
時間ごとの飽和脂肪酸含量（面積％）、ＥＰＡとＤＨＡ含量（面積％）を図５に示した。飽和脂肪酸含量は反応２時間で１５．０％まで減少したが、反応時間が長くなっても更なる減少は認められず、１５％程度の高い含量で推移した。

［実施例４、比較例２］
精製魚油３（脱酸マグロ油、日本水産株式会社）３ｍＬに水１．５ｍＬとリパーゼＯＦ５ｍｇ（６００ｕｎｉｔ／ｍＬ油）を加えて、２０℃の恒温槽内でマグネチックスターラーにて１４時間撹拌した。１４時間撹拌後、反応油約２ｍＬをサンプリングし、８０℃で１０分間加熱してリパーゼを失活させ、その後遠心分離機（４０℃、１８００ｇ、１０分）にて油層と水層とを分離し反応油を得た。
比較例として、上記実施例４の条件を温度だけ変化させて４０℃にて反応を行った。温度以外はすべて同じ条件、操作である。
実施例４と比較例２の飽和脂肪酸含量（面積％）、ＥＰＡとＤＨＡ含量（面積％）を図６に示した。この図から２０℃条件の場合、４０℃条件と比較して飽和脂肪酸含量が大幅に減少し、ＥＰＡ、ＤＨＡ含量は若干増加することが分かった。

［実施例５］
精製魚油４（脱酸マグロ油、日本水産株式会社）６，０００Ｌ、水３，０００Ｌ、リパーゼＯＦを５ｋｇ（３００ｕｎｉｔ／ｍＬ油）反応タンクに仕込み、２０〜２５℃に保ちながら２１時間撹拌して反応を行った。２１時間後に反応油約５０ｇをサンプリングし、８０℃で１０分間加熱してリパーゼを失活させ、上層の反応油を得た。
精製魚油の飽和脂肪酸含量（面積％）とＥＰＡとＤＨＡ含量（面積％）、反応油グリセリド画分中の飽和脂肪酸含量（面積％）、ＥＰＡ、ＤＨＡ含量（面積％）を図７に示した。大きいスケールで反応を行っても、ＥＰＡとＤＨＡが濃縮されるとともに飽和脂肪酸含量が１０％以下と大幅に低減されることが確認された。

［実施例６］
実施例１の１０、２０、４０、５０℃条件での反応油に関してグリセリド画分中の脂質組成（面積％）を測定した。表３に示すように、１０、２０℃で反応するとトリグリセリドの比率が８０面積％以上のものを得ることができた。一方、４０、５０℃で反応した場合は７２．８％、５９．９％程度であった。低温でリパーゼ反応を行うことにより、飽和脂肪酸含有量を低下させることができるだけでなく、トリグリセリドの比率を高めることができることが示された。

［実施例７、比較例３］
精製魚油５（精製イワシ油、日本水産株式会社）２ｇに、水２ｍＬ、リパーゼＱＬＭ（名糖産業株式会社）１００〜６００ｕｎｉｔ／ｇ油を加えて、２０℃または４０℃の温度条件下、マグネチックスターラーにて１７〜６５時間撹拌した。その後、反応液を９０℃で１５分間加熱してリパーゼを失活させ、遠心分離機（室温、３０００ｒｐｍ、５分）にて油層と水層とを分離し反応油を得た。
得られた反応油の酸価、グリセリド画分の脂肪酸組成（面積％）、加水分解率（％）と精製魚油５の脂肪酸組成（面積％）を表４に示した。加水分解率は酸価および精製魚油５のケン化価（２０６．０４）より下記式にて算出した。
加水分解率＝（酸価／ケン化価）×１００
また、加水分解率と脂肪酸組成（面積％）の関係を図８に示した。
表４および図８から、リパーゼＱＬＭを用いたＥＰＡ濃縮反応においても、２０℃で反応すると一般的に実施される温度帯である４０℃と比べ飽和脂肪酸含量が低減した。

ＥＰＡやＤＨＡなどの生理活性を有する脂肪酸を摂取する目的のひとつは、高コレステロール血症など、心、血管系の疾病予防である。飽和脂肪酸はエネルギー源として重要ではあるが、現代の食生活では、特に中高年においては摂取過多になりがちであり、積極的に摂取するのは好ましくない。特に心、血管系疾患の予防が必要な層においては、折角、高度不飽和脂肪酸を摂取するときに、一緒に摂取することになる飽和脂肪酸は少ないほうが好ましい。本発明の発明により製造された油脂は、高度不飽和脂肪酸が濃縮され、飽和脂肪酸はより低減されたものであるから、n-3系高度不飽和脂肪酸を供給するための健康食品やサプリメントとして用いるのに適している。

Claims

高度不飽和脂肪酸含有グリセリドに高度不飽和脂肪酸に対して反応性の低いリパーゼを作用させて高度不飽和脂肪酸を濃縮する方法において、リパーゼ反応を２５℃以下の温度で行うことを特徴とする飽和脂肪酸含有率を低減させる方法。
リパーゼが、カンジダ属、アルカリゲネス属、バークホリデリア属、シュードモナス属、サーモマイセス属、リゾムコール属のいずれかに属する微生物由来のリパーゼである請求項１の方法。
高度不飽和脂肪酸含有グリセリドに高度不飽和脂肪酸に対して反応性の低いリパーゼを作用させて高度不飽和脂肪酸を濃縮する方法において、リパーゼ反応を２５℃以下の温度で行うことにより製造したグリセリド中の飽和脂肪酸の割合が１２面積％以下の高度不飽和脂肪酸含有グリセリド。
リパーゼが、カンジダ属、アルカリゲネス属、バークホリデリア属、シュードモナス属、サーモマイセス属、リゾムコール属のいずれかに属する微生物由来のリパーゼである請求項３の高度不飽和脂肪酸含有グリセリド。
リパーゼ反応によって高度不飽和脂肪酸を濃縮したグリセリドであって、グリセリド中のドコサヘキサエン酸の含有量が４０面積％以上であり、かつ、飽和脂肪酸の含有量が１２面積％以下であるグリセリド。
グリセリド中のドコサヘキサエン酸の含有量が４６面積％以上である請求項５のグリセリド。
飽和脂肪酸の含有量が１０面積％以下である請求項５又は６のグリセリド。
パルミチン酸の含有量が８面積％以下である請求項５ないし７いずれかのグリセリド。
パルミチン酸の含有量が６面積％以下である請求項８のグリセリド。
グリセリド中のトリグリセリドの割合が８０面積％以上である請求項５ないし９いずれかのグリセリド。
グリセリド中のトリグリセリドの割合が８５面積％以上である請求項１０のグリセリド。
リパーゼ反応によって高度不飽和脂肪酸を濃縮したグリセリドであって、グリセリド中のエイコサペンタエン酸の含有量が２５面積％以上であり、かつ、飽和脂肪酸の含有量が２０面積％以下であるグリセリド。
グリセリド中のエイコサペンタエン酸の含有量が２８面積％以上である請求項１２のグリセリド。
飽和脂肪酸の含有量が１７面積％以下である請求項１２又は１３のグリセリド。