JPH1135549A - オキサミルのハプテン化合物、抗体及び測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、オキサミルのハプテン化合物、抗
体及び測定方法を提供することを目的とする。 【解決手段】 本発明のハプテン化合物は、オキサミル
またはその部分にスペーサーアームおよび結合のための
官能基を共有結合させた構造を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｎ,Ｎ−ジメチル
−２−メチルカルバモイルオキシイミノ−２−（メチル
チオ）アセトアミド（以下、本明細書中「オキサミル」
と言う）のハプテン化合物、抗原、抗体及びそのフラグ
メントに関する。

【０００２】本発明は、さらに前記抗原、抗体及びその
フラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。

【０００３】

【従来の技術】オキサミルは、以下の式（５）：

【化６】 で表される構造を有する、カ−バメート系殺虫剤であ
る。カーバメート系殺虫剤は、化合物の構成元素として
ＣｌやＰを含まず、Ｃ、Ｈ、Ｏ、Ｎからなる、殺虫作用
を有する一群の化合物である。主なカ−バメート系殺虫
剤は、構造的に大きく三つに分類される。第一に、ナフ
チルまたは置換フェニル−Ｎ−メチル型、第二に複素環
Ｎ,Ｎ−二置換基型、そして第三にオキシム（−Ｃ＝Ｎ
−Ｏ−）結合を分子内に持つオキシム型である。

【０００４】オキサミルはこれらのうちオキシム型のカ
−バメート系殺虫剤であり、殺虫、殺線虫作用を有する
農薬として使用されている。水溶性が大きく作物の地上
部に施用された薬物が地下部に移行して、殺線虫力を発
揮するという特異な浸透殺虫作用を有する。オキサミル
は、接触及び通常の浸透殺虫力、地下部から吸収されて
地上部での殺虫力により、アザミウマ類（ミナミキイロ
アザミウマを含む）、アブラムシ類、線虫に対し効果を
示す（農薬ハンドブック 第６２頁−第７９頁）。

【０００５】近年、土壌、水、大気等の環境中での残留
農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハー
ベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられてい
る。オキサミルについては、食品衛生法に基づき残留基
準値が、穀類（０．０２ｐｐｍ）、果実（０．５−５．
０ｐｐｍ）、野菜（０．０５−５ｐｐｍ）、豆類および
いも類（０．１ｐｐｍ）等、定められている（「最新農
薬の残留分析法」、前述）。環境や食品に関する安全確
保のためには、これらに含有される、オキサミルの量を
迅速、かつ正確に測定することが必要である。

【０００６】従来、オキサミルは、果実、野菜等の試料
から抽出し、精製した後ガスクロマトグラフィー、高速
液体カラムクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等により分
析されてきた。例えば、試料をアセトンで抽出して、フ
ロリジルカラムクロマトグラフィーで精製した後、ガス
クロマトグラフィーで分析する方法が採用されている。
これらの方法は、試料の調製が煩雑で多大の手間と時間
を必要とし、分析に熟練を有すること、並びに、測定装
置や設備等に高額の費用を必要とする等の問題点があ
る。オキサミルの測定は、特に輸入農産物等の残留農薬
の分析においては、短時間で膨大な数の試料の分析結果
を出す必要があり、精度面だけでなく、簡便性、迅速性
及び経済性をも具備した新規測定方法が要求されてきて
いる。

【０００７】免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的
に認識する、抗原抗体反応に基づいて抗原の検出を行う
方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経済性
から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法にお
いては検出方法として非常に多種の標識、例えば、酵
素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、金
属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが適
用されてきた。

【０００８】免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用す
る酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は特に優れたものとして広
く使用されるに至っている。酵素免疫測定法についての
優れた論評が、Tijssen P,“Practice and theory of e
nzyme immunoassays" in Laboratory techniques in bi
ochemistry and molecular biology, Elsevier Amsterd
am New York, Oxford ISBN 0-7204-4200-1 (1990) に記
載されている。

【０００９】一般に、分子量が大きな分子については、
それ以上修飾することなく動物に接種することにより、
適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生さ
せることができる。しかし、オキサミルのような低分子
化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引き出すこ
とができない。これらの分子は免疫原性を有する高分子
化合物に結合させることによって初めて一団のエピトー
プとして行動し、Ｔ細胞受容体の存在下で免疫応答を起
こし、その結果、一群のＢリンパ球により抗体が産生さ
れる。このように高分子化合物と結合させて初めて免疫
原性を生じる分子を総称して「ハプテン」という。

【００１０】しかし、低分子化合物を高分子化合物と結
合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子
を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない
場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そ
のものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペー
サーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして
使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能
基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導
入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体
は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫し
なければならない。

【００１１】特開平８−２３１５９１号公報は、カーバ
メート系化合物に対する抗体の一般的な製造方法を開示
している。しかしながら、オキサミルについては上記式
（１）においてｎａ＝３である化合物の合成を行ったに
止まっている（実施例４）。このように、その必要性が
非常に高かったにもかかわらず、オキサミルの抗体は本
発明前には得られていなかった。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、オキサミル
に反応性を有する新規な抗体を作製するための抗原を構
成するハプテン化合物となる、当該化合物の誘導体を提
供することを目的とする。

【００１３】本発明は、また、前記オキサミル誘導体と
高分子化合物又は標識物質との結合体を提供することを
目的とする。当該結合体はオキサミルに反応性を有する
抗体を作製するための抗原となる。

【００１４】本発明は、さらに、オキサミルに強い親和
性を有する新規な抗体もしくはそのフラグメント、及び
その作製方法を提供することを目的とする。尚、本明細
書において抗体の「フラグメント」とは、抗原と結合可
能な抗体の一部分、例えばＦ_ab断片等を意味する。

【００１５】本発明はその一態様において、オキサミル
に反応性を有するモノクローナル抗体を提供する。

【００１６】本発明は、さらにまた、前記抗体またはそ
のフラグメントを産生するハイブリドーマを提供するこ
とを目的とする。

【００１７】本発明は、さらに、前記抗体またはそのフ
ラグメントを使用することを含む、オキサミルの免疫学
的測定方法を提供することを目的とする。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、オキサミルにスペーサーアーム及び高分
子との結合に利用できる官能基を導入した、オキサミル
の誘導体をハプテンとして使用することにより、前記化
合物に反応性を有する抗体を得ることに成功し、本発明
の完成に至った。

【００１９】本発明の対象となるオキサミルは、以下の
式（５）：

【化７】 で表される化合物である。

【００２０】抗体作製のためのハプテンとして使用され
る誘導体は、以下の式（１）−（４）：

【化８】 ［式（１）−（４）中、Ｒ₁は、所望により１個ないし
２個のハロゲン原子（本明細書中、ハロゲン原子はＦ、
Ｃｌ、ＢｒもしくはＩを意味する）または炭素数１−３
のアルキル基で置換されていてもよい以下の式（Ｒ_1a）
−（Ｒ_1d）：

【化９】 からなる群から選択される構造を有し；Ｒ₂は、（Ｃ
Ｈ₂）_nc、ＣＨ₂ＣＯＮＨ（ＣＨ₂）_nd、またはＣＯ（Ｃ
Ｈ₂）_neであり、ここにおいて、ｎｃは、１−３の整
数、ｎｄは、１−５の整数、ｎｅは、１−５の整数であ
り；Ｒ₃は、炭素数１−６、好ましくは１−３のアルキ
ル基でありｎａは、５−１５の整数であり；そしてｎｂ
は、１−１０の整数である］からなる群から選択される
構造を有する化合物である。

【００２１】式（２）の化合物において、Ｒ₁は６員環
について、１,２位置換、１,３位置換または１,４位置
換で隣接する炭素原子または窒素原子と共有結合してい
る。好ましくは、Ｒ₁がシクロヘキサン環の場合は１,３
位置換もしくは１,４位置換であり、ベンゼン環の場合
には１,４位置換である。

【００２２】式（３）の化合物において、ｎｃは好まし
くは１である。

【００２３】本発明のオキサミル（またはその部分）に
スペーサーアーム及び結合に利用できる官能基を結合さ
せた誘導体（１）−（４）をハプテンとして適当な高分
子化合物と結合させたものを抗原として用いることによ
って、オキサミルに反応性を有する抗体を得ることがで
きる。

【００２４】本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン
化合物と高分子化合物との結合体、オキサミルに反応す
る抗体及びその作製方法、ならびに該ハプテン化合物又
は該抗体を用いるオキサミルの免疫学的測定方法に関す
る。

【００２５】オキサミルの誘導体の作製 式（１）ないし（４）のいずれかで表されるオキサミル
誘導体は、公知の方法に従って作製することができる。
例えば、以下に記載するような方法がある。

【００２６】式（1）ないし（4）のいずれかで表される
オキサミル誘導体は、各式の化合物のカルボキシル末端
にカルボキシル保護基が共有結合したエステル化合物か
ら、公知の方法によりカルボキシル保護基を除去するこ
とにより作製することができる。

【００２７】カルボキシル保護基は公知のものでよく，
その具体例として，たとえばメチル基、エチル基、ベン
ジル基、４-メトキシベンジル基、３，４-ジメトキシベ
ンジル基、ｔｅｒｔ-ブチル基、フェニル基、ｔｅｒｔ-
ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ-ブチルジフェニル
シリル基、トリイソプロピルシリル基、２-トリメチル
シリルエトキシ基等を挙げることができる。

【００２８】カルボキシル基の保護基は酸あるいはアル
カリ存在下で脱保護することができる。メチル基、エチ
ル基等の低級アルキル基、及びベンジル基、フェニル基
などは水とメタノール、エタノール、ＴＨＦ等の有機溶
媒との混合溶液中で、水酸化リチウム、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム等のアルカリ存在下、０℃から６０
℃、好ましくは０℃から１０℃、５分から２０時間、好
ましくは５分から１時間撹拌することによって除去でき
る。メチル基、ベンジル基、４-メトキシベンジル基、
３，４-メトキシベンジル基、ｔｅｒｔ-ブチル基、ｔｅ
ｒｔ-ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ-ブチルジフェ
ニルシリル基、トリイソプロピルシリル基、２-トリメ
チルシリルエトキシ基などはジクロロメタン、１，２-
ジクロロエタン、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン、ア
セトニトリル、ＴＨＦ、ジエチルエーテル等の適当な有
機溶媒中で、塩酸、硫酸、リン酸等の鉱酸、あるいは酢
酸、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸
等の有機酸存在下、マイナス１０℃から６０℃、好まし
くは０℃から２５℃、１時間から２０時間、好ましくは
２時間から５時間撹拌することにより除去できる。また
ベンジル基、４-メトキシベンジル基、３，４-メトキシ
ベンジル基は加水素分解、ｔｅｒｔ-ブチルジメチルシ
リル基、ｔｅｒｔ-ブチルジフェニルシリル基、トリイ
ソプロピルシリル基、２-トリメチルシリルエトキシ基
等のシリル基はフッ化ピリジニウム、テトラブチルアン
モニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）等によって除去するこ
とができる。

【００２９】Ｉ．式（１）、（２）又は（４）に記載さ
れた化合物の製造方法の例 式（１）、（２）又は（４）に記載された化合物は、例
えば、以下の式（６）：

【化１０】 ［式（６）中、Ｒ₄は、−ＳＣＨ₃または−ＣＨ₂ＳＲ₃で
あり（ここにおいて、Ｒ₃は式（４）で定義した通りで
ある）；Ｒ₅は、−ＣＯＮ（ＣＨ₃）₂または−Ｃ（Ｃ
Ｈ₃）₃であり；Ｒ₆は、（ＣＨ₂）_na、Ｒ₁または（Ｃ
Ｈ₂）_nbであり（ここにおいて、ｎａ、ｎｂおよびＲ₁は
式（１）、（２）または（４）で定義した通りであ
る）；そしてＲ₇は、カルボキシル保護基である］で表
されるエステル化合物からＲ₇で表されるカルボキシル
基の保護基を除去することにより製造できる。

【００３０】一般式（６）で表わされるエステル化合物
を製造する方法としては、アミノ酸誘導体とオキシムの
混合物にカルボニル化剤を反応させる方法（Ａ）、オキ
シムの炭酸エステル誘導体とアミノ酸エステルを反応さ
せる方法（Ｂ）、あるいはアミノ酸エステルのカルバマ
ート誘導体をオキシムと反応させる方法（Ｃ）等の公知
の方法を用いることができる。

【００３１】（Ａ）アミノ酸誘導体とオキシムの混合物
にカルボニル化剤を反応させる方法 この方法を用いて、式（６）のエステル化合物を製造す
る場合、以下の式（７）：

【化１１】 ［式（７）中、Ｒ₄およびＲ₅は先に定義した通りであ
る］で表わされるオキサミルオキシム若しくはその類縁
体のオキシムに、式（８）：

【化１２】 ［式（８）中、Ｒ₆およびＲ₇は先に定義した通りであ
る］で表わされる、保護基で保護されたカルボキシル基
を有するアミノ酸エステル誘導体をカルボニル基を介し
て結合させる。

【００３２】反応は、式（７）のオキシムと式（８）の
アミノ酸エステル誘導体をジクロロメタン、１，２-ジ
クロロエタン、ベンゼン、トルエン、ＴＨＦ、ジエチル
エーテル、酢酸エチル、アセトニトリル等の適当な溶媒
中で、ホスゲン、トリクロロメチルクロロ蟻酸（ＴＣ
Ｆ）、トリホスゲン、Ｎ，Ｎ-カルボニルジイミダゾー
ル等のカルボニル化剤、並びにトリエチルアミン、ピリ
ジン等の塩基性触媒存在下、マイナス１０℃から６０
℃、好ましくはマイナス０℃から３０℃、１時間から２
０時間、好ましくは２時間から５時間撹拌することによ
り行う。

【００３３】式（８）で表されるアミノ酸エステルは、
例えば、以下の式（９）：

【化１３】 ［式（９）中、Ｒ₆は先に定義した通りである］で表さ
れる遊離アミノ酸のカルボキシル基に、保護基Ｒ₇を導
入することにより得ることができ、その合成法としては
既知の方法が多く知られている。例えば、アミノ酸と対
応するアルコールの溶液あるいは懸濁液に塩化水素、ｐ
-トルエンスルホン酸等の酸触媒を加え脱水縮合する方
法、アミノ酸と塩化チオニルあるいはオキサリルクロリ
ド等との反応により得られる酸クロリドを無溶媒あるい
はベンゼン、トルエン、ジクロロメタン、１，２-ジク
ロロエタン等の適当な溶媒存在下で、アルコールと反応
させる方法（実験化学講座２２、２１４頁−２２７頁、
日本化学会編、丸善株式会社）があげられる。また，ア
ミノ酸のアミノ基を適当な保護基で保護したのちジクロ
ロメタン、１，２-ジクロロエタン、テトラヒドロフラ
ン（ＴＨＦ）、ジエチルエーテル、ベンゼン、トルエ
ン、キシレン、Ｎ，Ｎ-ジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）等の適当な溶媒存在下で、Ｎ，Ｎ-ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ-ジイソプロピル
カルボジイミド（ＤＩＰＣ）、１-（３-ジメチルアミノ
プロピル）-３-エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）等のカ
ルボジイミド系縮合剤、あるいはトリフェニルホスフィ
ンとアゾジカルボン酸ジエチル等のアゾジカルボン酸エ
ステルを用いアルコールと脱水縮合する方法、あるいは
トリフェニルホスフィンと２,２’−ジピリジルジスル
フィドを用い脱水縮合する方法、あるいはＢＯＰ試薬、
ＤＰＰＡ試薬等の他の縮合剤を用いてエステルを合成す
る方法等（実験化学講座２２、４３頁−５１頁、日本化
学会編、丸善株式会社）により得られたアミノ酸誘導体
の保護基を除去することによりアミノ酸エステルを得る
方法もあげられる。あるいは、塩基存在下アルキルハラ
イドを反応させる方法等により得られたアミノ酸誘導体
の保護基を除去する方法もあげられる。アミノ酸のｔｅ
ｒｔ-ブチルエステルについてはジクロロメタン、１，
２-ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、ＴＨＦ等の
適当な溶媒中、リン酸、硫酸、三フッ化ホウ素ジエチル
エーテル錯体等の存在下、アミノ基を保護したアミノ酸
とイソブテンを撹拌して得られたアミノ酸誘導体の保護
基を除去することにより得る方法もあげられる。

【００３４】アミノ基の保護基としては、例えば、ベン
ジルオキシカルボニル基（Ｚ基）、ｔｅｒｔ-ブトキシ
カルボニル基（Ｂｏｃ基）、９-フルオレニルメトキシ
カルボニル基（Ｆｍｏｃ基）等があげられる。保護基を
除去する方法としては加水素分解による方法、塩酸、硫
酸等の鉱酸、あるいはトリフルオロ酢酸等の有機酸を用
いる方法、ピリジンやピペリジン等の塩基を用いる方法
等があげられる。

【００３５】（Ｂ）オキシムの炭酸エステル誘導体とア
ミノ酸エステルを反応させる方法 この方法を用いて、式（６）のエステル化合物を製造す
る場合、以下の式（１０）：

【化１４】 ［式（１０）中、Ｙは水素原子またはフェニル基の置換
基を示し、好ましくはニトロ基、メタンスルホニル基等
であり；そしてＲ₄およびＲ₅は先に定義した通りであ
る。］で表わされるオキシムの炭酸エステル誘導体を上
記式（８）のアミノ酸エステルとを反応させる。

【００３６】反応は、ジクロロメタン、１,２-ジクロロ
エタン、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン、アセトニト
リル、ＴＨＦ、ジエチルエーテル等の有機溶媒中でトリ
エチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、１,８-ジ
アザビシクロ[５．４．０]ウンデク-７-エン（ＤＢ
Ｕ）、１,５-ジアザビシクロ[４．３．０]ノナ-５-エン
（ＤＢＮ）、１,４-ジアザビシクロ[２．２．２]オクタ
ン（ＤＡＢＣＯ）等の塩基存在下、マイナス１０℃から
５０℃、好ましくは０℃から２５℃、１時間から２０時
間、好ましくは２時間から５時間撹拌することにより行
う。

【００３７】式（１０）で表わされるオキシムの炭酸エ
ステル誘導体は、例えば、上記式（７）で表わされるオ
キシムと市販のクロロ炭酸フェニル類とを、ジクロロメ
タン、１，２-ジクロロエタン、酢酸エチル、ベンゼ
ン、トルエン、アセトニトリル、ＴＨＦ、ジエチルエー
テル等の適当な有機溶媒中でトリエチルアミン、ジイソ
プロピルエチルアミン等の塩基存在下、マイナス１０℃
から５０℃、好ましくは０℃から２５℃、１時間から２
０時間、好ましくは１時間から５時間撹拌することによ
り得ることができる。

【００３８】（Ｃ）アミノ酸エステルのカルバマート誘
導体をオキシムと反応させる方法 この方法を用いて、式（６）のエステル化合物を製造す
る場合、以下の式（１１）：

【化１５】 ［式（１１）中、Ｒ₆、Ｒ₇およびＹは先に定義した通り
である］で表わされるアミノ酸エステルのカルバマート
誘導体と上記式（７）で表わされるオキシムと反応させ
る。

【００３９】反応は、ジクロロメタン、１,２-ジクロロ
エタン、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン、アセトニト
リル、ＴＨＦ、ジエチルエーテル等の有機溶媒中で、ト
リエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、１,８-
ジアザビシクロ[５．４．０]ウンデク-７-エン（ＤＢ
Ｕ）、１,５-ジアザビシクロ[４．３．０]ノン-５-エン
（ＤＢＮ）、１,４-ジアザビシクロ[２．２．２]オクタ
ン（ＤＡＢＣＯ）等の塩基存在下、マイナス１０℃から
５０℃、好ましくは０℃から２５℃、１時間から２０時
間、好ましくは２時間から５時間撹拌することにより行
う。

【００４０】式（１１）で表わされるアミノ酸エステル
のカルバマート誘導体は、例えば式（８）で表わされる
アミノ酸エステルと市販のクロロ炭酸フェニル類を、ジ
クロロメタン、１，２-ジクロロエタン、酢酸エチル、
ベンゼン、トルエン、アセトニトリル、ＴＨＦ、ジエチ
ルエーテル等の適当な有機溶媒中でトリエチルアミン、
ジイソプロピルエチルアミン等の塩基存在下、マイナス
１０℃から５０℃、好ましくは０℃から１５℃、１時間
から２０時間、好ましくは１時間から３時間撹拌するこ
とにより得ることができる。

【００４１】II．式（３）に記載された化合物の製造方
法の例 式（３）に記載された化合物は、例えば、以下の式（１
２）：

【化１６】 ［式（１２）中、Ｒ₂およびＲ₇は先に定義した通りであ
る］で表されるエステル化合物からＲ₇で表されるカル
ボキシル基の保護基を除去することにより製造できる。

【００４２】（Ａ）Ｒ₂＝（ＣＨ₂）_ncの場合 式（１２）においてＲ₂＝（ＣＨ₂）_ncである化合物は、
例えば、上記式（７）のオキサミルオキシムと、以下の
式（１３）：

【化１７】 ［式（１３）中、Ｘはハロゲン原子であり；そしてｎｃ
およびＲ₇は先に定義した通りである］で表されるハロ
カルボン酸エステルとを反応させる方法等の公知の方法
により得られる。

【００４３】反応は、例えば、ジクロロメタン、１，２
-ジクロロエタン、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン、
アセトニトリル、ＴＨＦ、ジエチルエーテル等の有機溶
媒中で、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム等の無機塩基、
あるいはトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミ
ン等の有機塩基存在下、０から１００℃、好ましくは５
０から８０℃、１時間から２０時間、好ましくは１時間
から３時間撹拌することによって行う。

【００４４】（Ｂ）Ｒ₂＝ＣＨ₂ＣＯＮＨ（ＣＨ₂）_ndの
場合 式（１２）においてＲ₂＝ＣＨ₂ＣＯＮＨ（ＣＨ₂）_ndで
ある化合物は、例えば、以下の式（１４）：

【化１８】 で表したオキサミルオキシム酢酸誘導体と、以下の式
（１５）：

【化１９】 ［式（１５）中、ｎｄおよびＲ₇は先に定義した通りで
ある］で表したアミノ酸エステルを脱水縮合させる方法
等の公知の方法で製造することができる。

【００４５】脱水縮合反応を用いる場合，式（１４）の
オキサミルオキシム酢酸誘導体および式（１５）のアミ
ノ酸エステルは上述した方法に従って作製することがで
きる。脱水縮合は、オキサミルオキシム酢酸誘導体とア
ミノ酸エステルをジクロロメタン、１，２-ジクロロエ
タン、ＴＨＦ、ジエチルエーテル、ベンゼン、トルエ
ン、キシレン、ＤＭＦ等の適当な溶媒存在下で、ＤＣ
Ｃ、ＤＩＰＣ、ＥＤＣ等のカルボジイミド系縮合剤、あ
るいはトリフェニルホスフィンとアゾジカルボン酸ジエ
チル等のアゾジカルボン酸エステルを用いる方法、ある
いはトリフェニルホスフィンと２，２’−ジピリジルジ
スルフィドを用いる方法、あるいはＢＯＰ試薬、ＤＰＰ
Ａ試薬等の他の縮合剤を用いる方法（実験化学講座２
２、４３頁−５１頁、日本化学会編、丸善株式会社）等
により行うことができる。

【００４６】（Ｃ）Ｒ₂＝ＣＯ（ＣＨ₂）_neの場合 式（１２）においてＲ₂＝ＣＯ（ＣＨ₂）_neである化合物
は、例えば、オキサミルオキシムにジカルボン酸モノエ
ステルを脱水縮合させる方法，ジカルボン酸モノエステ
ルモノ酸ハライドを反応させる方法，ジカルボン酸ジハ
ライドを反応させた後アルコール類と反応させる方法等
の公知の方法で作製することができる。

【００４７】ジカルボン酸ジハライドを反応させた後ア
ルコール類と反応させる方法を用いる場合は、反応は、
例えば、ジクロロメタン、１，２-ジクロロエタン、酢
酸エチル、ベンゼン、トルエン、アセトニトリル、ＴＨ
Ｆ、ジエチルエーテル等の有機溶媒中で、炭酸カリウ
ム、炭酸ナトリウム等の無機塩基、あるいはトリエチル
アミン、ジイソプロピルエチルアミン等の有機塩基存在
下、マイナス１０℃から１００℃、好ましくは０から２
５℃で、オキサミルオキシムとカルボン酸クロリド、次
いでアルコール類を混合し１時間から３０時間、好まし
くは１時間から５時間、撹拌することにより行う。

【００４８】あるいは、ｎｅ＝２、そしてＲ₇＝Ｈの化
合物は、例えばオキサミルオキシムとコハク酸無水物と
の反応によって得ることもできる。この場合，反応はジ
クロロメタン、１，２-ジクロロエタン、酢酸エチル、
ベンゼン、トルエン、アセトニトリル、ＴＨＦ、ジエチ
ルエーテル等の有機溶媒中で、マイナス１０℃から１０
０℃、好ましくは０から２５℃、１時間から４０時間、
好ましくは５時間から１０時間撹拌して行う。またこの
反応において、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム等の無機
塩基、あるいはトリエチルアミン、ジイソプロピルエチ
ルアミン等の有機塩基を共存させてもよい。

【００４９】以上の製造法によって得られた化合物を、
必要に応じシリカゲルクロマトグラフィーまたは再結晶
操作等を行うことにより、さらに高純度の精製品とする
ことができる。

【００５０】以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免
疫学的測定方法について説明する。尚、これらの調製は
公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究
法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うこと
ができる。

【００５１】オキサミル誘導体と高分子化合物との結合
体の作製 上述のように合成されたオキサミル誘導体を適当な高分
子化合物に結合させてから免疫用抗原として使用する。

【００５２】好ましい高分子化合物の例としては、スカ
シガイヘモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と言う）、卵白
アルブミン（以下、「ＯＶＡ］と言う）、ウシ血清アル
ブミン（以下、「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブ
ミン（以下、「ＲＳＡ」と言う）などがあるが、ＫＬＨ
及びＢＳＡが好ましい。

【００５３】オキサミル誘導体と高分子化合物との結合
は、例えば、活性化エステル法（A.E. KARU et al.:J.
Agric. Food Chem. 42 301-309 (1994)）、又は混合酸
無水物法（B.F.Erlanger et al.:J.Biol.Chem. 234 109
0-1094 (1954)）等の公知の方法によって行うことがで
きる。

【００５４】活性化エステル法は、一般に以下のように
行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機溶媒に
溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシこ
はく酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミ
ドエステルを生成させる。

【００５５】カップリング剤としては、縮合反応に慣用
されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダ
ゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒
としては、例えば、ジメチルスルホキシド（以下、「Ｄ
ＭＳＯ」という）、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）、ジオキサン等が使用できる。反応に使用するハ
プテン化合物とＮ−ヒドロキシこはく酸イミドのモル比
は好ましくは１：１０−１０：１、より好ましくは、
１：１−１：１０、最も好ましくは１：１である。反応
温度は、０−１００℃、好ましくは５−５０℃、より好
ましくは２２−２７℃で、反応時間は５分−２４時間、
好ましくは３０分−６時間、より好ましくは１−２時間
である。反応温度は各々の融点以上沸点以下の温度で行
うことができる。

【００５６】カップリング反応後反応液を遠心し、上清
液を高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させると、
例えば高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当
該アミノ基とハプテン化合物のカルボキシル基の間に酸
アミド結合が生成される。反応温度は、０−６０℃、好
ましくは５−４０℃、より好ましくは２２−２７℃で、
反応時間は５分−２４時間、好ましくは１−１６時間、
より好ましくは１−２時間である。反応物を、透析、脱
塩カラム等によって精製して、オキサミル誘導体と高分
子化合物との結合体を得ることができる。

【００５７】一方、混合酸無水物法において用いられる
混合酸無水物は、通常のショッテン−バウマン反応によ
り得られ、これを高分子化合物と反応させることにより
目的とするハプテン−高分子化合物結合体が製造され
る。ショッテン−バウマン反応は塩基性化合物の存在下
に行われる。塩基性化合物としてはショッテン−バウマ
ン反応において慣用されている化合物を使用することが
できる。例えば、トリブチルアミン、トリエチルアミ
ン、トリメチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジ
ン、Ｎ,Ｎ−ジメチルアニリン、ＤＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡ
ＢＣＯ等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、
炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等
が挙げられる。該反応は、通常マイナス２０℃−１００
℃、好ましくは０℃−５０℃において行われ、反応時間
は５分−１０時間、好ましくは５分−２時間である。得
られた混合酸無水物と高分子化合物との反応は、通常マ
イナス２０℃−１５０℃、好ましくは０℃−１００℃に
おいて行われ、反応時間は５分−１０時間、好ましくは
５分−５時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で
行われる。溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されて
いるいずれの溶媒も使用可能であり、具体的にはジオキ
サン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジメト
キシエタン等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホ
ルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ベン
ゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、酢酸
メチル、酢酸エチル等のエステル類、Ｎ,Ｎ−ジメチル
ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリ
ン酸トリアミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられ
る。混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステ
ルとしては、例えばクロロ蟻酸イソブチル、クロロ蟻酸
メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ
蟻酸エチル等が挙げられる。当該方法におけるハプテン
とハロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い
範囲から適宜選択され得る。

【００５８】また、上記と同様の方法により、酵素等の
標識物質をオキサミル誘導体に結合させたものを、免疫
学測定方法において使用することができる。標識物質と
しては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下、「ＨＲ
Ｐ」と言う）、アルカリフォスファターゼ等の酵素、フ
ルオレセインイソチオシアネート、ローダミン等の発色
物質、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ等の放射性物質、化学発光物質など
がある。

【００５９】ポリクローナル抗体の作製 オキサミル誘導体と高分子化合物との結合体を使用し
て、慣用化された方法により本発明のポリクローナル抗
体を作製することができる。例えば、オキサミル誘導体
−ＫＬＨ結合体をリン酸緩衝液（以下、「ＰＢＳ」と言
う）に溶解し、フロイント完全アジュバント又は不完全
アジュバント、あるいはミョウバン等の補助剤と混合し
たものを、免疫用抗原として動物に免疫することによっ
て行う。免疫される動物としては当該分野で常用される
ものをいずれも使用できるが、例えば、マウス、ラッ
ト、ウサギ、ヤギ、ウマ等を挙げることができる。

【００６０】免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。投与は１回
又は適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間の間
隔で複数回行うことができる。

【００６１】免疫した動物から血液を採取し、そこから
分離した血清を用い、オキサミルと反応するポリクロー
ナル抗体の存在を評価することができる。

【００６２】モノクローナル抗体の作製 オキサミル誘導体と高分子化合物との結合体を使用し
て、公知の方法により本発明のモノクローナル抗体を作
製することができる。

【００６３】モノクローナル抗体の作製にあたっては、
少なくとも下記のような作業工程が必要である。 （ａ）免疫用抗原として使用するオキサミル誘導体と高
分子化合物との結合体の作製 （ｂ）動物への免疫 （ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製 （ｄ）ミエローマ細胞の調製 （ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハ
イブリドーマの選択的培養 （ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングと細胞クローニング （ｇ）ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドー
マの移植によるモノクローナル抗体の調製 （ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等

【００６４】モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを作製するための常法は、例えば、ハイブリドーマ
テクニックス（Hybridoma Techniques），コールド
スプリング ハーバーラボラトリー（Cold Spring Harb
or Laboratory），１９８０年版）、細胞組織化学（山
下修二ら、日本組織細胞化学会編；学際企画、１９８６
年）に記載されている。

【００６５】以下、上述の本発明のオキサミルに対する
モノクローナル抗体の作製方法を説明するが、これに制
限されないことは当業者によって明らかであろう。

【００６６】（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクローナル
抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行
うことができる。

【００６７】（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリン
パ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末
梢血液又はこれらの組み合わせから得ることができるが
脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫
後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存
在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。

【００６８】（ｄ）の工程に用いることができるミエロ
ーマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来骨
髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Natur
e，25 6, 495-497 (1975)）、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ
１（Ｐ３Ｕ１）（Current Topics.in Microbiology and
Immunology, 81 1-7 (1987)）、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａ
ｇ４−１（ＮＳ−１）（Eur.J.Immunol., 6, 511-519
(1976)）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）（Natu
re 276, 269-270 (1978)）、ＦＯ（J. Immuno.Meth., 3
5, 1-21 (1980)）、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３.６５３、Ｓ
１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由来の２１
０．ＲＣＹ３．Ａｇ１.２.３.（Ｙ３）（Nature 277, 1
31-133, (1979)）等を使用できる。

【００６９】上述した株化細胞をウシ胎児血清を含むダ
ルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はイスコフ改
変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融合当日
に約３×１０³以上の細胞数を確保する。

【００７０】（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例
えばミルシュタイン（Milstein）らの方法（Methods in
Enzymology, 73, 3 (1981)）等に準じて行うことがで
きる。現在最も一般的に行われているのはポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）を用いる方法である。ＰＥＧ法に
ついては、例えば、細胞組織化学、山下修二ら（上述）
に記載されている。別の融合方法としては、電気処理
（電気融合）による方法を採用することもできる（大河
内悦子ら、実験医学 ５．１３１５−１９、１９８
７）。その他の方法を適宜採用することもできる。ま
た、細胞の使用比率も公知の方法と同様でよく、例えば
ミエローマ細胞に対して脾細胞を３−１０倍程度用いれ
ばよい。

【００７１】脾細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体
産生能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択
は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチング
アニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使
用した場合、例えば上述のＤＭＥＭやＩＭＤＭにヒポキ
サンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製し
たＨＡＴ培地の使用により行うことができる。

【００７２】（ｆ）の工程では、選択されたハイブリド
ーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥ
ＬＩＳＡ法により、オキサミルに対する抗体活性を測定
する。

【００７３】さらに、測定によりオキサミルに反応する
抗体を産生することが判明したハイブリドーマの細胞ク
ローニングを行う。この細胞クローニング法としては、
限界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマが含ま
れるように希釈する方法「限界希釈法」；軟寒天培地上
に撒きコロニーをとる方法；マイクロマニピュレーター
によって１個の細胞を取り出す方法；セルソーターによ
って１個の細胞を分離する「ソータークローン法」等が
挙げられる。限界希釈法が簡単であり、よく用いられ
る。

【００７４】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法により細胞クローニングを１−４回繰り返
して安定して抗体価の得られたものを、抗オキサミルモ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択す
る。ハイブリドーマを培養する培地としては、例えば、
１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ又はＩＭＤＭ等が用
いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二酸化炭素
濃度５−７％程度及び３７℃（１００％湿度中の恒温器
中）で培養するのが好ましい。

【００７５】（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量
培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行
われる。又は、同系統のマウス（例えば、上述のＢａｌ
ｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリ
ドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも可
能である。

【００７６】これらにより得られた培養上清液あるいは
腹水液を抗オキサミルモノクローナル抗体として使用す
ることができるが、さらに透析、硫酸アンモニウムによ
る塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を集め
精製することにより抗オキサミルモノクローナル抗体を
得ることができる。さらに高度な精製が必要な場合に
は、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）などの慣用されている方法を組合わせるこ
とにより実施できる。

【００７７】以上のようにして得られた抗オキサミルモ
ノクローナル抗体は、例えば後述するＥＬＩＳＡ法など
の公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等を決定
することができる。

【００７８】抗体によるオキサミルの測定 本発明で使用する抗体によるオキサミルの測定方法とし
ては、放射性同位元素免疫測定方法（ＲＩＡ法）、ＥＬ
ＩＳＡ法（Engvall,E., Methods in Enzymol., 70, 41
9-439 (1980)）、蛍光抗体法、プラーク法、スポット
法、凝集法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）
法等の一般に抗原の検出に使用されている種々の方法
（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会
社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５
７年３月５日）が挙げられる。感度、簡便性等の観点か
らＥＬＩＳＡ法が汎用されている。

【００７９】オキサミルの測定は各種ＥＬＩＳＡ法のう
ち、例えば間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、以下のよ
うな手順により行うことができる。（ａ）まず、抗原で
あるオキサミル誘導体と高分子化合物との結合体を担体
に固相化する。（ｂ）抗原が吸着していない固相表面を
抗原と無関係な、例えばタンパク質によりブロッキング
する。（ｃ）これに各種濃度のオキサミルを含む試料及
び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及び遊離オキサ
ミルに競合的に反応させて、固相化抗原−抗体複合体及
び遊離オキサミル−抗体複合体を生成させる。（ｄ）固
相化抗原−抗体複合体の量を測定することにより、予め
作成した検量線から試料中の遊離オキサミルの量を決定
することができる。

【００８０】（ａ）工程において、抗原を固相化する担
体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において
常用されるものをいずれも使用することができる。例え
ば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープ
レートが挙げられる。

【００８１】抗原を担体に固相化させるには、例えば、
抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーション
すればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例
えば、ダルベッコのリン酸緩衝液を挙げることができ
る。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲から選択できる
が、通常０.０１−１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは
０.０５−５μｇ／ｍｌが適している。また、担体とし
て９６ウェルのマイクロタイタープレートを使用する場
合には、３００μｌ／ウェル以下で２０−１５０μｌ／
ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーションの条
件にも特に制限はないが、通常４℃程度で一晩インキュ
ベーションが適している。

【００８２】なお、担体に固相化させる抗原としては、
抗体作製に使用したオキサミル誘導体と高分子化合物と
の結合体のみならず、式（１）ないし（４）のいずれか
で表される他の誘導体と高分子化合物との結合体を用い
ることもできる。例えば、式（１）の化合物と高分子化
合物との結合体を抗原として抗体を作製した場合、式
（１）以外の化合物を固相化抗原として用いることもで
きる。また、式（１）−（４）の化合物で、ｎａないし
ｎｅの数が相違する抗原を各々抗体作製用と固相化用に
用いることもできる。さらに、式（１）−（４）に含ま
れない他のオキサミル類似化合物も、固相化抗原として
使用することも可能である。

【００８３】（ｂ）工程のブロッキングは、抗原（オキ
サミル誘導体と高分子化合物との結合体）を固相化した
担体において、オキサミル誘導体部分以外に後で添加す
る抗体が吸着され得る部分が存在する場合があり、もっ
ぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロッキング剤とし
て、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液を使用できる。
あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」、
大日本製薬社製、コードＮｏ．ＵＫ−２５Ｂ）等のブロ
ッキング剤として市販されているものを使用することも
できる。具体的には、限定されるわけではないが、例え
ば抗原を固相化した部分に、ブロッキング剤を含む緩衝
液［例えば、１％ＢＳＡと６０ｍＭ ＮａＣｌを添加し
た８５ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）］を適量加
え、約４℃−室温で、１時間−５時間インキュベーショ
ンした後、緩衝液で洗浄することにより行われる。洗浄
液としては特に制限はないが、例えば、６０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌを添加したホウ酸緩衝液を用いることができる。

【００８４】次いで（ｃ）工程において、オキサミルを
含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を固相化
抗原及び遊離オキサミルと反応させることにより、固相
化抗原−抗体複合体及び遊離オキサミル−抗体複合体が
生成する。

【００８５】この際、抗体としては、第一抗体として本
願発明のオキサミルに対する抗体を加え、更に第二抗体
として標識物質を結合した第一抗体に対する抗体を順次
加えて反応させる。

【００８６】第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限
定されるわけではないが、反応は、３７℃程度で約１時
間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未
反応の第一抗体を除去する。洗浄液としては、例えば、
６０ｍＭ ＮａＣｌを添加したホウ酸緩衝液を用いるこ
とができる。

【００８７】次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗
体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素
（例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファター
ゼ等）を結合した抗マウス抗体−ヤギ抗体を用いるのが
適当である。担体に結合した第一抗体に約５００−１０
０００倍、好ましくは最終吸光度が４以下、より好まし
くは０．５−３．０となるように希釈した第二抗体を反
応させるのが望ましい。希釈には緩衝液を用いる。限定
されるわけではないが、反応は室温で約１時間行い、反
応後、緩衝液で洗浄する。以上の反応により、第二抗体
が第一抗体に結合する。また、標識した第一抗体を用い
てもよく、その場合、第二抗体は不要である。

【００８８】次いで（ｄ）工程において担体に結合した
第二抗体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸
光度を測定することによって検量線からオキサミルの量
を算出することができる。

【００８９】第二抗体に結合する酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用する場合には、例えば基質として過酸化水
素、発色試薬として３,３',５,５'−テトラメチルベン
ジジンまたはｏ−フェニレンジアミン（以下、「ＯＰ
Ｄ」と言う）を使用する。限定されるわけではないが、
発色溶液を加え室温で約１０分間反応させた後、１Ｎの
硫酸を加えることにより酵素反応を停止させる。３,
３',５,５'−テトラメチルベンジジンを使用する場合、
４５０ｎｍの吸光度を測定する。ＯＰＤを使用する場
合、４９０ｎｍの吸光度を測定する。一方、第二抗体に
結合する酵素としてアルカリホスファターゼを使用する
場合には、例えばｐ−ニトロフェニルリン酸を基質とし
て発色させ、２ＮのＮａＯＨを加えて酵素反応を止め、
４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法が適している。

【００９０】遊離のオキサミルを添加しない反応溶液の
吸光度に対して、オキサミルを添加して抗体と反応させ
た溶液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知
の濃度のオキサミルを添加した反応液の阻害率により予
め作成しておいた検量線を用いて、試料中のオキサミル
の濃度を算出できる。

【００９１】上述した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によれ
ば、本発明のモノクローナル抗体ＯＸＭ Ｈ３、ＯＸＭ
２−３、ＯＸＭ３−２およびＯＸＭ６−８は、間接競合
阻害ＥＬＩＳＡ法によってオキサミルを各々約１,００
０−１０,０００ｎｇ／ｍｌ、約１００−１,０００ｎｇ
／ｍｌ、約１００−１,０００ｎｇ／ｍｌおよび約１０
−１００ｎｇ／ｍｌの範囲で測定するすることができる
（実施例１８）。

【００９２】あるいは、オキサミルの測定は、例えば以
下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用いた
直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって行うこともできる。 （ａ）まず、本発明のモノクローナル抗体を担体に固相
化する。 （ｂ）抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関
係な、例えばタンパク質によりブロッキングする。 （ｃ）上記工程とは別に、各種濃度のオキサミルを含む
試料に、オキサミル誘導体と酵素を結合させた酵素結合
ハプテンを加えた混合物を調製する。 （ｄ）上記混合物を上記抗体固相化担体と反応させる。 （ｅ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定
することにより、あらかじめ作成した検量線から試料中
のオキサミルの量を決定する。

【００９３】（ａ）工程においてモノクローナル抗体を
固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ
法において常用されるものを用いることができ、例えば
９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル
抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートする
ことによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接
競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。ある
いは、アミノ基結合型のマイクロタイタープレートに化
学結合法を用いて抗体を結合させたものを使用すること
もできる。

【００９４】（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相
化した担体において、後に添加する試料中のオキサミル
及び酵素結合ハプテンが抗原抗体反応とは無関係に吸着
される部分が存在する場合があるので、それを防ぐ目的
で行う。ブロッキング剤及びその方法は、前述の間接競
合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを使用できる。

【００９５】（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテ
ンの調製は、オキサミル誘導体を酵素に結合する方法で
あれば、特に制限なくいかなる方法で行ってもよい。例
えば、前述した活性化エステル法を採用することができ
る。調製した酵素結合ハプテンは、オキサミルを含む試
料と混合する。

【００９６】なお、酵素等の標識物質に結合させるハプ
テンとしては、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法における固相
化抗原の場合と同様に、抗体作製に使用したオキサミル
誘導体自体のみならず、式（１）ないし（４）で表され
る他の誘導体、さらに、式（１）ないし（４）に含まれ
ない他のオキサミル類似化合物も使用可能である。

【００９７】（ｄ）工程において当該混合物を抗体固相
化担体に接触させ、混合物中のオキサミルと酵素結合ハ
プテンとの競合阻害反応により、これらと固相化抗体と
の複合体が生成する。オキサミルを含む試料は適当な緩
衝液で希釈して使用する。限定されるわけではないが、
反応は例えば室温でおよそ１時間行う。反応終了後、緩
衝液で担体を洗浄し、未反応の酵素結合ハプテンを除去
する。洗浄液は、例えば６０ｍＭ ＮａＣｌを添加した
ホウ酸緩衝液を使用することができる。

【００９８】さらに、（ｅ）工程において酵素結合ハプ
テンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することに
より検量線からオキサミルの量を算出することができ
る。

【００９９】本発明のモノクローナル抗体ＯＸＭ６−８
は、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によってオキサミルを約
０．５−５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは８−２５０ｎｇ
／ｍｌの範囲で測定することができる（実施例２３およ
び２４、図２および３）。

【０１００】本発明の抗体のメタノール耐性 本発明の一態様であるモノクローナル抗体ＯＸＭ６−８
はさらに、上述した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によれば
約０−２０％の濃度のメタノール存在下においてオキサ
ミルを濃度依存的に認識できる（実施例２５）。オキサ
ミルは有機溶媒に易溶性であり、一般に分析はメタノー
ル等の有機溶媒中で行われることを考慮すると、本発明
のモノクローナル抗体のこのような特性は非常に有効で
ある。

【０１０１】本発明の抗体の交差反応性 上述した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法または間接競合阻害
法により、本発明のモノクローナル抗体の交差反応性を
調べることができる。ＯＸＭ６−８は、例えば直接競合
阻害ＥＬＩＳＡ法において類縁化合物であるメソミル、
ブトカルボキシム、アラニカルブ等とは０.３％以下し
か交差反応しない。（実施例２６、表１）。

【０１０２】以下、実施例によって本発明を具体的に説
明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するため
のものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容
易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは
本発明の技術的範囲に含まれる。

【０１０３】

【実施例】製造例 オキサミル誘導体−Ｃの合成

【化２０】

【０１０４】４−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）
酪酸（２）の合成 ２８ｇ（２７０ｍｍｏｌ）の４−アミノ酪酸（１）を２
規定の水酸化ナトリウム水溶液１４０ｍｌに溶解して氷
冷した。この溶液を激しく撹拌しながらクロロ蟻酸ベン
ジル（７０ｇ，４１０ｍｍｏｌ）と２規定の水酸化ナト
リウム水溶液２００ｍｌをそれぞれ３回に分けて交互に
滴下した。滴下終了後３０分間氷冷温度で撹拌し、更に
室温で一晩撹拌し続けた。氷冷したジエチルエーテル
（１５０ｍｌ×３回）で未反応のクロロ蟻酸ベンジルを
抽出した後、氷冷下で濃塩酸を添加してｐＨを約２に調
整した。ジクロロメタン（１５０ｍｌ×４回）で抽出
し、集めたジクロロメタン抽出物を無水硫酸ナトリウム
で脱水して、吸引濾過で硫酸ナトリウムを除いた後に減
圧濃縮した。その濃縮物を少量の酢酸エチルに溶解し、
この中にｎ−ヘキサンを加えて析出した白色結晶を吸引
濾過により集めて目的物（２）を得た（収量６０ｇ，収
率９３％）。

【０１０５】４−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）
酪酸ｔｅｒｔ−ブチル（３）の合成 ２８ｇ（１１８ｍｍｏｌ）の４−（ベンジルオキシカル
ボニルアミノ）酪酸（２）のジクロロメタン溶液（３０
０ｍｌ）を食塩−氷でマイナス１６℃に冷却して、その
溶液中にイソブテンの気流を５分間ゆっくりと流し込ん
だ。次にリン酸（０．９２ｇ，９．４ｍｍｏｌ）と三フ
ッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（２．５ｇ，１７．７
ｍｍｏｌ）をシリンジでゆっくりと滴下して、再びイソ
ブテンを５分間ゆっくりと流し込んだ。この溶液をその
まま室温になるまで撹拌して、更に一晩撹拌し続けた。
飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて３０分間撹拌し
た後、ジクロロメタン（１５０ｍｌ×４回）で抽出し
た。集めたジクロロメタン抽出物を無水硫酸ナトリウム
で脱水し、吸引濾過で硫酸ナトリウムを除いた後で減圧
濃縮した。この濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラ
フィー（ｎ−ヘキサン−酢酸エチル＝４：１）で精製し
て無色透明な液体として目的物（３）を得た（収量３１
ｇ，収率９０％）。

【０１０６】４−アミノ酪酸ｔｅｒｔ−ブチル（４）の
合成 １１．７ｇ（４０ｍｍｏｌ）の４−（ベンジルオキシカ
ルボニルアミノ酪酸）ｔｅｒｔ−ブチル（３）のメタノ
ール溶液（３００ｍｌ）に１．０ｇのパラジウムカーボ
ンを加えて水素存在下で水素の吸収が終了するまで撹拌
した。次に反応溶液を濾過後に減圧濃縮して、真空ポン
プで完全に溶媒を除くと黄色液体として目的物（４）を
得た（収量６．１ｇ，収率１００％）。

【０１０７】４−（フェノキシカルボニルアミノ）酪酸
ｔｅｒｔ−ブチル（５）の合成 クロロ炭酸フェニル（８．０ｇ，５ｍｍｏｌ）のジクロ
ロメタン溶液（５０ｍｌ）に氷冷温度で６．０ｇ（３．
８ｍｍｏｌ）の４−アミノ酪酸ｔｅｒｔ−ブチル（４）
のジクロロメタン溶液（５０ｍｌ）を滴下して、次にト
リエチルアミン（５．０ｇ，５ｍｍｏｌ）のジクロロメ
タン溶液（５０ｍｌ）を滴下した。滴下終了後、この溶
液をそのまま室温になるまで撹拌して、更に一晩撹拌し
続けた。反応溶液を飽和食塩水で洗浄後に無水硫酸ナト
リウムで脱水して、吸引濾過で硫酸ナトリウムを除いた
後に減圧濃縮した。その濃縮物を少量の酢酸エチルで溶
解して、この中にｎ−ヘキサンを加えて析出する白色結
晶を吸引濾過により集めて目的物（５）を得た（収量
７．４ｇ，収率７０％）。

【０１０８】（６）の合成 ３．２ｇ（２０ｍｍｏｌ）のオキサミルオキシムと４−
（ベンジルオキシカルボニルアミノ）酪酸ｔｅｒｔ−ブ
チル（５）５．６ｇ（２０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン
５０ｍｌに溶解し、氷冷下で３．０ｇ（２０ｍｍｏｌ）
の１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７
−エン（ＤＢＵ）のジクロロメタン溶液２０ｍｌを滴下
した。氷冷下で１時間撹拌後、更に室温で１時間撹拌し
た。反応液を減圧濃縮してシリカゲルクロマトグラフィ
ー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：２）で精製する
と、無色透明液体として３．６ｇ（収率５２％）の
（６）を得た。

【０１０９】（７）の合成 ５．６ｇ（１６ｍｍｏｌ）のエステル化合物（６）を１
００ｍｌのベンゼンに溶解し、トリフルオロ酢酸１０ｍ
ｌを添加後室温で１日撹拌した。反応溶液を減圧濃縮し
て、シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル）で精
製すると、無色透明液体として３．９ｇ（収率８４％）
のオキサミル誘導体−Ｃ（７）を得た。この液体はマイ
ナス２０℃の冷凍庫に長時間放置しておくと白色結晶に
なった。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） １．８６〜２．０２（ｍ，２Ｈ），２．３３（ｓ，３Ｈ）， ２．２４〜２．５８（ｔ，２Ｈ），３．１０（ｓ，３Ｈ）， ３．１２（ｓ，３Ｈ）， ３．１８〜３．４９（ｍ，２Ｈ）， ６．０４〜６．３２（ｔ，１Ｈ），７．３５〜７．７２（ｂｒ，１Ｈ）

【０１１０】実施例１ オキサミル誘導体−１の合成

【化２１】

【０１１１】６−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）
カプロン酸（２）の合成 １３．１ｇ（１００ｍｍｏｌ）の６−アミノカプロン酸
（１）を２規定の水酸化ナトリウム水溶液５０ｍｌに溶
解して氷冷した。この溶液を激しく撹拌しながらクロロ
蟻酸ベンジル（２０．５ｇ，１２０ｍｍｏｌ）と２規定
の水酸化ナトリウム水溶液６０ｍｌをそれぞれ２回に分
けて交互に滴下した。滴下終了後３０分間氷冷温度で撹
拌し、更に室温で一晩撹拌し続けた。氷冷したジエチル
エーテル（１５０ｍｌ×３回）で未反応のクロロ蟻酸ベ
ンジルを抽出した後、氷冷温度で濃塩酸を滴下してｐＨ
を約２に調整した。ジクロロメタン（１５０ｍｌ×４
回）で抽出して、集めたジクロロメタン抽出物を無水硫
酸ナトリウムで脱水して、吸引濾過で硫酸ナトリウムを
除いた後、減圧濃縮した。その濃縮物を少量の酢酸エチ
ルに溶解させ、この中にｎ−ヘキサンを加えた。析出し
た白色結晶を吸引濾過により単離し目的物（２）を得た
（収量２２ｇ，収率８３％）。

【０１１２】６−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）
カプロン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３）の合成 ５．３ｇ（２０ｍｍｏｌ）の６−（ベンジルオキシカル
ボニルアミノ）カプロン酸（２）のジクロロメタン溶液
（１００ｍｌ）を食塩−氷でマイナス１６℃に冷却し
て、その溶液中にイソブテンの気流を５分間ゆっくりと
流し込んだ。次にリン酸（０．１ｇ，１．８ｍｍｏｌ）
と三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（０．３７ｍ
ｌ，３ｍｍｏｌ）をシリンジでゆっくりと滴下して、再
びイソブテンを５分間ゆっくりと流し込んだ。この溶液
をそのまま室温になるまで撹拌して、更に一晩撹拌し続
けた。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて３０分間
撹拌した後、ジクロロメタン（１５０ｍｌ×４回）で抽
出した。集めたジクロロメタン抽出物を無水硫酸ナトリ
ウムで脱水し、吸引濾過で硫酸ナトリウムを除いた後、
減圧濃縮した。この濃縮物をシリカゲルカラムクロマト
グラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）で精
製して無色透明な液体として目的物（３）を得た（収量
４．０ｇ，収率６３％）。

【０１１３】６−アミノカプロン酸ｔｅｒｔ−ブチル
（４）の合成 ４．０ｇ（１２．５ｍｍｏｌ）の６−（ベンジルオキシ
カルボニルアミノカプロン酸）ｔｅｒｔ−ブチル（３）
のメタノール溶液（１００ｍｌ）に０．３ｇのパラジウ
ムカーボンを加えて水素存在下で水素の吸収が終了する
まで撹拌した。次に反応溶液を濾過後減圧濃縮して、真
空ポンプで完全に溶媒を除くと黄色の液体として目的物
（４）を得た（収量２．３ｇ，収率１００％）。

【０１１４】（５）の合成 １．４ｇ（７．５ｍｍｏｌ）の６−アミノカプロン酸ｔ
ｅｒｔ−ブチル（４）と２．０（７．１ｍｍｏｌ）のオ
キサミルオキシムのフェニルカルボナート誘導体のアセ
トニトリル溶液５０ｍｌに、氷冷下で１．１ｇ（７．２
ｍｍｏｌ）の１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウ
ンデク−７−エン（ＤＢＵ）のアセトニトリル溶液１０
ｍｌを滴下した。氷冷下で１時間撹拌後、更に室温で１
時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮して、シリカゲルク
ロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：
１）で精製すると、透明液体として２．０ｇ（収率７６
％）の（５）を得た。

【０１１５】（６）の合成 ２．０ｇ（５．３ｍｍｏｌ）のエステル化合物（５）を
１００ｍｌのジクロロメタンに溶解して、トリフルオロ
酢酸１０ｍｌを加えて室温で２時間撹拌した。反応溶液
を減圧濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸
エチル）で精製すると、透明液体として１．２ｇ（収率
７１％）のオキサミル誘導体−１（６）を得た。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） １．１８〜１．８２（ｍ，６Ｈ），２．２０〜２．４９
（overlap,５Ｈ），２．９８〜３．４０（overlap,８
Ｈ），５．８９〜６．２１（ｔ，１Ｈ），７．５０〜
７．９２（ｂｒ，１Ｈ）

【０１１６】実施例２ オキサミル誘導体−２の合成

【化２２】

【０１１７】７−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）
ヘプタン酸（２）の合成 ２．２ｇ（１５．２ｍｍｏｌ）の７−アミノヘプタン酸
（１）を２規定の水酸化ナトリウム水溶液７．６ｍｌに
溶解して氷冷した。この溶液を激しく撹拌しながらクロ
ロ蟻酸ベンジル（３．１ｇ，１８．２ｍｍｏｌ）と２規
定の水酸化ナトリウム水溶液９．１ｍｌを滴下した。滴
下終了後３０分間氷冷温度で撹拌後、更に室温で５時間
撹拌し続けた。氷冷したジエチルエーテル（５０ｍｌ×
３回）で未反応のクロロ蟻酸ベンジルを抽出した後、氷
冷下で濃塩酸を添加してｐＨを約２に調整した。ジクロ
ロメタン（５０ｍｌ×４回）で抽出し、集めたジクロロ
メタン抽出物を無水硫酸ナトリウムで脱水して、吸引濾
過で硫酸ナトリウムを除いた後に減圧濃縮した。その濃
縮物を少量の酢酸エチルに溶解し、この中にｎ−ヘキサ
ンを加えて析出した白色結晶を吸引濾過により集めて目
的物（２）を得た（収量３．０ｇ，収率７１％）。

【０１１８】７−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）
ヘプタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３）の合成 ３．０ｇ（１０．８ｍｍｏｌ）の７−（ベンジルオキシ
カルボニルアミノ）ヘプタン酸（２）のジクロロメタン
溶液（１５０ｍｌ）を食塩−氷でマイナス１６℃に冷却
して、その溶液中にイソブテンの気流を５分間ゆっくり
と流し込んだ。次に、濃硫酸０．１ｍｌをシリンジでゆ
っくりと滴下して、再びイソブテンを５分間ゆっくりと
流し込んだ。この溶液をそのまま氷冷下で３時間、更に
室温で一晩撹拌し続けた。反応液をそのまま減圧濃縮し
てシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン
−酢酸エチル＝４：１）で精製して無色透明な液体とし
て目的物（３）を得た（収量２．２ｇ，収率６１％）。

【０１１９】７−アミノヘプタン酸ｔｅｒｔ−ブチル
（４）の合成 ２．２ｇ（６．６ｍｍｏｌ）の７−（ベンジルオキシカ
ルボニルアミノ）ヘプタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３）の
メタノール溶液（２００ｍｌ）に１．０ｇのパラジウム
カーボンを加えて水素存在下で水素の吸収が終了するま
で撹拌した。次に反応溶液を濾過後に減圧濃縮して、真
空ポンプで完全に溶媒を除くと黄色液体として目的物
（４）を得た（収量１．２５ｇ，収率９５％）。

【０１２０】７−（フェノキシカルボニルアミノ）ヘプ
タン酸ｔｅｒｔ−ブチル（５）の合成 クロロ炭酸フェニル（１．６ｇ，１０ｍｍｏｌ）のジク
ロロメタン溶液（５０ｍｌ）に氷冷温度で１．２５ｇ
（６．２ｍｍｏｌ）の７−アミノヘプタン酸ｔｅｒｔ−
ブチル（４）のジクロロメタン溶液（５０ｍｌ）を滴下
して、次にトリエチルアミン（１．０ｇ，１０ｍｍｏ
ｌ）のジクロロメタン溶液（５０ｍｌ）を滴下した。滴
下終了後、この溶液を氷冷下で１時間、更に室温で一晩
撹拌し続けた。反応溶液を飽和食塩水で洗浄後に無水硫
酸ナトリウムで脱水して、吸引濾過で硫酸ナトリウムを
除いた後に減圧濃縮した。この濃縮物をシリカゲルクロ
マトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１９：１
→９：１→４：１）で精製すると、透明液体として１．
７ｇ（収率８５％）の（５）を得た。

【０１２１】（６）の合成 ０．９ｇ（２０ｍｍｏｌ）のオキサミルオキシムと７−
（フェニルオキシカルボニルアミノ）ヘプタン酸ｔｅｒ
ｔ−ブチル１．７ｇ（２０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル
５０ｍｌに溶解し、氷冷下で０．９ｇ（５．９ｍｍｏ
ｌ）の１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク
−７−エン（ＤＢＵ）のアセトニトリル溶液１０ｍｌを
滴下した。氷冷下で３時間撹拌後、反応液をそのまま減
圧濃縮してシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサ
ン：酢酸エチル＝１：１→酢酸エチル）で精製すると、
透明液体として１．７ｇ（収率８３％）の（６）を得
た。

【０１２２】（７）の合成 １．７ｇ（４．４ｍｍｏｌ）のエステル化合物（６）を
１００ｍｌのジクロロメタンに溶解し、トリフルオロ酢
酸１０ｍｌを添加後室温で３時間撹拌した。反応溶液を
減圧濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘ
キサン：酢酸エチル＝２：１→酢酸エチル）で精製する
と、白色結晶として１．２ｇ（収率８２％）のオキサミ
ル誘導体−２（７）を得た。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） １．２１〜１．４３（ｍ，４Ｈ）， １．４３〜１．７１（ｍ，４Ｈ）， ２．２１〜２．４０（overlap,５Ｈ），３．０６（ｓ，３Ｈ）， ３．１０（ｓ，３Ｈ）， ３．１７〜３．３１（ｍ，２Ｈ）， ６．１０〜６．２６（ｔ，１Ｈ）， １０．３０〜１０．５５（ｂｒ，１Ｈ）

【０１２３】実施例３ オキサミル誘導体−３の合成

【化２３】

【０１２４】８−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）
オクタン酸（２）の合成 ５．０ｇ（３１．４ｍｍｏｌ）の８−アミノオクタン酸
（１）を２規定の水酸化ナトリウム水溶液１６ｍｌに溶
解して氷冷した。この溶液を激しく撹拌しながらクロロ
蟻酸ベンジル（７．０ｇ，４１ｍｍｏｌ）と２規定の水
酸化ナトリウム水溶液２０ｍｌをそれぞれ２回に分けて
交互に滴下した。滴下終了後にＴＨＦを１００ｍｌ加え
て、室温で７時間撹拌し続けた。氷冷したジエチルエー
テル（５０ｍｌ×３回）で未反応のクロロ蟻酸ベンジル
を抽出した後、氷冷下で濃塩酸を添加してｐＨを約２に
調整した。ジクロロメタン（５０ｍｌ×４回）で抽出
し、集めたジクロロメタン抽出物を無水硫酸ナトリウム
で脱水して、吸引濾過で硫酸ナトリウムを除いた後に減
圧濃縮した。その濃縮物を少量の酢酸エチルに溶解し、
この中にｎ−ヘキサンを加えて析出した白色結晶を吸引
濾過により集めて目的物（２）を得た。（収量７．６
ｇ，収率８３％）。

【０１２５】８−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）
オクタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３）の合成 ７．６ｇ（２６ｍｍｏｌ）の８−（ベンジルオキシカル
ボニルアミノ）オクタン酸（２）のジクロロメタン溶液
（２５０ｍｌ）食塩−氷でマイナス１６℃に冷却して、
その溶液中にイソブテンの気流を５分間ゆっくりと流し
込んだ。次に濃硫酸０．３ｍｌをシリンジでゆっくりと
滴下して、再びイソブテンを５分間ゆっくりと流し込ん
だ。この溶液をそのまま１時間、更に一晩撹拌し続け
た。反応液をそのまま減圧濃縮してシリカゲルカラムク
ロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン−酢酸エチル＝４：
１）で精製して無色透明な液体として目的物（３）を得
た（収量５．４ｇ，収率６０％）。

【０１２６】８−アミノオクタン酸ｔｅｒｔ−ブチル
（４）の合成 ５．４ｇ（１５．５ｍｍｏｌ）の８−（ベンジルオキシ
カルボニルアミノ）オクタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３）
のメタノール溶液（１００ｍｌ）に０．５ｇのパラジウ
ムカーボンを加えて水素存在下で水素の吸収が終了する
まで撹拌した。次に反応溶液を濾過後に減圧濃縮して、
真空ポンプで完全に溶媒を除くと黄色液体として目的物
（４）を得た。（収量３．５ｇ，収率１０６％）。

【０１２７】８−（フェノキシカルボニルアミノ）オク
タン酸ｔｅｒｔ−ブチル（５）の合成 クロロ炭酸フェニル（３．８ｇ，２４ｍｍｏｌ）のジク
ロロメタン溶液（１００ｍｌ）に氷冷温度で３．５ｇ
（１６ｍｍｏｌ）の８−アミノオクタン酸ｔｅｒｔ−ブ
チル（４）のジクロロメタン溶液（１０ｍｌ）を滴下し
て、次にトリエチルアミン（２．４ｇ，２４ｍｍｏｌ）
のジクロロメタン溶液（１０ｍｌ）を滴下した。滴下終
了後、この溶液をそのまま室温になるまで撹拌し、更に
一晩撹拌し続けた。反応溶液を飽和食塩水で洗浄後に無
水硫酸ナトリウムで脱水して、吸引濾過で硫酸ナトリウ
ムを除いた後に減圧濃縮した。その濃縮物をシリカゲル
カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン−酢酸エチル
＝１９：１→９：１→４：１）で精製して無色透明な液
体として目的物（５）を得た（収量４．９ｇ，収率９０
％）。

【０１２８】（６）の合成 １．８ｇ（１１ｍｍｏｌ）のオキサミルオキシムと３．
１ｇ（９．２ｍｍｏｌ）の８−（フェノキシカルボニル
アミノ）オクタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（５）をアセトニ
トリル１５０ｍｌに溶解し、氷冷下で１．７ｇ（１１ｍ
ｍｏｌ）の１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウン
デク−７−エン（ＤＢＵ）のアセトニトリル溶液２０ｍ
ｌを滴下した。氷冷下で３時間撹拌後、反応液をそのま
ま減圧濃縮してシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘ
キサン：酢酸エチル＝１：１→酢酸エチル）で精製する
と、無色透明液体として３．２ｇ（収率８６％）の
（６）を得た。

【０１２９】（７）の合成 ３．２ｇ（７．９ｍｍｏｌ）のエステル化合物（６）を
１００ｍｌのジクロロメタンに溶解し、トリフルオロ酢
酸１０ｍｌを添加後室温で２．５時間撹拌した。反応溶
液を減圧濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー（ｎ
−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１→酢酸エチル）で精製
すると、透明液体として３．９ｇ（収率８４％）のオキ
サミル誘導体−３（７）を得た。この溶液はマイナス２
０℃の冷凍庫に長時間放置しておくと白色結晶になっ
た。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） １．２０〜１．４４（ｓ，６Ｈ）， １．４５〜１．７１（ｍ，４Ｈ）， ２．２５〜２．４２（overlap,５Ｈ），３．０８（ｓ，３Ｈ）， ３．１０（ｓ，３Ｈ）， ３．１５〜３．３２（ｍ，２Ｈ）， ５．８７〜６．０２（ｂｒ，１Ｈ）

【０１３０】実施例４ オキサミル誘導体−４の合成

【化２４】

【０１３１】１１−ブロモウンデカン酸ｔｅｒｔ−ブチ
ル（２）の合成 １３．３ｇ（５０ｍｍｏｌ）の１１−ブロモウンデカン
酸（１）のジクロロメタン溶液（２００ｍｌ）を食塩−
氷でマイナス１６℃に冷却して、その溶液中にイソブテ
ンの気流を５分間ゆっくりと流し込んだ。次に濃硫酸
０．５ｍｌをシリンジでゆっくりと滴下して、再びイソ
ブテンを５分間ゆっくりと流し込んだ。この溶液をその
まま氷冷下で２時間、更に室温で３時間撹拌し続けた。
反応液をそのまま減圧濃縮してシリカゲルカラムクロマ
トグラフィー（ｎ−ヘキサン−酢酸エチル＝１９：１）
で精製して無色透明な液体として目的物（２）を得た
（収量１０．８ｇ，収率６７％）。

【０１３２】１１−（フタルイミジル）ウンデカン酸ｔ
ｅｒｔ−ブチル（３）の合成 ２５．５ｇ（７９ｍｍｏｌ）の１１−ブロモウンデカン
酸ｔｅｒｔ−ブチル（２）をＤＭＦ（５００ｍｌ）に溶
解して、１５ｇ（８１ｍｍｏｌ）のフタルイミドカリウ
ムを室温で加えた。この溶液を室温で２晩撹拌し続け
た。反応液をエーテル−水で分配し（１５０ｍｌ×４
回）、集めたエーテル層を無水硫酸マグネシウムで脱水
し、濾過後に減圧濃縮してシリカゲルカラムクロマトグ
ラフィー（ｎ−ヘキサン−酢酸エチル＝９：１）で精製
し、液体として目的物（３）を得た（収量１９ｇ，収率
６２％）。

【０１３３】１１−アミノウンデカン酸ｔｅｒｔ−ブチ
ル（４）の合成 １０ｇ（２６ｍｍｏｌ）の１１−（フタルイミジル）ウ
ンデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３）のエタノール溶液
（１５０ｍｌ）に、１．０ｇ（３１ｍｍｏｌ）の無水ヒ
ドラジンのエタノール溶液５０ｍｌを氷冷下で滴下し
た。氷冷下で２時間、室温で３時間、更に５０℃で３０
分間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮して、酢酸エチルで
溶解後ヘキサンを加えて沈殿物を濾過で除いた。濾液を
濃縮して、その濃縮物をシリカゲルクロマトグラフィー
（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１→クロロホルム：
メタノール＝９：１）で精製すると、黄色液体として
２．０ｇ（収率３０％）の（５）を得た。

【０１３４】１１−（フェノキシカルボニルアミノ）ウ
ンデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（５）の合成 クロロ蟻酸フェニル（３．５ｇ，２２．３ｍｍｏｌ）の
ジクロロメタン溶液（５０ｍｌ）に氷冷温度で４．０ｇ
（１５．６ｍｍｏｌ）の１１−アミノウンデカン酸ｔｅ
ｒｔ−ブチル（４）のジクロロメタン溶液（５０ｍｌ）
を滴下して、次にトリエチルアミン（２．２ｇ，２２ｍ
ｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５０ｍｌ）を滴下し
た。滴下終了後、この溶液を氷冷下で１時間、更に室温
で３時間撹拌し続けた。反応溶液を飽和食塩水で洗浄
し、無水硫酸ナトリウムで脱水して、吸引濾過で硫酸ナ
トリウムを除いた後に減圧濃縮した。この濃縮物をシリ
カゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル
＝９：１）で精製すると、透明液体として４．５ｇ（収
率７７％）の（５）を得た。

【０１３５】（６）の合成 ３．０ｇ（１８．５ｍｍｏｌ）のオキサミルオキシムと
１１−（フェニルオキシカルボニルアミノ）ウンデカン
酸ｔｅｒｔ−ブチル４．５ｇ（１２ｍｍｏｌ）のアセト
ニトリル１００ｍｌに溶解し、氷冷下で２．０ｇ（１３
ｍｍｏｌ）の１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウ
ンデク−７−エン（ＤＢＵ）のアセトニトリル溶液２０
ｍｌを滴下した。氷冷下で３時間撹拌後、反応液をその
まま減圧濃縮してシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−
ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製すると、透明液
体として３．８ｇ（収率７２％）の（６）を得た。

【０１３６】（７）の合成 ３．８ｇ（８．５ｍｍｏｌ）のエステル化合物（２）を
８０ｍｌのジクロロメタンに溶解し、トリフルオロ酢酸
１０ｍｌを添加後室温で１時間撹拌した。反応溶液を減
圧濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキ
サン：酢酸エチル＝１：１→酢酸エチル）で精製する
と、白色結晶として２．５ｇ（収率７６％）のオキサミ
ル誘導体−４（７）を得た。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） １．１２〜１．４０（ｓ，１２Ｈ）， １．４０〜１．７１（ｍ，４Ｈ）， ２．２０〜２．３９（overlap,５Ｈ），３．０７（ｓ，３Ｈ）， ３．０９（ｓ，３Ｈ）， ３．１６〜３．３２（ｍ，２Ｈ）， ５．９３〜６．０８（ｔ，１Ｈ）， １０．０２〜１０．７３（ｂｒ，１Ｈ）

【０１３７】実施例５ オキサミル誘導体−５の合成

【化２５】

【０１３８】４−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）
シクロヘキサンカルボン酸（２）の合成 ５．０ｇ（３５ｍｍｏｌ）の４−アミノシクロヘキサン
カルボン酸（１）を２規定の水酸化ナトリウム水溶液１
７．５ｍｌに溶解して氷冷した。この溶液を激しく撹拌
しながらクロロ蟻酸ベンジル（７．８ｇ，４６ｍｍｏ
ｌ）と２規定の水酸化ナトリウム水溶液２３ｍｌを滴下
した。滴下終了後、室温に戻して一晩撹拌した。氷冷し
たジエチルエーテル（５０ｍｌ×３回）で未反応のクロ
ロ蟻酸ベンジルを抽出した後、氷冷下で濃塩酸を添加し
てｐＨを約２に調整した。ジエチルエーテル（５０ｍｌ
×４回）で抽出し、集めたジエチルエーテル抽出物を無
水硫酸ナトリウムで脱水して、吸引濾過で硫酸ナトリウ
ムを除いた後に減圧濃縮した。その濃縮物をシリカゲル
カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン−酢酸エチル
＝１：１）で精製して目的物（２）を白色結晶として得
た（収量７．２ｇ，収率９１％）。

【０１３９】４−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）
シクロヘキサンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３）の合
成 ７．２ｇ（２６ｍｍｏｌ）の４−（ベンジルオキシカル
ボニルアミノ）シクロヘキサンカルボン酸（２）のジク
ロロメタン溶液（１５０ｍｌ）を食塩−氷でマイナス１
６℃に冷却して、その溶液中にイソブテンの気流を５分
間ゆっくりと流し込んだ。次に濃硫酸０．２５ｍｌをシ
リンジでゆっくりと滴下して、再びイソブテンを１０分
間ゆっくりと流し込んだ。この溶液をそのまま一晩撹拌
し続けて室温まで戻した。反応液をそのまま減圧濃縮し
てシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン
−酢酸エチル＝４：１）で精製して白色結晶として目的
物（３）を得た（収量５．２ｇ，収率６６％）。

【０１４０】４−アミノシクロヘキサンカルボン酸ｔｅ
ｒｔ−ブチル（４）の合成 ５．０ｇ（１５ｍｍｏｌ）の４−（ベンジルオキシカル
ボニルアミノ）シクロヘキサンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブ
チル（３）のメタノール溶液（１５０ｍｌ）に０．５ｇ
のパラジウムカーボンを加えて水素存在下で水素の吸収
が終了するまで撹拌した。次に反応溶液を濾過後に減圧
濃縮して、真空ポンプで完全に溶媒を除くと黄色液体と
して目的物（４）を得た（収量３．０ｇ，収率１００
％）。

【０１４１】４−（フェノキシカルボニルアミノ）シク
ロヘキサンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（５）の合成 ４−アミノシクロヘキサンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル
３．０ｇ（１５ｍｍｏｌ）（４）のジクロロメタン溶液
（１００ｍｌ）に、氷冷温度でクロロ炭酸フェニル
（２．８ｇ，１８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１
０ｍｌ）を滴下して、次にトリエチルアミン（１．５
ｇ，１５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１０ｍｌ）
を滴下した。滴下終了後、この溶液を氷冷下で３時間、
更に室温で１時間撹拌し続けた。反応溶液を飽和食塩水
で洗浄後に無水硫酸ナトリウムで脱水して、吸引濾過で
硫酸ナトリウムを除いた後に減圧濃縮した。この濃縮物
をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸
エチル＝４：１）で精製すると、２．９ｇ（収率６０
％）の（５）を得た。

【０１４２】（６）の合成 １．４ｇ（８．６ｍｍｏｌ）のオキサミルオキシムと４
−（フェニルオキシカルボニルアミノ）シクロヘキサン
カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル２．７ｇ（８．５ｍｍｏ
ｌ）をアセトニトリル１００ｍｌに溶解し、氷冷下で
１．３ｇ（８．６ｍｍｏｌ）の１，８−ジアザビシクロ
［５．４．０］ウンデク−７−エン（ＤＢＵ）のアセト
ニトリル溶液１５ｍｌを滴下した。氷冷下で５時間撹拌
後、反応液をそのまま減圧濃縮してシリカゲルクロマト
グラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：２）で精
製すると、２．８ｇ（収率８５％）の（６）を得た。

【０１４３】（７）の合成 ２．８ｇ（７．２ｍｍｏｌ）のハプテンのエステル
（６）を１００ｍｌのジクロロメタンに溶解し、トリフ
ルオロ酢酸１０ｍｌを添加後室温で２．５時間撹拌し
た。反応溶液を減圧濃縮して、シリカゲルクロマトグラ
フィー（酢酸エチル）で精製すると、白色結晶として
１．９ｇ（収率７９％）のオキサミル誘導体−５（７）
を得た。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） １．５０〜２．０４（overlap,８Ｈ），２．３１（ｓ，３Ｈ）， ２．４８〜２．６２（ｍ，１Ｈ）， ３．０６（ｓ，３Ｈ）， ３．０９（ｓ，３Ｈ）， ３．６３〜３．８１（ｍ，１Ｈ）， ５．９２〜６．０９（ｄ，１Ｈ）．

【０１４４】実施例６ オキサミル誘導体−６の合成

【化２６】

【０１４５】４−（ベンジルオキシカルボニルアミノメ
チル）シクロヘキサンカルボン酸（２）の合成 ２５ｇ（１６０ｍｍｏｌ）の４−（アミノメチル）シク
ロヘキサンカルボン酸（１）を２規定の水酸化ナトリウ
ム水溶液８０ｍｌに溶解して氷冷した。この溶液を激し
く撹拌しながらクロロ蟻酸ベンジル（３６ｇ，２１０ｍ
ｍｏｌ）と２規定の水酸化ナトリウム水溶液１０４ｍｌ
をそれぞれ２回に分けて交互に滴下した。滴下終了後、
室温に戻して一晩撹拌した。氷冷したジエチルエーテル
（５０ｍｌ×３回）で未反応のクロロ蟻酸ベンジルを抽
出除去した後、氷冷下で濃塩酸を添加してｐＨを約２に
調整した。ジエチルエーテル（５０ｍｌ×４回）で抽出
し、集めたジエチルエーテル抽出物を無水硫酸ナトリウ
ムで脱水して、吸引濾過で硫酸ナトリウムを除いた後に
減圧濃縮した。その濃縮物を酢酸エチルに溶解し、ヘキ
サンを加えると白色結晶として（２）を得た（収量３
０．６ｇ，収率６６％）。

【０１４６】４−（ベンジルオキシカルボニルアミノメ
チル）シクロヘキサンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル
（３）の合成 １０．６ｇ（３６ｍｍｏｌ）の４−（ベンジルオキシカ
ルボニルアミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸
（２）のジクロロメタン溶液（１５０ｍｌ）を食塩−氷
でマイナス１６℃に冷却して、その溶液にイソブテンの
気流を５分間ゆっくりと流し込んだ。次に濃塩酸０．４
ｍｌをシリンジでゆっくりと滴下して、再びイソブテン
を１０分間ゆっくりと流し込んだ。この溶液をそのまま
１日撹拌し続けた。反応液をそのまま減圧濃縮してシリ
カゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン−酢酸
エチル＝４：１）で精製して白色結晶として目的物
（３）を得た（収量７．５ｇ，収率５９％）。

【０１４７】４−（アミノメチル）シクロヘキサンカル
ボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（４）の合成 ７．２ｇ（２０．１ｍｍｏｌ）の４−（ベンジルオキシ
カルボニルアミノ）ヘプタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３）
のメタノール溶液（２００ｍｌ）に１．０ｇのパラジウ
ムカーボンを加えて水素存在下で水素の吸収が終了する
まで撹拌した。次に反応溶液を濾過後に減圧濃縮して、
真空ポンプで完全に溶媒を除くと白色固体として目的物
（４）を得た（収量４．４ｇ，収率１００％）。

【０１４８】４−（フェノキシカルボニルアミノメチ
ル）シクロヘキサンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（５）
の合成 ４．４ｇ（２１ｍｍｏｌ）の４−（アミノメチル）シク
ロヘキサンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（４）のジクロ
ロメタン溶液（１００ｍｌ）に、氷冷温度でクロロ炭酸
フェニル（４．２ｇ，２６．８ｍｍｏｌ）のジクロロメ
タン溶液（２０ｍｌ）を滴下して、次にトリエチルアミ
ン（２．５ｇ，２５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液
（１０ｍｌ）を滴下した。滴下終了後、この溶液をその
まま一晩撹拌した。反応溶液を飽和食塩水で洗浄後に無
水硫酸ナトリウムで脱水して、吸引濾過で硫酸ナトリウ
ムを除いた後に減圧濃縮した。この濃縮物をシリカゲル
クロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：
１）で精製すると、透明液体として４．８ｇ（収率６９
％）の（５）を得た。

【０１４９】（６）の合成 １．６７ｇ（１０ｍｍｏｌ）のオキサミルオキシムと４
−（フェニルオキシカルボニルアミノメチル）ヘキサン
カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル３．３３ｇ（１０ｍｍｏ
ｌ）をアセトニトリル１５０ｍｌに溶解し、氷冷下で
１．５２ｇ（１０ｍｍｏｌ）の１，８−アザビシクロ
［５．４．０］ウンデク−７−エン（ＤＢＵ）のアセト
ニトリル溶液１５ｍｌを滴下した。氷冷下で３時間撹拌
後、反応液をそのまま減圧濃縮してシリカゲルクロマト
グラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：２→酢酸
エチル）で精製して３．３ｇ（収率８２％）の（６）を
得た。

【０１５０】（７）の合成 ３．３ｇ（８．２ｍｍｏｌ）のエステル化合物（６）を
５０ｍｌのジクロロメタンに溶解し、トリフルオロ酢酸
１０ｍｌを添加後室温で２時間撹拌した。反応溶液を減
圧濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチ
ル→クロロホルム：メタノール＝４：１）で精製する
と、白色結晶として２．２ｇ（収率１００％）のオキサ
ミル誘導体−６（７）を得た。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） ０．８８〜１．０８（ｔ，２Ｈ）， １．３１〜１．６
２（overlap,３Ｈ），１．７３〜１．９０（ｍ，２
Ｈ）， １．９３〜２．０８（ｍ，２Ｈ），２．１４〜
２．３２（overlap,４Ｈ），２．９４〜３．２０（over
lap,８Ｈ），５．８９〜６．０７（ｔ，１Ｈ）

【０１５１】実施例７ オキサミル誘導体−７の合成

【化２７】

【０１５２】４−（ベンジルオキシカルボニルアミノメ
チル）安息香酸（２）の合成 ４．５ｇ（３０ｍｍｏｌ）の４−アミノメチル安息香酸
（１）を２規定の水酸化ナトリウム水溶液１５ｍｌに溶
解して氷冷した。この溶液を激しく撹拌しながらクロロ
蟻酸ベンジル（６．６ｇ，３９ｍｍｏｌ）と２規定の水
酸化ナトリウム水溶液２０ｍｌを滴下した。滴下終了
後、室温に戻して一晩撹拌した。氷冷したジエチルエー
テル（５０ｍｌ×３回）で未反応のクロロ蟻酸ベンジル
を抽出除去した後、氷冷下で濃塩酸を添加してｐＨを約
２に調整した。ジエチルエーテル（５０ｍｌ×４回）で
抽出し、集めたジエチルエーテル抽出物を無水硫酸ナト
リウムで脱水して、吸引濾過で硫酸ナトリウムを除いた
後に減圧濃縮した。その濃縮物を酢酸エチルに溶解し、
ヘキサンを加えると白色結晶として（２）を得た（収量
６．０ｇ，収率７１％）。

【０１５３】４−（ベンジルオキシカルボニルアミノメ
チル）安息香酸ｔｅｒｔ−ブチル（３）の合成 ５．８ｇ（２０ｍｍｏｌ）の４−（ベンジルオキシカル
ボニルアミノメチル）安息香酸（２）をジクロロメタン
（２５０ｍｌ）に懸濁して、食塩−氷でマイナス１６℃
に冷却し、その懸濁液中にイソブテンの気流を５分間ゆ
っくりと流し込んだ。次に濃塩酸０．７ｍｌをシリンジ
でゆっくりと滴下して、再びイソブテンを２０分間ゆっ
くりと流し込んだ。この溶液をそのまま２日撹拌し続け
た。反応液をそのまま減圧濃縮してシリカゲルカラムク
ロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン−酢酸エチル＝４：
１）で精製して目的物（３）を得た（収量３．７８ｇ，
収率５４％）。

【０１５４】４−（アミノメチル）安息香酸ｔｅｒｔ−
ブチル（４）の合成 ３．７８ｇ（１１ｍｍｏｌ）の４−（ベンジルオキシカ
ルボニルアミノメチル）安息香酸ｔｅｒｔ−ブチル
（３）のメタノール溶液（２００ｍｌ）に０．５ｇのパ
ラジウムカーボンを加えて水素存在下で水素の吸収が終
了するまで撹拌した。次に反応溶液を濾過後に減圧濃縮
して、真空ポンプで完全に溶媒を除いて目的物（４）を
得た（収量２．２ｇ，収率９６％）。

【０１５５】４−（フェノキシカルボニルアミノメチ
ル）安息香酸ｔｅｒｔ−ブチル（５）の合成 ２．２ｇ（１０．６ｍｍｏｌ）の４−（アミノメチル）
安息香酸ｔｅｒｔ−ブチル（４）のジクロロメタン溶液
（１００ｍｌ）に、氷冷温度でクロロ炭酸フェニル
（２．１ｇ，１３．４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液
（１０ｍｌ）を滴下して、次にトリエチルアミン（１．
１ｇ，１１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１０ｍ
ｌ）を滴下した。氷冷下で２時間、更に室温で３時間撹
拌後、反応溶液を飽和食塩水で洗浄後に無水硫酸ナトリ
ウムで脱水して、吸引濾過で硫酸ナトリウムを除いた後
に減圧濃縮した。この濃縮物をシリカゲルクロマトグラ
フィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９：１）で精製す
ると、白色結晶として１．９３ｇ（収率５５％）の
（５）を得た。

【０１５６】（６）の合成 ０．９６ｇ（５．９ｍｍｏｌ）のオキサミルオキシムと
４−（フェニルオキシカルボニルアミノメチル）安息香
酸ｔｅｒｔ−ブチル１．９ｇ（５．８ｍｍｏｌ）をアセ
トニトリル１００ｍｌに溶解し、氷冷下で０．８８ｇ
（５．８ｍｍｏｌ）の１，８−ジアザビシクロ［５．
４．０］ウンデク−７−エン（ＤＢＵ）のアセトニトリ
ル溶液１５ｍｌを滴下した。氷冷下で４．５時間撹拌
後、反応液をそのまま減圧濃縮してシリカゲルクロマト
グラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：２→酢酸
エチル）で精製して１．５３ｇ（収率６７％）の（６）
を得た。

【０１５７】（７）の合成 １．５ｇ（３．８ｍｍｏｌ）のエステル化合物（６）を
１００ｍｌのジクロロメタンに溶解し、トリフルオロ酢
酸１０ｍｌを添加後室温で３時間撹拌した。反応溶液を
減圧濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサ
ン：酢酸エチル＝１：１→酢酸エチル）で精製すると、
白色結晶として０．８ｇ（収率６２％）のオキサミル誘
導体−７（７）を得た。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） ２．３３（ｓ，３Ｈ）， ３．０７（ｓ，３Ｈ）， ３．０９（ｓ，３Ｈ）， ４．４５〜４．６１（ｄ，２Ｈ）， ６．２９〜６．３５（ｂｒ，１Ｈ），７．３８〜７．４８（ｄ，２Ｈ）， ７．９９〜８．１２（ｄ，２Ｈ）．

【０１５８】実施例８ オキサミル誘導体−８および９
の合成

【化２８】

【０１５９】（２）の合成 ４．０ｇ（２５ｍｍｏｌ）のオキサミルオキシム（１）
とブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチル５．０ｇ（２５ｍｍｏ
ｌ）、それに炭酸カリウム１２ｇ（８７ｍｍｏｌ）を１
００ｍｌのアセトニトリルに加えて、８０℃で還流させ
ながら３時間撹拌した。反応液をセライトで濾過して濾
液を濃縮後、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン
−酢酸エチル＝１：１）で精製すると、白色結晶として
６．０ｇ（収率８７％）の（２）を得た。

【０１６０】（３）の合成 ５．８ｇ（２１ｍｍｏｌ）の（２）をジクロロメタン１
００ｍｌに溶解して、トリフルオロ酢酸１０ｍｌを加え
た後、室温で３時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮し、
シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル
＝１：１）で精製すると、白色結晶として３．９ｇ（収
率８４％）のオキサミル誘導体−８（３）を得た。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） ２．２５（ｓ，３Ｈ），３．０３（ｓ，３Ｈ），３．０
６（ｓ，３Ｈ），４．７６（ｓ，２Ｈ），８．１０
（ｓ，１Ｈ）．

【０１６１】（４）の合成 ２．２ｇ（１０ｍｍｏｌ）の（３）、１．６ｇ（１０ｍ
ｍｏｌ）の４−アミノ酪酸ｔｅｒｔ−ブチル、及びＮ−
ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＮＳｕ）１．５ｇ（１
３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液３０ｍｌを氷冷して、ジシク
ロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）２．５ｇ（１２ｍ
ｍｏｌ）のＴＨＦ溶液５０ｍｌを滴下した。滴下終了
後、室温で一晩撹拌した。析出してきたジシクロヘキシ
ル尿素を濾過で除いた後、濾液を濃縮してシリカゲルク
ロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル＝１：１）で
精製すると、白色結晶として２．４ｇ（収率６６％）の
エステル化合物（４）を得た。

【０１６２】（５）の合成 ２．３ｇ（６．４ｍｍｏｌ）のエステル化合物（４）を
１００ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、トリフルオロ
酢酸１０ｍｌを加えて室温で２時間撹拌した。反応溶液
を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチ
ル）で精製すると、白色結晶として１．３ｇ（収率６７
％）のオキサミル誘導体−９（５）を得た。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） １．７８〜２．１８（ｍ，２Ｈ）, ２．０９〜２．５０（overlap,５Ｈ）， ３．０４（ｓ，３Ｈ）， ３．０６（ｓ，３Ｈ）， ３．４１（ｑ，２Ｈ）， ４．６２（ｓ，２Ｈ）， ６．４８〜６．８５（ｂｒ，１Ｈ）,７．８０〜８．５０（ｂｒ，１Ｈ）

【０１６３】実施例９ オキサミル誘導体−１０の合成

【化２９】

【０１６４】（２）の合成 ０．８ｇ（５ｍｍｏｌ）のオキサミルオキシム（１）と
０．７ｇ（７ｍｍｏｌ）のコハク酸無水物を３０ｍｌの
ジクロロメタンに溶解して室温で一晩撹拌した。反応溶
液を減圧濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘ
キサン：酢酸エチル＝１：１→酢酸エチル）で精製する
と、白色結晶として１．０ｇ（収率７８％）の（２）を
得た。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） ２．３３（ｓ，３Ｈ）， ２．６８〜２．８８（ｍ，４Ｈ）， ３．０６（ｓ，３Ｈ）， ３．１１（ｓ，３Ｈ）， ９．１０〜９．５０（ｂｒ，１Ｈ）

【０１６５】実施例１０ オキサミル誘導体−１１の合
成

【化３０】

【０１６６】（２）の合成 １．９ｇ（１０．４ｍｍｏｌ）のアジピン酸クロリドを
ジクロロメタン１００ｍｌに溶解して、氷冷後１．７ｇ
（１０．５ｍｍｏｌ）のオキサミルオキシムのジクロロ
メタン溶液１０ｍｌ、０．８ｇ（１０ｍｍｏｌ）のピリ
ジンのジクロロメタン溶液１０ｍｌを滴下して１時間氷
冷下で撹拌した。２．０ｇ（１２ｍｍｏｌ）のベラトリ
ルアルコールのジクロロメタン溶液１０ｍｌ、０．８ｇ
（１０ｍｍｏｌ）のピリジンのジクロロメタン溶液１０
ｍｌを滴下して氷冷下で３０分、更に室温で１．５時間
撹拌した。反応溶液を水洗、無水硫酸マグネシウムで脱
水、濾過、濃縮してシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ
−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１→酢酸エチル）で粗精
製した。この粗精製物を次の反応にそのまま供した。

【０１６７】（３）の合成 （２）を含む２．０ｇの粗精製物を１００ｍｌのジクロ
ロメタンに溶解し、トリフルオロ酢酸１０ｍｌを添加後
室温で１時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮して、シリ
カゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝
１：１）で精製すると、１．３ｇ（（１）からの通算収
率４３％）の（３）を得た。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） １．６４〜１．８３（ｍ，４Ｈ），２．３３（ｓ，３Ｈ）， ２．３６〜２．４５（ｔ，２Ｈ），２．４５〜２．５６（ｔ，２Ｈ）， ３．０５（ｓ，３Ｈ）， ３．１１（ｓ，３Ｈ）

【０１６８】実施例１１ オキサミル誘導体−１２の合
成

【化３１】

【０１６９】（２）の合成 ３．５ｇ（５０ｍｍｏｌ）のナトリウムチオメトキシド
をエタノール１５０ｍｌに溶解して、氷冷下で９．０ｇ
（５０ｍｍｏｌ）の１−ブロモ−３，３−ジメチル−２
−ブタノン（１）のエタノール溶液２０ｍｌを滴下し
た。室温で２．５時間撹拌し、反応液を濾過後、濃縮し
た。この濃縮物をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−
ヘキサン：酢酸エチル＝１：９→酢酸エチル）で精製す
ると、透明液体として４．４ｇ（収率６０％）の（２）
を得た。

【０１７０】（３）の合成 ４．４ｇ（３０ｍｍｏｌ）の（２）をエタノール２００
ｍｌに溶解して、２．５ｇ（３６ｍｍｏｌ）のヒドロキ
ルアミン塩酸塩と３．５ｇ（３６ｍｍｏｌ）の酢酸カリ
ウムを加えて１１０℃で５時間加熱還流した。反応溶液
を濾過して、濾液を濃縮後にシリカゲルクロマトグラフ
ィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９：１→４：１）で
精製すると、透明液体として４．０ｇ（収率８２％）の
（３）を得た。

【０１７１】（４）の合成 ２．６ｇ（８．４ｍｍｏｌ）の６−（フェニルオキシカ
ルボニルアミノ）ヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルをアセト
ニトリル２００ｍｌに溶解して、氷冷下で１．５ｇ
（９．３ｍｍｏｌ）の３,３−ジメチル−１−（メチル
チオ）−２−ブタノンオキシム（チオファノックスオキ
シム）（３）のアセトニトリル溶液２０ｍｌ、次いで
１．３ｇ（８．５ｍｍｏｌ）の１，８−ジアザビシクロ
［５．４．０］ウンデク−７−エン（ＤＢＵ）のアセト
ニトリル溶液２０ｍｌを滴下した。そのまま氷冷下で５
時間撹拌後、反応溶液をそのまま濃縮して、シリカゲル
クロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９：
１→１：１）で精製すると、透明液体として，２．３ｇ
（収率７３％）の（４）を得た。

【０１７２】（５）の合成 ２．３ｇ（６．１ｍｍｏｌ）の（４）を２００ｍｌのジ
クロロメタンに溶解し、トリフルオロ酢酸１０ｍｌを添
加後室温で３時間撹拌した。反応溶液をそのまま減圧濃
縮して、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢
酸エチル＝４：１→２：１→１：１）で精製すると、透
明液体として１．３５ｇ（収率６９％）の（５）を得
た。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） １．２４（ｓ，９Ｈ）， １．３１〜１．４８（ｍ，２Ｈ）， １．５４〜１．７８（ｍ，４Ｈ），２．２５（ｓ，３Ｈ）， ２．３２〜２．４３（ｔ，２Ｈ），３．２３〜３．３６（ｍ，２Ｈ）， ３．４４（ｓ，２Ｈ）， ６．２４〜６．３８（ｂｒ，１Ｈ）

【０１７３】実施例１２ オキサミル誘導体−１３の合
成

【化３２】

【０１７４】（２）の合成 ２．３ｇ（５７．５ｍｍｏｌ）の水酸化ナトリウムをエ
タノール５０ｍｌに溶解して、氷冷下で４．５ｇ（７
２．６ｍｍｏｌ）エチルメルカプタンのエタノール溶液
１０ｍｌを滴下した。１０ｇ（５５．９ｍｍｏｌ）の１
−ブロモ−３，３−ジメチル−２−ブタノン（１）のエ
タノール溶液２０ｍｌを滴下して一晩撹拌した。反応液
を濾過後、濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー
（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４９：１→９：１）で精
製すると、透明液体として７．４ｇ（収率８３％）の
（２）を得た。

【０１７５】（３）の合成 ７．４ｇ（４６．３ｍｍｏｌ）の（２）をエタノール２
００ｍｌに溶解して、３．８６ｇ（５５．５ｍｍｏｌ）
のヒドロキルアミン塩酸塩と５．４４ｇ（５５．５ｍｍ
ｏｌ）の酢酸カリウムを加えて１１０℃で５時間加熱還
流した。反応溶液を濾過して、濾液を濃縮後にシリカゲ
ルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝
９：１）で精製すると、透明液体として７．１２ｇ（収
率８８％）の（３）を得た。

【０１７６】（４）の合成 １．７５ｇ（１０ｍｍｏｌ）のオキシム（３）をアセト
ニトリル１００ｍｌに溶解し、３．０７ｇ（１０ｍｍｏ
ｌ）の６−（フェニルオキシカルボニルアミノ）ヘキサ
ン酸ｔｅｒｔ−ブチルのアセトニトリル溶液２０ｍｌを
氷冷下で一気に加えた。次いで１．５２ｇ（１０ｍｍｏ
ｌ）の１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク
−７−エン（ＤＢＵ）のアセトニトリル溶液２０ｍｌを
氷冷下で滴下し、そのまま３時間撹拌した。反応溶液を
濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサ
ン：酢酸エチル＝９：１→１：１）で精製すると、透明
液体として２．８６ｇ（収率７４％）の（４）を得た。

【０１７７】（５）の合成 ２．８ｇ（７．２ｍｍｏｌ）の（４）を１００ｍｌのジ
クロロメタンに溶解し、トリフルオロ酢酸１０ｍｌを添
加後室温で２．５時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮し
て、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エ
チル＝４：１→１：１→酢酸エチル）で精製すると、白
色結晶として１．６７ｇ（収率７０％）の（５）を得
た。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） １．１７〜１．３２（overlap,１２Ｈ）,１．３２〜１．５０（ｍ，２Ｈ）， １．５１〜１．７６（ｍ，４Ｈ）， ２．３０〜２．４１（ｍ，２Ｈ）， ２．６５〜２．７６（ｑ，２Ｈ）， ３．２１〜３．３２（ｍ，２Ｈ）， ３．４４（ｓ，２Ｈ）， ６．２２〜６．３８（ｂｒ，１Ｈ）

【０１７８】実施例１３ オキサミル誘導体−１４の合
成

【化３３】

【０１７９】（２）の合成 １．１２ｇ（２８ｍｍｏｌ）の水酸化ナトリウムをエタ
ノール５０ｍｌに溶解して、室温で２．５ｇ（３３ｍｍ
ｏｌ）のイソプロピルメルカプタンのエタノール溶液１
５ｍｌを滴下した。５．０ｇ（２８ｍｍｏｌ）の１−ブ
ロモ−３，３−ジメチル−２−ブタノン（１）のエタノ
ール溶液１５ｍｌを室温で滴下して２日間撹拌した。反
応液を炭酸カリウム水溶液−ジクロロメタンで分配し
て、ジクロロメタン層を無水硫酸マグネシウムで脱水、
濾過、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘ
キサン：酢酸エチル＝４９：１）で精製すると、透明液
体として４．３ｇ（収率８８％）の（２）を得た。

【０１８０】（３）の合成 ４．３ｇ（２４ｍｍｏｌ）の（２）、２．０ｇ（２８．
８ｍｍｏｌ）のヒドロキルアミン塩酸塩と２．８ｇ（２
８．６ｍｍｏｌ）の酢酸カリウムをエタノール２００ｍ
ｌに加えて１１０℃で５時間加熱還流した。反応溶液を
濾過して、濾液を濃縮後にシリカゲルクロマトグラフィ
ー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９：１）で精製する
と、白色結晶として４．４９ｇ（収率９６％）の（３）
を得た。

【０１８１】（４）の合成 １．９ｇ（１０ｍｍｏｌ）のオキシム（３）をアセトニ
トリル５０ｍｌに溶解し、３．０７ｇ（１０ｍｍｏｌ）
の６−（フェニルオキシカルボニルアミノ）ヘキサン酸
ｔｅｒｔ−ブチルのアセトニトリル溶液１０ｍｌを室温
で加えた。次いで１．５２ｇ（１０ｍｍｏｌ）の１，８
−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン
（ＤＢＵ）のアセトニトリル溶液１０ｍｌを氷冷下で滴
下し、そのまま氷冷下で２時間、更に室温で２時間撹拌
した。反応溶液を濃縮して、シリカゲルクロマトグラフ
ィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９：１→４：１→
１：１）で精製すると、透明液体として３．２３ｇ（収
率８０％）の（４）を得た。

【０１８２】（５）の合成 ３．２ｇ（８．０ｍｍｏｌ）の（４）を１５０ｍｌのジ
クロロメタンに溶解し、トリフルオロ酢酸１０ｍｌを添
加後室温で３時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮して、
シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル
＝４：１→１：１）で精製すると、１．５１ｇ（収率５
５％）の（５）を得た。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） １．２３（ｓ，９Ｈ）， １．２４〜１．３１（ｄ，６Ｈ）， １．３２〜１．４８（ｍ，２Ｈ），１．５１〜１．７６（ｍ，４Ｈ）， ２．２９〜２．４１（ｍ，２Ｈ），３．０４〜３．１９（ｍ，１Ｈ）， ３．２１〜３．３５（ｍ，２Ｈ）， ３．４２（ｓ，２Ｈ）， ６．２２〜６．３８（ｂｒ，１Ｈ）

【０１８３】実施例１４ オキサミル誘導体−１５の合
成

【化３４】

【０１８４】（２）の合成 １．１２ｇ（２８ｍｍｏｌ）の水酸化ナトリウムをエタ
ノール５０ｍｌに溶解して、室温で２．５ｇ（３３ｍｍ
ｏｌ）のｎ−プロピルメルカプタンのエタノール１５ｍ
ｌを滴下した。５．０ｇ（２８ｍｍｏｌ）の１−ブロモ
−３，３−ジメチル−２−ブタノン（１）のエタノール
溶液１５ｍｌを室温で滴下して２日間撹拌した。反応液
を炭酸カリウム水溶液−ジクロロメタンで分配して、ジ
クロロメタン層を無水硫酸マグネシウムで脱水、濾過、
濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサ
ン：酢酸エチル＝４９：１）で精製すると、透明液体と
して４．２８ｇ（収率８８％）の（２）を得た。

【０１８５】（３）の合成 ６．１６ｇ（３５．４ｍｍｏｌ）の（２）、３．０ｇ
（４２．５ｍｍｏｌ）のヒドロキルアミン塩酸塩と４．
１６ｇ（４２．５ｍｍｏｌ）の酢酸カリウムをエタノー
ル２００ｍｌに加えて８０℃で一晩加熱還流した。反応
溶液を濾過して、濾液を濃縮後にシリカゲルクロマトグ
ラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９：１）で精製
すると、透明液体として６．２５ｇ（収率９３％）の
（３）を得た。

【０１８６】（４）の合成 ２．０ｇ（１６ｍｍｏｌ）のオキシム（３）と３．１ｇ
（１０ｍｍｏｌ）の６−（フェニルオキシカルボニルア
ミノ）ヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルをアセトニトリル５
０ｍｌに溶解した。次に１．５２ｇ（１０ｍｍｏｌ）の
１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−
エン（ＤＢＵ）のアセトニトリル溶液２０ｍｌを氷冷下
で滴下し、そのまま氷冷下で２時間、更に室温で２時間
撹拌した。反応溶液を濃縮して、シリカゲルクロマトグ
ラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９：１→４：
１）で精製すると、透明液体として２．８３ｇ（収率７
０％）の（４）を得た。

【０１８７】（５）の合成 ２．８ｇ（７．０ｍｍｏｌ）の（４）を１００ｍｌのジ
クロロメタンに溶解し、トリフルオロ酢酸１０ｍｌを添
加後室温で１時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮して、
シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン→ヘキサン：
酢酸エチル＝９：１→４：１）で精製すると、１．２ｇ
（収率５０％）の（５）を得た。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） ０．９１〜１．０３（ｔ，３Ｈ），１．２３（ｓ，９
Ｈ），１．３２〜１．４８（ｍ，２Ｈ），１．５３〜
１．７７（ｍ，６Ｈ），２．３１〜２．４１（ｔ，２
Ｈ），２．６１〜２．７０（ｔ，２Ｈ），３．２３〜
３．３４（ｑ，２Ｈ），３．４２（ｓ，２Ｈ），６．２
３〜６．３８（ｂｒ，１Ｈ）．

【０１８８】実施例１５ 免疫原およびスクリーニング
用抗原の作製 上記実施例１−１４および製造例において製造したオキ
サミル誘導体−１ないし−１５、およびオキサミル誘導
体−Ｃに活性化エステル法により担体蛋白質を結合さ
せ、免疫原およびスクリーニング用抗原を作製した。ま
ず、オキサミル誘導体をハプテンとして、各々３．５μ
ｍｏｌをＤＭＳＯ５０μｌに溶解した。次にこれらの溶
液にＮ−ヒドロキシこはく酸イミド（５μｍｏｌ）をＤ
ＭＳＯ１０μｌに溶解し添加後、さらに１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（４
μｍｏｌ）をＤＭＳＯ２０μｌに溶解し添加した。室温
にて１．５時間反応させた後、この反応溶液に８５ｍＭ
ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）５００μｌに溶解したＢＳ
ＡあるいはＫＬＨ各々１０ｍｇを、さらに添加し、再び
室温にて１．５時間反応させた。反応終了後ダルベコの
リン酸緩衝液（以下、「ＰＢＳ（−）」という）に対し
て透析し、オキサミル誘導体−ＫＬＨ結合体、オキサミ
ル誘導体−ＢＳＡ結合体を各々調製した。

【０１８９】実施例１６ 免疫感作 実施例１５で調製したオキサミル誘導体とＫＬＨの結合
体１００μｇをＰＢＳ（−）５０μｌに溶解し、等量の
フロイント完全アジュバントと乳化混合した後、Ｂａｌ
ｂ／ｃマウスの腹腔内に接種した。その後１カ月後にそ
れぞれの初回免疫量の１／４量を追加免疫し、さらに１
４日後に追加免疫と同量を最終免疫した。

【０１９０】実施例１７ 抗血清の採取及び抗体活性の
測定 追加免疫後のマウス尾静脈から血液を採取し、抗血清を
調製した。得られた抗血清の活性を実施例１５で調製し
たオキサミル誘導体とＢＳＡとの結合体を用いたＥＬＩ
ＳＡ法にて測定した。

【０１９１】各免疫原に対応するＢＳＡとの結合体（４
μｇ／ｍｌ）をＰＢＳ（−）に溶解し、９６ウェルのマ
イクロタイタープレートに１００μｌ／ウェルで添加
し、４℃で一晩静置することにより、固相化した。次に
３００μｌ／ウェルでブロッキング緩衝液｛１％ＢＳＡ
と６０ｍＭ ＮａＣｌを添加した８５ｍＭ ホウ酸緩衝
液（ｐＨ８．０）｝に置き換え、室温で１時間ブロッキ
ングした。このウェルを洗浄液（６０ｍＭ ＮａＣｌを
添加したホウ酸緩衝液）で洗浄した後、抗血清を１００
μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応した。洗浄液で
３回洗浄した後、第二抗体希釈液｛０．３％ＢＳＡと６
０ｍＭ ＮａＣｌを添加した８５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）｝で１０００倍希釈したペルオキシダーゼ結
合抗マウスＩｇＧ抗体（カペル社製）を１００μｌ／ウ
ェルで添加し、室温で１時間反応した。洗浄液で３回洗
浄した後、ペルオキシダーゼの基質溶液｛３,３',５,
５'−テトラメチルベンジジン（１００μｇ／ｍｌ）、
０．００６％過酸化水素を添加した０．１Ｍ酢酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ５．５）｝で１０分間発色し、１Ｎ硫
酸で反応停止後４５０ｎｍの吸光度を測定した。

【０１９２】実施例１８ 間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法に
よる抗血清のオキサミルとの反応性 実施例３で活性の確認できた抗血清について、オキサミ
ルに対する反応性を間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により評
価した。

【０１９３】まず、実施例１７と同様に固相化し、ブロ
ッキングしたマイクロタイタープレートへ、希釈液｛１
５０ｍＭ ＮａＣｌを添加した８５ｍＭホウ酸緩衝液
（ｐＨ８．０）｝で適当な濃度に希釈したオキサミル溶
液を５０μｌ／ウェルで加え、その後、直ちに同じ希釈
液で適当な濃度に希釈した抗血清溶液を５０μｌ／ウェ
ルで加えて混合し、室温で１時間反応した。３回洗浄し
た後、実施例１７に示したＥＬＩＳＡ法と同様の方法で
第二抗体と反応させ、発色後、４５０ｎｍの吸光度を測
定した。

【０１９４】結果は図１に示すようにオキサミル誘導体
−１から作製した抗血清がオキサミルとの反応性が最も
高かった。

【０１９５】実施例１９ モノクローナル抗体の作製 細胞融合は、実施例１６の最終免疫後３日目のマウスに
脾臓細胞を用いて行った。ステンレスメッシュで大きな
固形物を除去しながら、ダルベコ培地中に取り出した脾
臓細胞をダルベコ培地にて３回洗浄した後、マウスのミ
エローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と細胞数の
比で５：１（脾臓細胞：ミエローマ細胞）になるように
混合し、遠心（１，２００ｒｐｍ、５分間）して細胞沈
渣を集めた。この細胞沈渣に予め３７℃に加温しておい
た５０％ポリエチレングリコール（分子量１，５００）
１ｍｌを加え、細胞を融合した。細胞融合は、ダルベコ
培地１０ｍｌを徐々に添加し、牛胎児血清（以下「ＦＢ
Ｓ」という）１ｍｌを更に添加することにより、停止し
た。融合した細胞は、１０％ＦＢＳを添加したダルベコ
培地（以下「ダルベコ／１０％ＦＢＳ培地」という）に
ヒポキサンチン（１００μＭ）、アミノプテリン（０．
４μＭ）、およびチミジン（１６μＭ）を添加したＨＡ
Ｔ培地に懸濁後、９６ウェルのポリスチレンプレートに
２×１０⁵細胞／ウェルで分注し、３７℃、５％二酸化
炭素存在下で１０日間−１４日間培養した。培養後、ウ
ェル中の抗体活性の有無をそれぞれスクリーニングし
た。

【０１９６】抗体の反応性は、実施例１５で調製したオ
キサミル誘導体−ＢＳＡ結合体を用いて実施例１７と同
様の方法で測定した。

【０１９７】誘導体とＢＳＡの結合体に反応性を示した
ウェル中のハイブリドーマは、限界希釈法によって細胞
クローニングし、モノクローナル抗体産生細胞とした。
これらのうちオキサミル誘導体１−ＢＳＡ結合体を抗原
として得られたＯＸＭ６−８を平成９年７月３日に、寄
託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６３０１で工業技術院生命工学
工業研究所（〒３０５ 茨城県つくば市東１丁目１番３
号）に寄託した。

【０１９８】実施例２０ 間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法に
よるモノクローナル抗体のオキサミルとの反応性 実施例１９で得られたハイブリドーマのうち４株のハイ
ブリドーマ（ＯＸＭＨ３、ＯＸＭ２−３、ＯＸＭ３−
２、ＯＸＭ６−８）が産生するモノクローナル抗体（以
後モノクローナル抗体は、これらを産生するハイブリド
ーマと同一名称を用いる）の、オキサミルとの反応性を
実施例１８と同様の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって
検討した。

【０１９９】各モノクローナル抗体について得られた各
濃度における吸光度から以下の式：

【化３５】 を用いて阻害率を計算した。その結果、ＯＸＭ Ｈ３が
約１,０００〜１０,０００ｎｇ／ｍｌ、ＯＸＭ２−３と
ＯＸＭ３−２が約１００〜１０,０００ｎｇ／ｍｌ、Ｏ
ＸＭ６−８が約１０〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲でオキサ
ミルを測定することができた。従って、実施例１で合成
したオキサミル誘導体１を用いて作製した抗体ＯＸＭ６
−８が、オキサミルと最も高い反応性を示すことが明ら
かとなった。

【０２００】実施例２１ モノクローナル抗体の精製 まず、ハイブリドーマをダルベコ／１０％ＦＢＳ培地を
用いて培養した。その培養上清に５０％飽和となるよう
に硫安を加え、４℃て一晩撹拌した。生じた沈殿物に蒸
留水を加えて可溶化した後、ＰＢＳ（−）で透析し、Ａ
ｖｉｄ ＡＬゲル（バイオプローブ インターナショナ
ル社製）カラムクロマトグラフィーによって精製した。

【０２０１】実施例２２ オキサミル誘導体とＨＲＰと
の結合体の作製 表１に示した各オキサミル誘導体１．２５μｍｏｌをＤ
ＭＳＯ ５０μｌに溶解した。この溶液へＤＭＳＯに溶
解したＮ−ヒドロキシこはく酸イミド（５．５μｍｏ
ｌ）３μｌ、および塩酸１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミド（３．５μｍｏｌ）
７μｌを加え、室温にて１時間反応させた。この反応液
に１Ｍ炭酸水素ナトリウム４０μｌを加え、更にＨＲＰ
溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）２５０μｌを加えて混合し、室
温にて３時間反応した。得られた反応液から、ゲル濾過
カラム（Ｇ−２５）で低分子化合物を除去し、オキサミ
ル誘導体−ＨＲＰ結合体を得た。

【０２０２】実施例２３ 直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法で
のモノクローナル抗体ＯＸＭ６−８とオキサミルとの反
応性 実施例２１で精製したモノクローナル抗体ＯＸＭ６−８
と実施例２２で調製したオキサミル誘導体−ＨＲＰ結合
体を用いて、オキサミルとの反応性を直接競合阻害ＥＬ
ＩＳＡ法で比較した。直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法は、以
下の手順で実施した。

【０２０３】まず、実施例２１で精製したＯＸＭ６−８
を２μｇ／ｍｌの濃度で５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ８．３）に溶解し、９６ウェルのマイクロタイタ
ープレートに１００μｌ／ウェルで加えた後、４℃で一
晩静置することにより固相化した。つぎに３００μｌ／
ウェルでプロッキング緩衝液に置き換え、室温で１時間
ブロッキングした。また、このプレートとは別にオキサ
ミル溶液とオキサミル誘導体−ＨＲＰ結合体を最終濃度
が０．１５％ＢＳＡ、６０ｍＭ ＮａＣｌとなるように
これらを添加した８５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）
中で混合し、ブロッキングしたプレートに１００μｌ／
ウェルで加えた後、室温にて１時間反応した。洗浄液で
５回洗浄した後、ペルオキシダーゼの基質溶液で発色さ
せ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。

【０２０４】図２に示したように、ＯＸＭ６−８は、直
接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって約４〜５００ｎｇ／ｍ
ｌの測定範囲でオキサミルを測定することが可能であっ
た。

【０２０５】実施例２４ 直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法に
おける異種のオキサミル誘導体の効果 抗体の作製に使用したものとは構造の異なるオキサミル
誘導体とＨＲＰとの結合体を、標識競合化合物として用
いて、実施例２３と同様に直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法を
行った。

【０２０６】その結果、図３に示すように、オキサミル
誘導体−１を免疫原として作製されたモノクローナル抗
体ＯＸＭ６−８に対し、リンカーにシクロヘキサン環を
導入したオキサミル誘導体−５（実施例５）、あるいは
リンカー付近のアミノ基を除去したオキサミル誘導体−
１０（実施例９）もしくは−１１（実施例１０）を競合
物質として使用した場合の方が、オキサミル誘導体−１
自身を使用した場合よりも高感度にオキサミルを測定で
きることが明らかとなった。すなわち、例えば、オキサ
ミル誘導体−１１を使用した場合、約０．５−２０ｎｇ
／ｍｌの範囲でオキサミルの測定が可能となった。

【０２０７】実施例２５ 直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法に
おけるＯＸＭ６−８のメタノール耐性 実施例２３に示した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法におい
て、オキサミル誘導体−４を標識競合化合物として、測
定系に与えるメタノールの影響を調べた。その結果、２
０％程度までのメタノール濃度であれば、ほぼ同じ阻害
率でオキサミルと反応した。

【０２０８】実施例２６ ＯＸＭ６−８のオキシム類縁
化合物との交差反応性 ＯＸＭ６−８のオキサミル類縁化合物との交差反応性
を、標識競合化合物としてオキサミル誘導体−４を用い
た直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって調べた。結果は、
これらの化合物未添加時の吸光度を５０％阻害する濃度
を各々ＩＣ₅₀値として、表１に示した。

【０２０９】

【表１】 ＯＸＭ６−８は表１に示す類縁化合物とほとんど交差反
応しないことがわかった。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明のオキサミル誘導体を用いて得
られた抗血清の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるオキサ
ミルとの反応性を示す。

【図２】図２は、本発明のモノクローナル抗体ＯＸＭ６
−８の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるオキサミルとの
反応性を示す。

【図３】図３は、本発明のモノクローナル抗体ＯＸＭ６
−８の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において、標識競合化
合物を変えた場合のオキサミルとの反応性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/531 Ａ 33/531 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 三宅 司郎 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 山口 優樹 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 別府 佳紀 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の式（１）−（４）： 【化１】 ［式（１）−（４）中、 Ｒ₁は、所望により１個ないし２個のハロゲン原子、ま
   たは炭素数１−３のアルキル基で置換されていてもよい
   以下の式（Ｒ_1a）−（Ｒ_1d）： 【化２】 からなる群から選択される構造を有し；Ｒ₂は、（Ｃ
   Ｈ₂）_nc、ＣＨ₂ＣＯＮＨ（ＣＨ₂）_nd、またはＣＯ（Ｃ
   Ｈ₂）_neであり、ここにおいて、ｎｃは、１−３の整数
   であり、ｎｄは、１−５の整数であり、ｎｅは、１−５
   の整数である；Ｒ₃は、炭素数１−６のアルキル基であ
   り；ｎａは、６−１５の整数であり；そしてｎｂは、１
   −１０の整数である］からなる群から選択される構造を
   有する化合物。
2. 【請求項２】請求項１に記載の化合物と高分子化合物又
   は標識物質との結合体。
3. 【請求項３】以下の式（１）−（４）： 【化３】 ［式（１）−（４）中、 Ｒ₁は、所望により１個ないし２個のハロゲン原子、ま
   たは炭素数１−３のアルキル基で置換されていてもよい
   以下の式（Ｒ_1a）−（Ｒ_1d）： 【化４】 からなる群から選択される構造を有し；Ｒ₂は、（Ｃ
   Ｈ₂）_nc、ＣＨ₂ＣＯＮＨ（ＣＨ₂）_nd、またはＣＯ（Ｃ
   Ｈ₂）_neであり、ここにおいて、ｎｃは、１−３の整数
   であり、ｎｄは、１−５の整数であり、ｎｅは、１−５
   の整数である；Ｒ₃は、炭素数１−６のアルキル基であ
   り；ｎａは、５−１５の整数であり；そしてｎｂは、１
   −１０の整数である］のいずれかで表される構造を有す
   る化合物と高分子化合物を結合させることにより抗原を
   作製し、当該抗原を用いることにより、以下の式
   （５）： 【化５】 で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗体を製
   造することを特徴とする、式（５）の化合物に反応性を
   示す抗体又はそのフラグメントの製造方法。
4. 【請求項４】請求項３に記載の方法により製造された、
   式（５）の化合物と反応性を示す抗体又はそのフラグメ
   ント。
5. 【請求項５】式（１）においてｎａ＝５である化合物を
   用いて製造された、請求項４に記載の式（５）の化合物
   と反応性を示す抗体又はそのフラグメント。
6. 【請求項６】モノクローナル抗体である、請求項４又は
   ５に記載の抗体又はそのフラグメント。
7. 【請求項７】ＯＸＭ６−８である、請求項４ないし６の
   いずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
8. 【請求項８】請求項４ないし７のいずれか１項に記載の
   抗体又はそのフラグメントを産生するハイブリドーマ。
9. 【請求項９】寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６３０１で寄託
   されている、請求項８に記載のハイブリドーマ。
10. 【請求項１０】請求項４ないし７のいずれか１項に記載
    の抗体又はそのフラグメントを用いることを特徴とす
    る、式（５）で表される化合物の免疫学的測定方法。
11. 【請求項１１】さらに、式（１）−（４）のいずれかで
    表される化合物と高分子化合物または標識化合物との結
    合体を使用することを含む、請求項１０に記載の免疫学
    的測定方法。
12. 【請求項１２】式（１）−（４）のいずれかで表される
    化合物が、請求項４ないし７のいずれか１項に記載の抗
    体又はそのフラグメントを作製するための用いた化合物
    とは異なるものである、請求項１１に記載の免疫学的測
    定方法。