JPS5851894A - Ｒｎａ植物ウイルスベクタ−またはその部分の作製、利用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＲＮＡ植物ウィルスベクターまたはその部分、
その作製方法、およびそれから遺伝子由来生成物を製造
する方法に関する。

近年、遺伝子工学と呼ばれるＤＮＡ分子を直接操作する
技術の進歩と、ｉｎ　Ｖｉｔｒｏで遺伝情報をＤＮＡの
形で挿入したのちその情報をバクテリアおよび酵母の細
胞に運搬できるバクテリアＤＮＡシラスミドの発見によ
り、特異的な遺伝子生成物の経済的製造が可能になって
きた。これまで、バクテリアＤＮＡラスミドと酵母から
のある種のＤＮＡ成分のみか、外性遺伝子の運搬、複写
および表現に適したベクターまたはビークルであること
が明らかにされている。これらのベクターはバクテリア
および酵母に使用するのに適しているにすぎない。遺伝
情報を動物や植物細胞のような高等生物体に運搬するこ
とは、高等生物体で複写できる連節なベクターがないた
め、これまで不可能であった。

バクテリアＤＮＡ　７°２スミドを用いたＤＮＡ操作と
遺伝子運搬の領域における急速な進歩のため、ウィルス
ＲＮＡ分子を、外性遺伝情報の細胞への導入、細胞内で
の複製および表現のためのベクターまたはビークルとし
て使用する可能性についてはこれまでほとんどあるいは
全く注量が払われていない。

本発明者らの知る限りでは、タバコモザイクウィルス（
以下ＴＭＶと称す）またはＴＭＶの成分を、植物へ外性
遺伝情報を導入するためのベクターまたはベクタ一部分
として使用する概念の報告についてはわずか一報をみる
にすぎない。この報告は１添加遺伝情報の担体としての
ウィルスの使用”と題し、８．　ＲｏｇｅｒｓおよびＰ
、　ＰｆｕａｅｒｅｒによりＮａｔｕｒｅ　２１９：　
７４９−７５１．１９６８に発表された。コの報告では
ポリアデノシン（以下ポリＡと称す）１ をＴＭＶ　−ＲＮＡの６′末端に添加し、ついで接種し
たタバコ植物におけるポリへの表現について記述され、
著者らはウィルスＲＮＡの６′末端に添加したポリＡの
接種タバコ植物中での表現と考えられるとして結果を提
示している。この表現は、ＴＭＶ−ＲＮａ−ポリＡによ
る植物の感染の結果として合成されたポリリジン（ポリ
アミノ酸またはタンパク質）であったという。この報告
は一見して明らかなように他の研究者によって再現でき
ていないし、また発表した著者によっても追試できてい
ない。

本明細書において６′末端とＲＮＡ分子の遊離ヒドロキ
シル基（ＯＨ）を有する末端であり、他端は５′末端で
ある。通莞の用法では６′末端は分子の右端を示してい
る。

本発明は、ＴＭＶおよび他のＲＮＡ植物ウィルスからＲ
ＮＡ植物ウイつスベクターオたはその部分を、それに外
性遺伝情報を挿入し、これを植物または植物細胞中に運
搬し、植物または植物細胞中で挿入外性遺伝情報ととも
に、自己複製またはヘルパーウィルスとの共接種下の複
製によって、その２ ベクターまたは部分を複製および表現させるために作皺
する方法において、ウィルスＲＮＡのプラス（＋）スト
ランド５′末端から由来のヌクレオチド配列とウィルス
ＲＮＡのプラス（＋）ストランド６′末端由来のヌクレ
オチド配列（以下これらのヌクレオチド配列と呼ぶ）を
結合させ、これらのヌクレオチドは（ａ）以下フラグメ
ン）ｌと呼ぶ５′末端由来のフラグメントは６犠端方向
に延び、ウィルスＲＮＡのマイナス（→ストランドでウ
ィルス性式すメラーゼに対する認識および結合部位に相
補的なヌクレオチド配列を有し、（１）１以下フラグメ
ン）　１１と呼ぶ６′末端由来のフラグメントは５′末
端方向に延び、ウィルスＲＮＡのプラス（＋）ストラン
ドでウィルス性ポリメラーゼが認識および結合可能なヌ
クレオチド配列を有し、また（Ｃｌフラグメント１およ
び１１の少なくとも一方は少なくともウィルス外殻タン
パク質遺伝子の部分を含み、（ｄ）フラグメンｌ−１お
よび■は単独でまたは結合して外殻タンパク遺伝子の表
現を調節するヌクレオチド配列（以下調節領域という）
を含むオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの群
から選はれる、ＲＮＡ植物ウィルスベクターまたはその
部分の作製方法を提供する。

本明細書において１外性遺伝情報″とは、植物細胞中に
天然に生じると同等の任意のヌクレオチド配列で、その
ベクターまたはその部分と接種すして植物中でのその表
現がベクターまたはその部分への挿入により改変される
配列、または植物細胞中に天然にはない任意のヌクレオ
チド配列でベクターまたはその部分と接種される配列を
意味する。

さらに本発明は、ＴＭＶおよび他のＲＮＡ植物ウィルス
由来のＲＮＡ　Ｍ物つィルスベクターまたはその部分を
提供する。外性遺伝情報を挿入し、これを植物または植
物細胞中に運搬し、植物または植物細胞中で挿入外性遺
伝情報とともに、自己複製またはヘルパーウィルスとの
共接種下の複製のためのＲＮＡ植物ウィルスベクターま
たはその部分であって、ウィルスＲＮＡのプラス（刊ス
トランド５′末端から由来のヌクレオチド配列とウィル
スＲＮＡのプラス（ｌ−）ストランド６′末端から由来
のヌクレオチド配列（以下これらのヌクレオチド配列を
フラグメントと呼ぶ〕とからなり、この両フラグメント
は以下のオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの
群から選ばれ、両フラグメントが結合されたものである
。すなわち両フラグメントは（ａ）以下フラグメント１
と呼ぶ５′末端由来のフラグメントは６′末端方向に延
び、ウィルスＲＮＡのマイナス（−）ストランドでウィ
ルス性ポリメラーゼに対する認識および結合部位に相補
的なヌクレオチド配列を有し、（ｂ）以下フラグメント
■と呼ぶ６′末端由来のフラグメントは５′末端方向に
延び、ウィルスＲＮＡのプラス（ト）ストランドでウィ
ルス性ポリメラーゼが認識および結合できるヌクレオチ
ド配列を有し、（Ｃ）フラグメント１および１１の少な
くとも一方は少なくともウィルス外殻タンパク質遺伝子
の部分を含み、（ｄ）フラグメントＩおよび１［は単独
でまたは結合して外殻タンパク遺伝子の表現を調節する
ヌクレオチド配列（以下調節領域と呼ぶ）を含む。

本明細書におけるＴＭＶおよび他のＲＮＡ　植物ウィル
スス由来のＲＮＡ植物ウィルスベクターまたはその５ 部分とは、ＴＭＶおよび他のＲＮＡおよび他のＲＮＡ植
物ウィルスに本来包含されたヌクレオチげ配列から構成
されたベクターまたはその部分、および同様に構成され
たベクターまたはその部分の後代を意味する。

本発明はさらに、ＴＭＶおよび他のＲＮＡ植物ウィルス
ベクターまたはその部分に外性遺伝情報を挿入し、この
ベクターまたはその部分を挿入した遺伝情報とともに植
物または植物細胞中に接種して、植物または植物細胞中
で自己複写またはヘルパーウィルスとの共接種による複
写によって遺伝子由来生成物を士風蓄積させるために、
そのベクターまたは部分を複写、表現させる遺伝子由来
生成物の製造法を提供する。この場合、ＲＮＡ植物ウィ
ルスベクターまたはその部分はウィルスＲＮＡのプラス
（ト）ストランド５′末端から由来のヌクレオチド配列
とウィルスＲＮＡのプラス（ト）ストランド６′末端か
ら由来のヌクレオチド配列（以下これらのヌクレオチド
配列をフラグメントと呼ぶ）からなり、この両者は（ａ
）以下フラグメンｌ−１と呼ぶ５′末端由来６ のフラグメントは６′末端方向に延び、ウィルスＲＮＡ
マイナス（−）ストランドでウィルス性ポリメラーゼ゛
に対する認識および結合部位に相補的なヌクレオチド配
列を有し、（ｂ）以下フラグメント■と呼ぶ６′末端由
来のフラグメントは５′末端方向に延び、ウィルスＲＮ
Ａのプラス（＋）ストランｒでウィルス性式りメラーゼ
が認識および結合できるヌクレオチド配列を有し、（Ｃ
）フラグメンｌ−１およびｌの少なくとも一方は少なく
ともウィルス外殻タンパク質遺伝子の部分を含み、（ｄ
）フラグメントＩおよび■は単独でまたは結合して外殻
タンパク質遺伝子の表現を調節するヌクレオチド配列（
以下調節領域と呼ぶ）を含むようなオリゴヌクレオチド
およびポリヌクレオチドの群から選ばれ、両者が結合さ
れる。

１、　　本発明の一態様においては、フラグメント１お
よび■は単独でまたは結合して、ウィルス外殻タンパク
質によるＲＮＡのエンカメジディジョンに必要なヌクレ
オチド配列またはその部分（以下有核領域と呼ぶ）を含
有する。

本発明の一態様においては、外性遺伝情報が最終的には
ＲＮＡの形で、ＲＮＡベクターまたはその部分に挿入ま
たは付着される。

本発明の一態様においては、外性遺伝情報は外殻タンパ
ク質遺伝子またしｊそのタンパク質に挿入または付着さ
れる。

本発明の一態様においては、外性遺伝情報は調節領域ま
たはそのタンパク質に挿入または付層される。

本発明の一態様においては、外性遺伝情報゛報は核形成
領域またはそのタンパク質に挿入または付着される。

本発明の一態様においては、ＲＮＡ植物ウィルスベクタ
ーま１こはその部分は植物または植物細胞中に接種する
ことによる再生の目的のものである。

本発明の一態様においては、ＲＮＡ植物ウィルスベクタ
ーまたはその部分と添加された外性遺伝情報は植物また
は植物細胞中に接種することによる再生の目的のもので
ある。

本発明の一態様においては、ＲＮＡ植物ウィルスベクタ
ーまたはその部分と添加された外性遺伝情報は、植物ま
たは植物細胞中に接種して、タンパク質、オリゴヌクレ
オチド、ポリヌクレオチド′、ペプチド、酵素、抗体、
抗原性物質、抗ウイルス性化合物、抗癌性化合物ならび
に一次および二次代謝物の合成指向の目的のものである
。

本発明の一態様においては、ＲＮＡ植物ウィルスベクタ
ーまたはその部分と添加された外性遺伝情報は植物また
は植物細胞に接種して、植物または植物細胞の代謝また
は分解能を変更することを目的とするものである。

本発明の一態様においては、ＲＮＡ植物ウィルスベクタ
ーまたはその部分と添加された外性遺伝子情報は、植物
または植物細胞へ接種して、植物または植物細胞の生育
習性、収＠渣在性、疾病抵抗性、環境ストレスへの抵抗
性およびエネルギー利用性の群のうち少なくともひとつ
を改変することを目的とするものである。

本発明の一部の態様は、植物または植物細胞中に運搬可
能な、植物または植物細胞中で外性遺伝情報の複製およ
び表現が可能な、ＴＭＶからのＲＮＡ植物ウィルスベク
ターの少なくとも部分に関する。

この植物ウィルスベクターの少なくとも部分の新規な特
徴は、 １）上記ＲＮＡ植物ウィルスベクターの少なくとも部分
はタバコモデイクウイルス（ＴＭＶ）および他のＲＮＡ
植物ウィルスから作製される。

２）上記植物ウィルスベクターの少なくとも部分は遺伝
情報の植物または植物細胞への運搬ができ、またこの情
報の植物または植物細胞中での複製および表現が可能で
ある。

６）挿入遺伝情報は、バクテリアプラスミドの９ 場合のように、ＤＮＡよりもむしろＲＮＡの形である。

４）上記植物ウィルスベクターの少なくとも部分とＲＮ
Ａの形での遺伝情報は、本発明の一部の態様として、Ｔ
ＭＶの独特な能力、すなわち著しく大量の単一タンパク
質合成の指向を利用して作製される。

図面は本発明の態様を例示し、詳細に説明するものであ
る。

第１図および第２図は両者で、完全なＴＭＶおよび関連
のウィルス種の複製に関する基本的工程のフローダイア
ダラムであり、第６図はＴＭＶおよび関連のウィルス種
の複製がどのように進むと考えられるか、また３′末端
への遺伝情報の添加が複製に対して示す作用についての
可能性を例示したダイアダラムであり、第４図は植物ウ
ィルスベクターまたはその部分の作製に用いられる、Ｔ
ＭＶおよび関連ウィルス種からのヌクレオチド配列（フ
ラグメントＩおよび■）をダイアダラムとして示した図
であり、第５図は、ＴＭＶおよび関連ウィルス極から、
外殻タンパク質遺伝子の少なくとも一部０ 分の除去によるＲＮＡ植物ウィルスベクターの少なくと
も一部分の作製および上記遺伝子またはその部分を所望
の生成物の合成暗号であるＲＮＡヌクレオチド配列によ
る置換のフローダイアダラムであり、第６図はウィルス
外殻タンパク質によるＲＮＡベクターまたはその部分の
エンカプシデイションを防止するために、核形成領域の
少なくとも一部分を除去させた、ＴＭＶおよび関連ウィ
ルス種からのＲＮＡ　［物ウィルスベクターの少なくと
も一部分を作製する場合のフローダイアダラムであり、
第７図〜第９図はＴＭＶからの特異的ヌクレオチド配列
（フラグメント■および■）の生成および単紙ならびに
それからのＲＮＡベクターまたはその部分の作製から始
まって、感染植物または植物細胞から複製ベクターまた
はその部分の回収に至るまでのフローダイアダラムであ
り、またこれらの図はＲＮＡベクターまたはその部分へ
の外性遺伝情報の挿入および植物または植物細胞中での
遺伝子由来生成物の合成を生じる外性遺伝情報の表現を
例示している。

第１０図および第１１図は両者で、ＴＭＶから特異的な
ヌクレオチド配列（フラグメントＩおよび■）の生成お
よび単離、それらからのＩＡベクターまたはその部分の
作製から、感染植物または植物細胞から複製ベクターま
たはその部分の回収に至るまでの別のフローダイアダラ
ムを示し、またこれらの図はＲＮＡベクターまたはその
部分への外性遺伝情報の挿入および植物または植物細胞
中での遺伝子由来生成物の合成を生じる遺伝情報の表現
を例示し、第１２図から第１５図までは、またＴＭＶか
ら特異的なヌクレオチド配列（フラグメントＩおよび■
）の生成および単離、それらからのＲＮＡベクターまた
はその部分の作製から、感染植物または植物細胞から複
製ベクターま１こはその部分の回収に至るまでのさらに
別個のフローダイアダラムであり、またこれらの図はＲ
ＮＡベクターまたはその部分への外性遺伝子情報の挿入
および植物または植物細胞中での遺伝子由来生成物の合
成を生じる遺伝情報の表現を例示している。

第１図および第２図において、ＮＲは核形成領域、Ｃは
外殻タンパク質遺伝子の表現に対する調節領域、　　Ｏ
ＰＧは外殻タンパク質遺伝子である。

第１図および第２図を参照して説明すれば、一般的に１
で示したウィルス粒子の形のＴＭＶおよび関連種は、天
然のまたは人工の開口を通って植物細胞０図には示して
いない）に入る。細胞内への侵入時またはその直後に、
ウィルス外殻タンパク質２は除去され（１ａ）、ウィル
スＲＮＡ　　４が遊離する。感染ウィルス粒子からのウ
ィルスＲＮＡ　４を以下プラス（１）ストランドと呼ぶ
。この（（ト）ストランドは最初は、ウィルスレプリカ
ーゼ酵素乙の合成、またはウィルスレツリカーゼと同様
に機能する既存のまたは誘導された細胞性ＲＮＡポリメ
ラーゼを改変するウィルスタンパク質に対するメツセン
ジャーＲＮＡ　（ｍ、−ＦｔＮＡ　）として機能する（
１ｂ、１Ｃおよび１ｄ）。後述するように、初期に（＋
）ストランド４がｍ−ＦｔＮＡとして機能するためには
部位乙に結合するりボゾーム８の形にリーダー配列が要
求され、５′末端にキャップ構造（ｍ７ＧＰＰＢＧ　）
が要求されるものと思われる。

６ ウィルスレプリカーゼ６の合成に続いて、ｔ＋１ストラ
ンド４は、　（＋）ストランド４に対して相補的なヌク
レオチド配列を有する、１２のようなマイナス←）スト
ランド合成に対するテンプレイトとして機能する。ウィ
ルスレプリ、カーゼま１こはポリメラーゼ６の（ト）ス
トランドへの結合はウィルスＲＮＡ　４の６′末端また
はその付近におけるヌクレオチド配列１０の認識によっ
て行われる（１ｅ）。１２（１ｆ）のような（ハ）スト
ランド合成完了時または完了後、ウィルス？リメラーゼ
６は、（−１−）ストランド４の５′末端に相補性の１
２（１ｇ）のよりな←）ストランドの３′末端またはそ
の付近における配列１６を認識する。この認識が、１２
のような←）ストランドをウィルスＲＮＡ　（１ｈ　）
の１４のような（＋）ストランドの合成のテンプレート
として機能させることになる。

ウィルス外殻タンパク質１６の合成は、１４のような仕
）ストランドを、直接ｍ−ＨＮＡ　（１１）として用い
るかあるいはプロセスにより生成したフラグメント１８
の形でのその部分を用いて達成され４ る。ウィルス外殻タンパク質１６の合成は、（＋）スト
ランドの全長部分２０未満の合成を指向する１２のよう
な（−）ストランドを用いても行うことができる。この
場合←）ストランドは外殻タンパク質１６の合成のｍ　
−ＲＮＡとして機能する（１ｋ）。

ｍ−ＲＮＡがどのような形であれ、外殻タンパク遺伝子
（ＯＰＧ）の翻訳には細胞性リボゾーム８による特異的
ヌクレオチド配列の認識が要求される。この配列はウィ
ルス外殻タンパク質の合成を指向する配列の直前（すな
わち図中１１．１ｊおよび１にの左側）に存在するもの
と思われる。外殻タンパク質は他のウィルス遺伝子生成
物よりはるかに多量に産生される。感染植物からの完全
ウィルス粒子の回収に基づく外殻タンパク質の収量は葉
の生重量１　ｋｆｉに対し１〜１０ｇの範囲である（完
全ＴＭＶは９５チのタンパク質および５ｑ６のＲｈＪＡ
からなる）。

タバコのある変種では、感染部位の１個または２個以上
の細胞に侵入したのち、ウィルスは植物全体に拡がり、
複製できる（全体感染）。

外殻タンパク質の合成についで、これらのタンパク質は
ウィルスＲＮＡ分子の６′末端から約１０００ヌクレオ
チドで特異的なヌクレオチー配列をｇ識し、結合する。

この配列は核形成領域（ＮＲ）と呼ばれる。ついで結合
はこの領域から両方向に進行する。すなわち、ウィルス
Ｆ（ＮＡはエンカノシデイトされ（ウィルスタンパク質
で被覆され）、感染細胞のサイトプラズマ中に完全ウィ
ルスが蓄積する。

ＴＭＶおよび関連ウィルス棟からのＲＮＡ植物ウィルス
ベクターまたはその部分は、第１図および第２図を参照
して記述した完全ＴＭＶおよび関連ウィルス種の合成に
関与すると同じ基本工程をたどることになる。

第３図では第１図および第２図に示した部分と同じ部分
は同様に番号を付していて、先の記述がその説明になる
。

ＦｔＮＡ植物ウィルスの複製に関する一般的問題、とく
にＴＭＶ複製の問題についての、本願発明出願時点で一
般に受けいれられている理解によれば、Ｒｏｇｅｒｓお
よびＰｆｕａｅｒｅｒによる薔与は有益ではあったもの
の、かれらの教示はタバコモザイクウィルスおよび他の
Ｉ（ＮＡ植物ウィルスへのＲＮＡの形での外性遺伝情報
の挿入または添加、あるいはこのウィルスを、植物また
は植物細胞中に外性遺伝情報を導入し、複製、表現させ
るためのベクターとして使用することについての容認で
きる技術を提供するものでなかったことは、以下の理由
から明らかである。

第６図を参照して説明すれば、ウィルスＲＮＡ　４の６
′末端にポＩＪ　ＡＯ形で遺伝情報を添加してもウィル
スレプリカーゼ酵素乙によっては複製されなかったと思
われる。この酵素はウィルスＲＮＡ分子の６′末端また
はその付近に特異的部位（独特のヌクレオチド配列）１
０を認識すると考えられる（６ａ）。ついで複製はウィ
ルスＦ（ＮＡの３′床端からウィルスＲＮＡの５′末端
（左端）の方向に進行する（６ｂ）。Ｒｏｇｅｒｓおよ
びＰｆｕｎｄｅｒｅｒによって添加されたといわれるポ
リＡはレプリカーゼ結合部位１０の右側、ウィルス］（
ＮＡ　３’末端の右と思わ７ れるので、ポＩＪ　Ａ配列は複製されず、ウィルス合成
の次工程で失われてしまうことになる（３ｄ）。

この段階でのポリへの喪失は、植物内での、添加情報の
連続的表現の可能性を排除するものである。

これはバクテリオファージＱ、ＢＲＮＡの３′末端に添
加されたポＩＪ　Ａは感染バクテリア中で複製されず、
また表現されず、したがって後代ウィルスＲＮＡ中には
存在しないという事実によっても支持される（　０．　
Ｇｉｌｖａｒｇら：　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、　ＡｃａＪ　
Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、。

７２　：　４２８〜４６２．１９７５参照）。またさら
に、６′末端ポＩＪ　Ａ添加によって改変されたＴＭＶ
−ＩＡ分子は植物中では複製されない（３８）。これは
分子の３′末端へのポリＡ添加によって改変されたバク
テリオファージＱ、Ｂ　ＲＮＡは精製ウィルスレブリカ
ーゼによってｉｎ　ｖｉｔｒｏで複製されないという事
実によっても支持される（　Ｒ，Ｄｅｖｏｓら：Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　４４７　：　３
１９〜３２７．１９７６参照）。

上述の解析および支持文献に基づき、ＲｏｇｅｒＢおよ
びＰｆｕｎｄｅｒｅｒの研究は植物中への外性遺伝情８ 報の導入に植物ＲＮＡウィルスをベクターまたはビーク
ルとして使用することに応用できるものではないと結論
できる。さらに以下の記述から明らかになるように、Ｒ
ｏｇｅｒＢおよびＰｆｕｎｄｅｒｅｒの開示は、本発明
におけるＴＭＶベクターへの特異的遺伝情報の導入とは
全くかけはなれたものである。

前述のように、ＲｏｇｅｒｓおよびＰｆｕｎｄｅｒｅｒ
の開示がＲＮＡ植物ウィルス（ＴＭＶや関連ウィルス種
）を、外性遺伝情報の植物または植物細胞中への導入、
植物または植物細胞中での複製および表現のためのベク
ターとして特異的に使用することに関係があると思われ
る、発明者らの知る唯一の情報である。

第４図では、第１図および第２図に示した部分と同じ部
分は同様に番号を伺していて、先の記述が説明になる。

第４図はタバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）または関連
様から誘導されるウィルスＲＮＡの特異的ヌクレオチド
配列（フラグメントＩおよび■から、外性遺伝情報の植
物または植物細胞への導入ならびに植物または植物細胞
中での複製および表現のためのベクターまたはその部分
の作製に関する本発明の態様を例示している。ベクター
およびその部分は、以上のウィルスＦ（ＮＡヌクレオチ
ド配列から以下の技術によって作製される。

１）フラグメントＩ：ウイルスＲＮＡの５′末端由来の
ヌクレオチド配列またはフラグメントであり、この実際
の大きさくヌクレオチドの長さ）はこのフラグメントを
生成させるのに用いられた特定の方法によって決まる。

このヌクレオチド配列は第４図ではＦｒａｇ、Ｊ（例１
）またはＦｒａｇ、ＩＩ　（例２）と表示され、それぞ
れ生成した場合は区切って表示した。

２）フラグメント■；ウィルスＲＮＡの６′末端由来の
ヌクレオチド配列またはフラグメントであり、このフラ
グメントの実際の大きさはこのフラグメントを生成させ
るのに用いられた特定の方法によって決定される。この
ヌクレオチド配列は第４図ではＦｒａｇ、　ＴＩ　（例
１）またはＦｒａｇ、　ｌ　（例２）と表示され、それ
ぞれ生成した場合は区切って表示した０ ６）ベクターまたはその部分中に存在するヌクレオチド
配列を特定の位置で、この部位に外性遺伝情報が導入で
きるように開裂。

４）後述するような、外殻タンパク質遺伝子中または隣
接部への外性遺伝情報の挿入および挿入の方法 ＲＮＡベクターまたはその部分が機能的であるｋめには
、挿入遺伝情報の複製（ウィルスポリメラーゼによる認
識）、表現および表現の調節に必須なヌクレオチド配列
を含まねばならない。たとえば ａ）　５’　末端由来ｃ以下フラグメン）Ｉと呼ぶ）、
３′末端方向に延び、ウィルスＦＩＮＡのマイナス←）
ストランドでウィルスポリメラーゼの認識および結合部
位に相補性のヌクレオチド配列をもつフラグメント、 １ ｂ）６′末端由来Ｃ以下フラグメン）ＩＩと呼ぶ）、５
′末端方向に延び、ウィルスＲＮＡのプラス（＋）スト
ランドでウィルスポリメラーゼが認識、結合するヌクレ
オチド配列をもつフラグメント Ｃ）フラグメント■および■のうち少なくともひとつは
ウィルス外殻タンパク質遺伝子の少なくとも一部分を含
む、および ｄ）フラグメン）Ｉおよび■は単独でまたは結合して、
外殻タンパク質遺伝子の表現を調節するヌクレオチド配
列（以下調節領域という）を含む。

上述の厘必須な１ヌクレオチド配列はその本来の形で存
在しても、改変された型で存在してもよい。

第５図および第６図において、第１図から第４図に示し
たと同じ部分には同様に番号をつけている。したがって
先の記述がその説明になる。

上記のウィルスＲＮＡのヌクレオチド配列は、本発明の
一部の態様において、ＲＮＡ植物植物ウィルスペ タ２−またはその部分中に存在し、したがってその必須
部分と考えられる。しかしながら、本発明ノ一部の態様
においてはこれらのヌクレオチド配列の一部は、ＲＮＡ
植物ウィルスベクターの特定の機能的適用に合致するよ
うに一部または全部が改変または除去される。

ａ）遊離形成生成物（外殻タンパク質分子の部分に共有
結合的に付着していない）の合成に対する機能的要求に
合致するためには、外殻タンパク質合成暗号のそれらヌ
クレオチド配列（ＯＰＧ）の一部またはすべてを除去す
る必要がある。しかしながら、第５図に示すように外殻
タンパク質合成の調節に必要な、Ｃで示されたヌクレオ
チドはＲＮＡ植物ウィルスベクター中に残されるが、一
方、ＯＰＧで表わされ点線鎖−・−で示された外殻タン
パク質遺伝子ヌクレオチド配列は一部または全部が除去
され、所望の生成物の合成を指向するＲＮＡヌクレオチ
ド配列（第５図では、ｋとえばｍ−ＲＮＡで示されてい
る）に置換される。

ｂ）挿入遺伝情報の性質による生物学的抑制の機能的要
求に合致するためには、安定なベクター粒子の生成を妨
害する必要がある。この要求に合致するためには、第６
図に示すように、ＮＲで表わし、点線鋼−・・−で示し
た核形成領域はＩ（ＮＡ植物ウィルスまたはその部分か
ら、一部まｋは全部が除去される。

すなわち、特定の機能的要求に合致するためにはＲＮＡ
　、［物ウィルスベクターまたはその部分のあるヌクレ
オチド配列の一部または全部が除去されるか、改変され
ることが望ましく、必要である。

しかしながら、このような除去または改変がＥ（ＮＡ植
物ウィルスベクターの性質を、本技術においてＲＮＡ植
物ウィルスベクターまたはその部分として一般的に引用
されている性質から変えてしまうものではない。

本発明の例 例　　１ ５ リアプラスミドへのＤＮＡコピーの挿入−外性遺伝子Ｄ
ＮＡコピーの該ベクター外殻タンパク質遺伝子への挿入
−挿入遺伝子の１（ＮＡコピーを含むＲＮＡベクター（
以下Ｖ−ＲＮＡと略す）の回収−ＲＮＡベクター（Ｖ−
ＲＮＡ）の複製と挿入遺伝子の植物、ｋとえばタバコま
たはトマト中での表現−感染植物からのＶ−Ｆ（ＮＡ核
粒子回収 フラグメントＩ生成と単離 公知のフェノール抽出法を用いてＴＭＶからＴＭＶ−Ｒ
ＮＡを単離する。次にＲＮＡをＲＮＡ　５’末端キヤツ
プ構造の第２ａ（グアノシン）残基で％異的にメチル化
する（　ｍ　７　ＧｐｐｐＧＵ　−＝−＋　ｍ　７　Ｇ
ｐｐｐＧｍＵ　−＝　）。

ワクチン処理ウィルス粒子から精製したメチルトランス
フェラーゼを用いてこのメチル化を行う。

ついでメチル化ＲＮＡをりボヌクレアーゼＴ１（Ｃａｌ
　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃａ１ｉｆ
ｏｒｎｉａ、　Ｕ、８．Ａ、）により大きく分解する。

ウィルスＲＮＡの５′木端から生じに大きなＲＮＡフラ
グメントな標準方法により単離する。以下フラグメント
■と呼ぶこのフラグメントは約７１個のヌクレオチドと
５′末端を有６ し、キャップ構造は損われていない。このフラグメント
の６′末端のホスフェートはアルカリホスファターゼ（
Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ工ｎｃ１Ｍ１ｗａｕｋ
ｅｅ。

Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）処理によって除
去する。フラグメン）Ｉのヌクレオチド配列は次のとお
りである。

フラグメンｌ−１ フラグメント■生成と単離 完全ＴＭＶ　（１容量）を、１８時間約０°Ｃで、２、
　ＯＯｍＭ　２−アミノ−２−メチル−１，２−プロパ
ンジオール、２０　ｍＭ　Ｎａ（Ｊ、ｐＨ９，５（１容
量）で処理する。次に塩化マグネシウム（２００ｍＭ）
を加えて最終濃度１ｍＭとする。ついでＮｅｕｒｏｓｐ
ｏｒａｃｒａｓｓａヌクレアーゼ（Ｐ　−Ｌ　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ工ｎｃ、）を加えて（５Ｕ　／　ｔｘ
ｌ　）　、約０℃でさらに１８〜２４時間インキュベー
ションを続ける。ＲＮＡ　ｉ含む完全なリボヌクレオタ
ンパク負（以下フラグメント■と称す）ン単離、精製す
る。ついでフラグメント■をフェノール抽出法で単離す
る。このようにして製造されたフラグメント■は５′末
端ホスフエートヲ有し、そのヌクレオチド配列は次のと
おりである（下線を施したヌクレオチド配列は、以下の
例１中に述べる二１ストランドＤＮＡコピーのＳｅｔ制
限部位に相当するヌクレオチド配列である。

９ ５４９− ０ 第７図〜第７図中、第１図〜第５図に示したと類似の部
分は、同じ方法で表示しであるので、前述の注釈が参考
になる。

第７図〜第９図に示すように、それそハ２２および２４
と表示されたフラグメン）Ｉおよび■を適当な緩衝液中
で混合し、ＲＮＡ　！Ｊガーゼ１００〜２００　Ｕ　／
　ｍｅ　（Ｐ　−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉａａｌｓ工ｎａ
、。

Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、　Ｕ、Ｓ、
Ａ、　）とともに１〜６日間、４〜１０°Ｃでインキュ
ベートする。■で示した工程１である。このフラグメン
トＩとフラグメント■の結合により、ＲＮＡベクター筐
たはその部分（Ｖ　−ＲＮＡ　）と呼び、第７図に２６
と表示したＲＮＡ分子が生成する。この結合反応の効率
はきわめて低い。Ｖ　−ＲＮＡの回収は公知方法で反応
混合物Ｙ　ＴＭＶ外殻外殻タンパクインキュベートする
ことにより行われる。核形成領域を含むＲＮＡ分子はこ
のタンパク債によりエンカプシデイトされる。

Ｖ　−ＲＮＡ粒子（エンカプシデイトされたＶ−ＲＮＡ
）はついで、■で示した工程２１Ｃおいて、標準方法で
精製され、２８で示したベクター粒子またはその部分（
Ｖ−粒子）を与える。工程３（■で示す）で、ベクター
粒子を完全ＴＭＶとともにタバコ中に共接種しく完全ウ
ィルスは■−丘ＮＡ複製に必要なウィルスレブリカーゼ
の合成のために使用される）複製（増幅〕後、ベクター
粒子を標準方法で抽出、精製し、６０で示したＶ　−Ｒ
ＮＡ　ｉ次にフェノール抽出法で草離する。

６′末端にあらかじ検適当な短い相補性オリゴデオキシ
ヌクレオチドを付した、ｖ　−ＲＮＡ　３０　’Ｙ、■
で示した工程４において、トリ骨髄白血病ウイールスＲ
ＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）（Ｂｓｔｈ
ｅｓｄａ　Ｒｅ５ｓａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ　Ｉｎｃ、。

Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙ’１ａｎａ、Ｕ、Ｓ、Ａ、
（ＢＲＬ）　）により逆転写してＶ　−ＲＮＡの単一ス
トランドＤＮＡコピー６１（以下ｃ　−ｖ−ＤＮＡと呼
ぶ）を得る、■で示した工程４では、さらに、Ｖ　−Ｒ
ＮＡ　ｉ分解するアルカリ処理後にＣ−Ｖ−ＤＮＡｉ単
離し、このｃ−Ｖ−ＤＮＡ１ Ｙ　ＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｐ　−Ｌ　Ｂｉｏａｈｅ
ｍｉｃａｌｓ■ｎｃ、、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓｃ
ｏｎｓｉｎ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）　Ｙ用いてコピーし、かく
してＶ　−ＲＮＡの二重ストランドＤＮＡコピー３１．
３２Ｃ以下ｄｃ　−Ｖ　−ＤＮＡと呼ぶ〕を得る。■で
示した工程５において、ｄａ−Ｖ−ＲＮＡの末端を公知
方法で適当に改渡し、結合可能なりンカー配列をもった
ｄｃ　−Ｖ　−ＤＮＡ　’ｆ７生成させる。

閉じた環状二重ストランドＤＮＡ　３８　、４０の形に
精製したバクテリアプラスミド（たとえばｐＢＲ３２２
−ＢＲＬ）ｖ（○で示した工程６ａにおいて適当な制限
エンドヌクレアーゼで処理し、プラスミドな単一の位置
で開裂して環状プラスミド構造Ｙ開き、ｄａ　−Ｖ　−
ＤＮＡ　３４　＋　３６の末端と相補性の末端ビ有する
構造４２．４４’に形成させる。

たとえば制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ工はｐＢＲ３
２２をヌクレオチド配列 ↓ ５’　−Ｇ　ＡＡＴＴＯ ３’−０ＴＴＡＡＧ ↑ を有する単一の位置で開裂する。

２ ０で示した工程６ｂにおいて、開裂後、開いた環状プラ
スミド摘造４２．４４およびｄａ−Ｖ−ＤＮＡ３４．５
６を、ＤＮＡリガーゼ（ＢＲ’Ｌ　）の存在下に一緒に
インキュベートする。この酵素の存在下にａｃ　−ｖ　
−ＤＮＡ　５４　、３６はプラスミドの開裂部分に共有
結合的に挿入される。■で示した工程７ａにおいてｌｃ
　−Ｖ　−ＤＮＡシラスミド３４．３＋５゜４２．４４
は、適当な釉のバクテリア中たとえばＥｉｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　（Ｅ、ｃｏｌｉ　）中で複製、選
択、増幅される。

Ｏで示した工程７ｂにおいて、精ｆｉ　ｄｏ−Ｖ−ＤＮ
Ａプラスミド３４，３６，４２．４４を適当な制限エン
ドヌクレアーゼで処理し、ｄｃ　−Ｖ　−ＤＮＡプラス
ミド３４，３６，４２．４４をＯＰＧで示すＴＭＶ外殻
タンパク質遺伝子に相当するｄｃ−Ｖ−ＤＮＡの領域で
開裂する。たとえば、制限エンドヌクレアーゼＳｓｔ工
（ＢＲＬ　）はヌクレオチド配列↓ ５’−ＧＡＧＯＴＯ ろ’　−ＣＴＯＧＡＧ ↑ の位置で開裂する。この配列はｅＬｃ　−Ｖ　−ＤＮＡ
プラスミド３４，３６，４２．４４中に２個所ある。

両位置はＴＭＶ外殻タンパク’Ｊ遺伝子内にある。分裂
位置はＴＭＶ外殻外殻タンパ分質分子中ミノ酸１４１−
１４３および１４５−１４７の［物上であるヌクレオチ
ド配列中にある〔外殻タンパク質遺伝子中の札当する位
置については上記フラグメントＩ＋およびＴＭＶ外殻外
殻タンパ分質分子中当する位置については以下のアミノ
酸配列を参照〕。

５ 一一例１の（ｉｃ　−Ｖ　−ＤＮＡにおけるＳｓｔ工制
限部位に相当する配列 −−−飼２のりポヌクレアーゼＨによって開裂される部
位に相当する配列 ｄａ　−Ｖ　−ＤＮＡの外殻タンパク質遺伝子を開裂し
たのち、遺伝子限界Ｂ　−Ｂ’の遺伝子のｄａ　−ＤＮ
Ａコピー４６．４８Ｙ、あらかじめ３末端を適当に改変
してから、■で示した工程８におい゛Ｃ，ＤＮＡ！Ｊガ
ーゼを用いｄａ　−Ｖ　−ＤＮＡの外殻タンパク質遺伝
子中に共有結合的に挿入する。このように構築されたプ
ラスミドを■で示した工程９において適当なバクテリア
中で複製させ、適当な時間にプラスミド感染バクテリア
から全ＲＮＡ　’４抽出する。

挿入遺伝子のＲＮＡコピーを含むＶ　−ＲＮＡの回収バ
クテリア中でのプラスミド複製中に、プラスミド管理Ｒ
ＮＡ合成が起こる。工程９で合成されたＲＮＡの一部は
、挿入遺伝子を含むｄａ　−Ｖ　−ＤＮＡのコｖ−ｙ、
−包含する。このＲＮＡ　５０はＶ　−ＲＮＡ（Ａ−Ａ
’）はＶ　−ＲＮＡ　（Ａ　−Ａ’　）を含み、シラス
ミドＲＮＡ　（５’　−ＡおよびＡ’　−３’　）と共
有結合して６ いる。このＲＮＡ　５０は、！：　ＲＮＡンＴＭＶ外殻
タンパク質５１とインキュベートすることにより特異的
に単離できる。この外殻タンパク質５１はＶ−ＲＮＡ中
に存在する有核領域を含むＲＮＡ　５０にのみ結合し、
これンエンカゾシデートする。しかしながら、１０ａＫ
示したようにエンカデシデーションはＶ　−ＲＮＡの６
′」６よび５′末端を越えて広がらす、これらの点から
先のプラスミドＲＮＡはエンカプシデートされない。こ
の場合、地山プラスミドＲＮＡはヌクレアーゼ処理によ
って除去され、かくしてＶ　−ＲＮＡおよびＴＭＶ外殻
タンパク質のみからなる粒子５１．５２が生成する、。

一方、エンカプシデーションはＶ　−ＲＮＡの６′オよ
び５′末端を越えて、共有結合したプラスミドＲＮＡ　
Ｙ含む場合もある（１０ｂ参照）。この場合には、粒子
乞複製すると、以下に述べるようにＶ　−ＲＮＡが回収
される。

プラスミド感染バクテリアから抽出された全、［’ｊＮ
ＡからのＶ　−ＲＮＡの特異的単離のための第２の方法
には、工程１００で１．ＲＮＡ　ｉ、ｎｔＭｄｃ　−’
Ｖ’−ＤＮＡプラスミドから、たとえばＦｉｃｏ　Ｒ工
処理で回収したｄｃ　−Ｖ　−ＤＮＡと混合する方法が
ある。ついでこの混合物を熱変性し、徐々に放冷する。

冷却時に、Ｖ　−’ＲＮＡ　（／Ｃ相補性の単一ストラ
ンドｃ−Ｖ−ＤＮＡ５４がＲＮＡ　５０　、５４のＶ　
−ＲＮＡ　Ａ　−Ａ’部分とアニールして塩基対雑種ｃ
−Ｖ−ＤＮＡ／Ｖ−ＲＮＡを形成する。Ｖ　−ＲＮＡの
６′および／または５′末端に結合しているプラスミド
ＲＮＡは単一ストランドのままである。この単一ストラ
ンドＨＭＡは単一ストランド特異性ヌクレアーゼ（たと
えばＳ、ヌクレアーゼ、Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈ、ｅｍｉｃ
ａｌｓ工ｎａ、）’Ｙ用いて分解できる、精製後、ｃ　
−Ｖ　−ＤＮＡ／Ｖ−ＲＮＡ　１１　種のＤＮＡ　スト
ランド５４はＤＮＡ分解酵素で分解できる。完全なり　
−ＲＮｈ　５２はついでＴＭＶ外殻外殻タンパクツ５１
ンカプシヂートされる。ｖ　−ＲＮｈ粒子５１　。

５２は上記１０ａに略述した操作で回収される粒子に相
当する。

上記操ｈ（１０ａおよび１０ｃ）の結果生成するＶ　−
ＲＮＡ粒子は複製および挿入外性遺伝子情報の表現に必
要な特性を含むように設計することが粒子ノ、完全ＴＭ
Ｖ　（これがウィルスレブリカーゼを供給する）との、
（ｅで示される工程１１ａにおける共接種はＶ　−ＲＮ
Ａの複製を生じる。挿入遺伝子情報（この時点ではＲＮ
Ａの形）はＶ　−ＲＮＡの外殻タンパク質遺伝子内にあ
るので、挿入遺伝情報に暗号化されている生成物Ｐが完
全ＴＭＶ中の外殼゛タンパク質の量に匹敵する量生成し
、また挿入遺伝情報に含まれるｍ　−ＲＮＡの産生方式
は、完全ＴＭＶの複製中の外殻タンパク質ｍ　−ＲＮＡ
産生の方式にほぼ従う。結合プラスミドＲＮＡもベクタ
ー粒子形成時に、上記１０ｂにおけるようにエンヵプシ
ディ“トされる場合、複製が起これば、結合プラスミド
ＲＮＡは工程１１ｂに示すような（−）および（−＋−
）ストランド合成の間に複製酵素によってとひ越される
ことがあって、第３図の工程３ｄおよび３θをそれぞれ
参照して述べたと同じようにプラヌミ９ ドＲＮＡがウィルス合成の以下の工程で効果的に失われ
てしまうか、またはこのような粒子は全く複製されない
。前者の場合、複製されたＶ　−ＲＮＡは上述のＶ　−
ＲＮＡの場合と同様に機能的で、挿入外性遺伝子情報の
表現を指向できる。後者の場合はＶ　−ＲＮＡの回収に
ついて工程１０ｃＹ参照して述べたような別の方法が必
要になる。

らの複製ＲＮＡベクター粒子の回収 Ｖ　−ＲＮＡの外殻タンパク質遺伝子への外性遺伝子情
報の挿入は外殻タンパク質遺伝子の連続性を破壊する。

したがって、Ｖ　−ＲＮＡは機能性外殻タンパク質欠合
成しない。しかしながら、共感染完全ＴＭＶは機能性外
殻タンパク質の産生を指向し、Ｖ　−ＲＮＡ　、　ＴＭ
Ｖ　−ＲＮＡの両者がエンカゾシデイトされ、＠で示し
た工程１２に示すような粒子ビ形成する。Ｖ　−ＲＮＡ
粒子は標準操作によって単離でき、タバコまたはトマト
のような植物または植物細胞中での挿入外性遺伝情報（
遺伝子）の複製および表現を目的として将来使用するた
めに保存で０ きる。

第１０図および第１１図において、第７図から第９図に
示したと同じ部分は同様ＶＣ表示しであるので、前述の
点を参照する必要がある。

例１ Ｂ、　ＴＭＶ　−ＲＮＡのヌクレオチド配列フラグメン
トのフラグメン）ＩおよびＨの形での生成および単離−
フラグメントＩおよび■の逆転写−フラグメントＩおよ
び■のＤＮＡコピーのバクテリアシラスミドへの挿入□
フラグメントＩおよび■のＤＮＡコピーのＤＮＡ　−Ｄ
ＮＡ結合−結合ＤＮＡコピーのバクテリアプラスミドへ
の挿入−外性遺伝情報（遺伝子〕のＤＮＡコピーのベク
ター外殻タンパク質遺伝子への挿入□挿入外性遺伝情報
（遺伝子）のＲＮＡコピーを含むＲＮＡベクターの回収
−一タバコまたはトマトのような植物または植物細胞中
でのＲＮＡベクターの複製および挿入外性遺伝情報（遺
伝子）の表現−感染植物または植物細胞からの複製ＲＮ
Ａベクター粒子の回収例１Ｂは第１０図および第１１図
を参照して説明する。

これは例１人に述べたと同Ｓにして実施される。

フラグメントＩは６０で、フラグメント■は６２で示す
。

第１０図に示すように、６′末端に適当な、知い相補性
オリゴデオキシヌクレオチドを付したフラグメントラ、
トリ骨髄白梅病ウィルスの逆転写酵素（ＢＲＬ　）　Ｙ
用いて逆転写し、それぞれ６４および６６と表示したフ
ラグメン）Ｉおよび■の単一ストランドＤＮＡコピーを
合成させる。ついでリボストラントビアルカリ処理によ
り消化″′Ｊ−る。、郡−ストランドＤＮＡコピー６４
および６６Ｙ（１）で示して工程１ＶｃおいてＤＮＡポ
リメラーゼｘ　（ＢＲＬ　）とインキュベートし、６１
．６４で示したフラグメン）Ｉおよび■のＤＮＡ二重ス
トランドコピー、ならびに６３．６６で示したｄａ−フ
ラグメント■−ＤＮＡ乞合成させ、これらのＤＮＡコピ
ーの末端ヲ適当に修飾する。

フラグメントｌおよび■の二重ストランドＤＮＡ修飾後
、フラグメントＩおよび■の二重ストランドＤＮへコピ
ーＣ６１，６４および６６．６６）ン（２）で示した工
程２において、例１Ａ工程６ａおよび６ｂＶｃ記載した
と同じ方法により、たとえばＢｃｏ　ＲＩ　Ｍ）ような
制限エンドヌクレアーゼン用いてシラスミド？開裂し、
それぞれ６７．６８および７０．７１で示した別個のバ
クテリアプラスミドに挿入する。ついでプラスミドを、
たとえばＬｃｏｌｉのような連層なバクテリア中で別ｉ
ｌｌに独製、選択、増幅ｆる。デラスミＶの精製後、フ
ラグメントＩおよび１１６１．６４および６６．６６の
二重ストランドＤＮＡコピー乞、それぞれ、（３）で示
した工程３において、制限エンドヌクレアーゼたとえば
Ｅｃｏ　Ｒエビ用いてシラスミドから切除する。

ｘ　−ｘ’はフラグメントＩ、６１．６４の二重ストラ
ンドＤＮＡコピーの限界を、ｙ−７はフラグメント■、
６３．６６の二重ストランドＤＮＡコピー３ の限界を示す・ フラグメン）Ｉおよび■の二重ストランドＤＮＡコピ〜
のＤＮＡ　−ＤＮＡ結合 精製後、フラグメントＩおよび■の二重ストランドＤＮ
Ａコピー、６１．６４および６６．６６’ｌ：それぞれ
、（４）で示した工程４においてＤＮＡ　ＩＪガーゼを
用い結合させる。６１．６４．６６．６６で示される工
程４の生成物は例１人の工程４における生成物に類似す
る。生成物６１，６４．６３゜６６の末端を、次［（Ｆ
ｉ）で示した工程５において適当に改変する。

フラグメントＩおよび■の結合二重ストランドＤＮＡコ
ピーのバクテリアプラスミドへの挿入改変された生成物
６１，６４，６３，６６乞例なプラスミド（たとえばｐ
ＢＲ３２２）中へ挿入すベクター−ＲＮＡ構築の完成、
タバコまたはトマトのような植物または植物細胞中への
接種によるベクター−ＲＮＡの複製および表視が可能で
ある。

４ ■７かしながら、挿入前のプラスミドの開裂は先に用い
た制限エンドヌクレアーゼ（たとえば５ａ１１）とは別
の酵素ン用いて行われたことに注意すべきである。上述
のように構築された改変生成物６１．６４．’６３．６
６は、前述ノヨうＶＣＫｅｎ　、ＲＩが工程（３）　Ｋ
用すらねた場合、結合部位にＥｃｏ　Ｒ工制限部位を含
んでいる。ＥｃＯＲ−［制限部位が存在するために、Ｊ
７１４人ＤＮＡ　６１　、６４　、６３　、６６は、例
１人工程＠のようにプラスミドから切断するのＶｃＫｃ
ｏ　ＲＩ　’ａｉ用いたのでは、正常な形では回収でき
ない。Ｓａｌ、　１部位は挿入ＤＮＡ　６１　＋　６４
　＋６５．６６には生じないので、挿入ＤＮＡ６１．６
４１６３．６６はこの制限エンドヌクレアーゼを用いれ
ばプラスミドから切断できる。逆にＳａ：Ｌ　１　’２
はじめに用いたのであれば、ついでこの段階でＥｃｏ　
ＲＴを使用できる。

ベクターの回収 にして行う。

タバコまたはトマトのような植物または植物細胞中での
ＲＮＡベクターの複製および外性遺伝情報（遺伝子）の
表現 タバコおよびトマトのような感染植物または植菌１２図
１〜第１５図において、第１図〜第９図に示したと類似
の部分は同じように表示しであるので、前述の散切が参
考になる。

例２ ＴＭＶ　−ＲＮＡからヌクレオチド配列フラグメントＩ
および■の生成と単離−−フラグメン）Ｉの６′■の逆
転写□外性遺伝情報（ｍ−ＲＮＡ）の逆転写□ｍ　−Ｒ
ＮＡのベクターＲＮＡ　ＩＡ、飲タンパク質遺７ のような植物または植物細胞中でのＲＮＡベクター（Ｖ
　−ＲＮＡ　）の複製および挿入遺伝子の表現−一感染
植物または植物細胞からのａ製ＲＮＡベクターの回収 フラグメン）Ｉおよび■の生成および却離第１２図に示
すように、ＴＭＶ　−ＲＮＡ　７２なオリゴデオキシヌ
クレオチド−５’　ｄ　（（１！ＡＯＧＡＡＯＴＧ）（
“ｄ−″と表示）と混合する。この混合物ン工程ＩＫお
りで、５５℃で１５〜６０分インキュベートし、ついで
放冷する。この条件でオリゴデオキシヌクレオチドはＴ
ム１’Ｖ　−ＲＮＡにおける相補性配列にアニールされ
る。この例では、外殻タンパク質遺伝子（ＯＰＧ　）　
ＦＣ独特の５’　ｒ　（０ＡＧＵＵＯＧＵＧ　）が存在
する。ＴＭＶ外殻タンパク質のアミノ酸９〜１１の暗号
であるこのヌクレオチド配列は次のとおりである。

８ ：、 ５５４− ９ 下線を施こしたヌクレオチド配列はりボヌクレアーゼＨ
によって開裂されるヌクレオチド配列である０ アニール後、工程２でリボヌクレアーゼＨ（Ｐ−ＬＢｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　　）を加え、３０分間インキュ
ペーのフラグメント、すなわちフラグメントＩ（７６で
示す）およびフラグメン）ｎ（７８で示す）に開裂され
、開裂点は上述のＯＰＧにおける特異部位である。大き
い方のフラグメントＩ　７６は、ウィルスＲＮＡのキャ
ップ５′末端に由来し、外殻タンパク質遺伝中に延び、
　Ｆｒａｇ・ｌ　ＯＰＧで示される約５７４２個のヌク
レオチドから構成される。ウィルスレブリカーゼ遺伝子
はフラグメン）Ｉに含まれていると思われる。小さい方
のフラグメント■７８は外殻タンパク質遺伝子中開裂部
位の５′末端に由来し、Ｉ’ｒｒａｇ・ｌ　ＯＰＧで示
され、ウィルスＲＮＡの６′末端方向に延びる約６６６
個のヌクレオチドで構成される。

このフラグメントＩ　　７６の部分ヌクレオチド配列は
例１Ａのフラグメントｌを含み、次のとおりである。

０ １ ７８で示されるフラグメント■のヌクレオチド配列は次
のとおりである。

ＩＪＵＣＬＩＬＩＧＵＣＡＵＣＡＧＣＧＵＧＧＧＣＣＧ
ＡＣＣＣＡ−ＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＵＩＪＡＵＧ　ＵＡ
ＣＡＧ　ＧＵＡＣＡＡＵＧＣＧＧＵＧＩＪＩＪＡＧＡＣ
ＣＣＧＣＵＡＧＵＣＡＣＡＧ　ＣＡＵＵＡＣＵＡＧＧＵ
ＧＣＡＵＵＵＧＡＣＡＣＵＡＧＡＧＧＡＡ　ＣＣＧＧＡ
ＩＪ　ＣＬＩＩＪＡＵ　ＡＡＵ　ＣＧＧ　ＡＧＣＩＪＣ
ＩＪＩＪＩＪＣＧＡＧＡＧＣＩＪＣＵＩＪＣＵＧＧＩＪ
ＩＪＵＧＧ　ＩＪＩＪ　ＵＧＧ　ＡＣＵ　Ｕ　ＣＣＧＧ
ｔｌ　ＣＵＧＧＡ　ｔｌ　ＣＧ　ＣＧＣＧＧＧ　ＯＣＡ
ＡＡＵＧ　ＵＡＵＡＵＧＧＵ　Ｕ　ＣＡ　ＵＡＵＡＣＡ
　Ｕ　ＣＣＧＣＡ　ＧＧＣＡＣＧＵＡＡＵＡＡＡＧＣＧ
ＡにＧＧＧＵＵフラグメントＩの６′末端の延長 第１６図に示すように、例１Ａにおいてフラグメン）　
ｌ　ＲＮＡに関連して記述した方法で製造したフラグメ
ントＩｔ　ＲＮＡ　８０を例２工程１′Ｏに述べたオリ
ゴデオキシヌクレオチドと混合し、放置してアニールす
る。ついで工程２ｂにおいてリボヌクレアーゼＨを加え
、インキュベートしたのち、８２および８４で示す生成
した２個のＲＮＨセグメントを単離し、精製する。第１
２図におけるフラグメン）１の６′末端領域に相当する
セグメント８２をついで工程６ｂにおいてリボヌクレア
ーゼＴ１（Ｓｉｇｍａ　Ｏｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）で
消化する。次に工程４ｂにおいて８６で示されるオリゴ
リボヌクレオチド５’　（ＵＡＵＯＡＯＵＡＣＵＯＯ人
Ｕ（、ｔＪ　）　３’が単離される。

このオリゴヌクレオチドは７６で示されるフラグメント
１の６′末端と同じヌクレオチド配列を有する。このオ
リゴヌクレオチドを次に工程５ｂにおいて、ポリヌクレ
オチドホスホリラーゼ（Ｐ−ＬＢｉ、ｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ　　）および適当なりボヌクレオチドゾホスフエ−
）　（ｒＮＤＰ　）を用いて６′方向に延長４ する。延長したオリゴリボヌクレオチドを、逆転写酵素
および適当なプライマーたとえばオリゴ（ｉＴ　）、。

□２（Ｐ−Ｌ　　ＢｉＯＣｈｅｍｉＱａｌ　）を、用い
、工程６ｂで逆転写する。次にリボストランド８６を工
程７ｂにおいてアルカリ処理して消化し、このデオキシ
ストランド（ｃ−ＤＮＡストランド）８８を上述の工程
２からのフラグメン）　ｌ　７６（第１２図）に、工程
８ｂでアニールする。アニールされていないＣ−ＤＮＡ
ストランド８８の５′末端をテンプレイトとして用い、
工程９ｂにおいてフラグメンｌ−１を６′末端方向に、
ＤＮＡポリメラーゼｌ　（ＥＲＬ　）および適当なりポ
ヌクレオチドトリホスフエート（ｒＮＴＰ　）で延長す
る。Ｃ−ＤＮＡストランドを工程１０ｋｌにおいてＤＮ
人分解酵素で消化すると、６′末端方向に延長された、
９２で示されるフラグメント１が得られる。

結合の準備のためのフラグメントｎの逆転写第１２図の
工程２で生成した、８２で示されるフラグメント■を、
第１４図に示すように、その６′末端に相補性のオリゴ
デオキシヌクレオチドで５ 工程１Ｃにおいてプライムし、逆転写酵素を用いて逆転
写する。リボストランド７８を次に工程２Ｃでアルカリ
処理により消化し、９６と表示したフラグメント■の単
一ストランドＤＮＡコピーを工程６Ｃにおいて単離し、
末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＢＲＬ
　）および適当なデオキシヌクレオチドトリホスフェー
ト（ｄＮＴＰ　）を用いて６′末端方向に延長させる。

次に延長ＤＮＡコピー９８を工程４Ｃにおいて、工程２
で生成した第１２図で７８と表示したフラグメントｎと
アニールすると、フラグメント…ＲＮＡ　／　ＤＮＡノ
）イブリド７８．９８が生成する。

第１５図に示すように、１０２で示した精１ｉ！ｊｍ−
ＲＮＡを逆転写酵素により工程１ｄで逆転写する。

リボストランド１０２を次に工程２ｄにおいてアルカリ
処理して消化し、ｍ　−ＲＮＡのＤＮＡコピー１０４を
工程６ｄにおいて、末端デオキシヌクレオチＰトランス
フェラーゼおよび適当なデオキシヌクレオチドトリホス
フエート（、（］、ＮＴＰ　）を用いて６′末端方向に
延長し、ストランド１１２を生成させる。

延長ＤＮＡストランド１１２を、あらかじめ第１６図に
おける工程５ｂに述べたオリゴヌクレオチド８６の延長
の場合と同じ操作でその６′を延長したｌＴｌ−ＲＮＡ
　１１０によって工程４ｄでアニールし、ｍ　−ＲＮＡ
−／　ＤＮＡ　／−イブリド１１０．１１２を生成させ
る。

９２で表示した延長フラグメントＩおよびｍ−ＲＮＡ／
ＤＮＡバイブリド１１０．１１２を第１５図、工程５ｄ
で混合し、工程６ｄでＤＮＡポリメラーゼｌおよび適当
なりボヌクレオチドトリホスフエート（ｒＮＴＰ　）と
インキュベートする。９２で表示したフラグメンＩ−１
の６′末端における延長領域をバイブリドのＤＮＡ　１
１２の６′末端における延長領域とアニールし、フラグ
メン）１９２０３′末端とｍ−ＦｔＮＡｌｌｏの５′末
端とが架橋し、アラインメントを形成する。ＤＮＡポリ
メラーゼは直線ＲＮＡ分子の間のヤヤツプを満たす。次
にＤＮＡ　リガーゼを工程７ｄで用い、９２で表示した
フラグメントｌの６′末端をｍ−ＲＮＡ　１１Ｑの５′
末端に共有結合的に結合させる。ついでバイブリドのＤ
ＮＡ　１１２をＤＮＡ分解酵素で分解する。フラグメン
トＩ　−ｍ−ＲＮＡ９２．１１０を第１４図工程８ｄに
おいてフラグメント［ＲＮＡ　／　ＤＮＡハイプリドア
８．９８と混合される。

フラグメントＩ　−ｍ−ａＮｐ−９２、ｉｉｏの延長６
′末端とフラグメントＩ［７８の５′末端は、バイブリ
ドのＤＮＡ　９８の延長６′末端によりアラインメント
を形成する。次に工程９ｄにおいてＤＮＡポリメラーゼ
およびＤＮＡ　＋７ガーゼを用い、９２．１１０で表示
したフラグメントｌ　−ｍ−ＲＮＡ分子の６′末端をフ
ラグメン）Ｉ１７８の５′末端に共有結合的に結合させ
る。次にＤＮＡ分解酵素を用いてフラグメントｎＲＮＡ
　／　ＤＮＡハイシリドア８．９８のＤＮＡ　９　（３
を消化させる。フラグメントｌ　−ｍ−ＲＮＡ−フラグ
メント■分子（ｖ−ＲＮＡ）を工程１１ａで、ＴＭＶ外
殻外殻タンパクツ１１２りエンヵプシデイトし、工程１
２．１において、複製および表現のために植物８ または植物細胞中に接種する。表現により少なくとも１
個の遺伝子由来生成物Ｐと少なくともベクター９２．１
１０．７８の部分が生成する。その目的はたとえば以下
に述べるようなものである。

前述のよりに、本発明により作製したＶ　−ＲＮＡ粒子
は挿入遺伝子情報の複製および表現に必要な特徴を有す
る。このＶ−ＲＮＡはウィルスレブリカーゼの合成遺伝
子も含有し、したがって、たとえばタバコ中で完全ＴＭ
Ｖとの共感染の必要なく複製されることができる（例１
で作製された’ｉ’−ＲＮＡはレプリカーゼ遺伝子を含
まないので、複製のためのＴＭＶの共感染が必要である
）。挿入ｍ−ｐ、ＮＡ（外性遺伝子情報）の表現は、例
１に示したと同じ過程をとり、たとえばＴＭＶによるタ
バコの感染中に合成される生成外殻タンパク質に相当す
る生成物を生じる。

例２に示したフラグメントＩおよびＨの製造力９ 法は適宜変更が可能で、ＴＭＶ　−ＲＮＡの任意の場所
から所望のフラグメントを得ることができる。たとえば
、この方法で以下のフラグメントが作製できる。

また、この方法では、ベクターＲＮＡ内の任意の場所に
外性遺伝情報を挿入することができる。例１では挿入場
所を、制限エンドヌクレアーゼ部位例１におけるように
、外殻タンパク質遺伝子への外性遺伝情報の挿入は機能
性外殻タンパク質の産生を防止する。例２で産生される
Ｖ　−ＲＮＡはウィルスレブリカーゼ産生のために完全
ＴＭＶによる共感染を必要としないので、機能性の外殻
タンパク質は産生されず、したがって、Ｖ　−ＲＮＡは
粒子型にエンカプシデイトされることがない。Ｖ　−Ｒ
ＮＡの回収には全Ｒ，ＮＡの単離と、ついでＴＭｖ外殻
タンパク質による接種が必要である。Ｖ−ＲＮＡＦｉ特
異的にエンカプシデイトされ（ＮＲ配列を含むために）
、生成Ｖ　−ＲＮＡ粒子が常法により単離できる。植物
または植物細胞中にベクター粒子を生成させるために、
完全ＴＭＶを共感染させる別法もある。いずれの方法で
産生じた粒子でも、将来、植物または植物細／ン 胞中で複製させ、また外性遺伝情報を表現させるために
保存することが可能である。

ＲＮＡ植物ウィルスの例 １、　タバコラドルウィルス ２、　タバコモザイクウィルス ６、　ポテトウィルスＸ ４、　　カーネーションラテントウイルス５、　ポテト
ウィルスＹ ６、　アルファルファモザイクウイルスＺ　ビーエネイ
ションモデイクウイルス８、　キュウリモザイクウィル
ス ９、　カブ黄色モザイクウィルス １０、　　カラビーモザイクウィルス １１、　　タバコリングスポットウィルス１２゜　タノ
々コネクロシスウイルス １３、　　ブロウムモザイクウイルス １４、　　トマトソツシースタントウイルス１５、トマ
トスポツテツドウイルトウイルス３ コモンモザイク［ｖｕｌｇａｒ（Ｕｌ）　］　　　　ト
トマトオーキューバずイク（ＹＡ）　　　　　　タバコ
キューリモザイク３　（Ｃ１，’３）　　　　　　キュ
ーリキューリモザイク４　（ＯＶ’４）　　　　　　キ
ューリダーレメンス　　　　　　　　　　　　トマトホ
ルムスリブグラス（ＨＲ）　　　　　　　オオバコザウ
デンサンヘンプモザイク（ＳＳＭ）　　　　　サンヘン
プマイルドモザイク（Ｕ２）　　　　　　　　　タバコ
オドントグロサムリングショット（ＯＲ８Ｖ）　　ラン
（Ｕ５）　　　　　　　　　　　　　　　　　タバコ（
ＯＭ）　　　　　　　　　　　　　　　　タバコカラピ
ー（ＯＰＶ）　　　　　　　　　　　　ササゲ豆すモン
ズオパンシア（ｓｏｙ）　　　　　　カクタス黄色トマ
ト非定型モデイク（Ｙ−ＴＡＭＶ）　　　　トｆｆ　ト
緑色トマト非定型モデイク（Ｇ−ＴＡＭＶ）　　　　ト
ｆｆ　ト（ａｖ−６０）　　　　　　　　　　　　　　
　　トマト（Ｃｖ−６１）トマト アメリカコレクション９　号（ＡＣ−９）　　　　　ト
マトホーループビスＣＨＤ）　　　　　　　　）マＩ゛
サンジャキン（ｓ、ｙ）　　　　　　　　　トマトペン
ツラ（ｖＥＮ）トマト オーストラリアｌ　（Ａｕｓ−１）　　　　　　トマト
オランダ１（Ｄｕｔ−１）　　　　　　　　トマト（Ｋ
−１）　　　　　　　　　　　　　　　　）マド（ＰＴ
Ａ）　　　　　　　　　　　　　　　　トマトフイリツ
ビン（ＰＴＶ）　　　　　　　　　　）マトサウスアフ
リカン（ＳＡＦ）　　　　　　　トマトキュウリ緑色モ
トル　　　　　　　　キュウ１ノモザイク（ＯＧＭＭＶ
　） （０１〜０７）　　　　　　　　　　　　ラン（Ｂ−Ｔ
ＭＶｌおよび２）　　　　　　　　ナシ黄色葉Ｇ、Ｐ、
（ＹＬＧＰ）　　　　　　　　　　トマト本発明の望ま
しい特徴は次のとおりである。

１、　本発明により、前述のように作製されたＲＮＡベ
クターは挿入した外性遺伝情報の複製および表現を指向
する。このような挿入は外殻タンノぐり質遺伝子に行わ
れるので、挿入遺伝子生成物は感染過程で完全ＴＭＶに
よって合成される外殻タンパク質の収量に匹敵する収量
で合成される。この場合の収量は葉組織１ゆ（生重量）
に対し外殻タンパク質１〜１０ｇの範囲である。これら
の収量を公知のＤＮＡプラスミド／バクテリア系におけ
る収量と直接比較することはできないが、以下のように
２つの系での期待される収量を概略比較することはでき
る。

タバコ植’Ｊｈ　中ＲＮＡベクター（タバコ中で得られ
るＴＭＶ外殻タンパク質の収量に対する生成物の収量） １０７ウイルス粒子／葉細胞×１０３外殻タンパク質分
子／ウィルス粒子−１０１０外殻タンパク分子／細胞 １０１０外殻タンパク質分子／細胞×１０６細胞／ｇ（
生重量）葉組織−１０６外殻タンパク質分子／ｇ葉組織 １０１６外殻タンパク質分子／ｇ葉組織×１０３ｇ／Ｈ
＝　１０１９外殻タンパク質分子／ゆ葉組織６ フエロンまたは１０５イ゛ンシユリン分子／細胞（Ｎ、
　Ｗａａｅ　：　５ｃｉｅｎｃｅ　２０８　：１４４１
．１９８０およびり、　Ｇｏｅｄａｅｌらｇ’　Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａａ、　８ｃ１７６：１０６〜１
１０．１９７９参照）に基づく収量〕 １０８バクテリア／ｍＸ１０５インターフェロン（イン
シュリン）分子／細胞＝１０３分子／１１０１３分子／
ＩＬｌｘ　１０３ｒＩＬｅ／　Ａ　＝　１０”分子／Ｌ
２、工業的に応用できる生成物の多くは真核性遺伝子の
生成物である。これらの遺伝子のＤＮＡプラスミド／バ
クテリア系（原核性）における表現にはすでに問題が提
起されている。バクテリア中での表現による真核性遺伝
子の生成物がバクテリアプロテアーゼによって分解され
ることも報告されている。本発明のＲＮＡベクター／植
物系は真核系であり、したがって挿入される真核性遺伝
子、およびその生成物と適合性がある。

３、　　ＤＮＡプラスミド／バクテリア系中で産生され
る真核性遺伝子の生成物には不完全なものがあ７ る。たとえば、バクテリア系で合成されるインターフェ
ロンおよび抗体分子はグリコジル化（タンパク質に添加
される特異的糖分子）されていない。

この種の添加は真核細胞中の小胞体系で起こる。

バクテリアはこのような系を欠いているが、植物細胞中
には存在する。

４、本発明におけるＲＮＡベクターは室温（２５°Ｃ）
または室温付近で機能する。バクテリア系は３７°Ｃで
機能する。不安定なタンパク質等は、バクテリア系の場
合よりも、ＲＮＡベクター／植物系で採用される温度で
より安定と思われる。

５、バクテリアにより毒性化合物または発熱性化合物（
ポリサッカライド）がしばしば生成する。

生成物をヒトに応用する場合には、この種の化合物を生
成物から完全に除去しなげればならない。

このような化合物の存在は本発明のＲＮＡベクター／植
物系でははるかに少なくなる。

６、本発明のＲＮＡベクターが動物またはバクテリア細
胞中で複製されることは知られていない。

したがって、　ＤＮＡプラスンド系の場合に比し、バク
チリア公害が起こる可能性もはるかに低い。エンカプシ
デイションに必要な核形成領域の除去により生物学的抑
制因子も有意に増大する。本発明のベクターＲＮＡは、
ウィルスタンパク質によってエンカプシデイトされない
と、植物細胞外では生存できない。したがって、意に反
した漏洩の可能性もさらに低下する。

本発明の利用例を挙げれば次のとおりである。

１、　本発明のＲ１１Ａベクター／植物系はＤＮＡプラ
スミド／バクテリア系とほぼ同範囲への応用の可能性を
もっている。たとえば、タンパク質、酵素、抗体、ホル
モン（インシュリン、ソマトスフチン、生長ホルモン）
、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、抗原性タンパク質
、抗ウイルス性化合物（インターフェロン）、−次およ
び二次代謝物等である。

２、本発明のＲＮＡベクター／植物系は、植物または植
物細胞中における一次および二次生成物の合成および蓄
積に必要な酵素の合成を目的として、植物または植物細
胞の代謝を変更させることに応用できる。

３、本発明のＲＮＡベクターは植物の有利な変更、たと
えば止置習性、収量、エネルデー利用性の変化を生じる
ように、植物または植物細胞の代謝を変えるのに応用で
きる。

４、本発明のＲＮＡベクターは植物の疾病抵抗性の改良
、また環境ストレス状態（冷害、塩害等）に対する抵抗
性の改良に直接応用することかできる。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は完全なＴＭＶおよび関連ウィルス
棟の複製に関する基本工程を示すフローダイアグラムで
ある。第６図はＴＭＶおよび関連ウィルス種の複製がど
のように進むと考えられるか、また６′末端への遺伝情
報の添加が複製に対してどのように作用するかについて
の可能性を例示したダイアグラムである。第４図は植物
ウィルスベクターまたはその部分の作製に用いられる、
’Ｉ’ＭＶおよび関連ウィルス揮からのヌクレオチド配
列（フラグメントｌおよび■）をダイアグラムとして示
０ した図である。第５図はＴＭＶおよび関連ウィルス種か
ら外殻タンパク質遺伝子の少なくとも一部分の除去によ
るＲＮＡ植物ウィルスベクターの少なくとも一部分の作
製および上記遺伝子またはその部分を所望の生成物の合
成暗号であるＲＮＡヌクレオチド配列による置換工程を
示すフローダイアゲララムである。第６図はウィルス外
殻タンパク質によるＲＮＡベクターまたはその部分のエ
ンカプシデイションを防止するために、核形成領域の少
なくとも一部分を除去した、ＴＭＶおよび関連ウィルス
種からのＲＮＡ植物ウィルスベクターの少なくとも一部
分を作製する工程のフローダイアグラムである。第７図
〜第９図はＴＭＶからの特異的ヌクレオチド配列（フラ
グメン）Ｉおよび■）の生成および単離、ならびにそれ
からのＲＮＡベクターまたはその部分の作製に始まり感
染植物または植物細胞からの複製ベクターまたはその部
分の回収に至るまでのフローダイアグラムである。第１
０図および第１１図は、ＴＭＶから特異的なヌクレオチ
ド配列（フラグメントｌおよび■）の生成および単離、
１ それらからのＲＮＡベクターまたはその部分の作製に始
まり感染植物または植物細胞から復製ベクターまたはそ
の部分の回収に至るまでの別のフローダイアグラムを例
示するものである。第１２図から第１５図までは、ＴＭ
Ｖから特異的なヌクレオチド配列（フラグメントｌおよ
び■）の生成および単離ＳそれらからのＲＮＡベクター
またはその部分の作製に始まり感染植物または植物＃ｌ
Ｉ胞からの複製ベクターまたはその部分の回収に至るま
でのさらに別個のフローダイアグラムである。 代理人　浅　村　　　皓 外４名 Ｘ　　６１　　　　　　　Ｘ’ １ 鷲１１１力 １↓　。−８ユ。。ＧＡＡＣ工。） ２ ＦＲＡンＣＰＧ７゜ 滝１４関 呟　＋５　１ψは） ＪＪ　　　　”　　　　１ノ」　　゛　−〜ノ手続補正
書 昭和５７年　７月９日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和５７年特許願第　９０４８２　　号２・発明０名利
゛８、。植、ライ２．〜２−よ、、、。よその部分の作
製、利用方法 ３、４１ｉ’ｉＴＥをする者 事件との関係　特許出願人 住　　所 ４、代理人 ５、補正命令の日刊 昭和　　年　　月　　日 ６、補正により増加する発明の数 ８、補正の内容　　別紙のとおり ９、添付書類の目録　　同時に出願審査請求書を提出し
てあります。 （１）特許請求の範囲を別紙のごとく訂正する。 （２）　　明細書、１０頁下から２行の「表現」を「発
現」に訂正する。 （３）　　同書、１２頁１１行の「末端と」を「末端は
」に訂正する。 （４）同書、１６頁６行の１配列」を「配列をフラグメ
ント」に訂正する。 ２、特許請求の範囲 （１１ＴＭＶおよび他のＲＮＡ植物ウィルスからＲＮＡ
植物ウィルスベクターまたはその部分を、それに外性遺
伝情報を挿入しこれを植物または植物細胞中に運搬し、
植物または植物細胞中で挿入外性遺伝情報とともに、自
己複製またはヘルパーウィルスとの共接種下の複製によ
って、そのベクターまたは部分を複製および発現させる
ために作製する方法において、ウィルスＲＮＡのプラス
（＋）ストランド５′末端から由来のヌクレオチド配列
とウィルスＲＮＡのプラス（リストランド６′末端から
由来のヌクレオチド配列（以下この種のヌクレオチド配
列をフラグメントと呼ぶ）を結合させ、これらのヌクレ
オチド配列は以下のオリゴヌクレオチドおよびポリヌク
レオチド、すなわち（ａ）以下フラグメントＩと呼ぶ５
′末端由来のフラグメントは６′末端方向に延び、ウィ
ルスＲＮＡのマイナス（−）ストランドでウィルス性ポ
リメラーゼに対する認識および結合部位に相補的なヌク
レオチド配列を有する、（ｂ）以下フラグメン）１１と
呼ぶ６′末端由来のフラグメントは５′末端方向に延び
、ウィルスＲＮＡのプラス（＋）ストランドでウィルス
性ポリメラーゼが認識、結合できるヌクレオチド配列を
有する、（Ｃ）フラグメントＩおよび１の少なくとも一
方は少くともウィルス外殻タンパク質遺伝子の部分を含
む、および（ｄ）フラグメントＩおよび■は単独でまた
は結合して、外殻タンパク質遺伝子の発現を調節するヌ
クレオチド配列を調節領域またはその部分の形で含む：
からなる群から選ばれることを特徴とするＲＮＡ植物ウ
ィルスベクターまたはその部分の作製方法 （２）　　フラグメントＩおよび■ば単独でまたは結合
シテ、ＲＮＡのウィルス外殻タンパク質によるエンカメ
ジディジョンに必要な核形成領域またはその部分を形成
するヌクレオチド配列またはその部分を含むように作製
する特許請求の範囲第１項記載の方法 （３）　ＲＮＡベクターまたはその部分に対して外性遺
伝情報を挿入または付着させ、最終的にはＲＮＡ。 形とすることなさらに包含する特許請求の範囲第１項記
載の方法 （４）遺伝情報は外殻タンパク質遺伝子またはその部分
に挿入または付着させる特許請求の範囲第６項記載の方
法 （５）外性遺伝情報は調節領域またはその部分に挿入ま
たは付着させる特許請求の範囲第６項記載の方法 （６）　　ＲＮＡベクターまたはその部分の核形成領域
またはその部分に外性遺伝情報を最終的にはＲＮＡ０形
で挿入または付着させることをさらに包含する特許請求
の範囲第２項記載の方法 ＋７１　　ＲＮＡ植物ウィルスベクターまたはその部分
は植物または植物細胞への接種により再生させる目的で
生成させる特許請求の範囲第１項または第２項のいずれ
か一つに記載の方法 （８）　　ＲＮＡ植物ウィルスベクターまたはその部分
は、加えた外性遺伝情報とともに、植物筐たは植物細胞
への接種により再生させる目的で生成させろ特許請求の
範囲第６項、第４項、第５項または第６項のいずれか一
つに記載の方法。 （９）　　ＲＮＡ植物ウィルスベクターまたはその部分
は、加えた外性遺伝情報とともに、タンパク質、オリゴ
ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ベゾチド、酵素、抗
体、抗原性物質、抗ウイルス性化合物、抗癌性化合物な
らびに一次まれは二次体謝物の群から選ばれる生成物合
成の指向を目的として、植物丑たは植物細胞への接種に
よって生成させる特許請求の範囲第６項、第４項、第５
項または第６項のいずれか一つに記載の方法 （１０）　　ＲＮＡ植物ウィルスベクターまたはその部
分は、加えた外性遺伝情報とともに、植物捷たは植物細
胞の代謝捷たは分解能を変える目的で、植物または植物
細胞への接種によって生成させる特許請求の範囲第６項
、第４項、第５項または第６項のいずれか一つに記載の
方法 （Ｉ］）　　ＲＮＡ植物ウィルスベクターまたはその部
分は、加えた外性遺伝情報とともに、植物捷たは植物細
胞の生育習性、収穫潜在性、疾病抵抗性、環境ストレス
への抵抗性およびエネルギー利用性の群のうち少なくと
もひとつを改変する目的で、植物または植物細胞への接
種によって生成させる特許請求の範囲第６項、第４項、
第５項または第６項のいずれか一つに記載の方法 Ｑ２１　　ＴＭＶおよび他のＲＮＡ植物ウィルス由来の
ＲＮＡ植物ウィルスベクターまたはその部分であって、
それに外性遺伝情報を挿入し、これを種部または植物細
胞中に運搬し、植物または種部細胞中で挿入外性遺伝情
報とともに、自己複製またはヘルパーウィルスとの共接
種下の複製のためのものであり、ウィルスＲＮＡのプラ
ス（＋）ストランド５′末端から由来のヌクレオチド配
列とウィルスＲＮＡのプラス（＋）ストランド６′末端
から由来のヌクレオチド配列（以下これらのヌクレオチ
ド配列をフラグメントと呼ぶ）からなり、これらのクレ
オチド配列を結合させ、これらの配列は以下のオリゴヌ
クレオチドおよびポリヌクレオチド、すなわち（ａ）以
下フラグメントＩと呼ぶ５′末端由来のフラグメントば
３′末端方向に延び、ウィルスＲＮＡのマイナス（＝）
ストランドでウィルス性ポリメラーゼに対する認識およ
び結合部位に相補的なヌクレオチド配列を有する、（ｂ
）以下フラグメント■と呼ぶ６′末端由米のフラグメン
トは５′末端方向に延び、ウィルスＲＮＡのプラス（＋
）ストランドでウィルス性ポリメラーゼが認識および結
合できるヌクレオチド配列を有する、およびｆｃＪフラ
グメント■および■の少なくとも一方は少なくともウィ
ルス外殻タンパク質遺伝子の部分を含む、（ｄ）フラグ
メントＩおよび■は単独でまたは結合して外殻タンパク
遺伝子の発現を調節するヌクレオチ配列を調節領域また
はその部分の形で含む；からなる群から選ばれるＲＮＡ
　ｉ物つィルスベクター゛またはその部分 （１３）　　ＲＮＡ　ウィルス外殻タンパク質のエンカ
ゾシデイションに必要な核形成領域またはその部分を形
成するヌクレオチド配列またはその部分をさらに含んで
いる特許請求の範囲第１２項記載のＲＮＡ植物ウィルス
ベクターまたはその部分 Ｏａ　　さらに外注遺伝情報の挿入筐たは付着を包合し
、最終的にはＲＮＡ０形をとる特許請求の範囲第１２項
記載のＲＮＡ植物ウィルスベクターまたはその部分 （１５）外性遺伝情報は外被タンパク質遺伝子またはそ
の部分に挿入または付着された特許請求の範囲第１４項
記載の′Ｒ１ＲＮＡ植物ウィルスベクター捷その部分 （国　外性遺伝情報は調節領域またはその部分に挿入ま
たは付着された特許請求の範囲第１４項記載のＲＮＡ植
物ウィルスベクターまたはその部分（１７）核形成領域
またはその部分に外性遺伝情報を最終的にはＦｔＮＡＯ
形で挿入または付着させることなさらに包含する特許請
求の範囲第１６項記載のＲＮＡ植物ウィルスベクターま
たはその部分（Ｉａｌ　　ＲＮＡ植物ウィルスベクター
またはその部分は添加した外性遺伝情報とともに、植物
または植物細胞へ接種して、タンパク質、オリゴヌクレ
オチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、酵素、抗体、抗
原性物質、抗ウイルス性化合物、抗癌性化合物ならびに
一次および二次代謝物の群から選ばれる生成物合成の指
向を目的とした特許請求の範囲第１４項、第１５項、第
１６項または第１７項のいずれか一つに記載のＦｔＮＡ
植物ウィルスベクターまたはその部分 ０［株］　ＲＮＡ植物ウィルスベクターまたはその部分
は添加した外性遺伝情報とともに、植物または植物細胞
へ接種して、植物または植物細胞の代謝または分解能を
変えることな目的とした特許請求の範囲第１４項、第１
５項、第１６項または第１７項のいずれか一つに記載の
ＲＮＡ植物ウィルスベクターまたはその部分 （２ＱＩ　　ＲＮＡ　Ｍ　物ウィルスベクターまたはそ
の部分は加えた外性遺伝情報とともに植物または植物細
胞へ接種して、植物または植物細胞の生育習性、収穫潜
在性、疾病抵抗性、環境ストレスへの抵抗性およびエネ
ルギー利用性の群のうち少なくともひとつを改変するこ
とを目的とした、特許請求の範囲第１４．１５．１６ま
たは１７項のいずれか一つのＲＮＡ植物ウィルスベクタ
ーまたはその部分（２１）　　ＴＭＶおよび他のＲＮＡ
植物ウィルスから由来のＲＮＡ植物ウィルスベクターま
たはその部分に外性遺伝情報を挿入し、このベクターま
たはその部分を挿入した遺伝情報とともに植物捷たは植
物＃ｌ胞中に接種して、植物または植物細胞中で自己複
写またはヘルパーウィルスとの共接種による複写によっ
て遺伝子由来生成物を生成、蓄積させるために、そのベ
クターまたは部分を複写、発現させる遺伝子由来生成物
の製造方法であって、その１（ＮＡ植物ウィルスベクタ
ーまたはその部分はウィルスＲＮＡのプラス（十）スト
ランド５′末端から由来のヌクレオチド配列とウィルス
ＲＮＡのプラス（＋）ストランド６′末端から由来のヌ
クレオチド配列Ｃ以下これらのヌクレオチド配列なフラ
グメントと呼ぶ）からなり、これらのヌクレオチド配列
な結合させ、これらのヌクレオチド配列は以下のオリゴ
ヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、すなわち（ａ）
以下フラグメン）ｌと呼ぶ５′末端由来のフラグメント
は６′末端方向に延び、ウィルスＲＮＡマイナス（−）
ストランドでウィルス性ポリメラーゼに対する認識およ
び結合部位に相補的なヌクレオチド配列を有する、（ｂ
Ｊ以下フラグメント■と呼ぶ３′末端由来のフラグメン
トは５′末端方向に延び、ウィルスＲＮＡの７０ラス（
＋）ストランドでウィルス性ポリメラーゼが認識および
結合できるヌクレオチド配列をゼする、およびＦＣ）フ
ラグメントＩおよび■の少なくとも一万は少なくともウ
ィルス外殻タンパク質遺伝子の部分を富む、および（ｄ
）フラグメントＩおよび■は単独でまたは結合して外殻
タンパク遺伝子の発現を調節するヌクレオチド配列を調
節領域またはその部分の形で含む：からなる群から選ば
れることを特徴とする遺伝子由来生成物の製造方法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　ＴＭＶ　および他のＲＮＡ植物ウィルスから
   ＲＮＡ植物ウィルスベクターまたはその部分を、それに
   外性遺伝情報を挿入しこれを植物才たは植物細胞中に運
   搬し、植物または植物細胞中で挿入外性遺伝情報ととも
   に、自己複製またはヘルパーウィルスとの弁接種下の複
   製によって、そのベクターまたは部分を複製および表現
   させるために作製する方法において、ウィルスＲＮＡの
   プラス（ｌ−）ストランド５′末端から由来のヌクレオ
   チド配列とウィルスＲＮＡのプラス（＋）ストランド６
   味端から由来のヌクレオチド配列（以下この種のヌクレ
   オチド配列を。 フラグメントと呼ぶ）を結合させ、これらは以下のオリ
   ゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、すなわち（ａ
   ）以下フラグメントＩと呼ぶ５′末端由来のフラグメン
   トは６′末端方向に延び、ウィルスＲＮＡのマイナス（
   ハ）ストランドでウィルス性ポリメラーゼに対する認識
   および結合部位に相補的なヌクレオチド配列を有し、（
   １））以下フラグメント■と呼ぶ３′末端由来のフラグ
   メントは５′末端方向に砥料を有し、（Ｃ）フラグメン
   トＩおよび１の少なくとも一方は少なくともウィルス外
   殻タンパク質遺伝子の部分を含み、また（ｄ）フラグメ
   ントＩおよび１は単独でまたは結合して、外殻タンパク
   質遺伝子の表現を調節するヌクレオチド配列を調節領域
   またはその部分の形で含むヌクレオチド配列から選ばれ
   ることを特徴とするＲＮＡ植物ウィルスベクターまたは
   その部分の作製方法 （２）　　フラグメントＩおよび■は単独で才たは結合
   して、　ＲＮＡのウィルス外殻タンパク質によるエンカ
   ゾシデイションに必要な核形成領域またはその部分を形
   成するヌクレオチド配列またはその部分を含むように作
   製する特許請求の範囲第１項記載の方法 （３）　　ＲＮＡベクターまたはその部分に対して外性
   遺伝情報の挿入才たは付着させ、最終的にはＲＮＡ０形
   とすることをさらに包含する特許請求の範囲第１項記載
   の方法 （４）遺伝情報は外殻タンパク質遺伝子またはその部分
   に挿入または付着させる特許請求の範囲第６項記載の方
   法 （５）外性遺伝情報は調節領域またはその部分に挿入ま
   たは付着させる特許請求の範囲第６項記載の方法 （５）　　ＲＮＡベクターまたはその部分の核形成領域
   またはその部分に外性遺伝情報を最終的にはＲＮＡ０形
   で挿入または付着させることをさらに包含する特許請求
   の範囲第２項記釘の方法 （力　ＲＮＡ植物ウィルスベクターまたはその部分は植
   物苗たは植物細胞への接種により再生させる目的で生成
   させる特許請求の範囲第１項または第２項のいずれかに
   記載の方法 （８ｊ　　ＲＮＡ植物ウィルスベクターまたはその部分
   は、加えた外性遺伝情報とともに、植物または植物細胞
   への接種により再生させる目的で生成させる特許請求の
   範囲第６項、第４項、第５項または第６項のいずれかに
   記載の方法 （９１ＲＮＡ植物ウィルスベクターまたはその部分は、
   加えた外性遺伝情報とともに、タンパク質、オリゴヌク
   レオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、酵素、抗体、
   抗原性物質、抗ウイルス性化合物、抗癌性化合物ならび
   に一次または二次代謝物の群から選ばれる生成物合成の
   指向を目的として、植物苗たは植物細胞への接種によっ
   て生成させる特許請求の範囲第６項、第４項、第５項ま
   たは第６項のいずれかに記載の方法 ＱＱＩ　　ＦｔＮＡ　植物ウイルスベクターオたはその
   部分は、加えた外性遺伝情報とともに、植物または植物
   細胞の代謝または分解能を変える目的で、植物または植
   物細胞への接種によって生成させる特許請求の範囲第６
   項、第４項、第５項才たは第６項のいずれかに記載の方
   法 （ｔｌＪ　　ＲＮＡ植物ウィルスベクターまたはその部
   分は、加えた外性遺伝情報とともに、植物または植物細
   胞の生育習性、収＠潜在性、疾病抵抗性、環境ストレス
   への抵抗性およびエネルギー利用性の群のうち少なくと
   もひとつを改変する目的で、植物または植物細胞への接
   種によって生成させる特許請求の範囲第６項、第４項、
   第５項または第６項のいずれかに記載の方法 α２）　　ＴＭＶおよび他のＲＮＡ植物ウィルス由来の
   ＲＮＡ植物ウイつスベクターオたはその部分であって、
   それに外性遺伝情報を挿入し、これを植物苗たは植物細
   胞中に運搬し、植物苗たは植物細胞中で挿入外性遺伝情
   報とともに、自己複製またはヘルパーウィルスとの弁接
   種下の複製のためのものであり、ウィルスＲＮＡのプラ
   ス（＋）ストランド５′末端から由来のヌクレオチド配
   列とウィルスＲＮＡのプラス（利ストランド６′末端か
   ら由来のヌクレオチド配オチド 列（以下これらのヌクレ≠→配列をフラグメントと呼ぶ
   ）からなり、これらのクレオチド配列を結合させ、これ
   らの配列は以下のオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレ
   オチド、すなわち（ａ）以下フラグメント１と呼ぶ５′
   末端由来のフラグメントは６′末端方向に延び、ウィル
   スＲＮＡのマイナス（−）ストランドでウィルス性ポリ
   メラーゼに対する認識および結合部位に相補的なヌクレ
   オチド配列を有し、（ｂ）以下フラグメント■と呼ぶ６
   ′末端由来のフラグメントは５′末端方向に延び、ウィ
   ルスＲＮＡのプラス（−１−）ストランドでウィルス性
   ポリメラーゼが認識および結合できるヌクレオチド配列
   を有し、また（Ｃ）フラグメントＩおよびＨの少なくと
   も一方は少なくともウィルス外殻タンパク質遺伝子の部
   分を含み、（ｄ）フラグメントＩおよび■は単独でまた
   は結合して外殻タンパク遺伝子の表現を調節するヌクレ
   オチ配列を調節領域またはその部分の形で含むヌクレオ
   チド配列から選ばれるＲＮＡ　Ｍ物つィルスベクターオ
   たはその部分 Ｑ３）　　ＲＮＡウィルス外殻タンパク質のエンカプシ
   デイションに必要な核形成領域またはその部分を形成す
   るヌクレオチド配列またはその部分をさらに含んでいる
   特許請求の範囲第１２項記載のＲＮＡ植物ウイつスベク
   ターオたはその部分 ａ力　　さらに外性遺伝情報の挿入才たは付着を包含し
   、最終的にばＲＮＡの形をとる特許請求の範囲第１２項
   記載のＲＮＡ植物ウイつスベクターオたはその部分 （（５）外性遺伝情報は外植タンパク質遺伝子才たはそ
   の部分に挿入または付着された特許請求の範囲第１４項
   記載のＲＮＡ植物ウィルスベクターまたはその部分 （１６）外性遺伝情報は調節領域またはその部分に挿入
   才たは付着された特許請求の範囲第１４項記載のＲＮＡ
   　４１ｆ物ウイルスベクターまたはその部分αη　核形
   成領域才たはその部分に外性遺伝情報を最終的にはＲＮ
   Ａの形で挿入または付着させることをさらに包含する特
   許請求の範囲第１６項記載のＲＮＡ植物ウィルスベクタ
   ーまたはその部分Ｑ、８１　　ＲＮＡ植物ウィルスベク
   ターまたはその部分は添加した外性遺伝情報とともに、
   植物苗たは植物細胞へ接種して、タンパク質、オリゴヌ
   クレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、酵素、抗体
   、抗原性物質、抗ウイルス性化合物、抗癌性化合物なら
   びに一次および二次代謝物の群から選ばれる生成物合成
   の指向を目的とした特許請求の範囲第１４項、第１５項
   、第１６項または第１７項記載のＲＮＡ　ｍ物つィルス
   ベクターまたはその部分α９Ｊ　　ＲＮＡ植物ウィルス
   ベクターまたはその部分は添加した外性遺伝情報ととも
   に、植物または植物細胞へ接種して、植物苗たは植物細
   胞の代謝または分解能を変えることを目的とした特許請
   求の範囲第１４項、第１５項、第１６項または第１７項
   記載のＲＮＡ４１物ウイルスベクターまたはその部分Ｃ
   ２０Ｊ　　ＲＮＡ　＠物つィルスベクターまたはその部
   分は加えた外性遺伝情報とともに植物または植物細胞へ
   接種して、植物または植物細胞の生育習性、収穫潜在性
   、疾病抵抗性、環境ストレスへの抵抗性およびエネルギ
   ー利用性の群のうち少なくともひとつを改変することを
   目的とした、ＲＮＡ植物ウイつスベクターオたはその部
   分 （２］）　　ＴＭＶおよび他のＲＮＡ　Ｍｉ物ウつルス
   ベクターオたはその部分に外性遺伝情報を挿入し、この
   ベクターまたはその部分を挿入した遺伝情報とともに植
   物苗たは植物細胞中に接種して、植物韮たは植物細胞中
   で自己複写またはヘルパーウィルスとの共接種による複
   写によって遺伝子由来生成物を生成、蓄積させるために
   、そのベクターまたは部分を複写、表現させる遺伝子由
   来生成物の製造方法であって、そのＲＮＡ植物ウィルス
   ベクターまたはその部分はウィルスＲＮＡのプラス＠−
   ）ストランド５′末端から由来のヌクレオチド配列とウ
   ィルスＲＮＡのプラス（ト）ストランド６′末端から由
   来のヌクレオチド配列（以下これらのヌクレオチド配列
   をフラグメントと呼ぶ）からなり、これらのヌクレオチ
   ド配列を結合さぜ、これらのヌクレオチド配列は以下の
   オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、すなわち
   （ａ）以下フラグメント１と呼ぶ５′末端由来のフラグ
   メントは６′末端方向に延び、ウィルスＲＮＡマイナス
   （−）ストランドでウィルス性ポリメラーゼ゛に対する
   認識および結合部位に相補的なヌクレオチド配列を有し
   、（ｂ）以下フラグメント１１と呼ぶ６′末端由来のフ
   ラグメントは５′末端方向に延び、ウィルスＲＮＡのプ
   ラス（−１−）ストランドでウィルス性ポリメラーゼが
   認識および結合できるヌクレオチド配列を有し、また（
   Ｑ）フラグメントＩおよび１１の少なくとも一方は少な
   くともウィルス外殻タンパク質遺伝子の部分を含み、（
   ａ）フラグメント１および１１は単独でまたは結合して
   外殻タンパク遺伝子の表現を調節するヌクレオチド配列
   を調節領域またはその部分の形で含む配列から選ばれる
   ことを特徴とする遺伝子由来生成物の製造方法