KR101943661B1 - 리파아제에 의한 고도 불포화 지방산 함유 유지의 제조 방법 - Google Patents
리파아제에 의한 고도 불포화 지방산 함유 유지의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
[과제] 보다 포화 지방산의 함유율이 낮은 고도 불포화 지방산 함유 유지를 제공하는 것.
[해결 수단] 고도 불포화 지방산 함유 글리세리드에 고도 불포화 지방산에 대해 반응성이 낮은 리파아제를 작용시켜 고도 불포화 지방산을 농축하는 방법에 있어서, 리파아제 반응을 25 ℃ 이하의 온도에서 실시하는 것을 특징으로 하는 포화 지방산 함유율을 저감시키는 방법이다. 리파아제는, 칸디다속, 알칼리게네스속, 버크홀데리아속, 슈도모나스속, 서모마이세스속, 리조무코르속에 속하는 미생물 유래의 리파아제가 바람직하다. 또, 이 방법에 의해 얻을 수 있는 글리세리드로서, 글리세리드 중의 도코사헥사엔산의 함유량이 40 면적% 이상이며, 또한, 포화 지방산의 함유량이 12 면적% 이하인 글리세리드이다.
[해결 수단] 고도 불포화 지방산 함유 글리세리드에 고도 불포화 지방산에 대해 반응성이 낮은 리파아제를 작용시켜 고도 불포화 지방산을 농축하는 방법에 있어서, 리파아제 반응을 25 ℃ 이하의 온도에서 실시하는 것을 특징으로 하는 포화 지방산 함유율을 저감시키는 방법이다. 리파아제는, 칸디다속, 알칼리게네스속, 버크홀데리아속, 슈도모나스속, 서모마이세스속, 리조무코르속에 속하는 미생물 유래의 리파아제가 바람직하다. 또, 이 방법에 의해 얻을 수 있는 글리세리드로서, 글리세리드 중의 도코사헥사엔산의 함유량이 40 면적% 이상이며, 또한, 포화 지방산의 함유량이 12 면적% 이하인 글리세리드이다.
Description
본 발명은 리파아제 반응을 이용한 고도 불포화 지방산 함유 유지의 제조 방법에 관한 것이다.
고도 불포화 지방산은 인간을 포함한 척추 동물의 성장에 필수의 영양소일 뿐만 아니라, 최근, 심혈관계 질환, 염증성 질환에 대한 관여에 대해 많이 보고되고 있다. 특히 도코사헥사엔산, 에이코사펜타엔산과 같은 n-3 계의 고도 불포화 지방산의 섭취는 인간의 건강에 유용하다는 지견이 많이 보고되어 있다. n-3 계의 고도 불포화 지방산의 섭취량과 n-6 계 고도 불포화 지방산의 섭취량과 비율이 중요하다는 보고도 있다. 공업화 사회에서는, 에너지 섭취량, 포화 지방산 섭취량 및 n-6 계 고도 불포화 지방산 섭취량의 증가 경향과 n-3 계 고도 불포화 지방산 섭취량의 감소 경향이라고 하는 특징이 있고, 그것이 각종 성인병 등과 관계하고 있는 것으로 생각되어 왔다.
어유는 n-3 계 고도 불포화 지방산을 풍부하게 함유하는 유지로서, 그것들의 섭취가 널리 추천됨과 함께, 보다 효율적으로 n-3 계 고도 불포화 지방산을 섭취하기 위하여, 어유 중의 n-3 계 고도 불포화 지방산을 농축하는 연구가 이루어지고 있다. 리파아제 반응을 사용하는 고도 불포화 지방산의 농축은 그 중 하나이다.
리파아제는 유지를 유리 지방산과 글리세린으로 가수 분해하는 반응을 촉매하는 효소로, 여러 가지 동식물이나 미생물이 리파아제를 갖고 있는 것이 알려져 있다. 어떤 종류의 리파아제는 모든 지방산에 동일하게 작용하는 것이 아니고, 글리세리드 중의 결합 위치나 지방산의 탄소 사슬 길이, 이중 결합수 등에 따라 반응성이 상이하다. 따라서, 이와 같은 리파아제를 사용하여 지방산을 선택적으로 가수 분해하는 것이 가능하고, 그 결과, 글리세리드 획분 중에 특정의 지방산을 농축하는 것이 가능하다. 예를 들어 어떤 종류의 칸디다 (Candida) 속이 산생 하는 리파아제를 사용하면, 어유의 가수 분해 반응에 의해 도코사헥사엔산 등의 고도 불포화 지방산이 미분해 글리세리드 획분 중에 농축되는 것이 알려져 있다 (특허문헌 1).
이와 같이 리파아제에 의한 가수 분해 반응은 고도 불포화 지방산의 농축에 유효한 방법이다. 목적하는 고도 불포화 지방산 이외의 지방산에 대한 가수 분해가 진행될수록 글리세리드 획분 중의 고도 불포화 지방산의 농축도 진행된다. 그러나, 실제로는 고도 불포화 지방산의 글리세리드 획분 중으로의 농축이 진행됨에 따라 가수 분해 반응은 느려져, 더욱 고도로 가수 분해 반응을 진행시키기 위해서는 과잉의 효소를 부가할 필요가 있다. 과잉의 효소를 부가한 경우, 가수 분해 반응은 더욱 진행되지만, 이번에는 목적하는 고도 불포화 지방산에까지 가수 분해 반응이 미쳐, 가수 분해의 증가에 수반하는 농축의 효과가 감소됨과 함께 수율도 저하되게 된다. 또, 리파아제는 가수 분해 반응의 시간의 경과와 함께 서서히 실활되기 때문에 활성이 감소된 효소를 제거하고, 새로운 효소를 사용하여 재반응시킴으로써 더욱 가수 분해를 진행시킬 수 있다. 그러나, 이 경우에도 가수 분해의 정도가 지나치게 진행되면 수율의 저하가 현저하며, 목적으로 하는 고도 불포화 지방산의 농축 효과도 나타나지 않게 된다.
어유를 칸디다 실린드라세아 (Candida cylindracea) 유래의 리파아제로 가수 분해하는 경우에는 리파아제의 사용량을 증가시키거나 반응 시간을 길게 하거나, 또는 리파아제에 의한 가수 분해를 반복하여 실시함으로써, 분해유의 산가를 올리는 것이 가능하고, 목적 고도 불포화 지방산의 농축이 진행되지만, 산가가 160 을 초과하는 부근에서부터 반대로 고도 불포화 지방산의 농축도가 감소되는 것이 보고되어 있다 (특허문헌 1). 즉 과잉된 가수 분해 반응에 의해 목적 고도 불포화 지방산의 농축을 진행시켰을 때에는, 목적으로 하는 고도 불포화 지방산의 가수 분해의 빈도가 높아지는 것을 의미하고 있고, 농축률의 향상과 함께 목적으로 하는 고도 불포화 지방산의 손실의 비율도 상승하여, 어느 점을 경계로 농축률은 향상되지 않게 되어 손실되기만 한다는 것이다. 물론 가수 분해를 진행시킨다는 것은 글리세리드의 수량(收量)을 감소시키는 것이기도 하며, 따라서, 이 리파아제의 가수 분해를 이용한 고도 불포화 지방산의 농축에는 한계점이 발생하고, 얻어지는 유지 제품의 수율과 목적 지방산의 농축 효율의 양자의 밸런스로 효소의 첨가량, 반응 시간 등을 설정할 수 밖에 없다.
효소 반응의 온도에 대해서는, 각각의 효소에 의해 지적(至適) 온도가 알려져 있고, 그 범위 내에서 반응이 실시되지만, 리파아제의 경우, 리파아제 반응의 대상이 되는 유지가 저온에서는 점도가 높아져, 효소를 함유하는 물과의 교반 효율이 나빠지는 점에서 통상 30 - 40 ℃ 에서 실시되고 있다. 예를 들어, 고도 불포화 지방산을 농축할 때에 칸디다 실린드라세아 (Candida cylindracea) 유래의 리파아제를 사용하는 경우의 반응 온도는, 특허문헌 1 (1982년 출원) 의 실시예에서는 실온, 그 이후의 특허문헌 2-7 (각각 1988, 1993, 1994, 1995, 1996, 1999년 출원) 의 실시예에서는 각각 37, 37, 37, 30, 35, 35 ℃ 로 되어 있다.
상기 서술한 바와 같이, 리파아제 반응을 사용하여 고도 불포화 지방산을 함유하는 유지를 제조하는 방법은 여러 가지로 검토되어 있지만, 본 발명은 고도 불포화 지방산 함유 유지에 함유되는 포화 지방산에 착안한 발명이다. 고도 불포화 지방산이 농축된 유지는, 도코사헥사엔산 (이하, 「DHA」라고도 약기한다) 이나 에이코사펜타엔산 (이하, 「EPA」라고도 약기한다) 등의 유용 성분을 섭취할 목적으로 사용된다. 그 때, 그 목적에 무관계, 또는 오히려 바람직하지 않은 포화 지방산의 함유량은 적을수록 바람직한 것으로 생각된다. 본 발명은, 보다 포화 지방산의 함유율이 낮은 고도 불포화 지방산 함유 유지를 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은, 리파아제 반응의 수율, 조성 등에 대해서 더욱 개량을 도모할 여지가 없는지 검토하던 중에, 제조 조건 중, 30 ∼ 40 ℃ 가 지적 온도라는 인식이 고정되어 있어, 아무도 주목하지 않았던 반응 온도를 조절함으로써, 예상 외의 효과가 얻어지는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시켰다.
본 발명은, 하기 (1), (2) 의 포화 지방산 함유율을 저감시키는 방법, (3) ∼ (14) 의 포화 지방산 함유율이 낮은 글리세리드를 요지로 한다.
(1) 고도 불포화 지방산 함유 글리세리드에 고도 불포화 지방산에 대해 반응성이 낮은 리파아제를 작용시켜 고도 불포화 지방산을 농축하는 방법에 있어서, 리파아제 반응을 25 ℃ 이하의 온도에서 실시하는 것을 특징으로 하는 포화 지방산 함유율을 저감시키는 방법.
(2) 리파아제가, 칸디다속, 알칼리게네스속, 버크홀데리아속, 슈도모나스속, 서모마이세스속, 리조무코르속 중 어느 것에 속하는 미생물 유래의 리파아제인 (1) 의 방법.
(3) 고도 불포화 지방산 함유 글리세리드에 고도 불포화 지방산에 대해 반응성이 낮은 리파아제를 작용시켜 고도 불포화 지방산을 농축하는 방법에 있어서, 리파아제 반응을 25 ℃ 이하의 온도에서 실시함으로써 제조한 글리세리드 중의 포화 지방산의 비율이 12 면적% 이하인 고도 불포화 지방산 함유 글리세리드.
(4) 리파아제가, 칸디다속, 알칼리게네스속, 버크홀데리아속, 슈도모나스속, 서모마이세스속, 리조무코르속 중 어느 것에 속하는 미생물 유래의 리파아제인 (3) 의 고도 불포화 지방산 함유 글리세리드.
(5) 리파아제 반응에 의해 고도 불포화 지방산을 농축한 글리세리드로서, 글리세리드 중의 도코사헥사엔산의 함유량이 46 면적% 이상이며, 또한, 포화 지방산의 함유량이 12 면적% 이하인 글리세리드.
(6) 글리세리드 중의 도코사헥사엔산의 함유량이 46 면적% 이상인 (5) 의 글리세리드.
(7) 포화 지방산의 함유량이 10 면적% 이하인 (5) 또는 (6) 의 글리세리드.
(8) 팔미트산의 함유량이 8 면적% 이하인 (5) 내지 (7) 중 어느 하나의 글리세리드.
(9) 팔미트산의 함유량이 6 면적% 이하인 (8) 의 글리세리드.
(10) 글리세리드 중의 트리글리세리드의 비율이 80 면적% 이상인 (5) 내지 (9) 중 어느 하나의 글리세리드.
(11) 글리세리드 중의 트리글리세리드의 비율이 85 면적% 이상인 (10) 의 글리세리드.
(12) 리파아제 반응에 의해 고도 불포화 지방산을 농축한 글리세리드로서, 글리세리드 중의 에이코사펜타엔산의 함유량이 25 면적% 이상이며, 또한, 포화 지방산의 함유량이 20 면적% 이하인 글리세리드.
(13) 글리세리드 중의 에이코사펜타엔산의 함유량이 28 면적% 이상인 (12) 의 글리세리드.
(14) 포화 지방산의 함유량이 17 면적% 이하인 (12) 또는 (13) 의 글리세리드.
본 발명에 있어서, 면적% 란, 각종 지방산을 구성 성분으로 하는 글리세리드의 혼합물을 가스 크로마토그래피나 박층 크로마토그래피/수소염(炎) 이온화 검출기 (TLC/FID) 를 사용하여 분석한 차트의 각각의 성분의 피크 면적의 전체 피크 면적에 대한 비율로, 그 피크의 성분의 함유 비율을 나타내는 것이다. 지방산 조성에 대해서는 실시예에 나타내는 방법에 의한 가스 크로마토그래피에 의해, 지질 조성에 대해서는 TLC/FID 를 사용하였다.
본 발명 방법에 의하면, EPA 나 DHA 등의 고도 불포화 지방산이 농축되고, 또한 포화 지방산 함유율이 적은 글리세리드를 제조할 수 있다. 건강에 바람직한 것으로 여겨지는 고도 불포화 지방산을 섭취할 때에, 여분의 포화 지방산의 섭취량을 저감시킬 수 있다.
도 1 은 실시예 1 에 있어서 각 반응 온도에서 리파아제 처리했을 때의 글리세리드 획분에 함유되는 포화 지방산과 EPA+DHA 의 비율을 40 ℃ 에서의 반응의 결과를 100 으로 하여 나타낸 도면이다.
도 2 는 실시예 2 에 있어서 각 반응 온도에서 리파아제 처리했을 때의 글리세리드 획분에 함유되는 포화 지방산과 EPA+DHA 의 비율을 40 ℃ 에서의 반응의 결과를 100 으로 하여 나타낸 도면이다.
도 3 은 실시예 3 의 리파아제 반응에 있어서의 포화 지방산, EPA, DHA 량의 시간 경과적 변화를 나타내는 도면이다 (20 ℃, 600 unit/㎖ 오일).
도 4 는 실시예 3 의 리파아제 반응에 있어서의 포화 지방산, EPA, DHA 량의 시간 경과적 변화를 나타내는 도면이다 (20 ℃, 300 unit/㎖ 오일).
도 5 는 비교예 1 의 리파아제 반응에 있어서의 포화 지방산, EPA, DHA 량의 시간 경과적 변화를 나타내는 도면이다 (40 ℃, 600 unit/㎖ 오일).
도 6 은 실시예 4 (20 ℃), 비교예 2 (40 ℃) 의 리파아제 반응에 있어서의 포화 지방산, EPA, DHA 량의 비교를 나타내는 도면이다.
도 7 은 큰 스케일로 반응한 실시예 5 의 결과를 나타내는 도면이다.
도 8 은 실시예 7 의 리파아제 반응에 있어서의 포화 지방산, EPA, DHA 량의 시간 경과적 변화를 나타내는 도면이다.
도 2 는 실시예 2 에 있어서 각 반응 온도에서 리파아제 처리했을 때의 글리세리드 획분에 함유되는 포화 지방산과 EPA+DHA 의 비율을 40 ℃ 에서의 반응의 결과를 100 으로 하여 나타낸 도면이다.
도 3 은 실시예 3 의 리파아제 반응에 있어서의 포화 지방산, EPA, DHA 량의 시간 경과적 변화를 나타내는 도면이다 (20 ℃, 600 unit/㎖ 오일).
도 4 는 실시예 3 의 리파아제 반응에 있어서의 포화 지방산, EPA, DHA 량의 시간 경과적 변화를 나타내는 도면이다 (20 ℃, 300 unit/㎖ 오일).
도 5 는 비교예 1 의 리파아제 반응에 있어서의 포화 지방산, EPA, DHA 량의 시간 경과적 변화를 나타내는 도면이다 (40 ℃, 600 unit/㎖ 오일).
도 6 은 실시예 4 (20 ℃), 비교예 2 (40 ℃) 의 리파아제 반응에 있어서의 포화 지방산, EPA, DHA 량의 비교를 나타내는 도면이다.
도 7 은 큰 스케일로 반응한 실시예 5 의 결과를 나타내는 도면이다.
도 8 은 실시예 7 의 리파아제 반응에 있어서의 포화 지방산, EPA, DHA 량의 시간 경과적 변화를 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명에 있어서, 고도 불포화 지방산이란, 탄소수 18 이상, 이중 결합수 3 이상의 지방산이고, 보다 바람직하게는 탄소수 20 이상, 이중 결합수 3 이상의 지방산이다. 구체적으로는 α-리놀렌산 (18 : 3, n-3), γ-리놀렌산 (18 : 3, n-6), 아라키돈산 (20 : 4, n-6), 디호모-γ-리놀렌산 (20 : 3, n-6), 에이코사펜타엔산 (20 : 5, n-3), 도코사펜타엔산 (22 : 5, n-6), 도코사헥사엔산 (22 : 6, n-3) 등이 예시된다. 이들은 어떤 종류의 미생물유, 식물유나 해산 동물유 등에 많이 함유되는 것이 알려져 있다. 구체적으로는, 정어리, 다랑어, 가다랑어 등의 어류나 크릴 등의 갑각류의 해산 동물유, 들깨, 아마(亞麻), 대두, 유채 등의 식물유, 모르티에렐라 (Mortierella) 속, 페니실륨 (Penicillium) 속, 아스페르길루스 (Aspergillus) 속, 로도토룰라 (Rhodotorula) 속, 푸사리움 (Fusarium) 속에 속하는 미생물이 산생하는 유지 등이 예시된다.
본 발명에 있어서, 포화 지방산이란, 탄소수 14, 16, 18 의 포화 지방산이다. 이들은, 에너지원으로서는 중요한 영양소이지만, 현대의 식생활에서는 통상적인 식사에서 필요 이상으로 섭취되는 경우가 많아, 과잉되게 섭취해서는 안되는 지방산으로 생각되고 있다.
본 발명에 있어서, 고도 불포화 지방산 함유 글리세리드란, 상기의 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로서 함유하는 트리글리세리드, 디글리세리드, 및 모노글리세리드이다. 상기의 미생물유, 식물유, 해산 동물유는 고도 불포화 지방산을 함유하는 트리글리세리드이다.
본 발명에 있어서 사용하는 리파아제는, 고도 불포화 지방산에 대해 잘 작용하지 않고, 가수 분해 반응으로 미분해의 글리세리드 획분 중에 고도 불포화 지방산을 농축하는 성질을 가지면, 어떠한 리파아제여도 된다. 예를 들어 칸디다 실린드라세아 (Candida cylindracea), 칸디다 루고사 (Candida rugosa) 유래의 리파아제는 DHA, 아라키돈산, γ리놀렌산을 농축한다. 리조무코르 미에헤이 (Rhizomucor miehei) 유래의 리파아제도 DHA 농축능을 갖는다. 알칼리게네스 에스피 (Alcaligenes sp .), 슈도모나스 에스피 (Pseudomonas sp.) 유래의 리파아제는 EPA 농축능을 갖는다. 이들은 모두 시판되고 있고 용이하게 입수할 수 있다. 이들은 필요에 따라 고정화시켜 사용할 수도 있다. 예시하면, 칸디다속 유래의 리파아제인, 칸디다 실린드라세아 (Candida cylindracea) 유래의 리파아제를 사용할 수 있다. 칸디다 실린드라세아 (Candida cylindracea) 유래의 리파아제로는, 메이토 산업 주식회사 제조 리파아제 OF 가 예시된다. 또는, 알칼리게네스 에스피 (Alcaligenes sp .) 에 속하는 미생물로부터 얻어지는 리파아제 (리파아제 QLM, 리파아제 QLC, 리파아제 PL, 모두 메이토 산업 (주) 제조), 버크홀데리아 세파시아 (Burkholderia cepacia) 에 속하는 미생물로부터 얻어지는 리파아제 (리파아제 PS, 아마노 엔자임 (주) 제조), 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens) 에 속하는 미생물로부터 얻어지는 리파아제 (리파아제 AK, 아마노 엔자임 (주) 제조), 서모마이세스 라누기노사 (Thermomyces lanuginosa) 에 속하는 미생물로부터 얻어지는 리파아제 (리포자임 TLIM, 노보자임사 제조) 등을 들 수 있다.
리파아제의 사용량은, 통상 트리글리세리드 1 g 에 대해 10 ∼ 2000 유닛, 바람직하게는 200 ∼ 700 유닛으로 하는 것이 바람직하다. 또한 1 유닛은 1 분동안에 1 마이크로 몰의 지방산을 유리하는 효소량이다. 리파아제에 의한 가수 분해 반응은, 리파아제의 가수 분해 활성이 발현되기에 충분한 양의 물의 존재하에 실시할 필요가 있다. 물의 존재량으로는, 트리글리세리드에 대해 10 ∼ 200 중량%, 바람직하게는 50 ∼ 150 중량% 로 하는 것이 바람직하다.
또 가수 분해는, 지방산의 열화, 효소의 실활 등을 억제하기 위하여, 건조 질소 등의 불활성 가스 분위기하에서 실시하는 것이 바람직하다. 또 토코페롤, 아스코르브산, t-부틸하이드로퀴논 등의 항산화제를 병용해도 된다.
가수 분해 반응은 25 ℃ 이하, 바람직하게는 10 ∼ 25 ℃, 더욱 바람직하게는 15 ∼ 20 ℃ 에서 실시한다. 저온일수록, 포화 지방산의 함유율을 저하시키기에는 바람직하지만, 10 ℃ 이하에서는 효소 반응의 속도 자체가 지나치게 느려지는 점이나 유지의 점도가 높아지는 점에 배려하면, 15 ∼ 20 ℃ 전후가 가장 바람직하다. 대량 반응의 경우, 반응상을 평균 15 ∼ 20 ℃ 가 되도록 설정하고, ±5 ℃ 정도의 범위로 유지하면서 반응을 실시하면 된다. 가수 분해 반응은 교반이나 불활성 가스 등의 취입에 의한 유동 등에 의해 실시한다.
가수 분해는, 구성 지방산 중에서 차지하는 도코사헥사엔산의 비율이 목적 농도가 될 때까지 반응을 실시한다. 조건은 원료 유지에 따라 상이하지만, 예를 들어 다랑어유 (DHA 23 % 정도 함유) 등을 원료로 하는 경우, 반응 시간은 7 시간 이상이 바람직하고, 통상 5 ∼ 24 시간 가수 분해함으로써, 1 회의 리파아제 반응으로, 도코사헥사엔산의 비율은 46 면적% 이상이 된다. 또한 긴 시간 반응시켜도 상관없다. 실시예에 나타내는 바와 같이 65 시간 반응시켜도 악영향은 없었다. 또 산가를 가수 분해의 정도를 나타내는 지표로 할 수도 있고, 통상 산가가 140 이상이 되면 도코사헥사엔산의 비율은 46 면적% 이상이 된다.
이와 같이 하여 가수 분해를 실시함으로써, 미반응의 트리글리세리드 및 가수 분해물의 혼합물이 반응액으로서 얻어진다. 고도 불포화 지방산에 대해 반응성이 낮은 리파아제에 의한 가수 분해가 진행됨에 따라, 반응액 중의 미반응의 트리글리세리드 및 부분 글리세리드에 있어서의 구성 지방산 중에서 차지하는 도코사헥사엔산이나 에이코사펜타엔산 등의 고도 불포화 지방산의 비율은 높아지고, 가수 분해 종료시에는 도코사헥사엔산의 농도가 40 면적% 이상이 될 때까지 농축된다. 한편, 유리 지방산은 대부분이 고도 불포화 지방산 이외의 지방산으로 차지된다.
가수분 종료 후에는, 원심 분리 등에 의해 리파아제 및 글리세린 등을 함유하는 수층을 제거하여 오일층의 반응액을 얻은 후, 유리 지방산을 제거한다. 유리 지방산의 분리 제거 방법으로는, 알칼리염으로서 제거하는 방법, 액체 크로마토그래피 장치를 사용하는 방법, 분별 유분법, 결정 분별법 등, 공지된 방법을 채용할 수 있지만, 분자 증류, 수증기 증류가 바람직하다.
유리 지방산을 제거함으로써, 고농도로 도코사헥사엔산을 함유하는 트리글리세리드 및 부분 글리세리드의 글리세리드 혼합물이 얻어진다.
본 발명의 저온 반응에서 도코사헥사엔산이 40 면적% 이상, 나아가서는 46 면적% 이상으로 농축되고, 또한 탄소수 14, 16, 18 의 포화 지방산량의 합계가 12 면적% 이하, 바람직하게는, 10 면적% 이하의 글리세리드를 얻을 수 있다. 특히 포화 지방산 중에서도 함유량이 많은 팔미트산 (탄소수 16) 의 함유량이 8 면적% 이하, 바람직하게는 6 면적% 이하인 것이 바람직하다. 또, 저온에서 리파아제 반응하면, 얻어지는 반응유 중의 글리세리드의 지질 조성이 트리글리세리드의 비율의 높은 것으로 되었다. 실시예에 나타내는 다랑어 정제 어유나 가다랑어 정제 어유와 같은 도코사헥사엔산을 많이 함유하는 유지를 원료로 한 경우, 40 ℃ 에서는 트리글리세리드의 비율이 70 면적% 대 정도이지만, 저온 반응에서는 80 면적% 이상인 것이 얻어졌다.
본 발명의 리파아제 반응 유지에 대해, 탈산, 탈색, 탈취 처리를 실시함으로써, 고도 불포화 지방산이 농축되고, 또한 포화 지방산 함유량이 저감된 글리세리드를 얻을 수 있다. 탈산, 탈색, 탈취는 어떠한 방법으로 실시해도 되지만, 탈산 처리는 증류 처리에 의해, 탈색 처리는 활성 백토, 활성탄 등에 의한 처리에 의해, 탈취 처리는 수증기 증류 등에 의해 실시한다.
탈산 처리를 증류로 실시하면, 동시에 모노글리세리드도 제거되므로, 얻어지는 유지의 트리글리세리드 비율을 더욱 높일 수 있다. 트리글리세리드가 85 면적% 이상, 바람직하게는 90 면적% 이상인 것을 얻을 수도 있다.
이하에 본 발명의 실시예를 기재하지만, 본 발명은 이들에 전혀 한정되지 않는다.
실시예
각 실시예에 있어서, 지방산 조성, 산가의 측정은 이하의 방법으로 실시하였다.
지방산 조성의 측정
원료에 사용한 어유의 지방산 조성은, 어유를 에틸에스테르화하여 가스 크로마토그래피로 측정하였다. 즉, 어유 40 ㎕ 에 1 N 나트륨에틸레이트/에탄올 용액 1 ㎖ 를 첨가하여, 약 30 초간 교반하였다. 그 후, 1 N 염산을 1 ㎖ 첨가하여 중화하고, 헥산 2 ㎖, 포화 황산암모니아 수용액 3 ㎖ 를 첨가하여 교반, 정치 후, 상층을 가스 크로마토그래피로 측정하였다.
효소 반응을 실시한 오일의 글리세리드 획분 지방산 조성은 글리세리드 획분을 에틸에스테르화하고 나서, 효소 반응의 부생성물인 유리 지방산을 제거하고, 가스 크로마토그래피로 측정하였다. 즉, 반응유 70 ㎕ 에 1 N 나트륨에틸레이트/에탄올 용액 1 ㎖ 를 첨가하여, 약 30 초간 교반하였다. 그 후, 1 N 염산을 1 ㎖ 첨가하여 중화 후, 헥산 700 ㎕ 및 포화 황산암모니아 수용액 3 ㎖ 를 첨가하여 교반, 정치 후, 에틸에스테르와 유리 지방산을 함유하는 상층을 회수하였다. 얻어진 상층으로부터 유리 지방산을 제거하는 조작을 이하와 같이 실시하였다. 회수한 상층인 에틸에스테르와 유리 지방산이 용해된 헥산 용액 700 ㎕ 에 트리에틸아민을 10 ∼ 20 ㎕ 첨가하여 흔들어 혼합하고 나서, 고상 추출 카트리지 (Varian 사, BOND ELUT SI, 100 ㎎, 1 ㎖) 에 전체량을 부하하고, 헥산과 아세트산 에틸의 혼합 용액 (헥산 : 아세트산 에틸=50 : 1 용적비) 1 ㎖ 로 에틸에스테르를 용출시켜 유리 지방산을 제거하였다. 이것을 가스 크로마토그래피로 측정하였다.
가스 크로마토그래피 분석 조건
기종 ; Agilent 6850 GC system (Agilent 사)
칼럼 ; DB-WAX J&W 122-7032
칼럼 온도 ; 200 ℃
주입 온도 ; 300 ℃
주입 방법 ; 스플리트
스플리트비 ; 50 : 1
검출기 온도 : 300 ℃
검출기 : FID
캐리어 가스 : 헬륨 (2.9 ㎖/min, 콘스탄트 플로우)
산가 (
AV
) 의 측정
본 발명의 실시예에 있어서, 산가 (AV) 의 측정은 기준 유지 분석 시험법 (2003년도판) (사단법인 닛폰 오일 화학회 편) 에 준하여 실시하였다.
오일 약 0.5 g 을 에탄올에 용해시키고, 페놀프탈레인 1 방울을 첨가하여 1 N 수산화나트륨 수용액으로 중화 적정을 실시하여, 하기 식에 의해 산출하였다.
AV=적정량 (㎖)×56.11/샘플 중량 (g)
지질(脂質) 조성의 측정
지질 조성은 박층 크로마토그래피/수소염 이온화 검출기 (TLC/FID, 이아트로 스캔, 미츠비시 화학 아이어트론 주식회사) 로 실시하였다. 오일 20 ㎕ 를 헥산 1 ㎖ 에 용해시키고, 크로마로드에 0.5 ㎕ 를 부하하였다. 헥산, 디에틸에테르, 아세트산의 혼합 용액 (헥산 : 디에틸에테르 : 아세트산=70 : 30 : 0.1 용적비) 을 전개 용매로서 사용하여, 35 분간 전개하였다. 이것을 이아트로 스캔으로 분석하였다.
[실시예 1]
정제 어유 1 (탈산 다랑어유, 닛폰 수산 주식회사) 3 ㎖ 에 물 1.5 ㎖ 와 리파아제 OF 5 ㎎ (메이토 산업 주식회사, 600 unit/㎖ 오일) 을 첨가하고, 10 ∼ 60 ℃ 의 항온조 내에서 마그네틱 스터러로 14 시간 교반하였다. 14 시간 교반 후, 반응유 약 2 ㎖ 를 샘플링하고, 80 ℃ 에서 10 분간 가열하여 리파아제를 실활시키고, 그 후 원심분리기 (40 ℃, 1800 g, 10 분) 로 오일층과 수층을 분리하여 반응유를 얻었다.
얻어진 반응유의 글리세리드 획분의 지방산 조성 (면적%) 및 산가와 정제 어유 1 의 지방산 조성 (면적%) 을 표 1 에 나타냈다. 또, 가스 크로마토그래피로 얻어진 글리세리드 획분 중의 미리스트산 (C14 : 0), 팔미트산 (C16 : 0), 스테아르산 (C18 : 0) 함량 (면적%) 의 합계를 포화 지방산 함량으로서 나타냈다 (이하, 실시예 중에서 「포화 지방산 함량」이라고 기재할 때에는 동일한 의미로 사용한다).
반응 온도 30 ∼ 60 ℃ 에서는 포화 지방산 함량이 15 % 정도인 것에 반하여, 25 ℃ 에서는 11.40 %, 20 ℃ 에서는 9.36 %, 15 ℃ 에서는 7.74 %, 10 ℃ 에서는 8.42 % 로 저온에서 반응하면 대폭 감소하였다. 10 ∼ 25 ℃ 에서 포화 지방산 함량이 대폭 감소하였다. 또, 10 ℃ 에서는 다른 온도 조건보다 반응 속도가 떨어져, 산가 (AV) 가 113.9 로 낮은 결과였지만, 그러한 조건에 있어서도 포화 지방산 함량은 8.42 % 로 낮고, 산가 (AV) 가 125.1 로 가수 분해 반응이 보다 진행된 40 ℃ 조건보다 대폭 저감되었다.
리파아제 가수 분해 반응에서 일반적으로 실시되는 온도대 (40 ℃ 부근) 와, 포화 지방산 저감 효과를 비교하기 위하여, 40 ℃ 에서의 DHA 와 EPA 함량의 합계, 및 포화 지방산 함량을 100 으로 했을 때의 각각의 온도에서의 해당 지방산 함량의 비율을 플롯하여 도 1 에 나타냈다. 이 도면으로부터, 10 ∼ 25 ℃ 의 조건에서 EPA, DHA 함량은 높은 채로 포화 지방산 함량이 대폭 저감된 것을 알 수 있다.
[실시예 2]
정제 어유 2 (탈산 다랑어유, 닛폰 수산 주식회사) 200 g 에 물 100 g 과 리파아제 OF 320 ㎎ (메이토 산업 주식회사, 640 unit/㎖ 오일) 을 첨가하고, 10 ∼ 40 ℃ 에서 교반 날개로 20 시간 교반하였다. 20 시간 교반 후, 반응유를 80 ℃ 에서 15 분간 가열하여 리파아제를 실활시키고, 그 후 상층의 반응유를 얻었다.
얻어진 반응유의 글리세리드 획분의 지방산 조성 (면적%) 및 산가와 정제 어유 2 의 지방산 조성 (면적%) 을 표 2 에 나타냈다 (지방산 조성에 대해서는 대표적인 지방산만). 여기서 글리세리드 함량은 산가로부터 올레산 상당으로서 유리 지방산 함량을 산출하고, 반응유 전체로부터 차감하여 산출하였다. 또, 가스 크로마토그래피로 얻어진 글리세리드 획분 중의 미리스트산 (C14 : 0), 팔미트산 (C16 : 0), 스테아르산 (C18 : 0) 함량 (면적%) 의 합계를 포화 지방산 함량으로서 나타냈다.
35, 40 ℃ 에 비하여 10 ∼ 25 ℃ 에서는 포화 지방산 함량이 대폭 저감되었다.
상기 결과를 도 1 과 마찬가지로 40 ℃ 반응유의 결과를 100 으로 했을 때의 각 온도 조건에서의 글리세리드 획분 중 EPA 와 DHA 함량, 포화 지방산 함량을 도 2 에 나타냈다. 이 도면으로부터, 10 ∼ 25 ℃ 의 조건에서 EPA, DHA 는 높은 채로 포화 지방산이 대폭 저감된 것을 알 수 있다.
[실시예 3]
8 ㎖ 의 정제 어유 1 에 물 4 ㎖ 와 리파아제 OF 13.3 ㎎ (600 unit/㎖ 오일) 또는 6.7 ㎎ (300 unit/㎖ 오일) 을 첨가하고, 교반 날개로 교반하였다. 반응 온도는 20 ℃ 로 하였다. 2, 5, 8, 14, 20 시간 후에 약 1 ∼ 2 g 을 샘플링하고, 80 ℃ 에서 10 분간 가열하여 리파아제를 실활시키고, 그 후 원심분리기 (40 ℃, 1800 g, 10 분) 로 오일층과 수층을 분리하여 반응유를 얻었다.
시간마다 포화 지방산 함량 (면적%), EPA 와 DHA 함량 (면적%) 을 도 3, 4 에 나타냈다. 반응 시간과 함께 포화 지방산 함량은 대폭 저감되고, EPA 와 DHA 함량은 증가하였다.
[비교예 1]
반응 온도를 40 ℃ 로 하는 것 이외에는, 실시예 3 의 리파아제를 600 unit/㎖ 사용한 경우와 동일한 조건, 조작으로 반응을 실시하였다.
시간마다 포화 지방산 함량 (면적%), EPA 와 DHA 함량 (면적%) 을 도 5 에 나타냈다. 포화 지방산 함량은 반응 2 시간에 15.0 % 까지 감소했지만, 반응 시간이 길어져도 추가적인 감소는 관찰되지 않고, 15 % 정도의 높은 함량으로 추이하였다.
[실시예 4, 비교예 2]
정제 어유 3 (탈산 다랑어유, 닛폰 수산 주식회사) 3 ㎖ 에 물 1.5 ㎖ 와 리파아제 OF 5 ㎎ (600 unit/㎖ 오일) 을 첨가하고, 20 ℃ 의 항온조 내에서 마그네틱 스터러로 14 시간 교반하였다. 14 시간 교반 후, 반응유 약 2 ㎖ 를 샘플링하고, 80 ℃ 에서 10 분간 가열하여 리파아제를 실활시키고, 그 후 원심분리기 (40 ℃, 1800 g, 10 분) 로 오일층과 수층을 분리하여 반응유를 얻었다.
비교예로서 상기 실시예 4 의 조건을 온도만 변화시켜 40 ℃ 에서 반응을 실시하였다. 온도 이외에는 모두 동일한 조건, 조작이다.
실시예 4 와 비교예 2 의 포화 지방산 함량 (면적%), EPA 와 DHA 함량 (면적%) 을 도 6 에 나타냈다. 이 도면으로부터 20 ℃ 조건인 경우, 40 ℃ 조건과 비교하여 포화 지방산 함량이 대폭 감소되고, EPA, DHA 함량은 약간 증가하는 것을 알 수 있었다.
[실시예 5]
정제 어유 4 (탈산 다랑어유, 닛폰 수산 주식회사) 6,000 ℓ, 물 3,000 ℓ, 리파아제 OF 를 5 ㎏ (300 unit/㎖ 오일) 반응 탱크에 주입하고, 20 ∼ 25 ℃ 로 유지하면서 21 시간 교반하여 반응을 실시하였다. 21 시간 후에 반응유 약 50 g 을 샘플링하고, 80 ℃ 에서 10 분간 가열하여 리파아제를 실활시키고, 상층의 반응유를 얻었다.
정제 어유의 포화 지방산 함량 (면적%) 과 EPA 와 DHA 함량 (면적%), 반응유 글리세리드 획분 중의 포화 지방산 함량 (면적%), EPA, DHA 함량 (면적%) 을 도 7 에 나타냈다. 큰 스케일로 반응을 실시해도, EPA 와 DHA 가 농축됨과 함께 포화 지방산 함량이 10 % 이하로 대폭 저감되는 것이 확인되었다.
[실시예 6]
실시예 1 의 10, 20, 40, 50 ℃ 조건에서의 반응유에 관하여 글리세리드 획분 중의 지질 조성 (면적%) 을 측정하였다. 표 3 에 나타내는 바와 같이, 10, 20 ℃ 에서 반응하면 트리글리세리드의 비율이 80 면적% 이상인 것을 얻을 수 있었다. 한편, 40, 50 ℃ 에서 반응한 경우에는 72.8 %, 59.9 % 정도였다. 저온에서 리파아제 반응을 실시함으로써, 포화 지방산 함유량을 저하시킬 수 있을 뿐만이 아니라, 트리글리세리드의 비율을 높일 수 있는 것이 나타났다.
[실시예 7, 비교예 3]
정제 어유 5 (정제 정어리유, 닛폰 수산 주식회사) 2 g 에, 물 2 ㎖, 리파아제 QLM (메이토 산업 주식회사) 100 ∼ 600 unit/g 오일을 첨가하고, 20 ℃ 또는 40 ℃ 의 온도 조건하, 마그네틱 스터러로 17 ∼ 65 시간 교반하였다. 그 후, 반응액을 90 ℃ 에서 15 분간 가열하여 리파아제를 실활시키고, 원심분리기 (실온, 3000 rpm, 5 분) 로 오일층과 수층을 분리하여 반응유를 얻었다.
얻어진 반응유의 산가, 글리세리드 획분의 지방산 조성 (면적%), 가수 분해율 (%) 과 정제 어유 5 의 지방산 조성 (면적%) 을 표 4 에 나타냈다. 가수 분해율은 산가 및 정제 어유 5 의 비누화값 (206.04) 으로부터 하기 식으로 산출하였다.
가수 분해율=(산가/비누화값)×100
또, 가수 분해율과 지방산 조성 (면적%) 의 관계를 도 8 에 나타냈다.
표 4 및 도 8 로부터, 리파아제 QLM 을 사용한 EPA 농축 반응에 있어서도, 20 ℃ 에서 반응하면 일반적으로 실시되는 온도대인 40 ℃ 와 비교하여 포화 지방산 함량이 저감되었다.
산업상 이용가능성
EPA 나 DHA 등의 생리 활성을 갖는 지방산을 섭취하는 목적 중 하나는, 고콜레스테롤혈증 등, 심혈관계 질병 예방이다. 포화 지방산은 에너지원으로서 중요하기는 하지만, 현대의 식생활에서는, 특히 중노년에 있어서는 섭취 과다가 되기 쉽상이어서, 적극적으로 섭취하는 것은 바람직하지 않다. 특히 심혈관계 질환의 예방이 필요한 층에 있어서는, 모처럼, 고도 불포화 지방산을 섭취할 때에, 함께 섭취하게 되는 포화 지방산은 적은 편이 바람직하다. 본 발명의 발명에 의해 제조된 유지는, 고도 불포화 지방산이 농축되고, 포화 지방산은 보다 저감된 것이기 때문에, n-3 계 고도 불포화 지방산을 공급하기 위한 건강 식품이나 서플리먼트로서 사용하기에 적합하다.
Claims (14)
- 고도 불포화 지방산 함유 글리세리드에 가수 분해 반응으로 미분해의 글리세리드 획분 중에 고도 불포화 지방산을 농축하는 성질을 갖는 리파아제를 작용시켜 고도 불포화 지방산을 농축하는 방법에 있어서, 리파아제 가수 분해 반응을 10 ~ 20 ℃ 의 온도에서 실시하는 것을 특징으로 하고, 리파아제가, 칸디다속, 알칼리게네스속, 버크홀데리아속, 슈도모나스속, 서모마이세스속, 리조무코르속 중 어느 것에 속하는 미생물 유래의 리파아제인 포화 지방산 함유율을 저감시키는 방법.
- 제 1 항에 있어서,
리파아제가, 칸디다 실린드라세아, 또는 알칼리게네스 에스피 유래의 리파아제인 방법. - 고도 불포화 지방산 함유 글리세리드에 가수 분해 반응으로 미분해의 글리세리드 획분 중에 고도 불포화 지방산을 농축하는 성질을 갖는 리파아제를 작용시켜 고도 불포화 지방산을 농축하는 공정을 포함하고, 리파아제 가수 분해 반응을 10 ~ 20 ℃ 의 온도에서 실시하고, 리파아제가, 칸디다속, 알칼리게네스속, 버크홀데리아속, 슈도모나스속, 서모마이세스속, 리조무코르속 중 어느 것에 속하는 미생물 유래의 리파아제이고, 제조한 글리세리드 중의 포화 지방산의 비율이 12 면적% 이하이고, 추가로 얻어지는 글리세리드 획분 중의 도코사헥사엔산의 함유량이 40 면적% 이상인, 고도 불포화 지방산 함유 글리세리드의 제조 방법.
- 제 3 항에 있어서,
리파아제가, 칸디다 실린드라세아, 또는 알칼리게네스 에스피 유래의 리파아제인 방법. - 삭제
- 제 3 항에 있어서,
추가로 얻어지는 글리세리드 획분 중의 도코사헥사엔산의 함유량이 46 면적% 이상인 방법. - 제 3 항 또는 제 6 항에 있어서,
얻어지는 글리세리드 획분 중의 포화 지방산의 함유량이 10 면적% 이하인 방법. - 제 3 항 또는 제 6 항에 있어서,
얻어지는 글리세리드 획분 중의 팔미트산의 함유량이 8 면적% 이하인 방법. - 제 8 항에 있어서,
팔미트산의 함유량이 6 면적% 이하인 방법. - 제 3 항 또는 제 6 항에 있어서,
글리세리드 중의 트리글리세리드의 비율이 80 면적% 이상인 방법. - 제 10 항에 있어서,
글리세리드 중의 트리글리세리드의 비율이 85 면적% 이상인 방법. - 삭제
- 삭제
- 삭제
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