JPH11509311A - 電気化学電池 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ここには、作用電極と、この作用電極から所定距離隔たった対電極とを包含する種類の電気化学電池においてレドックス・スペシーズの還元形態（または酸化形態）の濃度を測定する方法であって、（１）電極間に電位差を印加する段階と、（２）スペシーズの還元形態の電気酸化（または酸化形態の電気還元）の率を拡散制御するように作用電極の電位を選定する段階と、（３）対電極からの反応生成物が作用電極に到達するように作用電極と対電極の間隔を選定する段階と、（４）電位の印加後で、安定状態の達成前に時間関数として電流を測定する段階と、（５）安定状態電流の大きさを判断する段階と、（６）電流経時変化および安定状態電流の大きさから、拡散係数またはスペシーズの還元形態（または酸化形態）の濃度あるいはこれら両方を示す値を得る段階とを包含することを特徴とする方法が開示してある。ここにはまた、電気化学電池においてレドックス・スペシーズの濃度を測定する装置であって、作用電極および対電極（または対／参照電極）を有する電気化学電池と、前記電極間に電位差を印加する手段と、経時電流変化を測定する手段とを包含する装置において、作用電極が５００μｍ未満だけ対電極から隔たっていることを特徴とする装置も開示してある。

Description

【発明の詳細な説明】 名称：電気化学電池 発明の分野 本発明は、バイオセンサ、一層詳しくは、キャリヤ内の検体の濃度を測定する 電気化学バイオセンサに関する。本発明は、特に、血液中のグルコースの濃度を 測定するのに有用であり、ここではその用途について説明するが、本発明が他の 分析測定にも適用可能であることは了解されたい。 発明の背景 電気化学バイオセンサは、一般的には、作用電極、対電極、参照電極を有する 電池を包含する。時には、対電極と参照電極の機能を「対／参照」電極または「 疑似参照電極」と呼ばれる単一の電極にまとめることもある。ここで使用する「 対電極」という用語は文脈上認められる場合には対／参照電極を含む。 検体を含むサンプルは電池内の酵素、レドックス・メディエイタを含む試液と 接触させられる。メディエイタが還元される（少なくとも１つの電子を受け取る ）一方で、検体が酸化される（少なくとも１つの電子を失う）か、あるいは、こ の逆の反応が行われる。通常、酸化されるのは検体であり、還元されるのはメデ ィエイタである。本発明は、ここでは原則としてこのようなシステムについて説 明するが、検体が還元され、メディエイタが酸化されるシステムにも適用可能で ある。 血液グルコース・レベルを監視するために糖尿病患者に使用されたり、診療所 、病院で使用されたりするような電気化学グルコース分析器は、普通、グルコー スオキシダーゼデヒドロゲナーゼ（ＧＯＤ）のような酵素や、フェリシアニドあ るいはフェロシアニドのようなレドックス・メディエイタを使用することを基本 とする。このような従来のシステムでは、検体（たとえば、グルコース）を含有 するサンプル（たとえば、血液）は電池内の試液と接触させられる。グルコース は酸化されてグルコン酸となり、それによって、グルコースオキシダーゼが還元 される。次に、メディエイタがグルコースオキ シダーゼを再度酸化させ、還元される。還元されたメディエイタは、電子を作用 電極に移送するときに再酸化させられる。ファラデー電流の正確な評価を得るに 充分な所定時間の経過後、グルコースの濃度が電流の大きさあるいは次に測定さ れた電圧の大きさから推断される。 従来の電気化学電池は２つ（または３つ）の隣接した電極からなり、これらの 電極は絶縁体の片側で互いに隔たっており、測定装置に接続できるようになって いる。血液サンプルを置くターゲット領域が電極上あるいはそれらの間に構成し てある。審査中の出願PCT/AU95/00207が多孔性膜の両側に電極を配置し、電極の １つが液体透過性ターゲット領域を有する電池を記載している。 従来技術では、作用電極を対電極（または対／参照電極）から充分に離し、１ つの電極での電気化学反応の生成物が他方の電極のところでの生成物と干渉しな いようにする必要がある。実際、許容できる精度を得るには、電極が５００μｍ より大きく分離している必要がある。 電池の各バッチは、予め較正しておかなければならない。サンプル成分や周囲 条件に応じて、バッチの変動のために精度を得られないことがある。 このようなバイオセンサの精度、信頼性を向上させることが望まれる。この目 的の達成は、血液内の検体の濃度を測定することを意図したセンサの場合、血液 が溶解ガス、イオン、コロイド、コンプレックス・ミセル、小規模細胞破片、主 水性媒体内の生きている細胞成分を含んでいるために、難しい。これらのうちい ずれもが測定の邪魔となる可能性がある。現存のセンサは、また、サンプル内に 存在する可能性があり、作用電極のところで酸化させられて、当該検体と誤って 識別される可能性のある他の妨害物質からの影響も受けやすい。あるいは、妨害 物質はレドックス・メディエイタの酸化形態を還元する可能性がある。これらの 影響は検体濃度の推定値を人工的に高めることになる。これに加えて、常に、検 体を加える前に若干の還元したレドックス・メディエイタが存在し、その濃度を 知っていて、還元メディエイタの測定値から引いて、検体の正確な濃度を求める 必要がある。さらに、血液中の酸素も、フェロシアニドと競合して、グルコース オキシダーゼデヒドロ ゲナーゼ（ＧＯＤ）に対するレドックス・メディエイタとして作用する。こうし て、高い酸素濃度がグルコース濃度の推定値を低下させる可能性がある。さらに 、測定値は、湿度、温度、溶液粘度、ヘマトクリット値の変化のようなファクタ に敏感である。 発明の目的 本発明の目的は、分析方法および従来技術の欠点のうちの少なくともいくつか を回避あるいは改善する、この方法で使用する装置を提供することにある。本発 明の好ましい形態の目的は、精度、信頼性、速度のいずれかあるいはすべてを向 上させたバイオセンサおよびそれを使用する方法を提供することにある。 発明の開示 一特徴によれば、本発明は、作用電極およびこの作用電極から所定距離隔たっ た対電極とを包含する種類の電気化学電池においてレドックス・スペシーズの還 元（または酸化）形態の濃度を測定する方法であって、 （１）電極間に電位差を印加する段階と、 （２）スペシーズの還元形態の電気酸化（または酸化形態の電気還元）の率を 拡散制御するように作用電極の電位を選定する段階と、 （３）対電極からの反応生成物が作用電極に到達するように作用電極と対電極 の間隔を選定する段階と、 （４）電位の印加後で、安定状態の達成前に時間関数として電流を測定する段 階と、 （５）安定状態電流の大きさを判断する段階と、 （６）電流経時変化および安定状態電流の大きさから、拡散係数またはスペシ ーズの還元形態（または酸化形態）の濃度あるいはこれら両方を示す値を得る段 階と を包含する方法にある。 このようにして測定した濃度は、もしあるとして還元形態の拡散係数における 変動からほぼ独立しており、したがって、温度および粘度における変動について 補正される。こうして測定した濃度は、レドックス・スペシーズの 還元形態の拡散係数に影響を与えるヘマトクリットその他の物質における変動か ら独立している。 ここで、本発明の方法が電池内でレドックス・スペシーズの還元形態あるいは レドックス・スペシーズの酸化形態の濃度を測定するのにも同等に適用可能であ ることは了解されたい。還元形態の濃度を測定しようとしている場合、作用電極 の電位は、還元形態の電気酸化の率を段階（２）で拡散制御し、段階（５）で得 られる還元形態の濃度となるように維持しなければならない。酸化形態の濃度を 測定しようとしている場合には、作用電極の電位は、酸化形態の電気還元の率を 段階（２）で拡散制御し、段階（５）で得られる酸化形態の濃度となるように維 持しなければならない。 レドックス・スペシーズは検体であってもよいし、レドックス・メディエイタ であってもよい。 本発明の好ましい具体例では、メディエイタを用い、このメディエイタの還元 形態（または酸化形態）の濃度が検体の濃度を示し、メディエイタの還元形態（ または酸化形態）の拡散係数の値が検体濃度の測定に対する前駆値として測定さ れる。 なるべくなら、電池は作用電極と対／参照電極とを包含する。対電極から分離 した参照電極を用いる場合には、参照電極を任意都合の良い場所に置き、そこに おいてセンサ内のサンプルと接触させてもよい。 従来技術と異なり、本発明の方法を導入するとき、電極は充分に接近しており 、対電極のところでの電気化学反応の生成物はテスト期間中に作用電極に移動す る。たとえば、酵素フェリシアニド系においては、対電極のところで生じたフェ ロシアニドは作用電極に向かって拡散する。 これにより、電極間に安定状態濃度分布が達成され、安定状態電流を得ること ができる。これは、順次、サンプル変動から独立してレドックス・スペシーズ（ メディエイタ）の拡散係数および濃度を測定するのを可能とし、したがって、精 度、信頼性を大きく向上させる。 この方法は、また、ルックアップ・テーブルを使用することによって（あるい は、血漿から赤血球を分離し、赤血球部分の拡散係数を測定することに よって）赤血球部分と血漿部分とを比較して拡散係数から血液ヘマトクリット濃 度を測定することも可能とする。 第２の特徴によれば、本発明は、電気化学電池においてレドックス・スペシー ズの濃度を測定する装置であって、 作用電極および対電極（または対／参照電極）を有する電気化学電池と、 前記電極間に電位差を印加する手段と、 電流経時変化を測定する手段と を包含する装置において、作用電極が対電極から５００μｍ未満隔たっているこ とを特徴とする装置にある。 好ましい具体例において、電池の有効容積は１．５マイクロリットル以下であ る。本発明で使用するための装置は、多孔性膜と、この膜の片側にある作用電極 と、反対側にある対／参照電極とを包含し、前記電極がそれらの間の膜ゾーンと 共に電気化学電池を構成しており、膜が電池から側方へサンプル堆積領域まで延 びており、このサンプル堆積領域が膜の厚さよりも大きい距離だけ電池ゾーンか ら隔たっていることを特徴とする装置にある。 好ましくは、多孔性膜、電池部分からのターゲット領域の距離および膜の厚さ は組み合わせて選定し、血液（血漿と赤血球を含む）をターゲット領域に置いた ときに、血漿が赤血球よりも進んで電気化学電池ゾーンに向かって側方へフロン ト拡散するようにする。 こうして、薄層電気化学電池をほとんどヘマトクリットのない血漿で満たすこ とが可能となる。ヘマトクリットは、レドックス・メディエイタの拡散係数の変 化を生じさせ、後に説明するようにテストの精度に影響を与えることになる。 本発明のバイオセンサの好ましい具体例において、膜の第２電気化学電池ゾー ンが、第２作用電極とこの第２作用電極とは膜の反対側にある第２対／参照電極 とによって構成される。第２電気化学電池ゾーンは、第１電池ゾーンとサンプル 堆積領域すなわち「ターゲット」領域との間に位置していてもよいし、ターゲッ ト領域の第１電気化学電池ゾーンとは反対の側に位置してもよい。これらの具体 例において、血漿は第１電気化学電池内の酵素と接触 するかあるいは第１電気化学電池への途中にあり、血漿が第２電池に到達するこ とはない。こうして、使用時、第１電池が血漿（電気化学的妨害物質を含む）お よび酵素の存在の下に還元メディエイタの濃度を測定する一方で、第２電気化学 電池が血漿（電気化学的妨害物質を含む）の存在の下、酵素のない状態で、還元 メディエイタの濃度を測定する。これにより、第２電池において還元妨害物質の 濃度を測定し、第１電池において還元妨害物質および検体の濃度を測定する。一 方の値を他方の値から引き算することによって、検体の絶対濃度を得ることがで きる。 本発明の非常に好ましい具体例では、中空の電池を使用する。この場合、作用 電極および参照電極（または対／参照電極）は５００μｍ未満、好ましくは２０ 〜２００μｍ互いに隔たる。 図面の説明 以下、添付図面を参照しながら本発明を具体例によってより詳しく説明する。 第１図は、本発明による第１具体例の概略側面図（縮尺は合わせてない）であ る。 第２図は、第１図の具体例の頂面図である。 第３図は、第１図の具体例の底面図である。 第４図は、第１図の具体例の端面図である。 第５図は、本発明による第２具体例の概略側面図（縮尺は合わせてない）であ る。 第６図は、第５図の具体例の頂面図である。 第７図は、本発明による第３具体例の概略側面図（縮尺は合わせてない）であ る。 第８図は、第７図の具体例の頂面図である。 第９図は、本発明の第４具体例の概略頂面図（縮尺は合わせてない）である。 第１０図は、第９図の具体例の端面図である。 第１１図は、第９図の具体例の側面図である。 第１２図は、本発明による中空電池具体例の概略横断面図（縮尺は合わせてな い）である。 第１３図は、本発明による方法を導入するに際しての電流（縦軸）対時間（横 軸）のプロットを示すグラフである。 第１４図は、本発明の方法を説明するのに使用する別のグラフである。 第５〜１２図において、第１〜４図の具体例の構成要素とに機能で対応する構 成要素は同一の符号または記号が付けてある。 好ましい具体例の説明 第１〜４図を参照して、ここには、本発明の装置の第１具体例が示してあり、 この場合、装置は血液中のグルコースを測定するバイオセンサである。この具体 例は、上下の表面２、３を有する薄いストリップ状の膜１を包含する。膜は、上 面２に配置した作用電極５と下面３に配置した対電極６との間に構成された電池 ゾーン４を有する。この膜の厚さは、電極が距離「ｌ」だけ分離するように選定 する。この距離「ｌ」は対電極のところでの電気化学反応の生成物がテスト期間 中に作用電極に移動し、安定状態拡散分布が充分に達成されるに充分な程度に短 い。代表的には、「ｌ」は５００μｍ未満である。サンプル堆積領域すなわち「 ターゲット」領域７が膜１の上面２に構成してあり、この領域は電池ゾーン４か ら膜厚さよりも大きな距離隔たっている。膜１はターゲット領域７と電池ゾーン ４の間に延在する拡散ゾーン８を有する。レドックス・メディエイタ「Ｍ」、酵 素「Ｅ」およびｐＨバッファ「Ｂ」を包含する適当な試液が、膜の電池ゾーン４ 内あるいは電池ゾーン４とターゲット領域７の間またはこれら両方に含まれてい る。試液は安定剤などを含んでいてもよい。 或る場合には、酵素、メディエイタ、バッファを膜の異なったゾーンに置くと 好ましい。たとえば、メディエイタを最初に電気化学電池ゾーン４内に置き、酵 素をターゲット領域７の下あるいは拡散領域８に置いてもよい。 ｐＨが低いときにはヘモグロビンが排出し、ｐＨが高いと、かなり強固に酸素 と結合する。酸素はグルコースオキシダーゼデヒドロゲナーゼ（ＧＯＤ）に対す るレドックス・メディエイタとして作用する。グルコース・センサ においては、これはレドックス・メディエイタと競合し、グルコース濃度の測定 値が低くなる。したがって、所望に応じて、第１ｐＨバッファをターゲット領域 ７付近に含ませてすべての酸素がヘモグロビンに結合するレベルまでｐＨを上昇 させるとよい。このｐＨは、ＧＯＤ／グルコースの運動学にとっては不適であり 、テストの速度、感度にとって有害となろう。本発明の好ましい具体例では、第 ２のｐＨバッファを作用電極付近で試液として含ませ、ｐＨを運動学的に最適な レベルに復帰させる。第２バッファを使用しても、ヘモグロビンが血液細胞内に 含まれているときに酸素がヘモグロビンから放出されることはない。血液細胞は 、血液ターゲット領域７付近に保持されるか、あるいは、血漿と比較して拡散放 出され、したがって、第２バッファによって影響を受けない。こうして、酸素の 妨害をかなり減らすか、なくすことができる。 センサの使用にあたっては、測定しようとしている或る濃度のグルコースを含 む血液のドロップをターゲット領域７に置く。血液成分は電池ゾーン４に吸い上 げられ、血漿成分は赤血球細胞よりも急速に拡散し、血漿フロントが赤血球細胞 よりも先に電池ゾーン４に到達する。 血漿が吸い上げられて試液と接触すると、試液は溶解し、反応が生じて検体を 酸化させ、メディエイタを還元させる。この反応を完了する所定の時間後、電位 差が作用電極と対電極の間に印加される。作用電極の電位は充分に陽極性に保た れ、作用電極のところでのメディエイタの還元形態の電気酸化率は作用電極への メディエイタの還元形態の拡散率によって決まり、電極／溶液界面を横切る電子 移動速度によっては決まらない。 加えて、対電極のところでのメディエイタの酸化形態の濃度は、充分なレベル に維持され、電流が電気化学電池内を流れるとき、対電極の電位、したがって、 作用電極の電位は或る程度まで陰極方向にシフトされず、作用電極の電位はもは や拡散制御領域にはない。すなわち、対電極のところでの酸化形態の濃度は作用 電極のところでのメディエイタの還元形態の拡散制御電気酸化を維持するに充分 でなければならない。 薄層電池の動作は、レドックス・カップルの酸化、還元両形態が存在する 場合に、最終的には電池を横切って安定状態濃度分布が確立されるような動作で ある。これが安定状態電流を生じさせる。安定状態電流の測定値を安定状態が達 成される前の電流過渡状態において電流が変化する率と比較することによって、 レドックス・メディエイタの拡散係数を濃度と共に測定することができる。 一層詳しく言えば、この状況について拡散式を解くことによって、限られた時 間にわたってｌｎ（ｉ／ｉ^∞−１）対時間（秒）のプロットが扇形であり、−４ π²Ｄ／ｌ²に等しい勾配（Ｓで示す）を有することを示すことができる。ここで 、「ｉ」は時刻「ｔ」での電流、「ｉ^∞」は安定状態電流、「Ｄ」は拡散係数（ ｃｍ²／ｓｅｃ）、「ｌ」は電極間の距離（ｃｍ）、「π」は約3.14159である。 電位を電極間に印加したときに存在する還元メディエイタの濃度は２π²ｉ^∞／ ＦＡｌＳで与えられる。ここで、「Ｆ」はファラデー常数、Ａは作用電極面積で あり、他の記号は上記と同じである。この後者の式でＳを用いるとき、それは拡 散係数の測定値を含む。 ｌが所与の電池についての常数であるから、時間およびｉ^∞の関数としてのｉ の測定値は、レドックス・メディエイタの拡散係数値の計算および検体の濃度測 定を可能とする。 さらに、検体濃度の測定は作用電極のところで電気酸化あるいは電気還元され るスペシーズの拡散係数についてのいかなる変化も補正する。拡散係数値の変化 は、溶液の温度、粘度の変化あるいは膜透過性の変化の結果として生じる可能性 がある。電池幾何学構成の変化、酵素化学への変化あるいは測定濃度に影響する 可能性のある他のファクタを説明するには濃度測定値に対する他の調整が必要で あるかもしれない。ヘマトクリット（もしこれが存在すると、レドックス・メデ ィエイタの拡散係数に変化を生じさせる）がほとんどない血漿に測定を行う場合 には、本方法の精度はさらに向上する。 電極５、６の各々は予め定義した面積を有する。第１〜４図の具体例において は、電池ゾーン４は、電極５、６の縁と一致する膜の縁９、１０、１１によって 、および、電極の前縁（ターゲット領域７に対して）１２、１３によって構成さ れる。本具体例では、電極は約６００オングストロームの厚さ を有し、１〜５ｍｍの幅を有する。 オプションとして、膜の両面を、ターゲット領域７を除いて、積層１４（平面 図では省略している）で覆う。この積層はサンプルからの水の蒸発を防ぐと共に 装置への機械的な頑丈さを与えるのに役立つ。水の蒸発は、それがサンプルを濃 縮し、電極を乾燥させ、溶液を冷却し、拡散係数に影響を与え、酵素の運動を遅 らせるので望ましくないが、拡散係数は上記の通りに推断できる。 第５、６図に示す本発明の第２具体例は、第２作用電極２５とそれとの間で第 ２電池ゾーン２４を構成する対／参照電極２６とを含むという点で第１具体例と 異なる。これらの電極も本具体例では５００μｍ未満隔たっている。第２電極２ ５、２６は電池ゾーン４とターゲット領域７の間に設置される。この具体例では 、レドックス・メディエイタは、ターゲット領域７の下あるいはそれに隣接して あるいはターゲット領域７と第１電池ゾーン４の間で膜に含まれる。酵素は第１ 、第２の電池ゾーン４、２４において膜に含まれる。酵素が第２電池２４内に延 びることはない。この場合、血液をターゲット領域に加えたとき、それはレドッ クス・メディエイタを溶解する。これは膜に沿って吸い上げられ、その結果、第 ２電気化学電池２４がレドックス・メディエイタ検体を含み、電気化学的妨害物 質を含む漿液を含むことになる。第１電気化学電池はメディエイタ、検体、電気 化学的妨害物質を含む漿液、酵素を受け取る。次に、作用電極、対電極（単数ま たは複数）両電極間に電位が印加されるが、経時電流変化は各対に対して個別に 測定される。これにより、検体の存在しない状態の還元メディエイタの濃度プラ ス第２電気化学電池における電気化学的妨害物質の濃度および第１電気化学電池 におけるこれらプラス検体の濃度を測定することができる。一方の値から他方の 値を引き算することにより、検体の絶対濃度を得ることができる。 同じ利益が第７、８図の具体例において異なった幾何学的配置によって達成さ れる。この具体例において、第２作用電極および第２対／参照電極は、ターゲッ ト領域７の、第１電気化学電池４とは反対の側で第２電池２４を構成する。この 場合、酵素はターゲット領域と電池１の間で膜ストリップに含 ませてもよい。レドックス・メディエイタは、ターゲット領域付近あるいはター ゲット領域と各電池の間にあってもよい。メディエイタの拡散係数は不溶解酵素 によって低下し、第７、８図の配置は薄層電池の外に酵素を保つという利点を有 し、より急速なテストを可能とする（より急速に安定状態電流に達したとき）。 さらに、レドックス・メディエイタの拡散常数は両薄層電池で同じであり、精密 な妨害の減少が可能である。 第１〜８図の具体例は一体のセンサであるが、第９〜１１図の具体例に示すよ うに複数のセンサを単一の膜上に形成することもできることは了解されたい。こ の場合、１つのセンサの電極は隣のセンサの電極に導電接続される。センサを連 続的に用いて使用後ストリップから切断してもよい。 第９〜１１図の具体例において、電極寸法は拡散方向（矢印によって示す）に おいて電極の幅によって定められる。拡散方向に対して横方向における電極の有 効寸法は審査中の出願PCT/AU96/00210により完全に説明されている方法で膜の圧 縮部分１６間に定められる。この出願の開示は全体的に参考資料として援用する 。説明をはっきりさせるために、第１図の積層１４は第９〜１１図からは省略し た。 第１２図の具体例において、ここには本発明による中空の電池が示してあり、 この電池において、電極５、６は間隔を置いたポリマー壁３０によって支持され 、中空の電池を構成している。開口３１が電池の片側に設けてあり、それによっ て、サンプルを空所３２内に入れることができる。この具体例において、膜は使 用されない。先の具体例と同様に、電極は５００μｍ、好ましくは、２０〜４０ ０μｍ、より好ましくは、２０〜２００μｍ互いに隔たっている。有効電池容積 は１．５マイクロリットル以下であると望ましい。 ここで、電極面間に充分に小さい距離を与えるように修正したとしても、本発 明の方法を審査中の出願PCT/AU95/00207に従って構成した電池あるいは他の公知 のデザインの電池で実施し得ることは了解されたい。 本発明の方法を、以下、第１３、１４図を参照しながら更に説明する。 実施例１ １３０ミクロン厚の膜の両面を６０ナノメートル厚のプラチナで被覆した。膜 を圧縮することによって１２．６平方ｍｍの面積を定めた。０．２モルのフェリ シアン化カリウムおよび１重量％のグルコースオキシダーゼデヒドロゲナーゼを 含有する１．５マイクロリットルの溶液を膜の定めた面積に加え、水を蒸発させ た。 次に、カリウム層を作用電極、対／参照電極として使用しようとしているポテ ンシオスタットに接続した。５ミリモルのＤ−グルコースと０．９重量％のＮａ Ｃｌを含有する３．０マイクロリットルの水性溶液を膜の定めた面積に滴下させ た。２０秒経過後、３００ミリボルトの電圧を作用電極と対／参照電極の間に印 加し、０．１秒の間隔でさらに３０秒間記録した。 第１３図は上記測定の基づく電流対時間のグラフである。２６．９マイクロア ンペアの安定状態電流の値を使用して、関数ｌｎ（ｉ／２６．９−１）を計算し 、時間に対してプロットした。グラフ（第１４図）の勾配は−０．３４２であり 、これは毎秒１．５×１０^-6ｃｍ²の拡散係数と、５．０ミリモルの訂正グルコ ース濃度（背景フェロシアニド減算）に対応する。 安定状態電流は、テスト中にさらなる有意の電流変化が生じないものである。 当業者であれば理解できるように、最低電流に達した後、側方拡散、蒸発、妨害 電気化学反応などのようなファクタによるドリフトがある可能性がある。しかし ながら、実際には、「安定状態」電流（ｉ^∞）ｗを測定することは難しい。これ を行う１つの方法としては、ｉ^∞についての初期値を近似する方法である。ｉ対 ｔデータの理論カーブへの適合を用いて、ｉ^∞のより良い測定値を得る。これを 、測定値および近似値が或る許容できる差内に集束するまで繰り返し、評価ｉ^∞ を生成する。 実際に、時刻ｔでの電流ｉの測定は、電位を印加した後に最小時刻ｔｍｉｎと 最大時刻ｔｍａｘの間で行う。最小、最大の時刻は方程式の適用性で決まり、決 まりきった実験によって容易に決定できる。所望に応じて、電圧をオフにし、レ ドックス・スペシーズの濃度分布を初期状態に戻すことによってテストを繰り返 してもよい。 ここで、電流対時刻カーブの分析を行って拡散係数または濃度あるいは両 方の値を得ることが上記の方法に限られるものではなくて他の方法によっても達 成できることは了解されたい。 たとえば、電流対時刻カーブの早期の部分をコットレル式によって分析してＤ^1/2 ×Ｃo(Co ＝ 検体の濃度)の値を得、安定状態電流を分析してＤ×Ｃｏの値 を得ることもできる。これら２つの値を次に比較してＤ、Ｃを別々に得ることが できる。 ここで、本発明の実施にあたって、経時電流変化を示す装置によって電気信号 が発せられる。この信号はアナログ信号でもディジタル信号でもよく、あるいは 、所定時間間隔で発せられる一連の信号であってもよい。これらの信号はマイク ロプロセッサその他の普通の回路によって処理して記憶したアルゴリズムに従っ て必要な演算を行い、拡散係数、検体濃度、ヘマトクリット濃度などをそれぞれ 示す出力信号を発生させてもよい。１つまたはそれ以上のこのような出力信号を アナログあるいはディジタルのディスプレイで表示してもよい。 また、適当な電池デザインによれば、メディエイタを消耗させるのに必要な電 流を測定する消耗電池として電池を作動させることもできる。たとえば、第５図 の具体例において、本発明の方法を、５００μｍ未満隔たった電極５、６を用い て実施してもよい。５００μｍより大きく隔たった電極５、２６を用いて電流測 定式あるいはボルタンメトリー式の消耗測定を行ってもよく、その場合、電極５ 、２６のところで電流測定式に測定されているレドックス・スペシーズ間に干渉 はない。 消耗測定は、本発明の方法による拡散係数の測定前、最中、その後のいずれで 行ってもよい。これにより、精度、再現性をかなり向上させることができる。 上述の具体例において、膜が、特許第4,629,563号、同第4,774,039号に記載さ れている種類の非対称多孔性膜であると好ましい。これら特許は共にその全体を 参考資料としてここに援用する。しかしながら、対称多孔性膜も使用できる。膜 は、シート、チューブ、中空ファイバその他適当な形態を取り得る。 膜が非対称である場合には、ターゲット領域が非対称膜の開きの大きい側にあ ると好ましい。未圧縮時の膜の厚さは２０〜５００μｍであると望ましい。最小 厚さは、速度、感度、精度、コストに合わせて選定する。所望に応じて、ゲルを 用いてヘマトクリットをＧＯＤから分離してもよい。ゲルは電極間あるいはサン プル適用領域と電極の間のスペースまたはこれら両方に存在してよい。 作用電極は任意適当な金属、たとえば、金、銀、プラチナ、パラジウム、イリ ジウム、鉛、適当な合金のいずれかで作る。作用電極は、任意適当な方法、たと えば、スパッタリング、部分真空下蒸発、無電極めっき、電気めっきなどによっ て予形成してもよいし、現場で形成してもよい。適当な非金属導線を電極構造に 用いてもよい。たとえば、ポリ（ピロル）、ポリ（アニリン）、ポルフィリン「 ワイヤ」、ポリ（イソプレン）、沃素でドープしたポリ（シス−ブタジエン）、 「ラダーポリマー」のような導電性ポリマーがある。他の非金属電極としては、 バインダと混合したグラファイトまたはカーボン、あるいはカーボン充填プラス チックがある。In₂O₃またはSnO₂のような無機電極も使用し得る。対／参照電極 は、たとえば、作用電極に類似した構造であってもよい。対／参照電極を形成す るのに水酸化ニッケルあるいはハロゲン化銀も使用し得る。塩化銀も使用できる が、塩素化処理は不要であり、充分な塩素イオンが血液サンプル内に存在する場 合には銀を使用してもよいことは了解されたい。上述の具体例においては作用電 極をバイオセンサの上面に置いて示し、対／参照電極を下面に置いて示したが、 それを逆にしてもよい。 作用電極および対電極（または対／参照電極）はほぼ同じ有効幾何学的面積を 持つものであると好ましい。 別体の参照電極と対電極を用いる場合には、それらを同じ構造としてもよい。 参照電極は任意適当な位置においてもよい。 ここで、上述の一具体例の特徴を別の具体例の特徴と組み合わせてもよいこと は了解されたい。本発明は、酵素とメディエイタの任意特定の組合せに限定され るものではなく、EP0351892などに記載されているような組合せも 使用し得る。本システムを適当な試液の適用および適当な膜選択によってグルコ ース以外の検体（たとえば、コレステロール）を測定するのに使用してもよい。 また、本システムを血液以外の媒質と一緒に用いるようにしてもよい。たとえば 、水中の不純物、たとえば、塩素、鉄、鉛、カドミウム、銅などの濃度を測定す るのに本方法を使用してもよい。 ここに記載した電池はほぼ扁平で平行な電極を持っているが、他の形態も使用 し得ることは了解されたい。たとえば、１つの電極が棒状あるいは針状で、他方 が同心のスリーブであってもよい。 ここに開示した発明概念から逸脱することなく本発明を他の形態で具体化し得 ることは当業者であれば本開示内容から明らかであろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年４月９日 【補正内容】 化形態の濃度は作用電極のところでのメディエイタの還元形態の拡散制御電気酸 化を維持するに充分でなければならない。 薄層電池の動作は、レドックス・カップルの酸化、還元両形態が存在する場合 に、最終的には電池を横切って安定状態濃度分布が確立されるような動作である 。これが安定状態電流を生じさせる。安定状態電流の測定値を安定状態が達成さ れる前の電流過渡状態において電流が変化する率と比較することによって、レド ックス・メディエイタの拡散係数を濃度と共に測定することができる。これは従 来技術で測定されるコットレル（Cottrell）電流と対照的である。センサ電極へ の電位の印加後の既知の時刻にコットレル電流を測定することによっては、製品 濃度×拡散係数の平方根を測定できるだけであり、したがって、拡散係数から独 立してメディエイタの濃度を測定することはできない。 本発明による電池においては、この状況について拡散式を解くことによって、 限られた時間にわたってｌｎ（ｉ／ｉ^∞−１）対時間（秒）のプロットが扇形で あり、−４π²Ｄ／ｌ²に等しい勾配（Ｓで示す）を有することを示すことができ る。ここで、「ｉ」は時刻「ｔ」での電流、「ｉ^∞」は安定状態電流、「Ｄ」は 拡散係数（ｃｍ²／ｓｅｃ）、「ｌ」は電極間の距離（ｃｍ）、「π」は約3.141 59である。電位を電極間に印加したときに存在する還元メディエイタの濃度は２ π²ｉ^∞／ＦＡｌＳで与えられる。ここで、「Ｆ」はファラデー常数、Ａは作用 電極面積であり、他の記号は上記と同じである。この後者の式でＳを用いるとき 、それは拡散係数の測定値を含む。 ｌが所与の電池についての常数であるから、時間およびｉ^∞の関数としてのｉ の測定値は、レドックス・メディエイタの拡散係数値の計算および検体の濃度測 定を可能とする。 さらに、検体濃度の測定は作用電極のところで電気酸化あるいは電気還元され るスペシーズの拡散係数についてのいかなる変化も補正する。拡散係数値の変化 は、 安定状態電流は、テスト中にさらなる有意の電流変化が生じないものである。 当業者であれば理解できるように、最低電流に達した後、側方拡散、蒸発、妨害 電気化学反応などのようなファクタによるドリフトがある可能性がある。しかし ながら、実際には、「安定状態」電流（ｉ^∞）ｗを測定することは難しい。これ を行う１つの方法としては、ｉ^∞についての初期値を近似する方法である。ｉ対 ｔデータの理論カーブへの適合を用いて、ｉ^∞のより良い測定値を得る。これを 、測定値および近似値が或る許容できる差内に集束するまで繰り返し、評価ｉ^∞ を生成する。 実際に、時刻ｔでの電流ｉの測定は、電位を印加した後に最小時刻ｔｍｉｎと 最大時刻ｔｍａｘの間で行う。最小、最大の時刻は方程式の適用性で決まり、決 まりきった実験によって容易に決定できる。所望に応じて、電圧をオフにし、レ ドックス・スペシーズの濃度分布を初期状態に戻すことによってテストを繰り返 してもよい。 ここで、電流対時刻カーブの分析を行って拡散係数または濃度あるいは両方の 値を得ることが上記の方法に限られるものではなくて他の方法によっても達成で きることは了解されたい。−−−−−−−−−−−−−−−−−−

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 トーマス ウィリアム ベック オーストラリア国 エヌエスダブリュー 2765、サウス ウィンザー、ドラムモンド ストリート 31 (72)発明者 オッドバー ヨハンセン オーストラリア国 ブイアイシー3170、マ ルグレイブ、ダーンレイ グロウブ 16

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 作用電極と、この作用電極から所定距離隔たった対電極とを包含する種類 の電気化学電池においてレドックス・スペシーズの還元形態（または酸化形態） の濃度を測定する方法であって、 （１）電極間に電位差を印加する段階と、 （２）スペシーズの還元形態の電気酸化（または酸化形態の電気還元）の率を 拡散制御するように作用電極の電位を選定する段階と、 （３）対電極からの反応生成物が作用電極に到達するように作用電極と対電極 の間隔を選定する段階と、 （４）電位の印加後で、安定状態の達成前に時間関数として電流を測定する段 階と、 （５）安定状態電流の大きさを判断する段階と、 （６）電流経時変化および安定状態電流の大きさから、拡散係数またはスペシ ーズの還元形態（または酸化形態）の濃度あるいはこれら両方を示す値を得る段 階と を包含することを特徴とする方法。 ２． 請求の範囲第１項記載の方法において、電気化学反応生成物の安定状態濃 度分布をテスト期間中に作用電極と対電極の間で達成することを特徴とする方法 。 ３． 請求の範囲第１項または第２項記載の方法において、電極が５００μｍ未 満隔たっていることを特徴とする方法。 ４． 請求の範囲第１項から第３項までのいずれか１つに記載の方法において、 レドックス・スペシーズがメディエイタであり、このメディエイタの還元形態（ または酸化形態）の濃度が検体の濃度を示し、メディエイタの還元形態（または 酸化形態）の拡散係数の値が検体濃度の測定のための前駆値として測定されるこ とを特徴とする方法。 ５． 請求の範囲第１項から第４項までのいずれか１つに記載の方法において、 安定状態電流を安定状態電流の初期値に近似させることによって推断し、測定電 流対時間データと理論カーブの間の矛盾を測定し、もしあったな らばその矛盾の程度を用いて安定状態電流のより良い推定値を得ることを特徴と する方法。 ６． 請求の範囲第１項から第３項までのいずれか１つに記載の方法において、 レドックス・スペシーズが検体であることを特徴とする方法。 ７． 請求の範囲第１項から第３項までのいずれか１つに記載の方法において、 レドックス・スペシーズがメディエイタであることを特徴とする方法。 ８． 請求の範囲第１項から第７項までのいずれか１つに記載の方法において、 電池が作用電極、対電極および別体の参照電極を包含することを特徴とする方法 。 ９． 請求の範囲第１項から第８項までのいずれか１つに記載の方法において、 電極間の間隔を、所望時間内に安定状態電流を得るように選定することを特徴と する方法。 １０．実質的に実施例の任意のものを参照しながら説明した方法。 １１．請求の範囲第１項に記載の方法で使用するための装置であって、多孔性膜 と、この膜の片側にある作用電極と、この膜の反対側にある対電極とを包含し、 前記両電極がそれらの間の膜ゾーンと共に電気化学電池を構成しており、膜が電 池から側方へサンプル堆積領域まで延びており、このサンプル堆積領域が膜の厚 さよりも大きい距離だけ電池ゾーンから隔たっていることを特徴とする装置。 １２．請求の範囲第１１項記載の装置において、電気化学電池が試液を収容して いることを特徴とする装置。 １３．請求の範囲第１１項または第１２項に記載の装置において、電気化学電池 がメディエイタを収容していることを特徴とする装置。 １４．請求の範囲第１１項から第１３項のいずれか１つに記載の装置において、 膜が電気化学電池とサンプル堆積領域の中間に酵素を収容していることを特徴と する装置。 １５．請求の範囲第１１項から第１４項のいずれか１つに記載の装置において、 さらに、サンプル堆積領域付近にｐＨバッファを設けたことを特徴と する装置。 １６．請求の範囲第１５項記載の装置において、さらに、作用電極付近にｐＨバ ッファを設けたことを特徴とする装置。 １７．請求の範囲第１１項記載の装置において、第２作用電極および膜の第２作 用電極と反対の側にある第２対／参照電極とによって構成された膜の第２電気化 学電池ゾーンを包含することを特徴とする装置。 １８．請求の範囲第１７項記載の装置において、第２電気化学電池ゾーンが第１ 電池ゾーンとサンプル堆積領域またはターゲット領域の中間に位置していること を特徴とする装置。 １９．請求の範囲第１１項から第１８項のいずれか１つに記載の装置において、 非圧縮時の膜の厚さが５００μｍ未満であることを特徴とする装置。 ２０．請求の範囲第１１項から第１９項のいずれか１つに記載の装置において、 作用電極が、金、銀、プラチナ、パラジウム、イリジウム、鉛、その合金からな るグループから選定した金属であることを特徴とする装置。 ２１．電気化学電池においてレドックス・スペシーズの濃度を測定する装置であ って、 作用電極および対電極（または対／参照電極）を有する電気化学電池と、 前記電極間に電位差を印加する手段と、 経時電流変化を測定する手段と を包含する装置において、 作用電極が５００μｍ未満だけ対電極から隔たっている ことを特徴とする装置。 ２２．作用電極と、対電極と、検体を内部に流入させる開口とを包含し、作用電 極が５００μｍだけ対電極から隔たっていることを特徴とする中空の電気化学電 池。 ２３．請求の範囲第２１項または第２２項に記載の電気化学電池において、電極 が１００〜２００μｍ隔たっていることを特徴とする電気化学電池。 ２４．請求の範囲第２１項から第２３項のうちいずれか１つに記載の電気 化学電池において、電極が互いに対面していることを特徴とする電気化学電池。 ２５．請求の範囲第２１項から第２４項のうちいずれか１つに記載の電気化学電 池において、電極がほぼ一致する面積を有することを特徴とする電気化学電池。 ２６．請求の範囲第２１項から第２５項のうちいずれか１つに記載の電気化学電 池において、作用電極、対電極および別体の参照電極を包含することを特徴とす る電気化学電池。 ２７．請求の範囲第２１項から第２６項のうちいずれか１つに記載の電気化学電 池において、１．５マイクロリットル未満の有効電池容積を有することを特徴と する電気化学電池。 ２８．実質的に実施例のいずれかを参照しながら説明した装置。 ２９．請求の範囲第１１項から第２８項のうちいずれか１つに記載の装置であっ て、血液中のグルコースの濃度を測定するのに使用することを特徴とする装置。 ３０．請求の範囲第１項から第１０項までのいずれか１つに記載の方法において 、ヘマトクリット濃度を測定するのに使用することを特徴とする方法。